β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを用いた腸管免疫活性化剤
【課題】 β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの新たな用途を開発する。
【解決手段】 β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管免疫活性化剤、腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤、腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡの産生誘導剤、及び感染症の予防剤。
【解決手段】 β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管免疫活性化剤、腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤、腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡの産生誘導剤、及び感染症の予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管免疫活性化剤、腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤、腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡ産生誘導剤、及び感染症予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−グルカン（β−１，３−Ｄ−グルカン、あるいはβ−１，６−Ｄ−グルカン、あるいはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン）は自然界に生息するきのこ（担子菌の子実体）に多く含まれる成分で、その子実体だけでなく培養菌糸体にも含まれていることが最近明らかになりつつある。
【０００３】
β−グルカンには免疫賦活活性、抗腫瘍活性があることが知ら
れている。例えばスエヒロタケ、カワラタケおよびシイタケから抽出されたβ−グルカンが抗がん剤などの医薬品として販売されている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００４】
一方、不完全菌であるオーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物もβ−グルカンを菌体外に生産することが知られている。この微生物がβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとフラクトオリゴ糖とを同時に生産すること（特開昭６１−１４６１９２号公報）やβ−グルカンとともにプルランを生産すること（特許文献１参照）が報告されている。
【０００５】
オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）K-1株がシュークロースを炭素源とする培地中に、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを菌体外に分泌生産し（Agric. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)；科学と工業, 64, 131-135 (1990)）、その構造はβ−１，３−Ｄ−グルカンを主鎖とする構造にD−グルコースが側鎖としてβ−１，６−結合で結合していること、そしてその一部側鎖のグルコース残基がスルホ酢酸基（HO3SCH2COOH）で置換されていること、また、この多糖の分子量はゲルろ過法（ＧＰＣ）により２００万であると推定されることも報告されている（Agric. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)；科学と工業, 64, 131-135 (1990)；特開平７−５１０８２号公報）。
【０００６】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物から生産されるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンも免疫賦活活性を有していること、そしてこの物質が機能性食品（腸内ビフィズス菌の増殖、便秘防止、免疫増強）や整腸剤などに利用できることが報告されている（特許文献２、３、４参照）。
【０００７】
特許文献２では、オーレオバシジウムの培養上清を濃縮したものを使用している。また、特許文献３では、オーレオバシジウムの培養上清に有機溶媒を添加して沈殿させて得られるものを使用している。さらに、特許文献４では、オーレオバシジウムの培養上清そのものを使用している。これらのβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは粘度が高いために、医薬品や食品などとして実用し難い。
【特許文献１】Fragrance Journal, 5, 71-75 (1995)
【特許文献２】特開昭６２−２０１９０１号公報
【特許文献３】特開平６−３４０７１号公報
【特許文献４】特開平２００２−２０４６８７号公報
【非特許文献１】日経バイオ, No. 2, pp.91-94 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの新たな用途を開発することを第一の課題とする。
【０００９】
また、本発明は、水溶液にする場合に低粘度溶液を与えるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの新たな用途を開発することを第二の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(i) オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンをマウスに経口投与すると、腸管関連リンパ組織（gut-associated lymphoid tissue:GALT）、中でも腸管パイエル板におけるリンパ球の増殖が促進される。
(ii) オーレオバシジウム属に属する微生物が産生するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンをマウスに経口投与すると、腸管関連リンパ組織、中でも腸管パイエル板におけるサイトカインの産生が促進される。
(iii) オーレオバシジウム属に属する微生物が産生するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンをマウスに経口投与すると、腸管関連リンパ組織、中でも腸管パイエル板におけるＩｇＡの産生が促進される。
(iv) オーレオバシジウム属に属する微生物が産生する天然型のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンをアルカリ処理によりｐＨ１２以上とした後、中和することにより得られる低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、天然型と同様の(i)〜(iii)の腸管免疫活性化作用を示す。
【００１１】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の腸管免疫活性化剤などを提供する。
【００１２】
１． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管免疫活性化剤。
【００１３】
２． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項１に記載の腸管免疫活性化剤。
【００１４】
３． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、一次粒子径が０．０５〜２μｍである微粒子状のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む項１又は２に記載の腸管免疫活性化剤。
【００１５】
４． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのβ−１，３結合/β−１，６結合の結合比が０．５〜２である項１〜３のいずれかに記載の腸管免疫活性化剤。
【００１６】
５． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが硫黄含有基を有する項１〜４のいずれかに記載の腸管免疫活性化剤。
【００１７】
６． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン中の金属イオン濃度が、１ｇ当たり０．４ｇ以下である項１〜５のいずれかに記載の腸管免疫活性化剤。
【００１８】
７． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである項１〜６のいずれかに記載の腸管免疫活性化剤。
【００１９】
８． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、天然型β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンをｐＨ１２以上になるようにアルカリ処理した後、中和することにより得られるものである項１〜６のいずれかに記載の腸管免疫活性化剤。
【００２０】
９． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２１】
１０． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項９に記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２２】
１１． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、一次粒子径が０．０５〜２μｍである微粒子状のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む項９又は１０に記載の腸管リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２３】
１２． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのβ−１，３結合/β−１，６結合の結合比が０．５〜２である項９〜１０のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２４】
１３． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが硫黄含有基を有する９〜１２のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２５】
１４． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン中の金属イオン濃度が、１ｇ当たり０．４ｇ以下である項９〜１３のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２６】
１５． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである項９〜１４のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２７】
１６． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、天然型β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンをｐＨ１２以上になるようにアルカリ処理した後、中和することにより得られるものである項９〜１４のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２８】
１７． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００２９】
１８． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項１７に記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３０】
１９． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、一次粒子径が０．０５〜２μｍである微粒子状のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む項１７又は１８に記載の腸管関連組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３１】
２０. β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのβ−１，３結合/β−１，６結合の結合比が０．５〜２である項１７〜１９のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３２】
２１． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが硫黄含有基を有する項１７〜２０のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３３】
２２． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン中の金属イオン濃度が、１ｇ当たり０．４ｇ以下である項１７〜２１のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３４】
２３． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求１７〜２２のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３５】
２４． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、天然型β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンをｐＨ１２以上になるようにアルカリ処理した後、中和することにより得られるものである項１７〜２２のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３６】
２５． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むＩｇＡの産生誘導剤。
【００３７】
２６． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項２５に記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００３８】
２７． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、一次粒子径が０．０５〜２μｍである微粒子状のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む項２５又は２６に記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００３９】
２８． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのβ−１，３結合/β−１，６結合の結合比が０．５〜２である項２５〜２７のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４０】
２７． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが硫黄含有基を有する項２５〜２８のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４１】
２８． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン中の金属イオン濃度が、１ｇ当たり０．４ｇ以下である項２５〜２７のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４２】
２９． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求２５〜２８のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４３】
３０． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、天然型β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンをｐＨ１２以上になるようにアルカリ処理した後、中和することにより得られるものである項２５〜２８のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４４】
３１． 腸管関連リンパ組織においてＩｇＡを産生するものである項２５〜３０のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４５】
