アシル−リン酸及びホスホン酸プローブ並びにその合成方法並びにプロテオーム分析における使用
本発明は、標識化されたアシルリン酸プローブ（「ＴＡＰＰ」）並びにその調製方法及び使用方法を提供する。標記方法及び組成物は、複合タンパク質混合物内の標的タンパク質、好ましくはヌクレオチド結合タンパク質の存在、量又は活性の変化を、ヌクレオチド結合タンパク質指向ＴＡＰＰを使って明らかにする際に、簡便さ及び精度を向上させる。本明細書で記載されるプロファイリング方法は、複合タンパク質混合物内の標的ヌクレオチド結合タンパク質の識別のためのいくつかの段階を有することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化１】
式中、ＢＡＳＥは１〜３個の環窒素を含む５員環又は６員環の不飽和複素環であり、前記５員環又は６員環の不飽和複素環は環窒素を通してリボース又はデオキシリボースの１’位と共有結合で結ばれ、前記５員環又は６員環の不飽和複素環はそれに縮合した６員環の不飽和炭素環又は複素環を任意選択で含み、前記縮合環は１〜２個の環窒素を含み、ＢＡＳＥの各炭素位は、−Ｈ、−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、＝Ｏ、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、又は−（ＣＨ２）ｍＯＨからなる群から独立して選択される置換基によって任意選択で置換されていてもよく；
Ｒ２’及びＲ３’は独立に−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、−（ＣＨ２）ｍＯＨ、又は−（ＣＨ２）ｍ−フェニルからなる群から選択され、前記フェニルは任意選択で−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、−（ＣＨ２）ｍＯＨで置換されており；
ｎは０〜２であり；
ｍは０〜６であり；
ＴＡＧは検出可能な標識であり；
各Ｚは独立してＯ、Ｓ、ＮＨ又はメチレンであり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）−からなる群から選択される１〜４０個の骨格原子の任意選択で存在するアルキル又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル又はヘテロアルキル基は任意選択で炭素環又は複素環の基を含み；
各Ｒは、独立してＨ又は−Ｃ１〜６アルキルの直鎖若しくは分岐鎖であり、又は任意選択で、任意選択で置換された縮合炭素環若しくは複素環構造を形成し；
Ｌに隣接したカルボニルは炭素と結合してアシル基を形成する、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項２】
ＢＡＳＥはプリンである、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
ＢＡＳＥはピリミジンである、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
ＢＡＳＥはアデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、イノシン、５−ブロモウラシル、５−フルオロウラシル、２−アミノプリン、Ｎ６−シクロヘキシルアデニン、８−アザグアニン及び５−フルオロシトシンからなる群から選択される、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
ＢＡＳＥはアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される、請求項４記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
Ｒ２’及びＲ３’は独立してＨ又はＯＨである、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
Ｒ２’及びＲ３’はそれぞれＯＨである、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
Ｌは下記構造を有し、
【化２】
式中、ｘ及びｙは独立して０〜４の範囲内にあり、ＸはＯ又はＣＨ２である、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項９】
Ｌは下記構造を有する、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【化３】
【請求項１０】
Ｌは下記構造を有する、請求項８記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
−ＮＨ（ＣＨ２）２（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜４−
【請求項１１】
Ｌはトリアゾール部を含む、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項１２】
Ｌは下記の部分を含む、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【化４】
【請求項１３】
ＴＡＧは下記からなる群から選択され：
【化５】
式中、５−置換カルボキシローダミン又は５−置換カルボキシフルオレセインは、６−カルボキシローダミン又は６−カルボキシフルオレセイン、或いは５−置換及び６−置換カルボキシローダミン又はカルボキシフルオレセインの混合体で置換することができる、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化６】
式中、
