ＩＰ３受容体結合タンパク質による細胞内標的分子の制御
【課題】ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）の標的分子を明らかにし、さらにＩＲＢＩＴの重要な生物学的機能を明らかにし、その機能の制御を確立する。
【解決手段】ＩＲＢＩＴ、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体を含む組成物であって、（１）タンパク質合成、（２）イノシトールリン脂質代謝、および（３）細胞内ｐＨ、からなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能の制御のための組成物。
【解決手段】ＩＲＢＩＴ、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体を含む組成物であって、（１）タンパク質合成、（２）イノシトールリン脂質代謝、および（３）細胞内ｐＨ、からなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能の制御のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞における生物学的機能を制御するための組成物および方法に関する。さらに具体的には、本発明は、ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）およびその細胞内標的分子が関与する該生物学的機能を制御するための組成物および方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、前記生物学的機能の制御を利用する物質のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
細胞膜上の受容体の活性化に伴いホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が加水分解されると、細胞内セカンドメッセンジャーであるイノシトール１，４，５−三リン酸（ｉｎｏｓｉｔｏｌ １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ＩＰ３））が生成する。ＩＰ３はＩＰ３受容体（ＩＰ３Ｒ）に結合することにより、細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ（主に小胞体）からのＣａ２＋放出を誘導する。このＩＰ３／Ｃａ２＋シグナル経路において、ＩＰ３受容体は、ＩＰ３のシグナルをＣａ２＋のシグナルへ変換する役割を担っている。
【０００４】
ＩＰ３受容体は、４量体の細胞内ＩＰ３誘導性Ｃａ２＋放出チャネル（ＩＰ３−ｇａｔｅｄ Ｃａ２＋ ｒｅｌｅａｓｅ ｃｈａｎｎｅｌ）である。哺乳動物では、３種の異なるＩＰ３受容体が存在する。ＩＰ３受容体タイプ１（ＩＰ３Ｒ１）は、中枢神経系、特に小脳において高発現している。マウスＩＰ３Ｒ１は、２７４９アミノ酸からなり、３つの機能的に異なる領域に分かれている。すなわち、Ｎ末端近傍にＩＰ３結合ドメイン、Ｃ末端近傍に６回膜貫通領域を有するチャネル形成ドメイン、およびこれら２つの領域の間に制御領域が存在する。ＩＰ３結合ドメインの欠失突然変異体解析より、ＩＰ３受容体のアミノ酸２２６〜５７８残基が特異的かつ高親和性のリガンド結合に必要な最小領域であることが示され、ＩＰ３結合コアと呼ばれている。
【０００５】
ＩＰ３受容体の活性化による細胞質Ｃａ２＋濃度の増加によって、多種多様な下流標的分子の活性が制御される。これら下流標的分子は、受精、発生、増殖、分泌、シナプス可塑性など多岐に渡る細胞応答において重要な役割を担っている。
【０００６】
本発明者らは、先に、新規のＩＰ３受容体結合タンパク質を見出し、ＩＲＢＩＴ（ＩＰ３Ｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｏｓｉｔｏｌ １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と命名した（特許文献１）。ＩＰ３受容体は、ヒト、マウスなどの哺乳動物の例えば脳、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、胸腺などの種々の組織や細胞に広く分布することから、ＩＲＢＩＴもそのような組織や細胞に存在すると推定される。ヒトおよびマウスＩＲＢＩＴのアミノ酸および塩基配列は、本発明者らによって決定された（非特許文献１、特許文献１）。これらのＩＲＢＩＴは５３０アミノ酸からなり、ヒトおよびマウス間の同一性は１００％である。ＩＰ３受容体との結合領域は、ＩＲＢＩＴのＮ末端領域（ヒトおよびマウスにおいて、アミノ酸１〜１０４）に存在する。
【０００７】
ＩＲＢＩＴは、（１）中性タンパク質である（推定ｐＩ値：６．４８）が、Ｎ末端領域は比較的酸性である（推定ｐＩ値：４．９８）、（２）Ｎ末端領域に複数のリン酸化部位が集中的に局在しており、リン酸化がＩＰ３Ｒ１との相互作用に必要であると推測される、（３）ＩＰ３Ｒ１のＩＰ３との結合に必須である５０８番目のリジン残基がＩＲＢＩＴとの相互作用においても必須である、（４）ＩＰ３によりＩＰ３Ｒ１との相互作用から解離する、および（５）高塩濃度により、ＩＰ３Ｒ１との相互作用から解離し、かつ粗ミクロソーム画分から抽出されることから、ＩＰ３Ｒ１との相互作用は静電気的結合によると推測される、などの特徴を有する（特許文献１）。
【０００８】
ＩＲＢＩＴは、ＩＰ３受容体のＩＰ３結合領域に結合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＰ３によりＩＰ３受容体から解離するという性質をもつ。このため、ＩＲＢＩＴは、ＩＰ３受容体のＩＰ３結合を抑制することにより、ＩＰ３受容体の活性を抑制する機能をもつことも明らかになっている（特許文献１）。
【０００９】
本発明者らは、今回、以下に説明するように、ＩＲＢＩＴの標的分子を明らかにし、さらにＩＲＢＩＴが三次メッセンジャーとして重要な生物学的機能をもつことを明らかにした。
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−１２９６１２
【非特許文献１】Ｈ． Ａｎｄｏら,Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：１０６０２−１０６１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＩＲＢＩＴとその分子標的との相互作用を利用して細胞内の生物学的機能の制御を可能にする組成物および方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、細胞内においてＩＲＢＩＴとその分子標的との間の結合を抑制または亢進することによって、前記生物学的機能の制御を可能にする物質のスクリーニング方法を提供することである。
【００１３】
本発明者らは、今回、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ＩＲＢＩＴの標的が、タンパク質合成を制御する分子、イノシトールリン脂質を制御する分子、および細胞内のｐＨを制御する分子であることを見出した。また、ＩＲＢＩＴが、細胞内代謝を制御する重要な分子の１つとして、今回見出された３種類の標的分子と結合して該標的分子の働きを制御する三次メッセンジャーとしての役割を有することを証明している。
【００１４】
発明の概要
したがって、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、 ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体を含む組成物であって、
（１）タンパク質合成、
（２）イノシトールリン脂質代謝、および
（３）細胞内ｐＨ、
からなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能の制御のための上記組成物を提供する。
【００１５】
一の実施形態において、前記タンパク質合成が、切断／ポリアデニレーション特異性因子（ＣＰＳＦ）による細胞質のｍＲＮＡポリアデニレーションが関与するものである。
【００１６】
別の実施形態において、前記イノシトールリン脂質代謝が、細胞内でのＰＩＰ２合成酵素（ＰＩＰＫＩＩ）が関与するものである。
【００１７】
別の実施形態において、前記細胞内ｐＨが、細胞内でのｐ型Ｎａ／ＨＣＯ３共トランスポーター１（ｐＮＢＣ１）が関与するものである。
【００１８】
別の実施形態において、前記制御が、抑制または亢進である。
別の実施形態において、前記ＩＲＢＩＴが、ヒトまたはマウス由来のものである。
【００１９】
別の実施形態において、前記ＩＲＢＩＴが、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつＩＲＢＩＴと同等の生物学的活性を有するタンパク質である。
【００２０】
別の実施形態において、前記組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで使用されるものである。
別の実施形態において、前記組成物が、疾患の治療用である。
【００２１】
本発明はまた、第２の態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のタンパク質合成の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
【００２２】
その実施形態において、前記ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦに結合しＣＰＳＦの機能を制御する。
【００２３】
本発明はまた、第３の態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のイノシトールリン脂質代謝の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
その実施形態において、前記ＩＲＢＩＴがＰＩＰＫＩＩ活性を抑制する。
【００２４】
本発明はまた、第４の態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内ｐＨの制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
【００２５】
その一の実施形態において、前記ＩＲＢＩＴがｐＮＢＣ１を活性化する。
別の実施形態において、前記ｐＮＢＣ１の活性化が前記ＩＲＢＩＴのリン酸化を必要とする。
【００２６】
本発明はまた、第５の態様において、候補物質の存在下で、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合を測定し、該結合を抑制または亢進する物質を同定することを含む、物質のスクリーニング方法を提供する。
【００２７】
その実施形態において、前記物質が治療用または診断用である。
別の実施形態において、前記結合が哺乳動物細胞内で行われる。
【００２８】
さらに別の実施形態において、前記物質が、細胞内のタンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝および細胞内ｐＨからなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能を制御するものである。
【００２９】
定義
本明細書中で使用する「ＩＲＢＩＴ」なる用語は、哺乳動物由来のＩＰ３受容体結合タンパク質であり、該受容体のＩＰ３結合部位に結合しており、ＩＰ３の該受容体への結合とともに細胞質に放出されるタンパク質である。本発明では、ＩＲＢＩＴは、ＣＰＳＦ（ｃｌｅａｖａｇｅ／ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＩＰＫＩＩ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ４−ｋｉｎａｓｅ）、またはｐＮＢＣ１（ｐａｎｃｒｅａｓ ｔｙｐｅ Ｎａ／ＨＣＯ３ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）と結合するが、これらのＩＲＢＩＴ標的タンパク質はＩＲＢＩＴとの結合を介してそれぞれタンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝、細胞内ｐＨの維持に関与する重要な生物学的機能を細胞内で果たしている。したがって、ＩＲＢＩＴは、これらの生物学的機能の制御を担っている。
【００３０】
本明細書で使用する「タンパク質合成」なる用語は、細胞内での遺伝子の転写と翻訳の一連の過程をいい、本発明では、細胞質でのｍＲＮＡポリアデニレーションの制御が関与する。また、イノシトールリン脂質代謝は、ＩＰ３を含むリン脂質の代謝を指す。
【００３１】
本明細書で使用する「抑制」なる用語は、上記生物学的機能の減少、低下または阻害をいう。
【００３２】
本明細書で使用する「亢進」なる用語は、上記生物学的機能の増加、上昇または増進をいう。
【００３３】
本明細書で使用する「ｅｘ ｖｉｖｏ」なる用語は、一旦生体外に取り出された細胞や組織を本発明の組成物で処理した後、生体内に戻すことをいう。
【００３４】
本明細書で使用する「患者」なる用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜動物（例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）などの哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の組成物および方法は、ＩＲＢＩＴが、哺乳動物細胞内でＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合を介してそれぞれ、タンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝、または細胞内ｐＨの維持に関与しているため、このような生物学的機能を制御するＩＲＢＩＴ、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体は、該機能の異常に伴う疾患の治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
１．組成物
本発明は、第１の態様により、ＩＲＢＩＴ、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、（１）タンパク質合成、（２）イノシトールリン脂質代謝、および（３）細胞内ｐＨからなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能の制御のために使用される。
以下に、上記３つの生物学的機能の制御について説明する。
【００３７】
タンパク質合成の制御
本発明において、前記タンパク質合成の制御は、細胞内でのＩＲＢＩＴとＣＰＳＦとの結合を介するｍＲＮＡポリアデニレーションの制御である。
【００３８】
ＣＰＳＦは、ＣＰＳＦ１６０、ＣＰＳＦ１００、ＣＰＳＦ７３およびＣＰＳＦ３０の４つのサブユニットからなる複合タンパク質である。本発明者らは、今回、ＣＯＳ細胞での共発現と免疫沈降による共沈試験から、ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦ、特にＣＰＳＦ１６０に結合することを見出した（図１）。
【００３９】
ＣＰＳＦは、核内でのｍＲＮＡのポリアデニレーション反応に必須の分子であるが、細胞質でポリ（Ａ）の長さを伸長することによるタンパク質合成を調節する働きを有すること、また、ＣＰＳＦ１６０のｍＲＮＡ結合部位は、ＣＰＳＦがポリ（Ａ）を付加するｍＲＮＡを認識する際に必須の領域であること、などが知られている（Ｃ． Ｂａｒｎａｒｄ Ｄａｒｏｎら，Ｃｅｌｌ ２００４，１１９：６４１−６５１、およびＥ． Ｋｌａｎｎら， “Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ”， Ｌｅａｒｎｉｎｇ ＆ Ｍｅｍｏｒｙ ２００４， １１：３６５−３７２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。具体的には、Ｅ． Ｋｌａｎｎら（上記）の「細胞質ポリアデニレーションとＣＰＥＢ」（３６７〜３６８頁）の項には、ポリアデニレーションは、ｍＲＮＡの３'非翻訳領域中の２つの配列、すなわち細胞質ポリアデニル化要素（ＣＰＥ）およびＡＡＵＡＡＡ、によって調節されており、ポリアデニレーションの重要な調節タンパク質であるＣＰＥ結合タンパク質（ＣＰＥＢ）が、特定のプロテインキナーゼ（Ａｕｒｏｒａ）によってリン酸化されるが、該キナーゼが、ＣＰＥＢを誘導して該ＡＡＵＡＡＡ配列上のＣＰＳＦとＣＰＥＢが相互作用することによって、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）を救済しｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部を伸長させることが記載されている。
【００４０】
上記の知見を考慮すると、ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦ１６０のｍＲＮＡ結合部位に結合することによって、ＣＰＳＦの機能が制御されると考えられる（図２）。
【００４１】
さらにまた、本発明者らは今回、ＩＲＢＩＴが、ＰＡＰ及びＦｉｐ１（ＣＰＳＦのサブユニット）の存在下でのポリアデニレーション活性（Ｉ． Ｋａｕｆｍａｎｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．（２００４）２３：６１６−６２６）をさらに増大させる働きがあるという知見を得た。この知見から、ＩＲＢＩＴを抑制することによってタンパク質合成を抑制することが可能になる。
【００４２】
このように、ＩＲＢＩＴは、ＣＰＳＦとの結合を介して、ｍＲＮＡポリアデニレーションの制御、したがってタンパク質合成の制御に関わっている。
【００４３】
したがって、ＩＲＢＩＴ、あるいはその生成および機能を抑制または亢進する物質は、ＣＰＳＦが関連するタンパク質合成の制御を可能にする。
【００４４】
イノシトールリン脂質代謝の制御
ＩＲＢＩＴはまた、ＰＩＰＫＩＩと結合して、該酵素の活性を抑制する（実施例２）。
ＰＩＰＫＩＩは、ホスファチジルイノシトール５リン酸（ＰＩ（５）Ｐ）からホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２）を合成する酵素であり、さらにＰＩＰ２の加水分解によりＩＰ３が産生される。ＩＰ３は、ＩＰ３受容体のリガンドであり、該受容体に結合することによって、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）とＩＲＢＩＴがともに細胞質内に放出されるという事実を考慮すると、ＩＲＢＩＴは、イノシトールリン脂質代謝の制御に関わっているということができる(Ｋａｔｊａ Ａ． Ｌａｍｉａら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４，２４：５０８０−５０８７)。
【００４５】
したがって、ＩＲＢＩＴ、あるいはその生成および機能を抑制または亢進する物質は、ＰＩＰＫＩＩが関係するイノシトールリン脂質代謝の制御を可能にする（図３）。
【００４６】
例えば、ＰＩＰＫＩＩは、哺乳動物において、ＰＩＰＫＩＩα、βおよびγの３種類のイソフォームを含むが、ＩＲＢＩＴはそのいずれの酵素にも結合する。特にＰＩＰＫＩＩβについては、その酵素をノックアウトしたトランスジェニックマウスが高いインスリン感受性をもつことから、該酵素の阻害が２型糖尿病の治療に有用であることが示されている（Ｋａｔｊａ Ａ． Ｌａｍｉａら，上記）。ＩＲＢＩＴがＰＩＰＫＩＩ活性を抑制するという、本発明者らによる知見は、ＩＲＢＩＴが２型糖尿病の治療に使用しうることを示している。
【００４７】
細胞内ｐＨの制御
ＩＲＢＩＴはさらに、ｐＮＢＣ１に結合し、それを活性化する。
具体的には、アフリカツメガエル卵母細胞にＩＲＢＩＴのｃＲＮＡとＮＢＣ１のｃＲＮＡを注入することにより細胞内ｐＨ変化で検出するｐＮＢＣ１の応答が、約６〜７倍高い応答が得られた（図１４）。この結果は、ＩＲＢＩＴがｐＮＢＣ１活性を顕著に増強することを示した。
【００４８】
ＮＢＣ１は、細胞膜上に存在する１０回膜貫通型タンパク質であり、ナトリウムイオンと重炭酸イオンとを一定の割合で細胞膜を横切って同じ方向に運ぶ働きをする。生体内のｐＨは重炭酸イオンと炭酸ガスとの濃度バランスによって巧妙に調節されているので、ＮＢＣ１は生体内のｐＨの調節に関与していると考えられる(Ｅ． ＧｒｏｓｓとＩ． Ｋｕｒｔｚ，Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００２，２８３：Ｆ８７６−Ｆ８８７)。特に、血液のｐＨが酸性に傾く酸血症の一種である近位尿細管型アシドーシスの原因遺伝子としてＮＢＣ１が同定されたことは、ＮＢＣ１による重炭酸イオンの輸送が生体内のｐＨの維持に欠くことのできない役割を果たしていることを示している。
【００４９】
ＮＢＣ１には、これまでに腎臓型（ｋｉｄｎｅｙ ｔｙｐｅ：ｋＮＢＣ１）と膵臓型（ｐａｎｃｒｅａｓ ｔｙｐｅ：ｐＮＢＣ１）の２つのスプライシング変異体が報告されており、ｋＮＢＣ１は主に腎臓に、ｐＮＢＣ１は膵臓を中心として脳神経系を含めた比較的多くの組織に、それぞれ発現している。本発明者らはＩＲＢＩＴがどちらのＮＢＣ１のどの部分と結合するのか明らかにするために、ＮＢＣ１の細胞質領域を大腸菌に組換え型タンパク質として発現させて精製し、培養細胞に強制発現したＩＲＢＩＴとの結合をプルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）アッセイで検討した。その結果、ＩＲＢＩＴはｐＮＢＣ１に特異的なＮ末側８５アミノ酸と特異的かつ強力に結合することがわかった（図１０）。更に特定の塩の濃度変化によってＩＲＢＩＴとｐＮＢＣ１の結合が制御されていることもわかった。
【００５０】
これらの結果は、種々の臓器におけるｐＮＢＣ１によるｐＨ調節をＩＲＢＩＴが細胞内の状況依存的に制御している可能性を強く示唆している。また、近位尿細管型アシドーシス患者は緑内障や白内障といった眼の疾患、低身長、精神遅滞、膵臓炎といった様々な症状を呈することから、ＮＢＣ１によるｐＨの調節が腎臓以外の臓器でも重要な役割を果たしていると考えられる。それゆえ、ＩＲＢＩＴは、ｐＮＢＣ１を介して緑内障や白内障などの眼の疾患、低身長、精神遅滞、膵臓炎などの疾患の治療法としても有用である（Ｓｅｔｈ Ｌ． Ａｌｐｅｒ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００２，６４：８９９−９２３）。
【００５１】
したがって、ＩＲＢＩＴ、あるいはその生成および機能を抑制または亢進する物質は、ｐＮＢＣ１が関係する細胞内ｐＨの制御を可能にする。
【００５２】
ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）
本発明で使用するＩＲＢＩＴは、哺乳動物由来のものである。ＩＲＢＩＴは、哺乳動物の脳、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、胸腺などの組織の細胞内小胞体に存在していることが知られている（特開２００４−１２９６１２号公報）。好ましいＩＲＢＩＴの例は、ヒトＩＲＢＩＴおよびマウスＩＲＢＩＴである（特開２００４−１２９６１２号公報、Ｈ． Ａｎｄｏら,Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：１０６０２−１０６１２）。特にヒトＩＲＢＩＴが好ましい。ヒトおよびマウスＩＲＢＩＴのアミノ酸および塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれＮＭ＿００６６２１（配列番号１、２参照）およびＮＭ＿１４５５４２（配列番号３、４参照）として登録されている。
【００５３】
また、好ましいＩＲＢＩＴの別の例は、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、もっとも好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつＩＲＢＩＴと同等の生物学的活性を有するタンパク質である。ここで、生物学的活性は、Ｓ−アデノシルホモシステインのアデノシンとホモシステインへの可逆的加水分解を触媒するＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様活性に加えて、タンパク質合成におけるＣＰＳＦとの結合を介するｍＲＮＡポリアデニレーションの制御、ＰＩＰＫＩＩとの結合を介するイノシトールリン脂質代謝の制御、およびｐＮＢＣ１との結合を介する細胞内ｐＨの制御を含む生物学的機能の制御に関わる活性をいう。
【００５４】
同様に、好ましいＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡの例は、配列番号２または配列番号４に示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、もっとも好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡ、あるいは、ストリンジェントな条件下で該配列番号２または配列番号４の塩基配列とハイブリダイズ可能なＤＮＡである。ここで、ストリンジェントな条件とは、以下のものに限定されないが、約４５〜５０℃で２〜６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、約５０〜６５℃での０．２〜２×ＳＳＣ／０．１〜１％ＳＤＳによる洗浄からなるか、あるいは６０〜６５℃で６×ＳＳＣ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションののち、６０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄からなる（例えば、Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （３版） Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９５年， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．)。
