ＨＩＦ−１αと水素結合代替ヘリックスを有するｐ３００／ＣＢＰの間の相互作用の阻害
本発明は、１種または複数種の安定な内部拘束αヘリックスを有し、かつＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインの少なくとも一部模倣した配列を含むペプチドに関する。これらのペプチドを含有する医薬組成物、ならびにこれらのペプチドを用いて、例えば遺伝子転写を低減させる、またＨＩＦ−１αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用によって仲介される障害を治療または予防する、また組織における脈管形成を低減または防止する、またアポトーシスを誘発する、また細胞の生存および／または増殖を低下させる、またＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の潜在的なリガンドを同定する方法も開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書中に援用される２００８年９月１８日出願の米国仮特許出願第６１／０９８，１９３号に関する利益の享受を請求する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、合衆国国立衛生研究所によって与えられる認可番号ＧＭ０７３９４３の下で政府の支援によって行われた。本発明において政府は一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ＶＥＧＦ転写の調節におけるＨＩＦ−１α−コアクチベーター相互作用の役割
コアクチベータータンパク質ｐ３００（または相同ＣＲＥＢ結合タンパク質、ＣＢＰ）のシステイン−ヒスチジンに富む１ドメイン（「ＣＨ１」）と、低酸素誘導因子１α（「ＨＩＦ−１α」）のＣ−末端トランス活性化ドメイン（「Ｃ−ＴＡＤ」、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ００１５２１のアミノ酸７８６番〜８２６番）との間の相互作用（Freedman et al., “Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1α”,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002)、Dames et al., “Structural Basis for HIF-1α/CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response”, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002)）は、低酸素誘導遺伝子のトランス活性化を仲介する（Hirota & Semenza, “Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1”,Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006)、Semenza, “Targeting HIF-1 for Cancer Therapy”, Nat. Rev. Cancer 3:721-32 (2003)）。図１Ａ〜Ｃに示すように低酸素誘導遺伝子は、脈管形成および癌転移における重要な原因である（Orourke et al., “Identification of Hypoxically Inducible mRNAs in HeLa Cells Using Differential-display PCR”, Eu. J Biochem. 241:403-10 (1996)、Ivan et al., “HIFα Targeted for VHL-mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for O2 Sensing”, Science 292:464-8 (2001)）。酸素正常状態（normoxia）下では、ＨＩＦ−１のα−サブユニットは、図２に示すように、プロリン水酸化酵素によってプロリン残基４０２番および５６４番において連続的にヒドロキシル化され、ユビキチン化され、次いでユビキチン−プロテアソーム（proteosome）系によって分解される。フォンヒッペル・リンドウ癌抑制タンパク質（Kaelin, “Molecular basis of the VHL Hereditary Cancer Syndrome”, Nat. Rev. Cancer 2:673-82 (2002)）が仲介するこの過程は、ＨＩＦ−１αのレベル、およびその結果としての低酸素に対する転写応答を制御する役割を担っている（Maxwell et al., “The Tumour Suppressor Protein VHL Targets Hypoxia-inducible Factors for Oxygen-dependent Proteolysis”, Nature 399:271-5 (1999)）。低酸素条件下ではＨＩＦ−１αは、もはや破壊には向けられず、蓄積する。その連続的に発現される結合パートナーであるアリール炭化水素受容体核内輸送体（「ＡＲＮＴ」）によるヘテロ二量体化（Wood et al., “The Role of the Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) in Hypoxic Induction of Gene Expression”, J Biol. Chem. 271:15117-23 (1996)）は、コグネイト低酸素応答エレメント（「ＨＲＥ」）との結合を引き起こす（Forsythe et al., “Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1”, Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996)）。アスパラギン８０３番に対する調節ヒドロキシル化の第三部位もまた、図２に示すように、これら低酸素条件下で阻害され（Lando et al., “FIH-I is an Asparaginyl Hydroxylase Enzyme That Regulates the Transcriptional Activity of Hypoxia-inducible Factor”, Genes & Develop 16:1466-71 (2002)）、低酸素誘導遺伝子の過剰発現の引き金となるｐ３００／ＣＢＰコアクチベーターの動員を可能にする。これらのなかには、血管内皮細胞成長因子（「ＶＥＧＦ」）およびＶＥＧＦ受容体であるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）などの脈管形成ペプチド、ならびにグルコース輸送体ＧＬＵＴ１とＧＬＵＴ３およびヘキソキナーゼ１と２などのエネルギー代謝の変化に関与するタンパク質をコードする遺伝子がある（Forsythe et al., “Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1”, Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996)、Okino et.el., “Hypoxia-inducible Mammalian Gene Expression Analyzed in Vivo at a TATA-driven Promoter and at an Initiator-driven Promoter”, J Biol. Chem. 273:23837-43 (1998)）。
【０００４】
低酸素誘導転写の調節因子としてのエピジチオジケトピペラジン真菌代謝産物
ＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤと転写コアクチベーターｐ３００／ＣＢＰの相互作用は、転写応答の顕著な増幅に関わる重要な点であるので、設計されたタンパク質リガンドによるその破壊は、癌における好気性の解糖および脈管形成（すなわち新血管の形成）を抑制する効果的な手段である可能性がある（Hirota & Semenza, “Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1”, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006)、Ramanathan et al., “Perturbational Profiling of a Cell-line Model of Tumorigenesis by Using Metabolic Measurements”, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 102:5992-7 (2005)、Underiner et al., “Development of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR）Kinase Inhibitors as Anti-angiogenic Agents in Cancer Therapy”, Curr. Med. Chem. 11:73145 (2004)）。ＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤとｐ３００／ＣＢＰの接触面は広い（３３９３Å２）が、このタンパク質−タンパク質相互作用の阻害は直接的干渉を必要としない場合もある。その代わりに、結合パートナー（ｐ３００／ＣＢＰ）の一方への構造変化の誘発は、その複合体を壊すのに十分であり得る（Kung et al., “Small Molecule Blockage of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway”, Cancer Cell 6:33-43 (2004)）。
【０００５】
低分子による核のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害は困難なことがこれまでに分かっていた（Arkin & Wells, “Small-molecule Inhibitors of Protein-Protein Interactions: Progressing Towards the Dream”, Nat. Rev. Drug Discov. 3:301-17 (2004)）が、高親和性タンパク質リガンドに対する最近の検討は、幾つかの注目すべき業績をもたらした（Kung et al., “Small Molecule Blockage of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway”, Cancer Cell 6:33-43 (2004)、Issaeva et al., “Small Molecule RITA Binds to p53, Blocks p53-HDM-2 Interaction and Activates p53 Function in Tumors”, Nat. Med. 10:1321-8 (2004)、Lepourcelet et al., “Small-molecule Antagonists of the Oncogenic Tcf/β-Catenin Protein Complex”, Cancer Cell 5:91-102 (2004)、Vassilev et al., “In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2”, Science 303:844-8 (2004)、Grasberger et al., “Discovery and Cocrystal Structure of Benzodiazepinedione HDM2 Antagonists That Activate p53 in Cells”, J Med. Chem. 48:909-12 (2005)、Ding et al., “Structure-based Design of Potent Non-peptide MDM2 Inhibitors”, J Am. Chem. Soc. 127:10130-1 (2005)、Berg et al., “Small-molecule Antagonists of Myc/Max Dimerization Inhibit Myc-induced Transformation of Chicken Embryo Fibroblasts” Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 99:3830-5 (2002)、De Munari et al.,の国際公開第２００６／０６６７７５号パンフレット）。２種類の低分子、カエトシン（chaetocin）（1）（Hauser et al., “Isolation and Structure Elucidation of Chaetocin”, Helv. Chirn. Acta 53 (5):1061-73 (1970)）（図３Ａに示す）およびケトミン（2）（Waksman & Bugie, “Chaetomin, a New Antibiotic Substance Produced by Chaetomium Cochliodes I. Formation and Properties”, J. Bacteriol. 48:527-30 (1944)）（図３Ｂに示す）が、ＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤとｐ３００／ＣＢＰの間の相互作用を阻害すること、および低酸素誘導転写を弱めることが示されているが、この阻害の正確な機構は不明なままである（Kung et al., “Small Molecule Blockage of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway”, Cancer Cell 6:33-43 (2004)）。初期の有望な報告にもかかわらず、（１）および（２）の両方とも実験動物において凝固性壊死、貧血、および白血球増加を誘発しているので、ＨＩＦ−１経路の阻害剤のさらなる設計が必要である。副作用のないまたは減少させたＨＩＦ−１経路の他の阻害剤を同定することが望ましいであろう。
【０００６】
本発明は、当分野におけるこれらのまた他の欠点の克服を目的とする。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において本発明は、１種または複数種の安定なαヘリックス構造を有し、低酸素誘導因子１αのＣ末端トランス活性化ドメインのヘリックスαＡまたはヘリックスαＢを模倣した配列を含むペプチドを提供する。一実施形態では、このペプチドは、式Ｉ
【化１】
のペプチドである。
式中、
【化２】
は、炭素−炭素単結合または二重結合であり、ここで、炭素−炭素二重結合はｃｉｓまたはｔｒａｎｓであり、
各ｎは、独立して１または２であり、
ｍは、０または任意の正の整数であり、
Ｒ１は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ４、−ＣＨ２ＮＨ２、アルキル基、アリール基、または水素であり、ここで、Ｒ４はアルキルまたはアリールであり、あるいはＲ１は、式
【化３】
（式中、Ａ５は、ペプチド、アミノ酸残基、アシル基、または水素であり、
各Ｒ５は、独立してアミノ酸側鎖、水素、アルキル、またはアリール基である）
を有し、
Ｒ２は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基であり、
Ｒ３は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ７）２、アルキル基、アリール基、または水素であり、ここで、Ｒ６は、アルキル基またはアリール基であり、各Ｒ７は、独立してアミノ酸側鎖、水素、アルキル基、またはアリール基であり、
Ａ１、Ａ２、およびＡ４は、それぞれ独立して、
【化４】
（式中、各Ｒ８は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）であり、
Ａ３は、
【化５】
（式中、各Ｒ９は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）である。
請求項２に記載されているペプチドにおいて、
（ｉ）Ａ１はＴｈｒであり、Ａ２はＳｅｒまたはＡｌａであり、Ａ３はＴｙｒまたはＡｌａであり、Ａ４は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７を含み、ここで、Ｘ１はＡｓｐまたはＡｓｎであり、Ｘ２はＶａｌ、Ｃｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ３はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ４はＶａｌまたはＴｙｒであり、Ｘ５はＡｓｎまたはＡｒｇであり、Ｘ６はＡｌａであり、Ｘ７はＡｒｇまたは不在であり、あるいは
（ｉｉ）Ａ１およびＡ２は、独立してＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ａ３はＬｅｕであり、Ａ４は、式ＬＲＸ８ＬＸ９を含み、ここで、ＬはＬｅｕであり、ＲはＡｒｇであり、Ｘ８はＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ９はＡｓｐまたはＡｓｎである。
【０００８】
別の実施形態では、このペプチドは、
【化６】
（式中、ｍおよびｎは独立して１または２であり、Ｘは水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）からなる群から選択される。
【０００９】
一実施形態では、ｍおよびｎが１である。別の実施形態では、ｍが１、ｎが２である。別の実施形態では、ｍが２、ｎが１である。さらに別の実施形態では、ｍおよびｎの両方が２である。
【００１０】
幾つかの実施形態では、本発明のペプチドは、低酸素誘導因子１αのＣ末端トランス活性化ドメインの少なくとも残基７９６番〜８０４番または残基８１６番〜８２３番を模倣している。
【００１１】
別の態様において本発明はまた、本発明のペプチドおよび薬学的に許容できるビヒクルを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
さらに別の態様において本発明は、低酸素誘導因子１αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用によって仲介される細胞における遺伝子の転写を低減させる方法を提供する。上記方法は、細胞を、遺伝子の転写を低減させるのに効果的な条件下で請求項１に記載のペプチドと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、その遺伝子は、アデニル酸キナーゼ３、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、エノラーゼ１、グルコース輸送体１、グルコース輸送体３、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、インスリン様増殖因子２、ＩＧＦ結合タンパク質１、ＩＧＦ結合タンパク質３、乳酸脱水素酵素Ａ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１、ピルビン酸キナーゼＭ、ｐ２１、トランスフォーミング増殖因子β３、セルロプラスミン、エリスロポエチン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、α１Ｂ−アドレナリン受容体、アドレノメデュリン、エンドセリン−１、ヘムオキシゲナーゼ１、一酸化窒素シンターゼ２、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、脈管内皮増殖因子、脈管内皮増殖因子受容体ＦＬＴ−１、脈管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、およびｐ３５ｓｒｇからなる群から選択される。
【００１３】
また、治療または予防が必要な被験体において、低酸素誘導因子１αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用によって仲介される障害を治療または予防する方法を提供する。この方法は、その障害を治療または予防するのに効果的な条件下で本発明のペプチドを被験体に投与することを含む。幾つかの実施形態では、この障害は、網膜虚血、肺高血圧症、子宮内発育遅延、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、および癌からなる群から選択される。
【００１４】
別の態様において本発明は、組織における脈管形成の低減または防止方法に関する。この方法は、組織を、その組織における脈管形成を低減または防止するのに効果的な条件下で本発明のペプチドと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。他の実施形態では、この組織は腫瘍である。
【００１５】
本発明はさらに、細胞におけるアポトーシスの誘発方法を提供する。この方法は、細胞を、その細胞のアポトーシスを誘発するのに効果的な条件下で本発明のペプチドと接触させることを含む。本発明はまた、細胞の生存および／または増殖を低下させる方法を提供する。この方法は、細胞を、その細胞の生存および／または増殖を低下させるのに効果的な条件下で本発明のペプチドと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、この細胞は、癌性であるか、または癌細胞を含有する組織の内皮脈管構造内に含まれる。別の態様において本発明は、ＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の潜在的なリガンドの同定方法に関する。この方法は、本発明のペプチドを提供すること、そのペプチドを被検物質と接触させること、およびこの被検物質がそのペプチドと選択的に結合するかどうかを検出することを含み、そのペプチドと選択的に結合する被検物質を、ＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の潜在的なリガンドとして同定する。
【００１６】
参照による援用
本明細書中で述べるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、および特許出願が、具体的かつ個々に示されて参照により援用されることが示されているかのように参照により本明細書中に援用される。
【００１７】
本発明の新規な特徴は、詳細には別添の特許請求の範囲により記述される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用した例示的実施形態および添付図面について述べる下記の詳細な説明を参照することによって得られるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（図１Ａ）低酸素誘導因子１α（「ＨＩＦ−１α」）のＣ末端トランス活性化ドメイン（「Ｃ−ＴＡＤ」）と、コアクチベータータンパク質ｐ３００（または相同ＣＲＥＢ結合タンパク質、ＣＢＰ）のシステイン−ヒスチジンに富む１ドメイン（「ＣＨ１」）との複合体の構造を示す図である（Lepourcelet et al., “Small-molecule Antagonists of the Oncogenic Tcf/β-Catenin Protein Complex”, Cancer Cell 5:91-102 (2004)、Vassilev et al., “In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2”, Science 303:844-8 (2004)）。 （図１Ｂ）塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス領域（「ｂＨＬＨ」）、ＰＡＳ、およびＮ末端トランス活性化ドメイン（「Ｎ−ＴＡＤ」）およびＣ−ＴＡＤを示すＨＩＦ−１αのドメインマップを示す図である。 （図１Ｃ）ヒトＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤ配列（配列番号１）を、αＡおよびαＢヘリックスの位置と共に示す図である。
【図２】ＨＩＦ−１α経路を示す図である。ＡＲＮＴはアリール炭化水素受容体核移行因子（receptor nuclear translocator)を表し、ＶＨＬはフォンヒッペル・リンドウ腫瘍抑制タンパク質を表し、ＨＲＥは低酸素応答エレメントを表し、ＶＥＧＦは脈管内皮増殖因子を表す。
【図３】(図３Ａ）カエトシン（chetocin）（１）（ケトミウム・グロボーサム（Chaetomium globosum）から単離される）の構造を示す図である。 (図３Ｂ）ケトミン（２）（ケトミウム・コディオデス（Chaetomium codiodes）から単離される）の構造を示す略図である。
【図４】Ｎ末端ｉとｉ＋４水素結合（Ｃ＝Ｏ−−Ｈ−Ｎ）を共有結合（Ｃ＝Ｘ−Ｙ−Ｎ）で置き換えることによる短鎖αヘリックスの核形成を示す略図である。これらの水素結合代替（hydrogen bond surrogate-based)（「ＨＢＳ」）αヘリックスは、閉環メタセシス反応（ring-closing metathesis reaction)（「ＲＣＭ」）から誘導される炭素−炭素結合を含有する。
【図５】（図５Ａ）ＨＢＳαヘリックスの構造を示す図である。ＨＢＳαヘリックスのＮＭＲから得られる構造を示す図である。 （図５Ｂ）ＨＢＳαヘリックスの構造を示す図である。精巧な分子モデルを用いたＨＢＳαヘリックスのＸ線結晶解析から得られる１．１Å分解能電子密度マップを示す図である。 （図５Ｃ）ＨＢＳαヘリックスの構造を示す図である。結晶解析データから得られるＨＢＳαヘリックスの分子モデルを示す図である。細い線は推定上のｉとｉ＋４の水素結合を表す。
【図６Ａ】ＨＢＳヘリックス(２２）に関し、ＨＢＳヘリックス（２２）の化学構造を表す図である。
【図６Ｂ】ＨＢＳヘリックス(２２）に関し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のＨＢＳヘリックス（２２）および対照ペプチド（２５）の円二色性スペクトルを示す図である。
【図７】リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した様々なペプチドによるＶＥＧＦ遺伝子レベルの時間に依存した阻害のグラフである。
【図８】細胞培養液の培地のみ（「対照」）、０．１％培地（「ビヒクル」）、ケトミン（２）、ＨＢＳヘリックス（２２）、または対照の直鎖ペプチド（２５）で処理した培養液の細胞密度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のαヘリックス化合物の設計
一態様において本発明は、ＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤとｐ３００／ＣＢＰ ＣＨ１ドメインとの相互作用を調節する水素結合代替（「ＨＢＳ」）αヘリックスに関する。
【００２０】
１５個未満のアミノ酸残基からなるペプチドはタンパク質環境から摘出された生理的条件では一般にαヘリックス構造を形成せず、αヘリックス立体配座を取るには人為的な制約を必要とする。ＨＩＦ−１αは、それぞれ８個のアミノ酸残基からなる２つの短鎖αヘリックス領域を特色とする。図４に示すように、短鎖ペプチド配列から安定なヘリックス構造を再生可能な方法で生成するという目的で、水素結合代替（「ＨＢＳ」）から得られるαヘリックスでＨＩＦ−１α／コアクチベーター界面を標的にした（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc.128:9248-56 (2006)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。ヘリックス模倣体（helix mimetics）の設計のための他の手法が文献に記載されているが、それらの方法は、立体配座を安定化するために「二重の安全対策（belts and braces)」を必要とすることが多い。立体配座を固定させるために側鎖官能性は使用されないので、このＨＢＳ手法により、分子認識に利用できるあらゆる面に関してαヘリックスの合成が独特に可能となる。
【００２１】
ＨＢＳヘリックス設計手法はヘリックス−コイル転移理論が中心であり、当該理論は、３個の連続的なアミノ酸を螺旋配向とする強く要求される組織化によって、短鎖αヘリックスの安定性を本質的に限定することを示唆する（Lifson & Roig, “On the Theory of Helix-Coil Transitions in Polypeptides”, J. Chem. Phys. 34:1963-74 (1961)、Zimm & Bragg, “Theory of the Phase Transition Between Helix and Random Coil in Polypeptide Chains”, J. Chem. Phys. 31:526-35 (1959)、本明細書によりそれらの全体が参照により援用される）。この理論によれば、１０個以下のアミノ酸からなるαヘリックスは、核形成の可能性が低いために本質的に不安定であると予想される。このＨＢＳ手法は、固有の核形成障壁を克服し、ヘリックス形成を開始させるために、予め組織化したαターンを与える。αヘリックスでは、図４に示すように、ｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏとｉ＋４番目のアミノ酸残基のＮＨの間の水素結合がヘリックス構造を安定化し、核を形成する。Ｃ＝Ｏ−−Ｈ−Ｎ水素結合をできるだけ近似に模倣し、αターンを予め組織化するために、Ｃ＝Ｘ−Ｙ−Ｎ型（ここでＸおよびＹは、それぞれｉおよびｉ＋４残基の一部である）の共有結合が利用される。この方法は、任意の構造的に拘束されたαヘリックスを調製するために広く応用できると期待される。これらと同様の方法も、構造的に拘束されたαヘリックスを調製するために使用することができる。
【００２２】