ＢＡＳＥは１〜３個の環窒素を含む５員環又は６員環の不飽和複素環であり、前記５員環又は６員環の不飽和複素環は環窒素を通してリボース又はデオキシリボースの１’位と共有結合で結ばれ、前記５員環又は６員環の不飽和複素環はそれに縮合した６員環の不飽和炭素環又は複素環を任意選択で含み、前記縮合環は１〜２個の環窒素を含み、ＢＡＳＥの各炭素位は、−Ｈ、−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、＝Ｏ、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、又は−（ＣＨ２）ｍＯＨからなる群から独立して選択される置換基によって任意選択で置換されていてもよく；
Ｒ２’及びＲ３’及びＲ５’の１つは以下の構造を有し：
【化７】
Ｒ２’及びＲ３’及びＲ５’の他の２つは独立に−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、−（ＣＨ２）ｍＯＨ、又は−（ＣＨ２）ｍ−フェニルからなる群から選択され、前記フェニルは任意選択で−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、−（ＣＨ２）ｍＯＨで置換されており；
ｎは０〜２であり；
ｍは０〜６であり；
ＴＡＧは検出可能な標識であり；
各Ｚは独立してＯ、Ｓ、ＮＨ又はメチレンであり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）−からなる群から選択される１〜４０個の骨格原子の任意選択で存在するアルキル又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル又はヘテロアルキル基は任意選択で炭素環又は複素環の基を含み；
各Ｒは、独立してＨ又は−Ｃ１〜６アルキルの直鎖若しくは分岐鎖であり、又は任意選択で、任意選択で置換された縮合炭素環若しくは複素環構造を形成し；
Ｌに隣接したカルボニルは炭素と結合してアシル基を形成する、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項１５】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化８】
式中、
ｎは１〜４であり；
ＴＡＧは検出可能な標識である、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項１６】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化９】
式中、
ｎは１〜４であり；
ＴＡＧは検出可能な標識である、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項１７】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化１０】
式中、
ｎは１〜４であり；
ＴＡＧは検出可能な標識である、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項１８】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化１１】
式中、
ｎは１〜４であり；
ＴＡＧは検出可能な標識である、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項１９】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化１２】
式中、
ｎは１〜４であり；
ＴＡＧは検出可能な標識である、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項２０】
複合タンパク混合物中の１つ又は複数の標的タンパク質の酵素プロフィールを決定する方法であって、リンカー部分「Ｌ」を通してＴＡＧと更に共有結合するアシル基と、５’の一、二若しくは三リン酸の末端リン酸基を通して共有結合するヌクレオチドを含む１つ又は複数のプローブを使用し、前記アシル基は前記プローブが前記標的タンパク質と結合するときに前記標的タンパク質と共に付加体を形成し、
反応媒体中で前記プローブと前記複合タンパク質混合物とを前記プローブと前記ヌクレオチド結合タンパク質との反応条件下で結合させて前記プローブと前記標的タンパク質とのコンジュゲートを形成するステップ；及び
それによって形成される１つ又は複数のコンジュゲートからシグナルを生成することによって前記酵素プロフィールを決定するステップ、
を含み、前記プローブは、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のヌクレオチド結合タンパク質指向プローブから選択される方法。
【請求項２１】
前記プローブは複数の標的タンパク質と結合する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
下記構造を有する精製された標識化ポリペプチドを含む組成物であって：
【化１３】
式中、ＴＡＧは検出可能な標識又は固体支持体であり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）−からなる群から選択される１〜４０個の骨格原子の任意選択で存在するアルキル又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル又はヘテロアルキルは任意選択で炭素環又は複素環の基を含み；
Ｌに隣接したカルボニルは炭素と結合してアシル基を形成し；
前記アシル基はアミド、エステル又はチオエステル結合を通してポリペプチドのアミノ酸残基と共有結合する、組成物。
【請求項２３】
Ｌは下記構造を有し：
【化１４】
式中、ｘ及びｙは独立して０〜４の範囲内にあり、ＸはＯ又はＣＨ２である、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
Ｌは下記構造を有する、請求項２２記載の組成物。
【化１５】
【請求項２５】
Ｌは下記構造を有する、請求項２０記載の組成物。
−ＮＨ（ＣＨ２）２（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜４−
