ＧＬＰ−１融合ポリペプチド
ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに直接または間接的に連結されたＧＬＰ−１またはそのレセプター結合部位を含む融合ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＬＰペプチドまたはその機能的変異体を含む融合ポリペプチド；当該融合ポリペプチドを含むダイマー；および前記融合ポリペプチドの投与から利益を受ける疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン様ペプチド１［ＧＬＰ−１］は種々の機能を有する。例えば、ＧＬＰ−１は膵臓β細胞によるインスリンの産生を刺激し、膵臓β細胞の増殖を増進し、膵臓β細胞のアポトーシスを阻害し、グルカゴン活性を低減し、胃内容排出を遅延させ、かつ、インスリン感応性を増強する。ＧＬＰ−１はプログルカゴンと称されるより大きなポリペプチドから誘導され、プログルカゴンはグルカゴン［２９アミノ酸］、ＧＬＰ−１［３６または３７アミノ酸残基］およびＧＬＰ−２［３４アミノ酸残基］を含む（図１ｂ）。ＧＬＰ−１は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ［ＤＰＰ４］によってタンパク質分解的切断によって生成される３６アミノ酸ペプチドおよび３７アミノ酸ペプチドの二つの形態で存在する。ＤＰＰ４は、高い親和性でアデノシンデアミナーゼ［ＡＤＡ］と呼ばれる酵素に結合する。ＤＰＰ４とＡＤＡとの結合の重要性は不明である。しかしながら、ＡＤＡは重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）と関連することが知られている。ＧＬＰ−１は、膵臓β細胞によって、また、それ程ではないにせよ肺、腎臓、心臓、消化管および脳によっても発現されるＧ共役受容体であるＧＬＰ−１レセプターを活性化する。
【０００３】
高血糖症をもたらす多くの病状が存在しており、その最もよく知られているものは糖尿病である。糖尿病には１型と２型があり得る。１型糖尿病は、膵臓β細胞の破壊をもたらす自己免疫疾患であり、これは患者がインスリンを製造できないことを意味する。２型糖尿病は、より複雑な病状であって、関連する多くの病気に由来し得るが、一般にはインスリンの代謝作用に対する耐性に関与している。例えば、２型糖尿病は、年齢、肥満、インスリン耐性をもたらす殆ど体を動かさない生活に関連している。関連する病状は、患者を２型糖尿病に掛かりやすくさせ得るメタボリックシンドロームと呼ばれる。このシンドロームに関連する症状は、高血圧、脂質異常症、体脂肪沈着の増加および心疾患である。インスリン耐性をもたらすさらなる病状は、成熟卵子を製造できなくなる多嚢胞性卵巣症候群、アンドロゲン過剰および多毛症である。低血糖症（異常に低濃度の血中グルコース）も知られており、典型的にはインスリン過剰投与の結果として引き起こされる。
【０００４】
ＧＬＰ−１は、糖尿病の制御における治療剤として使用されている。しかしながら、天然のＧＬＰ−１に関する問題は、その小さい質量ゆえに、２−５分間という薬物動態的半減期で循環から非常に急速に除去されてしまうことである。これは、治療効果を達成するのに比較的大量のＧＬＰ−１を投与する必要があることを意味する。これにより、長時間作用型のＧＬＰ−１の開発およびＤＰＰ４阻害剤を使用するに至っている。前者のアプローチは、ＧＬＰ−１を含む融合タンパク質の製造に関与し、後者はＤＰＰ４インヒビターを利用するものであるが、これはインヒビターがＤＰＰ４を不活性化し、他のペプチドホルモンを変性して望ましくない副作用を引き起こすという点で、特異性欠如に問題がある。それゆえ、ＧＬＰ−１および関連分子の急速な消化及び／又は腎クリアランスの問題に取り組むことが望まれている。
【０００５】
上述したように、急速なＧＬＰ−１クリアランスを低減する従来のアプローチは、ＧＬＰ−１融合タンパク質の作成に関与する。例えば、ＷＯ２００７／０１６７６４号は、ＧＬＰ−１と、１型糖尿病における自己免疫反応を低減するための自己免疫サプレッサーとを含む融合タンパク質について開示している。ＥＰ１７２４２８４号は、イムノグロブリンのＦｃ部位もしくはアルブミンへのＧＬＰ−１の融合物を記載している。同様に、ＷＯ２００５／００８９２号は、ＧＬＰ−１アナログとＩｇＧ４のＦｃ部位とを含む融合タンパク質、並びに糖尿病、肥満および過敏性腸症候群の治療におけるこれらの使用を記載している。ＵＳ２００７／０１１１９４０号には、ＧＬＰ−１と、ＧＬＰ−１の安定性を改善する変性アミノ酸を含むペプチドキャリアとを含む共役体が開示されている。ＵＳ７７１６２７８号では、トランスフェリンへのＧＬＰ−１の融合物が、腎クリアランスを低減し、かつ、糖尿病及び関連する症状を治療するために使用されている。ＷＯ２００８／０６１３５５号では、キャリアータンパク質／ペプチドにＧＬＰ−１を融合させる代替案として、一定期間にわたって持続的にＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１のアナログを放出する埋め込み型ヒドロゲルデバイスが記載されている。
【発明の概要】
【０００６】
ここに、ＧＬＰ−１ペプチドまたはその機能的アナログを含む融合ポリペプチドを開示する。ある態様では、ＧＬＰ−１がＧＬＰ−１レセプターの細胞外ドメインに連結されている。別の態様では、不活性化ＤＤＰ４および任意に不活性ＡＤＡへのＧＬＰ−１の融合物を含む。
【０００７】
本発明の一態様によれば、ＧＬＰ−１の活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供するものであり、ここで前記ポリペプチドは、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに直接または間接的に連結されたＧＬＰ−１またはそのレセプター結合部位を含む。
【０００８】
本発明の一態様によれば、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに直接または間接的に連結されたＧＬＰ−１ペプチドまたはその機能的アナログのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドは、ＧＬＰ−１レセプターのＧＬＰ−１結合ドメインである。
【００１０】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドは、酵素的に不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼである。
【００１１】
本発明の好ましい態様では、前記不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼは、少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって変性され、ここで当該変性はＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼの活性部位に対するものである。
【００１２】
好ましくは、前記変性は、図３ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸残基６３０に対するものである。
【００１３】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図３ｂに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
【００１４】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、前記ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに本来的に結合するポリペプチドをさらに含み、当該ポリペプチドは酵素的に不活性なアデノシンデアミナーゼである。
【００１５】
本発明の好ましい態様では、前記不活性なアデノシンデアミナーゼは、少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって変性され、ここで当該変性は前記不活性なアデノシンデアミナーゼの活性部位に対するものである。
【００１６】
好ましくは、前記変性は、図４ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２９５及び／又は２９６に対するものである。
【００１７】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図４ｂに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
【００１８】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、アミノ酸配列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRを含むまたは当該アミノ酸配列からなるＧＬＰ−１ペプチド、もしくは前記アミノ酸配列とは少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換により相違する変性されたＧＬＰ−１ペプチドであって、未変性のＧＬＰ−１ペプチドと比較して強いＧＬＰ−１活性を保持または有するものを含む。
【００１９】
本発明の別の好ましい態様では、前記ＧＬＰ−１ペプチドはアミノ酸配列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR;または HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
を含む。
【００２０】
本発明の別の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドはアミノ酸配列：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS;または DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
を含む。
【００２１】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１が、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに、ペプチドリンカーによって連結されている。
【００２２】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１が、不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている。
【００２３】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１が、不活性なアデノシンデアミナーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている。
【００２４】
本発明のさらに好ましい態様では、融合不活性ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼが、不活性なアデノシンデアミナーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている。
【００２５】
好ましくは、前記ペプチドリンカーは柔軟なペプチドリンカーである。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む。
【００２７】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２コピーを含む。
【００２８】
本発明に係る融合ポリペプチドのポリペプチドドメインは、典型的に、ここに記載するペプチドリンカー、例えばＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーによって連結される。Ｇｌｙ４Ｓｅｒのコピー数は変化させることができる。例えば、ＤＰＰ４に対するＧＬＰ−１の融合では０〜１０コピーの間、好ましくは５〜７コピーの間で変化させることができる。ＡＤＡドメインに対するＤＤＰ４の融合でも、０〜１２コピーの間、好ましくは７または８コピーの間で変化させることができる。細胞外ドメインに対するＧＬＰ−１の融合でも、０〜８コピーの間、好ましくは２〜５コピーの間で変化させることができる。
【００２９】
本発明の別の好ましい態様では、ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに、単一のペプチド結合によって連結されている。
【００３０】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１が、不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている。
【００３１】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１が、不活性なアデノシンデアミナーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、不活性ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼが、不活性なアデノシンデアミナーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている。
【００３３】
本発明の別の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、グリコシル化モチーフAsn-Xaa-SerまたはAsn-Xaa-Thr（ここでXはプロリンを除くいずれかのアミノ酸）の１つのコピーを含む、またはこれから構成される。
【００３４】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子は少なくとも５アミノ酸残基を含む。
【００３５】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカーは５〜５０アミノ酸残基を含む。
【００３６】
本発明のさらに好ましい態様では、前記ペプチドリンカーは５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸残基からなる。
【００３７】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、モチーフ（Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5）の少なくとも１つのコピーを含み、ここで前記モチーフはグリコシル化モチーフAsn-Xaa-SerまたはAsn-Xaa-Thrを含む。
【００３８】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、
Asn1-Xaa2-Ser3 Xaa4 Xaa5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Xaa1 Asn2-Xaa3-Ser4 Xaa5（ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Xaa1 Xaa2 Asn3-Xaa4-Ser5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Asn1-Xaa2-Thr3 Xaa4 Xaa5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Xaa1 Asn2-Xaa3-Thr4 Xaa5 （ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；および
Xaa1 Xaa2 Asn3-Xaa4-Thr5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）
からなる群から選択されるアミノ酸モチーフの少なくとも一つのコピーを含む。
【００３９】
好ましくは、前記ペプチドリンカー分子が、
Asn1-Xaa2-Ser3 Gly4 Ser5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Gly1 Asn2-Xaa3-Ser4 Ser5（ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Gly1 Gly2 Asn3-Xaa4-Ser5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Asn1-Xaa2-Thr3 Gly4 Ser5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Gly1 Asn2-Xaa3-Thr4 Ser5 （ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；および
Gly1 Gly2 Asn3-Xaa4-Thr5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）
からなる群から選択されるアミノ酸モチーフの少なくとも一つのコピーを含む。
【００４０】
本発明の別の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、
Asn1-Xaa2-Ser3 Ser4 Gly5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Ser1 Asn2-Xaa3-Ser4 Gly5（ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Ser1 Ser2 Asn3-Xaa4-Ser5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Asn1-Xaa2-Thr3 Ser4 Gly5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Ser1 Asn2-Xaa3-Thr4 Gly5 （ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；および
Ser1 Ser2 Asn3-Xaa4-Thr5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）
からなる群から選択されるアミノ酸モチーフの少なくとも一つのコピーを含む。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、モチーフ（Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5）の少なくとも１つのコピーを含み、ここで前記モチーフはグリコシル化モチーフAsn-Xaa-SerまたはAsn-Xaa-Thrおよびモチーフ（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）の少なくとも１つのコピーを含み、当該ペプチドリンカーは５〜５０アミノ酸である。
【００４２】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、モチーフ（Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5）の少なくとも１つのコピーを含み、ここで前記モチーフはグリコシル化モチーフAsn-Xaa-SerまたはAsn-Xaa-Thrおよびモチーフ（Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ）のコピーを含み、当該ペプチドリンカーは５〜５０アミノ酸である。
【００４３】
本発明の好ましい態様では、前記融合ペプチドリンカーが、マンノース、ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミン、Ｎ-アセチルノイラミン酸、Ｎ-グリコリルノイラミン酸、Ｎ-アセチルガラクトサミン、フコース、グルコース、ラムノース、キシロース、または、糖類の組み合わせ、例えばオリゴ糖またはスカフォールド系(scaffolded system)におけるものからなる群から選択される少なくとも一つの糖の付加によって修飾される。
【００４４】
適切な炭水化物成分は、単糖、オリゴ糖、および多糖を含み、かつ、天然に存在する糖タンパク質または生体系に存在するいずれかの炭水化物成分を含む。例えば、任意に保護されたグリコシル又はグリコシド誘導体、例えば任意に保護されたグルコシル、グルコシド、ガラクトシル又はガラクトシド誘導体である。グリコシル及びグリコシド基はα及びβグループの両方を含む。適切な炭水化物成分は、グルコース、ガラクトース、フコース、GlcNAc、GalNAc、シアル酸およびマンノース、並びに、少なくとも一つのグルコース、ガラクトース、フコース、GlcNAc、GalNAc、シアル酸及び／又はマンノース残基を含むオリゴ糖または多糖を含む。
【００４５】
