アルキルエステル脂肪酸配合物およびその用途
５０％を超える中鎖脂肪酸、またはその脂肪酸アルキルエステルを含有し、低融点を有する油または脂肪酸の配合物を本明細書にて提供する。かかる配合物は燃料として、または、例えば、バイオディーゼルの製造のための出発原料として有用である。また、遺伝的に改変または修飾した植物も提供され、当該修飾は該植物が生成する中鎖脂肪酸量を増大するようになされる。さらに、脂肪酸メチルエステルの配合物の融点を予測する方法、また、例えば、バイオディーゼルとしての使用に適する配合物を同定する方法をも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油；油または脂肪酸の配合物；かかる配合物の用途、例えば、燃料としての用途；および油または脂肪酸配合物の取得方法を提供する。ある種の実施態様においては、アルキルエステル化された油、油もしくは脂肪酸の配合物、およびかかるアルキルエステル化された油、油もしくは脂肪酸の配合物の用途が提供される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景についての以下の説明は、単に本発明の理解を目的として提供するものであり、本発明に対する先行技術を説明または構成するものではない。
【０００３】
植物油は代替燃料として、またバイオディーゼル生産のための供給原料として使用されている。一般に、使用される油は、特定の領域で大量に生育した植物から抽出する。それ故、米国ではダイズ油がバイオディーゼルの供給源として興味が持たれているが、一方、欧州諸国ではナタネ油が関心の対象となっている；また熱帯性気候の諸国はココヤシ油またはパーム油を利用している（オンライン公開：非特許文献１）。
【０００４】
変異体クフェア・ヴィスコシマ（Cuphea viscossima）であるＶＳ−３２０からの油を模倣したトリグリセリドの組成について、ゲラーら（非特許文献２）が開示している。ゲラーに開示されている“ＶＳ−３２０油の模倣類似体”は以下からなるトリグリセリドの組成を有する：４．２％Ｃ６：０；４０．２０％Ｃ８：０；３６．９０％Ｃ１０：０；４．８０％Ｃ１２：０；６．８０％Ｃ１４：０；３．３３％Ｃ１６：０；０．００％Ｃ１８：０；１．３７％Ｃ１８：１；２．０５％Ｃ１８：２；および０．００％Ｃ１８：３（表１参照)。ゲラーらは（１９９９年）、“このモデルは、植物油のＣ８：０含量の増加が、引続く中鎖および長鎖トリグリセリドの低下と共に、より効率的な、より良好に作動する代替ディーゼル燃料となり得る”ことを示唆していると結論付けた。
【０００５】
スターナスら（非特許文献３）は、様々な油の燃料としての特性について開示して、以下のように述べている：“流動点測定の繰返し精度が±３℃であるとした場合、添加した成分の殆どが基油燃料の流動点−１２℃に有意な程度の影響をもつとは思えなかった。主要な例外はＣ１２及びそれより長いアルキル鎖をもつ飽和脂肪アルコールであり、このものは流動点を実質的に上昇させる；少ないながら負の作用も一部のより長鎖のエステルにも観察された。留意する価値のあることは、オレイン酸誘導体すべてにおける二重結合の存在が、対応するステアリン酸エステルに比べて、それらの低温流動挙動を顕著に改善すること”、また、“点火特性と低温流動挙動の双方を考慮した場合は、三級ジメチルアミン類が最良の作動体である；しかし、三級アミドもまた興味深い可能性をもつと思われ、その場合、天然植物油のグリセリドからそれらを調製することは、幾つかの最近の研究が示しているように、アミンの調製よりもはるかに簡単である”ということである。
【０００６】
ミッテルバッハ（非特許文献４）は、植物油に由来するディーゼル燃料の規格と品質管理について考察し、以下のように述べている：“ＲＭＥについてのオーストリア基準に未だに含まれていないが、脂肪酸メチルエステルの一般的基準を規定する際に必要となるパラメータの一つは、ヨウ素価であり、この値は不飽和脂肪酸の含量を表わし、植物油の起源により唯一左右されるものである。ドイツでは１１５の値が規定されており、この値はナタネ油に相当するが、ヒマワリ油およびダイズ油など、異なる種類の油を排除することとなる。高不飽和酸の加熱がグリセリドの重合を起こすという事実があるため、不飽和脂肪酸を限定することが必要であり得る。このことは、堆積物の形成、または潤滑油の劣化につながりかねない。この影響は脂肪酸鎖における二重結合の数と共に増加する。従って、ヨウ素価による不飽和度を限定するよりも、リノレン酸などの高不飽和脂肪酸の含量を制限するほうがよりよいと思われる。”
【０００７】
グラボスキー（非特許文献５）は、“油脂由来のディーゼル燃料の、燃料としての性質、エンジン性能、およびエミッションに関する状況”を考察し、以下のように述べている：“鎖長が短縮され、および／または鎖の分枝が増加するにつれて、燃料の低温流動性が改善される。鎖長と分枝度は植物の交配、または遺伝子工学的方法の両方により変えることが可能であろうし、さらにバイオディーゼルの化学的プロセシングにより特定の二重結合を切断するか、または分枝異性体を形成させることもできよう。化学的プロセシング領域での実用的研究は殆どなされていない。バイオディーゼル燃料の低温流動性は、明らかに必要かつ重要な研究領域である。”
【０００８】
グッドラムら（非特許文献６）は、“バイオディーゼル燃料モデルの開発のための低分子量トリグリセリドの物理的性質”について考察し、以下のように述べている：“低分子量トリグリセリドの重要なフラクションを含む油は、燃料増量剤として直接使用することに適している。事実、クフェア（Cuphea）種（グラハム；Graham、１９８９年）からの原料は、主として、これらのトリグリセリド（特に、トリカプリリンおよびトリカプリン）から構成させる油を含有する。現代のＤＮＡ伝達テクノロジーは、クフェア（Cuphea）などの種から、低分子量トリグリセリドの合成をコントロールする遺伝子を、他のより充分に確立された脂肪種子作物に伝達することを可能としよう。その際、油成分は最適な所望のバイオディーゼルの性質に向け、遺伝的に修飾し得る。”
【０００９】
ノーセ（非特許文献７）は、以下のように述べている：“飽和脂肪化合物は不飽和脂肪化合物よりも有意に高い融点を有し（表１）、それらは混合物中で不飽和体よりも高い温度で結晶化する。従って、有意な量の飽和脂肪化合物を含む油脂由来のバイオディーゼル燃料は、より高い曇り点と流動点を示すであろう。”
【００１０】
カイニーら（非特許文献８）はバイオディーゼル配合物の性能を高めるためのダイズ油の修飾に関する問題について考察している。本論文はゲラーらが１９９９年に開示した配合物に言及し、“これらの短鎖脂肪酸に由来するバイオディーゼルの融点が相当に高いので、低温流動性を改善するためには、さらに脱ろう工程が必要となろう”と述べている。カイニーらはまた、“飽和脂肪酸含量を増加する脂肪酸プロフィールの変更は、酸化安定性を増強するが、低温流動を悪化させる……脂肪酸の二重結合の存在は、セタン価を低下させよう；従って、植物油の脂肪プールを飽和部分に移行させる戦略は、誘導バイオディーゼルの点火特性を改善するであろうが、酸化安定性と同様に、低温流動性を損ないかねない”とも述べている。
【００１１】
特許文献１（“‘７４３特許”）は、“脂肪酸エステルの合成燃料が、単独で、または他の既知の燃料と組合わせて燃焼させた場合、新しいエネルギー源を提供すること”、また“エステルは好ましくは、種々の油、例えば、ダイズ油、パーム油、ベニバナ油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、オイチシカ油、桐油、ココナツ油、ヒマシ油、紫蘇油、ナタネ油、ヒマワリ油、豚脂、獣脂、魚油、脂肪層、海中および陸上動物からの脂質、および植物起源の脂質などを用いるエステル転移反応により調製する”ことを開示している。
【００１２】
特許文献２（“‘１１３特許”）は、“ａ）１２ないし２２個の炭素原子を含む脂肪酸と１ないし４個の炭素原子を含む低級脂肪族アルコールから誘導されるヨウ素価５０ないし１５０の少なくとも１種のエステル５８ないし９５重量％；ｂ）６ないし１４個の炭素原子を含む脂肪酸と１ないし４個の炭素原子を含む低級脂肪族アルコールとの少なくとも１種のエステル４ないし４０重量％；およびｃ）少なくとも１種のポリマーエステル０．１ないし２重量％；を含有する混合物”を開示している。
【００１３】
特許文献３は、“改変した種子油成分を産生させる核酸構築物および方法”について開示し、“植物種子中のオレイン酸含量を増大させ、飽和脂肪酸含量を低下させる方法であって、ｉ）第一の異種ＦＡＤ２配列で形質転換した植物からのＦＡＤ２遺伝子の抑制量が、同様の遺伝的背景と第二の異種ＦＡＤ２配列を含んでなる植物細胞におけるＦＡＤ２遺伝子の抑制量に比較して少なくとも部分的に低下するまで、第一の異種ＦＡＤ２配列の長さを短縮すること（ただし、第二の異種ＦＡＤ２配列は第一の異種ＦＡＤ２配列よりもより内在性のＦＡＤ２配列からなる）；ii）同様の遺伝的背景をもつが、該異種ＦＡＴＢ配列をもたない植物細胞におけるＦＡＴＢの抑制に比較して、植物細胞におけるＦＡＴＢ遺伝子発現を少なくとも部分的に低下させ得る異種ＦＡＴＢ配列を発現させること；iii）第一の異種ＦＡＤ２配列および異種ＦＡＴＢ配列をもつゲノムを含んでなる植物を成長させること；およびiv）同様の遺伝的背景をもつが、第一の異種ＦＡＤ２配列および異種ＦＡＴＢ配列を欠如する植物からの種子に比較して、飽和脂肪酸含量の低下した種子を産生する植物を培養すること；からなる方法”について述べている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第４，３６４，７４３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３８９，１１３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６／０２６９６３号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Knothe et al., インターネット<URL: http://www.biodiesel.org/resources/reportsdatabase/reports/gen/19961201_gen-162.pdf>
【非特許文献２】Geller et al. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers 42:859-862, 1999
【非特許文献３】Stournas, et al., JACOS, 1995, 72:433-437
【非特許文献４】Mittelbach, Bioresource Technology, 1996, 56:7-11
【非特許文献５】Graboski, Prog. Energy Combustion Sci., 1998, 24:125-164
【非特許文献６】Goodrum et al., Bioresource Technology, 1996, 56:55-60
【非特許文献７】Knothe, Fuel Processing Technology, 2005, 86:1059-1070
【非特許文献８】Kinney et al., Fuel Processing Technology, 2005, 86:1137-1147
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
出願人は、植物油の配合物が代替燃料として、またはバイオディーゼル生産のための原料として使用し得る所望の性質を示すように選択し得ることを明らかにした。例えば、かかる配合物は気候が寒冷である地で燃料として使用した場合にも凍結し難いように選択し得る。配合物はまた、高温度でも安定であるようにも選択し得る。さらに、配合物は、輸送車両において燃料として使用した場合に、所望の点火性が得られるように選択し得る。本発明の油または脂肪酸の配合物のある種の特例を以下に記載する。理解されることは、本発明内の油または脂肪酸の配合物が、以下の実施態様に記載する特徴のいずれかの組合せを有し得ることである。特に、本発明者らは、脂肪酸のある種の混合物がバイオ燃料の生産のために驚くほど有益な性質を有することを発見した。例えば、本発明者らは中鎖脂肪酸とモノ不飽和脂肪酸の一定のバランスが、例えば、寒冷気候での許容能力に関して、驚くほど有益な性質を示し得ることを見出した。バランス量の中鎖脂肪酸（例えば、Ｃ８、Ｃ１０およびＣ１２）とモノ不飽和脂肪酸（好ましくは、Ｃ１６：１およびＣ１８：１）を含む脂肪酸混合物のある種の実施態様において、発明者らは、Ｃ１６：０およびＣ１８：０の存在が、低温流動性に対して特に好ましくない影響をもち、従って、バイオディーゼルにおけるＣ１６：０およびＣ１８：０のレベルを低下させることが、寒冷気候での許容能力にとって有益であり得ること；また、Ｃ１４：０、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０、Ｃ２２およびＣ２４もまた低温流動性に悪影響を与え得ること；従って、バイオディーゼルにおいてはこれらの脂肪酸を低下させることが有益であり得ることを見出した。また、油のある種のアルキルエステル、油の配合物、および脂肪酸の配合物が特に低温流動性に対して好ましい作用をもつが、その他のアルキルエステルはあまり有益でないことも発見された。
【００１７】
本明細書にて使用する場合、用語“油”とは主として脂肪酸のトリグリセリドから構成される物質をいう。植物油は植物の種々の部分、例えば、植物の種子、果実、または葉などから抽出し得る。このものは一般に室温で液体である。一部の実施態様において、油はカノーラ、ナタネ、ヤシ、ヤシ殻、ココヤシ、ホシダネヤシ、ヒマワリ、ベニバナ、オリーブ、マカダミア、ババスーヤシ、ヒマ、ラッカセイ、ワタ、アマ種子、亜麻仁、コフネヤシ、およびジャトロファに由来する。さらなる実施態様において、該油は遺伝的に修飾した植物から誘導してもよい。
【００１８】
トリグリセリドは植物油および動物脂肪の主要な構成分である。トリグリセリドは室温で固体または液体であり得る。トリグリセリドはまたトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）とも呼称され、１分子のグリセロールと３分子の脂肪酸から形成される化合物である。グリセロールは（３個の水酸基を含む）三価アルコールであり、３個までの脂肪酸との組合せで、１個、２個または３個の脂肪酸と結合した場合に、それぞれモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを形成し得る。モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドはエステルとして分類され、酸とアルコール間の反応により、副生物として水を放出し、創出される化合物である。脂肪酸は３つの水酸基のいずれかと結合してエステル結合を形成し、多様な化合物を創出する。さらに、長さの異なる脂肪酸は個々のグリセロール分子と結合し得る。従って、得られるジグリセリドまたはトリグリセリドは同じトリグリセリド分子内に異なる脂肪酸を含み得る。
【００１９】
脂肪酸は、一端にカルボキシル基をもつ炭素鎖骨格として炭素、水素、および酸素が配列されて、構成される。脂肪酸は飽和脂肪酸（ＳＦＡ）でもよく、その場合、炭素−炭素二重結合をもたず、またモノ不飽和（ＭＵＦＡ）でもよく、その場合、１個の炭素−炭素二重結合をもち、またはポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）でもよく、その場合、１個を超える炭素−炭素二重結合をもつ。脂肪酸鎖の炭素数および炭素−炭素二重結合の数は、一般に、“炭素数：炭素−炭素二重結合数”として表す。例えば、１８個の炭素と１個の二重結合をもつオレイン酸は、“Ｃ１８：１”または“１８：１”と表わし得る。
【００２０】
“中鎖脂肪酸”とは、本明細書にて使用する場合、６ないし１４個の炭素、好ましくは８ないし１２個の炭素を含む脂肪酸をいう。
【００２１】
“長鎖脂肪酸”とは、本明細書にて使用する場合、１４個を超える炭素、または１６個を超える炭素、さらに１８個を超える炭素を含む脂肪酸をいう。
【００２２】
一側面においては、脂肪酸の混合物が提供される。
【００２３】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物のある種の好適な実施態様においては、ラウリン酸が混合物中の６％ないし２０％、より好ましくは、混合物中の６％ないし１０％を占める。
【００２４】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物のある種の好適な実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の２０％ないし４０％；または混合物の２０％ないし３０％；または混合物の３０％ないし４０％；または混合物の２５％ないし３５％を占める。本明細書にて提供される脂肪酸混合物の他の実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０），およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の６０％ないし８５％；または混合物の６０％ないし７０％；または混合物の７０％ないし８５％；または混合物の６５％ないし７５％を占める。本明細書にて提供される脂肪酸混合物のさらに他の実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の４０％ないし６０％；または混合物の４０％ないし５０％；または混合物の５０％ないし６０％；または混合物の４５％ないし５５％を占める。
【００２５】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、モノ不飽和脂肪酸が、混合物の５％ないし９５％を占める；好ましくは、モノ不飽和脂肪酸が、混合物の１０％を超え、または１５％を超え；または２０％を超え；または２５％を超え；または３０％を超え；または３５％を超え；または４０％を超え；または４５％を超え；または５０％を超え；または６０％を超え；または６５％を超え；または７０％を超え；または８０％を超え；または８５％を超えて占める。
【００２６】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物のある種の好適な実施態様においては、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に、混合物の２０％ないし８５％；または混合物の２０％ないし４０％；または混合物の２０％ないし３０％；または混合物の３０％ないし４０％；または混合物の２５％ないし３５％；または混合物の４０％ないし６０％；または混合物の３５％ないし５５％；または混合物の５５％ないし６５％；または混合物の６０％ないし８５％；または混合物の６０％ないし７０％；または混合物の７０％ないし８５％；または混合物の６５％ないし７５％；を占める。
【００２７】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に、混合物の５０％を超え；または混合物の５５％を超え；または混合物の６０％を超え；または混合物の６５％を超え；または混合物の７０％を超え；または混合物の７５％を超え；または混合物の８０％を超え；または混合物の８５％を超え；または混合物の９０％を超えて占める。
【００２８】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、ステアリン酸（１８：０）およびパルミチン酸（１６：０）が共に、混合物の２５％未満；より好ましくは、混合物の１５％未満；より好ましくは、混合物の１０％未満；より好ましくは、混合物の８％未満；より好ましくは、混合物の６％未満；より好ましくは、混合物の５％未満；より好ましくは、混合物の４％未満；より好ましくは、混合物の３％未満；より好ましくは、混合物の２％未満；より好ましくは、混合物の１％未満；より好ましくは、混合物の０．５％未満；を占めるか、または一部の好適な実施態様において、脂肪酸の混合物はステアリン酸（１８：０）およびパルミチン酸（１６：０）を実質的に含有しない。
【００２９】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、ミリスチン酸（１４：０）が、混合物の２５％未満；より好ましくは、混合物の１５％未満；より好ましくは、混合物の１０％未満；より好ましくは、混合物の８％未満；より好ましくは、混合物の６％未満；より好ましくは、混合物の５％未満；より好ましくは、混合物の４％未満；より好ましくは、混合物の３％未満；より好ましくは、混合物の２％未満；より好ましくは、混合物の１％未満；より好ましくは、混合物の０．５％未満；を占めるか、または一部の好適な実施態様において、脂肪酸の混合物はミリスチン酸（１４：０）を実質的に含有しない。
【００３０】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、リノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）が共に、混合物の２５％未満；より好ましくは、混合物の１５％未満；より好ましくは、混合物の１０％未満；より好ましくは、混合物の８％未満；より好ましくは、混合物の６％未満；より好ましくは、混合物の５％未満；より好ましくは、混合物の４％未満；より好ましくは、混合物の３％未満；より好ましくは、混合物の２％未満；より好ましくは、混合物の１％未満；より好ましくは、混合物の０．５％未満；を占めるか、または一部の好適な実施態様において、脂肪酸の混合物はリノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）を実質的に含有しない。
【００３１】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、アラキドン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）およびリグノセリン酸（Ｃ２４：０）が共に、混合物の２５％未満；より好ましくは、混合物の１５％未満；より好ましくは、混合物の１０％未満；より好ましくは、混合物の８％未満；より好ましくは、混合物の６％未満；より好ましくは、混合物の５％未満；より好ましくは、混合物の４％未満；より好ましくは、混合物の３％未満；より好ましくは、混合物の２％未満；より好ましくは、混合物の１％未満；より好ましくは、混合物の０．５％未満；を占めるか、または一部の好適な実施態様において、脂肪酸の混合物はアラキドン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）およびリグノセリン酸（Ｃ２４：０）を実質的に含有しない。
【００３２】
ある種の側面において、脂肪酸の混合物は、８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸と１２〜１８個の炭素を有するモノ不飽和脂肪酸が混合物の８０％ないし１００％を占め、カプリル酸（Ｃ８：０）とカプリン酸（Ｃ１０：０）が混合物の５％ないし８０％を占め、ラウリン酸が混合物の２０％未満を占め、そして炭素が１２個を超えるポリ不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸が共に混合物の２０％未満を占める脂肪酸混合物として提供される。上記脂肪酸混合物のある種の好適な実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の２０％ないし４０％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）は混合物の６％ないし２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）は混合物の６％ないし１０％を構成する。該混合物の一部の好適な実施態様において、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）は共に、混合物の５０％ないし８５％を占める。
【００３３】
ある種の側面において、脂肪酸混合物は、８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸と１２〜１８個の炭素を有するモノ不飽和脂肪酸が混合物の８０％ないし１００％を占め、カプリル酸（Ｃ８：０）とカプリン酸（Ｃ１０：０）が混合物の５％ないし８０％を占め、ラウリン酸が混合物の２０％未満を占め、そして１２個を超える炭素を有するポリ不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸が共に混合物の２０％未満を占める脂肪酸混合物として提供される。上記脂肪酸混合物のある種の好適な実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の２０％ないし４０％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし１０％を構成する；また、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）は共に、混合物の５０％ないし８５％を占める。上記混合物の他の好適な実施態様において、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の６０％ないし８５％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし１０％を構成する；また、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）は共に、混合物の２０％ないし４０％を占める。
【００３４】
一側面において、本発明は２種以上の油の配合物を特徴とし、その場合、少なくとも５０重量％の脂肪酸が中鎖脂肪酸であり、またその場合のカプリル酸（Ｃ８：０）が最終配合物の２５％までを構成し、２０％未満が長鎖脂肪酸である。
【００３５】
関連する側面において、本発明は脂肪酸の配合物を特徴とし、その場合、少なくとも５０重量％の脂肪酸が中鎖脂肪酸であり、またその場合のカプリル酸（Ｃ８：０）が最終配合物の２５％までを構成し、２０％未満が長鎖脂肪酸である。
【００３６】
本発明の油または脂肪酸配合物の一部の実施態様において、該配合物は、少なくとも６０％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも６５％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも７０％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも７５％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも８０％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも８５％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも９０％の中鎖脂肪酸、または好ましくは少なくとも９５％の中鎖脂肪酸を含有してなる。
【００３７】
本発明の油または脂肪酸配合物の特定の実施態様において、該配合物は、５〜２５％のカプリル酸（Ｃ８：０）；１０〜２５％のカプリル酸（Ｃ８：０）；１０〜２０％のカプリル酸（Ｃ８：０）；または１５〜２５％のカプリル酸（Ｃ８：０）を含有してなる。
【００３８】
本発明の油または脂肪酸配合物の特定の実施態様において、該配合物は、３０〜６０％のカプリン酸（Ｃ１０：０）；２５〜５５％のカプリン酸（Ｃ１０：０）；３０〜５０％のカプリン酸（Ｃ１０：０）；または４０〜５０％のカプリン酸（Ｃ１０：０）を含有してなる。
【００３９】
本発明の油または脂肪酸配合物の特定の実施態様において、該配合物は、５〜３５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；１０〜２０％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；１５〜２５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；２０〜３０％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；または２５〜３５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなる。
【００４０】
本発明の油または脂肪酸配合物の他の実施態様において、該配合物は、１５％未満の長鎖脂肪酸、好ましくは１０％未満の長鎖脂肪酸、好ましくは７％未満の長鎖脂肪酸、好ましくは５％未満の長鎖脂肪酸、または好ましくは３％未満の長鎖脂肪酸を含有してなる。
【００４１】
本発明の油または脂肪酸配合物のさらに他の実施態様において、該配合物は、１５％未満のモノ不飽和脂肪酸、好ましくは１０％未満のモノ不飽和脂肪酸、好ましくは７％未満のモノ不飽和脂肪酸、好ましくは５％未満のモノ不飽和脂肪酸、または好ましくは２％未満のモノ不飽和脂肪酸を含有してなる。
【００４２】
本発明の油または脂肪酸配合物のさらに他の実施態様において、該配合物は、１０％未満のポリ不飽和脂肪酸、好ましくは７％未満のポリ不飽和脂肪酸、好ましくは５％未満のポリ不飽和脂肪酸、好ましくは３％未満のポリ不飽和脂肪酸、または好ましくは１％未満のポリ不飽和脂肪酸を含有してなる。
【００４３】
本発明の油または脂肪酸配合物の特定の実施態様においては、カプロン酸（６：０）が配合物の０ないし約５重量％；カプリル酸（８：０）が配合物の約５ないし約２５重量％；カプリン酸（１０：０）が配合物の約３０ないし約６０重量％；ラウリン酸（１２：０）が配合物の約５ないし約３０重量％；ミリスチン酸（１４：０）が配合物の０ないし約５重量％；パルミチン酸（１６：０）が配合物の０ないし約５重量％；パルミトレン酸（１６：１）が配合物の０ないし約１０重量％；ステアリン酸（１８：０）が配合物の０ないし約５重量％；オレイン酸（１８：１）が配合物の０ないし約１０重量％；リノール酸（１８：２）が配合物の０ないし約５重量％；リノレン酸（１８：３）が配合物の０ないし約１重量％；アラキドン酸（２０：０）が配合物の０ないし約３重量％；ベヘン酸（２２：０）が配合物の０ないし約３重量％；エルカ酸（２２：１）が配合物の０ないし約５重量％；およびリグノセリン酸（２４：０）が配合物の０ないし約３重量％；含まれていてもよい。
【００４４】
本発明の油または脂肪酸配合物の一部の実施態様においては、油または脂肪酸のトリグリセリドが脂肪酸アルキルエステルに変換される。特定の実施態様において、該アルキルエステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、またはブチルエステルである。好適な実施態様において、該アルキルエステルはメチルエステルである。
【００４５】
本発明の油配合物のある種の実施態様において、該油は植物油または動物脂肪に由来する。好適な実施態様において、油はカノーラ、ナタネ、パーム油、ヤシ殻、ココヤシ、ホシダネヤシ、ヒマワリ、ベニバナ、クフェア、オリーブ、マカダミア、ババスーヤシ、ヒマ、ラッカセイ、ワタ、アマ種子、亜麻仁、コフネヤシ、およびジャトロファからなる群より選択される。本発明の油配合物の一部の実施態様において、該油は遺伝的に修飾した植物に由来する。特定の実施態様において、油は遺伝的に修飾した植物に由来し、その場合、植物は未変性の植物に比較して増加した量の中鎖脂肪酸を産生するように修飾してある。さらなる実施態様においては、未変性の植物または植物類からの１種以上の油を、遺伝的に修飾した植物から得られた１種以上の油と配合し得る。
【００４６】
本発明の油または脂肪酸配合物の一部の実施態様において、油配合物または脂肪酸配合物は内燃機関に動力を供給する燃料として有用である。他の実施態様において、該油配合物または脂肪酸配合物は、燃料添加剤、機能的流体、凝固点降下剤、バイオディーゼル、航空燃料、家庭用暖房油、または灯油代替品の製造における原料として使用する。
【００４７】
関連する側面において、本発明は脂肪酸アルキルエステルの配合物を特徴とし、その場合、脂肪酸アルキルエステルの少なくとも５０％が中鎖脂肪酸アルキルエステルであり、２０％未満が長鎖脂肪酸アルキルエステルである。
【００４８】