３２． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む感染症予防剤。
【００４６】
３３． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項３２に記載の感染症予防剤。
【００４７】
３４． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、一次粒子径が０．０５〜２μｍである微粒子状のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む項３２又は３３に記載の感染症予防剤。
【００４８】
３５． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのβ−１，３結合/β−１，６結合の結合比が０．５〜２である項３２〜３４のいずれかに記載の感染症予防剤。
【００４９】
３６． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが硫黄含有基を有する項３２〜３５のいずれかに記載の感染症予防剤。
【００５０】
３７． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン中の金属イオン濃度が、１ｇ当たり０．４ｇ以下である項３２〜３６のいずれかに記載の感染症予防剤。
【００５１】
３８． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求３２〜３７のいずれかに記載の感染症予防剤。
【００５２】
３９． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、天然型β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンをｐＨ１２以上になるようにアルカリ処理した後、中和することにより得られるものである項３２〜３７のいずれかに記載の感染症予防剤。
【００５３】
４０． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含み、
腸管免疫を活性化する旨、又は感染予防に効果がある旨の表示を付した食品組成物。
【００５４】
４１． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項４０に記載の食品組成物。
【００５５】
４２． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである項４０又は４１に記載の食品組成物。
【発明の効果】
【００５６】
本発明により、オーレオバシジウム属に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管免疫活性化剤、腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤、腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡの産生誘導剤、及び感染症予防剤が提供された。
【００５７】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとして、オーレオバシジウム属に属する微生物が産生する天然型のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンをアルカリ処理することにより低粘度にしたものも、天然型と同様の腸管免疫活性化作用などを有し、腸管免疫活性化剤、腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤、腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡの産生誘導剤、及び感染症予防剤の有効成分として有用である。
【００５８】
この低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、オーレオバシジウム属微生物の培養上清をアルカリ処理し、次いで中和することにより得られることから、ろ過や遠心などにより容易に菌体のような不溶性成分と分離することができる。また、水溶液として使用する場合に低粘度で摂取し易い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）医薬
構成
本発明の腸管免疫活性化剤、腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤、腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡの産生誘導剤、及び感染症予防剤は、それぞれオーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む。特に、これを有効成分として含む。
【００６０】
腸管関連組織には、腸管パイエル板、腸管膜リンパ節、粘膜固有層、腸管上皮間リンパ球、クリプトパッチ等が含まれる。
【００６１】
本発明のリンパ球の増殖誘導剤は、腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節、中でも腸管パイエル板におけるリンパ球の増殖を強く誘導することから、腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節におけるリンパ球の増殖誘導剤として好適に使用でき、中でも腸管パイエル板におけるリンパ球の増殖誘導剤として好適に使用できる。
【００６２】
また本発明のサイトカインの産生誘導剤は、腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節、中でも腸管パイエル板におけるサイトカインの産生を強く誘導することから、腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節におけるサイトカインの産生誘導剤として好適に使用でき、中でも腸管パイエル板におけるサイトカインの産生誘導剤として好適に使用できる。
【００６３】
また本発明のＩｇＡ産生誘導剤は、特に腸管関連リンパ組織、中でも腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節におけるＩｇＡ産生を強く誘導することから、腸管関連リンパ組織として好適に使用でき、中でも腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節におけるＩｇＡの産生誘導剤として好適に使用でき、腸管パイエル板におけるＩｇＡの誘導剤として一層好適に使用できる。
【００６４】
腸管のリンパ組織において産生されたＩｇＡは、腸管粘膜や消化液中、さらに腸管ばかりではなく粘膜面、例えば唾液や管腔などに存在してウィルス、細菌、細菌の生産する毒素などの生体異物の吸収を阻害する機能を有する。このように、β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンは、腸管におけるＩｇＡ産生能を向上させることにより、微生物感染を予防することができる。このことから、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む製剤は、感染症の予防剤として有用である。
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカン
本発明の医薬製剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの形状は、限定されない。剤形に合わせて、固形又は水溶液などの状態で含まれていればよい。
【００６５】
本発明の各医薬に含まれるβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンはオーレオバシジウム属の微生物が生産するものであるが、このグルカンは、菌体外に分泌されるために回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて生産する。中でも、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株、又はGM-NH-1A2株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれFERM P-19285及びFERM P-19286として寄託済み）が生産するものが好ましい。GM-NH-1A1株及びGM-NH-1A2株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）K-1株の変異株である。オーレオバシジウム属K-1株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを生産することが知られている。また、K-1株の生産するβ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。
【００６６】
GM-NH-1A1株及びGM-NH-1A2株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ−グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが２〜３０万の低分子量のβ−グルカンの両方を生産する菌株である。
【００６７】
本発明の腸管免疫活性化剤、リンパ球の増殖誘導剤、サイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡ産生誘導剤、及び感染症予防剤には、好ましくは分子量１万〜５０万程度、より好ましくは２万〜１０万程度の比較的低分子量のβ−１,３−１,６−Ｄ−グルカンが含まれていればよい。上記分子量の範囲であれば、パイエル板を始めとする腸管関連リンパ組織に対する刺激が十分であり、かつ実用上十分な水溶性を有する。この低分子量のグルカンは、例えばオーレオバシジウムプルランスの培養上清から分離したβ−１,３−１,６−Ｄ−グルカンから、フィルターろ過や、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法で微粒子状β−１,３−１,６−Ｄ−グルカンを除くことにより得られる。
【００６８】
また、本発明の各医薬には、可溶性の低分子β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとともに、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である微粒子状のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが含まれていてもよい。本発明の各医薬に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。このような微粒子状のグルカンが含まれている場合は、パイエル板を始めとする腸管関連リンパ組織を効果的に刺激することができる。β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが水溶液として製剤中に含まれている場合は、レシチンのような乳化剤や、環状デキストリンのような安定化剤を水溶液に添加することにより、微粒子をさらに安定化させることができる。
【００６９】
また、本発明の各医薬に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンがオーレオバシジウム・プルランス由来のものである場合は、β-１，３結合／β-１，６結合の結合比は、０．５〜２程度である。
【００７０】
本発明の医薬製剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、金属イオン濃度が、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。製剤中にβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが水溶液状態で含まれる場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
【００７１】
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形製剤においても、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
【００７２】
本発明の各医薬に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、スルホン酸基のような硫黄含有基、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基等の官能基を有するものであってもよい。オーレオバシジウム属細菌が生産するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、通常、硫黄含有基を有する。
【００７３】
本発明の医薬製剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、水溶液にしたときの粘度が低いものであることが好ましい。この低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、好ましくは１０ｃＰ以下であればよい。本発明において、粘度はＢＭ型回転粘度計で測定した値である。この低粘度グルカンは、アルカリ処理していないβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと同じ一次構造を有する。具体的には、上記水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。
生産方法
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法は、周知である。例えば、これを生産する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することによりβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを沈殿物として得ることができる。
【００７４】
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる方法は種々報告されている。使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源を挙げることができる。
【００７５】
窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源を挙げることができる。場合によってはβ−グルカンの生産量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類を添加するのも有効な方法である。
【００７６】
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産するものなら特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
【００７７】
オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件が挙げられる。
【００７８】
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御するのも得策である。更に培養液の消泡のために適宜、泡消剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度が好ましく、通常1〜４日間程度も培養すればβ−グルカンを生産することが可能である。なお、β−グルカンの生産量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
【００７９】
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が０．１％から数％(w/v)含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ([ｍＰａ・s])から数千ｃＰ（[ｍＰａ・s]）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを沈殿物として得ることができる。
＜低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法＞
上記の高粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
【００８０】
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加すればよい。例えば水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が０．５％(w/v)以上、好ましくは１．２５％(w/v)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
【００８１】
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。
【００８２】
次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。
【００８３】
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、０．５ｗ／ｖ％の水溶液の３０℃における粘度が５０ｃＰ以下である。