【００５５】
他の哺乳動物由来のＩＲＢＩＴもまた、本発明において使用可能である。そのようなＩＲＢＩＴは、例えばラット、ハムスター、ウサギなどの実験動物のＩＲＢＩＴ、イヌ、ネコなどのペット動物のＩＲＢＩＴ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物のＩＲＢＩＴなどを含む。これらのＩＲＢＩＴの作製については、文献、データバンク等に記載のアミノ酸または塩基配列に基づいて、あるいはヒトまたはマウスＩＲＢＩＴの公知の配列に基づいて、プローブおよび／またはプライマーを作製し、ＤＮＡクローニング法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの慣用の手法によって、例えば市販のまたは調製された動物組織からのライブラリーを用いて、ＩＲＢＩＴ ｃＤＮＡをクローン化および／または増幅し、さらに、得られたＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを、適当な制御配列を有する例えば市販の発現ベクター（例えばプラスミド）に組み込み、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクションし、得られた細胞を、適当な培地にて培養してＩＲＢＩＴ ＤＮＡを発現させ、生成したＩＲＢＩＴタンパク質を回収することができる。これらの一連の手法については、例えばＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８９年， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （３版） Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９５年， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、実験医学別冊４版松村正實ら編「新遺伝子工学ハンドブック」（２００３年）羊土社、東京、日本などに記載されており、ここに記載されるような手法に従って、種々の哺乳動物由来のＩＲＢＩＴホモログを得ることが可能である。
【００５６】
ＩＲＢＩＴ遺伝子を含む哺乳動物組織をホモゲナイザーを用いて均質化し、約１０,０００ｒｐｍで遠心分離して上清を得た後、例えばグアニジン・酸性フェノール法で全ＲＮＡを回収し、定法に従いｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡからＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを得ることができる。ＲＮＡの抽出のためのキット、例えば日本ジーン社のＩＳＯＧＥＮ（商標)、が市販されているので、それを利用してもよい。
【００５７】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを検出するためのプローブのサイズは、通常３０塩基以上、好ましくは５０〜１００塩基またはそれ以上である。プローブには、通常、蛍光標識（例えばフルオレサミン、ローダミンまたはそれらの誘導体）、放射性同位元素標識（例えば３２Ｐ）などの標識を結合し、これによって目的のＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡとプローブとの結合を検出することができる。
【００５８】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーのサイズは、通常１５〜３０塩基、好ましくは２０〜２５塩基である。プライマーは、ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の３'末端側に相補的な配列を有しているべきである。しかし、増幅すべきＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡの配列が不明の場合には、公知のＩＲＢＩＴ配列に基づいて複数のプライマーを準備し、ＰＣＲによって鋳型ＤＮＡを増幅し、さらに、増幅された鋳型ＤＮＡに基づいて正式のプライマーを作製し、ＰＣＲによって目的の鋳型ＤＮＡを増幅することができる。
【００５９】
ＰＣＲは、一般に、ＤＮＡの変性、プライマーのアニーリングおよび伸長反応を１サイクルとして約２０〜４０サイクル行うことからなる。ＤＮＡの変性は、二本鎖ＤＮＡを一本鎖のＤＮＡに解離するための工程であり、通常９４℃で約１５秒〜１分の処理を行う。プライマーのアニーリングは、プライマーと、相補的な一本鎖鋳型ＤＮＡとを対合させる工程である。アニーリングに至適な温度や時間はプライマーの塩基配列や長さに依存するが、通常約５５〜６０℃で約３０秒〜１分の処理を行う。伸長反応は、４種類のｄＮＴＰと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で鋳型ＤＮＡを伸長する工程であり、通常７２℃で約３０秒〜１０分の処理を行う。サイクルを開始する前に、９４℃で約１〜５分加熱し完全にＤＮＡを変性することもできる。また、全サイクルの終了後に、７２℃で約１〜５分の加熱処理を行うこともできる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、市販されており、例えばＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｓ（Ｔａｑ）ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、パーキンエルマー、ファルマシアなどから販売）を使用することができる。ＰＣＲの手法については、例えば蛋白質核酸酵素「ＰＣＲ法最前線 基礎技術から応用まで」第４１巻第５号１９９６年４月増刊号、共立出版、東京、日本を参照することができる。
【００６０】
発現ベクターは、原核生物または真核生物由来の細胞で使用可能な任意のベクターである。ベクターは、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位、マルチクローニング部位、ターミネーターなどの制御配列を含むことができる。発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスなどのベクター、特に市販のベクター、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ−１（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＧ−１およびｐＸＴ１（ストラタジーン社）、ｐＭＡＬおよびｐＴＹＢシリーズ（第一化学薬品）、ｐＱＥシリーズ（キアゲン社）、ｐＥＴシリーズ（ノバジェン社）、ｐＳＶＫ３およびｐＳＶＬ ＳＶ４０（ファルマシア社）、ｐｃＤＮＡ１およびｐｃＤＭ８（フナコシ）、ｐＨＢ６、ｐＶＢ６、ｐＨＭ６、ｐＶＭ６およびｐＸＭ（ロシュダイアグノスティック社）などを適宜選択して使用することができる。
【００６１】
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属、枯草菌などのバチルス属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属などの細菌類、サッカロマイセス属、ピチア属、シゾサッカロマイセス属などの酵母類、昆虫細胞、植物細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３などの哺乳動物細胞などを挙げることができる。
【００６２】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルス感染による方法などが含まれる（実験医学別冊４版松村正實ら編「新遺伝子工学ハンドブック」（２００３年）羊土社、東京、日本）。
【００６３】
より具体的には、マウスＩＲＢＩＴについて、成熟マウス小脳からのＩＲＢＩＴの精製、ｃＤＮＡクローニングおよび発現が特開２００４−１２９６１２号公報に記載されており、それらの開示を参照可能である。
【００６４】
ＩＲＢＩＴの生物学的活性は、ＩＲＢＩＴが、Ｓ−アデノシルホモシステインのアデノシンとホモシステインへの可逆的加水分解を触媒するＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼと相同性を有するため、類似のアッセイ法に基づいて測定することができる。このアッセイ法は、例えばＣ．−Ｓ． Ｙｕａｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１：２８００９−２８０１６）の方法に準ずることができる。簡単に説明すると、ＩＲＢＩＴ（約３μｇ）およびウサギＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（シグマ社）（約２．５μｇ）を用いて上記の加水分解反応を行ない、その生成産物（ホモシステイン）を５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（シグマ社）と反応させて得られる発色を、４１２ｎｍで分光光度計にて測定し吸光度を求めることを含む。
【００６５】
ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸
本発明において、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸には、ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡ、ＩＲＢＩＴをコードするｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡもしくはその断片、ＩＲＢＩＴをコードするｍＲＮＡの切断を可能にするリボザイム、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）などの機能的ＲＮＡ、あるいは、それらのＤＮＡもしくはＲＮＡ（実際的には、ＲＮＡをコードするＤＮＡ）を含むベクターＤＮＡが包含される。
【００６６】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡは、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡであり、上記の「ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）」の項で説明したような手法で作製することができる。好ましいＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡは、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡであり、さらに好ましいＤＮＡは、配列番号２または配列番号４に示される塩基配列からなるヒトまたはマウスＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡである。
【００６７】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡは、発現ベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）に挿入されて、細胞内でのＩＲＢＩＴの発現のために使用可能である。
【００６８】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを発現するためのプラスミドベクターは、ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡ配列及びプロモーターの他に、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）、ターミネーター、マルチプルクローニングサイト、複製開始点、リボソーム結合部位などの制御配列を含むことができる。
【００６９】
また、ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを発現するためのウイルスベクターは、たとえばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター（白血病ウイルスベクターなど）、ヘルペスウイルスベクターなどを使用することができる。ウイルスベクターは、ヒトに使用する際に疾病を引き起こさないように例えば自己複製能を欠損したタイプのものが好ましい。たとえばアデノウイルスベクターの場合には、Ｅ１遺伝子及びＥ３遺伝子を欠失した自己複製能欠損型アデノウイルスベクター（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＡｄｅｎｏ−Ｘ）を使用することができる。ウイルスベクターの構築は、文献記載の方法を利用することができる（米国特許第５２５２４７９号、国際公開ＷＯ９４／１３７８８など）。
【００７０】
プロモーターは、哺乳動物細胞内で外来ＤＮＡの発現が可能なプロモーターを使用することができる。プロモーターの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦプロモーターなどを含む。
【００７１】
プラスミドベクターは、例えばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン、正電荷コレステロールなどの正電荷リポソームと複合体を形成しカプセル化された状態で患者の体内に導入することができる（例えば、中西守ら，蛋白質核酸酵素，４４巻１１号，４８〜５４頁，１９９９年，共立出版、東京、日本；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：４３２５−４３３３，１９９９；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，２６２：４４２９）。また、ウイルスベクターは患部に導入し細胞感染させることによって細胞内に遺伝子導入することができる（Ｌ．Ｚｅｎｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３），１００：７７７９７−７８０２；Ｈ．Ｘｉａら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２），２０：１００６−１０１０；Ｘ．Ｆ．Ｑｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３），１００：１８３−１８８；Ｇ．Ｍ．Ｂａｒｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２），９９：１４９４３−１４９４５；Ｊ．Ｄ．Ｈｏｍｍｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．（２００３），９：１５３９−１５４４）。特にアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターは種々の細胞種に非常に高い効率で遺伝子導入可能であることが確認されている。このベクターはまた、ゲノム中に組み込まれることがないため、その効果は一過性であり安全性も他のウイルスベクターと比べて高いと考えられる。
【００７２】
さらに、ＩＲＢＩＴをコードするｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡもしくはその断片は、ＩＲＢＩＴ遺伝子のＩＲＢＩＴタンパク質への翻訳を阻害することが可能である。
【００７３】
前記断片は、ＩＲＢＩＴ遺伝子又はｍＲＮＡの配列において連続する約３０塩基以上、５０塩基以上、７０塩基以上、１００塩基以上、１５０塩基以上、２０塩基以上又は２５０塩基以上から全長以下の塩基数からなる配列を含むことができる。
【００７４】
アンチセンスＲＮＡもしくはその断片は、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）、メチル、カルボキシメチル又はチオ基などの修飾基を含むことができる。
【００７５】
上記アンチセンス核酸は、周知のＤＮＡ／ＲＮＡ合成技術又はＤＮＡ組換え技術を用いて合成することができる。ＤＮＡ組換え技術によって合成する場合、ＩＲＢＩＴの塩基配列を含むベクターＤＮＡを鋳型にして、増幅しようとする配列を挟み込むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って標的配列を増幅し、必要に応じてベクター中にクローニングして、アンチセンスＤＮＡを生成することができる。あるいは、このようにして得られた増幅標的配列を有するＤＮＡをベクターに挿入し、該ベクターを真核又は原核細胞に導入し、その転写系を利用してアンチセンスＲＮＡを得ることができる。
【００７６】
同様の阻害はまた、ＩＲＢＩＴをコードするｍＲＮＡの切断を可能にするリボザイム、ｓｉＲＮＡなどの機能的ＲＮＡによっても可能である。
【００７７】
ｓｉＲＮＡは、例えば配列番号２（ヒトＩＲＢＩＴ）または配列番号４（マウスＩＲＢＩＴ）の塩基配列によってコードされるｍＲＮＡ配列からの連続する約１８〜３０、好ましくは約１９〜２５、さらに好ましくは約２０〜２３ヌクレオチドのセンス鎖配列と、その相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むことができる。ここで、センス鎖配列とは、前記ｍＲＮＡの標的サイトと同一の塩基配列をいい、また、アンチセンス鎖配列とは、このセンス鎖配列に相補的な塩基配列をいう。センス鎖とアンチセンス鎖は互いに対合して二本鎖のｓｉＲＮＡを形成することができる。ｓｉＲＮＡはさらに、センス鎖およびアンチセンス鎖の各３’末端に１〜５個の塩基からなるオーバーハング、例えばＵＵを含むことができる。
【００７８】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列を選択するためには、例えば標的ＩＲＢＩＴ ｍＲＮＡの標的サイトの選択のための公知の知識、例えば、（ａ）ＧＣ含量が約３０〜７０％、好ましくは約５０％である、（ｂ）すべてのヌクレオチドが均等であり、またＧが連続していない、（ｃ）アンチセンス鎖の５'末端のヌクレオチドがＡ、Ｕである、などの基準を使用することができる（Ｄ．Ｍ．Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００３），７７：７１７４−７１８１；Ａ．Ｋｈｖｏｒｏｖａら，Ｃｅｌｌ（２００３），１１５：２０９−２１６）。また、ＲＮＡ二次構造予測プログラムであるｍｆｏｌｄを用いて上記ｓｉＲＮＡの標的サイトであるＩＲＢＩＴ ｍＲＮＡ上の候補遺伝子部位を推定することもできる（Ｊ．Ａ．Ｊａｅｇｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８９，１８３：２８１−３０６；Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９，２８８：９１１−９４０）。例えば、ｓｉＲＮＡが標的とすることができる配列は、上記の知見に基づいて推定し、実際にその効果を確認することによって決定することができる。本発明で使用可能なｓｉＲＮＡは、非限定的な例として以下の配列を挙げることができる。
IRBIT siRNA-1: AAAUCCAGUUUGCUGAUGACA(配列番号５)
IRBIT siRNA-2: AACUCAGAAUGAAGUAGCUGC(配列番号６)
【００７９】
ｓｉＲＮＡは、周知の化学合成技術を用いて合成することができる。例えば、慣用のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を使用して化学的に合成するか、あるいは、ｓｉＲＮＡ関連の受託合成会社（例えばフナコシ株式会社（東京、日本）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、Ａｍｂｉｏｎ社など）に合成を委託することによって入手可能である。
【００８０】
ｓｉＲＮＡを細胞または組織内に導入するときには、ｓｉＲＮＡを直接細胞または組織内に注入するか、又はｓｉＲＮＡの発現が可能なベクターを使用することが好ましい。あるいは、ｓｉＲＮＡ又はベクターを、リポソーム、例えばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソーム（例えば、正電荷コレステロール）、又はマイクロカプセル、と複合体形成し、これを使用することもできる（例えば、中西守ら，蛋白質核酸酵素，４４巻１１号，４８〜５４頁，１９９９年，共立出版、東京、日本；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：４３２５−４３３３，１９９９；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７,２６２：４４２９）。
【００８１】
ｓｉＲＮＡを発現するためのベクターでは、ｓｉＲＮＡまたはその前駆体をコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む。
【００８２】
発現ベクターの１つの例は、ヘアピン型ベクターである。このベクターは、前記センス鎖ＲＮＡ配列と前記アンチセンス鎖ＲＮＡ配列とが一本鎖ループ配列を介して共有結合されているヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡを含み、ここで該ＤＮＡは、細胞内で転写により該ヘアピン型ＲＮＡを形成し、ダイサーによりプロセシングされて前記ｓｉＲＮＡを形成するベクターである。ｓｉＲＮＡをコードするヘアピン型ＤＮＡの３'末端には、転写停止シグナル配列として、あるいはオーバーハングのために、１〜６個、好ましくは１〜５個のＴからなるポリＴ配列が連結される。ベクターＤＮＡから転写されたｓｉＲＮＡ前駆体としてのショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、そのアンチセンス鎖の３'末端に２〜４個のＵからなるオーバーハングを有することが望ましく、オーバーハングの存在によって、センス鎖ＲＮＡ及びアンチセンス鎖ＲＮＡはヌクレアーゼによる分解に対して安定性を増すことができる。ヒトには内在性のダイサーが１つ存在し、これが長鎖ｄｓＲＮＡや前駆体マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をそれぞれｓｉＲＮＡと成熟ｍｉＲＮＡに変換する役割をもつ。プロモーターの例は、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばヒトもしくはマウス由来のＵ６プロモーター又はＨ１プロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、或いはサイトメガロウイルスプロモーターである。
【００８３】
発現ベクターの別の例は、タンデム型ベクターである。このベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列とを連続して含み、かつ各鎖の５’末端にプロモーターが、また各鎖の３’末端にポリＴ配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含み、ここで該ＤＮＡは、細胞内で転写後に該センス鎖ＲＮＡと該アンチセンス鎖ＲＮＡとがハイブリダイズして前記ｓｉＲＮＡを形成するベクターである。
【００８４】
タンデム型ベクターにおけるプロモーターの例は、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばヒトもしくはマウス由来のＵ６プロモーター又はＨ１プロモーター、或いはサイトメガロウイルスプロモーターである。また、ポリＴ配列は、１〜６個、好ましくは１〜５個のＴからなるポリＴ配列である。タンデム型ベクターは、細胞内に導入されたのち、センス鎖とアンチセンス鎖に相当するＲＮＡに転写され、互いにハイブリダイズして目的のｓｉＲＮＡを生成することができる。
【００８５】
上記ヘアピン型及びタンデム型ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターである。プラスミドベクターは、後述の実施例に記載の手法又は文献記載の方法を用いて調製してもよいし、或いは市販のベクター系、たとえばｐｉＧＥＮＥＴＭＵ６系ベクター及びｐｉＧＥＮＥＴＭＨ１系ベクター（タカラバイオ株式会社、京都、日本）を利用することもできる（Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２），２９６：５５０−５５３；Ｎ．Ｓ．Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２），２０：５００−５０５；Ｍ．Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２），２０：４９７−５００；Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎら，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．（２００２），１６：９４８−９５８；Ｔ．Ｔｕｓｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００２），２０：４４６−４４８；Ｃ．Ｐ．Ｐａｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２），２０：５０５−５０８；多比良和誠ら編、ＲＮＡｉ実験プロトコル、羊土社（東京、日本）、２００３年）。
【００８６】
本発明の組成物の有効成分である別の核酸は、リボザイムである。リボザイムは、触媒活性をもつＲＮＡであり、本発明の標的ＩＲＢＩＴ遺伝子に対応するｍＲＮＡを切断する活性を有している。この切断によって該遺伝子の発現が阻害又は抑制される。
【００８７】
