アミロイド前駆体タンパク質又はβアミロイド断片に結合する物質を検出する方法及び結合化合物
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はＡＰＰの＆ｂｇｒ；−アミロイド（Ａ＆ｂｇｒ；）断片への、物質の結合特性を同定及び評価するための方法が開示されている。ＡＰＰ又はＡ＆ｂｇｒ；と特異的に相互作用し、ＡＰＰ又はＡ＆ｂｇｒ；の、セクレアターゼ又はＡＰＰ若しくはＡ＆ｂｇｒ；結合抗体との相互作用を遮断する、式（Ｉ）のベンゾフラン誘導体のクラスも開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００４年４月７日に出願された米国仮出願第６０／５５８，８５５号及び２００４年７月１５日に出願された第６０／５８８，１８５号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的には、アルツハイマー病（「ＡＤ」）に付随する神経学的及び生理学的な機能不全の分野に関する。より具体的には、本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）への、又はＡＰＰのβ−アミロイド（Ａβ）断片への、物質の結合特性を同定及び評価するための方法に関する。本発明は、ＡＰＰ又はＡβと特異的に相互作用し、ＡＰＰ又はＡβの、セクレターゼとの又はＡＰＰ若しくはＡβ結合抗体との相互作用を遮断する、ベンゾフラン誘導体のクラスにも関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病は、高齢者を侵す一般的な神経変性疾患である。本疾患の主な特徴には、進行性の記憶障害、言語及び視覚空間能力の喪失並びに行動の不足が含まれる。これらの認知機能の変化は、大脳皮質、海馬、前脳基底部及び脳の他の領域中の神経細胞の変性の結果である。アミロイドβペプチド（Ａβ）と名付けられた３９−４３個のアミノ酸ペプチドの蓄積が、アルツハイマー病の原因であると考えられる。Ａβは、β−アミロイドタンパク質切断酵素（「β−セクレターゼ」又は「ＢＡＣＥ」）及びγ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセッシングによって脳内で産生される。このプロセッシングは、脳内のＡβの蓄積をもたらす。
【０００４】
ＡＤの病因を解明する上での最近の進歩の多くは、この複雑な疾患の遺伝的に多様な形態の統一的な病理的特徴として、Ａβの明白な役割に中心を据えている。ＡＤに特徴的な神経病理学的特性は、アミロイド斑として知られる不溶性のタンパク質堆積物が罹病者の脳内に蓄積することである。これらのアミロイド斑堆積物の存在は、アミロイド仮説の基礎を成す不可欠な観察である。
【０００５】
Ａβの堆積が、アミロイド斑の発生及びＡＤの発症に重要な役割を果たしていることが、証拠によって示唆されている。例えば、ＡＰＰをコードする遺伝子（Ａβタンパク質は、該遺伝子に由来する。）中に変異を有する個体は、アルツハイマー病を必ず発症する（Ｇｏａｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８４４−８４６； Ｍｕｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １：３４５−３４７； Ｍｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：９７−９９； Ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ， １９９５， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． ３５：８−１９）。同様に、ほぼ全てのアルツハイマー病患者の脳内にアミロイド斑が認められること、及びアミロイド斑の蓄積の程度が認知症の程度と相関することが、剖検によって示されている（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＆ Ｃｏｔｍａｎ， １９９５， Ｌａｎｃｅｔ ３２６：１５２４−１５８７）。
【０００６】
Ａβの細胞外蓄積と堆積がＡＤの発症における中心的な現象であることが、多くの証拠によって示唆されている一方、Ａβ又はアミロイド含有Ｃ末端断片（ＣＴＦβ）の細胞内蓄積の増加も、ＡＤの病態生理に役割を果たしている可能性があることが、最近の研究によって提起されている。例えば、家族性ＡＤを引き起こす変異を保有するＡＰＰの過剰発現は、神経細胞培養物中へのＣＴＦβの細胞内蓄積とＨＥＫ２９３細胞中へのＡβ４２の細胞内蓄積を増加させる。Ａβ４２は、Ａβのより短い形態より、アミロイド斑形成の点でさらに有効であると考えられている、４２アミノ酸のＡβの長い形態である。さらに、海馬の神経細胞中の異なる細胞プール中に細胞内及び細胞外Ａβが形成されること、並びにＡβ４２の細胞内蓄積の増加は、ＡＰＰ中の家族性ＡＤ突然変異の２つの種類（「スウェーデン」と「ロンドン」）に付随する共通の特徴である。このように、ＡＤの病変における細胞外Ａβ蓄積の関与を示唆するこれらの研究及びさらに初期の報告に基づけば、変化を受けたＡＰＰ異化作用が疾病の進行に関与している可能性があると思われる。
【０００７】
ＡＰＰは、様々なタンパク分解プロセッシング現象を実行する遍在性の膜貫通（１型）糖タンパク質である。（Ｓｅｌｋｏｅ， １９９８， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：４４７−４５３）。ＡＰＰは、実際には、単一遺伝子からの選択的スプライシングによって産生されるペプチドのファミリーである。ＡＰＰの主要な形態は、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０として知られており、下付き文字は、各スプライスバリアント中のアミノ酸の数を表している（Ｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２５−５２７； Ｔａｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２８−５３０； Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５３０−５３２）。ＡＰＰは、多くの細胞中で発現されており、恒常的に異化される。
【０００８】
ＡＰＰは、巨大な外部ドメイン、膜貫通領域及び短い細胞質尾部を有する受容体様構造を有する。Ａβドメインは、ＡＰＰの細胞外及び膜貫通両ドメインの一部を包含する。ＡＰＰからのＡβの放出は、ＡβのＮＨ２末端及びＣＯＯＨ末端を生成するために、２つの異なるタンパク分解現象が存在することを示唆する。膜からＡＰＰを放出し、ＡＰＰの可溶性ＣＯＯＨ末端切断形態（「分泌されたＡＰＰ」又は「ｓＡＰＰ」）を生成する、少なくとも２つの分泌機構が存在する。膜からＡＰＰ及びその断片を放出するプロテアーゼは、「セクレターゼ」と称されている。
【０００９】
主要な異化経路は、α−セクレターゼによる、Ａβ配列内でのＡＰＰの切断であると思われ、可溶性細胞外ドメイン（ｓＡＰＰα）の恒常的分泌及び非アミロイド産生性細胞内断片（約９ｋＤ）（恒常的カルボキシ末端断片（ｃＣＴＦα）と称される。）の出現をもたらす。ｃＣＴＦαは、γ−セクレターゼによる切断のための適切な基質であり、ｐ３断片を与える。この経路は、種間で広く保存されており、多くの細胞種中に存在するようである（Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｅｌｌ ５７：１１５−１２６； Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：４４９２−４４９７； ａｎｄ Ｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４Ｓ：１１２２−１１２４）。この経路では、ＡＰＰのプロセッシングは、Ａβ領域の残基Ｌｙｓ１６とＬｅｕ１７間の部位でのタンパク分解切断を伴うが、ＡＰＰは、なお、トランスゴルジ分泌コンパートメント中に存在する（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７７３−７７６）。この切断は、ＡＰＰのＡβ部分内で起こるので、Ａβの形成を伴わない。ｓＡＰＰαは、神経栄養及び神経保護活性を有する（Ｋｕｅｎｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２９５：３６７−３７８）。
【００１０】
α−セクレターゼが関与する非アミロイド産生経路とは異なり、β−セクレターゼによるＡＰＰのタンパク分解プロセッシングは、ＡβのＮ末端を露出させ、完全なＡβドメインを含有するＣＯＯＨ末端断片（Ｃ末端断片又はＣＴＦ）を産生する。様々なＣ末端におけるγ−セクレターゼ切断後に、Ａβが解離される。γ−セクレターゼ活性は、単一のペプチド結合においてではなく、ＡＰＰアミノ酸の短い連なりにわたって生じるので、Ｃ末端は、実際には、単一部位ではなく、むしろ切断部位の異種的集合物である。アミロイド産生経路では、ＡＰＰは、β−セクレターゼによって切断されて、ｓＡＰＰβ及びＣＴＦβを解離し、次いで、ＣＴＦβは、γ−セクレターゼによって切断されて、有害なＡβペプチドを解離する。
【００１１】
このＡβ産生経路において特に重要なのは、γ−セクレターゼ切断の位置である。γ−セクレターゼ切断が、残基７１１−７１２で起これば、短いＡβ（Ａβ４０）が得られる。γ−セクレターゼ切断が残基７１３以降での切断であれば、長いＡβ（Ａβ４２）が得られる。このように、γ−セクレターゼプロセスは、長さ４０又は４２アミノ酸のＡβペプチド（それぞれ、Ａβ４０及びＡβ４２）の産生に対して中心的である。ＡＰＰ及びそのプロセッシングについて考察している概説については、「Ｓｅｌｋｏｅ， １９９８， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４４７−４５３； Ｓｅｌｋｏｅ， １９９４， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０：３７３− ４０３」を参照されたい。「Ｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１１２２」も参照されたい。ＡＰＰの切断は、タンパク質分解によって産生されるポリペプチド又はペプチド断片を検出することによる様式を含む、多数の慣用の様式で検出することが可能である。このような断片は、抗体結合など、任意の便利な手段によって検出することが可能である。タンパク質分解切断を検出するための別の便利な方法は、基質の切断によって色素源（例えば、有色産物又は蛍光産物）を放出する色素産生性β−セクレターゼ基質を使用することである。
【００１２】
アルツハイマー病の症候を予防又は改善する手段として、アミロイド斑の発生を阻害する可能性に対して多大な興味が注がれている。この目的のために、有望な戦略は、一緒にＡβの産生に関与している２つの酵素であるβ及びγセクレターゼの少なくとも１つの活性を阻害することである。Ａβの堆積の結果としてのアミロイド斑の形成が、アルツハイマー病の原因であれば、２つのセクレターゼのうち一方又は両方の活性を阻害することは、炎症又はアポトーシスの発生などの後期段階での現象前に、疾病過程に初期段階で介入することになると思われるので、この戦略は魅力的である。このような初期段階での介入は、特に有益であると予想される（例えば、Ｃｉｔｒｏｎ， ２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ ６：３９２−３９７を参照）。
【００１３】
これらの理由のため、ＡＰＰからのＡβの産生を阻害若しくは抑制し、又は脳内Ａβの蓄積を阻害する能力について、試験化合物をスクリーニングするための方法及びシステムを提供することは望ましいであろう。特に、このような方法及びシステムは、試験化合物が変換をもたらす代謝経路を中断又は妨害することができる、このような変換に関わっている代謝経路に基づくことが望ましくいであろう。特に、適切な候補薬となる試験化合物の初期スクリーニングに特に適するように、当初の方法は、動物モデルではなく、むしろインビトロ系を使用すべきである。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、一つには、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はＡＰＰのβ−アミロイド（Ａβ）断片への、物質の結合特性を同定及び評価するためのアッセイに関する。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はアミロイドβペプチド（Ａβ）への物質の相互作用を測定する方法であり、前記方法は、
（ａ）第一の検査溶液（第一の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント、（ｉｉ）物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのｓＡＰＰβ領域に対して特異的である第一の抗体を含む。）をｓＡＰＰβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、ｓＡＰＰβ−抗体複合体の第一の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｂ）第二の検査溶液（第二の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアント、（ｉｉ）前記物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域に対して特異的である第二の抗体を含む。）を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第二の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｃ）対照溶液（前記対象領域は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントおよび（ｉｉ）前記第一及び第二の抗体を含む。）をｓＡＰＰβ−抗体複合体及びＡβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、ｓＡＰＰβ−抗体複合体の第一の対照シグナル読み取りおよびＡβ−抗体複合体の第二の対照シグナル読み取りを得ること、
（ｄ）前記第一の検査シグナル読み取りと前記第一の対照シグナル読み取りを比較すること、並びに前記第二の検査シグナル読み取りと前記第二の対照シグナル読み取りを比較すること、を含み、
（ｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡＰＰと相互作用せず、
（ｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りより低く、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡＰＰのｓＡＰＰβ領域に特異的に結合し、
（ｉｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りより低ければ、前記物質はＡＰＰのＡβ領域に特異的に結合する、
前記方法に関する。
【００１６】
ある種の実施形態において、Ａβに対して特異的な抗体は、Ａβのアミノ酸１ないし１７又は２８ないし４０に対して特異的である。他の実施形態において、Ａβに対して特異的な抗体は、Ａβ領域のＣ末端に特異的である。他の実施形態において、Ａβ領域に対して特異的な抗体は、Ａβ領域のＮ末端に対して特異的である。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、
アミロイドβペプチド（Ａβ）への物質の相互作用を測定する方法であり、前記方法は、
（ａ）第一の検査溶液［第一の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）、（ｉｉ）物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域の前記第一の亜領域に対して特異的である第一の抗体を含む。］を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第一の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｂ）第二の検査溶液［第二の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）、（ｉｉ）前記物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域の前記第二の亜領域に対して特異的である第二の抗体含む。］を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第二の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｃ）対照溶液［前記対象溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）および（ｉｉ）前記第一及び第二の抗体を含む。］をＡβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第一の対照シグナル読み取りとＡβ−抗体複合体の第二の対照シグナル読み取りとりを得ること、
（ｄ）前記第一の検査シグナル読み取りと前記第一の対照シグナル読み取りを比較すること、及び前記第二の検査シグナル読み取りと前記第二の対照シグナル読み取りを比較すること、を含み、
（ｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡβと相互作用せず、
（ｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りより低く、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡβの前記第一の亜領域に特異的に結合し、
（ｉｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りより低ければ、前記物質はＡβの前記第二の亜領域に特異的に結合する、
前記方法に関する。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、Ａβの前記第一の亜領域はＣ末端であり、Ａβの前記第二の亜領域はＮ末端である。
【００１９】
本発明のアッセイでは、前記検査溶液及び対照溶液は、希釈剤、ｐＨ調整剤又はアッセイで一般的に使用される他の添加物及び不活性担体をさらに含んでよい。検査及び対照溶液は、最大約２４時間インキュベートしてよい。
【００２０】
ある種の実施形態において、前記物質は、約２ｋＤ未満、好ましくは約１００Ｄａないし１，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。
【００２１】
ある種の実施形態において、アッセイで使用されるＡＰＰは、検出可能に標識されており、例えば、リガンドにより検出可能に標識されている。
【００２２】
ある種の実施形態において、前記検査及び対照溶液は、受容体ビーズを含む。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、本発明のアッセイによって同定された、ＡＰＰ又はＡβと相互作用する物質に関する。ある種の実施形態において、前記物質は、約２ｋＤ未満の分子量を有する小分子である。一実施形態において、前記物質は、式Ｉの化合物
【００２４】
【化４】
（式中、
Ｒ４は、必要に応じて存在し、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）Ｃ１−６アルキル及び
（ｃ）Ｃ１−６アルコキシ
からなる群から選択され；
Ｒ２は、
（ａ）水素、
（ｂ）（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ５（Ｒ５は、水素及びＣ１−６アルキルからなる群から選択され、ｍは、１、２又は３である。）
からなる群から選択され；
Ｒ３は、
（ａ）水素、及び
（ｂ）
【００２５】
【化５】
（Ｒ５及びＲ６は、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）ハロゲン、
（ｉｉｉ）Ｃ１−６アルキル、
（ｉｖ）Ｃ１−６アルコキシ及び
（ｖ）テトラゾリル
からなる群から選択され；
ｎは、３、４又は５である。）
からなる群から選択される。）
からなる群から選択されるベンゾフラン誘導体又は薬学的に許容されるその塩である。
【００２６】
（Ｉ）の化合物は、ＡＰＰ又はＡβと相互作用することが可能であり、ＡＰＰ又はＡβの、セクレターゼ又はＡＰＰ若しくはＡβ結合抗体との相互作用を遮断することが可能である。従って、式Ｉの化合物は、アルツハイマー病の治療において潜在的に有用である。
【００２７】
本発明は、式（Ｉ）の化合物の治療的有効量を、アルツハイマー病の治療を必要としている患者に投与することを含む、前記患者のアルツハイマー病を治療する方法にも関する。本発明は、式（Ｉ）の化合物の治療的有効量を、アルツハイマー病の改善又は抑制を必要としている患者に投与することを含む、前記患者のアルツハイマー病を改善又は抑制する方法にも関する。
【００２８】
定義
本明細書において使用される「ベータ−セクレターゼ」又は「β−セクレターゼ」という用語は、文献において、「ＢＡＣＥ」、「ＢＡＣＥ１」（例えば、Ｖａｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：７３５−７４１参照）又はＢＡＣＥ２（例えば、Ｆａｒｚａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００， ＰＮＡＳ ９７：９７１２−９７１７参照）としてときに知られている酵素を表す。ＢＡＣＥ１は、５０１アミノ酸の膜結合アスパラギン酸プロテアーゼである。ＢＡＣＥ１は、β−セクレターゼの公知の機能的特性及び特徴を全て有している。Ａｓｐ−１又はメマプシン−１とも称されるＢＡＣＥ２は、膜結合型アスパラギン酸プロテアーゼのＢＡＣＥファミリーの第二のメンバーである。 ＢＡＣＥ１とＢＡＣＥ２との差のさらなる論述については、「Ｒｏｇｇｏ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００２， ２：３５９− ３７０」を参照されたい。
【００２９】
本明細書で使用されている「γセクレターゼ」又は「ガンマセクレターゼ」という用語は、膜結合型ＡＰＰプロセッシング中間体からＡβペプチドを放出する重要な酵素であるガンマセクレターゼ酵素を表す。ガンマセクレターゼは、２つのプレセニリン断片並びに補因子ニカストリン、Ｐｅｎ−２及びＡｐｈ−１を含む、多タンパク質複合体であると考えられる。「Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， １００：１３０７５−１３０８０； Ｂｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｂｉｏｃｈｅｍ ４２：８１３３−８１４２」を参照されたい。
【００３０】
さらに、本明細書において使用される「ベータ−セクレターゼ」及び「ガンマセクレターゼ」という用語には、それぞれ、ＡＰＰ中のβ部位及びγ部位で切断する能力を有する天然酵素の全ての哺乳類形態が含まれる。本明細書において使用される「ベータ−セクレターゼ」及び「ガンマセクレターゼ」という用語には、同一基質に対する天然β−セクレターゼ又はγセクレターゼの有効性の少なくとも約５％のレベルで、ベータセクレターゼ又はガンマセクレターゼ基質の切断を触媒する機能的能力を維持している限り、このような酵素の、全ての組換え形態、突然変異及びその他のバリアントも含まれる。
【００３１】
本明細書において使用される「バリアント」という用語は、本発明において、元の配列の生物学的活性と実質的に同様の生物学的活性（機能的又は構造的の何れか）を保持する配列（核酸又はアミノ酸）を表す。このバリアント又は均等物は、同じ若しくは異なる種から得てもよく、天然バリアントであってもよく、又は合成的に調製されてもよい。このようなバリアントには、タンパク質の生物活性が保存されていれば、１以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列が含まれる。配列の生物活性が概ね維持されていれば、１以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有することが可能である核酸配列のバリアントに対しても、同じことが当てはまる。
【００３２】
本明細書において使用される「ＡＰＰバリアント」又は「バリアントβセクレターゼ基質」という用語は互換的に使用される。
【００３３】
典型的なＡＰＰバリアント（又はバリアントβ−セクレターゼ基質）は、ＷＯ０２／０９４９８５として公開された国際出願ＰＣＴ ／ＵＳ０２／１５５９０及び同じ所有者の米国特許出願ＵＳ２００３／０２００５５Ａ１（ともに、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されている新規β−セクレターゼＰ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’切断部位の何れかを含有するポリペプチドであり、このような分子が分析を促進するためにさらなるエピトープを含むかどうかを問わない。例えば、β−セクレターゼＰ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’切断部位の一方又は両方側に付着された２、３、４、５又は６個のアミノ酸から構成されるポリペプチドは、修飾されたβ−セクレターゼ基質である。修飾されたβ−セクレターゼ基質には、その各々が少なくとも８個のアミノ酸の連続配列断片を含む非天然ペプチドが含まれ、このような断片は、合成β−セクレターゼ切断部位を含み、前記少なくとも８個のアミノ酸は、Ｗ０２／０９４９８５及びＵＳ ２００３／０２００５５５Ａ１に開示されている配列の群から選択される配列を有する。これらに同様に記されているように、このような非天然ペプチドの断片及び相同体も、本発明によって包含される。完全長ＡＰＰ分子（６９５、７５１又は７７０アミノ酸長の何れでもよい。）、及び追加アミノ酸が一方又は両方末端に付加されたような分子は、それらが、上述のように、β−セクレターゼＰ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’切断部位を有している限り、修飾されたβ−セクレターゼ基質である。また、６９５、７５１又は７７０アミノ酸長の完全長ＡＰＰ分子より小さいが、最大１６ポリペプチド長の前記マルチマーより大きく、ＡＰＰ配列から実質的に構成され且つβ−セクレターゼによって切断可能な中間サイズのポリペプチドは、それらが、上述のように、β−セクレターゼＰ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’切断部位を有している限り、修飾されたβ−セクレターゼ基質である。このような中間サイズのポリペプチドは、ＡＰＰの「生物活性断片」又は「生物活性なアミノ酸断片」、「ＡＰＰ生物活性断片」又は「ＡＰＰ生物活性アミノ酸断片」とも称される。単独のβ−セクレターゼによる酵素的切断、又はγ−セクレターゼなどの他の酵素と組み合わせたβ−セクレターゼによる酵素的切断から得られるペプチド及びポリペプチドを表す場合には、「断片」という用語の使用との混同を避けるため、このような中間サイズのポリペプチドという表記（下記）は、これらの用語に限定される。
【００３４】
「誘導体」という用語は、本来これらの分子の一部ではない追加の化学的部分を含む場合に、上記バリアントの全てを含むものとする。これらの化学的部分は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期の改善、毒性の減少及び望ましくない副作用の除去又は減少など、様々な目的を有することが可能である。さらに、これらの部分は、標識、結合の目的のために使用することが可能であり、又はこれらの部分は、融合産物中に含めてもよい。上記効果を媒介することが可能な様々な部分は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （１９９５）」に見出すことが可能である。このような部分を分子に結合するための方法は、本分野において周知である。
【００３５】
「保存的アミノ酸置換」とは、別の、化学的に類似のアミノ酸残基による、あるアミノ酸残基の置換を表す。このような保存的置換の例は、ある疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニン）の置換を別の疎水性残基に置換すること、ある極性残基を同じ電荷の別の極性残基に置換すること（例えば、アルギニンをリジンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に）；ある芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン又はフェニルアラニン）を別の芳香族アミノ酸に置換することである。
【００３６】
上記定義の「保存的アミノ酸置換」は、さらに広義の用語である「保存的に修飾されたこれらのバリアント」という用語によって包含されるアミノ酸配列のリストのバリエーションの一種にすぎない。例えば、「保存的に修飾されたこれらのバリアント」という用語は、「Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ． § ２４２２．０３， Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１」中の用語に対して与えられた意味を有するものと解釈され、「Ｃ末端における、１、２、３、４又は５個の残基」などの欠失を含むことが可能であるが、この例に限定されるものではない。
【００３７】
例えば（但し、限定を加えるものではない。）、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列は、比較ウィンドウ上で最大の一致度が得られるように並列された場合に２個の配列が同一であれば、基準配列に対して「同一」であると考えられる。比較ウィンドウを並置するためのヌクレオチド及びアミノ酸配列の最適なアラインメントは、「Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２」の局所相同性アルゴリズムによって、「Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３」の相同性アラインメントアルゴリズムによって、「Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２４４４−２４４８」の類似法に対する検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって （ＧＡＰ， ＢＥＳＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ， ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）又は検査によって実行してもよい。このような同一性の測定は、バリアントがβ−セクレターゼ基質として機能し続ける限り、あるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の「保存的に修飾されたバリアント」を表すものと考えることが可能である。
【００３８】