【００８４】
アルカリ処理された低粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
【００８５】
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
【００８６】
得られるグルカン水溶液を脱塩する場合は、例えば限外ろ過膜を用いて脱塩すればよい。
【００８７】
このようにして得られる水溶液に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま医薬製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを析出させることができる。
【００８８】
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを低粘度化することにより、限ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
【００８９】
固形製剤にする場合は、低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
製剤
本発明の各医薬において、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、必要に応じて薬学的に許容される担体とともに適当な製剤とすることができる。このような担体として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤等が挙げられる。また、酸化防止剤のような慣用の添加剤なども含まれていてよい。
【００９０】
製剤の形態は特に限定されず、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等のどのような形態であってもよい。アルカリ処理された低粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを使用する場合は、高濃度の水溶液を調製できることから、シロップ剤にする場合にも、１日に無理なく摂取できる量に有効量のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含ませることができる。
【００９１】
賦形剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の各種の糖類；バレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン等の各種デンプン類、；結晶セルロース等の各種セルロース類；無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の各種無機塩類等が挙げられる。
【００９２】
結合剤としては、公知のものを使用でき、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【００９３】
崩壊剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００９４】
潤沢剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などが挙げられる。
【００９５】
付湿剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトール等が挙げられる。
【００９６】
製剤中に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの量は、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、１日摂取量が１０〜１０００ｍｇ程度、特に２０〜２００ｍｇ程度になるような量含まれていればよい。上記摂取量の範囲であれば、十分に腸管免疫活性化効果や感染症予防効果が得られるとともに、副作用や毒性が現れるということがない。また、余りに多量を摂取してもそれに見合った効果は得られない。
【００９７】
１日１回投与する製剤である場合は、１日必要量が一つの製剤に含まれていればよく、例えば１日３回投与する製剤である場合は、１日必要量の３分の１が製剤に含まれていればよい。
【００９８】
また、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤のような固形製剤の場合は、製剤中にβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが０．１〜１００重量％程度、特に1〜５０重量％程度含まれていることが好ましい。また、シロップ剤のような液体又は流動状の製剤の場合は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが０．０１〜２重量％程度、特に０．０５〜０．５重量％程度含まれていることが好ましい。上記範囲であれば、摂取し易い製剤量中に、腸管免疫効果や感染症予防効果が十分に得られるとともに、副作用や毒性が現れない程度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが含まれることになる。また、余りに多く含まれていてもそれに見合った効果は得られない。またシロップ剤の場合は、上記範囲であれば、飲み易い粘度のシロップ剤が得られる。
（ＩＩ）食品組成物
本発明の食品組成物は、上記説明したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む。この食品組成物は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含むことから、腸管免疫活性化作用や、感染症予防効果が得られる。このため、保健機能食品、栄養機能食品、特定保健用食品のような栄養補助食品として好適に使用できる。この場合、本発明の食品組成物は、腸管免疫を活性化する旨の表示、又は感染予防に効果がある旨の表示を付したものとすることができる。
実施例
次に実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）低粘度β−１，３−１，６−グルカンの調製
（１-1）β-グルカンの培養生産
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）GM-NH-1A1株（FERM P-19285）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
【００９９】
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ ＯＤで、多糖濃度は０．５％(w/v)で、置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β-グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ−グルカンを回収した。このβ−グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。
【０１００】
このβ−グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の濃度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（(ｍＰａ・ｓ)）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
【０１０３】
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(w/v)となるように２５％(w/w)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(w/v)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ([ｍＰａ・s])であった。
【０１０４】
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(w/v)で、ほぼ１００％の回収率であった。
（１−３）β−グルカン水溶液の脱塩
上記のβ−グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(w/v)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
【０１０５】
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ−グルカン水溶液を得た。この時のβ−グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(w/v)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。また、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。本β-グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。
＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ−１，３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
【０１０６】
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの重水に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
【０１０７】
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
【０１０８】
この結果、本β−グルカンがβ−１，３−１，６−Ｄグルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β−１，３結合/β−１，６結合の比は１．１５であることが判明した。
＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
【０１０９】
０．３μｍのピーク はβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
【０１１０】
また、二次粒子はマグネチックスタラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとβ−１，３−１，６−Ｄグルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
【０１１１】
水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
＜熱安定性＞
上記の（１−１）〜（１−３）に説明したようにして培養、アルカリ処理、除菌、及び脱塩を行い、金属イオンを５０ｍｇ／１００ｍｌ以下とした後、多糖濃度を０．２％（２ｍｇ／ｍｌ）、０．４０％、０．５２％、０．７７％、及び０．９６％に調整した溶液を調製した。各溶液を９０℃のオ−トクレ−ブで１５分間加熱滅菌した。
【０１１２】
加熱によるゲル化の有無を目視観察した。結果を以下の表２に示す。表２中、○印は変化がないことを示し、△印は一部に凝集が観察されたことを示し、×印は流動性のないゲルとなったことを示すを示す。多糖濃度が高いと凝集しやすい傾向が見られた。糖濃度が０．５％（５ｍｇ／ｍｌ）を超えると、凝集の傾向が見られ、０．７％以上では流動性のないゲルとなった。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
＜ｐＨによる溶解度への影響＞
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの溶解度は培養液のｐＨによって大きく変わった。粒度分布測定の結果、粒子として存在するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンはその大部分が０．１μｍ以上の大きさであることが分ったので、アドバンテック社製のフィルター（０．２１μｍ）で通過できるものを溶解しているもの、通過できなかったものを微粒子と考えることができる。ここでは、その存在比（０．２μｍを通過した培養液の多糖の重さ/培養液の多糖の重さ×１００（％））を溶解度と定義する。上記の（１-１）〜（１−３）に説明したようにして培養、アルカリ処理、除菌、及び脱塩した培養液の多糖濃度を０．２％（２ｍｇ／ｍｌ）に調製後、ｐＨを変えた時の溶解度を図３に示す。
＜温度による溶解度への影響＞
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの溶解度は温度によっても大きく変わる。ここでは、温度を変えて、上記のｐＨの検討時と同様にアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行い、溶解度を求めた。培養液の多糖濃度を０．２％（２ｍｇ／ｍｌ）に調製後、温度を変えた時の溶解度を図４に示す。ここでは、その存在比（０．２μｍを通過した培養液の多糖の重さ/培養液の多糖の重さ×１００（％））を溶解度と定義する。
【０１１５】
ｐＨと温度をコントロ−ルすることで溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン、及び微粒子β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを選択的に調製できることが分かる。
（２）粉末化グルカンの調製
（１）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含むβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。次いで、得られた乾燥β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
【０１１６】
一方、水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
【０１１７】
以上のように、オーレオバシジウム（Aureobasidium）属に属する微生物により生産される高粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンをアルカリ処理することにより低粘度化に成功した。本発明者等の手法で得られるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは水溶性成分と微粒子分散成分を含み、ｐＨ、温度でその割合をコントロ−ルできる。また、脱塩工程で金属イオンの濃度をコントロールすることで、保存性および熱安定性に優れた培養液が得られることがわかった。
（３）高純度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末の製造
（１）において得られた培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機40D-4を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置R-3を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
（４）腸管免疫活性化作用の確認
【実施例１】
【０１１８】
β-グルカンの細胞増殖能に与える影響（in vitro）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（７週齢、雄）より、パイエル板（Peyer's patch：ＰＰ）及び脾臓（Spleen:ＳＰＬ）を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過、赤血球溶解を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌとした。
【０１１９】
この細胞液に、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液（終濃度０、５０、２００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｚｙｍｏｓａｎ（１００μｇ／ｍｌ）添加したものをそれぞれ調製した。ＬＰＳはE.coli 055:B5由来のＬＰＳ（SIGMA社、L2880）である。ＬＰＳは種々の組織において免疫を活性化することが知られているものであり、陽性対照として用いた。Zymosan（ザイモサン）はパン酵母(Saccharomyces serevisiae)由来の細胞壁から調製された不溶性β-グルカン標品で、Sigma社よりZymosan A(カタログ番号 Z4250)として販売されている。β-グルカンの比較対照として利用した。
【０１２０】
この細胞を３７℃で４日間、５％ＣＯ２存在下で培養した。４日培養後、ＭＴＳ試薬（CellTiter96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay;Promega）を加え、さらに３７℃で３時間、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【０１２１】
結果を表３及び図５に示す。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板及び脾臓由来のリンパ球の増殖を容量依存的に促進した。