リボザイムの切断可能な標的配列は、一般にはＮＵＸ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ； Ｘ＝Ａ，Ｃ，Ｕ）、例えばＧＵＣトリプレットを含む配列であることが知られている。このようなリボザイムには、ハンマーヘッド型リボザイムが含まれる。ハンマーヘッド型リボザイムは、センサー部位を構成するヌクレオチド配列、センサー部位にＲＮＡが結合したときのみ安定にＭｇ２＋イオンを捕捉する空洞を形成しうる領域を含むヌクレオチド配列、及び標的ＲＮＡの切断部位周辺の配列に相補的である領域を含むヌクレオチド配列を含むことができる。
【００８８】
本発明のリボザイムを細胞内または患者体内に送達するために、リボザイムをリポソーム（好ましくは、正電荷リポソーム）に封入する（特開平９−２１６８２５号公報（１９９７年））、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターに組み込む（特表２００２−５４２８０５号公報）などの方法によってドラッグデリバリー系を構築することができる。
【００８９】
リボザイムは、それが発現可能なようにベクターに組み込むことができる。リボザイムを発現するためのプロモーターには、ｐｏｌ ＩＩ又はｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが含まれる。好ましいプロモーターは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば哺乳動物由来のｔＲＮＡプロモーター、より好ましくはｔＲＮＡＶａｌプロモーターである（Ｓ．Ｋｏｓｅｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：１８６８−１８７７，１９９９）。
【００９０】
抗体
ＩＲＢＩＴに対する抗体又はその断片もまた、上記生物学的機能の制御のために使用できる。
【００９１】
このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え型抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異抗体、合成抗体などが含まれる。
【００９２】
抗体のクラス、サブクラスは任意のタイプでよく、例えばＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＥ，ＩｇＤ，ＩｇＡ、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２などが含まれる。
【００９３】
抗体はまた、ペグ化、アセチル化、グリコシル化、アミド化などによって誘導体化されていてもよい。
【００９４】
ポリクローナル抗体の作製は、ＩＲＢＩＴを免疫原（約１μｇ〜１００μｇ）として、必要に応じてＦｒｅｕｎｄの完全もしくは不完全アジュバント、水酸化アルミニウム(ａｌｕｍ)、ムラミルジペプチド、リピドＡなどのアジュバントを含む油中水型乳濁液を、ウサギ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの非ヒト動物に皮内もしくは静脈内に免疫注射し、約２〜４週間後に、アジュバント非含有のＩＲＢＩＴを１〜２回注射し、ブーストを行う。試験的に採血し、抗体価が十分に上がったことを確認したあとで、動物から採血し、遠心分離により抗血清を回収する。必要に応じて、硫安分画、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーなどにより精製しＩｇＧを得ることができる。
【００９５】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ １９７５， ２５６：４９５−４９７）に準じて行うことができる。すなわち、ハイブリドーマは、免疫感作された動物から脾臓またはリンパ節を取り出し、それに含まれる抗体産生細胞と、マウス、ラット、モルモットなどの哺乳動物に由来のミエローマ細胞との細胞融合、ＨＡＴ選択によって得ることができる。細胞融合は、例えばポリエチレングリコール（例えば分子量１５００〜６０００）を用いて行うことができる。目的の抗体の産生は、ハイブリドーマの培養上清の免疫抗原に対する反応性を酵素免疫測定法、放射性免疫測定法、蛍光抗体法などの慣用の方法を用いて測定することができる。
【００９６】
また、ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の作製は、ハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養してその培養上清から単離してもよいし、あるいはマウス、ラット、モルモットなどの腹水等でｉｎ ｖｉｖｏで培養し、腹水から単離してもよい。
【００９７】
あるいは、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングしたのち、これをベクターに組み込み、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ）などに導入し、組換え型抗体を作製することもできる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓら，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）。
【００９８】
ヒト抗体は、例えばファージジスプレイライブラリー（ｐｈａｒｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）法（Ｔ．Ｃ．Ｔｈｏｍａｓら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１３８９−１４０１，１９９６）又はヒト抗体産生動物（例えばマウス、ウシなど）を用いる方法（Ｉ． Ｉｓｈｉｄａら，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：９１−１０２，２００２）によって製造できる。
【００９９】
例えば、ヒト抗体産生マウスは、ヒト人工染色体にヒト抗体産生遺伝子を含むヒト染色体断片を導入したのち、ミクロセル法を用いて例えばマウス胚性幹細胞ゲノムに人工染色体を組み込み、組換え胚性幹細胞を胚盤胞に注入し、仮親マウスの子宮に移植し、キメラマウスを出産し、雌雄のキメラマウス、またはキメラマウスと野生型マウス、の交配を通して、ヒト抗体遺伝子を含み、したがってヒト抗体の産生が可能である、ホモ接合型の子孫マウスを作出するなどの方法によって作製することができる（例えば、再表０２／０９２８１２号公報、国際公開ＷＯ ９８／２４８９３、ＷＯ ９６／３４０９６など）。このヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、本発明のＩＲＢＩＴタンパク質を抗原として免疫したのち、脾臓を摘出し、この脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを形成し、目的のモノクローナル抗体を選抜することができる。
【０１００】
ファージディスプレイライブラリー法は、未処置のヒトリンパ細胞から直接手に入れた免疫グロブリン遺伝子のライブラリーから、目的の抗体をコードするＤＮＡをスクリーニングし、このＤＮＡと、抗体鎖との間に、ファージ粒子を用いて物理的会合を確立し、これによって、標的に親和性をもつ抗体を提示するファージを親和性スクリーニングによって富化することを含む。この方法を用いて、標的に対する結合親和性をもつ抗体を、通常の手法によって大量に合成することができる（例えば、特表２００３−５２７８３２号公報）。
本発明の組成物は、疾患または障害の治療のために用いることができる。
【０１０１】
治療用組成物
本発明において、該疾患または障害とは、タンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝、および細胞内ｐＨの異常によって引起されるものである。
【０１０２】
タンパク質合成の場合、ＣＰＳＦに対するＩＲＢＩＴの結合に伴うタンパク質合成の制御が挙げられる。この場合、ＩＲＢＩＴはタンパク質合成を亢進し、ＩＲＢＩＴの働きを抑制する物質（上記の核酸または抗体）はタンパク質合成を抑制することができる。ＣＰＳＦが関与するタンパク質合成の異常には、例えば腫瘍がある。
【０１０３】
イノシトールリン脂質代謝の場合、ＰＩＰＫＩＩの異常な活性化に伴う疾患、例えば２型糖尿病が挙げられる。ＩＲＢＩＴはＰＩＰＫＩＩ活性を抑制する作用があるため、２型糖尿病の治療のために使用できる。
【０１０４】
細胞内ｐＨの場合、細胞内のｐＨの維持にｐＮＢＣ１が重要な働きをしているが、特にｐＨが酸性に傾くことによる疾患に、緑内障や白内障などの眼の疾患、低身長症、精神遅滞、膵臓炎などの疾患が含まれる。ＩＲＢＩＴは、ｐＮＢＣ１と結合し、細胞内ｐＨの正常な状態への調節を可能にする。
【０１０５】
本発明の組成物中の有効成分の含有量は、制限されないが、約１μｇ〜１００ｍｇである。その含有量は、有効成分の種類に応じて変化しうる。
【０１０６】
本発明の組成物中のＩＲＢＩＴの用量は、１投与単位あたり約１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約５０μｇ〜５００μｇであるが、この範囲に限定されない。
【０１０７】
本発明の組成物中の核酸の用量は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又はリボザイムに換算すると、以下のものに限定されないが、１投与単位あたり、約１ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜５０μＭである。
【０１０８】
本発明の組成物中の抗体又はその断片の用量は、以下のものに限定されないが、１投与単位あたり、約１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５〜７０ｍｇ／ｍｌである。
【０１０９】
しかし、上記の用量又は投与量は、患者の状態、年齢、性別、重篤度などに応じて変化しうるものであり、専門医の判断により用量又は投与量が決定されるべきである。
【０１１０】
本発明の組成物は、通常、製薬上許容可能な担体（すなわち、賦形剤又は希釈剤）、例えば滅菌された水、生理食塩水、緩衝液、非水性液体（例えば、アーモンド油、植物油、エタノールなど）などを含むことができる。該組成物にはさらに、製薬上許容可能な安定剤（例えばメチオニンなどのアミノ酸類）、保存剤（p-ヒドロキシ安息香酸メチル、ソルビン酸）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム）、乳化剤（例えばレシチン、アラビアガム）、懸濁化剤（例えばセルロース誘導体）などを含有させることができる。
好ましい医薬製剤は、溶液剤、懸濁液剤、乳剤などである。
【０１１１】
本発明の組成物の投与方法は、経口投与、非経口投与、例えば静脈内投与、局所投与などを含む。局所投与には、外科手術又は内視鏡下で患部に直接注射する方法などが含まれる。また、専門医が決定した治療計画に基づいて、一定の時間間隔、例えば１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年などの間隔で、患者に対して、本発明の組成物を１〜数回に分けて投与することができる。
【０１１２】
また、患者への抗体又はその断片の送達は、単独か又は例えばリポソーム（好ましくは、正電荷リポソーム）、マイクロカプセル又はナノ粒子中に抗体又はその断片を封入した形態で、通常は適当な担体（賦形剤又は希釈剤）と組み合わせて、経口経路、非経口経路（例えば、静脈内投与又は局所投与）にて行うことができる。
【０１１３】
本発明の組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｏｖｏで使用可能である。
【０１１４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、治療用物質のスクリーニングのために、本発明の組成物を利用することができる（下記参照）。
【０１１５】
ｅｘ ｖｏｖｏでは、一旦患者から生体外に取り出された細胞や組織を、本発明の有効成分で処理した後、体内に戻すことができる。これによって、タンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝または細胞内ｐＨの異常が生じた細胞や組織を正常に復することが可能となる。
【０１１６】
２．ＩＲＢＩＴの使用例
本発明はまた、ＩＲＢＩＴをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで使用する下記の方法を提供する。
【０１１７】
第１に、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のタンパク質合成の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
この方法は、ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦに結合してＣＰＳＦの機能を制御するという作用をもつことに基づく。
【０１１８】
第２に、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のイノシトールリン脂質代謝の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
この方法は、ＩＲＢＩＴがＰＩＰＫＩＩ活性を抑制するという作用をもつことに基づく。
【０１１９】
第３に、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内ｐＨの制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
この方法は、ＩＲＢＩＴがｐＮＢＣ１を活性化するという作用をもつことに基づく。また、ｐＮＢＣ１の活性化には、ＩＲＢＩＴのリン酸化が必要である。
【０１２０】
上記のとおりＩＲＢＩＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、細胞内でのタンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝または細胞内ｐＨの制御を可能にする物質のスクリーニングのために使用できるし、また、ｅｘ ｖｉｖｏでは、タンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝または細胞内ｐＨの異常が生じた細胞や組織を正常な状態に戻すために使用することができる。
【０１２１】
３．スクリーニング
本発明はさらに、候補物質の存在下で、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合を測定し、該結合を抑制または亢進する物質を同定することを含む、物質のスクリーニング方法を提供する。
【０１２２】
上記結合は、試験管内で、あるいは細胞（特に哺乳動物細胞）内で、候補物質の存在下でＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合を測定することができる。哺乳動物細胞には、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３などが含まれる。
【０１２３】
同定された物質は、例えば治療用または診断用として使用できる。特に、該物質は、細胞内のタンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝および細胞内ｐＨからなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能を制御するものである。
【０１２４】
上記結合を試験管内で実施するときには、例えば、適当なバッファ中に、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１とを存在させ、これに候補物質を加え、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合のレベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイッムノブロット法で検出することができる。この系は、上記結合を抑制または阻害する物質の検出に有効である。ＩＲＢＩＴ、ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１の組換えタンパク質の作製は、上記のＩＲＢＩＴの項で記載したと同様の手法で行うことができる。
【０１２５】
上記結合を細胞内で実施するときには、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１とを同時にまたは別個に発現させうるように、それぞれのタンパク質をコードするＤＮＡを同一のまたは異なるベクターに組込み、該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換またはトランスフェクションする。翻訳されたタンパク質は細胞内、特に細胞質に存在するように、好ましくは、ベクターＤＮＡは分泌シグナル配列を含まないようにするのがよい。
【０１２６】
ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１のアミノ酸および塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋや文献などから入手可能であり、それぞれ例えば（ＡＢ０９２５０４）、（ＡＦ０３０５５８、ＡＦ０３３３５５）、（ＮＭ＿００３７５９、ＮＭ＿０１８７６０）の登録番号が付与されている。ＩＲＢＩＴのアミノ酸および塩基配列については、上記のとおりである。
【０１２７】
発現ベクターは、好ましくは哺乳動物細胞で使用可能な任意のベクターである。ベクターは、プロモーター、エンハンサー、複製開始点、リボソーム結合部位、マルチクローニング部位、ターミネーター、ポリＡシグナルなどの制御配列を含むことができる。発現ベクターとしては、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１（ストラタジーン社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ ＳＶ４０（ファルマシア社）、ｐＨＭ６、ｐＶＭ６およびｐＸＭ（ロシュダイアグノスティック社）などの市販のベクターを適宜選択して使用することができる。
【０１２８】
プロモーターには、例えばＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦプロモーターなどが含まれる。
【０１２９】
ＩＲＢＩＴ、ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルス感染による方法などが含まれる（実験医学別冊４版松村正實ら編「新遺伝子工学ハンドブック」（２００３年）羊土社、東京、日本）。
【０１３０】
或いは、公知の手法により非ヒト動物の卵母細胞または胚性幹細胞を使用してＩＲＢＩＴ遺伝子を外来的にゲノムに組込み、強制的に発現可能にしたトランスジェニック非ヒト動物（例えばマウス）、ならびに、ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１遺伝子を外来的にゲノムに組込み、強制的に発現可能にしたトランスジェニック非ヒト動物（例えばマウス）をそれぞれ作製し、両動物を交配して、ＩＲＢＩＴ遺伝子と、ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１遺伝子とを発現可能にしたキメラ非ヒト動物およびその子孫を作製することができる。
【０１３１】
細胞内またはトランスジェニック非ヒト動物内で強制的に発現されたＩＲＢＩＴと、ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合が、細胞内または動物内に取り込んだ候補物質の存在下でどのように影響を受けるかを、該結合をプルダウン法、免疫沈降法などによって測定することによって調べる。同時に、ある特定のタンパク質の細胞内合成に及ぼす影響、イノシトールリン脂質代謝に及ぼす影響、細胞内のｐＨに及ぼす影響を調べる。
【０１３２】
タンパク質の細胞内合成に及ぼす影響は、例えば、特定のタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロット法などによって測定することができる。
【０１３３】
イノシトールリン脂質代謝に及ぼす影響は、例えば［３Ｈ］ラベル、あるいはＰＩＰ２結合タンパク質を用いたＰＩＰ２量定量などによって測定することができる。
【０１３４】
細胞内のｐＨに及ぼす影響は、例えば蛍光ｐＨ指示薬を用いた細胞内ｐＨ測定などによって測定することができる。
【０１３５】
候補物質は、有機小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）などを含むが、これらに限定されない。
【０１３６】
上で説明したように、ＩＲＢＩＴは、細胞内での代謝、ｐＨ変化、イオンバランス、リン脂質代謝の調節、タンパク質合成の制御、Ｃａ２＋放出の制御などを調節する上で大変重要な意義を全ての細胞で有している。ＩＲＢＩＴの濃度や発現パターンを制御することにより、上記の様々な生物学的機能を制御しうることが今回判明した。本発明のスクリーニング法で同定される物質は、このような制御のために有用である。
【実施例】
【０１３７】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されないものとする。
【０１３８】
＜実施例１＞
細胞質内ｐｏｌｙ（Ａ）付加反応へのＩＲＢＩＴの関与
ＣＰＳＦは、ＣＰＳＦ１６０、ＣＰＳＦ１００、ＣＰＳＦ７３およびＣＰＳＦ３０の４つのサブユニットからなる複合タンパク質群であるため、まず、この４つのサブユニットの内、どのサブユニットに結合するのかを明らかにするために、各サブユニットにｍｙｃタグを付けたｃＤＮＡを様々のコンビネーションで、ＩＲＢＩＴと共にＣＯＳ細胞等に発現し、ＩＲＢＩＴまたはＣＰＳＦを免疫沈降した時の共沈のされ方を調べた。
【０１３９】
ＣＰＳＦは、マウス由来のＣＰＳＦであり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０９２５０４の全長および４つの各サブユニットの塩基配列に基づき、ＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした（Ｈ． Ａｎｄｏら, ２００３，上記）。また、ＩＲＢＩＴは、マウス由来のＩＲＢＩＴであり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿１４５５４２の塩基配列に基づき、ＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした（Ｈ． Ａｎｄｏら, ２００３，上記）。
【０１４０】
ＣＰＳＦの全長または各サブユニットをコードするｃＤＮＡに、ｍｙｃタグをコードするＤＮＡを融合したＤＮＡを作製し、哺乳動物用ベクターに挿入した。一方、ＩＲＢＩＴをコードするｃＤＮＡもまた、同じベクターに挿入した。作製されたベクターを、ＣＯＳ細胞に形質転換し、上記ＤＮＡを共発現した。
【０１４１】
細胞を遠心分離によって分離し、細胞を溶解し、細胞質画分を回収し、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦとの結合を、抗ＩＲＢＩＴ抗体（特開２００４−１２９６１２号公報）および抗ｍｙｃ抗体を用いて検出した。
【０１４２】
その結果、ＩＲＢＩＴは、ＣＰＳＦ１６０サブユニットを介して、ＣＰＳＦと結合することが判明した（図１）。
【０１４３】
さらにまた、ＣＰＳＦ１６０の欠失変異体を使った同様の実験から、ＩＲＢＩＴはＣＰＳＦ１６０のｍＲＮＡ結合部位に結合することが判明した（図２）。
【０１４４】
ＣＰＳＦ１６０のｍＲＮＡ結合部位は、ＣＰＳＦがｐｏｌｙ（Ａ）を付加するｍＲＮＡを認識する際に必須の領域であることから、ＩＲＢＩＴがこの領域に結合することは、ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦ機能を阻害する可能性があり、これを確かめるために、精製蛋白質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成系で、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦとの結合、及びそれによるポリアデニレーション反応への影響を調べた。
【０１４５】
ＣＰＳＦは、ｍＲＮＡのポリアデニレーション反応に必須の分子であるが、それが働く場所は主に核の中であり、ＤＮＡから転写されたばかりのＲＮＡに対して、それがｍＲＮＡとなって核外へ出て行くまでの成熟反応の一つとして、働く。しかし例外的に、卵母細胞の成熟過程、あるいは、神経細胞の局所での新たなタンパク質合成といった局面では、細胞質でｍＲＮＡのポリアデニレーションに関与し、ｐｏｌｙ（Ａ）の長さを調節することで、目的分子のタンパク質合成を調節する（Ｄａｒｏｎ Ｃ． Ｂａｒｎａｒｄら，Ｃｅｌｌ ２００４，１１９：６４１−６５１）。この細胞質内ポリアデニレーション反応は、例外的現象であるが、卵母細胞の成熟、神経可塑性を成立させる上では、必須の現象となっている。ＩＲＢＩＴの細胞内分布を調べてみると、核内には殆ど存在しないことから、本発明者らは、ＩＲＢＩＴの細胞質内ポリアデニレーション反応への関与に焦点を絞って検討した。
【０１４６】
細胞質内ポリアデニレーション反応を調べる上で、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞の系が優れていることから、本発明者らは、先ず、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞からのＩＲＢＩＴ ｃＤＮＡのクローニングおよび単離を、定法に従って行った。Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞には、哺乳動物細胞とは異なり、３種類のＩＲＢＩＴ ｍＲＮＡが発現しており、この３種類とも、ＣＰＳＦ１６０と結合することが判明した。
【０１４７】
