ＩＬ−１７拮抗性抗体
ＩＬ−１７介在性疾患または病気、例えば関節リウマチの処置における使用のための、重鎖および軽鎖の超可変領域が定義されているようなアミノ酸配列を有している、ＩＬ−１７結合分子、特にヒトＩＬ−１７に対する抗体、より好ましくは、ＩＬ−１７に対するヒト抗体が提供されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ＩＬ−１７結合分子、特にヒトＩＬ−１７に対する抗体、更に好ましくは、ヒトＩＬ−１７に対するヒト抗体(ＩＬ−１７Ａとも命名されている)およびＩＬ−１７介在性疾患および状態の処置におけるこうした抗体の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、関節リウマチ(ＲＡ)に存在する、Ｔ細胞によって誘導されるサイトカインであるＩＬ−１７は、特にＩＬ−１およびＴＮＦ−αと共に炎症誘発性サイトカインとして作用する(Chabaud M & Miossec P (1999) Arthritis Rheum 42,963-970; Awane M et al(1999) J. Immunol 162, 5337-5344)。ＩＬ−１７はＭＭＰ産生を誘発し、かつＴＩＭＰをダウンレギュレートし(Jovanovic DV et al(2001) J. Rheumatol. 28, 712-718)、そして、ＩＬ−１とＩＬ−１７のブロックは、イン・ビボにおいて、炎症および骨の破壊に対して相乗的な効果を有する(Chabaud M & Miossec(2001) Arthritis Rheum 44, 1293-1303)。不適切または過剰なＩＬ−１７産生は、関節リウマチ(Witowski et al., 2004 Cell Mol Life Sci 61:567-579)、骨関節炎、骨インプラントの緩み、急性移植拒絶反応(Antonysamy et al., 1999, J Immunol 162, 577-584; van Kooten et al., 1998, J Am Soc Nephrol 9 , 1526-1534)、敗血症、敗血症性またはエンドトキシンショック、アレルギー、喘息(Molet et al., 2001, J Allergy Clin Immunol 108, 430-438)、骨喪失、乾癬(Teunissen et al., 1998, J Invest Dermatol 111, 645-649)、虚血、全身性硬化症(Kurasawa et al., 2000, Arthritis Rheum 43, 2455-2463)、卒中、および他の炎症性疾患のような様々な疾患および障害の病因に関連する。ＩＬ−１７に対する抗体は、ＩＬ−１７介在性疾患および障害の処置における使用が提案されてきた；例えば、ＷＯ ９５/１８８２６およびその導入における考察参照。
【０００３】
我々は、本発明により、ＩＬ−１７介在性疾患および障害の処置における使用に適当なヒトＩＬ−１７に対する改善された抗体を調製した。
【発明の開示】
【０００４】
従って、本発明は、順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３｛前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列(Ｎ−Ｙ−Ｗ−Ｍ−Ｎ)を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列(Ａ−Ｉ−Ｎ−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｅ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｖ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ)を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列(Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｔ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｉ−Ｈ−Ｙ−Ｗ−Ｙ−Ｆ−Ｄ−Ｌ)を有する｝；またはその直接ＣＤＲ等価物を含む、少なくとも一個の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含んでなる、抗原結合部位を含んでなるＩＬ−１７結合分子を提供する。
【０００５】
従って、本発明は、また、少なくとも一個の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含んでなるＩＬ−１７結合分子であって、順に、超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'｛前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列(Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ａ)を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列(Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ａ−Ｔ)を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列(Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｐ−Ｃ−Ｔ)を有する｝またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む、ＩＬ−１７結合分子を提供する。
【０００６】
本発明の別の態様では、本発明は、順に超可変領域ＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘおよびＣＤＲ３−ｘ｛前記ＣＤＲ１−ｘは、配列番号１１のアミノ酸配列(Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｗ−Ｍ−Ｎ)を有し、前記ＣＤＲ２−ｘは、配列番号１２のアミノ酸配列(Ａ−Ｉ−Ｎ−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｅ−Ｋ−Ｙ−Ｙ)を有し、そして前記ＣＤＲ３−ｘは、配列番号１３のアミノ酸配列(Ｃ−Ｖ−Ｒ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｔ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｉ−Ｈ−Ｙ−Ｗ−Ｙ−Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｗ−Ｇ)を有する｝；またはその直接ＣＤＲ−ｘ等価物を含む、少なくとも一個の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含んでなる、抗原結合部位を含んでなるＩＬ−１７結合分子を提供する。
【０００７】
更に、本発明は、また、重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)可変ドメインの両方を含んでなるＩＬ−１７結合分子であって；
前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３(前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ等価物を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)、またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
を含んでなる少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子も提供する。
【０００８】
更に、本発明は、また、重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)可変ドメインの両方を含んでなるＩＬ−１７結合分子であって；前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘおよびＣＤＲ３−ｘ(前記ＣＤＲ１−ｘは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２−ｘは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３−ｘは、配列番号１３のアミノ酸配列をする)またはその直接ＣＤＲ−ｘ等価物を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
を含んでなる少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子も提供する。
【０００９】
別途記載のない限り、ポリペプチド鎖はいずれも、アミノ酸配列はＮ末端で始まり、Ｃ末端で終了するように本明細書中で記載されている。抗原結合部位が、ＶＨおよびＶＬドメインの両方を含んでなる場合は、これらは、同一のポリペプチド分子上に位置してもよいし、または、好ましくは、それぞれのドメインは、異なった鎖上に存在してもよく、ＶＨドメインは、免疫グロブリン重鎖部分またはその断片の一部であり、そしてＶＬは、免疫グロブリン軽鎖部分またはその断片の一部である。
【００１０】
“ＩＬ−１７結合分子”とは、単独もしくは他の分子との組み合わせで、ＩＬ−１７抗原に結合することができるすべての分子を意味する。この結合反応は、ＩＬ−１７のその受容体との結合の阻害を測定するための、例えば、結合アッセイ、競合アッセイまたはバイオアッセイを含む標準的方法(定量的アッセイ)または他の任意の結合アッセイによって、無関係の特異性(unrelated specificity)であるが、同一のアイソタイプである抗体、例えば、抗ＣＤ２５抗体が使用されるネガティブコントロール試験を対照とすることにより、示し得る(実施例１も参照)。
【００１１】
抗原結合分子の例としては、Ｂ細胞またはハイブリドーマによって産生される抗体、およびキメラ、ＣＤＲ移植またはヒト抗体またはそれらの任意の断片、例えば、Ｆ(ａｂ')２およびＦａｂ断片、ならびに一本鎖または単一ドメイン抗体が含まれる。
【００１２】
一本鎖抗体は、通例１０〜３０個のアミノ酸、好ましくは、１５〜２５個のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって共有結合される抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインから構成されている。それ故、こうした構造には重鎖および軽鎖の定常部は含まれず、小ペプチドスペーサーは、定常部全体に比べて抗原性は少ないであろうと考えられている。“キメラ抗体”とは、重鎖もしくは軽鎖またはその両方の定常領域がヒト起源であり、一方、重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインは、非ヒト(例えば、マウス)起源かまたはヒト起源であるが、異なったヒト抗体に由来する、抗体を意味する。“ＣＤＲ移植抗体”とは、超可変領域(ＣＤＲ)が、非ヒト(例えば、マウス)抗体または異なったヒト抗体のようなドナーの抗体に由来し、一方、免疫グロブリンの他の部分の全部または実質的に全部、例えば、定常部および可変ドメインの高度に保存された部分、すなわち、フレームワーク領域が、アクセプター抗体、例えば、ヒト起源の抗体に由来する、抗体を意味する。しかしながら、ＣＤＲ移植抗体は、フレームワーク領域中、例えば、超可変領域に隣接しているフレームワーク領域の部分中に、ドナー配列の数アミノ酸を含むことができる。“ヒト抗体”とは、例えば、ＥＰ ０５４６０７３ Ｂ１、ＵＳＰ ５５４５８０６、ＵＳＰ ５５６９８２５、ＵＳＰ ５６２５１２６、ＵＳＰ ５６３３４２５、ＵＳＰ ５６６１０１６、ＵＳＰ ５７７０４２９、ＥＰ ０４３８４７４ Ｂ１およびＥＰ ０４６３１５１ Ｂ１に一般的に記載されているとおり、重鎖および軽鎖の両方の定常領域および可変領域が、すべてヒト起源であるか、または、必ずしも同一の抗体に由来するわけではなく、そしてマウスの免疫グロブリン可変および定常部遺伝子がヒトの対応物によって置き換えられているマウスによって産生される抗体を含むヒト起源の配列と実質的に同一である抗体を意味する。
【００１３】
本発明の特に好ましいＩＬ−１７結合分子は、ヒト抗体であり、特に、以下の実施例１および２の中で述べられているＡＩＮ４５７抗体である。
【００１４】
すなわち、好ましいキメラ抗体において、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、ヒト起源、例えば、配列番号１０(＝軽鎖の可変ドメイン、すなわち、配列番号１０のアミノ酸１〜１０９)および配列番号８(＝重鎖の可変ドメイン、すなわち、配列番号８のアミノ酸１〜１２７)中に示されているＡＩＮ４５７抗体の可変ドメインである。定常部ドメインは、また、適当なヒト定常部ドメイン、例えば、“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Kabat E. A. et al, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health中に記載されているようなドメインを含んでなるのが好ましい。
【００１５】
超可変領域は、ヒト起源であることが好ましいが、任意の種類のフレームワーク領域に結合していてもよい。適当なフレームワーク領域は、Kabat E. A. et al, 前掲書中に述べられている。好ましい重鎖フレームワーク領域は、例えば、ＡＩＮ４５７抗体のヒト重鎖フレームワーク領域であるヒト重鎖フレームワーク領域である。これは、順に、例えば、ＦＲ１(配列番号８のアミノ酸１〜３０)、ＦＲ２(配列番号８のアミノ酸３６〜４９)、ＦＲ３(配列番号８のアミノ酸６７〜９８)およびＦＲ４(配列番号８のアミノ酸１１７〜１２７)の領域から構成されている。ＡＩＮ４５７のＸ線分析によって決定された超可変領域を考慮すると、別の好ましい重鎖フレームワーク領域は、順に、ＦＲ１−ｘ(配列番号８のアミノ酸１〜２５)、ＦＲ２−ｘ(配列番号８のアミノ酸３６〜４９)、ＦＲ３−ｘ(配列番号８のアミノ酸６１〜９５)およびＦＲ４(配列番号８のアミノ酸１１９〜１２７)の領域から構成されている。同様な方法で、軽鎖フレームワーク領域は、順に、ＦＲ１'(配列番号１０のアミノ酸１〜２３)、ＦＲ２'(配列番号１０のアミノ酸３６〜５０)、ＦＲ３'(配列番号１０のアミノ酸５８〜８９)およびＦＲ４'(配列番号１０のアミノ酸９９〜１０９)の領域から構成されている。
【００１６】
従って、本発明は、また、１位のアミノ酸から始まって１２７位のアミノ酸で終了する配列番号８に示されているアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する第一のドメインまたは上記に述べた第一のドメインと、１位のアミノ酸から始まって１０９位のアミノ酸で終了する配列番号１０に示されているアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する第二のドメインを含んでなる、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなるＩＬ−１７結合分子を提供する。
【００１７】
すべてのヒトにおいて天然に発見される蛋白質に対して惹起されるモノクローナル抗体は、通例、非ヒト系、例えば、マウスで作成され、そして、それ自身通常非ヒト蛋白質である。この直接的な結果として、ハイブリドーマによって産生される異種抗体が、ヒトに投与されたとき、大部分は異種免疫グロブリンの定常部によって介在される好ましくない免疫応答を誘出する。これにより、長期間にわたって投与することができないので、こうした抗体の使用が明らかに制限される。それ故、ヒトに投与したとき、実質的に同種異系応答を誘出しそうもない、一本鎖、単一ドメイン、キメラ、ＣＤＲ移植、または特に、ヒト抗体を使用することが特に好ましい。
【００１８】
上記を鑑みると、本発明のより好ましいＩＬ−１７結合分子は、少なくとも
ａ)(ｉ)順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはその直接ＣＤＲ等価物を含む可変ドメインおよび(ｉｉ)ヒト重鎖の定常部またはその断片を含んでなる(前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する)、免疫グロブリン重鎖またはその断片；および
ｂ)(ｉ)順に超可変領域および、所望により、また、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'、およびＣＤＲ３'超可変領域またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む可変ドメインおよび(ｉｉ)ヒト軽鎖の定常部またはその断片を含んでなる(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)、免疫グロブリン軽鎖またはその断片
を含んでなるヒト抗ＩＬ−１７抗体から選択される。
【００１９】
あるいは、本発明のＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはその直接ＣＤＲ等価物(前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する)を含んでなる第一のドメイン；および
ｂ)超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'またはその直接ＣＤＲ'等価物(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)を含んでなる、第二のドメイン；および
ｃ)第一のドメインのＮ末端と第二のドメインのＣ末端に、または第一のドメインのＣ末端と第二のドメインのＮ末端に結合しているペプチドリンカー
を含んでなる抗原結合部位を含んでなる、一本鎖結合分子から選択することができる。
【００２０】
よく知られているように、一個の、ほんの少数のまたは数個でさえアミノ酸の欠失、付加または置換のようなアミノ酸配列の小さい変更は、実質的に同一の特性を有する元の蛋白質の対立形体に至り得る。
【００２１】
従って、“その直接ＣＤＲ等価物”という用語は、順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉおよびＣＤＲ３ｉ(ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の代わりに)を含んでなるＩＬ−１７結合分子を意味し、ここで
(ｉ)超可変領域ＣＤＲ１ｉは配列番号１に示されている超可変領域ＣＤＲ１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｉ)超可変領域ＣＤＲ２ｉは配列番号２に示されている超可変領域ＣＤＲ２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｉｉ)超可変領域ＣＤＲ３ｉは配列番号３に示されている超可変領域ＣＤＲ３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｖ)順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉ、およびＣＤＲ３ｉを含んでなるこうした分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００２２】
同様に、“その直接ＣＤＲ−ｘ等価物”という用語は、順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘおよびＣＤＲ３ｉ−ｘ(ＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘ、およびＣＤＲ３−ｘの代わりに)を含んでなるＩＬ−１７結合分子を意味し、ここで
(ｖ)超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘは配列番号１１に示されている超可変領域ＣＤＲ１−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｖｉ)超可変領域ＣＤＲ２ｉ−ｘは配列番号１２に示されている超可変領域ＣＤＲ２−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｖｉｉ)超可変領域ＣＤＲ３ｉ−ｘは配列番号１３に示されている超可変領域ＣＤＲ３−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｖｉｉｉ)順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘ、およびＣＤＲ３ｉ−ｘを含んでなるこうした分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００２３】
同様に、“その直接ＣＤＲ'等価物”という用語は、順に超可変領域ＣＤＲ１'ｉ、ＣＤＲ２'ｉおよびＣＤＲ３'ｉを含んでなるドメインを意味し、ここで
(ｉ)超可変領域ＣＤＲ１'ｉは配列番号４に示されている超可変領域ＣＤＲ１'と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｉ)超可変領域ＣＤＲ２'ｉは配列番号５に示されている超可変領域ＣＤＲ２'と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｉｉ)超可変領域ＣＤＲ３'ｉは配列番号６に示されている超可変領域ＣＤＲ３'と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｖ)順に超可変領域ＣＤＲ１'ｉ、ＣＤＲ２'ｉ、およびＣＤＲ３'ｉを含んでなるこうした分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００２４】
あるいは、本発明のＩＬ−１７結合分子は、
順に、
ａ)超可変領域ＣＤＲ１(配列番号１)、ＣＤＲ２(配列番号２)およびＣＤＲ３(配列番号３)；または
ｂ)超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉ、ＣＤＲ３ｉ
［前記超可変領域ＣＤＲ１ｉは、配列番号１に示されている超可変領域ＣＤＲ１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、
前記超可変領域ＣＤＲ２ｉは、配列番号２に示されている超可変領域ＣＤＲ２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして
前記超可変領域ＣＤＲ３ｉは、配列番号３に示されている超可変領域ＣＤＲ３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして
順に超可変領域ＣＤＲ１ｘ、ＣＤＲ２ｘ、およびＣＤＲ３ｘを含んでなる前記結合ＩＬ−１７分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができる(前記阻害活性は、ヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される)］
を含む、少なくとも一個の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含んでなる、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子であってもよい。
【００２５】
同様に、本発明のＩＬ−１７結合分子は、
順に、
ａ)超可変領域ＣＤＲ１−ｘ(配列番号１１)、ＣＤＲ２−ｘ(配列番号１２)およびＣＤＲ３−ｘ(配列番号１３)；または
ｂ)超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘ、ＣＤＲ３ｉ−ｘ
［前記超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘは、配列番号１１に示されているＣＤＲ１−ｘの超可変領域と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、
前記超可変領域ＣＤＲ２ｉ−ｘは、配列番号１２に示されているＣＤＲ２−ｘの超可変領域と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、そして
前記超可変領域ＣＤＲ３ｉ−ｘは、配列番号１３に示されているＣＤＲ３−ｘの超可変領域と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして
順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘ、およびＣＤＲ３ｉ−ｘを含んでなる前記結合ＩＬ−１７分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される］
を含む、少なくとも一個の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含んでなる、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子であってもよい。
【００２６】
同様に、本発明のＩＬ−１７結合分子は、
順に、
ａ)超可変領域ＣＤＲ'１(配列番号４)、ＣＤＲ'２(配列番号５)およびＣＤＲ'３(配列番号６)；または
ｂ)超可変領域ＣＤＲ１'ｉ、ＣＤＲ２'ｉ、ＣＤＲ３'ｉ
［前記超可変領域ＣＤＲ'１ｉは、配列番号４に示されている超可変領域ＣＤＲ'１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、
前記超可変領域ＣＤＲ'２ｉは、配列番号５に示されている超可変領域ＣＤＲ'２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、そして
前記超可変領域ＣＤＲ'３ｉは、配列番号６に示されている超可変領域ＣＤＲ'３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして
順に超可変領域ＣＤＲ'１ｉ、ＣＤＲ'２ｉ、およびＣＤＲ'３ｉを含んでなる前記結合ＩＬ−１７分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される］
を含む、少なくとも一個の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含んでなる、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子であってもよい。
【００２７】
あるいは、本発明のＩＬ−１７結合分子は、重鎖(ＶＨ)と軽鎖(ＶＬ)部ドメインの両方の可変ドメインを含んでなるＩＬ−１７結合分子であってもよく、前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１(配列番号１)、ＣＤＲ２(配列番号２)およびＣＤＲ３(配列番号３)を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
順に超可変領域ＣＤＲ１'(配列番号４)、ＣＤＲ２'(配列番号５)およびＣＤＲ３'(配列番号６)を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)；
または
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉ、およびＣＤＲ３ｉ(前記超可変領域ＣＤＲ１ｉは、配列番号１に示されている超可変領域ＣＤＲ１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、前記超可変領域ＣＤＲ２ｉは、配列番号２に示されている超可変領域ＣＤＲ２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして、前記超可変領域ＣＤＲ３ｉは、配列番号３に示されている超可変領域ＣＤＲ３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる)を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
順に超可変領域ＣＤＲ１'ｉ、ＣＤＲ２'ｉ、ＣＤＲ３'ｉ(前記超可変領域ＣＤＲ'１ｉは、配列番号４に示されている超可変領域ＣＤＲ'１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、前記超可変領域ＣＤＲ'２ｉは、配列番号５に示されている超可変領域ＣＤＲ'２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして、前記超可変領域ＣＤＲ'３ｉは、配列番号６に示されている超可変領域ＣＤＲ'３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる)を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)；