あるいは、本発明において、バリアントの比較類似性は、比較類似性が指定された境界内に属し、且つバリアントがβ−セクレターゼ酵素に対する基質であり続ける限り、新規タンパク質又はポリペプチド配列に対するそのバリアントの「相対配列同一性」によって定義される。例えば、あるＡＰＰ骨格（又はそのポリペプチド領域）は、置換、欠失、挿入及び付加のうち全てを有することが可能である。置換、欠失、挿入及び／又は付加を有するバリアントを作製するためのある種のアプローチ及び具体的な方法は、当業者の知識に属する。このため、ある実施形態では、指定された特許請求の範囲に記載されている配列数と少なくとも９５％同一である該配列数のタンパク質又はポリペプチドバリアント（アミノ酸配列相同性、すなわち「相対配列同一性」に基づく）は、このバリアントがβ−セクレターゼ酵素に対する基質であることが示されている場合には、本発明の範囲に属する。別の実施形態では、指定された特許請求の範囲に記載されている配列数と少なくとも８５％同一である該配列数のタンパク質又はポリペプチドバリアント（アミノ酸配列相同性に基づく）は、このバリアントがβ−セクレターゼ酵素に対する基質であることが示されている場合には、本発明の範囲に属する。さらに別の実施形態では、指定された特許請求の範囲に記載されている配列数と少なくとも６５％同一である該配列数のタンパク質又はポリペプチドバリアント（アミノ酸配列相同性に基づく）は、このバリアントがβ−セクレターゼ酵素に対する基質であることが示されている場合には、本発明の範囲に属する。このようなバリアントの全てについて、本明細書に記載されている試験系又は本分野で公知の他の方法などにおいて（又は、必要に応じて、本分野で後に公知となる方法を含む。）β−セクレターゼ酵素に対する「適切な基質」としての役割を果たす機能的能力が、本発明の操作及び任意の関連する請求項の範囲にこのようなバリアントの全てを含めることにとって、不可欠であることに留意すべきである。
【００３９】
「Ａβバリアントペプチド」とは、アミロイドβペプチド（Ａβ）のバリアント（この用語は上で定義されている。）であるアミロイドペプチドである。
【００４０】
β−セクレターゼ基質に関して「実質的にからなる」とは、基準配列に比べて、β−セクレターゼ基質の被切断能の大幅な減少を引き起こさないＮ末端及び／又はＣ末端の付加又は欠失によって、基準配列が修飾され得ることを表す。欠失の例は、Ｎ末端メチオニンの除去である。
【００４１】
「抗体」という用語は、分析物（抗原）に特異的に結合し及び認識する、１つの免疫グロブリン遺伝子又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はこれらの断片によって実質的にコードされるポリペプチドを表す。認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。抗体は、完全な状態の免疫グロブリンとして、又は、様々なペプチダーゼでの消化によって生じた、十分に特性決定された多数の断片として存在する。これらには、例えば、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２断片が含まれる。「抗体」という用語には、完全な抗体の修飾によって作製された抗体断片又は組換えＤＮＡ法を用いて新規に合成された抗体断片が含まれ、慣用技術によって作製された「ヒト化」抗体をさらに含む。
【００４２】
「イムノアッセイ」という用語は、分析物を特異的に結合するために抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、分析物を単離し、標的とし、及び／又は定量するために、特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とする。
【００４３】
タンパク質及びその他の生物物質の異種集団の存在下で、抗体が、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの存在を決定する結合反応において機能を果たす場合に、抗体は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド「に特異的に結合する」、又はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドと「特異的に免疫反応性である」。このため、表記されたイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は、特定のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに優先的に結合し、試料中に存在する他のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに有意な量で結合しない。このような条件下での、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの特異的な結合には、特定のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに対する特異性について選択された抗体が必要である。特定のタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又はその中の領域若しくはエピトープへの抗体の会合に関連して、本明細書において使用される「認識する」という用語は、前記抗体が、そのタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又はその中の領域若しくはエピトープ「に特異的に結合する」こと、又はそのタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又はその中の領域若しくはエピトープ「と特異的に免疫反応性である」ことを意味するものとする。
【００４４】
本発明において使用するのに適した抗体には、ＡＰＰ又はＡβに対して特異的である任意の抗体、より正確には、ＡＰＰ又はＡβの様々な特定領域に対して特異的である任意の抗体が含まれる。適切な抗体は文献に記載されており、当業者に公知である。ＡＰＰ又はＡβの特定領域に対して特異的な抗体は、慣用技術を用いて、当業者によって開発され得る。本発明のアッセイで使用するのに適した抗体の１つの種類は、ＡＰＰのｓＡＰＰβ領域に対して特異的な抗体である。典型的なｓＡＰＰβ特異的抗体には、カリフォルニア州南サンフランシスコのＺｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入できるＬＮ２７（ＡＰＰのＮ末端２００アミノ酸に対して特異的である。）；コロラド州ゴールデンのＡｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓから購入できるＰ２−１；インディアナ州のインディアナポリスのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入できる２２Ｃ１１及びテキサス州サンアントニオのＡｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．から購入できるＳ−１２が含まれる。
【００４５】
本発明のアッセイで使用するのに適した抗体の別の種類は、ＡＰＰのＡβ領域に対して特異的な抗体である。Ａβ領域に対して特異的な典型的抗体には、東レ、東京、日本から購入できるＷＯ−２及びマサチューセッツ州デドハムのＳｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入できる６Ｅ−１０が含まれる。
【００４６】
本発明のアッセイで使用するのに適した抗体の別の種類は、ＡβのＣ末端に対して特異的な抗体である。典型的なＡβＣ末端抗体には、日本、東京の東レ、から購入できるＧ２−１０が含まれる。
【００４７】
本発明のアッセイで使用するのに適した抗体の別の種類は、ＡβのＮ末端に対して特異的な抗体である。
【００４８】
抗体と特異的に結合するタンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、及び免疫細胞の細胞表面状態と特異的に結合する加工されたペプチドは、「抗原」と称される。
【００４９】
「免疫原性ペプチド」は、適切な宿主動物中に濃度の適切な範囲で注入された場合に、適切な宿主動物中に免疫応答（液性及び／又は細胞媒介性）を誘導するのに十分な長さとアミノ酸組成を有するペプチド配列として定義される。修飾されたβセクレターゼ切断部位（例えば、ＷＯ０２／０９４９８５及びＵＳ２００３／０２００５５５Ａ１に開示されている修飾されたβ−セクレターゼ切断部位など）の全部又は一部を含む免疫原性ペプチドは、修飾されたβ−セクレターゼ切断部位のペプチド配列を遊離ペプチドとして最終的に認識する抗体を、宿主動物中で産生させる（β−セクレターゼによって加工されたＡＰＰ及びＡＰＰバリアントの末端時においても）。先述された免疫原性ペプチドは、抗原の特性も有する。すなわち、このような各免疫原性ペプチドは、このような特異的ペプチドに対して産生された特定の抗体と特異的に結合する点で抗原である。
【００５０】
特定のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドと特異的に免疫反応する抗体を選択するために、様々なイムノアッセイフォーマットを使用し得る。例えば、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドと特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが日常的に使用される。特異的な免疫反応性を決定するために使用することが可能なイムノアッセイフォーマット及び条件の説明については、「Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．」を参照されたい。
【００５１】
本明細書において使用される「物質」という用語は、ＡＰＰ又はＡβと相互作用することが疑われ、且つセクレターゼ又はＡＰＰ結合抗体若しくはＡβ結合抗体との、ＡＰＰ又はＡβの相互作用を遮断することが可能である、いずれかの分子、化合物、分子若しくは化合物の混合物又はいずれかの他の組成物を意味する。本発明においてスクリーニングされる「物質」は、創薬過程中に薬学産業において一般的にスクリーニングされるあらゆる物質とすることができる。該物質は、タンパク質、多糖、核酸などの生物ポリマーのような巨大分子であってもよい。一般的に、物質は、約２ｋＤ未満、より一般的に１．５ｋＤ未満、しばしば１ｋＤ未満、及び通常１００Ｄａから１，０００Ｄａ、さらに一般的に２００Ｄａから７５０Ｄａまでの範囲の分子量を有する化合物又は小分子である。様々な基準に基づいて、１又は複数の物質を予め選択してもよい。例えば、公知のタンパク質分解阻害活性を有するとして、適切な物質を選択してよい。あるいは、無作為に前記物質を選択し、本発明のスクリーニング方法によって検査してよい。インビトロでの、セクレターゼ又はＡＰＰ結合抗体若しくはＡβ結合抗体との、ＡＰＰ又はＡβの相互作用を遮断することができる物質は、細胞及び／又は動物中においてこれらがＡβ産生を減少する能力をさらにスクリーニングするための候補として考えられる。物質は、物質の巨大な集合物として、例えば、低分子量の有機化合物、ペプチド又は天然産物のライブラリーとして、本発明の方法において検査し得る。
【００５２】
本明細書に記載されているアッセイ及びスクリーニング法は、明示的に、「一つ」の物質の検査に関するものであるが、当業者であれば、このような方法を、複数物質の検査（例えば、このような集合物の何れかの要素がＡＰＰを結合するかどうかを決定するためのコンビナトリアルライブラリー）のために適合できることが明らかである。従って、物質の集合物の使用又はこのような集合物の各要素は、本発明の範囲に属する。
【００５３】
本明細書において使用される「アッセイ条件」という用語は、アッセイにおいて望まれる結合関係の形成に対して伝導性（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）である条件である。例えば、アッセイ条件は、抗体と抗原間の複合体の形成に対して伝導性であり、又は該複合体の形成に適した条件（例えば、ｓＡＡＰβ−抗体複合体の形成に適した条件）としてよい。アッセイ条件は、ｐＨ調整剤（例えば、酢酸ナトリウム）、希釈剤（例えば、ＤＭＳＯ）、緩衝剤（たとえば、ＰＩＰＥＳを含む緩衝溶液）、界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ）及び／又はブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ）の使用を含み得る。アッセイ条件は、市販のアッセイカクテル、例えば、市販のプロテアーゼ阻害剤カクテルの使用を含み得る。
【００５４】
本明細書に使用されている「受容体ビーズ」という用語は、アッセイで一般に使用される不活性ビーズを表す。典型的な受容体ビーズには、「Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」から入手できるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ検出キットから得られる受容体ビーズが含まれる。
【００５５】
「断片」という用語は、同定されたアミノ酸配列の任意のセグメント及び／又は本明細書に上述されているバリアント又は誘導体の全ての任意のセグメントを表す。
【００５６】
「ｓＡＰＰβ断片」又は「ｓＡＰＰβ」は、ＡＰＰがβ−セクレターゼによって切断された場合に生じる、約１００ｋＤａのアミノ末端断片を表す。
【００５７】
「Ｃ末端断片」又は「ＣＴＦβ」は、ＡＰＰがβ−セクレターゼによって切断された場合に生じる、約１２ｋＤａの９９アミノ酸（ＣＴＦ９９として知られる。）ＣＯＯＨ末端断片を表す。あるいは、「Ｃ末端断片」又は「ＣＴＦβ」は、ＡＰＰの９９Ｃ末端アミノ酸及びＮ末端メチオニンを含有する、１００アミノ酸の工作されたタンパク質（ＣＴＦ１００又はＣ１００としても知られる。）を表し得る。ＣＴＦβは、Ａβドメイン全体を含有する。
【００５８】
本明細書に記載されているβ−セクレターゼアッセイは、切断によって産生されたアミノ末端又はカルボキシ末端断片が固相上に捕捉されている「サンドイッチ」アッセイを用いて便利に実施される。捕捉された断片は、次いで、β−セクレターゼ切断によって露出された断片の末端に対して特異的な抗体を用いて検出してもよい。典型的な抗体には、β−セクレターゼ活性の結果として生じた任意の切断産物に対して生じた抗体が含まれる。切断された切断産物への抗体の結合は、抗体に直接（共有結合で）結合された、又はビオチン及びアビジンなどの中間連結物質を通じて間接的に結合された、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は他の検出可能な酵素標識などの慣用の標識系を用いて検出される。このような「サンドイッチ」アッセイは、ＩＧＥＮをベースとした技術、ＨＴＲＦ、Ａｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎ技術及び当業者に公知の他の技術など、様々な様式で実行することが可能である。
【００５９】
本明細書において使用される「測定可能な信号」という用語は、放射性リガンド結合因子の、標的への結合に際して与えられる、生成された信号のあらゆる種類（例えば、放射性、比色、測光、分光光度、シンチレーション）を含む。
【００６０】
本明細書において使用される「Ｃ末端」又は「カルボキシ末端」という用語は、末端α−カルボキシル基を含有するタンパク質又はペプチドの領域である。本用語は、本明細書において、アミロイドβペプチドの末端α−カルボキシル基を含有する領域を表すために使用される。
【００６１】
本明細書において使用される「Ｎ末端」又は「アミノ末端」という用語は、末端α−アミノ基を含有するタンパク質又はペプチドの領域である。本用語は、本明細書において、アミロイドβペプチドの末端α−アミノ基を含有する領域を表すために使用される。
【００６２】
本明細書において使用される「セクレターゼ」という用語は、ＡＰＰを切断して、ＢＡＣＥ１、ＢＡＣＥ２及びγセクレターゼを含む、アミロイド産生ペプチドを形成するプロテアーゼを表す。
【００６３】
本明細書において使用される「ビヒクル」という用語は、実験で対照として使用される担体用の不活性媒体又は活性物質を表す。例えば、本明細書に記載されている本発明のアッセイで使用する場合、目的の物質は、通常、希釈剤、ｐＨ調整剤及びアッセイを実施するために当業者によって一般的に使用される他の不活性担体とともにインキュベートされる。アッセイで対照として使用される「ビヒクル」中には、同一の希釈剤、ｐＨ調整剤及び他の不活性担体が存在する。
【００６４】
本明細書において使用される「相互作用」という用語は、目的の物質、リガンド又は抗体と生物学的受容体との間の結合又は化学的引力の特性を表す。本明細書において使用される「相互作用」は、共有結合、水素結合又はイオン結合など、物質リガンド又は抗体と受容体との間の化学的結合のあらゆる種類を表す。
【００６５】
一実施形態において、本発明は、ＡＰＰのｓＡＰＰβ領域との物質の相互作用を検出及び評価するためのアッセイ、並びにＡβとの物質の相互作用を検出及び評価するためのアッセイに関する。
【００６６】
この実施形態において、完全なＡＰＰタンパク質（又はＡＰＰバリアントタンパク質）は、目的の物質とともに、及びＡＰＰのｓＡＰＰβ領域に対して特異的である第一の抗体とともに、第一の検査溶液中でインキュベートされる。ＡＰＰのＡβ領域に対して特異的である第二の抗体と、目的の物質と、ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントとを含む第二の検査溶液が形成される。第二の抗体は、Ａβの様々な領域に対して特異的であり得る。例えば、第二の抗体は、Ａβのアミノ酸１ないし１７又は２８ないし４０に対して特異的であり得る。あるいは、第二の抗体は、ＡβのＣ末端又はＮ末端に対して特異的であり得る。
【００６７】
ビヒクル、第一の抗体及びＡＰＰ又はバリアント、並びにビヒクル、第二の抗体及びＡＰＰ又はバリアントを含む２つの対照溶液が、アッセイ条件下で形成される。それぞれ、第一の抗体及び目的の物質、並びに第二の抗体及び目的の物質を含む、第三及び第四の対照溶液も形成してもよい。
【００６８】
第一及び第二の検査溶液並びに第一及び第二の対照溶液のそれぞれの中に存在する、第一及び第二の抗体のそれぞれの結合特性が測定される。結合測定は、目的の物質が、ＡＰＰのｓＡＰＰβ領域と相互作用又は結合する程度及びＡβと相互作用又は結合する程度を示す。
【００６９】
目的の物質の結合特性を決定するために、ＡＰＰ又はバリアントは、リガンドの結合対の一つのリガンドによって、検出可能に標識され得る。適切な標識されたＡＰＰ又はバリアントは、ビオチン化されたＡＰＰ又はバリアントである。
【００７０】
ある種の実施形態において、ＡＰＰは、ＷＯ０２／０９４９８５号及びＵＳ ２００３／０２００５５５ Ａ１に開示されている新規β−セクレターゼＰ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’切断部位の何れかを含有する修飾されたβ−セクレターゼ基質であるＡＰＰバリアントである。
【００７１】
前記物質とＡＰＰ（又はバリアント）は、最大約２４時間、好ましくは約１時間、約３７℃でインキュベートしてもよい。その後、インキュベートされた混合物の溶液を、マルチウェルプレートの１ウェル中に入れてもよい。安定化剤、例えば、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０は、結合反応を中和するために、混合物に添加し得る。
【００７２】
一実施形態において、アッセイにおいて使用するためのビーズが調製される。例えば、第一のビーズ混合物は、（１）ストレプトアビジンを含む供与体ビーズ、（２）Ａβのアミノ酸２８ないし４０に対して誘導されたポリクローナル抗体を含有する受容体ビーズ（例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得られるプロテインＡ受容体ビーズ）、（３）ＢＳＡ及び（４）リン酸緩衝食塩水から形成され、並びに、第二のビーズ混合物は、（１）ストレプトアビジンを含む供与体ビーズ、（２）ＡＰＰのＮ末端２００アミノ酸に対して誘導されたモノクローナルマウス抗体を含有する受容体ビーズ（例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得られるプロテインＡ受容体ビーズ）、（３）ＢＳＡ及び（４）リン酸緩衝食塩水から形成される。
【００７３】
その後、第一のビーズ混合物を、目的の物質とＡＰＰ（又はバリアント）のインキュベートされた混合物と混ぜ合わせて、この混合物を一晩インキュベートする。第二のビーズ混合物を、目的の物質とＡＰＰ（又はバリアント）のインキュベートされた混合物と混ぜ合わせる。ビヒクル、ＡＰＰ又はＡＰＰバリアント、並びに、それぞれ上記第一及び第二の混合物由来の受容体ビーズを含む第三及び第四の混合物が形成される。次いで、ウェルプレートを読み取る。
【００７４】
ストレプトアビジンでコートされた供与体ビーズは、ＡＰＰ（又はバリアント）上に存在するビオチン部分と相互作用し、受容体ビーズは、ＡＰＰのＮ末端又はＡβドメインの何れかに結合する抗体との相互作用を通じて、ＡＰＰ（又はバリアント）に結合する。ＡＰＰの第１又は第二の抗体結合部位の何れとも相互作用しない物質は、ビヒクルと概ね同じシグナルを生じる。抗Ａβ又はＡＰＰ Ｎ末端抗体混合物が使用される場合、ＡＰＰはいずれのの抗体にも接近できず、シグナルがビヒクルに比べて減少するので、ＡＰＰと非特異的に相互作用する物質は溶液からはずれる。第一及び第二の抗体の一つの結合部位近傍でＡＰＰと特異的に相互作用する物質は、該物質の結合部位近傍の抗体に対して特異的に減少するが、さらに遠くの抗体に対しては減少しないシグナルを生じる。
【００７５】
第二の実施形態において、本発明は、Ａβ又はＡβバリアントペプチドのＮ末端及びＣ末端との物質の相互作用を検出及び評価するためのアッセイに関する。この物質の結合特性の測定は、この物質がＡβ又はＡβバリアントペプチドと相互作用する又はＡβ又はＡβバリアントペプチドに結合する程度を決定することが可能である。
【００７６】
この実施形態において、Ａβ（又はバリアント）は、アッセイ条件下で、緩衝液と、例えば、リン酸緩衝生理食塩水中のＢＳＡと混合される。結合緩衝液の対照混合液も形成される。その後、結合混合物の溶液を、マルチウェルプレートの１ウェル中に入れてもよい。次いで、結合反応物を、約１時間、約３７℃でインキュベートする。各反応の溶液は、第二のアッセイプレートに移され、該プレートにおいて、Ａβ（又はＡβバリアントペプチド）と抗体間の相互作用が評価される。
【００７７】
第一のビーズ混合物は、（１）ストレプトアビジンを含む供与体ビーズと、及び（２）ＡβのＣ末端に対して特異的である標識された抗体と、から形成され得る。第二のビーズ混合物は、（１）受容体ビーズ（例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得られるプロテインＡ受容体ビーズ）と、及び（２）Ａβのアミノ末端に対して特異的である抗体と、から形成され得る。
【００７８】
アミロイド結合反応物の添加前に、混合物を、室温で約１時間インキュベートする。
【００７９】
マルチウェルプレートの各ウェル中には、第一のビーズ混合物、第二のビーズ混合物及び緩衝液（例えば、ＰＢＳ中のＢＳＡ）が添加される。次いで、プレートを一晩インキュベートし、ＡβのＮ末端に結合する抗体を検出する（例えば、ＡＬＰＨＡＱＵＥＳＴによって）。Ａβと相互作用する物質の存在下で反応が実施されれば、シグナルの減少が示される。
【００８０】
上記アッセイは、ＢｉｏＳｉｇｎａｌ Ｐａｃｋａｒｄ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｒｉｄｅｎ， Ｃｏｎｅｅｃｔｉｃｕｔによって開発されたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ技術を使用してもよい。本発明の基礎原理（すなわち、ＡＰＰと物質の混合物を、ＡＰＰのｓＡＰＰ領域に対して特異的である第一の抗体と及びＡＰＰのＡβ領域に対して特異的である第二の抗体と接触させ、該物質の結合特性を決定する。）を使用することが可能である他の結合アッセイ技術が本分野に存在する。これらの他の結合アッセイには、リガンド結合アッセイ、例えば、比色及び分光光度アッセイ、例えば、生成された色又は蛍光、リン光の測定（例えば、ＥＬＩＳＡ、固相吸着アッセイ）及び波長の短い又は長い光放射が生じる他のラジオイムノアッセイ（紫外線及びγ線放射など）が含まれる。
【００８１】
第三の実施形態において、本発明は、本発明のアッセイから同定された式（Ｉ）の化合物に関する。式（Ｉ）の化合物は、ＡＰＰ又はＡβと特異的に相互作用し、セクレターゼとの又はＡβ結合抗体との、ＡＰＰの相互作用を遮断する。式（Ｉ）の化合物は、ＢＡＣＥ１及びＢＡＣＥ２によるＡＰＰプロセッシングを阻害し、ＢＡＣＥ２によるＡβプロセッシングを阻害し、γセクレターゼによるＣＴＦβ（ＣＴＦ９９及びＣＴＦ１００を含む。）プロセッシングを阻害する。式（Ｉ）の化合物は、ＡＰＰのＡβドメイン内でＡＰＰを結合することによる、ＢＡＣＥ及びγセクレターゼのプロセッシングを阻害する。
【００８２】
本発明の化合物は、Ａβ１−４２の産生を選択的に弱めるために、γセクレターゼの作用の調節物質としても作用することができ、Ａβのさらに短い鎖のイソフォーム（例えば、Ａβ４０）の優先的な分泌をもたらす。より短い鎖のイソフォームは、自己凝集及び斑形成の傾向が低下するため、脳から、より簡単に除去され、神経毒性も低いと考えられる。
【００８３】
式Ｉの化合物は、以下のスキームによって形成され得る。
【００８４】
【化６】
【００８５】
本発明に記載されている方法のための出発材料及び試薬は、市販されているか、若しくは文献公知であり、又は類似の化合物に対して記載されている文献の方法に従って調製し得る。反応及び得られた反応産物の精製を実行する際に必要とされる技術は、当業者に公知である。精製手順には、結晶、蒸留、純相又は逆相クロマトグラフィーが含まれる。
【００８６】
本発明は、さらに、本発明の式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることを含む、ヒト及び動物のアルツハイマー病を治療するための医薬又は組成物の製造のための方法に関する。本発明は、ＡＰＰ又はＡβと特異的に相互作用して、セクレターゼとの、又はＡＰＰ若しくはＡβ結合抗体とのＡＰＰ又はＡβの相互作用を遮断する化合物を含む医薬の製造方法にも関する。
【００８７】
本発明の別の実施形態は、以下の実施例１ないし４の表題化合物及びこれらの薬学的に許容される塩から選択される、式（Ｉ）の化合物である。
【００８８】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、アルツハイマー病の治療、改善、抑制又はアルツハイマー病のリスクの低減において有用である。例えば、この化合物は、アルツハイマー型の認知症の予防、及びアルツハイマー型の認知症の初期段階、中間段階又は後期段階の治療に有用であろう。この化合物は、ＡＰＰの異常な切断によって媒介される疾病及びＡＰＰのＢＡＣＥ切断の阻害及びＡβの凝集の阻害によって治療又は予防され得るその他の症状の治療、改善、抑制又はこれらのリスクの軽減においても有用であり得る。このような症状には、軽度の認知障害、トリソミー２１（ダウン症候群）、脳アミロイドアンギオパチー、変性認知症、ダッチ型のアミロイドーシスを有する遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）、クロイツフェルトヤコブ病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、頭部外傷、発作、ダウン症候群、膵炎、封入体筋炎、その他の末梢アミロイドーシス、糖尿病及びアテローム性硬化症が含まれる。
【００８９】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、ＡＤの検出又は診断用の陽電子放出断層画像化法（ＰＥＴ）リガンドとしても有用であり得る。
【００９０】
本発明の化合物は、ＰＥＴリガンドとして、ＰＥＴ画像化において使用するために、陽電子放出放射性核種で標識してもよい。画像化の場合、適切なＰＥＴ放射性核種には、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、８２Ｂｒ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、１５Ｏ、１３Ｎ、２１１Ａｔ及び７７Ｂｒが含まれる。最も一般的に使用されているＰＥＴ放射性核種は、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ及び１３Ｎである。本発明の放射性標識された化合物中に取り込まれる具体的な放射性核種は、所望される具体的な分析又は薬理学的適用に依存する。
【００９１】
本発明は、本発明の化合物と薬学的に許容される少なくとも１つの担体又は賦形剤とを含む放射性薬学的組成物にも関する。本発明は、ＡＰＰの又はＡβの標識を必要としている哺乳動物に、本発明の放射性標識された化合物の有効量を投与することを含む、哺乳動物中にＡＰＰ又はＡβを標識する方法にも関する。
【００９２】
本発明は、ＡＰＰの又はＡβの診断画像化を必要としている哺乳動物に、本発明の放射性標識された化合物の有効量を投与することを含む、哺乳動物におけるＡＰＰの又はＡβの診断的画像化のための方法にも関する。
【００９３】
本発明は、脳の診断画像化を必要としている哺乳動物に、本発明の放射性標識された化合物の有効量を投与することを含む、哺乳動物中の脳の診断的画像化のための方法にも関する。
【００９４】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。「薬学的に許容される塩」という用語は、無機又は有機塩基及び無機又は有機酸を含む薬学的に許容される無毒の塩基又は酸から調製される塩を表す。無機塩基由来の塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、亜マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが含まれる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム及びナトリウム塩である。固体形態の塩は、２以上の結晶構造で存在する場合があり、水和物の形態で存在する場合もあり得る。薬学的に許容される無毒の有機塩基には、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレン−ジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの、一級、二級及び三級アミン、天然に存在する置換されたアミンを含む置換されたアミン、環状アミンの塩、及び塩基性イオン交換樹脂が含まれる。本発明の式（Ｉ）の化合物が塩基性である場合には、これらの塩は、無機及び有機酸を含む、薬学的に許容される無毒の酸から調製してもよい。このような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが含まれる。特に好ましいのは、クエン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、フマル酸及び酒石酸である。
【００９５】
本明細書において使用される、単独での、又は別の置換基の一部としての「アルキル」という用語は、表記される炭素原子の数を有する飽和直鎖又は分枝鎖炭化水素基を意味する（例えば、Ｃ１−１０アルキルは、１から１０個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。）。本発明において使用するための好ましいアルキル基は、１から６個の炭素原子を有するＣ１−６アルキル基である。典型的なアルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。
【００９６】