一実施形態では、ｉ残基とｉ＋４残基の間の共有結合が、閉環メタセシス反応から得られる炭素−炭素結合である（Chapman et al., “A Highly Stable Short α-Helix Constrained by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 126:12252-3 (2004)、Dimartino et al., “Solid-phase Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate-derived α-Helices”, Org. Lett. 7:2389-92 (2005)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）。
【００２３】
ＮＭＲから得られるＨＢＳαヘリックスの溶液構造および高分解結晶構造は、図５に示すように、この手法の潜在能力を明白に例示している（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”,J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)、Liu et al., “Atomic Structure of a Short Alpha-helix Stabilized by a Main Chain Hydrogen Bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 130:4334-7 (2008)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）。このＨＢＳ手法の２つの特徴、すなわち（１）溶媒に曝される表面を保護することなしにαヘリックスの設計を可能にし、それによって分子認識のための側鎖を保存する、架橋部の内部配置と、（２）１０個未満のアミノ酸残基を有するきわめて短いペプチドを拘束して非常に安定なαヘリックスとする能力は、それをアロステリック転写調節因子の設計にとって特に魅力あるものにする（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)、Wang et al., “Nucleation and Stability of Hydrogen-bond Surrogate-based α-Helices”, Org. Biomol. Chem. 4:4074-81 (2006)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）。
【００２４】
本発明の第一の態様は、１種または複数種の安定な内部拘束（internally-constrained)αヘリックスを有するペプチドに関する。このペプチドは、ＨＩＦ−１αヘリックスドメインの一部を模倣した配列を含む。一実施形態では、このＨＩＦ−１αヘリックスドメインは、ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインのヘリックスαＡまたはヘリックスαＢである。例えばこのペプチドは、ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインの少なくとも残基７９６番〜８０４番または残基８１６番〜８２３番を模倣している。
【００２５】
本発明の好適なペプチドには、式Ｉ
【化７】
のペプチドが含まれる。
式中、
【化８】
は、炭素−炭素単結合または二重結合であり、ここで、炭素−炭素二重結合はｃｉｓまたはｔｒａｎｓであり、各ｎは、独立して１または２であり、ｍは、０または任意の正の整数である。例えばｍは、３〜１６または３〜４０の任意の整数であることができる。Ｒ１は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ４、−ＣＨ２ＮＨ２、アルキル基、アリール基、または水素であることができ、ここで、Ｒ４はアルキルまたはアリールである。あるいはＲ１は、式
【化９】
部分である。
式中、Ａ５は、アミノ酸残基、アシル基、または水素であり、各Ｒ５は、独立して、アミノ酸側鎖、水素、アルキル、またはアリール基である。Ｒ２は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基であることができる。Ｒ３は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ７）２、アルキル基、アリール基、または水素であり、ここで、Ｒ６は、アルキル基またはアリール基であり、各Ｒ７は、独立して、アミノ酸側鎖、水素、アルキル基、またはアリール基である。Ａ１、Ａ２、およびＡ４は、それぞれ独立して、
【化１０】
（式中、各Ｒ８は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）であり、Ａ３は、
【化１１】
（式中、各Ｒ９は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）である。
【００２６】
本発明の実施において有用なアミノ酸には、天然または非天然のアミノ酸、二置換アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、および他のアミノ酸が挙げられ、また本明細書中で言及される残基には、そのようなアミノ酸から得られる残基が含まれる。一実施形態では、式Ｉなどの本発明の化合物中で言及されるアミノ酸側鎖は天然のアミノ酸側鎖である。
【００２７】
本明細書中で使用される「アルキル基」は、直鎖または分枝鎖アルキル基である。アルキルの定義の範囲内にはヘテロアルキル基も含まれ、ヘテロ原子は、窒素、酸素、リン、イオウ、およびケイ素であることができる。アルキル基には、これらに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、およびブチルが含まれる。アルキル基には、例えばＣ１〜Ｃ６アルキルが含まれる。
【００２８】
本明細書中で使用される「アシル基」には、メタノイル、エタノイル、プロパノイル、ベンゾイル、およびプロペノイルなどの直鎖または分枝鎖アシル基が含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用される「アリール基」には、芳香族アリール環、例えばフェニル、ピリジン、フラン、チオフェン、ピロール、インドール、およびプリンなどのヘテロ芳香族環、ならびに窒素、酸素、イオウ、またはリンを有するヘテロ環が含まれる。
【００３０】
アルキル、アシル、およびアリール基の定義には、置換されたアルキル、アシル、およびアリール基が含まれる。好適な置換基には、これらに限定されないが、ハロゲン、アミン、ヒドロキシル基、カルボン酸、ニトロ基、カルボニル、および他のアルキル、アシル、およびアリール基が含まれる。
【００３１】
ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインのヘリックスαＡを模倣したペプチドには、これらに限定されないが、式Ｉのものが含まれ、ここで、Ａ１はＴｈｒであり、Ａ２はＳｅｒまたはＡｌａであり、Ａ３はＴｙｒまたはＡｌａであり、Ａ４は式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７を含み、ここで、Ｘ１はＡｓｐまたはＡｓｎであり、Ｘ２はＶａｌ、Ｃｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ３はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ４はＶａｌまたはＴｙｒであり、Ｘ５はＡｓｎまたはＡｒｇであり、Ｘ６はＡｌａであり、Ｘ７はＡｒｇまたは不在である。当業者に理解されるように、Ａ４は、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号２）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号４）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号６）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号８）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号９）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号１０）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１１）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号１２）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１３）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号１４）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１５）、Ａｓｎ−ＡｌａＧｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号１６）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１７）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号１８）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１９）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号２０）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号２１）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号２２）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号２３）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号２４）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号２５）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号２６）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号２７）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号２８）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号２９）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号３０）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３１）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号３２）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３３）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号３４）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３５）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号３６）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３７）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号３８）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３９）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号４０）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号４１）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号４２）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号４３）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号４４）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号４５）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号４６）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号４７）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号４８）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号４９）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号５０）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５１）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号５２）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５３）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号５４）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５５）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号５６）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５７）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号５８）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５９）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号６０）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号６１）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号６２）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号６３）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号６４）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号６５）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号６６）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号６７）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号６８）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号６９）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号７０）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７１）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号７２）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７３、）Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号７４）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７５）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号７６）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７７）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号７８）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７９）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号８０）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号８１）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号８２）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号８３）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号８４）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号８５）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号８６）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号８７）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号８８）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号８９）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号９０）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号９１）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号９２）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号９３）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号９４）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号９５）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号９６）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号９７）の群から選択することができる。ペプチドの実例には、
【化１２】
が含まれる。
【００３２】
上記のペプチドにおいて、ｍおよびｎは独立して１または２である。例えば、ｍおよびｎのそれぞれが１であることができる。あるいは、ｍが１であり、ｎが２である。別の実施形態では、ｍが２であり、ｎが１である。さらに別の実施形態では、ｍおよびｎの両方が２である。
【００３３】
一般に、本発明の好適なペプチドには、式
【化１３】
を含むものが含まれる。
式中、
【化１４】
は、炭素−炭素単結合または二重結合であり、
【化１５】
は、単結合であり、
【化１６】
は、二重結合の場合にはｃｉｓまたはｔｒａｎｓであり、
各ｎは、独立して１または２であり、ｍは、任意の整数であり、
Ｒ１は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ４、−ＣＨ２ＮＨ２、アルキル基、アリール基、水素、または式
【化１７】
（式中、Ａ５は、ペプチド、アミノ酸残基、アシル基、または水素であり、各Ｒ５は、独立して、アミノ酸側鎖、水素、アルキル、またはアリール基である）を有する基であり、
Ｒ２は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基であり、
ＡＡ１およびＡＡ２は、独立して、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基であり、またＡ４は、式Ｉについて上記で定義したものと同様である。
【００３４】
一実施形態では、Ｒ１は水素である。別の実施形態では、Ｒ１は、
【化１８】
（式中、Ａ５はペプチド結合により結合したペプチドである）である。
【００３５】
一実施形態では、
【化１９】
によって表される結合は単結合である。別の実施形態では、
【化２０】
によって表される結合は二重結合である。
【００３６】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して、高度に安定化された内部拘束αヘリックスを有するペプチドを調製することができる。拘束は、Ｎ末端だけでなく、ペプチド内のどこにでも配置することができる。例えば、本発明の方法により調製される化合物は、式
【化２１】
を有することができる。
【００３７】
上記の式において、各Ｒは、独立して、任意のアミノ酸側鎖である。
【００３８】
本発明の方法により生成されるペプチドは、例えばアミノ酸残基５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５個未満、または１０個未満であることができる。一実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸の長さ５０個未満である。
【００３９】
本発明のＨＢＳαヘリックスは、例えば、図２に示すように、Ｎ末端主鎖ｉとｉ＋４の水素結合を、閉環メタセシス反応により炭素−炭素結合と置き換えることによって調製することができる（Arora et al.の米国特許第７，２０２，３３２号、Chapman & Arora, “Optimized Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate Helices: Surprising Effects of Microwave Heating on the Activity of Grubbs Catalysts”, Org. Lett. 8:5825-8 (2006)、Chapman et al., “A Highly Stable Short α-Helix Constrained by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 126:12252-3 (2004)、Dimartino et al., “Solid-phase Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate-derived α-Helices”, Org. Lett. 7:2389-92 (2005)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）。水素結合代替により、αターンは予め組織化され、αヘリックス立体配座におけるペプチド配列が安定化する。ＨＢＳαヘリックスは、安定なαヘリックス立体配座を様々な短鎖ペプチド配列から採ることが示されている（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。これらの人為的（artificial）αヘリックスは、それらの予想されるタンパク質受容体を高い親和性で標的にすることができることも示されている（Wang et al., “Enhanced Metabolic Stability and Protein-binding Properties of Artificial α Helices Derived from a Hydrogen-bond Surrogate: Application to Bcl-xL”, Angew. Chem. Int’l Ed. Engl. 44:6525-9 (2005), originally published at Angew. Chem. 117:6683-7 (2005)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。例えば、本発明の化合物の調製によって、ペプチド前駆化合物が提供され、炭素−炭素結合立体配座が促進され、安定な内部拘束αヘリックスを生じさせる。
【００４０】
一実施形態では、前駆体は、式
【化２２】
を有する。
【００４１】
上記の式の化合物は、炭素−炭素結合の形成を促進させるのに効果的な条件下で反応させることができる。そのような反応は、例えばメタセシスであることができる。ペプチド模倣物の調製において非天然の炭素−炭素拘束の容易な導入のためのオレフィンメタセシス触媒によって示される例外的な官能基の許容性は、ＸおよびＹが、スキーム２に示されるオレフィンメタセシス反応を介して結合された２個の炭素原子であることができることを示唆する（Hoveyda et al., “Ru Complexes Bearing Bidentate Carbenes: From Innocent Curiosity to Uniquely Effective Catalysts for Olefin Metathesis”, Org. Biomolec. Chem. 2:8-23 (2004)、Trnka et al., “The development of L2X2Tu = CHR Olefin Metathesis Catalysts: An Organometallic Success Story”, Accounts Chem. Res. 34:18-29 (2001)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）。
【００４２】
本発明のこの態様は、例えば閉環オレフィンメタセシス反応を伴うことができる。オレフィンメタセシス反応は、２つの二重結合（オレフィン）を結合して２つの新しい二重結合（その一方は一般にエチレンガス）を与える。閉環オレフィンメタセシスは、オレフィンメタセシス反応を利用して大環状化合物を形成する。この反応では、鎖内の２つの二重結合が結合される。反応は、例えば式
【化２３】
のメタセシス触媒を用いて行うことができる。
【００４３】
他の実施形態では、そのメタセシス触媒は、式
【化２４】
で表されるものである。
【００４４】
このメタセシス反応は、例えば約２５℃と１１０℃の間の温度、より好ましくは約５０℃の温度で行うことができる。
【００４５】
このメタセシス反応は、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、またはトルエンなどの有機溶媒を用いて行うことができる。
【００４６】
本明細書中で開示される反応は、例えば固体支持体上で行うことができる。好適な固体支持体には、粒子、ストランド、沈殿物、ゲル、シート、管、球体、容器、毛管、パッド、薄片、フィルム、プレート、スライド、円板、膜などが含まれる。これらの固体支持体は、ポリマー、プラスチックス、セラミックス、多糖、シリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、膜、またはこれらの複合材料を含む種々様々な材料から作ることができる。基体は、好ましくは平坦であるが、様々な代替表面構造を採ることもできる。例えば、基体は、その上で反応が行われる一段高くなったまたは低くなった領域を含むことができる。好ましくは基体およびその表面は、本明細書中で述べる反応をその上で行うための剛性支持体を形成する。他の基体材料は、本発明の開示内容を検討すれば通常の当業技術者に容易に明らかになるであろう。
【００４７】
メタセシス反応は、新しく形成された炭素−炭素結合が二重結合である化合物を最初に生成することができる。その後、当業界で知られている水素化法によって、この二重結合を単結合に転化することができる。
【００４８】
本発明のペプチドおよび薬学的に許容できるビヒクルを含む医薬組成物も本発明に包含される。
【００４９】
通常の当業技術者に明らかなように、投与は一般に知られている方法を用いて行うことができる。投与は、被験体への全身投与によるか、または羅漢した細胞への標的投与により達成することができる。投与経路の例には、これらに限定されないが、気管内接種、吸引、気道点滴、エアロゾル適用、噴霧、鼻腔内点滴、経口または経鼻的胃点滴、腹膜内注射、脈管内注射、局所、経皮、非経口、皮下、静脈内注射、動脈内注射（例えば、肺動脈経由）、筋内注射、胸腔内点滴、脳室内、病巣内、粘膜（鼻、喉、気管支、生殖器、および／または肛門の粘膜など）への塗布、または持続放出ビヒクルの移植が含まれる。
【００５０】
本発明のペプチドは、治療剤と、任意の薬学的に許容できるアジュバント、担体、賦形剤、および／または安定剤とを含み、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、または乳剤などの固体または液体の形態であることができる医薬製剤として哺乳動物に投与されることができる。組成物は、好ましくは治療剤を約０．０１から約９９重量％、より好ましくは約２から約６０重量％と、アジュバント、担体、および／または賦形剤とを含有する。このような治療に有用な組成物中の活性化合物の量は、好適な剤形が得られるような量である。
【００５１】
薬剤は、例えば不活性増量剤または吸収可能な可食担体と一緒に経口投与することができ、あるいはハードまたはソフトシェルカプセル中に封入することもでき、あるいは圧縮して錠剤にすることもでき、あるいは食生活の食べ物と直接混ぜ合わせることもできる。経口治療投与の場合、それらの活性化合物は、賦形剤と混ぜ合わせ、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態で使用することができる。このような組成物および製剤は、この薬剤を少なくとも０．１％含有すべきである。これらの組成物中の薬剤の割合は、もちろん変えることができ、好都合にはその単位の重量の約２％から約６０％の間であることができる。このような治療に有用な組成物中の薬剤の量は、好適な用量が得られるような量である。