【請求項２６】
前記ＴＡＧは下記からなる群から選択され：
【化１６】
式中、５−置換カルボキシローダミン又は５−置換カルボキシフルオレセインは、６−カルボキシローダミン又は６−カルボキシフルオレセイン、或いは５−置換及び６−置換のカルボキシローダミン又はカルボキシフルオレセインの混合体で置換することができる、請求項２０記載の組成物。
【請求項２７】
下記式を有する標識化アシルリン酸又はアシルホスホン酸のプローブであって、
【化１７】
式中、
Ｘは、酸素又は炭素を通して前記リン酸と結合する１つ又は複数の標的タンパク質に前記ＴＡＰＰを結合させるための親和性部分であり；
ＴＡＧは検出可能な標識であり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）−からなる群から選択される１〜４０個の骨格原子の任意選択で存在するアルキル又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル又はヘテロアルキル基は任意選択で炭素環又は複素環の基を含み；
各Ｒは、独立してＨ又は−Ｃ１〜６アルキルの直鎖若しくは分岐鎖であり、又は任意選択で、任意選択で置換された縮合炭素環若しくは複素環構造を形成し；
Ｌに隣接したカルボニルは炭素と結合してアシル基を形成する、
プローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項２８】
Ｘはヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、任意選択で置換されたナフチル基、小分子、ステロイド、ペプチドホルモン、酵素コファクター、ビタミン、酵素基質、脂質、プロスタグランジン又は受容体リガンドからなる群から選択される、請求項２７記載の標識化アシルリン酸プローブ。
【請求項２９】
標識化されたアシルリン酸又はホスホン酸のプローブを合成する方法であって：
末端がカルボキシル基の結合基Ｌを含む検出可能な標識を、ジイソプロピルカルボジイミド又はイソブチルクロロホルメート及びトリエチルアミンの存在下で、利用可能な−ＯＨ基を含む５’−結合リン酸を含むヌクレオチド又はヌクレオチド類似体と接触させることにより前記標識化されたアシルリン酸又はホスホン酸のプローブを形成するステップ；及び
前記プローブを精製するステップ、
を含む方法。
【請求項１】
下記式を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化１】
式中、ＢＡＳＥは１〜３個の環窒素を含む５員環又は６員環の不飽和複素環であり、前記５員環又は６員環の不飽和複素環は環窒素を通してリボース又はデオキシリボースの１’位と共有結合で結ばれ、前記５員環又は６員環の不飽和複素環はそれに縮合した６員環の不飽和炭素環又は複素環を任意選択で含み、前記縮合環は１〜２個の環窒素を含み、ＢＡＳＥの各炭素位は、−Ｈ、−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、＝Ｏ、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、又は−（ＣＨ２）ｍＯＨからなる群から独立して選択される置換基によって任意選択で置換されていてもよく；
Ｒ２’及びＲ３’は独立に−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、−（ＣＨ２）ｍＯＨ、又は−（ＣＨ２）ｍ−フェニルからなる群から選択され、前記フェニルは任意選択で−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、−（ＣＨ２）ｍＯＨで置換されており；
ｎは０〜２であり；
ｍは０〜６であり；
ＴＡＧは検出可能な標識であり；
各Ｚは独立してＯ、Ｓ、ＮＨ又はメチレンであり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）−からなる群から選択される１〜４０個の骨格原子の任意選択で存在するアルキル又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル又はヘテロアルキル基は任意選択で炭素環又は複素環の基を含み；
各Ｒは、独立してＨ又は−Ｃ１〜６アルキルの直鎖若しくは分岐鎖であり、又は任意選択で、任意選択で置換された縮合炭素環若しくは複素環構造を形成し；
Ｌに隣接したカルボニルは炭素と結合してアシル基を形成する、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項２】
ＢＡＳＥはプリンである、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
ＢＡＳＥはピリミジンである、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
ＢＡＳＥはアデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、イノシン、５−ブロモウラシル、５−フルオロウラシル、２−アミノプリン、Ｎ６−シクロヘキシルアデニン、８−アザグアニン及び５−フルオロシトシンからなる群から選択される、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
ＢＡＳＥはアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される、請求項４記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
Ｒ２’及びＲ３’は独立してＨ又はＯＨである、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
Ｒ２’及びＲ３’はそれぞれＯＨである、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
Ｌは下記構造を有し、