本発明の脂肪酸アルキルエステルの配合物の特定の実施態様において、かかる配合物は少なくとも６０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも６５％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも７０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも７５％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも８０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも８５％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも９０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、または好ましくは少なくとも９５％の中鎖脂肪酸アルキルエステルを含有する。
【００４９】
本発明の脂肪酸アルキルエステルの配合物の他の実施態様において、該配合物は１５％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは１０％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは７％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは５％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、または好ましくは３％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有する。
【００５０】
本発明の脂肪酸アルキルエステルの配合物のさらに他の実施態様において、該配合物は１５％未満のモノ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは１０％未満のモノ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは７％未満のモノ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは５％未満のモノ不飽和脂肪酸アルキルエステル、または好ましくは２％未満のモノ不飽和脂肪酸アルキルエステルを含有する。
【００５１】
本発明の脂肪酸アルキルエステルの配合物のさらに他の実施態様において、該配合物は１０％未満のポリ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは７％未満のポリ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは５％未満のポリ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは３％未満のポリ不飽和脂肪酸アルキルエステル、または好ましくは１％未満のポリ不飽和脂肪酸アルキルエステルを含有する。
【００５２】
本発明の脂肪酸アルキルエステルの配合物の特定の実施態様において、該脂肪酸アルキルエステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、およびブチルエステルからなる群より選択される。他の実施態様において、該脂肪酸アルキルエステルは、イソプロピルエステル、ｔ−ブチルエステル、またはｓｅｃ−ブチルエステルからなる群より選択される。一部の好適な実施態様において、該脂肪酸アルキルエステルはメチルエステルである。一部の実施態様において、カプロン酸メチルエステル（６：０）は総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；カプリル酸メチルエステル（８：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で約５ないし約３５％、または約１０ないし約３０％、または約１５ないし約２５％；カプリン酸メチルエステル（１０：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で約２０ないし約６０％、または約３０ないし約５０％、または約４０ないし約５０％；ラウリン酸メチルエステル（１２：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で約５ないし約３０％、または約１０ないし約３０％、または約１５ないし約２５％；ミリスチン酸メチルエステル（１４：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；パルミチン酸メチルエステル（１６：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；パルミトレン酸メチルエステル（１６：１）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約１０％；ステアリン酸メチルエステル（１８：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；オレイン酸メチルエステル（１８：１）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約１０％；リノール酸メチルエステル（１８：２）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；リノレン酸メチルエステル（１８：３）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約１％；アラキドン酸メチルエステル（２０：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約３％；ベヘン酸メチルエステル（２２：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約３％；エルカ酸メチルエステル（２２：１）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；およびリグノセリン酸メチルエステル（２４：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約３％であり得る。
【００５３】
ある種の好適な実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物は、アルキル−エステル化して、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ブチルエステル、およびイソプロピルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを形成する；より好ましくは、アルキルエステルは、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、およびｎ−ブチルエステルからなる群より選択される。一部の好適な実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物は、イソプロピルエステルを含有しない。ある種の好適な実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物は、エチルエステルを含むか、または基本的にエチルエステルから構成される。ある種の好適な実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物は、ｎ−プロピルエステルを含むか、または基本的にｎ−プロピルエステルから構成される。ある種の好適な実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物は、ブチルエステルを含むか、または基本的にブチルエステルから構成される；ある種の特に好適な実施態様において、該ブチルエステルはｎ−ブチルエステルであるか、またはｎ−ブチルエステルを含有する。他の実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物はアルキル−エステル化されており、その場合のアルキルエステルは、直鎖アルキルエステルである；好ましくは、該アルキルエステルは基本的に直鎖のアルキルエステルから構成される。ある種の実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸配合物のアルキルエステルは、分枝鎖アルキルエステルを包含しない。
【００５４】
本発明の上記側面のさらなる実施態様において、油、または脂肪酸、または脂肪酸アルキルエステルの配合物は、０℃未満のまたは０℃に等しい融点、好ましくは−１０℃未満のまたは−１０℃に等しい融点、好ましくは−１５℃未満のまたは−１５℃に等しい融点、好ましくは−２０℃未満のまたは−２０℃に等しい融点、または好ましくは−２５℃未満のまたは−２５℃に等しい融点を有する。
【００５５】
本発明の上記側面のさらなる実施態様において、油、または脂肪酸、または脂肪酸アルキルエステルの配合物は、０℃未満のまたは０℃に等しい曇り点、好ましくは−１０℃未満のまたは−１０℃に等しい曇り点、好ましくは−１５℃未満のまたは−１５℃に等しい曇り点、好ましくは−２０℃未満のまたは−２０℃に等しい曇り点、または好ましくは−２５℃未満のまたは−２５℃に等しい曇り点を有する。
【００５６】
本発明の上記側面のさらなる実施態様において、油、または脂肪酸、または脂肪酸アルキルエステルの配合物は、０℃未満のまたは０℃に等しい流動点、好ましくは−１０℃未満のまたは−１０℃に等しい流動点、好ましくは−１５℃未満のまたは−１５℃に等しい流動点、好ましくは−２０℃未満のまたは−２０℃に等しい流動点、または好ましくは−２５℃未満のまたは−２５℃に等しい流動点を有する。
【００５７】
本発明の上記側面の一部の実施態様において、油、または脂肪酸、または脂肪酸アルキルエステルの配合物は、内燃機関における燃料として、燃料添加物、機能的流体、凝固点降下剤、家庭用暖房油、航空もしくはジェット燃料、または灯油代替物としての使用に適している。
【００５８】
“内燃機関における使用に適する”という文言は、内燃機関に動力を供給するために使用し得る燃料の性質をいう。一部の実施態様において、適当な燃料は、セタン価が４０〜１００；４０〜８０；または好ましくは４０〜７０；または好ましくは４０〜６０；または好ましくは４０〜５５；または好ましくは４０〜５０である。他の実施態様において、適当な燃料は、ヨウ素価が２０〜１３０；好ましくは４０〜１００；好ましくは２０〜５０、または好ましくは１０〜２０である。さらなる実施態様において、適当な燃料は、融点が０℃未満または０℃に等しく、好ましくは−１０℃未満または−１０℃に等しく、好ましくは−１５℃未満または−１５℃に等しく、好ましくは−２０℃未満または−２０℃に等しく、または好ましくは−２５℃未満または−２５℃に等しい。なおさらなる実施態様において、適当な燃料は、曇り点が０℃未満または０℃に等しく、好ましくは−１０℃未満または−１０℃に等しく、好ましくは−１５℃未満または−１５℃に等しく、好ましくは−２０℃未満または−２０℃に等しく、または好ましくは−２５℃未満または−２５℃に等しい。さらに他の実施態様において、適当な燃料は、流動点が０℃未満または０℃に等しく、好ましくは−１０℃未満または−１０℃に等しく、好ましくは−１５℃未満または−１５℃に等しく、好ましくは−２０℃未満または−２０℃に等しく、または好ましくは−２５℃未満または−２５℃に等しい。
【００５９】
本発明の上記の側面の他の実施態様において、脂肪酸または脂肪酸アルキルエステルの配合物はバイオディーゼルとして使用し、また石油ベースのディーゼルと配合して、燃料として使用するためのバイオディーゼル配合物を形成する。特定の実施態様において、該バイオディーゼルは１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、またはさらに７５％のバイオディーゼル配合物を含有してなり、残りの部分を石油ベースのディーゼルを配合する。アメリカ材料試験協会（ＡＳＴＭ）は、ディーゼル燃料を２つの等級、＃１ディーゼル燃料および＃２ディーゼル燃料に分類している。特定の実施態様において、該バイオディーゼルは＃１ディーゼル燃料、＃２ディーゼル燃料と配合するか、または＃１と＃２ディーゼルの混合物と配合する。
【００６０】
別の側面において、本発明は遺伝的に改変した植物を特徴とし、その場合の植物は、一つ以上の変異をもつ１種以上の修飾酵素を発現することで、未変性の植物に比較して、該植物が中鎖脂肪酸を増量して産生するようにしたものである。好適な実施態様において、遺伝的に改変した植物は、８個、１０個、または１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸を優先的に産生する。本明細書にて使用する場合、用語“８個、１０個、または１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸を優先的に産生する”とは、遺伝的に改変した植物が産生する中鎖脂肪酸の少なくとも５０重量％が８個、１０個、または１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸であること；より好ましくは重量で少なくとも６０％；より好ましくは少なくとも７０％；より好ましくは少なくとも７５％；より好ましくは少なくとも８０％；より好ましくは少なくとも８５％；より好ましくは少なくとも９０％；より好ましくは少なくとも９５％；より好ましくは少なくとも９８％が８個、１０個、または１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸であることを意味する。
【００６１】
本発明の上記の側面の好適な実施態様において、遺伝的に改変した植物は、未変性の状態で４０％を超える長鎖脂肪酸を含む油を産生する植物に由来する。一部の実施態様において、遺伝的に改変した植物は、クフェア（Cuphea）種ではない未変性の植物に由来する。クフェアは本発明のある種の実施態様において、不利益となり得るある種の形質を有する。例えば、“野生型のクフェア生殖質は粉砕されて、結果として商品化するように成長させることができない”（Knapp et al. "Modifying the seed storage of lipids of Cuphea: A source of medium chain triglycerides.（クフェアの脂質の種子貯蔵を修飾する；中鎖トリグリセリドの起源）" In Seed Oils for the Future, 142-154, Champaign, Ill., AOCS Press）。加えて、“このものは降霜に耐えられず、種子は容易に粉砕されて、開花も予測できず、また茎、葉および花が粘着性の弾力性のある毛で被われ……発芽も遅い（１４ないし２０日）”（Ag Innovation News, Jul-Sept. 2003, Vol. 12, No. 3）。さらに、クフェアからの充分な量の油の取得は、クフェアを商業的に実用化するための充分な量の油を産生する能力を妨げる可能性がある。しかし、ある種の実施態様においては、クフェアのある種の他の形質が、修飾のために有利な植物を提供する可能性がある。例えば、“この植物は急速に成長し、種子は僅か６週間で成熟し、温暖な気候の季節が短い場合に理想的なものである”（Ag Innovation News, Jul-Sept. 2003, Vol. 12, No. 3）。従って、ある種の実施態様において、遺伝的に改変したクフェア植物は本明細書に開示するように、油配合物を産生するものとして提供される。
【００６２】
本発明の上記の側面の一部の実施態様において、修飾した酵素を発現する植物は、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、およびトウモロコシからなる群より選択される植物である。好適な実施態様において、該植物はダイズであり、より好ましくはヤシ、より好ましくはヒマ、または最も好ましくはナタネである。特定の実施態様において、該植物はナタネの種のもの、好ましくは、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）、ブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラッシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ブラッシカ・カリナータ（Brassica carinata）およびシナピス・アルバ（Sinapis alba）（ブラッシカ・アルバ・ラベン（Brassica alba Rabenh.））である。
【００６３】
本発明の上記の側面の好適な実施態様において、含まれる変異は、変異を含む遺伝子修復オリゴヌクレオベースを用いて酵素に導入する。
【００６４】
核酸塩基は、プリン、ピリミジン、またはその誘導体もしくは類似体である塩基からなる。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル部分を含む核酸塩基であり、例えば、任意に置換基を有してもよいリボシドまたは２'−デオキシリボシドである。ヌクレオシドは数個の連結部分の一つによって結合することができて、リンを含んでいても含んでいなくてもよい。未置換のホスホジエステル連結部分により連結しているヌクレオシドはヌクレオチドと呼ばれる。本明細書に使用する場合の“核酸塩基”は、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、およびモルホリン核酸塩基並びにヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含する。
【００６５】
オリゴヌクレオベースは核酸塩基のポリマーであり、このポリマーはワトソン−クリック塩基対合により、相補性配列をもつＤＮＡにハイブリッド形成し得る。オリゴヌクレオベース鎖は単一の５'および３'末端を有するが、これらはポリマーの最終的核酸塩基である。特定のオリゴヌクレオベース鎖はすべてのタイプの核酸塩基を含むことができる。オリゴヌクレオベース化合物は、相補性である１つ以上のオリゴヌクレオベース鎖から構成される化合物であり、ワトソン−クリック塩基対合によりハイブリッド形成する。核酸塩基はデオキシリボ型またはリボ型のいずれかである。リボ型核酸塩基はペントースフラノシル含有の核酸塩基であり、その２'炭素はヒドロキシル、アルコキシまたはハロゲンで置換されたメチレンである。デオキシリボ型核酸塩基はリボ型核酸塩基以外の核酸塩基であり、ペントースフラノシル部分を含まないすべての核酸塩基を含む。
【００６６】
オリゴヌクレオベースストランドは一般にオリゴヌクレオベース鎖およびオリゴヌクレオベース鎖のセグメントまたは領域の両方を含む。オリゴヌクレオベースストランドは、３'および５'末端をもつ。オリゴヌクレオベースストランドが１本の鎖と同一の拡がりをもつ場合、当該ストランドの３'および５'末端もまた当該鎖の３'および５'末端である。
【００６７】
“遺伝子修復オリゴヌクレオベース”という用語は、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、非ヌクレオチド含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドおよび以下に詳細に説明する他の遺伝子修復分子を含むオリゴヌクレオベースを示すために本明細書では使用する。
【００６８】
本発明上記側面のさらなる実施態様において、修飾する酵素はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである。ある種の実施態様において、修飾するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、およびトウモロコシからなる群より選択される植物に存在する。好適な実施態様において、修飾したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、様々なナタネ植物、好ましくは、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）、ブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラッシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ブラッシカ・カリナータ（Brassica carinata）、シナピス・アルバ（Sinapis alba）（ブラッシカ・アルバ・ラベン（Brassica alba Rabenh.））、好ましくはブラッシカ・ナプス（Brassica napus）に存在する。特定の実施態様においては、１つ以上の変異が配列番号２（SEQ ID NO:2）のアミノ酸残基９１〜３９７に相当する領域内に含まれている；好ましくは、１つ以上の設計された変異が、配列番号２のアミノ酸残基１２８〜１４７、配列番号２のアミノ酸残基１７５〜２０６、配列番号２のアミノ酸残基２５４〜２９７、配列番号２のアミノ酸残基３３３〜３３５、または配列番号２のアミノ酸残基３６５〜３９７からなる群より選択される領域に含まれている。ある種好適な実施態様において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼはパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＰＴＥ）である。
【００６９】
本発明の上記側面のなおさらなる実施態様において、修飾する酵素はケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）である。特定の実施態様において、ＫＡＳ酵素はその活性が低下するか、または除去されるように修飾し得る。他の実施態様において、ＫＡＳ酵素はその基質選択性が変化するように修飾し得る。好適な実施態様において、ＫＡＳ酵素はＫＡＳIIであり、１つ以上の変異がアミノ酸残基３２８〜３８５に相当する領域の位置に存在する。好適な実施態様においては、１つ以上の変異が配列番号３（SEQ ID NO:3）のアミノ酸残基３２５〜３５２または配列番号３のアミノ酸残基３５５〜３８５に相当する領域に存在する。より好適な実施態様においては、１つ以上の変異が配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３４０またはさらに配列番号３のアミノ酸残基３３１〜３３７に相当する領域に存在する。一部の実施態様において、配列番号３の３３７位置の保存ロイシン残基に相当するアミノ酸が変異を受けている。
【００７０】
本発明の別の側面においては、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをエンコードする２種の発現導入遺伝子を含んでなるトランスジェニック植物が提供され、その場合、各チオエステラーゼは異なる長さの中鎖脂肪酸に対して活性を有する。従って、かかるトランスジェニック植物は両方のチオエステラーゼを発現し、中鎖脂肪酸の配合物を産生する。
【００７１】
ある種の実施態様において、修飾する酵素はΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼである。好適な実施態様においては、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの活性または発現が増大する。好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物でのΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性の増大は、遺伝的に修飾した植物が未変性の植物に比較して、Ｃ１６：１および／またはＣ１８：１のレベルの上昇；および／またはＣ１６：０のレベルの低下、および／またはＣ１８：０のレベルの低下を招く。ある種の好適な実施態様において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、遺伝的に修飾した植物が上昇したレベルのＣ１６：１を産生するように修飾する。ある種の実施態様において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、パルミトイル−ＡＣＰで上昇した活性を示すように修飾する；または遺伝的に修飾した植物は、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、クフェア、ヒマ、またはトウモロコシなどの植物であり、Ｃ１６：０の生産増大は、マカダミア（Macadamia integrifolia）、クロウメモドキ（Hippophae rhamnoides）またはウングイスカティ（Doxantha unguis-cati）からのΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子によるナタネの形質転換により達成される。
【００７２】
ある種の実施態様において、修飾する酵素はΔ１２デサチュラーゼ（ＦＡＤ２遺伝子によりエンコード）である。好適な実施態様においては、Δ１２デサチュラーゼの活性または発現が阻害または減弱される。好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物におけるΔ１２デサチュラーゼの活性または発現の阻害または減弱は、未変性植物に比較して、遺伝的に修飾した植物におけるＣ１８：２、および／またはＣ１８：３の産生レベルを低下させ、またＣ１８：１のレベルを増加させるに至る。
【００７３】
上記側面のある種の実施態様において、第一のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼはＣ８およびＣ１０脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して活性を有し、また発現された導入遺伝子はＣ１２脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して活性を有する第二のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをエンコードする。特定の実施態様において、第一のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼはクフェアの種からのものであり、第二のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼはウルムス（Ulmus）の種からのものである。
【００７４】
本発明のある種の側面において、遺伝的に修飾した植物は、本明細書に開示した脂肪酸混合物を含む油を産生するように遺伝的に修飾したものとして提供される。例えば、ある種の好適な実施態様において、植物は脂肪酸の混合物を産生するが、その場合に、８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸と１２〜１８個の炭素を有するモノ不飽和脂肪酸が該混合物の８０％ないし１００％を占め、カプリル酸（Ｃ８：０）とカプリン酸（Ｃ１０：０）が混合物の５％ないし８０％を占め、ラウリン酸が混合物の２０％未満を占め、炭素数１２個を超えるポリ不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸が共に混合物の２０％未満を占めるものとして提供される。遺伝的に修飾した植物のある種の好適な実施態様において、該植物は上記脂肪酸混合物を産生し、その場合に、カプリル酸（Ｃ８；０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）が共に、混合物の２０％ないし４０％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし１０％を構成し；また、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に、混合物の５０％ないし８５％を占める。遺伝的に修飾した植物のある種の好適な実施態様において、該植物は上記の脂肪酸混合物を産生し、その場合に、カプリル酸（Ｃ８；０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）が共に、混合物の６０％ないし８５％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし１０％を構成し；また、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に、混合物の２０％ないし４０％を占める。ある種の特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、約１０％のＣ８；約２０％のＣ１０；約１０％のＣ１２：および約６０％のＣ１６：１および／またはＣ１８：１を含む油を産生するものとして提供される。異なる特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、約５％のＣ８；約５％のＣ１０；約１５％のＣ１２；約７０％のＣ１６：１および／またはＣ１８：１；およびそれぞれ約１％以下のＣ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２およびＣ１８：３を含む油を産生するものとして提供される。
【００７５】
本発明の上記側面の一部の実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、クフェア、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、およびトウモロコシからなる群より選択される植物から生成する。特定の実施態様において、該植物は、様々なナタネ植物、好ましくは、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）、ブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラッシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ブラッシカ・カリナータ（Brassica carinata）、およびシナピス・アルバ（Sinapis alba）（ブラッシカ・アルバ・ラベン（Brassica alba Rabenh.））である。
【００７６】
上記側面のある種の特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、遺伝的に改変させた植物である；他の好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、トランスジェニック植物である。さらなる実施態様はトランスジェニックおよび遺伝的改変両方を含む植物である。
【００７７】
一実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、遺伝的に修飾した植物が中鎖脂肪酸を上昇したレベルで産生し（好ましくは、本明細書に規定する好適な脂肪酸配合物によるＣ８：０、Ｃ１０：０およびＣ１２：０のレベルを上昇させる）、および／またはパルミチン酸（Ｃ１６；０）を低下レベルで、および／またはＣ１８：０を低下レベルで産生するように修飾する。他の好適な態様において、遺伝的に修飾した植物は、モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように、好ましくはＣ１６：１およびＣ１８：１モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように；および飽和およびポリ不飽和脂肪酸を低レベルで、好ましくは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２および／またはＣ１８：３を低レベルで産生するように修飾する。特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、中鎖脂肪酸を上昇レベルで産生し（好ましくはＣ８：０、Ｃ１０：０および／またはＣ１２：０を上昇レベルで）；Ｃ１６：０およびＣ１８：０を低下レベルで；また、Ｃ１６：１およびＣ１８：１を上昇レベルで産生するように修飾する。
【００７８】
