Ｎ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する抗ウイルス剤、それを含有する、抗ウイルス組成物、食餌及び動物用飼料
【課題】ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療し、環境中の感染性ウイルスを除去しえる、抗ウイルス剤を提供する。安全性に優れ、ヒトや動物の感染症の原因となる病原性ウイルスに対する抗ウイルス組成物を提供する。ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療する食餌を提供する。環境中の感染性ウイルスを除去でき、ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療する動物用飼料を提供する。
【解決手段】Ｎ−メチルピリジニウム化合物の蟻酸塩を有効成分として含有してなる抗ウイルス剤。
【解決手段】Ｎ−メチルピリジニウム化合物の蟻酸塩を有効成分として含有してなる抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する抗ウイルス剤、それを含有する、抗ウイルス組成物、食餌及び動物用飼料に関する。
さらに詳しくは、単純ヘルペスからコロナまで広範囲の病原性ウイルスに対して抗ウイルス作用を有し、感染したヒトおよび動物の感染症の予防ないしは治療する抗ウイルス剤、それを含有する抗ウイルス組成物、食餌及び動物用飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染を予防する有効で安価な方法はない。懸念される感染源に対して適当するワクチンがあればよいが、流行の予想株が外れれば無効となるし、ウイルス変異が起こればやはり無効となる。発症後の医療用医薬品として、アマンタジン、リバビリン、タミフルがあるが、一般人が日常安心して使えるようなものではない。安全で有効な抗ウイルス剤の開発は焦眉の急とされている。
家畜などの環境において、例えばトリインフルエンザの予防には消毒薬で対応するしか方策がない。トリインフルエンザの変異によるヒトへの感染が懸念されているが、日常の対応策は見出されていない。食材のなかにもウイルス感染症、またはウイルス感染予防に有用なものはない。
ところで、コーヒーを飲む人は飲まない人に比べて肝臓癌の罹患率が優位に低いことが報告されている。肝臓がんは、その９０％以上がＢ型・Ｃ型ウイルス感染に起因している。最近ペグインターフェロンとリバビリン併用によるＣ型肝炎ウイルス除去治療が注目されているが、ペグインターフェロンの無効例や何らかの理由でこれを使えない患者に、コーヒーを飲むことを勧める医者は未だいない。
トリインフルエンザのトリとトリ以外の動物間での感染は明らかに拡大している。トリインフルエンザがやがてヒトに感染し始めるのは時間の問題とも言われている。しかし、環境の保全と新型ワクチン創製以外の有効な方策は見つかっていないのが現状である。
抗ウイルス剤として、例えば、トリソジディウムホスホノホルメート（登録商標フォスカビル；アストラゼネカ社製）は、ＡＩＤＳ患者のＣＭＶ（サイトメガロウイルス）治療のため市販された（１９９１〜）。作用機序はＤＮＡポリメラーゼ抑制であり、最近の総説論文に引用されている（例えば、非特許文献１参照。）。耐性化が早く、骨組織に蓄積し、腎毒性がある。
従来、人体に無毒な抗ウイルス剤は知られていなかったし、一般に摂取する食材から発見されたことも抗ウイルス剤も存在しなかった。
コーヒーを飲んでいる人は肝臓癌になり難いという疫学調査結果は、コーヒーに抗肝炎ウイルス作用があることを示唆していた（非特許文献２）。
【非特許文献１】Ｋ．Ｋ．Ｂｉｒｏｎ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ７１：１５４−６３，２００６
【非特許文献２】Ｍ． Ｉｎｏｕｅ， Ｉ． Ｙｏｓｈｉｍｉ， Ｔ． Ｓｏｂｕｅ， Ｓ． Ｔｓｕｇａｎｅ； ＪＰＨＣ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｆｆｅｅ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｏｎ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｒｉｓｋ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ： ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｉｎ Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９７：２９２−３００ （２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、上述のような問題点を解消するため、ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療し、さらに環境中の感染性ウイルスを除去しえる、抗ウイルス剤を提供することにある。
また、本発明の目的は、安全性に優れ、ヒトや動物の感染症の原因となる病原性ウイルスに対する抗ウイルス組成物を提供することにある。
また、本発明の目的は、ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療する食餌を提供することにある。
本発明の他の目的は、環境中の感染性ウイルスを除去でき、ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療する動物用飼料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は下記手段により達成された。
すなわち本発明は、
（１） 下記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
【０００５】
【化１】
【０００６】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン、水酸基又はチオール基を表し、Ｘは脂肪酸イオン、無機酸イオン、芳香族カルボン酸イオン又はハロゲンを表す。
（２）前記一般式１において、Xが蟻酸イオンであることを特徴とする（１）に記載の抗ウイルス剤、
（３） 前記抗ウイルス剤が、焙煎コーヒー豆から得られることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の抗ウイルス剤、
（４） 下記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する焙煎コーヒー抽出液を含む抗ウイルス組成物、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン、水酸基又はチオール基を表し、Ｘは脂肪酸イオン、無機酸イオン、芳香族カルボン酸イオン又はハロゲンを表す。
（５） 前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤又は（４）に記載の抗ウイルス組成物を含有するウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の食餌、及び
（６） 前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤又は（４）に記載の抗ウイルス組成物を含有するウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の動物用飼料
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の抗ウイルス剤は、ウイルス増殖抑制作用だけでなく、直接的な殺ウイルス作用をも有している。
本発明の抗ウイルス剤は、抗ウイルス作用を単純ヘルペスからコロナまで広範囲のウイルスに及ぼすことができる。
本発明の抗ウイルス剤は、経口投与で人体に無害である。予防的、治療的応用範囲があり、医薬品のみならず、農薬、水産業等への広範な応用が可能である。
本発明の抗ウイルス剤は、ヒトと動物のウイルス感染の予防ないしは治療が期待され、医療用医薬品、農薬、動物薬、大衆薬等に好適である。
本発明の抗ウイルス組成物は、焙煎コーヒー豆から抽出し製造することができる。
本発明の食餌は、生活習慣的に常用されている食品に含ませることにより、又はウイルス感染予防を期待する健康食品とすることにより、長期の生活期間において、ウイルス感染の予防をすることができる。
