本発明は、Ｒａｓのキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ）の特異的な阻害のための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、ＫＳＲ（特にＫＳＲ発現）の特異的な阻害のための遺伝的アプローチ及び核酸を提供する。本発明は、ＫＳＲ ＲＮＡに対して実質的に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及び核酸の発現に関する。オリゴヌクレオチド及び核酸組成物が提供される。本発明は、ＫＳＲ発現の阻害を含む、ＫＳＲを阻害する方法を提供する。ｇｆ Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成、転移をブロックするための方法、及び癌治療のための方法が提供される。細胞に対して放射線感受性を与える方法も提供される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の支援）
本発明をもたらす研究は、少なくとも部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの助成金番号ＣＡ４２３８５および助成金番号ＣＡ５２４６２からの助成により支援された。従って、連邦政府は本発明において、特定の権利を有し得る。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、Ｒａｓのキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ）の特異的な阻害のための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、ＫＳＲ（特にＫＳＲ発現）の特異的な阻害のための遺伝的アプローチ及び核酸を提供する。本発明は、ＫＳＲを特異的に阻害し、ｇｆ Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成をブロックする、ＫＳＲ ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及び核酸の発現に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｒａｓは、腫瘍化形質転換及び発生において必須の役割を果たす。腫瘍形成Ｈ−、Ｋ−、及びＮ−Ｒａｓは、少数の部位に限定された点変異から生じる（アミノ酸１２、１３、５９、及び６１）。通常のＲａｓとは異なり、腫瘍形成ｒａｓタンパク質は、ＧＴＰアーゼ活性を本質的に欠いており、構成的に活性化されたままである（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。ヒトの癌における腫瘍形成ｒａｓの関与は３０％であると概算されている（非特許文献４）。
【０００４】
突然変異は、しばしば、ｒａｓ遺伝子の１つのみに限定されており、頻度は、組織特異的又は腫瘍型特異的である。Ｋ−ｒａｓは、ヒトの癌において最も通常に突然変異する癌遺伝子である（特に、コドン−１２突然変異）。一方、１個のヌクレオチド置換から生じるＨ−、Ｋ−、及びＮ−Ｒａｓの癌遺伝子活性化がヒトの癌の３０％において観察され（非特許文献５）、ヒト膵臓癌の９０％より多くがコドン１２Ｋ−ｒａｓ突然変異であることを明らかにする（非特許文献４；非特許文献６；非特許文献７）。膵臓管腺癌（膵臓で最も普通の癌）は、その急速な発症及び処置に対する耐性で有名である。ヒト膵臓腫瘍におけるＫ−ｒａｓ突然変異の頻度が高いことは、構成的なＲａｓ活性化が膵臓の腫瘍形成中に重要な役割を果たすことを示唆する。膵臓外分泌部の腺癌は、西欧諸国において癌に関連する死亡率の第４の主因を表す。処置の成功は限られたものであり、５年生存率は５％未満であり、外科的に切除不能な腫瘍を有する患者について平均生存度は４ヶ月である（非特許文献８；非特許文献９）。この点変異は、通常の立方骨の膵臓管上皮が平坦な増殖性の病変へ進行する場合、疾患の経過で初期に同定することができ、この病変は膵臓癌の病因論における原因であるとみなされる（非特許文献１０；非特許文献１１）。しかし、ヒト膵臓癌における癌遺伝子Ｋ−ｒａｓシグナル形成の制御は、主に未知のままである。
【０００５】
Ｋ−ｒａｓ突然変異は、直腸及び肺の癌の５０％に存在する（非特許文献１２；非特許文献１３）。尿路及び膀胱の癌において、突然変異は主にＨ−ｒａｓ遺伝子においてである（非特許文献１４；非特許文献１５）。Ｎ−ｒａｓ遺伝子の突然変異は、白血病及び肝癌の３０％に存在する。ヒトの皮膚病変のほぼ２５％は、Ｈａ−Ｒａｓの突然変異を含む（扁平上皮細胞癌種について２５％、及び黒色腫について２８％）（非特許文献５；非特許文献１６）。甲状腺癌の５０〜６０％は、全ての３つの遺伝子において固有の突然変異を有する（非特許文献１７）。
【０００６】
Ｒａｓの構成的活性化は、腫瘍形成突然変異を介して、又は過剰に活性化された増殖因子レセプター（例えばＥＧＦＲ）を介して達成することができる。ＥＧＦＲファミリーのメンバー、特にＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の発現及び／又は増幅の増加は、ヒトの悪性疾患の種々の形態に関連している（非特許文献１８にまとめられるように）。これらの癌のいくつか（膵臓、直腸、膀胱、肺を含む）では、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２の過剰発現は、腫瘍形成Ｒａｓ突然変異の存在によって悪化する。腫瘍におけるこれらのレセプターの異常活性化は、過剰発現、遺伝子増幅、構成的活性化突然変異又はオートクリン増殖因子ループに起因する場合がある（非特許文献１９）。増殖因子レセプター（特にＥＧＦＲ）について、これらのレセプターの増殖又は／及び過剰発現は、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、直腸神経芽細胞腫において頻繁に起こる。
【０００７】
種々の治療ストラテジーがＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫカスケードの重要化合物を失活するために開発されたが、機能獲得又は構成的Ｒａｓ（ｇｆ Ｒａｓ）作用の特異的な阻害は臨床的には達成されなかった（非特許文献１７；非特許文献２０）。
【非特許文献１】Ｔｒａｈｅｙ，Ｍ．及びＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｆ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８：５４２−５
【非特許文献２】Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）３００：１４３−９
【非特許文献３】Ｔａｐａｒｏｗｓｋｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）３００：７６２−５
【非特許文献４】Ａｌｍｏｇｕｅｒａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ（１９８８）５３：５４９−５４
【非特許文献５】Ｂｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９８９）４９，４６８２−９
【非特許文献６】Ｓｍｉｔ，Ｖ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８８）１６，７７７３−８２
【非特許文献７】Ｂｏｓ，Ｊ．Ｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９８９）４９，４６８２−９
【非特許文献８】Ｊｅｍａｌ，Ａ ｅｔ ａｌ．、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ（２００２）５２，２３−４７
【非特許文献９】Ｂｕｒｒｉｓ，Ｈ．Ａ．，３ｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（１９９７）１５，２４０３−１３
【非特許文献１０】Ｈｒｕｂａｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００）６，２９６９−７２
【非特許文献１１】Ｔａｄａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（１９９６）１１０，２２７−３１
【非特許文献１２】Ｂｏｓ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２７：２９３−７
【非特許文献１３】Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８８）４８：５７３８−４１
【非特許文献１４】Ｆｕｊｉｔａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：４６４−６
【非特許文献１５】Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ，Ｋ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ．（１９８８）３：７７−８６
【非特許文献１６】Ｍｉｇｌｅｙ，Ｒ．Ｓ．及びＫｅｒｒ，Ｄ．Ｊ．、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．（２００２）４４：１０９−２０
【非特許文献１７】Ａｄｊｅｉ，Ａ．Ａ．、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．（２００１）９３：１０６２−７４
【非特許文献１８】Ｐｒｅｎｚｅｌ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ．（２００１）８：１１−３１
【非特許文献１９】Ｖｏｌｄｂｏｒｇ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．（１９９７）８：１１９７−２０６
【非特許文献２０】Ｃｏｘ，Ａ．Ｄ．及びＤｅｒ，Ｃ．Ｊ．、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２００２）２，３８８−９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それ故に、Ｒａｓ経路（特にＲａｓにより媒介される癌）を失活又は阻害するための従来技術の方法に付随する上述の欠乏の観点から、Ｒａｓ経路を特異的に阻害するための、特にｇｆ Ｒａｓを阻害するための方法及び組成物についての当該技術分野における必要性がなお存在することが明らかであるべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書中の参考文献の引用は、本発明に対する従来技術であることを承認するものとは解釈されるべきではない。
【００１０】
（要旨）
本発明は、Ｒａｓのキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ）の特異的な阻害のための方法及び組成物に関する。本発明の組成物及び方法は、ＫＳＲの発現及び／又は活性を阻害する。１つの局面では、本発明は、ＫＳＲの特異的な阻害のための遺伝的アプローチ及び核酸を提供する。ＫＳＲの特定の阻害について、Ｒａｓ経路が破壊され、特に、Ｒａｓにより媒介される腫瘍及び腫瘍形成が阻害されるか又はブロックされ、既存の腫瘍が退縮し、転移が阻害され、腫瘍又は癌細胞の増殖が阻害されることが、本明細書中に示される。
【００１１】
本発明はさらに、ＫＳＡ発現及び／又は活性を特異的に阻害することによって、特に過剰発現性の癌細胞又は腫瘍細胞に放射線感受性を与えるための方法及び手段に関する。１つのこのような局面では、過剰発現性の癌細胞又は腫瘍細胞は、イオン化放射線（ＩＲ）により誘導されるアポトーシス又は細胞死に耐性である。ＫＳＲに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与又は発現によるものを含むＫＳＲの阻害は、イオン化放射線に対する感受性を細胞に与え、それによって細胞の分割又は増殖がブロックされるか、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの非存在下でのＩＲよりも効果的に細胞が殺される。ＫＳＲに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与又は発現は、放射線治療を含む癌治療を促進し、向上させる。
【００１２】
本発明はさらに、特に、ＫＳＲの発現及び／又は活性の活性化又は阻害の際にＶＥＧＦ発現を調整することによる、血管形成を調整するための方法及び手段に関する。ＶＥＧＦ発現は、ＫＳＲの発現及び／又は活性の特異的な阻害又は活性化によって調整される。ＫＳＲの活性化又は発現を高めることにより、細胞中又は細胞によるＶＥＧＦの量又は発現が増加する。このように、細胞又は組織におけるＫＳＲの活性化又は発現を高めることは、血管形成を刺激する方法を提供する。ＫＳＲの阻害、妨害又は減少は、ＶＥＧＦの量又は発現を減少させ、それによって抗血管形成効果を有する。１つのこのような局面では、癌細胞又は腫瘍細胞のＶＥＧＦ発現は、ＫＳＲに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与又は発現によるものを含むＫＳＲの阻害によってブロックされ、癌又は腫瘍における血管形成を阻害する。１つの局面では、ＫＳＲに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与又は発現によるものを含むＫＳＲの阻害は、腫瘍、ＫＳＲを発現する組織又は細胞、特に、ｇｆ Ｒａｓを発現する組織又は細胞において血管形成を阻害する方法を提供し、ここで、Ｒａｓ経路が過剰に活性化されるか、又はＲａｓが過剰発現されるか又は増幅される。
【００１３】
本発明は、ＫＳＲの発現及び活性を特異的に阻害するか又はブロックするオリゴヌクレオチド及び核酸を提供する。特に、ＫＳＲ ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及び核酸の発現は、ＫＳＲの発現を特異的に阻害し、ｇｆ Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成をブロックする。本発明は、ＫＳＲ ＲＮＡの領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、上記オリゴヌクレオチドはＫＳＲの発現を阻害する。本発明はさらに、哺乳動物ＫＳＲをコードする核酸に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、哺乳動物ＫＳＲ、特にヒトＫＳＲ及びマウスＫＳＲをコードする核酸に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドが提供される。
【００１４】
本発明の１つの局面では、哺乳動物ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの翻訳開始部位、５’未翻訳領域、コード領域又は３’未翻訳領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドが提供される。このように、１つのこのような局面では、本発明は、図１４及び配列番号２４に提供されるような、ヒトＫＳＲをコードするｍＲＮＡの翻訳開始部位、５’未翻訳領域、コード領域又は３’未翻訳領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物ＫＳＲ ｍＲＮＡのＮ−末端コード領域に対して、特に、哺乳動物ＫＳＲ ｍＲＮＡのコード領域のヌクレオチド１〜７６１の領域に対して実質的に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。１つの実施形態では、本発明は、ＫＳＲのＣＡ１領域に対して実質的に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明は、ヒトＫＳＲの配列のアミノ酸３３〜７２及びマウスＫＳＲの配列のアミノ酸４２〜８２をコードするヌクレオチドに対して実質的に相補的な配列、又はそれらの一部分を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１５】
さらなる実施形態では、本発明は、ヒトＫＳＲのコード配列のヌクレオチド９７〜２１６（配列番号２５）又はマウスＫＳＲのコード配列のヌクレオチド１２４〜２４３（配列番号１）に対して実質的に相補的な配列、又はそれらの一部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（このヌクレオチドはヒトＫＳＲの配列のアミノ酸３３〜７２（配列番号２６）及びマウスＫＳＲの配列のアミノ酸４２〜８２（配列番号２）又はそれらの一部分をコードする）を含む。特に、本発明のオリゴヌクレオチドとしては以下からなる群から選択されるヌクレオチドに対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる：マウスＫＳＲの配列のヌクレオチド１５１〜１６８に対応する、ヒトＫＳＲの配列のヌクレオチド１２４〜１４１（配列番号３）；マウスＫＳＲの配列のヌクレオチド１８１〜１９８（配列番号４）に対応するヒトＫＳＲの配列のヌクレオチド１５４〜１７１（配列番号２７）（５’最末端ヌクレオチドで１個の塩基対が異なる）；及びマウスＫＳＲの配列のヌクレオチド２１４〜２３１に対応する、ヒトＫＳＲの配列のヌクレオチド１８７〜２０４（配列番号５）。本発明は、配列番号６〜８及び配列番号２９〜３８の群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識で標識されてもよい。特定の局面では、標識は、酵素、リガンド、蛍光を発する化学物質及び放射性元素から選択されてもよい。放射能活性な標識、例えば、同位体^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^５１Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^９０Ｙ、^Ｉ２５Ｉ、^１３１Ｉ及び^１８６Ｒｅが使用される場合、既知の従来から利用可能な計測手段を使用してもよい。標識が酵素である場合、検出は、現在利用され、当該技術分野で既知の比色技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流測定技術又は気体定量技術のいずれかによって達成されてもよい。
【００１７】
特定の局面では、本発明の核酸及びオリゴヌクレオチドは、核酸の化学骨格の操作によって、又は他の部分の共有結合又は非共有結合のいずれかによって改変されてもよい。いずれかの場合又は任意の場合では、このような操作又は結合は、核酸及びオリゴヌクレオチドの安定性、細胞、組織又は臓器への取り込みを改変し、又は効力を高めるためになされてもよい。本発明のさらなる局面では、オリゴヌクレオチドは他の分子（限定されないが、ポリペプチド、炭水化物、脂質又は脂質様部分、リガンド、化学薬剤又は化合物が挙げられる）に共有結合され、オリゴヌクレオチドの取り込み、安定性を高めるか、又はオリゴヌクレオチドを標的化するためになされてもよい。
【００１８】
さらなる実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、化学骨格において改変されている。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート（Ｐ−Ｓ）結合を含む。
【００１９】
哺乳動物ＫＳＲ ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスＲＮＡの転写をコードする核酸配列又はそれらの一部分を含む組換えＤＮＡ分子が本発明によって提供される。さらに、組換えＤＮＡ分子は、転写制御配列に操作可能に結合した核酸配列を含む。これらの組み換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞株も本発明に含まれる。
【００２０】
さらなる局面では、ＫＳＲ ＲＮＡのコード配列に対して実質的に相補的な核酸、又はそれらの一部分を発現可能であり、上記核酸がＫＳＲの発現を阻害する、発現ベクターが提供される。特定の局面では、この発現ベクターは、ＫＳＲ ＲＮＡ（特にマウスＫＳＲ又はヒトＫＳＲ（配列番号１又は配列番号２５））のコード配列のＣＡ１領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチド、又はそれらの一部分を発現可能であり、上記オリゴヌクレオチドがＫＳＲの発現を阻害する、発現ベクターを含む。
【００２１】
核酸及びオリゴヌクレオチドの組成物は、本発明のさらなる局面である。本発明は、ＫＳＲ ＲＮＡの領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドと薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とを含む組成物を含む。このように、本発明は、治療的に有効量のＫＳＲ ＲＮＡの領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドと、薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２２】
さらなる局面では、１つ以上の化学治療剤又は放射能治療剤と、哺乳動物ＫＳＲをコードするｍＲＮＡに対して標的化されるオリゴヌクレオチドとを含み、ＫＳＲ発現を阻害する組成物が提供される。
【００２３】
さらなる実施形態では、本発明は、発現ベクターと、薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とを含み、上記発現ベクターが、ＫＳＲ ＲＮＡのコード配列に対して実質的に相補的な核酸、又はそれらの一部分を発現可能であり、上記核酸がＫＳＲの発現を阻害する、組成物を提供する。
【００２４】
ＫＳＲの発現を阻害する方法が提供される。１つの局面では、ＫＳＲを発現する細胞と、ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの一部分に対して相補的な有効量の核酸とを接触させる工程を含む、哺乳動物ＫＳＲの発現を阻害する方法が含まれる。特に、ＫＳＲを発現する細胞と、本発明の有効量のオリゴヌクレオチドとを接触させ、それにより哺乳動物ＫＳＲの発現が阻害される工程を含む、哺乳動物ＫＳＲの発現を阻害する方法が提供される。さらなる局面では、組織又は腫瘍、特にｇｆ Ｒａｓを発現する組織又は腫瘍は、又はＲａｓ経路が過剰に活性化されるか、又はＲａｓが過剰発現されるか又は増幅される場合に、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド又は核酸と接触され、このようにしてＫＳＲの発現を阻害する、ＫＳＲの発現を阻害する方法が提供される。
【００２５】
さらなる実施形態では、本発明は、ＫＳＲのキナーゼ又はホスホリル化活性を含む、ＫＳＲの活性を阻害又は妨害するための組成物及び方法を提供する。さらなる局面では、組織、腫瘍又はＫＳＲを発現させる細胞、特にｇｆ Ｒａｓを発現する組織又は腫瘍は、又はＲａｓ経路が過剰に活性化されるか、又はＲａｓが過剰発現されるか又は増幅される場合に、有効量の本発明の核酸又は組成物と接触され、ＫＳＲの活性を阻害する、ＫＳＲの発現を阻害する方法が提供される。
【００２６】
本発明はさらに、哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現を阻害する治療的に有効量の組成物又は薬剤を上記哺乳動物に投与する工程を含む、ｇｆ−Ｒａｓの発現に関連する過剰増殖状態、又は哺乳動物におけるＲａｓの高められた発現を処置又は予防する方法を含む。本方法の１つの局面では、上記化合物又は薬剤は、ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの一部分に対して相補的な治療的に有効量の核酸を上記哺乳動物において発現させるか、又は上記哺乳動物に投与する工程を含む、ｇｆ−Ｒａｓの発現に関連する過剰増殖状態、又は哺乳動物におけるＲａｓの高められた発現を処置又は予防する方法が提供される。
【００２８】
さらなる局面では、哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現を阻害する治療的に有効量の化合物又は薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において癌の進行を処置又は予防する方法が含まれる。本発明の方法に対して感受性の癌としては、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、頭頚部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道癌及び前立腺癌の群から選択される癌が挙げられる。このように、治療的に有効量の本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドを哺乳動物に対して投与する工程を含む、哺乳動物において癌の進行を処置又は阻害する方法が提供される。
【００２９】
本発明は、治療的に有効量のＫＳＲ発現及び／又は活性の１つ以上のインヒビターを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において過剰増殖性の癌細胞又は腫瘍細胞におけるイオン化放射線又は他の放射線又は化学治療に対して感受性を与える方法を提供する。本発明は、治療的に有効量の本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドを哺乳動物に対して投与する工程を含む、哺乳動物において過剰増殖性の癌細胞又は腫瘍細胞におけるイオン化放射線に対して感受性を与える方法を提供する。
【００３０】
本発明は、ＫＳＲの発現及び／又は活性の活性化又は阻害の際に、ＶＥＧＦ発現を調整することによって、哺乳動物において血管形成を調整する方法を提供する。ＫＳＲの阻害、妨害又は減少は、ＶＥＧＦの量又は発現を減少させ、それによって抗血管形成効果を有する。１つの特定のこのような局面では、癌細胞又は腫瘍細胞のＶＥＧＦ発現は、ＫＳＲに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与又は発現によるものを含むＫＳＲの阻害によってブロックされ、癌又は腫瘍における血管形成が阻害される。本発明は、腫瘍、ＫＳＲを発現する組織又は細胞、特にｇｆ Ｒａｓを発現する組織又は腫瘍は、又はＲａｓ経路が過剰に活性化されるか、又はＲａｓが過剰発現されるか又は増幅される場合に、上記哺乳動物にＫＳＲのインヒビター（治療的に有効量の１つ以上のＫＳＲに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）を投与する工程を含む、血管形成を阻害する方法を提供する。血管形成を調整するためのさらなる方法では、ＫＳＲの活性化又は発現を高めることにより、細胞中又は細胞によるＶＥＧＦの量又は発現が増加する。細胞又は組織においてＫＳＲを活性化又は発現を高める工程を含む、血管形成を刺激する方法が提供される。
【００３１】
それに加えて、以下の工程：
（ａ）候補化合物又は薬剤の存在下及び非存在下で、ＫＳＲを発現する細胞をインキュベートする工程；及び
（ｂ）候補化合物又は薬剤の存在下及び非存在下で、ＫＳＲの発現を検出又は測定する工程を含み、上記候補化合物又は薬剤の非存在下でのＫＳＲの発現に対して、上記候補化合物又は薬剤の存在下でのＫＳＲの発現が減少することが、上記化合物又は薬剤がＫＳＲの発現を阻害することを示す、ＫＳＲの発現を阻害する化合物又は薬剤を同定する方法が提供される。
【００３２】
本発明は、ＫＳＲ ｍＲＮＡの翻訳をブロックすることによって、又はＲＮＡの破壊又は不安定化を促進することによって翻訳が有効に起こりえないような転写レベルで、タンパク質、特にＫＳＲの発現を阻害可能なさらなる組成物を含む。この局面では、本発明は、ＫＳＲ ｍＲＮＡを開裂するリボザイムを提供する。
【００３３】
本発明は、本明細書中に示されるように既知の組み換え技術を含む、本発明の核酸及びオリゴヌクレオチドを調製するためのいくつかの手段が自然と意図され、本発明は、このような合成的調製をその範囲内に含むことが意図される。本明細書中に開示されるようなＫＳＲのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列の知識は、このような組み換え技術によって本発明の核酸の調製を容易にし、従って、本発明は、組換えＤＮＡ技術による宿主系において発現するために開示されたＤＮＡ配列から調製された発現ベクター、及び得られた形質転換宿主にまで拡張される。
【００３４】
他の目的及び利点は、以下の例示的な図面を参照して進められる以下の記載の観点から、当業者に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（詳細な記載）
本発明によれば、当該技術分野の熟練の範囲内の従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術が使用されてもよい。このような技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４）］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」
Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照。
【００３６】
それ故に、本明細書中に記載される場合、以下の用語は、以下に記載される定義を有する。
【００３７】
用語「オリゴヌクレオチド」、「アンチセンス」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「ＫＳＲ ＯＤＮ」、「ＫＳＲアンチセンス」、及び特別に列挙されていない任意の改変体は、本明細書中で互換可能に使用されてもよく、１個又は複数の核酸を含む核酸物質を参照して本明細書及び特許請求の範囲全体で使用される場合、及び本明細書中に記載される核酸配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドまで拡張され、図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１４及び配列番号１１、１２及び２４にあらわされるようなものを含み、図１１、１５及び１６に示されるようなそれらの保存ドメイン及び活性ドメインを含み、特に、ＫＳＲの発現を阻害可能な、本明細書及び特許請求の範囲に記載される活性のプロフィールを有する。特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号２５に提供されるような、ＫＳＲに対して特異的な核酸配列、又は、例えば配列番号３、４、５、及び２７において提供されるようなそれらの一部分に対して実質的に相補的であってもよい。例示的なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号６〜８及び配列番号２８〜３９のいずれかが挙げられる。従って、実質的に等価又は改変された活性を示す核酸及びそれらの類似体も同様に考慮される。これらの改変は、例えば、部位指向性の突然変異生成を介して得られた改変を考慮してもよいか、又は、例えば、核酸又はＫＳＲの産生者である宿主における突然変異を介して得られるように、偶発的であってもよい。
【００３８】
ＮＨ_２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシル基を指す。標準的なポリペプチド命名法Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に合わせて、アミノ酸残基の省略形は、以下の対応表に示される：
【００３９】
【化１−１】