ＩＰ３受容体ｍＲＮＡの３'末端は、細胞質内ポリアデニレーション反応を受ける可能性のある配列を有しており、実際、小脳Ｐｕｒｋｉｎｊｅ細胞では、樹状突起内にこのｍＲＮＡが存在している。このことは、ＩＰ３受容体から放出されたＩＲＢＩＴがＣＰＳＦとの結合を介して、ＩＰ３受容体自身のタンパク質合成を制御している可能性を示している。
【０１４８】
さらに、本発明者らは、ＩＲＢＩＴが、ＰＡＰ及びＦｉｐ１（ＣＰＳＦのサブユニット）の存在下でのポリアデニレーション活性（Ｉ． Ｋａｕｆｍａｎｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．（２００４）２３：６１６−６２６）をさらに増大させる働きがあることを見出した。
【０１４９】
上記の結果から、ＩＲＢＩＴが、細胞内でＣＰＳＦとの結合を介して、タンパク質合成を制御していることが示された。
【０１５０】
＜実施例２＞
ＩＲＢＩＴとＰＩＰキナーゼＩＩ型（ＰＩＰＫＩＩ）との相互作用
本発明者らはさらに、ＩＲＢＩＴと相互作用する分子を探索した。
実施例１と同様の手順で、ＨＥＫ２９３細胞にＦＬＡＧ−ＩＲＢＩＴを過剰発現し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降してＩＲＢＩＴと共沈してくるタンパク質を、質量分析器で解析した。その結果、リン脂質リン酸化酵素であるｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ４−ｋｉｎａｓｅγ （ＰＩＰＫＩＩγ）が同定された。ＰＩＰＫＩＩファミリー（ＰＩＰＫＩＩα，ＰＩＰＫＩＩβ，ＰＩＰＫＩＩγ）はＰＩＰ２を合成する酵素であり、ＰＩＰ２の加水分解によりＩＰ３が産生されることを考えると、ＩＰ３受容体、ＩＲＢＩＴ、ＰＩＰＫＩＩγからなる情報伝達機構が存在する可能性が考えられる（図３）。
【０１５１】
さらに、次の実験を行い、同時にその結果も以下に示す。
（１）マウスＩＲＢＩＴとＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩα, β, γをＣＯＳ−７に過剰発現し、免疫沈降を行った。具体的には、Ｌｙｓｉｓバッファー（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１％Ｐ−４０，ｐＨ７．４）で細胞を可溶化し、遠心（２００００×ｇ，３０分）して上清を回収後、抗Ｍｙｃ抗体あるいは抗ＩＲＢＩＴ抗体を添加し、１時間反応させた。さらにプロテインＧセファロースを添加して１時間反応後、免疫複合体をＬｙｓｉｓバッファーで洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで溶出した。その後、抗Ｍｙｃ抗体あるいは抗ＩＲＢＩＴ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果、ＩＲＢＩＴはＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩα, β, γのいずれとも共沈した（図４）。
【０１５２】
（２）マウス小脳から抗ＩＲＢＩＴ抗体で免疫沈降を行ったところ、ＰＩＰＫＩＩαが共沈した（図５）。その結果から、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲＢＩＴとＰＩＰＫＩＩとの結合が確認された。
【０１５３】
（３）マウスＩＲＢＩＴとＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩγをＣＯＳ−７に過剰発現し、免疫染色を行った。具体的には、４％パラフォルムアルデヒドで固定、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で膜透過処理、２％ヤギ血清でブロッキング処理を行った後、マウス抗Ｍｙｃ抗体およびウサギ抗ＩＲＢＩＴ抗体を添加し、室温で１時間反応させた。Ａｌｅｘａ４８８結合抗マウスＩｇＧ抗体およびＡｌｅｘａ５９４結合抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として添加し、３７℃で４５分反応させた。その結果、ＩＲＢＩＴとＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩγのいずれも細胞質に局在することが判かった（図６）。
【０１５４】
（４）マウスＩＲＢＩＴの欠失変異体（配列番号３のアミノ酸配列における６０−５３０，７８−５３０，１０５−５３０，１−２７７，１−１０４，１−９０および１−７７）は対応する配列をＰＣＲで増幅し、ＧＦＰ融合タンパク発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングして作製し、これらの変異体の各々とＰＩＰＫＩＩαとの結合を調べたところ、ＩＲＢＩＴのＮ末端領域にあるセリンに富む領域が上記結合に重要であることが明らかになった（図７）。
【０１５５】
（５）マウスＩＲＢＩＴのセリンに富む領域の点突然変異体（配列番号３のアミノ酸配列におけるＴ５２Ａ，Ｔ５８Ａ，Ｓ６２Ａ，Ｓ６４Ａ，Ｓ６６Ａ，Ｓ６８Ａ，Ｓ７０Ａ，Ｓ７１Ａ，Ｔ７２Ａ，Ｓ７４Ａ，Ｓ７６Ｇ，Ｓ７７Ａ，Ｓ８０Ａ，Ｄ８３Ａ，Ｓ９０ＡおよびＴ９７Ａ）は、部位特異的変異体作成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作製し、これらの変異体の各々とＰＩＰＫＩＩαとの結合を調べた。その結果、ＩＲＢＩＴのＳｅｒ６８及びＳｅｒ７１が上記結合に重要であった（図８）。
【０１５６】
以上の結果より、ＩＲＢＩＴがＰＩＰＫＩＩファミリーに結合することが確認された。さらに予備的データから、ＩＲＢＩＴはＰＩＰＫＩＩ活性を抑制することを見いだしているため、ＩＲＢＩＴはイノシトールリン脂質代謝の活性制御をおこなっていると結論づけられた。
【０１５７】
＜実施例３＞
ＩＲＢＩＴによるＮＢＣ１ （Ｎａ／ＨＣＯ３ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）の活性化
本発明者らはさらに、ＩＲＢＩＴに結合する蛋白質として、細胞膜上でナトリウムイオンと重炭酸イオンの輸送を行うＮＢＣ１（ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）蛋白質を同定した。
【０１５８】
ＮＢＣ１には、ｐ型とｋ型の２つのスプライシング変異体が存在することが知られているが（Ｓｅｔｈ Ｌ．Ａｌｐｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２，６４：８９９−９２３）、ＩＲＢＩＴは、そのうちｐ型のＮＢＣ１（ｐＮＢＣ１という）と結合すること、また、ＩＲＢＩＴにおけるいくつかのセリン残基のリン酸化がｐＮＢＣ１との結合に必要であることが明らかになった。以下に、具体的に実験および結果を示す。
【０１５９】
（１）ｐＮＢＣ１におけるＩＲＢＩＴ結合領域の同定
ｐＮＢＣ１のｐ型特異的なＮ末端配列（１−８５アミノ酸）がＩＲＢＩＴとの結合に必要不可欠であった。この８５アミノ酸内に更なる欠失変異体を作製し、それら変異体とＩＲＢＩＴとの結合をプルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）を用いて検討した。具体的には、以下の実験を行った。
【０１６０】
ＣＯＳ−７細胞にＨＡ−ＩＲＢＩＴを過剰発現し、細胞抽出液を調製した。ＭＢＰ−ｐＮＢＣ１の欠失変異体のリコンビナントタンパク質を添加し、反応後、結合したタンパク質をａｍｙｌｏｓｅレジンでプルダウンした。ＨＡ−ＩＲＢＩＴを抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した。
【０１６１】
その結果、ｐ型特異的な配列のうちＮ末端６２アミノ酸があればＩＲＢＩＴと結合しうることが示された（図９、図１０）。しかしこの６２アミノ酸から更にＮ末側やＣ末側を削ると、ＩＲＢＩＴとの結合が見られなくなり、これ以上ＩＲＢＩＴ結合領域を狭めるのは難しいと考えられた。この結果からＩＲＢＩＴとの結合にはｐＮＢＣ１の特定の数アミノ酸の配列が関与しているのではなく、数十アミノ酸からなる三次元的な構造が必要である可能性が示唆された。
【０１６２】
（２）ＩＲＢＩＴにおけるｐＮＢＣ１結合領域の同定
次に、マウスＩＲＢＩＴ（全長５３０アミノ酸；配列番号３）の各種欠失変異体をＣＯＳ７細胞に発現させ、それぞれの変異体のｐＮＢＣ１結合能をプルダウンアッセイで調べた。具体的には、以下の実験を行った。
【０１６３】
ＣＯＳ−７細胞にＧＦＰ−ＩＲＢＩＴの欠失変異体を過剰発現し、細胞抽出液を調整した。ＭＢＰ−ｐＮＢＣ１（１−８５）のリコンビナントタンパク質を添加し、反応後、結合したタンパク質をａｍｙｌｏｓｅレジンでプルダウンした。ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴの欠失変異体を抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した。
【０１６４】
その結果を図１１に示す。図から、ＩＰ３受容体との結合が確認されているＩＲＢＩＴのＮ末側を発現する欠失変異体（１−１０４、１−２７７）ですらｐＮＢＣ１とは結合できないことがわかった。またＩＰ３受容体と結合できないことが既に確認されているＩＲＢＩＴのＣ末側を発現する欠失変異体（１０５−５３０）もまたｐＮＢＣ１とは結合できなかった。ｐＮＢＣ１との結合に必要であることが示されているセリンリン酸化部位は１−１０４に全て含まれることから、１−１０４の中に短いｐＮＢＣ１結合配列が存在するにも関わらず何らかの立体構造によってｐＮＢＣ１との結合が阻害されている可能性も考えられた。そこで、１−１０４を更に細かく欠失させた欠失変異体を作製しｐＮＢＣ１との結合を解析したが、いずれもｐＮＢＣ１との結合は見られなかった。
【０１６５】
以上の結果から、ＩＲＢＩＴのＮ末側とＣ末側を含む全体の構造がｐＮＢＣ１との結合に必要であることが明らかとなり、ＩＲＢＩＴのＮ末側だけで十分であるとされるＩＲＢＩＴとＩＰ３受容体との結合様式との違いが明らかとなった。
【０１６６】
（３）内在性ＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合
次に、内在性のＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合を、免疫沈降法を用いて確認する実験を行った。
【０１６７】
そもそもＮＢＣ１は小脳の膜画分におけるＩＲＢＩＴ結合蛋白質として同定されたので、まず小脳膜画分抽出液を用いて免疫沈降を行った。また小脳膜画分においてＩＲＢＩＴはＩＰ３受容体とも結合していることがわかっているので、ＮＢＣ１、ＩＲＢＩＴ、ＩＰ３受容体からなる三者複合体を形成しうるか否かを検討した。具体的には、以下の実験を行った。
【０１６８】
小脳膜画分を界面活性剤で可溶化後、抗ＩＲＢＩＴ抗体、抗ＮＢＣ抗体、あるいはコントロール抗体を添加して反応させた。さらにプロテインＧセファロースを添加して免疫複合体を抽出した。その後、抗ＩＲＢＩＴ抗体、抗ＮＢＣ抗体あるいは抗ＩＰ３Ｒ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【０１６９】
その結果、抗ＮＢＣ１抗体免疫沈降物中に内在性のＩＲＢＩＴが、また抗ＩＲＢＩＴ抗体免疫沈降物中に内在性のＮＢＣ１が、それぞれ含まれることがわかり、内在性のＩＲＢＩＴとＮＢＣ１が小脳膜画分で複合体を形成することが確認された（図１２）。一方で、既にＡｎｄｏら（２００３，上記）によって報告されているように、抗ＩＲＢＩＴ免疫沈降物中にはＩＰ３受容体が検出されたが、抗ＮＢＣ１沈降物中にはＩＰ３受容体が検出できなかった。この結果から、内在性ＮＢＣ１の多くがＩＲＢＩＴとＩＰ３受容体を含む三者複合体を形成していないことが示された。
【０１７０】
さらにＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合が普遍的であることを確認するために、ＣＯＳ７細胞の抽出液を用いて内在性のＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合を、先ほどと同様の免疫沈降法を用いて検討した。具体的には、以下の実験を行った。
【０１７１】
ＣＯＳ−７細胞の細胞抽出液に抗ＩＲＢＩＴ抗体、抗ＮＢＣ抗体、あるいはコントロール抗体を添加して反応させた。さらにプロテインＧセファロースを添加して免疫複合体を抽出した。その後、抗ＩＲＢＩＴ抗体あるいは抗ＮＢＣ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【０１７２】
その結果を図１３に示す。図から、小脳膜画分の抽出液を調製する時に用いたものと同じバッファーでＣＯＳ７細胞を抽出した場合、内在性のＩＲＢＩＴとＮＢＣ１の結合が検出されないことがわかった。しかし、このバッファーに２ｍＭ ＣａＣｌ２を加えて同様の実験を行ったところ、内在性のＩＲＢＩＴとＮＢＣ１の結合が検出された。このバッファーは既に２ｍＭのＥＤＴＡを含んでいることから、２ｍＭ ＣａＣｌ２を加えた時のカルシウムイオン濃度は数μＭであると考えられる。これらの結果から、内在性のＮＢＣ１とＩＲＢＩＴとの結合が小脳膜画分とＣＯＳ７細胞とでは異なった様式で制御されている可能性が示唆された。
【０１７３】
（４）ＩＲＢＩＴによるＮＢＣ１の活性化
アフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓｅ Ｏｏｃｙｔｅ）の培養細胞にマウスＩＲＢＩＴのｃＲＮＡとヒトｐＮＢＣ１またはｋＮＢＣ１のｃＲＮＡを同時注入し、膜電位を−２５ｍＶにし、ＮＤ９６溶液（９６ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）からＮＤ９６＋ＨＣＯ３−溶液に変えた時の電流変化を測定した。コントロールには、ＩＲＢＩＴ、ｐＮＢＣ１、ｋＮＢＣ１を使用した。
【０１７４】
その結果、ｐＮＢＣ１活性のみが、ＩＲＢＩＴの同時注入によって約６〜７倍増強された（図１４Ａ）。同様に、ＮＤ９６＋ＨＣＯ３−溶液中で膜電位を−１６０ｍＶから＋６０ｍＶの範囲で変化させたときにも、ｐＮＢＣ１活性のみが、ＩＲＢＩＴの同時注入によって顕著に増強された（図１４Ｂ）。
【０１７５】
さらにまた、ＩＲＢＩＴのリン酸化部位をアラニン（Ａ）に置換したＩＲＢＩＴ変異体（Ｓ６８Ａ，Ｓ７１Ａ，Ｓ７４ＡまたはＳ７７Ａ）を作製し、上記と同様に、アフリカツメガエル卵母細胞にＩＲＢＩＴ変異体のｃＲＮＡとヒトｐＮＢＣ１のｃＲＮＡを同時注入し、膜電位を−２５ｍＶにし、ＮＤ９６溶液からＮＤ９６＋ＨＣＯ３−溶液に変えた時の電流変化を測定した。
【０１７６】
その結果、リン酸化部位をアラニンに置換したすべてのＩＲＢＩＴ変異体において、ＩＲＢＩＴのｐＮＢＣ１活性への増強作用は消失した（図１５）。このことは、ＩＲＢＩＴのリン酸化がｐＮＢＣ１の活性化に必要であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】
本発明により、ＩＲＢＩＴは、細胞内での代謝、ｐＨ変化、イオンバランス、リン脂質代謝の調節、タンパク質合成の制御、Ｃａ２＋放出の制御などを調節する上で大変重要な意義を全ての細胞で有していることが判明した。ＩＲＢＩＴの濃度や発現パターンを制御することにより、このような様々な生物学的機能を制御しうる。ＩＲＢＩＴは、例えば脳神経系では脈絡叢（ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ）や神経細胞、グリア細胞で強く発現しており、脳神経系の機能制御にも貢献している。また、ＩＲＢＩＴは、細胞内のｐＨの維持に重要なｐＮＢＣ１の働き活性化して、特にｐＨが酸性に傾くことによる疾患、例えば緑内障や白内障などの眼の疾患、低身長症、精神遅滞、膵臓炎などの疾患の治療に有用である。さらにまた、ＩＲＢＩＴは、ＰＩＰＫＩＩの活性を抑制または阻害する働きがあるため、２型糖尿病の治療に使用することができる。このように、本発明により、ＩＲＢＩＴが標的とする３つのタンパク質が特定されたことによって、ＩＲＢＩＴおよびその抑制剤、亢進剤が、標的タンパク質が生体内で果たす生物学的機能の制御のために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１は、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ１６０との結合を示すウエスタンブロット図である。図中、Ｉ．Ｂ．はウエスタンブロッティングを表し、Ｉ．Ｐ．は免疫沈降を表わし、ＨＡはタグとしてのヘマグルチニンを表し、ｌｏａｄは細胞抽出液を表す。
【図２】図２は、ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦのＣＰＳＦ１６０サブユニットのｍＲＮＡ結合部位に結合することを示す模式図である。
【図３】図３は、ＩＰ３受容体、ＩＲＢＩＴ、ＰＩＰＫＩＩ、ＩＰ３が関与するイノシトールリン脂質代謝を示す模式図である。図中、ＰＬＣはホスホリパーゼＣを表す。
【図４】図４は、マウスＩＲＢＩＴとＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩα, β, γとの結合を示す。（Ａ）は抗Ｍｙｃ抗体による免疫沈降を示す。（Ｂ）は抗ＩＲＢＩＴ抗体による免疫沈降を示す。図中、ｉｎｐｕｔは細胞抽出液を表し、ＩＰは免疫沈降を表し、対照ＩｇＧ（陰性対照）はこれを用いて免疫沈降を行ったサンプルを表す。
【図５】図５は、マウス小脳のＰＩＰＫＩＩαが抗マウスＩＲＢＩＴ抗体と免疫沈降で共沈したことを示す。ｉｎｐｕｔは、図４と同じである。
【図６】図６は、ＩＲＢＩＴとＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩγがともに細胞質に局在することを示す。ＭｅｒｇｅはＰＩＰＫＩＩの染色像とＩＲＢＩＴの染色像の重ね合わせを示し、重なっている部分が黄色となる。
【図７】図７は、ＩＲＢＩＴ欠失変異体を用いて、ＰＩＰＫＩＩと結合するＩＲＢＩＴの結合部位の特定を示す。（Ａ）はＩＲＢＩＴの欠失変異体の模式図を示す。（Ｂ）はＩＲＢＩＴのＮ末端側からの欠失変異体とＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩαとの結合を示す。（Ｃ）はＩＲＢＩＴのＣ末端側からの欠失変異体とＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩαとの結合を示す。
【図８】図８は、ＩＲＢＩＴのＳｅｒ６８及びＳｅｒ７１がＰＩＰＫＩＩと結合することを示す。図中、ｉｎｐｕｔは細胞抽出液を表し、ＩＰは免疫沈降を表し、ＩＢはウエスタンブロッティングを表す。
【図９】図９Ａは、ＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合を示すウエスタンブロット図（上図）である。ｐＮＢＣ１（膵臓型）に特異的な部分を含む組換え型タンパク質２と５にのみＩＲＢＩＴ（黒三角）が結合する。各組換え型タンパク質（１、２、３、４、５、６または７）は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動図（図９Ａの下図）中、黒丸で示し、かつ、図９Ｂに、ｐＮＢＣ１およびｋＮＢＣ１（腎臓型）の構造とともに、それらの構造を模式的に示した。図中、ＭＢＰは精製のために用いたマルトース結合タンパク質タグを示す。また、ＣＢＢはクマシーブリリアントブルーを表す。
【図１０】図１０は、ＮＢＣ１の欠失変異体とＩＲＢＩＴとの結合能を示す。図１０Ａは、ｐＮＢＣ１の欠失変異体をそれぞれ大腸菌で発現精製し、ＣＯＳ７細胞に強制発現したＨＡ−ＩＲＢＩＴ（ここで、ＨＡはヘマグルチニンを表わす）との結合（または、相互作用）をプルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）で検討した結果を示す。また、図１０Ｂの上図は、プルダウンしたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥしＣＢＢで染色した結果を示す。図１０Ｂの下図は、プルダウンしたサンプルを抗ＨＡ抗体でウエスタンブロッティングした結果を示す。黒三角はＨＡ−ＩＲＢＩＴの泳動位置を、黒点は各欠失変異体タンパク質の泳動位置をそれぞれ示している。
【図１１】図１１は、ＩＲＢＩＴの欠失変異体とｐＮＢＣ１との結合能を示す。ＩＲＢＩＴの各種欠失変異体をＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）との融合タンパク質としてＣＯＳ７細胞に強制発現し、ｐＮＢＣ１との結合をプルダウンアッセイで検討した。図１１Ａ、図１１Ｂともに、それぞれの欠失変異体を発現した細胞抽出液（ｌｙｓａｔｅ）もしくはプルダウンサンプル（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥし抗ＧＦＰ抗体でウエスタンブロッティングした結果を示す。黒三角は各欠失変異体の泳動位置を示している。全長（ＦＬ）以外のＩＲＢＩＴがいずれもｐＮＢＣ１と結合しなくなっていることがわかる。
【図１２】図１２は、小脳膜画分における内在性ＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合を示す。小脳膜画分の抽出液から、コントロールとなる免疫前の抗体（対照）、抗ＮＢＣ１抗体、抗ＩＲＢＩＴ抗体でそれぞれ免疫沈降（ＩＰ）を行い、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥして、抗ＩＲＢＩＴ抗体、抗ＮＢＣ１抗体、抗ＩＰ３受容体抗体でウエスタンブロッティング（ＩＢ）を行った。黒三角はそれぞれのタンパク質の泳動位置を示している。
【図１３】図１３は、ＣＯＳ７細胞抽出液中の内在性ＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合を示す。ＣＯＳ７細胞の抽出液からコントロールとなる免疫前の抗体（対照）、抗ＩＲＢＩＴ抗体、抗ＮＢＣ１抗体でそれぞれ免疫沈降（ＩＰ）を行い、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥして、抗ＮＢＣ１抗体もしくは抗ＩＲＢＩＴ抗体でウエスタンブロッティング（ＩＢ）を行った。黒三角はそれぞれのタンパク質の泳動位置を示している。左三列はＣａＣｌ２非存在下で、右三列はＣａＣｌ２存在下でそれぞれ免疫沈降を行った沈降物を用いている。
【図１４】図１４は、電圧クランプ法によって測定された、ＩＲＢＩＴによるｐＮＢＣ１の活性化を示す。図１４Ａは、膜電位を−２５ｍＶに固定したときの電流値（μＡ）である。また、図１４Ｂは、膜電位を−１６０ｍＶ〜＋６０ｍＶの間で変化させたときの電流変化をＩ−Ｖ曲線で示した。
【図１５】図１５は、ＩＲＢＩＴのリン酸化がｐＮＢＣ１の活性化に必要であることを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞における生物学的機能を制御するための組成物および方法に関する。さらに具体的には、本発明は、ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）およびその細胞内標的分子が関与する該生物学的機能を制御するための組成物および方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、前記生物学的機能の制御を利用する物質のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
細胞膜上の受容体の活性化に伴いホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が加水分解されると、細胞内セカンドメッセンジャーであるイノシトール１，４，５−三リン酸（ｉｎｏｓｉｔｏｌ １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ＩＰ３））が生成する。ＩＰ３はＩＰ３受容体（ＩＰ３Ｒ）に結合することにより、細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ（主に小胞体）からのＣａ２＋放出を誘導する。このＩＰ３／Ｃａ２＋シグナル経路において、ＩＰ３受容体は、ＩＰ３のシグナルをＣａ２＋のシグナルへ変換する役割を担っている。
【０００４】
ＩＰ３受容体は、４量体の細胞内ＩＰ３誘導性Ｃａ２＋放出チャネル（ＩＰ３−ｇａｔｅｄ Ｃａ２＋ ｒｅｌｅａｓｅ ｃｈａｎｎｅｌ）である。哺乳動物では、３種の異なるＩＰ３受容体が存在する。ＩＰ３受容体タイプ１（ＩＰ３Ｒ１）は、中枢神経系、特に小脳において高発現している。マウスＩＰ３Ｒ１は、２７４９アミノ酸からなり、３つの機能的に異なる領域に分かれている。すなわち、Ｎ末端近傍にＩＰ３結合ドメイン、Ｃ末端近傍に６回膜貫通領域を有するチャネル形成ドメイン、およびこれら２つの領域の間に制御領域が存在する。ＩＰ３結合ドメインの欠失突然変異体解析より、ＩＰ３受容体のアミノ酸２２６〜５７８残基が特異的かつ高親和性のリガンド結合に必要な最小領域であることが示され、ＩＰ３結合コアと呼ばれている。
【０００５】
ＩＰ３受容体の活性化による細胞質Ｃａ２＋濃度の増加によって、多種多様な下流標的分子の活性が制御される。これら下流標的分子は、受精、発生、増殖、分泌、シナプス可塑性など多岐に渡る細胞応答において重要な役割を担っている。
【０００６】
本発明者らは、先に、新規のＩＰ３受容体結合タンパク質を見出し、ＩＲＢＩＴ（ＩＰ３Ｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｏｓｉｔｏｌ １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と命名した（特許文献１）。ＩＰ３受容体は、ヒト、マウスなどの哺乳動物の例えば脳、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、胸腺などの種々の組織や細胞に広く分布することから、ＩＲＢＩＴもそのような組織や細胞に存在すると推定される。ヒトおよびマウスＩＲＢＩＴのアミノ酸および塩基配列は、本発明者らによって決定された（非特許文献１、特許文献１）。これらのＩＲＢＩＴは５３０アミノ酸からなり、ヒトおよびマウス間の同一性は１００％である。ＩＰ３受容体との結合領域は、ＩＲＢＩＴのＮ末端領域（ヒトおよびマウスにおいて、アミノ酸１〜１０４）に存在する。
【０００７】
