ＭＸＤ３遺伝子の発現阻害による肥満の抑制
【課題】 肥満抑制剤の候補物質を同定する方法を提供すること。
【解決手段】 試験物質を細胞と接触させ，細胞におけるＭＸＤ３遺伝子の発現を測定し，そして，試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されている場合に，その試験物質を肥満抑制剤の候補物質として選択することにより，肥満抑制剤の候補物質を選択する方法が開示される。好ましくは，試験物質と細胞との接触は，ゼブラフィッシュに試験物質を投与することにより行う。この方法により同定された物質は，肥満の抑制剤ならびに中性脂肪の低下剤の有効成分として有用である。
【解決手段】 試験物質を細胞と接触させ，細胞におけるＭＸＤ３遺伝子の発現を測定し，そして，試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されている場合に，その試験物質を肥満抑制剤の候補物質として選択することにより，肥満抑制剤の候補物質を選択する方法が開示される。好ましくは，試験物質と細胞との接触は，ゼブラフィッシュに試験物質を投与することにより行う。この方法により同定された物質は，肥満の抑制剤ならびに中性脂肪の低下剤の有効成分として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，肥満抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は体重や体脂肪が増加した状態であるが，放置すると血管障害，糖尿病，脂質異常症，高血圧症等を発症し重大な合併症により死に至る病態である。食事療法，運動療法，薬物療法，行動療法，外科療法等が試みられているが，治療効果は不十分である。この中でも薬物療法は，現時点で膵臓リパーゼ阻害薬，選択的セロトニン／ノルエピネフリン再取り込み阻害薬，ノルアドレナリン作用薬等，その標的分子が限られており，臨床的効果も限界がある。
【０００３】
従来の治療法には，多くの重大な問題点が認められる。食事療法，運動療法，行動療法などは，有効性において多くの問題点を残している。外科療法は，手術によるリスクや術後の合併症や副作用が問題点となる。薬物療法は限られた薬理ターゲット分子による治療であるため，有効性や副作用に深刻な問題点を残している。今後薬物療法の有効性を改善し，深刻な副作用を軽減するためには，新しい治療遺伝子を標的にした治療戦略の開発が不可欠である。
【０００４】
その発現を阻害することにより肥満を抑制することができるということが発見されている遺伝子としては，MITF（microphthalmia transcription factor）がある。また，肥満に関連した遺伝子として，遺伝子RPL19，POMC，PC2，Prolactin，Leptin Rec.，HSG P25L2G＿lが報告されている（WO2001/029071）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2001/029071
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は，肥満抑制剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは，体重増加や脂肪増加とＭＸＤ３遺伝子の発現との間に相関があること，およびその発現機能を阻害することにより，肥満の重要な病態指標である体重，体脂肪，血清中性脂肪の増加を抑制することを見出した。
【０００８】
すなわち，本発明は，肥満抑制剤の候補物質を選択する方法であって，
試験物質を細胞と接触させ，
細胞におけるＭＸＤ３遺伝子の発現を測定し，そして，
試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されている場合に，その試験物質を肥満抑制剤の候補物質として選択する，
の各工程を含む方法を提供する。
【０００９】
別の観点においては，本発明は，肥満抑制剤の候補物質を選択する方法であって，
ゼブラフィッシュに試験物質を投与し，
ＭＸＤ３遺伝子の発現を測定し，そして，
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されている場合に，その試験物質を肥満抑制剤の候補物質として選択する，
の各工程を含む方法を提供する。
【００１０】
さらに別の観点においては，本発明は，ＭＸＤ３遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド，ＭＸＤ３遺伝子に対するリボザイム，ＭＸＤ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される物質を有効成分として含有する肥満抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のスクリーニング方法により選択された物質は，肥満の抑制，体重増加の抑制，中性脂肪の低下作用を有する薬剤の候補物質として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は，肥満誘導したゼブラフィッシュにおけるＭＸＤ３遺伝子の発現量を示す。
【図２】図２は，ＭＸＤ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した肥満誘導ゼブラフィッシュの体重の変化を示す。
【図３】図３は，ＭＸＤ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した肥満誘導ゼブラフィッシュの血漿中性脂肪値を示す。
【図４】図４は，ＭＸＤ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した肥満誘導ゼブラフィッシュの脂肪組織量を示す。
【図５】図５は，ＭＸＤ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した肥満誘導ゼブラフィッシュにおけるＣＡＶ，ＣＤ３６およびアジポネクチンｂ遺伝子の発現量を示す。