上記側面の特に好適な一実施態様において、ナタネ植物は、本明細書に規定する脂肪酸混合物を含む油を産生するように遺伝的に修飾したもとのとして提供される。ある種の好適な実施態様において、遺伝的に修飾したナタネ植物は、未変性のナタネ植物に比較して、遺伝的に修飾したナタネ植物が、中鎖脂肪酸を上昇レベルで（好ましくは、本明細書に規定した好適な脂肪酸配合物によるＣ８：０、Ｃ１０：０およびＣ１２：０のレベルを上昇させる）、および／またはパルミチン酸（Ｃ１６；０）を低下レベルで、および／またはＣ１８：０を低下レベルで産生するように修飾する。他の好適な実施態様において、遺伝的に修飾したナタネ植物は、未変性のナタネ植物に比較して、遺伝的に修飾したナタネ植物が、モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように、好ましくはＣ１６：１およびＣ１８：１モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように；および飽和およびポリ不飽和脂肪酸を低レベルで、好ましくは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２およびＣ１８：３を低レベルで産生するように修飾する。特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾したナタネ植物は、中鎖脂肪酸を上昇レベルで産生し（好ましくはＣ８：０、Ｃ１０：０および／またはＣ１２：０を上昇レベルで）；Ｃ１６：０およびＣ１８：０を低下レベルで；また、Ｃ１６：１および／またはＣ１８：１を上昇レベルで産生するように修飾する。
【００７９】
上記側面の別の特に好適な実施態様において、ダイズ植物は本明細書に規定する脂肪酸混合物を含む油を産生するように遺伝的に修飾したもとのとして提供される。ある種の好適な実施態様において、遺伝的に修飾したダイズ植物は、未変性のダイズ植物に比較して、遺伝的に修飾したダイズ植物が、中鎖脂肪酸を上昇レベルで（好ましくは、本明細書に規定した好適な脂肪酸配合物によるＣ８：０、Ｃ１０：０およびＣ１２：０のレベルを上昇させる）、および／またはパルミチン酸（Ｃ１６；０）を低下レベルで、および／またはＣ１８：０を低下レベルで産生するように修飾する。他の好適な実施態様において、遺伝的に修飾したダイズ植物は、未変性のダイズ植物に比較して、遺伝的に修飾したダイズ植物が、モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように、好ましくはＣ１６：１およびＣ１８：１モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように；および飽和およびポリ不飽和脂肪酸を低レベルで、好ましくは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２およびＣ１８：３を低レベルで産生するように修飾する。特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾したダイズ植物は、中鎖脂肪酸を上昇レベルで産生し（好ましくは、Ｃ８：０、Ｃ１０：０および／またはＣ１２：０を上昇レベルで）；Ｃ１６：０およびＣ１８：０を低下レベルで；また、Ｃ１６：１および／またはＣ１８：１を上昇レベルで産生するように修飾する。
【００８０】
本発明の上記側面のさらなる実施態様においては、遺伝的に改変した植物またはトランスジェニック植物を産生させる種子が提供される。
【００８１】
本発明の上記側面のなおさらなる実施態様においては、上記の遺伝的に改変した植物またはトランスジェニック植物の種子、果実、または葉から抽出された油または脂肪酸混合物が提供される。
【００８２】
本発明の別の側面においては、改変した植物またはトランスジェニック植物から得られる油から、バイオディーゼルを製造する方法が提供される。ある種の実施態様において、遺伝的に改変した植物またはトランスジェニック植物からの油は、バイオディーゼルを製造する上での最良の油として使用される。他の実施態様において、遺伝的に改変した植物からの油は、未変性の植物、トランスジェニック植物、またはその両方からの油と配合してバイオディーゼルの製造に使用する。特定の実施態様において、該油は遺伝子修復オリゴヌクレオベースを用いて１つ以上の変異を導入した遺伝的に改変した植物に由来するものであり、かかる油は単独で、またはトランスジェニック植物もしくは未変性植物もしくは他の遺伝的に改変した植物から得られる１種以上の油と組合わせて使用し得る。ある種の実施態様において、該方法は、１種以上の遺伝的に改変した植物またはトランスジェニック植物の種子、果実、または葉から抽出された油を、１種以上の未変性植物から得られる油と配合してエステル転移反応に付し、脂肪酸アルキルエステルを含むバイオディーゼルを製造することからなる。一部の実施態様において、エステル転移反応は、当該油をアルコールおよび塩基触媒と反応させることにより実施する。さらなる実施態様において、該方法はさらに脂肪酸アルキルエステルを精製することからなる；かかる精製は触媒、グリセリン、および水の除去からなる。
【００８３】
さらに他の実施態様において、トランスジェニック植物からの油は、遺伝的に改変した植物、未変性の植物、またはその両方からの１種以上の油と配合して、バイオディーゼルの製造に使用する。特定の実施態様において、トランスジェニック植物は１種以上の導入遺伝子を発現する。特定の実施態様において、導入遺伝子は、該植物が産生する中鎖脂肪酸の含量を改変するタンパク質を発現する。好適な実施態様において、該トランスジェニック植物は未変性の植物よりも多量の中鎖脂肪酸を産生する。より好適な実施態様において、トランスジェニック植物は８個、１０個、または１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸を優先的に産生する。より好適な実施態様において、トランスジェニック植物は未変性の植物よりも短い鎖の脂肪酸を有する油を産生する。
【００８４】
さらに本発明の別の側面においては、脂肪酸メチルエステルの配合物の理論的融点を予測する方法が提供される。この方法では、配合物中に含まれる各脂肪酸ＭＥについて、以下の積の総計を算出する：個々の脂肪酸メチルエステルのパーセント（ｗ／ｗ）（Ｘ）、そのエステルの融点（ＭＰx）、および因子（Ｆx）。従って、各メチルエステルについて、例えば、（Ｘ＊ＭＰx＊Ｆx）に相当する項がある。本方法において使用される融点と因子の数値的定義は、変化させ得るものであり、なお有効な中間値を生じる。用語“因子”とは、本明細書にて使用する場合、脂肪酸メチルエステルに相当する一定値をいう。該因子はその脂肪酸ＭＥに対する含有率およびその脂肪酸ＭＥに対する融点を乗じて、本方法で使用するその脂肪酸ＭＥに対する項とする。例えば、個々の融点はプラスマイナス２℃、または５℃、さらには１０℃変動する可能性があり、また個々の因子は５％または１０％、さらには２０％変動し得るものであるが、なお該配合物に対する有効な予測融解温度を示す。
【００８５】
ある種の実施態様においては、配合物の融点を予測する方法が提供される；その場合、予測される融点ＰTmは、以下のように計算される：
PTm = [(A*MPA*FA) + (B*MPB*FB) + (C*MPC*FC) + (D*MPD*FD) + (E*MPE*FE) + (F*MPF*FF) + (G*MPG*FG) + (H*MPH*FH) + (I*MPI*FI) + (J*MPJ*FJ) + (K*MPK*FK) + (L*MPL*FL) + (M*MPM*FM)]*(0.01),
式中：
Ａは配合物中のカプロン酸ＭＥ（６：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｂは配合物中のカプリル酸ＭＥ（８：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｃは配合物中のカプリン酸ＭＥ（１０：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｄは配合物中のラウリン酸ＭＥ（１２：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｅは配合物中のミリスチン酸ＭＥ（１４：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｆは配合物中のパルミチン酸ＭＥ（１６：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｇは配合物中のステアリン酸ＭＥ（１８：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｈは配合物中のオレイン酸ＭＥ（１８：１）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｉは配合物中のリノール酸ＭＥ（１８：２）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｊは配合物中のリノレン酸ＭＥ（１８：３）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｋは配合物中のアラキドン酸ＭＥ（２０：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｌは配合物中のベヘン酸ＭＥ（２２：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｍは配合物中のリグノセリン酸ＭＥ（２４：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
ＭＰAは−８１℃から−６１℃までである；
ＭＰBは−５０℃から−３０℃までである；
ＭＰCは−２８℃から−８℃までである；
ＭＰDは−５℃から１５℃までである；
ＭＰEは９℃から２９℃までである；
ＭＰFは２１℃から４１℃までである；
ＭＰGは２８℃から４８℃までである；
ＭＰHは−３０℃から−１０℃までである；
ＭＰIは−４５℃から−２５℃までである；
ＭＰJは−６７℃から−４７℃までである；
ＭＰKは４５℃から６５℃までである；
ＭＰLは４３℃から６３℃までである；
ＭＰMは４８℃から６８℃までである；
ＦAは８から１２までである；
ＦBは３．５から５．５までである；
ＦCは１．０から１．４までである；
ＦDは０．８から１．２までである；
ＦEは０．５から０．７までである；
ＦFは１．１から１．６までである；
ＦGは１．８から２．６までである；
ＦHは０．９から１．３までである；
ＦIは０．５から０．８までである；
ＦJは０．１５から０．２５までである；
ＦKは８から１２までである；
ＦLは１．６から２．４までである；
ＦMは１．６から２．４までである。
【００８６】
本発明上記側面の特定の実施態様において、予測される融点は以下のように計算する：
PTm = [A(-71.0)(10.0) + B(-40.0)(4.5) + C(-18.0)(1.2) + D(5.2)(1.0) + E(19.0)(0.60) + F(30.7)(1.35) + G(37.8)(2.15) + H(-19.9)(1.10) + I(-35.0)(0.65) + J(-57)(0.2) + K(54.5)(10.0) + L(53.0)(2.0) + M(57.4)(2.0)]*(0.01),
また、ＡないしＭは上記定義のとおりである。
【００８７】
上記側面の関連する実施態様においては、アルゴリズムを用いて、バイオディーゼルとしての使用に適する脂肪酸メチルエステルの配合物を同定する；その場合、該配合物の予測される融点を計算し、カットオフ値と比較する。“カットオフ値”は本明細書にて使用する場合、所望の融点をいい、配合物が所望の融点よりも低いか、または等しいＰTmを有する場合、バイオディーゼルとしての使用に適する。特定の実施態様において、カットオフ値は０℃、好ましくは−５℃、好ましくは−１０℃、好ましくは−１５℃、好ましくは−２０℃、好ましくは０℃、または好ましくは−２０℃である。
【００８８】
用語“重量でのパーセント（重量％）”とは、本明細書にて使用する場合、配合物または混合物における成分の量をいう。一般に、この用語は混合物１００グラム当たりの成分のグラムをいう。例えば、“重量で１０％の化合物Ｘ”を含む混合物とは、混合物１００グラム中の化合物Ｘが１０グラムのことをいう。
【００８９】
用語“バイオディーゼル”とは、本明細書にて使用する場合、植物油または動物脂肪に由来する燃料をいう。一般に、バイオディーゼルは主として脂肪酸アルキルエステルから構成される。好ましくは、バイオディーゼルは内燃機関での使用に適する。
【００９０】
用語“バイオディーゼル配合物”とは、バイオディーゼルおよび別の燃料との配合物をいう。一般に、バイオディーゼルは石油に基づく燃料（すなわち、石油ディーゼル）と配合する。バイオディーゼル配合物はＢＸＸという。“ＸＸ”は配合物中のバイオディーゼルの量を示す。Ｂ１００は１００％のバイオディーゼルまたは“ニート”バイオディーゼルである。Ｂ２０配合物とは、例えば、２０％容量配合物のバイオディーゼルと８０％の石油ディーゼルである。
【００９１】
用語“燃料”とは、燃焼して熱または力を与える物質をいう。その例は、ガソリン、家庭用暖房油、航空燃料、灯油、ディーゼル、バイオディーゼル、植物油、およびバイオディーゼル配合物などの液体である。一部の燃料、例えば、ガソリン、ディーゼル、バイオディーゼル、植物油、またはバイオディーゼル配合物は内燃機関を駆動するために使用することができる。
【００９２】
“遺伝的に修飾した植物”という文言は、トランスジェニック植物または遺伝的に改変した植物をいう。
【００９３】
“未変性の植物”という用語は、本明細書にて使用する場合、遺伝的に修飾していない（すなわち、トランスジェニックまたは遺伝的に改変していない）植物をいう。未変性の植物は、野生型植物並びにある種の性質を得るために選択的に交配した植物である。
【００９４】
“トランスジェニック植物”という文言は、別の植物種または非植物種からの遺伝子を有する植物をいう。かかる遺伝子は“導入遺伝子”をいう。
【００９５】
“遺伝的に改変した植物”という文言は、１種以上の遺伝的修飾、例えば、１つ以上の設計された変異を含む導入遺伝子および／または修飾酵素を有する植物をいう。かかる設計された変異は、未変性の酵素とは異なる活性を有する修飾酵素を生じ得る。かかる差異は基質特異性または活性レベルの差異を含む。本明細書にて使用する場合、“トランスジェニック植物”とは“遺伝的に改変した植物”の一タイプである。
【００９６】
“燃料添加物”という文言は燃料に添加する液状物質をいい、最終燃料の５重量％未満を構成する。
【００９７】
“脂肪酸の混合物”または“脂肪酸の配合物”または“脂肪酸配合物”という文言は、互いに交換して使用し得るものであり、種々の脂肪酸を含有する組成物をいう。ある種の実施態様において、脂肪酸の混合物は油であるか、または油の配合物でもよく、他の実施態様においては、脂肪酸の混合物は遊離脂肪酸の混合物または遊離脂肪酸と油の混合物であるか、または油の配合物であり得る。ある種の実施態様において、脂肪酸混合物中の脂肪酸の一部または全部を修飾して、脂肪酸アルキルエステル、例えば、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、脂肪酸プロピルエステルなどを形成してもよい。ある種の好適な実施態様において、脂肪酸アルキルエステルはメチルエステルである。従って、特に断りのない限り、“脂肪酸の混合物”という文言は、本明細書にて使用する場合、混合物中で特定される脂肪酸の脂肪酸アルキルエステルの混合物を包含する。同様に、特に断りのない限り、本明細書にて使用する場合の用語“脂肪酸”は脂肪酸のアルキルエステルを包含する。
【００９８】
“機能的液体”という文言は、燃料に添加する液状物質をいい、最終燃料の５重量％を越えて包含する。
【００９９】
“凝固点降下”という文言は、燃料の凝固点を低下させるために、その燃料に添加する液状物質をいう。
【０１００】
“セタン価”またはＣＮは、燃料の点火特性の尺度であり、点火遅れ時間と相関する。例えば、高セタン価をもつ燃料はシリンダーに注入されて間もなく燃焼し始める（すなわち、それは短い点火遅れ時間をもつ）。対照的に、低セタン価をもつ燃料はより長い点火遅れ時間をもつ。さらに、より高いセタン価は、改善された燃焼、改善されたコールドスタート、ノイズ減少、白煙減少、および特に初期の暖機運転に際してのＨＣ、ＣＯおよび微粒子の排出減少と相関する。商業的に入手可能な石油由来のディーゼルは、一般に、２つのＣＮ範囲、すなわち、レギュラーディーゼルについては４０〜４６、またハイオクについては４５〜５０に見出される。
【０１０１】
“ヨウ素価”は植物油および脂肪における不飽和度を測定するために、標準的天然油アッセイにより決定する。
【０１０２】
“曇り点”とは最初の含ろう結晶が現れる温度をいい、アメリカ材料試験協会（ＡＳＴＭ）の標準的試験プロトコールを用いてこの温度を測定する。
【０１０３】
“流動点”とは、燃料がもはや流動しなくなる温度をいう。流動点は一般に曇り点よりも低い。一部のエンジンは曇り点で駆動し得ないが、一般にすべてのエンジンが流動点では駆動し得ない。
【０１０４】
結晶性固体の“融点”とは、状態を固体から液体へ変化させる温度をいう。逆の変化（すなわち、液体から固体へ）の温度として考慮した場合、それは“凝固点”という。殆どの物質の場合、融点と凝固点は等値である。融点または凝固点は流動点よりも低い。
【０１０５】
“供給原料”とは、本明細書にて使用する場合、バイオディーゼルの調製のための出発原料として使用し得る脂肪、脂肪酸、またはトリグリセリドから構成される物質をいう。バイオディーゼルの生産に使用し得る供給原料の例は、植物油、廃棄植物油、および動物脂肪である。他の供給原料は脂肪酸または脂肪酸アルキルエステルの混合物である。
【０１０６】
用語“約”とは、本明細書にて使用する場合、量についてプラスマイナス１０％の範囲にあることを意味する。例えば、“約３％”とは２．７〜３．３％の範囲を含み、“約１０％”とは９〜１１％の範囲を含む。
【０１０７】
特に断りのない限り、本明細書に示す百分率は重量パーセントである。
【０１０８】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態の説明から、また特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）からのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはＰＴＥ）の部分アミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【図２】アラビドプシス（Arabidopsis）からのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはＰＴＥ）のアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【図３】アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）からのケトアシル−シンターゼII（ＫＡＳ II）（ジェンバンク（GenBank）受託番号ＮＰ＿８４９８８８）のアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【図４】アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）からのケトアシル−シンターゼII（ＫＡＳ II）（ジェンバンク（GenBank）受託番号ＮＭ＿１７９５５７）のヌクレオチド配列（配列番号：４）を示す。
【図５】バイオディーゼルが油または脂肪から製造し得る２つの経路を示す。
【図６】一部例示としての油の脂肪酸含有率を示す。
【図７】曇り点に対する脂肪酸のアルキルエステル化の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
配合油
中鎖脂肪酸の種々の成分を含む油は、中鎖脂肪酸の所望の配合物を得るために、配合し得る。油は重量に基づいて配合する。例えば、２５％ナタネ油からなる配合物１００グラムに使用すべきナタネ油の容量は、最終配合物中のナタネ油のグラム数をナタネ油の比重で除することによって決定する（すなわち、２５ｇｍ／０．９１５ｇｍ／ｍＬ＝２７．３ｍＬ）。
【０１１１】
図６は含有される一部例示としての油および脂肪酸含有率を示す表である。これらの油は様々な供給元から商業的に入手可能である。注意すべきことは、当該技術分野で周知のように、特定の植物に存在する特定脂肪酸の量が相当に変動するため、その脂肪酸含有値をある範囲で表わすことである。従って、これらの植物から抽出される油は、いずれかの、またはすべての脂肪酸の量をバッチごとに違って示している可能性がある。それ故、通常は、配合物またはバイオディーゼルを製造するために実際に使用する油の脂肪酸含量を測定することが必要である。
【０１１２】
脂肪酸アルキルエステルの調製
脂肪酸アルキルエステルは脂肪酸またはトリグリセリドから製造することができる。一般に、脂肪酸アルキルエステルは油脂中のトリグリセリドのエステル交換反応または遊離脂肪酸のエステル化により製造する（図５）。あるいは、脂肪酸をトリグリセリドから加水分解により分断し、引き続きエステル化反応に付して脂肪酸エステルを製造する。
【０１１３】
脂肪酸アルキルエステルは、様々な植物由来の油、例えば、ダイズ油、パーム油、ベニバナ油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、ココヤシ油、ヒマシ油、ナタネ油、ヒマワリ油など、および動物脂肪由来の種々の油に見出されるトリグリセリドのエステル交換反応により調製し得る。これらの油は塩基触媒、例えば、ナトリウムアルコキシド、水酸化ナトリウムもしくはカリウム、チタニウムテトライソプロポキシドなどの存在下に、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール）と反応させる。温度および圧力などの反応条件は、具体的に使用されるアルコール基づき選択し得る。触媒量は、一般的に、脂肪酸に基づく重量で約０．１ないし約０．５％の範囲である。本工程では、脂肪酸アルキルエステルを、アルキル基がアルコールに由来する場合に製造する。従って、メタノールを使用する反応は、該アルコールが脂肪酸メチルエステルを生成する場合に使用した。他の副生物はグリセリンである。エステル交換産物は分別カラムを介する蒸留による減圧分別により単離する。
【０１１４】
脂肪酸アルキルエステルは、遊離脂肪酸からエステル化反応を経由して調製し得る。遊離の脂肪酸は多くの供給源から商業的に入手し得るか、または、例えば、上記の油から誘導し得るものであり、酸触媒、例えば、硫酸、アリールスルホン酸、またはアルキルスルホン酸などの酸触媒の存在下にアルコールと反応させ得る。温度および圧力などの反応条件は、使用する具体的なアルコールに基づき選択し得る。脂肪酸エステルは、硫酸を中和し、次いで精製して、水性反応成分を除去することにより、回収することができる。
【０１１５】
脂肪酸エステルの配合
脂肪酸エステルは商業的に入手し得るか、または上記のように脂肪酸のエステル化反応により取得し得る。脂肪酸は、バイオディーゼル、燃料添加物、機能的流体、飛行もしくはジェット燃料、家庭用暖房油、または灯油としての使用に適切な性質を有する混合物を得るために配合する。配合物を評価する際に考慮すべき性質は、融点、曇り点、流動点、ヨウ素価、セタン価、粘度、酸化安定性、および摩擦磨耗特性であり得る。
【０１１６】
配合物は重量パーセントに基づいて作製する。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の配合物の場合、各ＦＡＭＥ成分の所望の重量パーセントは、そのＦＡＭＥの比重で割り算する。これによって、最終配合物１００グラム当たりのＦＡＭＥ容量を得る。例えば、カプリン酸メチルエステル（比重０．８７７ｇ／ｍＬを有する）１４％（重量％）を含む配合物を得るためには、最終配合物１００グラムを作製する上で使用すべきカプリン酸メチルエステルの容量は以下のように決定する。
カプリン酸メチルエステルの容量＝（１４ｇ／０．８７７ｇ／ｍＬ）＝１５．９６ｍｌ
従って、最終配合物１００ｇｍそれぞれに、カプリン酸メチルエステル１５．９６ｍｌが必要とされよう。
【０１１７】
油配合物に含まれる脂肪酸を脂肪酸エステルに変換することから生じるＦＡＭＥ配合物またはＦＡＭＥ混合物の重量パーセントの測定は、フレームイオン化検出計（ＦＩＤ）を備えたキャピラリーガスクロマトグラフ（アジレントモデル６８９０）（カラム−スペルコ（Supelco）ＳＰＢ−２２５、３０Ｍ×０．３２ｍｍ、０．２５μｍフィルム厚さ）により実施する。サンプルピーク面積を各ピークについて換算した標準ＦＡＭＥの既知重量のピーク面積と比較し、サンプル中の各ＦＡＭＥの重量を決定する。すべての重量を合計した（パーセントに換算後の）総量に対する個々のＦＡＭＥ重量比は重量パーセントである。
【０１１８】
融点：脂肪酸エステル配合物の低融点は、かかる配合物を寒冷天候下で使用する場合に凝固するのを回避するために望ましい。脂肪酸メチルエステル配合物の低融点を得る手段は、一般に、常套のディーゼル燃料との配合、分枝鎖エステルおよび／またはアルキル鎖に嵩高い置換基を有する添加物の包接、および／または配合物の脱ろうなどである。本発明の配合物は、中鎖脂肪酸メチルエステル、特にＣ８およびＣ１０メチルエステルの包接により低融点を達成する。従って、脂肪酸エステルはある種の融点を得るように配合することが可能であり、また得られた配合物の融点を測定することができる。
【０１１９】
融点は当該技術分野で周知の方法により測定し得る。一方法において、脂肪酸メチルエステル配合物の融点は、配合物の一部を一端閉鎖ガラスキャピラールチューブに容れ、配合物の予測される融点以下の温度に保持した水浴またはエチレングリコール浴中でチューブを平衡化することにより測定する。チューブとその内容物が平衡となる充分な時間の経過後、水浴の温度をゆっくりと上昇させる。チューブを目視で観察するか、または光散乱装置（分光光度計）により観察する。固体から液体に遷移が観察される温度または光散乱が減衰する温度を、サンプルの融点として記録する。
【０１２０】
単一の融点に置き換わるものは、上に説明するように、“スリップ融点”である。この方法では少量のサンプルを一端閉鎖キャピラールに容れ、サンプルがチューブ長方向の中心に停止するようにする。水浴中で平衡化した後、温度をゆっくりと上昇させ、停止させたサンプルがキャピラール中で落下または“スリップ”し始めた瞬間の温度をスリップ融点として記録する。
【０１２１】
固体脂肪の融点の測定については、アメリカ穀草類化学者協会（ＡＡＣＣ）が記載する方法、方法番号５８−４０“融点−キャピラリー法、および方法番号５８−５３スリップ融点法”に詳細に記載されている。さらに、アメリカ油化学者学会（ＡＯＣＳ）公式方法Ｃｃ１−２５“融点キャピラリーチューブ法”およびＡＯＣＳ公式方法Ｃｃ３−２５“スリップ融点ＡＯＣＳ標準オープンチューブ融点”からの方法が利用可能である。
【０１２２】
別法として、予測される融点は本明細書に含まれるアルゴリズムを用いて算出することができる。
【０１２３】
曇り点および流動点：曇り点および流動点は一つの装置を用いる同じ実験で測定し得る。簡単に説明すると、サンプルを曇りおよび流動点装置中で冷却し、冷却下に定期的に試験する。かすみの観察される最高温度が曇り点である。油の動きが観察される最低温度が流動点である。本方法はＡＳＴＭ Ｄ９７、Ｄ２５００および関連仕様書に従うべきである。かかる装置（Ｋ４６１００曇り点と流動点装置曇り点および流動点チャンバー）は、ケーラー（Koehler）インストルーメントカンパニー、インク（１５９５シカモアー（Sycamore）通り、ボヘミア、ニューヨーク１１７１６、米国）から入手し得る。
【０１２４】
セタン価：ディーゼル燃料（ＤＦ）の点火特性は共通してアメリカ材料試験協会（ＡＳＴＭ）試験法ＡＳＴＭ Ｄ６１３によって測定し、セタン価（ＣＮ）として報告される。点火特性は、エンジンにおける燃料の点火遅れ時間と定義される。点火遅れ時間が短い程、ＣＮは高くなる。化合物はセタン目盛りに従ってランク付けする。セタン（Ｃ16Ｈ34またはヘキサデカン）は非常に短い点火遅れを示し、１００のＣＮを割り当てる。目盛りの他端は２，２，４，４，６，８，８−ヘプタメチルノナン（ＨＭＮ；またＣ16Ｈ34）であり、点火特性が劣り、１５のＣＮを割り当てる。一般に、長鎖非分枝飽和炭化水素（アルカン）は高ＣＮ値と良好な点火特性を有し、一方、分枝炭化水素（および芳香族などの他の材料）は低ＣＮ値と不良な点火特性を有する。さらに、脂肪酸に二重結合または不飽和度が存在する場合、セタン価は低くなる。
【０１２５】
高すぎるＣＮおよび低すぎるＣＮは共に操作上の問題を惹き起こし得るので（ＣＮが高すぎる場合、燃料と空気が適切に混合する前に燃焼が起こり得、不完全燃焼と排煙を起こす；ＣＮが低すぎる場合、エンジン粗度、ミスファイアリング、高空気温度、遅いエンジン暖機、および不完全燃焼もまた起こる）、殆どのエンジン製造業者は彼らのエンジンに対して要求されるＣＮの範囲を明示する。殆どの場合、この範囲はＣＮ４０〜５０前後である。例えば、常套のディーゼル燃料に対するＡＳＴＭ規格（ＡＳＴＭ Ｄ９７５）は４０の最少ＣＮを必要とする。
【０１２６】
ヨウ素価：ヨウ素価は共通して使用される飽和の測定、従って、酸化安定性の指標である。先に述べたように、不飽和分子は飽和分子よりも酸化を受け易い。この試験では、油または燃料中の二重結合の数を測定するためにヨウ素を使用する。従って、ダイズ油（ＩＮ＝１３０〜１３５）などの高いヨウ素価を有する油は、非常に酸化を受けやすいが、一方、獣脂（ＩＮ＝３０〜４８）などの低ヨウ素価をもつ動物脂肪は、余り酸化され易くない。ヨウ素価の主たる欠点は、一部の二重結合が他のものよりもより容易に酸化を受けることを認識しないということである。リノール酸メチルは２つの二重結合をもつが、１つしか二重結合をもたないオレイン酸メチルよりも約５０倍速く酸化を受ける。３つの二重結合をもつリノレン酸メチルはさらに急速に酸化を受けるが、その上昇レベルは同じではない。従って、主として飽和の中鎖脂肪酸の配合物は、低いヨウ素価を示すことが予測され、従って、良好な酸化安定性を示す。
【０１２７】
改変脂肪酸組成をもつ油を産生する遺伝的に改変した植物の産生
米国特許第６，１５０，５１２号は、“植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質特異性を改変する方法、およびそのように産生させた遺伝子工学改変植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを提供すること”、特に、“１８：０比活性が上昇したマンゴスチン・ガームファット（Garm Fat）Ａ１ １８：１チオエステラーゼ”を開示している。
【０１２８】
米国特許第５，９５５，３２９号は、“植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質特異性を改変する方法、および遺伝子工学的に改変した植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ”を開示している。特に、“ここに記載されているＣ１２優先の植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを改変して、Ｃ１４およびＣ１２基質に対して略等しい活性を有する植物チオエステラーゼを取得し得る”ことが開示されている。
【０１２９】
カールソンら（Carlsson et al. Plant Journal 29(6):761-770, 2002）は、“β−ケトアシル−［アシル・キャリヤタンパク質］シンターゼII（ＫＡＳII）の活性を部分的に欠如するアラビドプシス（Arabidopsis）のｆａｂ１変異体”について開示している。ｆａｂ１変異は、“Ｌｅｕ３３７Ｐｈｅ置換を生じるアラビドプシスＫＡＳ２の配列における１個のヌクレオチドの変化”であると記載している。
【０１３０】
ナップら（Knapp et al.“クフェアの脂質種子貯蔵の修飾：中鎖トリグリセリドの供給源”Seed Oils for the Future, 142-154, Champaign, Ill., AOCS Press）は、改変されたトリグリセリド成分を含む油を産生する、ランダム変異誘発により創出した変異体クフェア・ヴィスコシッシマ（Cuphea viscosissima）を開示している。
【０１３１】
米国特許第５，６６７，９９７号、第５，４５５，１６７号、第５，２９８，４２１号および第５，５１２，４８２号は、中鎖脂肪酸に特異性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのヌクレオチドとアミノ酸の配列およびこれらのチオエステラーゼそれぞれを発現する対応するトランスジェニック植物を開示している。
【０１３２】