本明細書において使用される、単独での、又は別の置換基の一部としての「アルコキシ」という用語は、Ｒが上記定義のアルキル基である、基−Ｏ−Ｒを意味する。本発明において使用するための好ましいアルコキシ基は、１から６個の炭素原子を有するＣ１−６アルコキシ基である。典型的なアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシなどが含まれる。
【００９７】
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語には、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードが含まれる。
【００９８】
本発明の式（Ｉ）の化合物が投与される対象又は患者は、一般に、ＡＰＰ又はＡβとの特異的相互作用が望まれる、男性又は女性であるヒトである。しかし、ＡＰＰ若しくはＡβとの特異的相互作用又はＡＰＰ結合抗体若しくはＡβ結合抗体との特異的相互作用が望まれる他の哺乳動物（イヌ、ネコ、ネズミ、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、サル、チンパンジー又は他の類人猿若しくは霊長類など）も包含し得る。
【００９９】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、本発明の式（Ｉ）の化合物が有用性を有する疾病又は症状の治療において、１又は複数の他の薬物と組み合わせて使用し得、この場合、薬物の組み合わせは、薬物単独より安全であるか、又はより効果的である。さらに、本発明の式（Ｉ）の化合物は、本発明の式（Ｉ）の化合物の副作用若しくは毒性を治療し、予防し、抑制し、改善し、又は副作用若しくは毒性のリスクを低減する１又は複数の他の薬物と組み合わせて使用してもよい。このような他の薬物は、だから一般的に使用される経路及び量で、本発明の式（Ｉ）の化合物と同時に又は逐次に投与してもよい。従って、本発明の薬学的組成物には、本発明の式（Ｉ）の化合物の他に、１又は複数の他の活性成分を含有する薬学的組成物も含まれる。前記組み合わせは、単位剤形組み合わせ産物の一部として、又はキットとして、又は一以上のさらなる薬物が治療計画の一部として別個の剤形で投与される治療プロトコールとして、投与し得る。
【０１００】
単位投薬又はキット形態の何れかでの、本発明の式（Ｉ）の化合物の他の薬物との組み合わせの例には、抗アルツハイマー病薬（例えば、他のβ−セクレターゼ阻害剤又はγ−セクレターゼ阻害剤）；ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤；イブプロフェンを含むＮＳＡＩＤ；ビタミンＥ；ヒト化されたモノクローナル抗体を含む抗アミロイド抗体；カテプシンＢ阻害剤；ＣＢ−１受容体アンタゴニスト若しくはＣＢ−１受容体インバースアゴニスト；ドキシサイクリン及びリファンピンなどの抗生物質；メマンチンなどのＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト；ガランタミン、リバスチグミン、ドネペジル、及びタクリンなどのコリンエステラーゼ阻害剤；イブタモレン、イブタモレンメシラート及びカプロモレリンなどの成長ホルモン分泌促進物質；ヒスタミンＨ３アンタゴニスト；ＡＭＰＡアゴニスト；ＰＤＥ ＩＶ阻害剤；ＧＡＢＡＡインバースアゴニスト；神経ニコチンアゴニスト；又は本発明の式（Ｉ）の化合物の有効性、安全性、利便性を増加させるか、又は本発明の式（Ｉ）の化合物の望ましくない副作用若しくは毒性を低減する受容体又は酵素に影響を与えるその他の薬物の、１又は複数との組み合わせが含まれる。組み合わせの先述したリストは、例示にすぎず、いかなる意味においても、限定を意図したものではない。
【０１０１】
本明細書において使用される「組成物」という用語は、指定された成分を、所定の量又は割合で含む産物、並びに指定された量の指定された成分の組み合わせから、直接又は間接的に得られる任意の産物を包含するものとする。薬学的組成物に関するこの用語は、１又は複数の活性成分と、及び不活性成分を含む必要に応じて使用される担体とを含む産物、並びに、成分の任意の２以上の組み合わせ、錯化若しくは凝集から、又は成分の１もしくは複数の解離から、又は成分の一もしくは複数の反応若しくは相互作用の別の種類から、直接又は間接的に得られる任意の産物を包含するものとする。一般に、薬学的組成物は、活性成分を、液体担体又は細かく分割された固体担体又は両方と、均一且つ密接に混合し、次いで、必要であれば、産物を所望の製剤へと成形することによって調製される。この薬学的組成物において、活性な対象化合物は、疾病の過程又は症状に対して所望の効果を引き起こすのに十分な量で含められる。従って、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物と薬学的に許容される担体とを混合することによって作製された組成物のどれでもを包含する。
【０１０２】
経口で使用することが意図された薬学的組成物は、薬学的組成物の製造の分野で公知のいずれかの方法に従って調製することができ、このような組成物は、薬学的に洗練された、口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、着香剤、着色剤及び防腐剤からなる群から選択される１又は複数の薬剤を含有することができる。錠剤は、錠剤の製造に適した薬学的に許容される無毒の賦形剤と混合して活性成分を含有し得る。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウなどの不活性な希釈剤；造粒剤及び崩壊剤、例えば、コーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン又はアカシア；並びに、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであってよい。錠剤は、コートしなくてもよく、又は、胃腸管での崩壊と吸収を遅延させることにより、長期間にわたって持続的な作用を提供するために、公知の技術によってコートしてもよい。
【０１０３】
経口用製剤は、活性成分が、不活性な固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合された硬ゼラチンカプセルとして、又は活性成分が水若しくは油媒体、例えばピーナッツ油、液体パラフィン若しくはオリーブ油と混合された軟ゼラチンカプセルとして与えてもよい。
【０１０４】
他の薬学的組成物には水性懸濁液が含まれ、水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合された活性物質を含有する。さらに、油性懸濁液は、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナッツ油、又は液体パラフィンなどの鉱物油中に活性成分を懸濁することによって調合し得る。油性懸濁液は、様々な賦形剤を含有し得る。本発明の薬学的組成物は、水中油エマルジョンの形態としてもよく、これは、甘味剤及び着香剤などの賦形剤も含有し得る。
【０１０５】
薬学的組成物は、注射可能な無菌水性又は油性懸濁液の形態としてもよく、注射可能な無菌水性又は油性懸濁液は、公知技術に従って調合し得、又は薬物の直腸投与のために坐剤の形態で投与し得る。
【０１０６】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、当業者に公知の吸入装置を用いた吸入によって、又は経皮パッチによって投与してよい。
【０１０７】
「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤又は賦形剤が、製剤の他の成分と適合性があり、および、その服用者に対して無害でなければならないことを意味する。
【０１０８】
化合物「の投与」又は「を投与する」という用語は、錠剤、カプセル、シロップ、懸濁液などの経口剤形；ＩＶ、ＩＭ又はＩＰなどの注射可能剤形；クリーム、ゼリー、粉末又はパッチなどの経皮剤形；口内剤形；吸入粉末、スプレー、懸濁液など；及び直腸坐剤を含む（これらに限定されない。）、治療的有用な形態及び治療的に有用な量で、個体の身体中に導入することが可能な形態で、治療の必要がある個体に、本発明の式（Ｉ）の化合物を与えることを意味するものと理解すべきである。
【０１０９】
「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師又はその他の臨床家によって求められている組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を惹起し得る本発明の化合物の量を意味する。本明細書において使用される「治療」という用語は、特に疾病又は疾患の症候を示している患者における、掲記されている症状の治療を表す。
【０１１０】
本明細書において使用される「治療」又は「治療する」という用語は、本発明の化合物のあらゆる投与を意味し、（１）疾病の病状又は症状を経験し、又は呈している動物中の疾病を阻害すること（すなわち、病状又は症状のさらなる進行を停止すること）、又は（２）疾病の病状又は症状を経験し、又は呈している動物中の疾病を改善すること（すなわち、病状及び／又は症状を回復させること）が含まれる。「抑制する」という用語には、抑制されている症状の重度を抑制し、治療し、根絶し、改善し又はその他軽減することが含まれる。
【０１１１】
本発明の式（Ｉ）の化合物を含有する組成物は、単位剤形で便利に与え得、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製し得る。「単位剤形」という用語は、患者又は患者に薬物を投与する者が、その中に含有されている全量を有する単一の容器又は包装を開封することが可能なように、および２以上の容器又は包装からの成分を一緒に混合する必要がないように、全ての活性及び不活性成分が適切な系中に混ぜ合わされている単一用量を意味するものとする。単一剤形の典型的な例は、経口投与用の錠剤若しくはカプセル、注射用の単一用量容器又は直腸投与用の坐剤である。単位剤形のこのリストは、いかなる意味においても限定を意図するものではなく、単位剤形の典型的な例を表したものにすぎない。
【０１１２】
本発明の式（Ｉ）の化合物を含有する組成物はキットとして便利に提供し得、このキットによって、活性又は不活性成分、担体、希釈剤などであり得る１つ又はそれ以上の構成成分が、患者又は患者に薬物を投与する者が実際の剤形を調製するための指示書と共に、提供される。このようなキットは、その中に含有される全ての必要な物質及び成分と共に提供し得、又はこのキットは、患者又は患者に薬物を投与する者が独立に取得しなければならない物質及び成分を使用又は製造するための指示書を含有し得る。
【０１１３】
アルツハイマー病の、又は本発明の式（Ｉ）の化合物が適応症となる他の疾病を治療し、改善し、抑制し、又はそのリスクを軽減する場合、本発明の式（Ｉ）の化合物が、好ましくは、単回１日用量として、又は１日に２ないし６回の分割用量で、又は徐放形態で、約０．１から約１００ｍｇ／ｋｇ動物体重の１日投薬量で投与されるとき、一般に、満足すべき結果が得られる。総１日用量は、ｋｇ体重当たり約１．０ｍｇから約２０００ｍｇまで、好ましくはｋｇ体重当たり約０．１ｍｇから約２０ｍｇまでである。７０ｋｇの成人の場合、総１日用量は、一般に、約７ｍｇから約１，４００ｍｇまでである。この投薬計画は、最適な治療的応答を与えるために調整し得る。本発明の式（Ｉ）の化合物は、１から４回／日、好ましくは１又は２回／日の投与計画で投与してよい。
【０１１４】
本発明の式（Ｉ）の化合物又は該化合物の薬学的に許容される塩の、投与のための具体的な投与量は、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、３０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇ及び５００ｍｇを含む。本発明の薬学的組成物は、約０．５ｍｇから約１０００ｍｇまでの活性成分を含む、より好ましくは約０．５ｍｇから約５００ｍｇまでの活性成分又は０．５ｍｇから２５０ｍｇまでの活性成分又は１ｍｇから１００ｍｇまでの活性成分を含む製剤形態として提供し得る。治療に有用な具体的な薬学的組成物は、活性成分約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、３０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇ及び５００ｍｇを含み得る。
【０１１５】
しかしながら、具体的な患者に対する具体的な投薬レベル及び投薬の頻度は変動する場合があり、使用される具体的な化合物の活性、化合物の代謝的安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与の様式及び時間、排泄の速度、薬物の組み合わせ、症状の重さ、並びに治療を受けている宿主など、様々な要因に依存し得ることが理解されるであろう。
【０１１６】
以下の実施例は、さらなる説明のためにのみ記載されており、開示されている発明に対する限定を意図するものではない。
【実施例１】
【０１１７】
｛［６−（３−フェノキシプロピル）−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−イル］オキシ｝酢酸
【０１１８】
【化７】
【０１１９】
段階Ａ −７８℃のＴＨＦ（２Ｌ）中の５−メトキシベンゾフラン（１４８ｇ、１モル）の溶液に、ヘキサン（４２０ｍＬ、１．０５モル）中の２．５Ｍのｎ−ブチルリチウムを滴加した。この混合物を、−７８℃で１．５時間撹拌し、ついで、１５分にわたってフェニルアセトアルデヒド（１４４ｇ、１．２モル）を添加した。冷却槽を取り除き、混合物を、０℃まで、徐々に上昇させた。水（６００ｍＬ）を添加した。エーテル層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮した。ヘキサン中の５％、１０％、２０％及び３０％酢酸エチルの漸増極性の溶媒混合物を用いて、粗生成物をシリカゲル（２ｋｇ）中のクロマトグラフィーにかけて、２−（１−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）−５−メトキシベンゾフラン、融点６９−７０℃を得る。
【０１２０】
段階Ｂ ５℃及び窒素雰囲気下のトルエン（２．５Ｌ）中の塩化アルミニウム（２０４ｇ；１．５モル）の混合物に、５０グラムずつ、ｔ−ブチルアミンボラン（２００グラム；２．３モル）を添加した。３０分間撹拌した後、トルエン（６００ｍＬ）中の化合物１−Ａ（２３８ｇ、８８０ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。混合物を、５℃で２時間撹拌した後、１０％の塩酸（３Ｌ）の撹拌氷冷混合物に、少しずつ添加した。発泡が停止するまで、撹拌を継続した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮した。１５％酢酸エチルを溶出液として用いて、残留物をシリカゲル（２ｋｇ）中のクロマトグラフィーにかけて、２−（２−フェニルエチル）−５−メトキシベンゾフランを得た。
【０１２１】
段階Ｃ ５℃のトリエチルシラン（４６５ｍＬ；２．８モル）中の、段階１−Ｂから得られた２−（２−フェニルエチル）−５−メトキシベンゾフラン（１２８グラム；５００ｍｍｏｌ）の懸濁液に、１５分にわたって、トリフルオロ酢酸（２３２ｍＬ；３０モル）を添加した。混合物を、この温度で１時間撹拌し、室温で１８時間撹拌した。混合物を濃縮し、エーテル中に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残留物をクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）にかけて、２−（２−フェニルエチル）−５−メトキシ−２，３−メトキシベンゾフランを得た。
【０１２２】
段階Ｄ 窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（７００ｍＬ）中の水素化リチウム（８ｇ；１．０ｍｏｌ）に、エタンチオール（６２ｇ、１モル）を滴加した。次いで、ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の２−（２−フェニルエチル）−５−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾフラン（１２６ｇ、５００ｍｍｏｌ）を一度に添加し、混合物を３時間還流した。１Ｎ塩酸中に混合物を注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。エーテル層を分離し、水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮して、５−ヒドロキシ−２−（２−フェニル−エチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン、融点５６−５８℃、１２３ｇ（９８％）を得た。
【０１２３】
段階Ｅ ５−ヒドロキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン（５．０ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（５．５ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、臭化アリル（４．８ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）及びアセトン（５０ｍＬ）の混合物を、１８時間還流した。この混合物を冷却し、ヘキサン（２５ｍＬ）で希釈し、Ｃｅｌｉｔｅを通してろ過した。真空中でろ液を濃縮し、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用して、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、５−アリルオキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフランを得る。
【０１２４】
段階Ｆ １，２−ジクロロベンゼン（１０ｍＬ）中の５−アリルオキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン（４．７ｇ、１６．７ｍｍｏｌ））の混合物を一晩撹拌した。混合物を濃縮し、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用して、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、純粋な異性体混合物４．１ｇ（８７％）を得て、クロマトグラフィー（５０％ヘキサン／ＤＣＭ）によって該異性体混合物をさらに分離して、６−アリル−５−ヒドロキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン、融点７９−８０℃を得た。
【０１２５】
段階Ｇ ６−アリル−５−ヒドロキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン（２．８ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．３８ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（１．７ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）及びアセトン（５０ｍＬ）の混合物を、１８時間還流した。この混合物を冷却し、エーテル（２５ｍＬ）で希釈し、Ｃｅｌｉｔｅを通してろ過した。溶媒の蒸発によって、所望のベンジルエーテル１−Ｇが残った。
【０１２６】
段階Ｈ ０℃のＴＨＦ中の、段階１−Ｇから得たオレフィン（２．０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（１４ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）中の１Ｍボランを添加し、反応混合物を２時間撹拌した。トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（２．１５ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）で反応混合物を処理し、その全体を８時間環流した。真空中で反応物を濃縮し、３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶出液として使用して、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、所望の化合物を得た。
【０１２７】
段階Ｉ ＤＣＭ２０ｍＬ中のアルコール１−Ｈ（９００ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（１．１ｇ、４．２ｍｍｏｌ）及び四臭化炭素（１．４ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、室温で１５分間撹拌し、次いで、ヘキサン、次いで、５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶出液として使用するクロマトグラフィーにかけて、表題の化合物を得た。
【０１２８】
段階Ｊ ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の９５％水素化ナトリウム（３６５ｍｇ；１４．５ｍｍｏｌ）に、フェノール（１．４ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）を添加した。３０分間撹拌した後、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の臭化物１−Ｉ（８７０ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を、室温で３時間撹拌した。過剰な１Ｎ ＨＣｌ中に混合物を注ぎ、エーテルで抽出した。１Ｎ 水酸化ナトリウムでエーテル層を２回洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮した。残留物を、ヘキサン中の５％酢酸エチルを使用するシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、５−ベンジルオキシ−２−（２−フェニルエチル）−６−（３−フェノキシプロピル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン６３０ｍｇ（８２％）を油として得た。Ｈ ＮＭＲ δ１．８６−２．２５（ｍ，４Ｈ），１．１５−２．９５（ｍ，５Ｈ），３．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），３．９６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．６−４．８３（ｍ，１Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｓ，１Ｈ），６．８０−７．０（ｍ，２Ｈ），７．１−７．５（ｍ，１３Ｈ）。
【０１２９】
段階Ｋ −７８℃のジクロロメタン（３０ｍＬ）中の、段階１−Ｊから得られたベンジルエーテルの溶液に、三臭化ホウ素溶液（１Ｍ ＤＣＭ：１．９ｍＬ；１．８８ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を１０分間撹拌し、次いで、メタノール（０．５ｍＬ）を滴加した。混合物を室温とし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加した。有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮した。残留物を、２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、５−ヒドロキシ−２−（２−フェニルエチル）−６−（３−フェノキシプロピル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン、融点６５−７０℃を得た。１Ｈ ＮＭＲ δ １．８６−２．２４（ｍ，４Ｈ），２．６８−２．９５（ｍ，５Ｈ），３．２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５Ｈｚ，Ｊ＝７．４），４．０（ｔ，２ＨＥ，Ｊ＝５．５）４．６７−４．８３（ｍ，１Ｈ），５．２１（ｓ，１Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），６．６７（ｓ，１Ｈ），６．８８−７．０４（ｍ，３Ｈ），７．１３−７．３９（ｍ，７Ｈ）。
【０１３０】
段階Ｌ ＤＭＦ（１２ｍＬ）中の、段階１−Ｋから得たフェノール（１５１ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）と炭酸セシウム（１２０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．０５ｍＬ、０．３７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１８時間、室温で撹拌した。エーテルと飽和炭酸水素ナトリウムの間に反応混合物を分配し、分離した。有機相を、水で７回洗浄し、乾燥させ、濃縮した。得られた固体は、さらなる精製をせずに、次の反応で直接使用した。
【０１３１】
段階Ｍ ＤＣＭ（２ｍＬ）中の、段階１−Ｌから得た化合物（１９５ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ２ｍＬを添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒の蒸発及び逆相クロマトグラフィーによって、所望の化合物が得られた。１Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，２５０ＭＨｚ）１．８９−２．２３（ｍ，４Ｈ），２．７１−３．３０（ｍ，６Ｈ），４．０２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）４．５８（ｓ，２Ｈ），４．７６（ｍ，１Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），６．６６（ｓ，１Ｈ），６．９１−６．９８（ｍ，３Ｈ），７．１８−７．３３（ｍ，８Ｈ）。
【実施例２】
【０１３２】
｛［６−［３−（２クロロフェノキシ）プロピル］−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−イル］オキシ｝酢酸
【０１３３】
【化８】
【０１３４】
該化合物は、化合物１と同様の様式で調製したが、段階１−Ｊで、フェノールを２−クロロフェノールに代えた。
【０１３５】
１Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）１．８９−２．２３（ｍ，４Ｈ），２．７１−３．３０（ｍ，６Ｈ），４．０２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）４．５８（ｓ，２Ｈ），４．７６（ｍ，１Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），６．８８−６．９８（ｍ，３Ｈ），７．２−７．４（ｍ，７Ｈ）。
【実施例３】
【０１３６】
２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−イル］オキシ｝酢酸
【０１３７】
【化９】
【０１３８】
段階Ａ ＴＨＦ３ｍＬ中に、５−ヒドロキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン１２０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）（実施例１−Ｄ）及びブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル０．０８８ｍＬ（０．６ｍｍｏｌ）を含有する溶液に、ＮａＨ粉末１５ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を５時間撹拌した後、水で反応を停止し、エーテルで抽出した。カラムクロマトグラフィー（３０％ ＥＯＡｃ／ヘキサン）によって、油として、所望のエステルを得た。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＝３７７．１１）。
【０１３９】
段階Ｂ 段階３−Ｂから得られたエステル（７１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＣＭ２ｍＬ中に溶解し、ＴＦＡ２ｍＬで処理した。反応混合物を３時間撹拌した後、濃縮し、逆相クロマトグラフィーによって精製した。 １Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）１．８５−１．９１（ｍ，１Ｈ），２．０５−２．２（ｍ，１Ｈ），２．７１−２．９１（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｄｄ，１Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ），４．７７（ｍ，１Ｈ），６．６５（ｓ，２Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），７．２−７−４（ｍ，６Ｈ）。
【実施例４】
【０１４０】
６−｛３−［２−クロロ−４−（１Ｈ−テトラゾル−５−イル）フェノキシ］プロピル｝−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−オール
【０１４１】
【化１０】
【０１４２】
この化合物は、「Ｌａｕ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，（１９９２），３５（７），１２９９−３１８」の方法に従って合成した。
【０１４３】
実施例１ないし４は、完全長ＡＰＰのＢＡＣＥ切断を阻害することが見出された。しかしながら、これらの化合物は、短いペプチド基質を用いたアッセイでは、ＢＡＣＥと相互作用しなかった。
【０１４４】
これらの化合物は、ＢＡＣＥ酵素ではなく、ＡＰＰ基質と阻害し得るか、又は、これらの化合物、完全長ＡＰＰに非特異的に結合して、ＡＰＰタンパク質を不溶性とし、ＢＡＣＥに対して接近不能にし得るという仮説を立てた。
【０１４５】
実施例１ないし４の阻害の様式を決定するために、以下のアッセイを開発した。
【実施例５】
【０１４６】
ビオチン化されたＡＰＰバリアント（４００ｎＭ）を、アッセイ条件（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５；１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１８３６１５３）；１００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、０．２％ＣＨＡＰＳ）下で、実施例１ないし３と混合した。ＤＭＳＯ（化合物希釈剤）を含むビヒクルとのインキュベーション、及びＡＰＰバリアントを欠くインキュベーションを、各実験に対する対照として行った。各混合物を、３７度で１時間インキュベートした。
【０１４７】
その後、各インキュベーション混合物７０μＬを、９６ウェルプレートのそれ自身のウェル中に入れた。全ての結合反応を中和するために、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０ ５μＬを各ウェルに添加した。
【０１４８】
実施例５Ａでは、
（１）２０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン供与体ビーズ；