【図６】図６は，ＭＸＤ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した肥満誘導ゼブラフィッシュにおけるＰＰＡＲＧおよびＣＥＢＰＡ遺伝子の発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明においては，ゼブラフィッシュに肥満誘導を行うと腹腔内脂肪組織内のＭＸＤ３遺伝子発現量が増加し，食事制限を行うと低下することが見いだされた。また，下記の実施例に示されるように，肥満誘導したゼブラフィッシュにＭＸＤ３遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すると，体重増加や腹腔内脂肪組織量の増加が抑制され，脂肪組織関連遺伝子発現量が減少することが見いだされた。これらの結果から，ＭＸＤ３遺伝子は肥満の治療標的となりうること，およびＭＸＤ３遺伝子の発現の抑制を指標として，肥満抑制剤の候補物質を同定しうることが明らかとなった。
【００１４】
ＭＸＤ３は，ＭＡＤ３またはＭＧＣ２３８３とも称され，Mycスーパーファミリーに属する転写制御因子である。ヒトのＭＸＤ３の遺伝子および蛋白質の配列はNCBI: NM＿001142935.1に記載されている。この蛋白質は，補因子ＭＡＸとともにヘテロダイマーを形成し，標的遺伝子のプロモータに結合してその転写を調節する。ＭＡＸ−ＭＸＤ３複合体を解離させると細胞増殖の制御が異常となるため，ＭＸＤ３は腫瘍発生に関与することが示唆されている。これまで，ＭＸＤ３遺伝子または蛋白質の発現と肥満や脂肪細胞の増殖との関連性についての示唆はない。
【００１５】
スクリーニング方法
１つの観点においては，本発明は，多様な試験物質から，肥満抑制剤の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は，試験物質が試験管内または細胞内でＭＸＤ３遺伝子の発現を阻害する能力を測定することにより評価することができる。試験物質がＭＸＤ３遺伝子の発現を阻害する能力は，試験物質をＭＸＤ３遺伝子を発現する細胞と接触させて，ＭＸＤ３のｍＲＮＡ量または蛋白質量を測定することにより評価することができる。試験物質と接触させたときに，接触させないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されれば，その試験物質は肥満抑制剤の候補物質であると考えられる。
【００１６】
試験物質は，種々の合成または天然の化合物ライブラリー，コンビナトリアルライブラリー，オリゴヌクレオチドライブラリー，ペプチドライブラリー等のライブラリーから得ることができる。また，細菌，真菌類，藻類，植物，動物等の天然物からの抽出物やその部分精製物を試験物質として用いてもよい。
【００１７】
ＭＸＤ３遺伝子の発現を測定するためには，RT-PCR法，RNA増幅法，ISH（in situ hybridization）法，ISP（in situ PCR）法，レーザーマイクロダイセクション法，レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法（LCM）などの，当該技術分野においてよく知られる遺伝子発現分析法を用いることができる。また，ＭＸＤ３の蛋白質量は，抗ＭＸＤ３抗体を用いるＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などにより測定することができる。ヒト，ラット，マウス，ゼブラフィッシュなどのＭＸＤ３蛋白質およびこれをコードする遺伝子の配列は公表されている。
【００１８】
ＭＸＤ３遺伝子を発現する細胞としては，各種の組織に由来する初代培養組織や培養細胞株などの任意のものを用いることができる。ＭＸＤ３遺伝子を強制発現させるよう遺伝子組換えされた細菌，酵母，昆虫細胞，動物細胞等を用いてもよい。
【００１９】
１つの好ましい態様においては，試験物質をゼブラフィッシュに投与して，ＭＸＤ３遺伝子の発現を調べる。ゼブラフィッシュ（属名Danio，例えばDanio rerio）とはインド原産の小型の熱帯魚である。主要臓器・組織の発生・構造などがヒトと良く似ているうえ，身体が透明であるため各種臓器および血管の形態を肉眼で観察することができるため，モデル動物として新薬候補化合物のスクリーニングに用いるのに適している。
【００２０】
本発明の方法には，通常の飼育条件で飼育したゼブラフィッシュを用いてもよく，あるいは，高脂肪餌を与えて肥満誘導したモデルゼブラフィッシュを用いてもよい。試験物質をゼブラフィッシュに投与する方法としては，候補物質が水溶性である場合には飼育水中に溶解すればよく，水不溶性である場合には適当な界面活性剤との複合体またはエマルジョンの形で飼育水中に懸濁すればよい。あるいは，ゼブラフィッシュの餌に混ぜて経口投与してもよく，注射などにより非経口投与してもよい。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法にゼブラフィッシュを用いることの利点は，試験物質がＭＸＤ３遺伝子の発現に及ぼす影響を測定できると同時に，毒性試験も行うことができることである。さらに，体重の変化，脂肪組織量の変化，心臓などの各種臓器の形態や機能の変化，各種マーカー遺伝子の発現量も測定することができる。
【００２２】
このようにして，本発明のスクリーニング方法により選択された物質は，肥満の抑制，体重増加の抑制，中性脂肪の低下作用を有する薬剤の候補物質として有用である。
【００２３】
肥満抑制剤
別の観点においては，本発明は，ＭＸＤ３遺伝子の発現を阻害する物質を有効成分として含有する肥満抑制剤を提供する。遺伝子の発現を阻害しうる阻害剤としては，例えば，
アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす分子（例えば，ｄｓＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）等の，ＭＸＤ３遺伝子の発現（転写および／または翻訳）の抑制剤を挙げることができる。このような核酸は，ＭＸＤ３の既知のヌクレオチド配列情報に基づいて容易に設計し製造することができ，ＭＸＤ３遺伝子またはＭＸＤ３をコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻害することができる。アンチセンス，リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは，ＭＸＤ３をコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ｍＲＮＡと特異的に結合し，転写および／または翻訳を阻害することにより蛋白質の発現を阻害する。結合はワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく，トリプレックス形成によるものでもよい。
