Ｎ型カルシウムチャネルの活性の抑制による、抑鬱症を軽減させる方法
本発明は、抑鬱症を軽減させる方法に関するものであり、より詳細には、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制することにより、抑鬱症を軽減させる方法に関するものである。本発明に従い、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制する物質は、抑鬱症の治療に有用に使用することができる。また、Ｎ型カルシウムチャネルを使用して抗鬱剤をスクリーニングすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抑鬱症を軽減させる方法に関するもので、より詳細には、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に作用して活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
電位依存性カルシウムチャネル（ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ、ＶＤＣＣ）は神経伝達物質の分泌、膜興奮性及び遺伝子発現の調節において重要な役割を果たし、現在まで多くの種類の電位依存性カルシウムチャネルが明らかにされている（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，１９９８年，第２４巻，３０７−３２３頁）。電位依存性カルシウムチャネルは、α１、α２、β及びγのサブユニットで構成される多サブユニット構造を有し（Ｄｕｎｌａｐら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９５年，第１８巻，８９−９８頁；Ｄｅ Ｗａａｒｄら，Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，１９９６年，第４巻，４１−８７頁；Ｈｏｆｍａｎｎら，Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９９年，第１３９巻，３３−８７頁）、電気生理学的または薬学的性質によってＬ型、Ｎ型、Ｐ型、Ｑ型、Ｒ型及びＴ型に分類される（Ｔｓｉｅｎら，Ｓｏｃ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｅｒ．１９８７年，第４１巻，１６７−１８７頁；Ｒａｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｔｓｉｅｎ，Ｊ．Ｎｅｕｓｃｉ．，１９９５年，第１５巻，２９９５−３０１２頁）。一般的に、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型、Ｒ型は高い電位でチャネルが開き、Ｔ型の場合は低い電位でチャネルが開く特徴を持っている。電位依存性カルシウムチャネルのサブユニット中、α１サブユニットはカルシウムチャネルが作用するのに必須の役割を果たし、チャネルの性質を決める。現在までα１サブユニットの多くのサブグループをコードする６個の異なる遺伝子（α１Ａ−α１Ｆ）が明らかにされている（Ｃｈｉｎ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９８年，第３０巻，１２３−１３０頁；Ｅｒｔｅｌら，Ｎｅｕｒｏｎ，２０００年，第２５巻，５３３−５３５頁；Ｈｏｆｍａｎｎら，Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９９年，第１３９巻，３３−８７頁）。
【０００３】
インサイチューハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を通じてネズミの脳に存在するα１サブユニットの存在有無を詳しく見てみると、α１Ｂサブユニットが中枢神経系の全般にわたって発現され、特に感情調節部位である背側縫線核（ｄｏｒｓａｌ ｒａｐｈｅ）部位と青斑核（ｌｏｃｕｓ ｃｏｅｒｕｌｅｕｓ）部位にも存在することが知られている（ＴａｎａＫａら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１９９５年，第３０巻，１−１６頁）。細胞内レベルで見れば、α１Ｂサブユニットは主に神経細胞のシナプス前神経終末に位置し、多様な神経伝達物質の分泌を調節する生理学的機能があり（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７年，第２３５巻，４６−５２頁；Ｈｉｒｎｉｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８年，第２３９巻，５７−６１頁；Ｗｅｓｔｅｎｂｒｏｅｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９５年，第１５巻，６４０３−１８頁）、その他にもシナプス前またはシナプス後でセロトニン及びノルエピネフリン受容体の抑制性調節機能に関与してシナプス内神経伝達を調節することが知られている（Ｏｋａｄａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００１年，第２１巻，６２８−６４０頁；Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓ Ａ．Ｒ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１９９９年，第４０巻，１３７−１４８頁；Ｓｕｎ，Ｑ．Ｑ．ら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９８年，第５１０巻，１０３−２０頁）。
【０００４】
最近、遺伝子ターゲティング方法によるＮ型カルシウムチャネルのα１Ｂサブユニットを欠乏させた変異マウスを利用して、インビボにおける侵害受容（ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ）情報の処理に関するＮ型カルシウムチャネルの正確な役割を特定する何種類かの遺伝的研究結果が報告された（Ｋｉｍら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第１８巻，２３５−２４５頁；Ｓａｅｇｕｓａ，Ｈ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，２００１年，第１５巻，２３４９−５６頁；Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，２００１年，第８巻，２４２３−７頁）。前記文献によれば、α１Ｂ変異マウスは、機械的痛症、放射熱による痛症及び炎症性痛症に対して正常マウスより顕著に減少した痛症反応を示した。また、神経損傷によって惹起された無害刺激に対する痛症と熱に対する過敏痛症にも正常マウスより著しい減少を示した。したがって、Ｎ型カルシウムチャネルは、痛症を認識するのに重要な役割を果たすことが分かる。その他にも高架式十字迷路法（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）を通じて、α１Ｂ変異マウスが正常マウスより不安感が軽減されているという研究結果が報告された（Ｓａｅｇｕｓａ，Ｈ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，２００１年，第１５巻，２３４９−５６頁）。しかし、抑鬱症のような感情障害に対して、Ｎ型カルシウムチャネルの正確な役割に関する薬理学的または遺伝的研究結果はいまだに報告されていない。
【０００５】
それで、本発明者らは、Ｎ型カルシウムチャネルα１Ｂ遺伝子を欠失させた変異マウスを利用して、代表的感情障害である抑鬱症とＮ型カルシウムチャネルの生理学的機能との連関性を研究するために、多様な抑鬱症関連動物行動実験を実施した。そして本発明者らは、Ｎ型カルシウムチャネルの活性の抑制により抑鬱症の症状が軽減されることを見出して本発明を完成させた。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる方法を提供することである。
【０００７】
また、本発明の目的は、Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂ遺伝子またはそのタンパク質を利用して、抗鬱剤をスクリーニングする方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤を有効成分として含む抗鬱剤を提供することである。
【０００９】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の上記目的を達成するために、本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂ遺伝子またはそのタンパク質を利用して、抗鬱剤をスクリーニングする方法を提供する
【００１１】
さらに、本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤を有効成分として含む抗鬱剤を提供する。
【００１２】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１３】
I．本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる方法を提供する
前記で、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制する方法には、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に作用して活性を抑制する物質を投与する、前記Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に結合する抗体を投与する、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子の転写を抑制する、または転写されたＮ型カルシウムチャネル遺伝子の翻訳を抑制する方法などがあるが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、前記で列挙した方法以外にもＮ型カルシウムチャネルの活性を抑制するすべての方法が使用できる。本発明の好ましい態様では、Ｎ型カルシウムチャネルをコードするα１Ｂ遺伝子がターゲットされたＮ型カルシウムチャネルを発現しないマウスを使用して、Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制と抗鬱との関係を調査した（図３及び図４参照）。
【００１４】
本発明者らは、Ｎ型カルシウムチャネルが代表的感情障害である抑鬱症と関連しているかどうかを確認するために、α１Ｂ遺伝子ノックアウトマウス（大韓民国特許出願第２００２−２３４３号）を使用して代表的な抑鬱症関連動物行動実験である強制水泳試験（ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｅｓｔ）及び、尾部懸垂試験（ｔａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔ）を実施した結果、強制水泳試験の場合、水を入れたビーカー中で１５分間マウスを泳がせた時、正常マウスは初期５分から抑鬱症状である静止浮遊状態（ｉｍｍｏｂｉｌｅ ｆｌｏａｔｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示した。一方、α１Ｂ変異（ノックアウト）マウスは、１５分間始終継続して水泳行動を示し、正常マウスより水の上に静止浮遊する時間が全般的に顕著に短いことを確認することにより、α１Ｂ変異マウスが正常マウスより抑鬱症が顕著に軽減した反応を示すことを確認した（図３参照）。また、尾部懸垂試験の場合にも強制水泳試験の場合と同様に、α１Ｂ変異マウスは正常マウスより顕著に減少した静止時間（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を示した（図４参照）。前記で詳しく説明したように、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子がターゲットされたα１Ｂ変異マウスは、二つの抑鬱症関連行動実験で抗鬱反応を示した。
【００１５】