【００５２】
錠剤、カプセル剤などは、トラガントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、バレイショデンプン、またはアルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、およびスクロース、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味剤を含有することができる。剤形の形態がカプセルの場合、上記種類の材料に加えて、脂肪油などの液状担体を含有することもできる。
【００５３】
様々な他の材料が、コーティングとして、あるいは剤形の物理的形態を改変するため、存在することができる。例えば、錠剤をセラック、糖、またはその両方でコーティングすることができる。シロップ剤は、活性成分に加えて、甘味剤としてスクロース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、染料、サクランボまたはオレンジ風味などの香味剤を含有することができる。
【００５４】
本発明のペプチドは、非経口投与することもできる。ペプチドの溶液または懸濁液は、好適にはヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と混ぜ合わせた水中で調製することができる。分散液は、油に溶かしたグリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中で調製することもできる。油の例は、石油、動物、植物、または合成の起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、または鉱油である。一般に水、生理的食塩水、水性デキストロースおよび関連した糖溶液、およびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射剤にとって好ましい液状担体である。貯蔵および使用の通常の条件下において、これらの製剤は微生物の成長を防ぐために保存剤を含有する。
【００５５】
注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液または分散液、ならびに滅菌注射剤または散剤を下準備なしに調製するための滅菌粉末が含まれる。いかなる場合でも、その形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性（syringability）を有する程度に流動的でなければならない。また、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、これらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であることができる。
【００５６】
本発明のこの態様によるペプチドは、エアロゾルの形態で気道へ直接投与することもできる。エアロゾルとして使用する場合、溶液または懸濁液の状態の本発明の化合物を、好適なプロペラント（propellant）、例えばプロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素プロペラントと一緒に、通常のアジュバントと共に加圧エアロゾル容器に詰めることができる。本発明の材料は、例えばネブライザーまたはアトマイザーの場合、非加圧形態で投与することもできる。
【００５７】
本発明のペプチドは、標的の組織、例えばウィルスによる感染を受けやすい組織に直接投与することができる。加えて、および／または、あるいは、薬剤を、標的の組織、器官、または細胞への薬剤の移動（および／またはそれによる取込み）を促進する１種または複数種の薬剤と一緒に非標的部位に投与することもできる。標的の組織はウィルスによる感染を受けやすい任意の組織であることができるが、ＨＩＶ−１感染を阻害する場合の好ましい標的組織には、口、生殖器、および直腸の粘膜が含まれる。通常の当業技術者には明らかなように、治療剤自体が、所望の組織、器官、または細胞へのその輸送（およびそれによる取込み）を促進するように改変される。
【００５８】
送達器具の例には、これらに限定されないが、ネブライザー、アトマイザー、リポソーム、経皮パッチ、インプラント、埋込可能または注射可能なタンパク質デポー組成物、注射器が含まれる。本発明のこの態様をｉｎ ｖｉｖｏで行うために、当業者に知られている他の送達系を使用して、治療剤の所望の器官、組織、または細胞への所望の送達を達成することもできる。
【００５９】
本発明のこの態様を実施するためには、ペプチドの送達のための任意の好適な手法を利用することができる。一般にはこれらペプチドは、ペプチドを標的細胞、組織、または器官に送達するビヒクルに溶かして患者に投与されることになる。
【００６０】
ペプチドを細胞中に送達するための一手法はリポソームの使用を伴う。一般にはそれは、送達される薬剤を含むリポソームを提供し、次いで薬剤を細胞、組織、または器官に送達するのに効果的な条件下でリポソームを標的細胞、組織、または器官と接触させることを伴う。
【００６１】
リポソームは、水性相を封じ込める１層または複数層の同心円状に配列した脂質二分子膜からなる小胞である。これらは、通常、漏出性でないが、膜に孔または多孔が生じた場合、膜が溶解または分解した場合、あるいは膜の温度が相転移温度まで上昇した場合に、漏出性になることができる。リポソームによる薬物送達の現行方法では、リポソーム担体が最終的に透過性になり、標的部位で封入薬物を放出することが必要である。これは、例えばリポソーム二分子膜が体内で様々な物質の作用により徐々に分解される受動的な方法で達成することができる。あらゆるリポソーム組成物は、循環中にまたは体内の他の部位で特徴的な半減期を有し、したがってそのリポソーム組成物の半減期を制御することによって二分子膜の分解速度を多少調節することが可能である。
【００６２】
受動的薬物放出とは対照的に能動的薬物放出は、薬剤を使用してリポソームの小胞の透過性変化を引き起こすことを伴う。リポソーム膜は、環境がリポソーム膜に近い酸性の場合に不安定になるように構築することができる（例えば、本明細書によりその全体が参照により援用されるWang & Huang, “pH-Sensitive Immunoliposomes Mediate Target-cell-specific Delivery and Controlled Expression of a Foreign Gene in Mouse”, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 84:7851-5 (1987) を参照されたい）。リポソームが、例えば標的細胞によってエンドサイトースされる場合、それらを酸性のエンドソームに送ることができ、リポソームが不安定化され、薬物放出を引き起こすことになる。
【００６３】
あるいは、酵素をリポソーム膜上に被膜として配置し、酵素がリポソームをゆっくり不安定化するようにリポソーム膜を化学的に修飾することもできる。薬物放出の制御は、膜中に最初に配置される酵素の濃度に左右されるので、薬物放出を「要望に応じて」達成するように薬物放出を調節または変化させるための真に有効な方法は存在しない。リポソームの小胞が標的細胞と接触するとすぐにそれは飲み込まれることになり、ｐＨの低下が薬物放出を引き起こすことになる点で、ｐＨの影響を受けやすいリポソームの場合も同様の問題が存在する。
【００６４】
このリポソーム送達系は、能動的ターゲッティングにより（例えば、リポソームビヒクルの表面に抗体またはホルモンを組み込むことによって）、標的器官、組織、または細胞に蓄積させることもできる。これは既知の方法により達成することができる。
【００６５】
様々な種類のリポソームを、Bangham et al., “Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellae of Swollen Phospholipids”, J. Mol. Biol. 13:238-52 (1965)、Hsuの米国特許第５，６５３，９９６号、Lee et al.の米国特許第５，６４３，５９９号、Holland et al.の米国特許第５，８８５，６１３号、DzauおよびKanedaの米国特許第５，６３１，２３７号、およびLoughrey他の米国特許第５，０５９，４２１号（これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）に従って調製することができる。
【００６６】
これらのリポソームは、本発明の治療剤に加えて抗炎症薬などの他の治療剤を含有するように作製することができ、次いでこれらは標的部位で放出される（例えば、Wolff et al., “The Use of Monoclonal Anti-Thy1l IgG1 for the Targeting of Liposomes to AKR-A Cells in Vitro and in Vivo”, Biochim. Biophys. Acta 802:259-73 (1984)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。
【００６７】
タンパク質またはポリペプチド剤（例えば、本発明のペプチド）を送達するための代替手法は、所望のタンパク質またはポリペプチドをポリマーに結合させることを伴う。このポリマーは、その結合タンパク質またはポリペプチドの酵素による分解を避けるように安定化される。この種の結合タンパク質またはポリペプチドは、Ekwuribeの米国特許第５，６８１，８１１号（本明細書によりその全体が参照により援用される）に記載されている。
【００６８】
タンパク質またはポリペプチド剤を送達するためのさらに別の手法は、Heartlein et al.の米国特許第５，８１７，７８９号（本明細書によりその全体が参照により援用される）に記載されているキメラタンパク質の調製を伴う。キメラタンパク質は、リガンドドメインおよびポリペプチド剤（例えば、本発明の人為的αヘリックス）を含むことができる。リガンドドメインは、標的細胞上に位置する受容体に特異的である。したがって、キメラタンパク質が血液またはリンパ液中へ経静脈的に送達されるか、または他の方法で導入される場合、キメラタンパク質は標的の細胞に吸着することになり、標的の細胞はキメラタンパク質を内在化することになる。
【００６９】
投与は、必要に応じてしばしば行うことができ、またウィルス感染に対して有効な治療を施すのに適した期間行うことができる。例えば投与は、１回の徐放性投与製剤により、または１日複数回投与により行うことができる。投与は、被験体がウィルスに触れる前に、それと同時に、および／または後に行うことができる。
【００７０】
投与量は、もちろん治療計画に応じて変わる。一般には薬剤は、ウィルスの感染性の低下に有効な量（すなわち治療に有効な量）を達成するように投与される。したがって治療に有効な量は、ウィルスの被験体への感染またはウィルスの被験体中での拡散を少なくとも部分的に防止することができる量であることができる。有効な量を得るのに必要な用量は、薬剤、処方、ウィルス、および薬剤が投与される個体に応じて変えることができる。
【００７１】
有効量の決定は、薬剤の様々な用量を培養液中で細胞に投与するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを伴うこともでき、感染性を抑制するのに有効な薬剤濃度がｉｎ ｖｉｖｏで必要とされる濃度を計算するために求められる。有効量は、ｉｎ ｖｉｖｏでの動物による検討に基づくこともできる。治療に有効な量は、当業者が経験的に決めることができる。
【００７２】
本発明の第二の態様は、本発明のペプチドを用いたＨＩＦ １α−ｐ３００／ＣＢＰ相互作用の阻害に関する。本発明のこの態様の一実施形態は、ＨＩＦ １αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用が仲介する細胞中の遺伝子の転写を低減させる方法に関する。この方法は、ペプチドの核取り込みを生じさせるのに効果的な条件下で細胞を本発明のペプチドと接触させることを伴い、ペプチドは、ＨＩＦ−１αとｐ３００／ＣＢＰの相互作用を妨害し、それによって遺伝子の転写を低減させる。転写がＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の相互作用によって仲介される遺伝子には、アデニル酸キナーゼ３、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、エノラーゼ１、グルコース輸送体１、グルコース輸送体３、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、インスリン様増殖因子２、ＩＧＦ結合タンパク質１、ＩＧＦ結合タンパク質３、乳酸脱水素酵素Ａ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１、ピルビン酸キナーゼＭ、ｐ２１、トランスフォーミング増殖因子β３、セルロプラスミン、エリスロポエチン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、α１Ｂ−アドレナリン受容体、アドレノメデュリン、エンドセリン−１、ヘムオキシゲナーゼ１、一酸化窒素シンターゼ２、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、脈管内皮増殖因子、脈管内皮増殖因子受容体ＦＬＴ−１、脈管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、およびｐ３５ｓｒｇが含まれる。これらの遺伝子の転写を阻害するための幾つかの使用法を表１に示す。
【００７３】
【表１】
【００７４】
本発明のこの態様の別の実施形態は、ＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の相互作用が仲介する障害の治療または予防を必要としている被験体に対する治療または予防方法に関する。この方法は、障害を治療または予防するのに効果的な条件下で本発明のペプチドを被験体に投与することを伴う。
【００７５】
治療または予防することができる障害には、例えば網膜虚血（Zhu et al., “Long-term Tolerance to Retinal Ischemia by Repetitive Hypoxic Preconditioning: Role of HIF-1α and Heme Oxygenase-1”, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48:1735-43 (2007)、Ding et al., “Retinal Disease in Mice. Lacking Hypoxia-inducible Transcription Factor-2a”, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46:1010-6 (2005)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）、肺高血圧症（Simon et al., “Hypoxia-induced Signaling in the Cardiovascular System”, Annu. Rev. Physiol. 70:51-71 (2008)、Eul et al., “Impact of HIF-1α and HIF-2α on Proliferation and Migration of Human Pulmonary Artery Fibroblasts in Hypoxia”, FASEB J. 20: 163-5 (2006)、本明細書によりこれらのそれぞれはその全体が参照により援用される）、子宮内発育遅延（Caramelo et al., “Respuesta a la Hipoxia. Un Mecanismo Sistemico Basado en el Control de la Expresion Genica [Response to Hypoxia. A Systemic Mechanism Based on the Control of Gene Expression]”, Medicina B. Aires 66: 155-{54 (2006)、Tazuke et al., “Hypoxia Stimulates Insulin-like Growth Factor Binding Protein I (IGFBP-1) Gene Expression in HepG2 Cells: A Possible Model for IGFBP-1 Expression in Fetal Hypoxia”, Proc. Nat’l Acad Sci. USA 95:10188-93 (1998)、これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）、糖尿病性網膜症（Ritter et al., “Myeloid Progenitors Differentiate into Microglia and Promote Vascular Repair in a Model of Ischemic Retinopathy”, J. Clin Invest. 116:3266-76 (2006)、Wilkinson-Berka et al., “The Role of Growth Hormone, Insulin-like Growth Factor and Somatostatin in Diabetic Retinopathy", Curr. Med Chem. 13:3307-17 (2006)、Vinores et al., “Implication of the Hypoxia Response Element of the Vegf Promoter in Mouse Models of Retinal and Choroidal Neovascularization, but Not Retinal Vascular Development”, J. Cell. Physiol. 206:749-58 (2006)、Caldwell et al., “Vascular Endothelial Growth Factor and Diabetic Retinopathy: Role of Oxidative Stress”, Curr. Drug Targets 6:511-24 (2005)、これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）、加齢黄斑変性症（Inoue et al., “Expression of Hypoxia-inducible Factor 1a and 2a in Choroidal Neovascular Membranes Associated with Age-related Macular Degeneration”, Br. J Ophthalmol. 91:1720-1 (2007)、Zuluaga et al., “Synergies of VEGF Inhibition and Photodynamic Therapy in the Treatment of Age-related Macular Degeneration”, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48:1767-72 (2007)、Provis, “Development of the Primate Retinal Vasculature”, Prog. Retin Eye Res. 20:799-821 (2001)、これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）、糖尿病性黄斑浮腫（Vinores et al., “Implication of the Hypoxia Response Element of the Vegf Promoter in Mouse Models of Retinal and Choroidal Neovascularization, but Not Retinal Vascular Development”, J. Cell. Physiol. 206:749-58 (2006)、Forooghian & Das, “Anti-angiogenic Effects of Ribonucleic Acid Interference Targeting Vascular Endothelial Growth Factor and Hypoxia-inducible Factor-1α”, Am. J Ophthalmol. 144:761-8 (2007)、これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）、および癌（Marignol et al., “Hypoxia in Prostate Cancer: A Powerful Shield Against Tumour Destruction?”, Cancer Treat. Rev. 34:313-27 (2008)、Galanis et al., “Reactive Oxygen Species and HIF-1 Signalling in Cancer”, Cancer Lett. 266:12-20 (2008)、Ushio-Fukai & Nakamura, “Reactive Oxygen Species and Angiogenesis: NADPH Oxidase as Target for Cancer Therapy”, Cancer Lett. 266:37--52 (2008)、Adamski et al., “The Cellular Adaptations to Hypoxia as Novel Therapeutic Targets in Childhood Cancer”, Cancer Treat. Rev. 34:231-46 (2008)、Toffoli & Michiels, “Intermittent Hypoxia Is a Key Regulator of Cancer Cell and Endothelial Cell Interplay in Tumours”, FEBS J. 275:2991-3002 (2008)、これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）が含まれる。
【００７６】
本発明のこの態様のさらに別の実施形態は、組織における脈管形成の低減または防止方法に関する。この方法は、その組織における脈管形成を低減または防止するのに効果的な条件下で組織を本発明のペプチドと接触させることを伴う。本発明のこの態様の別の実施形態は、細胞のアポトーシスを誘発する方法に関する。この方法は、その細胞のアポトーシスを誘発するのに効果的な条件下で細胞を本発明のペプチドと接触させることを伴う。本発明のこの態様の別の実施形態は、細胞の生存および／または増殖を低下させる方法に関する。この方法は、その細胞の生存および／または増殖を低下させるのに効果的な条件下で細胞を本発明のペプチドと接触させることを伴う。本発明のこの態様による接触（投与を含む）は、熟練者には明らかな、また上記で述べた方法を用いて行うことができ、またｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。
【００７７】
上記実施形態に対する標的細胞、組織、および／または器官の幾つかの例を、表２に示す。
【００７８】
【表２】
【００７９】
本発明の別の態様は、ＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の相互作用を阻害する可能性のある薬剤の同定方法に関する。この方法は、本発明のペプチドを提供すること、ペプチドを被検物質と接触させること、および被検物質がペプチドと選択的に結合するかどうかを検出することを含み、ペプチドと選択的に結合する被検物質を、ＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の間の相互作用の潜在的な阻害剤として同定する。
【００８０】
本発明のこの態様は、熟練者には明らかな様々な方法で行うことができる。例えば、本発明のペプチドに対する被検物質の親和性は、実施例４で述べる等温滴定熱量測定分析を用いて測定することができる（Wiseman et al., “Rapid Measurement of Binding Constants and Heats of Binding Using a New Titration Calorimeter”, Anal. Biochem. 179:131-7 (1989)、Freire et al., “Isothermal Titration Calorimetry”, Anal. Chem. 62:A950-A959 (1990)、Chervenak & Toone, “Calorimetric Analysis of the Binding of Lectins with Overlapping Carbohydrate-binding Ligand Specificities”, Biochemistry 34:5685-95 (1995)、Aki et al., “Competitive Binding of Drugs to the Multiple Binding Sites on Human Serum Albumin. A Calorimetric Study”, J Thermal Anal. Calorim. 57:361-70 (1999)、Graziano et al., “Linkage of Proton Binding to the Thermal Unfolding of Sso7d from the Hyperthermophilic Archaebacterium Sulfolobus solfataricus”, Int’l Biol. Macromolecules 26:45-53 (1999)、Pluschke & Mutz, “Use of Isothermal Titration Calorimetry in the Development of Molecularly Defined Vaccines”, J. Thermal Anal. Calorim. 57:377-88 (1999)、Corbell et al., “A Comparison of Biological and Calorimetric Analyses of Multivalent Glycodendrimer Ligands for Concanavalin A”, Tetrahedron-Asymmetry 11:95-111 (2000)、これらは本明細書によりその全体が参照により援用される）。一実施形態では、被検物質と本発明のペプチドの解離定数（Ｋｄ）が５０μＭ以下の場合、被検物質をＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の間の相互作用の潜在的な阻害剤として同定する。別の実施形態では、Ｋｄは２００ｎＭ以下である。さらに別の実施形態では、Ｋｄは１００ｎＭ以下である。
【００８１】
ＨＩＦ−１α−ｐ３００／ＣＲＥＢ相互作用の潜在的な阻害剤として同定された被検物質は、ＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の間の相互作用を阻害するそれらの能力を確認するために更なる試験にかけることができる。
【００８２】
本発明は、下記の実施例を参照することによりさらに例示することができる。
【実施例】
【００８３】
実施例１―ルシフェラーゼアッセイによるプロモーター活性の分析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＨＲＥ−Ｌｕｃ細胞を、１０％ウシ胎児血清および０．４ｇ／ＬのGeneticin（G418硫酸塩、RPI Corporation）を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）中で保持した。細胞を、６．５×１０４細胞／ｍＬ懸濁液１ｍＬを用いて２４ウェルの皿（BD Falcon）に密度６×１０４細胞／ウェルで塗布した。付着後、細胞を１０ｎＭから１μＭまでの範囲にわたる濃度のＨＢＳヘリックスまたはケトミンを含有する新鮮な培地１ｍＬで処理した。細胞を、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃で６時間インキュベートした。メシル酸デフェロキサミン（ＤＦＯ、Sigma）を３００μＭの最終濃度まで加えることによって低酸素を誘導し、細胞をさらに１８時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いでCell Culture Lysis Reagent（「ＣＣＬＲ」、Promega）１５０μＬを加えることによって全細胞ライセートを単離した。ライセートを集め、４℃において１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、等分し、−８０℃で貯蔵した。ルシフェラーゼアッセイを、Turner TD-20e Luminometerを用いて製造業者の使用説明書（Promega）に従って行った。相対照度の測定値を、ブラッドフォード検定を行うことによって標準化してルシフェラーゼアッセイ中に使用されたライセートのタンパク質含量を求めた。簡単に言うと、１．５ｍＬキュベット中で５０μＬの細胞ライセート／ルシフェラーゼアッセイ試薬混合物を、２００μＬのブラッドフォード試薬および７５０μＬのMillipore waterに加えた。１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液の適正量を用いて１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲でタンパク質標準物を作った。DU-800分光光度計を用いて吸光度を５９５ｎｍにおいて測定した。実験は３回行い、エラーバーを平均値の標準誤差として計算した。
【００８４】