【００２５】
リボザイムとは，標的とする核酸配列を切断しうる触媒的特性を有するＲＮＡ分子を表す。リボザイムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々の二次構造のリボザイム，例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは，二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。
【００２６】
本発明の肥満抑制剤は，被験者にそのまま投与することも可能であるが，通常，医薬で用いられる担体を用いて製剤して投与する。製剤に用いる担体としては，製剤分野で常用されるいずれのものをも用いることができ，例えば，滅菌水，生理食塩水，賦形剤，安定剤，酸化防止剤，緩衝剤，界面活性剤，結合剤等が好ましく用いられる。さらに，本発明の肥満抑制剤をマイクロカプセルや高分子ゲル中に封入して，徐放性製剤としてもよい。本発明の肥満抑制剤の投与経路としては，経口投与，静脈内投与，皮内投与，皮下投与，筋肉内投与，体腔内投与等が挙げられる。投与量は，肥満抑制剤の種類や投与経路，疾患の程度等に応じて適宜選択されるが，通常，０．１μg〜１０００mg/Kg，好ましくは，１μg〜１０mg/Kgである。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２８】
実施例１ 肥満誘導ゼブラフィッシュにおける腹腔内脂肪組織のＭＸＤ３遺伝子発現
ゼブラフィッシュ成魚（ＡＢ系統，受精後４ヶ月齢，オス）に，１匹あたりアルテミア６０ｍｇ／日をエサとして与え（肥満誘導），１週間後と２ヶ月後の腹腔内脂肪を回収した。さらに肥満誘導２ヶ月後，食事制限実験として，アルテミア２．５ｍｇ／日に減らした状態にして２週間飼育し，腹腔内脂肪を回収した。回収した脂肪組織からＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて，ｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製，Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ III（インビトロジェン社）を用いて，ｃＤＮＡを合成し，ＭＸＤ３遺伝子発現量を定量的ＰＣＲ法にて測定した。
【００２９】
ゼブラフィッシュＭＸＤ３遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオタイドの配列は，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに掲載されている，ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿２０１０５６ ＭＡＸ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ３ （ｍｘｄ３）を使用し，プライマーをデザインし，ＰＣＲ実験に使用した。
ｍｘｄ３プライマーの配列情報
フォワードプライマー：ＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＡＣＣＴＣＧＧＡＴ（配列番号１）
リバースプライマー：ＧＴＡＡＧＧＣＴＧＴＴＣＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴ（配列番号２）
【００３０】
結果を図１に示す。overfed 1Wは肥満誘導１週間目，overfed 2Wは肥満誘導２ヶ月目，overfed + diet restrictionは肥満誘導を２ヶ月処理したのち，２週間の食事制限を行った実験動物群である。これらのＭＸＤ３遺伝子発現量は，ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＩＮ，ＢＥＴＡの発現量で正規化した相対値で示される。図１に示すように，ＭＸＤ３遺伝子発現量は，肥満誘導２ヶ月目（overfed 2M）では，肥満誘導１週間に比較し，約４倍の有意な増加を認め，食事制限では減少する傾向を示した。
【００３１】
以上の結果から，肥満誘導を行うと腹腔内脂肪組織内のＭＸＤ３遺伝子発現量は増加し，食事制限を行うと低下することが明らかとなった。
【００３２】
実施例２ ＭＸＤ３遺伝子発現抑制が腹腔内脂肪組織量および脂肪組織関連遺伝子発現量に及ぼす影響
ゼブラフィッシュ成魚（ＡＢ系統あるいはｒｏｓｅ系統，受精後４ヶ月齢，メス）の腹腔内に，１ｋｇ体重あたり１００ｍｇ量の，ゼブラフィッシュＭＸＤ３遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを，リポフェクション法を用いて腹腔内投与した。
【００３３】
ゼブラフィッシュＭＸＤ３遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに掲載されている，ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿２０１０５６ ＭＡＸ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ３ （ｍｘｄ３），ｍＲＮＡの転写開始点に結合する相補的配列とした。ＭＸＤ３モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列情報は下記のとおりである。
ＧＡＴＧＴＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＣＣＴＣＣＡＴＴ（配列番号３）
【００３４】
