ＰＡＩ−１調節剤、それを含有する飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品
【課題】 継続的に使用しても安全かつ効果的な、ＰＡＩ−１産生量を調節することより、血管内皮機能改善作用を高めることが可能なＰＡＩ−１調節剤、それを含有する飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品を提供する。
【解決手段】 リンゴ抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とするＰＡＩ−１調節剤、該ＰＡＩ−１調節剤を含有する飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品。
【解決手段】 リンゴ抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とするＰＡＩ−１調節剤、該ＰＡＩ−１調節剤を含有する飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＡＩ−１産生量を調節することにより血管内皮機能を改善するＰＡＩ−１調節剤、それを含有する飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年我が国でも、生活様式の欧米化とともに肥満者および肥満予備群ともいうべき人口が増加し、肥満、高脂血症、糖尿病などに伴う血栓症、動脈硬化症が大きな問題となってきている。しかし、その病態や発症のメカニズムは解明されているとはいいがたい。欧米では既に肥満自体が心筋梗塞をはじめとした心血管障害の独立した危険因子として注目され、肥満に伴う血栓傾向の背景には血液凝固亢進状態および線溶能の低下があると指摘されている。
【０００３】
血管傷害局所における止血のための血栓形成には血小板と凝固因子の活性化が必須であるが、それに引き続いて起こる線溶（血栓溶解反応）系の活性化は、局所で形成された血栓が必要以上に存続あるいは拡大しないために非常に重要な反応である。すなわちこれは、血中のプラスミノーゲンが組織型あるいはウロキナーゼ型のプラスミノーゲン・アクチベーター（それぞれ「ｔ−ＰＡ」、「ｕ−ＰＡ」と略称する）によってフィブリン上で活性化され、酵素活性をもったプラスミンとなりフィブリンを溶解するという一連の反応である。したがって線溶系に異常が起こると、必然的に出血や血栓症といった病態が引き起こされることになる。
【０００４】
ＰＡＩ−１（Plasminogen activator inhibitor-1）は血栓形成部位においてｔ−ＰＡやｕ−ＰＡを阻害してプラスミンの生成を抑制するタンパク質である。そのメカニズムはフィブリン血栓を安定化させるとともに、細胞外マトリックスの溶解をも阻害して血管壁への沈着を促し、心血管病変の進展に寄与していると考えられる。血管壁に沈着したフィブリンおよびマトリックス成分は血管腔を狭小化させ、それがまた新たな血栓形成を引き起こすという悪循環を招く。また血栓形成部位では活性化血小板からもＰＡＩ−１が放出されるが、このＰＡＩ−１は可逆的にフィブリンに結合し、フィブリン周囲に濃縮された形で存在してｔ−ＰＡの活性を中和していると考えられる。
【０００５】
このようにＰＡＩ−１は血栓発症にとって極めて重要な線溶制御因子であり、生体内でのＰＡＩ−１発現増加は心筋梗塞や四肢深部静脈血栓症の発症に深くかかわっていると同時に、肺線維症や糸球体腎炎など線維化や微小血栓を基盤とした病理変化も促進すると考えられている（非特許文献１）。よって、このＰＡＩ−１産生量を調節することが血管内皮機能改善において非常に重要である。
【０００６】
血管内皮機能の改善作用をもつものとして一部の抗高脂血症薬などが挙げられるが、効能とともに副作用を考慮しなければならない。慢性的で無症候な病態である血管病変に対しては、長く安全に摂取できる食品による予防がより重要であると考えられ、血管内皮機能の改善作用をもつ食品の開発が期待されている。
【０００７】
しかしながら、特許文献１でプロアントシアニジンを含む「血栓形成抑制剤及び機能性食品」が開示されているが、ＰＡＩ−１産生量を調節することにより血管内皮機能を改善することに関しては一切言及されていない。
【０００８】
また、「血管変性性疾患の予防および処置のための組成物および方法（特許文献２）」においては、ココアポリフェノールとコンドロイチン硫酸との組合せによってのみ血管変性性疾患の予防および処置がなされることが開示されている。
【０００９】
「ココア成分、高められたポリフェノール含有量を有する食用製品、その製造法、および医学的利用法（特許文献３）」でも、ココアポリフェノールのみに限定しての医学的利用法が開示されている。
【００１０】
さらに、「窒素酸化物の生成を促進するためにポリフェノールおよびＬ−アルギニンを含有する製品（特許文献４）」ではプロシアニジンとアルギニンの組合せによってのみ、窒素酸化物の生成を促進することが開示されている。
【００１１】
以上のように、特許文献には、プロアントシアニジン又はポリフェノールの由来はブドウ種子及び松樹皮などであると開示され、リンゴ由来であるという記載はない。このように、いずれの特許文献にも、リンゴ抽出物がＰＡＩ−１産生量を調節する作用を有するという開示はなされていなく、ＰＡＩ−１産生量を調節することより、血管内皮機能改善作用を高めることが可能な、簡便かつ安全な飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品が待ち望まれていた。
【非特許文献１】山本晃士、日本臨床、61、2003. 520-525.