実施例２―ｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の分析
リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７細胞中でのＶＥＧＦおよびＧＬＵＴ１遺伝子発現レベルに及ぼすＨＢＳヘリックスの影響を正常酸素および低酸素条件の両方で調べた。ＶＥＧＦ分析の場合、順方向プライマー５’−ＡＧＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＡ−３’（配列番号１１４）および逆方向プライマー５’−ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＴＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＣＴ ＧＡ−３’（配列番号１１５）を用いて遺伝子の３’翻訳領域から１０４ｂｐフラグメントを増幅した。ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）分析の場合、順方向配列５’−ＴＡＧ ＡＡＡ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＴＧ Ｃ−３’（配列番号１１６）および逆方向配列５−ＧＧＴ ＡＡＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＡＴ Ｔ−３’（配列番号１１７）を利用して１７９ｂｐの産物を得た。β−グルクロニダーゼの発現レベルはこれら実験条件下で不変のままなので、それらを内在性対照として使用した。順方向プライマー５’−ＣＴＣ ＡＴＴ ＴＧＧ ＡＡＴ ＴＴＴ ＧＣＣ ＧＡＴ Ｔ−３’（配列番号１１８）および逆方向プライマー５’−ＣＣＧ ＡＧＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ Ａ−３’（配列番号１１９）をこの遺伝子に対して使用した。温度サイクルおよびＳＹＢＲ緑色発光の検出は、ABI 7300リアルタイムＰＣＲ装置により行った。データはABI Sequence Detection System, version 1.2により分析した。統計分析は６回の独立した実験からのデータで行った。実験は、Applied Biosystems SYBR Green RT-PCR master mixを用いて行った。
【００８５】
実施例３―ＥＬＩＳＡによるタンパク質レベルの決定
ＭＣＦ−７細胞を、１．１×１０５細胞／ｍＬ懸濁液１ｍＬを用いて２４ウェルの培養皿（BD Falcon）に密度１．１×１０５細胞／ウェルで塗布した。付着後、細胞を吸引し、実施例１で述べたと同様に濃度１０ｎＭから１μＭまでの範囲にわたってスポリデスミンまたはケトミンを含有する培地１ｍＬで処理した。３７℃および５％のＣＯ２における６時間のインキュベーション期間の後、培養液を３００ｎＭ ＤＦＯでスパイクし、１８時間インキュベートすることによって低酸素を誘導させた。細胞培養液上清を集め、１０，０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離し、２００μＬに等分してＥＬＩＳＡアッセイ用の９６ウェルプレート（R&D Systems）に入れた。これは製造業者のプロトコルに従って行った。吸光度測定値は、Bio-Tek μQuantマイクロプレートリ−ダーを用いて４５０ｎｍで採取した。処理した細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで培養細胞溶解試薬（Promega）を１ウェル当たり１５０μＬ加えることによって全細胞ライセートを同時に単離した。ライセートを集め、４℃において１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、−８０℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡと並行して、全細胞ライセートの総タンパク質レベルをブラッドフォードアッセイにより求め、上清中の測定ＶＥＧＦ濃度を標準化した。この過程は、ＶＥＧＦの阻害がＨＩＦ−１α介在性転写の阻止に特異的であり、転写機構の全体的破壊に起因するものではないことを確かめるためであった。試料および標準物はブラッドフォード試薬（Bio-Rad）４０μＬおよびタンパク質／水混合物１６０μＬを用いて調製し、吸光度は５９５ｎｍにおいてBio-Tek μQuantマイクロプレートリ−ダーを用いて測定した。
【００８６】
実施例４―細胞培養液中のＶＥＧＦ転写を調節するＨＢＳヘリックスの設計、合成、および評価
ｐ３００／ＣＢＰのＣＨ１ドメインは、図１Ａに示すように三角形の幾何形状を有し、ＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤの折りたたみのための足場として働く。図１Ａおよび図１Ｃに示すＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤのヘリックスαＡは、ＣＨ１ドメインとＨＩＦ−１αの間の相互作用にとって重要である。その理由は、残基の変異または８０３番Ａｓｎのヒドロキシル化がこの複合体を破壊し、ＨＩＦ−１α介在性転写を阻害することが知られているためである（Freedman et al., “Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1α”, Proc., Nat’l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002)、Dames et al., “Structural Basis for Hif-1α/CBP Recognition in the Cellular Hypoxia Response”, Proc., Nat’l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002)）。ＶＥＧＦ転写の潜在的な阻害剤としてのＨＢＳヘリックスの開発は、ＨＩＦ−１のａＡヘリックス領域を模倣することによって始めた。このヘリックスは、８個の残基、ＳＹＤＣＥＶＮＡＰ（配列番号１２０）からなり、ｐ３００／ＣＢＰを結合させるのに重要な３個の残基、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕを特徴とする。幾つかの直鎖ペプチドおよびそれらのＨＢＳαヘリックス類似体を設計して細胞培養液中のＶＥＧＦ転写を阻害するそれら分子の潜在能力を評価した。表３は、それらの検討の一部として設計され、試験された代表的な化合物を一覧表にする。下記に記載した手順を用いてそれぞれの非拘束ペプチドおよびＨＢＳヘリックスを合成した（Dimartino et al., “Solid-phase Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate-derived α-Helices”, Org. Lett. 7:2389-92 (2005)、Chapman & Arora, “Optimized Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate Helices: Surprising Effects of Microwave Heating on the Activity of Grubbs Catalysts”, Org. Lett. 8:5825-8 (2006)）。各ペプチドのヘリックス度％は、下記に記載したように１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中で円二色性分光法を用いて求めた（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)）。ｐ３００に対する各ペプチドの親和性は、等温滴定熱量測定分析によって測定した（Wiseman et al., “Rapid Measurement of Binding Constants and Heats of Binding Using a New Titration Calorimeter”, Anal. Biochem. 179:131-7 (1989)、Freire et al., “Isothermal Titration Calorimetry”, Anal. Chem. 62:A950-A959 (1990)、Chervenak & Toone, “Calorimetric Analysis of the Binding of Lectins with Overlapping Carbohydrate-binding Ligand Specificities”, Biochemistry 34:5685-95 (1995)、Aki et al., “Competitive Binding of Drugs to the Multiple Binding Sites on Human Serum Albumin. A Calorimetric Study”, J Thermal Anal. Calorim. 57:36170 (1999)、Graziano et al., “Linkage of Proton Binding to the Thermal Unfolding of Sso7d from the Hyperthermophilic Archaebacterium Sulfolobus solfataricus”, Int’l J. Biol. Macromolecules 26:45-53 (1999)、Pluschke & Mutz, “Use of Isothermal Titration Calorimetry in the Development of Molecularly Defined Vaccines”, J. Thermal Anal. Calorim. 57:377-88 (1999)、Corbell et al., “A Comparison of Biological and Calorimetric Analyses of Multivalent Glycodendrimer Ligands for Concanavalin A”, Tetrahedron-Asymmetry 11:95-111 (2000)）。細胞培養液中のＶＥＧＦ転写を下方制御する各ペプチドの能力を、上記と同様に等温熱量分析および定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。各ペプチドの細胞毒性は、１μＭ濃度の個々ペプチドの存在下で細胞の成長および集団倍加をモニターすることによって判定した。表３は、第一世代ＨＢＳヘリックスおよびペプチド誘導体について得られた結果を要約し、これらの値をケトミン（２）で観察されたものと比較する。
【００８７】
【表３】
【００８８】
ＨＢＳペプチド（２０）は、ＨＩＦ−１αＡヘリックスの直接の模倣体だが、セリン７９７番残基がアラニンで置換されている。この変異は合成方法を簡単にするために入れられたが、ＨＩＦ−１／ｐ３００構造の点検の結果、セリン７９７番が界面で重要な役割を果たさないことが示唆されたからである（Freedman et al., “Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1α”, Proc., Nat’l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002)、Dames et al., “Structural Basis for Hif-1α/CBP Recognition in the Cellular Hypoxia Response”, Proc., Nat’l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002)、これらは本明細書によりその全体が参照により援用される）。
【００８９】
この置換がｐ３００の結合を混乱させないことを、直鎖ペプチド（２３）および（２４）を合成しかつ特性を明らかにすることによって確かめた（表３）。ＨＢＳペプチド（２０）は、対応する非拘束類似体であるペプチド（２４）よりもヘリックス度が著しく大きく、ｐ３００と５４０ｎＭの親和性で結合する。ＨＢＳペプチド（２１）は、システイン８００番の代わりにバリン残基を含有する。バリンは、システイン８００番がｐ３００上の疎水性ポケットを標的にするという前提に基づいて導入し、より疎水性の残基でこの残基を置換することにより、結合の強化がもたらされる（Gu et al., “Molecular Mechanism of Hypoxia-inducible Factor 1α-p300 Interaction”, J. Biol. Chem. 276:3550-4 (2001)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。ＨＢＳペプチド（２１）は、親化合物であるＨＢＳペプチド（２０）よりもわずかに低い親和性でｐ３００に結合するが、これは、バリンが、一般にシステインが占める位置における最適な残基ではないことを示唆している。ＨＢＳヘリックス（２０）、（２１）および非拘束ペプチド（２３）、（２４）は、かなりの親和性でｐ３００に結合したが、これらのペプチドの各々は細胞培養液中でＶＥＧＦ転写を阻害しなかった。
【００９０】
ペプチドがＶＥＧＦ転写を阻害することができないことは、これらすべてのペプチドが生理的ｐＨにおいて全体として負電荷を有し、細胞透過性ペプチドはカチオン性残基に富むことが多いので、それらが細胞膜を越えることができないことを反映していると推測された（Joliot & Prochiantz, “Transduction Peptides: From Technology to Physiology”, Nat. Cell Biol. 6:189-96 (2004)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。Verdineおよび共同研究者は、側鎖架橋ヘリックスの細胞取込みの顕著な増加が、負電荷を中和し、かつカチオン性残基の限定された組を含むことによって観察されることを最近実証した（Bernal et al., “Reactivation of the p53 Tumor Suppressor Pathway by a Stapled p53 Peptide”, J. Am. Chem. Soc. 129:5298 (2007)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。したがって、親配列から誘導されるがＣ末端アルギニン残基を含有するＨＢＳヘリックス（２２）を設計し、アルギニン残基を加えることが、ヘリックスマクロ双極子の安定化、およびアルギニンの側鎖基とグルタミン酸残基の間のｉとｉ＋４のイオン性相互作用の電位形成によってヘリックス含量を増加させるかどうかを検討し試験した（Shi et al., “Stabilization of α-Helix Structure by Polar Side-chain Interaction: Complex Salt Bridges, Cation-πInteractions, and C-H…OH-bonds”, Peptide Sci. 60:366-80 (2002)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。これらの人為的ヘリックスの合成を簡単にするために、大環状化合物中のチロシン残基をアラニン（側鎖保護を必要としない残基）で置換した。野生型配列ではバリンによって占められ、結合相互作用に関与しないと予想される８０２番の位置に、代わりとしてチロシン残基を導入した。ペプチド濃度の定量のためにチロシンまたはトリプトファン残基を入れた。ペプチド（２５）をＨＢＳヘリックス（２２）の非拘束類似体として設計した。
【００９１】
ＨＢＳヘリックス（２２）は、可能性として円二色性分光法によって測定されるそのより高いヘリックス含量が理由で、ＨＢＳヘリックス（２０）、（２１）、ペプチド（２５）、およびその対応する非拘束ペプチドよりも強い親和性でｐ３００と結合した（表３および図６参照）。ＨＢＳヘリックスのＣＤスペクトルは、２０４および２２２ｎｍにおいてαヘリックスの特徴である二重極小を示し、２２２ｎｍにおける値は、拘束ペプチド（２２）が約５５％ヘリックスであることを示す（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。予想されるように対照ペプチド（２５）は構造化されていないように見える。
【００９２】
表３および図７に示すようにＨＢＳヘリックス（２２）は、ケトミン（２）によって得られるものに相当するレベルでＨｅＬａ細胞におけるＶＥＧＦ転写を阻害し、一方、直鎖対照ペプチド（２５）の効果はごくわずかであった。αヘリックス立体配座中のペプチドの安定化はそれらのプロテアーゼ抵抗性を向上させると予想されるので、この結果は非拘束ペプチドのタンパク質分解に対する不安定性を潜在的には反映している（Tyndall et al., “Proteases Universally Recognize Bata Strands in their Active Sites”, Chem. Rev. 105:973-99 (2005)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。ＨＢＳαヘリックスのタンパク質分解安定性の改良は、それらの非拘束の対応するものと比較して下記に報告されている（Wang et al., “Enhanced Metabolic Stability and Protein-binding Properties of Artificial α Helices Derived from a Hydrogen-bond Surrogate: Application to Bcl-xL”, Angew. Int’l Ed. Engl. 44:65259 (2005)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。ＨＢＳヘリックス（２２）は、ペプチドの全体としての電荷を変え、ヘリックス立体配座を安定化するように設計された。
【００９３】
２００ｎＭのケトミンが概略で１μＭのＨＢＳヘリックス（２２）と同様の阻害レベルを与えるので、ケトミンはＨＢＳヘリックス（２２）よりもＶＥＧＦ転写の強い阻害剤である。しかしながら、ケトミンは毒性のある試薬であることが知られており、一方、ＨＢＳヘリックス（２２）は、図８に示すように細胞成長アッセイにおいて明らかな毒性を示さなかった。したがって、ＨＢＳヘリックス（２２）は、ケトミンに伴う明らかな毒性なしにＶＥＧＦ転写の強い阻害を示すようである。
【００９４】
実施例５―ｐ３００／ＣＢＰ ＣＨ１ドメインを標的する第二世代ＨＢＳヘリックスの合成および特徴づけ
実施例４で述べた結果により、ＨＢＳヘリックス（２２）が、細胞培養液中でのＨＩＦ−１／ｐ３００相互作用を効果的に阻害することができることが示唆される。これらの研究は、同様の効果はペプチド（２０）上の配列置換によっても得ることができるが、ＨＢＳヘリックス（２２）における末端アルギニンの存在が細胞培養液の検討で効果を増大させるのに重要であり得ることを意味する。最適化ＨＢＦ ＨＩＦ−１模倣体を開発するために、表４に示すようにペプチド（２０）および（２２）から誘導される類似体を評価する追加の実験を企図する。幾種類かの化合物を調製して、細胞培養液中のこれら化合物の活性に及ぼす電荷の役割を評価する。ＨＢＳペプチド（４４）は、グルタミン酸残基でｉとｉ＋４の塩橋を形成することができる末端アルギニンを有するペプチド（２０）の類似体である。類似体（４５）は、２つの正に荷電した残基からなる。ペプチド（４４）におけるアルギニン残基によるアスパラギンの置換は、別のｉとｉ＋４の塩橋（アスパラギン酸残基で）を与えることができ、潜在的にはさらにヘリックス立体配座を安定化する（Shi et al., “Stabilization of α Helix Structure by Polar Side-chain Interaction: Complex Salt Bridges, Cation-πInteractions, and C-H---OH-bonds”, Peptide Sci. 60:366-80 (2002)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。ＨＢＳヘリックス（４６）はペプチド（２２）のジアルギニン類似体（２２）であり、最も活性なＨＢＳヘリックスを構築するために設計した。ペプチド（２２）の細胞分布を評価するためにフルオレセイン標識誘導体（４７）を調製することができる。必要に応じて他の蛍光類似体も調製することもできる。
【００９５】
【表４】
【００９６】
これらのＨＢＳヘリックスは、ＨＩＦ−１のαＡヘリックスを模倣していた。ＨＩＦ−１における第二ヘリックス（αＢ）の模倣体も評価することができる。例えば、ＨＢＳヘリックス（４８）は、αＢヘリックスの直接の模倣体の代表である。任意のＨＢＳヘリックスの非拘束ペプチド類似体はルーチンで調製し、ＨＢＳヘリックスと一緒に評価することができる。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態を本明細書中に示し説明してきたが、このような実施形態が例として提供されるに過ぎないことは当業者には明らかであろう。そこで、非常に多くの変形形態、改変形態、および代替形態が、本発明から逸脱することなく当業者には思い浮かぶはずである。本発明の実施に際しては本発明書中で述べた本発明の実施形態に対する様々な代替案を使用することができることを理解されたい。別添の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、それらの請求項の範囲内にある方法および構造ならびにそれらの同等物がそれによって含まれることを意図している。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書中に援用される２００８年９月１８日出願の米国仮特許出願第６１／０９８，１９３号に関する利益の享受を請求する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、合衆国国立衛生研究所によって与えられる認可番号ＧＭ０７３９４３の下で政府の支援によって行われた。本発明において政府は一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ＶＥＧＦ転写の調節におけるＨＩＦ−１α−コアクチベーター相互作用の役割
コアクチベータータンパク質ｐ３００（または相同ＣＲＥＢ結合タンパク質、ＣＢＰ）のシステイン−ヒスチジンに富む１ドメイン（「ＣＨ１」）と、低酸素誘導因子１α（「ＨＩＦ−１α」）のＣ−末端トランス活性化ドメイン（「Ｃ−ＴＡＤ」、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ００１５２１のアミノ酸７８６番〜８２６番）との間の相互作用（Freedman et al., “Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1α”,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002)、Dames et al., “Structural Basis for HIF-1α/CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response”, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002)）は、低酸素誘導遺伝子のトランス活性化を仲介する（Hirota & Semenza, “Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1”,Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006)、Semenza, “Targeting HIF-1 for Cancer Therapy”, Nat. Rev. Cancer 3:721-32 (2003)）。図１Ａ〜Ｃに示すように低酸素誘導遺伝子は、脈管形成および癌転移における重要な原因である（Orourke et al., “Identification of Hypoxically Inducible mRNAs in HeLa Cells Using Differential-display PCR”, Eu. J Biochem. 241:403-10 (1996)、Ivan et al., “HIFα Targeted for VHL-mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for O2 Sensing”, Science 292:464-8 (2001)）。酸素正常状態（normoxia）下では、ＨＩＦ−１のα−サブユニットは、図２に示すように、プロリン水酸化酵素によってプロリン残基４０２番および５６４番において連続的にヒドロキシル化され、ユビキチン化され、次いでユビキチン−プロテアソーム（proteosome）系によって分解される。フォンヒッペル・リンドウ癌抑制タンパク質（Kaelin, “Molecular basis of the VHL Hereditary Cancer Syndrome”, Nat. Rev. Cancer 2:673-82 (2002)）が仲介するこの過程は、ＨＩＦ−１αのレベル、およびその結果としての低酸素に対する転写応答を制御する役割を担っている（Maxwell et al., “The Tumour Suppressor Protein VHL Targets Hypoxia-inducible Factors for Oxygen-dependent Proteolysis”, Nature 399:271-5 (1999)）。低酸素条件下ではＨＩＦ−１αは、もはや破壊には向けられず、蓄積する。その連続的に発現される結合パートナーであるアリール炭化水素受容体核内輸送体（「ＡＲＮＴ」）によるヘテロ二量体化（Wood et al., “The Role of the Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) in Hypoxic Induction of Gene Expression”, J Biol. Chem. 271:15117-23 (1996)）は、コグネイト低酸素応答エレメント（「ＨＲＥ」）との結合を引き起こす（Forsythe et al., “Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1”, Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996)）。アスパラギン８０３番に対する調節ヒドロキシル化の第三部位もまた、図２に示すように、これら低酸素条件下で阻害され（Lando et al., “FIH-I is an Asparaginyl Hydroxylase Enzyme That Regulates the Transcriptional Activity of Hypoxia-inducible Factor”, Genes & Develop 16:1466-71 (2002)）、低酸素誘導遺伝子の過剰発現の引き金となるｐ３００／ＣＢＰコアクチベーターの動員を可能にする。これらのなかには、血管内皮細胞成長因子（「ＶＥＧＦ」）およびＶＥＧＦ受容体であるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）などの脈管形成ペプチド、ならびにグルコース輸送体ＧＬＵＴ１とＧＬＵＴ３およびヘキソキナーゼ１と２などのエネルギー代謝の変化に関与するタンパク質をコードする遺伝子がある（Forsythe et al., “Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1”, Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996)、Okino et.el., “Hypoxia-inducible Mammalian Gene Expression Analyzed in Vivo at a TATA-driven Promoter and at an Initiator-driven Promoter”, J Biol. Chem. 273:23837-43 (1998)）。
【０００４】
低酸素誘導転写の調節因子としてのエピジチオジケトピペラジン真菌代謝産物
ＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤと転写コアクチベーターｐ３００／ＣＢＰの相互作用は、転写応答の顕著な増幅に関わる重要な点であるので、設計されたタンパク質リガンドによるその破壊は、癌における好気性の解糖および脈管形成（すなわち新血管の形成）を抑制する効果的な手段である可能性がある（Hirota & Semenza, “Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1”, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006)、Ramanathan et al., “Perturbational Profiling of a Cell-line Model of Tumorigenesis by Using Metabolic Measurements”, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 102:5992-7 (2005)、Underiner et al., “Development of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR）Kinase Inhibitors as Anti-angiogenic Agents in Cancer Therapy”, Curr. Med. Chem. 11:73145 (2004)）。ＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤとｐ３００／ＣＢＰの接触面は広い（３３９３Å２）が、このタンパク質−タンパク質相互作用の阻害は直接的干渉を必要としない場合もある。その代わりに、結合パートナー（ｐ３００／ＣＢＰ）の一方への構造変化の誘発は、その複合体を壊すのに十分であり得る（Kung et al., “Small Molecule Blockage of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway”, Cancer Cell 6:33-43 (2004)）。