【実施例２】
【０１２４】
β-グルカンのサイトカイン産生能に与える影響（in vitro）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（７週齢、雄）より、パイエル板及び脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過、赤血球溶解を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。
【０１２５】
この細胞液に、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液（終濃度０、５０、２００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｚｙｍｏｓａｎ（１００μｇ／ｍｌ）添加したものをそれぞれ調製した。
【０１２６】
この細胞液を３７℃で７２時間、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養後、ＥＬＩＳＡ法で、培養上清中の各種サイトカイン（ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０），ＩＮＦ−γ）濃度を測定した。
【０１２７】
結果を表４及び図６ａ〜図６ｄに示す。
【０１２８】
【表４】
【０１２９】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板細胞において、ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−１２，ＩＮＦγの産生を容量依存的に増加させた。特に、ＩＬ−５産生誘導能が強かった。また、この低粘度グルカンは、脾臓細胞においても、Ｉｌ−６，ＩＮＦ−ガンマの産生を促進したが、ＩＬ−５，ＩＬ−１２の有意な産生誘導は観察されなかった。
【実施例３】
【０１３０】
β-グルカンの免疫グロブリン産生能に与える影響（in vitro）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（７週齢、雄）より、パイエル板及び脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過、赤血球溶解を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌとした。
【０１３１】
この細胞液に、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液（終濃度０、５０、２００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｚｙｍｏｓａｎ（１００μｇ／ｍｌ）添加したものをそれぞれ調製した。
【０１３２】
この細胞液を３７℃で１週間、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養後、ＥＬＩＳＡ法で、培養上清中の各種免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）濃度を測定した。
【０１３３】
結果を表５及び図７ａ〜図７ｄに示す。
【０１３４】
【表５】
【０１３５】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板細胞において、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａの産生を容量依存的に増大させた。また、脾臓細胞においては、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａの産生を容量依存的に増大させたが、ＩｇＡの有意な産生誘導は観察されなかった。
【実施例４】
【０１３６】
β-グルカンのリンパ球細胞分裂能に与える影響（in vivo）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（６週齢、雌）に連続して７日間、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液からエタノール沈殿により回収した粉末を１日当たり０〜２０００μｇ／２００μｌ経口投与した。投与終了後、パイエル板、腸管膜リンパ節（mesenteric lymph nodes：ＭＬＮ）、脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌとした。
【０１３７】
この細胞液に、マイトジェンとして、経口投与したと同じβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを０〜２００μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【０１３８】
この細胞液を３７℃で２日間、５％ＣＯ２存在下で培養し、トリチウムチミジン（０．５μＣｉ／１０μｌ）を添加した。さらに、同条件下で２０時間培養を継続した後、チミジンの取り込み量をカウントした。
【０１３９】
結果を表６及び図８ａ〜図８ｃに示す。
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板において、生理食塩水を用いた対照群に比べて、チミジンの取り込みを有意に増大させた。また、腸管膜リンパ節では、マイトジェン刺激した場合に、低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンによるチミジン取り込み量の有意な増大が認められた。一方、脾臓においては、マイトジェン刺激の有無にかかわらず、チミジン取り込み量の有意な増大は認められなかった。
【０１４２】
このことから、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管リンパ組織におけるリンパ球細胞分裂を促進することが分かる。特に、腸管パイエル板におけるリンパ球細胞分裂を強く促進する。
【実施例５】
【０１４３】
β-グルカンのサイトカイン産生能に与える影響（in vivo）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（６週齢、雌）に連続して７日間、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液からエタノール沈殿により回収した粉末を１日当たり０〜２０００μｇ／２００μｌ経口投与した。投与終了後、パイエル板、腸管膜リンパ節、及び脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。
【０１４４】
この細胞液に、マイトジェンとして、経口投与したと同じβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを０〜２００μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【０１４５】
この細胞液を３７℃で７２時間、５％ＣＯ２存在下で培養した後、細胞上清中のサイトカイン（ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＮＦ−γ）濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【０１４６】
結果を表７及び図９ａ〜図９ｉに示す。
【０１４７】
【表７】
【０１４８】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板において、生理食塩水を用いた対照群に比べて、ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＮＦ−γの産生を有意に増大させた。また、腸管膜リンパ節では、マイトジェン刺激した場合に、ＩＬ−６，ＩＮＦ−γの産生が有意に増大した。脾臓においては、マイトジェン刺激した場合にＩＮＦ−γの産生が有意に増大した。
【０１４９】
このことから、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管リンパ組織におけるサイトカインの産生を促進することが分かる。特に、腸管パイエル板におけるサイトカインの産生を強く促進する。
【実施例６】
【０１５０】
β-グルカンのＩｇＡ産生に与える影響（in vivo）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（６週齢、雌）に連続して７日間、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液からエタノール沈殿により回収した粉末を１日当たり０〜２０００μｇ／２００μｌ経口投与した。投与終了後、パイエル板、腸管膜リンパ節及び脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。
【０１５１】
この細胞液に、マイトジェンとして、経口投与したと同じβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを０〜２００μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【０１５２】
この細胞液を３７℃で１週間、５％ＣＯ２存在下で培養した後、細胞上清中のＩｇＡ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【０１５３】
結果を表８及び図１０ａ〜図１０ｃに示す。
【０１５４】
【表８】
【０１５５】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板において、生理食塩水を用いた対照群に比べて、ＩｇＡの産生を有意に増大させた。また、腸管膜リンパ節では、マイトジェン刺激した場合に、ＩｇＡの産生を有意に増大させた。一方、脾臓においては、ＩｇＡ産生の有意な増大は認められなかった。
【０１５６】
このことから、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管リンパ組織におけるＩｇＡの産生を促進することが分かる。特に、腸管パイエル板におけるＩｇＡの産生を強く促進する。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）スペクトルを示す。
【図２】超音波照射後の粒度分布（メジアン径０．２３μｍ）を示す。
【図３】溶解度とｐＨとの関係を示すグラフである。
【図４】溶解度と温度との関係を示すグラフである。
【図５】細胞レベルでのリンパ球の増殖に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図６ａ】細胞レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図６ｂ】細胞レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図６ｃ】細胞レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図６ｄ】細胞レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図７ａ】細胞レベルでの免疫グロブリン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図７ｂ】細胞レベルでの免疫グロブリン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図７ｃ】細胞レベルでの免疫グロブリン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図７ｄ】細胞レベルでの免疫グロブリン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図８ａ】生体レベルでのリンパ球産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図８ｂ】生体レベルでのリンパ球産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図８ｃ】生体レベルでのリンパ球産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ａ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｂ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｃ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｄ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｅ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｆ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｇ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｈ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｉ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図１０ａ】生体レベルでのＩｇＡ産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図１０ｂ】生体レベルでのＩｇＡ産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図１０ｃ】生体レベルでのＩｇＡ産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管免疫活性化剤、腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤、腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡ産生誘導剤、及び感染症予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−グルカン（β−１，３−Ｄ−グルカン、あるいはβ−１，６−Ｄ−グルカン、あるいはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン）は自然界に生息するきのこ（担子菌の子実体）に多く含まれる成分で、その子実体だけでなく培養菌糸体にも含まれていることが最近明らかになりつつある。
【０００３】
β−グルカンには免疫賦活活性、抗腫瘍活性があることが知ら
れている。例えばスエヒロタケ、カワラタケおよびシイタケから抽出されたβ−グルカンが抗がん剤などの医薬品として販売されている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００４】
一方、不完全菌であるオーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物もβ−グルカンを菌体外に生産することが知られている。この微生物がβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとフラクトオリゴ糖とを同時に生産すること（特開昭６１−１４６１９２号公報）やβ−グルカンとともにプルランを生産すること（特許文献１参照）が報告されている。
【０００５】
オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）K-1株がシュークロースを炭素源とする培地中に、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを菌体外に分泌生産し（Agric. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)；科学と工業, 64, 131-135 (1990)）、その構造はβ−１，３−Ｄ−グルカンを主鎖とする構造にD−グルコースが側鎖としてβ−１，６−結合で結合していること、そしてその一部側鎖のグルコース残基がスルホ酢酸基（HO3SCH2COOH）で置換されていること、また、この多糖の分子量はゲルろ過法（ＧＰＣ）により２００万であると推定されることも報告されている（Agric. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)；科学と工業, 64, 131-135 (1990)；特開平７−５１０８２号公報）。
【０００６】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物から生産されるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンも免疫賦活活性を有していること、そしてこの物質が機能性食品（腸内ビフィズス菌の増殖、便秘防止、免疫増強）や整腸剤などに利用できることが報告されている（特許文献２、３、４参照）。
【０００７】
特許文献２では、オーレオバシジウムの培養上清を濃縮したものを使用している。また、特許文献３では、オーレオバシジウムの培養上清に有機溶媒を添加して沈殿させて得られるものを使用している。さらに、特許文献４では、オーレオバシジウムの培養上清そのものを使用している。これらのβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは粘度が高いために、医薬品や食品などとして実用し難い。