【特許文献１】特開2004-238289公報
【特許文献２】特表2001-511153公報
【特許文献３】特開2003-204758公報
【特許文献４】特表2001-505864公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、継続的に使用しても安全かつ効果的な、ＰＡＩ−１産生量を調節することより、血管内皮機能改善作用を高めることが可能なＰＡＩ−１調節剤、それを含有する飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、本発明者はリンゴ抽出物が、ＰＡＩ−１調節作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の内容を要旨とするものである。
（１）リンゴ抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とするＰＡＩ−１調節作用剤。
（２）前記リンゴ抽出物がリンゴ由来ポリフェノールであることを特徴とする（１）に記
載のＰＡＩ−１調節作用剤。
（３）前記リンゴ由来ポリフェノールは、総ポリフェノール中のプロシアニジン類の含有
率が、２０〜１００重量％であることを特徴とする（２）に記載のＰＡＩ−１調節作用剤。
（４）（１）から（３）のいずれか１に記載のＰＡＩ−１調節作用剤を含有する飲食品。
（５）（１）から（３）のいずれか１に記載のＰＡＩ−１調節作用剤を含有する食品添加物。
（６）（１）から（３）のいずれか１に記載のＰＡＩ−１調節作用剤を含有する医薬。
（７）（１）から（３）のいずれか１に記載のＰＡＩ−１調節作用剤を含有する香粧品。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のリンゴ抽出物を有効成分とするＰＡＩ−１調節剤は、副作用が極めて少なくＰＡＩ−１を調節することができる。
【００１６】
また、上記のＰＡＩ−１調節作用剤を有効成分として含有する飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品は、副作用が極めて少なくＰＡＩ−１を調節することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明におけるＰＡＩ−１調節作用剤は、ＰＡＩ−１産生量を調節し、血管内皮機能を改善するものを指す。
【００１８】
本発明におけるリンゴ抽出物は、バラ科リンゴ属植物の果実、例えば、フジ、陸奥、津軽、スターキング・デリシャス等の栽培品種及び原種リンゴ等より公知抽出手段により抽出して得られるものである。
【００１９】
果実としては成熟果実、幼果ともに用いることができるが、より多くのポリフェノール化合物を含有すること、及び広範な生理作用を有する各種活性成分を多量に含むことから、幼果が特に好ましい。
【００２０】
本発明におけるリンゴ由来ポリフェノールは、リンゴ抽出物中にポリフェノールを有効成分として含まれているものである。本発明におけるＰＡＩ−１調節剤は、リンゴ抽出物あるいはリンゴ由来ポリフェノールのいずれでもよいが、好ましくはリンゴ由来ポリフェノールである。精製度の高いリンゴ由来ポリフェノールは、飲食品等に添加する場合、おりや濁りを発生しにくく、また、飲食品等自身に与える風味の影響も抑えることができるといった加工上の応用性が高い。
【００２１】
本発明におけるリンゴ由来ポリフェノールは、総ポリフェノール中のプロシアニジン類の含有率が、好ましくは２０〜１００重量％、より好ましくは３０〜９０重量％、特に好ましくは２０〜６５重量％である。総ポリフェノールに占めるプロシアニジン類の割合が２０重量％より低いとＰＡＩ−１を調節する作用が低下する。プロシアニジン類の含有率が２０重量％より低いということはリンゴ由来ポリフェノールに占める単量体（カテキン）の割合が８０重量％以上であることを意味し、単量体の割合が８０重量％以上になるとＰＡＩ−１調節の効果を得にくくなるからである。
【００２２】
本発明のリンゴ抽出物中に含有されるリンゴ由来ポリフェノールは、リンゴ果実、若しくは幼果実の搾汁果汁から作られる清澄果汁または、抽出液より精製されたポリフェノール画分からなるものであるが、当該ポリフェノール画分の精製は、搾汁果汁、抽出液を吸着剤で処理することにより行なわれ、吸着剤に吸着する画分（以下、吸着画分という）にポリフェノールは含有されている。吸着剤としては、ポリフェノールを吸着するものであれば特に限定されないが、例えば親水性ビニルポリマー樹脂（東ソー社製「トヨパールＨＷ４０」）、スチレン−ジビニルベンゼン樹脂（三菱化学社製「セパビーズＳＰ−８５０」）、ゲル型合成樹脂（三菱化学社製「ダイヤイオンＨＰ−２０」）を挙げることができる。
【００２３】
前記吸着剤に吸着した吸着画分を、例えば含水エタノール等のアルコール溶媒で溶出させることにより、ポリフェノール画分が精製される。当該ポリフェノール画分は、次いで濃縮処理することによりリンゴ抽出物として液体製剤を得ることができ、さらに、当該液体製剤を噴霧乾燥もしくは凍結乾燥処理することにより粉末製剤を得ることもできる。
【００２４】
リンゴ由来ポリフェノールの原料となるリンゴ抽出物の抽出方法としては、例えば洗浄した原料をｐＨ３．２〜４．６、好ましくはｐＨ３．５〜４．３で破砕し、得られた果汁にペクチナーゼを５〜７５℃、好ましくは３０〜６０℃で１０〜１００ｐｐｍ、さらに好ましくは２０〜３０ｐｐｍ添加して清澄化を行い、遠心分離後、５〜７５℃、好ましくは１５〜２５℃で珪藻土（商品名「シリカ３００Ｓ」、中央シリカ社製）濾過によりさらに清澄化を行い、清澄果汁を得る。或いはヘキサン、クロロホルム等の有機溶媒による分配及び濾過を行い、清澄抽出液としてリンゴ果汁が得られる。