本発明の動物用飼料は、環境中の感染性ウイルスを除去でき、ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
まず、本発明の抗ウイルス剤について説明する。
本発明の抗ウイルス剤は、前記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有してなる。前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物は焙煎コーヒー成分として新たに見出された。
前記一般式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５としては、水素原子、炭素数１〜３の低級アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基）、水酸基、チオール基、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン等が挙げられるが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも４つが水素原子であることが好ましく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のいずれもが水素原子であることがより好ましい。
前記Ｘで表される脂肪酸イオンとしては、炭素数１〜１０を有する脂肪酸イオンが挙げられ、蟻酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、シュウ酸イオン、乳酸イオン等が好ましい。炭素数１〜１０を有するアルキルスルホン酸イオンであってもよい。
前記Ｘで表される前記無機酸としては、リン酸イオン、硫酸イオン、亜硫酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン等が挙げられる。
前記Ｘとしては、前記脂肪酸イオンが好ましく、蟻酸イオンが特に好ましい。
【０００９】
ヨーグルト保存用として蟻酸の抗ウイルス作用が報告されている（米国特許第４，８３４，９８７号 Ａ． Ｌｅｍｂｋｅ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｄ．）。
コーヒー豆を焙煎したときに蟻酸は産生され、蟻酸は焙煎コーヒーの種類を問わず含まれている。
しかし、実施例の項の比較例で後述するように、本発明者らは、蟻酸の抗ウイルス作用はコーヒー抽出液には及ばない弱いものであることを確認している。
焙煎コーヒーの中で蟻酸はその沸点が１００℃とさほど高くはないにも拘らず、２００℃程度の焙煎でも揮散しない。そこで何らかの陽イオンと塩を形成して存在すると考え、本発明者らは、焙煎コーヒー成分としてのＮ−メチルピリジニウム化合物が、蟻酸と塩を形成していることを見出した。
本発明の抗ウイルス剤の好ましい１例であるＮ−メチルピリジニウムホルメートが、コーヒー焙煎中に産生される反応式を下記スキーム1に示す。
スキーム１
【００１０】
【化２】
【００１１】
生豆中のトリゴネリンは、２００℃以上の加熱によって脱炭酸反応を起こして炭酸ガスを放出し、本発明の抗ウイルス剤の好ましい１例であるＮ−メチルピリジニウムホルメートに変化する。焙煎コーヒー中でその一部はアセテートとしても存在していると考えられる。
これまでに、トリゴネリンを２００℃以上に加熱すると、そのメチル基が脱離して、ニコチン酸に変化することが知られていた。しかし、その変化率は微小であり、１０％を超えることはない。それに対し、脱炭酸反応は、これまで知られていなかったトリゴネリン熱分解の主反応であり、実施例の項において図３を参照して参考例２で後述するように、変化率は焙煎条件によって７０〜８０％に達しえる。
【００１２】
本発明者らは、前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物が抗ウイルス作用を有することを見出した。したがって、前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有してなる本発明の抗ウイルス剤は新規な抗ウイルス剤である。特に、本発明の抗ウイルス剤は、殺インフルエンザウイルス作用を有する。
前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物を焙煎コーヒー豆から得る方法については、焙煎コーヒー豆を挽く方法、挽き豆の粗さについて特に制限はなく、さらにその豆からの抽出方法についても何ら制限はない。さらに、焙煎コーヒー液を抽出した後の焙煎コーヒー豆残留物中にも、前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物は含まれている。
本発明におけるコーヒー抽出液は、焙煎コーヒー豆の挽き豆粉末を任意の温度の水で抽出することで得られ、該コーヒー抽出液を減圧濃縮し、凍結乾燥又はスプレードライ等により粉末としたものであってもよい。
前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物は、焙煎コーヒー豆から得られたものに制限されることはなく、任意の有機合成的手法、生化学的手法により製造されたものであってよい。
前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物を含有する焙煎コーヒー抽出液によるＨＳＶ−１増殖抑制の機構について解析した結果から、本発明の抗ウイルス剤は、下記２つの異なる機構により抗ウイルス作用を有する。
［１］感染性ウイルス粒子の感染性を直接的に不活化することができ、かつ
［２］感染細胞におけるウイルス増殖を最終段階の子孫ウイルス形成の段階（例えば、ヌクレオシドがエンベロープを獲得する段階）を阻害することができる。
【００１３】
本発明の抗ウイルス組成物は、前記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する焙煎コーヒー抽出液を含んでなる。
本発明の抗ウイルス組成物は、代表的なエンベロープＤＮＡウイルスである単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の増殖及び感染細胞での細胞死誘導に対するコーヒー抽出液のウイルス抑制作用の試験結果から、通常の飲用濃度の５分の１という低濃度ですらウイルス増殖抑制作用を有する。
本発明の抗ウイルス組成物としてのコーヒー抽出液は、スプレードライ法と凍結乾燥法のいずれによって得られたインスタントコーヒーであっても、レギュラーコーヒーと同程度のウイルス増殖抑制作用を有する。
本発明におけるウイルス増殖抑制作用は、コーヒー生豆の産地及び焙煎方法によらず、どの焙煎コーヒー抽出液でも有する。
また、実施例１で後述するように焙煎コーヒー抽出液はエンベロープを持たない代表的なＲＮＡウイルスであるポリオウイルスの増殖も抑制することを確認している。
しかし、焙煎コーヒー抽出液は、ＨＳＶ−１の場合と異なり、ポリオウイルスの感染性を直接的に不活化することはないことを実験的に確認している。
以上の実験的確認から、焙煎コーヒー抽出液の抗ウイルス作用が、焙煎コーヒーに含まれている前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物によるものであることを示している。
【００１４】
本発明の抗ウイルス剤又は抗ウイルス組成物は、静脈的、経口的に投与することができるが、四級塩基の消化管吸収率は低いという観点から、注射剤により静脈的に投与するのが好ましい。
また、幾つかの医学的に許容される経路（例えば、吸入、経皮膚、経粘膜）によって投与することもできるが、感染局所への直接投与が有効と考えられるので、外用薬、嗽薬、点眼・点鼻薬、膣坐薬等が挙げられる。
本発明の抗ウイルス剤又は抗ウイルス組成物の投与量は、感染症の種類、その程度、患者の年齢及び性別により変動し一義的に定められるものではないが、ヒトへのその投与量は、有効成分として１〜５ｍｇ／ｋｇ／日が好ましく、５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日がより好ましい。
次に、本発明のウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の食餌について説明する。
本発明において、広く、多くの人に嗜好品として愛好されているコーヒーに含まれている前記一般式（１）で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物が少なくとも１種含有してなる食餌とすることができる。