［順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉ、ＣＤＲ３ｉ、ＣＤＲ'１ｉ、ＣＤＲ'２ｉ、およびＣＤＲ'３ｉを含んでなる、ｂ)中で定義されている前記結合ＩＬ−１７分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される］
を含む、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、前記ＩＬ−１７結合分子である。
【００２８】
あるいは、本発明のＩＬ−１７結合分子は、重鎖(ＶＨ)と軽鎖(ＶＬ)部ドメインの両方の可変ドメインを含んでなるＩＬ−１７結合分子であってもよく、前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１−ｘ(配列番号１１)、ＣＤＲ２−ｘ(配列番号１２)およびＣＤＲ３−ｘ(配列番号１３)を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
順に超可変領域ＣＤＲ１'(配列番号４)、ＣＤＲ２'(配列番号５)およびＣＤＲ３'(配列番号６)を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)；または
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘ、およびＣＤＲ３ｉ−ｘ、前記超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘ、ＣＤＲ３ｉ−ｘ(前記超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘは、配列番号１１に示されている超可変領域ＣＤＲ１−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、前記超可変領域ＣＤＲ２ｉ−ｘは、配列番号１２に示されている超可変領域ＣＤＲ２−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして、前記超可変領域ＣＤＲ３ｉ−ｘは、配列番号１３に示されている超可変領域ＣＤＲ３−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる)を含んでなる、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
順に超可変領域ＣＤＲ１'ｉ、ＣＤＲ２'ｉ、ＣＤＲ３'ｉ(前記超可変領域ＣＤＲ'１ｉは、配列番号４に示されている超可変領域ＣＤＲ'１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、前記超可変領域ＣＤＲ'２ｉが、配列番号５に示されている超可変領域ＣＤＲ'２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして、前記超可変領域ＣＤＲ'３ｉが、配列番号６に示されている超可変領域ＣＤＲ'３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる)を含んでなる、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)；
［順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉ、ＣＤＲ３ｉ、ＣＤＲ'１ｉ、ＣＤＲ'２ｉ、およびＣＤＲ'３ｉを含んでなる、ｂ)中で定義されている前記結合ＩＬ−１７分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される］
を含んでなる、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、前記ＩＬ−１７結合分子である。
【００２９】
ＩＬ−１７のその受容体への結合を阻害することは、好都合なことに、本明細書中で以下に述べられているようなアッセイを含めて、様々なアッセイで試験することができる。“同一の程度まで”という用語は、参照および等価な分子が、統計に基づいて、本明細書で言及するアッセイの一つにおいて(実施例１参照)実質的に同一のＩＬ−１７阻害活性を示すことを意味する。例えば、本発明のＩＬ−１７結合分子は、通例、ヒトの皮膚線維芽細胞中のヒトＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生に基づいてヒトＩＬ−１７の阻害のＩＣ５０を有しており、＋/−５倍以内、すなわち、その１０ｎＭ以下、より好ましくは、９、８、７、６、５、４、３または２ｎＭであり、好ましくは、実施例１中で述べられているようにアッセイされた場合、対応する参照分子のＩＣ５０と実質的に同一である。
【００３０】
あるいは、使用されるアッセイは、可溶性のＩＬ−１７受容体(例えば、実施例１のヒトＩＬ−１７ Ｒ/Ｆｃ構築物)および本発明のＩＬ−１７結合分子によるＩＬ−１７の結合の競合的阻害アッセイであってもよい。
【００３１】
最も好ましくは、ヒトＩＬ−１７抗体は、少なくとも、
ａ)配列番号８中に示されている、１位のアミノ酸から始まって１２７位のアミノ酸で終了するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインとヒト重鎖の定常領域を含んでなる一個の重鎖；および
ｂ)配列番号１０中に示されている、１位のアミノ酸から始まって１０９位のアミノ酸で終了するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインとヒト軽鎖の定常領域を含んでなる一個の軽鎖
を含んでなる。
【００３２】
ヒト重鎖の定常領域は、γ１、γ２、γ３、γ４、μ、α１、α２、δまたはεタイプであってもよいが、好ましくは、γタイプ、より好ましくは、γ１タイプであり、一方、ヒト軽鎖の定常領域は、κまたはλタイプ(λ１、λ２およびλ３のサブタイプを含む)であってもよいが、好ましくは、κタイプである。こうした定常領域のすべてのアミノ酸配列は、Kabat et al(前掲)中に提供されている。
【００３３】
本発明の結合分子のコンジュゲート(conjugates)、例えば、酵素または毒素または放射性同位体のコンジュゲートもまた本発明の範囲内に含まれる。
【００３４】
“ポリペプチド”は、本明細書で特記されない限り、ペプチド結合によって互いに結合しているアミノ酸を含んでなり、Ｎ末端で始まり、Ｃ末端で終了するアミノ酸配列を有する任意のペプチドまたは蛋白質を含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、モノクローナル抗体であり、より好ましくは、キメラ(Ｖ移植とも呼ばれる)またはヒト化(ＣＤＲ移植とも呼ばれる)モノクローナル抗体であり、最も好ましいのは完全なヒト抗体であり、例えば、実施例１に例示されている技術によって得られる。このヒト化(ＣＤＲ移植)または完全なヒトモノクローナル抗体は、アクセプター抗体のフレームワーク領域(ＦＲ)配列に導入される更なる変異体を含んでも含まなくてもよい。
【００３５】
本明細書中で使用されるポリペプチドの機能的誘導体は、本発明のポリペプチドと同様に定性的な生物学的活性を有する、すなわち、ヒトＩＬ−１７と結合する能力を有している分子を含んでいる。機能的誘導体には、本発明のポリペプチドの断片およびペプチドアナログが含まれる。断片は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドの配列内の部分を含んでなる。“誘導体”という用語は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体、および共有結合的修飾を定義するために使用されている。例えば、特定の配列の、例えば、軽鎖および重鎖の超可変領域の本発明のポリペプチドの機能的誘導体は、好ましくは、例えば、特定の配列のアミノ酸配列の本発明のポリペプチドと、少なくとも約６５％、より好ましくは、少なくとも約７５％、更により好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５、９６、９７、９８、９９％の全配列相同性を有し、そしてヒトＩＬ−１７を結合させる能力を実質的に維持し、または、例えば、ＩＬ−１７誘発ヒト皮膚線維芽細胞のＩＬ−６の産生を中和する。
【００３６】
“共有結合修飾”という用語は、例えば、特定の配列の、本発明のポリペプチド；またはその断片の、有機蛋白質様または非蛋白質様誘導体化剤での修飾、異種ポリペプチド配列との融合、および翻訳後修飾を含む。例えば、特定の配列の共有結合修飾ポリペプチドの修飾は、依然としてヒトＩＬ−１７を結合させる能力を有するか、または、例えば、ＩＬ−１７誘発ヒト線維芽細胞のＩＬ−６の産生を架橋により中和する能力を有する。共有結合修飾は、伝統的に、標的アミノ酸残基を選択した側または末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させること、または選択された組み換え宿主細胞において機能する、翻訳後修飾のメカニズムを利用することによって導入される。所定の翻訳後修飾は、発現ポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、翻訳後修飾により脱アミド化されて、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。あるいは、こうした残基は、緩和な酸性条件下で脱アミノ化される。別の翻訳後修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル、チロシンまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジンの側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる(例えば、T.E. Creighton, 蛋白質(Proteins): 構造と分子特性(Structure and Molecular Properties), W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)参照)。共有結合修飾は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチド、およびイミュノアドヘシン(immunoadhesins)のようなそれらのアミノ酸配列変異体、および異種シグナル配列とのＮ−末端融合物を含んでなる融合蛋白質を例えば含む。
【００３７】
天然ポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する“相同性”は、最大相同性パーセントを達成させるために、必要ならば、この配列をアラインして、ギャップを挿入した後、対応する天然ポリペプチドの残基と一致する候補配列中でのアミノ酸残基の百分率として本明細書では定義されており、配列同一性の一部として同類置換(conservative substitutions)は何ら考慮されない。Ｎ末端またはＣ末端の延長または挿入は、いずれも同一性または相同性を減少させるものとして解釈されてはならない。アライメントの方法およびコンピュータープログラムは、よく知られている。
【００３８】
“アミノ酸”は、天然に存在するＬ−α−アミノ酸のすべてを意味し、そして、例えばＤ−アミノ酸を含む。アミノ酸は、既知の一文字または三文字表記によって同定する。
【００３９】
“アミノ酸配列変異体”という用語は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドと比較してそれらのアミノ酸の配列の一部の相違を有する分子を意味する。例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、依然として、ヒトＩＬ−１７を結合させる能力を有するか、または、例えば、ＩＬ−１７誘発ヒト皮膚線維芽細胞のＩＬ−６の産生を中和する能力を有する。置換変異体は、少なくとも一個のアミノ酸残基が除かれ、異なるアミノ酸が、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドのポリペプチド中の同一位置のその場所に挿入されたものである。これらの置換は、分子中の一個のアミノ酸のみが置換されている一置換であってもよいし、二個またはそれ以上のアミノ酸が同一の分子中で置換されている多置換であってもよい。挿入変異体は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドのポリペプチド中の特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入されている一個またはそれ以上のアミノ酸を有する変異体である。アミノ酸に直接隣接しているとは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のどちらかに結合していることを意味する。欠失変異体は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドのポリペプチド中で一個またはそれ以上のアミノ酸が除去されている変異体である。通例、欠失変異体は、分子の特定の領域で一個または二個のアミノ酸が欠失される。
【００４０】
本発明のＩＬ−１７結合分子は、組み換えＤＮＡ技法によって製造することができる。これを考慮すると、本結合分子をコードしている一個またはそれ以上のＤＮＡ分子が構築され、適当な制御配列のもとにおかれ、そして、発現のために適当な宿主生物中に移入されなければならない。
【００４１】
それ故、極めて一般的な方法では、
(ｉ)本発明の単一ドメインＩＬ−１７結合分子、本発明の一本鎖ＩＬ−１７結合分子、本明細書で定義されている重鎖および軽鎖を含んでなるＩＬ−１７結合分子、または本発明のＩＬ−１７結合分子の断片をコードしているＤＮＡ分子；および
(ｉｉ)組み換え手段によって本発明のＩＬ−１７結合分子を製造するための本発明のＤＮＡ分子の使用
が提供される。
【００４２】
従って、本発明は上述したＩＬ−１７結合分子をコードしているＤＮＡ分子を提供する。
【００４３】
更に、本発明は、配列番号７または配列番号９に実質的に相同であるＤＮＡ分子を含んでなるＤＮＡ構築物を提供する。
【００４４】
更に、本発明は、一方が、配列番号７に実質的に相同であるか、またはその直接ＤＮＡＨ等価物であり、他方が、配列番号９に実質的に相同であるか、またはその直接ＤＮＡＬ等価物である、二個のＤＮＡ分子を含んでなるＤＮＡ構築物を提供する。
【００４５】
この技術の現状は、当業者が本明細書中で提供された情報、すなわち、超可変領域のアミノ酸配列およびそれらをコードしているＤＮＡ配列を与えられたとすると、本発明のＤＮＡ分子を合成することができる。可変ドメイン遺伝子を構成する方法は、例えば、ＥＰＡ ２３９４００中で述べられており、次のように手短にまとめることができる：どんな特異性であれ、ＭＡｂの可変ドメインをコードしている遺伝子をクローン化する。フレームワーク領域および超可変領域をコードしているＤＮＡ断片が決定され、超可変領域をコードしているＤＮＡ断片が除去されると、その結果、フレームワーク領域をコードしているＤＮＡ断片は、接合部で適当な制限部位と一緒に融合される。制限部位は、標準的方法によってＤＮＡ分子の変異誘発によって適当な位置で引き起こすことができる。二本鎖合成ＣＤＲカセットは、配列番号１(ＣＤＲ１)、配列番号２(ＣＤＲ２)、配列番号３(ＣＤＲ３)、配列番号４(ＣＤＲ１')、配列番号５(ＣＤＲ２')、配列番号６(ＣＤＲ６')、配列番号１１(ＣＤＲ１−ｘ)、配列番号１２(ＣＤＲ２−ｘ)、配列番号１３(ＣＤＲ３−ｘ)をコードしている配列に従ってＤＮＡ合成によって調製される。こうしたカセットは、粘着末端と共に提供されるので、その結果、それらはフレームワーク領域の接合部で結合することができる。
【００４６】
更に、本発明のＩＬ−１７結合分子をコードするＤＮＡ構築物を得るために、産生性ハイブリドーマ細胞株からのｍＲＮＡを入手する必要がない。すなわち、遺伝子のヌクレオチド配列に関する記載情報のみが与えられたとしても、ＰＣＴ出願 ＷＯ ９０/０７８６１は組み換えＤＮＡ技術による抗体の産生の十分な指示を与える。この方法は、所望のＤＮＡ配列を生成するために、多数のオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ法によるそれらの増幅、およびそのスプライシングを含んでなる。
【００４７】
適当なプロモーターまたは重鎖および軽鎖定常領域をコードしている遺伝子を含んでなる発現ベクターは、公に利用が可能である。従って、一旦、本発明のＤＮＡ分子が調製されれば、好都合なことに適当な発現ベクター中にそれを移入することができる。一本鎖抗体をコードしているＤＮＡ分子は、また、例えば、ＷＯ ８８/１６４９に述べられているような標準的な方法によって調製できる。
【００４８】
ＣＤＲ等価物の場合に準じて、“その直接ＤＮＡＨ等価物”という用語は、本発明のＩＬ−１７結合分子の重鎖またはその断片をコードしている最初のＤＮＡ構築物を示すことを意味し、そして、
ａ)交互に(alternatively)フレームワーク領域および超可変領域を含んでなる、可変ドメインをコードする第一部分(前記超可変領域は、順にＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉおよびＣＤＲ３ｉ中に存在し、前記ＣＤＲ１ｉは、配列番号１に示されている超可変領域ＣＤＲ１と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、前記ＣＤＲ２ｉは、配列番号２に示されている超可変領域ＣＤＲ２と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、そしてＣＤＲ３ｉは、配列番号３に示されている超可変領域ＣＤＲ３と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり；この第一部分は、可変ドメインの第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードしているコドンで終了する)；および
ｂ)重鎖の定常領域の第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、定常領域またはその断片の最後のアミノ酸をコードしているコドン、続いて終止コドンで終了する、重鎖の定常領域またはその断片をコードしている第二部分
を含んでなり；そして
ｃ)前記ＤＮＡ構築物は、単独でまたは別のポリペプチドと組み合わせて、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができるポリペプチドをコードしており、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００４９】
同様に、“その直接ＤＮＡＨ−ｘ等価物”という用語は、本発明のＩＬ−１７結合分子の重鎖またはその断片をコードしている第一の別のＤＮＡ構築物を示すことを意味し、そして、
ａ)交互にフレームワーク領域および超可変領域を含んでなる、可変ドメインをコードする第一部分(前記超可変領域は、順にＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘおよびＣＤＲ３ｉ−ｘ中に存在し、前記ＣＤＲ１ｉ−ｘは、配列番号１１に示されている超可変領域ＣＤＲ１と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、前記ＣＤＲ２ｉ−ｘは、配列番号１２に示されている超可変領域ＣＤＲ２と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、そしてＣＤＲ３ｉ−ｘは、配列番号１３に示されている超可変領域ＣＤＲ３と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり；この第一部分は、可変ドメインの第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードしているコドンで終了する)；および
ｂ)重鎖の定常領域の第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、定常領域
またはその断片の最後のアミノ酸をコードしているコドン、続いて終止コドンで終了する、重鎖の定常領域またはその断片をコードしている第二部分
を含んでなり；そして
ｃ)前記ＤＮＡ構築物は、単独でまたは別のポリペプチドと組み合わせて、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができるポリペプチドをコードしており、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００５０】
好ましくは、これらのＤＮＡ構築物は、交互にフレームワーク領域および超可変領域を含んでなる可変ドメインをコードしており、前記超可変領域は順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３であり、前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する。更に好ましくは、これらのＤＮＡ構築物は、交互にフレームワーク領域および超可変領域を含んでなる可変ドメインをコードしており、前記超可変領域は順にＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘ、およびＣＤＲ３−ｘであり、前記ＣＤＲ１−ｘは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２−ｘは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ３−ｘは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する。更に好ましくは、この第一部分は、配列番号８中に示されている１位のアミノ酸から始まって、１２７位のアミノ酸で終了するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有している可変ドメインをコードしている。更に好ましくは、第一部分は、配列番号７中で示されている１位のヌクレオチドから始まって、３８１位のヌクレオチドで終了するヌクレオチド配列を有している。また、好ましくは、この第二部分は、ヒト重鎖の定常領域、より好ましくは、ヒトγ１鎖の定常領域をコードしている。この第二部分は、ゲノム起源のＤＮＡ断片(イントロンを含んでなる)であっても、ｃＤＮＡ断片(イントロンは含んでいない)であってもよい。
【００５１】
同様に、“その直接ＤＮＡＬ等価物”という用語は、本発明のＩＬ−１７結合分子の軽鎖またはその断片をコードしている第二のＤＮＡ構築物を示すことを意味し、そして、
ａ)交互にフレームワーク領域および超可変領域を含んでなる、可変ドメインをコードする第一部分(前記超可変領域は、ＣＤＲ３ｉ'であり、そして所望によりＣＤＲ１ｉ'およびＣＤＲ２ｉ'であり、前記ＣＤＲ１ｉ'は、配列番号４に示されている超可変領域ＣＤＲ１'と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、前記ＣＤＲ２ｉ'は、配列番号５に示されている超可変領域ＣＤＲ２'と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、そして前記ＣＤＲ３ｉ'は、配列番号６に示されている超可変領域ＣＤＲ３'と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり；この第一部分は、可変ドメインの第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードしているコドンで終了する)；および
ｂ)軽鎖の定常領域の第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、定常領域またはその断片の最後のアミノ酸をコードしているコドン、続いて終止コドンで終了する、軽鎖の定常領域またはその断片をコードしている第二部分
を含んでなり；そして
ｃ)前記ＤＮＡ構築物は、単独でまたは別のポリペプチドと組み合わせて、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができるポリペプチドをコードしており、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００５２】
好ましくは、この第二のＤＮＡ構築物は、交互にフレームワーク領域および超可変領域を含んでなる可変ドメインをコードしており、前記超可変領域は、順にＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'であり、前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、第二のＤＮＡ構築物のこの第一部分は、１位のアミノ酸から始まって、そして１０９位のアミノ酸で終了する配列番号１０に示されているアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有している可変ドメインをコードしている。更に好ましくは、第一部分は、１位のヌクレオチドから始まって、そして３２７位のヌクレオチドで終了する配列番号９で示されているヌクレオチド配列を有している。また、好ましくは、第二部分は、ヒト軽鎖の定常領域、より好ましくは、ヒトκの定常領域をコードしている。
【００５３】
好ましくは、第一と第二のＤＮＡ構築物は、一緒に使用されるが、別々に使用されてもよい。
【００５４】
本発明は、また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘ、ＣＤＲ３−ｘ、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'またはＣＤＲ３'またはフレームワークの一個またはそれ以上のアミノ酸残基、通例ほんの少数(例えば、１−４個)が；例えば、突然変異、例えば、対応するＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発により変更されているＩＬ−１７結合分子を含む。本発明は、こうした変更されたＩＬ−１７結合分子をコードするＤＮＡ配列を含む。特に、本発明は、ＣＤＲ１'またはＣＤＲ２'の一個またはそれ以上の残基が配列番号４(ＣＤＲ１'の場合)および配列番号５(ＣＤＲ２'の場合)に示されている残基から変更されたＩＬ−１７結合分子を含む。
【００５５】
第一および第二のＤＮＡ構築物において、第一および第二部分は、イントロンによって分離されていてもよく、そして、エンハンサーが第一と第二部分の間のイントロンに位置しているのが好都合であり得る。転写されるが、翻訳されないこうしたエンハンサーの存在は、効率的な転写を助け得る。特定の態様においては、第一および第二のＤＮＡ構築物は、ヒト起源の重鎖遺伝子のエンハンサーを含んでなるのが有利である。
【００５６】
ＤＮＡ構築物は、それぞれ、適当な制御配列の制御のもとに、特に適当なプロモーターの制御のもとに置かれる。ＤＮＡ構築物が発現のために移入される宿主生物に適合される限り、全ての種類のプロモーターが使用され得る。
【００５７】
所望の抗体は、細胞培養またはトランスジェニック動物で製造することができる。適当なトランスジェニック動物は、適当な制御配列のもとに置かれている第一および第二のＤＮＡ構築物を卵子中にマイクロインジェクションし、そのように調製された卵子を適当な偽妊娠雌中に移入し、そして所望の抗体を発現する子孫を選択することを含む標準的な方法で得ることができる。
【００５８】
抗体の鎖は、細胞培養で製造され、ＤＮＡ構築物は、最初に、単一発現ベクターか、または二個の別々であるが適合性のある発現ベクターの中に挿入しなければならないが、後者が好ましい可能性が高い。
【００５９】
従って、本発明は、また、上記で述べた少なくとも一個のＤＮＡ構築物を含んでなる原核または真核細胞株中で複製することができる発現ベクターを提供する。
【００６０】
次いで、ＤＮＡ構築物を含んでいるそれぞれの発現ベクターは、適当な宿主生物に移入される。このＤＮＡ構築物が別々に二個の発現ベクターに挿入される場合は、それらは、別々に、すなわち、細胞あたり一種のベクターで、または共移入によって移入することができるが、後者が好ましい可能性が高い。適当な宿主生物は、細菌、酵母または哺乳類細胞株であり得るが、この後者が好ましい。より好ましくは、哺乳類の細胞株は、リンパ系起源のもの、例えば、骨髄腫、ハイブリドーマまたは通常の不死化Ｂ細胞(normal immortalised B-cell)であり、これは、好都合なことにいかなる内在性抗体の重鎖または軽鎖を発現しない。
【００６１】