中鎖脂肪酸を産生する遺伝的に改変した植物は、脂肪酸生合成経路内の１種以上の酵素を変異または修飾することにより生産し得る。脂肪酸生合成は植物の色素体にて起こる。脂肪酸の合成は、アシルタンパク質キャリヤ（ＡＣＰ）に結合した２炭素前駆体から、酵素ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）が触媒する反応において連続して起こる２炭素付加を経て、進行する。このプロセスの間、脂肪酸はＡＣＰにエステル化されたままであり、その結果、アシル部分が多様な長さのアシル−ＡＣＰ中間体がプールされる。色素体に存在するチオエステラーゼは、脂肪酸とＡＣＰ間のチオール−エステル連結を加水分解し、その結果、脂肪酸を放出するが、その脂肪酸は色素体中に存在し得、またトリグリセリドに組み込まれ得る。
【０１３３】
ＫＡＳの数種の異性体は特定の長さのアシル鎖に対し親和性を有する。例えば、ＫＡＳＩ酵素、例えば、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）の酵素は、炭素数１６を超えるアシル鎖に対して親和性が低く、従って、この酵素については１６個の炭素を超えてアシル鎖を伸張できない。ＫＡＳIIは１６個の炭素のアシル鎖を１８個の炭素のアシル鎖に伸張する反応を特異的に触媒する。ＫＡＳIIは炭素が１６個より長くても短くても、アシル鎖に対し殆ど親和性を示さない。
【０１３４】
同様に、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは特定の長さのアシル鎖に優先的な活性を有するものが同定されてきた。例えば、１８個炭素の脂肪酸を含むアシル−ＡＣＰ類（例えば、オレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはＯＴＥ）を主として加水分解するチオエステラーゼが存在する。同様に、１６個炭素の脂肪酸を含むアシル−ＡＣＰ類（例えば、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはＰＴＥ）に対して優先的な活性を有するチオエステラーゼが存在する。さらに、種々の中鎖脂肪酸に対し優先的活性を有するチオエステラーゼが報告されている。特定の鎖長の脂肪酸アシル−キャリヤ基質に対する植物チオエステラーゼの“優先的活性”は、異なる鎖長の基質当たり得られる遊離脂肪酸産生量を比較することにより測定する。例えば、“Ｃ１２−優先”とは、酵素調製物の加水分解活性が、異なるアシル炭素鎖長の他の基質に優先して、ラウロイル、および恐らくデカノイルに対して優先性を示すことを意味する。同様に、“Ｃ１０−優先”活性をもつ植物チオエステラーゼは、異なる炭素鎖長の他の基質に優先して、デカノイル基質、および恐らくオクタノイルに対してより高い活性レベルを示す。注意すべきことは、有意に程度の劣る一部の活性が他の鎖長の脂肪酸基質について観察され得ることである。従って、優先性は実質的なものであるが、絶対的なものではない。
【０１３５】
好適な実施態様において、修飾酵素を発現する遺伝的に改変した植物は、本明細書で説明するように、遺伝子修復オリゴヌクレオベースの使用を介して、該酵素に変異を導入することにより製造する。該方法は、対象となる標的遺伝子に特異的な変異を含む遺伝子修復オリゴヌクレオベースを、当該技術分野にて周知の多くの方法（例えば、マイクロキャリヤー、マイクロファイバー、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクション）のいずれかにより、植物細胞に導入し、その変異酵素を有する細胞、種子または植物を同定することからなる。
【０１３６】
本明細書にて使用する場合、用語“標的遺伝子”とは、修飾すべき酵素をエンコードする遺伝子をいう。
【０１３７】
遺伝子修復オリゴヌクレオベース
本発明は以下に詳細に記載するコンフォメーションと化学的性質を有する“遺伝子修復オリゴヌクレオベース”により実施し得る。本発明の“遺伝子修復オリゴヌクレオベース”とは、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド不含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、および下記の特許および特許公開公報に記載された他の遺伝子修復分子である。本発明の“遺伝子修復オリゴヌクレオベース”は、公刊された科学文献および特許文献にも記載されているが、そこでは他の名称、例えば、“遺伝子組換えオリゴヌクレオベース”；“ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド”；“キメラオリゴヌクレオチド”；“混合二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）”；“ＲＮＡ ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＤＯ）”；“遺伝子標的オリゴヌクレオチド”；“ゲノプラスト”；“一本鎖修飾オリゴヌクレオチド”；“一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異性ベクター”；“二本鎖変異性ベクター”；および“ヘテロ二本鎖変異性ベクター”などを使用している。
【０１３８】
クミエックによって米国特許第５，５６５，３５０号（クミエックＩ）に、またクミエックによって米国特許第５，７３１，１８１号（クミエックII）（参照により本明細書の一部とする）に記載されたコンフォメーションと化学的性質を有するオリゴヌクレオベースは、本発明の“遺伝子修復オリゴヌクレオベース”としての使用に適している。クミエックＩおよび／またはクミエックIIにおける遺伝子修復オリゴヌクレオベースは、二本の相補的ストランドを含み、その一方は、他方のストランドのＤＮＡ型ヌクレオチドに塩基対合するＲＮＡ型ヌクレオチドの少なくとも１セグメント（“ＲＮＡ−セグメント”）を含む。
【０１３９】
クミエックIIは、プリンおよびピリミジン塩基含有非ヌクレオチドがヌクレオチドと置き換え得ることを開示している。本発明に使用し得るさらなる遺伝子修復分子が米国特許第５，７５６，３２５号；第５，８７１，９８４号；第５，７６０，０１２号；第５，８８８，９８３号；第５，７９５，９７２号；第５，７８０，２９６号；第５，９４５，３３９号；第６，００４，８０４号；および第６，０１０，９０７号に、また国際特許ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７；さらに、国際特許公開ＷＯ９８／４９３５０；ＷＯ９９／０７８６５；ＷＯ９９／５８７２３；ＷＯ９９／５８７０２；およびＷＯ９９／４０７８９（これらの全文をそれぞれ参照により本明細書の一部とする）に開示されている。
【０１４０】
一実施態様において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースは、混合二本鎖オリゴヌクレオチドであり、その場合、混合二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ型のヌクレオチドは、その２'−ヒドロキシルをフルオロ、クロロまたはブロモ官能基と置き換えることにより、または２'−Ｏ上に置換基を置くことにより、ＲＮアーゼ抵抗性とする。適切な置換基はクミエックIIが教示する置換基を包含する。替わり得る置換基は、米国特許第５，３３４，７１１号（スプロート；Sproat）が教示する置換基および欧州特許公開第６２９ ３８７号および第６７９ ６５７号（共に、マーチン（Martin）出願）（参照により本明細書の一部とする）が教示する置換基である。本明細書にて使用する場合、リボヌクレオチドの２'−フルオロ、クロロまたはブロモ誘導体またはマーチン出願もしくはスプロートに記載された置換基で置換された２'−ＯＨを有するリボヌクレオチドは、“２'−置換リボヌクレオチド”と呼称する。本明細書にて使用する場合、“ＲＮＡ型ヌクレオチド”は、未置換ホスホジエステル連結により、またはクミエックＩまたはクミエックIIが教示する非天然連結のいずれかにより、混合二本鎖オリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドに連結する２'−ヒドロキシルまたは２'−置換ヌクレオチドを意味する。本明細書にて使用する場合、用語“デオキシリボ型ヌクレオチド”とは、２'−Ｈを有するヌクレオチドを意味し、このものは未置換ホスホジエステル連結により、またはクミエックＩまたはクミエックIIが教示する非天然連結のいずれかにより、遺伝子修復オリゴヌクレオベースの他のヌクレオチドに連結し得る。
【０１４１】
本発明の特定の実施態様において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースは未置換ホスホジエステル結合によってのみ連結する混合二本鎖オリゴヌクレオチドである。替わり得る実施態様において、該連結は置換ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体およびクミエックIIが教示する非リン酸ベースの連結によるものである。さらに別の実施態様において、混合二本鎖オリゴヌクレオチドにおける各ＲＮＡ型ヌクレオチドは、２'−置換ヌクレオチドである。２'−置換リボヌクレオチドの特に好適な実施態様は、２'−フルオロ、２'−メトキシ、２'−プロピルオキシ、２'−アリルオキシ、２'−ヒドロキシルエチルオキシ、２'−メトキシエチルオキシ、２'−フルオロプロピルオキシおよび２'−トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。２'−置換リボヌクレオチドのより好適な実施態様は、２'−フルオロ、２'−メトキシ、２'−メトキシエチルオキシ、および２'−アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の実施態様において、混合二本鎖オリゴヌクレオチドは未置換ホスホジエステル結合により連結する。
【０１４２】
単一の型の２'−置換ＲＮＡ型ヌクレオチドのみを有する混合二本鎖オリゴヌクレオチドはさらに簡便に合成されるが、本発明の方法は、２種以上の型のＲＮＡ型ヌクレオチドを有する混合二本鎖オリゴヌクレオチドで実施する。ＲＮＡセグメントの機能は、２つのＲＮＡ型トリヌクレオチドの間にデオキシヌクレオチドを導入することにより惹起される分断により影響され得ない、従って、用語ＲＮＡセグメントは“分断ＲＮＡセグメント”などを包含する。未分断ＲＮＡセグメントは隣接ＲＮＡセグメントと呼称する。替わり得る実施態様において、ＲＮＡセグメントはＲＮアーゼ抵抗性ヌクレオチドおよび未置換２'−ＯＨヌクレオチドを交互に含み得る。混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１００個未満のヌクレオチド、そしてより好ましくは８５個未満のヌクレオチドではあるが、５０個を超えるヌクレオチドである。第一と第二のストランドはワトソン−クリック塩基対合する。一実施態様において、混合二本鎖オリゴヌクレオチドのストランドは、第一と第二のストランドが、単一の３'および単一の５'末端をもつ単一のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントであるように一本鎖のヘキサ、ペンタまたはテトラ−ヌクレオチドなどのリンカーによって共有結合する。３'および５'末端は“ヘアピンキャップ”を付加することにより保護し、それによって３'および５'末端ヌクレオチドを隣り合うヌクレオチドにワトソン−クリック対合させる。第二のヘアピンキャップは、さらに、３'および５'末端から離れた第一および第二のストランド間の結合位置に置くことができ、その結果、第一および第二のストランド間のワトソン−クリック対合が安定化する。
【０１４３】
第一および第二のストランドは標的遺伝子の２つのフラグメントと相同である、すなわち、標的遺伝子と同一の配列を有する２ヶ所の領域を含む。相同領域はＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含み、ＤＮＡセグメントを結合する１つ以上のＤＮＡ型ヌクレオチドを含み得、またその間のＤＮＡセグメント内には含まれていないＤＮＡ型ヌクレオチドをも含み得る。２つの相同性領域が、“異種領域”と呼ばれる標的遺伝子の配列とは異なる配列を有する領域により隔てられ、またそれぞれが隣接している。該異種領域は１個、２個または３個のミスマッチヌクレオチドを含み得る。ミスマッチヌクレオチドは隣接しているか、あるいは標的遺伝子と相同である１個または２個のヌクレオチドにより隔てられている。あるいは、異種領域は１個の挿入、または１個、２個、３個、または５個以下のヌクレオチドを含み得る。あるいは、混合二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、標的遺伝子の配列と、混合二本鎖オリゴヌクレオチドから１個、２個、３個、または５個以下のヌクレオチドが欠失した分だけ異なり得る。異種領域の長さと位置は、この場合、喩え混合二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが異種領域内にないとしても、欠失の長さであると思われる。２つの相同領域に相補性である標的遺伝子のフラグメント間の距離は、一つまたは複数の置換を意図する場合、異種領域の長さに一致させる。異種領域が挿入を含む場合、相同領域はそれによって混合二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、それらの相補性相同フラグメントが遺伝子にあるよりもさらに離れて隔てられ、その逆は異種領域が欠失をエンコードする場合に適用し得る。
【０１４４】
混合二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡセグメントはそれぞれ相同性領域、すなわち、標的遺伝子のフラグメントに配列が同一である領域、の一部であり、そのセグメントは共に、好ましくは少なくとも１３個のＲＮＡ型ヌクレオチド、そして好ましくは１６個ないし２５個のＲＮＡ型ヌクレオチド、またはさらにより好ましくは１８〜２２個のＲＮＡ型ヌクレオチド、または最も好ましくは２０個のヌクレオチドを含む。一実施態様において、相同性領域のＲＮＡセグメントは介在するＤＮＡセグメントにより隔てられ、また隣接している、すなわち、ＤＮＡセグメントにより“連結”されている。一実施態様において、異種領域の各ヌクレオチドは介在するＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。混合二本鎖オリゴヌクレオチドの異種領域を含む介在ＤＮＡセグメントは、“ミューテーターセグメント”と呼称される。
【０１４５】
本発明の別の実施態様において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異ベクター（ＳＳＯＭＶ）であり、このものは国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７、米国特許第６，２７１，３６０号、第６，４７９，２９２号、および第７，０６０，５００号（参照によりその全文を本明細書の一部とする）に開示されている。ＳＳＯＭＶの配列は、米国特許第５，７５６，３２５号；第５，８７１，９８４号；第５，７６０，０１２号；第５，８８８，９８３号；第５，７９５，９７２号；第５，７８０，２９６号；第５，９４５，３３９号；第６，００４，８０４号；および第６，０１０，９０７号および国際特許公開ＷＯ９８／４９３５０；ＷＯ９９／０７８６５；ＷＯ９９／５８７２３；ＷＯ９９／５８７０２；およびＷＯ９９／４０７８９に記載されている変異ベクターと同じ原理に基づいている。ＳＳＯＭＶの配列は、ミューテーター領域と呼称される所望の遺伝子改変を含む領域により隔てられた標的配列と相同である２つの領域を含む。ミューテーター領域は、標的配列の相同性配列を隔てる配列と同じ長さであるが異なる配列をもつ配列を有し得る。かかるミューテーター領域は置換を起こし得る。あるいは、ＳＳＯＭＶの相同性配列は互いに隣接し得るが、一方、同じ配列をもつ標的遺伝子の領域は、１個、２個またはそれ以上のヌクレオチドによって隔てられている。かかるＳＳＯＭＶはＳＳＯＭＶに欠けているヌクレオチドの標的遺伝子からの欠失を惹き起こす。最終的に、相同性領域に一致する標的遺伝子の配列は、標的遺伝子において隣接し得るが、ＳＳＯＭＶの配列において、１個または２個以上のヌクレオチドにより隔てられている。かかるＳＳＯＭＶは標的遺伝子配列において挿入の原因となる。
【０１４６】
ＳＳＯＭＶのヌクレオチドは、未修飾ホスホジエステル結合により連結されたデオキシリボヌクレオチドであるが、ただし、３'−末端および／または５'−末端ヌクレオチドの連結、あるいは２つの３'−末端および／または５'−末端ヌクレオチドの連結は、ホスホロチオアートまたはホスホアミデートであり得る。本明細書にて使用する場合、ヌクレオチドの連結はＳＳＯＭＶのヌクレオチド間の連結であり、３'−末端ヌクレオチドまたは５'−末端ヌクレオチド間の連結および保護置換基を含んでいない（上記参照）。具体的実施態様において、ＳＳＯＭＶの長さは２１個ないし５５個のデオキシヌクレオチドであり、相同性領域の長さは、従って、少なくとも２０個のデオキシヌクレオチドの合計の長さであって、少なくとも２つの相同性領域はそれぞれ少なくとも８個のデオキシヌクレオチドの長さをもつべきである。
【０１４７】
ＳＳＯＭＶは標的遺伝子のコーディングまたは非コーディングストランドに相補的であるように設計することができる。所望の変異が１個の塩基の置換である場合、ミューテーターヌクレオチドは双方がピリミジンであることが好ましい。所望の機能的結果を得ることと矛盾しない限り、該ミューテーターヌクレオチドと相補性ストランドの標的ヌクレオチドは共にピリミジンであることが好ましい。特に好適なのは、トランスバージョン変異をエンコードするＳＳＯＭＶ、すなわち、ＣまたはＴミューテーターヌクレオチドが、それぞれ相補性ストランドのＣまたはＴヌクレオチドとミスマッチしているＳＳＯＭＶである。
【０１４８】
オリゴデオキシヌクレオチドに加えて、ＳＳＯＭＶはリンカーを介して５'−末端炭素に付着する５'−保護置換基を含み得る。リンカーの化学的性質はその長さ以外あまり重要ではなく、その長さは少なくとも６個の原子の長さとすべきであり、リンカーは柔軟性に富むべきである。様々な非毒性の置換基は、例えば、ビオチン、コレステロールまたはその他のステロイド類または非インターカレーションカチオン性蛍光色素などが使用し得る。ＳＳＯＭＶ調製の試薬として特に好適なものは、グレン・リサーチ（スターリング、バージニア）がＣｙ３．ＴＭ．およびＣｙ５．ＴＭ．として販売される試薬であり、これらはオリゴヌクレオチドに取り込まれて、３，３，３'，３'−テトラメチルＮ，Ｎ'−イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニンをそれぞれ生成する保護ホスホロアミダイトである。Ｃｙ３が最も好適である。インドカルボシアニンがＮ−オキシアルキル置換されている場合、そのものは５'−末端リン酸エステルをもつホスホジエステルを介して、オリゴデオキシヌクレオチドの５'−末端に常套的に連結させ得る。該色素とオリゴデオキシヌクレオチド間の色素リンカーの化学的性質はそれ程問題ではなく、合成し易いように選択する。市販品として入手可能なＣｙ３ホスホルアミダイトをそのまま使用する場合、得られる５'−修飾は保護置換基とリンカーとからなり、それらはＮ−ヒドロキシプロピル、Ｎ'−ホスファチジルプロピル ３，３，３'，３'−テトラメチル インドモノカルボシアニンである。
【０１４９】
好適な実施態様において、インドカルボシアニン色素はインドール環の３および３'位でテトラ置換されている。理論的に限定されるものではないが、これらの置換は、色素がインターカレーションを受けることから色素を保護する。これらの位置として置換基を同定することは重要ではない。ＳＳＯＭＶはさらに３'保護置換基を有し得る。再度、３'保護置換基の化学的性質は重要ではない。
【０１５０】
修飾酵素
脂肪酸生合成経路に関与する酵素をエンコードする遺伝子は、変異の好適な標的である。一部の実施態様において、標的遺伝子はアシルＡＣＰチオエステラーゼをエンコードする。他の実施態様において、標的遺伝子はケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）をエンコードする。変異は、酵素活性を低下させるかまたは除去するように、または酵素活性を改変（例えば、基質選択性の変更）するように設計することができる。一部の実施態様においては、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を修飾する。ある種の実施態様においては、Δ１２デサチュラーゼをエンコードするＦＡＤ２遺伝子を標的として、リノレン酸（１８：３）およびリノール酸（１８：２）のレベルを低下させ、オレイン酸（１８：１）のレベルを上昇させる。
【０１５１】
本発明の特定の実施態様においては、未変性のアシルＡＣＰチオエステラーゼを変異させる。一例においては、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）のアシルＡＣＰチオエステラーゼは、配列番号２（SEQ ID NO:2）のアミノ酸残基９１〜３９７に相当する領域を変異させる。好適な実施態様においては、１つ以上の変異が配列番号２のアミノ酸残基１２８〜１４７、配列番号２のアミノ酸残基１７５〜２０６、配列番号２のアミノ酸残基２５４〜２９７、配列番号２のアミノ酸残基３３３〜３３５、または配列番号２のアミノ酸残基３６５〜３９７に相当する領域の位置に存在する。
【０１５２】
本発明の他の実施態様においては、未変性のケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）酵素を変異させる。一例において、ＫＡＳ酵素はＫＡＳII酵素であり、配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３８５に相当する領域で変異させる。好適な実施態様においては、１つ以上の変異が配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３５２または配列番号３のアミノ酸残基３５５〜３８５に相当する領域の位置に存在する。より好適な実施態様において、１つ以上の変異が配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３４０またはさらに配列番号３のアミノ酸残基３３１〜３３７に相当する領域に存在する。一部の実施態様において、配列番号３の３３７位置の保存ロイシン残基に相当するアミノ酸が変異を受けている。特定の実施態様においては、配列番号３の３３７位置の保存ロイシン残基に相当するアミノ酸が変異を受け、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまたはヒスチジンとなっている。他の実施態様においては、配列番号３の３３１位置の保存フェニルアラニン残基に相当するアミノ酸が変異を受ける。ある種の実施態様においては、配列番号３の３３１位置の保存フェニルアラニン残基に相当するアミノ酸が変異を受け、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、システイン、またはバリンとなる。
【０１５３】
遺伝子修復オリゴヌクレオベースの植物細胞への送達
植物細胞を遺伝子修復オリゴヌクレオベースで形質転換する本発明方法においては、一般に知られるいずれの方法も使用し得る。例示される方法は、マイクロキャリヤーまたはマイクロファイバー、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションの使用であり、以下に記載のとおりである。
【０１５４】
一部の実施態様において、金属マイクロキャリヤー（微粒子）はセルロース細胞壁をもつ植物細胞にＤＮＡの大きなフラグメントを発射貫通（バイオリスティック（Biolistic）送達）により導入するために使用するもので、関連技術分野の当業者に周知である。マイクロキャリヤーを選択する一般的技法およびそれらを発射する装置については、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，１００，７９２号；および第５，２０４，２５３号に記載されている。
【０１５５】
本発明の方法においてマイクロキャリヤーを使用するための具体的な条件については、国際特許公開ＷＯ９９／０７８６５、ＵＳ０９／１２９，２９８に記載されている。例えば、氷冷マイクロキャリヤー（６０ｍｇ／ｍＬ）、混合二本鎖オリゴヌクレオチド（６０ｍｇ／ｍＬ）、２．５Ｍ−ＣａＣｌ2および０．１Ｍスペルミジンをこの順序で加える；混合物を緩やかに、例えば、ボルテックスにより１０分間かき混ぜ、室温で１０分間放置し、次いで直ちにマイクロキャリヤーを５倍容量のエタノールに希釈し、遠心分離し、１００％エタノールに再懸濁する。例示として、粘着性溶液中の成分濃度は、８〜１０μｇ／μＬのマイクロキャリヤー、１４〜１７μｇ／μＬの混合二本鎖オリゴヌクレオチド、１．１〜１．４Ｍ−ＣａＣｌ2および１８〜２２ｍＭスペルミジンを含有する。一例において、該成分濃度は、８μｇ／μＬのマイクロキャリヤー、１６．５μｇ／μＬの混合二本鎖オリゴヌクレオチド、１．３Ｍ−ＣａＣｌ2および２１ｍＭスペルミジンである。
【０１５６】
遺伝子修復オリゴヌクレオベースはまた、本発明実施のためにマイクロファイバーを用いて植物細胞に導入させ、細胞壁と細胞膜を貫通させる。コフィー（Coffee；米国特許第５，３０２，５２３号）は、ブラック・メキシコ・スイートコーンの懸濁トウモロコシ培養株の形質転換を容易にするために、３０×０．５μｍおよび１０×０．３μｍのシリコンカーバイドファイバーを使用することについて記載している。マイクロファイバーを用いる植物細胞の形質転換のためには、ＤＮＡの導入に使用し得る機械技法が、遺伝子修復オリゴヌクレオベースの送達に使用し得る。
【０１５７】
遺伝子修復オリゴヌクレオベースのマイクロファイバー送達の一例は、以下のとおりである。無菌のマイクロファイバー（２μｇ）を、約１０μｇの混合二本鎖オリゴヌクレオチドを含む植物培養培地１５０μＬに懸濁する。懸濁培養液を静置し、等容積のパック細胞と無菌ファイバー／ヌクレオチド懸濁液を１０分間ボルテックス処理し、プレートに播く。選択培地は、直ちに適用するか、または特定の形質にとって適切である場合、約１２０時間までの遅れで適用する。
【０１５８】
替わりとなる実施態様において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースは植物の部分に由来するプロトプラストのエレクトロポレーションにより、植物細胞に送達し得る。プロトプラストは当業者周知の技法に従って、植物の部分、特に葉を酵素処理することにより形成させる。（参照：e.g., Gallois et al., 1996, Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp et al., 1999, Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, N.J.）。プロトプラストはエレクトロポレーションの前に、増殖培地にて培養する必要がない。エレクトロポレーションの例証としての条件は、総容量０．３ｍＬ中、３×１０5個のプロトプラストであり、その場合の遺伝子修復オリゴヌクレオベースの濃度は０．６〜４μｇ／ｍＬである。
【０１５９】
さらに別の替わり得る実施態様において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースは植物細胞のホイスカー（whiskers）またはマイクロインジェクションにより植物細胞に送達することができる。いわゆるホイスカー技法については、文献（Frame et al., 1994, Plant J. 6:941-948）に記載されたとおりに実質的に実施される。遺伝子修復オリゴヌクレオベースをホイスカーに加え、それを使用して植物細胞を形質転換する。遺伝子修復オリゴヌクレオベースは、植物細胞中でリコンビナーゼおよび／または遺伝子修復複合体を形成し得るタンパク質をエンコードする配列からなるプラスミドと同時培養するとよい；その結果、遺伝子修復がオリゴヌクレオチドと標的遺伝子中の標的配列の間で触媒される。
【０１６０】
修飾酵素を有する植物の選択
修飾酵素を発現する植物または植物細胞は、多くの手段のいずれかを介して同定することができる。一方法において、同時変換戦略は、同じ実験において選択可能な変換（すなわち、マーカー）および非選択性変換（例えば、対象の標的遺伝子）の両方を標的とするために、遺伝子修復オリゴヌクレオベース（ＲＯＮ）を使用する。例えば、カノーラ中のＡＬＳ（またはＡＨＡＳ）遺伝子は、１個のアミノ酸変化により修飾して、インビトロで、イミダゾリノン（ＩＭＩ）分類の除草剤に対し、（遺伝子変換を介して）耐性を提供し得る。ＡＬＳ遺伝子と他の標的遺伝子／対立遺伝子の変換を標的とし、生成するＩＭＩに対し再生するカルスを選択する遺伝子修復オリゴヌクレオベースを同時に送達することで、変換適格個体群を同定する。この方法においては、ＲＯＮが送達されなかった、またはＲＯＮにより特定された変換を伝達し得なかった細胞が排除されよう。関与していない遺伝子を標的とするＲＯＮの送達は選択的であるとは期待されないので、ある頻度で、ＡＬＳ変換を有する再生カルスは、他の標的遺伝子の一つにおいて変換を示すことが期待される。変換事象は一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析により解明し得よう。
【０１６１】
このように、ゲノムＤＮＡは、変換適格と見做されたプロトプラストから再生させた個々の植物からの葉部材料から抽出し、個々のＤＮＡサンプルは、各標的についてのＳＮＰ検出技法、例えば、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳＰＣＲ）により検出する。各標的についての推定陽性の植物を硬化させ、土壌に移す。陽性植物の配列変化を独立して確認するために、標的遺伝子の適切な領域をＰＣＲ増幅し、得られるアンプリコンを直接配列決定するか、またはクローン化して多重挿入断片を配列決定する。多重変化が同じ遺伝子でなされている場合、変換体は、標的遺伝子から変換したＡＬＳ耐性遺伝子の分離を可能とするその親株に戻し交配する。
【０１６２】
別法として、変異の対象遺伝子への取り込みは、抽出した核酸中の一ヌクレオチド変異を検出するために設計された多くの分子生物学技法のいずれかによって同定することができる（例えば、ＰＣＲおよび一ヌクレオチドプライマー伸張分析法などの増幅方法）。より大きな変異は、変異すべき標的遺伝子の領域を増幅し、配列決定することにより検出し得る。
【０１６３】
別法として、修飾酵素を含む植物または植物細胞は、例えば、該植物が産生した脂肪酸の組成を分析することにより同定することができる。従って、該植物を成長させて、油を抽出し、当該技術分野にて既知の方法（例えば、ガスクロマトグラフィー）により分析することができる。
【０１６４】
２種のチオエステラーゼ導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生産
中鎖脂肪酸の長さの異なるアシル基質に優先性を有するチオエステラーゼをエンコードする２種の導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、当該技術分野で周知の方法により生成させ得る。
【０１６５】
このように、植物チオエステラーゼは様々な起源から入手することができる。有意な量の中鎖脂肪酸を産生する植物は、中鎖優先性植物チオエステラーゼをエンコードするＤＮＡ配列の好適な供給源である。例えば、クフェア属の幾つかの種は、その種子中に中鎖脂肪酸を含むトリグリセリドを蓄積する（例えば、プロカンベンズ（procumbens）、ルテア（lutea）、フッケリアナ（hookeriana）、ハイソピフォリア（hyssopifolia）、ライチイ（wrightii）およびインフラタ（inflata））。さらに、ニレ（Ulmus americana）が有意な中鎖脂肪酸を含むことが示されている。さらに、クスノキ科（Lauraceae）の一員、例えば、ピサ（Pisa）（Actinodophne hookeri）、ゲッケイジュ（Laurus nobilis）、およびカリフォルニアベイ（Umbellularia californica）が中鎖脂肪酸を含む種子を産生する。さらなる供給源は、ニクズク科（Myristicaceae）、ニガキ科（Simarubaceae）、ボキシア科（Vochysiaceae）、およびサルバドラ科（Salvadoraceae）、およびエリスマ（Erisma）、ピクラムニア（Picramnia）およびビロラ（Virola）の多雨林種であり、これらはＣ１４脂肪酸を蓄積すると報告されている。中鎖優先チオエステラーゼを貯留する植物の幾つかの例とそれらの好適な基質を表１に示す。
【０１６６】
【表１】
【０１６７】