（２）ＡβのＣ末端領域に対して誘導されたウサギポリクローナル抗体１５０ｎｇ／ｍＬを含有する２０μｇ／ｍＬのプロテインＡ受容体ビーズ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ（プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１０，０００ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ６７６０６１７Ｍ）から入手）、及び
（３）０．１％ウシ血清アルブミン
からＡＬＰＨＡビーズの混合物を調製した。
【０１４９】
ビーズを、リン酸緩衝食塩水中で混合した。
【０１５０】
実施例５Ｂでは、
（１）２０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン供与体ビーズ；
（２）ＡＰＰのＮ末端領域に対して誘導されたモノクローナル抗体ＬＮ２７ １６０ｎｇ／ｍＬを含有する、２０μｇ／ｍＬのプロテインＡ受容体ビーズ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ（プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１０，０００ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ６７６０６１７Ｍ）から入手）、２０μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ受容体ビーズ；及び
（３）０．１％ウシ血清アルブミン
からＡＬＰＨＡビーズの混合物を調製し、リン酸緩衝食塩水中で混合した。
【０１５１】
５Ａ及び５Ｂでは、ＡＬＰＨＡビーズ混合物４６μＬを、インキュベーション混合物の各々４μＬと混合した。暗所、室温で、ビーズを一晩インキュベートした。
【０１５２】
翌日、抗体の結合の程度を測定するために、ＡＬＰＨＡＱＵＥＳＴを用いて、プレートを読み取った。
【０１５３】
５Ａ及び５Ｂの抗体の結合部位の何れにおいても、ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントと相互作用しない化合物は、ほぼビヒクルと同じである測定可能なシグナルを生じるであろう。ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントと非特異的に相互作用する化合物は、ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントを溶液から沈殿させるであろう。その結果、タンパク質は、全ての抗体に接近することができなくなるはずであり、測定可能なシグナルは、ビヒクルと比較して減少するはずである。抗体の一つの結合部位の付近でＡＰＰ又はＡＰＰバリアントと相互作用する化合物は、化合物結合部位の近くで、抗体に対するシグナルの減少を示すであろう。しかしながら、シグナルは、非近接部位では、抗体に対して減少しないはずである。
【０１５４】
実施例５Ａ及び５Ｂの結果は、実施例１及び２の化合物が、Ｃ末端結合部位の近傍で、そのＡβドメイン内においてＡＰＰバリアントと相互作用した。実施例３の化合物は、何れの抗体結合部位の近くでも、ＡＰＰバリアントと殆ど又は全く相互作用しなかった。
【実施例６】
【０１５５】
ＡβドメインのＣ末端領域の近くでＡＰＰバリアントを結合する化合物も、該化合物がＡＰＰのγ−セクレターゼ切断を阻害するかどうかを決定するために評価を行った。従って、実施例１ないし４の、完全長ＣＴＦβ基質の両方のγ−セクレターゼ切断を阻害する能力について「Ｌｉ， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９７：６１３８−６１４３」に記載されているようにして調べた。このアッセイは、以下のようにして行った。
【０１５６】
ＣＴＦβ切断の阻害
切断反応：
１０μＬ １０×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１８３６１５３）
２５μＬ ４×緩衝液（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＣａＣｌ２）
２μＬ １０％ＣＨＡＰＳＯ
５μＬ γ−セクレターゼ活性に対して特徴が明らかにされたＨｅＬａ細胞膜抽出物
７μＬ ２５μＭ細菌によって発現されたＣＴＦβ
５１μＬ 水
１μＬ ＤＭＳＯ中の化合物。
【０１５７】
反応物を、３７℃で１５０分間インキュベートし、５×ＲＩＰＡ緩衝液２５μＬ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ＮＰ−４０、２．５％ＤＯＣ、０．５％ ＳＤＳ、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）によって反応停止した。
【０１５８】
検出：
ＡβのＮ末端領域に対して特異的である４μｇ／ｍＬのビオチン化された抗体６Ｅ−１０の２５μＬ及びＡβ４０のＣ末端に対して特異的である１．５μｇ／ｍＬのルチニル化された抗体Ｇ２−１０の２５μＬとともに、反応物５０μＬをインキュベートすることによって、ＣＴＦβ基質のγ−セクレターゼ切断を評価した。Ｃ末端領域は、Ａβのγセクレターゼ切断後にのみ存在する。抗体を、室温で一晩インキュベート結合させた。翌日、８０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンコートされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ−２８０）２５μＬを、各反応に添加して、３０分間結合させ、ＩＧＥＮアッセイ緩衝液２７５μＬで反応停止させた。Ｏｒｉｇｅｎ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、γ−セクレターゼ切断産物の定量を行った。
【０１５９】
結果：
ＣＴＦβのγ−セクレターゼ切断の阻害について、実施例１ないし４をアッセイした。
【０１６０】
【表１】
【０１６１】
上述のように、実施例１−３のそれぞれが、γセクレターゼによるＣＴＦβの切断を阻害する。
【実施例７】
【０１６２】
セクレターゼ又はＡＰＰ（又はＡＰＰバリアント）のＡβドメインに結合する抗体と相互作用する化合物も、Ａβ又は関連するアミロイド産生ペプチドと相互作用すると予測することができる。ベンゾフランとアミロイドペプチド間の相互作用を評価するために、ＷＯ０２／０９４９８５及びＵＳ２００３／０２００５５５Ａ１に記載されているような、Ａβ１−４０と類似しているが、Ｎ末端の２個のアミノ酸がＧｌｕ及びＶａｌによって置換されたＡβバリアントペプチド（以下、「ＥＶ−アミロイド」と称する。）を使用した。実施例５の完全長ＡＰＰバリアントと同様に、生じ得る相互作用をアッセイするために、抗体結合部位のマスキングを使用した。アッセイは、以下のように行った。
【０１６３】
１．結合緩衝液中のＥＶ−アミロイドペプチドの主混合液は、以下のようにして作製した。リン酸緩衝食塩水中の０．１％ウシ血清アルブミン１０６５０μＬ、１０×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１８３６１５３）１２００μＬ、ＥＶアミロイドペプチド（ＤＭＳＯ中４μＭ）３０μＬ。
【０１６４】
２．結合緩衝液の陰性対照混合液は、リン酸緩衝食塩水中の０．１％ウシ血清アルブミン、１０×プロテアーゼ阻害剤カクテル及びＤＭＳＯを、同じ比で混ぜ合わせることによって調製した。
【０１６５】
３．主混合液及び陰性対照混合液９９μＬを、９６ウェルプレート中の各ウェルに分配した。
【０１６６】
４．ＤＭＳＯ中の実施例１ないし４又はＤＭＳＯのみ（ビヒクル）１μＬを各ウェルに添加した。
【０１６７】
５．次いで、結合反応物を、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１６８】
６．各反応物２０μＬを、第二のアッセイプレートに移した。ＡＬＰＨＡ検出を用いた抗体サンドイッチアッセイによるＥＶアミロイドペプチドの定量によって、ＥＶアミロイドと抗体の間の相互作用を評価した。
【０１６９】
７．ＥＶ−アミロイド検出の場合、以下の２つの溶液を調製した。
溶液１：ストレプトアビジン供与体ビーズ（５ｍｇ／ｍＬ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ（プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより；１０，０００ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６７６０６１７Ｍ））、ビオチン化された抗体Ｇ２−１０ ２．３μＬ（ＡβのＣ末端領域に対して特異的である。）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５ １１７３．７μＬ。
溶液２：プロテインＡ受容体ビーズ（５ｍｇ／ｍＬ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ（プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより；１０，０００ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６７６０６１７Ｍ））、ＥＶアミロイドのアミノ末端でＮＨ２−ＥＶＥＦＲと特異的に相互作用する抗体１０．４μＬ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５ １１６５．６μＬ。
ＥＶ−アミロイド結合反応への添加前に、溶液を、室温で１時間インキュベートした。
【０１７０】
８．ＥＶアミロイド結合反応を含有する９６ウェルプレート中の各ウェルに、溶液１ １０μＬ、溶液２ １０μＬ及びＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ１０μＬを添加した。
【０１７１】
９．プレートを、暗所、室温で一晩インキュベートし、ＡＬＰＨＡ Ｑｕｅｓｔを用いてＥＶ−アミロイドへの抗体結合を検出した。
【０１７２】
Ａβへの抗体結合を用いて、ＥＶ−アミロイドへの抗体結合の抑制を観察した。実施例１及び２（何れもＡＰＰのＢＡＣＥプロセッシング及びＣＴＦβのγ−セクレターゼプロセッシングの両者を阻害し、何れもＡＰＰへの抗体結合を遮断する。）は、ＥＶアミロイドへの抗体結合の約４０％を阻害する。ＡＰＰのＢＡＣＥプロセッシングも遮断せず、ＡＰＰとの抗体相互作用も遮断しなかった実施例３は、ＥＶ−アミロイドとの抗体相互作用に対して全く効果を有していなかった。
【実施例８】
【０１７３】
ＢＡＣＥ２酵素は、Ａβドメイン内の幾つかの異なる位置で、ＡＰＰを切断する。ＡＰＰのＡβドメイン内の異なる切断部位でのＢＡＣＥ２切断の異なる阻害は、阻害が、酵素切断ではなく、化合物の基質との相互作用によるものであることを示すのに役立つであろう。
【０１７４】
ＡＰＰのＢＡＣＥ２切断の阻害
β−セクレターゼ切断部位での、ＡＰＰの切断に対する実施例１−４の効果は、以下のようにしてアッセイした。
【０１７５】
切断反応：
２５μＬ ０．２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５
１０μＬ １０×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１８３６１５３）、
１０μＬ ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍＬ溶液）
４μＬ ５％ＣＨＡＰＳ
１μＬ ＥＤＴＡ（１５０ｍＭ、ｐＨ４．５）
２μＬ ＤＦ２μＬ
４μＬ ＮＦＥＶ ＢＡＣＥ切断部位を含有する、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）−ビオチン化ＡＰＰ融合タンパク質（細菌によって発現される、１０μＭ溶液）
１μＬ ＤＭＳＯ又はＤＭＳＯ中に溶解された化合物
２μＬ ＢＡＣＥ２（ＣＨＯ細胞によって発現されたタンパク質、２５０ｎＭ）
４１μＬ 蒸留水
反応物を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０ ４μＬで反応を停止した。
【０１７６】
ＡＬＰＨＡを用いたＭＢＰビオチンＡＰＰ（ＮＦ）切断産物の検出
ＡＬＰＨＡアッセイ混合液は、以下のようにして調製した。
【０１７７】
２０μＬ ストレプトアビジン供与体ビーズ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ（プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより）；１０，０００ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６７６０６１７Ｍ）
２０μＬ プロテインＡ受容体ビーズ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ （プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより）；１０，０００ ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６７６０６１７Ｍ）
３．７μＬ アフィニティー精製された抗ＮＦ抗体（２０３μｇ／ｍＬ）（ＷＯ ０２／０９４９８５に記載されている）
４．５ｍＬ ＰＢＳ中の０．１％ ＢＳＡ
反応停止された反応混合物４μＬを、アッセイ混合液４６μＬと混ぜ合わせた。反応物を、室温で一晩インキュベートし、ＡＬＰＨＡＱｕｅｓｔプレートリーダーを用いて読み取った。
【０１７８】
結果：
【０１７９】
【表２】
【０１８０】
実施例３は、ＢＡＣＥ１に対して不活性であり、ＢＡＣＥ２に対して若干活性であった。実施例１、２及び４は、同一部位でのＢＡＣＥ１切断の阻害と同様の有効性で、β−セクレターゼ位置におけるＡＰＰのＢＡＣＥ２切断を阻害することが可能であった。
【実施例９】
【０１８１】
「Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ， ２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：２１２８６−２１２９４」に記載されているプロトコールを用いて、ＥＶアミロイドのＢＡＣＥ２切断の阻害の効果をアッセイした。１００μＭの実施例１ないし４をアッセイする結果を以下に示す。
【０１８２】
【表３】
【０１８３】
調べた４つの化合物全てが、３４位でのＢＡＣＥ２切断を破壊した。
シグナルが極めて弱かったために、実施例１、２及び３では、１９及び２０位での切断に対する効果は、決定することができなかった。しかしながら、実施例２は、１９及び２０位での切断を大幅に増加させ、ＡＰＰのＢＡＣＥ２切断に対する位置依存的効果を示している。
【０１８４】
図１は、実施例４及び実施例１の化合物の１００μＭの存在下及び不存在下で、ＡβのＢＡＣＥ２切断の質量分析を示している。実施例４は、１９及び２０位でのＡβの切断を増強したが、３４位での切断を遮断した一方、実施例４は、全てのＡβ部位での切断を抑制した。このデータは、本発明の化合物が、セクレターゼ切断の調節物質として作用し得ることを示している。
【実施例１０】
【０１８５】
ウェスタンブロット分析を実施するために、増強されたＢＡＣＥ切断配列を含有する、細菌によって発現されたＡＰＰバリアントを、実施例２及びＢＡＣＥ１タンパク質とともに３７℃で１時間インキュベートした。反応物をゲル上に走行させて、ブロッティングした。ＢＡＣＥ切断後に生じるＮ末端産物を特異的に認識する抗体を使用して、ＢＡＣＥ特異的切断産物を検出した。図２（Ａ）は、ウェスタンブロットを図示している。図２（Ｂ）は、ウェスタンブロットの濃度測定定量であり、ＡＰＰのＢＡＣＥ切断が１１μＭのＩＣ５０で阻害されることを示している。
【実施例１１】
【０１８６】
図３は、スタチン−Ｖａｌ及び実施例４による、完全長ＡＰＰ及びβ部位Ｐ５／Ｐ５’ペプチド及びＡＰＰ断片のＢＡＣＥ１切断の阻害を示している。図３（Ａ）は、ＡＰＰ及びＡＰＰ断片のＢＡＣＥ切断（β部位Ｐ５／Ｐ５’ペプチド断片を含む。）の公知の阻害剤であるスタチン−Ｖａｌによる阻害を図示している。図２（Ｂ）は、実施例４による阻害を図示している。これらのグラフは、完全長ＡＰＰ基質（白丸）又はβ部位Ｐ５／Ｐ５’断片（白四角）の切断の阻害を図示している。酵素活性は、ＤＭＳＯ処理されたＢＡＣＥ切断と比較して示されている。スタチン−Ｖａｌは、ＡＰＰ及びペプチドをベースとする両基質の切断の阻害を示すのに対して、実施例４はＡＰＰのみの切断を阻害する。
【実施例１２】
【０１８７】
実施例１の化合物を、ＣＴＦ９９を発現しているＨ４神経膠腫細胞中に滴定した。実施例１の化合物で、該細胞を２０時間処理し、馴化培地を採集した。ＥＣＬを用いて、分泌されたアミロイドｘ−４２及びｘ−４０のレベルをアッセイし（Ｌｉ ｅｔ ａｌ， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６１３８−６１４３）、Ａβ４２及びＡβ４０の産生を測定し、図４に示されているように、グラフにした。結果は、本発明の化合物が、Ａβペプチドの産生を調節して、Ａβ４０の産生との比較においてＡβ４２の産生を減少させることを示している。
【実施例１３】
【０１８８】
式（Ｉ）の化合物は、ＡＰＰを結合することによってＡＰＰ切断機能を阻害すると考えられている。ＢｉａｃｏｒｅＳ５１によって、ＡＰＰへの実施例１の化合物の結合をアッセイした。ビオチン化されたＡＰＰ及びビオチン化されたｓＡＰＰｂを、ＳＡコートされたセンサーチップに固定した。実施例１の滴定を注射し、両タンパク質について、実施例１の各濃度に対する結合応答を得た。図５は、ＡＰＰに結合する、化合物２（白丸）又はＢＡＣＥ１阻害剤であるスタチン−Ｖａｌ（白四角）に対する反応単位のグラフである。
【０１８９】
実施例１の化合物はＡＰＰに結合するが、ｓＡＰＰβに結合しないこと、ＢＡＣＥ阻害剤、スタチン−ＶａｌはＡＰＰ及びｓＡＰＰβの何れにも結合しないことを、これらデータは示している。幾つかの異なる酵素によるＡＰＰプロセッシングが実施例１の化合物によって阻害されることを考え合わせると、実施例１の化合物のＡＰＰ結合能は、ＡＰＰプロセシングの阻害が、化合物と酵素との間の相互作用ではなく、むしろ、化合物とＡＰＰとの間の相互作用によって引き起こされ得ることを示している。
【０１９０】
本文書を通じて、以下の略号が使用される。
Ｍｅ：メチル
Ｅｔ：エチル
Ｂｕ：ブチル
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
Ａｒ：アリール
Ｂｎ：ベンジル
ＴＨｆ：テトラヒドロフラン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＰＰ：トリフェニルリン酸
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳＯ：３−［（クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート
ＣＨＡＰＳ：３−［（クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＲＩＰＡ：放射性免疫沈降アッセイ
ＰＩＰＥＳ：ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（エタンスルホン酸）
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
【０１９１】
本発明のある種の具体的な実施形態を参照しながら、本発明を記述及び例示してきたが、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、手順及びプロトコールの様々な改変、変化、変更、置換、欠失又は付加を為し得ることが当業者には自明であろう。例えば、上述されている本発明の方法から化合物を調製するための試薬又は方法の改変の結果として、本明細書に上記されている具体的な条件以外の反応条件を適用してもよい。同様に、出発材料の具体的な反応性は、存在する具体的な置換基又は製造の条件に従って、及びこれらに応じて変動する場合があり得、本発明の目的及び実施に従って、このような予測される結果の変動又は相違が想定される。従って、本発明は、以下に記載されている特許請求の範囲によって定義され、このような特許請求の範囲は、合理的な限り、できるだけ広く解釈されるべきものとする。
【０１９２】
さらに、全ての値はおよその値であり、記述のために与えられていることを理解しなければならない。特許、特許出願、刊行物、製品の説明及びプロトコールが本願を通じて引用されているが、これらの開示内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために、本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１Ａ】実施例１及び４の化合物によって影響を受けたＢＡＣＥ２によるＡβ切断の質量分析を図示している。
【図１Ｂ】実施例１及び４の化合物によって影響を受けたＢＡＣＥ２によるＡβ切断の質量分析を図示している。
【図２Ａ】図２（Ａ）及び２（Ｂ）は、実施例２の化合物による、ＡＰＰのＢＡＣＥ１切断の阻害のウェスタンブロット分析を図示している。
【図２Ｂ】図２（Ａ）及び２（Ｂ）は、実施例２の化合物による、ＡＰＰのＢＡＣＥ１切断の阻害のウェスタンブロット分析を図示している。
【図３Ａ】スタチン−Ｖａｌ及び実施例４の化合物による完全長ＡＰＰ又はＡＰＰ断片のＢＡＣＥ１切断の阻害を図示している。
【図３Ｂ】スタチン−Ｖａｌ及び実施例４の化合物による完全長ＡＰＰ又はＡＰＰ断片のＢＡＣＥ１切断の阻害を図示している。
【図４】図４は、Ｈ４−Ｃ９９細胞中のＡβ４０及び４２レベルの減少を図示している。
【図５】図５は、実施例１の化合物によるＡＰＰの結合のグラフを図示している。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００４年４月７日に出願された米国仮出願第６０／５５８，８５５号及び２００４年７月１５日に出願された第６０／５８８，１８５号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的には、アルツハイマー病（「ＡＤ」）に付随する神経学的及び生理学的な機能不全の分野に関する。より具体的には、本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）への、又はＡＰＰのβ−アミロイド（Ａβ）断片への、物質の結合特性を同定及び評価するための方法に関する。本発明は、ＡＰＰ又はＡβと特異的に相互作用し、ＡＰＰ又はＡβの、セクレターゼとの又はＡＰＰ若しくはＡβ結合抗体との相互作用を遮断する、ベンゾフラン誘導体のクラスにも関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病は、高齢者を侵す一般的な神経変性疾患である。本疾患の主な特徴には、進行性の記憶障害、言語及び視覚空間能力の喪失並びに行動の不足が含まれる。これらの認知機能の変化は、大脳皮質、海馬、前脳基底部及び脳の他の領域中の神経細胞の変性の結果である。アミロイドβペプチド（Ａβ）と名付けられた３９−４３個のアミノ酸ペプチドの蓄積が、アルツハイマー病の原因であると考えられる。Ａβは、β−アミロイドタンパク質切断酵素（「β−セクレターゼ」又は「ＢＡＣＥ」）及びγ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセッシングによって脳内で産生される。このプロセッシングは、脳内のＡβの蓄積をもたらす。
【０００４】
ＡＤの病因を解明する上での最近の進歩の多くは、この複雑な疾患の遺伝的に多様な形態の統一的な病理的特徴として、Ａβの明白な役割に中心を据えている。ＡＤに特徴的な神経病理学的特性は、アミロイド斑として知られる不溶性のタンパク質堆積物が罹病者の脳内に蓄積することである。これらのアミロイド斑堆積物の存在は、アミロイド仮説の基礎を成す不可欠な観察である。
【０００５】
Ａβの堆積が、アミロイド斑の発生及びＡＤの発症に重要な役割を果たしていることが、証拠によって示唆されている。例えば、ＡＰＰをコードする遺伝子（Ａβタンパク質は、該遺伝子に由来する。）中に変異を有する個体は、アルツハイマー病を必ず発症する（Ｇｏａｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８４４−８４６； Ｍｕｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １：３４５−３４７； Ｍｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：９７−９９； Ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ， １９９５， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． ３５：８−１９）。同様に、ほぼ全てのアルツハイマー病患者の脳内にアミロイド斑が認められること、及びアミロイド斑の蓄積の程度が認知症の程度と相関することが、剖検によって示されている（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＆ Ｃｏｔｍａｎ， １９９５， Ｌａｎｃｅｔ ３２６：１５２４−１５８７）。
【０００６】
Ａβの細胞外蓄積と堆積がＡＤの発症における中心的な現象であることが、多くの証拠によって示唆されている一方、Ａβ又はアミロイド含有Ｃ末端断片（ＣＴＦβ）の細胞内蓄積の増加も、ＡＤの病態生理に役割を果たしている可能性があることが、最近の研究によって提起されている。例えば、家族性ＡＤを引き起こす変異を保有するＡＰＰの過剰発現は、神経細胞培養物中へのＣＴＦβの細胞内蓄積とＨＥＫ２９３細胞中へのＡβ４２の細胞内蓄積を増加させる。Ａβ４２は、Ａβのより短い形態より、アミロイド斑形成の点でさらに有効であると考えられている、４２アミノ酸のＡβの長い形態である。さらに、海馬の神経細胞中の異なる細胞プール中に細胞内及び細胞外Ａβが形成されること、並びにＡβ４２の細胞内蓄積の増加は、ＡＰＰ中の家族性ＡＤ突然変異の２つの種類（「スウェーデン」と「ロンドン」）に付随する共通の特徴である。このように、ＡＤの病変における細胞外Ａβ蓄積の関与を示唆するこれらの研究及びさらに初期の報告に基づけば、変化を受けたＡＰＰ異化作用が疾病の進行に関与している可能性があると思われる。
【０００７】
ＡＰＰは、様々なタンパク分解プロセッシング現象を実行する遍在性の膜貫通（１型）糖タンパク質である。（Ｓｅｌｋｏｅ， １９９８， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：４４７−４５３）。ＡＰＰは、実際には、単一遺伝子からの選択的スプライシングによって産生されるペプチドのファミリーである。ＡＰＰの主要な形態は、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０として知られており、下付き文字は、各スプライスバリアント中のアミノ酸の数を表している（Ｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２５−５２７； Ｔａｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２８−５３０； Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５３０−５３２）。ＡＰＰは、多くの細胞中で発現されており、恒常的に異化される。
【０００８】
ＡＰＰは、巨大な外部ドメイン、膜貫通領域及び短い細胞質尾部を有する受容体様構造を有する。Ａβドメインは、ＡＰＰの細胞外及び膜貫通両ドメインの一部を包含する。ＡＰＰからのＡβの放出は、ＡβのＮＨ２末端及びＣＯＯＨ末端を生成するために、２つの異なるタンパク分解現象が存在することを示唆する。膜からＡＰＰを放出し、ＡＰＰの可溶性ＣＯＯＨ末端切断形態（「分泌されたＡＰＰ」又は「ｓＡＰＰ」）を生成する、少なくとも２つの分泌機構が存在する。膜からＡＰＰ及びその断片を放出するプロテアーゼは、「セクレターゼ」と称されている。
【０００９】
主要な異化経路は、α−セクレターゼによる、Ａβ配列内でのＡＰＰの切断であると思われ、可溶性細胞外ドメイン（ｓＡＰＰα）の恒常的分泌及び非アミロイド産生性細胞内断片（約９ｋＤ）（恒常的カルボキシ末端断片（ｃＣＴＦα）と称される。）の出現をもたらす。ｃＣＴＦαは、γ−セクレターゼによる切断のための適切な基質であり、ｐ３断片を与える。この経路は、種間で広く保存されており、多くの細胞種中に存在するようである（Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｅｌｌ ５７：１１５−１２６； Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：４４９２−４４９７； ａｎｄ Ｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４Ｓ：１１２２−１１２４）。この経路では、ＡＰＰのプロセッシングは、Ａβ領域の残基Ｌｙｓ１６とＬｅｕ１７間の部位でのタンパク分解切断を伴うが、ＡＰＰは、なお、トランスゴルジ分泌コンパートメント中に存在する（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７７３−７７６）。この切断は、ＡＰＰのＡβ部分内で起こるので、Ａβの形成を伴わない。ｓＡＰＰαは、神経栄養及び神経保護活性を有する（Ｋｕｅｎｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２９５：３６７−３７８）。
【００１０】
α−セクレターゼが関与する非アミロイド産生経路とは異なり、β−セクレターゼによるＡＰＰのタンパク分解プロセッシングは、ＡβのＮ末端を露出させ、完全なＡβドメインを含有するＣＯＯＨ末端断片（Ｃ末端断片又はＣＴＦ）を産生する。様々なＣ末端におけるγ−セクレターゼ切断後に、Ａβが解離される。γ−セクレターゼ活性は、単一のペプチド結合においてではなく、ＡＰＰアミノ酸の短い連なりにわたって生じるので、Ｃ末端は、実際には、単一部位ではなく、むしろ切断部位の異種的集合物である。アミロイド産生経路では、ＡＰＰは、β−セクレターゼによって切断されて、ｓＡＰＰβ及びＣＴＦβを解離し、次いで、ＣＴＦβは、γ−セクレターゼによって切断されて、有害なＡβペプチドを解離する。
【００１１】
このＡβ産生経路において特に重要なのは、γ−セクレターゼ切断の位置である。γ−セクレターゼ切断が、残基７１１−７１２で起これば、短いＡβ（Ａβ４０）が得られる。γ−セクレターゼ切断が残基７１３以降での切断であれば、長いＡβ（Ａβ４２）が得られる。このように、γ−セクレターゼプロセスは、長さ４０又は４２アミノ酸のＡβペプチド（それぞれ、Ａβ４０及びＡβ４２）の産生に対して中心的である。ＡＰＰ及びそのプロセッシングについて考察している概説については、「Ｓｅｌｋｏｅ， １９９８， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４４７−４５３； Ｓｅｌｋｏｅ， １９９４， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０：３７３− ４０３」を参照されたい。「Ｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１１２２」も参照されたい。ＡＰＰの切断は、タンパク質分解によって産生されるポリペプチド又はペプチド断片を検出することによる様式を含む、多数の慣用の様式で検出することが可能である。このような断片は、抗体結合など、任意の便利な手段によって検出することが可能である。タンパク質分解切断を検出するための別の便利な方法は、基質の切断によって色素源（例えば、有色産物又は蛍光産物）を放出する色素産生性β−セクレターゼ基質を使用することである。