ＩＲＢＩＴは、（１）中性タンパク質である（推定ｐＩ値：６．４８）が、Ｎ末端領域は比較的酸性である（推定ｐＩ値：４．９８）、（２）Ｎ末端領域に複数のリン酸化部位が集中的に局在しており、リン酸化がＩＰ３Ｒ１との相互作用に必要であると推測される、（３）ＩＰ３Ｒ１のＩＰ３との結合に必須である５０８番目のリジン残基がＩＲＢＩＴとの相互作用においても必須である、（４）ＩＰ３によりＩＰ３Ｒ１との相互作用から解離する、および（５）高塩濃度により、ＩＰ３Ｒ１との相互作用から解離し、かつ粗ミクロソーム画分から抽出されることから、ＩＰ３Ｒ１との相互作用は静電気的結合によると推測される、などの特徴を有する（特許文献１）。
【０００８】
ＩＲＢＩＴは、ＩＰ３受容体のＩＰ３結合領域に結合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＰ３によりＩＰ３受容体から解離するという性質をもつ。このため、ＩＲＢＩＴは、ＩＰ３受容体のＩＰ３結合を抑制することにより、ＩＰ３受容体の活性を抑制する機能をもつことも明らかになっている（特許文献１）。
【０００９】
本発明者らは、今回、以下に説明するように、ＩＲＢＩＴの標的分子を明らかにし、さらにＩＲＢＩＴが三次メッセンジャーとして重要な生物学的機能をもつことを明らかにした。
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−１２９６１２
【非特許文献１】Ｈ． Ａｎｄｏら,Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：１０６０２−１０６１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＩＲＢＩＴとその分子標的との相互作用を利用して細胞内の生物学的機能の制御を可能にする組成物および方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、細胞内においてＩＲＢＩＴとその分子標的との間の結合を抑制または亢進することによって、前記生物学的機能の制御を可能にする物質のスクリーニング方法を提供することである。
【００１３】
本発明者らは、今回、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ＩＲＢＩＴの標的が、タンパク質合成を制御する分子、イノシトールリン脂質を制御する分子、および細胞内のｐＨを制御する分子であることを見出した。また、ＩＲＢＩＴが、細胞内代謝を制御する重要な分子の１つとして、今回見出された３種類の標的分子と結合して該標的分子の働きを制御する三次メッセンジャーとしての役割を有することを証明している。
【００１４】
発明の概要
したがって、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、 ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体を含む組成物であって、
（１）タンパク質合成、
（２）イノシトールリン脂質代謝、および
（３）細胞内ｐＨ、
からなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能の制御のための上記組成物を提供する。
【００１５】
一の実施形態において、前記タンパク質合成が、切断／ポリアデニレーション特異性因子（ＣＰＳＦ）による細胞質のｍＲＮＡポリアデニレーションが関与するものである。
【００１６】
別の実施形態において、前記イノシトールリン脂質代謝が、細胞内でのＰＩＰ２合成酵素（ＰＩＰＫＩＩ）が関与するものである。
【００１７】
別の実施形態において、前記細胞内ｐＨが、細胞内でのｐ型Ｎａ／ＨＣＯ３共トランスポーター１（ｐＮＢＣ１）が関与するものである。
【００１８】
別の実施形態において、前記制御が、抑制または亢進である。
別の実施形態において、前記ＩＲＢＩＴが、ヒトまたはマウス由来のものである。
【００１９】
別の実施形態において、前記ＩＲＢＩＴが、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつＩＲＢＩＴと同等の生物学的活性を有するタンパク質である。
【００２０】
別の実施形態において、前記組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで使用されるものである。
別の実施形態において、前記組成物が、疾患の治療用である。
【００２１】
本発明はまた、第２の態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のタンパク質合成の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
【００２２】
その実施形態において、前記ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦに結合しＣＰＳＦの機能を制御する。
【００２３】
本発明はまた、第３の態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のイノシトールリン脂質代謝の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
その実施形態において、前記ＩＲＢＩＴがＰＩＰＫＩＩ活性を抑制する。
【００２４】
本発明はまた、第４の態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内ｐＨの制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
【００２５】
その一の実施形態において、前記ＩＲＢＩＴがｐＮＢＣ１を活性化する。
別の実施形態において、前記ｐＮＢＣ１の活性化が前記ＩＲＢＩＴのリン酸化を必要とする。
【００２６】
本発明はまた、第５の態様において、候補物質の存在下で、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合を測定し、該結合を抑制または亢進する物質を同定することを含む、物質のスクリーニング方法を提供する。
【００２７】
その実施形態において、前記物質が治療用または診断用である。
別の実施形態において、前記結合が哺乳動物細胞内で行われる。
【００２８】
さらに別の実施形態において、前記物質が、細胞内のタンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝および細胞内ｐＨからなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能を制御するものである。
【００２９】
定義
本明細書中で使用する「ＩＲＢＩＴ」なる用語は、哺乳動物由来のＩＰ３受容体結合タンパク質であり、該受容体のＩＰ３結合部位に結合しており、ＩＰ３の該受容体への結合とともに細胞質に放出されるタンパク質である。本発明では、ＩＲＢＩＴは、ＣＰＳＦ（ｃｌｅａｖａｇｅ／ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＩＰＫＩＩ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ４−ｋｉｎａｓｅ）、またはｐＮＢＣ１（ｐａｎｃｒｅａｓ ｔｙｐｅ Ｎａ／ＨＣＯ３ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）と結合するが、これらのＩＲＢＩＴ標的タンパク質はＩＲＢＩＴとの結合を介してそれぞれタンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝、細胞内ｐＨの維持に関与する重要な生物学的機能を細胞内で果たしている。したがって、ＩＲＢＩＴは、これらの生物学的機能の制御を担っている。
【００３０】
本明細書で使用する「タンパク質合成」なる用語は、細胞内での遺伝子の転写と翻訳の一連の過程をいい、本発明では、細胞質でのｍＲＮＡポリアデニレーションの制御が関与する。また、イノシトールリン脂質代謝は、ＩＰ３を含むリン脂質の代謝を指す。
【００３１】
本明細書で使用する「抑制」なる用語は、上記生物学的機能の減少、低下または阻害をいう。
【００３２】
本明細書で使用する「亢進」なる用語は、上記生物学的機能の増加、上昇または増進をいう。
【００３３】
本明細書で使用する「ｅｘ ｖｉｖｏ」なる用語は、一旦生体外に取り出された細胞や組織を本発明の組成物で処理した後、生体内に戻すことをいう。
【００３４】
本明細書で使用する「患者」なる用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜動物（例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）などの哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の組成物および方法は、ＩＲＢＩＴが、哺乳動物細胞内でＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合を介してそれぞれ、タンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝、または細胞内ｐＨの維持に関与しているため、このような生物学的機能を制御するＩＲＢＩＴ、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体は、該機能の異常に伴う疾患の治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
１．組成物
本発明は、第１の態様により、ＩＲＢＩＴ、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、（１）タンパク質合成、（２）イノシトールリン脂質代謝、および（３）細胞内ｐＨからなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能の制御のために使用される。
以下に、上記３つの生物学的機能の制御について説明する。
【００３７】
タンパク質合成の制御
本発明において、前記タンパク質合成の制御は、細胞内でのＩＲＢＩＴとＣＰＳＦとの結合を介するｍＲＮＡポリアデニレーションの制御である。
【００３８】
ＣＰＳＦは、ＣＰＳＦ１６０、ＣＰＳＦ１００、ＣＰＳＦ７３およびＣＰＳＦ３０の４つのサブユニットからなる複合タンパク質である。本発明者らは、今回、ＣＯＳ細胞での共発現と免疫沈降による共沈試験から、ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦ、特にＣＰＳＦ１６０に結合することを見出した（図１）。
【００３９】
ＣＰＳＦは、核内でのｍＲＮＡのポリアデニレーション反応に必須の分子であるが、細胞質でポリ（Ａ）の長さを伸長することによるタンパク質合成を調節する働きを有すること、また、ＣＰＳＦ１６０のｍＲＮＡ結合部位は、ＣＰＳＦがポリ（Ａ）を付加するｍＲＮＡを認識する際に必須の領域であること、などが知られている（Ｃ． Ｂａｒｎａｒｄ Ｄａｒｏｎら，Ｃｅｌｌ ２００４，１１９：６４１−６５１、およびＥ． Ｋｌａｎｎら， “Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ”， Ｌｅａｒｎｉｎｇ ＆ Ｍｅｍｏｒｙ ２００４， １１：３６５−３７２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。具体的には、Ｅ． Ｋｌａｎｎら（上記）の「細胞質ポリアデニレーションとＣＰＥＢ」（３６７〜３６８頁）の項には、ポリアデニレーションは、ｍＲＮＡの３'非翻訳領域中の２つの配列、すなわち細胞質ポリアデニル化要素（ＣＰＥ）およびＡＡＵＡＡＡ、によって調節されており、ポリアデニレーションの重要な調節タンパク質であるＣＰＥ結合タンパク質（ＣＰＥＢ）が、特定のプロテインキナーゼ（Ａｕｒｏｒａ）によってリン酸化されるが、該キナーゼが、ＣＰＥＢを誘導して該ＡＡＵＡＡＡ配列上のＣＰＳＦとＣＰＥＢが相互作用することによって、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）を救済しｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部を伸長させることが記載されている。
【００４０】
上記の知見を考慮すると、ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦ１６０のｍＲＮＡ結合部位に結合することによって、ＣＰＳＦの機能が制御されると考えられる（図２）。
【００４１】
さらにまた、本発明者らは今回、ＩＲＢＩＴが、ＰＡＰ及びＦｉｐ１（ＣＰＳＦのサブユニット）の存在下でのポリアデニレーション活性（Ｉ． Ｋａｕｆｍａｎｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．（２００４）２３：６１６−６２６）をさらに増大させる働きがあるという知見を得た。この知見から、ＩＲＢＩＴを抑制することによってタンパク質合成を抑制することが可能になる。
【００４２】
このように、ＩＲＢＩＴは、ＣＰＳＦとの結合を介して、ｍＲＮＡポリアデニレーションの制御、したがってタンパク質合成の制御に関わっている。
【００４３】
したがって、ＩＲＢＩＴ、あるいはその生成および機能を抑制または亢進する物質は、ＣＰＳＦが関連するタンパク質合成の制御を可能にする。
【００４４】
イノシトールリン脂質代謝の制御
ＩＲＢＩＴはまた、ＰＩＰＫＩＩと結合して、該酵素の活性を抑制する（実施例２）。
ＰＩＰＫＩＩは、ホスファチジルイノシトール５リン酸（ＰＩ（５）Ｐ）からホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２）を合成する酵素であり、さらにＰＩＰ２の加水分解によりＩＰ３が産生される。ＩＰ３は、ＩＰ３受容体のリガンドであり、該受容体に結合することによって、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）とＩＲＢＩＴがともに細胞質内に放出されるという事実を考慮すると、ＩＲＢＩＴは、イノシトールリン脂質代謝の制御に関わっているということができる(Ｋａｔｊａ Ａ． Ｌａｍｉａら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４，２４：５０８０−５０８７)。
【００４５】
したがって、ＩＲＢＩＴ、あるいはその生成および機能を抑制または亢進する物質は、ＰＩＰＫＩＩが関係するイノシトールリン脂質代謝の制御を可能にする（図３）。
【００４６】
例えば、ＰＩＰＫＩＩは、哺乳動物において、ＰＩＰＫＩＩα、βおよびγの３種類のイソフォームを含むが、ＩＲＢＩＴはそのいずれの酵素にも結合する。特にＰＩＰＫＩＩβについては、その酵素をノックアウトしたトランスジェニックマウスが高いインスリン感受性をもつことから、該酵素の阻害が２型糖尿病の治療に有用であることが示されている（Ｋａｔｊａ Ａ． Ｌａｍｉａら，上記）。ＩＲＢＩＴがＰＩＰＫＩＩ活性を抑制するという、本発明者らによる知見は、ＩＲＢＩＴが２型糖尿病の治療に使用しうることを示している。
【００４７】
細胞内ｐＨの制御
ＩＲＢＩＴはさらに、ｐＮＢＣ１に結合し、それを活性化する。
具体的には、アフリカツメガエル卵母細胞にＩＲＢＩＴのｃＲＮＡとＮＢＣ１のｃＲＮＡを注入することにより細胞内ｐＨ変化で検出するｐＮＢＣ１の応答が、約６〜７倍高い応答が得られた（図１４）。この結果は、ＩＲＢＩＴがｐＮＢＣ１活性を顕著に増強することを示した。
【００４８】
ＮＢＣ１は、細胞膜上に存在する１０回膜貫通型タンパク質であり、ナトリウムイオンと重炭酸イオンとを一定の割合で細胞膜を横切って同じ方向に運ぶ働きをする。生体内のｐＨは重炭酸イオンと炭酸ガスとの濃度バランスによって巧妙に調節されているので、ＮＢＣ１は生体内のｐＨの調節に関与していると考えられる(Ｅ． ＧｒｏｓｓとＩ． Ｋｕｒｔｚ，Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００２，２８３：Ｆ８７６−Ｆ８８７)。特に、血液のｐＨが酸性に傾く酸血症の一種である近位尿細管型アシドーシスの原因遺伝子としてＮＢＣ１が同定されたことは、ＮＢＣ１による重炭酸イオンの輸送が生体内のｐＨの維持に欠くことのできない役割を果たしていることを示している。
【００４９】
ＮＢＣ１には、これまでに腎臓型（ｋｉｄｎｅｙ ｔｙｐｅ：ｋＮＢＣ１）と膵臓型（ｐａｎｃｒｅａｓ ｔｙｐｅ：ｐＮＢＣ１）の２つのスプライシング変異体が報告されており、ｋＮＢＣ１は主に腎臓に、ｐＮＢＣ１は膵臓を中心として脳神経系を含めた比較的多くの組織に、それぞれ発現している。本発明者らはＩＲＢＩＴがどちらのＮＢＣ１のどの部分と結合するのか明らかにするために、ＮＢＣ１の細胞質領域を大腸菌に組換え型タンパク質として発現させて精製し、培養細胞に強制発現したＩＲＢＩＴとの結合をプルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）アッセイで検討した。その結果、ＩＲＢＩＴはｐＮＢＣ１に特異的なＮ末側８５アミノ酸と特異的かつ強力に結合することがわかった（図１０）。更に特定の塩の濃度変化によってＩＲＢＩＴとｐＮＢＣ１の結合が制御されていることもわかった。
【００５０】
これらの結果は、種々の臓器におけるｐＮＢＣ１によるｐＨ調節をＩＲＢＩＴが細胞内の状況依存的に制御している可能性を強く示唆している。また、近位尿細管型アシドーシス患者は緑内障や白内障といった眼の疾患、低身長、精神遅滞、膵臓炎といった様々な症状を呈することから、ＮＢＣ１によるｐＨの調節が腎臓以外の臓器でも重要な役割を果たしていると考えられる。それゆえ、ＩＲＢＩＴは、ｐＮＢＣ１を介して緑内障や白内障などの眼の疾患、低身長、精神遅滞、膵臓炎などの疾患の治療法としても有用である（Ｓｅｔｈ Ｌ． Ａｌｐｅｒ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００２，６４：８９９−９２３）。
【００５１】
したがって、ＩＲＢＩＴ、あるいはその生成および機能を抑制または亢進する物質は、ｐＮＢＣ１が関係する細胞内ｐＨの制御を可能にする。
【００５２】
ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）
本発明で使用するＩＲＢＩＴは、哺乳動物由来のものである。ＩＲＢＩＴは、哺乳動物の脳、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、胸腺などの組織の細胞内小胞体に存在していることが知られている（特開２００４−１２９６１２号公報）。好ましいＩＲＢＩＴの例は、ヒトＩＲＢＩＴおよびマウスＩＲＢＩＴである（特開２００４−１２９６１２号公報、Ｈ． Ａｎｄｏら,Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：１０６０２−１０６１２）。特にヒトＩＲＢＩＴが好ましい。ヒトおよびマウスＩＲＢＩＴのアミノ酸および塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれＮＭ＿００６６２１（配列番号１、２参照）およびＮＭ＿１４５５４２（配列番号３、４参照）として登録されている。
【００５３】
また、好ましいＩＲＢＩＴの別の例は、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、もっとも好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつＩＲＢＩＴと同等の生物学的活性を有するタンパク質である。ここで、生物学的活性は、Ｓ−アデノシルホモシステインのアデノシンとホモシステインへの可逆的加水分解を触媒するＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ様活性に加えて、タンパク質合成におけるＣＰＳＦとの結合を介するｍＲＮＡポリアデニレーションの制御、ＰＩＰＫＩＩとの結合を介するイノシトールリン脂質代謝の制御、およびｐＮＢＣ１との結合を介する細胞内ｐＨの制御を含む生物学的機能の制御に関わる活性をいう。
【００５４】
同様に、好ましいＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡの例は、配列番号２または配列番号４に示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、もっとも好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡ、あるいは、ストリンジェントな条件下で該配列番号２または配列番号４の塩基配列とハイブリダイズ可能なＤＮＡである。ここで、ストリンジェントな条件とは、以下のものに限定されないが、約４５〜５０℃で２〜６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、約５０〜６５℃での０．２〜２×ＳＳＣ／０．１〜１％ＳＤＳによる洗浄からなるか、あるいは６０〜６５℃で６×ＳＳＣ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションののち、６０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄からなる（例えば、Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （３版） Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９５年， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．)。
【００５５】
他の哺乳動物由来のＩＲＢＩＴもまた、本発明において使用可能である。そのようなＩＲＢＩＴは、例えばラット、ハムスター、ウサギなどの実験動物のＩＲＢＩＴ、イヌ、ネコなどのペット動物のＩＲＢＩＴ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物のＩＲＢＩＴなどを含む。これらのＩＲＢＩＴの作製については、文献、データバンク等に記載のアミノ酸または塩基配列に基づいて、あるいはヒトまたはマウスＩＲＢＩＴの公知の配列に基づいて、プローブおよび／またはプライマーを作製し、ＤＮＡクローニング法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの慣用の手法によって、例えば市販のまたは調製された動物組織からのライブラリーを用いて、ＩＲＢＩＴ ｃＤＮＡをクローン化および／または増幅し、さらに、得られたＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを、適当な制御配列を有する例えば市販の発現ベクター（例えばプラスミド）に組み込み、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクションし、得られた細胞を、適当な培地にて培養してＩＲＢＩＴ ＤＮＡを発現させ、生成したＩＲＢＩＴタンパク質を回収することができる。これらの一連の手法については、例えばＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８９年， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （３版） Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９５年， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、実験医学別冊４版松村正實ら編「新遺伝子工学ハンドブック」（２００３年）羊土社、東京、日本などに記載されており、ここに記載されるような手法に従って、種々の哺乳動物由来のＩＲＢＩＴホモログを得ることが可能である。
【００５６】
ＩＲＢＩＴ遺伝子を含む哺乳動物組織をホモゲナイザーを用いて均質化し、約１０,０００ｒｐｍで遠心分離して上清を得た後、例えばグアニジン・酸性フェノール法で全ＲＮＡを回収し、定法に従いｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡからＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを得ることができる。ＲＮＡの抽出のためのキット、例えば日本ジーン社のＩＳＯＧＥＮ（商標)、が市販されているので、それを利用してもよい。
【００５７】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを検出するためのプローブのサイズは、通常３０塩基以上、好ましくは５０〜１００塩基またはそれ以上である。プローブには、通常、蛍光標識（例えばフルオレサミン、ローダミンまたはそれらの誘導体）、放射性同位元素標識（例えば３２Ｐ）などの標識を結合し、これによって目的のＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡとプローブとの結合を検出することができる。
【００５８】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーのサイズは、通常１５〜３０塩基、好ましくは２０〜２５塩基である。プライマーは、ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の３'末端側に相補的な配列を有しているべきである。しかし、増幅すべきＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡの配列が不明の場合には、公知のＩＲＢＩＴ配列に基づいて複数のプライマーを準備し、ＰＣＲによって鋳型ＤＮＡを増幅し、さらに、増幅された鋳型ＤＮＡに基づいて正式のプライマーを作製し、ＰＣＲによって目的の鋳型ＤＮＡを増幅することができる。
【００５９】