Ｎ−メチルピリジニウム化合物を食餌として日常的に摂取することは、例えば、慢性的なウイルス感染症の治療ないしは予防につながる。
本発明の食餌は、コーヒー、牛乳、清涼飲料水、パン、ビスケット等任意の飲食品に、各飲食品の特性、目的に応じ、製造工程で、また飲食時に適宜、添加したものとすることができる。また、本発明の食餌は、任意の製剤方法により錠剤、顆粒剤、散剤などとしてもよい。
【００１５】
本発明の食餌は、例えば、デキストリン、澱粉等の糖類；乳蛋白質、大豆蛋白質、ゼラチン等の蛋白質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、ローカストビーンガム、キサンタンガム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより製造することができる。
【００１６】
本発明の食餌の形態としては、粉乳、加工乳、発酵乳、チーズ、バター、クリーム等の乳製品；乳酸飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料等の飲料；アイスクリーム、シャーベット、氷菓等の冷菓類；そば、うどん等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、チョコレート、錠菓、ビスケット、ゼリー、ジャム、焼き菓子類等の菓子類；マーガリン、バター、ショートニング、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；スープ、サラダ、パン、；経腸栄養剤：機能性食品等が挙げられる。
【００１７】
次に、本発明のウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の動物用飼料について説明する。
本発明の動物用飼料は、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類；大豆油粕、菜種油粕等の植物性油粕；フスマ、麦糠、米糠等の糠類；脱脂粉乳、ホエー、魚粉等の動物性飼料類；ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；アミノ酸類；糖類等を配合することにより製造することが可能である。動物用飼料として具体的には、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
本発明の動物用飼料は、トリインフルエンザ予防を目的とする環境保全のために、焙煎コーヒー抽出液や抽出糟を鶏舎に撒布したり、飼料に混入させることができる。
【００１８】
これによって、慢性ウイルス感染症患者、体調不良によってウイルス感染症の回帰発症の危険性が高いヒトを含む動物、特定のウイルス感染症が流行する時期のヒトを含む動物、乳幼児や高齢者等のウイルス感染症の予防および抗ウイルス治療薬服用時の補助的な食品等として抗ウイルス作用を享受することができる。
【実施例】
【００１９】
次に、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１ 焙煎コーヒー中のＮ−メチルピリジニウム陽イオンの同定
アラビカ種のコーヒー生豆１００ｇを２２０℃で２５分間焙煎した。室温まで冷却した後、通常の電気コーヒーミルで１０秒間処理して粉末状とした。次に、温水を加えて１００℃に加熱し、１０分間緩やかに煮沸した後、室温まで冷却してから、全量を１００ｍＬとなるように調整した。溶液の０．７ｍＬをＮＭＲ測定管に取り、内部標準化合物としてＴｓｐ０．５８ｍｍｏｌを添加して、６００ＭＨｚのＮＭＲ測定装置を用い、水シグナル消去法で測定した。得られたスペクトルの１例を図１に示す。図２は、図１のスペクトルの７．５〜９．５ｐｐｍの範囲の部分拡大図である。
Ｎ−メチルピリジニウム陽イオンのＮ−メチル基に基づくシグナルは４．４１ｐｐｍの一重線であり（図１参照。）、ピリジン骨格に直接結合したプロトンに基づくシグナルは８．７９ｐｐｍの２位プロトンの二重線、８．０７ｐｐｍの３位プロトンの三重線、並びに８．５４ｐｐｍの４位プロトンの三重線であった（図２参照。）。化学構造式を同定するため、別途に従来法に準じて合成したＮ−メチルピリジニウムホルメートの１ｍｍｏｌをサンプル溶液に添加して測定した。その結果、上記のシグナルの全てが重なり合ったので、コーヒー焙煎によって産生した化合物は、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートであることが判明した。また、焙煎コーヒーには蟻酸よりも多量の酢酸が含まれている。酢酸は蟻酸よりも弱い酸であるから、Ｎ−メチルピリジニウム陽イオンのカウンターイオンとしての寄与は、蟻酸のほうが強いと考えられる。
【００２０】
参考例２ コーヒー焙煎中のＮ−メチルピリジニウムホルメートの産生量の変化
参考例１のコーヒー豆焙煎中に、焙煎開始後の３、５、１０、１５、２０、２５、３０分に豆の一部を採取して、Ｎ−メチルピリジニウム塩の含量をＮＭＲを使って定量分析した。定量分析では０．００ｐｐｍに見られるＴｓｐシグナルを基準として、４．４１ｐｐｍに見られるＮ−メチルピリジニウムのメチル基プロトンのシグナル面積比を用い、検量線を作成した。この検量線を基に、下記（式１）により得られたＮ−メチルピリジニウム陽イオンの量（ｍｍｏｌ）を算出した。
【００２１】
【数１】
【００２２】
前記（式１）において、Ｘはサンプル０．７ｍＬ中に含まれているＮ−メチルピリジニウム陽イオンのモル当量を表し、ＳPyrはＮ−メチルピリジニウム陽イオンのメチル基シグナルの面積を表し、ＳTspはＴｓｐ由来のシグナルの面積を表す。結果は図３に示すとおりである。
図３は、焙煎時間経過にともなうコーヒー豆中の成分含有量の変化を示す図である。
図３中、縦軸は、式1で求めた数値Ｘ（ｍｍｏｌ）を重量に換算し、さらに、カフェイン含量を１００としたときの各成分の相対含量（％）を表している。焙煎したアラビカ種コーヒーの1杯分はおおよそコーヒー豆１０ｇに相当し、そのカフェイン含量の平均値はほぼ１００ｍｇであるから、図３中縦軸の各成分の数値は、そのまま各成分のコーヒー豆１０ｇ中の含量ｍｇに相当している。
図３から明らかなように、ピリジニウム陽イオンの焙煎コーヒー豆中の含有量は、従来から焙煎コーヒー豆に含まれていることが知られているニコチン酸を上回る増加曲線を示していることが分かる。
【００２３】
実施例１ コーヒー抽出液の抗ウイルス作用
ウイルスとしてＨＳＶ−１Ｆ株、細胞としてヒト由来のＨＥｐ−２細胞を用いた。ウイルスの定量はＶｅｒｏ細胞を用いてプラック法にて行った。試料としたコーヒー抽出液は、１）通常のコーヒーメーカーを用いて、市販の焙煎コーヒー１１．４ｇを熱水１００ｍＬで抽出後、ミリポアフィルター（０．２２μｍ）でろ過滅菌したもの、２）市販のインスタントコーヒー１０ｇを１００ｍＬの熱水に溶解したものを、同様にろ過滅菌したものを用いた。
ＨＥｐ−２細胞を単層培養し、細胞1個当たりのウイルス数をＰＦＵ感染単位で１０〜２０個感染させた。この感染細胞を０．１％ウシ血清アルブミンを含むＭＥＭ培地（イーグルの最低必須培地）を用いて培養し、ウイルスの細胞内侵入が完了した時点で、種々の濃度に調整したコーヒー抽出液を培養液に添加し、２４時間培養した。コーヒー抽出液の添加に際しては、培養液の希釈を避けるため、コーヒー液と同量の２倍濃縮ＭＥＭを同時添加した。感染細胞に生じた子孫ウイルス量は、感染細胞を培養液と共に２回凍結融解し、細胞内ウイルスを細胞外に放出させた後、細胞融解液中の感染性ウイルスをプラック法で定量した。結果を図４に示す。図４は、種々のコーヒーによるＨＳＶ−１増殖の抑制作用を示す図である。
図４は、細胞1個当たりの感染ウイルス数を１０として試験し、縦軸の数値は、コーヒーを含まない培地でのウイルス収量を１としたときの、各コーヒー濃度における比ウイルス収量を示す図である。○はマンダリン、△はキリマンジェロ、□はコロンビア、●はモカ、▲はブラジル豆である。
図４において、「コーヒー抽出液に対する濃度％」とは、上記１）又は２）の手法により得られたコーヒー抽出液の濃度（通常の飲用濃度）を１００％とした百分率で示す値である。例えば、上記コーヒー抽出液を１／５に希釈した濃度は図４において２０％となる（以下、同様である。）。
図４から明らかなように、コーヒー抽出液を細胞の培養液に加えると、通常の飲用濃度の５分の１という低濃度ですら最終ウイルス収量は１／５０以下に低下し、明確なヘルペスウイルス増殖抑制作用を示した。この増殖抑制作用は、実験に用いたコーヒー豆の産地によらず、どの焙煎コーヒーでも観察された。
ウイルスとしてＨＳＶ−１Ｆ株に代えてポリオウイルス１型Ｓａｂｉｎ株を用いて、上記と同様な試験をし、細胞融解液中の感染性ウイルスをプラック法で定量した。結果を図５に示す。図５は、種々のコーヒーによるポリオウイルス１型Ｓａｂｉｎ株への増殖抑制作用を示す図である。