【００４０】
【化１−２】

全てのアミノ酸残基配列が、左から右への方向がアミノ酸末端からカルボキシ末端の従来の方向である式によって本明細書中にあらわされることが注記されるべきである。さらに、アミノ酸残基配列の最初及び最後のダッシュ記号が、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列に対するペプチド結合を示すことが注記されるべきである。上記の表は、本明細書中で代替的にあらわれてもよい３−文字及び１−文字表記法を相関させるためにあらわされる。
【００４１】
「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自立単位として機能する（すなわち、それ自身の制御下で複製可能な）任意の遺伝要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００４２】
「ベクター」は、レプリコン（例えば、プラスミド、ファージ、ウイルス、レトロウイルス又はコスミド）であり、これに対して、別のＤＮＡセグメントが、接続したセグメントの複製をもたらすように接続してもよい。
【００４３】
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態、又は二本鎖らせんのいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又はシトシン）のポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造及び二次構造のみを指し、任意の特定の三次構造に限定しない。このように、この用語は、特に、直鎖ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、及び染色体中に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の議論において、ＤＮＡの転写されていない鎖（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同性の配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向における配列のみを与える通常の関連に従って、配列が本明細書中で記載されてもよい。
【００４４】
「複製開始点」は、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。
【００４５】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な制御配列の制御下におかれる場合、インビボでポリペプチドに転写され、翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端で開始コドンによって、及び３’（カルボキシ）末端で翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、限定されないが、原核生物の配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含むことができる。ポリアデニル化シグナル及び転写末端配列は、通常は、コード配列の３’に位置する。
【００４６】
転写及び翻訳制御配列は、ＤＮＡ制御配列、例えば、宿主細胞においてコード配列を発現するために提供される、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等である。
【００４７】
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合可能であり、下流の（３’方向の）コード配列の転写を開始するＤＮＡ制御領域である。本発明を定義する目的のために、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端に限られ、バックグラウンドの上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な塩基又は要素の最少数を含むために上流（５’方向）に延びる。プロモーター配列が、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって従来は定義される）、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）であることがわかる。真核生物プロモーターは、しばしば、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。原核生物プロモーターは、−１０〜−３５コンセンサス配列に加えて、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含有する。
【００４８】
「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御し、調整するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがｍＲＮＡにコード配列を転写し、次いでコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、細胞における転写及び翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００４９】
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれることができる。この配列は、細胞表面にポリペプチドを向けるか、又はポリペプチドを媒体内に分泌する宿主細胞に対して通信するシグナルペプチド（ポリペプチドに対してＮ−末端）をコードし、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞によって取り除かれる。シグナル配列は、原核生物及び真核生物に対してネイティブな種々のタンパク質と関連することがわかり得る。
【００５０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明の核酸を参照して本明細書中で使用される場合、２つ以上のリボヌクレオチド、好ましくは３つより多いリボヌクレオチドで構成される分子として定義される。その実寸は、最終的な機能及びオリゴヌクレオチドの使用に順に依存する多くの要因に依存する。特に、本発明に従って、オリゴヌクレオチドは、特にＫＳＲをコードするＲＮＡと関連づけられるべきであり、ＲＮＡの発現（すなわち翻訳）がブロックされるか、又はＲＮＡの安定性が負の影響を受けるような、標的ＲＮＡと特異的及び安定に関連するような適切な配列及びサイズ又は長さを有するべきである。本発明の１つの特定の局面では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約８〜約５０ヌクレオチド長、特に１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、特に１５〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。
【００５１】
用語「プライマー」は、本明細書中で使用される場合、プライマー伸長産物（核酸鎖に対して相補的である）の合成が誘発される条件下に置かれる場合に（すなわち、ヌクレオチドの存在下で、例えばＤＮＡポリメラーゼのような誘発剤の存在下及び適切な温度及びｐＨで）合成の開始点として作用可能であり、精製された制限消化におけるように天然に生じるか又は合成的に生じる、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖又は二本鎖のいずれかであってもよく、誘発剤の存在下で所望の伸長産物の合成を進めるのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの因子（温度、プライマー供給源及び使用方法を含む）に依存する。例えば、診断適用のために、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５〜２５又はそれ以上のヌクレオチドを含有することができるが、それより少ないヌクレオチドを含有してもよい。
【００５２】
プライマーは、本明細書中で、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に対して「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、プライマーが、それらの対応する鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。それ故に、プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントが、プライマーの５’末端に結合していてもよく、プライマー配列の残りの配列が鎖と相補的であってもよい。あるいは、非相補的塩基又はより長い配列が、プライマー中に散在していてもよいが、但し、プライマー配列は、鎖とハイブリダイズして、伸長産物の合成のためのテンプレートを形成するのに十分な相補性を有する。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」は、それぞれが特定のヌクレオチド配列又はその付近で二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。
【００５４】
細胞は、外因性又は異種ＤＮＡが細胞内に導入される場合、このようなＤＮＡによって「形質転換」される。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを作る染色体ＤＮＡ内に組み込まれて（共有結合されて）も組み込まれていなくてもよい。原核生物、酵母及び哺乳類細胞では、例えば、形質転換ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素上に維持されていてもよい。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、染色体複製中に娘細胞に遺伝するように形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれたものである。この安定性は、真核細胞が形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集合で構成される細胞株又はクローンを確立する能力によって示される。「クローン」は、有糸分裂によって１個の細胞又は共通の祖先から誘導される細胞の集合である。「細胞株」は、多世代のためのインビトロで安定に増殖可能な一次細胞のクローンである。
【００５５】
２個のＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０又は９５％）がＤＮＡ配列の定義される長さにわたってマッチする場合に、「実質的に相同性」である。実質的に相同性である配列を、配列データバンクにおいて入手可能な標準的なソフトウェアを用いて、又は、たとえば、特定のシステムについて定義されるようなストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において配列を比較することによって同定することができる。定義する適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術分野の技術内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ＆ＩＩ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出を参照。
【００５６】
また、配列番号１１及び配列番号１２を含むが、これらの配列を縮重させる、本明細書中で開示されるＫＳＲ配列と同じアミノ酸配列を有するＫＳＲをコードするＤＮＡ又は核酸配列が本発明の範囲内であることが理解されるべきである。「〜に縮重する」は、異なる３−文字コドンが特定のアミノ酸を特定化するために使用されることを意味する。以下のコドンがそれぞれの特定のアミノ酸をコードするために互換可能に使用可能であることは当該技術分野で周知である：
【００５７】
【化２−１】

【００５８】
【化２−２】

上に特定されるコドンがＲＮＡ配列についてであることが理解されるべきである。ＤＮＡについての対応するコドンはＵがＴに置換される。
【００５９】
突然変異は、特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変更されるようにｋｓｒにおいてなされることができる。このような突然変異は、一般的に、最も少ないヌクレオチド変化を可能にすることによってなされる。この種の置換変異は、得られたタンパク質において非保存的な様式でアミノ酸を変更するために（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸にコドンを変更することによって）、又は保存的な様式でアミノ酸を変更するために（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から同じグループに属するアミノ酸にコドンを変更することによって）なすことができる。このような保存的変更は、一般的に、得られたタンパク質の構造及び機能における変化をあまり生じない。非保存的変更は、得られたタンパク質の構造、活性又は機能を変更すると考えられる。本発明は、得られたタンパク質の活性又は結合特徴を顕著に改変しない保存的変更を含有する配列を含むとみなされるべきである。
【００６０】
以下のものは、アミノ酸の種々のグループ分けの一例である：
非極性Ｒ基を有するアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
電荷を有さない極性Ｒ基を有するアミノ酸
グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
荷電した極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）
アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）
リシン、アルギニン、ヒスチジン
別のグループ分けは、フェニル基を有するアミノ酸であってもよい：
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
別のグループ分けは、分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）に従っていてもよい：
【００６１】
【化３−１】