【化２】
式中、ｘ及びｙは独立して０〜４の範囲内にあり、ＸはＯ又はＣＨ２である、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項９】
Ｌは下記構造を有する、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【化３】
【請求項１０】
Ｌは下記構造を有する、請求項８記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
−ＮＨ（ＣＨ２）２（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜４−
【請求項１１】
Ｌはトリアゾール部を含む、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項１２】
Ｌは下記の部分を含む、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【化４】
【請求項１３】
ＴＡＧは下記からなる群から選択され：
【化５】
式中、５−置換カルボキシローダミン又は５−置換カルボキシフルオレセインは、６−カルボキシローダミン又は６−カルボキシフルオレセイン、或いは５−置換及び６−置換カルボキシローダミン又はカルボキシフルオレセインの混合体で置換することができる、請求項１記載のアシル−ヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化６】
式中、
ＢＡＳＥは１〜３個の環窒素を含む５員環又は６員環の不飽和複素環であり、前記５員環又は６員環の不飽和複素環は環窒素を通してリボース又はデオキシリボースの１’位と共有結合で結ばれ、前記５員環又は６員環の不飽和複素環はそれに縮合した６員環の不飽和炭素環又は複素環を任意選択で含み、前記縮合環は１〜２個の環窒素を含み、ＢＡＳＥの各炭素位は、−Ｈ、−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、＝Ｏ、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、又は−（ＣＨ２）ｍＯＨからなる群から独立して選択される置換基によって任意選択で置換されていてもよく；
Ｒ２’及びＲ３’及びＲ５’の１つは以下の構造を有し：
【化７】
Ｒ２’及びＲ３’及びＲ５’の他の２つは独立に−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、−（ＣＨ２）ｍＯＨ、又は−（ＣＨ２）ｍ−フェニルからなる群から選択され、前記フェニルは任意選択で−Ｆ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−ＳＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ）、アセトキシ、−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）（Ｒ）、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、メチレンジオキシ、トリハロメチル、トリハロメトキシ、−（ＣＨ２）ｍＯＨで置換されており；
ｎは０〜２であり；
ｍは０〜６であり；
ＴＡＧは検出可能な標識であり；
各Ｚは独立してＯ、Ｓ、ＮＨ又はメチレンであり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）−からなる群から選択される１〜４０個の骨格原子の任意選択で存在するアルキル又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル又はヘテロアルキル基は任意選択で炭素環又は複素環の基を含み；
各Ｒは、独立してＨ又は−Ｃ１〜６アルキルの直鎖若しくは分岐鎖であり、又は任意選択で、任意選択で置換された縮合炭素環若しくは複素環構造を形成し；
Ｌに隣接したカルボニルは炭素と結合してアシル基を形成する、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項１５】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化８】
式中、
ｎは１〜４であり；
ＴＡＧは検出可能な標識である、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項１６】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化９】
式中、
ｎは１〜４であり；
ＴＡＧは検出可能な標識である、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項１７】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化１０】
式中、
ｎは１〜４であり；
ＴＡＧは検出可能な標識である、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項１８】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化１１】
式中、
ｎは１〜４であり；
ＴＡＧは検出可能な標識である、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項１９】
下記構造を有するアシル−ヌクレオチドプローブであって、
【化１２】
式中、
ｎは１〜４であり；
ＴＡＧは検出可能な標識である、
アシル−ヌクレオチドプローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項２０】