炭水化物成分のいずれかの官能基は、当該技術分野で公知の保護基を用いて任意に保護してもよい（例えば、Greeneら, "Protecting groups in organic synthesis", 2nd Edition, Wiley, New York, 1991を参照。この開示内容を参照としてここに含める）。炭水化物成分におけるいずれかの-OH基の適切な保護基は、アセタート（Ac）、ベンジル（Bn）、シリル（例えばtert-ブチルジメチルシリル（TBDMSi）およびtert-ブチルジフェニルシリル（TMDPSi））、アセタール、ケタール、およびメトキシメチル（MOM）を含む。いずれかの保護基は、ペプチドリンカーに対する炭水化物成分の連結の前または後に取り除いてもよい。
【００４６】
本発明の好ましい態様では、前記糖は保護されていない。
【００４７】
特に好ましい炭水化物成分は、Glc(Ac)4β-、Glc(Bn)4β-、Gal(Ac)4β-、Gal(Bn)4β-、Glc(Ac)4α(1,4)Glc(Ac)3α(1,4)Glc(Ac)4β-、β-Glc、β-Gal、-Et-β-Gal、-Et-β-Glc、Et-α-Glc、-Et-α-Man、-Et-Lac、-β-Glc(Ac)2、-β-Glc(Ac)3、-Et-α-Glc(Ac)2、-Et-α-Glc(Ac)3、-Et-α-Glc(Ac)4、-Et-β-Glc(Ac)2、-Et-β-Glc(Ac)3、-Et-β-Glc(Ac)4、-Et-α-Man(Ac)3、-Et-α-Man(Ac)4、-Et-β-Gal(Ac)3、-Et-β-Gal(Ac)4、-Et-Lac(Ac)5、-Et-Lac(Ac)6、-Et-Lac(Ac)7、およびこれらの脱保護された同等物を含む。
【００４８】
好ましくは、天然に生じる糖から誘導される炭水化物成分を構成するいずれかのサッカリドユニットは、天然に生じる鏡像異性体であり、D型（例えばD-グルコースまたはD-ガラクトース）もしくはL型（例えば、L-ラムノースまたはL-フコース）であってもよい。いずれかのアノマー結合がα-またはβ-結合であってもよい。
【００４９】
本発明のさらに別の態様では、前記融合ポリペプチドは、
i)図５ｂに示される核酸配列；
ii)図５ｄに示される核酸配列；
iii)図５ｆに示される核酸配列；
iv)図６ｂに示される核酸配列；
v)図６ｄに示される核酸配列；
vi)図６ｆに示される核酸配列；
vii)図７ｂに示される核酸配列；
viii)図７ｄに示される核酸配列；
ix)図７ｆに示される核酸配列；
x)図８ｂに示される核酸配列；
xi)図８ｄに示される核酸配列；
xii)図８ｆに示される核酸配列；
xiii)図９ｂに示される核酸配列；
xiv)図９ｄに示される核酸配列；
xv)図９ｆに示される核酸配列；
xvi)図１０ｂに示される核酸配列；
xvii)図１０ｄに示される核酸配列；
xviii)図１０ｆに示される核酸配列；
xix)図１１ｂに示される核酸配列；
xx)図１１ｄに示される核酸配列；
xxi)図１１ｆに示される核酸配列；
xxii)図１２ｂに示される核酸配列；
xxiii)図１２ｄに示される核酸配列；
xxiv)図１２ｆに示される核酸配列；
からなる群から選択される核酸分子、もしくは
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で図５ｂ−１２ｆに示されている核酸配列にハイブリダイズし、ＧＬＰ−１レセプター調節活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子、
によってコードされる。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、前記核酸分子は、アゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする。
【００５１】
ＧＬＰ−１アゴニストから利益を受ける、高血糖症をもたらす多くの病状が存在しており、その最もよく知られているものは糖尿病である。糖尿病には１型と２型があり得る。１型糖尿病は、膵臓β細胞の破壊をもたらす自己免疫疾患であり、これは患者がインスリンを製造できないことを意味する。２型糖尿病は、より複雑な病状であって、関連する多くの病気に由来し得るが、一般にはインスリンの代謝作用に対する耐性に関与している。例えば、２型糖尿病は、年齢、肥満、インスリン耐性をもたらす殆ど体を動かさない生活に関連している。関連する病状は、患者を２型糖尿病に掛かりやすくさせ得るメタボリックシンドロームと呼ばれる。このシンドロームに関連する症状は、高血圧、脂質異常症、体脂肪沈着の増加および心疾患である。
【００５２】
本発明の別の好ましい態様では、前記核酸分子がアンタゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする。
【００５３】
低血糖症（異常に低濃度の血中グルコース）も知られており、典型的にはインスリン過剰投与の結果として引き起こされる。これは、ＧＬＰ−１アンタゴニストの投与から利益を受ける。低血糖状態をもたらす過剰なインスリン分泌を生じる疾患も存在する。例えば、インスリノーマはインスリンの過剰生産をもたらす膵臓β細胞の癌である。ＧＬＰ−１拮抗作用から利益を受けうる別の例は、インスリン過剰症、拒食症および１型糖尿病における制御グルカゴン分泌を含む。
【００５４】
核酸分子のハイブリダイゼーションは、二つの相補的核酸分子が互いに一定量の水素結合をしたときに生じる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸を取り巻く周囲条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、および使用する核酸分子の組成及び長さによって変化しうる。特定のストリンジェンシーを達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する算定は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); およびTijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology?Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York, 1993)に記載されている。Ｔｍは、核酸分子の所定の鎖の５０％がその相補鎖にハイブリダイズする温度である。以下は、ハイブリダイゼーション条件の例示的セットであり、これらに限定されるものではない。
【００５５】
非常に高いストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を有する配列をハイブリダイズさせる）
ハイブリダイゼーション： ５×ＳＳＣ、６５℃で１６時間
洗浄２回： ２×ＳＳＣ、それぞれ室温（ＲＴ）で１５分間
洗浄２回： ０．５×ＳＳＣ、それぞれ６５℃で２０分間
【００５６】
高いストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を有する配列をハイブリダイズさせる）
ハイブリダイゼーション： ５×−６×ＳＳＣ、６５℃−７０℃で１６−２０時間
洗浄２回： ２×ＳＳＣ、それぞれＲＴで５−２０分間
洗浄２回： １×ＳＳＣ、それぞれ５５℃−７０℃で３０分間
【００５７】
低いストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を有する配列をハイブリダイズさせる）
ハイブリダイゼーション： ６×ＳＳＣ、ＲＴから５５℃で１６−２０時間
洗浄２回： ２×ＳＳＣ、それぞれＲＴで５−２０分間
洗浄少なくとも２回： ２×−３×ＳＳＣ、それぞれＲＴから５５℃で２０−３０分間
【００５８】
本発明のさらなる態様では、本発明にかかる核酸分子によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５９】
本発明のさらなる態様では、図５ａ、５ｃ、５ｅ、６ａ、６ｃ、６ｅ、７ａ、７ｃ、７ｅ、８ａ、８ｃ、８ｅ、９ａ、９ｃ、９ｅ、１０ａ、１０ｃ、１０ｅ、１１ａ、１１ｃ、１１ｅ、１２ａ、１２ｃ、１２ｅ、１３ａ、１３ｃ、１３ｅ、１４ａ、１４ｃ、１４ｅ、１５ａ、１５ｃ、１５ｅ、１６ａ、１６ｃ、１６ｅ、１７ａ、１７ｃ、１７ｅ、１８ａ、１８ｃ、１８ｅ、１９ａ、１９ｃ、１９ｅ、２０ａ、２０ｃまたは２０ｅからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００６０】
本発明のさらなる態様では、本発明にかかる二つのポリペプチドからなるホモダイマーを提供する。
【００６１】
本発明のさらなる態様では、本発明にかかるポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００６２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る核酸分子を含むベクターを提供する。
【００６３】
本発明の好ましい態様では、前記ベクターは、本発明に係る核酸分子を発現するのに適合した発現ベクターである。
【００６４】
本発明に係る核酸を含むベクターは、特にそのベクターが安定なトランスフェクションのために組み換え用細胞のゲノムに核酸を導入するために使用される場合には、プロモーターまたは他の制御配列を含む必要はない。好ましくは、ベクター内の核酸は、宿主細胞において、適切なプロモーターまたは転写用の他の調節エレメントに機能的に連結される。ベクターは、多様なホストで機能するバイファンクショナル発現ベクターであってもよい。“プロモーター”は、転写開始部位より上流のヌクレオチド配列を意味し、転写に必要な全ての制御領域を含む。適切なプロモーターは、真核細胞または原核細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導、発生的（developmental）プロモーターなどを含む。“機能的に連結”とは、転写がプロモーターから開始されるのに適切な位置および方向で、同じ核酸分子の一部として組み込まれていることを意味する。プロモーターに機能的に連結したＤＮＡは、プロモーターの“転写開始調節下”にある。
【００６５】
好ましい態様では、プロモーターは、構成的、誘導または調節可能プロモーターである。
【００６６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る核酸分子またはベクターでトランスフェクトまたは形質転換された細胞を提供する。
【００６７】
好ましくは、前記細胞は真核細胞である。あるいは、前記細胞は原核細胞である。
【００６８】
本発明の好ましい態様では、前記細胞は、真菌細胞（例えば、ピチア属（Pichia spp）、サッカロミセス属（Saccharomyces spp）、アカパンカビ属（Neurospora spp））；昆虫細胞（例えば、スポドプテラ属）；哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）；植物細胞からなる群から選択される。
【００６９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係るポリペプチドを含み、賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００７０】
本発明の好ましい態様では、前記医薬組成物はさらなる治療剤と組み合わせられる。
【００７１】
投与の際に、本発明の医薬組成物は薬学的に許容可能な調製物で投与される。このような調製物は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合する担体、および任意に他の治療剤をごく普通に含んでもよい。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、注射を含むあらゆる通常の経路で投与することができる。投与及び適用は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、関節内、皮下、局所、皮膚（例えば、皮膚または粘膜へのクリーム脂溶性挿入物）、経皮または鼻腔内投与とすることができる。
【００７３】
本発明の医薬組成物は有効量で投与される。“有効量”とは、単独で、もしくはさらなる投与または相乗的薬剤と共同で、所望の応答を生じる薬剤／組成物の量である。これは、より好ましくは疾患の進行を永久に停止することを含むが、疾患の進行を一時的に遅延させるだけのものを含んでも良い。これは通常の方法でモニタでき、また、診断方法に従ってモニタすることもできる。
【００７４】
患者に投与される医薬組成物の投与量は、種々のパラメータに従って、特に、使用される投与方式および患者の状態（すなわち年齢および性別）に従って選択することができる。投与の際に、本発明の医薬組成物は薬学的に許容可能な量および薬学的に許容可能な組成物で適用される。薬剤に使用する場合、塩は薬学的に許容可能なものであるが、薬学的に許容できない塩であってもその薬学的に許容可能な塩を調製するために都合よく使用できることから、本発明の範囲から除外されるものではない。このような薬理学的および薬学的に許容可能な塩は、限定されるものではないが、以下の酸：塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸等から調製されたものを含む。また、薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩として調製できる。
【００７５】
医薬組成物は、所望であれば、薬学的に許容可能な担体と組み合わせてもよい。ここで使用する用語“薬学的に許容可能な担体”とは、ヒトへの投与に適した一以上の適合する固体または液体フィラー、希釈剤、封入剤を意味する。用語“担体”とは、天然または合成の有機または無機成分を指し、これと活性成分とを合わせることにより適用が容易となる。医薬組成物の各成分も、所望の薬学的効能を実質的に損なう相互作用が無いような方法で、本発明の分子と互いに混合することができる。
【００７６】
医薬組成物は、塩の状態の酢酸、塩の状態のクエン酸、塩の状態のホウ酸、および塩の状態のリン酸を含む適切な緩衝剤を含んでも良い。
【００７７】
医薬組成物は、任意に、適切な防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン類、およびチメロサールを含んでもよい。
【００７８】
医薬組成物は、通常は単位投与量形態で提供することができ、薬学分野で周知のいずれかの方法で調製できる。全ての方法が、活性剤を、一以上の補助成分を構成する担体と合わせる工程を含む。一般に、組成物は、活性化合物を均一かつ密接に液状担体、細かく砕いた固形状担体、またはその両方と合わせ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって製造される。
【００７９】
非経口投与に適した組成物は、通常は、好ましくは受容者の血液と等張の無菌水性または非水性調製物を含む。この調製物は、適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いた公知の方法に従って製造してもよい。無菌の注射用調製物は、例えば１，３−ブタンジオール溶液のような、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒における無菌の注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用できる許容可能な溶媒は、水、リンガー溶液および生理食塩液である。さらに、無菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体として通常用いられる。このために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含むあらゆる無菌性の固定油を使用できる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を注射剤の調製に使用してもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適した担体製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.から入手可能である。
【００８０】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む、高血糖症を患っているヒト患者を治療する方法を提供する。
【００８１】
本発明の好ましい方法では、前記ポリペプチドは静脈内に投与される。
【００８２】
本発明の別の好ましい方法では、前記ポリペプチドが皮下投与される。
【００８３】
本発明のさらに好ましい方法では、前記ポリペプチドが二日おきに投与され、好ましくは前記ポリペプチドが一週間おき、二週間おき、または一ヶ月おきに投与される。
【００８４】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症状が糖尿病である。
【００８５】
本発明の好ましい方法では、糖尿病が１型である。
【００８６】
本発明の好ましい方法では、糖尿病が２型である。
【００８７】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がインスリン耐性の結果である。
【００８８】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がメタボリックシンドロームの結果である。
【００８９】
本発明の態様によれば、糖尿病を治療する医薬を製造するための本発明に係るポリペプチドの使用を提供する。
【００９０】
本発明の好ましい態様では、糖尿病が１型である。
【００９１】
本発明の好ましい態様では、糖尿病が２型である。
【００９２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係るポリペプチドまたはダイマーに結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００９３】
好ましくは、前記モノクローナル抗体は、前記ポリペプチドまたはダイマーに結合するが、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１レセプター単独には特異的に結合しない抗体である。
【００９４】
モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むダイマーのいずれかによって提示される構造的抗原（conformational antigen）に結合する。
【００９５】
本発明のさらなる態様では、以下の工程：
ｉ）少なくとも一つの本発明に係るポリペプチドを含む免疫原で免疫応答性の哺乳動物を免疫化する；
ｉｉ）免疫化した免疫応答性の哺乳動物のリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する；
ｉｉｉ）（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性について、工程（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって製造されたモノクローナル抗体をスクリーニングする、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して、増殖及び／又は前記モノクローナル抗体を分泌させる、および
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収する
を含む、本発明に係るモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。
【００９６】
好ましくは、前記免疫応答性の哺乳動物はマウスである。あるいは、前記免疫応答性の哺乳動物はラットである。
【００９７】
ハイブリドーマ細胞を用いたモノクローナル抗体の製造は、当該分野において周知である。モノクローナル抗体を製造するために使用される方法は、KohlerおよびMilstein, Nature 256, 495-497 (1975)、並びにDonillardおよびHoffman, "Basic Facts about Hybridomas", Compendium of Immunology V.II版. Schwartz, 1981に開示されており、これらを参照として取り込む。
【００９８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る方法によって得られたまたは得られるハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００９９】
本発明のさらなる態様によれば、以下の工程：
ｉ）試験すべき単離されたサンプルを提供する、
ｉｉ）前記サンプルを本発明に係るポリペプチドに結合するリガンドと接触させる、および
ｉｉｉ）前記サンプルにおける前記リガンドの結合を検出する
を含む、生物学的サンプル中の本発明に係るポリペプチドを検出するための診断試験を提供する。
【０１００】