【００１２】
アルツハイマー病の症候を予防又は改善する手段として、アミロイド斑の発生を阻害する可能性に対して多大な興味が注がれている。この目的のために、有望な戦略は、一緒にＡβの産生に関与している２つの酵素であるβ及びγセクレターゼの少なくとも１つの活性を阻害することである。Ａβの堆積の結果としてのアミロイド斑の形成が、アルツハイマー病の原因であれば、２つのセクレターゼのうち一方又は両方の活性を阻害することは、炎症又はアポトーシスの発生などの後期段階での現象前に、疾病過程に初期段階で介入することになると思われるので、この戦略は魅力的である。このような初期段階での介入は、特に有益であると予想される（例えば、Ｃｉｔｒｏｎ， ２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ ６：３９２−３９７を参照）。
【００１３】
これらの理由のため、ＡＰＰからのＡβの産生を阻害若しくは抑制し、又は脳内Ａβの蓄積を阻害する能力について、試験化合物をスクリーニングするための方法及びシステムを提供することは望ましいであろう。特に、このような方法及びシステムは、試験化合物が変換をもたらす代謝経路を中断又は妨害することができる、このような変換に関わっている代謝経路に基づくことが望ましくいであろう。特に、適切な候補薬となる試験化合物の初期スクリーニングに特に適するように、当初の方法は、動物モデルではなく、むしろインビトロ系を使用すべきである。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、一つには、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はＡＰＰのβ−アミロイド（Ａβ）断片への、物質の結合特性を同定及び評価するためのアッセイに関する。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はアミロイドβペプチド（Ａβ）への物質の相互作用を測定する方法であり、前記方法は、
（ａ）第一の検査溶液（第一の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント、（ｉｉ）物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのｓＡＰＰβ領域に対して特異的である第一の抗体を含む。）をｓＡＰＰβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、ｓＡＰＰβ−抗体複合体の第一の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｂ）第二の検査溶液（第二の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアント、（ｉｉ）前記物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域に対して特異的である第二の抗体を含む。）を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第二の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｃ）対照溶液（前記対象領域は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントおよび（ｉｉ）前記第一及び第二の抗体を含む。）をｓＡＰＰβ−抗体複合体及びＡβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、ｓＡＰＰβ−抗体複合体の第一の対照シグナル読み取りおよびＡβ−抗体複合体の第二の対照シグナル読み取りを得ること、
（ｄ）前記第一の検査シグナル読み取りと前記第一の対照シグナル読み取りを比較すること、並びに前記第二の検査シグナル読み取りと前記第二の対照シグナル読み取りを比較すること、を含み、
（ｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡＰＰと相互作用せず、
（ｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りより低く、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡＰＰのｓＡＰＰβ領域に特異的に結合し、
（ｉｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りより低ければ、前記物質はＡＰＰのＡβ領域に特異的に結合する、
前記方法に関する。
【００１６】
ある種の実施形態において、Ａβに対して特異的な抗体は、Ａβのアミノ酸１ないし１７又は２８ないし４０に対して特異的である。他の実施形態において、Ａβに対して特異的な抗体は、Ａβ領域のＣ末端に特異的である。他の実施形態において、Ａβ領域に対して特異的な抗体は、Ａβ領域のＮ末端に対して特異的である。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、
アミロイドβペプチド（Ａβ）への物質の相互作用を測定する方法であり、前記方法は、
（ａ）第一の検査溶液［第一の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）、（ｉｉ）物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域の前記第一の亜領域に対して特異的である第一の抗体を含む。］を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第一の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｂ）第二の検査溶液［第二の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）、（ｉｉ）前記物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域の前記第二の亜領域に対して特異的である第二の抗体含む。］を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第二の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｃ）対照溶液［前記対象溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）および（ｉｉ）前記第一及び第二の抗体を含む。］をＡβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第一の対照シグナル読み取りとＡβ−抗体複合体の第二の対照シグナル読み取りとりを得ること、
（ｄ）前記第一の検査シグナル読み取りと前記第一の対照シグナル読み取りを比較すること、及び前記第二の検査シグナル読み取りと前記第二の対照シグナル読み取りを比較すること、を含み、
（ｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡβと相互作用せず、
（ｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りより低く、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡβの前記第一の亜領域に特異的に結合し、
（ｉｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りより低ければ、前記物質はＡβの前記第二の亜領域に特異的に結合する、
前記方法に関する。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、Ａβの前記第一の亜領域はＣ末端であり、Ａβの前記第二の亜領域はＮ末端である。
【００１９】
本発明のアッセイでは、前記検査溶液及び対照溶液は、希釈剤、ｐＨ調整剤又はアッセイで一般的に使用される他の添加物及び不活性担体をさらに含んでよい。検査及び対照溶液は、最大約２４時間インキュベートしてよい。
【００２０】
ある種の実施形態において、前記物質は、約２ｋＤ未満、好ましくは約１００Ｄａないし１，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。
【００２１】
ある種の実施形態において、アッセイで使用されるＡＰＰは、検出可能に標識されており、例えば、リガンドにより検出可能に標識されている。
【００２２】
ある種の実施形態において、前記検査及び対照溶液は、受容体ビーズを含む。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、本発明のアッセイによって同定された、ＡＰＰ又はＡβと相互作用する物質に関する。ある種の実施形態において、前記物質は、約２ｋＤ未満の分子量を有する小分子である。一実施形態において、前記物質は、式Ｉの化合物
【００２４】
【化４】
（式中、
Ｒ４は、必要に応じて存在し、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）Ｃ１−６アルキル及び
（ｃ）Ｃ１−６アルコキシ
からなる群から選択され；
Ｒ２は、
（ａ）水素、
（ｂ）（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ５（Ｒ５は、水素及びＣ１−６アルキルからなる群から選択され、ｍは、１、２又は３である。）
からなる群から選択され；
Ｒ３は、
（ａ）水素、及び
（ｂ）
【００２５】
【化５】
（Ｒ５及びＲ６は、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）ハロゲン、
（ｉｉｉ）Ｃ１−６アルキル、
（ｉｖ）Ｃ１−６アルコキシ及び
（ｖ）テトラゾリル
からなる群から選択され；
ｎは、３、４又は５である。）
からなる群から選択される。）
からなる群から選択されるベンゾフラン誘導体又は薬学的に許容されるその塩である。
【００２６】
（Ｉ）の化合物は、ＡＰＰ又はＡβと相互作用することが可能であり、ＡＰＰ又はＡβの、セクレターゼ又はＡＰＰ若しくはＡβ結合抗体との相互作用を遮断することが可能である。従って、式Ｉの化合物は、アルツハイマー病の治療において潜在的に有用である。
【００２７】
本発明は、式（Ｉ）の化合物の治療的有効量を、アルツハイマー病の治療を必要としている患者に投与することを含む、前記患者のアルツハイマー病を治療する方法にも関する。本発明は、式（Ｉ）の化合物の治療的有効量を、アルツハイマー病の改善又は抑制を必要としている患者に投与することを含む、前記患者のアルツハイマー病を改善又は抑制する方法にも関する。
【００２８】
定義
本明細書において使用される「ベータ−セクレターゼ」又は「β−セクレターゼ」という用語は、文献において、「ＢＡＣＥ」、「ＢＡＣＥ１」（例えば、Ｖａｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：７３５−７４１参照）又はＢＡＣＥ２（例えば、Ｆａｒｚａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００， ＰＮＡＳ ９７：９７１２−９７１７参照）としてときに知られている酵素を表す。ＢＡＣＥ１は、５０１アミノ酸の膜結合アスパラギン酸プロテアーゼである。ＢＡＣＥ１は、β−セクレターゼの公知の機能的特性及び特徴を全て有している。Ａｓｐ−１又はメマプシン−１とも称されるＢＡＣＥ２は、膜結合型アスパラギン酸プロテアーゼのＢＡＣＥファミリーの第二のメンバーである。 ＢＡＣＥ１とＢＡＣＥ２との差のさらなる論述については、「Ｒｏｇｇｏ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００２， ２：３５９− ３７０」を参照されたい。
【００２９】
本明細書で使用されている「γセクレターゼ」又は「ガンマセクレターゼ」という用語は、膜結合型ＡＰＰプロセッシング中間体からＡβペプチドを放出する重要な酵素であるガンマセクレターゼ酵素を表す。ガンマセクレターゼは、２つのプレセニリン断片並びに補因子ニカストリン、Ｐｅｎ−２及びＡｐｈ−１を含む、多タンパク質複合体であると考えられる。「Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， １００：１３０７５−１３０８０； Ｂｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｂｉｏｃｈｅｍ ４２：８１３３−８１４２」を参照されたい。
【００３０】
さらに、本明細書において使用される「ベータ−セクレターゼ」及び「ガンマセクレターゼ」という用語には、それぞれ、ＡＰＰ中のβ部位及びγ部位で切断する能力を有する天然酵素の全ての哺乳類形態が含まれる。本明細書において使用される「ベータ−セクレターゼ」及び「ガンマセクレターゼ」という用語には、同一基質に対する天然β−セクレターゼ又はγセクレターゼの有効性の少なくとも約５％のレベルで、ベータセクレターゼ又はガンマセクレターゼ基質の切断を触媒する機能的能力を維持している限り、このような酵素の、全ての組換え形態、突然変異及びその他のバリアントも含まれる。
【００３１】
本明細書において使用される「バリアント」という用語は、本発明において、元の配列の生物学的活性と実質的に同様の生物学的活性（機能的又は構造的の何れか）を保持する配列（核酸又はアミノ酸）を表す。このバリアント又は均等物は、同じ若しくは異なる種から得てもよく、天然バリアントであってもよく、又は合成的に調製されてもよい。このようなバリアントには、タンパク質の生物活性が保存されていれば、１以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列が含まれる。配列の生物活性が概ね維持されていれば、１以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有することが可能である核酸配列のバリアントに対しても、同じことが当てはまる。
【００３２】
本明細書において使用される「ＡＰＰバリアント」又は「バリアントβセクレターゼ基質」という用語は互換的に使用される。
【００３３】
典型的なＡＰＰバリアント（又はバリアントβ−セクレターゼ基質）は、ＷＯ０２／０９４９８５として公開された国際出願ＰＣＴ ／ＵＳ０２／１５５９０及び同じ所有者の米国特許出願ＵＳ２００３／０２００５５Ａ１（ともに、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されている新規β−セクレターゼＰ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’切断部位の何れかを含有するポリペプチドであり、このような分子が分析を促進するためにさらなるエピトープを含むかどうかを問わない。例えば、β−セクレターゼＰ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’切断部位の一方又は両方側に付着された２、３、４、５又は６個のアミノ酸から構成されるポリペプチドは、修飾されたβ−セクレターゼ基質である。修飾されたβ−セクレターゼ基質には、その各々が少なくとも８個のアミノ酸の連続配列断片を含む非天然ペプチドが含まれ、このような断片は、合成β−セクレターゼ切断部位を含み、前記少なくとも８個のアミノ酸は、Ｗ０２／０９４９８５及びＵＳ ２００３／０２００５５５Ａ１に開示されている配列の群から選択される配列を有する。これらに同様に記されているように、このような非天然ペプチドの断片及び相同体も、本発明によって包含される。完全長ＡＰＰ分子（６９５、７５１又は７７０アミノ酸長の何れでもよい。）、及び追加アミノ酸が一方又は両方末端に付加されたような分子は、それらが、上述のように、β−セクレターゼＰ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’切断部位を有している限り、修飾されたβ−セクレターゼ基質である。また、６９５、７５１又は７７０アミノ酸長の完全長ＡＰＰ分子より小さいが、最大１６ポリペプチド長の前記マルチマーより大きく、ＡＰＰ配列から実質的に構成され且つβ−セクレターゼによって切断可能な中間サイズのポリペプチドは、それらが、上述のように、β−セクレターゼＰ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’切断部位を有している限り、修飾されたβ−セクレターゼ基質である。このような中間サイズのポリペプチドは、ＡＰＰの「生物活性断片」又は「生物活性なアミノ酸断片」、「ＡＰＰ生物活性断片」又は「ＡＰＰ生物活性アミノ酸断片」とも称される。単独のβ−セクレターゼによる酵素的切断、又はγ−セクレターゼなどの他の酵素と組み合わせたβ−セクレターゼによる酵素的切断から得られるペプチド及びポリペプチドを表す場合には、「断片」という用語の使用との混同を避けるため、このような中間サイズのポリペプチドという表記（下記）は、これらの用語に限定される。
【００３４】
「誘導体」という用語は、本来これらの分子の一部ではない追加の化学的部分を含む場合に、上記バリアントの全てを含むものとする。これらの化学的部分は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期の改善、毒性の減少及び望ましくない副作用の除去又は減少など、様々な目的を有することが可能である。さらに、これらの部分は、標識、結合の目的のために使用することが可能であり、又はこれらの部分は、融合産物中に含めてもよい。上記効果を媒介することが可能な様々な部分は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （１９９５）」に見出すことが可能である。このような部分を分子に結合するための方法は、本分野において周知である。
【００３５】
「保存的アミノ酸置換」とは、別の、化学的に類似のアミノ酸残基による、あるアミノ酸残基の置換を表す。このような保存的置換の例は、ある疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニン）の置換を別の疎水性残基に置換すること、ある極性残基を同じ電荷の別の極性残基に置換すること（例えば、アルギニンをリジンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に）；ある芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン又はフェニルアラニン）を別の芳香族アミノ酸に置換することである。
【００３６】
上記定義の「保存的アミノ酸置換」は、さらに広義の用語である「保存的に修飾されたこれらのバリアント」という用語によって包含されるアミノ酸配列のリストのバリエーションの一種にすぎない。例えば、「保存的に修飾されたこれらのバリアント」という用語は、「Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ． § ２４２２．０３， Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１」中の用語に対して与えられた意味を有するものと解釈され、「Ｃ末端における、１、２、３、４又は５個の残基」などの欠失を含むことが可能であるが、この例に限定されるものではない。
【００３７】
例えば（但し、限定を加えるものではない。）、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列は、比較ウィンドウ上で最大の一致度が得られるように並列された場合に２個の配列が同一であれば、基準配列に対して「同一」であると考えられる。比較ウィンドウを並置するためのヌクレオチド及びアミノ酸配列の最適なアラインメントは、「Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２」の局所相同性アルゴリズムによって、「Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３」の相同性アラインメントアルゴリズムによって、「Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２４４４−２４４８」の類似法に対する検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって （ＧＡＰ， ＢＥＳＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ， ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）又は検査によって実行してもよい。このような同一性の測定は、バリアントがβ−セクレターゼ基質として機能し続ける限り、あるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の「保存的に修飾されたバリアント」を表すものと考えることが可能である。
【００３８】
あるいは、本発明において、バリアントの比較類似性は、比較類似性が指定された境界内に属し、且つバリアントがβ−セクレターゼ酵素に対する基質であり続ける限り、新規タンパク質又はポリペプチド配列に対するそのバリアントの「相対配列同一性」によって定義される。例えば、あるＡＰＰ骨格（又はそのポリペプチド領域）は、置換、欠失、挿入及び付加のうち全てを有することが可能である。置換、欠失、挿入及び／又は付加を有するバリアントを作製するためのある種のアプローチ及び具体的な方法は、当業者の知識に属する。このため、ある実施形態では、指定された特許請求の範囲に記載されている配列数と少なくとも９５％同一である該配列数のタンパク質又はポリペプチドバリアント（アミノ酸配列相同性、すなわち「相対配列同一性」に基づく）は、このバリアントがβ−セクレターゼ酵素に対する基質であることが示されている場合には、本発明の範囲に属する。別の実施形態では、指定された特許請求の範囲に記載されている配列数と少なくとも８５％同一である該配列数のタンパク質又はポリペプチドバリアント（アミノ酸配列相同性に基づく）は、このバリアントがβ−セクレターゼ酵素に対する基質であることが示されている場合には、本発明の範囲に属する。さらに別の実施形態では、指定された特許請求の範囲に記載されている配列数と少なくとも６５％同一である該配列数のタンパク質又はポリペプチドバリアント（アミノ酸配列相同性に基づく）は、このバリアントがβ−セクレターゼ酵素に対する基質であることが示されている場合には、本発明の範囲に属する。このようなバリアントの全てについて、本明細書に記載されている試験系又は本分野で公知の他の方法などにおいて（又は、必要に応じて、本分野で後に公知となる方法を含む。）β−セクレターゼ酵素に対する「適切な基質」としての役割を果たす機能的能力が、本発明の操作及び任意の関連する請求項の範囲にこのようなバリアントの全てを含めることにとって、不可欠であることに留意すべきである。
【００３９】
「Ａβバリアントペプチド」とは、アミロイドβペプチド（Ａβ）のバリアント（この用語は上で定義されている。）であるアミロイドペプチドである。
【００４０】
β−セクレターゼ基質に関して「実質的にからなる」とは、基準配列に比べて、β−セクレターゼ基質の被切断能の大幅な減少を引き起こさないＮ末端及び／又はＣ末端の付加又は欠失によって、基準配列が修飾され得ることを表す。欠失の例は、Ｎ末端メチオニンの除去である。
【００４１】
「抗体」という用語は、分析物（抗原）に特異的に結合し及び認識する、１つの免疫グロブリン遺伝子又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はこれらの断片によって実質的にコードされるポリペプチドを表す。認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。抗体は、完全な状態の免疫グロブリンとして、又は、様々なペプチダーゼでの消化によって生じた、十分に特性決定された多数の断片として存在する。これらには、例えば、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２断片が含まれる。「抗体」という用語には、完全な抗体の修飾によって作製された抗体断片又は組換えＤＮＡ法を用いて新規に合成された抗体断片が含まれ、慣用技術によって作製された「ヒト化」抗体をさらに含む。
【００４２】
「イムノアッセイ」という用語は、分析物を特異的に結合するために抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、分析物を単離し、標的とし、及び／又は定量するために、特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とする。
【００４３】
タンパク質及びその他の生物物質の異種集団の存在下で、抗体が、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの存在を決定する結合反応において機能を果たす場合に、抗体は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド「に特異的に結合する」、又はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドと「特異的に免疫反応性である」。このため、表記されたイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は、特定のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに優先的に結合し、試料中に存在する他のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに有意な量で結合しない。このような条件下での、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの特異的な結合には、特定のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに対する特異性について選択された抗体が必要である。特定のタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又はその中の領域若しくはエピトープへの抗体の会合に関連して、本明細書において使用される「認識する」という用語は、前記抗体が、そのタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又はその中の領域若しくはエピトープ「に特異的に結合する」こと、又はそのタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又はその中の領域若しくはエピトープ「と特異的に免疫反応性である」ことを意味するものとする。
【００４４】
本発明において使用するのに適した抗体には、ＡＰＰ又はＡβに対して特異的である任意の抗体、より正確には、ＡＰＰ又はＡβの様々な特定領域に対して特異的である任意の抗体が含まれる。適切な抗体は文献に記載されており、当業者に公知である。ＡＰＰ又はＡβの特定領域に対して特異的な抗体は、慣用技術を用いて、当業者によって開発され得る。本発明のアッセイで使用するのに適した抗体の１つの種類は、ＡＰＰのｓＡＰＰβ領域に対して特異的な抗体である。典型的なｓＡＰＰβ特異的抗体には、カリフォルニア州南サンフランシスコのＺｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入できるＬＮ２７（ＡＰＰのＮ末端２００アミノ酸に対して特異的である。）；コロラド州ゴールデンのＡｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓから購入できるＰ２−１；インディアナ州のインディアナポリスのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入できる２２Ｃ１１及びテキサス州サンアントニオのＡｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．から購入できるＳ−１２が含まれる。
【００４５】
本発明のアッセイで使用するのに適した抗体の別の種類は、ＡＰＰのＡβ領域に対して特異的な抗体である。Ａβ領域に対して特異的な典型的抗体には、東レ、東京、日本から購入できるＷＯ−２及びマサチューセッツ州デドハムのＳｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入できる６Ｅ−１０が含まれる。
【００４６】
本発明のアッセイで使用するのに適した抗体の別の種類は、ＡβのＣ末端に対して特異的な抗体である。典型的なＡβＣ末端抗体には、日本、東京の東レ、から購入できるＧ２−１０が含まれる。
【００４７】
本発明のアッセイで使用するのに適した抗体の別の種類は、ＡβのＮ末端に対して特異的な抗体である。
【００４８】
抗体と特異的に結合するタンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、及び免疫細胞の細胞表面状態と特異的に結合する加工されたペプチドは、「抗原」と称される。
【００４９】
「免疫原性ペプチド」は、適切な宿主動物中に濃度の適切な範囲で注入された場合に、適切な宿主動物中に免疫応答（液性及び／又は細胞媒介性）を誘導するのに十分な長さとアミノ酸組成を有するペプチド配列として定義される。修飾されたβセクレターゼ切断部位（例えば、ＷＯ０２／０９４９８５及びＵＳ２００３／０２００５５５Ａ１に開示されている修飾されたβ−セクレターゼ切断部位など）の全部又は一部を含む免疫原性ペプチドは、修飾されたβ−セクレターゼ切断部位のペプチド配列を遊離ペプチドとして最終的に認識する抗体を、宿主動物中で産生させる（β−セクレターゼによって加工されたＡＰＰ及びＡＰＰバリアントの末端時においても）。先述された免疫原性ペプチドは、抗原の特性も有する。すなわち、このような各免疫原性ペプチドは、このような特異的ペプチドに対して産生された特定の抗体と特異的に結合する点で抗原である。
【００５０】
特定のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドと特異的に免疫反応する抗体を選択するために、様々なイムノアッセイフォーマットを使用し得る。例えば、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドと特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが日常的に使用される。特異的な免疫反応性を決定するために使用することが可能なイムノアッセイフォーマット及び条件の説明については、「Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．」を参照されたい。
【００５１】
本明細書において使用される「物質」という用語は、ＡＰＰ又はＡβと相互作用することが疑われ、且つセクレターゼ又はＡＰＰ結合抗体若しくはＡβ結合抗体との、ＡＰＰ又はＡβの相互作用を遮断することが可能である、いずれかの分子、化合物、分子若しくは化合物の混合物又はいずれかの他の組成物を意味する。本発明においてスクリーニングされる「物質」は、創薬過程中に薬学産業において一般的にスクリーニングされるあらゆる物質とすることができる。該物質は、タンパク質、多糖、核酸などの生物ポリマーのような巨大分子であってもよい。一般的に、物質は、約２ｋＤ未満、より一般的に１．５ｋＤ未満、しばしば１ｋＤ未満、及び通常１００Ｄａから１，０００Ｄａ、さらに一般的に２００Ｄａから７５０Ｄａまでの範囲の分子量を有する化合物又は小分子である。様々な基準に基づいて、１又は複数の物質を予め選択してもよい。例えば、公知のタンパク質分解阻害活性を有するとして、適切な物質を選択してよい。あるいは、無作為に前記物質を選択し、本発明のスクリーニング方法によって検査してよい。インビトロでの、セクレターゼ又はＡＰＰ結合抗体若しくはＡβ結合抗体との、ＡＰＰ又はＡβの相互作用を遮断することができる物質は、細胞及び／又は動物中においてこれらがＡβ産生を減少する能力をさらにスクリーニングするための候補として考えられる。物質は、物質の巨大な集合物として、例えば、低分子量の有機化合物、ペプチド又は天然産物のライブラリーとして、本発明の方法において検査し得る。