【特許文献１】Fragrance Journal, 5, 71-75 (1995)
【特許文献２】特開昭６２−２０１９０１号公報
【特許文献３】特開平６−３４０７１号公報
【特許文献４】特開平２００２−２０４６８７号公報
【非特許文献１】日経バイオ, No. 2, pp.91-94 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの新たな用途を開発することを第一の課題とする。
【０００９】
また、本発明は、水溶液にする場合に低粘度溶液を与えるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの新たな用途を開発することを第二の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(i) オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンをマウスに経口投与すると、腸管関連リンパ組織（gut-associated lymphoid tissue:GALT）、中でも腸管パイエル板におけるリンパ球の増殖が促進される。
(ii) オーレオバシジウム属に属する微生物が産生するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンをマウスに経口投与すると、腸管関連リンパ組織、中でも腸管パイエル板におけるサイトカインの産生が促進される。
(iii) オーレオバシジウム属に属する微生物が産生するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンをマウスに経口投与すると、腸管関連リンパ組織、中でも腸管パイエル板におけるＩｇＡの産生が促進される。
(iv) オーレオバシジウム属に属する微生物が産生する天然型のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンをアルカリ処理によりｐＨ１２以上とした後、中和することにより得られる低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、天然型と同様の(i)〜(iii)の腸管免疫活性化作用を示す。
【００１１】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の腸管免疫活性化剤などを提供する。
【００１２】
１． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管免疫活性化剤。
【００１３】
２． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項１に記載の腸管免疫活性化剤。
【００１４】
３． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、一次粒子径が０．０５〜２μｍである微粒子状のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む項１又は２に記載の腸管免疫活性化剤。
【００１５】
４． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのβ−１，３結合/β−１，６結合の結合比が０．５〜２である項１〜３のいずれかに記載の腸管免疫活性化剤。
【００１６】
５． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが硫黄含有基を有する項１〜４のいずれかに記載の腸管免疫活性化剤。
【００１７】
６． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン中の金属イオン濃度が、１ｇ当たり０．４ｇ以下である項１〜５のいずれかに記載の腸管免疫活性化剤。
【００１８】
７． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである項１〜６のいずれかに記載の腸管免疫活性化剤。
【００１９】
８． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、天然型β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンをｐＨ１２以上になるようにアルカリ処理した後、中和することにより得られるものである項１〜６のいずれかに記載の腸管免疫活性化剤。
【００２０】
９． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２１】
１０． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項９に記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２２】
１１． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、一次粒子径が０．０５〜２μｍである微粒子状のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む項９又は１０に記載の腸管リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２３】
１２． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのβ−１，３結合/β−１，６結合の結合比が０．５〜２である項９〜１０のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２４】
１３． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが硫黄含有基を有する９〜１２のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２５】
１４． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン中の金属イオン濃度が、１ｇ当たり０．４ｇ以下である項９〜１３のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２６】
１５． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである項９〜１４のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２７】
１６． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、天然型β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンをｐＨ１２以上になるようにアルカリ処理した後、中和することにより得られるものである項９〜１４のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤。
【００２８】
１７． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００２９】
１８． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項１７に記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３０】
１９． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、一次粒子径が０．０５〜２μｍである微粒子状のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む項１７又は１８に記載の腸管関連組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３１】
２０. β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのβ−１，３結合/β−１，６結合の結合比が０．５〜２である項１７〜１９のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３２】
２１． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが硫黄含有基を有する項１７〜２０のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３３】
２２． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン中の金属イオン濃度が、１ｇ当たり０．４ｇ以下である項１７〜２１のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３４】
２３． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求１７〜２２のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３５】
２４． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、天然型β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンをｐＨ１２以上になるようにアルカリ処理した後、中和することにより得られるものである項１７〜２２のいずれかに記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【００３６】
２５． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むＩｇＡの産生誘導剤。
【００３７】
２６． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項２５に記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００３８】
２７． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、一次粒子径が０．０５〜２μｍである微粒子状のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む項２５又は２６に記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００３９】
２８． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのβ−１，３結合/β−１，６結合の結合比が０．５〜２である項２５〜２７のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４０】
２７． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが硫黄含有基を有する項２５〜２８のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４１】
２８． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン中の金属イオン濃度が、１ｇ当たり０．４ｇ以下である項２５〜２７のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４２】
２９． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求２５〜２８のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４３】
３０． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、天然型β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンをｐＨ１２以上になるようにアルカリ処理した後、中和することにより得られるものである項２５〜２８のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４４】
３１． 腸管関連リンパ組織においてＩｇＡを産生するものである項２５〜３０のいずれかに記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【００４５】
３２． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む感染症予防剤。
【００４６】
３３． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項３２に記載の感染症予防剤。
【００４７】
３４． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、一次粒子径が０．０５〜２μｍである微粒子状のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む項３２又は３３に記載の感染症予防剤。
【００４８】
３５． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのβ−１，３結合/β−１，６結合の結合比が０．５〜２である項３２〜３４のいずれかに記載の感染症予防剤。
【００４９】
３６． β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが硫黄含有基を有する項３２〜３５のいずれかに記載の感染症予防剤。
【００５０】
３７． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン中の金属イオン濃度が、１ｇ当たり０．４ｇ以下である項３２〜３６のいずれかに記載の感染症予防剤。
【００５１】
３８． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求３２〜３７のいずれかに記載の感染症予防剤。
【００５２】
３９． β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、天然型β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンをｐＨ１２以上になるようにアルカリ処理した後、中和することにより得られるものである項３２〜３７のいずれかに記載の感染症予防剤。
【００５３】
４０． オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含み、
腸管免疫を活性化する旨、又は感染予防に効果がある旨の表示を付した食品組成物。
【００５４】
４１． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である項４０に記載の食品組成物。
【００５５】
４２． β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである項４０又は４１に記載の食品組成物。
【発明の効果】
【００５６】
本発明により、オーレオバシジウム属に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管免疫活性化剤、腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤、腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡの産生誘導剤、及び感染症予防剤が提供された。
【００５７】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとして、オーレオバシジウム属に属する微生物が産生する天然型のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンをアルカリ処理することにより低粘度にしたものも、天然型と同様の腸管免疫活性化作用などを有し、腸管免疫活性化剤、腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤、腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡの産生誘導剤、及び感染症予防剤の有効成分として有用である。
【００５８】
この低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、オーレオバシジウム属微生物の培養上清をアルカリ処理し、次いで中和することにより得られることから、ろ過や遠心などにより容易に菌体のような不溶性成分と分離することができる。また、水溶液として使用する場合に低粘度で摂取し易い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）医薬
構成
本発明の腸管免疫活性化剤、腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の増殖誘導剤、腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡの産生誘導剤、及び感染症予防剤は、それぞれオーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含む。特に、これを有効成分として含む。