【００６２】
【化３−２】

特に好ましい置換は以下のものである：
−正電荷が維持され得るように、ＬｙｓをＡｒｇに、及びＡｒｇをＬｙｓに；
−負電荷が維持され得るように、ＧｌｕをＡｓｐに、及びＡｓｐをＧｌｕに；
−遊離−ＯＨを維持可能なように、ＳｅｒとＴｈｒに；及び
−遊離ＮＨ_２を維持可能なように、ＧｌｎをＡｓｎに。
【００６３】
アミノ酸置換はさらに、特に好ましい性質を有するアミノ酸を置換するために導入されてもよい。例えば、Ｃｙｓは、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在的な部位に導入されてもよい。Ｈｉｓは、特に「触媒的」部位として導入されてもよい（すなわち、Ｈｉｓが酸又は塩基として作用可能であり、生化学触媒作用において最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質構造においてβ−回転を誘導する、その特定の平面構造のために導入されてもよい。
【００６４】
２つのアミノ酸配列は、少なくとも約７０％のアミノ酸残基（好ましくは、少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０又は９５％）が同一であるか、又は保存的置換をあらわす場合、「実質的に相同性で」ある。
【００６５】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然においてさらに大きな分子と関連して発見されない、さらに大きなＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントである。このように、異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、その遺伝子は、通常は、供給源の有機体のゲノムにおいて哺乳動物ゲノムＤＮＡをフランキングしないＤＮＡによってフランキングされる。異種コード配列の別の例は、コード配列自身が天然で見い出されない構築物（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、又はネイティブ遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子改変体又は天然に生じる変異事象は、本明細書中に定義されるようなＤＮＡの異種領域には生じない。
【００６６】
句「薬学的に受容可能な」は、ヒトに投与された場合に、生理学的に許容可能であり、典型的にはアレルギー又はそれに類似した有害反応（例えば胃不調、めまいなど）を生じない分子存在物及び組成物を指す。
【００６７】
句「治療的に有効量」は、その存在及び活性に関与し得るように、標的細胞塊の有糸分裂活性における臨床的に顕著な変化、又は病理学の他の特徴（例えば、腫瘍重量の減少、腫瘍細胞増殖の減少、変異能力の減少、又はアポトーシスの向上）を防ぐ、好ましくは少なくとも約３０％減らす、さらに好ましくは少なくとも５０％減らす、さらに好ましくは少なくとも７０％減らす、最も好ましくは少なくとも９０％減らすのに十分な量を意味するために本明細書中で使用される。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」又は「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｕｌ」又は「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」はリットルを意味する。
【００６９】
ＤＮＡ配列は、発現制御配列がＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御及び調整する場合、発現制御配列に「操作可能に結合」する。用語「操作可能に結合する」は、発現されるＤＮＡ配列の前側に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有し、発現制御配列の制御下でのＤＮＡ配列の発現及びＤＮＡ配列によってコードされる所望な産物の産生を可能にする正しいリーディングフレームを維持することを含む。組換えＤＮＡ分子への挿入が望まれる遺伝子が適切な開始シグナルを含有しない場合、このような開始シグナルは遺伝子の前側に挿入することができる。
【００７０】
用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の両方で５×ＳＳＣ及び６５℃に実質的に等価な塩及び温度の条件を指す。しかし、このような「標準的なハイブリダイゼーション条件」が、バッファー中のナトリウム及びマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列長及び濃度、ミスマッチの割合、ホルムアミドの割合などを含む特定の条件に依存することを当業者は理解する。また、「標準的なハイブリダイゼーション条件」の決定において重要なことは、２つの配列のハイブリダイゼーションがＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡのいずれであるかである。このような標準的なハイブリダイゼーション条件は、周知の式に従って当業者によって容易に決定され、ハイブリダイゼーションは、典型的には、所望の場合、さらに高いストリンジェンシーの洗浄を用いて、予想されるか又は決定されるＴ_ｍの１０〜２０℃下である。
【００７１】
本発明は、Ｒａｓのキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ）の発現及び／又は活性の特異的な阻害のための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、ＫＳＲの特異的な阻害のための遺伝的アプローチ及び核酸を提供する。ＫＳＲの特異的な阻害について、Ｒａｓ経路が破壊され、特に、Ｒａｓにより媒介される腫瘍、腫瘍形成及び転移の退縮が阻害されるか、又はブロックされることが本明細書中に示される。特に、ＫＳＲ ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及び核酸の発現が、ＫＳＲの発現を特異的に阻害し、ｇｆ Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成をブロックする。
【００７２】
本発明は、ＫＳＲ ＲＮＡの領域に対して実質的に相補的であり、上記オリゴヌクレオチドがＫＳＲの発現を阻害するオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、哺乳動物ＫＳＲをコードする核酸に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、ヒトＫＳＲをコードする核酸に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドが提供される。
【００７３】
本発明の１つの局面では、哺乳動物ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの翻訳開始部位、５’未翻訳領域、コード領域又は３’未翻訳領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドが提供される。１つのこのような局面では、このように、本発明は、図１４及び配列番号２４に提供されるような、ヒトＫＳＲをコードするｍＲＮＡの翻訳開始部位、５’未翻訳領域、コード領域又は３’未翻訳領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物ＫＳＲ ｍＲＮＡのＮ−末端コード領域に対して、特に、哺乳動物ＫＳＲ ｍＲＮＡのコード領域のヌクレオチド１〜７６１の領域に対して実質的に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。１つの実施形態では、本発明は、ＫＳＲのＣＡ１領域に対して実質的に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む（配列番号１及び配列番号２５）。本発明は、ヒトＫＳＲの配列のアミノ酸３３〜７２（配列番号２６）及びマウスＫＳＲの配列のアミノ酸４２〜８２（アミノ酸配列番号２）をコードするヌクレオチドに対して実質的に相補的な配列、又はそれらの一部分を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００７４】
さらなる実施形態では、本発明は、ヒトＫＳＲのコード配列のヌクレオチド９７〜２１６（配列番号２５）又はマウスＫＳＲのヌクレオチド１２４〜２４３（配列番号１）に対して実質的に相補的な配列、又はそれらの一部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明は、ヒトＫＳＲの配列のアミノ酸３３〜７２（配列番号２６）及びマウスＫＳＲの配列のアミノ酸４２〜８２（配列番号２）をコードするヌクレオチドに対して実質的に相補的な配列、又はそれらの一部分を含むオリゴヌクレオチドを提供する。特に、本発明のオリゴヌクレオチドとしては以下からなる群から選択されるヌクレオチドに対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる：マウスＫＳＲの配列のヌクレオチド１５１〜１６８に対応する、ヒトＫＳＲの配列のヌクレオチド１２４〜１４１（配列番号３）；マウスＫＳＲの配列のヌクレオチド１８１〜１８９（配列番号４）に密接に対応するヒトＫＳＲの配列のヌクレオチド１５４〜１７１（配列番号２７）（５’最末端ヌクレオチドで１個の塩基対と共に）；及びマウスＫＳＲの配列のヌクレオチド２１４〜２３１に対応する、ヒトＫＳＲの配列のヌクレオチド１８７〜２０４（配列番号５）。本発明は、配列番号６〜８及び配列番号２８〜３９の群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００７５】
特定の局面では、本発明の核酸及びオリゴヌクレオチドは、核酸の化学骨格の操作によって、又は他の部分の共有結合又は非共有結合によって、改変されていてもよい。各々又は任意の場合において、このような操作又は結合が、安定性、細胞、組織、又は臓器への取り込みを改変し、核酸の効力を高め、他の分子（限定されないが、取り込み、安定性を高め、又はオリゴヌクレオチドを標的化するのに役立ち得る、ポリペプチド、炭水化物、脂質又は脂質様部分、リガンド、化学薬剤又は化合物）に共有結合することに役立ち得る。
【００７６】
さらなる実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、それらの化学骨格中で改変される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。
【００７７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、混合によって、又は非共有結合又は共有結合によって、他の標的に対して指向するオリゴヌクレオチドと組み合わせてもよい。例えば、本発明のＫＳＲアンチセンスオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，３９１，６３６号（本明細書中で参考として組み込まれる）に記載されるようなｒａｆに対して指向するアンチセンス、又は他の腫瘍形成タンパク質又は増殖タンパク質に対して指向するアンチセンスと組み合わせてもよい。
【００７８】
哺乳動物ＫＳＲ ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスＲＮＡの転写をコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子又はそれらの一部分が本発明によって提供される。さらに、組換えＤＮＡ分子は、転写制御配列に操作可能に結合する核酸配列を含む。これらの組換えＤＮＡ分子を用いてトランスフェクトされた細胞株もまた本発明に含まれる。
【００７９】
さらなる局面では、ＫＳＲ ＲＮＡのコード配列に対して実質的に相補的な核酸又はそれらの一部分を発現可能であり、上記核酸がＫＳＲの発現を阻害する、発現ベクターが提供される。特定の局面では、この発現ベクターは、ＫＳＲ ＲＮＡのコード配列のＣＡ１領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチド、又はそれらの一部分を発現可能であり、上記オリゴヌクレオチドがＫＳＲの発現を阻害する、発現ベクターを含む。
【００８０】
さらなる実施形態では、本発明は、発現ベクターと、薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とを含み、上記発現ベクターが、ＫＳＲ ＲＮＡのコード配列に対して実質的に相補的な核酸、又はそれらの一部分を発現可能であり、上記核酸がＫＳＲの発現を阻害する、組成物を提供する。
【００８１】
ＫＳＲの発現を阻害する方法が提供される。１つの局面では、ＫＳＲを発現する細胞と、ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの一部分に対して相補的な有効量の核酸とを接触させる工程を含む、哺乳動物ＫＳＲの発現を阻害する方法が含まれる。特に、ＫＳＲを発現する細胞と、本発明の有効量のオリゴヌクレオチドとを接触させ、それにより哺乳動物ＫＳＲの発現が阻害される工程を含む、哺乳動物ＫＳＲの発現を阻害する方法が提供される。さらなる局面では、ＫＳＲを発現する細胞と、ＫＳＲ活性を調整する有効量の薬剤又は化合物とを接触させる工程を含む、ＫＳＲ活性を調整する方法が提供される。１つのこのような局面では、ＫＳＲを発現する細胞と、ＫＳＲの活性をブロックし、阻害し、又は減少させる有効量の薬剤又は化合物とを接触させる工程を含む、ＫＳＲ活性を調整する方法が提供される。
【００８２】
それに加えて、以下の工程：
（ａ）候補化合物又は薬剤の存在下及び非存在下で、ＫＳＲを発現する細胞をインキュベートする工程；及び
（ｂ）候補化合物又は薬剤の存在下及び非存在下で、ＫＳＲの発現を検出又は測定する工程を含み、上記候補化合物又は薬剤の非存在下でのＫＳＲの発現に対して、上記候補化合物又は薬剤の存在下でのＫＳＲの発現が減少することが、上記化合物又は薬剤がＫＳＲの発現を阻害することを示す、ＫＳＲの発現を阻害する化合物又は薬剤を同定する方法が提供される。
【００８３】
ＫＳＲの活性（好ましくはキナーゼ又はホスホリル化活性を含む）を阻害するための方法が提供される。１つの局面では、ＫＳＲを発現する細胞と、ＫＳＲを阻害し、又はブロックする有効量の化合物又は薬剤とを接触させる工程を含む、哺乳動物ＫＳＲの活性を阻害する方法が含まれる。特に、ＫＳＲを発現する細胞と、本発明の有効量の化合物、薬剤又は組成物とを接触させ、それにより哺乳動物ＫＳＲの活性が阻害される工程を含む、哺乳動物ＫＳＲの活性を阻害する方法が提供される。
【００８４】
それに加えて、以下の工程：
（ａ）候補化合物又は薬剤の存在下及び非存在下で、ＫＳＲを発現する細胞をインキュベートする工程；及び
（ｂ）候補化合物又は薬剤の存在下及び非存在下で、ＫＳＲの活性を検出又は測定する工程を含み、上記候補化合物又は薬剤の非存在下でのＫＳＲの活性に対して、上記候補化合物又は薬剤の存在下でのＫＳＲの活性が減少することが、上記化合物又は薬剤がＫＳＲの活性を阻害することを示す、ＫＳＲの活性（キナーゼ活性又はホスホリル化活性を含む）を阻害する化合物又は薬剤を同定する方法が提供される。本発明の１つの局面では、ＫＳＲの活性及び／又は発現は、ＫＳＲキナーゼ標的、又はキナーゼ標的配列ドメインを含むペプチドのホスホリル化状態を決定することによって、評価又はモニタリングされてもよい。例えば、Ｒａｆ又はＲａｆにより誘導されるペプチドのホスホリル化状態は、このような評価に利用されてもよい。ＫＳＲの活性又は発現はさらに、腫瘍細胞又は腫瘍動物モデルにおいてインビトロ又はインビボで評価されてもよく、本明細書中の実施例に記載されるようなものを含む、Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成、腫瘍増殖又は転移がモニタリングされる。
【００８５】
本発明は、本明細書中に示されるように既知の組み換え技術を含む、本発明の核酸及びオリゴヌクレオチドを調製するためのいくつかの手段が自然と意図され、本発明は、このような合成的調製をその範囲内に含むことが意図される。本明細書中に開示されるようなＫＳＲのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列の知識は、このような組み換え技術によって本発明の核酸の調製を容易にし、従って、本発明は、組換えＤＮＡ技術による宿主系において発現するために開示されたＤＮＡ配列から調製された発現ベクター、及び得られた形質転換宿主にまで拡張される。
【００８６】
本発明の別の特徴は、本明細書中に開示される核酸の発現である。当該技術分野で周知であるように、核酸又はＤＮＡ配列は、適切な発現ベクターにおいてそれらを発現制御配列に操作可能に結合し、適切な単細胞宿主を形質転換するために発現ベクターを使用することによって発現されてもよい。発現制御配列への本発明の核酸配列のこのような操作可能な結合は、もちろん、すでにＤＮＡ配列の一部分ではない場合には、ＤＮＡ配列の上流の正しいリーディングフレームにおける開始コドン、ＡＴＧの供給を含む。
【００８７】
本発明のＤＮＡ配列の発現において、多種多様の宿主／発現ベクターの組合せが使用されてもよい。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントからなってもよい。適切なベクターとしては、ＳＶ４０及び既知の細菌プラスミド（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体）、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡＳ、例えば、ファージλの多くの誘導体、例えば、ＮＭ９８９、及び他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３及び糸状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド（例えば、２μプラスミド又はそれらの誘導体）；真核細胞において有用なベクター、例えば、昆虫又は哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミド及びファージＤＮＡの組合せ（例えば、ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を使用するために改変されたプラスミド）から誘導されるベクターなどが挙げられる。それに加えて、ウイルスベクター及びレトロウイルスベクターとしては、限定されないが、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスが挙げられ、これらは、このような発現において有用であり得る。
【００８８】
多種多様な発現制御配列のいずれか−それに操作可能に結合するＤＮＡ配列の発現を制御する配列−は、本発明のＤＮＡ配列を発現するためにこれらのベクター中で使用されてもよい。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期又は後期プロモーター、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ又はアデノウイルス、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ＬＴＲシステム、ファージλの主要なオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセラートキナーゼのためのプロモーター、又は他の解糖酵素のためのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母交接因子のプロモーター、及び真核細胞又は原核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られた他の配列、及び種々のこれらの組合せが挙げられる。
【００８９】
多種多様な単核宿主細胞はさらに、本発明のＤＮＡ配列の発現において有用である。これらの宿主は、周知の真核生物及び原核生物の宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、真菌、例えば、酵母、及び動物細胞、例えば、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ細胞及びＬ−Ｍ細胞、Ａｆｒｉｃａｎ Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、及びＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えばＳｆ９）、及び腫瘍細胞、形質転換された細胞、組織培養物中のヒト細胞及び植物細胞）を含んでもよい。
【００９０】
全てのベクター、発現制御配列及び宿主が、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに十分に等しい機能を有するわけではないことが理解される。全ての宿主機能が同じ発現システムを伴って十分等しいわけでもない。しかし、当業者は、本発明の範囲から逸脱しない範囲で所望な発現を達成するために、過度な実験をすることなく、適切なベクター、発現制御配列、及び宿主を選択することができる。例えば、ベクターの選択において、宿主は、ベクターがその中で機能されなければならないために、考慮されなければならない。ベクターの複製数、複製数を制御する能力、及びベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗菌マーカー）の発現もまた考慮される。
【００９１】
発現制御配列の選択において、種々の因子が通常は考慮される。これらとしては、例えば、システムの相対強度、その制御性、及び、特に潜在的な二次構造に関して、発現される特定のＤＮＡ配列又は遺伝子との適合性が挙げられる。適切な単細胞宿主は、例えば、選択されたベクターとの適合性、その分泌特徴、タンパク質を正しく折りたたむ能力、及びそれらの発酵要求、及び発現されるＤＮＡ配列によってコードされる産物の宿主に対する毒性、及び発現産物の精製容易性を考慮することによって選択される。これら及び他の因子を考慮すると、当業者は、発酵又は大スケール動物培養物において本発明のＤＮＡ配列を発現する種々のベクター／発現制御配列／宿主の組合せを構築可能である。
【００９２】
本発明はさらに、ＫＳＲがノックアウトされるか又は無効化された（本明細書中でｋｓｒ^−／−動物におけるように）、又はＫＳＲが本明細書中でさらに記載されるように過剰発現された、トランスジェニック動物及び動物モデルを含む。このような動物モデルとしては、たとえば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、イヌ、サルなど、及び研究のための他の認識された脊椎系又は非脊椎系（カモ、魚、ｄｒｏｓｐｈｉｌａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどを含む）の哺乳動物が挙げられる。無効化されたＫＳＲの場合には、これらの動物は、ＫＳＲを含まないバックグラウンドにおける、腫瘍形成又は転移における他の因子を同定することを含む、腫瘍形成の研究又は腫瘍形成のブロックのために有用である。腫瘍形成、細胞増殖及び転移が高められるＫＳＲ過剰発現者の場合には、これらのシステムは、腫瘍モデルの迅速な研究のために、及び潜在的な抗癌化合物又は薬剤（ＫＳＲを標的化するもの及び他の経路を含む）を評価するために有用であり得る。
【００９３】
上述のように、本発明の核酸及びオリゴヌクレオチドは、クローン化よりも全身的に調製することができる。一般的に、配列が発現のために使用される場合、目的の宿主のための好ましいコドンが選択される。完全な配列は、標準的な方法によって調製されるオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせ、完全なコード配列内で組み立てることによって組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：６３１１（１９８４）を参照。
【００９４】
アンチセンス核酸は、特異的なｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に対して相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９９０；Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８を参照）。細胞において、それらはそのｍＲＮＡにハイブリダイズし、二本鎖分子を形成し、タンパク質内でのｍＲＮＡの発現と干渉する。アンチセンス方法は、インビトロで多くの遺伝子の発現を阻害するために使用される（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８；Ｈａｍｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。
【００９５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＫＳＲ ｍＲＮＡの領域に対して実質的に相補的であるように選択される。領域に対して相補的であってもよい本発明のオリゴヌクレオチドは以下に挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）ｍＲＮＡ分子の５‘−ｃａｐ部位（Ｏｊａｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：３１−３８）；（ｂ）転写開始部位（Ｍｏｎｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９９５４−１９９６２）；（ｃ）翻訳開始コドン（Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１７６２−１１７６６）；（ｄ）翻訳停止コドン（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３３１８−３３２２）；（ｅ）ｍＲＮＡスプライス部位（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：７７９０−７７９４；Ｃｏｌｉｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７−１１）；（ｆ）ｍＲＮＡ分子の５’−未翻訳領域（Ｄｕｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７１６１−７１６６；Ｙａｍａｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８７：２８７８−２８８４）；（ｇ）ｍＲＮＡ分子の３’−未翻訳領域（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３５３０−３５４０；Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６１４６−１６４２４）；及び（ｈ）コード領域（Ｌａｐｔｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：１１０３３−１１０３９；Ｙａｍａｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８７：２８７８−２８８４）。
【００９６】
当業者は、ＫＳＲ発現の阻害において有効な、核酸及びオリゴヌクレオチドのための選択プロセスを容易にし、単純化するためのいくつかのストラテジーを容易に利用することができる。オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ分子中の相補配列との間の結合エネルギーの予測又は熱力学指数の計算を利用してもよい（Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８１６２−１８１７１；Ｓｔｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３５０１−３５０８）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは二次構造に基づいて選ばれてもよい（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ（１９９１）ｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ＡＩＤＳ，Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．７−２４；Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１２０５５−１２０６１）。Ｓｃｈｍｉｄｔ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ（米国特許第６，４１６，９５１号）は、ＲＮＡとオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズする工程と、インターカレーション染料の存在下でハイブリダイズすることによってハイブリダイゼーションの動力学をリアルタイムで測定する工程、又は標識を組み込む工程と、標識されていないオリゴヌクレオチドの存在下で染料又は標識のシグナルの分光学的性質を測定する工程とを含む、機能性アンチセンス薬剤を同定する方法を記載する。それに加えて、当業者によって認識される種々の判断基準（例えば、自己相補性の非存在、ヘアピンループの非存在、安定なホモダイマー及び二本鎖形成（安定性が予測されたエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）によって評価される）の非存在を含む）を利用する適切なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチセンス標的を予測する種々のコンピュータープログラムのいずれかを利用してもよい。このようなコンピュータープログラムの例は、用意に入手可能であり、当業者に既知であり、ＯＬＩＧＯ４又はＯＬＩＧＯ６プログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）及びＯｌｉｇｏ Ｔｅｃｈプログラム（Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）が挙げられる。
【００９７】
それに加えて、本発明において適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドライブラリー、又は核酸分子のライブラリーをスクリーニングし、標的ＲＮＡ又は核酸にハイブリダイズすることについて選択することによって同定されてもよい（例えば、米国特許第６，５００，６１５号参照）。Ｍｉｓｈｒａ及びＴｏｕｌｍｅはさらに、標的に結合するオリゴヌクレオチドの選択的な増幅に基づく選択手順を開発した（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３１７：９７７−９８２）。オリゴヌクレオチドはさらに、ＲＮＡｓｅ Ｈによって標的ＲＮＡの開裂を媒介する能力によって、開裂フラグメントの選択及び特徴決定によって選択されてもよい（Ｈｏ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：１９０１−１９０７；Ｈｏ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５９−６３０）。ＲＮＡ分子のＧＧＧＡモチーフに対するオリゴヌクレオチドの生成及び標的化もさらに記載されている（米国特許第６，２７７，９８１号）。
【００９８】
ｋｓｒ遺伝子発現の阻害は、例えば、当業者に周知のようなｍＲＮＡ発現のノーザンブロットアッセイ又はタンパク質発現のウェスタンブロットアッセイによって、当該技術分野で日常的な様式で測定することができる。細胞増殖又は腫瘍細胞増殖に対する効果もまた、本出願の実施例に教示されるものを含む当業者に周知の方法によって、インビトロ又はインビボで細胞、腫瘍又は動物モデルシステムにおいて測定することができる。同様に、ＫＳＲ活性の阻害、特にホスホリル化又はキナーゼ活性の阻害が測定されてもよい。
【００９９】
「実質的に相補的な」は、安定で特異的な結合がＤＮＡ又はＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチド又は核酸との間に生じるような十分な程度の相補性を示すために使用される。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能な標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解される。オリゴヌクレオチドは、標的に対するオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常な機能と干渉して有用性又は発現の損失を生じる場合に、特異的にハイブリダイズ可能であり、インビボアッセイ又は治療的処置の場合に、又はインビトロアッセイの場合に、アッセイが行われる条件下で、生理学的条件下で非標的配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるのに十分な相補性度が存在する。
【０１００】
本発明の内容において、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に生じる塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのオリゴマー又はポリマーを指す。オリゴヌクレオチドとしては、同様に機能する非天然に生じるモノマー、又はそれらの一部分を含むオリゴマーが挙げられ、このような改変又は置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みが高められ、ヌクレアーゼに対する安定性が高められているため、ネイティブ形態よりも好ましい場合がある。本発明のオリゴヌクレオチドは、２つ以上の化学的に別個の領域を含有してもよく、それぞれは少なくとも１つのヌクレオチドから作られ、例えば、１つ以上の有利な性質（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞への取り込みの増加、ＲＮＡ標的に対する結合アフィニティーの増加）を与える改変されたヌクレオチドの少なくとも１つの領域、及びＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂可能な酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ−ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼ）のための基質である領域から作られる。
【０１０１】
好ましい実施形態では、ＫＳＲ ｍＲＮＡ結合アフィニティーを増加させるために改変されるオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’位で、最も好ましくは２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル又は２’−フルオロ改変されたヌクレオチドで改変される少なくとも１つのヌクレオチドを含む。このような改変は、日常的にオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりもより高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合アフィニティー）を有することが示されている。別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を高めるために改変される。細胞は、核酸を分解可能な種々のエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼを含有する。多くのヌクレオチド及びヌクレオシド改変は、ヌクレアーゼ消化に対して比較的大きな耐性を与えることが示されている。少なくとも１つのホスホロチオエート改変を含有するオリゴヌクレオチドは、現時点で最も好ましい（Ｇｅａｒｙ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ １２：３８３−９３；Ｈｅｎｒｙ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ １２：３９５−４０８；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｄ．（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ２：５７４−８０）。いくつかの場合では、標的結合アフィニティーを高めるオリゴヌクレオチド改変はさらに、独立して、ヌクレアーゼ耐性を高めることができる。
【０１０２】
本発明のために想像されるいくつかの好ましいオリゴヌクレオチドの具体例としては、改変された骨格を含有するもの、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環の糖間結合を含有するものが挙げられる。最も好ましいのは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチドである。Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８：３６６−３７４に開示されるアミド骨格も好ましい。また、モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，米国特許第５，０３４，５０６号）。他の好ましい実施形態では、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格と交換され、核酸塩基が直接又は間接的にポリアミド骨格のアザ窒素原子に結合する（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７）。オリゴヌクレオチドはさらに、１つ以上の置換糖部分を含有してもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のものの１つを含む：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ_３、Ｆ、ＯＣＮ、ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ開裂基；リポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬動力学の性質を改良するための基；又はオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改良するための基及び類似した性質を有する他の置換基。同様の改変はさらに、オリゴヌクレオチドの他の位置でなされてもよく、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置、及び５’末端ヌクレオチドの５’位置でなされてもよい。
【０１０３】
オリゴヌクレオチドはさらに、さらなる又は代替の塩基改変又は置換を含んでもよい。本明細書中で使用される場合、「改変されていない」又は「天然」の核酸塩基としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。改変された核酸塩基としては、天然の核酸中にまれに又は一次的にのみ見出される核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−メチルピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びジェントビオシル（ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｙｌ）ＨＭＣ、及び合成核酸塩基（限定されないが、２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン）（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，ｐｐ７５−７７；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３）が挙げられる。当該技術分野で既知の「普遍的な」塩基、例えばイノシンが含まれてもよい。
【０１０４】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の改変は、オリゴヌクレオチドの活性又は細胞取り込みを高めるオリゴヌクレオチドの１つ以上の部分又は接合体に対する化学結合を含む。このような部分としては、限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７５：４９）、リン脂質、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １４：９６９）が挙げられる。親油性部分を含むオリゴヌクレオチド、及びこのようなオリゴヌクレオチドを調製するための方法は当該技術分野で、例えば、米国特許第５，１３８，０４５号、同第５，２１８，１０５号及び同第５，４５９，２５５号で既知である。
【０１０５】
Ｆａｒｒｅｌ ａｎｄ Ｋｌｏｓｔｅｒ（米国特許第６，３１０，０４７号）は、高アフィニティーＤＮＡ結合多核白金化合物を用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達及びインビボヌクレアーゼ耐性の向上を記載する。
【０１０６】
所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に改変されることは必要ではなく、上述の改変のうち１つより多くが１個のオリゴヌクレオチドに組み込まれるか、又はオリゴヌクレオチド内の１個のヌクレオシドに組み込まれてもよい。
【０１０７】
本発明に従うオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約８〜約５０ヌクレオチド長である。特に好ましいオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長、特に好ましいのは１５〜２５ヌクレオチド長である。本発明の内容では、本明細書中で先に記載されたような、８〜５０モノマーを有する非天然に生じるオリゴマーを包含することが理解される。
【０１０８】
本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術を介して簡便に日常的に製造されてもよい。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含む種々のベンダーによって販売されている。このよな合成のための任意の他の手段をさらに使用してもよく；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の能力の範囲内である。他のオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体を調製するための同様の技術を使用することも十分に知られている。
【０１０９】
本発明の方法及び組成物、特にオリゴヌクレオチドによって高められる治療的な可能性は、遺伝子ノックアウトによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する発現の阻害によって、及び逆相補ＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡ構築物の発現によるＫＳＲの失活が、Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成及び細胞過剰増殖（ｇｆ−Ｒａｓを介するものを含む）の特異的な妨害、及び癌の進行の処置又は阻害を生じるという本明細書中の実施例における説明から誘導される。本発明は、過剰発現されるか、又は増幅され、過剰活性化されるか又は腫瘍形成Ｒａｓ（ｇｆ−Ｒａｓを含む）が、Ｒａｓにより媒介される腫瘍、腫瘍形成、転移及び血管形成の進行を縮退、ブロック、処置又は阻害することが意図される、反応のカスケードにおける薬学的介入を考慮する。このように、Ｒａｓ（ｇｆ−Ｒａｓを含む）を減少又は阻害することが望ましい場合には、本発明の核酸及びオリゴヌクレオチドは、Ｒａｓ経路をブロック又は阻害するために導入される。
【０１１０】
本発明はさらに、哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現又は活性を阻害する治療的に有効量の化合物又は薬剤を上記哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物におけるｇｆ−Ｒａｓの発現に関連する過剰増殖状態、又はＲａｓの高められた発現又は過剰活性化又はＲａｓ経路を処置又は予防する方法を含む。本方法の１つの局面では、上記化合物又は薬剤は、ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの一部分に対して相補的な治療的に有効量の核酸を上記哺乳動物において発現させるか、又は上記哺乳動物に投与する工程を含む、ｇｆ−Ｒａｓの発現に関連する過剰増殖状態、又は哺乳動物におけるＲａｓの高められた発現又は過剰活性化を処置又は予防する方法が提供される。
【０１１１】
本発明はさらに、治療的に有効量のＫＳＲ発現及び／又は活性の１つ以上のインヒビターを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において過剰増殖性の癌細胞又は腫瘍細胞におけるイオン化放射線又は他の放射線又は化学治療に対して感受性を与える方法を提供する。本発明は、治療的に有効量の本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドを哺乳動物に対して投与する工程を含む、哺乳動物において過剰増殖性の癌細胞又は腫瘍細胞におけるイオン化放射線又は他の放射線又は化学治療に対して感受性を与える方法を提供する。
【０１１２】
本発明はさらに、ＫＳＲの発現及び／又は活性の活性化又は阻害の際に、特にＶＥＧＦ発現を調整することによって、血管形成を調整する方法を提供する。ＶＥＧＦ発現は、ＫＳＲの発現及び／又は活性の特定の阻害又は活性化によって調整される。ＫＳＲの活性化又は発現を高めることにより、細胞中又は細胞によるＶＥＧＦの量又は発現が増加する。このように、細胞又は組織におけるＫＳＲの活性化又は発現を高めることは、血管形成を刺激する方法を提供する。ＫＳＲの阻害、妨害又は減少は、ＶＥＧＦの量又は発現を減少させ、それによって抗血管形成効果を有する。１つのこのような局面では、癌細胞又は腫瘍細胞のＶＥＧＦ発現は、ＫＳＲに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与又は発現によるものを含むＫＳＲの阻害によってブロックされ、癌又は腫瘍における血管形成を阻害する。ＫＳＲに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与又は発現によるものを含むＫＳＲの阻害は、腫瘍、ＫＳＲを発現する組織又は細胞、特に、ｇｆ Ｒａｓを発現する組織又は細胞において血管形成を阻害する方法を提供し、又はここで、Ｒａｓ経路が過剰に活性化されるか、又はＲａｓが過剰発現されるか又は増幅される。
【０１１３】
さらなる局面では、哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現又は活性を阻害する治療的に有効量の化合物又は薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において癌の進行を処置又は予防する方法が含まれる。本発明の方法に対して感受性の癌としては、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝癌、甲状腺癌、大腸癌、腸癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、頭頚部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道癌及び前立腺癌の群から選択される癌が挙げられる。１つの局面では、哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現又は活性を阻害する治療的に有効量の化合物又は薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において膵臓癌の進行を処置又は阻害する方法が提供される。