本発明の好ましい態様では、前記リガンドは抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１０１】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、用語“含む(comprise)”および“含む(contain)”およびこれらの用語の変形、例えば“含む(comprising)”および“含む(comprises)”は、“包含するが限定されない(including but not limited to)”ことを意味し、別の部分、添加物、成分、整数または工程を排除することを意図しない（並びに排除しない）。
【０１０２】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、必要がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されるところでは、本明細書は、必要がない限り、単数形も複数形も意図すると解する。
【０１０３】
本発明の特定の態様、実施態様または実施例に関連して記載された特性、整数、特徴、化合物、化学的部分または基は、不適切でなければ、ここに記載された他の態様、実施態様または実施例に適用可能であるものと理解する。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１ａはヒトＧＬＰ−１およびヒトＧＬＰ−１前駆体の核酸配列及びアミノ酸配列である；図１ｂはエキセンディン４前駆体のアミノ酸配列である；図１ｃはＧＬＰ−１のアミノ酸配列（７−３７）である；図１ｄはＧＬＰ−１のアミノ酸配列（７−３６）である；図１ｅはエキセンディン４のアミノ酸配列である；図１ｆはエキセンディン４のアミノ酸配列（９−３９）である。
【図２】図２ａはヒトＧＬＰ−１レセプターの全長アミノ酸配列である；図２ｂはＧＬＰ−１細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
【図３】図３ａはヒトＤＰＰ４のアミノ酸配列である；図３ｂは不活性ＤＰＰ４のアミノ酸配列である。
【図４】図４ａはヒトＡＤＡのアミノ酸配列である；図４ｂは不活性ＡＤＡのアミノ酸配列である。
【図５ｉ】図５ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｂは核酸配列である；図５ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｄは核酸配列である；図５ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｆは核酸配列である。
【図５ｉｉ】図５ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｂは核酸配列である；図５ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｄは核酸配列である；図５ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｆは核酸配列である。
【図６ｉ】図６ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｂは核酸配列である；図６ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｄは核酸配列である；図６ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｆは核酸配列である。
【図６ｉｉ】図６ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｂは核酸配列である；図６ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｄは核酸配列である；図６ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｆは核酸配列である。
【図６ｉｉｉ】図６ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｂは核酸配列である；図６ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｄは核酸配列である；図６ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｆは核酸配列である。
【図７ｉ】図７ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｂは核酸配列である；図７ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｄは核酸配列である；図７ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｆは核酸配列である。
【図７ｉｉ】図７ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｂは核酸配列である；図７ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｄは核酸配列である；図７ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｆは核酸配列である。
【図７ｉｉｉ】図７ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｂは核酸配列である；図７ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｄは核酸配列である；図７ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｆは核酸配列である。
【図７ｉｖ】図７ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｂは核酸配列である；図７ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｄは核酸配列である；図７ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｆは核酸配列である。
【図８ｉ】図８ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｂは核酸配列である；図８ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｄは核酸配列である；図８ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｆは核酸配列である。
【図８ｉｉ】図８ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｂは核酸配列である；図８ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｄは核酸配列である；図８ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｆは核酸配列である。
【図８ｉｉｉ】図８ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｂは核酸配列である；図８ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｄは核酸配列である；図８ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｆは核酸配列である。
【図８ｉｖ】図８ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｂは核酸配列である；図８ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｄは核酸配列である；図８ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｆは核酸配列である。
【図９ｉ】図９ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｂは核酸配列である；図９ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｄは核酸配列である；図９ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｆは核酸配列である。
【図９ｉｉ】図９ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｂは核酸配列である；図９ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｄは核酸配列である；図９ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｆは核酸配列である。
【図１０ｉ】図１０ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｂは核酸配列である；図１０ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｄは核酸配列である；図１０ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｆは核酸配列である。
【図１０ｉｉ】図１０ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｂは核酸配列である；図１０ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｄは核酸配列である；図１０ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｆは核酸配列である。
【図１０ｉｉｉ】図１０ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｂは核酸配列である；図１０ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｄは核酸配列である；図１０ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｆは核酸配列である。
【図１１ｉ】図１１ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｂは核酸配列である；図１１ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｄは核酸配列である；図１１ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｆは核酸配列である。
【図１１ｉｉ】図１１ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｂは核酸配列である；図１１ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｄは核酸配列である；図１１ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｆは核酸配列である。
【図１１ｉｉｉ】図１１ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｂは核酸配列である；図１１ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｄは核酸配列である；図１１ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｆは核酸配列である。
【図１１ｉｖ】図１１ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｂは核酸配列である；図１１ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｄは核酸配列である；図１１ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｆは核酸配列である。
【図１２ｉ】図１２ａはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｂは核酸配列である；図１２ｃはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｄは核酸配列である；図１２ｅはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｆは核酸配列である。
【図１２ｉｉ】図１２ａはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｂは核酸配列である；図１２ｃはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｄは核酸配列である；図１２ｅはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｆは核酸配列である。
【図１２ｉｉｉ】図１２ａはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｂは核酸配列である；図１２ｃはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｄは核酸配列である；図１２ｅはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｆは核酸配列である。
【図１２ｉｖ】図１２ａはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｂは核酸配列である；図１２ｃはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｄは核酸配列である；図１２ｅはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｆは核酸配列である。
【図１２ｖ】図１２ａはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｂは核酸配列である；図１２ｃはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｄは核酸配列である；図１２ｅはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｆは核酸配列である。
【図１３】図１３ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１３ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１３ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；これらはいずれもグリコシル化し得るペプチドリンカーを含んでいる。
【図１４】図１４ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１の全長アミノ酸配列である；図１４ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１４ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である。
【図１５】図１５ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１５ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１５ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；これらはいずれもグリコシル化し得るペプチドリンカーを含んでいる。
【図１６】図１６ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１の全長アミノ酸配列である；図１６ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１６ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である。
【図１７】図１７ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１７ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１７ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；これらはいずれもグリコシル化し得るペプチドリンカーを含んでいる。
【図１８】図１８ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１の全長アミノ酸配列である；図１８ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１８ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である。
【図１９】図１９ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１９ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１９ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；これらはいずれもグリコシル化し得るペプチドリンカーを含んでいる。
【図２０】図２０ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１の全長アミノ酸配列である；図２０ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図２０ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である。
【図２１】図２１ａはＩＬ４シグナル配列の核酸配列であり、図２１ｂはアミノ酸配列である。
【図２２】ａ）ＰＣＲを用いて、適切な制限部位（プライマーＲ１−４に含まれる）を隣接させた目的の遺伝子からなるＤＮＡを生成した。ｂ）このＰＣＲ産物を、リンカー領域の各端で適切なベクターに結合させた。ｃ）この構成物を、不要な配列（すなわち、本来のものでない制限酵素認識部位）を含まない的確なリンカーを導入するように変性した。
【図２３】ａ）オリゴヌクレオチドを、特有のオーバーラップを備えた部分的二本鎖領域を形成するように設計し、アニールおよびプロセッシングした際に、リガンド及びレセプターにアニールする隣接領域を備えたリンカーをコードするものとした。ｂ）“メガプライマー”および末端プライマー（Ｒ１およびＲ２）を用いてＰＣＲを行い、ＬＲ−融合遺伝子を製造した。Ｒ１およびＲ２プライマーは、ターゲットベクターへの結合に使用可能な隣接制限酵素認識部位を取り込むように設計した。
【図２４】図２４はＧＬＰ１ＬＲ融合タンパク質ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ［２４−１４５］である１０Ａ１の発現を示す免疫ブロットである。
【図２５】図２５はＧＬＰ１／ＤＰＰ４／ＡＤＡ融合タンパク質ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４［３９−７６６；Ｓ６３０Ａ］−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ［Ｄ２９５Ｅ；Ｄ２９６Ａ）である１０Ｇ１の発現を示す免疫ブロットである。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
本発明の実施態様を、実施例を用いて、図面を参照しながら記載する。
【０１０６】
材料と方法
免疫学的試験
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対するインスリンの結合を調べる免疫測定法は、当該分野において知られている。商業的に入手可能なインスリン抗体がサンプル中のインスリンを検出するために利用でき、競争阻害試験における使用にも利用できる。例えば、モノクローナル抗体は、http://www.ab-direct.com/index AbD Serotecで購入することができる。
【０１０７】
融合タンパク質の組み換え生成
融合タンパク質の構成成分を、リガンドまたはレセプターにアニールし、かつ、ターゲットベクターへのクローニングに適した制限酵素認識部位を導入するように設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって生成した（図１４ａ）。ＰＣＲのテンプレートはターゲット遺伝子を含んでおり、ＩＭＡＧＥクローン、ｃＤＮＡライブラリーまたはカスタム合成遺伝子から得た。適切な隣接する制限酵素認識部位を有するリガンドおよびレセプター遺伝子を合成したら、これらをターゲットベクターにおいてリンカー領域の両端に結合させた（図１４ｂ）。この構築物を、リンカー領域の両端の二つの特有の制限酵素認識部位間にカスタム合成した長さのＤＮＡを挿入するか、ｓｓＤＮＡ変性技術によってリンカー領域を変異させるか、適切な制限酵素認識部位間にプライマーデュプレックス／マルチプレックス（primer duplex/multiplex）を挿入するか、またはＰＣＲ変性によって、隣接する制限酵素認識部位のない適正なリンカーを含むように変性させた（図１４ｃ）。