【００２５】
リンゴ果汁よりリンゴ由来ポリフェノールを得るには、次いで清澄抽出液を０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃、ｐＨ１．５〜４．２、好ましくはｐＨ３．０〜４．０で前記吸着剤を充填した吸着カラム（商品名「ダイヤイオンＨＰ−２０」、三菱化学社製）に通液し、ポリフェノール類を吸着させる。続いて純水を通液し、カラム中の非吸着物質（糖類、有機酸類等）を除去した後、１０〜９０％、好ましくは３０〜８０％のエタノールで吸着画分を溶出する。得られた吸着画分からエタノールを２５〜１００℃、好ましくは３５〜９０℃で減圧留去濃縮し、濃縮液をそのままで液体のリンゴ由来ポリフェノールとしてもよい。或いはデキストリン等の粉末助剤を添加し、噴霧乾燥又は凍結乾燥を行い、リンゴ由来ポリフェノールの抽出粉末品としてもよい。
【００２６】
本発明のＰＡＩ−１調節剤により、ＰＡＩ−１を調節する効果を得るための成人１日あたりの投与量は、リンゴ抽出物あるいはリンゴ由来ポリフェノールとして、１００〜２５００ｍｇであるが、好ましくは１５０〜１５００ｍｇ、更に好ましくは１５０〜１０００ｍｇ、特に１５０〜７５０ｍｇであるのが好ましい。
【００２７】
本発明のＰＡＩ−１調節剤を利用する場合、ポリフェノール類の吸収の点から、１日あたりのリンゴ抽出物量またはリンゴ由来ポリフェノール量を少ない回数で摂取する方がポリフェノール類の血中濃度が高くなり、ポリフェノール類の作用を発現しやすい。
【００２８】
本発明のＰＡＩ−１調節剤は、飲料を含む、広く食品一般に食品添加物として添加して用いることができ、例えばスープ類、飲料（ジュース、ミネラルウォーター、コーヒー、茶、ノンアルコールビール等）、菓子類（ガム、キャンディー、チョコレート、スナック、ゼリー等）、麺類（そば、うどん、ラーメン等）、アルコール飲料（ビール、発泡酒、カクテル、チューハイ、焼酎、日本酒、ウィスキー、ブランデー、ワイン等）に好適に用いられる。
【００２９】
本発明のＰＡＩ−１調節剤を含む医薬品の剤形は特に限定されないが、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の液剤等の経口投与剤が挙げられる。この経口投与剤は、形態に応じて当分野において通常用いられる賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、薬剤用担体等を添加して通常使用されている方法によって製造することができる。
【００３０】
また、香粧品にリンゴ由来ポリフェノールを配合しても良い。本発明における香粧品とは、化粧品、身体洗浄剤、口腔剤、入浴剤等の人体に適用する一連の製品を意味する。化粧品としては、例えば化粧水、化粧クリーム、乳液、ファンデーション、おしろい、口紅、整髪料、ヘトニック、育毛料、ヘアリンス等を挙げることができる。身体洗浄剤としては、例えば洗顔料、シャンプー、ボディーソープ等を挙げることができる。口腔剤としては、例えば練り歯磨き、先口液等を挙げることができる。香粧品を調整する場合には、通常の香粧品原料として使用されているものを適宜配合して製造することができる。
【００３１】
（実施例）
以下に実施例および試験例をあげ、本発明を具体的に説明する。
【００３２】
（製造例１）
青森県産リンゴ幼果３００ｋｇを破砕、圧搾し果汁２１０ｋｇを得た。得られた果汁にペクチナーゼ３０ｐｐｍで清澄化を行い、遠心分離後、珪藻土（シリカ３００Ｓ、中央シリカ社製）濾過により清澄化を行い清澄果汁を得た。清澄果汁を吸着カラム（ダイヤイオンＨＰ−２０、三菱化学社製）に通液し、ポリフェノール類を吸着させた。続いて純水を通液し、カラム中の非吸着物室（糖類、有機酸類など）を除去したのち、８０％アルコールで溶出した。得られた画分からアルコールを減圧濃縮し、抽出粉末品約２ｋｇを調製した。抽出粉末品を逆相系高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、クロロゲン酸類（約２０％）、フロレチレン配糖体類（約５％）、フラボノール類（約１５％）、プロアントシアニジン（約５０％）及びその他成分（約１０％）からなることが確認できた。更に、このプロトシアジニン類は、マトリックス支援レーザーイオン化―飛行時間型質量分析計(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ、アプライドバイオシステム社製)による解析の結果、フラバノール類であるカテキンやエビカテキンから構成される２量体から１５量体までのオリゴマーやポリマーであることが確認された（Ｍ．Ｏｈｎｉｓｈｉ−ｋａｍｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１１，３１，−３６，１９９７）。
【００３３】
（実施例１） 錠剤
製造例１で得られたリンゴ由来ポリフェノール１５０ｇとラクトース９０ｇとコーンスターチ１７ｇを混合し、この混合物をあらかじめコーンスターチ７０ｇから調整したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒にステアリン酸マグネシウム１ｇを加えてよく混合し、この混合物を打錠機にて打錠して錠剤１０００個を製造した。
【００３４】
（比較例１） 錠剤