最近になってセロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）およびノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）のようなモノアミン（ｍｏｎｏａｍｉｎｅ）、ならびにペプチドであるサブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）の調節異常が抑鬱症と病理学的に関連性があり、神経伝達物質を調節する薬剤が現在、抑鬱症治療剤として開発されている（Ｏｋａｄａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００１年，第２１巻，６２８−６４０頁；Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓ Ａ．Ｒ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１９９９年，第４０巻，１３７−１４８頁；Ｓｕｎ，Ｑ．Ｑ．ら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９８年，第５１０巻，１０３−２０頁）。前記Ｎ型カルシウムチャネル活性が抑制されたα１Ｂノックアウトマウスは、選択的セロトニン再取込抑制剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｒｅｕｐｔａｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、ＳＳＲＩ）、三環系（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃｓ）、モノアミン酸化酵素抑制剤（ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、サブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）または、ＮＫ−１受容体抑制剤等の抗鬱剤を処置した場合と等しい行動反応を示す。セロトニン１Ａ受容体変異マウスの場合は、正常マウスより不安感は高まっている一方、抑鬱症は軽減していることが知られている。ノルエピネフリントランスポーター変異マウスの場合も、正常マウスより減少した抑鬱症行動反応を示す（Ｒａｍｂｏｚ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，１４４７６−８１頁；Ｘｕ，Ｆ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年，第３巻，４６５−４７１頁）。
【００１６】
また、脊髓レベルでの痛症と関連して、Ｎ型カルシウムチャネルによって分泌すると知られているサブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）と、その受容体のＮＫ−１受容体の機能を阻害すれば、抑鬱症または不安感などが軽減するという薬理学的、遺伝学的研究結果が報告された（Ｓａｎｔａｒｅｌｌｉ，Ｌ．ら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，２００１年，第９８巻，１９１２−１７頁）。しかし、現在までＮ型カルシウムチャネルが抑鬱症と係わっているという研究結果は報告されていない。したがって、本発明者らが初めて遺伝子変異マウス利用した抑鬱症関連動物行動実験行い、Ｎ型カルシウムチャネルの活性の抑制による抑鬱症の軽減を明らかにした。
【００１７】
感情調節機能と関連するその他のカルシウムチャネルの研究結果を詳しく見ると、Ｌ型カルシウムチャネル抑制剤である「ニモデピン（ｎｉｍｏｄｅｐｉｎｅ）」が双極性障害（ｂｉｐｏｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）中、超高速周期双極性障害（ｕｌｔｒａ−ｒａｐｉｄ−ｃｙｃｌｉｎｇ ｂｉｐｏｌａｒ）と反復性短期抑鬱症（ｂｒｉｅｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）を緩和させる機能があり、カルシウムチャネルα２−デルタ抑制剤である「ガバペンチン（ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）」及び「リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ）」もこのような情緒障害を治療する候補物質になるという研究結果が報告された（Ｐｏｓｔ，Ｒ．Ｍ．ら，Ｂｉｐｏｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄ．，２０００年，第２巻，３０５−１５頁；Ｇｏｏｄｎｉｃｋ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｏｐｏｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄ．，２０００年，第２巻，１６５−７３頁）。しかし、抑鬱症と係わるカルシウムチャネルのインビボでの機能に対しては、本発明の研究結果以外には全く報告されておらず、本発明者らが初めて、Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制が抑鬱症軽減と関連することを明らかにした。
【００１８】
結論として、α１Ｂタンパク質の発現を抑制してＮ型カルシウムチャネルの活性を阻害すれば、抗鬱反応がもたらされる。したがって、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の活性を抑制する物質または前記遺伝子の産物であるＮ型カルシウムチャネルの活性を抑制する物質が抑鬱症治療剤として使用できることが示唆される。
【００１９】
II．本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂ遺伝子またはそのタンパク質を利用して抗鬱剤をスクリーニングする方法を提供する
α１Ｂの活性を抑制する物質が見出されれば、その物質は抗憂鬱剤として使用できる。したがって、タンパク質の活性を抑制する物質をスクリーニングする公知の方法によって、α１Ｂの活性を抑制する物質をスクリーニングすることができる。α１Ｂの活性を抑制する物質をスクリーニングする一般的な方法は、以下の工程を含む：
１）α１Ｂ構造遺伝子及びレポーター遺伝子を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；
２）前記形質転換体とスクリーニングする検体とを、共に培養する工程；及び
３）レポーター遺伝子の発現量を測定する工程。
【００２０】
前記でレポーター遺伝子として使用できる遺伝子として、ＬａｃＺ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）等を使用できるが、必ずしもこれらに限定されないことは当業者においては明白なことである。
【００２１】
III．本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤を有効成分として含む抗鬱剤を提供する
前記で、Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤は、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に作用して活性を抑制する化合物、前記Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に結合する抗体、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子の転写を抑制する物質、転写されたＮ型カルシウムチャネル遺伝子の翻訳を抑制する物質等があるが、必ずしもこれに限定されるものではなく、前記で列挙した物質以外にも、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制するすべての物質が使用可能である。
【００２２】
前記Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能で一般的な医薬品製剤の形態で使用可能である。好ましい薬剤学的製剤としては、錠剤、硬質または軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤等の経口投与用製剤、注射用溶液または懸濁液のような非経口投与用注射剤等があり、これら薬剤学的製剤は薬剤学的に許容可能な通常の担体、例えば経口投与用製剤の場合には賦形剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤または増量剤等を、注射剤の場合には、普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の稀釈剤または賦形剤等を使用して調剤することができる。また、非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、坐剤を含むことができる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステル等が使用可能である。坐剤の基材には、ウィテプソール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用可能である。
【００２３】
また、前記Ｎ型カルシウムチャネルの抑剤剤は、生理食塩水または有機溶媒と共に薬剤に許容された様々な担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と混合して使用可能であり、安全性や吸水性を増加させるためにグルコース、スクロースまたはデキストランのようなカーボハイドレート、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）またはグルタチオンのような抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）、キレート物質（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、低分子タンパク質または他の安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）が薬剤に使用可能である。
【００２４】
本発明の薬学的組成物で、Ｎ型カルシウムチャネル抑制剤の総有効量は巨丸剤（ｂｏｌｕｓ）形態あるいは相対的に短期間の注入剤（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）等によって単回投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与することができる。また、多回投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）を長期間投与する分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与することができる。前記Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤の濃度は、薬の投与経路及び治療回数だけではなく患者の年齢及び健康状態など多様な要因を考慮して患者の有効投与量が決められ、このような点を考慮する時、この分野の通常的な知識を持つ者であれば、本発明のＮ型カルシウムチャネル抑制剤の有効投与量を決めることができる。
【００２５】
前記Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤の好ましい有効用量は、注射剤の場合は、０．０１４〜０．１４μｇ／ｋｇ、経口投与剤の場合は、０．１４〜１．４μｇ／ｋｇで一日に１〜６回投与することができる（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｄ．Ｐ．ａｎｄ Ｊｕｄｉｔｈ Ａ．Ｐ．Ｐａｉｎ，２０００年，第８５巻，２９１−２９６頁）。
【００２６】
本発明の好ましい態様の適用については、添付の図面を参照して最も良く理解される。
【００２７】
実施例
本発明の実際の態様および目下の好ましい態様は、以下の実施例で示すように例証である。
【００２８】
但し、当業者はこの開示を考慮し、本発明の精神及び範囲内において改変や改良を加えてもよい。
【００２９】
実施例１：α１Ｂ遺伝子ノックアウトマウスの作製
＜１−１＞カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子を欠失したターゲティングベクターの作製