【０１１４】
このように、治療的に有効量の本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドを哺乳動物に対して投与する工程を含む、哺乳動物において癌の進行を処置又は阻害する方法が提供される。治療的に有効量の本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドを哺乳動物に対して投与する工程を含む、哺乳動物において膵臓癌の進行を処置又は阻害する方法が提供される。
【０１１５】
本発明はさらに、本発明の治療方法の実施において有用な治療組成物を考察する。目的の治療組成物は、薬学的に受容可能なキャリア（賦形剤）又は希釈剤と、活性成分として、本明細書中に記載されるような本発明の１つ以上の核酸又はオリゴヌクレオチドとを混合物で含む。好ましい実施形態では、この組成物は、ＫＳＲの発現を阻害可能なオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１６】
核酸及びオリゴヌクレオチドの組成物は、本発明のさらなる局面である。本発明は、ＫＳＲ ＲＮＡの領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチドと薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とを含む組成物を含む。このように、本発明は、ＫＳＲ ＲＮＡの領域に対して実質的に相補的な治療的に有効量のオリゴヌクレオチドと薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【０１１７】
さらなる局面では、１つ以上の化学治療剤又は放射能治療剤と、哺乳動物ＫＳＲをコードするｍＲＮＡに対して標的化されるオリゴヌクレオチドとを含み、ＫＳＲ発現を阻害する組成物が提供される。
【０１１８】
活性成分として核酸、オリゴヌクレオチド、又は類似体を含有する治療組成物の調製は、当該技術分野で十分に理解される。このような組成物は、注射可能なものとして、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製可能である。注射の前に液体にする、溶液又は懸濁液のために適切な固体形態をさらに調製することができる。この組成物は、持放性処方物を含む固体丸薬形態で調製されてもよい。この組成物は、経皮適用のためのパッチ形態、特に持放性処方のパッチ形態であってもよい。この調製物はさらに乳化させることもできる。活性治療成分は、しばしば、活性成分と薬学的に受容可能で適合性の賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せである。それに加えて、所望の場合、この組成物は、少量の活性成分の有効性を高める補助基質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤を含有することができる。
【０１１９】
核酸又はオリゴヌクレオチドは、中和された薬学的に受容可能な塩形態として治療組成物に処方化することができる。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ポリペプチド又は抗体分子の遊離アミノ基と形成された）、及び無機酸、例えば塩酸、又はリン酸、又は有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などと形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基から形成される塩はさらに、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄、及び有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２-−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導することができる。
【０１２０】
治療核酸、オリゴヌクレオチド、類似体又は活性フラグメントを含有する組成物は、例えば、単位用量を注射することによるように、静脈内投与されてもよい。用語「単位用量」は、本発明の治療組成物を参照して使用される場合、ヒトのために一体的な投薬量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の希釈剤（すなわち、キャリア又はビヒクル）と関連して所望の治療効果を得るように計算された所定の量の活性物質を含有する。
【０１２１】
治療組成物はさらに、有効量の核酸又はオリゴヌクレオチドと、１つ以上の以下の活性成分又は薬剤を含んでもよい：化学治療剤、放射線治療剤、免疫調整剤、及び抗分裂剤。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物は、局所的又は全身的な処置のどちらが望ましいかに依存して、及び処置される領域に依存した多くの様式で投与されてもよい。投与は、局所的（眼内、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮）、経口、又は非経口であってもよい。非経口投与は、点滴静注又は注入、皮下、腹腔内、又は筋肉内注射、例えば、吸入又は注入を含む肺投与、又はクモ膜下又は心室内投与を含む。経口投与のために、吸収特性及び分布特性のために、少なくとも１つの２’−置換リボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが特に有用であることがわかった。米国特許番号第５，５９１，７２１号（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．）は、経口投与のために適切であり得る。局所投与のための処方物は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体及び粉末を含んでもよい。従来の薬学的キャリア、水性ベース、粉末ベース又は油性ベース、増粘剤などは、必要であるか、望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、手袋などもまた有用であり得る。経口投与のための組成物としては、粉末又は顆粒、水又は非水媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル、サッシェ又は錠剤があげられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又はバインダーも望ましい。非経口、髄腔内又は心室内投与のための組成物は、バッファー、希釈剤及び他の適切な添加剤を含有してもよい滅菌水溶液を含んでもよい。このような薬学的キャリアに加えて、カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド取り込みを容易にするために処方物に含まれてもよい。取り込みを容易にするために示される１つのこのような組成物は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＢＲＬ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）である。
【０１２３】
投薬は、数日から数カ月まで持続する一連の処置と共に、又は治癒が効果をあらわすか又は疾患状態の減少が成し遂げられるまで、処置される状態の重篤度及び応答性に依存している。最適な投薬スケジュールは、体内の投薬の蓄積の測定値から計算することができる。当業者は、最適な投薬量、投薬方法論及び繰り返し率を容易に決定することができる。最適な投薬は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に依存して変動し得、一般的に、インビトロ及びインビボの動物実験におけるＩＣ５０又はＥＣ５０に依存して計算することができる。例えば、化合物の分子量（オリゴヌクレオチド配列及び化学構造から誘導される）、及び例えば有効な投薬量（例えばＩＣ５０）（実験的に誘導される）が与えられ、投薬量（ｍｇ／ｋｇ）が日常的に計算される。
【０１２４】
本発明のオリゴヌクレオチドはさらに、ＫＳＲ発現の検出及び診断のために有用である。例えば、放射能標識されたオリゴヌクレオチドは、ＫＳＲ発現の疑いのある組織又は細胞サンプル又はｇｆ−Ｒａｓ発現の疑いのある組織又は細胞サンプルと接触させ、未結合のオリゴヌクレオチドが除去される、５’末端又は３’末端に放射能活性な（例えば、^３２Ｐ）標識をする（ポリヌクレオチドキナーゼを用いることを含む）ことによって調製することができる。放射能活性をサンプル中に維持していることは、結合したオリゴヌクレオチドを示し（順にＫＳＲ又はｇｆ−Ｒａｓの存在を示す）、シンチレーションカウンター又は他の日常的な手段を用いて定量化することができる。放射能標識されたオリゴヌクレオチドはさらに、研究、診断又は治療目的のために、ＫＳＲ又はｇｆ−Ｒａｓ発現の局在化、分布及び定量を決定するための組織のオートラジオグラフィーを行なうために使用することができる。それに加えて、放射能標識は、細胞死を促進し、又は細胞増殖をブロックする治療効果を有する場合がある。ｒａｆ発現の蛍光検出のための類似のアッセイは、放射能標識の代わりに、蛍光又は他の蛍光タグと接合した本発明のオリゴヌクレオチドを用いて開発することができる。
【０１２５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を用いて標識されてもよい。特定の局面では、標識は、酵素、蛍光を発する化学物質及び放射性元素から選択されてもよい。放射能活性な標識、例えば、同位体^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^５１Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^９０Ｙ、^Ｉ２５Ｉ、^１３１Ｉ及び^１８６Ｒｅが使用される場合、既知の従来から利用可能な計測手段を使用してもよい。標識が酵素である場合、検出は、現在利用され、当該技術分野で既知の比色技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流測定技術又は気体定量技術のいずれかによって達成されてもよい。多くの蛍光材料が知られており、標識として使用可能である。これらとしては、例えば、フルオレスセイン、ローダミン、オウラミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＡＭＣＡブルー及びＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗが挙げられる。特定の検出材料は、ヤギから調製され、イソチオシアネートを介してフルオレセインで接合された抗−ウサギ抗体である。酵素標識も有用であり、現時点で利用される比色技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流測定技術又は気体定量技術のいずれかによって検出することができる。酵素は、架橋分子（例えば、カルボジイミド、ジイソシアナート、グルタルアルデヒドなど）を用いた反応により、選択された粒子に接合される。これらの手順において使用可能な多くの酵素が知られており、限定されないが、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが上げられる。米国特許第３，６５４，０９０号；同第３，８５０，７５２号；及び同第４，０１６，０４３号は、代替の標識物質及び方法の開示のための一例として挙げられる。
【０１２６】
本発明は、ＫＳＲ ｍＲＮＡの翻訳をブロックすることによって、又はＲＮＡの破壊又は不安定化を促進することによって翻訳が有効に起こりえないような転写レベルで、タンパク質、特にＫＳＲの発現を阻害可能なさらなる組成物を含む。この局面では、本発明は、ＫＳＲ ｍＲＮＡを開裂するリボザイムを提供する。
【０１２７】
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼにいくらか類似の様式で他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に開裂する能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、特定のｍＲＮＡがそれら自身のイントロンを切断する能力を有するという観察から発見された。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列を改変することによって、研究者は、ＲＮＡ分子中で特定のヌクレオチド配列を認識し、それを開裂する分子を設計することができた（Ｃｅｃｈ，１９８８）。これらは配列特異的であるため、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが失活する。
【０１２８】
観察者は、２種類のリボザイムＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ型及び「ハンマーヘッド」型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８）を同定した。Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ型リボザイムは、４個の塩基配列を認識し、一方、「ハンマーヘッド」型は１１〜１８個の塩基配列を認識する。認識配列が長ければ長いほど、標的ｍＲＮＡ種において排他的に認識が起こると考えられる。それ故に、ハンマーヘッド型リボザイムは、特異的なｍＲＮＡ種を失活するのにＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ型リボザイムよりも好ましく、１８塩基認識配列が、より短い認識配列よりも好ましい。
【０１２９】
ＫＳＲの発現を阻害するためのＲＮＡ干渉ストラテジーの使用は、さらに本発明に包含される。このように、ＲＮＡ干渉の方法及び小さな干渉ＲＮＡ組成物は、本発明の方法及び組成物に含まれる。ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）による特異的な遺伝子のサイレンシングを指す（Ｆｉｎｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１；８０６−８１１）。１つの実施形態では、短い又は小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が利用される（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８）。それに加えて、長い二本鎖ＲＮＡヘアピンが使用されてもよい（Ｔａｖｅｒｎａｒａｋｉｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ２４：１８０−１８３；Ｃｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｆ．及びＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，Ｅ．Ｍ．（２０００）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：４９８５−９０；Ｓｍｉｔｈ，ＮＡ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０７：３１９−２０）。Ｋ−Ｒａｓに対するウイルスにより媒介されるＲＮＡ干渉が記載されている（Ｂ ｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２：２４３−２４７）。
【０１３０】
本発明は、以下の本発明の例として提供される非限定的な実施例を参照してよりよく理解されてもよい。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をさらに完全に説明するために示されるが、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１３１】
これらの研究は、哺乳動物ＫＳＲがＥＧＦＲ／Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナル形成モジュールを介するシグナル形成を集積することを示す。ＥＧＦＲ、Ｒａｓ及びＫＳＲは、哺乳動物細胞における同じシグナル形成経路であり、ＭＥＦにおけるＥＧＦにより誘発されるＭＡＰＫシグナル形成を弱めることによって、及び複数の実験モデルにおけるＥＧＦＲ−／Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成の妨害によって、ＫＳＲノックアウトマウスにおいて明らかにされ、ＫＳＲノックアウトで繰り返される。さらに、遺伝的及び薬理学的アプローチは、インビトロ及びインビボで腫瘍形成の種々の局面のために要求されるようにＫＳＲを同定した。インビトロで、ＫＳＲ機能がなくなることは、ＭＥＦ、Ａ４３１及びＭＣＦ−７細胞の増殖を減らし、Ｒａｓにより媒介されるＭＥＦ形質転換を妨害し、Ａ４３１及びＭＣＦ−７細胞浸潤を減らした。インビボで、ＫＳＲの失活は、新生物の成長のために野生型Ｒａｓを必要とする、ν−Ｈａ−Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成及び確立されたＥＧＦＲにより誘導される腫瘍の増殖を阻止した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ^２，３におけるように、ＫＳＲは、ほとんどの場合、通常の成長のために重要ではなく見えるが、ＥＧＦ刺激において急性に、又はＲａｓにより媒介される腫瘍において慢性的に、ＥＧＦＲ／Ｒａｓ経路を介するシグナル形成の増加が必要な場合に、必要とされる。このことは、薬理学的な失活が治療的な利益をもたらすかもしれないことを示唆する。実際に、本明細書中に示される結果は、Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成のインビボモデルを含み、ｋｓｒの失活に対する細胞増殖及び細胞浸潤の顕著な阻害を示す。これらの研究は、癌及び腫瘍形成（特にＫ−Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成）における治療アプローチとしてのｋｓｒアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＫＳＲ−ＡＳ ＯＤＮ）の使用を示す。
【０１３２】
（実施例１）
（要約）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ及びＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおいて、Ｒａｓのキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ）は、Ｒａｆ^１〜３に対して上流又は平行のいずれかに対してＲａｓ／分裂促進因子により活性化されたタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル形成をポジティブに調整する。しかし、哺乳動物ＫＳＲの正確なシグナル形成機構、及びＲａｓにより媒介される形質転換におけるその役割は、いまだ明らかでない。組換えＫＳＲを顕著に過剰発現する細胞を利用することによって、いくつかの群が、ＫＳＲがＭＡＰＫ活性化及びＲａｓにより誘発される形質転換を阻害することが報告される^４〜６一方、他のグループがその効果を高めることが報告された^７〜１０。証拠は、これらの矛盾が遺伝子投与量の効果を反映することを示唆する^１１。インビボでのＫＳＲ機能における洞察を得るために、本願発明者らは、ＫＳＲを有さないマウス同種接合を作成した。ｋｓｒ^−／−マウスは生存可能であり、大きな発達上の瑕疵は存在しない。しかし、生まれたばかりのマウスは、ＥＧＦＲが欠損しているマウスにおいて以前に観察された固有な毛嚢表現型を示し、このことは、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ及びＫＳＲが哺乳動物において同じシグナル形成経路上にあることを示すための遺伝的支持を与える。ｋｓｒ^−／−動物由来の胚繊維芽細胞は、ＭＡＰＫ経路のＥＧＦ活性化を欠いており、増殖能力が減少しており、Ｒａｓ依存性形質転換力も損なわれていた。皮膚特異的なν−Ｈａ−ｒａｓ発現から生じるＴｇ．Ａｃマウスにおける腫瘍形成が、ｋｓｒ^−／−バックグラウンドにおいて失われていた。このように、本明細書中に示される証拠は、ＫＳＲが、抗−ＫＳＲ治療ストラテジーによって潜在的に標的化され得るＥＧＦＲ−／Ｒａｓ−により媒介される新形成を変換することを示唆する。
【０１３３】
（導入）
Ｒａｓのキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ）を、Ｒａｆに対して上流又は平行のいずれかでシグナル形成するＲａｓ／分裂促進因子により活性化されたタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル形成のポジティブモジュレーターとしてＤｒｏｓｏｐｈｉｕｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ及びＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおいて同定した（１〜３）。哺乳類のＫＳＲの生化学的性状を解明することに集中的な努力が向けられたが、その正確なシグナル形成機構はいまだ明らかでない。特に、Ｒａｓにより媒介される形質転換におけるその役割は、納得がいくように対処されなかった。いくつかの群が、ＫＳＲがＭＡＰＫ活性化及びＲａｓにより誘発される形質転換を阻害することが報告される（４〜６）一方、他のグループがその効果を高めることが報告された（８〜１０）。これらの実験は、内因性ＫＳＲよりもかなり高いレベルで組換えＫＳＲを過剰発現する細胞系を利用し、この証拠は、これらの矛盾が遺伝子投与量の効果を反映することを示唆する（１１）。本願発明者ら及び他の研究者は、Ｒａｆ−ＭＡＰＫカスケードの最適な活性化のための、キナーゼ及びＫＳＲの足場となる機能の両方の必要性を議論し（２６〜３０）、他の研究者は、ＫＳＲがその足場となる機能を介して単にシグナル形成すると考えている（９、１２、３１）。
【０１３４】
ＫＳＲのインビボ機能における洞察を得るために、本願発明者らは、ＫＳＲを有さないマウス同種接合を作成した。ｋｓｒ^−／−マウスは生存可能であり、大きな発達上の瑕疵は存在しない。しかし、生まれたばかりのマウスは、ＥＧＦＲが欠損しているマウスにおいて以前に観察された固有な毛嚢表現型を示す。ｋｓｒ^−／−動物由来のマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）は、増殖能力が減少しており、腫瘍形成ν−Ｈａ−Ｒａｓ依存性形質転換力も損なわれていた。さらに、ＥＧＦ及びＴＰＡは、ＭＥＦと同様の程度までＭＡＰＫカスケードを活性化するが、ＥＧＦの分裂促進用量によるｃ−Ｒａｆ−１活性化のみがｋｓｒに依存する。ＫＳＲノックアウトマウスは、このように、ｃ−Ｒａｆ−１活性化のＫＳＲ依存性及び非依存性機構の描写を可能にする。さらに、皮膚特異的なν−Ｈａ−ｒａｓ発現から生じ、形質転換にＭＡＰＫシグナル形成を使用する（３２）Ｔｇ．Ａｃマウスにおける腫瘍形成が、ｋｓｒ^−／−バックグラウンドにおいて失われていた。増殖、形質転換及び腫瘍形成におけるこれらの欠損は、ＫＳＲがＲａｓにより媒介される新形成のいくつかの形態を変換することを示唆する。
【０１３５】
（結果及び考察）
哺乳動物におけるＫＳＲのインビボ機能を観察するために、本願発明者らは、ＫＳＲ発現において欠損したマウスを得るために、マウスｋｓｒ遺伝子座を標的化した。ｋｓｒ^−／−マウスを、図１ａに示されるｐＦ９標的化ベクターを用いて、胚幹（ＥＳ）細胞における相同組換えによって作成した。標的化領域は、開始メチオニン（ｋｓｒ ｃＤＮＡにおけるｎｔ８３でのＡＴＧコドン）を含んでおり、その後の７４アミノ酸がＫＳＲ固有ＣＡ１ドメインの８５％を含んでいる。２つの標的化ＥＳクローン（図１ｂ）は、Ｃ５７ＢＬ／６尾胞に微量注入され、両方とも、生殖系列を介して変異ｋｓｒ対立遺伝子を移されたキメラマウスを生じた。ｋｓｒ^＋／−マウスの交差は、予想されるメンデル頻度の遺伝子型を有する子孫を生じた。ＰＣＲに基づくスクリーニングストラテジーを開発して、マウスゲノムＤＮＡ由来の野生型（ｗｔ）及び変異型対立遺伝子の両方を検出した（図１ｃ）。
【０１３６】
以前に報告されている（１２）ように、ノーザンブロット分析は、６．４ｋｂ及び７．４ｋｂのｗｔＫＳＲ転写物を明らかにした。より小さな転写物は、胎児７日目までに検出され、一方、さらに大きな転写物は、１１日目から観察された（図１ｄ）。成体において、多くの組織（心臓、脾臓、肺、胸腺及び脳を含む）がｋｓｒ転写物を発現した（図１ｅ）。腎臓は、ｋｓｒ ｍＲＮＡをほとんど示さなかったが、さらに大きな転写物が脳に対して制限された。このさらに大きなｍＲＮＡの存在は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及び共同研究者によって報告され、マウスＫＳＲ１（Ｂ−ＫＳＲ１と称される）のスプライス改変体を示している（１２）。重要なことに、ｋｓｒ^−／−マウスは、試験されるいずれの組織においてもｋｓｒ ｍＲＮＡを検出可能なレベルで発現しなかった（図１ｅ）。ＫＳＲ１及びＢ−ＫＳＲ１タンパク質はさらに、ｋｓｒ^−／−マウス由来の組織又はマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）におけるウェスタンブロット分析によって検出されなかった（図１ｆ）。ＫＳＲの欠失はさらに、ｋｓｒ ｃＤＮＡの３’−ＵＴＲに特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認された（図示せず）。本願発明者らのデータは、開始コード部位及びＣＡ１ドメインのほとんどを含むｋｓｒの５’領域の交換が、マウスＫＳＲ形態の発現を首尾よく阻止することを示唆する。
【０１３７】
ＫＳＲノックアウトマウスは生存可能であり、多産であり、大きな発達欠損は有さなかった。主要器官の全体の組織学的異常は、若いマウス又は１歳までの成体マウスにおいて明らかであった。動物の体重、挙動及び１腹子数はさらに、ＫＳＲノックアウトによって影響を受けなかった。しかし、１０日齢のｋｓｒ^−／−マウスの皮膚の組織学的検査により、毛嚢が顕著に少ないことがわかり、これは、皮膚の位置（深さ）及び配置（方向）において方向性がなく、非同期的な成長が明らかとなった（図２ａ対図２ｂ、ｃ）。さらに、有意な割合は、曲がりくねった形態を示した（図２ｂ）。他の小胞において、内毛根鞘は毛幹と分離しており、これは、水疱または嚢胞を形成した（図２ｃ）。この表現型は、著しく、ＥＧＦＲ欠損マウスの皮膚において見出されるものと密接に類似している（１３）（図２ｄ）。肉眼で見ると、ｅｇｆｒ^−／−マウスは、第１週齢に、短い、波打った毛皮及びちぢれたひげを示し、この毛皮及び鼻毛はまばらであり、時間と共に萎縮性であり、最終的には脱毛症となった（１３）。これらの全体的な表現型がｋｓｒ^−／−マウスにおいて見られなかったにもかかわらず、ホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）で処理した後に、同様に処置したｋｓｒ^＋／＋コントロールと比較して、脱毛症及びまばらな発毛の増加が観察された（図示せず）。両方のノックアウトによるこの固有な毛嚢表現型の徴候は、ＥＧＦＲ及びＫＳＲがマウスにおいて同じ経路上にあることを支持する。
【０１３８】
ＥＧＦＲ／ＭＡＰＫ経路の活性化に対するＫＳＲ破壊の効果をさらに説明するために、本願発明者らはｋｓｒ^＋／＋及びｋｓｒ^−／−同腹子由来のＭＥＦを作成し、低い分裂促進用量のＥＧＦ及びＴＰＡ（ＭＡＰＫカスケードを活性化することが知られている２つの増殖刺激）に対するそれらの応答を評価した。血清飢餓の４８時間後、さまざまな用量のＥＧＦ（０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌ）又はＴＰＡ（１０ｎＭ〜１ｕＭ）に応答するＭＡＰＫ活性を、モノクローナル及び抗−ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ^２０２／Ｔｈｒ^２０４）抗体を用いたウエスタンブロット分析によって決定した。ｋｓｒ^−／−ＭＥＦは、全ての用量で試験されるＥＧＦ−及びＴＰＡ−により誘導されるＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）活性化の顕著な減少を示し、一方、全ＭＡＰＫ含量は主に不変のままであった（図３Ａ）。ＥＧＦ刺激について、ＭＡＰＫ活性化の阻害は、０．０１ｎｇ／ｍｌの低い容量であらわれ（図示せず）、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦでは、ＭＡＰＫ活性化は部分的に回復した（図３Ａ、上側パネル、レーン８）。
【０１３９】
ＭＡＰＫ阻害条件下でＲａｆ−１活性化を試験するために、内因性Ｒａｆ−１を全てのＭＥＦ溶解物から均一に免疫沈降させ（図示せず）、キナーゼ不活性のＭＥＫ（Ｋ９７Ｍ）を基質として用いて活性をアッセイした。Ｒａｆ−１活性が、分裂促進用量のＥＧＦに応答してｋｓｒ^−／−ＭＥＦにおいて大きく阻害され（＞９０％）（図３Ｂ、上側パネル、レーン４及び６）、一方、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで刺激される場合には阻害は観察されなかった（図３Ｂ、上側パネル、レーン８）。このように、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦにおける１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦに応答するＭＡＰＫ活性化の部分的な阻害は、Ｒａｆ−１活性化から独立しており、ＫＳＲの既知のＭＡＫの足場となる機能から生じると考えられる。これらの結果は、ＭＥＦにおけるＥＧＦにより刺激されたＲａｆ−１活性化が用量依存性であり、ＫＳＲ依存性及び非依存性の機構を介して生じ得ることを示し、これは、本願発明者らの見解と一致している（２８）。
【０１４０】
ＴＰＡにより誘導されるｃ−Ｒａｆ−１活性化のための必要条件は、分裂促進用量のＥＧＦのための必要条件とは異なっていた。ｋｓｒを欠失した場合の分裂促進用量のＥＧＦを用いた刺激の後のｃ−Ｒａｆ−１活性化の完全な阻害と対照的に、ＴＰＡにより誘導されるＲａｆ−１活性化は、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦにおいて変化がなかった（図３Ｂ、下側パネル）。このように、ＫＳＲノックアウトＭＥＦの使用は、ｃ−Ｒａｆ−１活性化の２つの機構（分裂促進ＥＧＦ刺激に必要なＫＳＲ依存性機構、及びＴＰＡ、及びおそらく薬理学的用量のＥＧＦによって用いられるＫＳＲ非依存性機構）の定義を可能にする。ＫＳＲがないことにより、ｃ−Ｒａｆ−１活性化がおこらず、及びＫＳＲのＭＥＫの足場となる機能を失うことを介して、２つの機構によってＭＡＰＫ活性化に影響を与えることができる。
【０１４１】
インビボでの細胞増殖に対するＭＡＰＫ阻害の生物学的結果を検討するために、細胞発育の指数増殖期のＭＥＦを用いて増殖アッセイを行なった。増殖シグナルを提供するＭＡＰＫ分裂促進経路を介するシグナル形成の減少と一致して、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦＳにおける成長率の５０％低下が観察された（図３Ｃ）。
【０１４２】
Ｒａｓにより媒介される形質転換におけるＫＳＲ失活の潜在的な影響を決定するために、ｃ−Ｍｙｃ及びＨａ−ｒａｓＶ１２構築物を、高タイターレトロウイルスを用いてｋｓｒ^＋／＋及びｋｓｒ^−／−初期継代ＭＥＦに形質導入し、軟質寒天においてコロニーとして成長する能力を記載されるように評価した（１５）。ｋｓｒ^＋／＋繊維芽細胞は軟質寒天においてコロニーを形成せず、これらはＭｙｃ及びＲａｓ癌遺伝子の存在下でコロニーを形成しなかった（図示せず）。対照的に、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦは、ｃ−Ｍｙｃによって不死化されたが、Ｈａ−ｒａｓＶ１２によって形質転換されなかった。まとめると、これらの全ての結果は、遺伝的欠失によるＫＳＲの失活が、ＥＧＦＲ／Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路を介するシグナル形成を弱めることを示す。
【０１４３】
ヒトの癌における癌遺伝子ｒａｓの関与は３０％であると推定され（３３）、ヒトにおける皮膚の病変の約２５％がＨａ−Ｒａｓの突然変異を含む（扁平上皮癌について約２５％、黒色腫において２８％）（３４、３５）。ｋｓｒ^−／−マウスが、おそらくＥＧＦＥシグナル形成の欠陥を介して毛嚢の通常の発現を欠損していることが示されたため、本願発明者らは、皮膚における機能獲得ＲａｓにおけるＫＳＲの役割を検討した。これらの研究のために、二段階皮膚発癌の研究の標準化されたモデルである、本願発明者らはζ−グロブリンプロモーターに融合したハーバー癌遺伝子ν−Ｈａ−ｒａｓを有するＴｇ．Ａｃマウスを使用した（１６〜１８）。Ｔｇ．Ａｃマウスのν−Ｈａ−ｒａｓ導入遺伝子は、マウスの皮膚においてＫＳＲが局在化しているという本願発明者らの結果と一致する部位である毛嚢の外毛根鞘細胞に密接に関連する潜在的な新生物細胞（推定上の幹細胞）に導入されるまで、転写的に沈黙している（１９）（図示せず）。Ｔｇ．Ａｃマウス（ＦＶＢ／Ｎ株バックグラウンドにおける）を、ｋｓｒ^−／−マウス（混合したＣ５７ＢＬ／６：１２９ｓｖバックグラウンドにおける）と交差させた。ｋｓｒ遺伝子について異種のＦ１世代は、ｋｓｒ^＋／＋及びｋｓｒ^−／−バックグラウンドにおいてν−Ｈａ−ｒａｓ導入遺伝子を有するＦ２世代を得るために交配された。ｋｓｒの破壊がこのモデルにおける腫瘍形成に影響を与えるか否かを決定するために、本願発明者らは、Ｆ２マウスの背に、ビヒクル（アセトン）、又は５μｇのＴＰＡを１５週間のあいだ、週に２回局所処置した。２０週間、皮膚の悪性発現について動物をモニタリングした。
【０１４４】
ν−Ｈａ−ｒａｓ導入遺伝子ｍＲＮＡを検出するためのＲＴ−ＰＣＲを用いた初期コントロール試験は、ｋｓｒ^−／−マウスにおけるＫＳＲ機能の欠損が、皮膚においてＴＰＡにより誘導される癌遺伝子ν−Ｈａ−ｒａｓ導入遺伝子の発現に影響を与えないことを示した（図４Ａ）。しかし、ｋｓｒ^＋／＋バックグラウンドにおけるＴｇ．Ａｃトランスジェニックマウスの７０％で乳頭腫が進行し、一方、ｋｓｒ^−／−バックグラウンドにおいて１０％のみが乳頭腫を示した（図４Ｂ）。本願発明者らの研究における乳頭腫の平均数は、各グループにおいてマウスあたり２〜４であった。Ｔｇ．Ａｃマウスを用いたこれらの研究は、ＫＳＲの遺伝的失活がＥＧＦＲ−／Ｒａｓ−により媒介される皮膚腫瘍形成を防ぐことを示す。
【０１４５】
まとめると、これらの研究は、哺乳動物ＫＳＲが、ＥＧＦＲ／Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナル形成モジュールを介したシグナル形成を一体化することを示す。ＥＧＦＲ、Ｒａｓ及びＫＳＲは、哺乳動物細胞において同じシグナル形成経路上にあり、ＭＥＦにおけるＥＧＦにより誘発されるＭＡＰＫシグナル形成を弱めることによって、及び複数の実験モデルにおけるＥＧＦＲ−／Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成の妨害によって、ＥＧＦＲノックアウトマウスにおいてあらわれ、ＫＳＲノックアウトにおいて繰り返される通常ではない毛嚢表現型によって支持される（実施例２も参照）。これらの研究はさらに、Ｒａｆ−１活性化がＫＳＲ依存性及び非依存性の機構によって起こり得ることを示す。本願発明者らは、この観察結果が、Ｒａｓ／Ｒａｆ−１−ＭＡＰＫモジュールの上流要素に関する問題のいくつかを解決する役に立ち得、さらなる観察のための新しい標的及び試薬を提供すると考える。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（２、３）において、ＫＳＲは、ほとんどの場合、通常の成長のために重要ではなく見えるが、ＥＧＦ刺激において急性に、又はＲａｓにより媒介される腫瘍において慢性的に、ＥＧＦＲ／Ｒａｓ経路を介するシグナル形成の増加が必要な場合及び発癌遺伝子Ｒａｓにより変換されＭＡＰＫにより媒介される腫瘍形成のいくつかの形態に必要とされ、このことは、ＫＳＲ失活が治療的利点を与え、特に、ヒト腫瘍形成のＲａｓ／ＭＡＰＫシグナル形成の選択的な阻止に治療的利点を与えることを示す。
【０１４６】
（方法）
遺伝子標的化。マウスｋｓｒ ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｕ４３５８５）の５’コード領域（ｎｔ１〜７８６）を用いてマウス株１２９／ｓｖ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から調製したλＦｉｘＩＩファージライブラリーをスクリーニングすることによって、マウスｋｓｒゲノムＤＮＡクローンを単離した。マウスｋｓｒ ｃＤＮＡ配列を図１２Ａに示す。標的化ベクターｐＦ９を、マウスｋｓｒゲノムクローンの５’末端由来の２．５−ｋｂのＳｐｅＩ−ＳｍａＩフィルインフラグメントをｐＰＧＫ−ＮＴＫベクター（Ｄｒ．Ｆｒａｎｋ Ｓｉｒｏｔｎａｋより寄贈）のＮｏｔＩフィルイン部位に挿入することによって構築した。マウスｋｓｒゲノムクローンの３’下流領域由来の６．３−ｋｂのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフィルインフラグメントを、ＣｌａＩフィルイン部位でベクターに挿入した。得られたプラスミドをＫｐｎＩを用いて線形にし、１２９／Ｓｖにより誘導されたＷ９．５ＥＳ細胞（Ｃｈｒｙｓａｌｉｓ ＤＮＸ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）に電気穿孔した。２００のＧ４１８／ガンシクロビル耐性のＥＳ細胞クローンを、ｐＦ９中に存在するもののすぐ外側（５’）に位置するゲノム配列から誘導される０．６ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＳｐｅＩプローブを用いてサザンブロットによって分析した。このプローブを、ｗｔ ｋｓｒ対立遺伝子について５．７−ｋｂのＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、破壊された対立遺伝子について３．１−ｋｂのフラグメントにハイブリダイズする。Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで、尾胞段階Ｃ５７ＢＬ／６マウス胚に異種接合ＥＳ細胞を微量注入した。次いで、注入された尾胞を、擬似妊娠Ｃ５７ＢＬ／６マウスの子宮に移植した。キメラ雄をＣ５７ＢＬ／６雌と交配させた。アグーチＦ１世代において生殖系列の伝達をサザンブロットによってモニタリングした。マウス遺伝子型特定のために、ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてマウスの尾から単離し、ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩのいずれかで消化し、ＥＳ細胞についてのようにサザンブロットによって試験するか、又は２セットのプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって分析した。ｗｔ対立遺伝子のためのプライマーは、マウスｋｓｒ ＣＡ１ドメインのｃＤＮＡ配列から誘導された：上流プライマー、５’−ＴＡＴＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＡＧＴＣＴ−３’（配列番号：２０）、下流プライマー、５’−ＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＡ−３’（配列番号：２１）。変異対立遺伝子のためのプライマーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の配列由来であった：上流プライマー、５’−ＣＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＴＧ−３’（配列番号２２）；下流プライマー、５’−ＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣ−３’（配列番号２３）。予想産物のサイズはｗｔについて４９３−ｂｐであり、破壊された対立遺伝子について３１２−ｂｐであった。標準的なＰＣＲ条件を使用した：初期変性９４℃で５分、その後、アニーリング５６℃、伸長７２℃、及び変性９４℃の３０サイクル、すべて３０秒。
【０１４７】
ノーザン及びウェスタンブロット分析。ポリＡ^＋ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのＯｌｉｇｏｔｅｘキットを用いて成体マウス組織から調製した。マウスｋｓｒ ｃＤＮＡ（１．４７−ｋｂ）のＣＡ２〜ＣＡ４ドメインに対応する特異的な^３２Ｐ−標識されたプローブを用いてブロットをハイブリダイズした。胚組織について、本願発明者らは、マウス胚ＭＴＮ Ｂｌｏｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した。ｋｓｒ^＋／＋及びｋｓｒ^−／−組織から、又はＲＩＰＡバッファー中のＭＥＦからタンパク質均質物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１００μｇタンパク質／レーン）によってフラクション化した。マウスモノクローナル抗−ＫＳＲ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又はＫＳＲのアミノ酸８５５〜８７１に対して作成されたヤギポリクローナル抗−ＫＳＲ抗体（ｃ−１９，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて、ＫＳＲ発現をウェスタンブロットによって検出した。ＭＥＦにおけるＭＥＫ及びＭＡＰＫ活性化を、抗−ホスホ−ＭＥＫ及び抗−ホスホ−ＭＡＰＫ特異的抗体：ポリクローナル抗−ＭＥＫ、ポリクローナル抗−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ、モノクローナル抗−ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ^２０２／Ｔｈｒ^２０４）及びポリクローナル抗−ホスホＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ^２１７／Ｓｅｒ^２２１）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＣＡ）を用いたウェスタンブロットによって検出した。
【０１４８】
組織学。１０日齢のｋｓｒ^＋／＋、ｋｓｒ^−／−、及びｅｇｆｒ^−／−（Ｄｒ．Ｌａｕｒａ Ｈａｎｓｅｎによって親切にも提供された）マウスから皮膚組織を集め、１０％中性緩衝化ホルマリン中で１５〜１８時間固定し、７０％エタノールで２時間洗浄し、パラフィンブロック中に包埋した。このブロックを４〜６μｍ厚に切断し、ガラススライド上に置き、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【０１４９】
ＭＥＦ研究。ｋｓｒ^＋／＋及びｋｓｒ^−／−の１２〜１３日目の胚から誘導されるＭＥＦを記載されるように調製した^１５。０．２５×１０^６の初期継代ＭＥＦ（ＰＤＬ＜６）を６ウェルプレートに接種し、１０％ＦＢＳを追加したＤＭＥＭ中で３７℃で２４時間増殖させた。血清を含まない培地中で４８時間後、細胞を０．０５〜１．０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで３分間刺激し、ＰＢＳで洗浄し、０．２ｍｌのＮＰ−４０溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０及びプロテアーゼ及びホスファターゼインヒビター）中に溶解した。Ｒａｆ−１活性を以前に記載されたように行なった（２７）。簡単に言うと、３００ｕｇの完全溶解物をポリクローナル抗−Ｒａｆ−１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）で免疫沈降させ、０．５ＭのＮａＣｌを含有するＮＰ−４０バッファーで洗浄し、キナーゼを殺したＧＳＴ−ＭＥＫ−１（Ｋ９７Ｍ）と共にインキュベートした。活性化されたＭＥＫ−１を、ポリクローナル抗−ホスホ−ＭＥＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＣＡ）を用いてウェスタンブロットによって視覚化した。細胞増殖を分析するために、０．１５×１０^６のｋｓｒ^＋／＋又はｋｓｒ^−／−の低継代ＭＥＦを６０ｍｍプレートに接種し、血球計によって所定の時間点で計測した。データ（ｍｅａｎ＋／−ＳＤ）は、３つの独立実験から編集される。形質転換能力を評価するために、ｋｓｒ^＋／＋及びｋｓｒ^−／−マウス由来のＭＥＦを、レトロウイルスプラスミドｐＷＺＬ−Ｈｙｇｒｏ−ｃ−ｍｙｃ及びｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏ−Ｈ−ＲａｓＶ１２（Ｓｃｏｔｔ Ｌｏｗｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって親切にも提供された）順次形質導入し、記載されるように、０．３％の貴重な寒天中に再懸濁させ、６０ｍｍプレートに接種した（１５）。少なくとも５０細胞からなるコロニーを３週間後に計測した。
【０１５０】
Ｔｇ．ＡＣ／ｋｓｒ^−／−マウスの生成。同種接合の雌雄Ｔｇ．ＡＣトランスジェニックマウス（１６）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から、３〜４週齢で得た。標的集合を作成するために、ｋｓｒ^−／−マウスを最初に、ν−Ｈａ−ｒａｓ導入遺伝子を含有するヘミ接合性Ｔｇ．ＡＣマウスになるまで育てた。ｋｓｒについて異種接合性でありＴｇ．ＡＣ導入遺伝子についてヘミ接合性である、得られたＦ１世代の雌及び雄を、ｋｓｒバックグラウンドにおいて子孫を得るまで育てた。不応答性Ｔｇ．ＡＣマウス（１７）を研究グループから排除した。Ｔｇ．ＡＣ導入遺伝子の存在を以下のようなＰＣＲ増幅によって決定した：初期の変性７４℃で１分１０秒、その後、アニーリング５５℃で１分、伸長７２℃で３分、及び変性９４℃で１分を３０サイクル。順方向プライマーの配列は、５’−ＧＧＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧＡＣ−３’（配列番号１３）であり、逆方向プライマーの配列は５’−ＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＴＣＴＡＴＧＣＣＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１４）であった。ＰＣＲの結果を記載されるようなサザンブロット分析によって確認した（１７）。
【０１５１】
皮膚腫瘍実験。５μｇのＴＰＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いてマウスを１５週間の間、週に２回処置し、記載されるように乳頭腫成長について観察した（１６）。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからのＦＶＢ／Ｎバックグラウンドにおける元々のＴｇ．ＡＣマウスからの子孫をコントロールとして使用した。乳頭腫を２０週間のあいだ週に１回計測した。ＴＰＡ処置の後の皮膚におけるν−Ｈａ−ｒａｓ導入遺伝子発現を、記載されるような枝分かれＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）によって評価した（２４）。
【０１５２】
【化４−１】