その他の植物もまた特定の脂肪酸アシル鎖長に優先性を有する所望のチオエステラーゼの供給源となり得る。かかるさらなる植物チオエステラーゼは、種々植物油のトリアシルグリセリド組成物を分析することにより同定し得る。特異的チオエステラーゼの存在は、適切なアシル−ＡＣＰ基質を用いるアッセイにより確認し得る。例えば、Ｃ１０−優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼについてのアッセイは、国際公開ＷＯ９１／１６４２１に記載されており、かかる分析に使用することができる。
【０１６８】
対象の植物チオエステラーゼをエンコードするＤＮＡ配列を含む植物発現構築物は、多様な植物において、取分け、食用および工業用の植物油の生産に利用される植物において使用し得る。好適な植物は油料種子作物であり、限定されるものではないが、ナタネ（カノーラおよび高エルシン酸品種）、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、クフェア、ダイズ、ラッカセイ、ヤシの実と油料パーム、およびトウモロコシなどを包含する。
【０１６９】
宿主細胞が植物細胞である発現構築物は、植物中で機能的である調節領域（例えば、プロモーターおよびターミネーター領域）を含む。従って、得られるトランスジェニック植物にて発現するべきタンパク質をエンコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、未変性遺伝子に見出されるプロモーターなど、転写開始調節領域またはプロモーターにその５'末端で結合する。多数の他の転写開始領域が利用可能であり、それらは構造遺伝子機能の多様な構成的または誘導的転写を提供する。植物について使用する転写開始領域の中には、ＣａＭＶ ３５Ｓおよびノパリンおよびマンノピンシンターゼに対してなどの構造遺伝子と関連する、またはナピン、ＡＣＰプロモーターなどと関連する領域が存在する。かかる構造遺伝子に相当する転写／翻訳開始領域は、それぞれの開始コドンの５'上流直近に見出される。対象の植物宿主に本来存在するプロモーターまたは修飾プロモーターなど、すなわち一遺伝子起源に由来する転写開始領域または異なる遺伝子起源に由来する翻訳開始領域を有するプロモーター、対象の植物チオエステラーゼをエンコードする配列を含むプロモーター、または増強プロモーター、例えば、二重３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターなど、ある種のプロモーターを所望する場合、標準的技法により当該配列を一緒に結合し得る。植物中に中鎖チオエステラーゼの発現を望む殆どの適用の場合、種子特異的プロモーターの使用が好ましい。さらに、組換え構築物を宿主細胞に導入する方法によっては、発現構築物中にさらなる成分が必要とされ得る。例えば、形質転換細胞用の選択マーカーをエンコードするＤＮＡを、発現構築物に含み得る。従って、該構築物は、細胞傷害剤（例えば、抗生物質、重金属、毒素など）に対する耐性、栄養要求性宿主に原栄養体を提供する補完性、ウイルス免疫性などを提供し得る。異なる宿主種の数によっては、発現構築物またはその成分を導入し、１種以上のマーカーが採用されるが、その場合、選択のための異なる条件を異なる宿主に使用する。
【０１７０】
種々の植物形質転換法が当該技術分野において周知である。例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）感染、マイクロインジェクション、ＤＮＡ粒子衝撃、およびエレクトロポレーションを経由する形質転換が一般に使用される。さらに、新規方法として作物を形質転換することが利用可能であり、かかる方法も使用し得る。植物の形質転換の例は米国特許第５，６６７，９９７号に見出し得る。
【０１７１】
１つを超える導入遺伝子を発現するためには、発現構築物を各導入遺伝子について生成させ得る。次いで、植物を、第一の導入遺伝子と植物選択性マーカーを含有してなる第一の発現構築物で形質転換する。選択培地上で成長させた再生体は、例えば、ウエスタンブロッティング法により導入遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。導入遺伝子を発現する植物は成熟するまで成長させ、種子を定着させて、そこから第二世代の植物を生成させる（Ｔ２）。
【０１７２】
Ｔ２世代は二回目の形質転換に使用するが、その際、第二の導入遺伝子および第二の植物選択性マーカーを含んでなる第二発現構築物を使用する。（植物選択性マーカーの除去または不活性化の方法は当該技術分野にて既知である；例えば、ＷＯ９２／０１３７０に開示されているように）。再生体は選択培地上で成熟するまで成長させ、種子を定着させ、そこから次世代の植物を生成させる（Ｔ３）。Ｔ３世代を野生型植物に比較して、中鎖脂肪酸の増加についてスクリーニングする。
【０１７３】
中鎖脂肪酸とモノ不飽和脂肪酸の所望のバランスをもつ油を含む遺伝的に修飾した植物の生成
一部の実施態様において、リノレン酸（１８：３）およびリノール酸（１８：２）のレベル低下並びにオレイン酸（１８：１）のレベル上昇は、Δ１２デサチュラーゼ（ＦＡＤ２遺伝子）の発現または活性を低下させることにより、遺伝的に修飾した植物において達成させる；好ましくは、標的とするＦＡＤ２遺伝子は、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、クフェア、またはトウモロコシＦＡＤ２遺伝子である。好適な実施態様において、ＦＡＤ２の発現または活性は、遺伝子のコード配列にストップコドンを創出するか；またはヌクレオチドを欠失もしくは付加させて、フレームシフト変異を創出することにより低下させる。
【０１７４】
ある種の好適な実施態様においては、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を遺伝的に修飾した植物において修飾し、パルミトレン酸（Ｃ１６：１）および／またはオレイン酸（１８：１）のレベルを上昇させる；好ましくは、遺伝的に修飾した植物は、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、クフェア、およびトウモロコシからなる群より選択される。ある種の好適な実施態様において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現または活性は、モノ不飽和脂肪酸の産生増大を促進し、飽和脂肪酸を減少させるために増大させる；より好ましくは、遺伝的に改変した植物において、Ｃ１６：１および／またはＣ１８：１のレベルを未変性の植物に比べて増大させ、Ｃ１６：０および／またはＣ１８：０のレベルを低下させる。他の実施態様において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、遺伝的に修飾した植物がＣ１６：１のレベルを上昇させて産生するように修飾する。ある種の実施態様において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、パルミトイル−ＡＣＰにより活性の上昇を示すように修飾する。参照例：Cahoon, E. B. およびShanklin, J, 2000,“植物種子油の代謝エンジニアリング用脂肪酸デサチュラーゼ変異体を選択するための基質依存変異体相補性”, Proc. Nat. Acad. Sci. 97(22): 12350-12355。関連する実施態様において、Ｃ１６：０の産生増大は、マカダミア（Macadamia integrifolia）、グミの１種（sea buckthorn；Hippophae rhamnoides）またはウングイスカティ（Doxantha unguis-cati）からのΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子でナタネを形質転換することにより達成される。ある種の実施態様において、ＫＡＳII遺伝子の活性または発現は、１８：１および１６：１脂肪酸のさらにより高いレベルを達成するために、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子の修飾に加えて、本明細書に開示した方法により低下させる；より好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物のＰＴＥ酵素もまた、本明細書に開示するように修飾して、短鎖脂肪酸のレベルを上昇させ産生させる；より好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物のΔ１２デサチュラーゼもまた、低下した活性または発現を有するように修飾する。
【０１７５】
ある種の好適な実施態様において、植物（好ましくは、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、またはトウモロコシ植物）は遺伝的に修飾して、本明細書に開示するように、短／中鎖脂肪酸のレベルを以下のように上昇させる；（１）パルミトイルチオエステラーゼ（ＰＴＥ）の基質特異性を改変して、カプリロイル−ＡＣＰ（Ｃ８）、カプロイルーＡＣＰ（Ｃ１０）、およびラウロイル−ＡＣＰ（Ｃ１２）により活性を上昇させるか、または短鎖長特異性をもつ、クフェア、ココヤシ、ヤシ、ババスヤシ、ブラジル産ホンダヤシ（Astrocaryum vulgare）、ニレ（Ulmus Americana）、ニホンケヤキ（Zelkova serrata）またはカリフォルニアベイ（Umbellularia californica）からのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子で形質転換する；および（２）ＫＡＳII遺伝子の活性を低下させる。ある種の好適な実施態様において、植物は、ＰＴＥおよび／またはＫＡＳII遺伝子を本明細書に開示するように改変することにより、短／中鎖脂肪酸のレベルが上昇するように遺伝的に修飾する；また、さらに、Δ１２デサチュラーゼの発現または活性を低下させることにより、ポリ不飽和脂肪酸のレベルが低下（好ましくは、Ｃ１８：２およびＣ１８：３のレベル低下）するように修飾する；より好ましくは、該植物はさらにΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を修飾してパルミトレン酸（Ｃ１６：１）および／またはオレイン酸（１８：１）のレベルを上昇させ、Ｃ１６：０および／またはＣ１８：０のレベルを低下するように修飾する。
【０１７６】
脂肪酸メチルエステルの予測される融点の計算
脂肪酸メチルエステル配合物の予測される融点ＰTmは、配合物１００ｇ当たりの重量で表わす各脂肪酸メチルエステルの量および以下の等式を用いて算出する。
PTm = [A(-71.0)(10.0) + B(-40.0)(4.5) + C(-18.0)(1.2) + D(5.2)(1.0) + E(19.0)(0.60) + F(30.7)(1.35) + G(37.8)(2.15) + H(-19.9)(1.10) + I(-35.0)(0.65) + J(-57)(0.2) + K(54.5)(10.0) + L(53.0)(2.0) + M(57.4)(2.0)]*(0.01)
Ａは配合物中のカプロン酸ＭＥ（６：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｂは配合物中のカプリル酸ＭＥ（８：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｃは配合物中のカプリン酸ＭＥ（１０：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｄは配合物中のラウリン酸ＭＥ（１２：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｅは配合物中のミリスチン酸ＭＥ（１４：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｆは配合物中のパルミチン酸ＭＥ（１６：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｇは配合物中のステアリン酸ＭＥ（１８：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｈは配合物中のオレイン酸ＭＥ（１８：１）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｉは配合物中のリノール酸ＭＥ（１８：２）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｊは配合物中のリノレン酸ＭＥ（１８：３）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｋは配合物中のアラキドン酸ＭＥ（２０：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｌは配合物中のベヘン酸ＭＥ（２２：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；および
Ｍは配合物中のリグノセリン酸ＭＥ（２４：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である。
【０１７７】
一部の実施態様においては、予測される融点を用いて、バイオディーゼルとしての使用に適する配合物を同定し得る。これらの実施態様において、予測される融点をカットオフ値と比較する（すなわち、バイオディーゼルとしての所望の融点）。カットオフ値未満またはそれに等しい予測融点を有する配合物は、バイオディーゼルとしての使用に適している。
【０１７８】
以下の実施例は本発明を説明するためのものである。これらの実施例は決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例１】
【０１７９】
脂肪酸メチルエステル配合物１
下記の表に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する脂肪酸メチルエステル配合物（“配合物１”）は、下記表に提示した容量を用いて脂肪酸メチルエステルを共に混合し、１００ｇとして配合物１を調製する。
【表２】
【０１８０】
配合物１の予測融点ＰTmは、本発明方法により算出した場合、−４１．６℃である。
【実施例２】
【０１８１】
脂肪酸メチルエステル配合物２
下記の表に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する脂肪酸メチルエステル配合物（“配合物２”）は、下記表に提示した容量を用いて脂肪酸メチルエステルを共に混合し、１００ｇとして配合物２を調製する。
【表３】
【０１８２】
配合物２の予測融点ＰTmは、本発明方法により算出した場合、−２４．３℃である。
【実施例３】
【０１８３】
脂肪酸メチルエステル配合物３
下記の表に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する脂肪酸メチルエステル配合物（“配合物３”）は、下記表に提示した容量を用いて脂肪酸メチルエステルを共に混合し、１００ｇとして配合物３を調製する。
【表４】
【０１８４】
配合物３の予測融点ＰTmは、本発明方法により算出した場合、−１５．０℃である。
【実施例４】
【０１８５】
脂肪酸メチルエステル配合物４
下記の表に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する脂肪酸メチルエステル配合物（“配合物４”）は、下記表に提示した容量を用いて脂肪酸メチルエステルを共に混合し、１００ｇとして配合物４を調製する。
【表５】
【０１８６】
配合物４の予測融点ＰTmは、本発明方法により算出した場合、−１１．９℃である。
【実施例５】
【０１８７】
油配合物Ａ
下記に示す脂肪酸組成を有する２種の油の配合物（“配合物４”）は、下記に示す脂肪酸組成を有するココヤシ油とクフェア・ラセオラタ（Cuphea lanceolata）油を共に混合することにより調製する。
【表６】
【０１８８】
配合物Ａは７５重量％の上記ココヤシ油と２５重量％の上記クフェア・ランセオラタ油とを混合することにより調製し得る。クフェア・ランセオラタ油２５ｇ（２５ｇ／０．９２ｇ／ｍｌ＝２７．２ｍＬ）は７５ｇのダイズ油（７５ｇ／０．９２４ｇ／ｍＬ＝８１．２ｍＬ）と組合わせて１００ｇの配合物Ａとする。
【実施例６】
【０１８９】
油からＦＡＭＥへの変換
様々なタイプの市販植物油（ダイズ、カノーラ、トウモロコシ、マカダミア、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、クルミ、ヤシ、ココヤシ、およびヒマシ油を含む）は小売先から入手した。各油２００ｇをガラス製スクリューキャップ式瓶に秤量し、２倍容量（ｗ／ｖ）のナトリウムメトキシド試薬（５％ｗ／ｖナトリウムメトキシド／メタノール）と組合わせた。室温で２時間混合した後、ヘキサン５０ｍｌを加え、激しく混合し、相分離させた。低部グリセロール含有層を除き、廃棄した。上層部はロータリーエバポレーター中、減圧下に処理し、ヘキサンと残余の揮発成分を除去した。ＦＡＭＥの最終溶液を窒素ガス下、しっかりとキャップをしたガラス瓶に室温で保存した。
【実施例７】
【０１９０】
脂肪酸からＦＡＭＥへの変換
様々な脂肪酸、または脂肪酸の混合物１００グラムをガラス瓶に秤量し、２００ｍｌの無水メタノール／１％硫酸と組合わせた。各混合物を窒素ガスで蔽い、容器にしっかりと蓋をした。反応容器を５０℃のインキュベーターオーブン中に４時間置いた。インキュベーションの間、混合物を時々振盪して反応物を混合した。混合物をガラス製分液漏斗に移し、１００ｍｌの５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液を加えた。混合物を激しく振盪し、静置して相分離した。低部水層を除去廃棄した。上層を清浄な乾燥瓶に移し、５ｇの無水硫酸ナトリウムと組合わせた。この混合物を目視し得るすべての水滴が除かれるまで激しく振盪した。次いで、この混合物をワットマン１濾紙により濾過した。硫酸ナトリウムと濾過装置をヘキサンで洗い、追加のＦＡＭＥを回収し、洗液を非水性フラクションに加えた。合併した濾液と洗液をロータリーエバポレーターに容れ、減圧下でヘキサンと残余の揮発性分を除去した。ＦＡＭＥの最終溶液を褐色のガラス瓶に移し、窒素ガスで蔽い、テフロン（登録商標）内張りしたキャップでしっかりと蓋をし、４℃で保存した。他のエステルについては、上で用いたメタノールの代わりに、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、またはｔ−ブタノールに置き換えるプロトコールに従って合成した。
【実施例８】
【０１９１】
アルキルエステル混合物の低温試験
アルキルエステルおよびエステル混合物の低温での性質は、上記の油または脂肪酸から得られた純アルキルエステルまたはエステル混合物の一部をピペットで採取し、１０ｍｍ×１００ｍｍのガラス試験管に容れ、最終容量１．０ｍｌとして試験した。試験管はポリプロピレンスナップキャップで蓋をし、樹脂ラックに容れた。次いで、ラックに容れた試験管をサンプルの頂部の上、１〜２ｃｍの深さまで、５０％エチレングリコール／水の冷却溶液に沈めた。一連の水浴を用いて、連続的に試験サンプルを０、−１０、−１５、−２０、および−２５℃とした。サンプルをその試験温度に１時間保持し、各試験管を引き出して、曇りの存在、固化、および流動／流れ特性について試験した。さらに、選択したサンプルを独立した試験研究所（インターテック−カレブ−ブレット（Intertek-Caleb-Brett）ラボラトリーズ）に送り、ディーゼル燃料に適切なＡＳＴＭ標準法（ＡＳＴＭ Ｄ−９７−０６、ＡＳＴＭ Ｄ−２５００−０５、およびＡＳＴＭ Ｄ６３７１）を用いて、流動点、曇り点、および低温フィルタープラッギングについて評価した。エステルおよびエステル混合物の曇り点は、ポータブル型ディーゼル燃料曇り点分析計モデルＣＰＡ−Ｔ３０（フェーズ・テクノロジー・コープ）によっても測定した。１０ｍｌ容量の樹脂シリンジをエステルまたはエステル混合物で満たし、該装置に注入した。１０分後に、装置は正確な曇り点温度読取値を与えた。
【実施例９】
【０１９２】
Ｂ１００種子油および＃２ディーゼルの融点
一連のＢ１００バイオディーゼル流体（脂肪酸アルキルエステル）は、植物油、例えば、ダイズ、カノーラ、トウモロコシ、マカダミア、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、クルミ、ヤシ、ココヤシ、およびヒマシ油などから、実施例６に記載した手順に従って調製した。これらの燃料は、低温流動性について、実施例８に記載した手順に従って、市販品として入手した石油系ディーゼル＃２（シェル・オイル（株）、サンディエゴ、カリフォルニア）と比較した。＋２０℃と−２０℃の間の色々な温度で各流体をインキュベートしたときの効果を下記表に示す；この表は該流体が所定の温度で１時間インキュベートした後に液体であったか、または固体であったかを示す（流動点）。ディーゼル燃料は−１５℃まで液体のままであったが、−２０℃では１時間後に固体であった。対照的に、植物油に基づく脂肪酸メチルエステルは相当により低い温度で固化した。パーム油メチルエステルは＋５℃で固体であった。最良に機能する植物油に基づくエステルはカノーラとヒマのものであったが、共に−１５℃で固体であった。このように、植物油メチルエステルのいずれもが、−２０℃未満の曇り点のディーゼル燃料または標的に等しい低温度性をもたなかった。
【表７】
【実施例１０】
【０１９３】
ダイズおよびカノーラＢ１００の融点を低下させるＣ８およびＣ１０ＦＡＭＥ
植物油由来メチルエステルの低温度での性質は、短鎖脂肪酸メチルエステルの添加により改善された。ダイズ油メチルエステルは−１０℃で固体であった。ダイズ油メチルエステルに３０％（ｖ／ｖ）のＣ８メチルエステル（オクタン酸メチル）を加えた場合、その混合物は−１０℃で液体のままであった。Ｃ８メチルエステルを６０％（ｖ／ｖ）に増加した場合、混合物は−２０℃で液体のままであった。Ｃ１０メチルエステル（デカン酸メチル）の添加は、ダイズ由来のメチルエステルの流動点に対し、同一の効果を示した。カノーラ油由来のメチルエステルの低温度性能もまた、短鎖メチルエステルの添加により改善された。４０％のＣ８メチルエステルをカノーラメチルエステルに加えると、観測される流動点は−２０℃に低下した。Ｃ１０メチルエステルのカノーラへの添加は、観測される流動点に対し同様の効果を示した。カノーラまたはダイズメチルエステルにＣ８／Ｃ１０エステルの混合物を添加しても、混合物の流動点を低下させた。
【表８】
【実施例１１】
【０１９４】
種々の全油Ｂ２−Ｂ１００バイオディーゼル配合物の融解性
ディーゼル燃料と植物油由来メチルエステルとの混合物についてもまた低温度での性質について試験した。ディーゼル燃料は、２％（Ｂ２）、５％（Ｂ５）、２０％（Ｂ２０）（ｖ／ｖ）植物油由来メチルエステルと、純植物油由来メチルエステル（Ｂ１００）と共に試験した。植物油由来メチルエステルをディーゼル燃料に添加しても、Ｂ２０配合物を除き、混合物の流動点に観察し得る効果はなかった。カノーラ、ヒマおよびダイズはＢ２０流動点に効果を示さなかったが、一方、トウモロコシ、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、ヤシ、およびココヤシは、すべて純ディーゼル燃料に比べて、Ｂ２０配合物の観察される流動点を上昇させた。
【表９】
【実施例１２】
【０１９５】
融点に対する長鎖飽和体の効果
脂肪酸メチルエステルについて、上に詳述した低温度性能につき試験した。下記図表はＣ１８：１メチルエステル（オクタデセン酸メチル）に長鎖飽和脂肪酸を加える効果を示す。純Ｃ１８：１メチルエステルは−２０℃で液体であるが、Ｃ１８：０オクタデカン酸メチルを添加すると、混合物中に存在するＣ１８：０が２％と僅かであっても、観察される流動点を＋５℃も上昇させる；１％Ｃ１８：０では、混合物の流動点は０℃である。同様に、Ｃ１８：１とのＣ１６混合物は劇的に流動点を上昇させる。９％（ｖ／ｖ）Ｃ１６メチルエステル（ヘキサデカン酸メチル）と９１％Ｃ１８：１との混合物は、−５℃で固体であった。Ｃ１６：０が３％と少ない場合でも、−１５℃で固体となった。Ｃ１４：０メチルエステル（テトラデカン酸メチル）は、１％という低濃度で、−２０℃で固体を生じ、３０％Ｃ１４：０は−１０℃で固体であった。Ｃ１２：０（ドデカン酸メチル）との混合物は、興味深い予期せぬ結果を提供した。１％ないし５％のＣ１２レベルで、混合物は−２０℃で固体であったが、Ｃ１８：１との６％ないし２０％のＣ１２混合物は−２０℃で液体のままであった。従って、バイオディーゼル中、６〜２０％の、またはより好ましくは６〜１０％のＣ１２：０の存在は、低温流動性に対して驚くほど有益な作用を示す。このように、長鎖飽和ＦＡＭＥがＣ１８：１との混合物の流動点を有意に上昇させる一方、Ｃ１４はその効果が相当に小さく、Ｃ１２は２０％（ｖ／ｖ）までの濃度で殆ど効果を示さなかった。
【表１０】
【実施例１３】
【０１９６】
遺伝的に修飾したナタネ植物
ナタネ植物について、本明細書にて考察したように、中鎖脂肪酸とモノ不飽和脂肪酸との所望のバランスをもつ油を生成するように遺伝的に修飾する；すなわち、ナタネ植物を遺伝的に修飾して、相対的に上昇した短鎖／中鎖脂肪酸；相対的に上昇したレベルのモノ不飽和Ｃ１６：０およびＣ１８：０脂肪酸；および相対的に減少したレベルのポリ不飽和Ｃ１８：２およびＣ１８：３脂肪酸を有するようになる。以下の遺伝的修飾を実施する：（１）ＦＡＤ２遺伝子のコーディング配列にストップコドンを導入する遺伝子修復オリゴヌクレオチドベースを用いてΔ１２デサチュラーゼの活性を低下させ、リノレン酸（１８：３）およびリノール酸（１８：２）のレベルを低下させ、同様にオレイン酸（１８：１）のレベルを上昇させる；（２）マカダミア（Macadamia integrifolia）からのΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子でナタネ植物を形質転換することにより、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子の活性を修飾して、パルミトレン酸（１６：１）のレベルを上昇させる；（３）遺伝子修復オリゴヌクレオチドベースを用いてストップコドンをＫＡＳII遺伝子のコーディング配列に導入することによりケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳII）の活性を低下させる；（４）パルミトイルチオエステラーゼ（ＰＴＥ）の基質特異性は、カプリロイル−ＡＣＰ（Ｃ８）、カプロイル−ＡＣＰ（Ｃ１０）、およびラウロイル−ＡＣＰ（Ｃ１２）により活性が上昇し、結果として、短い鎖長特異性を有するクフェア・アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子でナタネ植物を形質転換して、短鎖および中鎖脂肪酸のレベルが上昇するように改変する。遺伝的に修飾したナタネ植物は以下の脂肪酸組成を有する油を産生する：Ｃ８は油の約５％を占める；Ｃ１０は油の約５％を占める；Ｃ１２は油の約１５％を占める；Ｃ１６：１およびＣ１８：１は共に油の約７０％を占める；そしてＣ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２およびＣ１８：３はそれぞれが油の１％未満を占める。該油のメチルエステルは約−２０℃で液体である。
【実施例１４】
【０１９７】
曇り点に対するアルキル−エステル化の効果
種々の脂肪酸（Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４およびＣ１８）は、実施例７に記載した一般的プロトコールを用いて、アルキルエステル（メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、またはイソプロピルエステル）に変換し、脂肪酸アルキルエステルの曇り点を評価した。これらの実験結果を図７に示す。予測されるように、各タイプのアルキルエステルについて、長鎖脂肪酸は短鎖脂肪酸よりもより高い曇り点を示した（すなわち、Ｃ８＜Ｃ１０＜Ｃ１２＜Ｃ１４＜Ｃ１８）。長鎖脂肪酸。驚くべきことに、各タイプの脂肪酸について、イソプロピルエステル脂肪酸が、他のタイプのアルキルエステル化脂肪酸に比べて、最も高い曇り点を示した。イソプロピルエステル化脂肪酸以外に、より長い鎖のエステルは一般に短い鎖のアルキルエステルよりも低い曇り点を示した（すなわち、メチルエステル＞エチルエステル＞ｎ−プロピルエステル＞ｎ−ブチルエステル）。従って、これらの実験に基づき、ｎ−ブチルエステルがバイオディーゼルにとって最も好ましい低温流動性を示し、イソプロピルエステルがバイオディーゼルにとって最も好ましからざる低温流動性を示す。さらに、直鎖のアルキルエステルが、対応する分枝鎖アルキルエステルに比較して、より好適な低温流動性を示す。
【０１９８】
他に特に断りのない限り、本明細書にて使用する技術的および科学的用語は、すべて本発明の属する技術分野の通常の技能を有する者が共通して理解する意味と同じ意味を有する。
【０１９９】
本明細書に記載し、説明した本発明は、いずれかの構成要素または限定がなく、本明細書に具体的に開示されていなくても、適切に実施し得るものである。従って、例えば、用語“含んでなる”、“包含する”、“含有する”などは包括的に、限定なしに読み取るべきものである。さらに、本明細書にて使用する用語および表現は、説明の手段であって、限定の手段ではなく、かかる用語および表現を用いて、開示し記載した特徴またはその一部と同等のものを除外しようとするものではないが、本発明の特許請求の範囲内で多様な変更態様が可能であることは明確に理解される。
【０２００】
従って、理解すべきことは、本発明が好適な実施態様および本発明の最適の特徴により具体的に開示されているとしても、本明細書に具体的に記載開示されている変更態様、改善および変動は当業者が頼りとし得るものであること、またかかる変更態様、改善および変動は本発明の範囲内のものであることである。ここに提示した材料、方法、および実施例は好適な実施態様の代表的なものであり、例示であって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０２０１】
本発明につき本明細書には幅広く一般的に記載してきた。一般的な開示に含まれる狭い種概念および下位概念の部類のそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これはその一群からある対象を除く条件つきまたは否定的限定のある本発明の一般的記載をも含み、除外されている物質が本明細書に具体的に列挙してあるか否かには関係ない。
【０２０２】
さらに、本発明の特徴または側面がマーカッシュ群により記載されている場合、当業者は、当該発明がそのものに関してマーカッシュ群の個々のメンバーまたはサブグループのメンバーとして記載されているものであることを認識されたい。
【０２０３】
本明細書にて言及した出版物、特許出願、特許、およびその他の引用文献は、すべて、それぞれを参照により個々に組み入れたと同じ程度に、その全体を参照により本明細書の一部とする。抵触のある場合は、本明細書が、その定義をも含めて、規制する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油；油または脂肪酸の配合物；かかる配合物の用途、例えば、燃料としての用途；および油または脂肪酸配合物の取得方法を提供する。ある種の実施態様においては、アルキルエステル化された油、油もしくは脂肪酸の配合物、およびかかるアルキルエステル化された油、油もしくは脂肪酸の配合物の用途が提供される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景についての以下の説明は、単に本発明の理解を目的として提供するものであり、本発明に対する先行技術を説明または構成するものではない。
【０００３】
植物油は代替燃料として、またバイオディーゼル生産のための供給原料として使用されている。一般に、使用される油は、特定の領域で大量に生育した植物から抽出する。それ故、米国ではダイズ油がバイオディーゼルの供給源として興味が持たれているが、一方、欧州諸国ではナタネ油が関心の対象となっている；また熱帯性気候の諸国はココヤシ油またはパーム油を利用している（オンライン公開：非特許文献１）。
【０００４】
変異体クフェア・ヴィスコシマ（Cuphea viscossima）であるＶＳ−３２０からの油を模倣したトリグリセリドの組成について、ゲラーら（非特許文献２）が開示している。ゲラーに開示されている“ＶＳ−３２０油の模倣類似体”は以下からなるトリグリセリドの組成を有する：４．２％Ｃ６：０；４０．２０％Ｃ８：０；３６．９０％Ｃ１０：０；４．８０％Ｃ１２：０；６．８０％Ｃ１４：０；３．３３％Ｃ１６：０；０．００％Ｃ１８：０；１．３７％Ｃ１８：１；２．０５％Ｃ１８：２；および０．００％Ｃ１８：３（表１参照)。ゲラーらは（１９９９年）、“このモデルは、植物油のＣ８：０含量の増加が、引続く中鎖および長鎖トリグリセリドの低下と共に、より効率的な、より良好に作動する代替ディーゼル燃料となり得る”ことを示唆していると結論付けた。