【０１０８】
あるいは、最適なリガンド又はレセプタードメインにアニールするように設計された隣接する配列を有するリンカーを、オリゴヌクレオチド二本鎖を生成することによって最初に合成し、これを処理して二本鎖ＤＮＡを生成した（図１５ａ）。次いで“メガプライマー”としてのリンカー配列、この“メガプライマー”がアニールするリガンドおよびレセプターの反対端に対向して設計されたプライマー、およびテンプレートとしてのリガンドおよびレセプターを用いて、ＰＣＲを行った。末端プライマーは、最適な発現ベクターへの結合に適した制限酵素認識部位を用いて設計した（図１５ｂ）。
【０１０９】
融合タンパク質の発現および精製
適切な系（例えば哺乳動物ＣＨＯ細胞、E.coli）で発現を行った。これは、インスリン融合遺伝子が生成されるベクターに依存する。次いで、当該分野で周知のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡの一以上を含んでもよい種々の方法を用いて発現を分析した。適切なレベルの発現を達成したら、インスリン融合物をより大きいスケールで発現し、精製および次の分析に十分なタンパク質を製造する。イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫安沈殿法、ゲル濾過、サイズ排除および／またはアフィニティークロマトグラフィー（ニッケル／コバルト樹脂、抗体固定化樹脂および／またはリガンド／レセプター固定化樹脂を使用）のような一以上のクロマトグラフ法の適切な組み合わせを用いて精製を行った。精製したタンパク質を、ブラッドフォード分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡを含む種々の方法を用いて分析した。
【０１１０】
融合ポリペプチドは、ポリペプチドの製造中にプロセッシングされるシグナル配列を含む。シグナル配列が、使用される特定の発現系に適した種々の起源から選択できること（例えば細菌性、哺乳動物性）は、当業者にとって明らかであろう。非限定的な例では、哺乳動物細胞における発現には、ＩＬ４および成長ホルモンのシグナル配列を使用する。細菌での発現では、適切なペリプラズムシグナル配列を選択する。
【０１１１】
ＧＬＰ−１融合タンパク質の特性評価
変性ＰＡＧＥ、ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロッティングを用いて、融合ポリペプチドを分析し、かつ、インスリン融合物に対して構造的に敏感でない抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ネイティブの溶液状態分子量情報は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ Ｇ２００分析カラムおよび分析超遠心を使用したサイズ排除クロマトグラフィーのような技術から得ることができる。
【０１１２】
統計
二つのグループを、分散が正規分布であればスチューデント検定を用いて比較し、正規分布でなければスチューデント−サタースワイト検定（Student-Satterthwaite's test）を用いて比較した。分布はＦ検定でテストした。一元ANOVA(One-way ANOVA)を用いて３以上のグループの平均を比較し、有意水準がｐ＜０．０５であれば、個々の比較をダネット検定を用いて行った。全ての統計的検定が両側５％の有意水準であり、欠測値にデータの補完は行わなかった。
【０１１３】
ＧＬＰ−１ ＬＲ融合体の発現：ＣＨＯ ＦｌｐIｎ細胞における一過性発現からの１０Ａ１および１０Ｇ１のウェスタンブロッティング
ＧＬＰ１ ＬＲ融合ポリペプチド１０Ａ１
５０μｌのサンプルを濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した；図２４（レーン１）。５０μｌのコントロール培地（トランスフェクション無し）も濃縮し、並行して流した（レーン２）。マーカーは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０および１５ｋＤａである。免疫ブロットをマウス抗ＧＬＰ抗体（Santa Cruz Inc.; Cat#: sc80604; 希釈=1:200）および抗マウスＨＲＰ抗体（Abcam.; 希釈=1:2500）を用いて行った。１０Ａ１の推定される分子量は１９ｋＤａである。
【０１１４】
ＧＬＰ１／ＤＰＰ４／ＡＤＡ融合ポリペプチド１０Ｇ１
５０μｌのサンプルを濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した；図２５（レーン２）。５０μｌのコントロール培地（トランスフェクション無し）も濃縮し、並行して流した（レーン１）。マーカーは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０および１５ｋＤａである。免疫ブロットをマウス抗ＧＬＰ抗体（Santa Cruz Inc.; Cat#: sc80604; 希釈=1:200）および抗マウスＨＲＰ抗体（Abcam.; 希釈=1:2500）を用いて行った。１０Ｇ１の推定される分子量は１３３ｋＤａである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＬＰペプチドまたはその機能的変異体を含む融合ポリペプチド；当該融合ポリペプチドを含むダイマー；および前記融合ポリペプチドの投与から利益を受ける疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン様ペプチド１［ＧＬＰ−１］は種々の機能を有する。例えば、ＧＬＰ−１は膵臓β細胞によるインスリンの産生を刺激し、膵臓β細胞の増殖を増進し、膵臓β細胞のアポトーシスを阻害し、グルカゴン活性を低減し、胃内容排出を遅延させ、かつ、インスリン感応性を増強する。ＧＬＰ−１はプログルカゴンと称されるより大きなポリペプチドから誘導され、プログルカゴンはグルカゴン［２９アミノ酸］、ＧＬＰ−１［３６または３７アミノ酸残基］およびＧＬＰ−２［３４アミノ酸残基］を含む（図１ｂ）。ＧＬＰ−１は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ［ＤＰＰ４］によってタンパク質分解的切断によって生成される３６アミノ酸ペプチドおよび３７アミノ酸ペプチドの二つの形態で存在する。ＤＰＰ４は、高い親和性でアデノシンデアミナーゼ［ＡＤＡ］と呼ばれる酵素に結合する。ＤＰＰ４とＡＤＡとの結合の重要性は不明である。しかしながら、ＡＤＡは重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）と関連することが知られている。ＧＬＰ−１は、膵臓β細胞によって、また、それ程ではないにせよ肺、腎臓、心臓、消化管および脳によっても発現されるＧ共役受容体であるＧＬＰ−１レセプターを活性化する。
【０００３】
高血糖症をもたらす多くの病状が存在しており、その最もよく知られているものは糖尿病である。糖尿病には１型と２型があり得る。１型糖尿病は、膵臓β細胞の破壊をもたらす自己免疫疾患であり、これは患者がインスリンを製造できないことを意味する。２型糖尿病は、より複雑な病状であって、関連する多くの病気に由来し得るが、一般にはインスリンの代謝作用に対する耐性に関与している。例えば、２型糖尿病は、年齢、肥満、インスリン耐性をもたらす殆ど体を動かさない生活に関連している。関連する病状は、患者を２型糖尿病に掛かりやすくさせ得るメタボリックシンドロームと呼ばれる。このシンドロームに関連する症状は、高血圧、脂質異常症、体脂肪沈着の増加および心疾患である。インスリン耐性をもたらすさらなる病状は、成熟卵子を製造できなくなる多嚢胞性卵巣症候群、アンドロゲン過剰および多毛症である。低血糖症（異常に低濃度の血中グルコース）も知られており、典型的にはインスリン過剰投与の結果として引き起こされる。
【０００４】
ＧＬＰ−１は、糖尿病の制御における治療剤として使用されている。しかしながら、天然のＧＬＰ−１に関する問題は、その小さい質量ゆえに、２−５分間という薬物動態的半減期で循環から非常に急速に除去されてしまうことである。これは、治療効果を達成するのに比較的大量のＧＬＰ−１を投与する必要があることを意味する。これにより、長時間作用型のＧＬＰ−１の開発およびＤＰＰ４阻害剤を使用するに至っている。前者のアプローチは、ＧＬＰ−１を含む融合タンパク質の製造に関与し、後者はＤＰＰ４インヒビターを利用するものであるが、これはインヒビターがＤＰＰ４を不活性化し、他のペプチドホルモンを変性して望ましくない副作用を引き起こすという点で、特異性欠如に問題がある。それゆえ、ＧＬＰ−１および関連分子の急速な消化及び／又は腎クリアランスの問題に取り組むことが望まれている。
【０００５】
上述したように、急速なＧＬＰ−１クリアランスを低減する従来のアプローチは、ＧＬＰ−１融合タンパク質の作成に関与する。例えば、ＷＯ２００７／０１６７６４号は、ＧＬＰ−１と、１型糖尿病における自己免疫反応を低減するための自己免疫サプレッサーとを含む融合タンパク質について開示している。ＥＰ１７２４２８４号は、イムノグロブリンのＦｃ部位もしくはアルブミンへのＧＬＰ−１の融合物を記載している。同様に、ＷＯ２００５／００８９２号は、ＧＬＰ−１アナログとＩｇＧ４のＦｃ部位とを含む融合タンパク質、並びに糖尿病、肥満および過敏性腸症候群の治療におけるこれらの使用を記載している。ＵＳ２００７／０１１１９４０号には、ＧＬＰ−１と、ＧＬＰ−１の安定性を改善する変性アミノ酸を含むペプチドキャリアとを含む共役体が開示されている。ＵＳ７７１６２７８号では、トランスフェリンへのＧＬＰ−１の融合物が、腎クリアランスを低減し、かつ、糖尿病及び関連する症状を治療するために使用されている。ＷＯ２００８／０６１３５５号では、キャリアータンパク質／ペプチドにＧＬＰ−１を融合させる代替案として、一定期間にわたって持続的にＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１のアナログを放出する埋め込み型ヒドロゲルデバイスが記載されている。
【発明の概要】
【０００６】
ここに、ＧＬＰ−１ペプチドまたはその機能的アナログを含む融合ポリペプチドを開示する。ある態様では、ＧＬＰ−１がＧＬＰ−１レセプターの細胞外ドメインに連結されている。別の態様では、不活性化ＤＤＰ４および任意に不活性ＡＤＡへのＧＬＰ−１の融合物を含む。
【０００７】
本発明の一態様によれば、ＧＬＰ−１の活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供するものであり、ここで前記ポリペプチドは、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに直接または間接的に連結されたＧＬＰ−１またはそのレセプター結合部位を含む。
【０００８】
本発明の一態様によれば、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに直接または間接的に連結されたＧＬＰ−１ペプチドまたはその機能的アナログのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドは、ＧＬＰ−１レセプターのＧＬＰ−１結合ドメインである。
【００１０】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドは、酵素的に不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼである。
【００１１】
本発明の好ましい態様では、前記不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼは、少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって変性され、ここで当該変性はＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼの活性部位に対するものである。
【００１２】
好ましくは、前記変性は、図３ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸残基６３０に対するものである。
【００１３】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図３ｂに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
【００１４】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、前記ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに本来的に結合するポリペプチドをさらに含み、当該ポリペプチドは酵素的に不活性なアデノシンデアミナーゼである。
【００１５】
本発明の好ましい態様では、前記不活性なアデノシンデアミナーゼは、少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって変性され、ここで当該変性は前記不活性なアデノシンデアミナーゼの活性部位に対するものである。
【００１６】
好ましくは、前記変性は、図４ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２９５及び／又は２９６に対するものである。
【００１７】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図４ｂに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
【００１８】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、アミノ酸配列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRを含むまたは当該アミノ酸配列からなるＧＬＰ−１ペプチド、もしくは前記アミノ酸配列とは少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換により相違する変性されたＧＬＰ−１ペプチドであって、未変性のＧＬＰ−１ペプチドと比較して強いＧＬＰ−１活性を保持または有するものを含む。
【００１９】
本発明の別の好ましい態様では、前記ＧＬＰ−１ペプチドはアミノ酸配列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR;または HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
を含む。
【００２０】
本発明の別の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドはアミノ酸配列：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS;または DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
を含む。
【００２１】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１が、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに、ペプチドリンカーによって連結されている。
【００２２】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１が、不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている。
【００２３】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１が、不活性なアデノシンデアミナーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている。
【００２４】
本発明のさらに好ましい態様では、融合不活性ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼが、不活性なアデノシンデアミナーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている。
【００２５】
好ましくは、前記ペプチドリンカーは柔軟なペプチドリンカーである。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む。
【００２７】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２コピーを含む。
【００２８】
本発明に係る融合ポリペプチドのポリペプチドドメインは、典型的に、ここに記載するペプチドリンカー、例えばＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーによって連結される。Ｇｌｙ４Ｓｅｒのコピー数は変化させることができる。例えば、ＤＰＰ４に対するＧＬＰ−１の融合では０〜１０コピーの間、好ましくは５〜７コピーの間で変化させることができる。ＡＤＡドメインに対するＤＤＰ４の融合でも、０〜１２コピーの間、好ましくは７または８コピーの間で変化させることができる。細胞外ドメインに対するＧＬＰ−１の融合でも、０〜８コピーの間、好ましくは２〜５コピーの間で変化させることができる。
【００２９】
本発明の別の好ましい態様では、ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに、単一のペプチド結合によって連結されている。
【００３０】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１が、不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている。
【００３１】
本発明の好ましい態様では、ＧＬＰ−１が、不活性なアデノシンデアミナーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、不活性ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼが、不活性なアデノシンデアミナーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている。
【００３３】
本発明の別の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、グリコシル化モチーフAsn-Xaa-SerまたはAsn-Xaa-Thr（ここでXはプロリンを除くいずれかのアミノ酸）の１つのコピーを含む、またはこれから構成される。
【００３４】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子は少なくとも５アミノ酸残基を含む。
【００３５】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカーは５〜５０アミノ酸残基を含む。
【００３６】
本発明のさらに好ましい態様では、前記ペプチドリンカーは５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸残基からなる。
【００３７】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、モチーフ（Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5）の少なくとも１つのコピーを含み、ここで前記モチーフはグリコシル化モチーフAsn-Xaa-SerまたはAsn-Xaa-Thrを含む。
【００３８】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、
Asn1-Xaa2-Ser3 Xaa4 Xaa5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Xaa1 Asn2-Xaa3-Ser4 Xaa5（ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Xaa1 Xaa2 Asn3-Xaa4-Ser5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Asn1-Xaa2-Thr3 Xaa4 Xaa5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Xaa1 Asn2-Xaa3-Thr4 Xaa5 （ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；および
Xaa1 Xaa2 Asn3-Xaa4-Thr5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）
からなる群から選択されるアミノ酸モチーフの少なくとも一つのコピーを含む。
【００３９】
好ましくは、前記ペプチドリンカー分子が、