【０１５３】
【化４−２】

【０１５４】
【化４−３】

【０１５５】
【化４−４】

。
【０１５６】
（実施例２）
（要約）
ヒトの癌における腫瘍形成ｒａｓ突然変異の罹患率が与えられ、機能獲得（ｇｆ）Ｒａｓシグナル形成の失活は、非常に魅力的な治療的アプローチをあらわすが、臨床的には達成されていない。ここで、ｇｆ Ｒａｓシグナル形成は、Ｒａｓ１のキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ１）（ｇｆ Ｒａｓについて選択的なすぐ下流のエフェクター）の遺伝的又は薬理学的失活を経て、間接的に標的化された。ＫＳＲ１失活は、いくつかのヒト腫瘍細胞株及びヌードマウス異種移植片において、構成的に活性化された表皮増殖因子レセプター又は腫瘍形成Ｋ−Ｒａｓ突然変異によって誘導されるｇｆ Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成を阻止した。ＫＳＲアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ）の連続的注入によるｋｓｒ１の阻害は、ヌードマウスにおいて、腫瘍形成Ｋ−ｒａｓ依存性ヒトＰＡＮＣ−１膵臓及びＡ５４９非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植片の増殖を防止し、確立されたＰＡＮＣ−１腫瘍の縮退に影響を与え、明らかな毒性を有さずに、Ａ５４９肺転移を阻害した。これらの研究は、ｇｆ Ｒａｓ依存性ヒト悪性腫瘍の処置としての、特に現在は有効な治療が存在しない膵臓癌の処置としての、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮが示唆される。
【０１５７】
（導入）
膵臓外分泌部の腺癌は、西欧諸国において癌に関連する死亡率の第４の主因を表す。処置の成功は限られたものであり、５年生存率は５％未満であり、外科的に切除不能な腫瘍を有する患者について平均生存度は４ヶ月である（１、２）。１個のヌクレオチド置換から生じるＨ−、Ｋ−、及びＮ−Ｒａｓの腫瘍形成活性化は、ヒトの癌の３０％で観察され（５）、ヒト膵臓癌の９０％を超えるものがコドン１２Ｋ−ｒａｓ変異を明らかにする（３〜５）。この点変異は、通常の立方骨の膵臓管上皮が平坦な増殖性の病変へ進行する場合、疾患の経過で初期に同定することができ、この病変は膵臓癌の病因論における原因であるとみなされる（６、７）。しかし、ヒト膵臓癌における癌遺伝子Ｋ−ｒａｓシグナル形成の制御は、主に未知のままである。種々の治療ストラテジーがＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫカスケードの重要化合物を失活するために開発されたが、ｇｆ Ｒａｓの特異的な阻害は臨床的には達成されなかった（８、９）。
【０１５８】
最近の研究は、Ｒａｓのキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ１）は、ＥＧＦＲ／Ｒａｓ経路のＲａｓ／ＭＡＰＫシグナル形成アームをポジティブに調整することを示した。ＫＳＲ１はＲａｓの下流で、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及びＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＲａｆの上流又はＲａｆに対して平行のいずれかで作用する（１０〜１２）。配列相同性に基づいて同定された（１２）ＫＳＲ１の哺乳動物形態は、ＫＳＲシグナル形成が進化的に保存されていることを示唆する。しかし、哺乳動物ＫＳＲシグナル形成及び生物学的機能の正確な機構は、主に未知のままである。ｋｓｒ−１欠損Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ及びマウスからの遺伝研究は、ｋｓｒ１が通常の進化のために重要でないが（１０、１１、１３）、ＭＡＰＫカスケードを介するｇｆ Ｒａｓシグナル形成について必須であってもよい（上述の実施例１参照）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでは、ＫＳＲの機能損失（ｌｆ）は、哺乳動物Ｒａｓに腫瘍形成能力を与える同じコドン１３変異によって生じる、ｇｆ Ｒａｓにより媒介される複数外陰部表現型に戻る（１０、１１）。
【０１５９】
Ｒａｓにより媒介されるヒト悪性腫瘍（特に膵臓癌）におけるＫＳＲ１の役割を解明するために、及びＫＳＲ１を治療標的として使用する実現可能性を探るために、哺乳動物ｋｓｒ１を遺伝的及び薬理学的に失活するためにアンチセンスアプローチが使用された。本願発明者らは、構成的に活性化されたＥＧＦＲ又は腫瘍形成Ｋ−Ｒａｓ突然変異のいずれかを介した、腫瘍形成のｇｆ Ｒａｓシグナル形成を阻止するＫＳＲ１失活に対する両方のアプローチを報告した。さらに、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの連続的注入を介するｋｓｒ１遺伝子発現のアンチセンスにより媒介される阻害は、ヌードマウスにおけるヒトＰＡＮＣ−１膵臓及びＡ５４９非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植片の腫瘍形成Ｋ−ｒａｓ依存性増殖を妨害し、確立されたＰＡＮＣ−１腫瘍の退縮を誘発し、明らかな毒性なしにＡ５４９肺転移を阻害する。これらの研究は、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮが、腫瘍形成Ｋ−ｒａｓ依存性ヒト悪性腫瘍の処置のための腫瘍特異的な治療薬剤をあらわすことを示す。
【０１６０】
（結果）
（ｋｓｒ１遺伝子発現の阻害が、Ａ４３１細胞における形態学的な変化を誘発する。）
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて、ＫＳＲ１は、ＬＥＴ−２３（ＥＧＦＲホモログ）を介して開始される経路である、外陰部成長のｇｆ Ｒａｓシグナル形成を調整する（１０、１１）。ＥＧＦＲにより媒介される腫瘍形成における哺乳動物ＫＳＲ１の役割を調査するために、本願発明者らは、１００倍過剰の活性化されたＥＧＦＲ／ＨＥＲ１（１０^７レセプター／細胞）により腫瘍増殖が野生型Ｒａｓにより開始されるＡ４３１ヒトエピデルモイド癌腫瘍株を使用した（１４）。本願発明者らは、Ｒｅｔｒｏ−Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムを用いた、野生型ＫＳＲ１（ＫＳＲ−Ｓ）、アンチセンスＫＳＲ１（ＫＳＲ−ＡＳ）及び優性なネガティブＫＳＲ１（ＤＮ−ＫＳＲ）の誘導可能な形態を安定に発現するＡ４３１細胞株を生成した。Ｆｌａｇ−タグ化ＫＳＲ−Ｓ及びＤＮ−ＫＳＲは、同様のレベルで発現し（図５Ａ）、ＫＳＲ−ＡＳの安定な発現は、内因性ＫＳＲ発現を６０％減少させた（図５Ｂ）。さらに、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処置は、ＫＳＲ−Ｓ発現の用量依存性阻害を誘発し（図５Ｃ）、Ｄｏｘの抜き取り後、その添加は、ＫＳＲ−Ｓ発現を効果的に回復した（図示せず）。同様の結果は、ＤＮ−ＫＳＲ及びＫＳＲ−ＡＳ細胞において見いだされた（図示せず）。これらの観察結果は、ＫＳＲ−Ｔｅｔ−ＯｆｆシステムがＤｏｘによってしっかり調整されていることを示す。
【０１６１】
安定にトランスフェクトされたＡ４３１細胞の形態学についてのＫＳＲ１レベルを操作する効果は最初に試験された。トランスフェクトされていない（図示せず）ベクターでトランスフェクトされた、ＫＳＲ−ＳでトランスフェクトされたＡ４３１細胞が、あまり分化していない鱗片状の上皮細胞の同様の敷石状の上皮細胞形態学を示し（図５Ｄ）、ＫＳＲ−ＡＳによるｋｓｒ１発現の阻止は、細胞形態学において顕著な変化をもたらした。ＫＳＲ−ＡＳ細胞体質が徐々に拡大し、平らにされ、細胞質内プロセスが引っ込み、細胞はより分散された形態で増殖した（図５Ｄ）。さらに、これらの細胞は、多核化し（図５Ｅ）、このことは、得られた増殖欠陥を有する完全な細胞質分裂に対する失敗を示す（以下を参照）（１５）。位相差顕微鏡法は、８０％を超えるＫＳＲ−ＡＳ細胞が多核を含有し、多核化細胞がコントロール又はＫＳＲ−Ｓ細胞においてまれにみられる（＜８％）ことをあらわす。同様の形態学的変化はＤＮ−ＫＳＲ細胞において観察され（図５Ｄ及び５Ｅ）、このことは、Ａ４３１細胞におけるｋｓｒ１遺伝子発現の阻害が、この腫瘍細胞株におけるＥＧＦＲにより媒介される生物学的事象について効果を示した。
【０１６２】
（ｋｓｒ１遺伝子発現の阻害はＡ４３１腫瘍形成を減らす。）
Ａ４３１細胞の悪性に対するＫＳＲ１阻害のコンセンサス、及びＥＧＦに対するインビトロでの応答を評価するために、細胞増殖、浸潤及び形質転換アッセイを行なった。ＫＳＲ−ＳがＡ４３１細胞によって過剰発現される場合、ベースライン及びＥＧＦにより刺激される増殖（図６Ａ）、浸潤（図６Ｃ）及び形質転換（図６Ｄ）が顕著に高まった。対照的に、ＫＳＲ−ＡＳ細胞におけるｋｓｒ発現の減少は、ベースライン増殖、浸潤及び形質転換の顕著な阻害を生じ（図６、各場合においてｐ＜０．０５）、ＥＧＦ応答の阻止を生じた（図６）。ＤＮ−ＫＳＲ効果を、ＫＳＲ−ＡＳを用いて同様に観察した（図６）。
【０１６３】
細胞増殖における観察された変更と一致して、ＫＳＲは、ＦＡＣＳ分析によって決定されるように、細胞サイクル分布に顕著に影響を与えた（図６Ｂ）。指数的に増殖するＫＳＲ−Ｓ細胞においてＳ−期細胞の顕著な増加が存在するが、Ｇ２／Ｍ−期細胞の付随する増加に連結するＳ−期細胞における激しい減少は、ベクターでトランスフェクトされたコントロールと比較してＫＳＲ−ＡＳ細胞において観察された（各場合においてｐ＜０／０５）。これらの観察結果は、Ｋｉ−６７染色によって確認された（図示せず）。刺激及び阻害をそれぞれ調整することにおいて、細胞増殖、浸潤及び形質転換のＫＳＲ−Ｓ及びＫＳＲ−ＡＳの特異性は、ＫＳＲ−Ｓ及びＫＳＲ−ＡＳ発現をＤｏｘ処置により止めることによって確認された（図示せず）。これらの観察結果は、ＫＳＲの過剰発現がＡ４３１細胞の新生物性を高め、ＫＳＲ−ＡＳ又はＤＮ−ＫＳＲの失活はＡ４３１細胞の悪性を減らした。
【０１６４】
ＫＳＲ１下方修正が同様の抗増殖活性をインビボで有するか否かを解明するために、１０^６ＫＳＲ−Ｓ、ＫＳＲ−ＡＳ、ＤＮ−ＫＳＲ又はベクターでトランスフェクトされたＡ４３１細胞を免疫不全（ヌード）マウスの右横腹に皮下注射した。採取された腫瘍が、ＫＳＲ−Ｓ及びベクターでトランスフェクトされた細胞を受けるマウスにおいて１００％であった場合、ＫＳＲ−Ｓ腫瘍は初期の発症を有し（図７Ａ、左側にシフトした増殖曲線、ｐ＜０．０５）、２５日目でサイズは２００％さらに大きく、匹敵するサイズのベクターでトランスフェクトされた腫瘍よりもＫｉ−６７ポジティブ細胞で２．５倍を有する（図示せず）。２５日目で除去される腫瘍標本の試験は、Ｆｌａｇ−ＫＳＲ−Ｓの連続した発現をあらわした（図示せず）。これらの効果を媒介するＫＳＲ−Ｓの特異性は、ＫＳＲ−Ｓ腫瘍を有するマウスのグループにＤｏｘを含有する水を与えて腫瘍性ＫＳＲ−Ｓ発現を効率よくシャットアウトすることによって確認され（図示せず）、Ａ４３１腫瘍に対するＫＳＲ−Ｓの増殖刺激効果をほとんど完全に防いだ（図７Ａ、ＫＳＲ−Ｓ対ＫＳＲ−Ｓ＋Ｄｏｘ、ｐ＜０．０１）。対照的に、１０^６のＡ４３１ＫＳＲ−ＡＳ又はＤＳ−ＫＳＲ細胞を注射したマウスは、１２０日まで観察された場合、いずれの腫瘍も成長することができなかった（図７Ａ及び図示せず）。接種菌のサイズが１０×１０^６まで増加し、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で調製し、それぞれの場合において２０匹のマウスのうち１匹のみが遅発性の発症が進行し（ＫＳＲ−ＡＳについて４２日、ＤＮ−ＫＳＲについて３６日）、腫瘍がゆっくりと成長した。さらに、鱗片状の分化は、ベクター−腫瘍及びＫＳＲ−Ｓ腫瘍の両方で明らかである（図７Ｂ（ｉ）及び（ｉｉ）、黒い矢印）が、ＫＳＲ−Ｓ腫瘍はケルトヒアリン（ｋｅｒｔｏｈｙａｌｉｎ）顆粒及びさらに高い分裂係数を有していた（図示せず）。対照的に、鱗片状の分化は、ＫＳＲ−ＡＳ及びＤＮ−ＫＳＲ腫瘍には存在しなかった（図７Ｂ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ））。さらに、本願発明者らのインビトロでの観察と一致して、２５％のＫＳＲ−ＡＳ及び１８％のＤＳ−ＫＳＲ腫瘍細胞は、インビボで多核化した（図７Ｂ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、黒い矢印、及び（ｖ））。
【０１６５】
これらの観察は、ＫＳＲ−ＡＳによるＡ４３１腫瘍形成の阻害が増殖の減少及び多核化の誘導に関与することを示す。ＫＳＲ−ＡＳによるＡ４３１腫瘍形成の予防がＫＳＲ−ＡＳによるｋｓｒ１発現の阻害に起因することを確認するために、本願発明者らは、ｋｓｒ１発現を薬理学的に失活するために、マウス及びヒトの間で保存されるＫＳＲ１の固有のＣＡ１ドメイン（配列番号１）（アミノ酸４２〜８２（配列番号２））（１２）に対するホスホロチオエートＡＳ−ＯＤＮを設計した。試験されるＡＳ−ＯＤＮの中で、ＫＳＲ１のヌクレオチド２１４〜２３１（配列番号５）に対するＡＳ−ＯＤＮ（ＡＳ−ＯＤＮ１（２１４〜２３１）と命名される）は、任意の他の哺乳動物遺伝子に対して相同な配列を有さず、最も強力で特異的なアンチセンス効果を示し、さらなる特性決定のために選択された。１μＭのＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮ（配列番号８）で２４時間のＡ４３１細胞のインビトロ処置において、免疫蛍光法染色（図８Ａ）、及びウェスタンブロッティング（図示せず）によって決定される場合、内因性ＫＳＲ１発現の９０％減少を生じ、一方、コントロールＯＤＮは明らかな効果を有さなかった（図８Ａ及び図示せず）。さらに、他の細胞タンパク質（ＥＧＦＲ、Ｈ−Ｒａｓ、ｃ−Ｒａｆ−１及びＭＡＰＫを含む）の発現は、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮ又はコントロールＯＤＮの処置によって改変されず（図示せず）、このことは、アンチセンス効果がＫＳＲに特有であることを示す。全長ＫＳＲ−ＡＳの安定な発現によるＫＳＲの失活と同様に、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮ処置は、用量依存性様式でＡ４３１細胞増殖（図８Ｂ）及び浸潤（図８Ｃ）を弱めた（ｐ＜０．０５）。１ｍＭで、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮはＡ４３１細胞増殖及び浸潤をそれぞれ８０％及び７０％阻害した。対照的に、コントロール−ＯＤＮ（図８Ｃ）は、任意の哺乳動物遺伝子に対する相同性を欠いているか（１６）、又はセンス−ＯＤＮ又はミスマッチＡＳ−ＯＤＮに対する相同性を欠いており（図示せず）、効果がなかった。
【０１６６】
ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの抗腫瘍活性をインビボで評価するために、ＡＳ−ＯＤＮ又はコントロールＯＤＮを連続的な皮下注入を経て送達し、持続した腫瘍暴露を提供した。安定状態のＯＤＮ血漿レベルに到達させる目的で、注入を腫瘍移植の２日前に開始した。１０^６のＡ４３１細胞をヌードマウスに皮下注射し、４００ｍｍ^３の種腫瘍を得た。次いで、約５０ｍｇの新しく調製した種腫瘍フラグメントをＡＳ−ＯＤＮ−又はコントロール−ＯＤＮ−処置されたマウスに移植した。５ｍｇ／ｋｇ／日のＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮを用いた処置は、明らかな毒性なく（この治療アプローチの毒性がないことが知られていることと一致）、腫瘍ＫＳＲ１レベルを８５％まで効果的に減少させ、Ａ４３１腫瘍増殖を８０％まで弱めた（図８Ｄ、ｐ＜０．０１）（１７）。対照的に、ビヒクル単独（食塩水）又は同一用量のコントロール−ＯＤＮ、又はセンス−ＯＤＮを用いた処置後に、抗腫瘍効果は観察されなかった（図８Ｄ及び図示せず）。１５０ｍｍ^３の確立されたＡ４３１腫瘍を有するマウスを用いた処置が開始される場合、同様の結果が得られた（図示せず）。全体的に、これらの結果は、ＫＳＲ１が、過剰活性化された野生型Ｒａｓを介するインビボでのＡ４３１腫瘍形成のＥＧＦＲシグナル形成のために必須であることを示す。さらに、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの抗腫瘍活性は、高い特異性を有してｋｓｒ１遺伝子発現の選択的な阻害を介して達成されると考えられた。これらの研究は、ヒト腫瘍形成のＥＧＦＲ／Ｒａｓシグナル形成を阻止するのにＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮを用いることが可能であることを示唆する。
【０１６７】
（ｋｓｒ１発現の阻害が、Ｒａｓ／Ｒａｆ−ＭＡＰＫシグナル形成の特異的な弱化を介して腫瘍形成Ｋ−ｒａｓにより媒介されるヒト膵臓腫瘍形成を阻止する。）
ヒト腫瘍形成の腫瘍形成Ｒａｓシグナル形成の媒介におけるＫＳＲ１の重要性を解明し、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの治療的潜在性を探索するために、本願発明者らは、ヒト膵臓癌ＰＡＮＣ−１異種移植片マウスモデルを使用した。この腫瘍は、Ｋ−ｒａｓの腫瘍形成コドン１２−突然変異を明らかにする。Ａ４３１細胞と同様に、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮを用いたインビトロでのＰＡＮＣ−１細胞の処置は、用量依存様式で、細胞増殖（図９Ａ）、浸潤（図９Ｃ）及び形質転換（図９Ｄ）を弱めた（図９及び図示せず）（それぞれの場合においてｐ＜０．０５）。さらに、５μＭのＡＳ−ＯＤＮを用いた処置により、内因性ＫＳＲ１発現が９０％減少した（図９Ｅ）。腫瘍形成Ｋ−ｒａｓ機能の阻害におけるＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの有効性を確認するために、コドン−１２Ｋ−ｒａｓ変異したヒト膵臓癌細胞株のパネルを５μＭのＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮで処置し、細胞増殖のためにアッセイした。全ての細胞株においてＡＳ−ＯＤＮ処置後に細胞増殖が５０〜８０％阻害される（それぞれｐ＜０．０１）が、センス−ＯＤＮはなんら明らかな効果を有さなかった（図９Ｂ）。
【０１６８】
本願発明者らは、ＫＳＲ１活性が、分裂促進用量のＥＧＦ刺激に応答したインビトロでのｃ−Ｒａｆ−１及びそれに続くＭＡＰＫ活性化のために必要であることを示した（１８、１９）。腫瘍形成Ｋ−ｒａｓシグナル形成においてＫＳＲ１及びＲａｆ−１に分子的に指令を与えるために、ＰＡＮＣ−１細胞を５μＭのＡＳ−ＯＤＮで処置し、優性ポジティブなＢＸＢ−Ｒａｆ−１でトランスフェクトし、細胞浸潤及び形質転換についてアッセイした。Ｒａｆ−１がＫＳＲの下流である場合、ｇｆ Ｒａｆ−１（ＢＸＢ−Ｒａｆ−１）は、ＰＡＮＣ−１細胞浸潤及び形質転換について、ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ失活の阻害効果を逆転させるべきである。実際に、ＢＸＢ−Ｒａｆ−１は内因性ＫＳＲ１発現に効果を有しなかった（図９Ｅ）が、ＰＡＮＣ−１細胞浸潤（図９Ｃ）及び形質転換（図９Ｄ）に対するＡＳ−ＯＤＮの阻害効果を完全に逆転させる。これらの観察は、本願発明者らのインビトロでの発見及び現在の文献（１９〜２２）と一致して、ｃ−Ｒａｆ−１がＫＳＲ１に対して上位であることを示す。機構を試験するさらなる研究を行ない、それにより、ＫＳＲ１失活は腫瘍形成Ｒａｓにより媒介される細胞内シグナル形成に影響を与えた。これらの研究のために、ＡＳ−ＯＤＮ処置された及びＢＸＢ−Ｒａｆ−１トランスフェクトされたＰＡＮＣ−１細胞を、４８時間血清を激減させ、１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで刺激した。ＭＡＰＫ及びＰＩ−３キナーゼ活性を、ホスホ−ＭＡＰＫ及びホスホ−Ａｋｔ特異的抗体を用いて、ウェスタンブロット分析によって分析した。ＡＳ−ＯＤＮ処置は、ＥＧＦにより誘導されるＭＡＰＫ活性をブロックし（図９Ｆ、上側パネル、レーン６対レーン２）、一方、Ａｋｔ活性について明らかな効果は有さなかった（図９Ｆ、下側パネル、レーン６対レーン２）。センス−ＯＤＮはＭＡＰＫ又はＡｋｔ活性のいずれかには影響を与えなかった（図９Ｆ）。さらに、ＭＡＰＫ活性に対するＡＳ−ＯＤＮの阻害効果は、ＢＸＢ−Ｒａｆ−１の発現によって完全に逆転した（図９Ｆ、上側パネル、レーン４対レーン２）。全ＭＡＰＫ及びＡｋｔ含量は、主にＯＤＮを用いた処置又はＢＸＢ−Ｒａｆ−１を用いたトランスフェクションによって影響を受けなかった（図９Ｆ及び図示せず）。これらの結果は、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮによる膵臓癌細胞における腫瘍形成Ｋ−Ｒａｓシグナル形成の阻止が、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫカスケードの特異的阻害によって同様に達成されることを示唆する。ヒト膵臓癌を処置するためのＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの治療潜在性を試験するために、１０^６培養されたＰＡＮＣ−１細胞（図１０Ａ（ｉ））から、又は新しく採取した種ＰＡＮＣ−１腫瘍（上に記載されるように調製した）（図１０Ａ（ｉｉ））からのＰＡＮＣ−１異種移植片を、ヌードマウスに移植した。５及び１０ｍｇ／ｋｇ／日の注入用量についての定常状態の血漿ＡＳ−ＯＤＮレベルを、それぞれ６３及び１２３ｎｇ／ｍｌでＯｌｉＧｒｅｅｎ及びＨＰＬＣアッセイによって決定し、これらは、同様の用量を用いる文献において報告されるものと一致した（２３）。注射された細胞から生じるＰＡＮＣ−１腫瘍について、ＡＳ−ＯＤＮ処置の開始前に腫瘍を１００ｍｍ^３に到達させた。１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＳ−ＯＤＮを１４日間注入することは、１００％応答率で腫瘍体積を４０％減少させた（図１０Ａ（ｉ）、ｐ＜０．０５対コントロール−ＯＤＮ）。縮退したＡＳ−ＯＤＮ処置された細胞のグループを、処置をやめた後に腫瘍再増殖についてモニタリングした。５腫瘍のうち１つのみが、再増殖を示し、一方、残りは退縮したままであり、４週間まで安定であった（図示せず）。ＰＡＮＣ−１異種移植片は、インビボで連続継代を経て伝播されるため、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの連続注入は腫瘍移植の２日前に開始され、用量依存性様式でＰＡＮＣ−１腫瘍の増殖を弱めた（図１０Ａ（ｉｉ））。任意の用量で明らかな毒性（体重減少、行動変更、臓器肥大症、炎症、出血）は観察されず、剖検で多くの組織の組織学的試験によって確認された（図示せず）。７５ｍｇ／ｋｇ／日で、ＰＡＮＣ−１腫瘍増殖は完全に阻止され、処置をやめた後、すべてのマウスは４週間まで腫瘍を有さないままである（図１０Ａ（ｉｉ）及び図示せず）。対照的に、ビヒクル単独（食塩水）での処置、コントロール−ＯＤＮ、又はセンス−ＯＤＮでの処置は、試験されるすべての用量で抗腫瘍効果を示さなかった（図１０Ａ及び図示せず）。これらの観察は、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮについて観察される抗腫瘍効果が作用のアンチセンス機構を介して生じるという結果を支持する。ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの同様の抗新生物性効果は、膵臓嚢の組織下で同所移植されたＰＡＮＣ−１腫瘍において観察された（図示せず）。
【０１６９】
膵臓腫瘍形成のＫ−ｒａｓシグナル形成の媒介においてＫＳＲの特異性を確認するために、本願発明者らは、食塩水−、センス−ＯＤＮ及びＡＳ−ＯＤＮ注入されたＰＡＮＣ−１腫瘍において内因性ｋｓｒ１遺伝子発現を試験した。ＫＳＲ１発現は、試験される全てのＡＳ−ＯＤＮ処置された動物において９０％まで阻害され、一方、食塩水又はセンス−ＯＤＮ注入によって主に変化せず（図１０Ｂ）、配列特異的な標的効果を確認する。さらなるコントロールとして、Ｒａｓ活性化についてのインビボでのＡＳ−ＯＤＮ処置の効果を、方法において記載されるようなＧＳＴ−ＲＢＤ−Ｒａｆ−１プルダウンアッセイを用いて、ＰＡＮＣ−１腫瘍におけるＧＴＰ−Ｒａｓの量を決定することによって測定した。培養物中のＡ４３１及びＰＡＮＣ−１細胞のデータと一致して（図示せず）、ＡＳ−ＯＤＮ処置はＲａｓ活性化について明らかな効果を有さず（図１０Ｃ）、このことは、Ｒａｓ活性化の上流のシグナル形成事象は損なわれておらず、ＫＳＲ欠失によるＰＡＮＣ−１細胞における腫瘍形成Ｋ−ｒａｓシグナル形成の失活はＲａｓの下流に生じることを示す。
【０１７０】
他の腫瘍形成Ｋ−ｒａｓ依存性ヒト腫瘍を遅らせるＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの有効性を確認するために、コドン１２Ｋ−ｒａｓ変異されたＡ５４９ヒト非小細胞肺癌モデル（ＮＳＣＬＣ）を選択した。これらの研究のために、上のようなＡ４３１及びＰＡＮＣ−１種腫瘍と同様に調製した５０ｍｇのＡ５４９種腫瘍フラグメントを皮下でヌードマウスに移植した。ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮを用いた処置は、Ａ５４９腫瘍が１５０ｍｍ^３に到達する場合に開始された。１０ｍｇ／ｋｇ／日で、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮは、確立されたＡ５４９腫瘍の増殖を完全に阻害し、一方、食塩水、コントロール−ＯＤＮ又はセンス−ＯＤＮは明らかな効果を有さなかった（図１０Ｄ（ｉ））。動物を実験の最後に屠殺し、肺をセンス−ＯＤＮ−又はＡＳ−ＯＤＮ−処置されたマウスから切除し、Ｉｎｄｉａｎインクで染色して、全身散布を介して誘導される表面肺転移を視覚化した。コントロール−ＯＤＮ−処置された肺は平均で８〜１１の転移巣を有していた。ＡＳ−ＯＤＮ処置は、Ａ５４９肺転移の用量依存性阻害を引き出した（図１０Ｄ（ｉｉ）、ｐ＜０．０５）。これらの観察は、ＫＳＲ１がＫ−ｒａｓ依存性原発性腫瘍増殖に必須であるが、これらの腫瘍の転移成長において必須の役割を示し得ることを示唆する。さらに、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮは、Ｋ−ｒａｓ−依存性ヒト悪性腫瘍の管理において有効な薬剤である。
【０１７１】
（考察）
本研究は、ＫＳＲ１が組織レベルでｇｆ Ｒａｓのシグナル形成に必須であり、ｋｓｒ１発現の阻害がｇｆ Ｒａｓ依存性腫瘍の選択的退縮を導くという証拠を提供する。以前の臨床研究は、今日まで主にうまくいっていないＲａｓ／Ｒａｆ−１／ＭＡＰＫシグナル形成カスケードの要素の阻害によって、ｇｆ Ｒａｓ依存性腫瘍を処置するために設計された（９）。ほとんどの薬剤についての毒性が受容可能であるが、処置の成功は、近年のデータが別の生物学的機能を有し得ることを示唆し（２４〜２６）、ｇｆ 対 生理学的Ｒａｓシグナル形成に対する選択性が欠如している（８、９）、異なるＲａｓイソ型の阻害における特異性の欠如によって限定されている。Ｒａｆ−１／ＭＥＫ１／ＭＡＰＫカスケードの要素を阻害するために設計された実験薬物について同様の問題が存在する（９）。ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮについての本研究は、Ｒａｓ依存性ヒト腫瘍の処置における、ｇｆ Ｒａｓシグナル形成を特異的に弱めるためのアプローチを提供する。
【０１７２】
ＡＳ−ＯＤＮ技術を用いたＤＮＡ配列の標的化は、癌の処置に対する魅力的な治療アプローチをあらわし（２７）、このアプローチの有する主な問題は、目的の遺伝子についてのＡＳ−ＯＤＮ効果の特異性の設計であった。本願発明者らは、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮを用いて観察された腫瘍形成の阻害が、ｋｓｒ１の阻害を介したｇｆ Ｋ−ｒａｓシグナル形成の選択的失活に起因するという考えを支持する多くの異なる証拠を提供する。本願発明者らのデータは、ＫＳＲ ＡＳ Ｔｅｔ−Ｏｆｆ構築物によるｋｓｒ１発現の遺伝的阻害が、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮとしてインビトロ及びインビボでかなりのアンチセンスにより媒介される効果を得たことを示す。さらに、種々のＯＤＮ（配列依存性及び配列非依存性非アンチセンス人工産物を制御するために設計される）は、ｋｓｒ１遺伝子発現になんら効果を有さないか、又は細胞培養物中又はインビボで腫瘍増殖についてなんら効果を有さなかった。ＯＤＮ配列特異性に加えて、ｋｓｒ１発現に対するＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの効果は、ＥＧＦＲ−Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路の他の遺伝子の発現が影響を受けないような、目的の標的について特異的であった。最後に、Ａ４３１細胞によるＫＳＲ−Ｓの条件的な過剰発現は、ＫＳＲ−ＡＳによるＫＳＲ失活に反する表現型を送達し、ＫＳＲ−Ｓ及びＫＳＲ−ＡＳの効果は両方とも、Ｄｏｘ処置によって発現を停止させることによってＴｅｔ−Ｏｆｆシステムにおいて可逆性であった。これらの結果は、全体的に、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの抗腫瘍効果がアンチセンス機構によって達成されることを証明する。
【０１７３】
ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮを用いて処置された動物における正常な組織の毒性の欠如は、ｋｓｒ１がＣ．ｅｌｅｇａｎｓ及びマウスにおける通常の成長のために重要ではないという最近の報告と一致している（１０、１１、１３及び上述の実施例１参照）。近年の観察は、第２のｋｓｒ対立遺伝子であるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ中（２８）及びマウス中（２９）のｋｓｒ２をカバーしておらず、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮによるｋｓｒ１の欠如後の組織毒性の欠如は、正常な細胞機能についてｋｓｒ２による修正に起因する場合がある。あるいは、毒性の欠如は、ＫＳＲのトポロジー分布を反映している場合がある。近年の証拠は、Ｒａｓ／Ｒａｆ−１／ＭＡＰＫ経路の要素が、膜微小ドメインの１つより多い種類に区画わけされることを示唆し（２６、３０）、この区画わけは、活性の調整と関連する。この観点では、Ｒａｓ及びｃ−Ｒａｆ−１は、血漿膜中、及びバルク膜フラクションと共にスフィンゴ脂質豊富な微小ドメイン（ラフト（ｒａｆｔ）としても知られる）と関連する。少なくともｃ−Ｒａｆ−１についてのラフト関連は、スフィンゴ脂質セラミドに対する結合を含むと考えられる（３１）。さらに、活性状態に依存して、Ｒａｓ形態は、コンパートメント（３２）と、バルク膜を優先的に標的化するｇｆ Ｒａｓとの間を通行してもよい。
【０１７４】
いくつかの議論された基がセラミド活性化されたＫＳＲ（２０、３３）がｇｆ Ｒａｓ活性化プロセスにおいて特定の役割をはたすかどうか、及びその失活が通常の細胞機能にわずかに影響を及ぼすかどうか、将来の観察の主題である。最後に、ＡＳ−ＯＤＮのホスホロチオエート種類（最も一般的にはＡＳ−ＯＤＮが使用される）が一般的に十分に許容可能であるため、本願発明者らのＫＳＲ ＯＤＮの毒性の明らかな欠如は驚くべきことではない。臨床前のモデル及びヒト臨床試験における連続的な注入を介する投与は、配列依存性の毒性（相補系の活性化、活性化された部分トロンボプラスチン時間の延長、及び血液学的パラメーターの変更）が、薬理学的アンチセンス効果が達成される用量では通常成し遂げられないことを確立した。
【０１７５】
これらの試験はさらに、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの治療的利点が腫瘍形成Ｋ−ｒａｓ依存ヒトがんに限られず、腫瘍種類のさらに広いスペクトルを含み、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮを用いた本願発明者らの試験は腫瘍株Ａ４３１に対して有効であることがわかり、これらは過剰活性化された野生型Ｒａｓによって開始される。インビボで確立された腫瘍に対するＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの治療作用は、腫瘍細胞増殖及び腫瘍細胞死の誘発の両方の阻害を含むと考えられる。ＫＳＲ１失活の抗増殖効果は、Ｓ段階の細胞における減少及びインビトロ及びインビボでの多核表現型の誘導によって明らかになった。さらに、ＡＳ−ＯＤＮ処置された−Ａ４３１及びＰＡＮＣ−１腫瘍は、大きな壊死領域（切断面の表面の６０〜８０％）を含有していた。しかし、後者の効果の機構は、未知のままである。以前の試験は、重要な微小血管内皮のアポトーシスがまた、ｒａｓ失活の結果として抗腫瘍効果に貢献することを示した（３７）。しかし、本願発明者らのモデルでは、散発的な血管内皮細胞アポトーシスだけは、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮで処置されるＰＡＮＣ−１腫瘍のＣＤ３４及びＴＵＮＥＬ染色によって検出された（図示せず）。血管形成におけるＫＳＲの役割は、腫瘍血管形成のさらに関連するモデルにおけるさらなる観察結果を待たなければならない。
【０１７６】
本試験から出される別の重要な発見は、ＫＳＲが腫瘍形成Ｒａｓにより媒介される腫瘍転移の進行のために必要とされると考えられることである。ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮで処置されたＡ５４９肺転移の阻害は、本願発明者の予備データと一致し、ＭＭＰ−２及び９活性は、Ａ４３１−ＫＳＲ−Ｓ細胞中で増加し、Ａ４３１−ＫＳＲ−ＡＳ細胞中で阻害される（データは図示せず）。観察は、腫瘍進行におけるＫＳＲの役割を説明するために進行中である。
【０１７７】
ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮの有効な使用はさらに、ｇｆ Ｒａｓシグナル形成が関与する重要な下流事象の調整の改良された理解を提供し、現時点では、部分的にしか知られていない。Ｒａｆ−ＭＡＰＫ及びＰＩ−３キナーゼモジュールは、腫瘍形成のｇｆ Ｒａｓシグナル形成を媒介する２つの確立された下流経路である（３８〜４１）。ここで、本願発明者らは、ＫＳＲ１が、Ｒａｆ−１−ＭＡＰＫシグナル形成アームの特異的な調整を介して同様にｇｆ Ｒａｓの重要なメディエーターとして機能するという証拠を提供した。この概念の支持は、ＭＭＴＶ−ＭＴ依存性の乳腺腫瘍起源（野生型Ｒａｓを経て主にｓｒｃ及びＰＩ−３キナーゼを介してシグナル形成される）がｋｓｒ^−／−マウスにおいて影響を受けないことを示す最近の研究から誘導される（１３）。対照的に、腫瘍形成ｖ−Ｈａ−Ｒａｓにより媒介される表皮性の皮膚腫瘍の腫瘍形成（ｃ−Ｒａｆ−１／ＭＡＰＫカスケードを介してシグナル形成される）は、ｋｓｒ１^−／−マウスにおいて阻止される（Ｌｏｚａｎｏ及びＫｏｌｅｓｎｉｃｋ、未公開）。さらに、ＫＳＲアンチセンスを用いた本研究は、哺乳動物ＫＳＲ１に対して上位としてのｃ−Ｒａｆ−１の分子の秩序化を支持し、これは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及びＣ．ｅｌｅｇａｎｓからの遺伝的結果と一致する（１０、１１）。本願発明者らは、これらの観察結果がＲａｓ／Ｒａｆ−１／ＭＡＰＫモジュールの上流要素に関する破壊のいくつかを解決するのに役立ち得ると考える。
【０１７８】
要約すると、現在の研究は、ｇｆ Ｒａｓシグナル形成に依存するヒト悪性腫瘍の処置のための新規な分子標的としてＫＳＲ１を支持する元々の観察結果を提供する。
【０１７９】
（方法）
Ｒｅｔｒｏ−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ Ａ４３１細胞株の細胞培養物及び生成。ヒト表皮癌細胞株Ａ４３１、肺癌細胞株Ａ５４９及び膵臓細胞株ＰＡＮＣ−１、Ｃａｐａｎ−２、ＰＬ−４５、ＨＰＡＦ−ＩＩ、ＡｓＰｃ−１及びＭｉａｐａＰａ−２をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。全長野生型マウスｋｓｒ１ ｃＤＮＡ（ヒトｋｓｒ１と９０％以上同一である（１２））を、ｐＲｅｔｒｏ−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）においてドキシサイクリン誘発性プロモーターの制御下でセンス（ＫＳＲ−Ｓ）及びアンチセンス（ＫＳＲ−ＡＳ）位置の両方においてｐＲｅｔｏｒ−ＴＲＥにクローン化した。ＤＮ−ＫＳＲ（Ｄ６８３Ａ／Ｄ７００Ａ／Ｒ５８９Ｍ）を同様にサブクローン化させた。Ａ４３１細胞を、ＫＳＲ−Ｓ、ＫＳＲ−ＡＳ、ＤＮ−ＫＳＲ又は空のベクターでトランスフェクトされたＰＴ６７パッケージング細胞から集められた培地で感染させ、二重の選択下（０．１ｍｇ／ｍｌのネオマイシン及び０．１ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン）で維持した。
【０１８０】
ウェスタンブロット、免疫蛍光法及び免疫組織化学。細胞溶解物全体及び腫瘍溶解物を記載されるようにＮＰ−４０バッファー中で調製した（１８、４２）。免疫沈降（ＩＰ）又はウェスタンブロッティング（ＷＢ）を製造業者のプロトコルに従って、以下の抗体を用いて行なった：Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのモノクローナル抗−Ｆｌａｇ Ｍ２抗体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＣＡ）からのポリクローナル抗−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ、モノクローナル抗−ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ポリクローナル抗−ホスホ−ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）及びポリクローナル抗−ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体、及びＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）からのポリクローナル抗−ｃ−Ｒａｆ−１抗体。内因性ＫＳＲ１発現を、全１ｍｇの溶解物からの免疫沈降及びＷＢ分析によって、又はモノクローナル抗−ＫＳＲ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（１：１００希釈）及びＨＲＰ−又はＴｅｘａｓ−Ｒｅｄに接合したヤギ抗−マウス二次抗体をそれぞれ用いた免疫蛍光顕微鏡検査法によって決定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）。組織学及び免疫組織化学を、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した腫瘍又は組織標本で行なった。５ｍｍ切断片を脱パラフィン化し、段階的なアルコール中で再水和させ、Ｈ＆Ｅ染色又はアビジン−ビオチンイムノペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）法を用いて免疫染色した（４３）。以下の一次抗体を使用した：ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのラット抗−マウスＣＤ３４（１：５０）抗体及びポリクローナル抗−ヒトＫｉ６７抗体（１：１００）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。記載されるように、ジアミノベンジジンを色原体として使用し、核対比染色としてヘマトキシリンを使用した（４３）。記載されるように、末端デオキシトランスフェラーゼにより媒介されるデオキシウリジントリホスフェートニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）（Ｒｏｃｈ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってアポトーシスを評価した（４３）。
【０１８１】
増殖、マトリゲル浸潤及び軟寒天形質転換アッセイ。２×１０^４のＡ４３１細胞又は１〜３×１０^４ヒト膵臓細胞を６ウェルプレートに接種した。細胞／ウェルの全数を所定の時間点で計測し、細胞増殖曲線を作る。ＥＧＦ処置のために、１．０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを培養物に添加し、１日おきに交換した。記載されるように、浸潤アッセイを行なった（４２）。フィルターの下側の細胞を１０個のランダムに選択したフィールドで計測し（４０倍拡大）、フィールドごとに浸潤した細胞の平均数として報告した。ＥＧＦ処置のために、実験の２時間前に細胞を無血清培地と交換した。軟質寒天アッセイを、０．５％寒天及び５％ＦＢＳを含有する１．５ｍｌの培地でコーティングされた３５ｍｍ培養プレート中で設定した。５×１０^３細胞を０．１％寒天及び５％ＦＢＳを含有する１．５ｍｌの培地に懸濁させ、寒天であらかじめコーティングされたプレートに添加した。解剖顕微鏡を使用して、５０細胞より多い細胞からなるコロニーをインキュベーションの１４〜２１日後に計測した。ＥＧＦ処置のために、ＦＢＳを培地から排除した。
【０１８２】
細胞サイクル分析。細胞サイクル分布をＦＡＣＳ分析によって決定した。これらの試験のために、指数的に増殖する単一層から集められた細胞ペレットを、０．５％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄し、１００％エタノールで１５分間固定した。固定された細胞をＲＮａｓｅＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で３０分処置し、プロピジウムヨージド（０．０５ｍｇ／ｍｌ）で染色した。異なる段階の細胞サイクルにおける細胞の比率を、実験的蛍光ヒストグラムから計算した。
【０１８３】
ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮを用いたインビトロ処置。ＫＳＲ１ ＡＳ−ＯＤＮ（５’−ＣＴＴＴＧＣＣＴＣＴＡＧＧＧＴＣＣＧ−３’）（配列番号８）（ＡＳ−ＯＤＮ１（２１４〜２３１））及びＫＳＲセンス−ＯＤＮ（５’−ＣＧＧＡＣＣＣＴＡＧＡＧＧＣＡＡＡＧ−３’）（配列番号１５）を、ＫＳＲ１の固有のＣＡドメイン（アミノ酸（ＡＡ）４２〜８２）のヌクレオチド２１４〜２３１（配列番号１）（Ｇｅｎｅｌｉｎｋ Ｉｎｃ．（Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，ＮＹ））に対して、ホスホロチオエート誘導体として作成した。コントロールＯＤＮ（５’−ＣＡＣＧＴＣＡＣＧＣＧＣＧＣＡＣＴＡＴＴ−３’）（配列番号１６）を同様に調製した。インビトロ試験のために、ＯＤＮを滅菌水に溶解し、製造業者の指示に従って、細胞が３０〜４０％密集度になった場合に、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって細胞に送達した。細胞増殖を所定の時間点でアッセイした。処置４８時間後、浸潤及び形質転換アッセイを上述のように設定した。いくつかの試験のために、コントロール−及びＡＳ−ＯＤＮ−処置されたＰＡＮＣ−１細胞を優性ポジティブのＲＳＶ−Ｒａｆ−ＢＸＢ（Ｄｒ．Ｊｏｓｅｐｈ Ｂｒｕｄｅｒ，ＮＣＩによって親切にも提供された）でトランスフェクトした。
【０１８４】
ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮを用いた腫瘍誘発及びインビボ処置。腫瘍誘発のために、１０^６の培養された腫瘍細胞を０．１ｍｌのＰＢＳ中で懸濁させるか、又は順次継代した種腫瘍から新しく収穫した５０ｍｇの腫瘍フラグメントを、６〜８週齢のオス胸腺欠損ＮＣＲｎｕ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）の右横腹に皮下移植した。腫瘍増殖を１日おきにカリパスで測定し、腫瘍体積を記載されるように計算した（４２）。Ａ４３１腫瘍形成に対するＫＳＲ−Ｓの特異性を決定するために、ＫＳＲ−Ｓ腫瘍を有するマウスのグループにＤｏｘ含有水（１００ｍｇ／ｍｌ）を与えた。ＫＳＲ−ＡＳ ＯＤＮの抗腫瘍活性をインビボで決定するために、Ａｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプを介したセンス−、コントロール−、又はＡＳ−ＯＤＮを用いた注入を、腫瘍移植の２日前か、又は腫瘍が１００〜１５０ｍｍ^３に到達した場合かのいずれかに開始した。５．０〜７５ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量範囲のＯＤＮを、同様のインビボでのＡＳ試験に基づいて選択した（３４、４４）。
【０１８５】
Ｒａｓ活性化アッセイ。コントロールＯＤＮ又はＡＳ−ＯＤＮ処置されたＰＡＮＣ−１細胞又は腫瘍におけるＲａｓ活性化状態（ＧＴＰ−Ｒａｓ）を、記載されるように製造業者の指示に従って、Ｒａｓ活性化アッセイキット（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を用いて測定した（４５）。
【０１８６】
統計分析。全てのデータは、スチューデントのｔ検定（両側）によってｐ＜０．０５とみなし有意性を有して評価された。
【０１８７】
【化５−１】