ＰＣＲは、一般に、ＤＮＡの変性、プライマーのアニーリングおよび伸長反応を１サイクルとして約２０〜４０サイクル行うことからなる。ＤＮＡの変性は、二本鎖ＤＮＡを一本鎖のＤＮＡに解離するための工程であり、通常９４℃で約１５秒〜１分の処理を行う。プライマーのアニーリングは、プライマーと、相補的な一本鎖鋳型ＤＮＡとを対合させる工程である。アニーリングに至適な温度や時間はプライマーの塩基配列や長さに依存するが、通常約５５〜６０℃で約３０秒〜１分の処理を行う。伸長反応は、４種類のｄＮＴＰと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で鋳型ＤＮＡを伸長する工程であり、通常７２℃で約３０秒〜１０分の処理を行う。サイクルを開始する前に、９４℃で約１〜５分加熱し完全にＤＮＡを変性することもできる。また、全サイクルの終了後に、７２℃で約１〜５分の加熱処理を行うこともできる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、市販されており、例えばＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｓ（Ｔａｑ）ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、パーキンエルマー、ファルマシアなどから販売）を使用することができる。ＰＣＲの手法については、例えば蛋白質核酸酵素「ＰＣＲ法最前線 基礎技術から応用まで」第４１巻第５号１９９６年４月増刊号、共立出版、東京、日本を参照することができる。
【００６０】
発現ベクターは、原核生物または真核生物由来の細胞で使用可能な任意のベクターである。ベクターは、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位、マルチクローニング部位、ターミネーターなどの制御配列を含むことができる。発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスなどのベクター、特に市販のベクター、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ−１（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＧ−１およびｐＸＴ１（ストラタジーン社）、ｐＭＡＬおよびｐＴＹＢシリーズ（第一化学薬品）、ｐＱＥシリーズ（キアゲン社）、ｐＥＴシリーズ（ノバジェン社）、ｐＳＶＫ３およびｐＳＶＬ ＳＶ４０（ファルマシア社）、ｐｃＤＮＡ１およびｐｃＤＭ８（フナコシ）、ｐＨＢ６、ｐＶＢ６、ｐＨＭ６、ｐＶＭ６およびｐＸＭ（ロシュダイアグノスティック社）などを適宜選択して使用することができる。
【００６１】
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属、枯草菌などのバチルス属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属などの細菌類、サッカロマイセス属、ピチア属、シゾサッカロマイセス属などの酵母類、昆虫細胞、植物細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３などの哺乳動物細胞などを挙げることができる。
【００６２】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルス感染による方法などが含まれる（実験医学別冊４版松村正實ら編「新遺伝子工学ハンドブック」（２００３年）羊土社、東京、日本）。
【００６３】
より具体的には、マウスＩＲＢＩＴについて、成熟マウス小脳からのＩＲＢＩＴの精製、ｃＤＮＡクローニングおよび発現が特開２００４−１２９６１２号公報に記載されており、それらの開示を参照可能である。
【００６４】
ＩＲＢＩＴの生物学的活性は、ＩＲＢＩＴが、Ｓ−アデノシルホモシステインのアデノシンとホモシステインへの可逆的加水分解を触媒するＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼと相同性を有するため、類似のアッセイ法に基づいて測定することができる。このアッセイ法は、例えばＣ．−Ｓ． Ｙｕａｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１：２８００９−２８０１６）の方法に準ずることができる。簡単に説明すると、ＩＲＢＩＴ（約３μｇ）およびウサギＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（シグマ社）（約２．５μｇ）を用いて上記の加水分解反応を行ない、その生成産物（ホモシステイン）を５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（シグマ社）と反応させて得られる発色を、４１２ｎｍで分光光度計にて測定し吸光度を求めることを含む。
【００６５】
ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸
本発明において、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸には、ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡ、ＩＲＢＩＴをコードするｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡもしくはその断片、ＩＲＢＩＴをコードするｍＲＮＡの切断を可能にするリボザイム、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）などの機能的ＲＮＡ、あるいは、それらのＤＮＡもしくはＲＮＡ（実際的には、ＲＮＡをコードするＤＮＡ）を含むベクターＤＮＡが包含される。
【００６６】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡは、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡであり、上記の「ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）」の項で説明したような手法で作製することができる。好ましいＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡは、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡであり、さらに好ましいＤＮＡは、配列番号２または配列番号４に示される塩基配列からなるヒトまたはマウスＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡである。
【００６７】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡは、発現ベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）に挿入されて、細胞内でのＩＲＢＩＴの発現のために使用可能である。
【００６８】
ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを発現するためのプラスミドベクターは、ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡ配列及びプロモーターの他に、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）、ターミネーター、マルチプルクローニングサイト、複製開始点、リボソーム結合部位などの制御配列を含むことができる。
【００６９】
また、ＩＲＢＩＴをコードするＤＮＡを発現するためのウイルスベクターは、たとえばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター（白血病ウイルスベクターなど）、ヘルペスウイルスベクターなどを使用することができる。ウイルスベクターは、ヒトに使用する際に疾病を引き起こさないように例えば自己複製能を欠損したタイプのものが好ましい。たとえばアデノウイルスベクターの場合には、Ｅ１遺伝子及びＥ３遺伝子を欠失した自己複製能欠損型アデノウイルスベクター（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＡｄｅｎｏ−Ｘ）を使用することができる。ウイルスベクターの構築は、文献記載の方法を利用することができる（米国特許第５２５２４７９号、国際公開ＷＯ９４／１３７８８など）。
【００７０】
プロモーターは、哺乳動物細胞内で外来ＤＮＡの発現が可能なプロモーターを使用することができる。プロモーターの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦプロモーターなどを含む。
【００７１】
プラスミドベクターは、例えばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン、正電荷コレステロールなどの正電荷リポソームと複合体を形成しカプセル化された状態で患者の体内に導入することができる（例えば、中西守ら，蛋白質核酸酵素，４４巻１１号，４８〜５４頁，１９９９年，共立出版、東京、日本；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：４３２５−４３３３，１９９９；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，２６２：４４２９）。また、ウイルスベクターは患部に導入し細胞感染させることによって細胞内に遺伝子導入することができる（Ｌ．Ｚｅｎｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３），１００：７７７９７−７８０２；Ｈ．Ｘｉａら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２），２０：１００６−１０１０；Ｘ．Ｆ．Ｑｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３），１００：１８３−１８８；Ｇ．Ｍ．Ｂａｒｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２），９９：１４９４３−１４９４５；Ｊ．Ｄ．Ｈｏｍｍｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．（２００３），９：１５３９−１５４４）。特にアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターは種々の細胞種に非常に高い効率で遺伝子導入可能であることが確認されている。このベクターはまた、ゲノム中に組み込まれることがないため、その効果は一過性であり安全性も他のウイルスベクターと比べて高いと考えられる。
【００７２】
さらに、ＩＲＢＩＴをコードするｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡもしくはその断片は、ＩＲＢＩＴ遺伝子のＩＲＢＩＴタンパク質への翻訳を阻害することが可能である。
【００７３】
前記断片は、ＩＲＢＩＴ遺伝子又はｍＲＮＡの配列において連続する約３０塩基以上、５０塩基以上、７０塩基以上、１００塩基以上、１５０塩基以上、２０塩基以上又は２５０塩基以上から全長以下の塩基数からなる配列を含むことができる。
【００７４】
アンチセンスＲＮＡもしくはその断片は、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）、メチル、カルボキシメチル又はチオ基などの修飾基を含むことができる。
【００７５】
上記アンチセンス核酸は、周知のＤＮＡ／ＲＮＡ合成技術又はＤＮＡ組換え技術を用いて合成することができる。ＤＮＡ組換え技術によって合成する場合、ＩＲＢＩＴの塩基配列を含むベクターＤＮＡを鋳型にして、増幅しようとする配列を挟み込むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って標的配列を増幅し、必要に応じてベクター中にクローニングして、アンチセンスＤＮＡを生成することができる。あるいは、このようにして得られた増幅標的配列を有するＤＮＡをベクターに挿入し、該ベクターを真核又は原核細胞に導入し、その転写系を利用してアンチセンスＲＮＡを得ることができる。
【００７６】
同様の阻害はまた、ＩＲＢＩＴをコードするｍＲＮＡの切断を可能にするリボザイム、ｓｉＲＮＡなどの機能的ＲＮＡによっても可能である。
【００７７】
ｓｉＲＮＡは、例えば配列番号２（ヒトＩＲＢＩＴ）または配列番号４（マウスＩＲＢＩＴ）の塩基配列によってコードされるｍＲＮＡ配列からの連続する約１８〜３０、好ましくは約１９〜２５、さらに好ましくは約２０〜２３ヌクレオチドのセンス鎖配列と、その相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むことができる。ここで、センス鎖配列とは、前記ｍＲＮＡの標的サイトと同一の塩基配列をいい、また、アンチセンス鎖配列とは、このセンス鎖配列に相補的な塩基配列をいう。センス鎖とアンチセンス鎖は互いに対合して二本鎖のｓｉＲＮＡを形成することができる。ｓｉＲＮＡはさらに、センス鎖およびアンチセンス鎖の各３’末端に１〜５個の塩基からなるオーバーハング、例えばＵＵを含むことができる。
【００７８】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列を選択するためには、例えば標的ＩＲＢＩＴ ｍＲＮＡの標的サイトの選択のための公知の知識、例えば、（ａ）ＧＣ含量が約３０〜７０％、好ましくは約５０％である、（ｂ）すべてのヌクレオチドが均等であり、またＧが連続していない、（ｃ）アンチセンス鎖の５'末端のヌクレオチドがＡ、Ｕである、などの基準を使用することができる（Ｄ．Ｍ．Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００３），７７：７１７４−７１８１；Ａ．Ｋｈｖｏｒｏｖａら，Ｃｅｌｌ（２００３），１１５：２０９−２１６）。また、ＲＮＡ二次構造予測プログラムであるｍｆｏｌｄを用いて上記ｓｉＲＮＡの標的サイトであるＩＲＢＩＴ ｍＲＮＡ上の候補遺伝子部位を推定することもできる（Ｊ．Ａ．Ｊａｅｇｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８９，１８３：２８１−３０６；Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９，２８８：９１１−９４０）。例えば、ｓｉＲＮＡが標的とすることができる配列は、上記の知見に基づいて推定し、実際にその効果を確認することによって決定することができる。本発明で使用可能なｓｉＲＮＡは、非限定的な例として以下の配列を挙げることができる。
IRBIT siRNA-1: AAAUCCAGUUUGCUGAUGACA(配列番号５)
IRBIT siRNA-2: AACUCAGAAUGAAGUAGCUGC(配列番号６)
【００７９】
ｓｉＲＮＡは、周知の化学合成技術を用いて合成することができる。例えば、慣用のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を使用して化学的に合成するか、あるいは、ｓｉＲＮＡ関連の受託合成会社（例えばフナコシ株式会社（東京、日本）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、Ａｍｂｉｏｎ社など）に合成を委託することによって入手可能である。
【００８０】
ｓｉＲＮＡを細胞または組織内に導入するときには、ｓｉＲＮＡを直接細胞または組織内に注入するか、又はｓｉＲＮＡの発現が可能なベクターを使用することが好ましい。あるいは、ｓｉＲＮＡ又はベクターを、リポソーム、例えばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソーム（例えば、正電荷コレステロール）、又はマイクロカプセル、と複合体形成し、これを使用することもできる（例えば、中西守ら，蛋白質核酸酵素，４４巻１１号，４８〜５４頁，１９９９年，共立出版、東京、日本；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：４３２５−４３３３，１９９９；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７,２６２：４４２９）。
【００８１】
ｓｉＲＮＡを発現するためのベクターでは、ｓｉＲＮＡまたはその前駆体をコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む。
【００８２】
発現ベクターの１つの例は、ヘアピン型ベクターである。このベクターは、前記センス鎖ＲＮＡ配列と前記アンチセンス鎖ＲＮＡ配列とが一本鎖ループ配列を介して共有結合されているヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡを含み、ここで該ＤＮＡは、細胞内で転写により該ヘアピン型ＲＮＡを形成し、ダイサーによりプロセシングされて前記ｓｉＲＮＡを形成するベクターである。ｓｉＲＮＡをコードするヘアピン型ＤＮＡの３'末端には、転写停止シグナル配列として、あるいはオーバーハングのために、１〜６個、好ましくは１〜５個のＴからなるポリＴ配列が連結される。ベクターＤＮＡから転写されたｓｉＲＮＡ前駆体としてのショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、そのアンチセンス鎖の３'末端に２〜４個のＵからなるオーバーハングを有することが望ましく、オーバーハングの存在によって、センス鎖ＲＮＡ及びアンチセンス鎖ＲＮＡはヌクレアーゼによる分解に対して安定性を増すことができる。ヒトには内在性のダイサーが１つ存在し、これが長鎖ｄｓＲＮＡや前駆体マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をそれぞれｓｉＲＮＡと成熟ｍｉＲＮＡに変換する役割をもつ。プロモーターの例は、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばヒトもしくはマウス由来のＵ６プロモーター又はＨ１プロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、或いはサイトメガロウイルスプロモーターである。
【００８３】
発現ベクターの別の例は、タンデム型ベクターである。このベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列とを連続して含み、かつ各鎖の５’末端にプロモーターが、また各鎖の３’末端にポリＴ配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含み、ここで該ＤＮＡは、細胞内で転写後に該センス鎖ＲＮＡと該アンチセンス鎖ＲＮＡとがハイブリダイズして前記ｓｉＲＮＡを形成するベクターである。
【００８４】
タンデム型ベクターにおけるプロモーターの例は、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばヒトもしくはマウス由来のＵ６プロモーター又はＨ１プロモーター、或いはサイトメガロウイルスプロモーターである。また、ポリＴ配列は、１〜６個、好ましくは１〜５個のＴからなるポリＴ配列である。タンデム型ベクターは、細胞内に導入されたのち、センス鎖とアンチセンス鎖に相当するＲＮＡに転写され、互いにハイブリダイズして目的のｓｉＲＮＡを生成することができる。
【００８５】
上記ヘアピン型及びタンデム型ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターである。プラスミドベクターは、後述の実施例に記載の手法又は文献記載の方法を用いて調製してもよいし、或いは市販のベクター系、たとえばｐｉＧＥＮＥＴＭＵ６系ベクター及びｐｉＧＥＮＥＴＭＨ１系ベクター（タカラバイオ株式会社、京都、日本）を利用することもできる（Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２），２９６：５５０−５５３；Ｎ．Ｓ．Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２），２０：５００−５０５；Ｍ．Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２），２０：４９７−５００；Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎら，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．（２００２），１６：９４８−９５８；Ｔ．Ｔｕｓｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００２），２０：４４６−４４８；Ｃ．Ｐ．Ｐａｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２），２０：５０５−５０８；多比良和誠ら編、ＲＮＡｉ実験プロトコル、羊土社（東京、日本）、２００３年）。
【００８６】
本発明の組成物の有効成分である別の核酸は、リボザイムである。リボザイムは、触媒活性をもつＲＮＡであり、本発明の標的ＩＲＢＩＴ遺伝子に対応するｍＲＮＡを切断する活性を有している。この切断によって該遺伝子の発現が阻害又は抑制される。
【００８７】
リボザイムの切断可能な標的配列は、一般にはＮＵＸ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ； Ｘ＝Ａ，Ｃ，Ｕ）、例えばＧＵＣトリプレットを含む配列であることが知られている。このようなリボザイムには、ハンマーヘッド型リボザイムが含まれる。ハンマーヘッド型リボザイムは、センサー部位を構成するヌクレオチド配列、センサー部位にＲＮＡが結合したときのみ安定にＭｇ２＋イオンを捕捉する空洞を形成しうる領域を含むヌクレオチド配列、及び標的ＲＮＡの切断部位周辺の配列に相補的である領域を含むヌクレオチド配列を含むことができる。
【００８８】
本発明のリボザイムを細胞内または患者体内に送達するために、リボザイムをリポソーム（好ましくは、正電荷リポソーム）に封入する（特開平９−２１６８２５号公報（１９９７年））、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターに組み込む（特表２００２−５４２８０５号公報）などの方法によってドラッグデリバリー系を構築することができる。
【００８９】
リボザイムは、それが発現可能なようにベクターに組み込むことができる。リボザイムを発現するためのプロモーターには、ｐｏｌ ＩＩ又はｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが含まれる。好ましいプロモーターは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば哺乳動物由来のｔＲＮＡプロモーター、より好ましくはｔＲＮＡＶａｌプロモーターである（Ｓ．Ｋｏｓｅｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：１８６８−１８７７，１９９９）。
【００９０】
抗体
ＩＲＢＩＴに対する抗体又はその断片もまた、上記生物学的機能の制御のために使用できる。
【００９１】
このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え型抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異抗体、合成抗体などが含まれる。
【００９２】
抗体のクラス、サブクラスは任意のタイプでよく、例えばＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＥ，ＩｇＤ，ＩｇＡ、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２などが含まれる。
【００９３】
抗体はまた、ペグ化、アセチル化、グリコシル化、アミド化などによって誘導体化されていてもよい。
【００９４】
ポリクローナル抗体の作製は、ＩＲＢＩＴを免疫原（約１μｇ〜１００μｇ）として、必要に応じてＦｒｅｕｎｄの完全もしくは不完全アジュバント、水酸化アルミニウム(ａｌｕｍ)、ムラミルジペプチド、リピドＡなどのアジュバントを含む油中水型乳濁液を、ウサギ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの非ヒト動物に皮内もしくは静脈内に免疫注射し、約２〜４週間後に、アジュバント非含有のＩＲＢＩＴを１〜２回注射し、ブーストを行う。試験的に採血し、抗体価が十分に上がったことを確認したあとで、動物から採血し、遠心分離により抗血清を回収する。必要に応じて、硫安分画、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーなどにより精製しＩｇＧを得ることができる。
【００９５】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ １９７５， ２５６：４９５−４９７）に準じて行うことができる。すなわち、ハイブリドーマは、免疫感作された動物から脾臓またはリンパ節を取り出し、それに含まれる抗体産生細胞と、マウス、ラット、モルモットなどの哺乳動物に由来のミエローマ細胞との細胞融合、ＨＡＴ選択によって得ることができる。細胞融合は、例えばポリエチレングリコール（例えば分子量１５００〜６０００）を用いて行うことができる。目的の抗体の産生は、ハイブリドーマの培養上清の免疫抗原に対する反応性を酵素免疫測定法、放射性免疫測定法、蛍光抗体法などの慣用の方法を用いて測定することができる。
【００９６】
また、ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の作製は、ハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養してその培養上清から単離してもよいし、あるいはマウス、ラット、モルモットなどの腹水等でｉｎ ｖｉｖｏで培養し、腹水から単離してもよい。
【００９７】