【００５２】
本明細書に記載されているアッセイ及びスクリーニング法は、明示的に、「一つ」の物質の検査に関するものであるが、当業者であれば、このような方法を、複数物質の検査（例えば、このような集合物の何れかの要素がＡＰＰを結合するかどうかを決定するためのコンビナトリアルライブラリー）のために適合できることが明らかである。従って、物質の集合物の使用又はこのような集合物の各要素は、本発明の範囲に属する。
【００５３】
本明細書において使用される「アッセイ条件」という用語は、アッセイにおいて望まれる結合関係の形成に対して伝導性（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）である条件である。例えば、アッセイ条件は、抗体と抗原間の複合体の形成に対して伝導性であり、又は該複合体の形成に適した条件（例えば、ｓＡＡＰβ−抗体複合体の形成に適した条件）としてよい。アッセイ条件は、ｐＨ調整剤（例えば、酢酸ナトリウム）、希釈剤（例えば、ＤＭＳＯ）、緩衝剤（たとえば、ＰＩＰＥＳを含む緩衝溶液）、界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ）及び／又はブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ）の使用を含み得る。アッセイ条件は、市販のアッセイカクテル、例えば、市販のプロテアーゼ阻害剤カクテルの使用を含み得る。
【００５４】
本明細書に使用されている「受容体ビーズ」という用語は、アッセイで一般に使用される不活性ビーズを表す。典型的な受容体ビーズには、「Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」から入手できるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ検出キットから得られる受容体ビーズが含まれる。
【００５５】
「断片」という用語は、同定されたアミノ酸配列の任意のセグメント及び／又は本明細書に上述されているバリアント又は誘導体の全ての任意のセグメントを表す。
【００５６】
「ｓＡＰＰβ断片」又は「ｓＡＰＰβ」は、ＡＰＰがβ−セクレターゼによって切断された場合に生じる、約１００ｋＤａのアミノ末端断片を表す。
【００５７】
「Ｃ末端断片」又は「ＣＴＦβ」は、ＡＰＰがβ−セクレターゼによって切断された場合に生じる、約１２ｋＤａの９９アミノ酸（ＣＴＦ９９として知られる。）ＣＯＯＨ末端断片を表す。あるいは、「Ｃ末端断片」又は「ＣＴＦβ」は、ＡＰＰの９９Ｃ末端アミノ酸及びＮ末端メチオニンを含有する、１００アミノ酸の工作されたタンパク質（ＣＴＦ１００又はＣ１００としても知られる。）を表し得る。ＣＴＦβは、Ａβドメイン全体を含有する。
【００５８】
本明細書に記載されているβ−セクレターゼアッセイは、切断によって産生されたアミノ末端又はカルボキシ末端断片が固相上に捕捉されている「サンドイッチ」アッセイを用いて便利に実施される。捕捉された断片は、次いで、β−セクレターゼ切断によって露出された断片の末端に対して特異的な抗体を用いて検出してもよい。典型的な抗体には、β−セクレターゼ活性の結果として生じた任意の切断産物に対して生じた抗体が含まれる。切断された切断産物への抗体の結合は、抗体に直接（共有結合で）結合された、又はビオチン及びアビジンなどの中間連結物質を通じて間接的に結合された、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は他の検出可能な酵素標識などの慣用の標識系を用いて検出される。このような「サンドイッチ」アッセイは、ＩＧＥＮをベースとした技術、ＨＴＲＦ、Ａｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎ技術及び当業者に公知の他の技術など、様々な様式で実行することが可能である。
【００５９】
本明細書において使用される「測定可能な信号」という用語は、放射性リガンド結合因子の、標的への結合に際して与えられる、生成された信号のあらゆる種類（例えば、放射性、比色、測光、分光光度、シンチレーション）を含む。
【００６０】
本明細書において使用される「Ｃ末端」又は「カルボキシ末端」という用語は、末端α−カルボキシル基を含有するタンパク質又はペプチドの領域である。本用語は、本明細書において、アミロイドβペプチドの末端α−カルボキシル基を含有する領域を表すために使用される。
【００６１】
本明細書において使用される「Ｎ末端」又は「アミノ末端」という用語は、末端α−アミノ基を含有するタンパク質又はペプチドの領域である。本用語は、本明細書において、アミロイドβペプチドの末端α−アミノ基を含有する領域を表すために使用される。
【００６２】
本明細書において使用される「セクレターゼ」という用語は、ＡＰＰを切断して、ＢＡＣＥ１、ＢＡＣＥ２及びγセクレターゼを含む、アミロイド産生ペプチドを形成するプロテアーゼを表す。
【００６３】
本明細書において使用される「ビヒクル」という用語は、実験で対照として使用される担体用の不活性媒体又は活性物質を表す。例えば、本明細書に記載されている本発明のアッセイで使用する場合、目的の物質は、通常、希釈剤、ｐＨ調整剤及びアッセイを実施するために当業者によって一般的に使用される他の不活性担体とともにインキュベートされる。アッセイで対照として使用される「ビヒクル」中には、同一の希釈剤、ｐＨ調整剤及び他の不活性担体が存在する。
【００６４】
本明細書において使用される「相互作用」という用語は、目的の物質、リガンド又は抗体と生物学的受容体との間の結合又は化学的引力の特性を表す。本明細書において使用される「相互作用」は、共有結合、水素結合又はイオン結合など、物質リガンド又は抗体と受容体との間の化学的結合のあらゆる種類を表す。
【００６５】
一実施形態において、本発明は、ＡＰＰのｓＡＰＰβ領域との物質の相互作用を検出及び評価するためのアッセイ、並びにＡβとの物質の相互作用を検出及び評価するためのアッセイに関する。
【００６６】
この実施形態において、完全なＡＰＰタンパク質（又はＡＰＰバリアントタンパク質）は、目的の物質とともに、及びＡＰＰのｓＡＰＰβ領域に対して特異的である第一の抗体とともに、第一の検査溶液中でインキュベートされる。ＡＰＰのＡβ領域に対して特異的である第二の抗体と、目的の物質と、ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントとを含む第二の検査溶液が形成される。第二の抗体は、Ａβの様々な領域に対して特異的であり得る。例えば、第二の抗体は、Ａβのアミノ酸１ないし１７又は２８ないし４０に対して特異的であり得る。あるいは、第二の抗体は、ＡβのＣ末端又はＮ末端に対して特異的であり得る。
【００６７】
ビヒクル、第一の抗体及びＡＰＰ又はバリアント、並びにビヒクル、第二の抗体及びＡＰＰ又はバリアントを含む２つの対照溶液が、アッセイ条件下で形成される。それぞれ、第一の抗体及び目的の物質、並びに第二の抗体及び目的の物質を含む、第三及び第四の対照溶液も形成してもよい。
【００６８】
第一及び第二の検査溶液並びに第一及び第二の対照溶液のそれぞれの中に存在する、第一及び第二の抗体のそれぞれの結合特性が測定される。結合測定は、目的の物質が、ＡＰＰのｓＡＰＰβ領域と相互作用又は結合する程度及びＡβと相互作用又は結合する程度を示す。
【００６９】
目的の物質の結合特性を決定するために、ＡＰＰ又はバリアントは、リガンドの結合対の一つのリガンドによって、検出可能に標識され得る。適切な標識されたＡＰＰ又はバリアントは、ビオチン化されたＡＰＰ又はバリアントである。
【００７０】
ある種の実施形態において、ＡＰＰは、ＷＯ０２／０９４９８５号及びＵＳ ２００３／０２００５５５ Ａ１に開示されている新規β−セクレターゼＰ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’切断部位の何れかを含有する修飾されたβ−セクレターゼ基質であるＡＰＰバリアントである。
【００７１】
前記物質とＡＰＰ（又はバリアント）は、最大約２４時間、好ましくは約１時間、約３７℃でインキュベートしてもよい。その後、インキュベートされた混合物の溶液を、マルチウェルプレートの１ウェル中に入れてもよい。安定化剤、例えば、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０は、結合反応を中和するために、混合物に添加し得る。
【００７２】
一実施形態において、アッセイにおいて使用するためのビーズが調製される。例えば、第一のビーズ混合物は、（１）ストレプトアビジンを含む供与体ビーズ、（２）Ａβのアミノ酸２８ないし４０に対して誘導されたポリクローナル抗体を含有する受容体ビーズ（例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得られるプロテインＡ受容体ビーズ）、（３）ＢＳＡ及び（４）リン酸緩衝食塩水から形成され、並びに、第二のビーズ混合物は、（１）ストレプトアビジンを含む供与体ビーズ、（２）ＡＰＰのＮ末端２００アミノ酸に対して誘導されたモノクローナルマウス抗体を含有する受容体ビーズ（例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得られるプロテインＡ受容体ビーズ）、（３）ＢＳＡ及び（４）リン酸緩衝食塩水から形成される。
【００７３】
その後、第一のビーズ混合物を、目的の物質とＡＰＰ（又はバリアント）のインキュベートされた混合物と混ぜ合わせて、この混合物を一晩インキュベートする。第二のビーズ混合物を、目的の物質とＡＰＰ（又はバリアント）のインキュベートされた混合物と混ぜ合わせる。ビヒクル、ＡＰＰ又はＡＰＰバリアント、並びに、それぞれ上記第一及び第二の混合物由来の受容体ビーズを含む第三及び第四の混合物が形成される。次いで、ウェルプレートを読み取る。
【００７４】
ストレプトアビジンでコートされた供与体ビーズは、ＡＰＰ（又はバリアント）上に存在するビオチン部分と相互作用し、受容体ビーズは、ＡＰＰのＮ末端又はＡβドメインの何れかに結合する抗体との相互作用を通じて、ＡＰＰ（又はバリアント）に結合する。ＡＰＰの第１又は第二の抗体結合部位の何れとも相互作用しない物質は、ビヒクルと概ね同じシグナルを生じる。抗Ａβ又はＡＰＰ Ｎ末端抗体混合物が使用される場合、ＡＰＰはいずれのの抗体にも接近できず、シグナルがビヒクルに比べて減少するので、ＡＰＰと非特異的に相互作用する物質は溶液からはずれる。第一及び第二の抗体の一つの結合部位近傍でＡＰＰと特異的に相互作用する物質は、該物質の結合部位近傍の抗体に対して特異的に減少するが、さらに遠くの抗体に対しては減少しないシグナルを生じる。
【００７５】
第二の実施形態において、本発明は、Ａβ又はＡβバリアントペプチドのＮ末端及びＣ末端との物質の相互作用を検出及び評価するためのアッセイに関する。この物質の結合特性の測定は、この物質がＡβ又はＡβバリアントペプチドと相互作用する又はＡβ又はＡβバリアントペプチドに結合する程度を決定することが可能である。
【００７６】
この実施形態において、Ａβ（又はバリアント）は、アッセイ条件下で、緩衝液と、例えば、リン酸緩衝生理食塩水中のＢＳＡと混合される。結合緩衝液の対照混合液も形成される。その後、結合混合物の溶液を、マルチウェルプレートの１ウェル中に入れてもよい。次いで、結合反応物を、約１時間、約３７℃でインキュベートする。各反応の溶液は、第二のアッセイプレートに移され、該プレートにおいて、Ａβ（又はＡβバリアントペプチド）と抗体間の相互作用が評価される。
【００７７】
第一のビーズ混合物は、（１）ストレプトアビジンを含む供与体ビーズと、及び（２）ＡβのＣ末端に対して特異的である標識された抗体と、から形成され得る。第二のビーズ混合物は、（１）受容体ビーズ（例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得られるプロテインＡ受容体ビーズ）と、及び（２）Ａβのアミノ末端に対して特異的である抗体と、から形成され得る。
【００７８】
アミロイド結合反応物の添加前に、混合物を、室温で約１時間インキュベートする。
【００７９】
マルチウェルプレートの各ウェル中には、第一のビーズ混合物、第二のビーズ混合物及び緩衝液（例えば、ＰＢＳ中のＢＳＡ）が添加される。次いで、プレートを一晩インキュベートし、ＡβのＮ末端に結合する抗体を検出する（例えば、ＡＬＰＨＡＱＵＥＳＴによって）。Ａβと相互作用する物質の存在下で反応が実施されれば、シグナルの減少が示される。
【００８０】
上記アッセイは、ＢｉｏＳｉｇｎａｌ Ｐａｃｋａｒｄ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｒｉｄｅｎ， Ｃｏｎｅｅｃｔｉｃｕｔによって開発されたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ技術を使用してもよい。本発明の基礎原理（すなわち、ＡＰＰと物質の混合物を、ＡＰＰのｓＡＰＰ領域に対して特異的である第一の抗体と及びＡＰＰのＡβ領域に対して特異的である第二の抗体と接触させ、該物質の結合特性を決定する。）を使用することが可能である他の結合アッセイ技術が本分野に存在する。これらの他の結合アッセイには、リガンド結合アッセイ、例えば、比色及び分光光度アッセイ、例えば、生成された色又は蛍光、リン光の測定（例えば、ＥＬＩＳＡ、固相吸着アッセイ）及び波長の短い又は長い光放射が生じる他のラジオイムノアッセイ（紫外線及びγ線放射など）が含まれる。
【００８１】
第三の実施形態において、本発明は、本発明のアッセイから同定された式（Ｉ）の化合物に関する。式（Ｉ）の化合物は、ＡＰＰ又はＡβと特異的に相互作用し、セクレターゼとの又はＡβ結合抗体との、ＡＰＰの相互作用を遮断する。式（Ｉ）の化合物は、ＢＡＣＥ１及びＢＡＣＥ２によるＡＰＰプロセッシングを阻害し、ＢＡＣＥ２によるＡβプロセッシングを阻害し、γセクレターゼによるＣＴＦβ（ＣＴＦ９９及びＣＴＦ１００を含む。）プロセッシングを阻害する。式（Ｉ）の化合物は、ＡＰＰのＡβドメイン内でＡＰＰを結合することによる、ＢＡＣＥ及びγセクレターゼのプロセッシングを阻害する。
【００８２】
本発明の化合物は、Ａβ１−４２の産生を選択的に弱めるために、γセクレターゼの作用の調節物質としても作用することができ、Ａβのさらに短い鎖のイソフォーム（例えば、Ａβ４０）の優先的な分泌をもたらす。より短い鎖のイソフォームは、自己凝集及び斑形成の傾向が低下するため、脳から、より簡単に除去され、神経毒性も低いと考えられる。
【００８３】
式Ｉの化合物は、以下のスキームによって形成され得る。
【００８４】
【化６】
【００８５】
本発明に記載されている方法のための出発材料及び試薬は、市販されているか、若しくは文献公知であり、又は類似の化合物に対して記載されている文献の方法に従って調製し得る。反応及び得られた反応産物の精製を実行する際に必要とされる技術は、当業者に公知である。精製手順には、結晶、蒸留、純相又は逆相クロマトグラフィーが含まれる。
【００８６】
本発明は、さらに、本発明の式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることを含む、ヒト及び動物のアルツハイマー病を治療するための医薬又は組成物の製造のための方法に関する。本発明は、ＡＰＰ又はＡβと特異的に相互作用して、セクレターゼとの、又はＡＰＰ若しくはＡβ結合抗体とのＡＰＰ又はＡβの相互作用を遮断する化合物を含む医薬の製造方法にも関する。
【００８７】
本発明の別の実施形態は、以下の実施例１ないし４の表題化合物及びこれらの薬学的に許容される塩から選択される、式（Ｉ）の化合物である。
【００８８】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、アルツハイマー病の治療、改善、抑制又はアルツハイマー病のリスクの低減において有用である。例えば、この化合物は、アルツハイマー型の認知症の予防、及びアルツハイマー型の認知症の初期段階、中間段階又は後期段階の治療に有用であろう。この化合物は、ＡＰＰの異常な切断によって媒介される疾病及びＡＰＰのＢＡＣＥ切断の阻害及びＡβの凝集の阻害によって治療又は予防され得るその他の症状の治療、改善、抑制又はこれらのリスクの軽減においても有用であり得る。このような症状には、軽度の認知障害、トリソミー２１（ダウン症候群）、脳アミロイドアンギオパチー、変性認知症、ダッチ型のアミロイドーシスを有する遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）、クロイツフェルトヤコブ病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、頭部外傷、発作、ダウン症候群、膵炎、封入体筋炎、その他の末梢アミロイドーシス、糖尿病及びアテローム性硬化症が含まれる。
【００８９】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、ＡＤの検出又は診断用の陽電子放出断層画像化法（ＰＥＴ）リガンドとしても有用であり得る。
【００９０】
本発明の化合物は、ＰＥＴリガンドとして、ＰＥＴ画像化において使用するために、陽電子放出放射性核種で標識してもよい。画像化の場合、適切なＰＥＴ放射性核種には、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、８２Ｂｒ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、１５Ｏ、１３Ｎ、２１１Ａｔ及び７７Ｂｒが含まれる。最も一般的に使用されているＰＥＴ放射性核種は、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ及び１３Ｎである。本発明の放射性標識された化合物中に取り込まれる具体的な放射性核種は、所望される具体的な分析又は薬理学的適用に依存する。
【００９１】
本発明は、本発明の化合物と薬学的に許容される少なくとも１つの担体又は賦形剤とを含む放射性薬学的組成物にも関する。本発明は、ＡＰＰの又はＡβの標識を必要としている哺乳動物に、本発明の放射性標識された化合物の有効量を投与することを含む、哺乳動物中にＡＰＰ又はＡβを標識する方法にも関する。
【００９２】
本発明は、ＡＰＰの又はＡβの診断画像化を必要としている哺乳動物に、本発明の放射性標識された化合物の有効量を投与することを含む、哺乳動物におけるＡＰＰの又はＡβの診断的画像化のための方法にも関する。
【００９３】
本発明は、脳の診断画像化を必要としている哺乳動物に、本発明の放射性標識された化合物の有効量を投与することを含む、哺乳動物中の脳の診断的画像化のための方法にも関する。
【００９４】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。「薬学的に許容される塩」という用語は、無機又は有機塩基及び無機又は有機酸を含む薬学的に許容される無毒の塩基又は酸から調製される塩を表す。無機塩基由来の塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、亜マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが含まれる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム及びナトリウム塩である。固体形態の塩は、２以上の結晶構造で存在する場合があり、水和物の形態で存在する場合もあり得る。薬学的に許容される無毒の有機塩基には、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレン−ジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの、一級、二級及び三級アミン、天然に存在する置換されたアミンを含む置換されたアミン、環状アミンの塩、及び塩基性イオン交換樹脂が含まれる。本発明の式（Ｉ）の化合物が塩基性である場合には、これらの塩は、無機及び有機酸を含む、薬学的に許容される無毒の酸から調製してもよい。このような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが含まれる。特に好ましいのは、クエン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、フマル酸及び酒石酸である。
【００９５】
本明細書において使用される、単独での、又は別の置換基の一部としての「アルキル」という用語は、表記される炭素原子の数を有する飽和直鎖又は分枝鎖炭化水素基を意味する（例えば、Ｃ１−１０アルキルは、１から１０個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。）。本発明において使用するための好ましいアルキル基は、１から６個の炭素原子を有するＣ１−６アルキル基である。典型的なアルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。
【００９６】
本明細書において使用される、単独での、又は別の置換基の一部としての「アルコキシ」という用語は、Ｒが上記定義のアルキル基である、基−Ｏ−Ｒを意味する。本発明において使用するための好ましいアルコキシ基は、１から６個の炭素原子を有するＣ１−６アルコキシ基である。典型的なアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシなどが含まれる。
【００９７】
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語には、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードが含まれる。
【００９８】
本発明の式（Ｉ）の化合物が投与される対象又は患者は、一般に、ＡＰＰ又はＡβとの特異的相互作用が望まれる、男性又は女性であるヒトである。しかし、ＡＰＰ若しくはＡβとの特異的相互作用又はＡＰＰ結合抗体若しくはＡβ結合抗体との特異的相互作用が望まれる他の哺乳動物（イヌ、ネコ、ネズミ、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、サル、チンパンジー又は他の類人猿若しくは霊長類など）も包含し得る。
【００９９】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、本発明の式（Ｉ）の化合物が有用性を有する疾病又は症状の治療において、１又は複数の他の薬物と組み合わせて使用し得、この場合、薬物の組み合わせは、薬物単独より安全であるか、又はより効果的である。さらに、本発明の式（Ｉ）の化合物は、本発明の式（Ｉ）の化合物の副作用若しくは毒性を治療し、予防し、抑制し、改善し、又は副作用若しくは毒性のリスクを低減する１又は複数の他の薬物と組み合わせて使用してもよい。このような他の薬物は、だから一般的に使用される経路及び量で、本発明の式（Ｉ）の化合物と同時に又は逐次に投与してもよい。従って、本発明の薬学的組成物には、本発明の式（Ｉ）の化合物の他に、１又は複数の他の活性成分を含有する薬学的組成物も含まれる。前記組み合わせは、単位剤形組み合わせ産物の一部として、又はキットとして、又は一以上のさらなる薬物が治療計画の一部として別個の剤形で投与される治療プロトコールとして、投与し得る。
【０１００】
単位投薬又はキット形態の何れかでの、本発明の式（Ｉ）の化合物の他の薬物との組み合わせの例には、抗アルツハイマー病薬（例えば、他のβ−セクレターゼ阻害剤又はγ−セクレターゼ阻害剤）；ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤；イブプロフェンを含むＮＳＡＩＤ；ビタミンＥ；ヒト化されたモノクローナル抗体を含む抗アミロイド抗体；カテプシンＢ阻害剤；ＣＢ−１受容体アンタゴニスト若しくはＣＢ−１受容体インバースアゴニスト；ドキシサイクリン及びリファンピンなどの抗生物質；メマンチンなどのＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト；ガランタミン、リバスチグミン、ドネペジル、及びタクリンなどのコリンエステラーゼ阻害剤；イブタモレン、イブタモレンメシラート及びカプロモレリンなどの成長ホルモン分泌促進物質；ヒスタミンＨ３アンタゴニスト；ＡＭＰＡアゴニスト；ＰＤＥ ＩＶ阻害剤；ＧＡＢＡＡインバースアゴニスト；神経ニコチンアゴニスト；又は本発明の式（Ｉ）の化合物の有効性、安全性、利便性を増加させるか、又は本発明の式（Ｉ）の化合物の望ましくない副作用若しくは毒性を低減する受容体又は酵素に影響を与えるその他の薬物の、１又は複数との組み合わせが含まれる。組み合わせの先述したリストは、例示にすぎず、いかなる意味においても、限定を意図したものではない。
【０１０１】
本明細書において使用される「組成物」という用語は、指定された成分を、所定の量又は割合で含む産物、並びに指定された量の指定された成分の組み合わせから、直接又は間接的に得られる任意の産物を包含するものとする。薬学的組成物に関するこの用語は、１又は複数の活性成分と、及び不活性成分を含む必要に応じて使用される担体とを含む産物、並びに、成分の任意の２以上の組み合わせ、錯化若しくは凝集から、又は成分の１もしくは複数の解離から、又は成分の一もしくは複数の反応若しくは相互作用の別の種類から、直接又は間接的に得られる任意の産物を包含するものとする。一般に、薬学的組成物は、活性成分を、液体担体又は細かく分割された固体担体又は両方と、均一且つ密接に混合し、次いで、必要であれば、産物を所望の製剤へと成形することによって調製される。この薬学的組成物において、活性な対象化合物は、疾病の過程又は症状に対して所望の効果を引き起こすのに十分な量で含められる。従って、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物と薬学的に許容される担体とを混合することによって作製された組成物のどれでもを包含する。
【０１０２】
経口で使用することが意図された薬学的組成物は、薬学的組成物の製造の分野で公知のいずれかの方法に従って調製することができ、このような組成物は、薬学的に洗練された、口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、着香剤、着色剤及び防腐剤からなる群から選択される１又は複数の薬剤を含有することができる。錠剤は、錠剤の製造に適した薬学的に許容される無毒の賦形剤と混合して活性成分を含有し得る。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウなどの不活性な希釈剤；造粒剤及び崩壊剤、例えば、コーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン又はアカシア；並びに、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであってよい。錠剤は、コートしなくてもよく、又は、胃腸管での崩壊と吸収を遅延させることにより、長期間にわたって持続的な作用を提供するために、公知の技術によってコートしてもよい。
【０１０３】
経口用製剤は、活性成分が、不活性な固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合された硬ゼラチンカプセルとして、又は活性成分が水若しくは油媒体、例えばピーナッツ油、液体パラフィン若しくはオリーブ油と混合された軟ゼラチンカプセルとして与えてもよい。
【０１０４】
他の薬学的組成物には水性懸濁液が含まれ、水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合された活性物質を含有する。さらに、油性懸濁液は、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナッツ油、又は液体パラフィンなどの鉱物油中に活性成分を懸濁することによって調合し得る。油性懸濁液は、様々な賦形剤を含有し得る。本発明の薬学的組成物は、水中油エマルジョンの形態としてもよく、これは、甘味剤及び着香剤などの賦形剤も含有し得る。
【０１０５】
薬学的組成物は、注射可能な無菌水性又は油性懸濁液の形態としてもよく、注射可能な無菌水性又は油性懸濁液は、公知技術に従って調合し得、又は薬物の直腸投与のために坐剤の形態で投与し得る。
【０１０６】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、当業者に公知の吸入装置を用いた吸入によって、又は経皮パッチによって投与してよい。
【０１０７】
「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤又は賦形剤が、製剤の他の成分と適合性があり、および、その服用者に対して無害でなければならないことを意味する。
【０１０８】
化合物「の投与」又は「を投与する」という用語は、錠剤、カプセル、シロップ、懸濁液などの経口剤形；ＩＶ、ＩＭ又はＩＰなどの注射可能剤形；クリーム、ゼリー、粉末又はパッチなどの経皮剤形；口内剤形；吸入粉末、スプレー、懸濁液など；及び直腸坐剤を含む（これらに限定されない。）、治療的有用な形態及び治療的に有用な量で、個体の身体中に導入することが可能な形態で、治療の必要がある個体に、本発明の式（Ｉ）の化合物を与えることを意味するものと理解すべきである。
【０１０９】
「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師又はその他の臨床家によって求められている組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を惹起し得る本発明の化合物の量を意味する。本明細書において使用される「治療」という用語は、特に疾病又は疾患の症候を示している患者における、掲記されている症状の治療を表す。
【０１１０】
本明細書において使用される「治療」又は「治療する」という用語は、本発明の化合物のあらゆる投与を意味し、（１）疾病の病状又は症状を経験し、又は呈している動物中の疾病を阻害すること（すなわち、病状又は症状のさらなる進行を停止すること）、又は（２）疾病の病状又は症状を経験し、又は呈している動物中の疾病を改善すること（すなわち、病状及び／又は症状を回復させること）が含まれる。「抑制する」という用語には、抑制されている症状の重度を抑制し、治療し、根絶し、改善し又はその他軽減することが含まれる。
【０１１１】
本発明の式（Ｉ）の化合物を含有する組成物は、単位剤形で便利に与え得、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製し得る。「単位剤形」という用語は、患者又は患者に薬物を投与する者が、その中に含有されている全量を有する単一の容器又は包装を開封することが可能なように、および２以上の容器又は包装からの成分を一緒に混合する必要がないように、全ての活性及び不活性成分が適切な系中に混ぜ合わされている単一用量を意味するものとする。単一剤形の典型的な例は、経口投与用の錠剤若しくはカプセル、注射用の単一用量容器又は直腸投与用の坐剤である。単位剤形のこのリストは、いかなる意味においても限定を意図するものではなく、単位剤形の典型的な例を表したものにすぎない。
【０１１２】
本発明の式（Ｉ）の化合物を含有する組成物はキットとして便利に提供し得、このキットによって、活性又は不活性成分、担体、希釈剤などであり得る１つ又はそれ以上の構成成分が、患者又は患者に薬物を投与する者が実際の剤形を調製するための指示書と共に、提供される。このようなキットは、その中に含有される全ての必要な物質及び成分と共に提供し得、又はこのキットは、患者又は患者に薬物を投与する者が独立に取得しなければならない物質及び成分を使用又は製造するための指示書を含有し得る。