Asn1-Xaa2-Ser3 Gly4 Ser5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Gly1 Asn2-Xaa3-Ser4 Ser5（ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Gly1 Gly2 Asn3-Xaa4-Ser5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Asn1-Xaa2-Thr3 Gly4 Ser5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Gly1 Asn2-Xaa3-Thr4 Ser5 （ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；および
Gly1 Gly2 Asn3-Xaa4-Thr5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）
からなる群から選択されるアミノ酸モチーフの少なくとも一つのコピーを含む。
【００４０】
本発明の別の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、
Asn1-Xaa2-Ser3 Ser4 Gly5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Ser1 Asn2-Xaa3-Ser4 Gly5（ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Ser1 Ser2 Asn3-Xaa4-Ser5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Asn1-Xaa2-Thr3 Ser4 Gly5 （ここでXaa2はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；
Ser1 Asn2-Xaa3-Thr4 Gly5 （ここでXaa3はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）；および
Ser1 Ser2 Asn3-Xaa4-Thr5 （ここでXaa4はプロリンを除くいずれかのアミノ酸）
からなる群から選択されるアミノ酸モチーフの少なくとも一つのコピーを含む。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、モチーフ（Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5）の少なくとも１つのコピーを含み、ここで前記モチーフはグリコシル化モチーフAsn-Xaa-SerまたはAsn-Xaa-Thrおよびモチーフ（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ）の少なくとも１つのコピーを含み、当該ペプチドリンカーは５〜５０アミノ酸である。
【００４２】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチドリンカー分子が、モチーフ（Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5）の少なくとも１つのコピーを含み、ここで前記モチーフはグリコシル化モチーフAsn-Xaa-SerまたはAsn-Xaa-Thrおよびモチーフ（Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ）のコピーを含み、当該ペプチドリンカーは５〜５０アミノ酸である。
【００４３】
本発明の好ましい態様では、前記融合ペプチドリンカーが、マンノース、ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミン、Ｎ-アセチルノイラミン酸、Ｎ-グリコリルノイラミン酸、Ｎ-アセチルガラクトサミン、フコース、グルコース、ラムノース、キシロース、または、糖類の組み合わせ、例えばオリゴ糖またはスカフォールド系(scaffolded system)におけるものからなる群から選択される少なくとも一つの糖の付加によって修飾される。
【００４４】
適切な炭水化物成分は、単糖、オリゴ糖、および多糖を含み、かつ、天然に存在する糖タンパク質または生体系に存在するいずれかの炭水化物成分を含む。例えば、任意に保護されたグリコシル又はグリコシド誘導体、例えば任意に保護されたグルコシル、グルコシド、ガラクトシル又はガラクトシド誘導体である。グリコシル及びグリコシド基はα及びβグループの両方を含む。適切な炭水化物成分は、グルコース、ガラクトース、フコース、GlcNAc、GalNAc、シアル酸およびマンノース、並びに、少なくとも一つのグルコース、ガラクトース、フコース、GlcNAc、GalNAc、シアル酸及び／又はマンノース残基を含むオリゴ糖または多糖を含む。
【００４５】
炭水化物成分のいずれかの官能基は、当該技術分野で公知の保護基を用いて任意に保護してもよい（例えば、Greeneら, "Protecting groups in organic synthesis", 2nd Edition, Wiley, New York, 1991を参照。この開示内容を参照としてここに含める）。炭水化物成分におけるいずれかの-OH基の適切な保護基は、アセタート（Ac）、ベンジル（Bn）、シリル（例えばtert-ブチルジメチルシリル（TBDMSi）およびtert-ブチルジフェニルシリル（TMDPSi））、アセタール、ケタール、およびメトキシメチル（MOM）を含む。いずれかの保護基は、ペプチドリンカーに対する炭水化物成分の連結の前または後に取り除いてもよい。
【００４６】
本発明の好ましい態様では、前記糖は保護されていない。
【００４７】
特に好ましい炭水化物成分は、Glc(Ac)4β-、Glc(Bn)4β-、Gal(Ac)4β-、Gal(Bn)4β-、Glc(Ac)4α(1,4)Glc(Ac)3α(1,4)Glc(Ac)4β-、β-Glc、β-Gal、-Et-β-Gal、-Et-β-Glc、Et-α-Glc、-Et-α-Man、-Et-Lac、-β-Glc(Ac)2、-β-Glc(Ac)3、-Et-α-Glc(Ac)2、-Et-α-Glc(Ac)3、-Et-α-Glc(Ac)4、-Et-β-Glc(Ac)2、-Et-β-Glc(Ac)3、-Et-β-Glc(Ac)4、-Et-α-Man(Ac)3、-Et-α-Man(Ac)4、-Et-β-Gal(Ac)3、-Et-β-Gal(Ac)4、-Et-Lac(Ac)5、-Et-Lac(Ac)6、-Et-Lac(Ac)7、およびこれらの脱保護された同等物を含む。
【００４８】
好ましくは、天然に生じる糖から誘導される炭水化物成分を構成するいずれかのサッカリドユニットは、天然に生じる鏡像異性体であり、D型（例えばD-グルコースまたはD-ガラクトース）もしくはL型（例えば、L-ラムノースまたはL-フコース）であってもよい。いずれかのアノマー結合がα-またはβ-結合であってもよい。
【００４９】
本発明のさらに別の態様では、前記融合ポリペプチドは、
i)図５ｂに示される核酸配列；
ii)図５ｄに示される核酸配列；
iii)図５ｆに示される核酸配列；
iv)図６ｂに示される核酸配列；
v)図６ｄに示される核酸配列；
vi)図６ｆに示される核酸配列；
vii)図７ｂに示される核酸配列；
viii)図７ｄに示される核酸配列；
ix)図７ｆに示される核酸配列；
x)図８ｂに示される核酸配列；
xi)図８ｄに示される核酸配列；
xii)図８ｆに示される核酸配列；
xiii)図９ｂに示される核酸配列；
xiv)図９ｄに示される核酸配列；
xv)図９ｆに示される核酸配列；
xvi)図１０ｂに示される核酸配列；
xvii)図１０ｄに示される核酸配列；
xviii)図１０ｆに示される核酸配列；
xix)図１１ｂに示される核酸配列；
xx)図１１ｄに示される核酸配列；
xxi)図１１ｆに示される核酸配列；
xxii)図１２ｂに示される核酸配列；
xxiii)図１２ｄに示される核酸配列；
xxiv)図１２ｆに示される核酸配列；
からなる群から選択される核酸分子、もしくは
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で図５ｂ−１２ｆに示されている核酸配列にハイブリダイズし、ＧＬＰ−１レセプター調節活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子、
によってコードされる。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、前記核酸分子は、アゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする。
【００５１】
ＧＬＰ−１アゴニストから利益を受ける、高血糖症をもたらす多くの病状が存在しており、その最もよく知られているものは糖尿病である。糖尿病には１型と２型があり得る。１型糖尿病は、膵臓β細胞の破壊をもたらす自己免疫疾患であり、これは患者がインスリンを製造できないことを意味する。２型糖尿病は、より複雑な病状であって、関連する多くの病気に由来し得るが、一般にはインスリンの代謝作用に対する耐性に関与している。例えば、２型糖尿病は、年齢、肥満、インスリン耐性をもたらす殆ど体を動かさない生活に関連している。関連する病状は、患者を２型糖尿病に掛かりやすくさせ得るメタボリックシンドロームと呼ばれる。このシンドロームに関連する症状は、高血圧、脂質異常症、体脂肪沈着の増加および心疾患である。
【００５２】
本発明の別の好ましい態様では、前記核酸分子がアンタゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする。
【００５３】
低血糖症（異常に低濃度の血中グルコース）も知られており、典型的にはインスリン過剰投与の結果として引き起こされる。これは、ＧＬＰ−１アンタゴニストの投与から利益を受ける。低血糖状態をもたらす過剰なインスリン分泌を生じる疾患も存在する。例えば、インスリノーマはインスリンの過剰生産をもたらす膵臓β細胞の癌である。ＧＬＰ−１拮抗作用から利益を受けうる別の例は、インスリン過剰症、拒食症および１型糖尿病における制御グルカゴン分泌を含む。
【００５４】
核酸分子のハイブリダイゼーションは、二つの相補的核酸分子が互いに一定量の水素結合をしたときに生じる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸を取り巻く周囲条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、および使用する核酸分子の組成及び長さによって変化しうる。特定のストリンジェンシーを達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する算定は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); およびTijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology?Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York, 1993)に記載されている。Ｔｍは、核酸分子の所定の鎖の５０％がその相補鎖にハイブリダイズする温度である。以下は、ハイブリダイゼーション条件の例示的セットであり、これらに限定されるものではない。
【００５５】
非常に高いストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を有する配列をハイブリダイズさせる）
ハイブリダイゼーション： ５×ＳＳＣ、６５℃で１６時間
洗浄２回： ２×ＳＳＣ、それぞれ室温（ＲＴ）で１５分間
洗浄２回： ０．５×ＳＳＣ、それぞれ６５℃で２０分間
【００５６】
高いストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を有する配列をハイブリダイズさせる）
ハイブリダイゼーション： ５×−６×ＳＳＣ、６５℃−７０℃で１６−２０時間
洗浄２回： ２×ＳＳＣ、それぞれＲＴで５−２０分間
洗浄２回： １×ＳＳＣ、それぞれ５５℃−７０℃で３０分間
【００５７】
低いストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を有する配列をハイブリダイズさせる）
ハイブリダイゼーション： ６×ＳＳＣ、ＲＴから５５℃で１６−２０時間
洗浄２回： ２×ＳＳＣ、それぞれＲＴで５−２０分間
洗浄少なくとも２回： ２×−３×ＳＳＣ、それぞれＲＴから５５℃で２０−３０分間
【００５８】
本発明のさらなる態様では、本発明にかかる核酸分子によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５９】
本発明のさらなる態様では、図５ａ、５ｃ、５ｅ、６ａ、６ｃ、６ｅ、７ａ、７ｃ、７ｅ、８ａ、８ｃ、８ｅ、９ａ、９ｃ、９ｅ、１０ａ、１０ｃ、１０ｅ、１１ａ、１１ｃ、１１ｅ、１２ａ、１２ｃ、１２ｅ、１３ａ、１３ｃ、１３ｅ、１４ａ、１４ｃ、１４ｅ、１５ａ、１５ｃ、１５ｅ、１６ａ、１６ｃ、１６ｅ、１７ａ、１７ｃ、１７ｅ、１８ａ、１８ｃ、１８ｅ、１９ａ、１９ｃ、１９ｅ、２０ａ、２０ｃまたは２０ｅからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００６０】
本発明のさらなる態様では、本発明にかかる二つのポリペプチドからなるホモダイマーを提供する。
【００６１】
本発明のさらなる態様では、本発明にかかるポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００６２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る核酸分子を含むベクターを提供する。
【００６３】
本発明の好ましい態様では、前記ベクターは、本発明に係る核酸分子を発現するのに適合した発現ベクターである。
【００６４】
本発明に係る核酸を含むベクターは、特にそのベクターが安定なトランスフェクションのために組み換え用細胞のゲノムに核酸を導入するために使用される場合には、プロモーターまたは他の制御配列を含む必要はない。好ましくは、ベクター内の核酸は、宿主細胞において、適切なプロモーターまたは転写用の他の調節エレメントに機能的に連結される。ベクターは、多様なホストで機能するバイファンクショナル発現ベクターであってもよい。“プロモーター”は、転写開始部位より上流のヌクレオチド配列を意味し、転写に必要な全ての制御領域を含む。適切なプロモーターは、真核細胞または原核細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導、発生的（developmental）プロモーターなどを含む。“機能的に連結”とは、転写がプロモーターから開始されるのに適切な位置および方向で、同じ核酸分子の一部として組み込まれていることを意味する。プロモーターに機能的に連結したＤＮＡは、プロモーターの“転写開始調節下”にある。
【００６５】
好ましい態様では、プロモーターは、構成的、誘導または調節可能プロモーターである。
【００６６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る核酸分子またはベクターでトランスフェクトまたは形質転換された細胞を提供する。
【００６７】
好ましくは、前記細胞は真核細胞である。あるいは、前記細胞は原核細胞である。
【００６８】
本発明の好ましい態様では、前記細胞は、真菌細胞（例えば、ピチア属（Pichia spp）、サッカロミセス属（Saccharomyces spp）、アカパンカビ属（Neurospora spp））；昆虫細胞（例えば、スポドプテラ属）；哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）；植物細胞からなる群から選択される。
【００６９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係るポリペプチドを含み、賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００７０】
本発明の好ましい態様では、前記医薬組成物はさらなる治療剤と組み合わせられる。
【００７１】
投与の際に、本発明の医薬組成物は薬学的に許容可能な調製物で投与される。このような調製物は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合する担体、および任意に他の治療剤をごく普通に含んでもよい。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、注射を含むあらゆる通常の経路で投与することができる。投与及び適用は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、関節内、皮下、局所、皮膚（例えば、皮膚または粘膜へのクリーム脂溶性挿入物）、経皮または鼻腔内投与とすることができる。
【００７３】
本発明の医薬組成物は有効量で投与される。“有効量”とは、単独で、もしくはさらなる投与または相乗的薬剤と共同で、所望の応答を生じる薬剤／組成物の量である。これは、より好ましくは疾患の進行を永久に停止することを含むが、疾患の進行を一時的に遅延させるだけのものを含んでも良い。これは通常の方法でモニタでき、また、診断方法に従ってモニタすることもできる。
【００７４】
患者に投与される医薬組成物の投与量は、種々のパラメータに従って、特に、使用される投与方式および患者の状態（すなわち年齢および性別）に従って選択することができる。投与の際に、本発明の医薬組成物は薬学的に許容可能な量および薬学的に許容可能な組成物で適用される。薬剤に使用する場合、塩は薬学的に許容可能なものであるが、薬学的に許容できない塩であってもその薬学的に許容可能な塩を調製するために都合よく使用できることから、本発明の範囲から除外されるものではない。このような薬理学的および薬学的に許容可能な塩は、限定されるものではないが、以下の酸：塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸等から調製されたものを含む。また、薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩として調製できる。
【００７５】
医薬組成物は、所望であれば、薬学的に許容可能な担体と組み合わせてもよい。ここで使用する用語“薬学的に許容可能な担体”とは、ヒトへの投与に適した一以上の適合する固体または液体フィラー、希釈剤、封入剤を意味する。用語“担体”とは、天然または合成の有機または無機成分を指し、これと活性成分とを合わせることにより適用が容易となる。医薬組成物の各成分も、所望の薬学的効能を実質的に損なう相互作用が無いような方法で、本発明の分子と互いに混合することができる。
【００７６】
医薬組成物は、塩の状態の酢酸、塩の状態のクエン酸、塩の状態のホウ酸、および塩の状態のリン酸を含む適切な緩衝剤を含んでも良い。
【００７７】
医薬組成物は、任意に、適切な防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン類、およびチメロサールを含んでもよい。
【００７８】
医薬組成物は、通常は単位投与量形態で提供することができ、薬学分野で周知のいずれかの方法で調製できる。全ての方法が、活性剤を、一以上の補助成分を構成する担体と合わせる工程を含む。一般に、組成物は、活性化合物を均一かつ密接に液状担体、細かく砕いた固形状担体、またはその両方と合わせ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって製造される。
【００７９】
非経口投与に適した組成物は、通常は、好ましくは受容者の血液と等張の無菌水性または非水性調製物を含む。この調製物は、適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いた公知の方法に従って製造してもよい。無菌の注射用調製物は、例えば１，３−ブタンジオール溶液のような、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒における無菌の注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用できる許容可能な溶媒は、水、リンガー溶液および生理食塩液である。さらに、無菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体として通常用いられる。このために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含むあらゆる無菌性の固定油を使用できる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を注射剤の調製に使用してもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適した担体製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.から入手可能である。