比較対照群として，ゼブラフィッシュには存在しない遺伝子を標的としたコントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを同様の方法を用いて腹腔内投与した。コントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列情報は下記のとおりである。
ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ（配列番号４）
【００３５】
リポフェクション法には，リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）の試薬を用いた。各腹腔内投与は週に1回，day1, 7, 14, 21に行い，その期間，肥満誘導としてゼブラフィッシュのエサであるアルテミアを，１日６０ｍｇ投与した。
【００３６】
毎週１回，身長と体重を測定した結果，ＭＸＤ３遺伝子発現抑制群では，肥満誘導時の体重増加が有意に抑制された（図２）。身長については差を認めなかった。
【００３７】
また，３週間後の血漿中の中性脂肪値をＬタイプワコー ＴＧ・Ｈ（和光純薬）を用いて測定した。図３に結果を示す。normal fedは通常飼育動物群，overfedは肥満誘導群である。ＭＸＤ３遺伝子発現抑制により，血漿中の中性脂肪の量が減少した。摂食量については差を認めなかった。
【００３８】
なおＭＸＤ３遺伝子発現の抑制は，day 21の段階で，腹腔内臓器を摘出し，蛋白質を抽出して，ウェスタンブロット法にて確認した。ＭＸＤ３ ＭＯ投与群ではＭＸＤ３蛋白質量の減少が認められた。
【００３９】
蛍光色素の１種であるナイルレッドは，脂肪組織を特異的に染色することが知られている。ｒｏｓｅ系統のゼブラフィッシュを用いた場合，ナイルレッド染色によって，腹腔内の脂肪量を蛍光量にて測定できる。ＭＸＤ３ ＭＯを腹腔内投与し，肥満誘導３週間後のゼブラフィッシュに対して，ナイルレッド染色を行った結果，ＭＸＤ３ ＭＯ群ではコントロールと比較してその蛍光量が１／４に減弱していた（図４）。
【００４０】
さらに，腹腔内脂肪組織を剔出し，その組織に存在しているｍＲＮＡの量を定量的ＰＣＲ法で測定したところ，図５に示すように，脂肪細胞のマーカー遺伝子であるＣａｖｅｏｌｉｎ（ＣＡＶ），ＣＤ３６，Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｂ遺伝子の発現量の減少を認めた。
【００４１】
また，脂肪前駆細胞から成熟脂肪細胞への分化を誘導するＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｇａｍｍａ（ＰＰＡＲＧ），ＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＣＥＢＰＡ）遺伝子の発現量も減少していた（図６）。
これらの遺伝子の定量的ＰＣＲに用いたプライマー配列は下記のとおりである。
ＣＡＶ
フォワードプライマー：ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号５）
リバースプライマー：ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号６）
ＣＤ３６
フォワードプライマー：ＣＧＡＴＧＡＧＡＣＧＧＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡ（配列番号７）
リバースプライマー：ＣＣＣＡＧＡＡＡＴＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＣＡＧＴＴ（配列番号８）
Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｂ
フォワードプライマー：ＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＣＴＧＡＣＣ（配列番号９）
リバースプライマー：ＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＧＴＴＣＴＴＧＴ（配列番号１０）
ＰＰＡＲＧ
フォワードプライマー： ＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＧＡＴＣ（配列番号１１）
リバースプライマー：ＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＧＧＴＣＧＴＴＣＡ（配列番号１２）
ＣＥＢＰＡ
フォワードプライマー：ＧＴＡＣＣＴＡＧＴＣＣＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧ（配列番号１３）
リバースプライマー：ＣＴＧＴＡＣＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＴ（配列番号１４）
【００４２】
以上の結果から，ＭＸＤ３遺伝子の発現を阻害することにより，肥満誘導における体重増加，血漿中の中性脂肪量の増加が抑制され，腹腔内脂肪組織量および脂肪組織関連遺伝子発現量が減少し，前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化が抑制されたことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は，肥満抑制剤の候補物質のスクリーニングならびに肥満抑制剤の治療に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は，肥満抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は体重や体脂肪が増加した状態であるが，放置すると血管障害，糖尿病，脂質異常症，高血圧症等を発症し重大な合併症により死に至る病態である。食事療法，運動療法，薬物療法，行動療法，外科療法等が試みられているが，治療効果は不十分である。この中でも薬物療法は，現時点で膵臓リパーゼ阻害薬，選択的セロトニン／ノルエピネフリン再取り込み阻害薬，ノルアドレナリン作用薬等，その標的分子が限られており，臨床的効果も限界がある。
【０００３】