図５は、細胞1個当たりの感染ウイルス数を１０として試験し、縦軸の数値は、コーヒーを含まない培地でのウイルス収量を１としたときの、各コーヒー濃度における比ウイルス収量を示す図である。○はコロンビア、△はモカ、□はブラジルである。
図５から明らかなように、ヘルペスウイルスの場合と同様に、ポリオウイルス１型Ｓａｂｉｎ株の場合においても明確なウイルス増殖抑制作用を示した。ＨＳＶ−１とポリオウイルスとでは、ゲノム核酸の種類が各々ＤＮＡとＲＮＡとで異なるために細胞内増殖の機構が全く異なる。それにも関わらず、両ウイルスに対して増殖抑制作用を有することは興味深い。
【００２４】
実施例２ ＨＳＶ−１粒子の感染性に対するコーヒー抽出液の直接的な殺ウイルス作用
異なる製造会社４社のインスタントコーヒーと１％血清加リン酸緩衝液を用いて、種々のコーヒー濃度の試験溶液を調製した。この試験溶液に、一定量のＨＳＶ−１を加え、３７℃で２０分間保温した後のウイルス感染価をプラック法で定量した。コーヒーを含まない試験溶液での感染価を１として、各濃度の感染価を図６に示す。図６は、ＨＳＶ−１粒子の感染性に対するコーヒー抽出液の直接的なウイルス不活化作用(殺ウイルス作用)を示す図である。
図６中、●はスプレードライ法で製造したインスタントコーヒーＨ、○、△、□はそれぞれ異なるメーカーの焙煎豆から製造した抽出液を表す。○：スペシャルブレンドＫ Ｋ社製、△：オリジナルブレンドＵ Ｕ社製、□：スペシャルブレンドＡ Ａ社製である。
図６から明らかなように、実験に用いたコーヒーはメーカーによらず、どの市販の焙煎コーヒーでも直接的な殺ウイルス作用、すなわちウイルス感染性の不活化が観察された。インスタントコーヒーにおいても、スプレードライ法と凍結乾燥法との差はなく、レギュラーコーヒーと同程度のウイルス増殖抑制作用が見られた。
しかしながら、ポリオウイルス１型Ｓａｂｉｎ株についても同様の試験をした結果（データ省略）、ＨＳＶ−１を不活性化した場合と異なり、ポリオウイルスの感染性の不活化は見られなかった。この差は、一般に、エンベロープを有するウイルスは、エンベロープを有さないウイルスよりも弱いことが知られていることから、ＨＳＶ−１はエンベロープを有するのに対し、ポリオウイルスはエンベロープを有さないことによると考えられる。
【００２５】
実施例３ Ｎ−メチルピリジニウム化合物の抗ウイルス作用
ウイルスとしてＨＳＶ−１Ｆ株、細胞としてヒト由来のＨＥｐ−２細胞、試験化合物としてＮ−メチルピリジニウムホルメートを用いた。その他の実験手順は、実施例１の手順に準じて行った。焙煎コーヒーに含まれているＮ−メチルピリジニウムホルメートとＨＳＶ−１株の実験結果を図７に示す。
図７は、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートによる単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）に対する抗ウイルス作用を示す図である。縦軸は保温培養後のウイルス収量で、試薬を添加しない時のウイルス収量を１とした。試薬濃度の増加につれウイルス収量が低下しており、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートはＨＳＶ−１に対して抗ウイルス作用を示す。
図７の結果と後述の図８に示した比較例と比べると、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートの抗ウイルス作用は蟻酸のほぼ１０倍であり、優れていることが分かる。
【００２６】
比較例
図８は、比較例として、蟻酸（○）と蟻酸ナトリウム（△）の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）に対する抗ウイルス作用を示す図である。縦軸は保温培養後のウイルス収量で、無処理の場合を１として示してある。試薬濃度が高まるにつれウイルス収量が低下しており抗ウイルス作用(増殖抑制作用)が示されている。
図８中、蟻酸による抗ウイルス作用のほうが蟻酸ナトリウムより強いことは、蟻酸の作用は中和によって弱まることを示している。
【００２７】
実施例４ Ｎ−メチルピリジニウムホルメートによるインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス作用
ウイルスとしてＡ型インフルエンザウイルスＡｉｃｈｉ株(H３N２)を用い、その他の手順は、実施例３の手順に準じて行った。実験結果を図９に示す。
図９から明らかなように、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートは、図７の単純ヘルペスウイルスに対してと同様にインフルエンザウイルスに対しても濃度依存的に抗ウイルス作用(増殖抑制作用)を示す。
【００２８】
最後に、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートの直接的な殺ウイルス作用を単純ヘルペスウイルスとインフルエンザウイルスを用いて実施例２と同様な手法により試験したところ、インフルエンザウイルスでは濃度１ｍＭ、氷上１時間の保温でウイルス感染価が４％にまで低下しており、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートが、インフルエンザウイルスを不活化する作用を確認した。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、焙煎コーヒー抽出液の６００ＭＨｚのＮＭＲスペクトルの一例を示す図である。
【図２】図２は、図１のスペクトルの７．５〜９．５ｐｐｍの範囲の部分拡大図である。
【図３】図３は、焙煎時間経過にともなうコーヒー豆中の成分含有量の変化を示す図である。
【図４】図４は、種々のコーヒーによるＨＳＶ−１増殖の抑制作用を示す図である。
【図５】図５は、種々のコーヒーによるポリオウイルス増殖の抑制作用を示す図である。
【図６】図６は、ＨＳＶ−１粒子の感染性に対するコーヒー抽出液の直接的な殺ウイルス作用を示す図である。
【図７】図７は、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートによる単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）増殖の抑制作用を示す図である。
【図８】図８は、比較例として、蟻酸（○）と蟻酸ナトリウム（△）の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）に対する抗ウイルス作用(増殖抑制作用)を示す図である。
【図９】図９は、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートによるインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス作用(増殖抑制作用)を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する抗ウイルス剤、それを含有する、抗ウイルス組成物、食餌及び動物用飼料に関する。
さらに詳しくは、単純ヘルペスからコロナまで広範囲の病原性ウイルスに対して抗ウイルス作用を有し、感染したヒトおよび動物の感染症の予防ないしは治療する抗ウイルス剤、それを含有する抗ウイルス組成物、食餌及び動物用飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染を予防する有効で安価な方法はない。懸念される感染源に対して適当するワクチンがあればよいが、流行の予想株が外れれば無効となるし、ウイルス変異が起こればやはり無効となる。発症後の医療用医薬品として、アマンタジン、リバビリン、タミフルがあるが、一般人が日常安心して使えるようなものではない。安全で有効な抗ウイルス剤の開発は焦眉の急とされている。
家畜などの環境において、例えばトリインフルエンザの予防には消毒薬で対応するしか方策がない。トリインフルエンザの変異によるヒトへの感染が懸念されているが、日常の対応策は見出されていない。食材のなかにもウイルス感染症、またはウイルス感染予防に有用なものはない。
ところで、コーヒーを飲む人は飲まない人に比べて肝臓癌の罹患率が優位に低いことが報告されている。肝臓がんは、その９０％以上がＢ型・Ｃ型ウイルス感染に起因している。最近ペグインターフェロンとリバビリン併用によるＣ型肝炎ウイルス除去治療が注目されているが、ペグインターフェロンの無効例や何らかの理由でこれを使えない患者に、コーヒーを飲むことを勧める医者は未だいない。