ラクトース１４０ｇとコーンスターチ１７ｇとを混合し、この混合物をあらかじめコーンスターチ７０ｇから調整したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒にステアリン酸マグネシウム１ｇを加えてよく混合し、この混合物を打錠機にて打錠して錠剤１０００個を製造した。
【００３５】
（試験例１） リンゴ由来ポリフェノールのＰＡＩ−１調節作用（ヒト）
次に、臨床試験により、リンゴ由来ポリフェノールのＰＡＩ−１調節作用を検討した。
【００３６】
（方法）
（１）対象
有償ボランティアで、本試験への参加を自発的に志願した４０歳以上、ＢＭＩ２４以上の日本人男性の中から、試験開始４週間前以内に実施した予備検査において血糖高値（空腹時血糖が１１０〜１４０ｍｇ／ｄｌのもの）かつ血圧高値（収縮期血圧１３０〜１５９ｍｍＨｇまたは拡張期血圧８５〜９９ｍｍＨｇ）のものとした。ただし、血管内皮機能に影響のある可能性をもつ高脂血症用薬もしくは血糖改善薬による治療を受けている者や食品アレルギーの既往のあるもの、そのほか、試験開始前の健康診断や薬剤の使用状況調査などにおいて試験責任医師が参加に不適当と判断された者は除外した。これらの条件を満たした７名を被験者とし、ヘルシンキ宣言（1964年採択、'75,'83,'89,'96, 2000年修正、2002年注釈追加）の主旨に従い、被験者に対して研究内容、方法などについて十分な説明を行い、文書による同意を得て実施した。
【００３７】
（２） 試験食
本試験食は、実施例１で製造されたリンゴ由来ポリフェノールを含有した錠剤（１５０ｍｇ／１錠）および比較例１で製造されたポリフェノールが配合されていない対照食（プラセボ錠剤）とした。また、試験実施前に、試験責任医師が、風味、香りなどの官能面やパッケージなどにより、被験飲料とプラセボ錠剤間で区別がつかないことを確認した。
【００３８】
（３）摂取方法とスケジュール
試験はクロスオーバーによる２重盲検法を採用した。摂取期間を１週間、休止期間を２週間、さらに摂取期間を１週間、後観察期間を1週間と設定した。被験者には、次の方法で試験錠剤を摂取させた。
・リンゴ由来ポリフェノール含有被験錠剤（１５０ｍｇ／１錠）を夕食時に４錠摂取、以下 リンゴ由来ポリフェノール摂取
・プラセボ錠剤（１５０ｍｇ／１錠）を夕食時に4錠摂取、以下 プラセボ摂取
なお、試験期間中は、被験者に毎日の食事内容、飲酒量、運動量について普段と変わらない生活をとるよう指示し、暴飲暴食、過度の運動は禁じた。さらに、被験食の効果をより明確とするべく、試験期間中はりんごおよびりんご製品の摂取を禁じた。
【００３９】
（４）血液検査
全ての被験者に、摂取開始日、摂取１週間後（摂取終了）、後観察後において、ＰＡＩ−１、Ｎａ、Ｃａ、Ｃｌ、Ｋ、ＧＰＴ（ＡＬＴ）、ＬＤＨ、γ−ＧＴＰ、ＧＯＴ、総蛋白質、尿素窒素、Ｃｒｅ、ＴＣ、ＴＧ、ＡＬＢ、血糖、ＩＲＩ、血球成分（白血球、赤血球、ヘモグロビン量、ヘマトクリット値、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、血小板数）の測定項目を実施した。すべての検査に際しては、食事や運動などの外因的影響を避けるため、１２時間以上の絶食を行い、来院後10分以上の安静状態を維持した後、座位にて採血を実施した。
【００４０】
（結果）
結果を表１に示した。ＰＡＩ−１について、強い血管内皮機能障害を有していると考えられる本試験被験者において、リンゴ由来ポリフェノール摂取１週間後にプラセボと比較し有意に低下した(ｐ< 0.05)。また、各種血液検査から異常は認められなかった。摂取期間中、問題となるような訴えは全く見られなかった。
【００４１】
【表１】
【００４２】
（実施例２） 外用剤
ワセリン３０ｇ、流動パラフィン２０ｇ、パラフィン７ｇ、ラノリン４ｇの油相成分を
混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、セスキオレイン酸ソルビタン４ｇ、プロピレン
グリコール２．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．２ｇ、
精製水３１．７ｇの水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに香料０．２ｇを加
え、ホモミキサーにて均一に分散させた。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキ
サーにて乳化した。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて実施例１で得られたリンゴ由
来のポリフェノール０．２ｇの成分を加え、均一に混合した。
【００４３】
（実施例３） 飴
リンゴ由来ポリフェノール ５．０ｇ
ショ糖 １５．０ｇ
水飴（７５％固形分） ７０．０ｇ
水 ９．５ｇ
着色料（ダイワ化成株式会社 ハイオレンジＷ−１５０） ０．０５ｇ
香料（長谷川香料株式会社 オレンジフレーバーＡＨ−１１４４４） ０．４５ｇ
合計 １００．０ｇ
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従って飴とした。
【００４４】
（実施例４） ジュース
リンゴ由来ポリフェノール ２．５g
濃縮ミカン果汁 １５．０g
果糖 ２．５g
クエン酸 ０．２g
香料（高砂香料株式会社 オレンジフレーバー） ０．１g
色素（三栄源 オレンジカラーベース） ０．１５g
アスコルビン酸ナトリウム ０．０５g
水 ７９．５g
合計 １００．０g