哺乳類細胞における発現のために、配列をコードしているＩＬ−１７結合分子は、ＩＬ−１７結合分子の高レベルな発現を可能にするか、またはそれに有利な、宿主細胞ＤＮＡの遺伝子座内に組み込まれる。配列をコードしているＩＬ−１７結合分子が、こうした好都合に働く遺伝子座に組み込まれている細胞は、それらが発現するＩＬ−１７結合分子のレベルに基づいて同定し、選択することができる。任意の適当な選択可能なマーカーを、配列をコードしているＩＬ−１７結合分子を含んでいる宿主細胞の調製のために使用することができる；例えば、ｄｈｆｒ遺伝子/メトトレキサートまたは等価な選択系が使用可能である。本発明のＩＬ−１７結合分子の発現のための別系は、ＥＰ ０２５６０５５ Ｂ、ＥＰ ０３２３９９７ Ｂおよび欧州特許出願８９３０３９６４.４中に述べられているもののようなＧＳをベースとした増幅/選択系を含む。
【００６２】
本発明の更なる局面では、(ｉ)上記で定義された発現ベクターを用いて形質転換される生物を培養すること、および(ｉｉ)培養物からＩＬ−１７結合分子を回収することを含んでなるＩＬ−１７結合分子を製造する方法が提供される。
【００６３】
本記載の目的のために、抗体がＩＬ−１７のその受容体への結合をＡＩＮ４５７抗体と同程度まで実質的に阻害することができるならば、抗体は“ＡＩＮ４５７のようにＩＬ−１７の結合を阻害することができる”とし、“同程度まで”とは上記に定義された意味を有する。
【００６４】
このＡＩＮ４５７抗体は、以前に抗ＩＬ−１７抗体、特に何らかの抗ヒトＩＬ−１７抗体について報告された親和性に比較して、ＩＬ−１７に対して高い結合親和性を有している。すなわち、ＡＩＮ４５７は、ＩＬ−１７に結合する解離平衡定数ＫＤとして約０.１８８±０.０３６ｎＭ(例えば、実施例２に示されているようにBIAcoreによって測定された)を有している。この高結合親和性によって、このＡＩＮ４５７の抗体は治療適用に特に適切である。
【００６５】
本明細書において、“ＩＬ−１７によって介在される疾患”という表現は、疾患または障害の原因、発症、進行、持続または病因を含む、疾患または医学的状態において、ＩＬ−１７、が直接的であれ、間接的であれ役割を演じる疾患および医学的状態のすべてを包含する。
【００６６】
本明細書では、“処置”または“処置し”という用語は、疾患に罹患するリスクを有するか、または疾患に罹患していると疑われる患者ならびに病気であるか、疾患または医学的状態を有すると診断された患者の処置を含んで、予防的または防止的処置ならびに治療的または疾患修飾的処置の両方を意味し、臨床的再発の抑制を含む。
【００６７】
ヒトＩＬ−１７に対して結合特異性を有している上記に定義されたＩＬ−１７結合分子、特に、ＩＬ−１７のその受容体への結合を阻害できる抗体；および５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができるＩＬ−１７に対する抗体(前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される)は、本明細書では本発明の抗体と称される。
【００６８】
好ましくは、本発明の抗体は、ヒト抗体であり、最も好ましくは、ＡＩＮ４５７抗体またはその直接等価物である。
【００６９】
本発明の抗体は、その標的細胞でＩＬ−１７の作用を遮断し、従って、ＩＬ−１７によって介在される疾患および障害の処置における使用に指示される。本発明の抗体のこれらの薬理学的活性および他の薬理学的活性は、下記に示す実施例の標準的試験方法において示すことができる：
【００７０】
初代ヒト線維芽細胞によるインターロイキン−６のＩＬ−１７依存産生の中和：初代ヒト(皮膚)線維芽細胞におけるＩＬ−６の産生は、ＩＬ−１７に依存する(Hwang SY et al., (2004) Arthritis Res Ther; 6:R120-128)。
【００７１】
手短に言えば、様々な濃度の本発明の抗体またはＦｃ部を有するヒトＩＬ−１７受容体の存在下で、ヒトの皮膚線維芽細胞を組み換えＩＬ−１７で刺激する。キメラ抗ＣＤ２５抗体、シムレクト(Simulect)(登録商標)(バシリキシマブ)をネガティブコントロールとして使用する。上清を、１６時間の刺激の後に取得し、ＥＬＩＳＡ(ELISA)によってＩＬ−６について試験する。本発明の抗体は、上記のとおり試験したとき、すなわち、前記阻害活性を、ヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生によって測定するとき、通例、ＩＬ−６産生阻害(１ｎＭ ヒトＩＬ−１７の存在下で)に対して約５０ｎＭまたはそれ以下(例えば、約０.０１〜約５０ｎＭ)のＩＣ５０を有している。好ましくは、本発明の抗体は、約２０ｎＭまたはそれ以下、より好ましくは約１０ｎＭまたはそれ以下、更に好ましくは約５ｎＭまたはそれ以下、更に好ましくは約２ｎＭまたはそれ以下、更により好ましくは約１ｎＭまたはそれ以下の上記に定義したとおりのＩＬ−６の産生の阻害に対するＩＣ５０を有している。
【００７２】
上記のアッセイにおいて示されるとおり、本発明の抗体は、ＩＬ−１７の作用を強力に遮断する。従って、本発明の抗体は、次のとおり薬学的有用性を有する：
【００７３】
本発明の抗体は、ＩＬ−１７によって介在される疾患または医学的障害、例えば、炎症性疾患、アレルギーおよびアレルギー状態、過敏性反応、自己免疫疾患、重症感染症、および臓器または組織移植拒絶の予防および処置に有用である。
【００７４】
例えば、本発明の抗体は、同種移植片拒絶または異種移植片拒絶を含む心臓、肺、心肺複合、肝臓、腎臓、すい臓、皮膚または角膜移植のレシピエントの処置、および骨髄移植の後のような移植片対宿主疾患、および臓器移植関連動脈硬化症の予防のために使用できる。
【００７５】
本発明の抗体は、自己免疫疾患および炎症性障害、特に、炎症状態ならびに骨喪失、炎症性疼痛、強直性脊椎炎(ankolsing spondylitis)を含む脊椎関節症、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、および腸関連関節炎(enterophathis arthritis)が関与するリウマチ性疾患を含む関節炎(例えば、関節リウマチ、慢性進行性関節炎および変形性関節炎)およびリウマチ性疾患、過敏性反応(気道過敏症および皮膚過敏症の両方を含む)およびアレルギーのような自己免疫要素を含む病因の炎症性状態の処置、防止、または寛解のために特に有用である。本発明の抗体が使用できる特定の自己免疫疾患は、自己免疫血液疾患(例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球癆、および特発性血小板減少性紫斑病を含む)、全身性エリテマトーデス、炎症性筋疾患、多発性軟骨炎、強皮症、ウェグナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブンジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病および過敏性腸症候群を含む)、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁肝硬変、若年性糖尿病(Ｉ型真性糖尿病)、ブドウ膜炎(前部および後部)、乾性角結膜炎および春季角結膜炎、間質性肺線維症、乾癬性関節炎および糸球体腎炎(例えば、特発性ネフローゼ症候群または微小変化型腎症を含むネフローゼ症候群を伴うか伴わない)、腫瘍、多発性硬化症、皮膚および角膜の炎症性疾患、筋肉炎、骨インプラントの緩み、アテローム動脈硬化症、糖尿病、および脂質代謝異常のような代謝性疾患を含む。
【００７６】
本発明の抗体は、また、喘息、気管支炎、塵肺症、肺気腫、および気道の他の閉塞性または炎症性疾患の処置、予防、または寛解に有用である。
【００７７】
本発明の抗体は、ＩＬ−１７によって介在されるか、またはＩＬ−１７の産生、ＩＬ−１７によるＴＮＦ放出の促進に関与する望ましくない、急性および超急性の炎症性反応、例えば、急性感染症、例えば、敗血症ショック(例えば、エンドトキシンショックおよび成人急性呼吸促迫症候群)、髄膜炎、肺炎；および重症火傷の処置；および、感染症、がん、または臓器不全の結果として起こる病的なＴＮＦ放出に関連するカヘキシー、消耗症候群、特に、例えば、ＨＩＶ感染に伴うか、ＨＩＶ感染の結果として起こるＡＩＤＳ関連カヘキシーの処置に有用である。
【００７８】
本発明の抗体は、特に、骨関節炎、骨粗鬆症および他の炎症性関節炎、および加齢による骨喪失を含む一般的な骨喪失、および特に歯周病を含む骨代謝疾患を処置するのに有用である。
【００７９】
このような適応症の場合、適当な投与量は、もちろん、例えば、使用される本発明の特定の抗体、宿主、投与方式および処置されている障害の特性および重症度に応じて異なる。しかしながら、予防的使用では、満足すべき結果は、通例、体重１キログラムあたり約０.０５ｍｇ〜約１０ｍｇ、より普通には、体重１キログラムあたり約０.１ｍｇ〜約５ｍｇの投与量で得られることが示されている。予防的使用の投与の頻度は、通常、１週間あたり約１回から３ヶ月毎に約１回の範囲であり、より普通には、２週間毎に約１回から１０週間毎に約１回の範囲、例えば、４〜８週間毎に１回である。本発明の抗体は、非経口的、静脈内、例えば、肘窩または他の末梢静脈中に、筋肉内または皮下投与するのが好都合である。予防的処置は、通例、本発明の抗体を１ヶ月あたり１回から２〜３ヶ月毎に１回、またはそれより少なく投与することを含んでなる。
【００８０】
本発明の抗体は、例えば、上記に言及した疾患の処置または防止のために、唯一の有効成分として投与することもできるし、あるいは、例えば、他の薬剤(例えば、免疫抑制剤または免疫調節剤または他の抗炎症剤)のアジュバントとしてか、またはこうした薬剤と組み合わせて、他の薬剤と一緒に投与することができる。例えば、本発明の抗体は、ＤＭＡＲＤ、例えば、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、サイクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、グルココルチコイド；例えば、サイクロスポリンＡまたはＦＫ ５０６であるカルシニューリン阻害剤；例えば、ＦＴＹ７２０およびＦＴＹ７２０類似体であるリンパ球再循環調整剤；例えば、ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３またはＴＡＦＡ−９３であるｍＴＯＲ阻害剤；例えば、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１などの免疫抑制特性を有するアスコマイシン；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン(azathioprene)；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリン(15-deoxyspergualine)またはその免疫抑制ホモログ、アナログまたは誘導体；免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば、白血球受容体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはそのリガンドに対するモノクローナル抗体；他の免疫調節性化合物、例えば、ＣＴＬＡ４またはその変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部、例えば非ＣＴＬＡ４蛋白質配列に結合したＣＴＬＡ４またはその変異体の少なくとも細胞外部分を有する組み換え結合分子、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ(例えば、ＡＴＣＣ６８６２９として呼ばれている)またはその変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１または−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニストまたはＶＬＡ−４アンタゴニスト；または化学療法剤、例えばパクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシンまたは５−フルオロウラシル；抗ＴＮＦ剤、例えば、ＴＮＦの対するモノクローナル抗体、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０、またはＴＮＦ−ＲＩまたはＴＮＦ−ＲＩＩに対する受容体構築物、例えば、エタネルセプト、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ；炎症誘発性サイトカインブロッカー、ＩＬ−１ブロッカー、例えば、アナキンラまたはＩＬ−１ トラップ(IL-1 trap)、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ８８５、ＩＬ−６ブロッカー；ケモカインブロッカー、例えば、プロテアーゼ、例えば、メタロプロテアーゼの阻害剤または活性化剤、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＣＤ２０抗体、アスピリンのようなＮＳＡＩＤｓまたは抗感染症剤と組み合わせて使用することができる(リストは、上記に言及した薬剤に限定されない)。
【００８１】
上記に従って、本発明は更に別の局面において次に記載のことを提供する：
治療的に有効な量の例えば、本発明の抗体であるＩＬ−１７結合分子、および少なくとも一種の第二の薬剤物質を、例えば、同時または順に共投与することを含んでなる上記に定義される方法であって、ここで第二の薬剤物質とは、例えば、上記に示したような免疫抑制薬／免疫調節薬、抗炎症化学療法薬または抗感染症薬である。
【００８２】
または、治療的に有効な量のａ)例えば、本発明の抗体であるＩＬ−１７結合分子、およびｂ)例えば、上記に示したような免疫抑制薬／免疫調節薬、抗炎症化学療法薬または抗感染症薬から選択される少なくとも一種の第二の薬剤物質を含んでなる例えば、キットである治療的組み合わせ。このキットは、その投与のための指示を含み得る。
【００８３】
本発明の抗体を、他の免疫抑制薬／免疫調節薬、抗炎症化学療法薬または抗感染症薬と組み合わせて投与するとき、共投与される組み合わせる化合物の投与量は、当然使用される共薬剤の種類、例えば、それが、ＤＭＡＲＤ、抗ＴＮＦ、ＩＬ−１ブロッカーまたは他の薬剤であるかどうか、使用される特定の薬剤、処置される障害その他に応じて異なる。
【００８４】
本発明の薬学的組成物は、従来の方法で製造することができる。本発明による組成物は凍結乾燥形態で提供されるのが好ましい。速やかに投与するためには、それを適当な水性の担体、例えば、注射用滅菌水または滅菌した緩衝生理食塩水に溶解する。ボーラス注射としてではなく、点滴による大量投与の溶液を作製することが望ましいと考えられるときは、ヒト血清アルブミンまたは患者自身のヘパリン処置した血液を製剤時に生理食塩水に組み込んでおくことが有利である。あるいは、皮下注射用の製剤が提供される。過剰なこうした生理的に不活性な蛋白質の存在によって、容器の壁および点滴溶液で使用される管に吸着することによる抗体の減少が防止される。アルブミンが使用されるときは、適当な濃度は生理食塩水の重量に対し、０.５％〜４.５％である。他の製剤は、液体または凍結乾燥製剤を含んでなる。
【実施例】
【００８５】
本発明は更に次の実施例中の例証によって説明される：
実施例
マウスの免疫グロブリンレパートリーの代わりに、ヒトＩｇＧ/κレパートリーを発現させるために操作されたトランスジェニックマウス(Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol., 14, 845-851)が、ヒトＩＬ−１７に対する抗体を生成するために使用される。これらのマウスに由来するＢ細胞は、標準的なハイブリドーマ技術によって不死化され、そして、ヒトＩｇＧ１/κ抗体ＡＩＮ４５７を分泌するマウスのハイブリドーマ細胞が得られる。
【００８６】
実施例１：
ハイブリドーマの生成、抗体の精製、ＡＩＮ４５７抗体の選択
組み換えヒトＩＬ−１７(huIL-17)の製造：組み換えｈｕＩＬ−１７を、大腸菌中、封入体で製造し、そして従来技術によって再折りたたみする(イン・ハウスキャリアフリーで製造された)(E. coli; Novartis Pharma, バッチBM-E-3141/98)か、または購入するか(キャリアフリー、E. coli; R&D Systems #317-IL/CF))、またはＨＥＫ.ＥＢＮＡ中に分泌され一部グリコシル化されたタンパク質として産生する(組み換えｈｕＩＬ−１７、キャリアフリー(トランスフェクトされたＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞に由来するＩＬ−１７ ＡＰＰ−Ｃ６；Novartis Pharma, バッチ En. E-3382/82;０.２８ｍｇ/ｍｌ；組み換えｈｕＩＬ−１７、キャリアフリー(トランスフェクトされたＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞に由来するＩＬ−１７ ＡＰＰ−Ｃ４；Novartis Pharma, バッチ En. E-3382/83;０.２９ｍｇ/ｍｌ))。後者の形態は、培養上清から免疫アフィニティークロマトグラフィーによって急速に精製するためにＣ末端に４個のアミノ酸延長を特徴とする。この場合、培養上清を、製造業者(Pharmacia)の指示に従って１０ｍｇ／ｍｌ樹脂の密度で、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂと連結した特定の固定化抗ｔａｇ抗体の適当なサイズのカラムに加える。ＰＢＳを用いて基本洗浄後、結合したｈｕＩＬ−１７を１００ｍＭ グリシン、ｐＨ２.７で溶出し、そして、直ちに希釈ＮａＯＨを用いて中和する。
【００８７】
ｈｕＩＬ−１7のキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)への結合：大腸菌(E.coli)またはＨＥＫ.ＥＢＮＡのどちらかで製造されたｈｕＩＬ−１７を過剰のホモ二機能性架橋剤スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)を用いて、予じめ活性化されたＫＬＨに結合させる。手短に言えば、２０ｍｇの凍結乾燥したImject(登録商標) Mariculture KLH(Pierce #77600)を２ｍｌのＨ２Ｏを用いて再構成させ、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)、ｐＨ７.２を含む１０ｍｇ/ｍｌ溶液を作成する。この溶液にジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)中の２５０ｍＭのＤＳＳ４００μｌを加え、次にこの混合物を室温で約１時間撹拌する(試薬のすべてが溶解するわけではなく、一部沈殿物が形成される)。次いで短時間遠心分離し、ろ過(０.４５μｍ)後、この溶液をＰＢＳ(流速 ２ｍｌ/分)中でセファデックスＧ２５ファイン(Sephadex G25 fine)(Pharmacia)を用いて脱塩すると、１.５ｍｇ/ｍｌ(Bradford)で活性化されたＫＬＨが約１１ｍｇ生じる。１ｍｌの活性化されたＫＬＨ(１.５ｍｇ)を凍結乾燥された大腸菌(E.coli)によって誘導されたｈｕＩＬ−１７(バッチ ＢＭ−Ｅ３１４１/９８)の水溶液(９ｍｇ/ｍｌ)の１ｍｌと混和する。この溶液は透明のままであり、次にこれを室温で２時間インキュベートする。この結果生じる複合体の濃度は、１.４ｍｇ/ｍｌ(Bradfordによって測定される)である。１ｍｌの活性化されたＫＬＨ(１.５ｍｇ)を１ｍｌのＨＥＫ.ＥＢＮＡ ｈｕＩＬ−１７(水中で約３ｍｇ；バッチ Ｅｎ.Ｅ−３３８２/８３)と混和する。この溶液は透明のままであり、次に室温で２時間インキュベートする。濃度は２.９ｍｇ/ｍｌ(Bradford)である。
【００８８】
免疫化：マウスの免疫グロブリン可変および定常部遺伝子が機能的にそれらのヒト対応物(遺伝子型 Ｔｇコード ２２１１００−ＴｇＨ(ＣＭＤ)＋＋；ＴｇＮ(Ｈｃｏ７)１１９５２＋；ＴｇＨ(ＪＫＤ)＋＋；ＴｇＮ(ＫＣＯ５)９２７２＋(Sherie L. Morrison, 1994, Nature, Vol. 368, p. 812-813; Nils Lonberg et al., 1994, Nature, Vol. 368, p. 856-859も参照)によって置き換えられている、遺伝学的に操作されたマウス２７３４０(雌性；MEDAREX Inc, Annandale, NJ)を表１に報告されているスキームに従って免疫化する。
【００８９】
【表１】
血清サンプルは、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)によって抗ｈｕＩＬ−１７抗体のレベルを測定するために、免疫プロトコールの開始から３５日および９９日後に得る。
【００９０】
ハイブリドーマの生成：１２０日目に、マウス２７３４０をＣＯ２吸入によって殺す。全脾臓細胞(１×１０８)をＰＥＧ ４０００を用いてＰＡＩ−０細胞(５×１０７細胞)で融合する。融合細胞をＨＡＴ培地(２ｇ/ｌ重炭酸ナトリウム、５×１０−５Ｍ β−メルカプトエタノール、１０−４Ｍ ヒポキサンチン、１.６×１０−５Ｍ チミジン、４×１０−７Ｍ アミノプテリン、１０％熱不活性ＦＣＳおよび５０μｇ/ｍｌ ゲンタマイシンを含む、ＲＰＭＩ １６４０)中で、マウス腹膜細胞(Balb/c mice)の支持細胞層を含む、７２０ウェル(１ｍｌ/ウェル)中でプレーティングする。１４日目に、ＨＡＴ培地をＨＴ培地、すなわち、アミノプテリンを含まないＨＡＴ培地と交換する。１０日目にスクリーニングを開始し、２週間続ける。プレートされた最初の７２０ウェルのうち、６８４ウェル(９５％)でハイブリドーマ増殖がポジティブである。上清を集め、大腸菌(E.coli)およびＨＥＫ/ＥＢＮＡによって誘導されるｈｕＩＬ−１７の両方を用いて、ＥＬＩＳＡでｈｕＩＬ−１７反応性ＭＡｂについてスクリーニングする。５２個の一次ウェルが、抗ｈｕＩＬ−１７抗体の存在に対してポジティブである。２８個のハイブリドーマをクローン化し、残りのものは凍結する。クローニングは、４×９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて、ＨＴ培地およびマウス腹膜細胞の支持細胞層中で行われる。ハイブリドーマは、ウェルあたり、０.５細胞/１００μｌでプレーティングする。ウェルを顕微鏡的に増殖についてスクリーニングし、そして、ポジティブのものは、１００μｌのＨＴ培地に入れる。翌日、上清をｈｕＩＬ−１７特異的ＥＬＩＳＡで抗体産生について試験する。クローニングにより、大部分のクローン化ハイブリドーマは、抗ｈｕＩＬ−１７特異的モノクローナル抗体(ＭＡｂ)を分泌する能力を保持している。
【００９１】
抗体の産生と精製：選択されたクローンは、無血清培地(５ｍｌ)中で２５ｃｍ２ＴＣ(ＴＣ：組織培養)フラスコの中へ移す。ハイブリドーマは、無血清培地中、７５ｃｍ２ＴＣフラスコおよびローラーフラスコまで、漸増的に拡張する。ＮＶＰ−ＡＩＮ４５７−ＮＸ(３４０−１１０−２８、すなわち、マウス番号−ハイブリドーマ番号−クローン番号)を含む異なった抗ｈｕＩＬ−１７ＭＡｂのすべて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。培養上清をｐＨ７.３に調整し、プロテインＡセファロース ４ ファーストフロウ(Pharmacia)の適当なサイズのカラムに入れる。１００ｍＭの燐酸緩衝液(ｐＨ７.３)を用いて基本洗浄後、結合した抗体を５０ｍＭ クエン酸、ｐＨ２.７、１４０ｍＭ ＮａＣｌで溶出する。この溶出したフラクションを、直ちに中和し(ｐＨ ７.０)、無菌ろ過する。蛋白質濃度は、１.３５吸光度(ＡＵ)/ｍｇの倍率を用いて２８０ｎｍでの吸光度によって決定する。
【００９２】
ヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生に対する抗ｈｕＩＬ−１７ＭＡｂの阻害活性：ヒト皮膚線維芽細胞を２％ ＦＣＳ、インシュリン(５μｇ/ｍｌ)ｈｕＦＧＦ−ｂａｓｉｃ(０.１μｇ/ｍｌ)およびゲンタマイシン(５０μｇ/ｍｌ)を補充したＦＢＭ中で培養する。線維芽細胞は、トリプシン/ＥＤＴＡ溶液を用いてプラスチックから分離させる。線維芽細胞を、１％ＦＣＳを補充したＦＢＭ中で１×１０４細胞/ウェル密度で９６ウェルのマイクロタイタープレートに分配する。線維芽細胞を一晩プレートに付着させる。翌朝、培地を除き、１％ＦＣＳを補充した新鮮なＦＢＭ、ｈｕＩＬ−１７(３０〜５００ｎｇ/ｍｌの範囲の様々な濃度)およびハイブリドーマ上清(１/５最終希釈)または精製抗体を最終容量２００μｌまで加える。培養上清は、２４時間のインキュベーションの後、回収し、そしてｈｕＩＬ−６産生(量)がＥＬＩＳＡによって測定される。
【００９３】
抗ｈｕＩＬ−１７抗体の検証のためのＥＬＩＳＡ：ヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生に対する抗ｈｕＩＬ−１７ＭＡｂの阻害活性：ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートをＰＢＳ ０.０２％ＮａＮ３中の組み換えｈｕＩＬ−１７(３μｇ/ｍｌで１００μｌ/ウェル；バッチ ＢＭ−Ｅ３１４１/９８またはＥｎ.Ｅ−３３８２/８２)を用いて被覆し、次に室温で一晩インキュベートする。翌日、マイクロタイタープレートをＰＢＳ/２％ＢＳＡ/０.０２％ＮａＮ３の３００μｌを用いて３７℃で２時間ブロッキングする。次いでプレートを、ＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０/０.０２％ＮａＮ３で４回洗浄する。マウス２７３４０の血清希釈液(３５日目の最終希釈範囲：１/１００〜１/３２００；９９日目の最終希釈範囲：１/２００〜１/１２８００；１００μｌ/ウェル)またはハイブリドーマの培養上清(最終希釈 １：３；１００μｌ/ウェル)が加えられる。室温で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０/０.０２％ＮａＮ３で４回洗浄する。ビオチンコンジュゲートマウス抗ｈｕ−ＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的抗体が最終濃度１/２００００(１００μｌ/ウェル)で加えられる。サンプルを、室温で４時間反応させる。洗浄(４回)後、アルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジンが最終希釈１/８０００(１００μｌ/ウェル)で加えられる。室温で４０分後、プレートを再び４回洗浄し、次に基質(ジエチルアミノバッファーｐＨ９.８中のｐ−ニトロフェニルホスファート；１５０μｌ/ウェル)が加えられる。プレートをマイクロタイターリーダー(Bio-Rad)で、４０５および４９０ｎｍのフィルターを用いて、反応の発色に応じて３０分または４５分後に読み取る。
【００９４】
抗体アイソタイプの検出のためのＥＬＩＳＡ：ＭＡｂのアイソタイプを明らかにするために、培養上清(１００μｌ；最終希釈１/５)をｈｕＩＬ−１７で被覆されたマイクロタイタープレートのウェルに加え(上記参照)、次に室温で一晩インキュベートする。洗浄(４回)後、１００μｌ/ウェルのビオチンコンジュゲートマウスＭＡｂｓ抗ヒトＩｇＧ１(最終希釈１/１０００)、ＩｇＧ２(最終希釈１/１０００)、ＩｇＧ３(最終希釈１/１０００)、ＩｇＧ４(最終希釈１/２０００)または抗ヒトκ軽鎖(最終希釈１/１０００)を室温で４時間加える。対照として、ビオチンコンジュゲートラット抗マウスλ１およびλ２軽鎖特異的ＭＡｂを使用する(最終希釈１/１０００)。前に述べたごとくこれに続いて、洗浄およびアルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジンの添加(１００μｌ；最終希釈１/８０００)が行われる。４回洗浄した後、基質(ジエチルアミノバッファー中のｐ−ニトロフェニルホスファート；１００μｌ)が加えられる。プレートをマイクロタイターリーダー(Bio-Rad)で、４０５および４９０ｎｍのフィルターを用いて、反応の発色に応じて３０分または４５分後に読み取る。
【００９５】