トリインフルエンザのトリとトリ以外の動物間での感染は明らかに拡大している。トリインフルエンザがやがてヒトに感染し始めるのは時間の問題とも言われている。しかし、環境の保全と新型ワクチン創製以外の有効な方策は見つかっていないのが現状である。
抗ウイルス剤として、例えば、トリソジディウムホスホノホルメート（登録商標フォスカビル；アストラゼネカ社製）は、ＡＩＤＳ患者のＣＭＶ（サイトメガロウイルス）治療のため市販された（１９９１〜）。作用機序はＤＮＡポリメラーゼ抑制であり、最近の総説論文に引用されている（例えば、非特許文献１参照。）。耐性化が早く、骨組織に蓄積し、腎毒性がある。
従来、人体に無毒な抗ウイルス剤は知られていなかったし、一般に摂取する食材から発見されたことも抗ウイルス剤も存在しなかった。
コーヒーを飲んでいる人は肝臓癌になり難いという疫学調査結果は、コーヒーに抗肝炎ウイルス作用があることを示唆していた（非特許文献２）。
【非特許文献１】Ｋ．Ｋ．Ｂｉｒｏｎ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ７１：１５４−６３，２００６
【非特許文献２】Ｍ． Ｉｎｏｕｅ， Ｉ． Ｙｏｓｈｉｍｉ， Ｔ． Ｓｏｂｕｅ， Ｓ． Ｔｓｕｇａｎｅ； ＪＰＨＣ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｆｆｅｅ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｏｎ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｒｉｓｋ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ： ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｉｎ Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９７：２９２−３００ （２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、上述のような問題点を解消するため、ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療し、さらに環境中の感染性ウイルスを除去しえる、抗ウイルス剤を提供することにある。
また、本発明の目的は、安全性に優れ、ヒトや動物の感染症の原因となる病原性ウイルスに対する抗ウイルス組成物を提供することにある。
また、本発明の目的は、ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療する食餌を提供することにある。
本発明の他の目的は、環境中の感染性ウイルスを除去でき、ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療する動物用飼料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は下記手段により達成された。
すなわち本発明は、
（１） 下記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
【０００５】
【化１】
【０００６】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン、水酸基又はチオール基を表し、Ｘは脂肪酸イオン、無機酸イオン、芳香族カルボン酸イオン又はハロゲンを表す。
（２）前記一般式１において、Xが蟻酸イオンであることを特徴とする（１）に記載の抗ウイルス剤、
（３） 前記抗ウイルス剤が、焙煎コーヒー豆から得られることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の抗ウイルス剤、
（４） 下記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する焙煎コーヒー抽出液を含む抗ウイルス組成物、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン、水酸基又はチオール基を表し、Ｘは脂肪酸イオン、無機酸イオン、芳香族カルボン酸イオン又はハロゲンを表す。
（５） 前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤又は（４）に記載の抗ウイルス組成物を含有するウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の食餌、及び
（６） 前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤又は（４）に記載の抗ウイルス組成物を含有するウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の動物用飼料
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の抗ウイルス剤は、ウイルス増殖抑制作用だけでなく、直接的な殺ウイルス作用をも有している。
本発明の抗ウイルス剤は、抗ウイルス作用を単純ヘルペスからコロナまで広範囲のウイルスに及ぼすことができる。
本発明の抗ウイルス剤は、経口投与で人体に無害である。予防的、治療的応用範囲があり、医薬品のみならず、農薬、水産業等への広範な応用が可能である。
本発明の抗ウイルス剤は、ヒトと動物のウイルス感染の予防ないしは治療が期待され、医療用医薬品、農薬、動物薬、大衆薬等に好適である。
本発明の抗ウイルス組成物は、焙煎コーヒー豆から抽出し製造することができる。
本発明の食餌は、生活習慣的に常用されている食品に含ませることにより、又はウイルス感染予防を期待する健康食品とすることにより、長期の生活期間において、ウイルス感染の予防をすることができる。
本発明の動物用飼料は、環境中の感染性ウイルスを除去でき、ヒト及び動物のウイルス感染を予防ないしは治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
まず、本発明の抗ウイルス剤について説明する。
本発明の抗ウイルス剤は、前記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有してなる。前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物は焙煎コーヒー成分として新たに見出された。
前記一般式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５としては、水素原子、炭素数１〜３の低級アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基）、水酸基、チオール基、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン等が挙げられるが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも４つが水素原子であることが好ましく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のいずれもが水素原子であることがより好ましい。
前記Ｘで表される脂肪酸イオンとしては、炭素数１〜１０を有する脂肪酸イオンが挙げられ、蟻酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、シュウ酸イオン、乳酸イオン等が好ましい。炭素数１〜１０を有するアルキルスルホン酸イオンであってもよい。
前記Ｘで表される前記無機酸としては、リン酸イオン、硫酸イオン、亜硫酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン等が挙げられる。
前記Ｘとしては、前記脂肪酸イオンが好ましく、蟻酸イオンが特に好ましい。
【０００９】
ヨーグルト保存用として蟻酸の抗ウイルス作用が報告されている（米国特許第４，８３４，９８７号 Ａ． Ｌｅｍｂｋｅ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｄ．）。
コーヒー豆を焙煎したときに蟻酸は産生され、蟻酸は焙煎コーヒーの種類を問わず含まれている。
しかし、実施例の項の比較例で後述するように、本発明者らは、蟻酸の抗ウイルス作用はコーヒー抽出液には及ばない弱いものであることを確認している。