【０１８８】
【化５−２】

【０１８９】
【化５−３】

【０１９０】
【化５−４】

。
【０１９１】
（実施例３）
さらなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し、表１に示されるようなＡ４３１細胞における増殖アッセイにおいて試験した。アンチセンスヌクレオチド及びそれらの配列を基準に基づいて（ハイブリダイゼーション条件に基づいて）選択し、安定なホモダイマーを形成せず、ヘアピンループを形成せず、自己相補性配列を形成せず、及び安定な二本鎖を形成しなかった（＜−６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。オリゴ４プログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）を用いて配列を選択し、その後、Ｏｌｉｇｏ Ｔｅｃｈプログラム（Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）を用いて検証した。ＫＳＲ ＣＡ１ドメインのヌクレオチド１５１〜１６８に対してアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ（１５１〜１６８））（ＡＳオリゴ配列５’−ＣＡＧＣＣＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＧＣＣ−３’）（配列番号６）及びヌクレオチド１８１〜１９８（ＡＳ−ＯＤＮ２（１８１〜１９８））（ＡＳオリゴ配列５’−ＧＡＧＧＴＣＧＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’）（配列番号７）を生成した（両方ともＰ−Ｓオリゴヌクレオチドであった）。これらのオリゴヌクレオチドを、実施例２に記載されるように、ヌクレオチド２１４〜２３１（ＡＳ−ＯＤＮ１（２１４〜２３１））（ＡＳオリゴ配列 配列番号８）に対するＡＳ−ＯＤＮオリゴヌクレオチドに沿って試験した。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれＫＳＲのＣＡ１ドメインのアミノ酸配列ＧＳＬＲＧＬ（配列番号１７）、ＡＶＳＮＤＬ（配列番号１８）及びＲＴＬＥＡＫ（配列番号１９）をコードする核酸の逆相補体をあらわす。Ａ４３１細胞を所定量のＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮでトランスフェクトし、細胞増殖を処置７２時間後に評価した。Ａ４３１細胞増殖に対するＡＳ−ＯＤＮの効果をビヒクル処置された（オリゴフェクタミン単独）の阻害割合としてあらわした。これは、４つの類似の試験のうちの１つの代表例である。
【０１９２】
【表１】

（実施例４）
ｇｆ Ｒａｓシグナル形成の媒介におけるＫＳＲ１の特異性を確立するために、十分に特性決定されたヒト慢性骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２を使用した。Ｋ５６２は、Ｂｃｒ−ａｂｌにより開始され、それ故に、ｇｆ Ｒａｓシグナル形成から独立している。ＡＳ―ＯＤＮ処置によるＰＡＮＣ−１細胞増殖の特異的及び用量依存性阻害は、図１３に示される。ＰＡＮＣ−１及びＫ５６２細胞を所定用量のコントロール−またはＡＳ−ＯＤＮを用いて処置し、細胞増殖アッセイを行なった（図１３Ａ）。ＡＳ−ＯＤＮ−１及びＡＳ−ＯＤＮ−２は、それぞれｋｓｒ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド２１４〜２３１及び１８１〜１９８に対応する。ＰＡＮＣ−１細胞増殖は予想されるように阻害されるが、Ｋ５６２細胞増殖はＯＤＮ処置によって影響を受けなかった。５μＭのＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮ−１を用いたＫ５６２細胞の処置は、ウェスタンブロット分析によって決定される場合、ＰＡＮＣ−１細胞において観察されたものに対して内因性ＫＳＲ１遺伝子発現のかなりの減少（８０％を超える）を誘発した（図１３Ｂ）。それにもかかわらず、増殖の阻害はＰＡＮＣ−１細胞においてのみ観察された（図１３Ａ）。ゲル類の等しい負荷が全Ｐ４４／４２ＭＡＰＫを用いて確認された。ウェスタンブロットのためのポジティブコントロールとして役立つ精製されたＦｌａｇ−ＫＳＲは、Ｆｌａｇ−タグに起因する内因性ＫＳＲよりもわずかに遅く移動する（図１３Ｂ）。これらの結果は、ｇｆ Ｒａｓシグナル形成がＫＳＲ１に対して特異的にカップリングするという証拠を与える。
【０１９３】
（実施例５）
ヒトＫＳＲ１の全長ｍＲＮＡ配列が決定された。この配列を図１４に示す（配列番号２４）。アンチセンスオリゴヌクレオチド（上述のものを含む）をヒトＫＳＲ核酸のＣＡ１ドメインに対して設計した。ヒトＫＳＲアンチセンスオリゴヌクレオチドを、図１５において注釈を付けられたヒトＫＳＲ配列上に示した。ヒト配列のヌクレオチド１８７〜２０４に対する、オリゴヌクレオチドＡＳ−ＯＤＮ１（１８７〜２０４）（５’ＣＴＴＴＧＣＣＴＣＴＡＧＧＧＴＣＣＧ３’）（配列番号２８）は、上述のＡＳ−ＯＤＮ１（２１４〜２３１）（配列番号８）に対する配列に対応する。このように、ＡＳ−ＯＤＮ１は、それぞれヒト及びマウスｃＤＮＡの位置１８７〜２０４及び２１４〜２３１でのヌクレオチドに対して相補的である。ヒト配列のヌクレオチド１２４〜１４１に対するオリゴヌクレオチドＡＳ−ＯＤＮ３（１２４〜１４１）（５’ＣＡＧＣＣＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＧＣＣ３’）（配列番号２９）は、上述のＡＳ−ＯＤＮ１（１５１〜１６８）（配列番号６）に対する配列に対応する。このように、ＡＳ−ＯＤＮ３は、それぞれヒト及びマウスｃＤＮＡ配列の位置１２４〜１４１及び１５１〜１６８でのヌクレオチドに対して相補的である。オリゴヌクレオチドＡＳ−ＯＤＮ２（１５４〜１７１）は、ヒト配列のヌクレオチド１５４〜１７１に対して設計される。ＡＳ−ＯＤＮ２は、それぞれヒト及びマウスｃＤＮＡの位置１５４〜１７１及び１８１〜１９８でのヌクレオチドに対して相補的である。ヒト配列は、対応する位置でのマウス配列からのアンチセンス配列のほぼ５’ｂｐにおいて１個の塩基対が異なり、ヒトＡＳ−ＯＤＮ２（１５４〜１７１）配列が５’ＧＡＧＧＴＣＧＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＣ３’（配列番号３０）であり、マウス配列が５’ＧＡＧＧＴＣＧＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＡ３’（配列番号７）である（異なるヌクレオチドは太字で示される）。図１６は、所定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有する注釈を付けられたマウスＫＳＲ ｃＤＮＡ配列を示す。本願発明者らは、元々のＡＳ−ＯＤＮ２（１８１〜１９８）と修正されたヒトＡＳ−ＯＤＮ２（１５４〜１７１）とを比較し、それらがＰＡＮＣ−１細胞の増殖（腫瘍形成Ｋ−ｒａｓ依存性ヒト膵臓細胞であり、ほぼ同一である）を阻害することを発見した（図１８）。
【０１９４】
（実施例６）
本願発明者らは、ヒトＫＳＲ１の他のヌクレオチドに対するさらに潜在的なＡＳ−ＯＤＮを設計した。これらのＯＤＮ（ＡＳ−ＯＤＮ４〜ＡＳ−ＯＤＮ１２）が図１７に記載され、ヒトＫＳＲ１ヌクレオチド配列上に注釈が付けられた。表２は、これらの新しく設計されたＯＤＮと対応するヒトヌクレオチド標的配列のリストである。
【０１９５】
【表２】