あるいは、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングしたのち、これをベクターに組み込み、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ）などに導入し、組換え型抗体を作製することもできる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓら，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）。
【００９８】
ヒト抗体は、例えばファージジスプレイライブラリー（ｐｈａｒｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）法（Ｔ．Ｃ．Ｔｈｏｍａｓら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１３８９−１４０１，１９９６）又はヒト抗体産生動物（例えばマウス、ウシなど）を用いる方法（Ｉ． Ｉｓｈｉｄａら，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：９１−１０２，２００２）によって製造できる。
【００９９】
例えば、ヒト抗体産生マウスは、ヒト人工染色体にヒト抗体産生遺伝子を含むヒト染色体断片を導入したのち、ミクロセル法を用いて例えばマウス胚性幹細胞ゲノムに人工染色体を組み込み、組換え胚性幹細胞を胚盤胞に注入し、仮親マウスの子宮に移植し、キメラマウスを出産し、雌雄のキメラマウス、またはキメラマウスと野生型マウス、の交配を通して、ヒト抗体遺伝子を含み、したがってヒト抗体の産生が可能である、ホモ接合型の子孫マウスを作出するなどの方法によって作製することができる（例えば、再表０２／０９２８１２号公報、国際公開ＷＯ ９８／２４８９３、ＷＯ ９６／３４０９６など）。このヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、本発明のＩＲＢＩＴタンパク質を抗原として免疫したのち、脾臓を摘出し、この脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを形成し、目的のモノクローナル抗体を選抜することができる。
【０１００】
ファージディスプレイライブラリー法は、未処置のヒトリンパ細胞から直接手に入れた免疫グロブリン遺伝子のライブラリーから、目的の抗体をコードするＤＮＡをスクリーニングし、このＤＮＡと、抗体鎖との間に、ファージ粒子を用いて物理的会合を確立し、これによって、標的に親和性をもつ抗体を提示するファージを親和性スクリーニングによって富化することを含む。この方法を用いて、標的に対する結合親和性をもつ抗体を、通常の手法によって大量に合成することができる（例えば、特表２００３−５２７８３２号公報）。
本発明の組成物は、疾患または障害の治療のために用いることができる。
【０１０１】
治療用組成物
本発明において、該疾患または障害とは、タンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝、および細胞内ｐＨの異常によって引起されるものである。
【０１０２】
タンパク質合成の場合、ＣＰＳＦに対するＩＲＢＩＴの結合に伴うタンパク質合成の制御が挙げられる。この場合、ＩＲＢＩＴはタンパク質合成を亢進し、ＩＲＢＩＴの働きを抑制する物質（上記の核酸または抗体）はタンパク質合成を抑制することができる。ＣＰＳＦが関与するタンパク質合成の異常には、例えば腫瘍がある。
【０１０３】
イノシトールリン脂質代謝の場合、ＰＩＰＫＩＩの異常な活性化に伴う疾患、例えば２型糖尿病が挙げられる。ＩＲＢＩＴはＰＩＰＫＩＩ活性を抑制する作用があるため、２型糖尿病の治療のために使用できる。
【０１０４】
細胞内ｐＨの場合、細胞内のｐＨの維持にｐＮＢＣ１が重要な働きをしているが、特にｐＨが酸性に傾くことによる疾患に、緑内障や白内障などの眼の疾患、低身長症、精神遅滞、膵臓炎などの疾患が含まれる。ＩＲＢＩＴは、ｐＮＢＣ１と結合し、細胞内ｐＨの正常な状態への調節を可能にする。
【０１０５】
本発明の組成物中の有効成分の含有量は、制限されないが、約１μｇ〜１００ｍｇである。その含有量は、有効成分の種類に応じて変化しうる。
【０１０６】
本発明の組成物中のＩＲＢＩＴの用量は、１投与単位あたり約１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約５０μｇ〜５００μｇであるが、この範囲に限定されない。
【０１０７】
本発明の組成物中の核酸の用量は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又はリボザイムに換算すると、以下のものに限定されないが、１投与単位あたり、約１ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜５０μＭである。
【０１０８】
本発明の組成物中の抗体又はその断片の用量は、以下のものに限定されないが、１投与単位あたり、約１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５〜７０ｍｇ／ｍｌである。
【０１０９】
しかし、上記の用量又は投与量は、患者の状態、年齢、性別、重篤度などに応じて変化しうるものであり、専門医の判断により用量又は投与量が決定されるべきである。
【０１１０】
本発明の組成物は、通常、製薬上許容可能な担体（すなわち、賦形剤又は希釈剤）、例えば滅菌された水、生理食塩水、緩衝液、非水性液体（例えば、アーモンド油、植物油、エタノールなど）などを含むことができる。該組成物にはさらに、製薬上許容可能な安定剤（例えばメチオニンなどのアミノ酸類）、保存剤（p-ヒドロキシ安息香酸メチル、ソルビン酸）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム）、乳化剤（例えばレシチン、アラビアガム）、懸濁化剤（例えばセルロース誘導体）などを含有させることができる。
好ましい医薬製剤は、溶液剤、懸濁液剤、乳剤などである。
【０１１１】
本発明の組成物の投与方法は、経口投与、非経口投与、例えば静脈内投与、局所投与などを含む。局所投与には、外科手術又は内視鏡下で患部に直接注射する方法などが含まれる。また、専門医が決定した治療計画に基づいて、一定の時間間隔、例えば１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年などの間隔で、患者に対して、本発明の組成物を１〜数回に分けて投与することができる。
【０１１２】
また、患者への抗体又はその断片の送達は、単独か又は例えばリポソーム（好ましくは、正電荷リポソーム）、マイクロカプセル又はナノ粒子中に抗体又はその断片を封入した形態で、通常は適当な担体（賦形剤又は希釈剤）と組み合わせて、経口経路、非経口経路（例えば、静脈内投与又は局所投与）にて行うことができる。
【０１１３】
本発明の組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｏｖｏで使用可能である。
【０１１４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、治療用物質のスクリーニングのために、本発明の組成物を利用することができる（下記参照）。
【０１１５】
ｅｘ ｖｏｖｏでは、一旦患者から生体外に取り出された細胞や組織を、本発明の有効成分で処理した後、体内に戻すことができる。これによって、タンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝または細胞内ｐＨの異常が生じた細胞や組織を正常に復することが可能となる。
【０１１６】
２．ＩＲＢＩＴの使用例
本発明はまた、ＩＲＢＩＴをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで使用する下記の方法を提供する。
【０１１７】
第１に、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のタンパク質合成の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
この方法は、ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦに結合してＣＰＳＦの機能を制御するという作用をもつことに基づく。
【０１１８】
第２に、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のイノシトールリン脂質代謝の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
この方法は、ＩＲＢＩＴがＰＩＰＫＩＩ活性を抑制するという作用をもつことに基づく。
【０１１９】
第３に、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内ｐＨの制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法を提供する。
この方法は、ＩＲＢＩＴがｐＮＢＣ１を活性化するという作用をもつことに基づく。また、ｐＮＢＣ１の活性化には、ＩＲＢＩＴのリン酸化が必要である。
【０１２０】
上記のとおりＩＲＢＩＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、細胞内でのタンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝または細胞内ｐＨの制御を可能にする物質のスクリーニングのために使用できるし、また、ｅｘ ｖｉｖｏでは、タンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝または細胞内ｐＨの異常が生じた細胞や組織を正常な状態に戻すために使用することができる。
【０１２１】
３．スクリーニング
本発明はさらに、候補物質の存在下で、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合を測定し、該結合を抑制または亢進する物質を同定することを含む、物質のスクリーニング方法を提供する。
【０１２２】
上記結合は、試験管内で、あるいは細胞（特に哺乳動物細胞）内で、候補物質の存在下でＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合を測定することができる。哺乳動物細胞には、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３などが含まれる。
【０１２３】
同定された物質は、例えば治療用または診断用として使用できる。特に、該物質は、細胞内のタンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝および細胞内ｐＨからなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能を制御するものである。
【０１２４】
上記結合を試験管内で実施するときには、例えば、適当なバッファ中に、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１とを存在させ、これに候補物質を加え、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合のレベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイッムノブロット法で検出することができる。この系は、上記結合を抑制または阻害する物質の検出に有効である。ＩＲＢＩＴ、ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１の組換えタンパク質の作製は、上記のＩＲＢＩＴの項で記載したと同様の手法で行うことができる。
【０１２５】
上記結合を細胞内で実施するときには、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１とを同時にまたは別個に発現させうるように、それぞれのタンパク質をコードするＤＮＡを同一のまたは異なるベクターに組込み、該ベクターで哺乳動物細胞を形質転換またはトランスフェクションする。翻訳されたタンパク質は細胞内、特に細胞質に存在するように、好ましくは、ベクターＤＮＡは分泌シグナル配列を含まないようにするのがよい。
【０１２６】
ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１のアミノ酸および塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋや文献などから入手可能であり、それぞれ例えば（ＡＢ０９２５０４）、（ＡＦ０３０５５８、ＡＦ０３３３５５）、（ＮＭ＿００３７５９、ＮＭ＿０１８７６０）の登録番号が付与されている。ＩＲＢＩＴのアミノ酸および塩基配列については、上記のとおりである。
【０１２７】
発現ベクターは、好ましくは哺乳動物細胞で使用可能な任意のベクターである。ベクターは、プロモーター、エンハンサー、複製開始点、リボソーム結合部位、マルチクローニング部位、ターミネーター、ポリＡシグナルなどの制御配列を含むことができる。発現ベクターとしては、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１（ストラタジーン社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ ＳＶ４０（ファルマシア社）、ｐＨＭ６、ｐＶＭ６およびｐＸＭ（ロシュダイアグノスティック社）などの市販のベクターを適宜選択して使用することができる。
【０１２８】
プロモーターには、例えばＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦプロモーターなどが含まれる。
【０１２９】
ＩＲＢＩＴ、ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルス感染による方法などが含まれる（実験医学別冊４版松村正實ら編「新遺伝子工学ハンドブック」（２００３年）羊土社、東京、日本）。
【０１３０】
或いは、公知の手法により非ヒト動物の卵母細胞または胚性幹細胞を使用してＩＲＢＩＴ遺伝子を外来的にゲノムに組込み、強制的に発現可能にしたトランスジェニック非ヒト動物（例えばマウス）、ならびに、ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１遺伝子を外来的にゲノムに組込み、強制的に発現可能にしたトランスジェニック非ヒト動物（例えばマウス）をそれぞれ作製し、両動物を交配して、ＩＲＢＩＴ遺伝子と、ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１遺伝子とを発現可能にしたキメラ非ヒト動物およびその子孫を作製することができる。
【０１３１】
細胞内またはトランスジェニック非ヒト動物内で強制的に発現されたＩＲＢＩＴと、ＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合が、細胞内または動物内に取り込んだ候補物質の存在下でどのように影響を受けるかを、該結合をプルダウン法、免疫沈降法などによって測定することによって調べる。同時に、ある特定のタンパク質の細胞内合成に及ぼす影響、イノシトールリン脂質代謝に及ぼす影響、細胞内のｐＨに及ぼす影響を調べる。
【０１３２】
タンパク質の細胞内合成に及ぼす影響は、例えば、特定のタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロット法などによって測定することができる。
【０１３３】
イノシトールリン脂質代謝に及ぼす影響は、例えば［３Ｈ］ラベル、あるいはＰＩＰ２結合タンパク質を用いたＰＩＰ２量定量などによって測定することができる。
【０１３４】
細胞内のｐＨに及ぼす影響は、例えば蛍光ｐＨ指示薬を用いた細胞内ｐＨ測定などによって測定することができる。
【０１３５】
候補物質は、有機小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）などを含むが、これらに限定されない。
【０１３６】
上で説明したように、ＩＲＢＩＴは、細胞内での代謝、ｐＨ変化、イオンバランス、リン脂質代謝の調節、タンパク質合成の制御、Ｃａ２＋放出の制御などを調節する上で大変重要な意義を全ての細胞で有している。ＩＲＢＩＴの濃度や発現パターンを制御することにより、上記の様々な生物学的機能を制御しうることが今回判明した。本発明のスクリーニング法で同定される物質は、このような制御のために有用である。
【実施例】
【０１３７】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されないものとする。
【０１３８】
＜実施例１＞
細胞質内ｐｏｌｙ（Ａ）付加反応へのＩＲＢＩＴの関与
ＣＰＳＦは、ＣＰＳＦ１６０、ＣＰＳＦ１００、ＣＰＳＦ７３およびＣＰＳＦ３０の４つのサブユニットからなる複合タンパク質群であるため、まず、この４つのサブユニットの内、どのサブユニットに結合するのかを明らかにするために、各サブユニットにｍｙｃタグを付けたｃＤＮＡを様々のコンビネーションで、ＩＲＢＩＴと共にＣＯＳ細胞等に発現し、ＩＲＢＩＴまたはＣＰＳＦを免疫沈降した時の共沈のされ方を調べた。
【０１３９】
ＣＰＳＦは、マウス由来のＣＰＳＦであり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０９２５０４の全長および４つの各サブユニットの塩基配列に基づき、ＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした（Ｈ． Ａｎｄｏら, ２００３，上記）。また、ＩＲＢＩＴは、マウス由来のＩＲＢＩＴであり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿１４５５４２の塩基配列に基づき、ＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした（Ｈ． Ａｎｄｏら, ２００３，上記）。
【０１４０】
ＣＰＳＦの全長または各サブユニットをコードするｃＤＮＡに、ｍｙｃタグをコードするＤＮＡを融合したＤＮＡを作製し、哺乳動物用ベクターに挿入した。一方、ＩＲＢＩＴをコードするｃＤＮＡもまた、同じベクターに挿入した。作製されたベクターを、ＣＯＳ細胞に形質転換し、上記ＤＮＡを共発現した。
【０１４１】
細胞を遠心分離によって分離し、細胞を溶解し、細胞質画分を回収し、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦとの結合を、抗ＩＲＢＩＴ抗体（特開２００４−１２９６１２号公報）および抗ｍｙｃ抗体を用いて検出した。
【０１４２】
その結果、ＩＲＢＩＴは、ＣＰＳＦ１６０サブユニットを介して、ＣＰＳＦと結合することが判明した（図１）。
【０１４３】
さらにまた、ＣＰＳＦ１６０の欠失変異体を使った同様の実験から、ＩＲＢＩＴはＣＰＳＦ１６０のｍＲＮＡ結合部位に結合することが判明した（図２）。
【０１４４】
ＣＰＳＦ１６０のｍＲＮＡ結合部位は、ＣＰＳＦがｐｏｌｙ（Ａ）を付加するｍＲＮＡを認識する際に必須の領域であることから、ＩＲＢＩＴがこの領域に結合することは、ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦ機能を阻害する可能性があり、これを確かめるために、精製蛋白質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成系で、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦとの結合、及びそれによるポリアデニレーション反応への影響を調べた。
【０１４５】
ＣＰＳＦは、ｍＲＮＡのポリアデニレーション反応に必須の分子であるが、それが働く場所は主に核の中であり、ＤＮＡから転写されたばかりのＲＮＡに対して、それがｍＲＮＡとなって核外へ出て行くまでの成熟反応の一つとして、働く。しかし例外的に、卵母細胞の成熟過程、あるいは、神経細胞の局所での新たなタンパク質合成といった局面では、細胞質でｍＲＮＡのポリアデニレーションに関与し、ｐｏｌｙ（Ａ）の長さを調節することで、目的分子のタンパク質合成を調節する（Ｄａｒｏｎ Ｃ． Ｂａｒｎａｒｄら，Ｃｅｌｌ ２００４，１１９：６４１−６５１）。この細胞質内ポリアデニレーション反応は、例外的現象であるが、卵母細胞の成熟、神経可塑性を成立させる上では、必須の現象となっている。ＩＲＢＩＴの細胞内分布を調べてみると、核内には殆ど存在しないことから、本発明者らは、ＩＲＢＩＴの細胞質内ポリアデニレーション反応への関与に焦点を絞って検討した。
【０１４６】
細胞質内ポリアデニレーション反応を調べる上で、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞の系が優れていることから、本発明者らは、先ず、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞からのＩＲＢＩＴ ｃＤＮＡのクローニングおよび単離を、定法に従って行った。Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞には、哺乳動物細胞とは異なり、３種類のＩＲＢＩＴ ｍＲＮＡが発現しており、この３種類とも、ＣＰＳＦ１６０と結合することが判明した。
【０１４７】
ＩＰ３受容体ｍＲＮＡの３'末端は、細胞質内ポリアデニレーション反応を受ける可能性のある配列を有しており、実際、小脳Ｐｕｒｋｉｎｊｅ細胞では、樹状突起内にこのｍＲＮＡが存在している。このことは、ＩＰ３受容体から放出されたＩＲＢＩＴがＣＰＳＦとの結合を介して、ＩＰ３受容体自身のタンパク質合成を制御している可能性を示している。
【０１４８】
さらに、本発明者らは、ＩＲＢＩＴが、ＰＡＰ及びＦｉｐ１（ＣＰＳＦのサブユニット）の存在下でのポリアデニレーション活性（Ｉ． Ｋａｕｆｍａｎｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．（２００４）２３：６１６−６２６）をさらに増大させる働きがあることを見出した。
【０１４９】
上記の結果から、ＩＲＢＩＴが、細胞内でＣＰＳＦとの結合を介して、タンパク質合成を制御していることが示された。
【０１５０】
＜実施例２＞
ＩＲＢＩＴとＰＩＰキナーゼＩＩ型（ＰＩＰＫＩＩ）との相互作用
本発明者らはさらに、ＩＲＢＩＴと相互作用する分子を探索した。
実施例１と同様の手順で、ＨＥＫ２９３細胞にＦＬＡＧ−ＩＲＢＩＴを過剰発現し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降してＩＲＢＩＴと共沈してくるタンパク質を、質量分析器で解析した。その結果、リン脂質リン酸化酵素であるｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ４−ｋｉｎａｓｅγ （ＰＩＰＫＩＩγ）が同定された。ＰＩＰＫＩＩファミリー（ＰＩＰＫＩＩα，ＰＩＰＫＩＩβ，ＰＩＰＫＩＩγ）はＰＩＰ２を合成する酵素であり、ＰＩＰ２の加水分解によりＩＰ３が産生されることを考えると、ＩＰ３受容体、ＩＲＢＩＴ、ＰＩＰＫＩＩγからなる情報伝達機構が存在する可能性が考えられる（図３）。
【０１５１】
さらに、次の実験を行い、同時にその結果も以下に示す。
（１）マウスＩＲＢＩＴとＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩα, β, γをＣＯＳ−７に過剰発現し、免疫沈降を行った。具体的には、Ｌｙｓｉｓバッファー（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１％Ｐ−４０，ｐＨ７．４）で細胞を可溶化し、遠心（２００００×ｇ，３０分）して上清を回収後、抗Ｍｙｃ抗体あるいは抗ＩＲＢＩＴ抗体を添加し、１時間反応させた。さらにプロテインＧセファロースを添加して１時間反応後、免疫複合体をＬｙｓｉｓバッファーで洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで溶出した。その後、抗Ｍｙｃ抗体あるいは抗ＩＲＢＩＴ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果、ＩＲＢＩＴはＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩα, β, γのいずれとも共沈した（図４）。
【０１５２】
（２）マウス小脳から抗ＩＲＢＩＴ抗体で免疫沈降を行ったところ、ＰＩＰＫＩＩαが共沈した（図５）。その結果から、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＲＢＩＴとＰＩＰＫＩＩとの結合が確認された。
【０１５３】
（３）マウスＩＲＢＩＴとＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩγをＣＯＳ−７に過剰発現し、免疫染色を行った。具体的には、４％パラフォルムアルデヒドで固定、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で膜透過処理、２％ヤギ血清でブロッキング処理を行った後、マウス抗Ｍｙｃ抗体およびウサギ抗ＩＲＢＩＴ抗体を添加し、室温で１時間反応させた。Ａｌｅｘａ４８８結合抗マウスＩｇＧ抗体およびＡｌｅｘａ５９４結合抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として添加し、３７℃で４５分反応させた。その結果、ＩＲＢＩＴとＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩγのいずれも細胞質に局在することが判かった（図６）。
【０１５４】
（４）マウスＩＲＢＩＴの欠失変異体（配列番号３のアミノ酸配列における６０−５３０，７８−５３０，１０５−５３０，１−２７７，１−１０４，１−９０および１−７７）は対応する配列をＰＣＲで増幅し、ＧＦＰ融合タンパク発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングして作製し、これらの変異体の各々とＰＩＰＫＩＩαとの結合を調べたところ、ＩＲＢＩＴのＮ末端領域にあるセリンに富む領域が上記結合に重要であることが明らかになった（図７）。
【０１５５】