焙煎コーヒーの中で蟻酸はその沸点が１００℃とさほど高くはないにも拘らず、２００℃程度の焙煎でも揮散しない。そこで何らかの陽イオンと塩を形成して存在すると考え、本発明者らは、焙煎コーヒー成分としてのＮ−メチルピリジニウム化合物が、蟻酸と塩を形成していることを見出した。
本発明の抗ウイルス剤の好ましい１例であるＮ−メチルピリジニウムホルメートが、コーヒー焙煎中に産生される反応式を下記スキーム1に示す。
スキーム１
【００１０】
【化２】
【００１１】
生豆中のトリゴネリンは、２００℃以上の加熱によって脱炭酸反応を起こして炭酸ガスを放出し、本発明の抗ウイルス剤の好ましい１例であるＮ−メチルピリジニウムホルメートに変化する。焙煎コーヒー中でその一部はアセテートとしても存在していると考えられる。
これまでに、トリゴネリンを２００℃以上に加熱すると、そのメチル基が脱離して、ニコチン酸に変化することが知られていた。しかし、その変化率は微小であり、１０％を超えることはない。それに対し、脱炭酸反応は、これまで知られていなかったトリゴネリン熱分解の主反応であり、実施例の項において図３を参照して参考例２で後述するように、変化率は焙煎条件によって７０〜８０％に達しえる。
【００１２】
本発明者らは、前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物が抗ウイルス作用を有することを見出した。したがって、前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有してなる本発明の抗ウイルス剤は新規な抗ウイルス剤である。特に、本発明の抗ウイルス剤は、殺インフルエンザウイルス作用を有する。
前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物を焙煎コーヒー豆から得る方法については、焙煎コーヒー豆を挽く方法、挽き豆の粗さについて特に制限はなく、さらにその豆からの抽出方法についても何ら制限はない。さらに、焙煎コーヒー液を抽出した後の焙煎コーヒー豆残留物中にも、前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物は含まれている。
本発明におけるコーヒー抽出液は、焙煎コーヒー豆の挽き豆粉末を任意の温度の水で抽出することで得られ、該コーヒー抽出液を減圧濃縮し、凍結乾燥又はスプレードライ等により粉末としたものであってもよい。
前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物は、焙煎コーヒー豆から得られたものに制限されることはなく、任意の有機合成的手法、生化学的手法により製造されたものであってよい。
前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物を含有する焙煎コーヒー抽出液によるＨＳＶ−１増殖抑制の機構について解析した結果から、本発明の抗ウイルス剤は、下記２つの異なる機構により抗ウイルス作用を有する。
［１］感染性ウイルス粒子の感染性を直接的に不活化することができ、かつ
［２］感染細胞におけるウイルス増殖を最終段階の子孫ウイルス形成の段階（例えば、ヌクレオシドがエンベロープを獲得する段階）を阻害することができる。
【００１３】
本発明の抗ウイルス組成物は、前記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する焙煎コーヒー抽出液を含んでなる。
本発明の抗ウイルス組成物は、代表的なエンベロープＤＮＡウイルスである単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の増殖及び感染細胞での細胞死誘導に対するコーヒー抽出液のウイルス抑制作用の試験結果から、通常の飲用濃度の５分の１という低濃度ですらウイルス増殖抑制作用を有する。
本発明の抗ウイルス組成物としてのコーヒー抽出液は、スプレードライ法と凍結乾燥法のいずれによって得られたインスタントコーヒーであっても、レギュラーコーヒーと同程度のウイルス増殖抑制作用を有する。
本発明におけるウイルス増殖抑制作用は、コーヒー生豆の産地及び焙煎方法によらず、どの焙煎コーヒー抽出液でも有する。
また、実施例１で後述するように焙煎コーヒー抽出液はエンベロープを持たない代表的なＲＮＡウイルスであるポリオウイルスの増殖も抑制することを確認している。
しかし、焙煎コーヒー抽出液は、ＨＳＶ−１の場合と異なり、ポリオウイルスの感染性を直接的に不活化することはないことを実験的に確認している。
以上の実験的確認から、焙煎コーヒー抽出液の抗ウイルス作用が、焙煎コーヒーに含まれている前記Ｎ−メチルピリジニウム化合物によるものであることを示している。
【００１４】
本発明の抗ウイルス剤又は抗ウイルス組成物は、静脈的、経口的に投与することができるが、四級塩基の消化管吸収率は低いという観点から、注射剤により静脈的に投与するのが好ましい。
また、幾つかの医学的に許容される経路（例えば、吸入、経皮膚、経粘膜）によって投与することもできるが、感染局所への直接投与が有効と考えられるので、外用薬、嗽薬、点眼・点鼻薬、膣坐薬等が挙げられる。
本発明の抗ウイルス剤又は抗ウイルス組成物の投与量は、感染症の種類、その程度、患者の年齢及び性別により変動し一義的に定められるものではないが、ヒトへのその投与量は、有効成分として１〜５ｍｇ／ｋｇ／日が好ましく、５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日がより好ましい。
次に、本発明のウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の食餌について説明する。
本発明において、広く、多くの人に嗜好品として愛好されているコーヒーに含まれている前記一般式（１）で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物が少なくとも１種含有してなる食餌とすることができる。
Ｎ−メチルピリジニウム化合物を食餌として日常的に摂取することは、例えば、慢性的なウイルス感染症の治療ないしは予防につながる。
本発明の食餌は、コーヒー、牛乳、清涼飲料水、パン、ビスケット等任意の飲食品に、各飲食品の特性、目的に応じ、製造工程で、また飲食時に適宜、添加したものとすることができる。また、本発明の食餌は、任意の製剤方法により錠剤、顆粒剤、散剤などとしてもよい。
【００１５】
本発明の食餌は、例えば、デキストリン、澱粉等の糖類；乳蛋白質、大豆蛋白質、ゼラチン等の蛋白質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、ローカストビーンガム、キサンタンガム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより製造することができる。
【００１６】
本発明の食餌の形態としては、粉乳、加工乳、発酵乳、チーズ、バター、クリーム等の乳製品；乳酸飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料等の飲料；アイスクリーム、シャーベット、氷菓等の冷菓類；そば、うどん等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、チョコレート、錠菓、ビスケット、ゼリー、ジャム、焼き菓子類等の菓子類；マーガリン、バター、ショートニング、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；スープ、サラダ、パン、；経腸栄養剤：機能性食品等が挙げられる。
【００１７】
次に、本発明のウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の動物用飼料について説明する。
本発明の動物用飼料は、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類；大豆油粕、菜種油粕等の植物性油粕；フスマ、麦糠、米糠等の糠類；脱脂粉乳、ホエー、魚粉等の動物性飼料類；ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；アミノ酸類；糖類等を配合することにより製造することが可能である。動物用飼料として具体的には、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
本発明の動物用飼料は、トリインフルエンザ予防を目的とする環境保全のために、焙煎コーヒー抽出液や抽出糟を鶏舎に撒布したり、飼料に混入させることができる。
【００１８】