【０００５】
低分子による核のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害は困難なことがこれまでに分かっていた（Arkin & Wells, “Small-molecule Inhibitors of Protein-Protein Interactions: Progressing Towards the Dream”, Nat. Rev. Drug Discov. 3:301-17 (2004)）が、高親和性タンパク質リガンドに対する最近の検討は、幾つかの注目すべき業績をもたらした（Kung et al., “Small Molecule Blockage of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway”, Cancer Cell 6:33-43 (2004)、Issaeva et al., “Small Molecule RITA Binds to p53, Blocks p53-HDM-2 Interaction and Activates p53 Function in Tumors”, Nat. Med. 10:1321-8 (2004)、Lepourcelet et al., “Small-molecule Antagonists of the Oncogenic Tcf/β-Catenin Protein Complex”, Cancer Cell 5:91-102 (2004)、Vassilev et al., “In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2”, Science 303:844-8 (2004)、Grasberger et al., “Discovery and Cocrystal Structure of Benzodiazepinedione HDM2 Antagonists That Activate p53 in Cells”, J Med. Chem. 48:909-12 (2005)、Ding et al., “Structure-based Design of Potent Non-peptide MDM2 Inhibitors”, J Am. Chem. Soc. 127:10130-1 (2005)、Berg et al., “Small-molecule Antagonists of Myc/Max Dimerization Inhibit Myc-induced Transformation of Chicken Embryo Fibroblasts” Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 99:3830-5 (2002)、De Munari et al.,の国際公開第２００６／０６６７７５号パンフレット）。２種類の低分子、カエトシン（chaetocin）（1）（Hauser et al., “Isolation and Structure Elucidation of Chaetocin”, Helv. Chirn. Acta 53 (5):1061-73 (1970)）（図３Ａに示す）およびケトミン（2）（Waksman & Bugie, “Chaetomin, a New Antibiotic Substance Produced by Chaetomium Cochliodes I. Formation and Properties”, J. Bacteriol. 48:527-30 (1944)）（図３Ｂに示す）が、ＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤとｐ３００／ＣＢＰの間の相互作用を阻害すること、および低酸素誘導転写を弱めることが示されているが、この阻害の正確な機構は不明なままである（Kung et al., “Small Molecule Blockage of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway”, Cancer Cell 6:33-43 (2004)）。初期の有望な報告にもかかわらず、（１）および（２）の両方とも実験動物において凝固性壊死、貧血、および白血球増加を誘発しているので、ＨＩＦ−１経路の阻害剤のさらなる設計が必要である。副作用のないまたは減少させたＨＩＦ−１経路の他の阻害剤を同定することが望ましいであろう。
【０００６】
本発明は、当分野におけるこれらのまた他の欠点の克服を目的とする。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において本発明は、１種または複数種の安定なαヘリックス構造を有し、低酸素誘導因子１αのＣ末端トランス活性化ドメインのヘリックスαＡまたはヘリックスαＢを模倣した配列を含むペプチドを提供する。一実施形態では、このペプチドは、式Ｉ
【化１】
のペプチドである。
式中、
【化２】
は、炭素−炭素単結合または二重結合であり、ここで、炭素−炭素二重結合はｃｉｓまたはｔｒａｎｓであり、
各ｎは、独立して１または２であり、
ｍは、０または任意の正の整数であり、
Ｒ１は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ４、−ＣＨ２ＮＨ２、アルキル基、アリール基、または水素であり、ここで、Ｒ４はアルキルまたはアリールであり、あるいはＲ１は、式
【化３】
（式中、Ａ５は、ペプチド、アミノ酸残基、アシル基、または水素であり、
各Ｒ５は、独立してアミノ酸側鎖、水素、アルキル、またはアリール基である）
を有し、
Ｒ２は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基であり、
Ｒ３は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ７）２、アルキル基、アリール基、または水素であり、ここで、Ｒ６は、アルキル基またはアリール基であり、各Ｒ７は、独立してアミノ酸側鎖、水素、アルキル基、またはアリール基であり、
Ａ１、Ａ２、およびＡ４は、それぞれ独立して、
【化４】
（式中、各Ｒ８は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）であり、
Ａ３は、
【化５】
（式中、各Ｒ９は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）である。
請求項２に記載されているペプチドにおいて、
（ｉ）Ａ１はＴｈｒであり、Ａ２はＳｅｒまたはＡｌａであり、Ａ３はＴｙｒまたはＡｌａであり、Ａ４は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７を含み、ここで、Ｘ１はＡｓｐまたはＡｓｎであり、Ｘ２はＶａｌ、Ｃｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ３はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ４はＶａｌまたはＴｙｒであり、Ｘ５はＡｓｎまたはＡｒｇであり、Ｘ６はＡｌａであり、Ｘ７はＡｒｇまたは不在であり、あるいは
（ｉｉ）Ａ１およびＡ２は、独立してＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ａ３はＬｅｕであり、Ａ４は、式ＬＲＸ８ＬＸ９を含み、ここで、ＬはＬｅｕであり、ＲはＡｒｇであり、Ｘ８はＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ９はＡｓｐまたはＡｓｎである。
【０００８】
別の実施形態では、このペプチドは、
【化６】
（式中、ｍおよびｎは独立して１または２であり、Ｘは水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）からなる群から選択される。
【０００９】
一実施形態では、ｍおよびｎが１である。別の実施形態では、ｍが１、ｎが２である。別の実施形態では、ｍが２、ｎが１である。さらに別の実施形態では、ｍおよびｎの両方が２である。
【００１０】
幾つかの実施形態では、本発明のペプチドは、低酸素誘導因子１αのＣ末端トランス活性化ドメインの少なくとも残基７９６番〜８０４番または残基８１６番〜８２３番を模倣している。
【００１１】
別の態様において本発明はまた、本発明のペプチドおよび薬学的に許容できるビヒクルを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
さらに別の態様において本発明は、低酸素誘導因子１αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用によって仲介される細胞における遺伝子の転写を低減させる方法を提供する。上記方法は、細胞を、遺伝子の転写を低減させるのに効果的な条件下で請求項１に記載のペプチドと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、その遺伝子は、アデニル酸キナーゼ３、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、エノラーゼ１、グルコース輸送体１、グルコース輸送体３、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、インスリン様増殖因子２、ＩＧＦ結合タンパク質１、ＩＧＦ結合タンパク質３、乳酸脱水素酵素Ａ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１、ピルビン酸キナーゼＭ、ｐ２１、トランスフォーミング増殖因子β３、セルロプラスミン、エリスロポエチン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、α１Ｂ−アドレナリン受容体、アドレノメデュリン、エンドセリン−１、ヘムオキシゲナーゼ１、一酸化窒素シンターゼ２、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、脈管内皮増殖因子、脈管内皮増殖因子受容体ＦＬＴ−１、脈管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、およびｐ３５ｓｒｇからなる群から選択される。
【００１３】
また、治療または予防が必要な被験体において、低酸素誘導因子１αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用によって仲介される障害を治療または予防する方法を提供する。この方法は、その障害を治療または予防するのに効果的な条件下で本発明のペプチドを被験体に投与することを含む。幾つかの実施形態では、この障害は、網膜虚血、肺高血圧症、子宮内発育遅延、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、および癌からなる群から選択される。
【００１４】
別の態様において本発明は、組織における脈管形成の低減または防止方法に関する。この方法は、組織を、その組織における脈管形成を低減または防止するのに効果的な条件下で本発明のペプチドと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。他の実施形態では、この組織は腫瘍である。
【００１５】
本発明はさらに、細胞におけるアポトーシスの誘発方法を提供する。この方法は、細胞を、その細胞のアポトーシスを誘発するのに効果的な条件下で本発明のペプチドと接触させることを含む。本発明はまた、細胞の生存および／または増殖を低下させる方法を提供する。この方法は、細胞を、その細胞の生存および／または増殖を低下させるのに効果的な条件下で本発明のペプチドと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、この細胞は、癌性であるか、または癌細胞を含有する組織の内皮脈管構造内に含まれる。別の態様において本発明は、ＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の潜在的なリガンドの同定方法に関する。この方法は、本発明のペプチドを提供すること、そのペプチドを被検物質と接触させること、およびこの被検物質がそのペプチドと選択的に結合するかどうかを検出することを含み、そのペプチドと選択的に結合する被検物質を、ＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の潜在的なリガンドとして同定する。
【００１６】
参照による援用
本明細書中で述べるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、および特許出願が、具体的かつ個々に示されて参照により援用されることが示されているかのように参照により本明細書中に援用される。
【００１７】
本発明の新規な特徴は、詳細には別添の特許請求の範囲により記述される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用した例示的実施形態および添付図面について述べる下記の詳細な説明を参照することによって得られるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（図１Ａ）低酸素誘導因子１α（「ＨＩＦ−１α」）のＣ末端トランス活性化ドメイン（「Ｃ−ＴＡＤ」）と、コアクチベータータンパク質ｐ３００（または相同ＣＲＥＢ結合タンパク質、ＣＢＰ）のシステイン−ヒスチジンに富む１ドメイン（「ＣＨ１」）との複合体の構造を示す図である（Lepourcelet et al., “Small-molecule Antagonists of the Oncogenic Tcf/β-Catenin Protein Complex”, Cancer Cell 5:91-102 (2004)、Vassilev et al., “In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2”, Science 303:844-8 (2004)）。 （図１Ｂ）塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス領域（「ｂＨＬＨ」）、ＰＡＳ、およびＮ末端トランス活性化ドメイン（「Ｎ−ＴＡＤ」）およびＣ−ＴＡＤを示すＨＩＦ−１αのドメインマップを示す図である。 （図１Ｃ）ヒトＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤ配列（配列番号１）を、αＡおよびαＢヘリックスの位置と共に示す図である。
【図２】ＨＩＦ−１α経路を示す図である。ＡＲＮＴはアリール炭化水素受容体核移行因子（receptor nuclear translocator)を表し、ＶＨＬはフォンヒッペル・リンドウ腫瘍抑制タンパク質を表し、ＨＲＥは低酸素応答エレメントを表し、ＶＥＧＦは脈管内皮増殖因子を表す。
【図３】(図３Ａ）カエトシン（chetocin）（１）（ケトミウム・グロボーサム（Chaetomium globosum）から単離される）の構造を示す図である。 (図３Ｂ）ケトミン（２）（ケトミウム・コディオデス（Chaetomium codiodes）から単離される）の構造を示す略図である。
【図４】Ｎ末端ｉとｉ＋４水素結合（Ｃ＝Ｏ−−Ｈ−Ｎ）を共有結合（Ｃ＝Ｘ−Ｙ−Ｎ）で置き換えることによる短鎖αヘリックスの核形成を示す略図である。これらの水素結合代替（hydrogen bond surrogate-based)（「ＨＢＳ」）αヘリックスは、閉環メタセシス反応（ring-closing metathesis reaction)（「ＲＣＭ」）から誘導される炭素−炭素結合を含有する。
【図５】（図５Ａ）ＨＢＳαヘリックスの構造を示す図である。ＨＢＳαヘリックスのＮＭＲから得られる構造を示す図である。 （図５Ｂ）ＨＢＳαヘリックスの構造を示す図である。精巧な分子モデルを用いたＨＢＳαヘリックスのＸ線結晶解析から得られる１．１Å分解能電子密度マップを示す図である。 （図５Ｃ）ＨＢＳαヘリックスの構造を示す図である。結晶解析データから得られるＨＢＳαヘリックスの分子モデルを示す図である。細い線は推定上のｉとｉ＋４の水素結合を表す。
【図６Ａ】ＨＢＳヘリックス(２２）に関し、ＨＢＳヘリックス（２２）の化学構造を表す図である。
【図６Ｂ】ＨＢＳヘリックス(２２）に関し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のＨＢＳヘリックス（２２）および対照ペプチド（２５）の円二色性スペクトルを示す図である。
【図７】リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した様々なペプチドによるＶＥＧＦ遺伝子レベルの時間に依存した阻害のグラフである。
【図８】細胞培養液の培地のみ（「対照」）、０．１％培地（「ビヒクル」）、ケトミン（２）、ＨＢＳヘリックス（２２）、または対照の直鎖ペプチド（２５）で処理した培養液の細胞密度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のαヘリックス化合物の設計
一態様において本発明は、ＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤとｐ３００／ＣＢＰ ＣＨ１ドメインとの相互作用を調節する水素結合代替（「ＨＢＳ」）αヘリックスに関する。
【００２０】
１５個未満のアミノ酸残基からなるペプチドはタンパク質環境から摘出された生理的条件では一般にαヘリックス構造を形成せず、αヘリックス立体配座を取るには人為的な制約を必要とする。ＨＩＦ−１αは、それぞれ８個のアミノ酸残基からなる２つの短鎖αヘリックス領域を特色とする。図４に示すように、短鎖ペプチド配列から安定なヘリックス構造を再生可能な方法で生成するという目的で、水素結合代替（「ＨＢＳ」）から得られるαヘリックスでＨＩＦ−１α／コアクチベーター界面を標的にした（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc.128:9248-56 (2006)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。ヘリックス模倣体（helix mimetics）の設計のための他の手法が文献に記載されているが、それらの方法は、立体配座を安定化するために「二重の安全対策（belts and braces)」を必要とすることが多い。立体配座を固定させるために側鎖官能性は使用されないので、このＨＢＳ手法により、分子認識に利用できるあらゆる面に関してαヘリックスの合成が独特に可能となる。
【００２１】
ＨＢＳヘリックス設計手法はヘリックス−コイル転移理論が中心であり、当該理論は、３個の連続的なアミノ酸を螺旋配向とする強く要求される組織化によって、短鎖αヘリックスの安定性を本質的に限定することを示唆する（Lifson & Roig, “On the Theory of Helix-Coil Transitions in Polypeptides”, J. Chem. Phys. 34:1963-74 (1961)、Zimm & Bragg, “Theory of the Phase Transition Between Helix and Random Coil in Polypeptide Chains”, J. Chem. Phys. 31:526-35 (1959)、本明細書によりそれらの全体が参照により援用される）。この理論によれば、１０個以下のアミノ酸からなるαヘリックスは、核形成の可能性が低いために本質的に不安定であると予想される。このＨＢＳ手法は、固有の核形成障壁を克服し、ヘリックス形成を開始させるために、予め組織化したαターンを与える。αヘリックスでは、図４に示すように、ｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏとｉ＋４番目のアミノ酸残基のＮＨの間の水素結合がヘリックス構造を安定化し、核を形成する。Ｃ＝Ｏ−−Ｈ−Ｎ水素結合をできるだけ近似に模倣し、αターンを予め組織化するために、Ｃ＝Ｘ−Ｙ−Ｎ型（ここでＸおよびＹは、それぞれｉおよびｉ＋４残基の一部である）の共有結合が利用される。この方法は、任意の構造的に拘束されたαヘリックスを調製するために広く応用できると期待される。これらと同様の方法も、構造的に拘束されたαヘリックスを調製するために使用することができる。
【００２２】
一実施形態では、ｉ残基とｉ＋４残基の間の共有結合が、閉環メタセシス反応から得られる炭素−炭素結合である（Chapman et al., “A Highly Stable Short α-Helix Constrained by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 126:12252-3 (2004)、Dimartino et al., “Solid-phase Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate-derived α-Helices”, Org. Lett. 7:2389-92 (2005)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）。
【００２３】
ＮＭＲから得られるＨＢＳαヘリックスの溶液構造および高分解結晶構造は、図５に示すように、この手法の潜在能力を明白に例示している（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”,J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)、Liu et al., “Atomic Structure of a Short Alpha-helix Stabilized by a Main Chain Hydrogen Bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 130:4334-7 (2008)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）。このＨＢＳ手法の２つの特徴、すなわち（１）溶媒に曝される表面を保護することなしにαヘリックスの設計を可能にし、それによって分子認識のための側鎖を保存する、架橋部の内部配置と、（２）１０個未満のアミノ酸残基を有するきわめて短いペプチドを拘束して非常に安定なαヘリックスとする能力は、それをアロステリック転写調節因子の設計にとって特に魅力あるものにする（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)、Wang et al., “Nucleation and Stability of Hydrogen-bond Surrogate-based α-Helices”, Org. Biomol. Chem. 4:4074-81 (2006)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）。
【００２４】
本発明の第一の態様は、１種または複数種の安定な内部拘束（internally-constrained)αヘリックスを有するペプチドに関する。このペプチドは、ＨＩＦ−１αヘリックスドメインの一部を模倣した配列を含む。一実施形態では、このＨＩＦ−１αヘリックスドメインは、ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインのヘリックスαＡまたはヘリックスαＢである。例えばこのペプチドは、ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインの少なくとも残基７９６番〜８０４番または残基８１６番〜８２３番を模倣している。
【００２５】
本発明の好適なペプチドには、式Ｉ
【化７】
のペプチドが含まれる。
式中、
【化８】
は、炭素−炭素単結合または二重結合であり、ここで、炭素−炭素二重結合はｃｉｓまたはｔｒａｎｓであり、各ｎは、独立して１または２であり、ｍは、０または任意の正の整数である。例えばｍは、３〜１６または３〜４０の任意の整数であることができる。Ｒ１は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ４、−ＣＨ２ＮＨ２、アルキル基、アリール基、または水素であることができ、ここで、Ｒ４はアルキルまたはアリールである。あるいはＲ１は、式
【化９】
部分である。
式中、Ａ５は、アミノ酸残基、アシル基、または水素であり、各Ｒ５は、独立して、アミノ酸側鎖、水素、アルキル、またはアリール基である。Ｒ２は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基であることができる。Ｒ３は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ７）２、アルキル基、アリール基、または水素であり、ここで、Ｒ６は、アルキル基またはアリール基であり、各Ｒ７は、独立して、アミノ酸側鎖、水素、アルキル基、またはアリール基である。Ａ１、Ａ２、およびＡ４は、それぞれ独立して、
【化１０】
（式中、各Ｒ８は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）であり、Ａ３は、
【化１１】
（式中、各Ｒ９は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）である。
【００２６】
本発明の実施において有用なアミノ酸には、天然または非天然のアミノ酸、二置換アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、および他のアミノ酸が挙げられ、また本明細書中で言及される残基には、そのようなアミノ酸から得られる残基が含まれる。一実施形態では、式Ｉなどの本発明の化合物中で言及されるアミノ酸側鎖は天然のアミノ酸側鎖である。
【００２７】
本明細書中で使用される「アルキル基」は、直鎖または分枝鎖アルキル基である。アルキルの定義の範囲内にはヘテロアルキル基も含まれ、ヘテロ原子は、窒素、酸素、リン、イオウ、およびケイ素であることができる。アルキル基には、これらに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、およびブチルが含まれる。アルキル基には、例えばＣ１〜Ｃ６アルキルが含まれる。
【００２８】
本明細書中で使用される「アシル基」には、メタノイル、エタノイル、プロパノイル、ベンゾイル、およびプロペノイルなどの直鎖または分枝鎖アシル基が含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用される「アリール基」には、芳香族アリール環、例えばフェニル、ピリジン、フラン、チオフェン、ピロール、インドール、およびプリンなどのヘテロ芳香族環、ならびに窒素、酸素、イオウ、またはリンを有するヘテロ環が含まれる。
【００３０】
アルキル、アシル、およびアリール基の定義には、置換されたアルキル、アシル、およびアリール基が含まれる。好適な置換基には、これらに限定されないが、ハロゲン、アミン、ヒドロキシル基、カルボン酸、ニトロ基、カルボニル、および他のアルキル、アシル、およびアリール基が含まれる。
【００３１】
ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインのヘリックスαＡを模倣したペプチドには、これらに限定されないが、式Ｉのものが含まれ、ここで、Ａ１はＴｈｒであり、Ａ２はＳｅｒまたはＡｌａであり、Ａ３はＴｙｒまたはＡｌａであり、Ａ４は式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７を含み、ここで、Ｘ１はＡｓｐまたはＡｓｎであり、Ｘ２はＶａｌ、Ｃｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ３はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ４はＶａｌまたはＴｙｒであり、Ｘ５はＡｓｎまたはＡｒｇであり、Ｘ６はＡｌａであり、Ｘ７はＡｒｇまたは不在である。当業者に理解されるように、Ａ４は、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号２）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号４）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号６）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号８）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号９）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号１０）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１１）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号１２）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１３）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号１４）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１５）、Ａｓｎ−ＡｌａＧｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号１６）、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１７）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号１８）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１９）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号２０）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号２１）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号２２）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号２３）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号２４）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号２５）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号２６）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号２７）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号２８）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号２９）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号３０）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３１）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号３２）、Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３３）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号３４）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３５）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号３６）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３７）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号３８）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号３９）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号４０）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号４１）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号４２）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号４３）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号４４）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号４５）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号４６）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号４７）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号４８）、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号４９）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号５０）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５１）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号５２）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５３）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号５４）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５５）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号５６）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５７）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号５８）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５９）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号６０）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号６１）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号６２）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号６３）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号６４）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号６５）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号６６）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号６７）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号６８）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号６９）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号７０）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７１）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号７２）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７３、）Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号７４）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７５）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号７６）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７７）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号７８）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号７９）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号８０）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号８１）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号８２）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号８３）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号８４）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号８５）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号８６）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号８７）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号８８）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号８９）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号９０）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号９１）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号９２）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号９３）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号９４）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号９５）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号９６）、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号９７）の群から選択することができる。ペプチドの実例には、
【化１２】
が含まれる。
【００３２】
上記のペプチドにおいて、ｍおよびｎは独立して１または２である。例えば、ｍおよびｎのそれぞれが１であることができる。あるいは、ｍが１であり、ｎが２である。別の実施形態では、ｍが２であり、ｎが１である。さらに別の実施形態では、ｍおよびｎの両方が２である。
【００３３】
一般に、本発明の好適なペプチドには、式
【化１３】
を含むものが含まれる。
式中、
【化１４】
は、炭素−炭素単結合または二重結合であり、
【化１５】
は、単結合であり、
【化１６】
は、二重結合の場合にはｃｉｓまたはｔｒａｎｓであり、
各ｎは、独立して１または２であり、ｍは、任意の整数であり、
Ｒ１は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ４、−ＣＨ２ＮＨ２、アルキル基、アリール基、水素、または式
【化１７】
（式中、Ａ５は、ペプチド、アミノ酸残基、アシル基、または水素であり、各Ｒ５は、独立して、アミノ酸側鎖、水素、アルキル、またはアリール基である）を有する基であり、
Ｒ２は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基であり、
ＡＡ１およびＡＡ２は、独立して、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基であり、またＡ４は、式Ｉについて上記で定義したものと同様である。
【００３４】
一実施形態では、Ｒ１は水素である。別の実施形態では、Ｒ１は、
【化１８】
（式中、Ａ５はペプチド結合により結合したペプチドである）である。
【００３５】
一実施形態では、
【化１９】
によって表される結合は単結合である。別の実施形態では、
【化２０】
によって表される結合は二重結合である。
【００３６】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して、高度に安定化された内部拘束αヘリックスを有するペプチドを調製することができる。拘束は、Ｎ末端だけでなく、ペプチド内のどこにでも配置することができる。例えば、本発明の方法により調製される化合物は、式
【化２１】
を有することができる。
【００３７】
上記の式において、各Ｒは、独立して、任意のアミノ酸側鎖である。
【００３８】
本発明の方法により生成されるペプチドは、例えばアミノ酸残基５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５個未満、または１０個未満であることができる。一実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸の長さ５０個未満である。
【００３９】
本発明のＨＢＳαヘリックスは、例えば、図２に示すように、Ｎ末端主鎖ｉとｉ＋４の水素結合を、閉環メタセシス反応により炭素−炭素結合と置き換えることによって調製することができる（Arora et al.の米国特許第７，２０２，３３２号、Chapman & Arora, “Optimized Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate Helices: Surprising Effects of Microwave Heating on the Activity of Grubbs Catalysts”, Org. Lett. 8:5825-8 (2006)、Chapman et al., “A Highly Stable Short α-Helix Constrained by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 126:12252-3 (2004)、Dimartino et al., “Solid-phase Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate-derived α-Helices”, Org. Lett. 7:2389-92 (2005)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）。水素結合代替により、αターンは予め組織化され、αヘリックス立体配座におけるペプチド配列が安定化する。ＨＢＳαヘリックスは、安定なαヘリックス立体配座を様々な短鎖ペプチド配列から採ることが示されている（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。これらの人為的（artificial）αヘリックスは、それらの予想されるタンパク質受容体を高い親和性で標的にすることができることも示されている（Wang et al., “Enhanced Metabolic Stability and Protein-binding Properties of Artificial α Helices Derived from a Hydrogen-bond Surrogate: Application to Bcl-xL”, Angew. Chem. Int’l Ed. Engl. 44:6525-9 (2005), originally published at Angew. Chem. 117:6683-7 (2005)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。例えば、本発明の化合物の調製によって、ペプチド前駆化合物が提供され、炭素−炭素結合立体配座が促進され、安定な内部拘束αヘリックスを生じさせる。
【００４０】
一実施形態では、前駆体は、式
【化２２】
を有する。
【００４１】
上記の式の化合物は、炭素−炭素結合の形成を促進させるのに効果的な条件下で反応させることができる。そのような反応は、例えばメタセシスであることができる。ペプチド模倣物の調製において非天然の炭素−炭素拘束の容易な導入のためのオレフィンメタセシス触媒によって示される例外的な官能基の許容性は、ＸおよびＹが、スキーム２に示されるオレフィンメタセシス反応を介して結合された２個の炭素原子であることができることを示唆する（Hoveyda et al., “Ru Complexes Bearing Bidentate Carbenes: From Innocent Curiosity to Uniquely Effective Catalysts for Olefin Metathesis”, Org. Biomolec. Chem. 2:8-23 (2004)、Trnka et al., “The development of L2X2Tu = CHR Olefin Metathesis Catalysts: An Organometallic Success Story”, Accounts Chem. Res. 34:18-29 (2001)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）。
【００４２】
本発明のこの態様は、例えば閉環オレフィンメタセシス反応を伴うことができる。オレフィンメタセシス反応は、２つの二重結合（オレフィン）を結合して２つの新しい二重結合（その一方は一般にエチレンガス）を与える。閉環オレフィンメタセシスは、オレフィンメタセシス反応を利用して大環状化合物を形成する。この反応では、鎖内の２つの二重結合が結合される。反応は、例えば式
【化２３】
のメタセシス触媒を用いて行うことができる。
【００４３】
他の実施形態では、そのメタセシス触媒は、式
【化２４】
で表されるものである。
【００４４】
このメタセシス反応は、例えば約２５℃と１１０℃の間の温度、より好ましくは約５０℃の温度で行うことができる。
【００４５】
このメタセシス反応は、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、またはトルエンなどの有機溶媒を用いて行うことができる。
【００４６】
本明細書中で開示される反応は、例えば固体支持体上で行うことができる。好適な固体支持体には、粒子、ストランド、沈殿物、ゲル、シート、管、球体、容器、毛管、パッド、薄片、フィルム、プレート、スライド、円板、膜などが含まれる。これらの固体支持体は、ポリマー、プラスチックス、セラミックス、多糖、シリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、膜、またはこれらの複合材料を含む種々様々な材料から作ることができる。基体は、好ましくは平坦であるが、様々な代替表面構造を採ることもできる。例えば、基体は、その上で反応が行われる一段高くなったまたは低くなった領域を含むことができる。好ましくは基体およびその表面は、本明細書中で述べる反応をその上で行うための剛性支持体を形成する。他の基体材料は、本発明の開示内容を検討すれば通常の当業技術者に容易に明らかになるであろう。
【００４７】
メタセシス反応は、新しく形成された炭素−炭素結合が二重結合である化合物を最初に生成することができる。その後、当業界で知られている水素化法によって、この二重結合を単結合に転化することができる。
【００４８】
本発明のペプチドおよび薬学的に許容できるビヒクルを含む医薬組成物も本発明に包含される。
【００４９】
通常の当業技術者に明らかなように、投与は一般に知られている方法を用いて行うことができる。投与は、被験体への全身投与によるか、または羅漢した細胞への標的投与により達成することができる。投与経路の例には、これらに限定されないが、気管内接種、吸引、気道点滴、エアロゾル適用、噴霧、鼻腔内点滴、経口または経鼻的胃点滴、腹膜内注射、脈管内注射、局所、経皮、非経口、皮下、静脈内注射、動脈内注射（例えば、肺動脈経由）、筋内注射、胸腔内点滴、脳室内、病巣内、粘膜（鼻、喉、気管支、生殖器、および／または肛門の粘膜など）への塗布、または持続放出ビヒクルの移植が含まれる。
【００５０】
本発明のペプチドは、治療剤と、任意の薬学的に許容できるアジュバント、担体、賦形剤、および／または安定剤とを含み、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、または乳剤などの固体または液体の形態であることができる医薬製剤として哺乳動物に投与されることができる。組成物は、好ましくは治療剤を約０．０１から約９９重量％、より好ましくは約２から約６０重量％と、アジュバント、担体、および／または賦形剤とを含有する。このような治療に有用な組成物中の活性化合物の量は、好適な剤形が得られるような量である。
【００５１】
薬剤は、例えば不活性増量剤または吸収可能な可食担体と一緒に経口投与することができ、あるいはハードまたはソフトシェルカプセル中に封入することもでき、あるいは圧縮して錠剤にすることもでき、あるいは食生活の食べ物と直接混ぜ合わせることもできる。経口治療投与の場合、それらの活性化合物は、賦形剤と混ぜ合わせ、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態で使用することができる。このような組成物および製剤は、この薬剤を少なくとも０．１％含有すべきである。これらの組成物中の薬剤の割合は、もちろん変えることができ、好都合にはその単位の重量の約２％から約６０％の間であることができる。このような治療に有用な組成物中の薬剤の量は、好適な用量が得られるような量である。
【００５２】
錠剤、カプセル剤などは、トラガントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、バレイショデンプン、またはアルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、およびスクロース、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味剤を含有することができる。剤形の形態がカプセルの場合、上記種類の材料に加えて、脂肪油などの液状担体を含有することもできる。
【００５３】
様々な他の材料が、コーティングとして、あるいは剤形の物理的形態を改変するため、存在することができる。例えば、錠剤をセラック、糖、またはその両方でコーティングすることができる。シロップ剤は、活性成分に加えて、甘味剤としてスクロース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、染料、サクランボまたはオレンジ風味などの香味剤を含有することができる。
【００５４】
本発明のペプチドは、非経口投与することもできる。ペプチドの溶液または懸濁液は、好適にはヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と混ぜ合わせた水中で調製することができる。分散液は、油に溶かしたグリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中で調製することもできる。油の例は、石油、動物、植物、または合成の起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、または鉱油である。一般に水、生理的食塩水、水性デキストロースおよび関連した糖溶液、およびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射剤にとって好ましい液状担体である。貯蔵および使用の通常の条件下において、これらの製剤は微生物の成長を防ぐために保存剤を含有する。
【００５５】
注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液または分散液、ならびに滅菌注射剤または散剤を下準備なしに調製するための滅菌粉末が含まれる。いかなる場合でも、その形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性（syringability）を有する程度に流動的でなければならない。また、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、これらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であることができる。
【００５６】
本発明のこの態様によるペプチドは、エアロゾルの形態で気道へ直接投与することもできる。エアロゾルとして使用する場合、溶液または懸濁液の状態の本発明の化合物を、好適なプロペラント（propellant）、例えばプロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素プロペラントと一緒に、通常のアジュバントと共に加圧エアロゾル容器に詰めることができる。本発明の材料は、例えばネブライザーまたはアトマイザーの場合、非加圧形態で投与することもできる。
【００５７】
本発明のペプチドは、標的の組織、例えばウィルスによる感染を受けやすい組織に直接投与することができる。加えて、および／または、あるいは、薬剤を、標的の組織、器官、または細胞への薬剤の移動（および／またはそれによる取込み）を促進する１種または複数種の薬剤と一緒に非標的部位に投与することもできる。標的の組織はウィルスによる感染を受けやすい任意の組織であることができるが、ＨＩＶ−１感染を阻害する場合の好ましい標的組織には、口、生殖器、および直腸の粘膜が含まれる。通常の当業技術者には明らかなように、治療剤自体が、所望の組織、器官、または細胞へのその輸送（およびそれによる取込み）を促進するように改変される。
【００５８】
送達器具の例には、これらに限定されないが、ネブライザー、アトマイザー、リポソーム、経皮パッチ、インプラント、埋込可能または注射可能なタンパク質デポー組成物、注射器が含まれる。本発明のこの態様をｉｎ ｖｉｖｏで行うために、当業者に知られている他の送達系を使用して、治療剤の所望の器官、組織、または細胞への所望の送達を達成することもできる。
【００５９】
本発明のこの態様を実施するためには、ペプチドの送達のための任意の好適な手法を利用することができる。一般にはこれらペプチドは、ペプチドを標的細胞、組織、または器官に送達するビヒクルに溶かして患者に投与されることになる。
【００６０】
ペプチドを細胞中に送達するための一手法はリポソームの使用を伴う。一般にはそれは、送達される薬剤を含むリポソームを提供し、次いで薬剤を細胞、組織、または器官に送達するのに効果的な条件下でリポソームを標的細胞、組織、または器官と接触させることを伴う。
【００６１】
リポソームは、水性相を封じ込める１層または複数層の同心円状に配列した脂質二分子膜からなる小胞である。これらは、通常、漏出性でないが、膜に孔または多孔が生じた場合、膜が溶解または分解した場合、あるいは膜の温度が相転移温度まで上昇した場合に、漏出性になることができる。リポソームによる薬物送達の現行方法では、リポソーム担体が最終的に透過性になり、標的部位で封入薬物を放出することが必要である。これは、例えばリポソーム二分子膜が体内で様々な物質の作用により徐々に分解される受動的な方法で達成することができる。あらゆるリポソーム組成物は、循環中にまたは体内の他の部位で特徴的な半減期を有し、したがってそのリポソーム組成物の半減期を制御することによって二分子膜の分解速度を多少調節することが可能である。
【００６２】
受動的薬物放出とは対照的に能動的薬物放出は、薬剤を使用してリポソームの小胞の透過性変化を引き起こすことを伴う。リポソーム膜は、環境がリポソーム膜に近い酸性の場合に不安定になるように構築することができる（例えば、本明細書によりその全体が参照により援用されるWang & Huang, “pH-Sensitive Immunoliposomes Mediate Target-cell-specific Delivery and Controlled Expression of a Foreign Gene in Mouse”, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 84:7851-5 (1987) を参照されたい）。リポソームが、例えば標的細胞によってエンドサイトースされる場合、それらを酸性のエンドソームに送ることができ、リポソームが不安定化され、薬物放出を引き起こすことになる。
【００６３】
あるいは、酵素をリポソーム膜上に被膜として配置し、酵素がリポソームをゆっくり不安定化するようにリポソーム膜を化学的に修飾することもできる。薬物放出の制御は、膜中に最初に配置される酵素の濃度に左右されるので、薬物放出を「要望に応じて」達成するように薬物放出を調節または変化させるための真に有効な方法は存在しない。リポソームの小胞が標的細胞と接触するとすぐにそれは飲み込まれることになり、ｐＨの低下が薬物放出を引き起こすことになる点で、ｐＨの影響を受けやすいリポソームの場合も同様の問題が存在する。
【００６４】
このリポソーム送達系は、能動的ターゲッティングにより（例えば、リポソームビヒクルの表面に抗体またはホルモンを組み込むことによって）、標的器官、組織、または細胞に蓄積させることもできる。これは既知の方法により達成することができる。
【００６５】
様々な種類のリポソームを、Bangham et al., “Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellae of Swollen Phospholipids”, J. Mol. Biol. 13:238-52 (1965)、Hsuの米国特許第５，６５３，９９６号、Lee et al.の米国特許第５，６４３，５９９号、Holland et al.の米国特許第５，８８５，６１３号、DzauおよびKanedaの米国特許第５，６３１，２３７号、およびLoughrey他の米国特許第５，０５９，４２１号（これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）に従って調製することができる。
【００６６】
これらのリポソームは、本発明の治療剤に加えて抗炎症薬などの他の治療剤を含有するように作製することができ、次いでこれらは標的部位で放出される（例えば、Wolff et al., “The Use of Monoclonal Anti-Thy1l IgG1 for the Targeting of Liposomes to AKR-A Cells in Vitro and in Vivo”, Biochim. Biophys. Acta 802:259-73 (1984)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。
【００６７】