従来の治療法には，多くの重大な問題点が認められる。食事療法，運動療法，行動療法などは，有効性において多くの問題点を残している。外科療法は，手術によるリスクや術後の合併症や副作用が問題点となる。薬物療法は限られた薬理ターゲット分子による治療であるため，有効性や副作用に深刻な問題点を残している。今後薬物療法の有効性を改善し，深刻な副作用を軽減するためには，新しい治療遺伝子を標的にした治療戦略の開発が不可欠である。
【０００４】
その発現を阻害することにより肥満を抑制することができるということが発見されている遺伝子としては，MITF（microphthalmia transcription factor）がある。また，肥満に関連した遺伝子として，遺伝子RPL19，POMC，PC2，Prolactin，Leptin Rec.，HSG P25L2G＿lが報告されている（WO2001/029071）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2001/029071
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は，肥満抑制剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは，体重増加や脂肪増加とＭＸＤ３遺伝子の発現との間に相関があること，およびその発現機能を阻害することにより，肥満の重要な病態指標である体重，体脂肪，血清中性脂肪の増加を抑制することを見出した。
【０００８】
すなわち，本発明は，肥満抑制剤の候補物質を選択する方法であって，
試験物質を細胞と接触させ，
細胞におけるＭＸＤ３遺伝子の発現を測定し，そして，
試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されている場合に，その試験物質を肥満抑制剤の候補物質として選択する，
の各工程を含む方法を提供する。
【０００９】
別の観点においては，本発明は，肥満抑制剤の候補物質を選択する方法であって，
ゼブラフィッシュに試験物質を投与し，
ＭＸＤ３遺伝子の発現を測定し，そして，
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されている場合に，その試験物質を肥満抑制剤の候補物質として選択する，
の各工程を含む方法を提供する。
【００１０】
さらに別の観点においては，本発明は，ＭＸＤ３遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド，ＭＸＤ３遺伝子に対するリボザイム，ＭＸＤ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される物質を有効成分として含有する肥満抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のスクリーニング方法により選択された物質は，肥満の抑制，体重増加の抑制，中性脂肪の低下作用を有する薬剤の候補物質として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は，肥満誘導したゼブラフィッシュにおけるＭＸＤ３遺伝子の発現量を示す。
【図２】図２は，ＭＸＤ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した肥満誘導ゼブラフィッシュの体重の変化を示す。
【図３】図３は，ＭＸＤ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した肥満誘導ゼブラフィッシュの血漿中性脂肪値を示す。
【図４】図４は，ＭＸＤ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した肥満誘導ゼブラフィッシュの脂肪組織量を示す。
【図５】図５は，ＭＸＤ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した肥満誘導ゼブラフィッシュにおけるＣＡＶ，ＣＤ３６およびアジポネクチンｂ遺伝子の発現量を示す。
【図６】図６は，ＭＸＤ３遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した肥満誘導ゼブラフィッシュにおけるＰＰＡＲＧおよびＣＥＢＰＡ遺伝子の発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明においては，ゼブラフィッシュに肥満誘導を行うと腹腔内脂肪組織内のＭＸＤ３遺伝子発現量が増加し，食事制限を行うと低下することが見いだされた。また，下記の実施例に示されるように，肥満誘導したゼブラフィッシュにＭＸＤ３遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すると，体重増加や腹腔内脂肪組織量の増加が抑制され，脂肪組織関連遺伝子発現量が減少することが見いだされた。これらの結果から，ＭＸＤ３遺伝子は肥満の治療標的となりうること，およびＭＸＤ３遺伝子の発現の抑制を指標として，肥満抑制剤の候補物質を同定しうることが明らかとなった。
【００１４】
ＭＸＤ３は，ＭＡＤ３またはＭＧＣ２３８３とも称され，Mycスーパーファミリーに属する転写制御因子である。ヒトのＭＸＤ３の遺伝子および蛋白質の配列はNCBI: NM＿001142935.1に記載されている。この蛋白質は，補因子ＭＡＸとともにヘテロダイマーを形成し，標的遺伝子のプロモータに結合してその転写を調節する。ＭＡＸ−ＭＸＤ３複合体を解離させると細胞増殖の制御が異常となるため，ＭＸＤ３は腫瘍発生に関与することが示唆されている。これまで，ＭＸＤ３遺伝子または蛋白質の発現と肥満や脂肪細胞の増殖との関連性についての示唆はない。
【００１５】
スクリーニング方法
１つの観点においては，本発明は，多様な試験物質から，肥満抑制剤の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は，試験物質が試験管内または細胞内でＭＸＤ３遺伝子の発現を阻害する能力を測定することにより評価することができる。試験物質がＭＸＤ３遺伝子の発現を阻害する能力は，試験物質をＭＸＤ３遺伝子を発現する細胞と接触させて，ＭＸＤ３のｍＲＮＡ量または蛋白質量を測定することにより評価することができる。試験物質と接触させたときに，接触させないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されれば，その試験物質は肥満抑制剤の候補物質であると考えられる。