これによって、慢性ウイルス感染症患者、体調不良によってウイルス感染症の回帰発症の危険性が高いヒトを含む動物、特定のウイルス感染症が流行する時期のヒトを含む動物、乳幼児や高齢者等のウイルス感染症の予防および抗ウイルス治療薬服用時の補助的な食品等として抗ウイルス作用を享受することができる。
【実施例】
【００１９】
次に、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１ 焙煎コーヒー中のＮ−メチルピリジニウム陽イオンの同定
アラビカ種のコーヒー生豆１００ｇを２２０℃で２５分間焙煎した。室温まで冷却した後、通常の電気コーヒーミルで１０秒間処理して粉末状とした。次に、温水を加えて１００℃に加熱し、１０分間緩やかに煮沸した後、室温まで冷却してから、全量を１００ｍＬとなるように調整した。溶液の０．７ｍＬをＮＭＲ測定管に取り、内部標準化合物としてＴｓｐ０．５８ｍｍｏｌを添加して、６００ＭＨｚのＮＭＲ測定装置を用い、水シグナル消去法で測定した。得られたスペクトルの１例を図１に示す。図２は、図１のスペクトルの７．５〜９．５ｐｐｍの範囲の部分拡大図である。
Ｎ−メチルピリジニウム陽イオンのＮ−メチル基に基づくシグナルは４．４１ｐｐｍの一重線であり（図１参照。）、ピリジン骨格に直接結合したプロトンに基づくシグナルは８．７９ｐｐｍの２位プロトンの二重線、８．０７ｐｐｍの３位プロトンの三重線、並びに８．５４ｐｐｍの４位プロトンの三重線であった（図２参照。）。化学構造式を同定するため、別途に従来法に準じて合成したＮ−メチルピリジニウムホルメートの１ｍｍｏｌをサンプル溶液に添加して測定した。その結果、上記のシグナルの全てが重なり合ったので、コーヒー焙煎によって産生した化合物は、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートであることが判明した。また、焙煎コーヒーには蟻酸よりも多量の酢酸が含まれている。酢酸は蟻酸よりも弱い酸であるから、Ｎ−メチルピリジニウム陽イオンのカウンターイオンとしての寄与は、蟻酸のほうが強いと考えられる。
【００２０】
参考例２ コーヒー焙煎中のＮ−メチルピリジニウムホルメートの産生量の変化
参考例１のコーヒー豆焙煎中に、焙煎開始後の３、５、１０、１５、２０、２５、３０分に豆の一部を採取して、Ｎ−メチルピリジニウム塩の含量をＮＭＲを使って定量分析した。定量分析では０．００ｐｐｍに見られるＴｓｐシグナルを基準として、４．４１ｐｐｍに見られるＮ−メチルピリジニウムのメチル基プロトンのシグナル面積比を用い、検量線を作成した。この検量線を基に、下記（式１）により得られたＮ−メチルピリジニウム陽イオンの量（ｍｍｏｌ）を算出した。
【００２１】
【数１】
【００２２】
前記（式１）において、Ｘはサンプル０．７ｍＬ中に含まれているＮ−メチルピリジニウム陽イオンのモル当量を表し、ＳPyrはＮ−メチルピリジニウム陽イオンのメチル基シグナルの面積を表し、ＳTspはＴｓｐ由来のシグナルの面積を表す。結果は図３に示すとおりである。
図３は、焙煎時間経過にともなうコーヒー豆中の成分含有量の変化を示す図である。
図３中、縦軸は、式1で求めた数値Ｘ（ｍｍｏｌ）を重量に換算し、さらに、カフェイン含量を１００としたときの各成分の相対含量（％）を表している。焙煎したアラビカ種コーヒーの1杯分はおおよそコーヒー豆１０ｇに相当し、そのカフェイン含量の平均値はほぼ１００ｍｇであるから、図３中縦軸の各成分の数値は、そのまま各成分のコーヒー豆１０ｇ中の含量ｍｇに相当している。
図３から明らかなように、ピリジニウム陽イオンの焙煎コーヒー豆中の含有量は、従来から焙煎コーヒー豆に含まれていることが知られているニコチン酸を上回る増加曲線を示していることが分かる。
【００２３】
実施例１ コーヒー抽出液の抗ウイルス作用
ウイルスとしてＨＳＶ−１Ｆ株、細胞としてヒト由来のＨＥｐ−２細胞を用いた。ウイルスの定量はＶｅｒｏ細胞を用いてプラック法にて行った。試料としたコーヒー抽出液は、１）通常のコーヒーメーカーを用いて、市販の焙煎コーヒー１１．４ｇを熱水１００ｍＬで抽出後、ミリポアフィルター（０．２２μｍ）でろ過滅菌したもの、２）市販のインスタントコーヒー１０ｇを１００ｍＬの熱水に溶解したものを、同様にろ過滅菌したものを用いた。
ＨＥｐ−２細胞を単層培養し、細胞1個当たりのウイルス数をＰＦＵ感染単位で１０〜２０個感染させた。この感染細胞を０．１％ウシ血清アルブミンを含むＭＥＭ培地（イーグルの最低必須培地）を用いて培養し、ウイルスの細胞内侵入が完了した時点で、種々の濃度に調整したコーヒー抽出液を培養液に添加し、２４時間培養した。コーヒー抽出液の添加に際しては、培養液の希釈を避けるため、コーヒー液と同量の２倍濃縮ＭＥＭを同時添加した。感染細胞に生じた子孫ウイルス量は、感染細胞を培養液と共に２回凍結融解し、細胞内ウイルスを細胞外に放出させた後、細胞融解液中の感染性ウイルスをプラック法で定量した。結果を図４に示す。図４は、種々のコーヒーによるＨＳＶ−１増殖の抑制作用を示す図である。
図４は、細胞1個当たりの感染ウイルス数を１０として試験し、縦軸の数値は、コーヒーを含まない培地でのウイルス収量を１としたときの、各コーヒー濃度における比ウイルス収量を示す図である。○はマンダリン、△はキリマンジェロ、□はコロンビア、●はモカ、▲はブラジル豆である。
図４において、「コーヒー抽出液に対する濃度％」とは、上記１）又は２）の手法により得られたコーヒー抽出液の濃度（通常の飲用濃度）を１００％とした百分率で示す値である。例えば、上記コーヒー抽出液を１／５に希釈した濃度は図４において２０％となる（以下、同様である。）。
図４から明らかなように、コーヒー抽出液を細胞の培養液に加えると、通常の飲用濃度の５分の１という低濃度ですら最終ウイルス収量は１／５０以下に低下し、明確なヘルペスウイルス増殖抑制作用を示した。この増殖抑制作用は、実験に用いたコーヒー豆の産地によらず、どの焙煎コーヒーでも観察された。
ウイルスとしてＨＳＶ−１Ｆ株に代えてポリオウイルス１型Ｓａｂｉｎ株を用いて、上記と同様な試験をし、細胞融解液中の感染性ウイルスをプラック法で定量した。結果を図５に示す。図５は、種々のコーヒーによるポリオウイルス１型Ｓａｂｉｎ株への増殖抑制作用を示す図である。
図５は、細胞1個当たりの感染ウイルス数を１０として試験し、縦軸の数値は、コーヒーを含まない培地でのウイルス収量を１としたときの、各コーヒー濃度における比ウイルス収量を示す図である。○はコロンビア、△はモカ、□はブラジルである。
図５から明らかなように、ヘルペスウイルスの場合と同様に、ポリオウイルス１型Ｓａｂｉｎ株の場合においても明確なウイルス増殖抑制作用を示した。ＨＳＶ−１とポリオウイルスとでは、ゲノム核酸の種類が各々ＤＮＡとＲＮＡとで異なるために細胞内増殖の機構が全く異なる。それにも関わらず、両ウイルスに対して増殖抑制作用を有することは興味深い。
【００２４】
実施例２ ＨＳＶ−１粒子の感染性に対するコーヒー抽出液の直接的な殺ウイルス作用
異なる製造会社４社のインスタントコーヒーと１％血清加リン酸緩衝液を用いて、種々のコーヒー濃度の試験溶液を調製した。この試験溶液に、一定量のＨＳＶ−１を加え、３７℃で２０分間保温した後のウイルス感染価をプラック法で定量した。コーヒーを含まない試験溶液での感染価を１として、各濃度の感染価を図６に示す。図６は、ＨＳＶ−１粒子の感染性に対するコーヒー抽出液の直接的なウイルス不活化作用(殺ウイルス作用)を示す図である。
図６中、●はスプレードライ法で製造したインスタントコーヒーＨ、○、△、□はそれぞれ異なるメーカーの焙煎豆から製造した抽出液を表す。○：スペシャルブレンドＫ Ｋ社製、△：オリジナルブレンドＵ Ｕ社製、□：スペシャルブレンドＡ Ａ社製である。
図６から明らかなように、実験に用いたコーヒーはメーカーによらず、どの市販の焙煎コーヒーでも直接的な殺ウイルス作用、すなわちウイルス感染性の不活化が観察された。インスタントコーヒーにおいても、スプレードライ法と凍結乾燥法との差はなく、レギュラーコーヒーと同程度のウイルス増殖抑制作用が見られた。
しかしながら、ポリオウイルス１型Ｓａｂｉｎ株についても同様の試験をした結果（データ省略）、ＨＳＶ−１を不活性化した場合と異なり、ポリオウイルスの感染性の不活化は見られなかった。この差は、一般に、エンベロープを有するウイルスは、エンベロープを有さないウイルスよりも弱いことが知られていることから、ＨＳＶ−１はエンベロープを有するのに対し、ポリオウイルスはエンベロープを有さないことによると考えられる。
【００２５】
実施例３ Ｎ−メチルピリジニウム化合物の抗ウイルス作用
ウイルスとしてＨＳＶ−１Ｆ株、細胞としてヒト由来のＨＥｐ−２細胞、試験化合物としてＮ−メチルピリジニウムホルメートを用いた。その他の実験手順は、実施例１の手順に準じて行った。焙煎コーヒーに含まれているＮ−メチルピリジニウムホルメートとＨＳＶ−１株の実験結果を図７に示す。