本発明者らは、カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子が欠失した遺伝子ノックアウトマウスを作製するために、一般的に使われる遺伝子ターゲティング法（ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を利用した。まず、α１Ｂ遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡを得るために１２９／ｓｖマウスゲノムＤＮＡ断片を無作為に挿入させたバクテリオファージラムダＦＩＸ II（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｌａｍｄａ ＦＩＸ II）ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をα１ＢラットｃＤＮＡ（ＡＵＧ〜７２０ｂｐ、Ｄｒ．Ｊｉｎ ＨＭ（ＮＩＨ）から得た）をプローブに使用してスクリーニングした。前記スクリーニングを通じてα１Ｂ遺伝子ＩＳ（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔ）１−３コード領域を含む１８．４ｋｂゲノムＤＮＡを持ったバクテリオファージクローンを得、多様な制限酵素を利用して制限酵素地図を完成した後、ターゲティングベクターを作るのに使用した。基本ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ（＋／−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を基本ベクターに使用し、ｐＥＧＦＰ−１ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）からＳＶ４０−ポリＡを含むＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を切り取ってエクソン（アミノ酸１５８）を含むＢａｍＨＩ−タグＩＳ２に融合した。ｐＬＮＴベクター（Ｓｕｇｉｔａｕｉ Ｎｏｄａから得た）からＰＧＫ−ｎｅｏ遺伝子を切り取ってＧＦＰ遺伝子の下流に連結した。
【００３０】
その結果、本発明で作製したターゲティングベクターは、ＩＳ３部分を欠失させ、陽性選別のためのＧＦＰ−ＮＥＯカセットで置換した。そして、陰性選別のためのＨＳＢ−ｔｋ遺伝子は、５’−相同領域の５’末端に連結した（図１）。
【００３１】
＜１−２＞胚幹細胞へのトランスフェクション
前記実施例＜１−１＞で作製したターゲティングベクターをトランスフェクトするための細胞株にＪ１胚幹細胞株を使用した。胚幹細胞培養と胚操作は以前の文献と同じ方法で実施した（Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９７年，第３８９巻，２９０−２９３頁）。Ｊ１胚幹細胞（米国、ＭＩＴのＲ．Ｊｅａｎｉｓｃｈから分与を受ける）をＥＳ培地［１５％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、１×ペニシリンストレプトマイシン（ｐｈｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ社）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）］に接種して３７℃で２〜３日間培養した。前記培養から得た胚細胞群に０．２５％トリプシンを含んだ１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えて単一細胞を得た。
【００３２】
前記で単一細胞に分離した胚幹細胞に実施例＜１−１＞で作製したターゲティングベクターをトランスフェクトするためにエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を実施した。詳細には、分離した単一の胚幹細胞２×１０７個／ｍｌと作製例＜１−１＞のターゲティングベクターＤＮＡ２５μｇを添加して混合した後、２７０Ｖ／５００ｍｉｃｒｏＦ条件下でエレクトロポレーションを実施した。ターゲティングベクターを導入した胚幹細胞を０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８及び２μＭのガンシクローバ（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｏｒ）が含まれたＥＳ培地で５〜７日間培養して胚幹細胞内カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子がターゲティングベクターによって正確にターゲットされた胚幹細胞クローンを選別維持した。カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子の欠失が確認された胚幹細胞クローンを再びＥＳ培地に分注して、１８〜２２時間培養した後、トリプシンを処理して単一細胞に分離し、生存した細胞のみを選んで微量注入に使用した。
【００３３】
＜１−３＞キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）マウスの作製
カルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つキメラマウスを作製するために、受精した胞胚に前記実施例＜１−２＞で選別した胚幹細胞クローンを微量注入した。詳細には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）メスとオスを交配し、交尾後３．５日（３．５ ｐ．ｃ．）のメスを頚椎脱臼法で屠殺した。屠殺したメスから子宮を摘出して子宮末端部をはさみで切除した後、１ｍｌ注射器を使用して２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％牛胎児血清、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール及びＤＭＥＭを含む注入溶液１ｍｌを貫流させた。解剖顕微鏡下で微細ガラス管を使用して前記子宮組職から胞胚を分離した。分離した胞胚を３５ｍｍペトリ皿上にあらかじめ滴下しておいた注入溶液に移し、後続する導入過程に使用した。このように分離した胞胚に前記実施例＜１−３＞で選別した胚幹細胞クローンを導入するために、微量注入器（Ｚｅｉｓｓ社）を利用してホールディング（ｈｏｌｄｉｎｇ）ピペットで胞胚の内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）方向を陰圧でつかんだ状態で１０〜１５個の胚幹細胞クローンを吸入した注射ピペットを胞胚の包胚腔内に挿入した後、陽圧を与えて胚幹細胞クローンを胞胚の包胚腔内に注入した。前記クローンが注入された胞胚を、精管手術したオスと交配した２．５ｐ．ｃ．の仮妊娠代理母マウスの子宮に移植して胚幹細胞クローン（Ｊ１）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胞胚から形成された異型細胞交雑種の一種であるキメラマウスの発生を誘導した。この時、子宮移植はアベルチン（ａｖｅｒｔｉｎｅ、１ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した代理母の腹部を１ｃｍ位切除して；子宮上部をピンセットでつまんで２ｃｍ程度体外に引っぱり；注射針で子宮に穴を開けて、その穴を通じて前記の胞胚を微細ガラス管で注入し；内部腹腔膜を縫合糸で二針縫った後、外皮膚を内科用クリップで封入する方法を使用した。このように胚幹細胞を注入した胞胚を代理母マウスの子宮に移植して約１９日間培養することにより胚幹細胞由来の細胞と胞胚由来の細胞とを融合し、ゲノム内にカルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つキメラマウスを得た。
【００３４】
＜１−４＞α１Ｂ＋／−異型接合マウスの作製
前記実施例＜１−３＞から得たオスキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスと交配して子孫を得た。この中からカルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つ異型接合マウスを選別するために、次のようにＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。
【００３５】
詳細には、ゲノムＤＮＡを抽出するためにマウス尾部を１．５ｃｍ位の大きさで切り取った後、前記組職を溶解緩衝液（１００ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．２％ＳＤＳ）０．４ｍｌに入れて、そこに０．１ｍｇ／ｍｌになるようにプロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を入れた後、５５℃で５時間処理した。前記反応液に、８Ｍカリウムアセテート７５μｌとクロロホルム０．４ｍｌを加えてよく振った後、４℃で１０分間放置した。前記反応液を１５、０００ｒｐｍで遠心分離した。上清０．４ｍｌをエチルアルコール１ｍｌに入れてゲノムＤＮＡを沈澱させた後、再び７０％エチルアルコールで洗浄して乾燥させた後、蒸溜水５０μｌで溶解し、ＰＣＲに供した。
【００３６】
前記のように抽出したマウスゲノムＤＮＡ １μｌを鋳型に使用して配列番号：１で記載されるプライマー１、配列番号：２で記載されるプライマー２及び配列番号：３で記載されるプライマー３を各々１０ｐｍｏｌで使用してＰＣＲを実施した。ここで、プライマー１とプライマー２は、野生型カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子の１９０ｂｐＤＮＡ断片を増幅して、プライマー１及びプライマー３は、ターゲットされたカルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子の３２０ｂｐＤＮＡ断片を増幅するように考案した。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒間（変性段階）、５８℃で３０秒間（プライマーアニーリング段階）、７２℃で３０秒間（伸長段階）反応させることを４０サイクル行った。これから得たＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲルに電気泳動した後、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＥｔＢｒ）で染色して観察した。対照として野生型マウスからのＤＮＡ抽出物を使用した。
【００３７】
その結果、１９０ｂｐの大きさ（α１Ｂ遺伝子ターゲティングによる）と３２０ｂｐの大きさ（野生型α１Ｂ遺伝子による）の二つの増幅されたバンドが示され、これによりカルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つ異型接合マウスであることを確認した（図２Ａ、レーン３参照）。
【００３８】
＜１−５＞α１Ｂ−／−同型接合マウスの作製
前記実施例＜１−４＞で選別したカルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つ異型接合マウスのメスとオスを交配してカルシウムイオンチャネルα１Ｂ−／−遺伝子型を持つ同型接合トランスジェニックマウスを得た。作製したトランスジェニックマウスがゲノム内カルシウムイオンチャネルα１Ｂ−／−遺伝子型を持つかどうかを確認するためにサザンブロット分析及びＰＣＲを実施した。トランスジェニックマウスでカルシウムイオンチャネルα１Ｂタンパク質が発現されないことを確認するためにウエスタンブロット分析を実施した。
【００３９】
まず、サザンブロット分析をするために前記実施例＜１−４＞と同じ方法でトランスジェニックマウスの尾部の組職からゲノムＤＮＡを分離した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した。前記マウスＤＮＡに対して実施例＜１−１＞のＤＮＡから得たボックス部分（□）断片（図１のＣ）をプローブに使用してハイブリッド反応を実施した。この時対照群には野生型マウスから抽出したゲノムＤＮＡとカルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つ異型接合トランスジェニックマウスから抽出したゲノムＤＮＡを使用した。
【００４０】
その結果は、図２Ｂに示す。図面でレーン１及びレーン２は、対照群の野生型マウス（＋／＋）、レーン３からレーン５は異型接合マウス（＋／−）、レーン６及びレーン７は同型接合マウス（−／−）のゲノムＤＮＡを示し、８．０ｋｂバンドは野生型カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子から由来したもので、１４．５ｋｂバンドはターゲットされたカルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子から由来したものである。図面に見られるように、作製されたトランスジェニックマウスは、１４．５ｋｂバンドだけが見られ、このことからカルシウムイオンチャネルα１Ｂ−／−の遺伝子型を持っていることを確認した。