【０００５】
スターナスら（非特許文献３）は、様々な油の燃料としての特性について開示して、以下のように述べている：“流動点測定の繰返し精度が±３℃であるとした場合、添加した成分の殆どが基油燃料の流動点−１２℃に有意な程度の影響をもつとは思えなかった。主要な例外はＣ１２及びそれより長いアルキル鎖をもつ飽和脂肪アルコールであり、このものは流動点を実質的に上昇させる；少ないながら負の作用も一部のより長鎖のエステルにも観察された。留意する価値のあることは、オレイン酸誘導体すべてにおける二重結合の存在が、対応するステアリン酸エステルに比べて、それらの低温流動挙動を顕著に改善すること”、また、“点火特性と低温流動挙動の双方を考慮した場合は、三級ジメチルアミン類が最良の作動体である；しかし、三級アミドもまた興味深い可能性をもつと思われ、その場合、天然植物油のグリセリドからそれらを調製することは、幾つかの最近の研究が示しているように、アミンの調製よりもはるかに簡単である”ということである。
【０００６】
ミッテルバッハ（非特許文献４）は、植物油に由来するディーゼル燃料の規格と品質管理について考察し、以下のように述べている：“ＲＭＥについてのオーストリア基準に未だに含まれていないが、脂肪酸メチルエステルの一般的基準を規定する際に必要となるパラメータの一つは、ヨウ素価であり、この値は不飽和脂肪酸の含量を表わし、植物油の起源により唯一左右されるものである。ドイツでは１１５の値が規定されており、この値はナタネ油に相当するが、ヒマワリ油およびダイズ油など、異なる種類の油を排除することとなる。高不飽和酸の加熱がグリセリドの重合を起こすという事実があるため、不飽和脂肪酸を限定することが必要であり得る。このことは、堆積物の形成、または潤滑油の劣化につながりかねない。この影響は脂肪酸鎖における二重結合の数と共に増加する。従って、ヨウ素価による不飽和度を限定するよりも、リノレン酸などの高不飽和脂肪酸の含量を制限するほうがよりよいと思われる。”
【０００７】
グラボスキー（非特許文献５）は、“油脂由来のディーゼル燃料の、燃料としての性質、エンジン性能、およびエミッションに関する状況”を考察し、以下のように述べている：“鎖長が短縮され、および／または鎖の分枝が増加するにつれて、燃料の低温流動性が改善される。鎖長と分枝度は植物の交配、または遺伝子工学的方法の両方により変えることが可能であろうし、さらにバイオディーゼルの化学的プロセシングにより特定の二重結合を切断するか、または分枝異性体を形成させることもできよう。化学的プロセシング領域での実用的研究は殆どなされていない。バイオディーゼル燃料の低温流動性は、明らかに必要かつ重要な研究領域である。”
【０００８】
グッドラムら（非特許文献６）は、“バイオディーゼル燃料モデルの開発のための低分子量トリグリセリドの物理的性質”について考察し、以下のように述べている：“低分子量トリグリセリドの重要なフラクションを含む油は、燃料増量剤として直接使用することに適している。事実、クフェア（Cuphea）種（グラハム；Graham、１９８９年）からの原料は、主として、これらのトリグリセリド（特に、トリカプリリンおよびトリカプリン）から構成させる油を含有する。現代のＤＮＡ伝達テクノロジーは、クフェア（Cuphea）などの種から、低分子量トリグリセリドの合成をコントロールする遺伝子を、他のより充分に確立された脂肪種子作物に伝達することを可能としよう。その際、油成分は最適な所望のバイオディーゼルの性質に向け、遺伝的に修飾し得る。”
【０００９】
ノーセ（非特許文献７）は、以下のように述べている：“飽和脂肪化合物は不飽和脂肪化合物よりも有意に高い融点を有し（表１）、それらは混合物中で不飽和体よりも高い温度で結晶化する。従って、有意な量の飽和脂肪化合物を含む油脂由来のバイオディーゼル燃料は、より高い曇り点と流動点を示すであろう。”
【００１０】
カイニーら（非特許文献８）はバイオディーゼル配合物の性能を高めるためのダイズ油の修飾に関する問題について考察している。本論文はゲラーらが１９９９年に開示した配合物に言及し、“これらの短鎖脂肪酸に由来するバイオディーゼルの融点が相当に高いので、低温流動性を改善するためには、さらに脱ろう工程が必要となろう”と述べている。カイニーらはまた、“飽和脂肪酸含量を増加する脂肪酸プロフィールの変更は、酸化安定性を増強するが、低温流動を悪化させる……脂肪酸の二重結合の存在は、セタン価を低下させよう；従って、植物油の脂肪プールを飽和部分に移行させる戦略は、誘導バイオディーゼルの点火特性を改善するであろうが、酸化安定性と同様に、低温流動性を損ないかねない”とも述べている。
【００１１】
特許文献１（“‘７４３特許”）は、“脂肪酸エステルの合成燃料が、単独で、または他の既知の燃料と組合わせて燃焼させた場合、新しいエネルギー源を提供すること”、また“エステルは好ましくは、種々の油、例えば、ダイズ油、パーム油、ベニバナ油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、オイチシカ油、桐油、ココナツ油、ヒマシ油、紫蘇油、ナタネ油、ヒマワリ油、豚脂、獣脂、魚油、脂肪層、海中および陸上動物からの脂質、および植物起源の脂質などを用いるエステル転移反応により調製する”ことを開示している。
【００１２】
特許文献２（“‘１１３特許”）は、“ａ）１２ないし２２個の炭素原子を含む脂肪酸と１ないし４個の炭素原子を含む低級脂肪族アルコールから誘導されるヨウ素価５０ないし１５０の少なくとも１種のエステル５８ないし９５重量％；ｂ）６ないし１４個の炭素原子を含む脂肪酸と１ないし４個の炭素原子を含む低級脂肪族アルコールとの少なくとも１種のエステル４ないし４０重量％；およびｃ）少なくとも１種のポリマーエステル０．１ないし２重量％；を含有する混合物”を開示している。
【００１３】
特許文献３は、“改変した種子油成分を産生させる核酸構築物および方法”について開示し、“植物種子中のオレイン酸含量を増大させ、飽和脂肪酸含量を低下させる方法であって、ｉ）第一の異種ＦＡＤ２配列で形質転換した植物からのＦＡＤ２遺伝子の抑制量が、同様の遺伝的背景と第二の異種ＦＡＤ２配列を含んでなる植物細胞におけるＦＡＤ２遺伝子の抑制量に比較して少なくとも部分的に低下するまで、第一の異種ＦＡＤ２配列の長さを短縮すること（ただし、第二の異種ＦＡＤ２配列は第一の異種ＦＡＤ２配列よりもより内在性のＦＡＤ２配列からなる）；ii）同様の遺伝的背景をもつが、該異種ＦＡＴＢ配列をもたない植物細胞におけるＦＡＴＢの抑制に比較して、植物細胞におけるＦＡＴＢ遺伝子発現を少なくとも部分的に低下させ得る異種ＦＡＴＢ配列を発現させること；iii）第一の異種ＦＡＤ２配列および異種ＦＡＴＢ配列をもつゲノムを含んでなる植物を成長させること；およびiv）同様の遺伝的背景をもつが、第一の異種ＦＡＤ２配列および異種ＦＡＴＢ配列を欠如する植物からの種子に比較して、飽和脂肪酸含量の低下した種子を産生する植物を培養すること；からなる方法”について述べている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第４，３６４，７４３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３８９，１１３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６／０２６９６３号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Knothe et al., インターネット<URL: http://www.biodiesel.org/resources/reportsdatabase/reports/gen/19961201_gen-162.pdf>
【非特許文献２】Geller et al. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers 42:859-862, 1999
【非特許文献３】Stournas, et al., JACOS, 1995, 72:433-437
【非特許文献４】Mittelbach, Bioresource Technology, 1996, 56:7-11
【非特許文献５】Graboski, Prog. Energy Combustion Sci., 1998, 24:125-164
【非特許文献６】Goodrum et al., Bioresource Technology, 1996, 56:55-60
【非特許文献７】Knothe, Fuel Processing Technology, 2005, 86:1059-1070
【非特許文献８】Kinney et al., Fuel Processing Technology, 2005, 86:1137-1147
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
出願人は、植物油の配合物が代替燃料として、またはバイオディーゼル生産のための原料として使用し得る所望の性質を示すように選択し得ることを明らかにした。例えば、かかる配合物は気候が寒冷である地で燃料として使用した場合にも凍結し難いように選択し得る。配合物はまた、高温度でも安定であるようにも選択し得る。さらに、配合物は、輸送車両において燃料として使用した場合に、所望の点火性が得られるように選択し得る。本発明の油または脂肪酸の配合物のある種の特例を以下に記載する。理解されることは、本発明内の油または脂肪酸の配合物が、以下の実施態様に記載する特徴のいずれかの組合せを有し得ることである。特に、本発明者らは、脂肪酸のある種の混合物がバイオ燃料の生産のために驚くほど有益な性質を有することを発見した。例えば、本発明者らは中鎖脂肪酸とモノ不飽和脂肪酸の一定のバランスが、例えば、寒冷気候での許容能力に関して、驚くほど有益な性質を示し得ることを見出した。バランス量の中鎖脂肪酸（例えば、Ｃ８、Ｃ１０およびＣ１２）とモノ不飽和脂肪酸（好ましくは、Ｃ１６：１およびＣ１８：１）を含む脂肪酸混合物のある種の実施態様において、発明者らは、Ｃ１６：０およびＣ１８：０の存在が、低温流動性に対して特に好ましくない影響をもち、従って、バイオディーゼルにおけるＣ１６：０およびＣ１８：０のレベルを低下させることが、寒冷気候での許容能力にとって有益であり得ること；また、Ｃ１４：０、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０、Ｃ２２およびＣ２４もまた低温流動性に悪影響を与え得ること；従って、バイオディーゼルにおいてはこれらの脂肪酸を低下させることが有益であり得ることを見出した。また、油のある種のアルキルエステル、油の配合物、および脂肪酸の配合物が特に低温流動性に対して好ましい作用をもつが、その他のアルキルエステルはあまり有益でないことも発見された。
【００１７】
本明細書にて使用する場合、用語“油”とは主として脂肪酸のトリグリセリドから構成される物質をいう。植物油は植物の種々の部分、例えば、植物の種子、果実、または葉などから抽出し得る。このものは一般に室温で液体である。一部の実施態様において、油はカノーラ、ナタネ、ヤシ、ヤシ殻、ココヤシ、ホシダネヤシ、ヒマワリ、ベニバナ、オリーブ、マカダミア、ババスーヤシ、ヒマ、ラッカセイ、ワタ、アマ種子、亜麻仁、コフネヤシ、およびジャトロファに由来する。さらなる実施態様において、該油は遺伝的に修飾した植物から誘導してもよい。
【００１８】
トリグリセリドは植物油および動物脂肪の主要な構成分である。トリグリセリドは室温で固体または液体であり得る。トリグリセリドはまたトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）とも呼称され、１分子のグリセロールと３分子の脂肪酸から形成される化合物である。グリセロールは（３個の水酸基を含む）三価アルコールであり、３個までの脂肪酸との組合せで、１個、２個または３個の脂肪酸と結合した場合に、それぞれモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを形成し得る。モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドはエステルとして分類され、酸とアルコール間の反応により、副生物として水を放出し、創出される化合物である。脂肪酸は３つの水酸基のいずれかと結合してエステル結合を形成し、多様な化合物を創出する。さらに、長さの異なる脂肪酸は個々のグリセロール分子と結合し得る。従って、得られるジグリセリドまたはトリグリセリドは同じトリグリセリド分子内に異なる脂肪酸を含み得る。
【００１９】
脂肪酸は、一端にカルボキシル基をもつ炭素鎖骨格として炭素、水素、および酸素が配列されて、構成される。脂肪酸は飽和脂肪酸（ＳＦＡ）でもよく、その場合、炭素−炭素二重結合をもたず、またモノ不飽和（ＭＵＦＡ）でもよく、その場合、１個の炭素−炭素二重結合をもち、またはポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）でもよく、その場合、１個を超える炭素−炭素二重結合をもつ。脂肪酸鎖の炭素数および炭素−炭素二重結合の数は、一般に、“炭素数：炭素−炭素二重結合数”として表す。例えば、１８個の炭素と１個の二重結合をもつオレイン酸は、“Ｃ１８：１”または“１８：１”と表わし得る。
【００２０】
“中鎖脂肪酸”とは、本明細書にて使用する場合、６ないし１４個の炭素、好ましくは８ないし１２個の炭素を含む脂肪酸をいう。
【００２１】
“長鎖脂肪酸”とは、本明細書にて使用する場合、１４個を超える炭素、または１６個を超える炭素、さらに１８個を超える炭素を含む脂肪酸をいう。
【００２２】
一側面においては、脂肪酸の混合物が提供される。
【００２３】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物のある種の好適な実施態様においては、ラウリン酸が混合物中の６％ないし２０％、より好ましくは、混合物中の６％ないし１０％を占める。
【００２４】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物のある種の好適な実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の２０％ないし４０％；または混合物の２０％ないし３０％；または混合物の３０％ないし４０％；または混合物の２５％ないし３５％を占める。本明細書にて提供される脂肪酸混合物の他の実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０），およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の６０％ないし８５％；または混合物の６０％ないし７０％；または混合物の７０％ないし８５％；または混合物の６５％ないし７５％を占める。本明細書にて提供される脂肪酸混合物のさらに他の実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の４０％ないし６０％；または混合物の４０％ないし５０％；または混合物の５０％ないし６０％；または混合物の４５％ないし５５％を占める。
【００２５】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、モノ不飽和脂肪酸が、混合物の５％ないし９５％を占める；好ましくは、モノ不飽和脂肪酸が、混合物の１０％を超え、または１５％を超え；または２０％を超え；または２５％を超え；または３０％を超え；または３５％を超え；または４０％を超え；または４５％を超え；または５０％を超え；または６０％を超え；または６５％を超え；または７０％を超え；または８０％を超え；または８５％を超えて占める。
【００２６】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物のある種の好適な実施態様においては、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に、混合物の２０％ないし８５％；または混合物の２０％ないし４０％；または混合物の２０％ないし３０％；または混合物の３０％ないし４０％；または混合物の２５％ないし３５％；または混合物の４０％ないし６０％；または混合物の３５％ないし５５％；または混合物の５５％ないし６５％；または混合物の６０％ないし８５％；または混合物の６０％ないし７０％；または混合物の７０％ないし８５％；または混合物の６５％ないし７５％；を占める。
【００２７】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に、混合物の５０％を超え；または混合物の５５％を超え；または混合物の６０％を超え；または混合物の６５％を超え；または混合物の７０％を超え；または混合物の７５％を超え；または混合物の８０％を超え；または混合物の８５％を超え；または混合物の９０％を超えて占める。
【００２８】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、ステアリン酸（１８：０）およびパルミチン酸（１６：０）が共に、混合物の２５％未満；より好ましくは、混合物の１５％未満；より好ましくは、混合物の１０％未満；より好ましくは、混合物の８％未満；より好ましくは、混合物の６％未満；より好ましくは、混合物の５％未満；より好ましくは、混合物の４％未満；より好ましくは、混合物の３％未満；より好ましくは、混合物の２％未満；より好ましくは、混合物の１％未満；より好ましくは、混合物の０．５％未満；を占めるか、または一部の好適な実施態様において、脂肪酸の混合物はステアリン酸（１８：０）およびパルミチン酸（１６：０）を実質的に含有しない。
【００２９】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、ミリスチン酸（１４：０）が、混合物の２５％未満；より好ましくは、混合物の１５％未満；より好ましくは、混合物の１０％未満；より好ましくは、混合物の８％未満；より好ましくは、混合物の６％未満；より好ましくは、混合物の５％未満；より好ましくは、混合物の４％未満；より好ましくは、混合物の３％未満；より好ましくは、混合物の２％未満；より好ましくは、混合物の１％未満；より好ましくは、混合物の０．５％未満；を占めるか、または一部の好適な実施態様において、脂肪酸の混合物はミリスチン酸（１４：０）を実質的に含有しない。
【００３０】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、リノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）が共に、混合物の２５％未満；より好ましくは、混合物の１５％未満；より好ましくは、混合物の１０％未満；より好ましくは、混合物の８％未満；より好ましくは、混合物の６％未満；より好ましくは、混合物の５％未満；より好ましくは、混合物の４％未満；より好ましくは、混合物の３％未満；より好ましくは、混合物の２％未満；より好ましくは、混合物の１％未満；より好ましくは、混合物の０．５％未満；を占めるか、または一部の好適な実施態様において、脂肪酸の混合物はリノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）を実質的に含有しない。
【００３１】
本明細書にて提供される脂肪酸混合物の一部の好適な実施態様においては、アラキドン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）およびリグノセリン酸（Ｃ２４：０）が共に、混合物の２５％未満；より好ましくは、混合物の１５％未満；より好ましくは、混合物の１０％未満；より好ましくは、混合物の８％未満；より好ましくは、混合物の６％未満；より好ましくは、混合物の５％未満；より好ましくは、混合物の４％未満；より好ましくは、混合物の３％未満；より好ましくは、混合物の２％未満；より好ましくは、混合物の１％未満；より好ましくは、混合物の０．５％未満；を占めるか、または一部の好適な実施態様において、脂肪酸の混合物はアラキドン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）およびリグノセリン酸（Ｃ２４：０）を実質的に含有しない。
【００３２】
ある種の側面において、脂肪酸の混合物は、８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸と１２〜１８個の炭素を有するモノ不飽和脂肪酸が混合物の８０％ないし１００％を占め、カプリル酸（Ｃ８：０）とカプリン酸（Ｃ１０：０）が混合物の５％ないし８０％を占め、ラウリン酸が混合物の２０％未満を占め、そして炭素が１２個を超えるポリ不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸が共に混合物の２０％未満を占める脂肪酸混合物として提供される。上記脂肪酸混合物のある種の好適な実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の２０％ないし４０％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）は混合物の６％ないし２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）は混合物の６％ないし１０％を構成する。該混合物の一部の好適な実施態様において、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）は共に、混合物の５０％ないし８５％を占める。
【００３３】
ある種の側面において、脂肪酸混合物は、８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸と１２〜１８個の炭素を有するモノ不飽和脂肪酸が混合物の８０％ないし１００％を占め、カプリル酸（Ｃ８：０）とカプリン酸（Ｃ１０：０）が混合物の５％ないし８０％を占め、ラウリン酸が混合物の２０％未満を占め、そして１２個を超える炭素を有するポリ不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸が共に混合物の２０％未満を占める脂肪酸混合物として提供される。上記脂肪酸混合物のある種の好適な実施態様においては、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の２０％ないし４０％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし１０％を構成する；また、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）は共に、混合物の５０％ないし８５％を占める。上記混合物の他の好適な実施態様において、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）は共に、混合物の６０％ないし８５％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし１０％を構成する；また、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）は共に、混合物の２０％ないし４０％を占める。
【００３４】
一側面において、本発明は２種以上の油の配合物を特徴とし、その場合、少なくとも５０重量％の脂肪酸が中鎖脂肪酸であり、またその場合のカプリル酸（Ｃ８：０）が最終配合物の２５％までを構成し、２０％未満が長鎖脂肪酸である。
【００３５】
関連する側面において、本発明は脂肪酸の配合物を特徴とし、その場合、少なくとも５０重量％の脂肪酸が中鎖脂肪酸であり、またその場合のカプリル酸（Ｃ８：０）が最終配合物の２５％までを構成し、２０％未満が長鎖脂肪酸である。
【００３６】
本発明の油または脂肪酸配合物の一部の実施態様において、該配合物は、少なくとも６０％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも６５％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも７０％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも７５％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも８０％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも８５％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも９０％の中鎖脂肪酸、または好ましくは少なくとも９５％の中鎖脂肪酸を含有してなる。
【００３７】
本発明の油または脂肪酸配合物の特定の実施態様において、該配合物は、５〜２５％のカプリル酸（Ｃ８：０）；１０〜２５％のカプリル酸（Ｃ８：０）；１０〜２０％のカプリル酸（Ｃ８：０）；または１５〜２５％のカプリル酸（Ｃ８：０）を含有してなる。
【００３８】
本発明の油または脂肪酸配合物の特定の実施態様において、該配合物は、３０〜６０％のカプリン酸（Ｃ１０：０）；２５〜５５％のカプリン酸（Ｃ１０：０）；３０〜５０％のカプリン酸（Ｃ１０：０）；または４０〜５０％のカプリン酸（Ｃ１０：０）を含有してなる。
【００３９】
本発明の油または脂肪酸配合物の特定の実施態様において、該配合物は、５〜３５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；１０〜２０％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；１５〜２５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；２０〜３０％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；または２５〜３５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなる。
【００４０】
本発明の油または脂肪酸配合物の他の実施態様において、該配合物は、１５％未満の長鎖脂肪酸、好ましくは１０％未満の長鎖脂肪酸、好ましくは７％未満の長鎖脂肪酸、好ましくは５％未満の長鎖脂肪酸、または好ましくは３％未満の長鎖脂肪酸を含有してなる。
【００４１】
本発明の油または脂肪酸配合物のさらに他の実施態様において、該配合物は、１５％未満のモノ不飽和脂肪酸、好ましくは１０％未満のモノ不飽和脂肪酸、好ましくは７％未満のモノ不飽和脂肪酸、好ましくは５％未満のモノ不飽和脂肪酸、または好ましくは２％未満のモノ不飽和脂肪酸を含有してなる。
【００４２】
本発明の油または脂肪酸配合物のさらに他の実施態様において、該配合物は、１０％未満のポリ不飽和脂肪酸、好ましくは７％未満のポリ不飽和脂肪酸、好ましくは５％未満のポリ不飽和脂肪酸、好ましくは３％未満のポリ不飽和脂肪酸、または好ましくは１％未満のポリ不飽和脂肪酸を含有してなる。
【００４３】
本発明の油または脂肪酸配合物の特定の実施態様においては、カプロン酸（６：０）が配合物の０ないし約５重量％；カプリル酸（８：０）が配合物の約５ないし約２５重量％；カプリン酸（１０：０）が配合物の約３０ないし約６０重量％；ラウリン酸（１２：０）が配合物の約５ないし約３０重量％；ミリスチン酸（１４：０）が配合物の０ないし約５重量％；パルミチン酸（１６：０）が配合物の０ないし約５重量％；パルミトレン酸（１６：１）が配合物の０ないし約１０重量％；ステアリン酸（１８：０）が配合物の０ないし約５重量％；オレイン酸（１８：１）が配合物の０ないし約１０重量％；リノール酸（１８：２）が配合物の０ないし約５重量％；リノレン酸（１８：３）が配合物の０ないし約１重量％；アラキドン酸（２０：０）が配合物の０ないし約３重量％；ベヘン酸（２２：０）が配合物の０ないし約３重量％；エルカ酸（２２：１）が配合物の０ないし約５重量％；およびリグノセリン酸（２４：０）が配合物の０ないし約３重量％；含まれていてもよい。
【００４４】
本発明の油または脂肪酸配合物の一部の実施態様においては、油または脂肪酸のトリグリセリドが脂肪酸アルキルエステルに変換される。特定の実施態様において、該アルキルエステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、またはブチルエステルである。好適な実施態様において、該アルキルエステルはメチルエステルである。
【００４５】
本発明の油配合物のある種の実施態様において、該油は植物油または動物脂肪に由来する。好適な実施態様において、油はカノーラ、ナタネ、パーム油、ヤシ殻、ココヤシ、ホシダネヤシ、ヒマワリ、ベニバナ、クフェア、オリーブ、マカダミア、ババスーヤシ、ヒマ、ラッカセイ、ワタ、アマ種子、亜麻仁、コフネヤシ、およびジャトロファからなる群より選択される。本発明の油配合物の一部の実施態様において、該油は遺伝的に修飾した植物に由来する。特定の実施態様において、油は遺伝的に修飾した植物に由来し、その場合、植物は未変性の植物に比較して増加した量の中鎖脂肪酸を産生するように修飾してある。さらなる実施態様においては、未変性の植物または植物類からの１種以上の油を、遺伝的に修飾した植物から得られた１種以上の油と配合し得る。
【００４６】
本発明の油または脂肪酸配合物の一部の実施態様において、油配合物または脂肪酸配合物は内燃機関に動力を供給する燃料として有用である。他の実施態様において、該油配合物または脂肪酸配合物は、燃料添加剤、機能的流体、凝固点降下剤、バイオディーゼル、航空燃料、家庭用暖房油、または灯油代替品の製造における原料として使用する。
【００４７】
関連する側面において、本発明は脂肪酸アルキルエステルの配合物を特徴とし、その場合、脂肪酸アルキルエステルの少なくとも５０％が中鎖脂肪酸アルキルエステルであり、２０％未満が長鎖脂肪酸アルキルエステルである。
【００４８】
本発明の脂肪酸アルキルエステルの配合物の特定の実施態様において、かかる配合物は少なくとも６０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも６５％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも７０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも７５％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも８０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも８５％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも９０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、または好ましくは少なくとも９５％の中鎖脂肪酸アルキルエステルを含有する。
【００４９】
本発明の脂肪酸アルキルエステルの配合物の他の実施態様において、該配合物は１５％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは１０％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは７％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは５％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、または好ましくは３％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有する。
【００５０】
本発明の脂肪酸アルキルエステルの配合物のさらに他の実施態様において、該配合物は１５％未満のモノ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは１０％未満のモノ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは７％未満のモノ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは５％未満のモノ不飽和脂肪酸アルキルエステル、または好ましくは２％未満のモノ不飽和脂肪酸アルキルエステルを含有する。
【００５１】