【００６０】
腸管関連組織には、腸管パイエル板、腸管膜リンパ節、粘膜固有層、腸管上皮間リンパ球、クリプトパッチ等が含まれる。
【００６１】
本発明のリンパ球の増殖誘導剤は、腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節、中でも腸管パイエル板におけるリンパ球の増殖を強く誘導することから、腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節におけるリンパ球の増殖誘導剤として好適に使用でき、中でも腸管パイエル板におけるリンパ球の増殖誘導剤として好適に使用できる。
【００６２】
また本発明のサイトカインの産生誘導剤は、腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節、中でも腸管パイエル板におけるサイトカインの産生を強く誘導することから、腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節におけるサイトカインの産生誘導剤として好適に使用でき、中でも腸管パイエル板におけるサイトカインの産生誘導剤として好適に使用できる。
【００６３】
また本発明のＩｇＡ産生誘導剤は、特に腸管関連リンパ組織、中でも腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節におけるＩｇＡ産生を強く誘導することから、腸管関連リンパ組織として好適に使用でき、中でも腸管パイエル板及び腸管膜リンパ節におけるＩｇＡの産生誘導剤として好適に使用でき、腸管パイエル板におけるＩｇＡの誘導剤として一層好適に使用できる。
【００６４】
腸管のリンパ組織において産生されたＩｇＡは、腸管粘膜や消化液中、さらに腸管ばかりではなく粘膜面、例えば唾液や管腔などに存在してウィルス、細菌、細菌の生産する毒素などの生体異物の吸収を阻害する機能を有する。このように、β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンは、腸管におけるＩｇＡ産生能を向上させることにより、微生物感染を予防することができる。このことから、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む製剤は、感染症の予防剤として有用である。
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカン
本発明の医薬製剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの形状は、限定されない。剤形に合わせて、固形又は水溶液などの状態で含まれていればよい。
【００６５】
本発明の各医薬に含まれるβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンはオーレオバシジウム属の微生物が生産するものであるが、このグルカンは、菌体外に分泌されるために回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて生産する。中でも、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株、又はGM-NH-1A2株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれFERM P-19285及びFERM P-19286として寄託済み）が生産するものが好ましい。GM-NH-1A1株及びGM-NH-1A2株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）K-1株の変異株である。オーレオバシジウム属K-1株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを生産することが知られている。また、K-1株の生産するβ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。
【００６６】
GM-NH-1A1株及びGM-NH-1A2株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ−グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが２〜３０万の低分子量のβ−グルカンの両方を生産する菌株である。
【００６７】
本発明の腸管免疫活性化剤、リンパ球の増殖誘導剤、サイトカインの産生誘導剤、ＩｇＡ産生誘導剤、及び感染症予防剤には、好ましくは分子量１万〜５０万程度、より好ましくは２万〜１０万程度の比較的低分子量のβ−１,３−１,６−Ｄ−グルカンが含まれていればよい。上記分子量の範囲であれば、パイエル板を始めとする腸管関連リンパ組織に対する刺激が十分であり、かつ実用上十分な水溶性を有する。この低分子量のグルカンは、例えばオーレオバシジウムプルランスの培養上清から分離したβ−１,３−１,６−Ｄ−グルカンから、フィルターろ過や、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法で微粒子状β−１,３−１,６−Ｄ−グルカンを除くことにより得られる。
【００６８】
また、本発明の各医薬には、可溶性の低分子β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとともに、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である微粒子状のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが含まれていてもよい。本発明の各医薬に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。このような微粒子状のグルカンが含まれている場合は、パイエル板を始めとする腸管関連リンパ組織を効果的に刺激することができる。β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが水溶液として製剤中に含まれている場合は、レシチンのような乳化剤や、環状デキストリンのような安定化剤を水溶液に添加することにより、微粒子をさらに安定化させることができる。
【００６９】
また、本発明の各医薬に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンがオーレオバシジウム・プルランス由来のものである場合は、β-１，３結合／β-１，６結合の結合比は、０．５〜２程度である。
【００７０】
本発明の医薬製剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、金属イオン濃度が、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。製剤中にβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが水溶液状態で含まれる場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
【００７１】
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形製剤においても、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
【００７２】
本発明の各医薬に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、スルホン酸基のような硫黄含有基、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基等の官能基を有するものであってもよい。オーレオバシジウム属細菌が生産するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、通常、硫黄含有基を有する。
【００７３】
本発明の医薬製剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、水溶液にしたときの粘度が低いものであることが好ましい。この低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、好ましくは１０ｃＰ以下であればよい。本発明において、粘度はＢＭ型回転粘度計で測定した値である。この低粘度グルカンは、アルカリ処理していないβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと同じ一次構造を有する。具体的には、上記水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。
生産方法
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法は、周知である。例えば、これを生産する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することによりβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを沈殿物として得ることができる。
【００７４】
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる方法は種々報告されている。使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源を挙げることができる。
【００７５】
窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源を挙げることができる。場合によってはβ−グルカンの生産量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類を添加するのも有効な方法である。
【００７６】
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産するものなら特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
【００７７】
オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件が挙げられる。
【００７８】
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御するのも得策である。更に培養液の消泡のために適宜、泡消剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度が好ましく、通常1〜４日間程度も培養すればβ−グルカンを生産することが可能である。なお、β−グルカンの生産量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
【００７９】
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が０．１％から数％(w/v)含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ([ｍＰａ・s])から数千ｃＰ（[ｍＰａ・s]）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを沈殿物として得ることができる。
＜低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法＞
上記の高粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
【００８０】
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加すればよい。例えば水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が０．５％(w/v)以上、好ましくは１．２５％(w/v)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
【００８１】
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。
【００８２】
次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。
【００８３】
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、０．５ｗ／ｖ％の水溶液の３０℃における粘度が５０ｃＰ以下である。
【００８４】
アルカリ処理された低粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
【００８５】
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
【００８６】
得られるグルカン水溶液を脱塩する場合は、例えば限外ろ過膜を用いて脱塩すればよい。
【００８７】
このようにして得られる水溶液に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま医薬製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを析出させることができる。
【００８８】
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを低粘度化することにより、限ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
【００８９】
固形製剤にする場合は、低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
製剤
本発明の各医薬において、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、必要に応じて薬学的に許容される担体とともに適当な製剤とすることができる。このような担体として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤等が挙げられる。また、酸化防止剤のような慣用の添加剤なども含まれていてよい。
【００９０】
製剤の形態は特に限定されず、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等のどのような形態であってもよい。アルカリ処理された低粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを使用する場合は、高濃度の水溶液を調製できることから、シロップ剤にする場合にも、１日に無理なく摂取できる量に有効量のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含ませることができる。
【００９１】
賦形剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の各種の糖類；バレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン等の各種デンプン類、；結晶セルロース等の各種セルロース類；無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の各種無機塩類等が挙げられる。
【００９２】
結合剤としては、公知のものを使用でき、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【００９３】
崩壊剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００９４】
潤沢剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などが挙げられる。
【００９５】
付湿剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトール等が挙げられる。
【００９６】
製剤中に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの量は、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、１日摂取量が１０〜１０００ｍｇ程度、特に２０〜２００ｍｇ程度になるような量含まれていればよい。上記摂取量の範囲であれば、十分に腸管免疫活性化効果や感染症予防効果が得られるとともに、副作用や毒性が現れるということがない。また、余りに多量を摂取してもそれに見合った効果は得られない。
【００９７】
１日１回投与する製剤である場合は、１日必要量が一つの製剤に含まれていればよく、例えば１日３回投与する製剤である場合は、１日必要量の３分の１が製剤に含まれていればよい。
【００９８】
また、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤のような固形製剤の場合は、製剤中にβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが０．１〜１００重量％程度、特に1〜５０重量％程度含まれていることが好ましい。また、シロップ剤のような液体又は流動状の製剤の場合は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが０．０１〜２重量％程度、特に０．０５〜０．５重量％程度含まれていることが好ましい。上記範囲であれば、摂取し易い製剤量中に、腸管免疫効果や感染症予防効果が十分に得られるとともに、副作用や毒性が現れない程度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが含まれることになる。また、余りに多く含まれていてもそれに見合った効果は得られない。またシロップ剤の場合は、上記範囲であれば、飲み易い粘度のシロップ剤が得られる。