【００４１】
次に、ＰＣＲ分析のために、本発明者らは前記実施例＜１−４＞と同じ方法でトランスジェニックマウスの尾部の組職からゲノムＤＮＡを分離した後、このゲノムＤＮＡ １μｌを鋳型に使用して実施例＜１−４＞と同じプライマーを使用してＰＣＲを実施した。
【００４２】
その結果、野生型マウス（＋／＋）では、１９０ｂｐのバンド一つだけ観察され、異型接合マウス（＋／−）では、１９０ｂｐと３２０ｂｐ二つのバンドが観察された。また、本発明の同型接合トランスジェニックマウスでは、３２０ｂｐバンド一つだけが観察され、前記同型接合トランスジェニックマウスがカルシウムイオンチャネルα１Ｂ−／−の遺伝子型を持っていることを確認した（図２Ａ）。
【００４３】
第三に、カルシウムイオンチャネルα１Ｂ−／−遺伝子の遺伝子型を持っている本発明のα１Ｂノックアウトマウスで実際にカルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子が発現されないことを確認するために、ウエスタンブロット分析（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。詳細には、野生型マウスと同型接合トランスジェニックマウスを頚椎脱臼法で屠殺した後、頭蓋骨を切開して大脳（ｃｅｒｅｂｒｕｍ）を分離した。分離した大脳組職をタンパク質分解抑制剤が含まれた溶解額（５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＰＭＳＦ、タンパク質分解抑制混合液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、カルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）抑制剤ＩとII）に入れて粉砕した。前記組織液を１、０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清と沈殿物を分離した後、上清のみを取って再び２８、０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して粗細胞膜タンパク質画分を得た。前記細胞膜タンパク質画分を８〜１６％ＳＤＳ ＰＡＧＥ勾配ゲルで分離してニトロセルセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＰＲＯＴＲＡＮ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社）にブロットし、アフィニティー精製ポリクローナル抗体α１Ｂ（ＣＷ２１、Ｖａｎｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８年、第２７３巻、１４４９５−５０２頁）と化学発光により可視化した。
【００４４】
その結果を、図２のＣに示す。α１Ｂタンパク質はα１Ｂ−／−の脳では検出されず、野生型（＋／＋）マウスの脳で検出された。したがって、本発明のα１Ｂノックアウトマウスでカルシウムイオンチャネルα１Ｂタンパク質が発現していないことが確認された。本発明者らは、前記カルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−遺伝子型を持つトランスジェニックマウスの胚（ｅｍｂｒｙｏ）を２００２年１月８日付で韓国生命工学研究院遺伝子バンク（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に寄託した（アクセッション番号；ＫＣＴＣ １０１５８ＢＰ）。
【００４５】
実施例２：Ｎ型カルシウムチャネルが抑鬱症に及ぼす影響の研究
Ｎ型カルシウムチャネルが除去されたα１Ｂノックアウトマウス（アクセッション番号；ＫＣＴＣ １０１５８ＢＰ）の抑鬱症関連行動実験に対する反応を観察するために、本発明者らは、前記マウスと対照群マウスを使用して強制水泳試験と尾部懸垂試験を実施した。すべての動物は、温度、湿度を調節した環境で食べ物と水に自由に近付くことができるようにし、夜昼１２時間のサイクルで８時に朝が始まる条件下で飼育した。Ｆ１マウスのメス、オスすべて実験に使用した。８〜１０週齢のマウスを使用した。すべての行動実験は、単一盲検法（ｂｌｉｎｄ ｔｅｓｔ）によって行った。すべての抑鬱症関連行動試験は、２４時間周期の影響を最小化するために朝９時から正午の間に実施し、すべてのマウスは各実験に一回のみ使用した。
【００４６】
＜２−１＞強制水泳試験に対する静止反応の減少
強制水泳試験は、ポソルトらの文献を参考にして一部変形した方法で実施した（Ｐｏｓｏｌｔ，Ｒ．Ｄ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９７８年，第４７巻，３７９−３９１頁）。詳細には、本発明者らは、４リットルのプラスチックビーカー（１３ｃｍ×２５ｃｍ）に深さ１５ｃｍに水を満たして、α１Ｂノックアウトマウスと対照群（野生型）マウスに水泳を強制させて避けることができないストレスによる抑鬱症を誘発させた。抑鬱症行動反応に反映される静止浮遊した時間を測定した。総１５分間測定し、５分間隔でデータを集計して平均値を分析に使用した。
【００４７】
その結果、強制水泳試験でマウスは、１５分間水が入ったビーカー中で泳がせた時、野生型マウスは初期５分から抑鬱症状である静止浮遊状態（ｉｍｍｏｂｉｌｅ ｆｌｏａｔｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示した。一方、α１Ｂノックアウトマウスは１５分間始終続けて泳ぐ行動を示し、野生型マウスより水の上に静止浮遊する時間が全般的に顕著に短かった。前記事実から、α１Ｂノックアウトマウスは野生型マウスより抑鬱症が軽減した反応を示すことを確認した（図３参照）。
【００４８】
＜２−２＞尾部懸垂試験
尾部懸垂試験は、ステルらの文献を参考にして実施した（Ｓｔｅｒｕ，Ｌ．ら，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９８５年，第８５巻，３６７−３７０頁）。具体的に、動物をそれぞれ３５ｃｍ×４０ｃｍの筒中に、底からマウスの頭部が２５ｃｍの高さに位置するように尾部をテープで巻いた後、金属棒中央で７分間ぶら下げることを実施し、ビデオで撮影して単一盲検法により静止時間を測定した。初期１分間は、激しい行動を示す時期で初期１分を除いた６分間抑鬱症行動反応に表される静止時間を集計して平均値を分析に使用した。
【００４９】
その結果、尾部懸垂試験の場合にも強制水泳試験の場合と同様にα１Ｂノックアウトマウスは野生型マウスより顕著に減少した静止時間（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を示した（図４参照）。前記の結果から、α１Ｂノックアウトマウスは野生型マウスに比べて顕著に減少した静止反応を示すことから抑鬱症が著しく軽減していることを確認した。
【００５０】
産業上の利用可能性
前記で詳しく見たように、Ｎ型カルシウムチャネルが欠失したトランスジェニックマウスは、野生型マウスより顕著に減少した抗鬱反応を示し、これは、前記Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の活性の抑制により抑鬱症を軽減できることを示唆する。したがって、前記Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の活性を抑制する物質、または前記遺伝子の産物であるＮ型カルシウムチャネルの機能を抑制する物質は、抑鬱症の治療剤として有用に使用可能である。
【００５１】
上述に開示した概念及び特定の態様が、本発明の目的と同じ目的を実施するための改変されたまたは設計された他の態様の根拠として容易に利用されうることは当業者に理解されるものと思われる。当業者はまた、そのような等価の態様が、添付の特許請求の範囲に示されるような本発明の精神及び範囲から逸脱しないことも理解するものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】野生型α１Ｂ遺伝子座、ターゲティングベクター、及び分断された遺伝子座を示す模式図である。Ａ：野生型α１Ｂ遺伝子座、Ｂ：ＩＳ３部分がＧＦＰ−Ｎｅｏに置換され、ｔｋ遺伝子を含むターゲティングベクター、Ｃ：ターゲティングベクターによってターゲットされた遺伝子座、□：プローブに使用する断片。
【図２】図２Ａは、野生型、異型接合、同型接合変異マウスのPCR結果を示す電気泳動写真である。レーン１：マーカー、レーン２：野生型（＋／＋）、レーン３：異型接合（＋／−）、レーン４：同型接合（−／−）。図２Ｂは、野生型、異型接合、同型接合変異マウスのサザンブロット分析結果を示す電気泳動写真である。レーン１及び２：野生型（＋／＋）、レーン３〜５：異型接合（＋／−）、レーン６及び７：同型接合（−／−）。図２Ｃは、野生型およびトランスジェニックマウスからの脳組織のウエスタンブロット分析結果を示す電気泳動写真である。レーン１：野生型マウス（＋／＋）の小脳、レーン２：遺伝子変異マウス（−／−）の小脳、レーン３：野生型マウス（＋／＋）の大脳、レーン４：遺伝子変異マウス（−／−）の大脳。
【図３】野生型マウスとα１Ｂノックアウトマウスの強制水泳試験結果を示すグラフである。
【図４】野生型マウスとα１Ｂノックアウトマウスの尾部懸垂試験結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抑鬱症を軽減させる方法に関するもので、より詳細には、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に作用して活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
電位依存性カルシウムチャネル（ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ、ＶＤＣＣ）は神経伝達物質の分泌、膜興奮性及び遺伝子発現の調節において重要な役割を果たし、現在まで多くの種類の電位依存性カルシウムチャネルが明らかにされている（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，１９９８年，第２４巻，３０７−３２３頁）。電位依存性カルシウムチャネルは、α１、α２、β及びγのサブユニットで構成される多サブユニット構造を有し（Ｄｕｎｌａｐら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９５年，第１８巻，８９−９８頁；Ｄｅ Ｗａａｒｄら，Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，１９９６年，第４巻，４１−８７頁；Ｈｏｆｍａｎｎら，Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９９年，第１３９巻，３３−８７頁）、電気生理学的または薬学的性質によってＬ型、Ｎ型、Ｐ型、Ｑ型、Ｒ型及びＴ型に分類される（Ｔｓｉｅｎら，Ｓｏｃ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｅｒ．１９８７年，第４１巻，１６７−１８７頁；Ｒａｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｔｓｉｅｎ，Ｊ．Ｎｅｕｓｃｉ．，１９９５年，第１５巻，２９９５−３０１２頁）。一般的に、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型、Ｒ型は高い電位でチャネルが開き、Ｔ型の場合は低い電位でチャネルが開く特徴を持っている。電位依存性カルシウムチャネルのサブユニット中、α１サブユニットはカルシウムチャネルが作用するのに必須の役割を果たし、チャネルの性質を決める。現在までα１サブユニットの多くのサブグループをコードする６個の異なる遺伝子（α１Ａ−α１Ｆ）が明らかにされている（Ｃｈｉｎ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９８年，第３０巻，１２３−１３０頁；Ｅｒｔｅｌら，Ｎｅｕｒｏｎ，２０００年，第２５巻，５３３−５３５頁；Ｈｏｆｍａｎｎら，Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９９年，第１３９巻，３３−８７頁）。
【０００３】
インサイチューハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を通じてネズミの脳に存在するα１サブユニットの存在有無を詳しく見てみると、α１Ｂサブユニットが中枢神経系の全般にわたって発現され、特に感情調節部位である背側縫線核（ｄｏｒｓａｌ ｒａｐｈｅ）部位と青斑核（ｌｏｃｕｓ ｃｏｅｒｕｌｅｕｓ）部位にも存在することが知られている（ＴａｎａＫａら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１９９５年，第３０巻，１−１６頁）。細胞内レベルで見れば、α１Ｂサブユニットは主に神経細胞のシナプス前神経終末に位置し、多様な神経伝達物質の分泌を調節する生理学的機能があり（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７年，第２３５巻，４６−５２頁；Ｈｉｒｎｉｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８年，第２３９巻，５７−６１頁；Ｗｅｓｔｅｎｂｒｏｅｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９５年，第１５巻，６４０３−１８頁）、その他にもシナプス前またはシナプス後でセロトニン及びノルエピネフリン受容体の抑制性調節機能に関与してシナプス内神経伝達を調節することが知られている（Ｏｋａｄａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００１年，第２１巻，６２８−６４０頁；Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓ Ａ．Ｒ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１９９９年，第４０巻，１３７−１４８頁；Ｓｕｎ，Ｑ．Ｑ．ら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９８年，第５１０巻，１０３−２０頁）。
【０００４】
最近、遺伝子ターゲティング方法によるＮ型カルシウムチャネルのα１Ｂサブユニットを欠乏させた変異マウスを利用して、インビボにおける侵害受容（ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ）情報の処理に関するＮ型カルシウムチャネルの正確な役割を特定する何種類かの遺伝的研究結果が報告された（Ｋｉｍら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第１８巻，２３５−２４５頁；Ｓａｅｇｕｓａ，Ｈ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，２００１年，第１５巻，２３４９−５６頁；Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ｓ．ら，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，２００１年，第８巻，２４２３−７頁）。前記文献によれば、α１Ｂ変異マウスは、機械的痛症、放射熱による痛症及び炎症性痛症に対して正常マウスより顕著に減少した痛症反応を示した。また、神経損傷によって惹起された無害刺激に対する痛症と熱に対する過敏痛症にも正常マウスより著しい減少を示した。したがって、Ｎ型カルシウムチャネルは、痛症を認識するのに重要な役割を果たすことが分かる。その他にも高架式十字迷路法（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）を通じて、α１Ｂ変異マウスが正常マウスより不安感が軽減されているという研究結果が報告された（Ｓａｅｇｕｓａ，Ｈ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，２００１年，第１５巻，２３４９−５６頁）。しかし、抑鬱症のような感情障害に対して、Ｎ型カルシウムチャネルの正確な役割に関する薬理学的または遺伝的研究結果はいまだに報告されていない。
【０００５】
それで、本発明者らは、Ｎ型カルシウムチャネルα１Ｂ遺伝子を欠失させた変異マウスを利用して、代表的感情障害である抑鬱症とＮ型カルシウムチャネルの生理学的機能との連関性を研究するために、多様な抑鬱症関連動物行動実験を実施した。そして本発明者らは、Ｎ型カルシウムチャネルの活性の抑制により抑鬱症の症状が軽減されることを見出して本発明を完成させた。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる方法を提供することである。
【０００７】
また、本発明の目的は、Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂ遺伝子またはそのタンパク質を利用して、抗鬱剤をスクリーニングする方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤を有効成分として含む抗鬱剤を提供することである。
【０００９】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の上記目的を達成するために、本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂ遺伝子またはそのタンパク質を利用して、抗鬱剤をスクリーニングする方法を提供する
【００１１】
さらに、本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤を有効成分として含む抗鬱剤を提供する。
【００１２】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１３】
I．本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる方法を提供する
前記で、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制する方法には、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に作用して活性を抑制する物質を投与する、前記Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に結合する抗体を投与する、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子の転写を抑制する、または転写されたＮ型カルシウムチャネル遺伝子の翻訳を抑制する方法などがあるが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、前記で列挙した方法以外にもＮ型カルシウムチャネルの活性を抑制するすべての方法が使用できる。本発明の好ましい態様では、Ｎ型カルシウムチャネルをコードするα１Ｂ遺伝子がターゲットされたＮ型カルシウムチャネルを発現しないマウスを使用して、Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制と抗鬱との関係を調査した（図３及び図４参照）。
【００１４】
本発明者らは、Ｎ型カルシウムチャネルが代表的感情障害である抑鬱症と関連しているかどうかを確認するために、α１Ｂ遺伝子ノックアウトマウス（大韓民国特許出願第２００２−２３４３号）を使用して代表的な抑鬱症関連動物行動実験である強制水泳試験（ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｅｓｔ）及び、尾部懸垂試験（ｔａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔ）を実施した結果、強制水泳試験の場合、水を入れたビーカー中で１５分間マウスを泳がせた時、正常マウスは初期５分から抑鬱症状である静止浮遊状態（ｉｍｍｏｂｉｌｅ ｆｌｏａｔｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示した。一方、α１Ｂ変異（ノックアウト）マウスは、１５分間始終継続して水泳行動を示し、正常マウスより水の上に静止浮遊する時間が全般的に顕著に短いことを確認することにより、α１Ｂ変異マウスが正常マウスより抑鬱症が顕著に軽減した反応を示すことを確認した（図３参照）。また、尾部懸垂試験の場合にも強制水泳試験の場合と同様に、α１Ｂ変異マウスは正常マウスより顕著に減少した静止時間（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を示した（図４参照）。前記で詳しく説明したように、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子がターゲットされたα１Ｂ変異マウスは、二つの抑鬱症関連行動実験で抗鬱反応を示した。
【００１５】
最近になってセロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）およびノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）のようなモノアミン（ｍｏｎｏａｍｉｎｅ）、ならびにペプチドであるサブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）の調節異常が抑鬱症と病理学的に関連性があり、神経伝達物質を調節する薬剤が現在、抑鬱症治療剤として開発されている（Ｏｋａｄａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００１年，第２１巻，６２８−６４０頁；Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓ Ａ．Ｒ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１９９９年，第４０巻，１３７−１４８頁；Ｓｕｎ，Ｑ．Ｑ．ら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９８年，第５１０巻，１０３−２０頁）。前記Ｎ型カルシウムチャネル活性が抑制されたα１Ｂノックアウトマウスは、選択的セロトニン再取込抑制剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｒｅｕｐｔａｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、ＳＳＲＩ）、三環系（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃｓ）、モノアミン酸化酵素抑制剤（ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、サブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）または、ＮＫ−１受容体抑制剤等の抗鬱剤を処置した場合と等しい行動反応を示す。セロトニン１Ａ受容体変異マウスの場合は、正常マウスより不安感は高まっている一方、抑鬱症は軽減していることが知られている。ノルエピネフリントランスポーター変異マウスの場合も、正常マウスより減少した抑鬱症行動反応を示す（Ｒａｍｂｏｚ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，１４４７６−８１頁；Ｘｕ，Ｆ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年，第３巻，４６５−４７１頁）。
【００１６】
また、脊髓レベルでの痛症と関連して、Ｎ型カルシウムチャネルによって分泌すると知られているサブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）と、その受容体のＮＫ−１受容体の機能を阻害すれば、抑鬱症または不安感などが軽減するという薬理学的、遺伝学的研究結果が報告された（Ｓａｎｔａｒｅｌｌｉ，Ｌ．ら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，２００１年，第９８巻，１９１２−１７頁）。しかし、現在までＮ型カルシウムチャネルが抑鬱症と係わっているという研究結果は報告されていない。したがって、本発明者らが初めて遺伝子変異マウス利用した抑鬱症関連動物行動実験行い、Ｎ型カルシウムチャネルの活性の抑制による抑鬱症の軽減を明らかにした。
【００１７】