本発明の脂肪酸アルキルエステルの配合物のさらに他の実施態様において、該配合物は１０％未満のポリ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは７％未満のポリ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは５％未満のポリ不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは３％未満のポリ不飽和脂肪酸アルキルエステル、または好ましくは１％未満のポリ不飽和脂肪酸アルキルエステルを含有する。
【００５２】
本発明の脂肪酸アルキルエステルの配合物の特定の実施態様において、該脂肪酸アルキルエステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、およびブチルエステルからなる群より選択される。他の実施態様において、該脂肪酸アルキルエステルは、イソプロピルエステル、ｔ−ブチルエステル、またはｓｅｃ−ブチルエステルからなる群より選択される。一部の好適な実施態様において、該脂肪酸アルキルエステルはメチルエステルである。一部の実施態様において、カプロン酸メチルエステル（６：０）は総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；カプリル酸メチルエステル（８：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で約５ないし約３５％、または約１０ないし約３０％、または約１５ないし約２５％；カプリン酸メチルエステル（１０：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で約２０ないし約６０％、または約３０ないし約５０％、または約４０ないし約５０％；ラウリン酸メチルエステル（１２：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で約５ないし約３０％、または約１０ないし約３０％、または約１５ないし約２５％；ミリスチン酸メチルエステル（１４：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；パルミチン酸メチルエステル（１６：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；パルミトレン酸メチルエステル（１６：１）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約１０％；ステアリン酸メチルエステル（１８：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；オレイン酸メチルエステル（１８：１）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約１０％；リノール酸メチルエステル（１８：２）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；リノレン酸メチルエステル（１８：３）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約１％；アラキドン酸メチルエステル（２０：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約３％；ベヘン酸メチルエステル（２２：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約３％；エルカ酸メチルエステル（２２：１）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約５％；およびリグノセリン酸メチルエステル（２４：０）が総脂肪酸メチルエステル配合物の重量で０ないし約３％であり得る。
【００５３】
ある種の好適な実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物は、アルキル−エステル化して、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ブチルエステル、およびイソプロピルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを形成する；より好ましくは、アルキルエステルは、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、およびｎ−ブチルエステルからなる群より選択される。一部の好適な実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物は、イソプロピルエステルを含有しない。ある種の好適な実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物は、エチルエステルを含むか、または基本的にエチルエステルから構成される。ある種の好適な実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物は、ｎ−プロピルエステルを含むか、または基本的にｎ−プロピルエステルから構成される。ある種の好適な実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物は、ブチルエステルを含むか、または基本的にブチルエステルから構成される；ある種の特に好適な実施態様において、該ブチルエステルはｎ−ブチルエステルであるか、またはｎ−ブチルエステルを含有する。他の実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸の配合物はアルキル−エステル化されており、その場合のアルキルエステルは、直鎖アルキルエステルである；好ましくは、該アルキルエステルは基本的に直鎖のアルキルエステルから構成される。ある種の実施態様において、該油、本明細書で提供される油または脂肪酸配合物のアルキルエステルは、分枝鎖アルキルエステルを包含しない。
【００５４】
本発明の上記側面のさらなる実施態様において、油、または脂肪酸、または脂肪酸アルキルエステルの配合物は、０℃未満のまたは０℃に等しい融点、好ましくは−１０℃未満のまたは−１０℃に等しい融点、好ましくは−１５℃未満のまたは−１５℃に等しい融点、好ましくは−２０℃未満のまたは−２０℃に等しい融点、または好ましくは−２５℃未満のまたは−２５℃に等しい融点を有する。
【００５５】
本発明の上記側面のさらなる実施態様において、油、または脂肪酸、または脂肪酸アルキルエステルの配合物は、０℃未満のまたは０℃に等しい曇り点、好ましくは−１０℃未満のまたは−１０℃に等しい曇り点、好ましくは−１５℃未満のまたは−１５℃に等しい曇り点、好ましくは−２０℃未満のまたは−２０℃に等しい曇り点、または好ましくは−２５℃未満のまたは−２５℃に等しい曇り点を有する。
【００５６】
本発明の上記側面のさらなる実施態様において、油、または脂肪酸、または脂肪酸アルキルエステルの配合物は、０℃未満のまたは０℃に等しい流動点、好ましくは−１０℃未満のまたは−１０℃に等しい流動点、好ましくは−１５℃未満のまたは−１５℃に等しい流動点、好ましくは−２０℃未満のまたは−２０℃に等しい流動点、または好ましくは−２５℃未満のまたは−２５℃に等しい流動点を有する。
【００５７】
本発明の上記側面の一部の実施態様において、油、または脂肪酸、または脂肪酸アルキルエステルの配合物は、内燃機関における燃料として、燃料添加物、機能的流体、凝固点降下剤、家庭用暖房油、航空もしくはジェット燃料、または灯油代替物としての使用に適している。
【００５８】
“内燃機関における使用に適する”という文言は、内燃機関に動力を供給するために使用し得る燃料の性質をいう。一部の実施態様において、適当な燃料は、セタン価が４０〜１００；４０〜８０；または好ましくは４０〜７０；または好ましくは４０〜６０；または好ましくは４０〜５５；または好ましくは４０〜５０である。他の実施態様において、適当な燃料は、ヨウ素価が２０〜１３０；好ましくは４０〜１００；好ましくは２０〜５０、または好ましくは１０〜２０である。さらなる実施態様において、適当な燃料は、融点が０℃未満または０℃に等しく、好ましくは−１０℃未満または−１０℃に等しく、好ましくは−１５℃未満または−１５℃に等しく、好ましくは−２０℃未満または−２０℃に等しく、または好ましくは−２５℃未満または−２５℃に等しい。なおさらなる実施態様において、適当な燃料は、曇り点が０℃未満または０℃に等しく、好ましくは−１０℃未満または−１０℃に等しく、好ましくは−１５℃未満または−１５℃に等しく、好ましくは−２０℃未満または−２０℃に等しく、または好ましくは−２５℃未満または−２５℃に等しい。さらに他の実施態様において、適当な燃料は、流動点が０℃未満または０℃に等しく、好ましくは−１０℃未満または−１０℃に等しく、好ましくは−１５℃未満または−１５℃に等しく、好ましくは−２０℃未満または−２０℃に等しく、または好ましくは−２５℃未満または−２５℃に等しい。
【００５９】
本発明の上記の側面の他の実施態様において、脂肪酸または脂肪酸アルキルエステルの配合物はバイオディーゼルとして使用し、また石油ベースのディーゼルと配合して、燃料として使用するためのバイオディーゼル配合物を形成する。特定の実施態様において、該バイオディーゼルは１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、またはさらに７５％のバイオディーゼル配合物を含有してなり、残りの部分を石油ベースのディーゼルを配合する。アメリカ材料試験協会（ＡＳＴＭ）は、ディーゼル燃料を２つの等級、＃１ディーゼル燃料および＃２ディーゼル燃料に分類している。特定の実施態様において、該バイオディーゼルは＃１ディーゼル燃料、＃２ディーゼル燃料と配合するか、または＃１と＃２ディーゼルの混合物と配合する。
【００６０】
別の側面において、本発明は遺伝的に改変した植物を特徴とし、その場合の植物は、一つ以上の変異をもつ１種以上の修飾酵素を発現することで、未変性の植物に比較して、該植物が中鎖脂肪酸を増量して産生するようにしたものである。好適な実施態様において、遺伝的に改変した植物は、８個、１０個、または１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸を優先的に産生する。本明細書にて使用する場合、用語“８個、１０個、または１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸を優先的に産生する”とは、遺伝的に改変した植物が産生する中鎖脂肪酸の少なくとも５０重量％が８個、１０個、または１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸であること；より好ましくは重量で少なくとも６０％；より好ましくは少なくとも７０％；より好ましくは少なくとも７５％；より好ましくは少なくとも８０％；より好ましくは少なくとも８５％；より好ましくは少なくとも９０％；より好ましくは少なくとも９５％；より好ましくは少なくとも９８％が８個、１０個、または１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸であることを意味する。
【００６１】
本発明の上記の側面の好適な実施態様において、遺伝的に改変した植物は、未変性の状態で４０％を超える長鎖脂肪酸を含む油を産生する植物に由来する。一部の実施態様において、遺伝的に改変した植物は、クフェア（Cuphea）種ではない未変性の植物に由来する。クフェアは本発明のある種の実施態様において、不利益となり得るある種の形質を有する。例えば、“野生型のクフェア生殖質は粉砕されて、結果として商品化するように成長させることができない”（Knapp et al. "Modifying the seed storage of lipids of Cuphea: A source of medium chain triglycerides.（クフェアの脂質の種子貯蔵を修飾する；中鎖トリグリセリドの起源）" In Seed Oils for the Future, 142-154, Champaign, Ill., AOCS Press）。加えて、“このものは降霜に耐えられず、種子は容易に粉砕されて、開花も予測できず、また茎、葉および花が粘着性の弾力性のある毛で被われ……発芽も遅い（１４ないし２０日）”（Ag Innovation News, Jul-Sept. 2003, Vol. 12, No. 3）。さらに、クフェアからの充分な量の油の取得は、クフェアを商業的に実用化するための充分な量の油を産生する能力を妨げる可能性がある。しかし、ある種の実施態様においては、クフェアのある種の他の形質が、修飾のために有利な植物を提供する可能性がある。例えば、“この植物は急速に成長し、種子は僅か６週間で成熟し、温暖な気候の季節が短い場合に理想的なものである”（Ag Innovation News, Jul-Sept. 2003, Vol. 12, No. 3）。従って、ある種の実施態様において、遺伝的に改変したクフェア植物は本明細書に開示するように、油配合物を産生するものとして提供される。
【００６２】
本発明の上記の側面の一部の実施態様において、修飾した酵素を発現する植物は、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、およびトウモロコシからなる群より選択される植物である。好適な実施態様において、該植物はダイズであり、より好ましくはヤシ、より好ましくはヒマ、または最も好ましくはナタネである。特定の実施態様において、該植物はナタネの種のもの、好ましくは、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）、ブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラッシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ブラッシカ・カリナータ（Brassica carinata）およびシナピス・アルバ（Sinapis alba）（ブラッシカ・アルバ・ラベン（Brassica alba Rabenh.））である。
【００６３】
本発明の上記の側面の好適な実施態様において、含まれる変異は、変異を含む遺伝子修復オリゴヌクレオベースを用いて酵素に導入する。
【００６４】
核酸塩基は、プリン、ピリミジン、またはその誘導体もしくは類似体である塩基からなる。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル部分を含む核酸塩基であり、例えば、任意に置換基を有してもよいリボシドまたは２'−デオキシリボシドである。ヌクレオシドは数個の連結部分の一つによって結合することができて、リンを含んでいても含んでいなくてもよい。未置換のホスホジエステル連結部分により連結しているヌクレオシドはヌクレオチドと呼ばれる。本明細書に使用する場合の“核酸塩基”は、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、およびモルホリン核酸塩基並びにヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含する。
【００６５】
オリゴヌクレオベースは核酸塩基のポリマーであり、このポリマーはワトソン−クリック塩基対合により、相補性配列をもつＤＮＡにハイブリッド形成し得る。オリゴヌクレオベース鎖は単一の５'および３'末端を有するが、これらはポリマーの最終的核酸塩基である。特定のオリゴヌクレオベース鎖はすべてのタイプの核酸塩基を含むことができる。オリゴヌクレオベース化合物は、相補性である１つ以上のオリゴヌクレオベース鎖から構成される化合物であり、ワトソン−クリック塩基対合によりハイブリッド形成する。核酸塩基はデオキシリボ型またはリボ型のいずれかである。リボ型核酸塩基はペントースフラノシル含有の核酸塩基であり、その２'炭素はヒドロキシル、アルコキシまたはハロゲンで置換されたメチレンである。デオキシリボ型核酸塩基はリボ型核酸塩基以外の核酸塩基であり、ペントースフラノシル部分を含まないすべての核酸塩基を含む。
【００６６】
オリゴヌクレオベースストランドは一般にオリゴヌクレオベース鎖およびオリゴヌクレオベース鎖のセグメントまたは領域の両方を含む。オリゴヌクレオベースストランドは、３'および５'末端をもつ。オリゴヌクレオベースストランドが１本の鎖と同一の拡がりをもつ場合、当該ストランドの３'および５'末端もまた当該鎖の３'および５'末端である。
【００６７】
“遺伝子修復オリゴヌクレオベース”という用語は、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、非ヌクレオチド含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドおよび以下に詳細に説明する他の遺伝子修復分子を含むオリゴヌクレオベースを示すために本明細書では使用する。
【００６８】
本発明上記側面のさらなる実施態様において、修飾する酵素はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである。ある種の実施態様において、修飾するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、およびトウモロコシからなる群より選択される植物に存在する。好適な実施態様において、修飾したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、様々なナタネ植物、好ましくは、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）、ブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラッシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ブラッシカ・カリナータ（Brassica carinata）、シナピス・アルバ（Sinapis alba）（ブラッシカ・アルバ・ラベン（Brassica alba Rabenh.））、好ましくはブラッシカ・ナプス（Brassica napus）に存在する。特定の実施態様においては、１つ以上の変異が配列番号２（SEQ ID NO:2）のアミノ酸残基９１〜３９７に相当する領域内に含まれている；好ましくは、１つ以上の設計された変異が、配列番号２のアミノ酸残基１２８〜１４７、配列番号２のアミノ酸残基１７５〜２０６、配列番号２のアミノ酸残基２５４〜２９７、配列番号２のアミノ酸残基３３３〜３３５、または配列番号２のアミノ酸残基３６５〜３９７からなる群より選択される領域に含まれている。ある種好適な実施態様において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼはパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＰＴＥ）である。
【００６９】
本発明の上記側面のなおさらなる実施態様において、修飾する酵素はケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）である。特定の実施態様において、ＫＡＳ酵素はその活性が低下するか、または除去されるように修飾し得る。他の実施態様において、ＫＡＳ酵素はその基質選択性が変化するように修飾し得る。好適な実施態様において、ＫＡＳ酵素はＫＡＳIIであり、１つ以上の変異がアミノ酸残基３２８〜３８５に相当する領域の位置に存在する。好適な実施態様においては、１つ以上の変異が配列番号３（SEQ ID NO:3）のアミノ酸残基３２５〜３５２または配列番号３のアミノ酸残基３５５〜３８５に相当する領域に存在する。より好適な実施態様においては、１つ以上の変異が配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３４０またはさらに配列番号３のアミノ酸残基３３１〜３３７に相当する領域に存在する。一部の実施態様において、配列番号３の３３７位置の保存ロイシン残基に相当するアミノ酸が変異を受けている。
【００７０】
本発明の別の側面においては、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをエンコードする２種の発現導入遺伝子を含んでなるトランスジェニック植物が提供され、その場合、各チオエステラーゼは異なる長さの中鎖脂肪酸に対して活性を有する。従って、かかるトランスジェニック植物は両方のチオエステラーゼを発現し、中鎖脂肪酸の配合物を産生する。
【００７１】
ある種の実施態様において、修飾する酵素はΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼである。好適な実施態様においては、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの活性または発現が増大する。好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物でのΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性の増大は、遺伝的に修飾した植物が未変性の植物に比較して、Ｃ１６：１および／またはＣ１８：１のレベルの上昇；および／またはＣ１６：０のレベルの低下、および／またはＣ１８：０のレベルの低下を招く。ある種の好適な実施態様において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、遺伝的に修飾した植物が上昇したレベルのＣ１６：１を産生するように修飾する。ある種の実施態様において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、パルミトイル−ＡＣＰで上昇した活性を示すように修飾する；または遺伝的に修飾した植物は、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、クフェア、ヒマ、またはトウモロコシなどの植物であり、Ｃ１６：０の生産増大は、マカダミア（Macadamia integrifolia）、クロウメモドキ（Hippophae rhamnoides）またはウングイスカティ（Doxantha unguis-cati）からのΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子によるナタネの形質転換により達成される。
【００７２】
ある種の実施態様において、修飾する酵素はΔ１２デサチュラーゼ（ＦＡＤ２遺伝子によりエンコード）である。好適な実施態様においては、Δ１２デサチュラーゼの活性または発現が阻害または減弱される。好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物におけるΔ１２デサチュラーゼの活性または発現の阻害または減弱は、未変性植物に比較して、遺伝的に修飾した植物におけるＣ１８：２、および／またはＣ１８：３の産生レベルを低下させ、またＣ１８：１のレベルを増加させるに至る。
【００７３】
上記側面のある種の実施態様において、第一のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼはＣ８およびＣ１０脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して活性を有し、また発現された導入遺伝子はＣ１２脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して活性を有する第二のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをエンコードする。特定の実施態様において、第一のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼはクフェアの種からのものであり、第二のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼはウルムス（Ulmus）の種からのものである。
【００７４】
本発明のある種の側面において、遺伝的に修飾した植物は、本明細書に開示した脂肪酸混合物を含む油を産生するように遺伝的に修飾したものとして提供される。例えば、ある種の好適な実施態様において、植物は脂肪酸の混合物を産生するが、その場合に、８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸と１２〜１８個の炭素を有するモノ不飽和脂肪酸が該混合物の８０％ないし１００％を占め、カプリル酸（Ｃ８：０）とカプリン酸（Ｃ１０：０）が混合物の５％ないし８０％を占め、ラウリン酸が混合物の２０％未満を占め、炭素数１２個を超えるポリ不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸が共に混合物の２０％未満を占めるものとして提供される。遺伝的に修飾した植物のある種の好適な実施態様において、該植物は上記脂肪酸混合物を産生し、その場合に、カプリル酸（Ｃ８；０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）が共に、混合物の２０％ないし４０％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし１０％を構成し；また、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に、混合物の５０％ないし８５％を占める。遺伝的に修飾した植物のある種の好適な実施態様において、該植物は上記の脂肪酸混合物を産生し、その場合に、カプリル酸（Ｃ８；０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）が共に、混合物の６０％ないし８５％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％ないし１０％を構成し；また、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に、混合物の２０％ないし４０％を占める。ある種の特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、約１０％のＣ８；約２０％のＣ１０；約１０％のＣ１２：および約６０％のＣ１６：１および／またはＣ１８：１を含む油を産生するものとして提供される。異なる特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、約５％のＣ８；約５％のＣ１０；約１５％のＣ１２；約７０％のＣ１６：１および／またはＣ１８：１；およびそれぞれ約１％以下のＣ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２およびＣ１８：３を含む油を産生するものとして提供される。
【００７５】
本発明の上記側面の一部の実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、クフェア、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、およびトウモロコシからなる群より選択される植物から生成する。特定の実施態様において、該植物は、様々なナタネ植物、好ましくは、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）、ブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラッシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ブラッシカ・カリナータ（Brassica carinata）、およびシナピス・アルバ（Sinapis alba）（ブラッシカ・アルバ・ラベン（Brassica alba Rabenh.））である。
【００７６】
上記側面のある種の特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、遺伝的に改変させた植物である；他の好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、トランスジェニック植物である。さらなる実施態様はトランスジェニックおよび遺伝的改変両方を含む植物である。
【００７７】
一実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、遺伝的に修飾した植物が中鎖脂肪酸を上昇したレベルで産生し（好ましくは、本明細書に規定する好適な脂肪酸配合物によるＣ８：０、Ｃ１０：０およびＣ１２：０のレベルを上昇させる）、および／またはパルミチン酸（Ｃ１６；０）を低下レベルで、および／またはＣ１８：０を低下レベルで産生するように修飾する。他の好適な態様において、遺伝的に修飾した植物は、モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように、好ましくはＣ１６：１およびＣ１８：１モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように；および飽和およびポリ不飽和脂肪酸を低レベルで、好ましくは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２および／またはＣ１８：３を低レベルで産生するように修飾する。特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物は、中鎖脂肪酸を上昇レベルで産生し（好ましくはＣ８：０、Ｃ１０：０および／またはＣ１２：０を上昇レベルで）；Ｃ１６：０およびＣ１８：０を低下レベルで；また、Ｃ１６：１およびＣ１８：１を上昇レベルで産生するように修飾する。
【００７８】
上記側面の特に好適な一実施態様において、ナタネ植物は、本明細書に規定する脂肪酸混合物を含む油を産生するように遺伝的に修飾したもとのとして提供される。ある種の好適な実施態様において、遺伝的に修飾したナタネ植物は、未変性のナタネ植物に比較して、遺伝的に修飾したナタネ植物が、中鎖脂肪酸を上昇レベルで（好ましくは、本明細書に規定した好適な脂肪酸配合物によるＣ８：０、Ｃ１０：０およびＣ１２：０のレベルを上昇させる）、および／またはパルミチン酸（Ｃ１６；０）を低下レベルで、および／またはＣ１８：０を低下レベルで産生するように修飾する。他の好適な実施態様において、遺伝的に修飾したナタネ植物は、未変性のナタネ植物に比較して、遺伝的に修飾したナタネ植物が、モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように、好ましくはＣ１６：１およびＣ１８：１モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように；および飽和およびポリ不飽和脂肪酸を低レベルで、好ましくは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２およびＣ１８：３を低レベルで産生するように修飾する。特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾したナタネ植物は、中鎖脂肪酸を上昇レベルで産生し（好ましくはＣ８：０、Ｃ１０：０および／またはＣ１２：０を上昇レベルで）；Ｃ１６：０およびＣ１８：０を低下レベルで；また、Ｃ１６：１および／またはＣ１８：１を上昇レベルで産生するように修飾する。
【００７９】
上記側面の別の特に好適な実施態様において、ダイズ植物は本明細書に規定する脂肪酸混合物を含む油を産生するように遺伝的に修飾したもとのとして提供される。ある種の好適な実施態様において、遺伝的に修飾したダイズ植物は、未変性のダイズ植物に比較して、遺伝的に修飾したダイズ植物が、中鎖脂肪酸を上昇レベルで（好ましくは、本明細書に規定した好適な脂肪酸配合物によるＣ８：０、Ｃ１０：０およびＣ１２：０のレベルを上昇させる）、および／またはパルミチン酸（Ｃ１６；０）を低下レベルで、および／またはＣ１８：０を低下レベルで産生するように修飾する。他の好適な実施態様において、遺伝的に修飾したダイズ植物は、未変性のダイズ植物に比較して、遺伝的に修飾したダイズ植物が、モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように、好ましくはＣ１６：１およびＣ１８：１モノ不飽和脂肪酸を上昇レベルで産生するように；および飽和およびポリ不飽和脂肪酸を低レベルで、好ましくは、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２およびＣ１８：３を低レベルで産生するように修飾する。特に好適な実施態様において、遺伝的に修飾したダイズ植物は、中鎖脂肪酸を上昇レベルで産生し（好ましくは、Ｃ８：０、Ｃ１０：０および／またはＣ１２：０を上昇レベルで）；Ｃ１６：０およびＣ１８：０を低下レベルで；また、Ｃ１６：１および／またはＣ１８：１を上昇レベルで産生するように修飾する。