【０１１３】
アルツハイマー病の、又は本発明の式（Ｉ）の化合物が適応症となる他の疾病を治療し、改善し、抑制し、又はそのリスクを軽減する場合、本発明の式（Ｉ）の化合物が、好ましくは、単回１日用量として、又は１日に２ないし６回の分割用量で、又は徐放形態で、約０．１から約１００ｍｇ／ｋｇ動物体重の１日投薬量で投与されるとき、一般に、満足すべき結果が得られる。総１日用量は、ｋｇ体重当たり約１．０ｍｇから約２０００ｍｇまで、好ましくはｋｇ体重当たり約０．１ｍｇから約２０ｍｇまでである。７０ｋｇの成人の場合、総１日用量は、一般に、約７ｍｇから約１，４００ｍｇまでである。この投薬計画は、最適な治療的応答を与えるために調整し得る。本発明の式（Ｉ）の化合物は、１から４回／日、好ましくは１又は２回／日の投与計画で投与してよい。
【０１１４】
本発明の式（Ｉ）の化合物又は該化合物の薬学的に許容される塩の、投与のための具体的な投与量は、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、３０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇ及び５００ｍｇを含む。本発明の薬学的組成物は、約０．５ｍｇから約１０００ｍｇまでの活性成分を含む、より好ましくは約０．５ｍｇから約５００ｍｇまでの活性成分又は０．５ｍｇから２５０ｍｇまでの活性成分又は１ｍｇから１００ｍｇまでの活性成分を含む製剤形態として提供し得る。治療に有用な具体的な薬学的組成物は、活性成分約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、３０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇ及び５００ｍｇを含み得る。
【０１１５】
しかしながら、具体的な患者に対する具体的な投薬レベル及び投薬の頻度は変動する場合があり、使用される具体的な化合物の活性、化合物の代謝的安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与の様式及び時間、排泄の速度、薬物の組み合わせ、症状の重さ、並びに治療を受けている宿主など、様々な要因に依存し得ることが理解されるであろう。
【０１１６】
以下の実施例は、さらなる説明のためにのみ記載されており、開示されている発明に対する限定を意図するものではない。
【実施例１】
【０１１７】
｛［６−（３−フェノキシプロピル）−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−イル］オキシ｝酢酸
【０１１８】
【化７】
【０１１９】
段階Ａ −７８℃のＴＨＦ（２Ｌ）中の５−メトキシベンゾフラン（１４８ｇ、１モル）の溶液に、ヘキサン（４２０ｍＬ、１．０５モル）中の２．５Ｍのｎ−ブチルリチウムを滴加した。この混合物を、−７８℃で１．５時間撹拌し、ついで、１５分にわたってフェニルアセトアルデヒド（１４４ｇ、１．２モル）を添加した。冷却槽を取り除き、混合物を、０℃まで、徐々に上昇させた。水（６００ｍＬ）を添加した。エーテル層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮した。ヘキサン中の５％、１０％、２０％及び３０％酢酸エチルの漸増極性の溶媒混合物を用いて、粗生成物をシリカゲル（２ｋｇ）中のクロマトグラフィーにかけて、２−（１−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）−５−メトキシベンゾフラン、融点６９−７０℃を得る。
【０１２０】
段階Ｂ ５℃及び窒素雰囲気下のトルエン（２．５Ｌ）中の塩化アルミニウム（２０４ｇ；１．５モル）の混合物に、５０グラムずつ、ｔ−ブチルアミンボラン（２００グラム；２．３モル）を添加した。３０分間撹拌した後、トルエン（６００ｍＬ）中の化合物１−Ａ（２３８ｇ、８８０ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。混合物を、５℃で２時間撹拌した後、１０％の塩酸（３Ｌ）の撹拌氷冷混合物に、少しずつ添加した。発泡が停止するまで、撹拌を継続した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮した。１５％酢酸エチルを溶出液として用いて、残留物をシリカゲル（２ｋｇ）中のクロマトグラフィーにかけて、２−（２−フェニルエチル）−５−メトキシベンゾフランを得た。
【０１２１】
段階Ｃ ５℃のトリエチルシラン（４６５ｍＬ；２．８モル）中の、段階１−Ｂから得られた２−（２−フェニルエチル）−５−メトキシベンゾフラン（１２８グラム；５００ｍｍｏｌ）の懸濁液に、１５分にわたって、トリフルオロ酢酸（２３２ｍＬ；３０モル）を添加した。混合物を、この温度で１時間撹拌し、室温で１８時間撹拌した。混合物を濃縮し、エーテル中に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残留物をクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）にかけて、２−（２−フェニルエチル）−５−メトキシ−２，３−メトキシベンゾフランを得た。
【０１２２】
段階Ｄ 窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（７００ｍＬ）中の水素化リチウム（８ｇ；１．０ｍｏｌ）に、エタンチオール（６２ｇ、１モル）を滴加した。次いで、ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の２−（２−フェニルエチル）−５−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾフラン（１２６ｇ、５００ｍｍｏｌ）を一度に添加し、混合物を３時間還流した。１Ｎ塩酸中に混合物を注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。エーテル層を分離し、水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮して、５−ヒドロキシ−２−（２−フェニル−エチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン、融点５６−５８℃、１２３ｇ（９８％）を得た。
【０１２３】
段階Ｅ ５−ヒドロキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン（５．０ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（５．５ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、臭化アリル（４．８ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）及びアセトン（５０ｍＬ）の混合物を、１８時間還流した。この混合物を冷却し、ヘキサン（２５ｍＬ）で希釈し、Ｃｅｌｉｔｅを通してろ過した。真空中でろ液を濃縮し、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用して、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、５−アリルオキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフランを得る。
【０１２４】
段階Ｆ １，２−ジクロロベンゼン（１０ｍＬ）中の５−アリルオキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン（４．７ｇ、１６．７ｍｍｏｌ））の混合物を一晩撹拌した。混合物を濃縮し、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用して、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、純粋な異性体混合物４．１ｇ（８７％）を得て、クロマトグラフィー（５０％ヘキサン／ＤＣＭ）によって該異性体混合物をさらに分離して、６−アリル−５−ヒドロキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン、融点７９−８０℃を得た。
【０１２５】
段階Ｇ ６−アリル−５−ヒドロキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン（２．８ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．３８ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（１．７ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）及びアセトン（５０ｍＬ）の混合物を、１８時間還流した。この混合物を冷却し、エーテル（２５ｍＬ）で希釈し、Ｃｅｌｉｔｅを通してろ過した。溶媒の蒸発によって、所望のベンジルエーテル１−Ｇが残った。
【０１２６】
段階Ｈ ０℃のＴＨＦ中の、段階１−Ｇから得たオレフィン（２．０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（１４ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）中の１Ｍボランを添加し、反応混合物を２時間撹拌した。トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（２．１５ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）で反応混合物を処理し、その全体を８時間環流した。真空中で反応物を濃縮し、３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶出液として使用して、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、所望の化合物を得た。
【０１２７】
段階Ｉ ＤＣＭ２０ｍＬ中のアルコール１−Ｈ（９００ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（１．１ｇ、４．２ｍｍｏｌ）及び四臭化炭素（１．４ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、室温で１５分間撹拌し、次いで、ヘキサン、次いで、５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶出液として使用するクロマトグラフィーにかけて、表題の化合物を得た。
【０１２８】
段階Ｊ ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の９５％水素化ナトリウム（３６５ｍｇ；１４．５ｍｍｏｌ）に、フェノール（１．４ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）を添加した。３０分間撹拌した後、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の臭化物１−Ｉ（８７０ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を、室温で３時間撹拌した。過剰な１Ｎ ＨＣｌ中に混合物を注ぎ、エーテルで抽出した。１Ｎ 水酸化ナトリウムでエーテル層を２回洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮した。残留物を、ヘキサン中の５％酢酸エチルを使用するシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、５−ベンジルオキシ−２−（２−フェニルエチル）−６−（３−フェノキシプロピル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン６３０ｍｇ（８２％）を油として得た。Ｈ ＮＭＲ δ１．８６−２．２５（ｍ，４Ｈ），１．１５−２．９５（ｍ，５Ｈ），３．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），３．９６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．６−４．８３（ｍ，１Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｓ，１Ｈ），６．８０−７．０（ｍ，２Ｈ），７．１−７．５（ｍ，１３Ｈ）。
【０１２９】
段階Ｋ −７８℃のジクロロメタン（３０ｍＬ）中の、段階１−Ｊから得られたベンジルエーテルの溶液に、三臭化ホウ素溶液（１Ｍ ＤＣＭ：１．９ｍＬ；１．８８ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を１０分間撹拌し、次いで、メタノール（０．５ｍＬ）を滴加した。混合物を室温とし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加した。有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮した。残留物を、２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけて、５−ヒドロキシ−２−（２−フェニルエチル）−６−（３−フェノキシプロピル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン、融点６５−７０℃を得た。１Ｈ ＮＭＲ δ １．８６−２．２４（ｍ，４Ｈ），２．６８−２．９５（ｍ，５Ｈ），３．２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５Ｈｚ，Ｊ＝７．４），４．０（ｔ，２ＨＥ，Ｊ＝５．５）４．６７−４．８３（ｍ，１Ｈ），５．２１（ｓ，１Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），６．６７（ｓ，１Ｈ），６．８８−７．０４（ｍ，３Ｈ），７．１３−７．３９（ｍ，７Ｈ）。
【０１３０】
段階Ｌ ＤＭＦ（１２ｍＬ）中の、段階１−Ｋから得たフェノール（１５１ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）と炭酸セシウム（１２０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．０５ｍＬ、０．３７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１８時間、室温で撹拌した。エーテルと飽和炭酸水素ナトリウムの間に反応混合物を分配し、分離した。有機相を、水で７回洗浄し、乾燥させ、濃縮した。得られた固体は、さらなる精製をせずに、次の反応で直接使用した。
【０１３１】
段階Ｍ ＤＣＭ（２ｍＬ）中の、段階１−Ｌから得た化合物（１９５ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ２ｍＬを添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒の蒸発及び逆相クロマトグラフィーによって、所望の化合物が得られた。１Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，２５０ＭＨｚ）１．８９−２．２３（ｍ，４Ｈ），２．７１−３．３０（ｍ，６Ｈ），４．０２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）４．５８（ｓ，２Ｈ），４．７６（ｍ，１Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），６．６６（ｓ，１Ｈ），６．９１−６．９８（ｍ，３Ｈ），７．１８−７．３３（ｍ，８Ｈ）。
【実施例２】
【０１３２】
｛［６−［３−（２クロロフェノキシ）プロピル］−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−イル］オキシ｝酢酸
【０１３３】
【化８】
【０１３４】
該化合物は、化合物１と同様の様式で調製したが、段階１−Ｊで、フェノールを２−クロロフェノールに代えた。
【０１３５】
１Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）１．８９−２．２３（ｍ，４Ｈ），２．７１−３．３０（ｍ，６Ｈ），４．０２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）４．５８（ｓ，２Ｈ），４．７６（ｍ，１Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），６．８８−６．９８（ｍ，３Ｈ），７．２−７．４（ｍ，７Ｈ）。
【実施例３】
【０１３６】
２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−イル］オキシ｝酢酸
【０１３７】
【化９】
【０１３８】
段階Ａ ＴＨＦ３ｍＬ中に、５−ヒドロキシ−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン１２０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）（実施例１−Ｄ）及びブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル０．０８８ｍＬ（０．６ｍｍｏｌ）を含有する溶液に、ＮａＨ粉末１５ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を５時間撹拌した後、水で反応を停止し、エーテルで抽出した。カラムクロマトグラフィー（３０％ ＥＯＡｃ／ヘキサン）によって、油として、所望のエステルを得た。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＝３７７．１１）。
【０１３９】
段階Ｂ 段階３−Ｂから得られたエステル（７１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＣＭ２ｍＬ中に溶解し、ＴＦＡ２ｍＬで処理した。反応混合物を３時間撹拌した後、濃縮し、逆相クロマトグラフィーによって精製した。 １Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）１．８５−１．９１（ｍ，１Ｈ），２．０５−２．２（ｍ，１Ｈ），２．７１−２．９１（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｄｄ，１Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ），４．７７（ｍ，１Ｈ），６．６５（ｓ，２Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），７．２−７−４（ｍ，６Ｈ）。
【実施例４】
【０１４０】
６−｛３−［２−クロロ−４−（１Ｈ−テトラゾル−５−イル）フェノキシ］プロピル｝−２−（２−フェニルエチル）−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−オール
【０１４１】
【化１０】
【０１４２】
この化合物は、「Ｌａｕ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，（１９９２），３５（７），１２９９−３１８」の方法に従って合成した。
【０１４３】
実施例１ないし４は、完全長ＡＰＰのＢＡＣＥ切断を阻害することが見出された。しかしながら、これらの化合物は、短いペプチド基質を用いたアッセイでは、ＢＡＣＥと相互作用しなかった。
【０１４４】
これらの化合物は、ＢＡＣＥ酵素ではなく、ＡＰＰ基質と阻害し得るか、又は、これらの化合物、完全長ＡＰＰに非特異的に結合して、ＡＰＰタンパク質を不溶性とし、ＢＡＣＥに対して接近不能にし得るという仮説を立てた。
【０１４５】
実施例１ないし４の阻害の様式を決定するために、以下のアッセイを開発した。
【実施例５】
【０１４６】
ビオチン化されたＡＰＰバリアント（４００ｎＭ）を、アッセイ条件（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５；１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１８３６１５３）；１００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、０．２％ＣＨＡＰＳ）下で、実施例１ないし３と混合した。ＤＭＳＯ（化合物希釈剤）を含むビヒクルとのインキュベーション、及びＡＰＰバリアントを欠くインキュベーションを、各実験に対する対照として行った。各混合物を、３７度で１時間インキュベートした。
【０１４７】
その後、各インキュベーション混合物７０μＬを、９６ウェルプレートのそれ自身のウェル中に入れた。全ての結合反応を中和するために、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０ ５μＬを各ウェルに添加した。
【０１４８】
実施例５Ａでは、
（１）２０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン供与体ビーズ；
（２）ＡβのＣ末端領域に対して誘導されたウサギポリクローナル抗体１５０ｎｇ／ｍＬを含有する２０μｇ／ｍＬのプロテインＡ受容体ビーズ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ（プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１０，０００ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ６７６０６１７Ｍ）から入手）、及び
（３）０．１％ウシ血清アルブミン
からＡＬＰＨＡビーズの混合物を調製した。
【０１４９】
ビーズを、リン酸緩衝食塩水中で混合した。
【０１５０】
実施例５Ｂでは、
（１）２０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン供与体ビーズ；
（２）ＡＰＰのＮ末端領域に対して誘導されたモノクローナル抗体ＬＮ２７ １６０ｎｇ／ｍＬを含有する、２０μｇ／ｍＬのプロテインＡ受容体ビーズ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ（プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１０，０００ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ６７６０６１７Ｍ）から入手）、２０μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ受容体ビーズ；及び
（３）０．１％ウシ血清アルブミン
からＡＬＰＨＡビーズの混合物を調製し、リン酸緩衝食塩水中で混合した。
【０１５１】
５Ａ及び５Ｂでは、ＡＬＰＨＡビーズ混合物４６μＬを、インキュベーション混合物の各々４μＬと混合した。暗所、室温で、ビーズを一晩インキュベートした。
【０１５２】
翌日、抗体の結合の程度を測定するために、ＡＬＰＨＡＱＵＥＳＴを用いて、プレートを読み取った。
【０１５３】
５Ａ及び５Ｂの抗体の結合部位の何れにおいても、ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントと相互作用しない化合物は、ほぼビヒクルと同じである測定可能なシグナルを生じるであろう。ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントと非特異的に相互作用する化合物は、ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントを溶液から沈殿させるであろう。その結果、タンパク質は、全ての抗体に接近することができなくなるはずであり、測定可能なシグナルは、ビヒクルと比較して減少するはずである。抗体の一つの結合部位の付近でＡＰＰ又はＡＰＰバリアントと相互作用する化合物は、化合物結合部位の近くで、抗体に対するシグナルの減少を示すであろう。しかしながら、シグナルは、非近接部位では、抗体に対して減少しないはずである。
【０１５４】
実施例５Ａ及び５Ｂの結果は、実施例１及び２の化合物が、Ｃ末端結合部位の近傍で、そのＡβドメイン内においてＡＰＰバリアントと相互作用した。実施例３の化合物は、何れの抗体結合部位の近くでも、ＡＰＰバリアントと殆ど又は全く相互作用しなかった。
【実施例６】
【０１５５】
ＡβドメインのＣ末端領域の近くでＡＰＰバリアントを結合する化合物も、該化合物がＡＰＰのγ−セクレターゼ切断を阻害するかどうかを決定するために評価を行った。従って、実施例１ないし４の、完全長ＣＴＦβ基質の両方のγ−セクレターゼ切断を阻害する能力について「Ｌｉ， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９７：６１３８−６１４３」に記載されているようにして調べた。このアッセイは、以下のようにして行った。
【０１５６】
ＣＴＦβ切断の阻害
切断反応：
１０μＬ １０×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１８３６１５３）
２５μＬ ４×緩衝液（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＣａＣｌ２）
２μＬ １０％ＣＨＡＰＳＯ
５μＬ γ−セクレターゼ活性に対して特徴が明らかにされたＨｅＬａ細胞膜抽出物
７μＬ ２５μＭ細菌によって発現されたＣＴＦβ
５１μＬ 水
１μＬ ＤＭＳＯ中の化合物。
【０１５７】
反応物を、３７℃で１５０分間インキュベートし、５×ＲＩＰＡ緩衝液２５μＬ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ＮＰ−４０、２．５％ＤＯＣ、０．５％ ＳＤＳ、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）によって反応停止した。
【０１５８】
検出：
ＡβのＮ末端領域に対して特異的である４μｇ／ｍＬのビオチン化された抗体６Ｅ−１０の２５μＬ及びＡβ４０のＣ末端に対して特異的である１．５μｇ／ｍＬのルチニル化された抗体Ｇ２−１０の２５μＬとともに、反応物５０μＬをインキュベートすることによって、ＣＴＦβ基質のγ−セクレターゼ切断を評価した。Ｃ末端領域は、Ａβのγセクレターゼ切断後にのみ存在する。抗体を、室温で一晩インキュベート結合させた。翌日、８０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンコートされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ−２８０）２５μＬを、各反応に添加して、３０分間結合させ、ＩＧＥＮアッセイ緩衝液２７５μＬで反応停止させた。Ｏｒｉｇｅｎ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、γ−セクレターゼ切断産物の定量を行った。
【０１５９】
結果：
ＣＴＦβのγ−セクレターゼ切断の阻害について、実施例１ないし４をアッセイした。
【０１６０】
【表１】
【０１６１】
上述のように、実施例１−３のそれぞれが、γセクレターゼによるＣＴＦβの切断を阻害する。
【実施例７】
【０１６２】
セクレターゼ又はＡＰＰ（又はＡＰＰバリアント）のＡβドメインに結合する抗体と相互作用する化合物も、Ａβ又は関連するアミロイド産生ペプチドと相互作用すると予測することができる。ベンゾフランとアミロイドペプチド間の相互作用を評価するために、ＷＯ０２／０９４９８５及びＵＳ２００３／０２００５５５Ａ１に記載されているような、Ａβ１−４０と類似しているが、Ｎ末端の２個のアミノ酸がＧｌｕ及びＶａｌによって置換されたＡβバリアントペプチド（以下、「ＥＶ−アミロイド」と称する。）を使用した。実施例５の完全長ＡＰＰバリアントと同様に、生じ得る相互作用をアッセイするために、抗体結合部位のマスキングを使用した。アッセイは、以下のように行った。
【０１６３】
１．結合緩衝液中のＥＶ−アミロイドペプチドの主混合液は、以下のようにして作製した。リン酸緩衝食塩水中の０．１％ウシ血清アルブミン１０６５０μＬ、１０×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１８３６１５３）１２００μＬ、ＥＶアミロイドペプチド（ＤＭＳＯ中４μＭ）３０μＬ。
【０１６４】
２．結合緩衝液の陰性対照混合液は、リン酸緩衝食塩水中の０．１％ウシ血清アルブミン、１０×プロテアーゼ阻害剤カクテル及びＤＭＳＯを、同じ比で混ぜ合わせることによって調製した。
【０１６５】
３．主混合液及び陰性対照混合液９９μＬを、９６ウェルプレート中の各ウェルに分配した。
【０１６６】
４．ＤＭＳＯ中の実施例１ないし４又はＤＭＳＯのみ（ビヒクル）１μＬを各ウェルに添加した。
【０１６７】
５．次いで、結合反応物を、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１６８】
６．各反応物２０μＬを、第二のアッセイプレートに移した。ＡＬＰＨＡ検出を用いた抗体サンドイッチアッセイによるＥＶアミロイドペプチドの定量によって、ＥＶアミロイドと抗体の間の相互作用を評価した。
【０１６９】
７．ＥＶ−アミロイド検出の場合、以下の２つの溶液を調製した。
溶液１：ストレプトアビジン供与体ビーズ（５ｍｇ／ｍＬ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ（プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより；１０，０００ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６７６０６１７Ｍ））、ビオチン化された抗体Ｇ２−１０ ２．３μＬ（ＡβのＣ末端領域に対して特異的である。）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５ １１７３．７μＬ。
溶液２：プロテインＡ受容体ビーズ（５ｍｇ／ｍＬ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ（プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより；１０，０００ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６７６０６１７Ｍ））、ＥＶアミロイドのアミノ末端でＮＨ２−ＥＶＥＦＲと特異的に相互作用する抗体１０．４μＬ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５ １１６５．６μＬ。
ＥＶ−アミロイド結合反応への添加前に、溶液を、室温で１時間インキュベートした。
【０１７０】
８．ＥＶアミロイド結合反応を含有する９６ウェルプレート中の各ウェルに、溶液１ １０μＬ、溶液２ １０μＬ及びＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ１０μＬを添加した。
【０１７１】
９．プレートを、暗所、室温で一晩インキュベートし、ＡＬＰＨＡ Ｑｕｅｓｔを用いてＥＶ−アミロイドへの抗体結合を検出した。
【０１７２】
Ａβへの抗体結合を用いて、ＥＶ−アミロイドへの抗体結合の抑制を観察した。実施例１及び２（何れもＡＰＰのＢＡＣＥプロセッシング及びＣＴＦβのγ−セクレターゼプロセッシングの両者を阻害し、何れもＡＰＰへの抗体結合を遮断する。）は、ＥＶアミロイドへの抗体結合の約４０％を阻害する。ＡＰＰのＢＡＣＥプロセッシングも遮断せず、ＡＰＰとの抗体相互作用も遮断しなかった実施例３は、ＥＶ−アミロイドとの抗体相互作用に対して全く効果を有していなかった。