ｈｕＩＬ−６産生の検証のためのＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートをＰＢＳ ０.０２％ＮａＮ３中の抗ｈｕＩＬ−６マウスＭＡｂ(R&D systemに由来するＭＡＢ２０６；４μｇ/ｍｌで１００μｌ/ウェル)を用いて被覆し、次に室温で一晩インキュベートする。次の日に、マイクロタイタープレートをＰＢＳ/２％ＢＳＡ/０.０２％ＮａＮ３の３００μｌを用いて３７℃で２時間ブロッキングした。次いでプレートは、ＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０/０.０２％ＮａＮ３で４回洗浄する。ヒト皮膚線維芽細胞の培養上清(最終希釈１：３；１００μｌ/ウェル)が加えられる。タイトレーション曲線を確立するために、ｈｕＩＬ−６(１００μｌ/ウェル)を１：２希釈工程中４００ｐｇ/ｍｌ〜３.１ｐｇ/ｍｌで力価測定する。室温で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０/０.０２％ＮａＮ３で４回洗浄する。ビオチンコンジュゲートヤギ抗ｈｕＩＬ−６抗体(BAP206; R&D Systems)が加えられる(２５ｎｇ/ｍｌ；１００μｌ/ウェル)。サンプルを、室温で４時間反応させる。洗浄(４回)後、アルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジン(alkaline phosphatase-conjugated streptavidin)が最終希釈１/８０００(１００μｌ/ウェル)で加えられる。室温で４０分後、プレートを再び４回洗浄し、次に基質(ジエチルアミノバッファーｐＨ９.８中のｐ−ニトロフェニルホスファート；１５０μｌ/ウェル)が加えられる。プレートをマイクロタイターリーダー(Bio-Rad)で、４０５および４９０ｎｍのフィルターを用いて３０分後に読み取る。
【００９６】
計算：値は、オリジナルのＯ.Ｄ.値か、または２回の測定値の平均値に基づいて計算される阻害％として報告する。更なるデータは、平均値±標準誤差として報告する。ｈｕＩＬ−６の標準曲線を、三次曲線フィットを用いることによって、培養上清中のｈｕＩＬ−６濃度を測定するために使用した。
【００９７】
結果
マウス２７３４０の血清力価：
【表２】
＊マイクロタイタープレートは、大腸菌(E.coli)(ＢＭ−Ｅ３１４１/９８)またはＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞(Ｅｎ.Ｅ−３３８２/８２)に由来するｈｕＩＬ−１７(３μｇ/ｍｌ)で被覆されている。
マウス２７３４０の血清は、二個の異なったｈｕＩＬ−１７の調製物に基づいて、３５日目と９９日目に抗ｈｕＩＬ−１７抗体の存在についてＥＬＩＳＡで分析する(表２)。結果は、マウス２７３４０の血清力価は、３５日目と９９日目の間で約４倍に増加しており、そして、両方のｈｕＩＬ−１７調製物が識別されるということを示している。
【００９８】
ハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡにおける結合：６８４上清を、組み換えｈｕＩＬ−１７の二個の調製物(前者は大腸菌(E.coli)(ＢＭ−Ｅ３１４１/９８)に起源しており、後者はＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞(Ｅｎ.Ｅ−３３８２/８２)に起源している)を用いて、抗ｈｕＩＬ−１７抗体の存在についてＥＬＩＳＡで試験する。５２個の上清が、抗ｈｕ−ＩＬ−１７抗体の存在に対してポジティブである(表３)。一方または他方のｈｕＩＬ−１７の調製物に優先的に結合することが、いくつかの場合に観察される。続いてクローン化する２８個のハイブリドーマに、下線を引く。
【表３】
＊プレートは、大腸菌(E.coli)(ＢＭ−Ｅ３１４１/９８)またはＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞(Ｅｎ.Ｅ−３３８２/８２)に由来する組み換えｈｕＩＬ−１７(３μｇ/ｍｌ)で被覆されている。上清は、最終希釈率１/３で試験される。
【００９９】
ハイブリドーマクローンの培養上清のＥＬＩＳＡにおける結合：抗ｈｕＩＬ−１７ ＭＡｂの最もよい産生物を維持している１１個のハイブリドーマのクローンの上清のＥＬＩＳＡにおける反応性を表４に示す。下線(bold)で強調されているクローンは、抗体の精製および分析のためのローラーボトル中の〜１リットルの上清を産生するために選択された。ｈｕＩｇＧ３κ抗体を産生するハイブリドーマＮｏ ５から誘導されるクローンを除いて、他のクローンのすべては、アイソタイプ特異的モノクローナル抗体によって評価されるとおり、ｈｕＩｇＧ１κＭＡｂを産生した。
【表４】
マイクロタイタープレートは、ＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞(Ｅｎ.Ｅ−３３８２/８２)に由来する組み換えｈｕＩＬ−１７(３μｇ/ｍｌ)で被覆されている。
【０１００】
培養上清の活性の中和：培養上清を、組み換えｈｕＩＬ−１７で刺激されたヒト皮膚線維芽細胞によるｈｕＩＬ−６の産生阻害について試験する。表５に示すとおり、大部分の培養上清は、阻害活性を示す。
【表５】
【０１０１】
ＡＩＮ４５の中和活性：開発候補物ＡＩＮ４５７(本発明の好ましい態様)の産生のためのクローン１１０−２８の選択は、精製抗体のＢＩＡＣＯＲＥ２０００による中和活性およびアフィニティー測定に基づいている(下記実施例２参照)。
【０１０２】
実施例２：ＡＩＮ４５７は、非常に高い親和性をもって組み換えヒトＩＬ−１７(ｈｕＩＬ−１７)に結合する；ＫＤは、１２２±２２ｐＭ(BIAcore)であり、ヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕＩＬ−１７によって誘発されるヒトＩＬ−６の産生を中和する；ＩＣ５０は、１.８７ｎＭ ｈｕＩＬ−１７の濃度で２.１±０.１ｎＭである。
ａ)方法
試薬：一般的研究用試薬を、ＭｅｒｃｋまたはＳｉｇｍａ社から購入し、入手できる最も高い純度グレードである；特別の試薬の供給源は下記に詳述する。
蛋白質：モノクローナル抗体は、ＭＥＤＡＲＥＸトランスジェニックマウスを組み換えヒトＩＬ−１７で免疫することによって生成させ、次いで細胞株を生産する標準的な手順に従って、そこから分泌物質をプロテインＡセファロースクロマトグラフィー(Protein A Sepharose chromatography)によって精製することができる(実質的に実施例１中で述べられている)。ＡＩＮ４５７は、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０、１４０ｍＭのＮａＣｌ中の滅菌ろ過溶液として４℃で保存される。この組み換えヒトＡＩＮ４５７(バッチ ＫＢ０３３０３Ａ)は、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム/４０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７、１５０ｍＭ ＮａＣｌか、または１Ｍトリス塩基で調整された２０ｍＭ 酢酸 ｐＨ５.５のどちらかの滅菌ストック溶液中で得られる。濃度は、通例、２ｍｇ/ｍｌの範囲内であり、Biacore実験のために、ＢＩＡ緩衝液(２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.０５％ｖ/ｖツイーン−２０)中で最終濃度５μｇ/ｍｌまで希釈される。
組み換えヒトＩＬ−１７は、社内で製造される；バッチ Ｅｎ/Ｅ ３８８２/８３；０.２９ｍｇ/ｍｌ。
【０１０３】
ＢＩＡｃｏｒｅ測定
速度論的結合パラメーターおよび交差反応性のレベルの決定が、光バイオセンサーＢＩＡｃｏｒｅ ２０００(BIAcore AB, Upsalla, Sweden, 詳細はLit. HS 1,2参照)を用いて表面プラズモン共鳴測定によって行われる。この技術によって、リガンドが受容体に結合および解離する顕微鏡的比率定数(ｋｏｎおよびｋｏｆｆ)の無標識での決定を可能とする。それ故、抗体−抗原の相互作用を特徴付けるのに特に適している。この技術は、ＥＬＩＳＡ測定の欠点を補い、様々な点でＥＬＩＳＡ測定に比べて優れている(Van Regenmortel, DevBiol(Basel).2003; 112: 141-51)。組み換えＩＬ−１７のＩＬ−１７抗体ＡＩＮ４５７への結合の検討は、二つの方法で行われる。標準的プロトコールでは、ＡＩＮ４５７は、その前にＣＭ−５ ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ(研究グレード)に固定化されている抗ヒトＦＣγ抗体によって捕捉される(Jackson Immunochemicals; Cat. No. 109-005-098)。ＦＣγ捕捉抗体の共有結合は、BIAcoreから提供される(BIAcore, Cat. No. BR-1000-50)‘アミン結合キット’を用いて行われる。通例、捕捉抗体の３０００ＲＵＳは、１０ｍＭ Ａｃ緩衝液、ｐＨ４.５中の３０μｇ/ｍｌ 抗ＦＣγ抗体溶液を流速５μｌ/分にすると、活性化したデキストラン表面に結合して、約２５０ＲＵＳのＡＩＮ４５７の固定化に至る。ガイドラインとして、１０００ＲＵＳは、１ｎｇ/ｍｍ２の物質移動に相当する。あるいは、ＩＬ−１７(Section 3.2; 表４)、ＡＩＮ４５７抗体は、抗体を捕捉することなく、直接チップの表面に結合する。この結果は、表９(下記参照)に述べられているプロトコールに比較されている。
【０１０４】
ｂ)結果
ＩＬ−１７/ＡＩＮ４５７複合体の結合速度
平衡解離定数ＫＤは、イン・ビボで形成された、複合体の安定性についてのいくつかの判断を可能にする。それ故、我々は、ヒトＩＬ−１７が固定化されたＡＩＮ４５７抗体に結合する速度定数を決定し、次にこうしたデータからこのプロセスのＫＤを誘導した。二個の実験の曲線が、ＢＩＡエバルエーション(BIAevaluation) ３.０ ソフトウエアを用いるラングミアモデル(Langmuir model)にフィットしている場合に、表３は得られたデータのサマリーを示す。もちろん、抗体は二価であるけれども、この結合は、個々の抗体結合部位は、単量体ＩＬ−１７分子によって占められるようになる表面に提示される個々の抗体結合部位で、１：１事象として処理できる。
この実験では、抗体−ケモカイン複合体の極端に速い結合ならびに極めて遅い解離速度の両方を示す。センサーグラムが、(BIAevaluationで示唆されているように全体的ではなく)個別的に処理されるときに、最もよいデータフィットが得られる。すなわち、連続したタイトレーションを集約した後、我々は、１２個のセンサーグラムから平均値を得る(ｋｏｎ＝(４.１±０.１)×１０５ ｌ/Ｍｓ；ｋｏｆｆ＝(３.８±０.５)×１０−４ ｌ/ｓ；およびＫＤ＝１２２±２２ｐＭ)。
【表６】
平均ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｏｆｆ/ｋｏｎを適用したのではなく、個々のエントリー(垂直軸)から計算された。
【０１０５】
組み換え細胞中で産生されたＡＩＮ４５７(ＫＢ０３３０３Ａ)について、親和性測定を、ヒト、マーモセット、アカゲザルおよびカニクイザルにそれぞれ由来するＩＬ−１７サイトカインについて行う。Biacore測定の実験的詳細は、ＭＡＢ１１０−２８抗体の場合に上記で述べられたと同一である。それぞれのラン行程で六種のＩＬ−１７の濃度を試験する二つの独立したランが行われる。ヒトＩＬ−１７の濃度は、２、４、８、１２、１６、２０ｎＭであり、そして他の種のすべての場合は、１０、２０、３０、４０、５０、６０ｎＭである。完全なデータ分析によって、各ＩＬ−１７種のためのｎ＝１２の個々の測定が得られる。ＫＤならびにＳＥＭを報告する。
【表７】
【０１０６】
ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＫＤならびにそれぞれのＩＬ−１７種を含んでいる抗体ＫＢ０３３０３Ａの場合のBIAcore分析の全一式データが、下記の表５〜８に提供される。
【表８】
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
【表１１】
【０１１０】
次に、ｈｕＩＬ−１７に対する精製されたＡＩＮ４５７(バッチ Ｅｎ/Ｅ−１０３３３/５３；０.５４ｍｇ/ｍｌ)の阻害活性を評価する。ＩＣ５０値は、表６に示す。これらの実験では、ｈｕＩＬ−１７Ｒ/Ｆｃおよびマウス抗ｈｕＩＬ−１７ ＭＡｂは、ポジティブコントロールとして、そして、シムレクト(Simulect)はネガティブコントロールとして含まれる。
【表１２】
＊平均値および標準誤差は、三個の異なった、独立した実験から計算される。
【０１１１】
結論として、ＡＩＮ４５７は、ヒトの皮膚線維芽細胞によるＩＬ−１７依存性のｈｕＩＬ−６の分泌を抑止する。この作用強度は、ｈｕＩＬ−１７Ｒ/Ｆｃのそれと匹敵し、商業上利用可能なマウス抗ｈｕＩＬ−１７ ＭＡｂのそれと比較して優れている。ＩＬ−１７Ｒ/Ｆｃに比較して、ＡＩＮ４５７でより完全な阻害が観察されることを注目することは興味深い。
【０１１２】
実施例３：重鎖と軽鎖のアミノ酸シークエンシングの純度および部分的アミノ酸配列
ＶＬおよびＶＨ領域のアミノ末端アミノ酸配列：二個の抗ＩＬ−１７Ａ抗体の重鎖および軽鎖の最初の４８個のアミノ酸残基、クローン１１０−７(表４参照)および１１０−２８(表４参照)を、エドマン分解によって決定する。このアミノ酸配列は、両方のクローンで同一である。ジーンバンクでは、blast分析でサーチされ、そして、見出された最も相同的なＤＮＡ配列をクローニングプライマーの設計に使用する。
【０１１３】
ＶＬおよびＶＨ領域の分子クローニング：製造業者(Quiagen Hilden Germany)のプロトコールに従ってRNeasy Midi Kitを用いて、全ＲＮＡを２×１０７個のハイブリドーマ細胞(クローン １１０−７、クローン １１０−２８)から調製する。全ＲＮＡを２００μｌのＲＮａｓｅ非含有水中に溶出し、−８０℃で保存する。ファーストストランドｃＤＮＡ合成を、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素(Promega, Madison, WI)、oligo-dT プライマー、ＰＣＲヌクレオチド混合物(dNTP)およびＲＮＡｓｉｎ阻害剤(Roche, Mannheim)を用いて行う。５μｇの全ＲＮＡは、１μｌのoligo-dT プライマー(０.５μｇ/μｌ)と混和し、次にＲＮａｓｅ非含有水を最終容積３６μｌまで加える。この混合物を７０℃で１０分間インキュベートし、次いで氷上に保存する。氷の上にある間に、次の試薬を加える：１０μｌ ５× ＲＴ緩衝液、２μｌ ｄＮＴＰｓ(各１０ｍＭ)、２μｌ ＲＮａｓｉｎおよび１μｌ Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。この反応を４２℃で１時間行う。
【０１１４】
ＰＣＲ反応を全容量４０μｌ中でｃＤＮＡテンプレート４μｌ、それぞれ１０μＭの各プライマー２μｌ(概要は下記および表１０および１１参照)、２×Qiamix (緩衝液、dNTP's, TAQPolymeraseを含む)２０μｌおよびPwo DNA Polymerase １μｌを用いて、構築する。このＰＣＲの条件は、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間そして７２℃で３０秒間の３５サイクルにセットされる。ＰＣＲ生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｚｅｒｏ(Stragagene, La Jolla, Ca.)クローニングベクターにサブクローニングする。いくつかのクローンを各反応から回収し、ヌクレオチド配列がプライマー ＭＶ４３２(配列番号２１)、ＭＶ４３３(配列番号２２)、ＭＶ４３４(配列番号２３)、ＭＶ４３５(配列番号１４)、およびベクターＤＮＡにおける標準的プライマーを用いて、Solvias AG(Basel)によって決定する。
【０１１５】
重鎖をコードしているｃＤＮＡを、プライマーペアー ＭＶ４１６(配列番号１５)/＃２６５(配列番号１６)およびＭＶ４１８(配列番号１７)/＃２６５(配列番号１６)を用いて増幅する。このプライマーは、重鎖の次のアミノ酸位置に相当するヌクレオチド配列をカバーしている：ＭＶ４１６ 位置−１９/−１３(シグナルペプチド)；ＭＶ４１８ 位置＋１/＋７；＃２６５ 位置＋２５３/＋２５９。位置＋１は、成熟蛋白質の最初のアミノ酸である。
【０１１６】
軽鎖をコードしているｃＤＮＡを、プライマーペアー ＭＶ４１７(配列番号１８)/＃２２３(配列番号１９)およびＭＶ４１９(配列番号２０)/＃２２３(配列番号１９)を用いて増幅する。このプライマーは、軽鎖の次のアミノ酸位置に相当するヌクレオチド配列をカバーしている：ＭＶ４１７ 位置−２０/−１４(シグナルペプチド)；ＭＶ４１９ 位置＋１/＋７；＃２２３ 位置＋２１０/＋２１５。このアプローチによって、それぞれの免疫グロブリン鎖の二個の独立したＰＣＲ増幅が可能になり、その結果、二個のＤＮＡ配列が独立して確立することになる。
【０１１７】
結果および考察
二個のハイブリドーマ(１１０−７および１１０−２８、上記表４参照)に由来する重鎖および軽鎖をコードしているクローニングされたＰＣＲ生成物は、ＤＮＡシークエンシングによって特徴付けられる。５個および６個の独立した配列が軽鎖および重鎖の配列を集合させるために使用される。軽鎖ｃＤＮＡは、すべて同一であり、全体をコードしている配列(アミノ酸位置−２０〜＋２１５)をカバーしている。重鎖ｃＤＮＡは、それぞれ一個のｃＤＮＡに二個の異なるミスマッチを有していた。これらは、開始コドンから定常領域ドメイン１(アミノ酸位置−１９から＋２３８)の後のヒンジ領域の端まで伸長している最終的な配列から排除される。両方のハイブリドーマの配列は同一である。ハイブリドーマ１１０−２８から得られるｃＤＮＡを選択し、すべての更なる発現作業のために使用する。配列番号７(ＡＩＮ４５７の重鎖のｃＤＮＡ)、配列番号８(ＡＩＮ４５７の重鎖のアミノ酸配列)、配列番号９(ＡＩＮ４５７の軽鎖のｃＤＮＡ)および配列番号１０(ＡＩＮ４５７のアミノ酸配列)は、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡシークエンシングのために使用される蛋白質配列およびプライマーの位置と共に、ＡＩＮ４５７の軽鎖および重鎖をコードしているＤＮＡ配列を示す。このＤＮＡ配列は、重鎖に対しては受託番号 ＮＰＬ００３６８９として、軽鎖に対しては受託番号 ＮＰＬ００３６９０として、PlasNovaに登録されている。
【０１１８】
ｃＤＮＡクローニングによって見出されたアミノ酸配列は、以前に精製免疫グロブリン重鎖および軽鎖のエドマン分解によって得られたそれと同一であり、正しいｃＤＮＡがクローニングされたことを示している。
【０１１９】
【表１３】
【表１４】
【０１２０】
【表１５】
【表１６】
【０１２１】
実施例４：抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体ＡＩＮ４５７のＦａｂ断片の三次元構造
相補性決定領域(ＣＤＲ')の立体配座およびＡＩＮ４５７の抗原結合部位の構造を決定するために、Ｆａｂ断片を生成し、結晶化し、次にそのＸ線構造を蛋白質結晶構造解析によって決定する。
【０１２２】
方法：ＮＶＰ−ＡＩＮ４５７のＦａｂ断片を抗体全体からパパイン開裂によって製造し、プロテインＡクロマトグラフィー、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。次いで精製物を限外ろ過によって１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＴＣＥＰ中で２０ｍｇ/ｍｌまで濃縮する。結晶は、２.０Ｍ 硫酸アンモニウム、５％ ＰＥＧ４００、０.１Ｍ Ｎａ ＭＥＳ ｐＨ６.５によって１９℃で懸滴して蒸気拡散法の技術によって成長させる。これらは、単位格子寸法 ａ＝９０.３Å、ｂ＝１０６.７Å、ｃ＝１３１.４Åを有し、かつ非対称単位に二個のＦａｂ分子を有する空間群Ｐ２１２１２１にある。Ｘ線データ回収の前に、ＡＩＮ４５７ Ｆａｂの単一結晶は、Lustyの方法(J. Appl. Cryst. (1999) 32, 106-112)を用いて、グルタルアルデヒドで架橋され、次いで２.０Ｍ Ｌｉ２ＳＯ４、２％ＰＥＧ４００、および０.１Ｍ Ｎａ ＭＥＳ ｐＨ６.５を含む溶液に移される。次にこの結晶をデータ回収のために９５Ｋで、クリオループ(cryo-loop)にマウントし、急速冷凍する。それぞれ１.０deg振動に相当する１８０の回折像が記録される。この回折データは、ＨＫＬプログラムスイートで処理される。この構造は、分子置換によって２.５Å分解能まで決定される。次いでこの構造は、プログラムＣＮＸを用いて、ねじれ角力学およびエネルギー最小化によって精度をあげる。
【０１２３】
結果：二個のＡＩＮ４５７Ｆａｂ分子は結晶の非対称ユニットで存在し、両方のＦａｂ分子のＨ−ＣＤＲ３ループが対称関連ＦａｂのＨ−ＣＤＲ３ループとの蛋白質−蛋白質接触中に関与している。この二個のＦａｂ分子は、異なった肘角度を示すが、その他の点で本質的には同一のＣＤＲループ立体配座を有する(ＣＤＲループのアミノ酸配列の表１２参照)。このＨ−ＣＤＲ１ループはしかるべきＨ１：１の正準な構造を採用しており、一方、Ｈ−ＣＤＲ２ループ立体配座は、規範的構造Ｈ２：３Ａのそれと適合している。ＡＩＮ４５７抗体のＨ−ＣＤＲ３ループは、Kabat ９４位(Ａｒｇ Ｈ９８)と１０１位(Ａｓｐ Ｈ１１５)の間の１８個の残基を含んでなり、非常に長い。それは、９４位(Ａｒｇ Ｈ９８)中のＡｒｇの側鎖とＨ１０１位(Ａｓｐ Ｈ１１５)中のＡｓｐカルボキシラート基の間の塩架橋によって、およびＴｒｐ Ｈ１１７の側鎖とＰｈｅ Ｈ１１４の主鎖カルボニル基の間の水素結合相互作用によって、安定化された典型的な湾曲したトルソー構造(bulged torso structure)を示す。Ｈ−ＣＤＲ３ループの頭部は、その基部に第二のベータ−湾曲(beta-bulge)およびその頂点にタイプＩのベータ−ターン(type I' beta-turn)を有する長い、ねじれたベータヘアピン構造を有する。ＡＩＮ４５７ Ｈ−ＣＤＲ３ループの際立った特徴は、その高含量の芳香族残基である：６個のチロシン、２個のトリプトファン、１個のフェニルアラニン。他のＣＤＲループのすべては、それぞれ更に一個のチロシンを供給しているので、ＡＩＮ４５７の抗原結合部位は、全部で１１個のチロシンを有している。Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２のループの立体配座は、それぞれ、正準な構造Ｌ１：６およびＬ２：１に合致する。Ｈ−ＣＤＲ３とは対照的に、Ｌ−ＣＤＲ３ループは短く(６個の残基)、その先端部にシス−プロリン(Ｐｒｏ Ｌ９６)を有し、Kabat ９０位にグルタミン(Ｇｌｎ Ｌ９１)を有し、Kabat ９７位にトレオニン(Ｔｈｒ Ｌ９８)を有する、一般に観察される規範的構造Ｌ３：１を示す。しかしながら、ＡＩＮ４５７ Ｌ−ＣＤＲ３ループのかなり異例な特徴は、シス−プロリンの後にシステイン残基の存在することである(Ｃｙｓ Ｌ９７)。Ｃｙｓ Ｌ９７の側鎖は、ＶＬ−ＶＨインターフェイスに位置している浅い陥凹の底部にあり、残基Ｔｒｐ Ｈ１１２、Ｔｒｐ Ｈ４７およびＴｙｒ Ｌ９２によって並んでいる。
【表１７】
【０１２４】
表１：Chothiaおよびその共同研究者のアプローチを用いて、Kabat定義に基づき、Ｘ線解析によって決定されたＡＩＮ４５７モノクローナル抗体の超可変領域のアミノ酸配列。太字で強調表示されたアミノ酸は、ＣＤＲループの部分であり、一方、普通のスタイルで示されたアミノ酸は、抗体フレームワークの部分である。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ＡＩＮ４５７ ＦａｂのＸ線構造を示す。相補性決定領域が強調されているＡＩＮ４５７ Ｆａｂ(Ｃ□トレース)の可変ドメインのクローズアップ図である。ＡＩＮ４５７の抗原結合部位が特別にチロシン残基に多く含まれているという事実を図解するために、ＣＤＲループによって提供されているチロシン側鎖のすべてが示されている。ＶＬ−ＶＨインターフェイスでのＣｙｓ Ｌ９７の側鎖が、また示されている(矢印)。
【図２】ＡＩＮ４５７ ＦａｂのＸ線構造、概観図を示す。ＡＩＮ４５７のＦａｂのファンデルワールスの表面描写である。軽鎖および重鎖は、それぞれ、ライトグレイおよびダークグレイで色付けされている。ＣＤＲループは、異なった色で強調されている。抗体の抗原結合部位から突き出ているまさにループであるＨ−ＣＤＲ３ループ(H-CDR3 loop)が存在していることが注目される。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ＩＬ−１７結合分子、特にヒトＩＬ−１７に対する抗体、更に好ましくは、ヒトＩＬ−１７に対するヒト抗体(ＩＬ−１７Ａとも命名されている)およびＩＬ−１７介在性疾患および状態の処置におけるこうした抗体の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、関節リウマチ(ＲＡ)に存在する、Ｔ細胞によって誘導されるサイトカインであるＩＬ−１７は、特にＩＬ−１およびＴＮＦ−αと共に炎症誘発性サイトカインとして作用する(Chabaud M & Miossec P (1999) Arthritis Rheum 42,963-970; Awane M et al(1999) J. Immunol 162, 5337-5344)。ＩＬ−１７はＭＭＰ産生を誘発し、かつＴＩＭＰをダウンレギュレートし(Jovanovic DV et al(2001) J. Rheumatol. 28, 712-718)、そして、ＩＬ−１とＩＬ−１７のブロックは、イン・ビボにおいて、炎症および骨の破壊に対して相乗的な効果を有する(Chabaud M & Miossec(2001) Arthritis Rheum 44, 1293-1303)。不適切または過剰なＩＬ−１７産生は、関節リウマチ(Witowski et al., 2004 Cell Mol Life Sci 61:567-579)、骨関節炎、骨インプラントの緩み、急性移植拒絶反応(Antonysamy et al., 1999, J Immunol 162, 577-584; van Kooten et al., 1998, J Am Soc Nephrol 9 , 1526-1534)、敗血症、敗血症性またはエンドトキシンショック、アレルギー、喘息(Molet et al., 2001, J Allergy Clin Immunol 108, 430-438)、骨喪失、乾癬(Teunissen et al., 1998, J Invest Dermatol 111, 645-649)、虚血、全身性硬化症(Kurasawa et al., 2000, Arthritis Rheum 43, 2455-2463)、卒中、および他の炎症性疾患のような様々な疾患および障害の病因に関連する。ＩＬ−１７に対する抗体は、ＩＬ−１７介在性疾患および障害の処置における使用が提案されてきた；例えば、ＷＯ ９５/１８８２６およびその導入における考察参照。
【０００３】
我々は、本発明により、ＩＬ−１７介在性疾患および障害の処置における使用に適当なヒトＩＬ−１７に対する改善された抗体を調製した。
【発明の開示】
【０００４】
従って、本発明は、順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３｛前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列(Ｎ−Ｙ−Ｗ−Ｍ−Ｎ)を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列(Ａ−Ｉ−Ｎ−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｅ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｖ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ)を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列(Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｔ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｉ−Ｈ−Ｙ−Ｗ−Ｙ−Ｆ−Ｄ−Ｌ)を有する｝；またはその直接ＣＤＲ等価物を含む、少なくとも一個の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含んでなる、抗原結合部位を含んでなるＩＬ−１７結合分子を提供する。
【０００５】
従って、本発明は、また、少なくとも一個の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含んでなるＩＬ−１７結合分子であって、順に、超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'｛前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列(Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ａ)を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列(Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ａ−Ｔ)を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列(Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｐ−Ｃ−Ｔ)を有する｝またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む、ＩＬ−１７結合分子を提供する。