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従ってジュースとした。
【００４５】
（実施例５） クッキー
リンゴ由来ポリフェノール ５．０g
薄力粉 ３２．０g
全卵 １６．０g
バター １６．０g
砂糖 ２０．０g
水 １０．８g
ベーキングパウダー ０．２g
合計 １００．０g
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従ってクッキーとした。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、ＰＡＩ−１産生量を調節できるＰＡＩ−１調節剤組成物が得られたので、血管内皮機能を改善できる安全性の高い飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品類に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＡＩ−１産生量を調節することにより血管内皮機能を改善するＰＡＩ−１調節剤、それを含有する飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年我が国でも、生活様式の欧米化とともに肥満者および肥満予備群ともいうべき人口が増加し、肥満、高脂血症、糖尿病などに伴う血栓症、動脈硬化症が大きな問題となってきている。しかし、その病態や発症のメカニズムは解明されているとはいいがたい。欧米では既に肥満自体が心筋梗塞をはじめとした心血管障害の独立した危険因子として注目され、肥満に伴う血栓傾向の背景には血液凝固亢進状態および線溶能の低下があると指摘されている。
【０００３】
血管傷害局所における止血のための血栓形成には血小板と凝固因子の活性化が必須であるが、それに引き続いて起こる線溶（血栓溶解反応）系の活性化は、局所で形成された血栓が必要以上に存続あるいは拡大しないために非常に重要な反応である。すなわちこれは、血中のプラスミノーゲンが組織型あるいはウロキナーゼ型のプラスミノーゲン・アクチベーター（それぞれ「ｔ−ＰＡ」、「ｕ−ＰＡ」と略称する）によってフィブリン上で活性化され、酵素活性をもったプラスミンとなりフィブリンを溶解するという一連の反応である。したがって線溶系に異常が起こると、必然的に出血や血栓症といった病態が引き起こされることになる。
【０００４】
ＰＡＩ−１（Plasminogen activator inhibitor-1）は血栓形成部位においてｔ−ＰＡやｕ−ＰＡを阻害してプラスミンの生成を抑制するタンパク質である。そのメカニズムはフィブリン血栓を安定化させるとともに、細胞外マトリックスの溶解をも阻害して血管壁への沈着を促し、心血管病変の進展に寄与していると考えられる。血管壁に沈着したフィブリンおよびマトリックス成分は血管腔を狭小化させ、それがまた新たな血栓形成を引き起こすという悪循環を招く。また血栓形成部位では活性化血小板からもＰＡＩ−１が放出されるが、このＰＡＩ−１は可逆的にフィブリンに結合し、フィブリン周囲に濃縮された形で存在してｔ−ＰＡの活性を中和していると考えられる。
【０００５】
このようにＰＡＩ−１は血栓発症にとって極めて重要な線溶制御因子であり、生体内でのＰＡＩ−１発現増加は心筋梗塞や四肢深部静脈血栓症の発症に深くかかわっていると同時に、肺線維症や糸球体腎炎など線維化や微小血栓を基盤とした病理変化も促進すると考えられている（非特許文献１）。よって、このＰＡＩ−１産生量を調節することが血管内皮機能改善において非常に重要である。
【０００６】
血管内皮機能の改善作用をもつものとして一部の抗高脂血症薬などが挙げられるが、効能とともに副作用を考慮しなければならない。慢性的で無症候な病態である血管病変に対しては、長く安全に摂取できる食品による予防がより重要であると考えられ、血管内皮機能の改善作用をもつ食品の開発が期待されている。
【０００７】
しかしながら、特許文献１でプロアントシアニジンを含む「血栓形成抑制剤及び機能性食品」が開示されているが、ＰＡＩ−１産生量を調節することにより血管内皮機能を改善することに関しては一切言及されていない。
【０００８】
また、「血管変性性疾患の予防および処置のための組成物および方法（特許文献２）」においては、ココアポリフェノールとコンドロイチン硫酸との組合せによってのみ血管変性性疾患の予防および処置がなされることが開示されている。
【０００９】
「ココア成分、高められたポリフェノール含有量を有する食用製品、その製造法、および医学的利用法（特許文献３）」でも、ココアポリフェノールのみに限定しての医学的利用法が開示されている。
【００１０】
さらに、「窒素酸化物の生成を促進するためにポリフェノールおよびＬ−アルギニンを含有する製品（特許文献４）」ではプロシアニジンとアルギニンの組合せによってのみ、窒素酸化物の生成を促進することが開示されている。
【００１１】
以上のように、特許文献には、プロアントシアニジン又はポリフェノールの由来はブドウ種子及び松樹皮などであると開示され、リンゴ由来であるという記載はない。このように、いずれの特許文献にも、リンゴ抽出物がＰＡＩ−１産生量を調節する作用を有するという開示はなされていなく、ＰＡＩ−１産生量を調節することより、血管内皮機能改善作用を高めることが可能な、簡便かつ安全な飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品が待ち望まれていた。
【非特許文献１】山本晃士、日本臨床、61、2003. 520-525.