複合タンパク混合物中の１つ又は複数の標的タンパク質の酵素プロフィールを決定する方法であって、リンカー部分「Ｌ」を通してＴＡＧと更に共有結合するアシル基と、５’の一、二若しくは三リン酸の末端リン酸基を通して共有結合するヌクレオチドを含む１つ又は複数のプローブを使用し、前記アシル基は前記プローブが前記標的タンパク質と結合するときに前記標的タンパク質と共に付加体を形成し、
反応媒体中で前記プローブと前記複合タンパク質混合物とを前記プローブと前記ヌクレオチド結合タンパク質との反応条件下で結合させて前記プローブと前記標的タンパク質とのコンジュゲートを形成するステップ；及び
それによって形成される１つ又は複数のコンジュゲートからシグナルを生成することによって前記酵素プロフィールを決定するステップ、
を含み、前記プローブは、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のヌクレオチド結合タンパク質指向プローブから選択される方法。
【請求項２１】
前記プローブは複数の標的タンパク質と結合する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
下記構造を有する精製された標識化ポリペプチドを含む組成物であって：
【化１３】
式中、ＴＡＧは検出可能な標識又は固体支持体であり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）−からなる群から選択される１〜４０個の骨格原子の任意選択で存在するアルキル又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル又はヘテロアルキルは任意選択で炭素環又は複素環の基を含み；
Ｌに隣接したカルボニルは炭素と結合してアシル基を形成し；
前記アシル基はアミド、エステル又はチオエステル結合を通してポリペプチドのアミノ酸残基と共有結合する、組成物。
【請求項２３】
Ｌは下記構造を有し：
【化１４】
式中、ｘ及びｙは独立して０〜４の範囲内にあり、ＸはＯ又はＣＨ２である、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
Ｌは下記構造を有する、請求項２２記載の組成物。
【化１５】
【請求項２５】
Ｌは下記構造を有する、請求項２０記載の組成物。
−ＮＨ（ＣＨ２）２（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜４−
【請求項２６】
前記ＴＡＧは下記からなる群から選択され：
【化１６】
式中、５−置換カルボキシローダミン又は５−置換カルボキシフルオレセインは、６−カルボキシローダミン又は６−カルボキシフルオレセイン、或いは５−置換及び６−置換のカルボキシローダミン又はカルボキシフルオレセインの混合体で置換することができる、請求項２０記載の組成物。
【請求項２７】
下記式を有する標識化アシルリン酸又はアシルホスホン酸のプローブであって、
【化１７】
式中、
Ｘは、酸素又は炭素を通して前記リン酸と結合する１つ又は複数の標的タンパク質に前記ＴＡＰＰを結合させるための親和性部分であり；
ＴＡＧは検出可能な標識であり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（Ｒ）（Ｒ）−からなる群から選択される１〜４０個の骨格原子の任意選択で存在するアルキル又はヘテロアルキル基であり、前記アルキル又はヘテロアルキル基は任意選択で炭素環又は複素環の基を含み；
各Ｒは、独立してＨ又は−Ｃ１〜６アルキルの直鎖若しくは分岐鎖であり、又は任意選択で、任意選択で置換された縮合炭素環若しくは複素環構造を形成し；
Ｌに隣接したカルボニルは炭素と結合してアシル基を形成する、
プローブ或いはその薬剤として許容される塩又は複合体。
【請求項２８】
Ｘはヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、任意選択で置換されたナフチル基、小分子、ステロイド、ペプチドホルモン、酵素コファクター、ビタミン、酵素基質、脂質、プロスタグランジン又は受容体リガンドからなる群から選択される、請求項２７記載の標識化アシルリン酸プローブ。
【請求項２９】
標識化されたアシルリン酸又はホスホン酸のプローブを合成する方法であって：
末端がカルボキシル基の結合基Ｌを含む検出可能な標識を、ジイソプロピルカルボジイミド又はイソブチルクロロホルメート及びトリエチルアミンの存在下で、利用可能な−ＯＨ基を含む５’−結合リン酸を含むヌクレオチド又はヌクレオチド類似体と接触させることにより前記標識化されたアシルリン酸又はホスホン酸のプローブを形成するステップ；及び
前記プローブを精製するステップ、
を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００６−５２６０１０（Ｐ２００６−５２６０１０Ａ）
【公表日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９５９２（Ｐ２００６−５０９５９２）
【出願日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１００７５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０１５４
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５０５３６７１８７）アクティブクス バイオサイエンシズ、インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１００７５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０１５４
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５０５３６７１８７）アクティブクス バイオサイエンシズ、インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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