【実施例８】
【０１７３】
ＢＡＣＥ２酵素は、Ａβドメイン内の幾つかの異なる位置で、ＡＰＰを切断する。ＡＰＰのＡβドメイン内の異なる切断部位でのＢＡＣＥ２切断の異なる阻害は、阻害が、酵素切断ではなく、化合物の基質との相互作用によるものであることを示すのに役立つであろう。
【０１７４】
ＡＰＰのＢＡＣＥ２切断の阻害
β−セクレターゼ切断部位での、ＡＰＰの切断に対する実施例１−４の効果は、以下のようにしてアッセイした。
【０１７５】
切断反応：
２５μＬ ０．２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５
１０μＬ １０×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１８３６１５３）、
１０μＬ ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍＬ溶液）
４μＬ ５％ＣＨＡＰＳ
１μＬ ＥＤＴＡ（１５０ｍＭ、ｐＨ４．５）
２μＬ ＤＦ２μＬ
４μＬ ＮＦＥＶ ＢＡＣＥ切断部位を含有する、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）−ビオチン化ＡＰＰ融合タンパク質（細菌によって発現される、１０μＭ溶液）
１μＬ ＤＭＳＯ又はＤＭＳＯ中に溶解された化合物
２μＬ ＢＡＣＥ２（ＣＨＯ細胞によって発現されたタンパク質、２５０ｎＭ）
４１μＬ 蒸留水
反応物を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０ ４μＬで反応を停止した。
【０１７６】
ＡＬＰＨＡを用いたＭＢＰビオチンＡＰＰ（ＮＦ）切断産物の検出
ＡＬＰＨＡアッセイ混合液は、以下のようにして調製した。
【０１７７】
２０μＬ ストレプトアビジン供与体ビーズ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ（プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより）；１０，０００ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６７６０６１７Ｍ）
２０μＬ プロテインＡ受容体ビーズ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＩｇＧ （プロテインＡ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより）；１０，０００ ｐｔｓ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６７６０６１７Ｍ）
３．７μＬ アフィニティー精製された抗ＮＦ抗体（２０３μｇ／ｍＬ）（ＷＯ ０２／０９４９８５に記載されている）
４．５ｍＬ ＰＢＳ中の０．１％ ＢＳＡ
反応停止された反応混合物４μＬを、アッセイ混合液４６μＬと混ぜ合わせた。反応物を、室温で一晩インキュベートし、ＡＬＰＨＡＱｕｅｓｔプレートリーダーを用いて読み取った。
【０１７８】
結果：
【０１７９】
【表２】
【０１８０】
実施例３は、ＢＡＣＥ１に対して不活性であり、ＢＡＣＥ２に対して若干活性であった。実施例１、２及び４は、同一部位でのＢＡＣＥ１切断の阻害と同様の有効性で、β−セクレターゼ位置におけるＡＰＰのＢＡＣＥ２切断を阻害することが可能であった。
【実施例９】
【０１８１】
「Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ， ２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：２１２８６−２１２９４」に記載されているプロトコールを用いて、ＥＶアミロイドのＢＡＣＥ２切断の阻害の効果をアッセイした。１００μＭの実施例１ないし４をアッセイする結果を以下に示す。
【０１８２】
【表３】
【０１８３】
調べた４つの化合物全てが、３４位でのＢＡＣＥ２切断を破壊した。
シグナルが極めて弱かったために、実施例１、２及び３では、１９及び２０位での切断に対する効果は、決定することができなかった。しかしながら、実施例２は、１９及び２０位での切断を大幅に増加させ、ＡＰＰのＢＡＣＥ２切断に対する位置依存的効果を示している。
【０１８４】
図１は、実施例４及び実施例１の化合物の１００μＭの存在下及び不存在下で、ＡβのＢＡＣＥ２切断の質量分析を示している。実施例４は、１９及び２０位でのＡβの切断を増強したが、３４位での切断を遮断した一方、実施例４は、全てのＡβ部位での切断を抑制した。このデータは、本発明の化合物が、セクレターゼ切断の調節物質として作用し得ることを示している。
【実施例１０】
【０１８５】
ウェスタンブロット分析を実施するために、増強されたＢＡＣＥ切断配列を含有する、細菌によって発現されたＡＰＰバリアントを、実施例２及びＢＡＣＥ１タンパク質とともに３７℃で１時間インキュベートした。反応物をゲル上に走行させて、ブロッティングした。ＢＡＣＥ切断後に生じるＮ末端産物を特異的に認識する抗体を使用して、ＢＡＣＥ特異的切断産物を検出した。図２（Ａ）は、ウェスタンブロットを図示している。図２（Ｂ）は、ウェスタンブロットの濃度測定定量であり、ＡＰＰのＢＡＣＥ切断が１１μＭのＩＣ５０で阻害されることを示している。
【実施例１１】
【０１８６】
図３は、スタチン−Ｖａｌ及び実施例４による、完全長ＡＰＰ及びβ部位Ｐ５／Ｐ５’ペプチド及びＡＰＰ断片のＢＡＣＥ１切断の阻害を示している。図３（Ａ）は、ＡＰＰ及びＡＰＰ断片のＢＡＣＥ切断（β部位Ｐ５／Ｐ５’ペプチド断片を含む。）の公知の阻害剤であるスタチン−Ｖａｌによる阻害を図示している。図２（Ｂ）は、実施例４による阻害を図示している。これらのグラフは、完全長ＡＰＰ基質（白丸）又はβ部位Ｐ５／Ｐ５’断片（白四角）の切断の阻害を図示している。酵素活性は、ＤＭＳＯ処理されたＢＡＣＥ切断と比較して示されている。スタチン−Ｖａｌは、ＡＰＰ及びペプチドをベースとする両基質の切断の阻害を示すのに対して、実施例４はＡＰＰのみの切断を阻害する。
【実施例１２】
【０１８７】
実施例１の化合物を、ＣＴＦ９９を発現しているＨ４神経膠腫細胞中に滴定した。実施例１の化合物で、該細胞を２０時間処理し、馴化培地を採集した。ＥＣＬを用いて、分泌されたアミロイドｘ−４２及びｘ−４０のレベルをアッセイし（Ｌｉ ｅｔ ａｌ， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６１３８−６１４３）、Ａβ４２及びＡβ４０の産生を測定し、図４に示されているように、グラフにした。結果は、本発明の化合物が、Ａβペプチドの産生を調節して、Ａβ４０の産生との比較においてＡβ４２の産生を減少させることを示している。
【実施例１３】
【０１８８】
式（Ｉ）の化合物は、ＡＰＰを結合することによってＡＰＰ切断機能を阻害すると考えられている。ＢｉａｃｏｒｅＳ５１によって、ＡＰＰへの実施例１の化合物の結合をアッセイした。ビオチン化されたＡＰＰ及びビオチン化されたｓＡＰＰｂを、ＳＡコートされたセンサーチップに固定した。実施例１の滴定を注射し、両タンパク質について、実施例１の各濃度に対する結合応答を得た。図５は、ＡＰＰに結合する、化合物２（白丸）又はＢＡＣＥ１阻害剤であるスタチン−Ｖａｌ（白四角）に対する反応単位のグラフである。
【０１８９】
実施例１の化合物はＡＰＰに結合するが、ｓＡＰＰβに結合しないこと、ＢＡＣＥ阻害剤、スタチン−ＶａｌはＡＰＰ及びｓＡＰＰβの何れにも結合しないことを、これらデータは示している。幾つかの異なる酵素によるＡＰＰプロセッシングが実施例１の化合物によって阻害されることを考え合わせると、実施例１の化合物のＡＰＰ結合能は、ＡＰＰプロセシングの阻害が、化合物と酵素との間の相互作用ではなく、むしろ、化合物とＡＰＰとの間の相互作用によって引き起こされ得ることを示している。
【０１９０】
本文書を通じて、以下の略号が使用される。
Ｍｅ：メチル
Ｅｔ：エチル
Ｂｕ：ブチル
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
Ａｒ：アリール
Ｂｎ：ベンジル
ＴＨｆ：テトラヒドロフラン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＰＰ：トリフェニルリン酸
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳＯ：３−［（クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート
ＣＨＡＰＳ：３−［（クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＲＩＰＡ：放射性免疫沈降アッセイ
ＰＩＰＥＳ：ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（エタンスルホン酸）
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
【０１９１】
本発明のある種の具体的な実施形態を参照しながら、本発明を記述及び例示してきたが、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、手順及びプロトコールの様々な改変、変化、変更、置換、欠失又は付加を為し得ることが当業者には自明であろう。例えば、上述されている本発明の方法から化合物を調製するための試薬又は方法の改変の結果として、本明細書に上記されている具体的な条件以外の反応条件を適用してもよい。同様に、出発材料の具体的な反応性は、存在する具体的な置換基又は製造の条件に従って、及びこれらに応じて変動する場合があり得、本発明の目的及び実施に従って、このような予測される結果の変動又は相違が想定される。従って、本発明は、以下に記載されている特許請求の範囲によって定義され、このような特許請求の範囲は、合理的な限り、できるだけ広く解釈されるべきものとする。
【０１９２】
さらに、全ての値はおよその値であり、記述のために与えられていることを理解しなければならない。特許、特許出願、刊行物、製品の説明及びプロトコールが本願を通じて引用されているが、これらの開示内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために、本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１Ａ】実施例１及び４の化合物によって影響を受けたＢＡＣＥ２によるＡβ切断の質量分析を図示している。
【図１Ｂ】実施例１及び４の化合物によって影響を受けたＢＡＣＥ２によるＡβ切断の質量分析を図示している。
【図２Ａ】図２（Ａ）及び２（Ｂ）は、実施例２の化合物による、ＡＰＰのＢＡＣＥ１切断の阻害のウェスタンブロット分析を図示している。
【図２Ｂ】図２（Ａ）及び２（Ｂ）は、実施例２の化合物による、ＡＰＰのＢＡＣＥ１切断の阻害のウェスタンブロット分析を図示している。
【図３Ａ】スタチン−Ｖａｌ及び実施例４の化合物による完全長ＡＰＰ又はＡＰＰ断片のＢＡＣＥ１切断の阻害を図示している。
【図３Ｂ】スタチン−Ｖａｌ及び実施例４の化合物による完全長ＡＰＰ又はＡＰＰ断片のＢＡＣＥ１切断の阻害を図示している。
【図４】図４は、Ｈ４−Ｃ９９細胞中のＡβ４０及び４２レベルの減少を図示している。
【図５】図５は、実施例１の化合物によるＡＰＰの結合のグラフを図示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はアミロイドβペプチド（Ａβ）への物質の相互作用を測定する方法であり、前記方法は、
（ａ）第一の検査溶液（第一の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント、（ｉｉ）物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのｓＡＰＰβ領域に対して特異的である第一の抗体を含む。）をｓＡＰＰβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、ｓＡＰＰβ−抗体複合体の第一の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｂ）第二の検査溶液（第二の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアント、（ｉｉ）前記物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域に対して特異的である第二の抗体を含む。）を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第二の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｃ）対照溶液（前記対象領域は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントおよび（ｉｉ）前記第一及び第二の抗体を含む。）をｓＡＰＰβ−抗体複合体及びＡβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、ｓＡＰＰβ−抗体複合体の第一の対照シグナル読み取りおよびＡβ−抗体複合体の第二の対照シグナル読み取りを得ること、
（ｄ）前記第一の検査シグナル読み取りと前記第一の対照シグナル読み取りを比較すること、並びに前記第二の検査シグナル読み取りと前記第二の対照シグナル読み取りを比較すること、を含み、
（ｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡＰＰと相互作用せず、
（ｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りより低く、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡＰＰのｓＡＰＰβ領域に特異的に結合し、
（ｉｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りより低ければ、前記物質はＡＰＰのＡβ領域に特異的に結合する、
前記方法。
【請求項２】
前記検査溶液及び前記対照溶液の各々が希釈剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検査溶液及び前記対照溶液がｐＨ調整剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記物質が約２ｋＤ未満の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＰＰが、リガンドにより検出可能に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検査溶液及び前記対照溶液が受容体ビーズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第二の抗体が、Ａβのアミノ酸１ないし１７又は２８ないし４０に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第二の抗体が、Ａβ領域のＣ末端に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第二の抗体が、Ａβ領域のＮ末端に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントがＡＰＰバリアントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アミロイドβペプチド（Ａβ）への物質の相互作用を測定する方法であり、前記方法は、
（ａ）第一の検査溶液［第一の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）、（ｉｉ）物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域の前記第一の亜領域に対して特異的である第一の抗体を含む。］を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第一の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｂ）第二の検査溶液［第二の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）、（ｉｉ）前記物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域の前記第二の亜領域に対して特異的である第二の抗体含む。］を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第二の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｃ）対照溶液［前記対象溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）および（ｉｉ）前記第一及び第二の抗体を含む。］をＡβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第一の対照シグナル読み取りとＡβ−抗体複合体の第二の対照シグナル読み取りとりを得ること、
（ｄ）前記第一の検査シグナル読み取りと前記第一の対照シグナル読み取りを比較すること、及び前記第二の検査シグナル読み取りと前記第二の対照シグナル読み取りを比較すること、を含み、
（ｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡβと相互作用せず、
（ｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りより低く、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡβの前記第一の亜領域に特異的に結合し、
（ｉｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りより低ければ、前記物質はＡβの前記第二の亜領域に特異的に結合する、
前記方法。
【請求項１２】
Ａβの前記第一の亜領域がＣ末端であり、Ａβの前記第二の亜領域がＮ末端である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検査溶液及び前記対照溶液の各々が希釈剤をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記検査溶液及び前記対照溶液の各々がｐＨ調整剤をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントがＡＰＰバリアントである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記物質が約２ｋＤ未満の分子量を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントが、リガンドにより検出可能に標識されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記検査溶液及び前記対照溶液が受容体ビーズを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＰＰ又はＡβと相互作用し、その構造が請求項１に記載のアッセイによって同定される物質。
【請求項２０】
ＡＰＰ又はＡβと相互作用し、その構造が請求項１１に記載のアッセイによって同定される物質。
【請求項２１】
式Ｉの化合物又は該化合物の薬学的に許容される塩。
【化１】
（式中、
Ｒ４は、必要に応じて存在し、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）Ｃ１−６アルキル及び
（ｃ）Ｃ１−６アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ２は、
（ａ）水素、
（ｂ）（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ５（Ｒ５は、水素及びＣ１−６アルキルからなる群から選択され、ｍは、１、２又は３である。）
からなる群から選択され；
Ｒ３は、
（ａ）水素、及び
（ｂ）
【化２】
（Ｒ５及びＲ６は、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）ハロゲン、
（ｉｉｉ）Ｃ１−６アルキル、
（ｉｖ）Ｃ１−６アルコキシ及び
（ｖ）テトラゾリル
からなる群から選択され；
ｎは、３、４又は５である。）
からなる群から選択される。）
【請求項２２】
Ｒ３が、
【化３】
である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
アルツハイマー病の治療を必要としている哺乳動物に、請求項２１に記載の化合物又は該化合物の薬学的に許容される塩の治療的有効量を投与することを含む、前記哺乳動物中のアルツハイマー病を治療する方法。
【請求項１】
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はアミロイドβペプチド（Ａβ）への物質の相互作用を測定する方法であり、前記方法は、
（ａ）第一の検査溶液（第一の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント、（ｉｉ）物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのｓＡＰＰβ領域に対して特異的である第一の抗体を含む。）をｓＡＰＰβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、ｓＡＰＰβ−抗体複合体の第一の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｂ）第二の検査溶液（第二の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアント、（ｉｉ）前記物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域に対して特異的である第二の抗体を含む。）を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第二の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｃ）対照溶液（前記対象領域は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントおよび（ｉｉ）前記第一及び第二の抗体を含む。）をｓＡＰＰβ−抗体複合体及びＡβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、ｓＡＰＰβ−抗体複合体の第一の対照シグナル読み取りおよびＡβ−抗体複合体の第二の対照シグナル読み取りを得ること、
（ｄ）前記第一の検査シグナル読み取りと前記第一の対照シグナル読み取りを比較すること、並びに前記第二の検査シグナル読み取りと前記第二の対照シグナル読み取りを比較すること、を含み、
（ｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡＰＰと相互作用せず、
（ｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りより低く、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡＰＰのｓＡＰＰβ領域に特異的に結合し、
（ｉｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りより低ければ、前記物質はＡＰＰのＡβ領域に特異的に結合する、
前記方法。
【請求項２】
前記検査溶液及び前記対照溶液の各々が希釈剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検査溶液及び前記対照溶液がｐＨ調整剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記物質が約２ｋＤ未満の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＰＰが、リガンドにより検出可能に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検査溶液及び前記対照溶液が受容体ビーズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第二の抗体が、Ａβのアミノ酸１ないし１７又は２８ないし４０に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第二の抗体が、Ａβ領域のＣ末端に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第二の抗体が、Ａβ領域のＮ末端に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントがＡＰＰバリアントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アミロイドβペプチド（Ａβ）への物質の相互作用を測定する方法であり、前記方法は、
（ａ）第一の検査溶液［第一の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）、（ｉｉ）物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域の前記第一の亜領域に対して特異的である第一の抗体を含む。］を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第一の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｂ）第二の検査溶液［第二の検査溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有するＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）、（ｉｉ）前記物質並びに（ｉｉｉ）前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントのＡβ領域の前記第二の亜領域に対して特異的である第二の抗体含む。］を前記Ａβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第二の検査シグナル読み取りを得ること、
（ｃ）対照溶液［前記対象溶液は（ｉ）ｓＡＰＰβ領域とＡβ領域とを有する前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアント（前記Ａβ領域は第一の亜領域及び第二の亜領域を有する。）および（ｉｉ）前記第一及び第二の抗体を含む。］をＡβ−抗体複合体の形成に適した条件下で形成して、Ａβ−抗体複合体の第一の対照シグナル読み取りとＡβ−抗体複合体の第二の対照シグナル読み取りとりを得ること、
（ｄ）前記第一の検査シグナル読み取りと前記第一の対照シグナル読み取りを比較すること、及び前記第二の検査シグナル読み取りと前記第二の対照シグナル読み取りを比較すること、を含み、
（ｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡβと相互作用せず、
（ｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りより低く、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りと等しければ、前記物質はＡβの前記第一の亜領域に特異的に結合し、
（ｉｉｉ）前記第一の検査シグナル読み取りが前記第一の対照シグナル読み取りと等しく、且つ前記第二の検査シグナル読み取りが前記第二の対照シグナル読み取りより低ければ、前記物質はＡβの前記第二の亜領域に特異的に結合する、
前記方法。
【請求項１２】
Ａβの前記第一の亜領域がＣ末端であり、Ａβの前記第二の亜領域がＮ末端である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検査溶液及び前記対照溶液の各々が希釈剤をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記検査溶液及び前記対照溶液の各々がｐＨ調整剤をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントがＡＰＰバリアントである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記物質が約２ｋＤ未満の分子量を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＰＰ又はＡＰＰバリアントが、リガンドにより検出可能に標識されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記検査溶液及び前記対照溶液が受容体ビーズを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＰＰ又はＡβと相互作用し、その構造が請求項１に記載のアッセイによって同定される物質。
【請求項２０】
ＡＰＰ又はＡβと相互作用し、その構造が請求項１１に記載のアッセイによって同定される物質。
【請求項２１】
式Ｉの化合物又は該化合物の薬学的に許容される塩。
【化１】
（式中、
Ｒ４は、必要に応じて存在し、
（ａ）ハロゲン、
（ｂ）Ｃ１−６アルキル及び
（ｃ）Ｃ１−６アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ２は、
（ａ）水素、
（ｂ）（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ５（Ｒ５は、水素及びＣ１−６アルキルからなる群から選択され、ｍは、１、２又は３である。）
からなる群から選択され；
Ｒ３は、
（ａ）水素、及び
（ｂ）
【化２】
（Ｒ５及びＲ６は、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）ハロゲン、
（ｉｉｉ）Ｃ１−６アルキル、
（ｉｖ）Ｃ１−６アルコキシ及び
（ｖ）テトラゾリル
からなる群から選択され；
ｎは、３、４又は５である。）
からなる群から選択される。）
【請求項２２】
Ｒ３が、
【化３】
である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
アルツハイマー病の治療を必要としている哺乳動物に、請求項２１に記載の化合物又は該化合物の薬学的に許容される塩の治療的有効量を投与することを含む、前記哺乳動物中のアルツハイマー病を治療する方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５０２８８０（Ｐ２００８−５０２８８０Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０６４７７（Ｐ２００７−５０６４７７）
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１０５３８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９６７３０
【国際公開日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１０５３８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９６７３０
【国際公開日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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