【００８０】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む、高血糖症を患っているヒト患者を治療する方法を提供する。
【００８１】
本発明の好ましい方法では、前記ポリペプチドは静脈内に投与される。
【００８２】
本発明の別の好ましい方法では、前記ポリペプチドが皮下投与される。
【００８３】
本発明のさらに好ましい方法では、前記ポリペプチドが二日おきに投与され、好ましくは前記ポリペプチドが一週間おき、二週間おき、または一ヶ月おきに投与される。
【００８４】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症状が糖尿病である。
【００８５】
本発明の好ましい方法では、糖尿病が１型である。
【００８６】
本発明の好ましい方法では、糖尿病が２型である。
【００８７】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がインスリン耐性の結果である。
【００８８】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がメタボリックシンドロームの結果である。
【００８９】
本発明の態様によれば、糖尿病を治療する医薬を製造するための本発明に係るポリペプチドの使用を提供する。
【００９０】
本発明の好ましい態様では、糖尿病が１型である。
【００９１】
本発明の好ましい態様では、糖尿病が２型である。
【００９２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係るポリペプチドまたはダイマーに結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００９３】
好ましくは、前記モノクローナル抗体は、前記ポリペプチドまたはダイマーに結合するが、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１レセプター単独には特異的に結合しない抗体である。
【００９４】
モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むダイマーのいずれかによって提示される構造的抗原（conformational antigen）に結合する。
【００９５】
本発明のさらなる態様では、以下の工程：
ｉ）少なくとも一つの本発明に係るポリペプチドを含む免疫原で免疫応答性の哺乳動物を免疫化する；
ｉｉ）免疫化した免疫応答性の哺乳動物のリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する；
ｉｉｉ）（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性について、工程（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって製造されたモノクローナル抗体をスクリーニングする、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して、増殖及び／又は前記モノクローナル抗体を分泌させる、および
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収する
を含む、本発明に係るモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。
【００９６】
好ましくは、前記免疫応答性の哺乳動物はマウスである。あるいは、前記免疫応答性の哺乳動物はラットである。
【００９７】
ハイブリドーマ細胞を用いたモノクローナル抗体の製造は、当該分野において周知である。モノクローナル抗体を製造するために使用される方法は、KohlerおよびMilstein, Nature 256, 495-497 (1975)、並びにDonillardおよびHoffman, "Basic Facts about Hybridomas", Compendium of Immunology V.II版. Schwartz, 1981に開示されており、これらを参照として取り込む。
【００９８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る方法によって得られたまたは得られるハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００９９】
本発明のさらなる態様によれば、以下の工程：
ｉ）試験すべき単離されたサンプルを提供する、
ｉｉ）前記サンプルを本発明に係るポリペプチドに結合するリガンドと接触させる、および
ｉｉｉ）前記サンプルにおける前記リガンドの結合を検出する
を含む、生物学的サンプル中の本発明に係るポリペプチドを検出するための診断試験を提供する。
【０１００】
本発明の好ましい態様では、前記リガンドは抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１０１】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、用語“含む(comprise)”および“含む(contain)”およびこれらの用語の変形、例えば“含む(comprising)”および“含む(comprises)”は、“包含するが限定されない(including but not limited to)”ことを意味し、別の部分、添加物、成分、整数または工程を排除することを意図しない（並びに排除しない）。
【０１０２】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、必要がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されるところでは、本明細書は、必要がない限り、単数形も複数形も意図すると解する。
【０１０３】
本発明の特定の態様、実施態様または実施例に関連して記載された特性、整数、特徴、化合物、化学的部分または基は、不適切でなければ、ここに記載された他の態様、実施態様または実施例に適用可能であるものと理解する。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１ａはヒトＧＬＰ−１およびヒトＧＬＰ−１前駆体の核酸配列及びアミノ酸配列である；図１ｂはエキセンディン４前駆体のアミノ酸配列である；図１ｃはＧＬＰ−１のアミノ酸配列（７−３７）である；図１ｄはＧＬＰ−１のアミノ酸配列（７−３６）である；図１ｅはエキセンディン４のアミノ酸配列である；図１ｆはエキセンディン４のアミノ酸配列（９−３９）である。
【図２】図２ａはヒトＧＬＰ−１レセプターの全長アミノ酸配列である；図２ｂはＧＬＰ−１細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
【図３】図３ａはヒトＤＰＰ４のアミノ酸配列である；図３ｂは不活性ＤＰＰ４のアミノ酸配列である。
【図４】図４ａはヒトＡＤＡのアミノ酸配列である；図４ｂは不活性ＡＤＡのアミノ酸配列である。
【図５ｉ】図５ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｂは核酸配列である；図５ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｄは核酸配列である；図５ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｆは核酸配列である。
【図５ｉｉ】図５ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｂは核酸配列である；図５ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｄは核酸配列である；図５ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図５ｆは核酸配列である。
【図６ｉ】図６ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｂは核酸配列である；図６ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｄは核酸配列である；図６ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｆは核酸配列である。
【図６ｉｉ】図６ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｂは核酸配列である；図６ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｄは核酸配列である；図６ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｆは核酸配列である。
【図６ｉｉｉ】図６ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｂは核酸配列である；図６ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｄは核酸配列である；図６ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図６ｆは核酸配列である。
【図７ｉ】図７ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｂは核酸配列である；図７ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｄは核酸配列である；図７ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｆは核酸配列である。
【図７ｉｉ】図７ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｂは核酸配列である；図７ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｄは核酸配列である；図７ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｆは核酸配列である。
【図７ｉｉｉ】図７ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｂは核酸配列である；図７ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｄは核酸配列である；図７ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｆは核酸配列である。
【図７ｉｖ】図７ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｂは核酸配列である；図７ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｄは核酸配列である；図７ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図７ｆは核酸配列である。
【図８ｉ】図８ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｂは核酸配列である；図８ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｄは核酸配列である；図８ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｆは核酸配列である。
【図８ｉｉ】図８ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｂは核酸配列である；図８ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｄは核酸配列である；図８ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｆは核酸配列である。
【図８ｉｉｉ】図８ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｂは核酸配列である；図８ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｄは核酸配列である；図８ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｆは核酸配列である。
【図８ｉｖ】図８ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｂは核酸配列である；図８ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ、Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｄは核酸配列である；図８ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）７−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図８ｆは核酸配列である。
【図９ｉ】図９ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｂは核酸配列である；図９ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｄは核酸配列である；図９ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｆは核酸配列である。
【図９ｉｉ】図９ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｂは核酸配列である；図９ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｄは核酸配列である；図９ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図９ｆは核酸配列である。
【図１０ｉ】図１０ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｂは核酸配列である；図１０ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｄは核酸配列である；図１０ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｆは核酸配列である。
【図１０ｉｉ】図１０ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｂは核酸配列である；図１０ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｄは核酸配列である；図１０ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｆは核酸配列である。
【図１０ｉｉｉ】図１０ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｂは核酸配列である；図１０ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｄは核酸配列である；図１０ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１０ｆは核酸配列である。
【図１１ｉ】図１１ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｂは核酸配列である；図１１ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｄは核酸配列である；図１１ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｆは核酸配列である。
【図１１ｉｉ】図１１ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｂは核酸配列である；図１１ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｄは核酸配列である；図１１ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｆは核酸配列である。
【図１１ｉｉｉ】図１１ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｂは核酸配列である；図１１ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｄは核酸配列である；図１１ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｆは核酸配列である。
【図１１ｉｖ】図１１ａはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｂは核酸配列である；図１１ｃはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｄは核酸配列である；図１１ｅはＨＧＨｓｓ−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）７−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１１ｆは核酸配列である。
【図１２ｉ】図１２ａはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｂは核酸配列である；図１２ｃはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｄは核酸配列である；図１２ｅはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｆは核酸配列である。
【図１２ｉｉ】図１２ａはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｂは核酸配列である；図１２ｃはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｄは核酸配列である；図１２ｅはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｆは核酸配列である。
【図１２ｉｉｉ】図１２ａはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｂは核酸配列である；図１２ｃはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｄは核酸配列である；図１２ｅはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｆは核酸配列である。
【図１２ｉｖ】図１２ａはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｂは核酸配列である；図１２ｃはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｄは核酸配列である；図１２ｅはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｆは核酸配列である。
【図１２ｖ】図１２ａはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｂは核酸配列である；図１２ｃはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＬＶＰＲ−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｄは核酸配列である；図１２ｅはＨＧＨｓｓ−ＡＤＡ Ｄ２９５Ｅ，Ｄ２９６Ａ）−（Ｇ４Ｓ）８−ＤＰＰ４（３９−７６６；Ｓ６３０Ａ）−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列であり、図１２ｆは核酸配列である。
【図１３】図１３ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１３ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１３ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；これらはいずれもグリコシル化し得るペプチドリンカーを含んでいる。
【図１４】図１４ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１の全長アミノ酸配列である；図１４ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１４ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である。
【図１５】図１５ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１５ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１５ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；これらはいずれもグリコシル化し得るペプチドリンカーを含んでいる。