【００１６】
試験物質は，種々の合成または天然の化合物ライブラリー，コンビナトリアルライブラリー，オリゴヌクレオチドライブラリー，ペプチドライブラリー等のライブラリーから得ることができる。また，細菌，真菌類，藻類，植物，動物等の天然物からの抽出物やその部分精製物を試験物質として用いてもよい。
【００１７】
ＭＸＤ３遺伝子の発現を測定するためには，RT-PCR法，RNA増幅法，ISH（in situ hybridization）法，ISP（in situ PCR）法，レーザーマイクロダイセクション法，レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法（LCM）などの，当該技術分野においてよく知られる遺伝子発現分析法を用いることができる。また，ＭＸＤ３の蛋白質量は，抗ＭＸＤ３抗体を用いるＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などにより測定することができる。ヒト，ラット，マウス，ゼブラフィッシュなどのＭＸＤ３蛋白質およびこれをコードする遺伝子の配列は公表されている。
【００１８】
ＭＸＤ３遺伝子を発現する細胞としては，各種の組織に由来する初代培養組織や培養細胞株などの任意のものを用いることができる。ＭＸＤ３遺伝子を強制発現させるよう遺伝子組換えされた細菌，酵母，昆虫細胞，動物細胞等を用いてもよい。
【００１９】
１つの好ましい態様においては，試験物質をゼブラフィッシュに投与して，ＭＸＤ３遺伝子の発現を調べる。ゼブラフィッシュ（属名Danio，例えばDanio rerio）とはインド原産の小型の熱帯魚である。主要臓器・組織の発生・構造などがヒトと良く似ているうえ，身体が透明であるため各種臓器および血管の形態を肉眼で観察することができるため，モデル動物として新薬候補化合物のスクリーニングに用いるのに適している。
【００２０】
本発明の方法には，通常の飼育条件で飼育したゼブラフィッシュを用いてもよく，あるいは，高脂肪餌を与えて肥満誘導したモデルゼブラフィッシュを用いてもよい。試験物質をゼブラフィッシュに投与する方法としては，候補物質が水溶性である場合には飼育水中に溶解すればよく，水不溶性である場合には適当な界面活性剤との複合体またはエマルジョンの形で飼育水中に懸濁すればよい。あるいは，ゼブラフィッシュの餌に混ぜて経口投与してもよく，注射などにより非経口投与してもよい。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法にゼブラフィッシュを用いることの利点は，試験物質がＭＸＤ３遺伝子の発現に及ぼす影響を測定できると同時に，毒性試験も行うことができることである。さらに，体重の変化，脂肪組織量の変化，心臓などの各種臓器の形態や機能の変化，各種マーカー遺伝子の発現量も測定することができる。
【００２２】
このようにして，本発明のスクリーニング方法により選択された物質は，肥満の抑制，体重増加の抑制，中性脂肪の低下作用を有する薬剤の候補物質として有用である。
【００２３】
肥満抑制剤
別の観点においては，本発明は，ＭＸＤ３遺伝子の発現を阻害する物質を有効成分として含有する肥満抑制剤を提供する。遺伝子の発現を阻害しうる阻害剤としては，例えば，
アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす分子（例えば，ｄｓＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）等の，ＭＸＤ３遺伝子の発現（転写および／または翻訳）の抑制剤を挙げることができる。このような核酸は，ＭＸＤ３の既知のヌクレオチド配列情報に基づいて容易に設計し製造することができ，ＭＸＤ３遺伝子またはＭＸＤ３をコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻害することができる。アンチセンス，リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは，ＭＸＤ３をコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ｍＲＮＡと特異的に結合し，転写および／または翻訳を阻害することにより蛋白質の発現を阻害する。結合はワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく，トリプレックス形成によるものでもよい。
【００２５】
リボザイムとは，標的とする核酸配列を切断しうる触媒的特性を有するＲＮＡ分子を表す。リボザイムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々の二次構造のリボザイム，例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは，二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。
【００２６】
本発明の肥満抑制剤は，被験者にそのまま投与することも可能であるが，通常，医薬で用いられる担体を用いて製剤して投与する。製剤に用いる担体としては，製剤分野で常用されるいずれのものをも用いることができ，例えば，滅菌水，生理食塩水，賦形剤，安定剤，酸化防止剤，緩衝剤，界面活性剤，結合剤等が好ましく用いられる。さらに，本発明の肥満抑制剤をマイクロカプセルや高分子ゲル中に封入して，徐放性製剤としてもよい。本発明の肥満抑制剤の投与経路としては，経口投与，静脈内投与，皮内投与，皮下投与，筋肉内投与，体腔内投与等が挙げられる。投与量は，肥満抑制剤の種類や投与経路，疾患の程度等に応じて適宜選択されるが，通常，０．１μg〜１０００mg/Kg，好ましくは，１μg〜１０mg/Kgである。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２８】
実施例１ 肥満誘導ゼブラフィッシュにおける腹腔内脂肪組織のＭＸＤ３遺伝子発現