【０００６】
本発明の別の態様では、本発明は、順に超可変領域ＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘおよびＣＤＲ３−ｘ｛前記ＣＤＲ１−ｘは、配列番号１１のアミノ酸配列(Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｗ−Ｍ−Ｎ)を有し、前記ＣＤＲ２−ｘは、配列番号１２のアミノ酸配列(Ａ−Ｉ−Ｎ−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｅ−Ｋ−Ｙ−Ｙ)を有し、そして前記ＣＤＲ３−ｘは、配列番号１３のアミノ酸配列(Ｃ−Ｖ−Ｒ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｔ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｉ−Ｈ−Ｙ−Ｗ−Ｙ−Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｗ−Ｇ)を有する｝；またはその直接ＣＤＲ−ｘ等価物を含む、少なくとも一個の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含んでなる、抗原結合部位を含んでなるＩＬ−１７結合分子を提供する。
【０００７】
更に、本発明は、また、重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)可変ドメインの両方を含んでなるＩＬ−１７結合分子であって；
前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３(前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ等価物を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)、またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
を含んでなる少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子も提供する。
【０００８】
更に、本発明は、また、重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)可変ドメインの両方を含んでなるＩＬ−１７結合分子であって；前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘおよびＣＤＲ３−ｘ(前記ＣＤＲ１−ｘは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２−ｘは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３−ｘは、配列番号１３のアミノ酸配列をする)またはその直接ＣＤＲ−ｘ等価物を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
を含んでなる少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子も提供する。
【０００９】
別途記載のない限り、ポリペプチド鎖はいずれも、アミノ酸配列はＮ末端で始まり、Ｃ末端で終了するように本明細書中で記載されている。抗原結合部位が、ＶＨおよびＶＬドメインの両方を含んでなる場合は、これらは、同一のポリペプチド分子上に位置してもよいし、または、好ましくは、それぞれのドメインは、異なった鎖上に存在してもよく、ＶＨドメインは、免疫グロブリン重鎖部分またはその断片の一部であり、そしてＶＬは、免疫グロブリン軽鎖部分またはその断片の一部である。
【００１０】
“ＩＬ−１７結合分子”とは、単独もしくは他の分子との組み合わせで、ＩＬ−１７抗原に結合することができるすべての分子を意味する。この結合反応は、ＩＬ−１７のその受容体との結合の阻害を測定するための、例えば、結合アッセイ、競合アッセイまたはバイオアッセイを含む標準的方法(定量的アッセイ)または他の任意の結合アッセイによって、無関係の特異性(unrelated specificity)であるが、同一のアイソタイプである抗体、例えば、抗ＣＤ２５抗体が使用されるネガティブコントロール試験を対照とすることにより、示し得る(実施例１も参照)。
【００１１】
抗原結合分子の例としては、Ｂ細胞またはハイブリドーマによって産生される抗体、およびキメラ、ＣＤＲ移植またはヒト抗体またはそれらの任意の断片、例えば、Ｆ(ａｂ')２およびＦａｂ断片、ならびに一本鎖または単一ドメイン抗体が含まれる。
【００１２】
一本鎖抗体は、通例１０〜３０個のアミノ酸、好ましくは、１５〜２５個のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって共有結合される抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインから構成されている。それ故、こうした構造には重鎖および軽鎖の定常部は含まれず、小ペプチドスペーサーは、定常部全体に比べて抗原性は少ないであろうと考えられている。“キメラ抗体”とは、重鎖もしくは軽鎖またはその両方の定常領域がヒト起源であり、一方、重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインは、非ヒト(例えば、マウス)起源かまたはヒト起源であるが、異なったヒト抗体に由来する、抗体を意味する。“ＣＤＲ移植抗体”とは、超可変領域(ＣＤＲ)が、非ヒト(例えば、マウス)抗体または異なったヒト抗体のようなドナーの抗体に由来し、一方、免疫グロブリンの他の部分の全部または実質的に全部、例えば、定常部および可変ドメインの高度に保存された部分、すなわち、フレームワーク領域が、アクセプター抗体、例えば、ヒト起源の抗体に由来する、抗体を意味する。しかしながら、ＣＤＲ移植抗体は、フレームワーク領域中、例えば、超可変領域に隣接しているフレームワーク領域の部分中に、ドナー配列の数アミノ酸を含むことができる。“ヒト抗体”とは、例えば、ＥＰ ０５４６０７３ Ｂ１、ＵＳＰ ５５４５８０６、ＵＳＰ ５５６９８２５、ＵＳＰ ５６２５１２６、ＵＳＰ ５６３３４２５、ＵＳＰ ５６６１０１６、ＵＳＰ ５７７０４２９、ＥＰ ０４３８４７４ Ｂ１およびＥＰ ０４６３１５１ Ｂ１に一般的に記載されているとおり、重鎖および軽鎖の両方の定常領域および可変領域が、すべてヒト起源であるか、または、必ずしも同一の抗体に由来するわけではなく、そしてマウスの免疫グロブリン可変および定常部遺伝子がヒトの対応物によって置き換えられているマウスによって産生される抗体を含むヒト起源の配列と実質的に同一である抗体を意味する。
【００１３】
本発明の特に好ましいＩＬ−１７結合分子は、ヒト抗体であり、特に、以下の実施例１および２の中で述べられているＡＩＮ４５７抗体である。
【００１４】
すなわち、好ましいキメラ抗体において、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、ヒト起源、例えば、配列番号１０(＝軽鎖の可変ドメイン、すなわち、配列番号１０のアミノ酸１〜１０９)および配列番号８(＝重鎖の可変ドメイン、すなわち、配列番号８のアミノ酸１〜１２７)中に示されているＡＩＮ４５７抗体の可変ドメインである。定常部ドメインは、また、適当なヒト定常部ドメイン、例えば、“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Kabat E. A. et al, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health中に記載されているようなドメインを含んでなるのが好ましい。
【００１５】
超可変領域は、ヒト起源であることが好ましいが、任意の種類のフレームワーク領域に結合していてもよい。適当なフレームワーク領域は、Kabat E. A. et al, 前掲書中に述べられている。好ましい重鎖フレームワーク領域は、例えば、ＡＩＮ４５７抗体のヒト重鎖フレームワーク領域であるヒト重鎖フレームワーク領域である。これは、順に、例えば、ＦＲ１(配列番号８のアミノ酸１〜３０)、ＦＲ２(配列番号８のアミノ酸３６〜４９)、ＦＲ３(配列番号８のアミノ酸６７〜９８)およびＦＲ４(配列番号８のアミノ酸１１７〜１２７)の領域から構成されている。ＡＩＮ４５７のＸ線分析によって決定された超可変領域を考慮すると、別の好ましい重鎖フレームワーク領域は、順に、ＦＲ１−ｘ(配列番号８のアミノ酸１〜２５)、ＦＲ２−ｘ(配列番号８のアミノ酸３６〜４９)、ＦＲ３−ｘ(配列番号８のアミノ酸６１〜９５)およびＦＲ４(配列番号８のアミノ酸１１９〜１２７)の領域から構成されている。同様な方法で、軽鎖フレームワーク領域は、順に、ＦＲ１'(配列番号１０のアミノ酸１〜２３)、ＦＲ２'(配列番号１０のアミノ酸３６〜５０)、ＦＲ３'(配列番号１０のアミノ酸５８〜８９)およびＦＲ４'(配列番号１０のアミノ酸９９〜１０９)の領域から構成されている。
【００１６】
従って、本発明は、また、１位のアミノ酸から始まって１２７位のアミノ酸で終了する配列番号８に示されているアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する第一のドメインまたは上記に述べた第一のドメインと、１位のアミノ酸から始まって１０９位のアミノ酸で終了する配列番号１０に示されているアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する第二のドメインを含んでなる、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなるＩＬ−１７結合分子を提供する。
【００１７】
すべてのヒトにおいて天然に発見される蛋白質に対して惹起されるモノクローナル抗体は、通例、非ヒト系、例えば、マウスで作成され、そして、それ自身通常非ヒト蛋白質である。この直接的な結果として、ハイブリドーマによって産生される異種抗体が、ヒトに投与されたとき、大部分は異種免疫グロブリンの定常部によって介在される好ましくない免疫応答を誘出する。これにより、長期間にわたって投与することができないので、こうした抗体の使用が明らかに制限される。それ故、ヒトに投与したとき、実質的に同種異系応答を誘出しそうもない、一本鎖、単一ドメイン、キメラ、ＣＤＲ移植、または特に、ヒト抗体を使用することが特に好ましい。
【００１８】
上記を鑑みると、本発明のより好ましいＩＬ−１７結合分子は、少なくとも
ａ)(ｉ)順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはその直接ＣＤＲ等価物を含む可変ドメインおよび(ｉｉ)ヒト重鎖の定常部またはその断片を含んでなる(前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する)、免疫グロブリン重鎖またはその断片；および
ｂ)(ｉ)順に超可変領域および、所望により、また、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'、およびＣＤＲ３'超可変領域またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む可変ドメインおよび(ｉｉ)ヒト軽鎖の定常部またはその断片を含んでなる(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)、免疫グロブリン軽鎖またはその断片
を含んでなるヒト抗ＩＬ−１７抗体から選択される。
【００１９】
あるいは、本発明のＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはその直接ＣＤＲ等価物(前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する)を含んでなる第一のドメイン；および
ｂ)超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'またはその直接ＣＤＲ'等価物(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)を含んでなる、第二のドメイン；および
ｃ)第一のドメインのＮ末端と第二のドメインのＣ末端に、または第一のドメインのＣ末端と第二のドメインのＮ末端に結合しているペプチドリンカー
を含んでなる抗原結合部位を含んでなる、一本鎖結合分子から選択することができる。
【００２０】
よく知られているように、一個の、ほんの少数のまたは数個でさえアミノ酸の欠失、付加または置換のようなアミノ酸配列の小さい変更は、実質的に同一の特性を有する元の蛋白質の対立形体に至り得る。
【００２１】
従って、“その直接ＣＤＲ等価物”という用語は、順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉおよびＣＤＲ３ｉ(ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の代わりに)を含んでなるＩＬ−１７結合分子を意味し、ここで
(ｉ)超可変領域ＣＤＲ１ｉは配列番号１に示されている超可変領域ＣＤＲ１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｉ)超可変領域ＣＤＲ２ｉは配列番号２に示されている超可変領域ＣＤＲ２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｉｉ)超可変領域ＣＤＲ３ｉは配列番号３に示されている超可変領域ＣＤＲ３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｖ)順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉ、およびＣＤＲ３ｉを含んでなるこうした分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００２２】
同様に、“その直接ＣＤＲ−ｘ等価物”という用語は、順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘおよびＣＤＲ３ｉ−ｘ(ＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘ、およびＣＤＲ３−ｘの代わりに)を含んでなるＩＬ−１７結合分子を意味し、ここで
(ｖ)超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘは配列番号１１に示されている超可変領域ＣＤＲ１−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｖｉ)超可変領域ＣＤＲ２ｉ−ｘは配列番号１２に示されている超可変領域ＣＤＲ２−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｖｉｉ)超可変領域ＣＤＲ３ｉ−ｘは配列番号１３に示されている超可変領域ＣＤＲ３−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｖｉｉｉ)順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘ、およびＣＤＲ３ｉ−ｘを含んでなるこうした分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００２３】
同様に、“その直接ＣＤＲ'等価物”という用語は、順に超可変領域ＣＤＲ１'ｉ、ＣＤＲ２'ｉおよびＣＤＲ３'ｉを含んでなるドメインを意味し、ここで
(ｉ)超可変領域ＣＤＲ１'ｉは配列番号４に示されている超可変領域ＣＤＲ１'と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｉ)超可変領域ＣＤＲ２'ｉは配列番号５に示されている超可変領域ＣＤＲ２'と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｉｉ)超可変領域ＣＤＲ３'ｉは配列番号６に示されている超可変領域ＣＤＲ３'と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる；および
(ｉｖ)順に超可変領域ＣＤＲ１'ｉ、ＣＤＲ２'ｉ、およびＣＤＲ３'ｉを含んでなるこうした分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００２４】
あるいは、本発明のＩＬ−１７結合分子は、
順に、
ａ)超可変領域ＣＤＲ１(配列番号１)、ＣＤＲ２(配列番号２)およびＣＤＲ３(配列番号３)；または
ｂ)超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉ、ＣＤＲ３ｉ
［前記超可変領域ＣＤＲ１ｉは、配列番号１に示されている超可変領域ＣＤＲ１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、
前記超可変領域ＣＤＲ２ｉは、配列番号２に示されている超可変領域ＣＤＲ２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして
前記超可変領域ＣＤＲ３ｉは、配列番号３に示されている超可変領域ＣＤＲ３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして
順に超可変領域ＣＤＲ１ｘ、ＣＤＲ２ｘ、およびＣＤＲ３ｘを含んでなる前記結合ＩＬ−１７分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができる(前記阻害活性は、ヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される)］
を含む、少なくとも一個の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含んでなる、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子であってもよい。
【００２５】
同様に、本発明のＩＬ−１７結合分子は、
順に、
ａ)超可変領域ＣＤＲ１−ｘ(配列番号１１)、ＣＤＲ２−ｘ(配列番号１２)およびＣＤＲ３−ｘ(配列番号１３)；または
ｂ)超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘ、ＣＤＲ３ｉ−ｘ
［前記超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘは、配列番号１１に示されているＣＤＲ１−ｘの超可変領域と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、
前記超可変領域ＣＤＲ２ｉ−ｘは、配列番号１２に示されているＣＤＲ２−ｘの超可変領域と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、そして
前記超可変領域ＣＤＲ３ｉ−ｘは、配列番号１３に示されているＣＤＲ３−ｘの超可変領域と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして
順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘ、およびＣＤＲ３ｉ−ｘを含んでなる前記結合ＩＬ−１７分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される］
を含む、少なくとも一個の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含んでなる、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子であってもよい。
【００２６】
同様に、本発明のＩＬ−１７結合分子は、
順に、
ａ)超可変領域ＣＤＲ'１(配列番号４)、ＣＤＲ'２(配列番号５)およびＣＤＲ'３(配列番号６)；または
ｂ)超可変領域ＣＤＲ１'ｉ、ＣＤＲ２'ｉ、ＣＤＲ３'ｉ
［前記超可変領域ＣＤＲ'１ｉは、配列番号４に示されている超可変領域ＣＤＲ'１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、
前記超可変領域ＣＤＲ'２ｉは、配列番号５に示されている超可変領域ＣＤＲ'２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、そして
前記超可変領域ＣＤＲ'３ｉは、配列番号６に示されている超可変領域ＣＤＲ'３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして
順に超可変領域ＣＤＲ'１ｉ、ＣＤＲ'２ｉ、およびＣＤＲ'３ｉを含んでなる前記結合ＩＬ−１７分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される］
を含む、少なくとも一個の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含んでなる、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子であってもよい。
【００２７】
あるいは、本発明のＩＬ−１７結合分子は、重鎖(ＶＨ)と軽鎖(ＶＬ)部ドメインの両方の可変ドメインを含んでなるＩＬ−１７結合分子であってもよく、前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１(配列番号１)、ＣＤＲ２(配列番号２)およびＣＤＲ３(配列番号３)を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
順に超可変領域ＣＤＲ１'(配列番号４)、ＣＤＲ２'(配列番号５)およびＣＤＲ３'(配列番号６)を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)；
または
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉ、およびＣＤＲ３ｉ(前記超可変領域ＣＤＲ１ｉは、配列番号１に示されている超可変領域ＣＤＲ１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、前記超可変領域ＣＤＲ２ｉは、配列番号２に示されている超可変領域ＣＤＲ２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして、前記超可変領域ＣＤＲ３ｉは、配列番号３に示されている超可変領域ＣＤＲ３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる)を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
順に超可変領域ＣＤＲ１'ｉ、ＣＤＲ２'ｉ、ＣＤＲ３'ｉ(前記超可変領域ＣＤＲ'１ｉは、配列番号４に示されている超可変領域ＣＤＲ'１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、前記超可変領域ＣＤＲ'２ｉは、配列番号５に示されている超可変領域ＣＤＲ'２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして、前記超可変領域ＣＤＲ'３ｉは、配列番号６に示されている超可変領域ＣＤＲ'３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる)を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)；
［順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉ、ＣＤＲ３ｉ、ＣＤＲ'１ｉ、ＣＤＲ'２ｉ、およびＣＤＲ'３ｉを含んでなる、ｂ)中で定義されている前記結合ＩＬ−１７分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される］
を含む、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、前記ＩＬ−１７結合分子である。
【００２８】
あるいは、本発明のＩＬ−１７結合分子は、重鎖(ＶＨ)と軽鎖(ＶＬ)部ドメインの両方の可変ドメインを含んでなるＩＬ−１７結合分子であってもよく、前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１−ｘ(配列番号１１)、ＣＤＲ２−ｘ(配列番号１２)およびＣＤＲ３−ｘ(配列番号１３)を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
順に超可変領域ＣＤＲ１'(配列番号４)、ＣＤＲ２'(配列番号５)およびＣＤＲ３'(配列番号６)を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)；または
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘ、およびＣＤＲ３ｉ−ｘ、前記超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘ、ＣＤＲ３ｉ−ｘ(前記超可変領域ＣＤＲ１ｉ−ｘは、配列番号１１に示されている超可変領域ＣＤＲ１−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、前記超可変領域ＣＤＲ２ｉ−ｘは、配列番号１２に示されている超可変領域ＣＤＲ２−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして、前記超可変領域ＣＤＲ３ｉ−ｘは、配列番号１３に示されている超可変領域ＣＤＲ３−ｘと３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる)を含んでなる、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
順に超可変領域ＣＤＲ１'ｉ、ＣＤＲ２'ｉ、ＣＤＲ３'ｉ(前記超可変領域ＣＤＲ'１ｉは、配列番号４に示されている超可変領域ＣＤＲ'１と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり、前記超可変領域ＣＤＲ'２ｉが、配列番号５に示されている超可変領域ＣＤＲ'２と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なり；そして、前記超可変領域ＣＤＲ'３ｉが、配列番号６に示されている超可変領域ＣＤＲ'３と３個、好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が異なる)を含んでなる、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)；
［順に超可変領域ＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉ、ＣＤＲ３ｉ、ＣＤＲ'１ｉ、ＣＤＲ'２ｉ、およびＣＤＲ'３ｉを含んでなる、ｂ)中で定義されている前記結合ＩＬ−１７分子は、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される］
を含んでなる、少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、前記ＩＬ−１７結合分子である。
【００２９】
ＩＬ−１７のその受容体への結合を阻害することは、好都合なことに、本明細書中で以下に述べられているようなアッセイを含めて、様々なアッセイで試験することができる。“同一の程度まで”という用語は、参照および等価な分子が、統計に基づいて、本明細書で言及するアッセイの一つにおいて(実施例１参照)実質的に同一のＩＬ−１７阻害活性を示すことを意味する。例えば、本発明のＩＬ−１７結合分子は、通例、ヒトの皮膚線維芽細胞中のヒトＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生に基づいてヒトＩＬ−１７の阻害のＩＣ５０を有しており、＋/−５倍以内、すなわち、その１０ｎＭ以下、より好ましくは、９、８、７、６、５、４、３または２ｎＭであり、好ましくは、実施例１中で述べられているようにアッセイされた場合、対応する参照分子のＩＣ５０と実質的に同一である。
【００３０】
あるいは、使用されるアッセイは、可溶性のＩＬ−１７受容体(例えば、実施例１のヒトＩＬ−１７ Ｒ/Ｆｃ構築物)および本発明のＩＬ−１７結合分子によるＩＬ−１７の結合の競合的阻害アッセイであってもよい。
【００３１】
最も好ましくは、ヒトＩＬ−１７抗体は、少なくとも、