（ＩＩ）食品組成物
本発明の食品組成物は、上記説明したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む。この食品組成物は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含むことから、腸管免疫活性化作用や、感染症予防効果が得られる。このため、保健機能食品、栄養機能食品、特定保健用食品のような栄養補助食品として好適に使用できる。この場合、本発明の食品組成物は、腸管免疫を活性化する旨の表示、又は感染予防に効果がある旨の表示を付したものとすることができる。
実施例
次に実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）低粘度β−１，３−１，６−グルカンの調製
（１-1）β-グルカンの培養生産
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）GM-NH-1A1株（FERM P-19285）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
【００９９】
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ ＯＤで、多糖濃度は０．５％(w/v)で、置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β-グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ−グルカンを回収した。このβ−グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。
【０１００】
このβ−グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の濃度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（(ｍＰａ・ｓ)）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
【０１０３】
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(w/v)となるように２５％(w/w)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(w/v)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ([ｍＰａ・s])であった。
【０１０４】
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(w/v)で、ほぼ１００％の回収率であった。
（１−３）β−グルカン水溶液の脱塩
上記のβ−グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(w/v)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
【０１０５】
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ−グルカン水溶液を得た。この時のβ−グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(w/v)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。また、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。本β-グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。
＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ−１，３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
【０１０６】
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの重水に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
【０１０７】
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
【０１０８】
この結果、本β−グルカンがβ−１，３−１，６−Ｄグルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β−１，３結合/β−１，６結合の比は１．１５であることが判明した。
＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
【０１０９】
０．３μｍのピーク はβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
【０１１０】
また、二次粒子はマグネチックスタラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとβ−１，３−１，６−Ｄグルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
【０１１１】
水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
＜熱安定性＞
上記の（１−１）〜（１−３）に説明したようにして培養、アルカリ処理、除菌、及び脱塩を行い、金属イオンを５０ｍｇ／１００ｍｌ以下とした後、多糖濃度を０．２％（２ｍｇ／ｍｌ）、０．４０％、０．５２％、０．７７％、及び０．９６％に調整した溶液を調製した。各溶液を９０℃のオ−トクレ−ブで１５分間加熱滅菌した。
【０１１２】
加熱によるゲル化の有無を目視観察した。結果を以下の表２に示す。表２中、○印は変化がないことを示し、△印は一部に凝集が観察されたことを示し、×印は流動性のないゲルとなったことを示すを示す。多糖濃度が高いと凝集しやすい傾向が見られた。糖濃度が０．５％（５ｍｇ／ｍｌ）を超えると、凝集の傾向が見られ、０．７％以上では流動性のないゲルとなった。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
＜ｐＨによる溶解度への影響＞
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの溶解度は培養液のｐＨによって大きく変わった。粒度分布測定の結果、粒子として存在するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンはその大部分が０．１μｍ以上の大きさであることが分ったので、アドバンテック社製のフィルター（０．２１μｍ）で通過できるものを溶解しているもの、通過できなかったものを微粒子と考えることができる。ここでは、その存在比（０．２μｍを通過した培養液の多糖の重さ/培養液の多糖の重さ×１００（％））を溶解度と定義する。上記の（１-１）〜（１−３）に説明したようにして培養、アルカリ処理、除菌、及び脱塩した培養液の多糖濃度を０．２％（２ｍｇ／ｍｌ）に調製後、ｐＨを変えた時の溶解度を図３に示す。
＜温度による溶解度への影響＞
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの溶解度は温度によっても大きく変わる。ここでは、温度を変えて、上記のｐＨの検討時と同様にアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行い、溶解度を求めた。培養液の多糖濃度を０．２％（２ｍｇ／ｍｌ）に調製後、温度を変えた時の溶解度を図４に示す。ここでは、その存在比（０．２μｍを通過した培養液の多糖の重さ/培養液の多糖の重さ×１００（％））を溶解度と定義する。
【０１１５】
ｐＨと温度をコントロ−ルすることで溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン、及び微粒子β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを選択的に調製できることが分かる。
（２）粉末化グルカンの調製
（１）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含むβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。次いで、得られた乾燥β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
【０１１６】
一方、水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
【０１１７】
以上のように、オーレオバシジウム（Aureobasidium）属に属する微生物により生産される高粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンをアルカリ処理することにより低粘度化に成功した。本発明者等の手法で得られるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは水溶性成分と微粒子分散成分を含み、ｐＨ、温度でその割合をコントロ−ルできる。また、脱塩工程で金属イオンの濃度をコントロールすることで、保存性および熱安定性に優れた培養液が得られることがわかった。
（３）高純度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末の製造
（１）において得られた培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機40D-4を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置R-3を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
（４）腸管免疫活性化作用の確認
【実施例１】
【０１１８】
β-グルカンの細胞増殖能に与える影響（in vitro）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（７週齢、雄）より、パイエル板（Peyer's patch：ＰＰ）及び脾臓（Spleen:ＳＰＬ）を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過、赤血球溶解を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌとした。
【０１１９】
この細胞液に、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液（終濃度０、５０、２００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｚｙｍｏｓａｎ（１００μｇ／ｍｌ）添加したものをそれぞれ調製した。ＬＰＳはE.coli 055:B5由来のＬＰＳ（SIGMA社、L2880）である。ＬＰＳは種々の組織において免疫を活性化することが知られているものであり、陽性対照として用いた。Zymosan（ザイモサン）はパン酵母(Saccharomyces serevisiae)由来の細胞壁から調製された不溶性β-グルカン標品で、Sigma社よりZymosan A(カタログ番号 Z4250)として販売されている。β-グルカンの比較対照として利用した。
【０１２０】
この細胞を３７℃で４日間、５％ＣＯ２存在下で培養した。４日培養後、ＭＴＳ試薬（CellTiter96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay;Promega）を加え、さらに３７℃で３時間、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【０１２１】
結果を表３及び図５に示す。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板及び脾臓由来のリンパ球の増殖を容量依存的に促進した。
【実施例２】
【０１２４】
β-グルカンのサイトカイン産生能に与える影響（in vitro）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（７週齢、雄）より、パイエル板及び脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過、赤血球溶解を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。
【０１２５】
この細胞液に、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液（終濃度０、５０、２００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｚｙｍｏｓａｎ（１００μｇ／ｍｌ）添加したものをそれぞれ調製した。
【０１２６】
この細胞液を３７℃で７２時間、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養後、ＥＬＩＳＡ法で、培養上清中の各種サイトカイン（ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０），ＩＮＦ−γ）濃度を測定した。
【０１２７】
結果を表４及び図６ａ〜図６ｄに示す。
【０１２８】
【表４】
【０１２９】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板細胞において、ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−１２，ＩＮＦγの産生を容量依存的に増加させた。特に、ＩＬ−５産生誘導能が強かった。また、この低粘度グルカンは、脾臓細胞においても、Ｉｌ−６，ＩＮＦ−ガンマの産生を促進したが、ＩＬ−５，ＩＬ−１２の有意な産生誘導は観察されなかった。
【実施例３】
【０１３０】
β-グルカンの免疫グロブリン産生能に与える影響（in vitro）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（７週齢、雄）より、パイエル板及び脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過、赤血球溶解を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌとした。
【０１３１】
この細胞液に、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液（終濃度０、５０、２００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｚｙｍｏｓａｎ（１００μｇ／ｍｌ）添加したものをそれぞれ調製した。
【０１３２】
この細胞液を３７℃で１週間、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養後、ＥＬＩＳＡ法で、培養上清中の各種免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）濃度を測定した。
【０１３３】
結果を表５及び図７ａ〜図７ｄに示す。
【０１３４】
【表５】
【０１３５】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板細胞において、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａの産生を容量依存的に増大させた。また、脾臓細胞においては、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａの産生を容量依存的に増大させたが、ＩｇＡの有意な産生誘導は観察されなかった。
【実施例４】
【０１３６】
β-グルカンのリンパ球細胞分裂能に与える影響（in vivo）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（６週齢、雌）に連続して７日間、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液からエタノール沈殿により回収した粉末を１日当たり０〜２０００μｇ／２００μｌ経口投与した。投与終了後、パイエル板、腸管膜リンパ節（mesenteric lymph nodes：ＭＬＮ）、脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌとした。
【０１３７】
この細胞液に、マイトジェンとして、経口投与したと同じβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを０〜２００μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【０１３８】