感情調節機能と関連するその他のカルシウムチャネルの研究結果を詳しく見ると、Ｌ型カルシウムチャネル抑制剤である「ニモデピン（ｎｉｍｏｄｅｐｉｎｅ）」が双極性障害（ｂｉｐｏｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）中、超高速周期双極性障害（ｕｌｔｒａ−ｒａｐｉｄ−ｃｙｃｌｉｎｇ ｂｉｐｏｌａｒ）と反復性短期抑鬱症（ｂｒｉｅｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）を緩和させる機能があり、カルシウムチャネルα２−デルタ抑制剤である「ガバペンチン（ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）」及び「リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ）」もこのような情緒障害を治療する候補物質になるという研究結果が報告された（Ｐｏｓｔ，Ｒ．Ｍ．ら，Ｂｉｐｏｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄ．，２０００年，第２巻，３０５−１５頁；Ｇｏｏｄｎｉｃｋ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｏｐｏｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄ．，２０００年，第２巻，１６５−７３頁）。しかし、抑鬱症と係わるカルシウムチャネルのインビボでの機能に対しては、本発明の研究結果以外には全く報告されておらず、本発明者らが初めて、Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制が抑鬱症軽減と関連することを明らかにした。
【００１８】
結論として、α１Ｂタンパク質の発現を抑制してＮ型カルシウムチャネルの活性を阻害すれば、抗鬱反応がもたらされる。したがって、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の活性を抑制する物質または前記遺伝子の産物であるＮ型カルシウムチャネルの活性を抑制する物質が抑鬱症治療剤として使用できることが示唆される。
【００１９】
II．本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂ遺伝子またはそのタンパク質を利用して抗鬱剤をスクリーニングする方法を提供する
α１Ｂの活性を抑制する物質が見出されれば、その物質は抗憂鬱剤として使用できる。したがって、タンパク質の活性を抑制する物質をスクリーニングする公知の方法によって、α１Ｂの活性を抑制する物質をスクリーニングすることができる。α１Ｂの活性を抑制する物質をスクリーニングする一般的な方法は、以下の工程を含む：
１）α１Ｂ構造遺伝子及びレポーター遺伝子を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；
２）前記形質転換体とスクリーニングする検体とを、共に培養する工程；及び
３）レポーター遺伝子の発現量を測定する工程。
【００２０】
前記でレポーター遺伝子として使用できる遺伝子として、ＬａｃＺ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）等を使用できるが、必ずしもこれらに限定されないことは当業者においては明白なことである。
【００２１】
III．本発明は、Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤を有効成分として含む抗鬱剤を提供する
前記で、Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤は、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に作用して活性を抑制する化合物、前記Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に結合する抗体、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子の転写を抑制する物質、転写されたＮ型カルシウムチャネル遺伝子の翻訳を抑制する物質等があるが、必ずしもこれに限定されるものではなく、前記で列挙した物質以外にも、Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制するすべての物質が使用可能である。
【００２２】
前記Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能で一般的な医薬品製剤の形態で使用可能である。好ましい薬剤学的製剤としては、錠剤、硬質または軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤等の経口投与用製剤、注射用溶液または懸濁液のような非経口投与用注射剤等があり、これら薬剤学的製剤は薬剤学的に許容可能な通常の担体、例えば経口投与用製剤の場合には賦形剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤または増量剤等を、注射剤の場合には、普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の稀釈剤または賦形剤等を使用して調剤することができる。また、非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、坐剤を含むことができる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステル等が使用可能である。坐剤の基材には、ウィテプソール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用可能である。
【００２３】
また、前記Ｎ型カルシウムチャネルの抑剤剤は、生理食塩水または有機溶媒と共に薬剤に許容された様々な担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と混合して使用可能であり、安全性や吸水性を増加させるためにグルコース、スクロースまたはデキストランのようなカーボハイドレート、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）またはグルタチオンのような抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）、キレート物質（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、低分子タンパク質または他の安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）が薬剤に使用可能である。
【００２４】
本発明の薬学的組成物で、Ｎ型カルシウムチャネル抑制剤の総有効量は巨丸剤（ｂｏｌｕｓ）形態あるいは相対的に短期間の注入剤（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）等によって単回投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与することができる。また、多回投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）を長期間投与する分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与することができる。前記Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤の濃度は、薬の投与経路及び治療回数だけではなく患者の年齢及び健康状態など多様な要因を考慮して患者の有効投与量が決められ、このような点を考慮する時、この分野の通常的な知識を持つ者であれば、本発明のＮ型カルシウムチャネル抑制剤の有効投与量を決めることができる。
【００２５】
前記Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤の好ましい有効用量は、注射剤の場合は、０．０１４〜０．１４μｇ／ｋｇ、経口投与剤の場合は、０．１４〜１．４μｇ／ｋｇで一日に１〜６回投与することができる（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｄ．Ｐ．ａｎｄ Ｊｕｄｉｔｈ Ａ．Ｐ．Ｐａｉｎ，２０００年，第８５巻，２９１−２９６頁）。
【００２６】
本発明の好ましい態様の適用については、添付の図面を参照して最も良く理解される。
【００２７】
実施例
本発明の実際の態様および目下の好ましい態様は、以下の実施例で示すように例証である。
【００２８】
但し、当業者はこの開示を考慮し、本発明の精神及び範囲内において改変や改良を加えてもよい。
【００２９】
実施例１：α１Ｂ遺伝子ノックアウトマウスの作製
＜１−１＞カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子を欠失したターゲティングベクターの作製
本発明者らは、カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子が欠失した遺伝子ノックアウトマウスを作製するために、一般的に使われる遺伝子ターゲティング法（ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を利用した。まず、α１Ｂ遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡを得るために１２９／ｓｖマウスゲノムＤＮＡ断片を無作為に挿入させたバクテリオファージラムダＦＩＸ II（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｌａｍｄａ ＦＩＸ II）ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をα１ＢラットｃＤＮＡ（ＡＵＧ〜７２０ｂｐ、Ｄｒ．Ｊｉｎ ＨＭ（ＮＩＨ）から得た）をプローブに使用してスクリーニングした。前記スクリーニングを通じてα１Ｂ遺伝子ＩＳ（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔ）１−３コード領域を含む１８．４ｋｂゲノムＤＮＡを持ったバクテリオファージクローンを得、多様な制限酵素を利用して制限酵素地図を完成した後、ターゲティングベクターを作るのに使用した。基本ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ（＋／−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を基本ベクターに使用し、ｐＥＧＦＰ−１ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）からＳＶ４０−ポリＡを含むＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を切り取ってエクソン（アミノ酸１５８）を含むＢａｍＨＩ−タグＩＳ２に融合した。ｐＬＮＴベクター（Ｓｕｇｉｔａｕｉ Ｎｏｄａから得た）からＰＧＫ−ｎｅｏ遺伝子を切り取ってＧＦＰ遺伝子の下流に連結した。
【００３０】
その結果、本発明で作製したターゲティングベクターは、ＩＳ３部分を欠失させ、陽性選別のためのＧＦＰ−ＮＥＯカセットで置換した。そして、陰性選別のためのＨＳＢ−ｔｋ遺伝子は、５’−相同領域の５’末端に連結した（図１）。
【００３１】
＜１−２＞胚幹細胞へのトランスフェクション
前記実施例＜１−１＞で作製したターゲティングベクターをトランスフェクトするための細胞株にＪ１胚幹細胞株を使用した。胚幹細胞培養と胚操作は以前の文献と同じ方法で実施した（Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９７年，第３８９巻，２９０−２９３頁）。Ｊ１胚幹細胞（米国、ＭＩＴのＲ．Ｊｅａｎｉｓｃｈから分与を受ける）をＥＳ培地［１５％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、１×ペニシリンストレプトマイシン（ｐｈｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ社）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）］に接種して３７℃で２〜３日間培養した。前記培養から得た胚細胞群に０．２５％トリプシンを含んだ１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えて単一細胞を得た。
【００３２】