ゼブラフィッシュ成魚（ＡＢ系統，受精後４ヶ月齢，オス）に，１匹あたりアルテミア６０ｍｇ／日をエサとして与え（肥満誘導），１週間後と２ヶ月後の腹腔内脂肪を回収した。さらに肥満誘導２ヶ月後，食事制限実験として，アルテミア２．５ｍｇ／日に減らした状態にして２週間飼育し，腹腔内脂肪を回収した。回収した脂肪組織からＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて，ｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製，Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ III（インビトロジェン社）を用いて，ｃＤＮＡを合成し，ＭＸＤ３遺伝子発現量を定量的ＰＣＲ法にて測定した。
【００２９】
ゼブラフィッシュＭＸＤ３遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオタイドの配列は，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに掲載されている，ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿２０１０５６ ＭＡＸ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ３ （ｍｘｄ３）を使用し，プライマーをデザインし，ＰＣＲ実験に使用した。
ｍｘｄ３プライマーの配列情報
フォワードプライマー：ＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＡＣＣＴＣＧＧＡＴ（配列番号１）
リバースプライマー：ＧＴＡＡＧＧＣＴＧＴＴＣＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴ（配列番号２）
【００３０】
結果を図１に示す。overfed 1Wは肥満誘導１週間目，overfed 2Wは肥満誘導２ヶ月目，overfed + diet restrictionは肥満誘導を２ヶ月処理したのち，２週間の食事制限を行った実験動物群である。これらのＭＸＤ３遺伝子発現量は，ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＩＮ，ＢＥＴＡの発現量で正規化した相対値で示される。図１に示すように，ＭＸＤ３遺伝子発現量は，肥満誘導２ヶ月目（overfed 2M）では，肥満誘導１週間に比較し，約４倍の有意な増加を認め，食事制限では減少する傾向を示した。
【００３１】
以上の結果から，肥満誘導を行うと腹腔内脂肪組織内のＭＸＤ３遺伝子発現量は増加し，食事制限を行うと低下することが明らかとなった。
【００３２】
実施例２ ＭＸＤ３遺伝子発現抑制が腹腔内脂肪組織量および脂肪組織関連遺伝子発現量に及ぼす影響
ゼブラフィッシュ成魚（ＡＢ系統あるいはｒｏｓｅ系統，受精後４ヶ月齢，メス）の腹腔内に，１ｋｇ体重あたり１００ｍｇ量の，ゼブラフィッシュＭＸＤ３遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを，リポフェクション法を用いて腹腔内投与した。
【００３３】
ゼブラフィッシュＭＸＤ３遺伝子特異的モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに掲載されている，ＬＯＣＵＳ ＮＭ＿２０１０５６ ＭＡＸ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ３ （ｍｘｄ３），ｍＲＮＡの転写開始点に結合する相補的配列とした。ＭＸＤ３モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列情報は下記のとおりである。
ＧＡＴＧＴＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＣＣＴＣＣＡＴＴ（配列番号３）
【００３４】
比較対照群として，ゼブラフィッシュには存在しない遺伝子を標的としたコントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを同様の方法を用いて腹腔内投与した。コントロールモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列情報は下記のとおりである。
ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ（配列番号４）
【００３５】
リポフェクション法には，リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）の試薬を用いた。各腹腔内投与は週に1回，day1, 7, 14, 21に行い，その期間，肥満誘導としてゼブラフィッシュのエサであるアルテミアを，１日６０ｍｇ投与した。
【００３６】
毎週１回，身長と体重を測定した結果，ＭＸＤ３遺伝子発現抑制群では，肥満誘導時の体重増加が有意に抑制された（図２）。身長については差を認めなかった。
【００３７】
また，３週間後の血漿中の中性脂肪値をＬタイプワコー ＴＧ・Ｈ（和光純薬）を用いて測定した。図３に結果を示す。normal fedは通常飼育動物群，overfedは肥満誘導群である。ＭＸＤ３遺伝子発現抑制により，血漿中の中性脂肪の量が減少した。摂食量については差を認めなかった。
【００３８】
なおＭＸＤ３遺伝子発現の抑制は，day 21の段階で，腹腔内臓器を摘出し，蛋白質を抽出して，ウェスタンブロット法にて確認した。ＭＸＤ３ ＭＯ投与群ではＭＸＤ３蛋白質量の減少が認められた。
【００３９】
蛍光色素の１種であるナイルレッドは，脂肪組織を特異的に染色することが知られている。ｒｏｓｅ系統のゼブラフィッシュを用いた場合，ナイルレッド染色によって，腹腔内の脂肪量を蛍光量にて測定できる。ＭＸＤ３ ＭＯを腹腔内投与し，肥満誘導３週間後のゼブラフィッシュに対して，ナイルレッド染色を行った結果，ＭＸＤ３ ＭＯ群ではコントロールと比較してその蛍光量が１／４に減弱していた（図４）。
【００４０】
さらに，腹腔内脂肪組織を剔出し，その組織に存在しているｍＲＮＡの量を定量的ＰＣＲ法で測定したところ，図５に示すように，脂肪細胞のマーカー遺伝子であるＣａｖｅｏｌｉｎ（ＣＡＶ），ＣＤ３６，Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｂ遺伝子の発現量の減少を認めた。
【００４１】