タンパク質またはポリペプチド剤（例えば、本発明のペプチド）を送達するための代替手法は、所望のタンパク質またはポリペプチドをポリマーに結合させることを伴う。このポリマーは、その結合タンパク質またはポリペプチドの酵素による分解を避けるように安定化される。この種の結合タンパク質またはポリペプチドは、Ekwuribeの米国特許第５，６８１，８１１号（本明細書によりその全体が参照により援用される）に記載されている。
【００６８】
タンパク質またはポリペプチド剤を送達するためのさらに別の手法は、Heartlein et al.の米国特許第５，８１７，７８９号（本明細書によりその全体が参照により援用される）に記載されているキメラタンパク質の調製を伴う。キメラタンパク質は、リガンドドメインおよびポリペプチド剤（例えば、本発明の人為的αヘリックス）を含むことができる。リガンドドメインは、標的細胞上に位置する受容体に特異的である。したがって、キメラタンパク質が血液またはリンパ液中へ経静脈的に送達されるか、または他の方法で導入される場合、キメラタンパク質は標的の細胞に吸着することになり、標的の細胞はキメラタンパク質を内在化することになる。
【００６９】
投与は、必要に応じてしばしば行うことができ、またウィルス感染に対して有効な治療を施すのに適した期間行うことができる。例えば投与は、１回の徐放性投与製剤により、または１日複数回投与により行うことができる。投与は、被験体がウィルスに触れる前に、それと同時に、および／または後に行うことができる。
【００７０】
投与量は、もちろん治療計画に応じて変わる。一般には薬剤は、ウィルスの感染性の低下に有効な量（すなわち治療に有効な量）を達成するように投与される。したがって治療に有効な量は、ウィルスの被験体への感染またはウィルスの被験体中での拡散を少なくとも部分的に防止することができる量であることができる。有効な量を得るのに必要な用量は、薬剤、処方、ウィルス、および薬剤が投与される個体に応じて変えることができる。
【００７１】
有効量の決定は、薬剤の様々な用量を培養液中で細胞に投与するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを伴うこともでき、感染性を抑制するのに有効な薬剤濃度がｉｎ ｖｉｖｏで必要とされる濃度を計算するために求められる。有効量は、ｉｎ ｖｉｖｏでの動物による検討に基づくこともできる。治療に有効な量は、当業者が経験的に決めることができる。
【００７２】
本発明の第二の態様は、本発明のペプチドを用いたＨＩＦ １α−ｐ３００／ＣＢＰ相互作用の阻害に関する。本発明のこの態様の一実施形態は、ＨＩＦ １αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用が仲介する細胞中の遺伝子の転写を低減させる方法に関する。この方法は、ペプチドの核取り込みを生じさせるのに効果的な条件下で細胞を本発明のペプチドと接触させることを伴い、ペプチドは、ＨＩＦ−１αとｐ３００／ＣＢＰの相互作用を妨害し、それによって遺伝子の転写を低減させる。転写がＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の相互作用によって仲介される遺伝子には、アデニル酸キナーゼ３、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、エノラーゼ１、グルコース輸送体１、グルコース輸送体３、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、インスリン様増殖因子２、ＩＧＦ結合タンパク質１、ＩＧＦ結合タンパク質３、乳酸脱水素酵素Ａ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１、ピルビン酸キナーゼＭ、ｐ２１、トランスフォーミング増殖因子β３、セルロプラスミン、エリスロポエチン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、α１Ｂ−アドレナリン受容体、アドレノメデュリン、エンドセリン−１、ヘムオキシゲナーゼ１、一酸化窒素シンターゼ２、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、脈管内皮増殖因子、脈管内皮増殖因子受容体ＦＬＴ−１、脈管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、およびｐ３５ｓｒｇが含まれる。これらの遺伝子の転写を阻害するための幾つかの使用法を表１に示す。
【００７３】
【表１】
【００７４】
本発明のこの態様の別の実施形態は、ＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の相互作用が仲介する障害の治療または予防を必要としている被験体に対する治療または予防方法に関する。この方法は、障害を治療または予防するのに効果的な条件下で本発明のペプチドを被験体に投与することを伴う。
【００７５】
治療または予防することができる障害には、例えば網膜虚血（Zhu et al., “Long-term Tolerance to Retinal Ischemia by Repetitive Hypoxic Preconditioning: Role of HIF-1α and Heme Oxygenase-1”, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48:1735-43 (2007)、Ding et al., “Retinal Disease in Mice. Lacking Hypoxia-inducible Transcription Factor-2a”, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46:1010-6 (2005)、本明細書によりこれらの全体が参照により援用される）、肺高血圧症（Simon et al., “Hypoxia-induced Signaling in the Cardiovascular System”, Annu. Rev. Physiol. 70:51-71 (2008)、Eul et al., “Impact of HIF-1α and HIF-2α on Proliferation and Migration of Human Pulmonary Artery Fibroblasts in Hypoxia”, FASEB J. 20: 163-5 (2006)、本明細書によりこれらのそれぞれはその全体が参照により援用される）、子宮内発育遅延（Caramelo et al., “Respuesta a la Hipoxia. Un Mecanismo Sistemico Basado en el Control de la Expresion Genica [Response to Hypoxia. A Systemic Mechanism Based on the Control of Gene Expression]”, Medicina B. Aires 66: 155-{54 (2006)、Tazuke et al., “Hypoxia Stimulates Insulin-like Growth Factor Binding Protein I (IGFBP-1) Gene Expression in HepG2 Cells: A Possible Model for IGFBP-1 Expression in Fetal Hypoxia”, Proc. Nat’l Acad Sci. USA 95:10188-93 (1998)、これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）、糖尿病性網膜症（Ritter et al., “Myeloid Progenitors Differentiate into Microglia and Promote Vascular Repair in a Model of Ischemic Retinopathy”, J. Clin Invest. 116:3266-76 (2006)、Wilkinson-Berka et al., “The Role of Growth Hormone, Insulin-like Growth Factor and Somatostatin in Diabetic Retinopathy", Curr. Med Chem. 13:3307-17 (2006)、Vinores et al., “Implication of the Hypoxia Response Element of the Vegf Promoter in Mouse Models of Retinal and Choroidal Neovascularization, but Not Retinal Vascular Development”, J. Cell. Physiol. 206:749-58 (2006)、Caldwell et al., “Vascular Endothelial Growth Factor and Diabetic Retinopathy: Role of Oxidative Stress”, Curr. Drug Targets 6:511-24 (2005)、これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）、加齢黄斑変性症（Inoue et al., “Expression of Hypoxia-inducible Factor 1a and 2a in Choroidal Neovascular Membranes Associated with Age-related Macular Degeneration”, Br. J Ophthalmol. 91:1720-1 (2007)、Zuluaga et al., “Synergies of VEGF Inhibition and Photodynamic Therapy in the Treatment of Age-related Macular Degeneration”, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48:1767-72 (2007)、Provis, “Development of the Primate Retinal Vasculature”, Prog. Retin Eye Res. 20:799-821 (2001)、これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）、糖尿病性黄斑浮腫（Vinores et al., “Implication of the Hypoxia Response Element of the Vegf Promoter in Mouse Models of Retinal and Choroidal Neovascularization, but Not Retinal Vascular Development”, J. Cell. Physiol. 206:749-58 (2006)、Forooghian & Das, “Anti-angiogenic Effects of Ribonucleic Acid Interference Targeting Vascular Endothelial Growth Factor and Hypoxia-inducible Factor-1α”, Am. J Ophthalmol. 144:761-8 (2007)、これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）、および癌（Marignol et al., “Hypoxia in Prostate Cancer: A Powerful Shield Against Tumour Destruction?”, Cancer Treat. Rev. 34:313-27 (2008)、Galanis et al., “Reactive Oxygen Species and HIF-1 Signalling in Cancer”, Cancer Lett. 266:12-20 (2008)、Ushio-Fukai & Nakamura, “Reactive Oxygen Species and Angiogenesis: NADPH Oxidase as Target for Cancer Therapy”, Cancer Lett. 266:37--52 (2008)、Adamski et al., “The Cellular Adaptations to Hypoxia as Novel Therapeutic Targets in Childhood Cancer”, Cancer Treat. Rev. 34:231-46 (2008)、Toffoli & Michiels, “Intermittent Hypoxia Is a Key Regulator of Cancer Cell and Endothelial Cell Interplay in Tumours”, FEBS J. 275:2991-3002 (2008)、これらのそれぞれは本明細書によりその全体が参照により援用される）が含まれる。
【００７６】
本発明のこの態様のさらに別の実施形態は、組織における脈管形成の低減または防止方法に関する。この方法は、その組織における脈管形成を低減または防止するのに効果的な条件下で組織を本発明のペプチドと接触させることを伴う。本発明のこの態様の別の実施形態は、細胞のアポトーシスを誘発する方法に関する。この方法は、その細胞のアポトーシスを誘発するのに効果的な条件下で細胞を本発明のペプチドと接触させることを伴う。本発明のこの態様の別の実施形態は、細胞の生存および／または増殖を低下させる方法に関する。この方法は、その細胞の生存および／または増殖を低下させるのに効果的な条件下で細胞を本発明のペプチドと接触させることを伴う。本発明のこの態様による接触（投与を含む）は、熟練者には明らかな、また上記で述べた方法を用いて行うことができ、またｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。
【００７７】
上記実施形態に対する標的細胞、組織、および／または器官の幾つかの例を、表２に示す。
【００７８】
【表２】
【００７９】
本発明の別の態様は、ＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の相互作用を阻害する可能性のある薬剤の同定方法に関する。この方法は、本発明のペプチドを提供すること、ペプチドを被検物質と接触させること、および被検物質がペプチドと選択的に結合するかどうかを検出することを含み、ペプチドと選択的に結合する被検物質を、ＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の間の相互作用の潜在的な阻害剤として同定する。
【００８０】
本発明のこの態様は、熟練者には明らかな様々な方法で行うことができる。例えば、本発明のペプチドに対する被検物質の親和性は、実施例４で述べる等温滴定熱量測定分析を用いて測定することができる（Wiseman et al., “Rapid Measurement of Binding Constants and Heats of Binding Using a New Titration Calorimeter”, Anal. Biochem. 179:131-7 (1989)、Freire et al., “Isothermal Titration Calorimetry”, Anal. Chem. 62:A950-A959 (1990)、Chervenak & Toone, “Calorimetric Analysis of the Binding of Lectins with Overlapping Carbohydrate-binding Ligand Specificities”, Biochemistry 34:5685-95 (1995)、Aki et al., “Competitive Binding of Drugs to the Multiple Binding Sites on Human Serum Albumin. A Calorimetric Study”, J Thermal Anal. Calorim. 57:361-70 (1999)、Graziano et al., “Linkage of Proton Binding to the Thermal Unfolding of Sso7d from the Hyperthermophilic Archaebacterium Sulfolobus solfataricus”, Int’l Biol. Macromolecules 26:45-53 (1999)、Pluschke & Mutz, “Use of Isothermal Titration Calorimetry in the Development of Molecularly Defined Vaccines”, J. Thermal Anal. Calorim. 57:377-88 (1999)、Corbell et al., “A Comparison of Biological and Calorimetric Analyses of Multivalent Glycodendrimer Ligands for Concanavalin A”, Tetrahedron-Asymmetry 11:95-111 (2000)、これらは本明細書によりその全体が参照により援用される）。一実施形態では、被検物質と本発明のペプチドの解離定数（Ｋｄ）が５０μＭ以下の場合、被検物質をＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の間の相互作用の潜在的な阻害剤として同定する。別の実施形態では、Ｋｄは２００ｎＭ以下である。さらに別の実施形態では、Ｋｄは１００ｎＭ以下である。
【００８１】
ＨＩＦ−１α−ｐ３００／ＣＲＥＢ相互作用の潜在的な阻害剤として同定された被検物質は、ＨＩＦ−１αとＣＢＰおよび／またはｐ３００の間の相互作用を阻害するそれらの能力を確認するために更なる試験にかけることができる。
【００８２】
本発明は、下記の実施例を参照することによりさらに例示することができる。
【実施例】
【００８３】
実施例１―ルシフェラーゼアッセイによるプロモーター活性の分析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＨＲＥ−Ｌｕｃ細胞を、１０％ウシ胎児血清および０．４ｇ／ＬのGeneticin（G418硫酸塩、RPI Corporation）を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）中で保持した。細胞を、６．５×１０４細胞／ｍＬ懸濁液１ｍＬを用いて２４ウェルの皿（BD Falcon）に密度６×１０４細胞／ウェルで塗布した。付着後、細胞を１０ｎＭから１μＭまでの範囲にわたる濃度のＨＢＳヘリックスまたはケトミンを含有する新鮮な培地１ｍＬで処理した。細胞を、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃で６時間インキュベートした。メシル酸デフェロキサミン（ＤＦＯ、Sigma）を３００μＭの最終濃度まで加えることによって低酸素を誘導し、細胞をさらに１８時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いでCell Culture Lysis Reagent（「ＣＣＬＲ」、Promega）１５０μＬを加えることによって全細胞ライセートを単離した。ライセートを集め、４℃において１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、等分し、−８０℃で貯蔵した。ルシフェラーゼアッセイを、Turner TD-20e Luminometerを用いて製造業者の使用説明書（Promega）に従って行った。相対照度の測定値を、ブラッドフォード検定を行うことによって標準化してルシフェラーゼアッセイ中に使用されたライセートのタンパク質含量を求めた。簡単に言うと、１．５ｍＬキュベット中で５０μＬの細胞ライセート／ルシフェラーゼアッセイ試薬混合物を、２００μＬのブラッドフォード試薬および７５０μＬのMillipore waterに加えた。１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液の適正量を用いて１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲でタンパク質標準物を作った。DU-800分光光度計を用いて吸光度を５９５ｎｍにおいて測定した。実験は３回行い、エラーバーを平均値の標準誤差として計算した。
【００８４】
実施例２―ｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の分析
リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７細胞中でのＶＥＧＦおよびＧＬＵＴ１遺伝子発現レベルに及ぼすＨＢＳヘリックスの影響を正常酸素および低酸素条件の両方で調べた。ＶＥＧＦ分析の場合、順方向プライマー５’−ＡＧＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＡ−３’（配列番号１１４）および逆方向プライマー５’−ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＴＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＣＴ ＧＡ−３’（配列番号１１５）を用いて遺伝子の３’翻訳領域から１０４ｂｐフラグメントを増幅した。ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）分析の場合、順方向配列５’−ＴＡＧ ＡＡＡ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＴＧ Ｃ−３’（配列番号１１６）および逆方向配列５−ＧＧＴ ＡＡＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＡＴ Ｔ−３’（配列番号１１７）を利用して１７９ｂｐの産物を得た。β−グルクロニダーゼの発現レベルはこれら実験条件下で不変のままなので、それらを内在性対照として使用した。順方向プライマー５’−ＣＴＣ ＡＴＴ ＴＧＧ ＡＡＴ ＴＴＴ ＧＣＣ ＧＡＴ Ｔ−３’（配列番号１１８）および逆方向プライマー５’−ＣＣＧ ＡＧＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ Ａ−３’（配列番号１１９）をこの遺伝子に対して使用した。温度サイクルおよびＳＹＢＲ緑色発光の検出は、ABI 7300リアルタイムＰＣＲ装置により行った。データはABI Sequence Detection System, version 1.2により分析した。統計分析は６回の独立した実験からのデータで行った。実験は、Applied Biosystems SYBR Green RT-PCR master mixを用いて行った。
【００８５】
実施例３―ＥＬＩＳＡによるタンパク質レベルの決定
ＭＣＦ−７細胞を、１．１×１０５細胞／ｍＬ懸濁液１ｍＬを用いて２４ウェルの培養皿（BD Falcon）に密度１．１×１０５細胞／ウェルで塗布した。付着後、細胞を吸引し、実施例１で述べたと同様に濃度１０ｎＭから１μＭまでの範囲にわたってスポリデスミンまたはケトミンを含有する培地１ｍＬで処理した。３７℃および５％のＣＯ２における６時間のインキュベーション期間の後、培養液を３００ｎＭ ＤＦＯでスパイクし、１８時間インキュベートすることによって低酸素を誘導させた。細胞培養液上清を集め、１０，０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離し、２００μＬに等分してＥＬＩＳＡアッセイ用の９６ウェルプレート（R&D Systems）に入れた。これは製造業者のプロトコルに従って行った。吸光度測定値は、Bio-Tek μQuantマイクロプレートリ−ダーを用いて４５０ｎｍで採取した。処理した細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで培養細胞溶解試薬（Promega）を１ウェル当たり１５０μＬ加えることによって全細胞ライセートを同時に単離した。ライセートを集め、４℃において１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、−８０℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡと並行して、全細胞ライセートの総タンパク質レベルをブラッドフォードアッセイにより求め、上清中の測定ＶＥＧＦ濃度を標準化した。この過程は、ＶＥＧＦの阻害がＨＩＦ−１α介在性転写の阻止に特異的であり、転写機構の全体的破壊に起因するものではないことを確かめるためであった。試料および標準物はブラッドフォード試薬（Bio-Rad）４０μＬおよびタンパク質／水混合物１６０μＬを用いて調製し、吸光度は５９５ｎｍにおいてBio-Tek μQuantマイクロプレートリ−ダーを用いて測定した。
【００８６】
実施例４―細胞培養液中のＶＥＧＦ転写を調節するＨＢＳヘリックスの設計、合成、および評価
ｐ３００／ＣＢＰのＣＨ１ドメインは、図１Ａに示すように三角形の幾何形状を有し、ＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤの折りたたみのための足場として働く。図１Ａおよび図１Ｃに示すＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤのヘリックスαＡは、ＣＨ１ドメインとＨＩＦ−１αの間の相互作用にとって重要である。その理由は、残基の変異または８０３番Ａｓｎのヒドロキシル化がこの複合体を破壊し、ＨＩＦ−１α介在性転写を阻害することが知られているためである（Freedman et al., “Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1α”, Proc., Nat’l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002)、Dames et al., “Structural Basis for Hif-1α/CBP Recognition in the Cellular Hypoxia Response”, Proc., Nat’l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002)）。ＶＥＧＦ転写の潜在的な阻害剤としてのＨＢＳヘリックスの開発は、ＨＩＦ−１のａＡヘリックス領域を模倣することによって始めた。このヘリックスは、８個の残基、ＳＹＤＣＥＶＮＡＰ（配列番号１２０）からなり、ｐ３００／ＣＢＰを結合させるのに重要な３個の残基、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕを特徴とする。幾つかの直鎖ペプチドおよびそれらのＨＢＳαヘリックス類似体を設計して細胞培養液中のＶＥＧＦ転写を阻害するそれら分子の潜在能力を評価した。表３は、それらの検討の一部として設計され、試験された代表的な化合物を一覧表にする。下記に記載した手順を用いてそれぞれの非拘束ペプチドおよびＨＢＳヘリックスを合成した（Dimartino et al., “Solid-phase Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate-derived α-Helices”, Org. Lett. 7:2389-92 (2005)、Chapman & Arora, “Optimized Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate Helices: Surprising Effects of Microwave Heating on the Activity of Grubbs Catalysts”, Org. Lett. 8:5825-8 (2006)）。各ペプチドのヘリックス度％は、下記に記載したように１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中で円二色性分光法を用いて求めた（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)）。ｐ３００に対する各ペプチドの親和性は、等温滴定熱量測定分析によって測定した（Wiseman et al., “Rapid Measurement of Binding Constants and Heats of Binding Using a New Titration Calorimeter”, Anal. Biochem. 179:131-7 (1989)、Freire et al., “Isothermal Titration Calorimetry”, Anal. Chem. 62:A950-A959 (1990)、Chervenak & Toone, “Calorimetric Analysis of the Binding of Lectins with Overlapping Carbohydrate-binding Ligand Specificities”, Biochemistry 34:5685-95 (1995)、Aki et al., “Competitive Binding of Drugs to the Multiple Binding Sites on Human Serum Albumin. A Calorimetric Study”, J Thermal Anal. Calorim. 57:36170 (1999)、Graziano et al., “Linkage of Proton Binding to the Thermal Unfolding of Sso7d from the Hyperthermophilic Archaebacterium Sulfolobus solfataricus”, Int’l J. Biol. Macromolecules 26:45-53 (1999)、Pluschke & Mutz, “Use of Isothermal Titration Calorimetry in the Development of Molecularly Defined Vaccines”, J. Thermal Anal. Calorim. 57:377-88 (1999)、Corbell et al., “A Comparison of Biological and Calorimetric Analyses of Multivalent Glycodendrimer Ligands for Concanavalin A”, Tetrahedron-Asymmetry 11:95-111 (2000)）。細胞培養液中のＶＥＧＦ転写を下方制御する各ペプチドの能力を、上記と同様に等温熱量分析および定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。各ペプチドの細胞毒性は、１μＭ濃度の個々ペプチドの存在下で細胞の成長および集団倍加をモニターすることによって判定した。表３は、第一世代ＨＢＳヘリックスおよびペプチド誘導体について得られた結果を要約し、これらの値をケトミン（２）で観察されたものと比較する。