前記で単一細胞に分離した胚幹細胞に実施例＜１−１＞で作製したターゲティングベクターをトランスフェクトするためにエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を実施した。詳細には、分離した単一の胚幹細胞２×１０７個／ｍｌと作製例＜１−１＞のターゲティングベクターＤＮＡ２５μｇを添加して混合した後、２７０Ｖ／５００ｍｉｃｒｏＦ条件下でエレクトロポレーションを実施した。ターゲティングベクターを導入した胚幹細胞を０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８及び２μＭのガンシクローバ（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｏｒ）が含まれたＥＳ培地で５〜７日間培養して胚幹細胞内カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子がターゲティングベクターによって正確にターゲットされた胚幹細胞クローンを選別維持した。カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子の欠失が確認された胚幹細胞クローンを再びＥＳ培地に分注して、１８〜２２時間培養した後、トリプシンを処理して単一細胞に分離し、生存した細胞のみを選んで微量注入に使用した。
【００３３】
＜１−３＞キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）マウスの作製
カルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つキメラマウスを作製するために、受精した胞胚に前記実施例＜１−２＞で選別した胚幹細胞クローンを微量注入した。詳細には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）メスとオスを交配し、交尾後３．５日（３．５ ｐ．ｃ．）のメスを頚椎脱臼法で屠殺した。屠殺したメスから子宮を摘出して子宮末端部をはさみで切除した後、１ｍｌ注射器を使用して２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％牛胎児血清、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール及びＤＭＥＭを含む注入溶液１ｍｌを貫流させた。解剖顕微鏡下で微細ガラス管を使用して前記子宮組職から胞胚を分離した。分離した胞胚を３５ｍｍペトリ皿上にあらかじめ滴下しておいた注入溶液に移し、後続する導入過程に使用した。このように分離した胞胚に前記実施例＜１−３＞で選別した胚幹細胞クローンを導入するために、微量注入器（Ｚｅｉｓｓ社）を利用してホールディング（ｈｏｌｄｉｎｇ）ピペットで胞胚の内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）方向を陰圧でつかんだ状態で１０〜１５個の胚幹細胞クローンを吸入した注射ピペットを胞胚の包胚腔内に挿入した後、陽圧を与えて胚幹細胞クローンを胞胚の包胚腔内に注入した。前記クローンが注入された胞胚を、精管手術したオスと交配した２．５ｐ．ｃ．の仮妊娠代理母マウスの子宮に移植して胚幹細胞クローン（Ｊ１）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胞胚から形成された異型細胞交雑種の一種であるキメラマウスの発生を誘導した。この時、子宮移植はアベルチン（ａｖｅｒｔｉｎｅ、１ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した代理母の腹部を１ｃｍ位切除して；子宮上部をピンセットでつまんで２ｃｍ程度体外に引っぱり；注射針で子宮に穴を開けて、その穴を通じて前記の胞胚を微細ガラス管で注入し；内部腹腔膜を縫合糸で二針縫った後、外皮膚を内科用クリップで封入する方法を使用した。このように胚幹細胞を注入した胞胚を代理母マウスの子宮に移植して約１９日間培養することにより胚幹細胞由来の細胞と胞胚由来の細胞とを融合し、ゲノム内にカルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つキメラマウスを得た。
【００３４】
＜１−４＞α１Ｂ＋／−異型接合マウスの作製
前記実施例＜１−３＞から得たオスキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスと交配して子孫を得た。この中からカルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つ異型接合マウスを選別するために、次のようにＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。
【００３５】
詳細には、ゲノムＤＮＡを抽出するためにマウス尾部を１．５ｃｍ位の大きさで切り取った後、前記組職を溶解緩衝液（１００ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．２％ＳＤＳ）０．４ｍｌに入れて、そこに０．１ｍｇ／ｍｌになるようにプロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を入れた後、５５℃で５時間処理した。前記反応液に、８Ｍカリウムアセテート７５μｌとクロロホルム０．４ｍｌを加えてよく振った後、４℃で１０分間放置した。前記反応液を１５、０００ｒｐｍで遠心分離した。上清０．４ｍｌをエチルアルコール１ｍｌに入れてゲノムＤＮＡを沈澱させた後、再び７０％エチルアルコールで洗浄して乾燥させた後、蒸溜水５０μｌで溶解し、ＰＣＲに供した。
【００３６】
前記のように抽出したマウスゲノムＤＮＡ １μｌを鋳型に使用して配列番号：１で記載されるプライマー１、配列番号：２で記載されるプライマー２及び配列番号：３で記載されるプライマー３を各々１０ｐｍｏｌで使用してＰＣＲを実施した。ここで、プライマー１とプライマー２は、野生型カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子の１９０ｂｐＤＮＡ断片を増幅して、プライマー１及びプライマー３は、ターゲットされたカルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子の３２０ｂｐＤＮＡ断片を増幅するように考案した。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒間（変性段階）、５８℃で３０秒間（プライマーアニーリング段階）、７２℃で３０秒間（伸長段階）反応させることを４０サイクル行った。これから得たＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲルに電気泳動した後、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＥｔＢｒ）で染色して観察した。対照として野生型マウスからのＤＮＡ抽出物を使用した。
【００３７】
その結果、１９０ｂｐの大きさ（α１Ｂ遺伝子ターゲティングによる）と３２０ｂｐの大きさ（野生型α１Ｂ遺伝子による）の二つの増幅されたバンドが示され、これによりカルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つ異型接合マウスであることを確認した（図２Ａ、レーン３参照）。
【００３８】
＜１−５＞α１Ｂ−／−同型接合マウスの作製
前記実施例＜１−４＞で選別したカルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つ異型接合マウスのメスとオスを交配してカルシウムイオンチャネルα１Ｂ−／−遺伝子型を持つ同型接合トランスジェニックマウスを得た。作製したトランスジェニックマウスがゲノム内カルシウムイオンチャネルα１Ｂ−／−遺伝子型を持つかどうかを確認するためにサザンブロット分析及びＰＣＲを実施した。トランスジェニックマウスでカルシウムイオンチャネルα１Ｂタンパク質が発現されないことを確認するためにウエスタンブロット分析を実施した。
【００３９】
まず、サザンブロット分析をするために前記実施例＜１−４＞と同じ方法でトランスジェニックマウスの尾部の組職からゲノムＤＮＡを分離した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した。前記マウスＤＮＡに対して実施例＜１−１＞のＤＮＡから得たボックス部分（□）断片（図１のＣ）をプローブに使用してハイブリッド反応を実施した。この時対照群には野生型マウスから抽出したゲノムＤＮＡとカルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−の遺伝子型を持つ異型接合トランスジェニックマウスから抽出したゲノムＤＮＡを使用した。
【００４０】
その結果は、図２Ｂに示す。図面でレーン１及びレーン２は、対照群の野生型マウス（＋／＋）、レーン３からレーン５は異型接合マウス（＋／−）、レーン６及びレーン７は同型接合マウス（−／−）のゲノムＤＮＡを示し、８．０ｋｂバンドは野生型カルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子から由来したもので、１４．５ｋｂバンドはターゲットされたカルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子から由来したものである。図面に見られるように、作製されたトランスジェニックマウスは、１４．５ｋｂバンドだけが見られ、このことからカルシウムイオンチャネルα１Ｂ−／−の遺伝子型を持っていることを確認した。
【００４１】
次に、ＰＣＲ分析のために、本発明者らは前記実施例＜１−４＞と同じ方法でトランスジェニックマウスの尾部の組職からゲノムＤＮＡを分離した後、このゲノムＤＮＡ １μｌを鋳型に使用して実施例＜１−４＞と同じプライマーを使用してＰＣＲを実施した。
【００４２】
その結果、野生型マウス（＋／＋）では、１９０ｂｐのバンド一つだけ観察され、異型接合マウス（＋／−）では、１９０ｂｐと３２０ｂｐ二つのバンドが観察された。また、本発明の同型接合トランスジェニックマウスでは、３２０ｂｐバンド一つだけが観察され、前記同型接合トランスジェニックマウスがカルシウムイオンチャネルα１Ｂ−／−の遺伝子型を持っていることを確認した（図２Ａ）。
【００４３】
第三に、カルシウムイオンチャネルα１Ｂ−／−遺伝子の遺伝子型を持っている本発明のα１Ｂノックアウトマウスで実際にカルシウムイオンチャネルα１Ｂ遺伝子が発現されないことを確認するために、ウエスタンブロット分析（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。詳細には、野生型マウスと同型接合トランスジェニックマウスを頚椎脱臼法で屠殺した後、頭蓋骨を切開して大脳（ｃｅｒｅｂｒｕｍ）を分離した。分離した大脳組職をタンパク質分解抑制剤が含まれた溶解額（５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＰＭＳＦ、タンパク質分解抑制混合液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、カルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）抑制剤ＩとII）に入れて粉砕した。前記組織液を１、０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清と沈殿物を分離した後、上清のみを取って再び２８、０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して粗細胞膜タンパク質画分を得た。前記細胞膜タンパク質画分を８〜１６％ＳＤＳ ＰＡＧＥ勾配ゲルで分離してニトロセルセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＰＲＯＴＲＡＮ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社）にブロットし、アフィニティー精製ポリクローナル抗体α１Ｂ（ＣＷ２１、Ｖａｎｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８年、第２７３巻、１４４９５−５０２頁）と化学発光により可視化した。
【００４４】
その結果を、図２のＣに示す。α１Ｂタンパク質はα１Ｂ−／−の脳では検出されず、野生型（＋／＋）マウスの脳で検出された。したがって、本発明のα１Ｂノックアウトマウスでカルシウムイオンチャネルα１Ｂタンパク質が発現していないことが確認された。本発明者らは、前記カルシウムイオンチャネルα１Ｂ＋／−遺伝子型を持つトランスジェニックマウスの胚（ｅｍｂｒｙｏ）を２００２年１月８日付で韓国生命工学研究院遺伝子バンク（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に寄託した（アクセッション番号；ＫＣＴＣ １０１５８ＢＰ）。
【００４５】
実施例２：Ｎ型カルシウムチャネルが抑鬱症に及ぼす影響の研究