ａ)配列番号８中に示されている、１位のアミノ酸から始まって１２７位のアミノ酸で終了するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインとヒト重鎖の定常領域を含んでなる一個の重鎖；および
ｂ)配列番号１０中に示されている、１位のアミノ酸から始まって１０９位のアミノ酸で終了するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインとヒト軽鎖の定常領域を含んでなる一個の軽鎖
を含んでなる。
【００３２】
ヒト重鎖の定常領域は、γ１、γ２、γ３、γ４、μ、α１、α２、δまたはεタイプであってもよいが、好ましくは、γタイプ、より好ましくは、γ１タイプであり、一方、ヒト軽鎖の定常領域は、κまたはλタイプ(λ１、λ２およびλ３のサブタイプを含む)であってもよいが、好ましくは、κタイプである。こうした定常領域のすべてのアミノ酸配列は、Kabat et al(前掲)中に提供されている。
【００３３】
本発明の結合分子のコンジュゲート(conjugates)、例えば、酵素または毒素または放射性同位体のコンジュゲートもまた本発明の範囲内に含まれる。
【００３４】
“ポリペプチド”は、本明細書で特記されない限り、ペプチド結合によって互いに結合しているアミノ酸を含んでなり、Ｎ末端で始まり、Ｃ末端で終了するアミノ酸配列を有する任意のペプチドまたは蛋白質を含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、モノクローナル抗体であり、より好ましくは、キメラ(Ｖ移植とも呼ばれる)またはヒト化(ＣＤＲ移植とも呼ばれる)モノクローナル抗体であり、最も好ましいのは完全なヒト抗体であり、例えば、実施例１に例示されている技術によって得られる。このヒト化(ＣＤＲ移植)または完全なヒトモノクローナル抗体は、アクセプター抗体のフレームワーク領域(ＦＲ)配列に導入される更なる変異体を含んでも含まなくてもよい。
【００３５】
本明細書中で使用されるポリペプチドの機能的誘導体は、本発明のポリペプチドと同様に定性的な生物学的活性を有する、すなわち、ヒトＩＬ−１７と結合する能力を有している分子を含んでいる。機能的誘導体には、本発明のポリペプチドの断片およびペプチドアナログが含まれる。断片は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドの配列内の部分を含んでなる。“誘導体”という用語は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体、および共有結合的修飾を定義するために使用されている。例えば、特定の配列の、例えば、軽鎖および重鎖の超可変領域の本発明のポリペプチドの機能的誘導体は、好ましくは、例えば、特定の配列のアミノ酸配列の本発明のポリペプチドと、少なくとも約６５％、より好ましくは、少なくとも約７５％、更により好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５、９６、９７、９８、９９％の全配列相同性を有し、そしてヒトＩＬ−１７を結合させる能力を実質的に維持し、または、例えば、ＩＬ−１７誘発ヒト皮膚線維芽細胞のＩＬ−６の産生を中和する。
【００３６】
“共有結合修飾”という用語は、例えば、特定の配列の、本発明のポリペプチド；またはその断片の、有機蛋白質様または非蛋白質様誘導体化剤での修飾、異種ポリペプチド配列との融合、および翻訳後修飾を含む。例えば、特定の配列の共有結合修飾ポリペプチドの修飾は、依然としてヒトＩＬ−１７を結合させる能力を有するか、または、例えば、ＩＬ−１７誘発ヒト線維芽細胞のＩＬ−６の産生を架橋により中和する能力を有する。共有結合修飾は、伝統的に、標的アミノ酸残基を選択した側または末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させること、または選択された組み換え宿主細胞において機能する、翻訳後修飾のメカニズムを利用することによって導入される。所定の翻訳後修飾は、発現ポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、翻訳後修飾により脱アミド化されて、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。あるいは、こうした残基は、緩和な酸性条件下で脱アミノ化される。別の翻訳後修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル、チロシンまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジンの側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる(例えば、T.E. Creighton, 蛋白質(Proteins): 構造と分子特性(Structure and Molecular Properties), W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)参照)。共有結合修飾は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチド、およびイミュノアドヘシン(immunoadhesins)のようなそれらのアミノ酸配列変異体、および異種シグナル配列とのＮ−末端融合物を含んでなる融合蛋白質を例えば含む。
【００３７】
天然ポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する“相同性”は、最大相同性パーセントを達成させるために、必要ならば、この配列をアラインして、ギャップを挿入した後、対応する天然ポリペプチドの残基と一致する候補配列中でのアミノ酸残基の百分率として本明細書では定義されており、配列同一性の一部として同類置換(conservative substitutions)は何ら考慮されない。Ｎ末端またはＣ末端の延長または挿入は、いずれも同一性または相同性を減少させるものとして解釈されてはならない。アライメントの方法およびコンピュータープログラムは、よく知られている。
【００３８】
“アミノ酸”は、天然に存在するＬ−α−アミノ酸のすべてを意味し、そして、例えばＤ−アミノ酸を含む。アミノ酸は、既知の一文字または三文字表記によって同定する。
【００３９】
“アミノ酸配列変異体”という用語は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドと比較してそれらのアミノ酸の配列の一部の相違を有する分子を意味する。例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、依然として、ヒトＩＬ−１７を結合させる能力を有するか、または、例えば、ＩＬ−１７誘発ヒト皮膚線維芽細胞のＩＬ−６の産生を中和する能力を有する。置換変異体は、少なくとも一個のアミノ酸残基が除かれ、異なるアミノ酸が、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドのポリペプチド中の同一位置のその場所に挿入されたものである。これらの置換は、分子中の一個のアミノ酸のみが置換されている一置換であってもよいし、二個またはそれ以上のアミノ酸が同一の分子中で置換されている多置換であってもよい。挿入変異体は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドのポリペプチド中の特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入されている一個またはそれ以上のアミノ酸を有する変異体である。アミノ酸に直接隣接しているとは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のどちらかに結合していることを意味する。欠失変異体は、例えば、特定の配列の本発明のポリペプチドのポリペプチド中で一個またはそれ以上のアミノ酸が除去されている変異体である。通例、欠失変異体は、分子の特定の領域で一個または二個のアミノ酸が欠失される。
【００４０】
本発明のＩＬ−１７結合分子は、組み換えＤＮＡ技法によって製造することができる。これを考慮すると、本結合分子をコードしている一個またはそれ以上のＤＮＡ分子が構築され、適当な制御配列のもとにおかれ、そして、発現のために適当な宿主生物中に移入されなければならない。
【００４１】
それ故、極めて一般的な方法では、
(ｉ)本発明の単一ドメインＩＬ−１７結合分子、本発明の一本鎖ＩＬ−１７結合分子、本明細書で定義されている重鎖および軽鎖を含んでなるＩＬ−１７結合分子、または本発明のＩＬ−１７結合分子の断片をコードしているＤＮＡ分子；および
(ｉｉ)組み換え手段によって本発明のＩＬ−１７結合分子を製造するための本発明のＤＮＡ分子の使用
が提供される。
【００４２】
従って、本発明は上述したＩＬ−１７結合分子をコードしているＤＮＡ分子を提供する。
【００４３】
更に、本発明は、配列番号７または配列番号９に実質的に相同であるＤＮＡ分子を含んでなるＤＮＡ構築物を提供する。
【００４４】
更に、本発明は、一方が、配列番号７に実質的に相同であるか、またはその直接ＤＮＡＨ等価物であり、他方が、配列番号９に実質的に相同であるか、またはその直接ＤＮＡＬ等価物である、二個のＤＮＡ分子を含んでなるＤＮＡ構築物を提供する。
【００４５】
この技術の現状は、当業者が本明細書中で提供された情報、すなわち、超可変領域のアミノ酸配列およびそれらをコードしているＤＮＡ配列を与えられたとすると、本発明のＤＮＡ分子を合成することができる。可変ドメイン遺伝子を構成する方法は、例えば、ＥＰＡ ２３９４００中で述べられており、次のように手短にまとめることができる：どんな特異性であれ、ＭＡｂの可変ドメインをコードしている遺伝子をクローン化する。フレームワーク領域および超可変領域をコードしているＤＮＡ断片が決定され、超可変領域をコードしているＤＮＡ断片が除去されると、その結果、フレームワーク領域をコードしているＤＮＡ断片は、接合部で適当な制限部位と一緒に融合される。制限部位は、標準的方法によってＤＮＡ分子の変異誘発によって適当な位置で引き起こすことができる。二本鎖合成ＣＤＲカセットは、配列番号１(ＣＤＲ１)、配列番号２(ＣＤＲ２)、配列番号３(ＣＤＲ３)、配列番号４(ＣＤＲ１')、配列番号５(ＣＤＲ２')、配列番号６(ＣＤＲ６')、配列番号１１(ＣＤＲ１−ｘ)、配列番号１２(ＣＤＲ２−ｘ)、配列番号１３(ＣＤＲ３−ｘ)をコードしている配列に従ってＤＮＡ合成によって調製される。こうしたカセットは、粘着末端と共に提供されるので、その結果、それらはフレームワーク領域の接合部で結合することができる。
【００４６】
更に、本発明のＩＬ−１７結合分子をコードするＤＮＡ構築物を得るために、産生性ハイブリドーマ細胞株からのｍＲＮＡを入手する必要がない。すなわち、遺伝子のヌクレオチド配列に関する記載情報のみが与えられたとしても、ＰＣＴ出願 ＷＯ ９０/０７８６１は組み換えＤＮＡ技術による抗体の産生の十分な指示を与える。この方法は、所望のＤＮＡ配列を生成するために、多数のオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ法によるそれらの増幅、およびそのスプライシングを含んでなる。
【００４７】
適当なプロモーターまたは重鎖および軽鎖定常領域をコードしている遺伝子を含んでなる発現ベクターは、公に利用が可能である。従って、一旦、本発明のＤＮＡ分子が調製されれば、好都合なことに適当な発現ベクター中にそれを移入することができる。一本鎖抗体をコードしているＤＮＡ分子は、また、例えば、ＷＯ ８８/１６４９に述べられているような標準的な方法によって調製できる。
【００４８】
ＣＤＲ等価物の場合に準じて、“その直接ＤＮＡＨ等価物”という用語は、本発明のＩＬ−１７結合分子の重鎖またはその断片をコードしている最初のＤＮＡ構築物を示すことを意味し、そして、
ａ)交互に(alternatively)フレームワーク領域および超可変領域を含んでなる、可変ドメインをコードする第一部分(前記超可変領域は、順にＣＤＲ１ｉ、ＣＤＲ２ｉおよびＣＤＲ３ｉ中に存在し、前記ＣＤＲ１ｉは、配列番号１に示されている超可変領域ＣＤＲ１と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、前記ＣＤＲ２ｉは、配列番号２に示されている超可変領域ＣＤＲ２と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、そしてＣＤＲ３ｉは、配列番号３に示されている超可変領域ＣＤＲ３と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり；この第一部分は、可変ドメインの第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードしているコドンで終了する)；および
ｂ)重鎖の定常領域の第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、定常領域またはその断片の最後のアミノ酸をコードしているコドン、続いて終止コドンで終了する、重鎖の定常領域またはその断片をコードしている第二部分
を含んでなり；そして
ｃ)前記ＤＮＡ構築物は、単独でまたは別のポリペプチドと組み合わせて、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができるポリペプチドをコードしており、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００４９】
同様に、“その直接ＤＮＡＨ−ｘ等価物”という用語は、本発明のＩＬ−１７結合分子の重鎖またはその断片をコードしている第一の別のＤＮＡ構築物を示すことを意味し、そして、
ａ)交互にフレームワーク領域および超可変領域を含んでなる、可変ドメインをコードする第一部分(前記超可変領域は、順にＣＤＲ１ｉ−ｘ、ＣＤＲ２ｉ−ｘおよびＣＤＲ３ｉ−ｘ中に存在し、前記ＣＤＲ１ｉ−ｘは、配列番号１１に示されている超可変領域ＣＤＲ１と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、前記ＣＤＲ２ｉ−ｘは、配列番号１２に示されている超可変領域ＣＤＲ２と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、そしてＣＤＲ３ｉ−ｘは、配列番号１３に示されている超可変領域ＣＤＲ３と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり；この第一部分は、可変ドメインの第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードしているコドンで終了する)；および
ｂ)重鎖の定常領域の第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、定常領域
またはその断片の最後のアミノ酸をコードしているコドン、続いて終止コドンで終了する、重鎖の定常領域またはその断片をコードしている第二部分
を含んでなり；そして
ｃ)前記ＤＮＡ構築物は、単独でまたは別のポリペプチドと組み合わせて、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができるポリペプチドをコードしており、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００５０】
好ましくは、これらのＤＮＡ構築物は、交互にフレームワーク領域および超可変領域を含んでなる可変ドメインをコードしており、前記超可変領域は順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３であり、前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する。更に好ましくは、これらのＤＮＡ構築物は、交互にフレームワーク領域および超可変領域を含んでなる可変ドメインをコードしており、前記超可変領域は順にＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘ、およびＣＤＲ３−ｘであり、前記ＣＤＲ１−ｘは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２−ｘは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ３−ｘは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する。更に好ましくは、この第一部分は、配列番号８中に示されている１位のアミノ酸から始まって、１２７位のアミノ酸で終了するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有している可変ドメインをコードしている。更に好ましくは、第一部分は、配列番号７中で示されている１位のヌクレオチドから始まって、３８１位のヌクレオチドで終了するヌクレオチド配列を有している。また、好ましくは、この第二部分は、ヒト重鎖の定常領域、より好ましくは、ヒトγ１鎖の定常領域をコードしている。この第二部分は、ゲノム起源のＤＮＡ断片(イントロンを含んでなる)であっても、ｃＤＮＡ断片(イントロンは含んでいない)であってもよい。
【００５１】
同様に、“その直接ＤＮＡＬ等価物”という用語は、本発明のＩＬ−１７結合分子の軽鎖またはその断片をコードしている第二のＤＮＡ構築物を示すことを意味し、そして、
ａ)交互にフレームワーク領域および超可変領域を含んでなる、可変ドメインをコードする第一部分(前記超可変領域は、ＣＤＲ３ｉ'であり、そして所望によりＣＤＲ１ｉ'およびＣＤＲ２ｉ'であり、前記ＣＤＲ１ｉ'は、配列番号４に示されている超可変領域ＣＤＲ１'と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、前記ＣＤＲ２ｉ'は、配列番号５に示されている超可変領域ＣＤＲ２'と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり、そして前記ＣＤＲ３ｉ'は、配列番号６に示されている超可変領域ＣＤＲ３'と少なくとも５０％相同性、好ましくは少なくとも６０、７０、８０、８５、または９０％相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性があり；この第一部分は、可変ドメインの第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードしているコドンで終了する)；および
ｂ)軽鎖の定常領域の第一のアミノ酸をコードしているコドンから始まって、定常領域またはその断片の最後のアミノ酸をコードしているコドン、続いて終止コドンで終了する、軽鎖の定常領域またはその断片をコードしている第二部分
を含んでなり；そして
ｃ)前記ＤＮＡ構築物は、単独でまたは別のポリペプチドと組み合わせて、５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができるポリペプチドをコードしており、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される。
【００５２】
好ましくは、この第二のＤＮＡ構築物は、交互にフレームワーク領域および超可変領域を含んでなる可変ドメインをコードしており、前記超可変領域は、順にＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'であり、前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、第二のＤＮＡ構築物のこの第一部分は、１位のアミノ酸から始まって、そして１０９位のアミノ酸で終了する配列番号１０に示されているアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有している可変ドメインをコードしている。更に好ましくは、第一部分は、１位のヌクレオチドから始まって、そして３２７位のヌクレオチドで終了する配列番号９で示されているヌクレオチド配列を有している。また、好ましくは、第二部分は、ヒト軽鎖の定常領域、より好ましくは、ヒトκの定常領域をコードしている。
【００５３】
好ましくは、第一と第二のＤＮＡ構築物は、一緒に使用されるが、別々に使用されてもよい。
【００５４】
本発明は、また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘ、ＣＤＲ３−ｘ、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'またはＣＤＲ３'またはフレームワークの一個またはそれ以上のアミノ酸残基、通例ほんの少数(例えば、１−４個)が；例えば、突然変異、例えば、対応するＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発により変更されているＩＬ−１７結合分子を含む。本発明は、こうした変更されたＩＬ−１７結合分子をコードするＤＮＡ配列を含む。特に、本発明は、ＣＤＲ１'またはＣＤＲ２'の一個またはそれ以上の残基が配列番号４(ＣＤＲ１'の場合)および配列番号５(ＣＤＲ２'の場合)に示されている残基から変更されたＩＬ−１７結合分子を含む。
【００５５】
第一および第二のＤＮＡ構築物において、第一および第二部分は、イントロンによって分離されていてもよく、そして、エンハンサーが第一と第二部分の間のイントロンに位置しているのが好都合であり得る。転写されるが、翻訳されないこうしたエンハンサーの存在は、効率的な転写を助け得る。特定の態様においては、第一および第二のＤＮＡ構築物は、ヒト起源の重鎖遺伝子のエンハンサーを含んでなるのが有利である。
【００５６】
ＤＮＡ構築物は、それぞれ、適当な制御配列の制御のもとに、特に適当なプロモーターの制御のもとに置かれる。ＤＮＡ構築物が発現のために移入される宿主生物に適合される限り、全ての種類のプロモーターが使用され得る。
【００５７】
所望の抗体は、細胞培養またはトランスジェニック動物で製造することができる。適当なトランスジェニック動物は、適当な制御配列のもとに置かれている第一および第二のＤＮＡ構築物を卵子中にマイクロインジェクションし、そのように調製された卵子を適当な偽妊娠雌中に移入し、そして所望の抗体を発現する子孫を選択することを含む標準的な方法で得ることができる。
【００５８】
抗体の鎖は、細胞培養で製造され、ＤＮＡ構築物は、最初に、単一発現ベクターか、または二個の別々であるが適合性のある発現ベクターの中に挿入しなければならないが、後者が好ましい可能性が高い。
【００５９】
従って、本発明は、また、上記で述べた少なくとも一個のＤＮＡ構築物を含んでなる原核または真核細胞株中で複製することができる発現ベクターを提供する。
【００６０】
次いで、ＤＮＡ構築物を含んでいるそれぞれの発現ベクターは、適当な宿主生物に移入される。このＤＮＡ構築物が別々に二個の発現ベクターに挿入される場合は、それらは、別々に、すなわち、細胞あたり一種のベクターで、または共移入によって移入することができるが、後者が好ましい可能性が高い。適当な宿主生物は、細菌、酵母または哺乳類細胞株であり得るが、この後者が好ましい。より好ましくは、哺乳類の細胞株は、リンパ系起源のもの、例えば、骨髄腫、ハイブリドーマまたは通常の不死化Ｂ細胞(normal immortalised B-cell)であり、これは、好都合なことにいかなる内在性抗体の重鎖または軽鎖を発現しない。
【００６１】
哺乳類細胞における発現のために、配列をコードしているＩＬ−１７結合分子は、ＩＬ−１７結合分子の高レベルな発現を可能にするか、またはそれに有利な、宿主細胞ＤＮＡの遺伝子座内に組み込まれる。配列をコードしているＩＬ−１７結合分子が、こうした好都合に働く遺伝子座に組み込まれている細胞は、それらが発現するＩＬ−１７結合分子のレベルに基づいて同定し、選択することができる。任意の適当な選択可能なマーカーを、配列をコードしているＩＬ−１７結合分子を含んでいる宿主細胞の調製のために使用することができる；例えば、ｄｈｆｒ遺伝子/メトトレキサートまたは等価な選択系が使用可能である。本発明のＩＬ−１７結合分子の発現のための別系は、ＥＰ ０２５６０５５ Ｂ、ＥＰ ０３２３９９７ Ｂおよび欧州特許出願８９３０３９６４.４中に述べられているもののようなＧＳをベースとした増幅/選択系を含む。
【００６２】
本発明の更なる局面では、(ｉ)上記で定義された発現ベクターを用いて形質転換される生物を培養すること、および(ｉｉ)培養物からＩＬ−１７結合分子を回収することを含んでなるＩＬ−１７結合分子を製造する方法が提供される。
【００６３】
本記載の目的のために、抗体がＩＬ−１７のその受容体への結合をＡＩＮ４５７抗体と同程度まで実質的に阻害することができるならば、抗体は“ＡＩＮ４５７のようにＩＬ−１７の結合を阻害することができる”とし、“同程度まで”とは上記に定義された意味を有する。
【００６４】
このＡＩＮ４５７抗体は、以前に抗ＩＬ−１７抗体、特に何らかの抗ヒトＩＬ−１７抗体について報告された親和性に比較して、ＩＬ−１７に対して高い結合親和性を有している。すなわち、ＡＩＮ４５７は、ＩＬ−１７に結合する解離平衡定数ＫＤとして約０.１８８±０.０３６ｎＭ(例えば、実施例２に示されているようにBIAcoreによって測定された)を有している。この高結合親和性によって、このＡＩＮ４５７の抗体は治療適用に特に適切である。
【００６５】
本明細書において、“ＩＬ−１７によって介在される疾患”という表現は、疾患または障害の原因、発症、進行、持続または病因を含む、疾患または医学的状態において、ＩＬ−１７、が直接的であれ、間接的であれ役割を演じる疾患および医学的状態のすべてを包含する。
【００６６】
本明細書では、“処置”または“処置し”という用語は、疾患に罹患するリスクを有するか、または疾患に罹患していると疑われる患者ならびに病気であるか、疾患または医学的状態を有すると診断された患者の処置を含んで、予防的または防止的処置ならびに治療的または疾患修飾的処置の両方を意味し、臨床的再発の抑制を含む。
【００６７】
ヒトＩＬ−１７に対して結合特異性を有している上記に定義されたＩＬ−１７結合分子、特に、ＩＬ−１７のその受容体への結合を阻害できる抗体；および５０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ、更に好ましくは５ｎＭの前記分子の濃度で、１ｎＭ(＝３０ｎｇ/ｍｌ)のヒトＩＬ−１７の活性を５０％阻害することができるＩＬ−１７に対する抗体(前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される)は、本明細書では本発明の抗体と称される。
【００６８】
好ましくは、本発明の抗体は、ヒト抗体であり、最も好ましくは、ＡＩＮ４５７抗体またはその直接等価物である。
【００６９】
本発明の抗体は、その標的細胞でＩＬ−１７の作用を遮断し、従って、ＩＬ−１７によって介在される疾患および障害の処置における使用に指示される。本発明の抗体のこれらの薬理学的活性および他の薬理学的活性は、下記に示す実施例の標準的試験方法において示すことができる：
【００７０】
初代ヒト線維芽細胞によるインターロイキン−６のＩＬ−１７依存産生の中和：初代ヒト(皮膚)線維芽細胞におけるＩＬ−６の産生は、ＩＬ−１７に依存する(Hwang SY et al., (2004) Arthritis Res Ther; 6:R120-128)。
【００７１】
手短に言えば、様々な濃度の本発明の抗体またはＦｃ部を有するヒトＩＬ−１７受容体の存在下で、ヒトの皮膚線維芽細胞を組み換えＩＬ−１７で刺激する。キメラ抗ＣＤ２５抗体、シムレクト(Simulect)(登録商標)(バシリキシマブ)をネガティブコントロールとして使用する。上清を、１６時間の刺激の後に取得し、ＥＬＩＳＡ(ELISA)によってＩＬ−６について試験する。本発明の抗体は、上記のとおり試験したとき、すなわち、前記阻害活性を、ヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生によって測定するとき、通例、ＩＬ−６産生阻害(１ｎＭ ヒトＩＬ−１７の存在下で)に対して約５０ｎＭまたはそれ以下(例えば、約０.０１〜約５０ｎＭ)のＩＣ５０を有している。好ましくは、本発明の抗体は、約２０ｎＭまたはそれ以下、より好ましくは約１０ｎＭまたはそれ以下、更に好ましくは約５ｎＭまたはそれ以下、更に好ましくは約２ｎＭまたはそれ以下、更により好ましくは約１ｎＭまたはそれ以下の上記に定義したとおりのＩＬ−６の産生の阻害に対するＩＣ５０を有している。
【００７２】
上記のアッセイにおいて示されるとおり、本発明の抗体は、ＩＬ−１７の作用を強力に遮断する。従って、本発明の抗体は、次のとおり薬学的有用性を有する：
【００７３】
本発明の抗体は、ＩＬ−１７によって介在される疾患または医学的障害、例えば、炎症性疾患、アレルギーおよびアレルギー状態、過敏性反応、自己免疫疾患、重症感染症、および臓器または組織移植拒絶の予防および処置に有用である。
【００７４】
例えば、本発明の抗体は、同種移植片拒絶または異種移植片拒絶を含む心臓、肺、心肺複合、肝臓、腎臓、すい臓、皮膚または角膜移植のレシピエントの処置、および骨髄移植の後のような移植片対宿主疾患、および臓器移植関連動脈硬化症の予防のために使用できる。