（５）マウスＩＲＢＩＴのセリンに富む領域の点突然変異体（配列番号３のアミノ酸配列におけるＴ５２Ａ，Ｔ５８Ａ，Ｓ６２Ａ，Ｓ６４Ａ，Ｓ６６Ａ，Ｓ６８Ａ，Ｓ７０Ａ，Ｓ７１Ａ，Ｔ７２Ａ，Ｓ７４Ａ，Ｓ７６Ｇ，Ｓ７７Ａ，Ｓ８０Ａ，Ｄ８３Ａ，Ｓ９０ＡおよびＴ９７Ａ）は、部位特異的変異体作成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作製し、これらの変異体の各々とＰＩＰＫＩＩαとの結合を調べた。その結果、ＩＲＢＩＴのＳｅｒ６８及びＳｅｒ７１が上記結合に重要であった（図８）。
【０１５６】
以上の結果より、ＩＲＢＩＴがＰＩＰＫＩＩファミリーに結合することが確認された。さらに予備的データから、ＩＲＢＩＴはＰＩＰＫＩＩ活性を抑制することを見いだしているため、ＩＲＢＩＴはイノシトールリン脂質代謝の活性制御をおこなっていると結論づけられた。
【０１５７】
＜実施例３＞
ＩＲＢＩＴによるＮＢＣ１ （Ｎａ／ＨＣＯ３ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）の活性化
本発明者らはさらに、ＩＲＢＩＴに結合する蛋白質として、細胞膜上でナトリウムイオンと重炭酸イオンの輸送を行うＮＢＣ１（ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）蛋白質を同定した。
【０１５８】
ＮＢＣ１には、ｐ型とｋ型の２つのスプライシング変異体が存在することが知られているが（Ｓｅｔｈ Ｌ．Ａｌｐｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２，６４：８９９−９２３）、ＩＲＢＩＴは、そのうちｐ型のＮＢＣ１（ｐＮＢＣ１という）と結合すること、また、ＩＲＢＩＴにおけるいくつかのセリン残基のリン酸化がｐＮＢＣ１との結合に必要であることが明らかになった。以下に、具体的に実験および結果を示す。
【０１５９】
（１）ｐＮＢＣ１におけるＩＲＢＩＴ結合領域の同定
ｐＮＢＣ１のｐ型特異的なＮ末端配列（１−８５アミノ酸）がＩＲＢＩＴとの結合に必要不可欠であった。この８５アミノ酸内に更なる欠失変異体を作製し、それら変異体とＩＲＢＩＴとの結合をプルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）を用いて検討した。具体的には、以下の実験を行った。
【０１６０】
ＣＯＳ−７細胞にＨＡ−ＩＲＢＩＴを過剰発現し、細胞抽出液を調製した。ＭＢＰ−ｐＮＢＣ１の欠失変異体のリコンビナントタンパク質を添加し、反応後、結合したタンパク質をａｍｙｌｏｓｅレジンでプルダウンした。ＨＡ−ＩＲＢＩＴを抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した。
【０１６１】
その結果、ｐ型特異的な配列のうちＮ末端６２アミノ酸があればＩＲＢＩＴと結合しうることが示された（図９、図１０）。しかしこの６２アミノ酸から更にＮ末側やＣ末側を削ると、ＩＲＢＩＴとの結合が見られなくなり、これ以上ＩＲＢＩＴ結合領域を狭めるのは難しいと考えられた。この結果からＩＲＢＩＴとの結合にはｐＮＢＣ１の特定の数アミノ酸の配列が関与しているのではなく、数十アミノ酸からなる三次元的な構造が必要である可能性が示唆された。
【０１６２】
（２）ＩＲＢＩＴにおけるｐＮＢＣ１結合領域の同定
次に、マウスＩＲＢＩＴ（全長５３０アミノ酸；配列番号３）の各種欠失変異体をＣＯＳ７細胞に発現させ、それぞれの変異体のｐＮＢＣ１結合能をプルダウンアッセイで調べた。具体的には、以下の実験を行った。
【０１６３】
ＣＯＳ−７細胞にＧＦＰ−ＩＲＢＩＴの欠失変異体を過剰発現し、細胞抽出液を調整した。ＭＢＰ−ｐＮＢＣ１（１−８５）のリコンビナントタンパク質を添加し、反応後、結合したタンパク質をａｍｙｌｏｓｅレジンでプルダウンした。ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴの欠失変異体を抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した。
【０１６４】
その結果を図１１に示す。図から、ＩＰ３受容体との結合が確認されているＩＲＢＩＴのＮ末側を発現する欠失変異体（１−１０４、１−２７７）ですらｐＮＢＣ１とは結合できないことがわかった。またＩＰ３受容体と結合できないことが既に確認されているＩＲＢＩＴのＣ末側を発現する欠失変異体（１０５−５３０）もまたｐＮＢＣ１とは結合できなかった。ｐＮＢＣ１との結合に必要であることが示されているセリンリン酸化部位は１−１０４に全て含まれることから、１−１０４の中に短いｐＮＢＣ１結合配列が存在するにも関わらず何らかの立体構造によってｐＮＢＣ１との結合が阻害されている可能性も考えられた。そこで、１−１０４を更に細かく欠失させた欠失変異体を作製しｐＮＢＣ１との結合を解析したが、いずれもｐＮＢＣ１との結合は見られなかった。
【０１６５】
以上の結果から、ＩＲＢＩＴのＮ末側とＣ末側を含む全体の構造がｐＮＢＣ１との結合に必要であることが明らかとなり、ＩＲＢＩＴのＮ末側だけで十分であるとされるＩＲＢＩＴとＩＰ３受容体との結合様式との違いが明らかとなった。
【０１６６】
（３）内在性ＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合
次に、内在性のＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合を、免疫沈降法を用いて確認する実験を行った。
【０１６７】
そもそもＮＢＣ１は小脳の膜画分におけるＩＲＢＩＴ結合蛋白質として同定されたので、まず小脳膜画分抽出液を用いて免疫沈降を行った。また小脳膜画分においてＩＲＢＩＴはＩＰ３受容体とも結合していることがわかっているので、ＮＢＣ１、ＩＲＢＩＴ、ＩＰ３受容体からなる三者複合体を形成しうるか否かを検討した。具体的には、以下の実験を行った。
【０１６８】
小脳膜画分を界面活性剤で可溶化後、抗ＩＲＢＩＴ抗体、抗ＮＢＣ抗体、あるいはコントロール抗体を添加して反応させた。さらにプロテインＧセファロースを添加して免疫複合体を抽出した。その後、抗ＩＲＢＩＴ抗体、抗ＮＢＣ抗体あるいは抗ＩＰ３Ｒ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【０１６９】
その結果、抗ＮＢＣ１抗体免疫沈降物中に内在性のＩＲＢＩＴが、また抗ＩＲＢＩＴ抗体免疫沈降物中に内在性のＮＢＣ１が、それぞれ含まれることがわかり、内在性のＩＲＢＩＴとＮＢＣ１が小脳膜画分で複合体を形成することが確認された（図１２）。一方で、既にＡｎｄｏら（２００３，上記）によって報告されているように、抗ＩＲＢＩＴ免疫沈降物中にはＩＰ３受容体が検出されたが、抗ＮＢＣ１沈降物中にはＩＰ３受容体が検出できなかった。この結果から、内在性ＮＢＣ１の多くがＩＲＢＩＴとＩＰ３受容体を含む三者複合体を形成していないことが示された。
【０１７０】
さらにＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合が普遍的であることを確認するために、ＣＯＳ７細胞の抽出液を用いて内在性のＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合を、先ほどと同様の免疫沈降法を用いて検討した。具体的には、以下の実験を行った。
【０１７１】
ＣＯＳ−７細胞の細胞抽出液に抗ＩＲＢＩＴ抗体、抗ＮＢＣ抗体、あるいはコントロール抗体を添加して反応させた。さらにプロテインＧセファロースを添加して免疫複合体を抽出した。その後、抗ＩＲＢＩＴ抗体あるいは抗ＮＢＣ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【０１７２】
その結果を図１３に示す。図から、小脳膜画分の抽出液を調製する時に用いたものと同じバッファーでＣＯＳ７細胞を抽出した場合、内在性のＩＲＢＩＴとＮＢＣ１の結合が検出されないことがわかった。しかし、このバッファーに２ｍＭ ＣａＣｌ２を加えて同様の実験を行ったところ、内在性のＩＲＢＩＴとＮＢＣ１の結合が検出された。このバッファーは既に２ｍＭのＥＤＴＡを含んでいることから、２ｍＭ ＣａＣｌ２を加えた時のカルシウムイオン濃度は数μＭであると考えられる。これらの結果から、内在性のＮＢＣ１とＩＲＢＩＴとの結合が小脳膜画分とＣＯＳ７細胞とでは異なった様式で制御されている可能性が示唆された。
【０１７３】
（４）ＩＲＢＩＴによるＮＢＣ１の活性化
アフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓｅ Ｏｏｃｙｔｅ）の培養細胞にマウスＩＲＢＩＴのｃＲＮＡとヒトｐＮＢＣ１またはｋＮＢＣ１のｃＲＮＡを同時注入し、膜電位を−２５ｍＶにし、ＮＤ９６溶液（９６ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）からＮＤ９６＋ＨＣＯ３−溶液に変えた時の電流変化を測定した。コントロールには、ＩＲＢＩＴ、ｐＮＢＣ１、ｋＮＢＣ１を使用した。
【０１７４】
その結果、ｐＮＢＣ１活性のみが、ＩＲＢＩＴの同時注入によって約６〜７倍増強された（図１４Ａ）。同様に、ＮＤ９６＋ＨＣＯ３−溶液中で膜電位を−１６０ｍＶから＋６０ｍＶの範囲で変化させたときにも、ｐＮＢＣ１活性のみが、ＩＲＢＩＴの同時注入によって顕著に増強された（図１４Ｂ）。
【０１７５】
さらにまた、ＩＲＢＩＴのリン酸化部位をアラニン（Ａ）に置換したＩＲＢＩＴ変異体（Ｓ６８Ａ，Ｓ７１Ａ，Ｓ７４ＡまたはＳ７７Ａ）を作製し、上記と同様に、アフリカツメガエル卵母細胞にＩＲＢＩＴ変異体のｃＲＮＡとヒトｐＮＢＣ１のｃＲＮＡを同時注入し、膜電位を−２５ｍＶにし、ＮＤ９６溶液からＮＤ９６＋ＨＣＯ３−溶液に変えた時の電流変化を測定した。
【０１７６】
その結果、リン酸化部位をアラニンに置換したすべてのＩＲＢＩＴ変異体において、ＩＲＢＩＴのｐＮＢＣ１活性への増強作用は消失した（図１５）。このことは、ＩＲＢＩＴのリン酸化がｐＮＢＣ１の活性化に必要であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】
本発明により、ＩＲＢＩＴは、細胞内での代謝、ｐＨ変化、イオンバランス、リン脂質代謝の調節、タンパク質合成の制御、Ｃａ２＋放出の制御などを調節する上で大変重要な意義を全ての細胞で有していることが判明した。ＩＲＢＩＴの濃度や発現パターンを制御することにより、このような様々な生物学的機能を制御しうる。ＩＲＢＩＴは、例えば脳神経系では脈絡叢（ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ）や神経細胞、グリア細胞で強く発現しており、脳神経系の機能制御にも貢献している。また、ＩＲＢＩＴは、細胞内のｐＨの維持に重要なｐＮＢＣ１の働き活性化して、特にｐＨが酸性に傾くことによる疾患、例えば緑内障や白内障などの眼の疾患、低身長症、精神遅滞、膵臓炎などの疾患の治療に有用である。さらにまた、ＩＲＢＩＴは、ＰＩＰＫＩＩの活性を抑制または阻害する働きがあるため、２型糖尿病の治療に使用することができる。このように、本発明により、ＩＲＢＩＴが標的とする３つのタンパク質が特定されたことによって、ＩＲＢＩＴおよびその抑制剤、亢進剤が、標的タンパク質が生体内で果たす生物学的機能の制御のために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１は、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ１６０との結合を示すウエスタンブロット図である。図中、Ｉ．Ｂ．はウエスタンブロッティングを表し、Ｉ．Ｐ．は免疫沈降を表わし、ＨＡはタグとしてのヘマグルチニンを表し、ｌｏａｄは細胞抽出液を表す。
【図２】図２は、ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦのＣＰＳＦ１６０サブユニットのｍＲＮＡ結合部位に結合することを示す模式図である。
【図３】図３は、ＩＰ３受容体、ＩＲＢＩＴ、ＰＩＰＫＩＩ、ＩＰ３が関与するイノシトールリン脂質代謝を示す模式図である。図中、ＰＬＣはホスホリパーゼＣを表す。
【図４】図４は、マウスＩＲＢＩＴとＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩα, β, γとの結合を示す。（Ａ）は抗Ｍｙｃ抗体による免疫沈降を示す。（Ｂ）は抗ＩＲＢＩＴ抗体による免疫沈降を示す。図中、ｉｎｐｕｔは細胞抽出液を表し、ＩＰは免疫沈降を表し、対照ＩｇＧ（陰性対照）はこれを用いて免疫沈降を行ったサンプルを表す。
【図５】図５は、マウス小脳のＰＩＰＫＩＩαが抗マウスＩＲＢＩＴ抗体と免疫沈降で共沈したことを示す。ｉｎｐｕｔは、図４と同じである。
【図６】図６は、ＩＲＢＩＴとＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩγがともに細胞質に局在することを示す。ＭｅｒｇｅはＰＩＰＫＩＩの染色像とＩＲＢＩＴの染色像の重ね合わせを示し、重なっている部分が黄色となる。
【図７】図７は、ＩＲＢＩＴ欠失変異体を用いて、ＰＩＰＫＩＩと結合するＩＲＢＩＴの結合部位の特定を示す。（Ａ）はＩＲＢＩＴの欠失変異体の模式図を示す。（Ｂ）はＩＲＢＩＴのＮ末端側からの欠失変異体とＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩαとの結合を示す。（Ｃ）はＩＲＢＩＴのＣ末端側からの欠失変異体とＭｙｃ−ＰＩＰＫＩＩαとの結合を示す。
【図８】図８は、ＩＲＢＩＴのＳｅｒ６８及びＳｅｒ７１がＰＩＰＫＩＩと結合することを示す。図中、ｉｎｐｕｔは細胞抽出液を表し、ＩＰは免疫沈降を表し、ＩＢはウエスタンブロッティングを表す。
【図９】図９Ａは、ＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合を示すウエスタンブロット図（上図）である。ｐＮＢＣ１（膵臓型）に特異的な部分を含む組換え型タンパク質２と５にのみＩＲＢＩＴ（黒三角）が結合する。各組換え型タンパク質（１、２、３、４、５、６または７）は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動図（図９Ａの下図）中、黒丸で示し、かつ、図９Ｂに、ｐＮＢＣ１およびｋＮＢＣ１（腎臓型）の構造とともに、それらの構造を模式的に示した。図中、ＭＢＰは精製のために用いたマルトース結合タンパク質タグを示す。また、ＣＢＢはクマシーブリリアントブルーを表す。
【図１０】図１０は、ＮＢＣ１の欠失変異体とＩＲＢＩＴとの結合能を示す。図１０Ａは、ｐＮＢＣ１の欠失変異体をそれぞれ大腸菌で発現精製し、ＣＯＳ７細胞に強制発現したＨＡ−ＩＲＢＩＴ（ここで、ＨＡはヘマグルチニンを表わす）との結合（または、相互作用）をプルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）で検討した結果を示す。また、図１０Ｂの上図は、プルダウンしたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥしＣＢＢで染色した結果を示す。図１０Ｂの下図は、プルダウンしたサンプルを抗ＨＡ抗体でウエスタンブロッティングした結果を示す。黒三角はＨＡ−ＩＲＢＩＴの泳動位置を、黒点は各欠失変異体タンパク質の泳動位置をそれぞれ示している。
【図１１】図１１は、ＩＲＢＩＴの欠失変異体とｐＮＢＣ１との結合能を示す。ＩＲＢＩＴの各種欠失変異体をＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）との融合タンパク質としてＣＯＳ７細胞に強制発現し、ｐＮＢＣ１との結合をプルダウンアッセイで検討した。図１１Ａ、図１１Ｂともに、それぞれの欠失変異体を発現した細胞抽出液（ｌｙｓａｔｅ）もしくはプルダウンサンプル（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥし抗ＧＦＰ抗体でウエスタンブロッティングした結果を示す。黒三角は各欠失変異体の泳動位置を示している。全長（ＦＬ）以外のＩＲＢＩＴがいずれもｐＮＢＣ１と結合しなくなっていることがわかる。
【図１２】図１２は、小脳膜画分における内在性ＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合を示す。小脳膜画分の抽出液から、コントロールとなる免疫前の抗体（対照）、抗ＮＢＣ１抗体、抗ＩＲＢＩＴ抗体でそれぞれ免疫沈降（ＩＰ）を行い、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥして、抗ＩＲＢＩＴ抗体、抗ＮＢＣ１抗体、抗ＩＰ３受容体抗体でウエスタンブロッティング（ＩＢ）を行った。黒三角はそれぞれのタンパク質の泳動位置を示している。
【図１３】図１３は、ＣＯＳ７細胞抽出液中の内在性ＩＲＢＩＴとＮＢＣ１との結合を示す。ＣＯＳ７細胞の抽出液からコントロールとなる免疫前の抗体（対照）、抗ＩＲＢＩＴ抗体、抗ＮＢＣ１抗体でそれぞれ免疫沈降（ＩＰ）を行い、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥして、抗ＮＢＣ１抗体もしくは抗ＩＲＢＩＴ抗体でウエスタンブロッティング（ＩＢ）を行った。黒三角はそれぞれのタンパク質の泳動位置を示している。左三列はＣａＣｌ２非存在下で、右三列はＣａＣｌ２存在下でそれぞれ免疫沈降を行った沈降物を用いている。
【図１４】図１４は、電圧クランプ法によって測定された、ＩＲＢＩＴによるｐＮＢＣ１の活性化を示す。図１４Ａは、膜電位を−２５ｍＶに固定したときの電流値（μＡ）である。また、図１４Ｂは、膜電位を−１６０ｍＶ〜＋６０ｍＶの間で変化させたときの電流変化をＩ−Ｖ曲線で示した。
【図１５】図１５は、ＩＲＢＩＴのリン酸化がｐＮＢＣ１の活性化に必要であることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体を含む組成物であって、
（１）タンパク質合成、
（２）イノシトールリン脂質代謝、および
（３）細胞内ｐＨ、
からなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能の制御のための上記組成物。
【請求項２】
前記タンパク質合成が、切断／ポリアデニレーション特異性因子（ＣＰＳＦ）による細胞質のｍＲＮＡポリアデニレーションが関与するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記イノシトールリン脂質代謝が、細胞内でのＰＩＰ２合成酵素（ＰＩＰＫＩＩ）が関与するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞内ｐＨが、細胞内でのｐ型Ｎａ／ＨＣＯ３共トランスポーター１（ｐＮＢＣ１）が関与するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記制御が、抑制または亢進である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＩＲＢＩＴが、ヒトまたはマウス由来のものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＩＲＢＩＴが、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつＩＲＢＩＴと同等の生物学的活性を有するタンパク質である、請求項１または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、疾患の治療用である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のタンパク質合成の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法。
【請求項１１】
前記ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦに結合しＣＰＳＦの機能を制御する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のイノシトールリン脂質代謝の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法。
【請求項１３】
前記ＩＲＢＩＴがＰＩＰＫＩＩ活性を抑制する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内ｐＨの制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法。
【請求項１５】
前記ＩＲＢＩＴがｐＮＢＣ１を活性化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｐＮＢＣ１の活性化が前記ＩＲＢＩＴのリン酸化を必要とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
候補物質の存在下で、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合を測定し、該結合を抑制または亢進する物質を同定することを含む、物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記物質が治療用または診断用である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記結合を哺乳動物細胞内で行う、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記物質が、細胞内のタンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝および細胞内ｐＨからなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能を制御するものである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体を含む組成物であって、
（１）タンパク質合成、
（２）イノシトールリン脂質代謝、および
（３）細胞内ｐＨ、
からなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能の制御のための上記組成物。
【請求項２】
前記タンパク質合成が、切断／ポリアデニレーション特異性因子（ＣＰＳＦ）による細胞質のｍＲＮＡポリアデニレーションが関与するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記イノシトールリン脂質代謝が、細胞内でのＰＩＰ２合成酵素（ＰＩＰＫＩＩ）が関与するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞内ｐＨが、細胞内でのｐ型Ｎａ／ＨＣＯ３共トランスポーター１（ｐＮＢＣ１）が関与するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記制御が、抑制または亢進である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＩＲＢＩＴが、ヒトまたはマウス由来のものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＩＲＢＩＴが、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつＩＲＢＩＴと同等の生物学的活性を有するタンパク質である、請求項１または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、疾患の治療用である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のタンパク質合成の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法。
【請求項１１】
前記ＩＲＢＩＴがＣＰＳＦに結合しＣＰＳＦの機能を制御する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内のイノシトールリン脂質代謝の制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法。
【請求項１３】
前記ＩＲＢＩＴがＰＩＰＫＩＩ活性を抑制する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内ｐＨの制御におけるＩＲＢＩＴの使用方法。
【請求項１５】
前記ＩＲＢＩＴがｐＮＢＣ１を活性化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｐＮＢＣ１の活性化が前記ＩＲＢＩＴのリン酸化を必要とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
候補物質の存在下で、ＩＲＢＩＴとＣＰＳＦ、ＰＩＰＫＩＩまたはｐＮＢＣ１との結合を測定し、該結合を抑制または亢進する物質を同定することを含む、物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記物質が治療用または診断用である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記結合を哺乳動物細胞内で行う、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記物質が、細胞内のタンパク質合成、イノシトールリン脂質代謝および細胞内ｐＨからなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能を制御するものである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００７−２８４４３３（Ｐ２００７−２８４４３３Ａ）
【公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７３３９６（Ｐ２００７−７３３９６）
【出願日】平成１９年３月２０日（２００７．３．２０）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２０日（２００７．３．２０）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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