【００８７】
【表３】
【００８８】
ＨＢＳペプチド（２０）は、ＨＩＦ−１αＡヘリックスの直接の模倣体だが、セリン７９７番残基がアラニンで置換されている。この変異は合成方法を簡単にするために入れられたが、ＨＩＦ−１／ｐ３００構造の点検の結果、セリン７９７番が界面で重要な役割を果たさないことが示唆されたからである（Freedman et al., “Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1α”, Proc., Nat’l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002)、Dames et al., “Structural Basis for Hif-1α/CBP Recognition in the Cellular Hypoxia Response”, Proc., Nat’l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002)、これらは本明細書によりその全体が参照により援用される）。
【００８９】
この置換がｐ３００の結合を混乱させないことを、直鎖ペプチド（２３）および（２４）を合成しかつ特性を明らかにすることによって確かめた（表３）。ＨＢＳペプチド（２０）は、対応する非拘束類似体であるペプチド（２４）よりもヘリックス度が著しく大きく、ｐ３００と５４０ｎＭの親和性で結合する。ＨＢＳペプチド（２１）は、システイン８００番の代わりにバリン残基を含有する。バリンは、システイン８００番がｐ３００上の疎水性ポケットを標的にするという前提に基づいて導入し、より疎水性の残基でこの残基を置換することにより、結合の強化がもたらされる（Gu et al., “Molecular Mechanism of Hypoxia-inducible Factor 1α-p300 Interaction”, J. Biol. Chem. 276:3550-4 (2001)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。ＨＢＳペプチド（２１）は、親化合物であるＨＢＳペプチド（２０）よりもわずかに低い親和性でｐ３００に結合するが、これは、バリンが、一般にシステインが占める位置における最適な残基ではないことを示唆している。ＨＢＳヘリックス（２０）、（２１）および非拘束ペプチド（２３）、（２４）は、かなりの親和性でｐ３００に結合したが、これらのペプチドの各々は細胞培養液中でＶＥＧＦ転写を阻害しなかった。
【００９０】
ペプチドがＶＥＧＦ転写を阻害することができないことは、これらすべてのペプチドが生理的ｐＨにおいて全体として負電荷を有し、細胞透過性ペプチドはカチオン性残基に富むことが多いので、それらが細胞膜を越えることができないことを反映していると推測された（Joliot & Prochiantz, “Transduction Peptides: From Technology to Physiology”, Nat. Cell Biol. 6:189-96 (2004)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。Verdineおよび共同研究者は、側鎖架橋ヘリックスの細胞取込みの顕著な増加が、負電荷を中和し、かつカチオン性残基の限定された組を含むことによって観察されることを最近実証した（Bernal et al., “Reactivation of the p53 Tumor Suppressor Pathway by a Stapled p53 Peptide”, J. Am. Chem. Soc. 129:5298 (2007)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。したがって、親配列から誘導されるがＣ末端アルギニン残基を含有するＨＢＳヘリックス（２２）を設計し、アルギニン残基を加えることが、ヘリックスマクロ双極子の安定化、およびアルギニンの側鎖基とグルタミン酸残基の間のｉとｉ＋４のイオン性相互作用の電位形成によってヘリックス含量を増加させるかどうかを検討し試験した（Shi et al., “Stabilization of α-Helix Structure by Polar Side-chain Interaction: Complex Salt Bridges, Cation-πInteractions, and C-H…OH-bonds”, Peptide Sci. 60:366-80 (2002)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。これらの人為的ヘリックスの合成を簡単にするために、大環状化合物中のチロシン残基をアラニン（側鎖保護を必要としない残基）で置換した。野生型配列ではバリンによって占められ、結合相互作用に関与しないと予想される８０２番の位置に、代わりとしてチロシン残基を導入した。ペプチド濃度の定量のためにチロシンまたはトリプトファン残基を入れた。ペプチド（２５）をＨＢＳヘリックス（２２）の非拘束類似体として設計した。
【００９１】
ＨＢＳヘリックス（２２）は、可能性として円二色性分光法によって測定されるそのより高いヘリックス含量が理由で、ＨＢＳヘリックス（２０）、（２１）、ペプチド（２５）、およびその対応する非拘束ペプチドよりも強い親和性でｐ３００と結合した（表３および図６参照）。ＨＢＳヘリックスのＣＤスペクトルは、２０４および２２２ｎｍにおいてαヘリックスの特徴である二重極小を示し、２２２ｎｍにおける値は、拘束ペプチド（２２）が約５５％ヘリックスであることを示す（Wang et al., “Evaluation of Biologically Relevant Short α-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate”, J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。予想されるように対照ペプチド（２５）は構造化されていないように見える。
【００９２】
表３および図７に示すようにＨＢＳヘリックス（２２）は、ケトミン（２）によって得られるものに相当するレベルでＨｅＬａ細胞におけるＶＥＧＦ転写を阻害し、一方、直鎖対照ペプチド（２５）の効果はごくわずかであった。αヘリックス立体配座中のペプチドの安定化はそれらのプロテアーゼ抵抗性を向上させると予想されるので、この結果は非拘束ペプチドのタンパク質分解に対する不安定性を潜在的には反映している（Tyndall et al., “Proteases Universally Recognize Bata Strands in their Active Sites”, Chem. Rev. 105:973-99 (2005)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。ＨＢＳαヘリックスのタンパク質分解安定性の改良は、それらの非拘束の対応するものと比較して下記に報告されている（Wang et al., “Enhanced Metabolic Stability and Protein-binding Properties of Artificial α Helices Derived from a Hydrogen-bond Surrogate: Application to Bcl-xL”, Angew. Int’l Ed. Engl. 44:65259 (2005)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。ＨＢＳヘリックス（２２）は、ペプチドの全体としての電荷を変え、ヘリックス立体配座を安定化するように設計された。
【００９３】
２００ｎＭのケトミンが概略で１μＭのＨＢＳヘリックス（２２）と同様の阻害レベルを与えるので、ケトミンはＨＢＳヘリックス（２２）よりもＶＥＧＦ転写の強い阻害剤である。しかしながら、ケトミンは毒性のある試薬であることが知られており、一方、ＨＢＳヘリックス（２２）は、図８に示すように細胞成長アッセイにおいて明らかな毒性を示さなかった。したがって、ＨＢＳヘリックス（２２）は、ケトミンに伴う明らかな毒性なしにＶＥＧＦ転写の強い阻害を示すようである。
【００９４】
実施例５―ｐ３００／ＣＢＰ ＣＨ１ドメインを標的する第二世代ＨＢＳヘリックスの合成および特徴づけ
実施例４で述べた結果により、ＨＢＳヘリックス（２２）が、細胞培養液中でのＨＩＦ−１／ｐ３００相互作用を効果的に阻害することができることが示唆される。これらの研究は、同様の効果はペプチド（２０）上の配列置換によっても得ることができるが、ＨＢＳヘリックス（２２）における末端アルギニンの存在が細胞培養液の検討で効果を増大させるのに重要であり得ることを意味する。最適化ＨＢＦ ＨＩＦ−１模倣体を開発するために、表４に示すようにペプチド（２０）および（２２）から誘導される類似体を評価する追加の実験を企図する。幾種類かの化合物を調製して、細胞培養液中のこれら化合物の活性に及ぼす電荷の役割を評価する。ＨＢＳペプチド（４４）は、グルタミン酸残基でｉとｉ＋４の塩橋を形成することができる末端アルギニンを有するペプチド（２０）の類似体である。類似体（４５）は、２つの正に荷電した残基からなる。ペプチド（４４）におけるアルギニン残基によるアスパラギンの置換は、別のｉとｉ＋４の塩橋（アスパラギン酸残基で）を与えることができ、潜在的にはさらにヘリックス立体配座を安定化する（Shi et al., “Stabilization of α Helix Structure by Polar Side-chain Interaction: Complex Salt Bridges, Cation-πInteractions, and C-H---OH-bonds”, Peptide Sci. 60:366-80 (2002)、本明細書によりその全体が参照により援用される）。ＨＢＳヘリックス（４６）はペプチド（２２）のジアルギニン類似体（２２）であり、最も活性なＨＢＳヘリックスを構築するために設計した。ペプチド（２２）の細胞分布を評価するためにフルオレセイン標識誘導体（４７）を調製することができる。必要に応じて他の蛍光類似体も調製することもできる。
【００９５】
【表４】
【００９６】
これらのＨＢＳヘリックスは、ＨＩＦ−１のαＡヘリックスを模倣していた。ＨＩＦ−１における第二ヘリックス（αＢ）の模倣体も評価することができる。例えば、ＨＢＳヘリックス（４８）は、αＢヘリックスの直接の模倣体の代表である。任意のＨＢＳヘリックスの非拘束ペプチド類似体はルーチンで調製し、ＨＢＳヘリックスと一緒に評価することができる。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態を本明細書中に示し説明してきたが、このような実施形態が例として提供されるに過ぎないことは当業者には明らかであろう。そこで、非常に多くの変形形態、改変形態、および代替形態が、本発明から逸脱することなく当業者には思い浮かぶはずである。本発明の実施に際しては本発明書中で述べた本発明の実施形態に対する様々な代替案を使用することができることを理解されたい。別添の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、それらの請求項の範囲内にある方法および構造ならびにそれらの同等物がそれによって含まれることを意図している。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数種の安定な内部拘束α−ヘリックス構造を有するペプチドであって、低酸素誘導因子１αのＣ末端トランス活性化ドメインのヘリックスαＡまたはヘリックスαＢを模倣した配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、式Ｉ
【化１】
のペプチドであり、
式中、
【化２】
は、炭素−炭素単結合または二重結合であり、ここで、前記炭素−炭素二重結合はｃｉｓまたはｔｒａｎｓであり、
各ｎは、独立して１または２であり、
ｍは、０または任意の正の整数であり、
Ｒ１は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ４、−ＣＨ２ＮＨ２、アルキル基、アリール基、または水素であり、ここで、Ｒ４はアルキルまたはアリールであり、
あるいは、Ｒ１が、式
【化３】
（式中、Ａ５は、ペプチド、アミノ酸残基、アシル基、または水素であり、各Ｒ５は、独立してアミノ酸側鎖、水素、アルキル、またはアリール基である）
を有し、
Ｒ２は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基であり、
Ｒ３は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ７）２、アルキル基、アリール基、または水素であり、ここで、Ｒ６は、アルキル基またはアリール基であり、各Ｒ７は、独立して、アミノ酸側鎖、水素、アルキル基、またはアリール基であり、
Ａ１、Ａ２、およびＡ４は、それぞれ独立して
【化４】
（式中、各Ｒ８は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）であり、
Ａ３は、
【化５】
（式中、各Ｒ９は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
（ｉ）Ａ１はＴｈｒであり、Ａ２はＳｅｒまたはＡｌａであり、Ａ３はＴｙｒまたはＡｌａであり、Ａ４は式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７を含み、ここで、Ｘ１はＡｓｐまたはＡｓｎであり、Ｘ２はＶａｌ、Ｃｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ３はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ４はＶａｌまたはＴｙｒであり、Ｘ５はＡｓｎまたはＡｒｇであり、Ｘ６はＡｌａであり、Ｘ７はＡｒｇまたは不在であり、あるいは
（ｉｉ）Ａ１およびＡ２は、独立して、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ａ３はＬｅｕであり、Ａ４は、式ＬＲＸ８ＬＸ９を含み、ここで、ＬはＬｅｕであり、ＲはＡｒｇであり、Ｘ８はＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ９はＡｓｐまたはＡｓｎである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、
【化６】
（式中、ｍおよびｎは、独立して、１または２であり、Ｘは、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）
からなる群から選択される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、低酸素誘導因子１αのＣ末端トランス活性化ドメインの少なくとも残基７９６番〜８０４番または残基８１６番〜８２３番を模倣している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドおよび薬学的に許容できるビヒクルを含む、医薬組成物。
【請求項７】
低酸素誘導因子１αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用によって仲介される細胞における遺伝子の転写を低減させる方法であって、前記遺伝子の転写を低減させるのに効果的な条件下で前記細胞を請求項１に記載のペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項８】
前記遺伝子が、アデニル酸キナーゼ３、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、エノラーゼ１、グルコース輸送体１、グルコース輸送体３、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、インスリン様増殖因子２、ＩＧＦ結合タンパク質１、ＩＧＦ結合タンパク質３、乳酸脱水素酵素Ａ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１、ピルビン酸キナーゼＭ、ｐ２１、トランスフォーミング増殖因子β３、セルロプラスミン、エリスロポエチン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、α１Ｂ−アドレナリン受容体、アドレノメデュリン、エンドセリン−１、ヘムオキシゲナーゼ１、一酸化窒素シンターゼ２、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、脈管内皮増殖因子、脈管内皮増殖因子受容体ＦＬＴ−１、脈管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、およびｐ３５ｓｒｇからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
治療または予防が必要な被験体において低酸素誘導因子１αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用によって仲介される障害を治療または予防する方法であって、前記障害を治療または予防するのに効果的な条件下で前記被験体に請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記障害が、網膜虚血、肺高血圧症、子宮内発育遅延、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、および癌からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組織における脈管形成を低減または防止する方法であって、前記組織における脈管形成を低減または防止するのに効果的な条件下で前記組織を請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
前記方法が、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が腫瘍である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞においてアポトーシスを誘発する方法であって、前記細胞のアポトーシスを誘発するのに効果的な条件下で前記細胞を請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項１５】
細胞の生存および／または増殖を低下させる方法であって、前記細胞の生存および／または増殖を低下させるのに効果的な条件下で前記細胞を請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項１６】
前記細胞が、癌性であるか、または癌細胞を含有する組織の内皮脈管構造内に含まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の潜在的なリガンドの同定方法であって、
請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドを提供すること、
前記ペプチドを被検物質と接触させること、および
前記被検物質が前記ペプチドと選択的に結合するかどうかを検出し、前記ペプチドと選択的に結合する被検物質をＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の潜在的なリガンドとして同定すること
を含む、方法。
【請求項１８】
ｍおよびｎが１であるか、ｍが１でありｎが２であるか、ｍが２でありｎが１であるか、あるいはｍおよびｎの両方が２である、請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチド。
【請求項１】
１種または複数種の安定な内部拘束α−ヘリックス構造を有するペプチドであって、低酸素誘導因子１αのＣ末端トランス活性化ドメインのヘリックスαＡまたはヘリックスαＢを模倣した配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、式Ｉ
【化１】
のペプチドであり、
式中、
【化２】
は、炭素−炭素単結合または二重結合であり、ここで、前記炭素−炭素二重結合はｃｉｓまたはｔｒａｎｓであり、
各ｎは、独立して１または２であり、
ｍは、０または任意の正の整数であり、
Ｒ１は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ４、−ＣＨ２ＮＨ２、アルキル基、アリール基、または水素であり、ここで、Ｒ４はアルキルまたはアリールであり、
あるいは、Ｒ１が、式
【化３】
（式中、Ａ５は、ペプチド、アミノ酸残基、アシル基、または水素であり、各Ｒ５は、独立してアミノ酸側鎖、水素、アルキル、またはアリール基である）
を有し、
Ｒ２は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基であり、
Ｒ３は、アミノ酸、ペプチド、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ７）２、アルキル基、アリール基、または水素であり、ここで、Ｒ６は、アルキル基またはアリール基であり、各Ｒ７は、独立して、アミノ酸側鎖、水素、アルキル基、またはアリール基であり、
Ａ１、Ａ２、およびＡ４は、それぞれ独立して
【化４】
（式中、各Ｒ８は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）であり、
Ａ３は、
【化５】
（式中、各Ｒ９は、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
（ｉ）Ａ１はＴｈｒであり、Ａ２はＳｅｒまたはＡｌａであり、Ａ３はＴｙｒまたはＡｌａであり、Ａ４は式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７を含み、ここで、Ｘ１はＡｓｐまたはＡｓｎであり、Ｘ２はＶａｌ、Ｃｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ３はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ４はＶａｌまたはＴｙｒであり、Ｘ５はＡｓｎまたはＡｒｇであり、Ｘ６はＡｌａであり、Ｘ７はＡｒｇまたは不在であり、あるいは
（ｉｉ）Ａ１およびＡ２は、独立して、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ａ３はＬｅｕであり、Ａ４は、式ＬＲＸ８ＬＸ９を含み、ここで、ＬはＬｅｕであり、ＲはＡｒｇであり、Ｘ８はＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ９はＡｓｐまたはＡｓｎである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、
【化６】
（式中、ｍおよびｎは、独立して、１または２であり、Ｘは、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である）
からなる群から選択される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、低酸素誘導因子１αのＣ末端トランス活性化ドメインの少なくとも残基７９６番〜８０４番または残基８１６番〜８２３番を模倣している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドおよび薬学的に許容できるビヒクルを含む、医薬組成物。
【請求項７】
低酸素誘導因子１αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用によって仲介される細胞における遺伝子の転写を低減させる方法であって、前記遺伝子の転写を低減させるのに効果的な条件下で前記細胞を請求項１に記載のペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項８】
前記遺伝子が、アデニル酸キナーゼ３、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、エノラーゼ１、グルコース輸送体１、グルコース輸送体３、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、インスリン様増殖因子２、ＩＧＦ結合タンパク質１、ＩＧＦ結合タンパク質３、乳酸脱水素酵素Ａ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１、ピルビン酸キナーゼＭ、ｐ２１、トランスフォーミング増殖因子β３、セルロプラスミン、エリスロポエチン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、α１Ｂ−アドレナリン受容体、アドレノメデュリン、エンドセリン−１、ヘムオキシゲナーゼ１、一酸化窒素シンターゼ２、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、脈管内皮増殖因子、脈管内皮増殖因子受容体ＦＬＴ−１、脈管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、およびｐ３５ｓｒｇからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
治療または予防が必要な被験体において低酸素誘導因子１αとＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の相互作用によって仲介される障害を治療または予防する方法であって、前記障害を治療または予防するのに効果的な条件下で前記被験体に請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記障害が、網膜虚血、肺高血圧症、子宮内発育遅延、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、および癌からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組織における脈管形成を低減または防止する方法であって、前記組織における脈管形成を低減または防止するのに効果的な条件下で前記組織を請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
前記方法が、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が腫瘍である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞においてアポトーシスを誘発する方法であって、前記細胞のアポトーシスを誘発するのに効果的な条件下で前記細胞を請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項１５】
細胞の生存および／または増殖を低下させる方法であって、前記細胞の生存および／または増殖を低下させるのに効果的な条件下で前記細胞を請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項１６】
前記細胞が、癌性であるか、または癌細胞を含有する組織の内皮脈管構造内に含まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の潜在的なリガンドの同定方法であって、
請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチドを提供すること、
前記ペプチドを被検物質と接触させること、および
前記被検物質が前記ペプチドと選択的に結合するかどうかを検出し、前記ペプチドと選択的に結合する被検物質をＣＲＥＢ結合タンパク質および／またはｐ３００の潜在的なリガンドとして同定すること
を含む、方法。
【請求項１８】
ｍおよびｎが１であるか、ｍが１でありｎが２であるか、ｍが２でありｎが１であるか、あるいはｍおよびｎの両方が２である、請求項１、２、３、４または５のいずれか1項に記載のペプチド。
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１２−５０３０１３（Ｐ２０１２−５０３０１３Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２８０２０（Ｐ２０１１−５２８０２０）
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５７５９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３３８７９
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５００３５０２６５）ニューヨーク ユニバーシティ (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５７５９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３３８７９
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５００３５０２６５）ニューヨーク ユニバーシティ (11)
【Ｆターム（参考）】
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