【特許文献１】特開2004-238289公報
【特許文献２】特表2001-511153公報
【特許文献３】特開2003-204758公報
【特許文献４】特表2001-505864公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、継続的に使用しても安全かつ効果的な、ＰＡＩ−１産生量を調節することより、血管内皮機能改善作用を高めることが可能なＰＡＩ−１調節剤、それを含有する飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、本発明者はリンゴ抽出物が、ＰＡＩ−１調節作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の内容を要旨とするものである。
（１）リンゴ抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とするＰＡＩ−１調節作用剤。
（２）前記リンゴ抽出物がリンゴ由来ポリフェノールであることを特徴とする（１）に記
載のＰＡＩ−１調節作用剤。
（３）前記リンゴ由来ポリフェノールは、総ポリフェノール中のプロシアニジン類の含有
率が、２０〜１００重量％であることを特徴とする（２）に記載のＰＡＩ−１調節作用剤。
（４）（１）から（３）のいずれか１に記載のＰＡＩ−１調節作用剤を含有する飲食品。
（５）（１）から（３）のいずれか１に記載のＰＡＩ−１調節作用剤を含有する食品添加物。
（６）（１）から（３）のいずれか１に記載のＰＡＩ−１調節作用剤を含有する医薬。
（７）（１）から（３）のいずれか１に記載のＰＡＩ−１調節作用剤を含有する香粧品。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のリンゴ抽出物を有効成分とするＰＡＩ−１調節剤は、副作用が極めて少なくＰＡＩ−１を調節することができる。
【００１６】
また、上記のＰＡＩ−１調節作用剤を有効成分として含有する飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品は、副作用が極めて少なくＰＡＩ−１を調節することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明におけるＰＡＩ−１調節作用剤は、ＰＡＩ−１産生量を調節し、血管内皮機能を改善するものを指す。
【００１８】
本発明におけるリンゴ抽出物は、バラ科リンゴ属植物の果実、例えば、フジ、陸奥、津軽、スターキング・デリシャス等の栽培品種及び原種リンゴ等より公知抽出手段により抽出して得られるものである。
【００１９】
果実としては成熟果実、幼果ともに用いることができるが、より多くのポリフェノール化合物を含有すること、及び広範な生理作用を有する各種活性成分を多量に含むことから、幼果が特に好ましい。
【００２０】
本発明におけるリンゴ由来ポリフェノールは、リンゴ抽出物中にポリフェノールを有効成分として含まれているものである。本発明におけるＰＡＩ−１調節剤は、リンゴ抽出物あるいはリンゴ由来ポリフェノールのいずれでもよいが、好ましくはリンゴ由来ポリフェノールである。精製度の高いリンゴ由来ポリフェノールは、飲食品等に添加する場合、おりや濁りを発生しにくく、また、飲食品等自身に与える風味の影響も抑えることができるといった加工上の応用性が高い。
【００２１】
本発明におけるリンゴ由来ポリフェノールは、総ポリフェノール中のプロシアニジン類の含有率が、好ましくは２０〜１００重量％、より好ましくは３０〜９０重量％、特に好ましくは２０〜６５重量％である。総ポリフェノールに占めるプロシアニジン類の割合が２０重量％より低いとＰＡＩ−１を調節する作用が低下する。プロシアニジン類の含有率が２０重量％より低いということはリンゴ由来ポリフェノールに占める単量体（カテキン）の割合が８０重量％以上であることを意味し、単量体の割合が８０重量％以上になるとＰＡＩ−１調節の効果を得にくくなるからである。
【００２２】
本発明のリンゴ抽出物中に含有されるリンゴ由来ポリフェノールは、リンゴ果実、若しくは幼果実の搾汁果汁から作られる清澄果汁または、抽出液より精製されたポリフェノール画分からなるものであるが、当該ポリフェノール画分の精製は、搾汁果汁、抽出液を吸着剤で処理することにより行なわれ、吸着剤に吸着する画分（以下、吸着画分という）にポリフェノールは含有されている。吸着剤としては、ポリフェノールを吸着するものであれば特に限定されないが、例えば親水性ビニルポリマー樹脂（東ソー社製「トヨパールＨＷ４０」）、スチレン−ジビニルベンゼン樹脂（三菱化学社製「セパビーズＳＰ−８５０」）、ゲル型合成樹脂（三菱化学社製「ダイヤイオンＨＰ−２０」）を挙げることができる。
【００２３】
前記吸着剤に吸着した吸着画分を、例えば含水エタノール等のアルコール溶媒で溶出させることにより、ポリフェノール画分が精製される。当該ポリフェノール画分は、次いで濃縮処理することによりリンゴ抽出物として液体製剤を得ることができ、さらに、当該液体製剤を噴霧乾燥もしくは凍結乾燥処理することにより粉末製剤を得ることもできる。
【００２４】
リンゴ由来ポリフェノールの原料となるリンゴ抽出物の抽出方法としては、例えば洗浄した原料をｐＨ３．２〜４．６、好ましくはｐＨ３．５〜４．３で破砕し、得られた果汁にペクチナーゼを５〜７５℃、好ましくは３０〜６０℃で１０〜１００ｐｐｍ、さらに好ましくは２０〜３０ｐｐｍ添加して清澄化を行い、遠心分離後、５〜７５℃、好ましくは１５〜２５℃で珪藻土（商品名「シリカ３００Ｓ」、中央シリカ社製）濾過によりさらに清澄化を行い、清澄果汁を得る。或いはヘキサン、クロロホルム等の有機溶媒による分配及び濾過を行い、清澄抽出液としてリンゴ果汁が得られる。
【００２５】
リンゴ果汁よりリンゴ由来ポリフェノールを得るには、次いで清澄抽出液を０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃、ｐＨ１．５〜４．２、好ましくはｐＨ３．０〜４．０で前記吸着剤を充填した吸着カラム（商品名「ダイヤイオンＨＰ−２０」、三菱化学社製）に通液し、ポリフェノール類を吸着させる。続いて純水を通液し、カラム中の非吸着物質（糖類、有機酸類等）を除去した後、１０〜９０％、好ましくは３０〜８０％のエタノールで吸着画分を溶出する。得られた吸着画分からエタノールを２５〜１００℃、好ましくは３５〜９０℃で減圧留去濃縮し、濃縮液をそのままで液体のリンゴ由来ポリフェノールとしてもよい。或いはデキストリン等の粉末助剤を添加し、噴霧乾燥又は凍結乾燥を行い、リンゴ由来ポリフェノールの抽出粉末品としてもよい。
【００２６】
本発明のＰＡＩ−１調節剤により、ＰＡＩ−１を調節する効果を得るための成人１日あたりの投与量は、リンゴ抽出物あるいはリンゴ由来ポリフェノールとして、１００〜２５００ｍｇであるが、好ましくは１５０〜１５００ｍｇ、更に好ましくは１５０〜１０００ｍｇ、特に１５０〜７５０ｍｇであるのが好ましい。