。
【０１９６】
（実施例７）
（放射線増感剤としてのＫＳＲアンチセンスオリゴヌクレオチド）
（背景）
イオン化放射線（ＩＲ）はヒトの癌のための主要な処置であるが、放射線治療に対して応答しないことが、この種の有効性を制限する。蓄積された証拠は、細胞増殖及び分化の経路の類似したシグナル形質導入経路がＩＲ耐性を導くという主張を支持する。さらに特定的には、ｇｆ Ｒａｓを介するＥＧＦＲ／Ｒａｓ経路の構成的活性化又はＥＧＦＲの過剰活性化は、ヒト腫瘍細胞において放射線耐性を導く（１〜２７）。ＥＧＦＲ及びＲａｓのこの作用の基礎をなす正確な機構は十分に理解されていない。それ故に、ＩＲに対する応答におけるＥＧＦＲ及びＲａｓエフェクターシグナル形成の下流要素の同定は、ＩＲ処置のための機構に基づく治療ストラテジーの開発にとって重要である。ＥＧＦＲ及びＲａｓエフェクターシグナル形成経路の中で、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫ（１０、２８〜３２）及びＲａｓ−ＰＩ３−キナーゼ（３、３３、３４）経路は、ＩＲに対する放射能感受性のＥＧＦＲ／Ｒａｓ調整を媒介することに関与している。これらの２つのシグナル形成経路の相対的な寄与は、腫瘍の種類に特異的である場合がある。
【０１９７】
ＥＧＦＲ／Ｒａｓにより媒介される放射線耐性の基礎をなす潜在的な機構としては、以下のものが挙げられる：ＤＮＡ損傷修復の能力の増加、生存する腫瘍細胞の再増殖促進、ＩＲによって誘発されたアポトーシスに対する耐性、及びＩＲにより誘発される細胞サイクルチェックポイントの遅れがないこと。ＩＲにより誘発されるＥＧＦＲ／Ｒａｓ活性化は、ＭＡＰＫシグナル形成カスケードを介する用量依存性増殖応答の延長を生じ、少なくとも部分的に、増殖の促進の機構、放射能治療の失敗の原因に貢献する（４９、５０）。腫瘍細胞増殖のｇｆ ＥＧＦＲ／Ｒａｓ−Ｒａｆ−１−ＭＡＰＫシグナル形成の絶対的なメディエーターとして（５１）、ＫＳＲの失活は、生存する腫瘍細胞の再増殖の促進を阻止することによって、ＩＲ治療の効力を増加させる場合がある。
【０１９８】
ＥＧＦＲ及びＲａｓを介する放射線耐性を潜在的に媒介することに加えて、ＫＳＲはさらに、脂質の第２のメッセンジャーセラミドのためのシグナルを送ってもよい。生じたデータは、ＩＲがいくつかの細胞種の血漿膜に直接作用し、酸スフィンゴミエリナーゼを活性化し、スフィンゴミエリンの酵素的加水分解によってセラミドを生成することを示唆する。次いで、セラミドが、細胞種及び細胞の内容物に特異的なアポトーシス応答を開始又は阻害する第２のメッセンジャーとして作用する（１３、１５、３５〜３８）。ＥＧＦＲがＫＳＲ活性化を利用するチロシンキナーゼに基づく機構に加えて、セラミドはさらにＫＳＲを直接的に活性化してもよい。この観点では、ＫＳＲは、Ｋｏｌｅｓｎｉｃｋ及び共同開発者によってセラミド活性化タンパク質キナーゼ（ＣＡＰＫ）として同定された（３９）。セラミドが、ｃ−Ｊｕｎキナーゼ及び遺伝子産物（例えば、Ｆａｓリガンド又は死応答を媒介するＴＮＦα）の転写調整を介していくつかの細胞種においてアポトーシスをシグナル形成することができるが（１３、１４、４５）、アポトーシス前Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーＢＡＤを含有する他の細胞において、セラミドは、ＫＳＲ、ｃ−Ｒａｆ−１、及びＭＥＫ１の連続的なＲａｓ依存性活性化を含む機構を介してアポトーシスを直接誘発する（４４、４６〜４８）。この場合には、１個の標的（例えばＢＡＤ（４４））の利用可能性は、通常は増殖性及び／又は抗アポトーシス性であるＭＡＰＫカスケードをアポトーシス前シグナル経路に変換する。それ故に、ＫＳＲは、細胞種に特異的な様式でセラミド依存性及び非依存性アポトーシス応答の調整によって、放射線感受性を調整する場合がある。ＫＳＲがアポトーシスのいくつかの形態が生じるのを防止し得るという概念を支持して、Ｐｏｌｋ及び共同開発者らは、ＹＡＭＣ直腸細胞におけるＫＳＲの失活が、ＴＮＦレセプターから出される抗アポトーシスシグナルを拮抗し、ＴＮＦをこれらの細胞におけるアポトーシスのインデューサーに変換することを示した（４１、４２）。
【０１９９】
本実施例では、本願発明者らは、このストラテジーを放射線感受性に導くことができる法則における証拠としてＥＧＦＲ／Ｒａｓ経路の失活に研究を限定する。この意見を調べるために、本願発明者らは、（上に記載されるような）ＫＳＲ機能を薬理学的に阻害するために、ＫＳＲに特異的なＡＳ−ＯＤＮを合成し、Ａ４３１細胞を使用し、これは、活性化されたＥＧＦＲの１００倍の過剰発現によって野生型Ｒａｓを介して開始される。インビトロで試験される場合、ＡＳ−ＯＤＮは、核内で特異的に採取され、内因性ＫＳＲ遺伝子発現を減少させ、Ａ４３１増殖、浸潤、形質転換及び腫瘍形成を阻害した（実施例２参照）。さらに、本願発明者らは、遺伝的（ＫＳＲ−ＡＳの発現）又は薬理学的（ＡＳ−ＯＤＮ）なアプローチを介するＫＳＲの失活により、Ａ４３１細胞がＩＲにより誘発されるインビトロでのアポトーシスに対して感受性になることを示す。
【０２００】
（結果）
ＡＳ−ＫＳＲ及びＤＮ Ｋｉ−ＫＳＲがＡ４３１細胞をＩＲにより誘発されるアポトーシスに対して感受性にする：
ＫＳＲの失活がＩＲにより誘発される細胞死に対する感受性を高めるという仮説を試験するために、異なるＫＳＲ構築物で安定にトランスフェクトされたＡ４３１細胞を、ＩＲにより誘発されるアポトーシスに対する感受性について分析した。活性化されたＥＧＦＲの過剰発現に起因して、Ａ４３１細胞は、放射線耐性であることが知られている（４３）。血清不足のＡ４３１細胞を２０Ｇｙの単一線量で照射し、ＩＲ２４時間後にアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いたフローサイトメトリーによってアポトーシスを決定した。図１９は、野生型Ｆｌａｇ−ＫＳＲ（ＫＳＲ−Ｓ）を発現するＡ４３１細胞は、最小限のＩＲにより誘導されるアポトーシスを示したことを示す。Ｆｌａｇ−ＡＳ−ＫＳＲ（ＫＳＲ−Ｓ）又は優性ネガティブＦｌａｇ−Ｋｉ−ＫＳＲ（Ｋｉ−ＫＳＲ）の放射線感受性化されたＡ４３１細胞の発現は、ＩＲにより誘発されるアポトーシスをかなり増加させた（ｎ＝３）。ほぼ４０％のＡ４３１−ＫＳＲ−ＡＳ及びＫｉ−ＫＳＲ細胞は、ＩＲの２４時間後にアポトーシスを受けた。これらの結果は、予備的ではあるが、ＫＳＲがＩＲに対する細胞感受性において鍵となる役割を果たし得ることを強力に示唆する。アポトーシスがビスベンズイミド染色で計測される場合に、匹敵する結果が得られた。
【０２０１】
ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮはＩＲにより誘発されたアポトーシスに対してＡ４３１細胞を感受性にする：上述のように、遺伝的アプローチ（ＡＳ−ＫＳＲ及びＤＮ−Ｋｉ−ＫＳＲ）によるＫＳＲ機能の阻止は、ＩＲにより誘発されたアポトーシスに対してＡ４３１細胞を感受性にした。放射線感受性に対するＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１遺伝子発現の薬理学的阻害の有効性を試験するために、ＩＲ前に、Ａ４３１細胞を２００ｎＭのＡＳ−２１４２３１で３６時間処置した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いたフローサイトメトリーによってアポトーシスを定量した。図２０に示されるように、ＡＳ−２１４２３１はＡ４３１細胞を感受性にし、７２時間後にＩＲにより誘発されるアポトーシスにおいて２倍増加させた。この効果の大きさは、ＡＳ−ＫＳＲの過剰発現で観察されたものと匹敵する。対照的に、コントロールＯＤＮは、ＩＲにより誘発されたアポトーシスに対して放射線感受性に対してなんら効果を有さなかった。使用されるオリゴフェクタミンの濃度で、基礎レベルのアポトーシスの顕著な増加は検出されなかったことを注記すべきである（図示せず）。これらの結果は、ＡＳ−２１４２３１の放射線感受性にする効果は、ＫＳＲ配列特異性であり、放射線感受性剤としてＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮを使用することが可能であることを示す。
【０２０２】
ＫＳＲ−ＡＳによるＫＳＲ１の失活は、ＩＲにより誘発されたクローン原性の生存に対してＡ４３１細胞を阻害する：Ａ４３１細胞でＫＳＲ１がイオン化放射線の致死作用に関与しているか否かを評価するために、ＫＳＲ−Ｓ−及びＫＳＲ−ＡＳ−トランスフェクトされたＡ４３１細胞のクローン原性の生存を、放射線暴露の線量を増加させた後に決定した。Ａ４３１−ｐＴＲＥ、ＫＳＲ−Ｓ及びＫＳＲ−ＡＳ細胞をそれぞれ３．４×１０^４、１．４×１０^４、又は７．０×１０^３細胞／ｃｍ^２の接種密度で６０ｍｍ皿に４日間接種し、８５％密集度に到達させた。照射の前に、培地を、０．２％ヒトアルブミンを含有する無血清細胞増殖培地と２０〜２４時間交換した。次いで、６０^Ｃｏ源を用いて、培養物を１〜１５Ｇｙの放射線に２．２４Ｇｙ／分の線量速度でさらした。次いで、培地を再び、１０％のＴｅｔで認可されたＦＢＳを含有する新しい増殖培地とさらに２４時間交換した。その後、細胞をトリプシン化によって収穫し、クローン原性生存アッセイを標準的な手順を用いて行なった。細胞を異なる希釈度で接種し、各放射線線量について６０ｍｍ培養皿あたり２５〜８０コロニーを作成し、５％ＣＯ_２中３７℃で１２日間インキュベートし、５０を超える細胞を含有するコロニーをクリスタルバイオレットで染色して、生存フラクションを決定した。図２１は、ＫＳＲ−Ｓの過剰発現がＡ４３１−ｐＴＲＥコントロールと比較した場合に、少し放射線耐性が高められ、これは線量−生存曲線の肩幅（Ｄ_ｑ）の増加と関係があり、傾斜（Ｄ_０）には顕著な変化がなかったことを示す。対照的に、ＫＳＲ−ＡＳによるＫＳＲ１の失活は、Ａ４３１細胞を顕著に放射線感受性にし、このことは、線量−生存曲線の肩の完全な消失及びＤ_０の減少によって明らかにされた。ＫＳＲ失活の際の１０％生存率（Ｄ_１０）での線量改変因子（ＭＤＦ）は２．４４であった。これらの結果は、ＫＳＲ１が放射線により誘発される細胞死を阻止するのに必須であり、ＫＳＲ１が放射線感受性にするための新規な分子標的をあらわすことを示す。
【０２０３】
【化６−１】

【０２０４】
【化６−２】

【０２０５】
【化６−３】

【０２０６】
【化６−４】

【０２０７】
【化６−５】

【０２０８】
【化６−６】

。
【０２０９】
（実施例８）
（ＫＳＲ１による血管形成の調整）
背景：血管形成（先に存在する脈管系からの新規な血管の形成）は、通常の成長、創傷治癒の組織再生及び虚血後の組織修復中に重要な役割をはたす。それに加えて、血管形成は、腫瘍増殖、進行及び散布に対して主要である^{ａ、ｂ、ｃ、ｄ}。新しい血管の成長及び成熟は非常に複雑に組み合わされたプロセスであり、多くのリガンドによる一連のレセプターの連続的な活性化を必要とする^ｅ、ｆ。血管内皮成育因子（ＶＥＧＦ）は、血管形成の鍵となるレギュレーターである。ＶＥＧＦシグナル形成は、２つのレセプターチロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２によって媒介され、生理学的血管形成（胚形成、骨格成長及び再生機能）においてだけではなく、病理学的血管形成（例えば腫瘍増殖に関連するもの^ｇ）においても重要な律速段階である。
【０２１０】
選択的ｍＲＮＡスプライシングで、ヒトＶＥＧＦ遺伝子は、シグナル配列の開裂後にそれぞれ１２１、１６３、１８９、及び２０１アミノ酸を有する４つの主なＶＥＧＦイソ型（ＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_１８９、及びＶＥＧＦ_２０１）を生じる^ｈ、ｉ。ＶＥＧＦ_１２１が遊離の拡散性タンパク質であり、ＶＥＧＦ_１８９、及びＶＥＧＦ_２０６はヘパリンについて高いアフィニティーを有し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でヘパリンを含有するプロテオグリカンにほとんど結合している^ｊ、ｋ。ＶＥＧＦ１６５（主要なイソ型）は分泌されるが、それでも、有意部分については、細胞表面又はＥＣＭに結合したままである^ｋ。ＶＥＧＦの生物学的機能は、２つのレセプターチロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１としても知られる）及びＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１又はＫＤＲとしても知られる）によって媒介される。ＶＥＧＦＲ−２は、内皮細胞の有糸分裂誘発及び生存、血管形成及び微小血管透過のＶＥＧＦシグナル形成の主なメディエーターである。対照的に、ＶＥＧＦＲ−１は、分裂促進シグナルを効果的に送らない。ＶＥＧＦを封鎖することによってＶＥＧＦＲ−２活性を阻害し、ＶＥＧＦＲ−２に結合するのを妨害する。それに加えて、ＶＥＧＦＲ−１は脈管床から組織特異的な増殖因子の放出を調整する^ｆ。
【０２１１】
ＶＥＧＦの遺伝子発現をしっかりと調整する。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現は、低酸素又は酸素圧に応答した低酸素症により誘発される因子（ＨＩＦ）を介して上方調整される^ｌ。それに加えて、レセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦＲ）の過剰活性化又はＲａｓの腫瘍形成活性化は、ＶＥＧＦ発現の転写上方調整を導く^ｇ、ｍ。さらに、ＤｅＰｉｎｈｏ及び同僚は、近年、腫瘍形成Ｈ−Ｒａｓシグナル形成がＶＥＧＦ産生及び内皮細胞生存の調整を介して黒色腫腫瘍の維持のために必須であることを示す^ｎ。さらに、血管形成におけるＲａｓ−Ｒａｆ−１の重要性は、Ｒａｆ−１が内部及び外部アポトーシス刺激に応答して脈管の生存を与えるというＣｈｅｒｅｓｈ及び共同研究者の観察によって強められた^ｏ。
【０２１２】
血管形成におけるＶＥＧＦの重要性は、癌処置のための治療標的として確立し、種々のＶＥＧＦインヒビターの臨床的開発を導いた。１９９３年に、ＶＥＧＦを標的化したモノクローナル抗体が腫瘍増殖をインビボで顕著に抑制し^ｐ、これによりこのＶＥＧＦ抗体のヒト化改変体であるベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を抗癌剤として開発した。転移性結直腸癌のもっとも重要な治療としてのベバシズマブのＵＳ ＦＤＡによる最近の承認は、ＶＥＧＦが腫瘍血管形成の鍵となるメディエーターであり、血管形成をブロックすることがヒトの癌を処置するのに有効なストラテジーであるという考えが正等であることを証明する^ｑ。
【０２１３】
結果：ＫＳＲ１はＡ４３１細胞においてＶＥＧＦ産生のために必要とされる
ＫＳＲ１が腫瘍形成の機能獲得Ｒａｓシグナル形成の重要なメディエーターであるため^ｒ、ｓ、本願発明者らは、本願発明者らにより以前に特性決定された^ｓＡ４３１−ｐＴＲＥ−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ−ＫＳＲ細胞株における、ＥＧＦにより刺激されるＶＥＧＦ産生におけるＫＳＲ１の関係を評価した。これらの研究のために、Ａ４３１−ｐＴＲＥ−ＫＳＲ細胞をそれぞれ６×１０^５細胞（ｐＴＲＥ及びＫＳＲ−Ｓ細胞について）又は３×１０^５細胞（ＫＳＲ−ＡＳ及びＤＮ−ＫＳＲ細胞について）で６ウェル培養プレートに接種し、８０％密集度になるまで４８時間増殖させた。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＥＧＦの存在下（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）又は非存在下で１ｍｌの無血清培地中でさらに２４時間又は４８時間インキュベートした。所定の時間点で、ＶＥＧＦの分泌形態を含有する馴化培地を集め、細胞片を遠心分離によって除去し、さらなる特性決定を行なうまで−８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を行って、製造業者の指示に従って、ＶＥＧＦの全てのイソ型を認識する抗体を利用して、馴化培地中でＶＥＧＦの可溶性形態を測定した。図２２は、約４００ｐｇ／ｍｌ／１０^５細胞のＶＥＧＦがＡ４３１−ｐＴＲＥ細胞から２４時間かけて分泌されることを示し、これは、文献において報告された値と一致している^ｔ。Ａ４３１−ＫＳＲ−Ｓ細胞におけるＦｌａｇ−ＫＳＲ１の過剰発現は、Ａ４３１−ｐＴＲＥ細胞の場合と比較して、基礎となるＶＥＧＦ産生を３倍増加させる。対照的に、ＫＳＲ−ＡＳ又は優性ネガティブのＫＳＲ１突然変異（ＤＮ−ＫＳＲ１）のいずれかによるＫＳＲ１の失活は、試験されるすべての時間点でベースラインＶＥＧＦ分泌を阻止した。さらに、トランスフェクトされていないＡ４３１細胞又はＡ４３１−ｐＴＲＥ及びＫＳＲ−Ｓ細胞におけるＶＥＧＦが１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ処置を用いた刺激によってさらに増加する一方、Ａ４３１−ＫＳＲ１−ＡＳ及びＡ４３１−ＤＮ−ＫＳＲ１細胞はＥＧＦ刺激に対する応答がなかった。低用量のＥＧＦで刺激された場合、同様の結果が観察された。これらの結果は、ＫＳＲ１がベースライン及びインビトロでのＥＧＦにより誘発されたＶＥＧＦリガンド産生に必須であり、ＫＳＲ１が病理学的血管形成（例えば癌）と関連する状態を処置するための抗−血管形成治療のための新しい標的をあらわし得ることを示唆する。さらなる試験により、Ａ４３１細胞におけるインビトロでの、Ａ４３１腫瘍異種移植片におけるインビボでのＶＥＧＦ発現の阻害におけるＫＳＲ１ ＡＳ−ＯＤＮの有効性を評価する。
【０２１４】
【化７】