【図１６】図１６ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１の全長アミノ酸配列である；図１６ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１６ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である。
【図１７】図１７ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１７ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１７ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；これらはいずれもグリコシル化し得るペプチドリンカーを含んでいる。
【図１８】図１８ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１の全長アミノ酸配列である；図１８ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１８ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である。
【図１９】図１９ａはＩＬ４ｓｓ−ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１９ｃはＩＬ４ｓｓ−エキセンディン−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図１９ｅはＩＬ４ｓｓ−Ｅｘ４（９−３９）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；これらはいずれもグリコシル化し得るペプチドリンカーを含んでいる。
【図２０】図２０ａはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−ＬＶＰＲ−ＧＬＰ１の全長アミノ酸配列である；図２０ｃはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）２−エキセンディン融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である；図２０ｅはＧＬＰ１Ｒｓｓ−ＧＬＰ１Ｒ（２４−１４５）−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＥＰＤ−Ｅｘ４（９−３９）アンタゴニスト融合ポリペプチドの全長アミノ酸配列である。
【図２１】図２１ａはＩＬ４シグナル配列の核酸配列であり、図２１ｂはアミノ酸配列である。
【図２２】ａ）ＰＣＲを用いて、適切な制限部位（プライマーＲ１−４に含まれる）を隣接させた目的の遺伝子からなるＤＮＡを生成した。ｂ）このＰＣＲ産物を、リンカー領域の各端で適切なベクターに結合させた。ｃ）この構成物を、不要な配列（すなわち、本来のものでない制限酵素認識部位）を含まない的確なリンカーを導入するように変性した。
【図２３】ａ）オリゴヌクレオチドを、特有のオーバーラップを備えた部分的二本鎖領域を形成するように設計し、アニールおよびプロセッシングした際に、リガンド及びレセプターにアニールする隣接領域を備えたリンカーをコードするものとした。ｂ）“メガプライマー”および末端プライマー（Ｒ１およびＲ２）を用いてＰＣＲを行い、ＬＲ−融合遺伝子を製造した。Ｒ１およびＲ２プライマーは、ターゲットベクターへの結合に使用可能な隣接制限酵素認識部位を取り込むように設計した。
【図２４】図２４はＧＬＰ１ＬＲ融合タンパク質ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＬＰ１Ｒ［２４−１４５］である１０Ａ１の発現を示す免疫ブロットである。
【図２５】図２５はＧＬＰ１／ＤＰＰ４／ＡＤＡ融合タンパク質ＧＬＰ１−（Ｇ４Ｓ）５−ＤＰＰ４［３９−７６６；Ｓ６３０Ａ］−（Ｇ４Ｓ）８−ＡＤＡ［Ｄ２９５Ｅ；Ｄ２９６Ａ）である１０Ｇ１の発現を示す免疫ブロットである。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
本発明の実施態様を、実施例を用いて、図面を参照しながら記載する。
【０１０６】
材料と方法
免疫学的試験
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対するインスリンの結合を調べる免疫測定法は、当該分野において知られている。商業的に入手可能なインスリン抗体がサンプル中のインスリンを検出するために利用でき、競争阻害試験における使用にも利用できる。例えば、モノクローナル抗体は、http://www.ab-direct.com/index AbD Serotecで購入することができる。
【０１０７】
融合タンパク質の組み換え生成
融合タンパク質の構成成分を、リガンドまたはレセプターにアニールし、かつ、ターゲットベクターへのクローニングに適した制限酵素認識部位を導入するように設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって生成した（図１４ａ）。ＰＣＲのテンプレートはターゲット遺伝子を含んでおり、ＩＭＡＧＥクローン、ｃＤＮＡライブラリーまたはカスタム合成遺伝子から得た。適切な隣接する制限酵素認識部位を有するリガンドおよびレセプター遺伝子を合成したら、これらをターゲットベクターにおいてリンカー領域の両端に結合させた（図１４ｂ）。この構築物を、リンカー領域の両端の二つの特有の制限酵素認識部位間にカスタム合成した長さのＤＮＡを挿入するか、ｓｓＤＮＡ変性技術によってリンカー領域を変異させるか、適切な制限酵素認識部位間にプライマーデュプレックス／マルチプレックス（primer duplex/multiplex）を挿入するか、またはＰＣＲ変性によって、隣接する制限酵素認識部位のない適正なリンカーを含むように変性させた（図１４ｃ）。
【０１０８】
あるいは、最適なリガンド又はレセプタードメインにアニールするように設計された隣接する配列を有するリンカーを、オリゴヌクレオチド二本鎖を生成することによって最初に合成し、これを処理して二本鎖ＤＮＡを生成した（図１５ａ）。次いで“メガプライマー”としてのリンカー配列、この“メガプライマー”がアニールするリガンドおよびレセプターの反対端に対向して設計されたプライマー、およびテンプレートとしてのリガンドおよびレセプターを用いて、ＰＣＲを行った。末端プライマーは、最適な発現ベクターへの結合に適した制限酵素認識部位を用いて設計した（図１５ｂ）。
【０１０９】
融合タンパク質の発現および精製
適切な系（例えば哺乳動物ＣＨＯ細胞、E.coli）で発現を行った。これは、インスリン融合遺伝子が生成されるベクターに依存する。次いで、当該分野で周知のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡの一以上を含んでもよい種々の方法を用いて発現を分析した。適切なレベルの発現を達成したら、インスリン融合物をより大きいスケールで発現し、精製および次の分析に十分なタンパク質を製造する。イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫安沈殿法、ゲル濾過、サイズ排除および／またはアフィニティークロマトグラフィー（ニッケル／コバルト樹脂、抗体固定化樹脂および／またはリガンド／レセプター固定化樹脂を使用）のような一以上のクロマトグラフ法の適切な組み合わせを用いて精製を行った。精製したタンパク質を、ブラッドフォード分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡを含む種々の方法を用いて分析した。
【０１１０】
融合ポリペプチドは、ポリペプチドの製造中にプロセッシングされるシグナル配列を含む。シグナル配列が、使用される特定の発現系に適した種々の起源から選択できること（例えば細菌性、哺乳動物性）は、当業者にとって明らかであろう。非限定的な例では、哺乳動物細胞における発現には、ＩＬ４および成長ホルモンのシグナル配列を使用する。細菌での発現では、適切なペリプラズムシグナル配列を選択する。
【０１１１】
ＧＬＰ−１融合タンパク質の特性評価
変性ＰＡＧＥ、ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロッティングを用いて、融合ポリペプチドを分析し、かつ、インスリン融合物に対して構造的に敏感でない抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ネイティブの溶液状態分子量情報は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ Ｇ２００分析カラムおよび分析超遠心を使用したサイズ排除クロマトグラフィーのような技術から得ることができる。
【０１１２】
統計
二つのグループを、分散が正規分布であればスチューデント検定を用いて比較し、正規分布でなければスチューデント−サタースワイト検定（Student-Satterthwaite's test）を用いて比較した。分布はＦ検定でテストした。一元ANOVA(One-way ANOVA)を用いて３以上のグループの平均を比較し、有意水準がｐ＜０．０５であれば、個々の比較をダネット検定を用いて行った。全ての統計的検定が両側５％の有意水準であり、欠測値にデータの補完は行わなかった。
【０１１３】
ＧＬＰ−１ ＬＲ融合体の発現：ＣＨＯ ＦｌｐIｎ細胞における一過性発現からの１０Ａ１および１０Ｇ１のウェスタンブロッティング
ＧＬＰ１ ＬＲ融合ポリペプチド１０Ａ１
５０μｌのサンプルを濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した；図２４（レーン１）。５０μｌのコントロール培地（トランスフェクション無し）も濃縮し、並行して流した（レーン２）。マーカーは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０および１５ｋＤａである。免疫ブロットをマウス抗ＧＬＰ抗体（Santa Cruz Inc.; Cat#: sc80604; 希釈=1:200）および抗マウスＨＲＰ抗体（Abcam.; 希釈=1:2500）を用いて行った。１０Ａ１の推定される分子量は１９ｋＤａである。
【０１１４】
ＧＬＰ１／ＤＰＰ４／ＡＤＡ融合ポリペプチド１０Ｇ１
５０μｌのサンプルを濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した；図２５（レーン２）。５０μｌのコントロール培地（トランスフェクション無し）も濃縮し、並行して流した（レーン１）。マーカーは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０および１５ｋＤａである。免疫ブロットをマウス抗ＧＬＰ抗体（Santa Cruz Inc.; Cat#: sc80604; 希釈=1:200）および抗マウスＨＲＰ抗体（Abcam.; 希釈=1:2500）を用いて行った。１０Ｇ１の推定される分子量は１３３ｋＤａである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドがＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに直接または間接的に連結されたＧＬＰ−１またはそのレセプター結合部位を含む、核酸分子。
【請求項２】
ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに直接または間接的に連結されたＧＬＰ−１ペプチドまたはその機能的アナログのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項３】
ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドがＧＬＰ−１レセプターのＧＬＰ−１結合ドメインである、請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドが酵素的に不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼである、請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼが、少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって変性され、ここで当該変性はＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼの活性部位に対するものである、請求項４記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記変性が、図３ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸残基６３０に対するものである、請求項５記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記融合ポリペプチドは、図３ｂに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる、請求項４または５記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記融合ポリペプチドは、前記ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに本来的に結合するポリペプチドをさらに含み、当該ポリペプチドは酵素的に不活性なアデノシンデアミナーゼである、請求項４ないし７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記不活性なアデノシンデアミナーゼは、少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって変性され、ここで当該変性は前記アデノシンデアミナーゼの活性部位に対するものである、請求項８記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記変性は、図４ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２９５及び／又は２９６に対するものである、請求項８または９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドは、図４ｂに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる、請求項８または９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記融合ポリペプチドは、アミノ酸配列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRを含むまたは当該アミノ酸配列からなるＧＬＰ−１ペプチド、もしくは前記アミノ酸配列とは少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換により相違する変性されたＧＬＰ−１ペプチドであって、未変性のＧＬＰ−１ペプチドと比較して強いＧＬＰ−１活性を保持または有するものを含む、請求項２ないし１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＧＬＰ−１ペプチドはアミノ酸配列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR;または HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
を含む、請求項１２記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記融合ポリペプチドはアミノ酸配列：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS;または DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
を含む、請求項１２記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
ＧＬＰ−１が、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項２ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
ＧＬＰ−１が、不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項４ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
ＧＬＰ−１が、不活性なアデノシンデアミナーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項８ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記不活性ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼが、不活性なアデノシンデアミナーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項８ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドリンカーが柔軟なペプチドリンカーである、請求項１５ないし１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む、請求項１９記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２コピーを含む、請求項２０記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに、単一のペプチド結合によって連結されている、請求項２ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
ＧＬＰ−１が、不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている、請求項４ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
ＧＬＰ−１が、不活性なアデノシンデアミナーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている、請求項８ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
不活性ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼが、不活性なアデノシンデアミナーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている、請求項８ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記ペプチドリンカー分子が、グリコシル化モチーフAsn-Xaa-SerまたはAsn-Xaa-Thr（ここでXはプロリンを除くいずれかのアミノ酸）の１つのコピーを含む、またはこれから構成される、請求項１５ないし２１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
i)図５ｂに示される核酸配列；
ii)図５ｄに示される核酸配列；
iii)図５ｆに示される核酸配列；
iv)図６ｂに示される核酸配列；
v)図６ｄに示される核酸配列；
vi)図６ｆに示される核酸配列；
vii)図７ｂに示される核酸配列；
viii)図７ｄに示される核酸配列；
ix)図７ｆに示される核酸配列；
x)図８ｂに示される核酸配列；
xi)図８ｄに示される核酸配列；
xii)図８ｆに示される核酸配列；
xiii)図９ｂに示される核酸配列；
xiv)図９ｄに示される核酸配列；
xv)図９ｆに示される核酸配列；
xvi)図１０ｂに示される核酸配列；
xvii)図１０ｄに示される核酸配列；
xviii)図１０ｆに示される核酸配列；
xix)図１１ｂに示される核酸配列；
xx)図１１ｄに示される核酸配列；
xxi)図１１ｆに示される核酸配列；
xxii)図１２ｂに示される核酸配列；
xxiii)図１２ｄに示される核酸配列；
xxiv)図１２ｆに示される核酸配列；
からなる群から選択される核酸分子、もしくは
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で図５ｂ−１２ｆに示されている核酸配列にハイブリダイズし、ＧＬＰ−１レセプター調節活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２８】
アゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする、請求項２７記載の核酸分子。