【００２７】
本発明のＰＡＩ−１調節剤を利用する場合、ポリフェノール類の吸収の点から、１日あたりのリンゴ抽出物量またはリンゴ由来ポリフェノール量を少ない回数で摂取する方がポリフェノール類の血中濃度が高くなり、ポリフェノール類の作用を発現しやすい。
【００２８】
本発明のＰＡＩ−１調節剤は、飲料を含む、広く食品一般に食品添加物として添加して用いることができ、例えばスープ類、飲料（ジュース、ミネラルウォーター、コーヒー、茶、ノンアルコールビール等）、菓子類（ガム、キャンディー、チョコレート、スナック、ゼリー等）、麺類（そば、うどん、ラーメン等）、アルコール飲料（ビール、発泡酒、カクテル、チューハイ、焼酎、日本酒、ウィスキー、ブランデー、ワイン等）に好適に用いられる。
【００２９】
本発明のＰＡＩ−１調節剤を含む医薬品の剤形は特に限定されないが、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の液剤等の経口投与剤が挙げられる。この経口投与剤は、形態に応じて当分野において通常用いられる賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、薬剤用担体等を添加して通常使用されている方法によって製造することができる。
【００３０】
また、香粧品にリンゴ由来ポリフェノールを配合しても良い。本発明における香粧品とは、化粧品、身体洗浄剤、口腔剤、入浴剤等の人体に適用する一連の製品を意味する。化粧品としては、例えば化粧水、化粧クリーム、乳液、ファンデーション、おしろい、口紅、整髪料、ヘトニック、育毛料、ヘアリンス等を挙げることができる。身体洗浄剤としては、例えば洗顔料、シャンプー、ボディーソープ等を挙げることができる。口腔剤としては、例えば練り歯磨き、先口液等を挙げることができる。香粧品を調整する場合には、通常の香粧品原料として使用されているものを適宜配合して製造することができる。
【００３１】
（実施例）
以下に実施例および試験例をあげ、本発明を具体的に説明する。
【００３２】
（製造例１）
青森県産リンゴ幼果３００ｋｇを破砕、圧搾し果汁２１０ｋｇを得た。得られた果汁にペクチナーゼ３０ｐｐｍで清澄化を行い、遠心分離後、珪藻土（シリカ３００Ｓ、中央シリカ社製）濾過により清澄化を行い清澄果汁を得た。清澄果汁を吸着カラム（ダイヤイオンＨＰ−２０、三菱化学社製）に通液し、ポリフェノール類を吸着させた。続いて純水を通液し、カラム中の非吸着物室（糖類、有機酸類など）を除去したのち、８０％アルコールで溶出した。得られた画分からアルコールを減圧濃縮し、抽出粉末品約２ｋｇを調製した。抽出粉末品を逆相系高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、クロロゲン酸類（約２０％）、フロレチレン配糖体類（約５％）、フラボノール類（約１５％）、プロアントシアニジン（約５０％）及びその他成分（約１０％）からなることが確認できた。更に、このプロトシアジニン類は、マトリックス支援レーザーイオン化―飛行時間型質量分析計(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ、アプライドバイオシステム社製)による解析の結果、フラバノール類であるカテキンやエビカテキンから構成される２量体から１５量体までのオリゴマーやポリマーであることが確認された（Ｍ．Ｏｈｎｉｓｈｉ−ｋａｍｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１１，３１，−３６，１９９７）。
【００３３】
（実施例１） 錠剤
製造例１で得られたリンゴ由来ポリフェノール１５０ｇとラクトース９０ｇとコーンスターチ１７ｇを混合し、この混合物をあらかじめコーンスターチ７０ｇから調整したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒にステアリン酸マグネシウム１ｇを加えてよく混合し、この混合物を打錠機にて打錠して錠剤１０００個を製造した。
【００３４】
（比較例１） 錠剤
ラクトース１４０ｇとコーンスターチ１７ｇとを混合し、この混合物をあらかじめコーンスターチ７０ｇから調整したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒にステアリン酸マグネシウム１ｇを加えてよく混合し、この混合物を打錠機にて打錠して錠剤１０００個を製造した。
【００３５】
（試験例１） リンゴ由来ポリフェノールのＰＡＩ−１調節作用（ヒト）
次に、臨床試験により、リンゴ由来ポリフェノールのＰＡＩ−１調節作用を検討した。
【００３６】
（方法）
（１）対象
有償ボランティアで、本試験への参加を自発的に志願した４０歳以上、ＢＭＩ２４以上の日本人男性の中から、試験開始４週間前以内に実施した予備検査において血糖高値（空腹時血糖が１１０〜１４０ｍｇ／ｄｌのもの）かつ血圧高値（収縮期血圧１３０〜１５９ｍｍＨｇまたは拡張期血圧８５〜９９ｍｍＨｇ）のものとした。ただし、血管内皮機能に影響のある可能性をもつ高脂血症用薬もしくは血糖改善薬による治療を受けている者や食品アレルギーの既往のあるもの、そのほか、試験開始前の健康診断や薬剤の使用状況調査などにおいて試験責任医師が参加に不適当と判断された者は除外した。これらの条件を満たした７名を被験者とし、ヘルシンキ宣言（1964年採択、'75,'83,'89,'96, 2000年修正、2002年注釈追加）の主旨に従い、被験者に対して研究内容、方法などについて十分な説明を行い、文書による同意を得て実施した。
【００３７】
（２） 試験食
本試験食は、実施例１で製造されたリンゴ由来ポリフェノールを含有した錠剤（１５０ｍｇ／１錠）および比較例１で製造されたポリフェノールが配合されていない対照食（プラセボ錠剤）とした。また、試験実施前に、試験責任医師が、風味、香りなどの官能面やパッケージなどにより、被験飲料とプラセボ錠剤間で区別がつかないことを確認した。
【００３８】
（３）摂取方法とスケジュール
試験はクロスオーバーによる２重盲検法を採用した。摂取期間を１週間、休止期間を２週間、さらに摂取期間を１週間、後観察期間を1週間と設定した。被験者には、次の方法で試験錠剤を摂取させた。
・リンゴ由来ポリフェノール含有被験錠剤（１５０ｍｇ／１錠）を夕食時に４錠摂取、以下 リンゴ由来ポリフェノール摂取
・プラセボ錠剤（１５０ｍｇ／１錠）を夕食時に4錠摂取、以下 プラセボ摂取
なお、試験期間中は、被験者に毎日の食事内容、飲酒量、運動量について普段と変わらない生活をとるよう指示し、暴飲暴食、過度の運動は禁じた。さらに、被験食の効果をより明確とするべく、試験期間中はりんごおよびりんご製品の摂取を禁じた。
【００３９】