また，脂肪前駆細胞から成熟脂肪細胞への分化を誘導するＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｇａｍｍａ（ＰＰＡＲＧ），ＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＣＥＢＰＡ）遺伝子の発現量も減少していた（図６）。
これらの遺伝子の定量的ＰＣＲに用いたプライマー配列は下記のとおりである。
ＣＡＶ
フォワードプライマー：ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号５）
リバースプライマー：ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号６）
ＣＤ３６
フォワードプライマー：ＣＧＡＴＧＡＧＡＣＧＧＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡ（配列番号７）
リバースプライマー：ＣＣＣＡＧＡＡＡＴＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＣＡＧＴＴ（配列番号８）
Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｂ
フォワードプライマー：ＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣＧＴＡＣＣＡＴＣＴＧＡＣＣ（配列番号９）
リバースプライマー：ＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＧＴＴＣＴＴＧＴ（配列番号１０）
ＰＰＡＲＧ
フォワードプライマー： ＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＧＡＴＣ（配列番号１１）
リバースプライマー：ＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＧＧＴＣＧＴＴＣＡ（配列番号１２）
ＣＥＢＰＡ
フォワードプライマー：ＧＴＡＣＣＴＡＧＴＣＣＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧ（配列番号１３）
リバースプライマー：ＣＴＧＴＡＣＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＴ（配列番号１４）
【００４２】
以上の結果から，ＭＸＤ３遺伝子の発現を阻害することにより，肥満誘導における体重増加，血漿中の中性脂肪量の増加が抑制され，腹腔内脂肪組織量および脂肪組織関連遺伝子発現量が減少し，前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化が抑制されたことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は，肥満抑制剤の候補物質のスクリーニングならびに肥満抑制剤の治療に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満抑制剤の候補物質を選択する方法であって，
試験物質を細胞と接触させ，
細胞におけるＭＸＤ３遺伝子の発現を測定し，そして，
試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されている場合に，その試験物質を肥満抑制剤の候補物質として選択する，
の各工程を含む方法。
【請求項２】
肥満抑制剤の候補物質を選択する方法であって，
ゼブラフィッシュに試験物質を投与し，
ＭＸＤ３遺伝子の発現を測定し，そして，
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されている場合に，その試験物質を肥満抑制剤の候補物質として選択する，
の各工程を含む方法。
【請求項３】
ＭＸＤ３遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド，ＭＸＤ３遺伝子に対するリボザイム，ＭＸＤ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される物質を有効成分として含有する肥満抑制剤。
【請求項１】
肥満抑制剤の候補物質を選択する方法であって，
試験物質を細胞と接触させ，
細胞におけるＭＸＤ３遺伝子の発現を測定し，そして，
試験物質と接触させたときに接触させていないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されている場合に，その試験物質を肥満抑制剤の候補物質として選択する，
の各工程を含む方法。
【請求項２】
肥満抑制剤の候補物質を選択する方法であって，
ゼブラフィッシュに試験物質を投与し，
ＭＸＤ３遺伝子の発現を測定し，そして，
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＭＸＤ３遺伝子の発現が抑制されている場合に，その試験物質を肥満抑制剤の候補物質として選択する，
の各工程を含む方法。
【請求項３】
ＭＸＤ３遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド，ＭＸＤ３遺伝子に対するリボザイム，ＭＸＤ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡからなる群より選択される物質を有効成分として含有する肥満抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−５５７５５（Ｐ２０１１−５５７５５Ａ）
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０８２７２（Ｐ２００９−２０８２７２）
【出願日】平成２１年９月９日（２００９．９．９）
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月９日（２００９．９．９）
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
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