。
【０２１５】
本発明は、他の形態において実施されてもよく、又はそれらの精神又は必須の特徴から逸脱することなく他の様式で行なわれてもよい。それ故に、本開示は、全ての局面において例示的であり制限的ではないものとみなされ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって示され、その意味の中にある全ての変化及び等価体の範囲は、本発明に包含されることが意図される。
【０２１６】
種々の参考文献は、本明細書全体にわたって引用され、これらはそれぞれ、その全体において参考として本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１Ａ】図１は、マウスにおけるｋｓｒ遺伝子の標的化された破壊を示す。Ａ、ｋｓｒ対立遺伝子を標的化するためのストラテジー。野生型ｋｓｒ対立遺伝子、標的化ベクター、及び変異した対立遺伝子の５’領域の単純化された制限マップが示される。内因性ｋｓｒを用いた相同組換えは、内部の１．１−ｋｂ ＳｍａＩ−ＳｐｅＩゲノムフラグメントとＮｅｏカセットとを交換する。脳が、わずかに短いＢ−ＫＳＲ１イソ型を発現する一方、肺及び脾臓は、より長いＫＳＲ１イソ型を発現することに注記する。さらに、溶解物をｋｓｒ^＋／＋、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦの２つの独立したセットから調製した。抗−α−チューブリン抗体を用いたブロットを再プローブ化することによって、等しいローディングが確認された。
【図１Ｂ】図１は、マウスにおけるｋｓｒ遺伝子の標的化された破壊を示す。Ｂ、標的化構築物の正しい挿入を示すＥＳクローンのサザンブロット分析。ＥＳ細胞から単離されたゲノムＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで消化し、Ａに示されるようなｋｓｒ標的化領域の５’アームのすぐ外側に位置する５’プローブにハイブリダイズした。野生型対立遺伝子は５．７−Ｋｂフラグメントを与え、一方、変異対立遺伝子は３．１−ｋｂフラグメントを与える。脳が、わずかに短いＢ−ＫＳＲ１イソ型を発現する一方、肺及び脾臓は、より長いＫＳＲ１イソ型を発現することに注記する。さらに、溶解物をｋｓｒ^＋／＋、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦの２つの独立したセットから調製した。抗−α−チューブリン抗体を用いたブロットを再プローブ化することによって、等しいローディングが確認された。
【図１Ｃ】図１は、マウスにおけるｋｓｒ遺伝子の標的化された破壊を示す。Ｃ、ＰＣＲによるｋｓｒ^−／−マウスの遺伝子型特定。ＰＣＲ産物のサイズは野生型対立遺伝子について４９３ｂｐであり、変異した対立遺伝子について３１２ｂｐである。脳が、わずかに短いＢ−ＫＳＲ１イソ型を発現する一方、肺及び脾臓は、より長いＫＳＲ１イソ型を発現することに注記する。さらに、溶解物をｋｓｒ^＋／＋、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦの２つの独立したセットから調製した。抗−α−チューブリン抗体を用いたブロットを再プローブ化することによって、等しいローディングが確認された。
【図１Ｄ】図１は、マウスにおけるｋｓｒ遺伝子の標的化された破壊を示す。Ｄ、野生型マウス胚におけるｋｓｒの発現。２つの転写物のサイズは６．４ｋｂ及び７．４ｋｂである。脳が、わずかに短いＢ−ＫＳＲ１イソ型を発現する一方、肺及び脾臓は、より長いＫＳＲ１イソ型を発現することに注記する。さらに、溶解物をｋｓｒ^＋／＋、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦの２つの独立したセットから調製した。抗−α−チューブリン抗体を用いたブロットを再プローブ化することによって、等しいローディングが確認された。
【図１Ｅ】図１は、マウスにおけるｋｓｒ遺伝子の標的化された破壊を示す。Ｅ、組織ｋｓｒ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析。成体のｋｓｒ^＋／＋、ｋｓｒ^＋／−、ｋｓｒ^−／−マウスの異なる組織から単離されたポリ−Ａ^＋ＲＮＡを、ｋｓｒ ｃＤＮＡにおけるドメインＣＡ２〜ＣＡ４に対応するプローブでハイブリダイズした。ＮＩＨ３Ｔ３細胞由来のｍＲＮＡをコントロールとして使用した。脳が、わずかに短いＢ−ＫＳＲ１イソ型を発現する一方、肺及び脾臓は、より長いＫＳＲ１イソ型を発現することに注記する。さらに、溶解物をｋｓｒ^＋／＋、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦの２つの独立したセットから調製した。抗−α−チューブリン抗体を用いたブロットを再プローブ化することによって、等しいローディングが確認された。
【図１Ｆ】図１は、マウスにおけるｋｓｒ遺伝子の標的化された破壊を示す。Ｆ、ＫＳＲタンパク質発現。野生型及びｋｓｒ^−／−組織から調製した溶解物を、特定の抗−ＫＳＲモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。脳が、わずかに短いＢ−ＫＳＲ１イソ型を発現する一方、肺及び脾臓は、より長いＫＳＲ１イソ型を発現することに注記する。さらに、溶解物をｋｓｒ^＋／＋、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦの２つの独立したセットから調製した。抗−α−チューブリン抗体を用いたブロットを再プローブ化することによって、等しいローディングが確認された。
【図２】図２は、生まれたてのｋｓｒ^−／−マウスにおける皮膚表現型を示す。１０日齢のｋｓｒ^＋／＋、ｋｓｒ^−／−、及びｅｇｆｒ^−／−マウスの皮膚全体の厚みの切断物を４〜６μｍ厚に切断し、ガラススライド上に置き、ヘマトキシリン−エオジンで染色した。ｓ−曲がりくねっている、ｂｌ−水膨れ、ｄｏ−方向性なし。
【図３Ａ】図３は、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦにおけるＥＧＦ−及びＴＰＡ−により誘導されるＭＡＰＫシグナル形成及び増殖における欠損を示す。Ａ、ＥＧＦ及びＴＰＡ処置の際のＭＡＰＫ活性のウェスタンブロット分析。ｋｓｒ^＋／＋及びｋｓｒ^−／−から誘導される低継代ＭＥＦは、血清を含まない培地中で４８時間インキュベーションすることによって鎮静され、低用量のＥＧＦで３分間（上のパネル）又はＴＰＡで１０分間（下のパネル）で刺激された。細胞をＮＰ４０バッファー中で溶解し、ＭＡＰＫカスケードの活性化を、ＭＡＰＫの活性化形態（ＥＲＫ１／２）について抗−ホスホロに特異的な抗体を用いてウェスタンブロットによって試験した。４つの独立した実験の１つからの代表的なブロットが示される。
【図３Ｂ】図３は、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦにおけるＥＧＦ−及びＴＰＡ−により誘導されるＭＡＰＫシグナル形成及び増殖における欠損を示す。Ｂ、ＥＧＦ（上のパネル）及びＴＰＡ（下のパネル）処置の際の内因性Ｒａｆ−１の活性化を、方法において本明細書中に記載されるようなＲａｆ−１活性アッセイによって決定した。ＭＥＫ１ホスホリル化を、ＭＥＫ１の活性化形態について抗−ホスホに特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって試験した。１又は４つの独立した実験から代表的なブロットが示される。
【図３Ｃ】図３は、ｋｓｒ^−／−ＭＥＦにおけるＥＧＦ−及びＴＰＡ−により誘導されるＭＡＰＫシグナル形成及び増殖における欠損を示す。Ｃ、ＭＥＦの増殖。０．１５×１０^６のｋｓｒ^＋／＋及びｋｓｒ^−／−低継代ＭＥＦを、６０ｍｍプレートに接種し、方法において記載されるように増殖させた。細胞を１日おきにトリプシン化し、血球計によって計数した。データ（平均±ＳＤ）を、３つの独立実験から編集する。
【図４Ａ】図４。ｋｓｒ^−／−マウスにおける、ｋｓｒ遺伝子の破壊によって阻止された腫瘍形成Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成。Ａ、Ｔｇ．ＡＣ／ｋｓｒ^＋／＋及びＴｇ．ＡＣ／ｋｓｒ^−／−マウスの表皮から単離された全ＲＮＡ由来のν−Ｈａ−ｒａｓ発現、その後のＴＰＡ処置によるＲＴ−ＰＣＲ検出。ν−Ｈａ−ｒａｓ導入遺伝子の３’ＵＴＲ領域について特異的なイントロンにわたるプライマーを使用した。さらに大きな２７９ｂｐ単位複製配列は、逆転写酵素［ＲＴ（−）］の非存在下で検出され、ＤＮＡ及びスプライシングされていないＲＮＡから誘導される。さらに小さな２１４ｂｐ単位複製配列は、スプライシングされたｍＲＮＡから誘導され、導入遺伝子発現を示す。
【図４Ｂ】図４。ｋｓｒ^−／−マウスにおける、ｋｓｒ遺伝子の破壊によって阻止された腫瘍形成Ｒａｓにより媒介される腫瘍形成。Ｂ、遺伝子型に従って分けられたマウス（１０／グループ）を、１５週間、５μｇのＴＰＡで週に２回処置した。乳頭腫を、２０週間、週に１度計測した。
【図５Ａ】図５。誘発性Ａ４３１−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ−ｐＴＲＥ−ＫＳＲ細胞。Ａ及びＢ、野生型Ｆｌａｇ−ＫＳＲ−Ｓ及びＦｌａｇ−ＤＮ−ＫＳＲ発現（Ａ）、及びＫＳＲ−ＡＳによる内因性ＫＳＲ１発現の阻害（Ｂ）のウェスタンブロット分析。Ｆｌａｇ−ＫＳＲ−Ｓ及びＤＮ−ＫＳＲは、モノクローナル抗−Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体で免疫沈降（ＩＰ）され、ＷＢによって検出された。Ｆｌａｇ−ＫＳＲの同一性は、モノクローナル抗−ＫＳＲ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で再プローブ化することによって確認された。内因性ＫＳＲ１を方法において記載されるように免疫沈降し、上述のように検出した。
【図５Ｂ】図５。誘発性Ａ４３１−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ−ｐＴＲＥ−ＫＳＲ細胞。Ａ及びＢ、野生型Ｆｌａｇ−ＫＳＲ−Ｓ及びＦｌａｇ−ＤＮ−ＫＳＲ発現（Ａ）、及びＫＳＲ−ＡＳによる内因性ＫＳＲ１発現の阻害（Ｂ）のウェスタンブロット分析。Ｆｌａｇ−ＫＳＲ−Ｓ及びＤＮ−ＫＳＲは、モノクローナル抗−Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体で免疫沈降（ＩＰ）され、ＷＢによって検出された。Ｆｌａｇ−ＫＳＲの同一性は、モノクローナル抗−ＫＳＲ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で再プローブ化することによって確認された。内因性ＫＳＲ１を方法において記載されるように免疫沈降し、上述のように検出した。
【図５Ｃ】図５。誘発性Ａ４３１−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ−ｐＴＲＥ−ＫＳＲ細胞。Ｃ、ドキシサイクリンによるＦｌａｇ−ＫＳＲ−Ｓ発現の用量依存性阻害。ＫＳＲ−Ｓ細胞を所定の用量のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）で２４時間処置し、Ｄｏｘ処置の後のＦｌａｇ−ＫＳＲ−Ｓ発現を、上述のようにＷＢによって決定した。
【図５Ｄ】図５。誘発性Ａ４３１−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ−ｐＴＲＥ−ＫＳＲ細胞。Ｄ及びＥ、ＫＳＲ−ＡＳ又はＤＮ−ＫＳＲによるＫＳＲ１の失活により形態の変更を生じ（Ｄ）、多核性の表現型の成長を生じる（Ｅ）。Ａ４３１−ｐＴＲＥ細胞を、位相差顕微鏡の下で試験し、細胞形態（Ｄ）について２０倍の拡大で撮影し、多核性形成（Ｅ）について４０倍の拡大で撮影した。
【図５Ｅ】図５。誘発性Ａ４３１−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ−ｐＴＲＥ−ＫＳＲ細胞。Ｄ及びＥ、ＫＳＲ−ＡＳ又はＤＮ−ＫＳＲによるＫＳＲ１の失活により形態の変更を生じ（Ｄ）、多核性の表現型の成長を生じる（Ｅ）。Ａ４３１−ｐＴＲＥ細胞を、位相差顕微鏡の下で試験し、細胞形態（Ｄ）について２０倍の拡大で撮影し、多核性形成（Ｅ）について４０倍の拡大で撮影した。
【図６Ａ】図６。ＫＳＲ１の失活は、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦにより刺激された生体反応を阻止する。Ａ、（ｉ）ＥＦＧ刺激なし及び（ｉｉ）ＥＦＧ刺激ありでの細胞増殖アッセイ。増殖アッセイを方法において記載されるように行なった。
【図６Ｂ】図６。ＫＳＲ１の失活は、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦにより刺激された生体反応を阻止する。Ｂ、Ａ４３１−ｐＴＲＥ細胞の細胞サイクル分布を方法において記載されるようにＦＡＣＳ分析によって決定した。細胞周期の異なる段階の細胞の比率を、実験的な蛍光ヒストグラムから算出した。
【図６Ｃ】図６。ＫＳＲ１の失活は、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦにより刺激された生体反応を阻止する。Ｃ、ＥＧＦ刺激に応答するマトリゲル浸潤分析。Ａ４３１細胞浸潤についてＫＳＲ−Ｓの過剰発現の刺激効果を最適化するために、アッセイを１２時間後に終了させた（ｉ）。Ａ４３１細胞浸潤についてＫＳＲ−ＡＳ及びＤＮ−ＫＳＲの阻害効果を最大化するために、アッセイを１８時間後に終了させた（ｉｉ）。
【図６Ｄ】図６。ＫＳＲ１の失活は、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦにより刺激された生体反応を阻止する。Ｄ、ＥＧＦ刺激に応答する軟質寒天コロニー形成アッセイを、方法におけるように行なった。それぞれの細胞株又は処置のために、４プレートを計測した。これらの結果は、４個の同様の試験のうち１個をあらわす。
【図７Ａ】図７。ＫＳＲ１の失活はＡ４３１腫瘍形成を防ぐ。Ａ、Ａ４３１腫瘍の増殖曲線。方法において記載されるように、１０^６のＡ４３１−ｐＴＲＥ細胞をヌードマウスに皮下で注射した。Ａ４３１腫瘍形成についてＫＳＲ−Ｓの特異性を決定するために、Ｄｏｘ（１００ｍｇ／ｍｌ）を、腫瘍移植の３日前に、ＫＳＲ−Ｓ腫瘍を有するマウスのグループの飲み水に添加し（ＫＳＲ−Ｓ＋Ｄｏｘ）、ＫＳＲ−Ｓ発現が中断するまで実験全体にわたって計測した。ＫＳＲ−ＡＳ及びＤＮ−ＫＳＲ細胞を受けるマウスを１２０日までモニタリングした。これらの結果は、３個の同様の実験のうち１つをあらわす。それぞれの実験グループに５匹ずつのマウスが存在した。
【図７Ｂ】図７。ＫＳＲ１の失活はＡ４３１腫瘍形成を防ぐ。Ｂ、Ａ４３１腫瘍のＨ＆Ｅ染色。ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋され、５ｍｍに切断されたＡ４３１−ｐＴＲＥ腫瘍断片を、方法において記載されるようにＨ＆Ｅを用いて染色した。（ｉ）及び（ｉｉ）における黒色の矢印は、扁平上皮細胞の分化を示す。（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）における黒色の矢印は、多核性腫瘍細胞を示し、（ｖ）は、多核性細胞の（ｉｉｉ）中のフレームフィールドの拡大である。
【図８Ａ】図８。ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１の失活は、Ａ４３１腫瘍形成を減らす。Ａ、１ｍＭのコントロール−又はＡＳ−ＯＤＮで処理した後の内因性ＫＳＲ１発現の免疫蛍光染色を、方法におけるように行なった。核をＤＡＰＩでカウンター染色した。蛍光標識の強度を比較するために、ＫＳＲ発現の全ての画像を同じ露光時間で行なった。
【図８Ｂ】図８。ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１の失活は、Ａ４３１腫瘍形成を減らす。Ｂ及びＣ、ＡＳ−ＯＤＮ処置による、Ａ４３１細胞増殖の用量依存性阻害（Ｂ）及び浸潤（Ｃ）。増殖アッセイのために、図３におけるように、３０％の融合性のＡ４３１細胞を所定用量のコントロール−又はＡＳ−ＯＤＮで処置した。ＯＤＮ処置後の細胞増殖を、未処置コントロールの割合として計算した。浸潤アッセイを上述のようなＯＤＮ処置の４８時間後に設定した。
【図８Ｃ】図８。ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１の失活は、Ａ４３１腫瘍形成を減らす。Ｂ及びＣ、ＡＳ−ＯＤＮ処置による、Ａ４３１細胞増殖の用量依存性阻害（Ｂ）及び浸潤（Ｃ）。増殖アッセイのために、図３におけるように、３０％の融合性のＡ４３１細胞を所定用量のコントロール−又はＡＳ−ＯＤＮで処置した。ＯＤＮ処置後の細胞増殖を、未処置コントロールの割合として計算した。浸潤アッセイを上述のようなＯＤＮ処置の４８時間後に設定した。
【図８Ｄ】図８。ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１の失活は、Ａ４３１腫瘍形成を減らす。Ｄ、ＡＳ−ＯＤＮ５ｍｇ／ｋｇ／日の連続的注入によるＡ４３１腫瘍形成の減少。方法において記載されるように新しく調製したＡ４３１種腫瘍フラグメントを、ヌードマウスの右脇腹に皮下移植した。ＯＤＮの連続注入を腫瘍移植の２日前に開始した。それぞれの処置グループに５匹ずつのマウスが存在した。これらの結果は、３個の同様の実験のうち１つをあらわす。
【図９Ａ】図９。ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１の失活は、ＰＡＮＣ−１においてインビトロで腫瘍形成Ｋ−ｒａｓシグナル形成を阻害する。Ａ、ＡＳ−ＯＤＮ処置によるＰＡＮＣ−１細胞増殖の用量依存性阻害。ＰＡＮＣ−１細胞を所定用量のコントロール−又はＡＳ−ＯＤＮで処置し、細胞増殖アッセイを図７におけるように行なった。
【図９Ｂ】図９。ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１の失活は、ＰＡＮＣ−１においてインビトロで腫瘍形成Ｋ−ｒａｓシグナル形成を阻害する。Ｂ、ＡＳ−ＯＤＮ処置（５μＭ）は、ヒト膵臓癌細胞株のパネルの増殖を減らした。各細胞株についての接種密度は、ＯＤＮでトランスフェクトされた場合に全ての細胞株が３０〜４０％融合性であるように、前研究において決定した。
【図９Ｃ】図９。ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１の失活は、ＰＡＮＣ−１においてインビトロで腫瘍形成Ｋ−ｒａｓシグナル形成を阻害する。Ｃ及びＤ、ｃ−ｒａｆ−１はＫＳＲ１に対して上位である。ＰＡＮＣ−１細胞を最初にセンス−又はＡＳ−ＯＤＮで４８時間処置し、方法において記載されるようにＢＸＢ−Ｒａｆでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、浸潤及びコロニー形成アッセイを図７におけるように設定した。ＰＡＮＣ−１細胞浸潤（Ｃ）及び形質転換（Ｄ）についてのＡＳ−ＯＤＮの阻害効果を、優性ポジティブなＢＸＢ−Ｒａｆによって逆転させた。
【図９Ｄ】図９。ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１の失活は、ＰＡＮＣ−１においてインビトロで腫瘍形成Ｋ−ｒａｓシグナル形成を阻害する。Ｃ及びＤ、ｃ−ｒａｆ−１はＫＳＲ１に対して上位である。ＰＡＮＣ−１細胞を最初にセンス−又はＡＳ−ＯＤＮで４８時間処置し、方法において記載されるようにＢＸＢ−Ｒａｆでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、浸潤及びコロニー形成アッセイを図７におけるように設定した。ＰＡＮＣ−１細胞浸潤（Ｃ）及び形質転換（Ｄ）についてのＡＳ−ＯＤＮの阻害効果を、優性ポジティブなＢＸＢ−Ｒａｆによって逆転させた。
【図９Ｅ】図９。ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１の失活は、ＰＡＮＣ−１においてインビトロで腫瘍形成Ｋ−ｒａｓシグナル形成を阻害する。Ｅ、ＡＳ−ＯＤＮ処置は、ＰＡＮＣ−１細胞における内因性ＫＳＲ１発現を阻害した。内因性ＫＳＲ１を、未処置の（ＮＴ）、センス−ＯＤＮ処置した又はＡＳ−ＯＤＮ処置したＰＡＮＣ−１細胞から免疫沈降し、ＫＳＲ１発現を方法において記載されるようにＷＢによって決定した。精製したＦｌａｇ−ＫＳＲを、ＷＢのためのポジティブコントロールとして役立てた。
【図９Ｆ】図９。ＡＳ−ＯＤＮによるＫＳＲ１の失活は、ＰＡＮＣ−１においてインビトロで腫瘍形成Ｋ−ｒａｓシグナル形成を阻害する。Ｆ、ＥＧＦに応答するＡＳ−ＯＤＮ処置されたＰＡＮＣ−１細胞、及びＢＸＢ−Ｒａｆ−１でトランスフェクトされたＰＡＮＣ−１細胞におけるＭＡＰＫ及びＰＩ−３キナーゼ活性を、方法において記載されるように、ホスホ−ＭＡＰＫ及びホスホ−Ａｋｔ特異性抗体を用いてＷＢ分析した。これらの条件下で、ｂ−アクチン及び全Ａｋｔは変化しなかった（図示せず）。これらの結果は、３個の同様の実験のうち１つをあらわす。
【図１０Ａ】図１０。ＡＳ−ＯＤＮ処置は、ＰＡＮＣ−１及びＡ５４９腫瘍形成をインビボで阻止した。Ａ、ＡＳ−ＯＤＮの連続注入は、ＰＡＮＣ−１腫瘍増殖を阻止した。１０^６ＰＡＮＣ−１細胞から（ｉ）、又は新しく収穫した種ＰＡＮＣ−１腫瘍から（ｉｉ）誘導されたＰＡＮＣ−１異種移植片を、方法において記載されるようにヌードマウスに移植した。Ａ（ｉ）、確立されたＰＡＮＣ腫瘍（約１００ｍｍ^３）を、コントロール−又はＡＳ−ＯＤＮ１０ｍｇ／ｋｇ／日で１４日間処置した。退縮したＡＳＡ−ＯＤＮ処置された腫瘍を有するマウスを４週間までモニタリングした。Ａ（ｉｉ）、新しく調製したＰＡＮＣ−１種腫瘍フラグメントをヌードマウスに上述のように移植した。ＯＤＮを用いた注入を、腫瘍移植の２日前に開始し、さらに１４日間続けた。これらの結果は、３個の同様の実験のうちの１つをあらわす。それぞれの処置グループに５匹ずつのマウスが存在した。
【図１０Ｂ】図１０。ＡＳ−ＯＤＮ処置は、ＰＡＮＣ−１及びＡ５４９腫瘍形成をインビボで阻止した。Ｂ、ＡＳ−ＯＤＮ処置は、内因性腫瘍ＫＳＲ１発現を阻害した。腫瘍ＫＳＲ１を、食塩水−、センス−、又はＡＳ−ＯＤＮ処置されたＰＡＮＣ−１腫瘍から免疫沈降させ、上述のようにＷＢによって発現を決定した。
【図１０Ｃ】図１０。ＡＳ−ＯＤＮ処置は、ＰＡＮＣ−１及びＡ５４９腫瘍形成をインビボで阻止した。Ｃ、ｋｓｒ１の阻害は、ＰＡＮＣ−１腫瘍におけるＲａｓ活性化に影響を与えなかった。図１０。ＡＳ−ＯＤＮ処置は、ＰＡＮＣ−１及びＡ５４９腫瘍形成をインビボで阻止した。Ｒａｓ活性化状態は、食塩水−、コントロール−ＯＤＮ−、センス−ＯＤＮ−又はＡＳ−ＯＤＮ−処置されたＰＡＮＣ−１腫瘍におけるＧＴＰ−Ｒａｓの量によって測定され、これらはＲａｓ活性化アッセイキットによって決定された。
【図１０Ｄ】図１０。ＡＳ−ＯＤＮ処置は、ＰＡＮＣ−１及びＡ５４９腫瘍形成をインビボで阻止した。Ｄ、ＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮ処置はＡ５４９腫瘍増殖を防ぎ（ｉ）、全身性内転移を介した肺転移を阻害した（ｉｉ）。方法におけるように新しく調製されたＡ５４９種腫瘍フラグメントを、ヌードマウスに移植した。腫瘍が１５０ｍｍ^３に達した場合にコントロール−又はＡＳ−ＯＤＮを用いた処理を開始し、さらに１８日間続けた（ｉ）。動物を実験の終了時に屠殺し、肺をコントロール−又はＡＳ−ＯＤＮ−処置されたマウスから切除し、インディアンインクで染色して、全身性内転移を介して誘導される表面肺転移を視覚化した（ｉｉ）。これらの結果は、３個の同様の実験のうちの１つをあらわす。各処置グループに５匹ずつのマウスが存在した。
【図１１】図１１は、マウスＫＳＲポリペプチド配列（配列番号９）及びヒトＫＳＲポリペプチド配列（配列番号１０）の比較配列を示す。
【図１２】図１２。Ａ、マウスｋｓｒの配列をコードする核酸（ｃＤＮＡ）を示す（配列番号１１）。Ｂ、ヒトｋｓｒの配列をコードする部分的な核酸（ｃＤＮＡ）を示す（配列番号１２）。
【図１３Ａ】図１３は、ＡＳ−ＯＤＮ処置によるＰＡＮＣ−１細胞増殖の特異的阻害及び用量依存性阻害を示す。Ａ、ＡＳ−ＯＤＮ処置によるＰＡＮＣ−１細胞増殖の用量依存性阻害；Ｋ５６２細胞の増殖はＡＳ−ＯＤＮ処置によって阻害されない。
【図１３Ｂ】図１３は、ＡＳ−ＯＤＮ処置によるＰＡＮＣ−１細胞増殖の特異的阻害及び用量依存性阻害を示す。Ｂ、Ｋ５６２及びＰＡＮＣ−１細胞における内因性ＫＳＲ１遺伝子発現のウェスタンブロット分析。５μＭのＫＳＲ ＡＳ−ＯＤＮ−１を用いたＫ５６２の処置は、ＰＡＮＣ−１細胞において観察されるものに対して、内因性ＫＳＲ１遺伝子発現のかなりの減少（８０％を超える）を引き出した。
【図１４】図１４は、ヒトＫＳＲ１全長ｍＲＮＡ配列（配列番号２４）を示す。
【図１５Ａ】図１５は、ＣＡ１〜ＣＡ５ドメインの位置に注釈を付けられたヒトＫＳＲ核酸及びタンパク質配列及びＡＳ−ＯＤＮについての標的配列を示す。全長ヒトＫＳＲタンパク質は８６６アミノ酸を有すると予想される。
【図１５Ｂ】図１５Ａの続き。
【図１５Ｃ】図１５Ｂの続き。
【図１６Ａ】図１６は、ＣＡ１〜ＣＡ５ドメインの位置に注釈を付けられたマウスＫＳＲ核酸及びタンパク質配列及びＡＳ−ＯＤＮについての標的配列を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａの続き。
【図１６Ｃ】図１６Ｂの続き。
【図１７】図１７は、示されるヒトＡＳ−ＯＤＮ１〜ＡＳ−ＯＤＮ１２についての核酸標的配列を有するヒトＫＳＲ−１全長ｍＲＮＡ配列を示す。
【図１８】図１８は、コントロールＯＤＮ、ＡＳ―ＯＤＮ２（１８１〜１９８）（マウス）（ＡＳ−ＯＤＮ２−ｏｌｄ）及びＡＳ−ＯＤＮ２（１５４〜１７１）（ヒト）（ＡＳ−ＯＤＮ２−ｎｅｗ）で処置されたＰＡＮＣ−１細胞の増殖アッセイを示す。
【図１９】図１９は、ベクターを発現するＡ４３１細胞、野生型Ｆｌａｇ−ＫＳＲ（ＫＳＲ−Ｓ）、Ｆｌａｇ−ＡＳ−ＫＳＲ（ＫＳＲ−ＡＳ）又は優性ネガティブＦｌａｇ−Ｋｉ−ＫＳＲ（Ｋｉ−ＫＳＲ）において、アネキシンＶ染色を用いて記録されるような、イオン化放射線により誘発されるアポトーシスの割合を示す。
【図２０】図２０は、ＡＳ−ＯＤＮ２（２１４〜２３１）、コントロールＯＤＮ又は発現ベクターで処理されたＡ４３１細胞において、アネキシンＶ染色を用いて記録されるような、イオン化放射線により誘発されるアポトーシスの割合を示す。
【図２１】図２１Ａ及び図２１Ｂは、ＫＳＲ−ＡＳの発現がイオン化放射線に対してＡ４３１細胞を放射線増感することを示す。
【図２２Ａ】図２２Ａ及び図２２Ｂは、（ＫＳＲ−ＡＳ発現による）ＫＳＲの失活が、Ａ４３１細胞においてｏｔｈベースライン及びＥＧＦにより刺激されるＶＥＧＦ産生を阻止することを示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａ及び図２２Ｂは、（ＫＳＲ−ＡＳ発現による）ＫＳＲの失活が、Ａ４３１細胞においてｏｔｈベースライン及びＥＧＦにより刺激されるＶＥＧＦ産生を阻止することを示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＳＲの発現を阻害する、ＫＳＲ ＲＮＡの領域に対して実質的に相補的な、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
哺乳動物ＫＳＲをコードする核酸に対して実質的に相補的な、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ヒトＫＳＲをコードする核酸に対して実質的に相補的な、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
哺乳動物ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの翻訳開始部位、５’未翻訳領域、コード領域又は３’未翻訳領域に対して実質的に相補的な、オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ＫＳＲのＣＡ１領域に対して実質的に相補的な配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
マウスＫＳＲのコード配列のヌクレオチド１２４〜２４３（配列番号１）又はヒトＫＳＲのヌクレオチド９７〜２１６（配列番号２５）、又はそれらの一部分に対して実質的に相補的な配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
以下からなる群から選択されるヌクレオチドに対して実質的に相補的な配列を含む、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド：
（ａ）マウスＫＳＲの配列の１５１〜１６８に対応する、ヒトＫＳＲの配列の１２４〜１４１（配列番号３）、
（ｂ）ヒトＫＳＲの配列の１５４〜１７１（配列番号２７）、
（ｃ）マウスＫＳＲの配列の１８１〜１９８（配列番号４）；及び
（ｄ）マウスＫＳＲの配列の２１４〜２３１に対応する、ヒトＫＳＲの配列の１８７〜２０４（配列番号５）。
【請求項８】
配列番号６〜８及び配列番号２８〜３９の群から選択される配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
検出可能な標識で標識された請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記標識が、酵素、リガンド、蛍光を発する化学物質及び放射性元素から選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
哺乳動物ＫＳＲ ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスＲＮＡを転写の際にコードする核酸配列又はそれらの一部分を含む、組換えＤＮＡ分子。
【請求項１３】
前記核酸配列が、転写制御配列に操作可能に結合する、請求項１２の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子を用いてトランスフェクトされた細胞株。
【請求項１５】
ＫＳＲ ＲＮＡのコード配列に対して実質的に相補的な核酸、又はそれらの一部分／フラグメントを発現可能であり、該オリゴヌクレオチド／核酸がＫＳＲの発現を阻害する、発現ベクター。
【請求項１６】
ＫＳＲ ＲＮＡのコード配列のＣＡ１領域に対して実質的に相補的なオリゴヌクレオチド、又はそれらの一部分／フラグメントを発現可能であり、該オリゴヌクレオチドがＫＳＲの発現を阻害する、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１に記載の治療的に有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと、薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とを含む、組成物。
【請求項１９】
１つ以上の化学治療剤又は放射能治療剤と、哺乳動物ＫＳＲをコードするｍＲＮＡに対して標的化されるオリゴヌクレオチドとを含み、ＫＳＲ発現を阻害する組成物。
【請求項２０】
発現ベクターと、薬学的に受容可能なキャリア又は希釈剤とを含み、前記発現ベクターが、ＫＳＲ ＲＮＡのコード配列に対して実質的に相補的な核酸、又はそれらの一部分／フラグメントを発現可能であり、前記核酸がＫＳＲの発現を阻害する、組成物。
【請求項２１】
ＫＳＲを発現する細胞と、ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの一部分に対して相補的な有効量の核酸とを接触させる工程を含む、哺乳動物ＫＳＲの発現を阻害する方法。
【請求項２２】
ＫＳＲを発現する細胞と、請求項１に記載の有効量のオリゴヌクレオチドとを接触させ、それにより哺乳動物ＫＳＲの発現が阻害される工程を含む、哺乳動物ＫＳＲの発現を阻害する、方法。
【請求項２３】
哺乳動物におけるｇｆ−Ｒａｓの発現又はＲａｓの高められた発現に関連する過剰増殖状態を処置又は予防する方法であって、哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現を阻害する治療的に有効量の化合物又は薬剤を該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２４】
前記化合物又は薬剤が、ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの一部分に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物におけるｇｆ−Ｒａｓの発現又はＲａｓの高められた発現に関連する過剰増殖状態を処置又は予防する方法であって、ＫＳＲをコードするｍＲＮＡの一部分に対して相補的な治療的に有効量の核酸を該哺乳動物において発現させるか又は該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２６】
哺乳動物において癌の進行を処置又は阻害する方法であって、哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現を阻害する治療的に有効量の化合物又は薬剤を該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２７】
前記癌が、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、頭頚部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道癌及び前立腺癌の群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
治療的に有効量の請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを哺乳動物に対して投与する工程を含む、哺乳動物において癌の進行を処置又は阻害する、方法。
【請求項２９】
哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現を阻害する治療的に有効量の化合物又は薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において腫瘍細胞におけるイオン化放射線に対して放射線感受性を与える、方法。
【請求項３０】
治療的に有効量の請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを哺乳動物に対して投与する工程を含む、哺乳動物において腫瘍細胞におけるイオン化放射線に対して放射線感受性を与える、方法。
【請求項３１】
哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現を阻害する治療的に有効量の化合物又は薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において腫瘍細胞の血管形成を阻害する、方法。
【請求項３２】
腫瘍細胞が、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、頭頚部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道癌及び前立腺癌の群から選択される癌細胞である、請求項２９、３０、又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
治療的に有効量の請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを哺乳動物に対して投与する工程を含む、哺乳動物において血管形成を阻害する、方法。
【請求項３４】
哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現を阻害する治療的に有効量の化合物又は薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物においてＶＥＧＦの発現又は活性を阻害又は減らすための、方法。
【請求項３５】
治療的に有効量の請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを哺乳動物に対して投与する工程を含む、哺乳動物においてＶＥＧＦの発現又は活性を阻害又は減らすための、方法。
【請求項３６】
哺乳動物ＫＳＲタンパク質の発現を活性化する治療的に有効量の化合物又は薬剤、又は哺乳動物ＫＳＲを発現するベクターを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において血管形成を刺激する、方法。
【請求項３７】
ＫＳＲの発現を阻害する化合物又は薬剤を同定する方法であって、以下の工程：
（ｃ）候補化合物又は薬剤の存在下及び非存在下で、ＫＳＲを発現する細胞をインキュベートする工程；及び
（ｄ）候補化合物又は薬剤の存在下及び非存在下で、ＫＳＲの発現を検出又は測定する工程を含み、
前記候補化合物又は薬剤の非存在下でのＫＳＲの発現に対して、前記候補化合物又は薬剤の存在下でのＫＳＲの発現が減少することが、前記化合物又は薬剤がＫＳＲの発現を阻害することを示す、方法。
【請求項３８】
ＫＳＲ ｍＲＮＡを開裂するリボザイム。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図９Ｄ】

【図９Ｅ】

【図９Ｆ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１１−１】

【図１１−２】

【図１２Ａ−１】

【図１２Ａ−２】

【図１２Ｂ−１】

【図１２Ｂ−２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１６Ｃ】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【公表番号】特表２００７−５１２８４４（Ｐ２００７−５１２８４４Ａ）
【公表日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４２７８２（Ｐ２００６−５４２７８２）
【出願日】平成１６年１２月３日（２００４．１２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４０５０６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６７５６
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５００２１３８３４）
【Ｆターム（参考）】