（４）血液検査
全ての被験者に、摂取開始日、摂取１週間後（摂取終了）、後観察後において、ＰＡＩ−１、Ｎａ、Ｃａ、Ｃｌ、Ｋ、ＧＰＴ（ＡＬＴ）、ＬＤＨ、γ−ＧＴＰ、ＧＯＴ、総蛋白質、尿素窒素、Ｃｒｅ、ＴＣ、ＴＧ、ＡＬＢ、血糖、ＩＲＩ、血球成分（白血球、赤血球、ヘモグロビン量、ヘマトクリット値、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、血小板数）の測定項目を実施した。すべての検査に際しては、食事や運動などの外因的影響を避けるため、１２時間以上の絶食を行い、来院後10分以上の安静状態を維持した後、座位にて採血を実施した。
【００４０】
（結果）
結果を表１に示した。ＰＡＩ−１について、強い血管内皮機能障害を有していると考えられる本試験被験者において、リンゴ由来ポリフェノール摂取１週間後にプラセボと比較し有意に低下した(ｐ< 0.05)。また、各種血液検査から異常は認められなかった。摂取期間中、問題となるような訴えは全く見られなかった。
【００４１】
【表１】
【００４２】
（実施例２） 外用剤
ワセリン３０ｇ、流動パラフィン２０ｇ、パラフィン７ｇ、ラノリン４ｇの油相成分を
混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、セスキオレイン酸ソルビタン４ｇ、プロピレン
グリコール２．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．２ｇ、
精製水３１．７ｇの水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに香料０．２ｇを加
え、ホモミキサーにて均一に分散させた。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキ
サーにて乳化した。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて実施例１で得られたリンゴ由
来のポリフェノール０．２ｇの成分を加え、均一に混合した。
【００４３】
（実施例３） 飴
リンゴ由来ポリフェノール ５．０ｇ
ショ糖 １５．０ｇ
水飴（７５％固形分） ７０．０ｇ
水 ９．５ｇ
着色料（ダイワ化成株式会社 ハイオレンジＷ−１５０） ０．０５ｇ
香料（長谷川香料株式会社 オレンジフレーバーＡＨ−１１４４４） ０．４５ｇ
合計 １００．０ｇ
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従って飴とした。
【００４４】
（実施例４） ジュース
リンゴ由来ポリフェノール ２．５g
濃縮ミカン果汁 １５．０g
果糖 ２．５g
クエン酸 ０．２g
香料（高砂香料株式会社 オレンジフレーバー） ０．１g
色素（三栄源 オレンジカラーベース） ０．１５g
アスコルビン酸ナトリウム ０．０５g
水 ７９．５g
合計 １００．０g
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従ってジュースとした。
【００４５】
（実施例５） クッキー
リンゴ由来ポリフェノール ５．０g
薄力粉 ３２．０g
全卵 １６．０g
バター １６．０g
砂糖 ２０．０g
水 １０．８g
ベーキングパウダー ０．２g
合計 １００．０g
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従ってクッキーとした。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、ＰＡＩ−１産生量を調節できるＰＡＩ−１調節剤組成物が得られたので、血管内皮機能を改善できる安全性の高い飲食品、食品添加物、医薬及び香粧品類に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴ抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とするＰＡＩ−１調節剤。
【請求項２】
前記リンゴ抽出物がリンゴ由来ポリフェノールであることを特徴とする請求項１に記載のＰＡＩ−１調節剤。
【請求項３】
前記リンゴ由来ポリフェノールは、総ポリフェノール中のプロシアニジン類の含有率が、２０〜１００重量％であることを特徴とする請求項２に記載のＰＡＩ−１調節剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＰＡＩ−１調節剤を含有する飲食品。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＰＡＩ−１調節剤を含有する食品添加物。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＰＡＩ−１調節剤を含有する医薬。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＰＡＩ−１調節剤を含有する香粧品。
【請求項１】
リンゴ抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とするＰＡＩ−１調節剤。
【請求項２】
前記リンゴ抽出物がリンゴ由来ポリフェノールであることを特徴とする請求項１に記載のＰＡＩ−１調節剤。
【請求項３】
前記リンゴ由来ポリフェノールは、総ポリフェノール中のプロシアニジン類の含有率が、２０〜１００重量％であることを特徴とする請求項２に記載のＰＡＩ−１調節剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＰＡＩ−１調節剤を含有する飲食品。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＰＡＩ−１調節剤を含有する食品添加物。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＰＡＩ−１調節剤を含有する医薬。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＰＡＩ−１調節剤を含有する香粧品。
【公開番号】特開２００７−８８３６（Ｐ２００７−８８３６Ａ）
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１８９２７４（Ｐ２００５−１８９２７４）
【出願日】平成１７年６月２９日（２００５．６．２９）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２９日（２００５．６．２９）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
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