図７は、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートによる単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）に対する抗ウイルス作用を示す図である。縦軸は保温培養後のウイルス収量で、試薬を添加しない時のウイルス収量を１とした。試薬濃度の増加につれウイルス収量が低下しており、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートはＨＳＶ−１に対して抗ウイルス作用を示す。
図７の結果と後述の図８に示した比較例と比べると、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートの抗ウイルス作用は蟻酸のほぼ１０倍であり、優れていることが分かる。
【００２６】
比較例
図８は、比較例として、蟻酸（○）と蟻酸ナトリウム（△）の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）に対する抗ウイルス作用を示す図である。縦軸は保温培養後のウイルス収量で、無処理の場合を１として示してある。試薬濃度が高まるにつれウイルス収量が低下しており抗ウイルス作用(増殖抑制作用)が示されている。
図８中、蟻酸による抗ウイルス作用のほうが蟻酸ナトリウムより強いことは、蟻酸の作用は中和によって弱まることを示している。
【００２７】
実施例４ Ｎ−メチルピリジニウムホルメートによるインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス作用
ウイルスとしてＡ型インフルエンザウイルスＡｉｃｈｉ株(H３N２)を用い、その他の手順は、実施例３の手順に準じて行った。実験結果を図９に示す。
図９から明らかなように、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートは、図７の単純ヘルペスウイルスに対してと同様にインフルエンザウイルスに対しても濃度依存的に抗ウイルス作用(増殖抑制作用)を示す。
【００２８】
最後に、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートの直接的な殺ウイルス作用を単純ヘルペスウイルスとインフルエンザウイルスを用いて実施例２と同様な手法により試験したところ、インフルエンザウイルスでは濃度１ｍＭ、氷上１時間の保温でウイルス感染価が４％にまで低下しており、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートが、インフルエンザウイルスを不活化する作用を確認した。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、焙煎コーヒー抽出液の６００ＭＨｚのＮＭＲスペクトルの一例を示す図である。
【図２】図２は、図１のスペクトルの７．５〜９．５ｐｐｍの範囲の部分拡大図である。
【図３】図３は、焙煎時間経過にともなうコーヒー豆中の成分含有量の変化を示す図である。
【図４】図４は、種々のコーヒーによるＨＳＶ−１増殖の抑制作用を示す図である。
【図５】図５は、種々のコーヒーによるポリオウイルス増殖の抑制作用を示す図である。
【図６】図６は、ＨＳＶ−１粒子の感染性に対するコーヒー抽出液の直接的な殺ウイルス作用を示す図である。
【図７】図７は、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートによる単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）増殖の抑制作用を示す図である。
【図８】図８は、比較例として、蟻酸（○）と蟻酸ナトリウム（△）の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）に対する抗ウイルス作用(増殖抑制作用)を示す図である。
【図９】図９は、Ｎ−メチルピリジニウムホルメートによるインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス作用(増殖抑制作用)を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
【化１】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン、水酸基又はチオール基を表し、Ｘは脂肪酸イオン、無機酸イオン、芳香族カルボン酸イオン又はハロゲンを表す。
【請求項２】
前記一般式１において、Xが蟻酸イオンであることを特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
前記抗ウイルス剤が、焙煎コーヒー豆から得られることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
下記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する焙煎コーヒー抽出液を含む抗ウイルス組成物。
【化２】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン、水酸基又はチオール基を表し、Ｘは脂肪酸イオン、無機酸イオン、芳香族カルボン酸イオン又はハロゲンを表す。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤又は請求項４に記載の抗ウイルス組成物を含有するウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の食餌。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤又は請求項４に記載の抗ウイルス組成物を含有するウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の動物用飼料。
【請求項１】
下記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
【化１】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン、水酸基又はチオール基を表し、Ｘは脂肪酸イオン、無機酸イオン、芳香族カルボン酸イオン又はハロゲンを表す。
【請求項２】
前記一般式１において、Xが蟻酸イオンであることを特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
前記抗ウイルス剤が、焙煎コーヒー豆から得られることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
下記一般式１で表されるＮ−メチルピリジニウム化合物を有効成分として含有する焙煎コーヒー抽出液を含む抗ウイルス組成物。
【化２】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ、水素原子、アルキル基、ハロゲン、水酸基又はチオール基を表し、Ｘは脂肪酸イオン、無機酸イオン、芳香族カルボン酸イオン又はハロゲンを表す。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤又は請求項４に記載の抗ウイルス組成物を含有するウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の食餌。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤又は請求項４に記載の抗ウイルス組成物を含有するウイルス感染症治療用もしくはウイルス感染予防用の動物用飼料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−２３９３２（Ｐ２００９−２３９３２Ａ）
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８７６６４（Ｐ２００７−１８７６６４）
【出願日】平成１９年７月１８日（２００７．７．１８）
【出願人】（８００００００８０）タマティーエルオー株式会社 (255)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１８日（２００７．７．１８）
【出願人】（８００００００８０）タマティーエルオー株式会社 (255)
【Ｆターム（参考）】
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