【００７５】
本発明の抗体は、自己免疫疾患および炎症性障害、特に、炎症状態ならびに骨喪失、炎症性疼痛、強直性脊椎炎(ankolsing spondylitis)を含む脊椎関節症、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、および腸関連関節炎(enterophathis arthritis)が関与するリウマチ性疾患を含む関節炎(例えば、関節リウマチ、慢性進行性関節炎および変形性関節炎)およびリウマチ性疾患、過敏性反応(気道過敏症および皮膚過敏症の両方を含む)およびアレルギーのような自己免疫要素を含む病因の炎症性状態の処置、防止、または寛解のために特に有用である。本発明の抗体が使用できる特定の自己免疫疾患は、自己免疫血液疾患(例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球癆、および特発性血小板減少性紫斑病を含む)、全身性エリテマトーデス、炎症性筋疾患、多発性軟骨炎、強皮症、ウェグナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブンジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病および過敏性腸症候群を含む)、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁肝硬変、若年性糖尿病(Ｉ型真性糖尿病)、ブドウ膜炎(前部および後部)、乾性角結膜炎および春季角結膜炎、間質性肺線維症、乾癬性関節炎および糸球体腎炎(例えば、特発性ネフローゼ症候群または微小変化型腎症を含むネフローゼ症候群を伴うか伴わない)、腫瘍、多発性硬化症、皮膚および角膜の炎症性疾患、筋肉炎、骨インプラントの緩み、アテローム動脈硬化症、糖尿病、および脂質代謝異常のような代謝性疾患を含む。
【００７６】
本発明の抗体は、また、喘息、気管支炎、塵肺症、肺気腫、および気道の他の閉塞性または炎症性疾患の処置、予防、または寛解に有用である。
【００７７】
本発明の抗体は、ＩＬ−１７によって介在されるか、またはＩＬ−１７の産生、ＩＬ−１７によるＴＮＦ放出の促進に関与する望ましくない、急性および超急性の炎症性反応、例えば、急性感染症、例えば、敗血症ショック(例えば、エンドトキシンショックおよび成人急性呼吸促迫症候群)、髄膜炎、肺炎；および重症火傷の処置；および、感染症、がん、または臓器不全の結果として起こる病的なＴＮＦ放出に関連するカヘキシー、消耗症候群、特に、例えば、ＨＩＶ感染に伴うか、ＨＩＶ感染の結果として起こるＡＩＤＳ関連カヘキシーの処置に有用である。
【００７８】
本発明の抗体は、特に、骨関節炎、骨粗鬆症および他の炎症性関節炎、および加齢による骨喪失を含む一般的な骨喪失、および特に歯周病を含む骨代謝疾患を処置するのに有用である。
【００７９】
このような適応症の場合、適当な投与量は、もちろん、例えば、使用される本発明の特定の抗体、宿主、投与方式および処置されている障害の特性および重症度に応じて異なる。しかしながら、予防的使用では、満足すべき結果は、通例、体重１キログラムあたり約０.０５ｍｇ〜約１０ｍｇ、より普通には、体重１キログラムあたり約０.１ｍｇ〜約５ｍｇの投与量で得られることが示されている。予防的使用の投与の頻度は、通常、１週間あたり約１回から３ヶ月毎に約１回の範囲であり、より普通には、２週間毎に約１回から１０週間毎に約１回の範囲、例えば、４〜８週間毎に１回である。本発明の抗体は、非経口的、静脈内、例えば、肘窩または他の末梢静脈中に、筋肉内または皮下投与するのが好都合である。予防的処置は、通例、本発明の抗体を１ヶ月あたり１回から２〜３ヶ月毎に１回、またはそれより少なく投与することを含んでなる。
【００８０】
本発明の抗体は、例えば、上記に言及した疾患の処置または防止のために、唯一の有効成分として投与することもできるし、あるいは、例えば、他の薬剤(例えば、免疫抑制剤または免疫調節剤または他の抗炎症剤)のアジュバントとしてか、またはこうした薬剤と組み合わせて、他の薬剤と一緒に投与することができる。例えば、本発明の抗体は、ＤＭＡＲＤ、例えば、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、サイクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、グルココルチコイド；例えば、サイクロスポリンＡまたはＦＫ ５０６であるカルシニューリン阻害剤；例えば、ＦＴＹ７２０およびＦＴＹ７２０類似体であるリンパ球再循環調整剤；例えば、ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３またはＴＡＦＡ−９３であるｍＴＯＲ阻害剤；例えば、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１などの免疫抑制特性を有するアスコマイシン；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン(azathioprene)；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリン(15-deoxyspergualine)またはその免疫抑制ホモログ、アナログまたは誘導体；免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば、白血球受容体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはそのリガンドに対するモノクローナル抗体；他の免疫調節性化合物、例えば、ＣＴＬＡ４またはその変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部、例えば非ＣＴＬＡ４蛋白質配列に結合したＣＴＬＡ４またはその変異体の少なくとも細胞外部分を有する組み換え結合分子、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ(例えば、ＡＴＣＣ６８６２９として呼ばれている)またはその変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１または−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニストまたはＶＬＡ−４アンタゴニスト；または化学療法剤、例えばパクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシンまたは５−フルオロウラシル；抗ＴＮＦ剤、例えば、ＴＮＦの対するモノクローナル抗体、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０、またはＴＮＦ−ＲＩまたはＴＮＦ−ＲＩＩに対する受容体構築物、例えば、エタネルセプト、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ；炎症誘発性サイトカインブロッカー、ＩＬ−１ブロッカー、例えば、アナキンラまたはＩＬ−１ トラップ(IL-1 trap)、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ８８５、ＩＬ−６ブロッカー；ケモカインブロッカー、例えば、プロテアーゼ、例えば、メタロプロテアーゼの阻害剤または活性化剤、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＣＤ２０抗体、アスピリンのようなＮＳＡＩＤｓまたは抗感染症剤と組み合わせて使用することができる(リストは、上記に言及した薬剤に限定されない)。
【００８１】
上記に従って、本発明は更に別の局面において次に記載のことを提供する：
治療的に有効な量の例えば、本発明の抗体であるＩＬ−１７結合分子、および少なくとも一種の第二の薬剤物質を、例えば、同時または順に共投与することを含んでなる上記に定義される方法であって、ここで第二の薬剤物質とは、例えば、上記に示したような免疫抑制薬／免疫調節薬、抗炎症化学療法薬または抗感染症薬である。
【００８２】
または、治療的に有効な量のａ)例えば、本発明の抗体であるＩＬ−１７結合分子、およびｂ)例えば、上記に示したような免疫抑制薬／免疫調節薬、抗炎症化学療法薬または抗感染症薬から選択される少なくとも一種の第二の薬剤物質を含んでなる例えば、キットである治療的組み合わせ。このキットは、その投与のための指示を含み得る。
【００８３】
本発明の抗体を、他の免疫抑制薬／免疫調節薬、抗炎症化学療法薬または抗感染症薬と組み合わせて投与するとき、共投与される組み合わせる化合物の投与量は、当然使用される共薬剤の種類、例えば、それが、ＤＭＡＲＤ、抗ＴＮＦ、ＩＬ−１ブロッカーまたは他の薬剤であるかどうか、使用される特定の薬剤、処置される障害その他に応じて異なる。
【００８４】
本発明の薬学的組成物は、従来の方法で製造することができる。本発明による組成物は凍結乾燥形態で提供されるのが好ましい。速やかに投与するためには、それを適当な水性の担体、例えば、注射用滅菌水または滅菌した緩衝生理食塩水に溶解する。ボーラス注射としてではなく、点滴による大量投与の溶液を作製することが望ましいと考えられるときは、ヒト血清アルブミンまたは患者自身のヘパリン処置した血液を製剤時に生理食塩水に組み込んでおくことが有利である。あるいは、皮下注射用の製剤が提供される。過剰なこうした生理的に不活性な蛋白質の存在によって、容器の壁および点滴溶液で使用される管に吸着することによる抗体の減少が防止される。アルブミンが使用されるときは、適当な濃度は生理食塩水の重量に対し、０.５％〜４.５％である。他の製剤は、液体または凍結乾燥製剤を含んでなる。
【実施例】
【００８５】
本発明は更に次の実施例中の例証によって説明される：
実施例
マウスの免疫グロブリンレパートリーの代わりに、ヒトＩｇＧ/κレパートリーを発現させるために操作されたトランスジェニックマウス(Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol., 14, 845-851)が、ヒトＩＬ−１７に対する抗体を生成するために使用される。これらのマウスに由来するＢ細胞は、標準的なハイブリドーマ技術によって不死化され、そして、ヒトＩｇＧ１/κ抗体ＡＩＮ４５７を分泌するマウスのハイブリドーマ細胞が得られる。
【００８６】
実施例１：
ハイブリドーマの生成、抗体の精製、ＡＩＮ４５７抗体の選択
組み換えヒトＩＬ−１７(huIL-17)の製造：組み換えｈｕＩＬ−１７を、大腸菌中、封入体で製造し、そして従来技術によって再折りたたみする(イン・ハウスキャリアフリーで製造された)(E. coli; Novartis Pharma, バッチBM-E-3141/98)か、または購入するか(キャリアフリー、E. coli; R&D Systems #317-IL/CF))、またはＨＥＫ.ＥＢＮＡ中に分泌され一部グリコシル化されたタンパク質として産生する(組み換えｈｕＩＬ−１７、キャリアフリー(トランスフェクトされたＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞に由来するＩＬ−１７ ＡＰＰ−Ｃ６；Novartis Pharma, バッチ En. E-3382/82;０.２８ｍｇ/ｍｌ；組み換えｈｕＩＬ−１７、キャリアフリー(トランスフェクトされたＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞に由来するＩＬ−１７ ＡＰＰ−Ｃ４；Novartis Pharma, バッチ En. E-3382/83;０.２９ｍｇ/ｍｌ))。後者の形態は、培養上清から免疫アフィニティークロマトグラフィーによって急速に精製するためにＣ末端に４個のアミノ酸延長を特徴とする。この場合、培養上清を、製造業者(Pharmacia)の指示に従って１０ｍｇ／ｍｌ樹脂の密度で、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂと連結した特定の固定化抗ｔａｇ抗体の適当なサイズのカラムに加える。ＰＢＳを用いて基本洗浄後、結合したｈｕＩＬ−１７を１００ｍＭ グリシン、ｐＨ２.７で溶出し、そして、直ちに希釈ＮａＯＨを用いて中和する。
【００８７】
ｈｕＩＬ−１7のキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)への結合：大腸菌(E.coli)またはＨＥＫ.ＥＢＮＡのどちらかで製造されたｈｕＩＬ−１７を過剰のホモ二機能性架橋剤スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)を用いて、予じめ活性化されたＫＬＨに結合させる。手短に言えば、２０ｍｇの凍結乾燥したImject(登録商標) Mariculture KLH(Pierce #77600)を２ｍｌのＨ２Ｏを用いて再構成させ、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)、ｐＨ７.２を含む１０ｍｇ/ｍｌ溶液を作成する。この溶液にジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)中の２５０ｍＭのＤＳＳ４００μｌを加え、次にこの混合物を室温で約１時間撹拌する(試薬のすべてが溶解するわけではなく、一部沈殿物が形成される)。次いで短時間遠心分離し、ろ過(０.４５μｍ)後、この溶液をＰＢＳ(流速 ２ｍｌ/分)中でセファデックスＧ２５ファイン(Sephadex G25 fine)(Pharmacia)を用いて脱塩すると、１.５ｍｇ/ｍｌ(Bradford)で活性化されたＫＬＨが約１１ｍｇ生じる。１ｍｌの活性化されたＫＬＨ(１.５ｍｇ)を凍結乾燥された大腸菌(E.coli)によって誘導されたｈｕＩＬ−１７(バッチ ＢＭ−Ｅ３１４１/９８)の水溶液(９ｍｇ/ｍｌ)の１ｍｌと混和する。この溶液は透明のままであり、次にこれを室温で２時間インキュベートする。この結果生じる複合体の濃度は、１.４ｍｇ/ｍｌ(Bradfordによって測定される)である。１ｍｌの活性化されたＫＬＨ(１.５ｍｇ)を１ｍｌのＨＥＫ.ＥＢＮＡ ｈｕＩＬ−１７(水中で約３ｍｇ；バッチ Ｅｎ.Ｅ−３３８２/８３)と混和する。この溶液は透明のままであり、次に室温で２時間インキュベートする。濃度は２.９ｍｇ/ｍｌ(Bradford)である。
【００８８】
免疫化：マウスの免疫グロブリン可変および定常部遺伝子が機能的にそれらのヒト対応物(遺伝子型 Ｔｇコード ２２１１００−ＴｇＨ(ＣＭＤ)＋＋；ＴｇＮ(Ｈｃｏ７)１１９５２＋；ＴｇＨ(ＪＫＤ)＋＋；ＴｇＮ(ＫＣＯ５)９２７２＋(Sherie L. Morrison, 1994, Nature, Vol. 368, p. 812-813; Nils Lonberg et al., 1994, Nature, Vol. 368, p. 856-859も参照)によって置き換えられている、遺伝学的に操作されたマウス２７３４０(雌性；MEDAREX Inc, Annandale, NJ)を表１に報告されているスキームに従って免疫化する。
【００８９】
【表１】
血清サンプルは、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)によって抗ｈｕＩＬ−１７抗体のレベルを測定するために、免疫プロトコールの開始から３５日および９９日後に得る。
【００９０】
ハイブリドーマの生成：１２０日目に、マウス２７３４０をＣＯ２吸入によって殺す。全脾臓細胞(１×１０８)をＰＥＧ ４０００を用いてＰＡＩ−０細胞(５×１０７細胞)で融合する。融合細胞をＨＡＴ培地(２ｇ/ｌ重炭酸ナトリウム、５×１０−５Ｍ β−メルカプトエタノール、１０−４Ｍ ヒポキサンチン、１.６×１０−５Ｍ チミジン、４×１０−７Ｍ アミノプテリン、１０％熱不活性ＦＣＳおよび５０μｇ/ｍｌ ゲンタマイシンを含む、ＲＰＭＩ １６４０)中で、マウス腹膜細胞(Balb/c mice)の支持細胞層を含む、７２０ウェル(１ｍｌ/ウェル)中でプレーティングする。１４日目に、ＨＡＴ培地をＨＴ培地、すなわち、アミノプテリンを含まないＨＡＴ培地と交換する。１０日目にスクリーニングを開始し、２週間続ける。プレートされた最初の７２０ウェルのうち、６８４ウェル(９５％)でハイブリドーマ増殖がポジティブである。上清を集め、大腸菌(E.coli)およびＨＥＫ/ＥＢＮＡによって誘導されるｈｕＩＬ−１７の両方を用いて、ＥＬＩＳＡでｈｕＩＬ−１７反応性ＭＡｂについてスクリーニングする。５２個の一次ウェルが、抗ｈｕＩＬ−１７抗体の存在に対してポジティブである。２８個のハイブリドーマをクローン化し、残りのものは凍結する。クローニングは、４×９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて、ＨＴ培地およびマウス腹膜細胞の支持細胞層中で行われる。ハイブリドーマは、ウェルあたり、０.５細胞/１００μｌでプレーティングする。ウェルを顕微鏡的に増殖についてスクリーニングし、そして、ポジティブのものは、１００μｌのＨＴ培地に入れる。翌日、上清をｈｕＩＬ−１７特異的ＥＬＩＳＡで抗体産生について試験する。クローニングにより、大部分のクローン化ハイブリドーマは、抗ｈｕＩＬ−１７特異的モノクローナル抗体(ＭＡｂ)を分泌する能力を保持している。
【００９１】
抗体の産生と精製：選択されたクローンは、無血清培地(５ｍｌ)中で２５ｃｍ２ＴＣ(ＴＣ：組織培養)フラスコの中へ移す。ハイブリドーマは、無血清培地中、７５ｃｍ２ＴＣフラスコおよびローラーフラスコまで、漸増的に拡張する。ＮＶＰ−ＡＩＮ４５７−ＮＸ(３４０−１１０−２８、すなわち、マウス番号−ハイブリドーマ番号−クローン番号)を含む異なった抗ｈｕＩＬ−１７ＭＡｂのすべて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。培養上清をｐＨ７.３に調整し、プロテインＡセファロース ４ ファーストフロウ(Pharmacia)の適当なサイズのカラムに入れる。１００ｍＭの燐酸緩衝液(ｐＨ７.３)を用いて基本洗浄後、結合した抗体を５０ｍＭ クエン酸、ｐＨ２.７、１４０ｍＭ ＮａＣｌで溶出する。この溶出したフラクションを、直ちに中和し(ｐＨ ７.０)、無菌ろ過する。蛋白質濃度は、１.３５吸光度(ＡＵ)/ｍｇの倍率を用いて２８０ｎｍでの吸光度によって決定する。
【００９２】
ヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生に対する抗ｈｕＩＬ−１７ＭＡｂの阻害活性：ヒト皮膚線維芽細胞を２％ ＦＣＳ、インシュリン(５μｇ/ｍｌ)ｈｕＦＧＦ−ｂａｓｉｃ(０.１μｇ/ｍｌ)およびゲンタマイシン(５０μｇ/ｍｌ)を補充したＦＢＭ中で培養する。線維芽細胞は、トリプシン/ＥＤＴＡ溶液を用いてプラスチックから分離させる。線維芽細胞を、１％ＦＣＳを補充したＦＢＭ中で１×１０４細胞/ウェル密度で９６ウェルのマイクロタイタープレートに分配する。線維芽細胞を一晩プレートに付着させる。翌朝、培地を除き、１％ＦＣＳを補充した新鮮なＦＢＭ、ｈｕＩＬ−１７(３０〜５００ｎｇ/ｍｌの範囲の様々な濃度)およびハイブリドーマ上清(１/５最終希釈)または精製抗体を最終容量２００μｌまで加える。培養上清は、２４時間のインキュベーションの後、回収し、そしてｈｕＩＬ−６産生(量)がＥＬＩＳＡによって測定される。
【００９３】
抗ｈｕＩＬ−１７抗体の検証のためのＥＬＩＳＡ：ヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生に対する抗ｈｕＩＬ−１７ＭＡｂの阻害活性：ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートをＰＢＳ ０.０２％ＮａＮ３中の組み換えｈｕＩＬ−１７(３μｇ/ｍｌで１００μｌ/ウェル；バッチ ＢＭ−Ｅ３１４１/９８またはＥｎ.Ｅ−３３８２/８２)を用いて被覆し、次に室温で一晩インキュベートする。翌日、マイクロタイタープレートをＰＢＳ/２％ＢＳＡ/０.０２％ＮａＮ３の３００μｌを用いて３７℃で２時間ブロッキングする。次いでプレートを、ＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０/０.０２％ＮａＮ３で４回洗浄する。マウス２７３４０の血清希釈液(３５日目の最終希釈範囲：１/１００〜１/３２００；９９日目の最終希釈範囲：１/２００〜１/１２８００；１００μｌ/ウェル)またはハイブリドーマの培養上清(最終希釈 １：３；１００μｌ/ウェル)が加えられる。室温で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０/０.０２％ＮａＮ３で４回洗浄する。ビオチンコンジュゲートマウス抗ｈｕ−ＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的抗体が最終濃度１/２００００(１００μｌ/ウェル)で加えられる。サンプルを、室温で４時間反応させる。洗浄(４回)後、アルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジンが最終希釈１/８０００(１００μｌ/ウェル)で加えられる。室温で４０分後、プレートを再び４回洗浄し、次に基質(ジエチルアミノバッファーｐＨ９.８中のｐ−ニトロフェニルホスファート；１５０μｌ/ウェル)が加えられる。プレートをマイクロタイターリーダー(Bio-Rad)で、４０５および４９０ｎｍのフィルターを用いて、反応の発色に応じて３０分または４５分後に読み取る。
【００９４】
抗体アイソタイプの検出のためのＥＬＩＳＡ：ＭＡｂのアイソタイプを明らかにするために、培養上清(１００μｌ；最終希釈１/５)をｈｕＩＬ−１７で被覆されたマイクロタイタープレートのウェルに加え(上記参照)、次に室温で一晩インキュベートする。洗浄(４回)後、１００μｌ/ウェルのビオチンコンジュゲートマウスＭＡｂｓ抗ヒトＩｇＧ１(最終希釈１/１０００)、ＩｇＧ２(最終希釈１/１０００)、ＩｇＧ３(最終希釈１/１０００)、ＩｇＧ４(最終希釈１/２０００)または抗ヒトκ軽鎖(最終希釈１/１０００)を室温で４時間加える。対照として、ビオチンコンジュゲートラット抗マウスλ１およびλ２軽鎖特異的ＭＡｂを使用する(最終希釈１/１０００)。前に述べたごとくこれに続いて、洗浄およびアルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジンの添加(１００μｌ；最終希釈１/８０００)が行われる。４回洗浄した後、基質(ジエチルアミノバッファー中のｐ−ニトロフェニルホスファート；１００μｌ)が加えられる。プレートをマイクロタイターリーダー(Bio-Rad)で、４０５および４９０ｎｍのフィルターを用いて、反応の発色に応じて３０分または４５分後に読み取る。
【００９５】
ｈｕＩＬ−６産生の検証のためのＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートをＰＢＳ ０.０２％ＮａＮ３中の抗ｈｕＩＬ−６マウスＭＡｂ(R&D systemに由来するＭＡＢ２０６；４μｇ/ｍｌで１００μｌ/ウェル)を用いて被覆し、次に室温で一晩インキュベートする。次の日に、マイクロタイタープレートをＰＢＳ/２％ＢＳＡ/０.０２％ＮａＮ３の３００μｌを用いて３７℃で２時間ブロッキングした。次いでプレートは、ＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０/０.０２％ＮａＮ３で４回洗浄する。ヒト皮膚線維芽細胞の培養上清(最終希釈１：３；１００μｌ/ウェル)が加えられる。タイトレーション曲線を確立するために、ｈｕＩＬ−６(１００μｌ/ウェル)を１：２希釈工程中４００ｐｇ/ｍｌ〜３.１ｐｇ/ｍｌで力価測定する。室温で一晩インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０/０.０２％ＮａＮ３で４回洗浄する。ビオチンコンジュゲートヤギ抗ｈｕＩＬ−６抗体(BAP206; R&D Systems)が加えられる(２５ｎｇ/ｍｌ；１００μｌ/ウェル)。サンプルを、室温で４時間反応させる。洗浄(４回)後、アルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジン(alkaline phosphatase-conjugated streptavidin)が最終希釈１/８０００(１００μｌ/ウェル)で加えられる。室温で４０分後、プレートを再び４回洗浄し、次に基質(ジエチルアミノバッファーｐＨ９.８中のｐ−ニトロフェニルホスファート；１５０μｌ/ウェル)が加えられる。プレートをマイクロタイターリーダー(Bio-Rad)で、４０５および４９０ｎｍのフィルターを用いて３０分後に読み取る。
【００９６】
計算：値は、オリジナルのＯ.Ｄ.値か、または２回の測定値の平均値に基づいて計算される阻害％として報告する。更なるデータは、平均値±標準誤差として報告する。ｈｕＩＬ−６の標準曲線を、三次曲線フィットを用いることによって、培養上清中のｈｕＩＬ−６濃度を測定するために使用した。
【００９７】
結果
マウス２７３４０の血清力価：
【表２】
＊マイクロタイタープレートは、大腸菌(E.coli)(ＢＭ−Ｅ３１４１/９８)またはＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞(Ｅｎ.Ｅ−３３８２/８２)に由来するｈｕＩＬ−１７(３μｇ/ｍｌ)で被覆されている。
マウス２７３４０の血清は、二個の異なったｈｕＩＬ−１７の調製物に基づいて、３５日目と９９日目に抗ｈｕＩＬ−１７抗体の存在についてＥＬＩＳＡで分析する(表２)。結果は、マウス２７３４０の血清力価は、３５日目と９９日目の間で約４倍に増加しており、そして、両方のｈｕＩＬ−１７調製物が識別されるということを示している。
【００９８】
ハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡにおける結合：６８４上清を、組み換えｈｕＩＬ−１７の二個の調製物(前者は大腸菌(E.coli)(ＢＭ−Ｅ３１４１/９８)に起源しており、後者はＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞(Ｅｎ.Ｅ−３３８２/８２)に起源している)を用いて、抗ｈｕＩＬ−１７抗体の存在についてＥＬＩＳＡで試験する。５２個の上清が、抗ｈｕ−ＩＬ−１７抗体の存在に対してポジティブである(表３)。一方または他方のｈｕＩＬ−１７の調製物に優先的に結合することが、いくつかの場合に観察される。続いてクローン化する２８個のハイブリドーマに、下線を引く。
【表３】
＊プレートは、大腸菌(E.coli)(ＢＭ−Ｅ３１４１/９８)またはＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞(Ｅｎ.Ｅ−３３８２/８２)に由来する組み換えｈｕＩＬ−１７(３μｇ/ｍｌ)で被覆されている。上清は、最終希釈率１/３で試験される。
【００９９】
ハイブリドーマクローンの培養上清のＥＬＩＳＡにおける結合：抗ｈｕＩＬ−１７ ＭＡｂの最もよい産生物を維持している１１個のハイブリドーマのクローンの上清のＥＬＩＳＡにおける反応性を表４に示す。下線(bold)で強調されているクローンは、抗体の精製および分析のためのローラーボトル中の〜１リットルの上清を産生するために選択された。ｈｕＩｇＧ３κ抗体を産生するハイブリドーマＮｏ ５から誘導されるクローンを除いて、他のクローンのすべては、アイソタイプ特異的モノクローナル抗体によって評価されるとおり、ｈｕＩｇＧ１κＭＡｂを産生した。
【表４】
マイクロタイタープレートは、ＨＥＫ/ＥＢＮＡ細胞(Ｅｎ.Ｅ−３３８２/８２)に由来する組み換えｈｕＩＬ−１７(３μｇ/ｍｌ)で被覆されている。
【０１００】
培養上清の活性の中和：培養上清を、組み換えｈｕＩＬ−１７で刺激されたヒト皮膚線維芽細胞によるｈｕＩＬ−６の産生阻害について試験する。表５に示すとおり、大部分の培養上清は、阻害活性を示す。
【表５】
【０１０１】
ＡＩＮ４５の中和活性：開発候補物ＡＩＮ４５７(本発明の好ましい態様)の産生のためのクローン１１０−２８の選択は、精製抗体のＢＩＡＣＯＲＥ２０００による中和活性およびアフィニティー測定に基づいている(下記実施例２参照)。
【０１０２】
実施例２：ＡＩＮ４５７は、非常に高い親和性をもって組み換えヒトＩＬ−１７(ｈｕＩＬ−１７)に結合する；ＫＤは、１２２±２２ｐＭ(BIAcore)であり、ヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕＩＬ−１７によって誘発されるヒトＩＬ−６の産生を中和する；ＩＣ５０は、１.８７ｎＭ ｈｕＩＬ−１７の濃度で２.１±０.１ｎＭである。
ａ)方法
試薬：一般的研究用試薬を、ＭｅｒｃｋまたはＳｉｇｍａ社から購入し、入手できる最も高い純度グレードである；特別の試薬の供給源は下記に詳述する。