Ｎ型カルシウムチャネルが除去されたα１Ｂノックアウトマウス（アクセッション番号；ＫＣＴＣ １０１５８ＢＰ）の抑鬱症関連行動実験に対する反応を観察するために、本発明者らは、前記マウスと対照群マウスを使用して強制水泳試験と尾部懸垂試験を実施した。すべての動物は、温度、湿度を調節した環境で食べ物と水に自由に近付くことができるようにし、夜昼１２時間のサイクルで８時に朝が始まる条件下で飼育した。Ｆ１マウスのメス、オスすべて実験に使用した。８〜１０週齢のマウスを使用した。すべての行動実験は、単一盲検法（ｂｌｉｎｄ ｔｅｓｔ）によって行った。すべての抑鬱症関連行動試験は、２４時間周期の影響を最小化するために朝９時から正午の間に実施し、すべてのマウスは各実験に一回のみ使用した。
【００４６】
＜２−１＞強制水泳試験に対する静止反応の減少
強制水泳試験は、ポソルトらの文献を参考にして一部変形した方法で実施した（Ｐｏｓｏｌｔ，Ｒ．Ｄ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９７８年，第４７巻，３７９−３９１頁）。詳細には、本発明者らは、４リットルのプラスチックビーカー（１３ｃｍ×２５ｃｍ）に深さ１５ｃｍに水を満たして、α１Ｂノックアウトマウスと対照群（野生型）マウスに水泳を強制させて避けることができないストレスによる抑鬱症を誘発させた。抑鬱症行動反応に反映される静止浮遊した時間を測定した。総１５分間測定し、５分間隔でデータを集計して平均値を分析に使用した。
【００４７】
その結果、強制水泳試験でマウスは、１５分間水が入ったビーカー中で泳がせた時、野生型マウスは初期５分から抑鬱症状である静止浮遊状態（ｉｍｍｏｂｉｌｅ ｆｌｏａｔｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示した。一方、α１Ｂノックアウトマウスは１５分間始終続けて泳ぐ行動を示し、野生型マウスより水の上に静止浮遊する時間が全般的に顕著に短かった。前記事実から、α１Ｂノックアウトマウスは野生型マウスより抑鬱症が軽減した反応を示すことを確認した（図３参照）。
【００４８】
＜２−２＞尾部懸垂試験
尾部懸垂試験は、ステルらの文献を参考にして実施した（Ｓｔｅｒｕ，Ｌ．ら，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９８５年，第８５巻，３６７−３７０頁）。具体的に、動物をそれぞれ３５ｃｍ×４０ｃｍの筒中に、底からマウスの頭部が２５ｃｍの高さに位置するように尾部をテープで巻いた後、金属棒中央で７分間ぶら下げることを実施し、ビデオで撮影して単一盲検法により静止時間を測定した。初期１分間は、激しい行動を示す時期で初期１分を除いた６分間抑鬱症行動反応に表される静止時間を集計して平均値を分析に使用した。
【００４９】
その結果、尾部懸垂試験の場合にも強制水泳試験の場合と同様にα１Ｂノックアウトマウスは野生型マウスより顕著に減少した静止時間（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を示した（図４参照）。前記の結果から、α１Ｂノックアウトマウスは野生型マウスに比べて顕著に減少した静止反応を示すことから抑鬱症が著しく軽減していることを確認した。
【００５０】
産業上の利用可能性
前記で詳しく見たように、Ｎ型カルシウムチャネルが欠失したトランスジェニックマウスは、野生型マウスより顕著に減少した抗鬱反応を示し、これは、前記Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の活性の抑制により抑鬱症を軽減できることを示唆する。したがって、前記Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の活性を抑制する物質、または前記遺伝子の産物であるＮ型カルシウムチャネルの機能を抑制する物質は、抑鬱症の治療剤として有用に使用可能である。
【００５１】
上述に開示した概念及び特定の態様が、本発明の目的と同じ目的を実施するための改変されたまたは設計された他の態様の根拠として容易に利用されうることは当業者に理解されるものと思われる。当業者はまた、そのような等価の態様が、添付の特許請求の範囲に示されるような本発明の精神及び範囲から逸脱しないことも理解するものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】野生型α１Ｂ遺伝子座、ターゲティングベクター、及び分断された遺伝子座を示す模式図である。Ａ：野生型α１Ｂ遺伝子座、Ｂ：ＩＳ３部分がＧＦＰ−Ｎｅｏに置換され、ｔｋ遺伝子を含むターゲティングベクター、Ｃ：ターゲティングベクターによってターゲットされた遺伝子座、□：プローブに使用する断片。
【図２】図２Ａは、野生型、異型接合、同型接合変異マウスのPCR結果を示す電気泳動写真である。レーン１：マーカー、レーン２：野生型（＋／＋）、レーン３：異型接合（＋／−）、レーン４：同型接合（−／−）。図２Ｂは、野生型、異型接合、同型接合変異マウスのサザンブロット分析結果を示す電気泳動写真である。レーン１及び２：野生型（＋／＋）、レーン３〜５：異型接合（＋／−）、レーン６及び７：同型接合（−／−）。図２Ｃは、野生型およびトランスジェニックマウスからの脳組織のウエスタンブロット分析結果を示す電気泳動写真である。レーン１：野生型マウス（＋／＋）の小脳、レーン２：遺伝子変異マウス（−／−）の小脳、レーン３：野生型マウス（＋／＋）の大脳、レーン４：遺伝子変異マウス（−／−）の大脳。
【図３】野生型マウスとα１Ｂノックアウトマウスの強制水泳試験結果を示すグラフである。
【図４】野生型マウスとα１Ｂノックアウトマウスの尾部懸垂試験結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる方法。
【請求項２】
Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂの活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制が、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に作用して活性を抑制する物質を投与することにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制が、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に結合する抗体を投与することにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制が、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子の転写を抑制することにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制が、転写されたＮ型カルシウムチャネル遺伝子の翻訳を抑制することにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤を有効成分として含む、抗鬱剤。
【請求項８】
Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂの抑制剤を有効成分として含む、請求項７記載の抗鬱剤。
【請求項９】
Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤が、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に作用して活性を抑制する化合物、前記Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に結合する抗体、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子の転写を抑制する物質、及び転写されたＮ型カルシウムチャネル遺伝子の翻訳を抑制する物質からなる群より選択される、請求項７記載の抗鬱剤。
【請求項１０】
α１Ｂ遺伝子またはそのタンパク質を用いて抗鬱剤をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、請求項１０記載の抗鬱剤のスクリーニング方法：
１）α１Ｂ構造遺伝子及びレポーター遺伝子を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；
２）前記形質転換体とスクリーニングする検体とを、共に培養する工程；及び
３）レポーター遺伝子の発現量を測定する工程。
【請求項１】
Ｎ型カルシウムチャネルの活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる方法。
【請求項２】
Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂの活性を抑制することにより抑鬱症を軽減させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制が、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に作用して活性を抑制する物質を投与することにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制が、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に結合する抗体を投与することにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制が、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子の転写を抑制することにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｎ型カルシウムチャネルの活性抑制が、転写されたＮ型カルシウムチャネル遺伝子の翻訳を抑制することにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤を有効成分として含む、抗鬱剤。
【請求項８】
Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂの抑制剤を有効成分として含む、請求項７記載の抗鬱剤。
【請求項９】
Ｎ型カルシウムチャネルの抑制剤が、Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に作用して活性を抑制する化合物、前記Ｎ型カルシウムチャネルに特異的に結合する抗体、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子の転写を抑制する物質、及び転写されたＮ型カルシウムチャネル遺伝子の翻訳を抑制する物質からなる群より選択される、請求項７記載の抗鬱剤。
【請求項１０】
α１Ｂ遺伝子またはそのタンパク質を用いて抗鬱剤をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、請求項１０記載の抗鬱剤のスクリーニング方法：
１）α１Ｂ構造遺伝子及びレポーター遺伝子を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトして形質転換体を得る工程；
２）前記形質転換体とスクリーニングする検体とを、共に培養する工程；及び
３）レポーター遺伝子の発現量を測定する工程。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５０９７３７（Ｐ２００６−５０９７３７Ａ）
【公表日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４５０５２（Ｐ２００４−５４５０５２）
【出願日】平成１５年１０月１６日（２００３．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００３／００２１５９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５０８７
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５９５００１１８１）コリア インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月１６日（２００３．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００３／００２１５９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５０８７
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５９５００１１８１）コリア インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (25)
【Ｆターム（参考）】
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