【請求項２９】
アンタゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする、請求項２７記載の核酸分子。
【請求項３０】
請求項２７ないし２９のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項３１】
図５ａ、５ｃ、５ｅ、６ａ、６ｃ、６ｅ、７ａ、７ｃ、７ｅ、８ａ、８ｃ、８ｅ、９ａ、９ｃ、９ｅ、１０ａ、１０ｃ、１０ｅ、１１ａ、１１ｃ、１１ｅ、１２ａ、１２ｃ、１２ｅ、１３ａ、１３ｃ、１３ｅ、１４ａ、１４ｃ、１４ｅ、１５ａ、１５ｃ、１５ｅ、１６ａ、１６ｃ、１６ｅ、１７ａ、１７ｃ、１７ｅ、１８ａ、１８ｃ、１８ｅ、１９ａ、１９ｃ、１９ｅ、２０ａ、２０ｃまたは２０ｅからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３２】
請求項２ないし２６、３０または３１のいずれか一項に記載の二つの融合ポリペプチドからなるホモダイマー。
【請求項３３】
請求項１または請求項２７ないし２９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３４】
請求項１、２７ないし２９、または３３のいずれか一項に記載のベクターまたは核酸分子で形質転換またはトランスフェクトした単離された細胞。
【請求項３５】
前記細胞は真核細胞である、請求項３４記載の細胞。
【請求項３６】
前記細胞は原核細胞である、請求項３４記載の細胞。
【請求項３７】
請求項２ないし２６、３０または３１のいずれか一項に記載のポリペプチドを含み、賦形剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項３８】
さらなる治療剤と組み合わせられる、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
請求項２記載の少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む高血糖症を患っているヒト患者を治療する方法。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが静脈内に投与される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが皮下投与される、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが二日おきに投与される、請求項３９ないし４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが一週間おきに投与される、請求項３９ないし４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが二週間おきに投与される、請求項３９ないし４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが一ヶ月おきに投与される、請求項３９ないし４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記高血糖症が糖尿病である、請求項３９ないし４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
糖尿病が１型である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
糖尿病が２型である、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
前記高血糖症がインスリン耐性の結果である、請求項３９ないし４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記高血糖症がメタボリックシンドロームの結果である、請求項３９ないし４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
糖尿病の治療における請求項２記載のポリペプチドの使用。
【請求項５２】
糖尿病が１型である、請求項５１記載の使用。
【請求項５３】
糖尿病が２型である、請求項５１記載の使用。
【請求項１】
ＧＬＰ−１活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドがＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに直接または間接的に連結されたＧＬＰ−１またはそのレセプター結合部位を含む、核酸分子。
【請求項２】
ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに直接または間接的に連結されたＧＬＰ−１ペプチドまたはその機能的アナログのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項３】
ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドがＧＬＰ−１レセプターのＧＬＰ−１結合ドメインである、請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドが酵素的に不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼである、請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼが、少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって変性され、ここで当該変性はＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼの活性部位に対するものである、請求項４記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記変性が、図３ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸残基６３０に対するものである、請求項５記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記融合ポリペプチドは、図３ｂに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる、請求項４または５記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記融合ポリペプチドは、前記ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに本来的に結合するポリペプチドをさらに含み、当該ポリペプチドは酵素的に不活性なアデノシンデアミナーゼである、請求項４ないし７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記不活性なアデノシンデアミナーゼは、少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって変性され、ここで当該変性は前記アデノシンデアミナーゼの活性部位に対するものである、請求項８記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記変性は、図４ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸残基２９５及び／又は２９６に対するものである、請求項８または９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドは、図４ｂに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる、請求項８または９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記融合ポリペプチドは、アミノ酸配列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRを含むまたは当該アミノ酸配列からなるＧＬＰ−１ペプチド、もしくは前記アミノ酸配列とは少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換により相違する変性されたＧＬＰ−１ペプチドであって、未変性のＧＬＰ−１ペプチドと比較して強いＧＬＰ−１活性を保持または有するものを含む、請求項２ないし１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＧＬＰ−１ペプチドはアミノ酸配列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR;または HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
を含む、請求項１２記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記融合ポリペプチドはアミノ酸配列：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS;または DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
を含む、請求項１２記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
ＧＬＰ−１が、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項２ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
ＧＬＰ−１が、不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項４ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
ＧＬＰ−１が、不活性なアデノシンデアミナーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項８ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記不活性ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼが、不活性なアデノシンデアミナーゼに、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項８ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドリンカーが柔軟なペプチドリンカーである、請求項１５ないし１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む、請求項１９記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２コピーを含む、請求項２０記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１に本来的に結合するポリペプチドに、単一のペプチド結合によって連結されている、請求項２ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
ＧＬＰ−１が、不活性なＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている、請求項４ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
ＧＬＰ−１が、不活性なアデノシンデアミナーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている、請求項８ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
不活性ＧＬＰ−１ジペプチジルペプチダーゼが、不活性なアデノシンデアミナーゼに、単一のペプチド結合によって連結されている、請求項８ないし１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記ペプチドリンカー分子が、グリコシル化モチーフAsn-Xaa-SerまたはAsn-Xaa-Thr（ここでXはプロリンを除くいずれかのアミノ酸）の１つのコピーを含む、またはこれから構成される、請求項１５ないし２１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
i)図５ｂに示される核酸配列；
ii)図５ｄに示される核酸配列；
iii)図５ｆに示される核酸配列；
iv)図６ｂに示される核酸配列；
v)図６ｄに示される核酸配列；
vi)図６ｆに示される核酸配列；
vii)図７ｂに示される核酸配列；
viii)図７ｄに示される核酸配列；
ix)図７ｆに示される核酸配列；
x)図８ｂに示される核酸配列；
xi)図８ｄに示される核酸配列；
xii)図８ｆに示される核酸配列；
xiii)図９ｂに示される核酸配列；
xiv)図９ｄに示される核酸配列；
xv)図９ｆに示される核酸配列；
xvi)図１０ｂに示される核酸配列；
xvii)図１０ｄに示される核酸配列；
xviii)図１０ｆに示される核酸配列；
xix)図１１ｂに示される核酸配列；
xx)図１１ｄに示される核酸配列；
xxi)図１１ｆに示される核酸配列；
xxii)図１２ｂに示される核酸配列；
xxiii)図１２ｄに示される核酸配列；
xxiv)図１２ｆに示される核酸配列；
からなる群から選択される核酸分子、もしくは
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で図５ｂ−１２ｆに示されている核酸配列にハイブリダイズし、ＧＬＰ−１レセプター調節活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２８】
アゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする、請求項２７記載の核酸分子。
【請求項２９】
アンタゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする、請求項２７記載の核酸分子。
【請求項３０】
請求項２７ないし２９のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項３１】
図５ａ、５ｃ、５ｅ、６ａ、６ｃ、６ｅ、７ａ、７ｃ、７ｅ、８ａ、８ｃ、８ｅ、９ａ、９ｃ、９ｅ、１０ａ、１０ｃ、１０ｅ、１１ａ、１１ｃ、１１ｅ、１２ａ、１２ｃ、１２ｅ、１３ａ、１３ｃ、１３ｅ、１４ａ、１４ｃ、１４ｅ、１５ａ、１５ｃ、１５ｅ、１６ａ、１６ｃ、１６ｅ、１７ａ、１７ｃ、１７ｅ、１８ａ、１８ｃ、１８ｅ、１９ａ、１９ｃ、１９ｅ、２０ａ、２０ｃまたは２０ｅからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３２】
請求項２ないし２６、３０または３１のいずれか一項に記載の二つの融合ポリペプチドからなるホモダイマー。
【請求項３３】
請求項１または請求項２７ないし２９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３４】
請求項１、２７ないし２９、または３３のいずれか一項に記載のベクターまたは核酸分子で形質転換またはトランスフェクトした単離された細胞。
【請求項３５】
前記細胞は真核細胞である、請求項３４記載の細胞。
【請求項３６】
前記細胞は原核細胞である、請求項３４記載の細胞。
【請求項３７】
請求項２ないし２６、３０または３１のいずれか一項に記載のポリペプチドを含み、賦形剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項３８】
さらなる治療剤と組み合わせられる、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
請求項２記載の少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む高血糖症を患っているヒト患者を治療する方法。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが静脈内に投与される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが皮下投与される、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが二日おきに投与される、請求項３９ないし４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが一週間おきに投与される、請求項３９ないし４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが二週間おきに投与される、請求項３９ないし４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが一ヶ月おきに投与される、請求項３９ないし４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記高血糖症が糖尿病である、請求項３９ないし４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
糖尿病が１型である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
糖尿病が２型である、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
前記高血糖症がインスリン耐性の結果である、請求項３９ないし４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記高血糖症がメタボリックシンドロームの結果である、請求項３９ないし４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
糖尿病の治療における請求項２記載のポリペプチドの使用。
【請求項５２】
糖尿病が１型である、請求項５１記載の使用。
【請求項５３】
糖尿病が２型である、請求項５１記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ｉ】
【図５ｉｉ】
【図６ｉ】
【図６ｉｉ】
【図６ｉｉｉ】
【図７ｉ】
【図７ｉｉ】
【図７ｉｉｉ】
【図７ｉｖ】
【図８ｉ】
【図８ｉｉ】
【図８ｉｉｉ】
【図８ｉｖ】
【図９ｉ】
【図９ｉｉ】
【図１０ｉ】
【図１０ｉｉ】
【図１０ｉｉｉ】
【図１１ｉ】
【図１１ｉｉ】
【図１１ｉｉｉ】
【図１１ｉｖ】
【図１２ｉ】
【図１２ｉｉ】
【図１２ｉｉｉ】
【図１２ｉｖ】
【図１２ｖ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ｉ】
【図５ｉｉ】
【図６ｉ】
【図６ｉｉ】
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【図７ｉ】
【図７ｉｉ】
【図７ｉｉｉ】
【図７ｉｖ】
【図８ｉ】
【図８ｉｉ】
【図８ｉｉｉ】
【図８ｉｖ】
【図９ｉ】
【図９ｉｉ】
【図１０ｉ】
【図１０ｉｉ】
【図１０ｉｉｉ】
【図１１ｉ】
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【図１１ｉｉｉ】
【図１１ｉｖ】
【図１２ｉ】
【図１２ｉｉ】
【図１２ｉｉｉ】
【図１２ｉｖ】
【図１２ｖ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公表番号】特表２０１２−５０００１７（Ｐ２０１２−５０００１７Ａ）
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２３４４４（Ｐ２０１１−５２３４４４）
【出願日】平成２１年８月１８日（２００９．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２００６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２０７６７
【国際公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（５０２４５２９７８）アステリオン・リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１８日（２００９．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２００６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２０７６７
【国際公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（５０２４５２９７８）アステリオン・リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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