この細胞液を３７℃で２日間、５％ＣＯ２存在下で培養し、トリチウムチミジン（０．５μＣｉ／１０μｌ）を添加した。さらに、同条件下で２０時間培養を継続した後、チミジンの取り込み量をカウントした。
【０１３９】
結果を表６及び図８ａ〜図８ｃに示す。
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板において、生理食塩水を用いた対照群に比べて、チミジンの取り込みを有意に増大させた。また、腸管膜リンパ節では、マイトジェン刺激した場合に、低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンによるチミジン取り込み量の有意な増大が認められた。一方、脾臓においては、マイトジェン刺激の有無にかかわらず、チミジン取り込み量の有意な増大は認められなかった。
【０１４２】
このことから、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管リンパ組織におけるリンパ球細胞分裂を促進することが分かる。特に、腸管パイエル板におけるリンパ球細胞分裂を強く促進する。
【実施例５】
【０１４３】
β-グルカンのサイトカイン産生能に与える影響（in vivo）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（６週齢、雌）に連続して７日間、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液からエタノール沈殿により回収した粉末を１日当たり０〜２０００μｇ／２００μｌ経口投与した。投与終了後、パイエル板、腸管膜リンパ節、及び脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。
【０１４４】
この細胞液に、マイトジェンとして、経口投与したと同じβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを０〜２００μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【０１４５】
この細胞液を３７℃で７２時間、５％ＣＯ２存在下で培養した後、細胞上清中のサイトカイン（ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＮＦ−γ）濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【０１４６】
結果を表７及び図９ａ〜図９ｉに示す。
【０１４７】
【表７】
【０１４８】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板において、生理食塩水を用いた対照群に比べて、ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＮＦ−γの産生を有意に増大させた。また、腸管膜リンパ節では、マイトジェン刺激した場合に、ＩＬ−６，ＩＮＦ−γの産生が有意に増大した。脾臓においては、マイトジェン刺激した場合にＩＮＦ−γの産生が有意に増大した。
【０１４９】
このことから、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管リンパ組織におけるサイトカインの産生を促進することが分かる。特に、腸管パイエル板におけるサイトカインの産生を強く促進する。
【実施例６】
【０１５０】
β-グルカンのＩｇＡ産生に与える影響（in vivo）
Ｂａｌｂ／ｃＡマウス（６週齢、雌）に連続して７日間、（１）で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液からエタノール沈殿により回収した粉末を１日当たり０〜２０００μｇ／２００μｌ経口投与した。投与終了後、パイエル板、腸管膜リンパ節及び脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理、洗浄、ろ過を行い、各組織のリンパ球細胞液を調製した。細胞密度は、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。
【０１５１】
この細胞液に、マイトジェンとして、経口投与したと同じβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを０〜２００μｇ／ｍｌとなるように添加した。
【０１５２】
この細胞液を３７℃で１週間、５％ＣＯ２存在下で培養した後、細胞上清中のＩｇＡ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【０１５３】
結果を表８及び図１０ａ〜図１０ｃに示す。
【０１５４】
【表８】
【０１５５】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管パイエル板において、生理食塩水を用いた対照群に比べて、ＩｇＡの産生を有意に増大させた。また、腸管膜リンパ節では、マイトジェン刺激した場合に、ＩｇＡの産生を有意に増大させた。一方、脾臓においては、ＩｇＡ産生の有意な増大は認められなかった。
【０１５６】
このことから、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、腸管リンパ組織におけるＩｇＡの産生を促進することが分かる。特に、腸管パイエル板におけるＩｇＡの産生を強く促進する。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）スペクトルを示す。
【図２】超音波照射後の粒度分布（メジアン径０．２３μｍ）を示す。
【図３】溶解度とｐＨとの関係を示すグラフである。
【図４】溶解度と温度との関係を示すグラフである。
【図５】細胞レベルでのリンパ球の増殖に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図６ａ】細胞レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図６ｂ】細胞レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図６ｃ】細胞レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図６ｄ】細胞レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図７ａ】細胞レベルでの免疫グロブリン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図７ｂ】細胞レベルでの免疫グロブリン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図７ｃ】細胞レベルでの免疫グロブリン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図７ｄ】細胞レベルでの免疫グロブリン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図８ａ】生体レベルでのリンパ球産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図８ｂ】生体レベルでのリンパ球産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図８ｃ】生体レベルでのリンパ球産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ａ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｂ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｃ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｄ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｅ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｆ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｇ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｈ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図９ｉ】生体レベルでのサイトカイン産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図１０ａ】生体レベルでのＩｇＡ産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図１０ｂ】生体レベルでのＩｇＡ産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【図１０ｃ】生体レベルでのＩｇＡ産生に及ぼすβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの影響を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管免疫活性化剤。
【請求項２】
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求項１に記載の腸管免疫活性化剤。
【請求項３】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である請求項１又は２に記載の腸管免疫活性化剤。
【請求項４】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むリンパ球の増殖誘導剤。
【請求項５】
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求項４に記載のリンパ球の増殖誘導剤。
【請求項６】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である請求項４又は５に記載のリンパ球の増殖誘導剤。
【請求項７】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【請求項８】
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求項７に記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【請求項９】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である請求項７又は８に記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【請求項１０】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むＩｇＡの産生誘導剤。
【請求項１１】
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求項１０に記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【請求項１２】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である請求項１０又は１１に記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【請求項１３】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む感染症予防剤。
【請求項１４】
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求項１３に記載の感染症予防剤。
【請求項１５】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である請求項１３又は１４に記載の感染症予防剤。
【請求項１６】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含み、
腸管免疫を活性化する旨、又は感染予防に効果がある旨の表示を付した食品組成物。
【請求項１】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管免疫活性化剤。
【請求項２】
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求項１に記載の腸管免疫活性化剤。
【請求項３】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である請求項１又は２に記載の腸管免疫活性化剤。
【請求項４】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むリンパ球の増殖誘導剤。
【請求項５】
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求項４に記載のリンパ球の増殖誘導剤。
【請求項６】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である請求項４又は５に記載のリンパ球の増殖誘導剤。
【請求項７】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【請求項８】
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求項７に記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【請求項９】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である請求項７又は８に記載の腸管関連リンパ組織におけるサイトカインの産生誘導剤。
【請求項１０】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むＩｇＡの産生誘導剤。
【請求項１１】
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求項１０に記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【請求項１２】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である請求項１０又は１１に記載のＩｇＡの産生誘導剤。
【請求項１３】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む感染症予防剤。
【請求項１４】
β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンが、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、該水溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである請求項１３に記載の感染症予防剤。
【請求項１５】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量が１万〜５０万である請求項１３又は１４に記載の感染症予防剤。
【請求項１６】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含み、
腸管免疫を活性化する旨、又は感染予防に効果がある旨の表示を付した食品組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図６ｄ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図７ｄ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図９ｄ】
【図９ｅ】
【図９ｆ】
【図９ｇ】
【図９ｈ】
【図９ｉ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図６ｄ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図７ｄ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図９ｄ】
【図９ｅ】
【図９ｆ】
【図９ｇ】
【図９ｈ】
【図９ｉ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【公開番号】特開２００６−１３７７１９（Ｐ２００６−１３７７１９Ａ）
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３２９８８０（Ｐ２００４−３２９８８０）
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【出願人】（０００１０８９９３）ダイソー株式会社 (229)
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【出願人】（０００１０８９９３）ダイソー株式会社 (229)
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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