蛋白質：モノクローナル抗体は、ＭＥＤＡＲＥＸトランスジェニックマウスを組み換えヒトＩＬ−１７で免疫することによって生成させ、次いで細胞株を生産する標準的な手順に従って、そこから分泌物質をプロテインＡセファロースクロマトグラフィー(Protein A Sepharose chromatography)によって精製することができる(実質的に実施例１中で述べられている)。ＡＩＮ４５７は、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０、１４０ｍＭのＮａＣｌ中の滅菌ろ過溶液として４℃で保存される。この組み換えヒトＡＩＮ４５７(バッチ ＫＢ０３３０３Ａ)は、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム/４０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７、１５０ｍＭ ＮａＣｌか、または１Ｍトリス塩基で調整された２０ｍＭ 酢酸 ｐＨ５.５のどちらかの滅菌ストック溶液中で得られる。濃度は、通例、２ｍｇ/ｍｌの範囲内であり、Biacore実験のために、ＢＩＡ緩衝液(２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.０５％ｖ/ｖツイーン−２０)中で最終濃度５μｇ/ｍｌまで希釈される。
組み換えヒトＩＬ−１７は、社内で製造される；バッチ Ｅｎ/Ｅ ３８８２/８３；０.２９ｍｇ/ｍｌ。
【０１０３】
ＢＩＡｃｏｒｅ測定
速度論的結合パラメーターおよび交差反応性のレベルの決定が、光バイオセンサーＢＩＡｃｏｒｅ ２０００(BIAcore AB, Upsalla, Sweden, 詳細はLit. HS 1,2参照)を用いて表面プラズモン共鳴測定によって行われる。この技術によって、リガンドが受容体に結合および解離する顕微鏡的比率定数(ｋｏｎおよびｋｏｆｆ)の無標識での決定を可能とする。それ故、抗体−抗原の相互作用を特徴付けるのに特に適している。この技術は、ＥＬＩＳＡ測定の欠点を補い、様々な点でＥＬＩＳＡ測定に比べて優れている(Van Regenmortel, DevBiol(Basel).2003; 112: 141-51)。組み換えＩＬ−１７のＩＬ−１７抗体ＡＩＮ４５７への結合の検討は、二つの方法で行われる。標準的プロトコールでは、ＡＩＮ４５７は、その前にＣＭ−５ ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ(研究グレード)に固定化されている抗ヒトＦＣγ抗体によって捕捉される(Jackson Immunochemicals; Cat. No. 109-005-098)。ＦＣγ捕捉抗体の共有結合は、BIAcoreから提供される(BIAcore, Cat. No. BR-1000-50)‘アミン結合キット’を用いて行われる。通例、捕捉抗体の３０００ＲＵＳは、１０ｍＭ Ａｃ緩衝液、ｐＨ４.５中の３０μｇ/ｍｌ 抗ＦＣγ抗体溶液を流速５μｌ/分にすると、活性化したデキストラン表面に結合して、約２５０ＲＵＳのＡＩＮ４５７の固定化に至る。ガイドラインとして、１０００ＲＵＳは、１ｎｇ/ｍｍ２の物質移動に相当する。あるいは、ＩＬ−１７(Section 3.2; 表４)、ＡＩＮ４５７抗体は、抗体を捕捉することなく、直接チップの表面に結合する。この結果は、表９(下記参照)に述べられているプロトコールに比較されている。
【０１０４】
ｂ)結果
ＩＬ−１７/ＡＩＮ４５７複合体の結合速度
平衡解離定数ＫＤは、イン・ビボで形成された、複合体の安定性についてのいくつかの判断を可能にする。それ故、我々は、ヒトＩＬ−１７が固定化されたＡＩＮ４５７抗体に結合する速度定数を決定し、次にこうしたデータからこのプロセスのＫＤを誘導した。二個の実験の曲線が、ＢＩＡエバルエーション(BIAevaluation) ３.０ ソフトウエアを用いるラングミアモデル(Langmuir model)にフィットしている場合に、表３は得られたデータのサマリーを示す。もちろん、抗体は二価であるけれども、この結合は、個々の抗体結合部位は、単量体ＩＬ−１７分子によって占められるようになる表面に提示される個々の抗体結合部位で、１：１事象として処理できる。
この実験では、抗体−ケモカイン複合体の極端に速い結合ならびに極めて遅い解離速度の両方を示す。センサーグラムが、(BIAevaluationで示唆されているように全体的ではなく)個別的に処理されるときに、最もよいデータフィットが得られる。すなわち、連続したタイトレーションを集約した後、我々は、１２個のセンサーグラムから平均値を得る(ｋｏｎ＝(４.１±０.１)×１０５ ｌ/Ｍｓ；ｋｏｆｆ＝(３.８±０.５)×１０−４ ｌ/ｓ；およびＫＤ＝１２２±２２ｐＭ)。
【表６】
平均ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｏｆｆ/ｋｏｎを適用したのではなく、個々のエントリー(垂直軸)から計算された。
【０１０５】
組み換え細胞中で産生されたＡＩＮ４５７(ＫＢ０３３０３Ａ)について、親和性測定を、ヒト、マーモセット、アカゲザルおよびカニクイザルにそれぞれ由来するＩＬ−１７サイトカインについて行う。Biacore測定の実験的詳細は、ＭＡＢ１１０−２８抗体の場合に上記で述べられたと同一である。それぞれのラン行程で六種のＩＬ−１７の濃度を試験する二つの独立したランが行われる。ヒトＩＬ−１７の濃度は、２、４、８、１２、１６、２０ｎＭであり、そして他の種のすべての場合は、１０、２０、３０、４０、５０、６０ｎＭである。完全なデータ分析によって、各ＩＬ−１７種のためのｎ＝１２の個々の測定が得られる。ＫＤならびにＳＥＭを報告する。
【表７】
【０１０６】
ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＫＤならびにそれぞれのＩＬ−１７種を含んでいる抗体ＫＢ０３３０３Ａの場合のBIAcore分析の全一式データが、下記の表５〜８に提供される。
【表８】
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
【表１１】
【０１１０】
次に、ｈｕＩＬ−１７に対する精製されたＡＩＮ４５７(バッチ Ｅｎ/Ｅ−１０３３３/５３；０.５４ｍｇ/ｍｌ)の阻害活性を評価する。ＩＣ５０値は、表６に示す。これらの実験では、ｈｕＩＬ−１７Ｒ/Ｆｃおよびマウス抗ｈｕＩＬ−１７ ＭＡｂは、ポジティブコントロールとして、そして、シムレクト(Simulect)はネガティブコントロールとして含まれる。
【表１２】
＊平均値および標準誤差は、三個の異なった、独立した実験から計算される。
【０１１１】
結論として、ＡＩＮ４５７は、ヒトの皮膚線維芽細胞によるＩＬ−１７依存性のｈｕＩＬ−６の分泌を抑止する。この作用強度は、ｈｕＩＬ−１７Ｒ/Ｆｃのそれと匹敵し、商業上利用可能なマウス抗ｈｕＩＬ−１７ ＭＡｂのそれと比較して優れている。ＩＬ−１７Ｒ/Ｆｃに比較して、ＡＩＮ４５７でより完全な阻害が観察されることを注目することは興味深い。
【０１１２】
実施例３：重鎖と軽鎖のアミノ酸シークエンシングの純度および部分的アミノ酸配列
ＶＬおよびＶＨ領域のアミノ末端アミノ酸配列：二個の抗ＩＬ−１７Ａ抗体の重鎖および軽鎖の最初の４８個のアミノ酸残基、クローン１１０−７(表４参照)および１１０−２８(表４参照)を、エドマン分解によって決定する。このアミノ酸配列は、両方のクローンで同一である。ジーンバンクでは、blast分析でサーチされ、そして、見出された最も相同的なＤＮＡ配列をクローニングプライマーの設計に使用する。
【０１１３】
ＶＬおよびＶＨ領域の分子クローニング：製造業者(Quiagen Hilden Germany)のプロトコールに従ってRNeasy Midi Kitを用いて、全ＲＮＡを２×１０７個のハイブリドーマ細胞(クローン １１０−７、クローン １１０−２８)から調製する。全ＲＮＡを２００μｌのＲＮａｓｅ非含有水中に溶出し、−８０℃で保存する。ファーストストランドｃＤＮＡ合成を、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素(Promega, Madison, WI)、oligo-dT プライマー、ＰＣＲヌクレオチド混合物(dNTP)およびＲＮＡｓｉｎ阻害剤(Roche, Mannheim)を用いて行う。５μｇの全ＲＮＡは、１μｌのoligo-dT プライマー(０.５μｇ/μｌ)と混和し、次にＲＮａｓｅ非含有水を最終容積３６μｌまで加える。この混合物を７０℃で１０分間インキュベートし、次いで氷上に保存する。氷の上にある間に、次の試薬を加える：１０μｌ ５× ＲＴ緩衝液、２μｌ ｄＮＴＰｓ(各１０ｍＭ)、２μｌ ＲＮａｓｉｎおよび１μｌ Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。この反応を４２℃で１時間行う。
【０１１４】
ＰＣＲ反応を全容量４０μｌ中でｃＤＮＡテンプレート４μｌ、それぞれ１０μＭの各プライマー２μｌ(概要は下記および表１０および１１参照)、２×Qiamix (緩衝液、dNTP's, TAQPolymeraseを含む)２０μｌおよびPwo DNA Polymerase １μｌを用いて、構築する。このＰＣＲの条件は、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間そして７２℃で３０秒間の３５サイクルにセットされる。ＰＣＲ生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｚｅｒｏ(Stragagene, La Jolla, Ca.)クローニングベクターにサブクローニングする。いくつかのクローンを各反応から回収し、ヌクレオチド配列がプライマー ＭＶ４３２(配列番号２１)、ＭＶ４３３(配列番号２２)、ＭＶ４３４(配列番号２３)、ＭＶ４３５(配列番号１４)、およびベクターＤＮＡにおける標準的プライマーを用いて、Solvias AG(Basel)によって決定する。
【０１１５】
重鎖をコードしているｃＤＮＡを、プライマーペアー ＭＶ４１６(配列番号１５)/＃２６５(配列番号１６)およびＭＶ４１８(配列番号１７)/＃２６５(配列番号１６)を用いて増幅する。このプライマーは、重鎖の次のアミノ酸位置に相当するヌクレオチド配列をカバーしている：ＭＶ４１６ 位置−１９/−１３(シグナルペプチド)；ＭＶ４１８ 位置＋１/＋７；＃２６５ 位置＋２５３/＋２５９。位置＋１は、成熟蛋白質の最初のアミノ酸である。
【０１１６】
軽鎖をコードしているｃＤＮＡを、プライマーペアー ＭＶ４１７(配列番号１８)/＃２２３(配列番号１９)およびＭＶ４１９(配列番号２０)/＃２２３(配列番号１９)を用いて増幅する。このプライマーは、軽鎖の次のアミノ酸位置に相当するヌクレオチド配列をカバーしている：ＭＶ４１７ 位置−２０/−１４(シグナルペプチド)；ＭＶ４１９ 位置＋１/＋７；＃２２３ 位置＋２１０/＋２１５。このアプローチによって、それぞれの免疫グロブリン鎖の二個の独立したＰＣＲ増幅が可能になり、その結果、二個のＤＮＡ配列が独立して確立することになる。
【０１１７】
結果および考察
二個のハイブリドーマ(１１０−７および１１０−２８、上記表４参照)に由来する重鎖および軽鎖をコードしているクローニングされたＰＣＲ生成物は、ＤＮＡシークエンシングによって特徴付けられる。５個および６個の独立した配列が軽鎖および重鎖の配列を集合させるために使用される。軽鎖ｃＤＮＡは、すべて同一であり、全体をコードしている配列(アミノ酸位置−２０〜＋２１５)をカバーしている。重鎖ｃＤＮＡは、それぞれ一個のｃＤＮＡに二個の異なるミスマッチを有していた。これらは、開始コドンから定常領域ドメイン１(アミノ酸位置−１９から＋２３８)の後のヒンジ領域の端まで伸長している最終的な配列から排除される。両方のハイブリドーマの配列は同一である。ハイブリドーマ１１０−２８から得られるｃＤＮＡを選択し、すべての更なる発現作業のために使用する。配列番号７(ＡＩＮ４５７の重鎖のｃＤＮＡ)、配列番号８(ＡＩＮ４５７の重鎖のアミノ酸配列)、配列番号９(ＡＩＮ４５７の軽鎖のｃＤＮＡ)および配列番号１０(ＡＩＮ４５７のアミノ酸配列)は、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡシークエンシングのために使用される蛋白質配列およびプライマーの位置と共に、ＡＩＮ４５７の軽鎖および重鎖をコードしているＤＮＡ配列を示す。このＤＮＡ配列は、重鎖に対しては受託番号 ＮＰＬ００３６８９として、軽鎖に対しては受託番号 ＮＰＬ００３６９０として、PlasNovaに登録されている。
【０１１８】
ｃＤＮＡクローニングによって見出されたアミノ酸配列は、以前に精製免疫グロブリン重鎖および軽鎖のエドマン分解によって得られたそれと同一であり、正しいｃＤＮＡがクローニングされたことを示している。
【０１１９】
【表１３】
【表１４】
【０１２０】
【表１５】
【表１６】
【０１２１】
実施例４：抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体ＡＩＮ４５７のＦａｂ断片の三次元構造
相補性決定領域(ＣＤＲ')の立体配座およびＡＩＮ４５７の抗原結合部位の構造を決定するために、Ｆａｂ断片を生成し、結晶化し、次にそのＸ線構造を蛋白質結晶構造解析によって決定する。
【０１２２】
方法：ＮＶＰ−ＡＩＮ４５７のＦａｂ断片を抗体全体からパパイン開裂によって製造し、プロテインＡクロマトグラフィー、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。次いで精製物を限外ろ過によって１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＴＣＥＰ中で２０ｍｇ/ｍｌまで濃縮する。結晶は、２.０Ｍ 硫酸アンモニウム、５％ ＰＥＧ４００、０.１Ｍ Ｎａ ＭＥＳ ｐＨ６.５によって１９℃で懸滴して蒸気拡散法の技術によって成長させる。これらは、単位格子寸法 ａ＝９０.３Å、ｂ＝１０６.７Å、ｃ＝１３１.４Åを有し、かつ非対称単位に二個のＦａｂ分子を有する空間群Ｐ２１２１２１にある。Ｘ線データ回収の前に、ＡＩＮ４５７ Ｆａｂの単一結晶は、Lustyの方法(J. Appl. Cryst. (1999) 32, 106-112)を用いて、グルタルアルデヒドで架橋され、次いで２.０Ｍ Ｌｉ２ＳＯ４、２％ＰＥＧ４００、および０.１Ｍ Ｎａ ＭＥＳ ｐＨ６.５を含む溶液に移される。次にこの結晶をデータ回収のために９５Ｋで、クリオループ(cryo-loop)にマウントし、急速冷凍する。それぞれ１.０deg振動に相当する１８０の回折像が記録される。この回折データは、ＨＫＬプログラムスイートで処理される。この構造は、分子置換によって２.５Å分解能まで決定される。次いでこの構造は、プログラムＣＮＸを用いて、ねじれ角力学およびエネルギー最小化によって精度をあげる。
【０１２３】
結果：二個のＡＩＮ４５７Ｆａｂ分子は結晶の非対称ユニットで存在し、両方のＦａｂ分子のＨ−ＣＤＲ３ループが対称関連ＦａｂのＨ−ＣＤＲ３ループとの蛋白質−蛋白質接触中に関与している。この二個のＦａｂ分子は、異なった肘角度を示すが、その他の点で本質的には同一のＣＤＲループ立体配座を有する(ＣＤＲループのアミノ酸配列の表１２参照)。このＨ−ＣＤＲ１ループはしかるべきＨ１：１の正準な構造を採用しており、一方、Ｈ−ＣＤＲ２ループ立体配座は、規範的構造Ｈ２：３Ａのそれと適合している。ＡＩＮ４５７抗体のＨ−ＣＤＲ３ループは、Kabat ９４位(Ａｒｇ Ｈ９８)と１０１位(Ａｓｐ Ｈ１１５)の間の１８個の残基を含んでなり、非常に長い。それは、９４位(Ａｒｇ Ｈ９８)中のＡｒｇの側鎖とＨ１０１位(Ａｓｐ Ｈ１１５)中のＡｓｐカルボキシラート基の間の塩架橋によって、およびＴｒｐ Ｈ１１７の側鎖とＰｈｅ Ｈ１１４の主鎖カルボニル基の間の水素結合相互作用によって、安定化された典型的な湾曲したトルソー構造(bulged torso structure)を示す。Ｈ−ＣＤＲ３ループの頭部は、その基部に第二のベータ−湾曲(beta-bulge)およびその頂点にタイプＩのベータ−ターン(type I' beta-turn)を有する長い、ねじれたベータヘアピン構造を有する。ＡＩＮ４５７ Ｈ−ＣＤＲ３ループの際立った特徴は、その高含量の芳香族残基である：６個のチロシン、２個のトリプトファン、１個のフェニルアラニン。他のＣＤＲループのすべては、それぞれ更に一個のチロシンを供給しているので、ＡＩＮ４５７の抗原結合部位は、全部で１１個のチロシンを有している。Ｌ−ＣＤＲ１とＬ−ＣＤＲ２のループの立体配座は、それぞれ、正準な構造Ｌ１：６およびＬ２：１に合致する。Ｈ−ＣＤＲ３とは対照的に、Ｌ−ＣＤＲ３ループは短く(６個の残基)、その先端部にシス−プロリン(Ｐｒｏ Ｌ９６)を有し、Kabat ９０位にグルタミン(Ｇｌｎ Ｌ９１)を有し、Kabat ９７位にトレオニン(Ｔｈｒ Ｌ９８)を有する、一般に観察される規範的構造Ｌ３：１を示す。しかしながら、ＡＩＮ４５７ Ｌ−ＣＤＲ３ループのかなり異例な特徴は、シス−プロリンの後にシステイン残基の存在することである(Ｃｙｓ Ｌ９７)。Ｃｙｓ Ｌ９７の側鎖は、ＶＬ−ＶＨインターフェイスに位置している浅い陥凹の底部にあり、残基Ｔｒｐ Ｈ１１２、Ｔｒｐ Ｈ４７およびＴｙｒ Ｌ９２によって並んでいる。
【表１７】
【０１２４】
表１：Chothiaおよびその共同研究者のアプローチを用いて、Kabat定義に基づき、Ｘ線解析によって決定されたＡＩＮ４５７モノクローナル抗体の超可変領域のアミノ酸配列。太字で強調表示されたアミノ酸は、ＣＤＲループの部分であり、一方、普通のスタイルで示されたアミノ酸は、抗体フレームワークの部分である。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ＡＩＮ４５７ ＦａｂのＸ線構造を示す。相補性決定領域が強調されているＡＩＮ４５７ Ｆａｂ(Ｃ□トレース)の可変ドメインのクローズアップ図である。ＡＩＮ４５７の抗原結合部位が特別にチロシン残基に多く含まれているという事実を図解するために、ＣＤＲループによって提供されているチロシン側鎖のすべてが示されている。ＶＬ−ＶＨインターフェイスでのＣｙｓ Ｌ９７の側鎖が、また示されている(矢印)。
【図２】ＡＩＮ４５７ ＦａｂのＸ線構造、概観図を示す。ＡＩＮ４５７のＦａｂのファンデルワールスの表面描写である。軽鎖および重鎖は、それぞれ、ライトグレイおよびダークグレイで色付けされている。ＣＤＲループは、異なった色で強調されている。抗体の抗原結合部位から突き出ているまさにループであるＨ−ＣＤＲ３ループ(H-CDR3 loop)が存在していることが注目される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ｎＭのヒトＩＬ−１７の活性を５ｎＭ以下の濃度で５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される、ＩＬ−１７結合分子。
【請求項２】
重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)可変ドメインの両方を含んでなるＩＬ−１７結合分子であって；
前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３(前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ等価物を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
を含んでなる少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子。
【請求項３】
重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)可変ドメインの両方を含んでなるＩＬ−１７結合分子であって、前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘおよびＣＤＲ３−ｘ(前記ＣＤＲ１−ｘは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２−ｘは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３−ｘは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ−ｘ等価物を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
ｃ)順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
を含んでなる少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子。
【請求項４】
ヒト抗体である請求項１、２または３に記載のＩＬ−１７結合分子。
【請求項５】
１位のアミノ酸から始まって１２７位のアミノ酸で終了する配列番号８に示されているアミノ酸に実質的に相同性のあるアミノ酸配列を有する第一のドメインまたは上記に述べられた第一のドメインと、１位のアミノ酸から始まって１０９位のアミノ酸で終了する配列番号１０に示されているアミノ酸に実質的に相同性のあるアミノ酸配列を有する第二のドメインを含んでなる少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１７結合分子をコードしているＤＮＡ構築物。
【請求項７】
配列番号７またはその直接ＤＮＡＨ等価物；または配列番号９またはその直接ＤＮＡＬ等価物に実質的に相同的であるＤＮＡ分子を含んでなるＤＮＡ構築物。
【請求項８】
一方が配列番号７またはその直接ＤＮＡＨ等価物に実質的に相同性があり、そして、他方が配列番号９またはその直接ＤＮＡＬ等価物に実質的に相同性がある二個のＤＮＡ分子を含んでなるＤＮＡ構築物。
【請求項９】
請求項６、７または８に記載の少なくとも一個のＤＮＡ構築物を含んでなる原核または真核細胞株中で複製できる発現ベクター。
【請求項１０】
(ｉ)請求項９に記載の発現ベクターで形質転換された生物を培養し、そして(ｉｉ)培養物からＩＬ−１７結合分子を回収することを含んでなる、ＩＬ−１７結合分子の製造方法。
【請求項１１】
薬剤を製造するための請求項１〜５に記載のＩＬ−１７結合分子の使用。
【請求項１２】
ＩＬ−１７介在性疾患または障害の処置をする薬剤を製造するための請求項１〜５に記載のＩＬ−１７結合分子の使用。
【請求項１３】
骨関節炎、関節リウマチ、骨粗鬆症および他の炎症性関節炎疹の処置のための請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１７結合分子の使用。
【請求項１４】
患者に有効量の請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１７結合分子を投与することを含んでなる、それを必要とする患者におけるＩＬ−１７介在性疾患または障害の処置方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１７に対する抗体を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と共に含んでなる医薬組成物。
【請求項１】
１ｎＭのヒトＩＬ−１７の活性を５ｎＭ以下の濃度で５０％阻害することができ、前記阻害活性はヒトの皮膚線維芽細胞中のｈｕ−ＩＬ−１７によって誘発されるＩＬ−６の産生により測定される、ＩＬ−１７結合分子。
【請求項２】
重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)可変ドメインの両方を含んでなるＩＬ−１７結合分子であって；
前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３(前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ等価物を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
を含んでなる少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子。
【請求項３】
重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)可変ドメインの両方を含んでなるＩＬ−１７結合分子であって、前記ＩＬ−１７結合分子は、
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１−ｘ、ＣＤＲ２−ｘおよびＣＤＲ３−ｘ(前記ＣＤＲ１−ｘは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２−ｘは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３−ｘは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ−ｘ等価物を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(ＶＨ)；および
ｃ)順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'(前記ＣＤＲ１'は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２'は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、そして前記ＣＤＲ３'は、配列番号６のアミノ酸配列を有する)またはその直接ＣＤＲ'等価物を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
を含んでなる少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子。
【請求項４】
ヒト抗体である請求項１、２または３に記載のＩＬ−１７結合分子。
【請求項５】
１位のアミノ酸から始まって１２７位のアミノ酸で終了する配列番号８に示されているアミノ酸に実質的に相同性のあるアミノ酸配列を有する第一のドメインまたは上記に述べられた第一のドメインと、１位のアミノ酸から始まって１０９位のアミノ酸で終了する配列番号１０に示されているアミノ酸に実質的に相同性のあるアミノ酸配列を有する第二のドメインを含んでなる少なくとも一個の抗原結合部位を含んでなる、ＩＬ−１７結合分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１７結合分子をコードしているＤＮＡ構築物。
【請求項７】
配列番号７またはその直接ＤＮＡＨ等価物；または配列番号９またはその直接ＤＮＡＬ等価物に実質的に相同的であるＤＮＡ分子を含んでなるＤＮＡ構築物。
【請求項８】
一方が配列番号７またはその直接ＤＮＡＨ等価物に実質的に相同性があり、そして、他方が配列番号９またはその直接ＤＮＡＬ等価物に実質的に相同性がある二個のＤＮＡ分子を含んでなるＤＮＡ構築物。
【請求項９】
請求項６、７または８に記載の少なくとも一個のＤＮＡ構築物を含んでなる原核または真核細胞株中で複製できる発現ベクター。
【請求項１０】
(ｉ)請求項９に記載の発現ベクターで形質転換された生物を培養し、そして(ｉｉ)培養物からＩＬ−１７結合分子を回収することを含んでなる、ＩＬ−１７結合分子の製造方法。
【請求項１１】
薬剤を製造するための請求項１〜５に記載のＩＬ−１７結合分子の使用。
【請求項１２】
ＩＬ−１７介在性疾患または障害の処置をする薬剤を製造するための請求項１〜５に記載のＩＬ−１７結合分子の使用。
【請求項１３】
骨関節炎、関節リウマチ、骨粗鬆症および他の炎症性関節炎疹の処置のための請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１７結合分子の使用。
【請求項１４】
患者に有効量の請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１７結合分子を投与することを含んでなる、それを必要とする患者におけるＩＬ−１７介在性疾患または障害の処置方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１７に対する抗体を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と共に含んでなる医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５０７９８８（Ｐ２００８−５０７９８８Ａ）
【公表日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２４２８６（Ｐ２００７−５２４２８６）
【出願日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８４７０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１３１０７
【国際公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８４７０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１３１０７
【国際公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
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