【００８０】
本発明の上記側面のさらなる実施態様においては、遺伝的に改変した植物またはトランスジェニック植物を産生させる種子が提供される。
【００８１】
本発明の上記側面のなおさらなる実施態様においては、上記の遺伝的に改変した植物またはトランスジェニック植物の種子、果実、または葉から抽出された油または脂肪酸混合物が提供される。
【００８２】
本発明の別の側面においては、改変した植物またはトランスジェニック植物から得られる油から、バイオディーゼルを製造する方法が提供される。ある種の実施態様において、遺伝的に改変した植物またはトランスジェニック植物からの油は、バイオディーゼルを製造する上での最良の油として使用される。他の実施態様において、遺伝的に改変した植物からの油は、未変性の植物、トランスジェニック植物、またはその両方からの油と配合してバイオディーゼルの製造に使用する。特定の実施態様において、該油は遺伝子修復オリゴヌクレオベースを用いて１つ以上の変異を導入した遺伝的に改変した植物に由来するものであり、かかる油は単独で、またはトランスジェニック植物もしくは未変性植物もしくは他の遺伝的に改変した植物から得られる１種以上の油と組合わせて使用し得る。ある種の実施態様において、該方法は、１種以上の遺伝的に改変した植物またはトランスジェニック植物の種子、果実、または葉から抽出された油を、１種以上の未変性植物から得られる油と配合してエステル転移反応に付し、脂肪酸アルキルエステルを含むバイオディーゼルを製造することからなる。一部の実施態様において、エステル転移反応は、当該油をアルコールおよび塩基触媒と反応させることにより実施する。さらなる実施態様において、該方法はさらに脂肪酸アルキルエステルを精製することからなる；かかる精製は触媒、グリセリン、および水の除去からなる。
【００８３】
さらに他の実施態様において、トランスジェニック植物からの油は、遺伝的に改変した植物、未変性の植物、またはその両方からの１種以上の油と配合して、バイオディーゼルの製造に使用する。特定の実施態様において、トランスジェニック植物は１種以上の導入遺伝子を発現する。特定の実施態様において、導入遺伝子は、該植物が産生する中鎖脂肪酸の含量を改変するタンパク質を発現する。好適な実施態様において、該トランスジェニック植物は未変性の植物よりも多量の中鎖脂肪酸を産生する。より好適な実施態様において、トランスジェニック植物は８個、１０個、または１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸を優先的に産生する。より好適な実施態様において、トランスジェニック植物は未変性の植物よりも短い鎖の脂肪酸を有する油を産生する。
【００８４】
さらに本発明の別の側面においては、脂肪酸メチルエステルの配合物の理論的融点を予測する方法が提供される。この方法では、配合物中に含まれる各脂肪酸ＭＥについて、以下の積の総計を算出する：個々の脂肪酸メチルエステルのパーセント（ｗ／ｗ）（Ｘ）、そのエステルの融点（ＭＰx）、および因子（Ｆx）。従って、各メチルエステルについて、例えば、（Ｘ＊ＭＰx＊Ｆx）に相当する項がある。本方法において使用される融点と因子の数値的定義は、変化させ得るものであり、なお有効な中間値を生じる。用語“因子”とは、本明細書にて使用する場合、脂肪酸メチルエステルに相当する一定値をいう。該因子はその脂肪酸ＭＥに対する含有率およびその脂肪酸ＭＥに対する融点を乗じて、本方法で使用するその脂肪酸ＭＥに対する項とする。例えば、個々の融点はプラスマイナス２℃、または５℃、さらには１０℃変動する可能性があり、また個々の因子は５％または１０％、さらには２０％変動し得るものであるが、なお該配合物に対する有効な予測融解温度を示す。
【００８５】
ある種の実施態様においては、配合物の融点を予測する方法が提供される；その場合、予測される融点ＰTmは、以下のように計算される：
PTm = [(A*MPA*FA) + (B*MPB*FB) + (C*MPC*FC) + (D*MPD*FD) + (E*MPE*FE) + (F*MPF*FF) + (G*MPG*FG) + (H*MPH*FH) + (I*MPI*FI) + (J*MPJ*FJ) + (K*MPK*FK) + (L*MPL*FL) + (M*MPM*FM)]*(0.01),
式中：
Ａは配合物中のカプロン酸ＭＥ（６：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｂは配合物中のカプリル酸ＭＥ（８：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｃは配合物中のカプリン酸ＭＥ（１０：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｄは配合物中のラウリン酸ＭＥ（１２：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｅは配合物中のミリスチン酸ＭＥ（１４：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｆは配合物中のパルミチン酸ＭＥ（１６：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｇは配合物中のステアリン酸ＭＥ（１８：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｈは配合物中のオレイン酸ＭＥ（１８：１）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｉは配合物中のリノール酸ＭＥ（１８：２）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｊは配合物中のリノレン酸ＭＥ（１８：３）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｋは配合物中のアラキドン酸ＭＥ（２０：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｌは配合物中のベヘン酸ＭＥ（２２：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｍは配合物中のリグノセリン酸ＭＥ（２４：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
ＭＰAは−８１℃から−６１℃までである；
ＭＰBは−５０℃から−３０℃までである；
ＭＰCは−２８℃から−８℃までである；
ＭＰDは−５℃から１５℃までである；
ＭＰEは９℃から２９℃までである；
ＭＰFは２１℃から４１℃までである；
ＭＰGは２８℃から４８℃までである；
ＭＰHは−３０℃から−１０℃までである；
ＭＰIは−４５℃から−２５℃までである；
ＭＰJは−６７℃から−４７℃までである；
ＭＰKは４５℃から６５℃までである；
ＭＰLは４３℃から６３℃までである；
ＭＰMは４８℃から６８℃までである；
ＦAは８から１２までである；
ＦBは３．５から５．５までである；
ＦCは１．０から１．４までである；
ＦDは０．８から１．２までである；
ＦEは０．５から０．７までである；
ＦFは１．１から１．６までである；
ＦGは１．８から２．６までである；
ＦHは０．９から１．３までである；
ＦIは０．５から０．８までである；
ＦJは０．１５から０．２５までである；
ＦKは８から１２までである；
ＦLは１．６から２．４までである；
ＦMは１．６から２．４までである。
【００８６】
本発明上記側面の特定の実施態様において、予測される融点は以下のように計算する：
PTm = [A(-71.0)(10.0) + B(-40.0)(4.5) + C(-18.0)(1.2) + D(5.2)(1.0) + E(19.0)(0.60) + F(30.7)(1.35) + G(37.8)(2.15) + H(-19.9)(1.10) + I(-35.0)(0.65) + J(-57)(0.2) + K(54.5)(10.0) + L(53.0)(2.0) + M(57.4)(2.0)]*(0.01),
また、ＡないしＭは上記定義のとおりである。
【００８７】
上記側面の関連する実施態様においては、アルゴリズムを用いて、バイオディーゼルとしての使用に適する脂肪酸メチルエステルの配合物を同定する；その場合、該配合物の予測される融点を計算し、カットオフ値と比較する。“カットオフ値”は本明細書にて使用する場合、所望の融点をいい、配合物が所望の融点よりも低いか、または等しいＰTmを有する場合、バイオディーゼルとしての使用に適する。特定の実施態様において、カットオフ値は０℃、好ましくは−５℃、好ましくは−１０℃、好ましくは−１５℃、好ましくは−２０℃、好ましくは０℃、または好ましくは−２０℃である。
【００８８】
用語“重量でのパーセント（重量％）”とは、本明細書にて使用する場合、配合物または混合物における成分の量をいう。一般に、この用語は混合物１００グラム当たりの成分のグラムをいう。例えば、“重量で１０％の化合物Ｘ”を含む混合物とは、混合物１００グラム中の化合物Ｘが１０グラムのことをいう。
【００８９】
用語“バイオディーゼル”とは、本明細書にて使用する場合、植物油または動物脂肪に由来する燃料をいう。一般に、バイオディーゼルは主として脂肪酸アルキルエステルから構成される。好ましくは、バイオディーゼルは内燃機関での使用に適する。
【００９０】
用語“バイオディーゼル配合物”とは、バイオディーゼルおよび別の燃料との配合物をいう。一般に、バイオディーゼルは石油に基づく燃料（すなわち、石油ディーゼル）と配合する。バイオディーゼル配合物はＢＸＸという。“ＸＸ”は配合物中のバイオディーゼルの量を示す。Ｂ１００は１００％のバイオディーゼルまたは“ニート”バイオディーゼルである。Ｂ２０配合物とは、例えば、２０％容量配合物のバイオディーゼルと８０％の石油ディーゼルである。
【００９１】
用語“燃料”とは、燃焼して熱または力を与える物質をいう。その例は、ガソリン、家庭用暖房油、航空燃料、灯油、ディーゼル、バイオディーゼル、植物油、およびバイオディーゼル配合物などの液体である。一部の燃料、例えば、ガソリン、ディーゼル、バイオディーゼル、植物油、またはバイオディーゼル配合物は内燃機関を駆動するために使用することができる。
【００９２】
“遺伝的に修飾した植物”という文言は、トランスジェニック植物または遺伝的に改変した植物をいう。
【００９３】
“未変性の植物”という用語は、本明細書にて使用する場合、遺伝的に修飾していない（すなわち、トランスジェニックまたは遺伝的に改変していない）植物をいう。未変性の植物は、野生型植物並びにある種の性質を得るために選択的に交配した植物である。
【００９４】
“トランスジェニック植物”という文言は、別の植物種または非植物種からの遺伝子を有する植物をいう。かかる遺伝子は“導入遺伝子”をいう。
【００９５】
“遺伝的に改変した植物”という文言は、１種以上の遺伝的修飾、例えば、１つ以上の設計された変異を含む導入遺伝子および／または修飾酵素を有する植物をいう。かかる設計された変異は、未変性の酵素とは異なる活性を有する修飾酵素を生じ得る。かかる差異は基質特異性または活性レベルの差異を含む。本明細書にて使用する場合、“トランスジェニック植物”とは“遺伝的に改変した植物”の一タイプである。
【００９６】
“燃料添加物”という文言は燃料に添加する液状物質をいい、最終燃料の５重量％未満を構成する。
【００９７】
“脂肪酸の混合物”または“脂肪酸の配合物”または“脂肪酸配合物”という文言は、互いに交換して使用し得るものであり、種々の脂肪酸を含有する組成物をいう。ある種の実施態様において、脂肪酸の混合物は油であるか、または油の配合物でもよく、他の実施態様においては、脂肪酸の混合物は遊離脂肪酸の混合物または遊離脂肪酸と油の混合物であるか、または油の配合物であり得る。ある種の実施態様において、脂肪酸混合物中の脂肪酸の一部または全部を修飾して、脂肪酸アルキルエステル、例えば、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、脂肪酸プロピルエステルなどを形成してもよい。ある種の好適な実施態様において、脂肪酸アルキルエステルはメチルエステルである。従って、特に断りのない限り、“脂肪酸の混合物”という文言は、本明細書にて使用する場合、混合物中で特定される脂肪酸の脂肪酸アルキルエステルの混合物を包含する。同様に、特に断りのない限り、本明細書にて使用する場合の用語“脂肪酸”は脂肪酸のアルキルエステルを包含する。
【００９８】
“機能的液体”という文言は、燃料に添加する液状物質をいい、最終燃料の５重量％を越えて包含する。
【００９９】
“凝固点降下”という文言は、燃料の凝固点を低下させるために、その燃料に添加する液状物質をいう。
【０１００】
“セタン価”またはＣＮは、燃料の点火特性の尺度であり、点火遅れ時間と相関する。例えば、高セタン価をもつ燃料はシリンダーに注入されて間もなく燃焼し始める（すなわち、それは短い点火遅れ時間をもつ）。対照的に、低セタン価をもつ燃料はより長い点火遅れ時間をもつ。さらに、より高いセタン価は、改善された燃焼、改善されたコールドスタート、ノイズ減少、白煙減少、および特に初期の暖機運転に際してのＨＣ、ＣＯおよび微粒子の排出減少と相関する。商業的に入手可能な石油由来のディーゼルは、一般に、２つのＣＮ範囲、すなわち、レギュラーディーゼルについては４０〜４６、またハイオクについては４５〜５０に見出される。
【０１０１】
“ヨウ素価”は植物油および脂肪における不飽和度を測定するために、標準的天然油アッセイにより決定する。
【０１０２】
“曇り点”とは最初の含ろう結晶が現れる温度をいい、アメリカ材料試験協会（ＡＳＴＭ）の標準的試験プロトコールを用いてこの温度を測定する。
【０１０３】
“流動点”とは、燃料がもはや流動しなくなる温度をいう。流動点は一般に曇り点よりも低い。一部のエンジンは曇り点で駆動し得ないが、一般にすべてのエンジンが流動点では駆動し得ない。
【０１０４】
結晶性固体の“融点”とは、状態を固体から液体へ変化させる温度をいう。逆の変化（すなわち、液体から固体へ）の温度として考慮した場合、それは“凝固点”という。殆どの物質の場合、融点と凝固点は等値である。融点または凝固点は流動点よりも低い。
【０１０５】
“供給原料”とは、本明細書にて使用する場合、バイオディーゼルの調製のための出発原料として使用し得る脂肪、脂肪酸、またはトリグリセリドから構成される物質をいう。バイオディーゼルの生産に使用し得る供給原料の例は、植物油、廃棄植物油、および動物脂肪である。他の供給原料は脂肪酸または脂肪酸アルキルエステルの混合物である。
【０１０６】
用語“約”とは、本明細書にて使用する場合、量についてプラスマイナス１０％の範囲にあることを意味する。例えば、“約３％”とは２．７〜３．３％の範囲を含み、“約１０％”とは９〜１１％の範囲を含む。
【０１０７】
特に断りのない限り、本明細書に示す百分率は重量パーセントである。
【０１０８】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態の説明から、また特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）からのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはＰＴＥ）の部分アミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【図２】アラビドプシス（Arabidopsis）からのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはＰＴＥ）のアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【図３】アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）からのケトアシル−シンターゼII（ＫＡＳ II）（ジェンバンク（GenBank）受託番号ＮＰ＿８４９８８８）のアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【図４】アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）からのケトアシル−シンターゼII（ＫＡＳ II）（ジェンバンク（GenBank）受託番号ＮＭ＿１７９５５７）のヌクレオチド配列（配列番号：４）を示す。
【図５】バイオディーゼルが油または脂肪から製造し得る２つの経路を示す。
【図６】一部例示としての油の脂肪酸含有率を示す。
【図７】曇り点に対する脂肪酸のアルキルエステル化の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
配合油
中鎖脂肪酸の種々の成分を含む油は、中鎖脂肪酸の所望の配合物を得るために、配合し得る。油は重量に基づいて配合する。例えば、２５％ナタネ油からなる配合物１００グラムに使用すべきナタネ油の容量は、最終配合物中のナタネ油のグラム数をナタネ油の比重で除することによって決定する（すなわち、２５ｇｍ／０．９１５ｇｍ／ｍＬ＝２７．３ｍＬ）。
【０１１１】
図６は含有される一部例示としての油および脂肪酸含有率を示す表である。これらの油は様々な供給元から商業的に入手可能である。注意すべきことは、当該技術分野で周知のように、特定の植物に存在する特定脂肪酸の量が相当に変動するため、その脂肪酸含有値をある範囲で表わすことである。従って、これらの植物から抽出される油は、いずれかの、またはすべての脂肪酸の量をバッチごとに違って示している可能性がある。それ故、通常は、配合物またはバイオディーゼルを製造するために実際に使用する油の脂肪酸含量を測定することが必要である。
【０１１２】
脂肪酸アルキルエステルの調製
脂肪酸アルキルエステルは脂肪酸またはトリグリセリドから製造することができる。一般に、脂肪酸アルキルエステルは油脂中のトリグリセリドのエステル交換反応または遊離脂肪酸のエステル化により製造する（図５）。あるいは、脂肪酸をトリグリセリドから加水分解により分断し、引き続きエステル化反応に付して脂肪酸エステルを製造する。
【０１１３】
脂肪酸アルキルエステルは、様々な植物由来の油、例えば、ダイズ油、パーム油、ベニバナ油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、ココヤシ油、ヒマシ油、ナタネ油、ヒマワリ油など、および動物脂肪由来の種々の油に見出されるトリグリセリドのエステル交換反応により調製し得る。これらの油は塩基触媒、例えば、ナトリウムアルコキシド、水酸化ナトリウムもしくはカリウム、チタニウムテトライソプロポキシドなどの存在下に、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール）と反応させる。温度および圧力などの反応条件は、具体的に使用されるアルコール基づき選択し得る。触媒量は、一般的に、脂肪酸に基づく重量で約０．１ないし約０．５％の範囲である。本工程では、脂肪酸アルキルエステルを、アルキル基がアルコールに由来する場合に製造する。従って、メタノールを使用する反応は、該アルコールが脂肪酸メチルエステルを生成する場合に使用した。他の副生物はグリセリンである。エステル交換産物は分別カラムを介する蒸留による減圧分別により単離する。
【０１１４】
脂肪酸アルキルエステルは、遊離脂肪酸からエステル化反応を経由して調製し得る。遊離の脂肪酸は多くの供給源から商業的に入手し得るか、または、例えば、上記の油から誘導し得るものであり、酸触媒、例えば、硫酸、アリールスルホン酸、またはアルキルスルホン酸などの酸触媒の存在下にアルコールと反応させ得る。温度および圧力などの反応条件は、使用する具体的なアルコールに基づき選択し得る。脂肪酸エステルは、硫酸を中和し、次いで精製して、水性反応成分を除去することにより、回収することができる。
【０１１５】
脂肪酸エステルの配合
脂肪酸エステルは商業的に入手し得るか、または上記のように脂肪酸のエステル化反応により取得し得る。脂肪酸は、バイオディーゼル、燃料添加物、機能的流体、飛行もしくはジェット燃料、家庭用暖房油、または灯油としての使用に適切な性質を有する混合物を得るために配合する。配合物を評価する際に考慮すべき性質は、融点、曇り点、流動点、ヨウ素価、セタン価、粘度、酸化安定性、および摩擦磨耗特性であり得る。
【０１１６】
配合物は重量パーセントに基づいて作製する。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の配合物の場合、各ＦＡＭＥ成分の所望の重量パーセントは、そのＦＡＭＥの比重で割り算する。これによって、最終配合物１００グラム当たりのＦＡＭＥ容量を得る。例えば、カプリン酸メチルエステル（比重０．８７７ｇ／ｍＬを有する）１４％（重量％）を含む配合物を得るためには、最終配合物１００グラムを作製する上で使用すべきカプリン酸メチルエステルの容量は以下のように決定する。
カプリン酸メチルエステルの容量＝（１４ｇ／０．８７７ｇ／ｍＬ）＝１５．９６ｍｌ
従って、最終配合物１００ｇｍそれぞれに、カプリン酸メチルエステル１５．９６ｍｌが必要とされよう。
【０１１７】
油配合物に含まれる脂肪酸を脂肪酸エステルに変換することから生じるＦＡＭＥ配合物またはＦＡＭＥ混合物の重量パーセントの測定は、フレームイオン化検出計（ＦＩＤ）を備えたキャピラリーガスクロマトグラフ（アジレントモデル６８９０）（カラム−スペルコ（Supelco）ＳＰＢ−２２５、３０Ｍ×０．３２ｍｍ、０．２５μｍフィルム厚さ）により実施する。サンプルピーク面積を各ピークについて換算した標準ＦＡＭＥの既知重量のピーク面積と比較し、サンプル中の各ＦＡＭＥの重量を決定する。すべての重量を合計した（パーセントに換算後の）総量に対する個々のＦＡＭＥ重量比は重量パーセントである。
【０１１８】
融点：脂肪酸エステル配合物の低融点は、かかる配合物を寒冷天候下で使用する場合に凝固するのを回避するために望ましい。脂肪酸メチルエステル配合物の低融点を得る手段は、一般に、常套のディーゼル燃料との配合、分枝鎖エステルおよび／またはアルキル鎖に嵩高い置換基を有する添加物の包接、および／または配合物の脱ろうなどである。本発明の配合物は、中鎖脂肪酸メチルエステル、特にＣ８およびＣ１０メチルエステルの包接により低融点を達成する。従って、脂肪酸エステルはある種の融点を得るように配合することが可能であり、また得られた配合物の融点を測定することができる。
【０１１９】
融点は当該技術分野で周知の方法により測定し得る。一方法において、脂肪酸メチルエステル配合物の融点は、配合物の一部を一端閉鎖ガラスキャピラールチューブに容れ、配合物の予測される融点以下の温度に保持した水浴またはエチレングリコール浴中でチューブを平衡化することにより測定する。チューブとその内容物が平衡となる充分な時間の経過後、水浴の温度をゆっくりと上昇させる。チューブを目視で観察するか、または光散乱装置（分光光度計）により観察する。固体から液体に遷移が観察される温度または光散乱が減衰する温度を、サンプルの融点として記録する。
【０１２０】
単一の融点に置き換わるものは、上に説明するように、“スリップ融点”である。この方法では少量のサンプルを一端閉鎖キャピラールに容れ、サンプルがチューブ長方向の中心に停止するようにする。水浴中で平衡化した後、温度をゆっくりと上昇させ、停止させたサンプルがキャピラール中で落下または“スリップ”し始めた瞬間の温度をスリップ融点として記録する。
【０１２１】
固体脂肪の融点の測定については、アメリカ穀草類化学者協会（ＡＡＣＣ）が記載する方法、方法番号５８−４０“融点−キャピラリー法、および方法番号５８−５３スリップ融点法”に詳細に記載されている。さらに、アメリカ油化学者学会（ＡＯＣＳ）公式方法Ｃｃ１−２５“融点キャピラリーチューブ法”およびＡＯＣＳ公式方法Ｃｃ３−２５“スリップ融点ＡＯＣＳ標準オープンチューブ融点”からの方法が利用可能である。
【０１２２】
別法として、予測される融点は本明細書に含まれるアルゴリズムを用いて算出することができる。
【０１２３】
曇り点および流動点：曇り点および流動点は一つの装置を用いる同じ実験で測定し得る。簡単に説明すると、サンプルを曇りおよび流動点装置中で冷却し、冷却下に定期的に試験する。かすみの観察される最高温度が曇り点である。油の動きが観察される最低温度が流動点である。本方法はＡＳＴＭ Ｄ９７、Ｄ２５００および関連仕様書に従うべきである。かかる装置（Ｋ４６１００曇り点と流動点装置曇り点および流動点チャンバー）は、ケーラー（Koehler）インストルーメントカンパニー、インク（１５９５シカモアー（Sycamore）通り、ボヘミア、ニューヨーク１１７１６、米国）から入手し得る。
【０１２４】
セタン価：ディーゼル燃料（ＤＦ）の点火特性は共通してアメリカ材料試験協会（ＡＳＴＭ）試験法ＡＳＴＭ Ｄ６１３によって測定し、セタン価（ＣＮ）として報告される。点火特性は、エンジンにおける燃料の点火遅れ時間と定義される。点火遅れ時間が短い程、ＣＮは高くなる。化合物はセタン目盛りに従ってランク付けする。セタン（Ｃ16Ｈ34またはヘキサデカン）は非常に短い点火遅れを示し、１００のＣＮを割り当てる。目盛りの他端は２，２，４，４，６，８，８−ヘプタメチルノナン（ＨＭＮ；またＣ16Ｈ34）であり、点火特性が劣り、１５のＣＮを割り当てる。一般に、長鎖非分枝飽和炭化水素（アルカン）は高ＣＮ値と良好な点火特性を有し、一方、分枝炭化水素（および芳香族などの他の材料）は低ＣＮ値と不良な点火特性を有する。さらに、脂肪酸に二重結合または不飽和度が存在する場合、セタン価は低くなる。
【０１２５】
高すぎるＣＮおよび低すぎるＣＮは共に操作上の問題を惹き起こし得るので（ＣＮが高すぎる場合、燃料と空気が適切に混合する前に燃焼が起こり得、不完全燃焼と排煙を起こす；ＣＮが低すぎる場合、エンジン粗度、ミスファイアリング、高空気温度、遅いエンジン暖機、および不完全燃焼もまた起こる）、殆どのエンジン製造業者は彼らのエンジンに対して要求されるＣＮの範囲を明示する。殆どの場合、この範囲はＣＮ４０〜５０前後である。例えば、常套のディーゼル燃料に対するＡＳＴＭ規格（ＡＳＴＭ Ｄ９７５）は４０の最少ＣＮを必要とする。
【０１２６】
ヨウ素価：ヨウ素価は共通して使用される飽和の測定、従って、酸化安定性の指標である。先に述べたように、不飽和分子は飽和分子よりも酸化を受け易い。この試験では、油または燃料中の二重結合の数を測定するためにヨウ素を使用する。従って、ダイズ油（ＩＮ＝１３０〜１３５）などの高いヨウ素価を有する油は、非常に酸化を受けやすいが、一方、獣脂（ＩＮ＝３０〜４８）などの低ヨウ素価をもつ動物脂肪は、余り酸化され易くない。ヨウ素価の主たる欠点は、一部の二重結合が他のものよりもより容易に酸化を受けることを認識しないということである。リノール酸メチルは２つの二重結合をもつが、１つしか二重結合をもたないオレイン酸メチルよりも約５０倍速く酸化を受ける。３つの二重結合をもつリノレン酸メチルはさらに急速に酸化を受けるが、その上昇レベルは同じではない。従って、主として飽和の中鎖脂肪酸の配合物は、低いヨウ素価を示すことが予測され、従って、良好な酸化安定性を示す。
【０１２７】
改変脂肪酸組成をもつ油を産生する遺伝的に改変した植物の産生
米国特許第６，１５０，５１２号は、“植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質特異性を改変する方法、およびそのように産生させた遺伝子工学改変植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを提供すること”、特に、“１８：０比活性が上昇したマンゴスチン・ガームファット（Garm Fat）Ａ１ １８：１チオエステラーゼ”を開示している。
【０１２８】
米国特許第５，９５５，３２９号は、“植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質特異性を改変する方法、および遺伝子工学的に改変した植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ”を開示している。特に、“ここに記載されているＣ１２優先の植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを改変して、Ｃ１４およびＣ１２基質に対して略等しい活性を有する植物チオエステラーゼを取得し得る”ことが開示されている。
【０１２９】
カールソンら（Carlsson et al. Plant Journal 29(6):761-770, 2002）は、“β−ケトアシル−［アシル・キャリヤタンパク質］シンターゼII（ＫＡＳII）の活性を部分的に欠如するアラビドプシス（Arabidopsis）のｆａｂ１変異体”について開示している。ｆａｂ１変異は、“Ｌｅｕ３３７Ｐｈｅ置換を生じるアラビドプシスＫＡＳ２の配列における１個のヌクレオチドの変化”であると記載している。
【０１３０】
ナップら（Knapp et al.“クフェアの脂質種子貯蔵の修飾：中鎖トリグリセリドの供給源”Seed Oils for the Future, 142-154, Champaign, Ill., AOCS Press）は、改変されたトリグリセリド成分を含む油を産生する、ランダム変異誘発により創出した変異体クフェア・ヴィスコシッシマ（Cuphea viscosissima）を開示している。
【０１３１】
米国特許第５，６６７，９９７号、第５，４５５，１６７号、第５，２９８，４２１号および第５，５１２，４８２号は、中鎖脂肪酸に特異性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのヌクレオチドとアミノ酸の配列およびこれらのチオエステラーゼそれぞれを発現する対応するトランスジェニック植物を開示している。
【０１３２】
中鎖脂肪酸を産生する遺伝的に改変した植物は、脂肪酸生合成経路内の１種以上の酵素を変異または修飾することにより生産し得る。脂肪酸生合成は植物の色素体にて起こる。脂肪酸の合成は、アシルタンパク質キャリヤ（ＡＣＰ）に結合した２炭素前駆体から、酵素ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）が触媒する反応において連続して起こる２炭素付加を経て、進行する。このプロセスの間、脂肪酸はＡＣＰにエステル化されたままであり、その結果、アシル部分が多様な長さのアシル−ＡＣＰ中間体がプールされる。色素体に存在するチオエステラーゼは、脂肪酸とＡＣＰ間のチオール−エステル連結を加水分解し、その結果、脂肪酸を放出するが、その脂肪酸は色素体中に存在し得、またトリグリセリドに組み込まれ得る。
【０１３３】
ＫＡＳの数種の異性体は特定の長さのアシル鎖に対し親和性を有する。例えば、ＫＡＳＩ酵素、例えば、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）の酵素は、炭素数１６を超えるアシル鎖に対して親和性が低く、従って、この酵素については１６個の炭素を超えてアシル鎖を伸張できない。ＫＡＳIIは１６個の炭素のアシル鎖を１８個の炭素のアシル鎖に伸張する反応を特異的に触媒する。ＫＡＳIIは炭素が１６個より長くても短くても、アシル鎖に対し殆ど親和性を示さない。
【０１３４】
同様に、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは特定の長さのアシル鎖に優先的な活性を有するものが同定されてきた。例えば、１８個炭素の脂肪酸を含むアシル−ＡＣＰ類（例えば、オレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはＯＴＥ）を主として加水分解するチオエステラーゼが存在する。同様に、１６個炭素の脂肪酸を含むアシル−ＡＣＰ類（例えば、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはＰＴＥ）に対して優先的な活性を有するチオエステラーゼが存在する。さらに、種々の中鎖脂肪酸に対し優先的活性を有するチオエステラーゼが報告されている。特定の鎖長の脂肪酸アシル−キャリヤ基質に対する植物チオエステラーゼの“優先的活性”は、異なる鎖長の基質当たり得られる遊離脂肪酸産生量を比較することにより測定する。例えば、“Ｃ１２−優先”とは、酵素調製物の加水分解活性が、異なるアシル炭素鎖長の他の基質に優先して、ラウロイル、および恐らくデカノイルに対して優先性を示すことを意味する。同様に、“Ｃ１０−優先”活性をもつ植物チオエステラーゼは、異なる炭素鎖長の他の基質に優先して、デカノイル基質、および恐らくオクタノイルに対してより高い活性レベルを示す。注意すべきことは、有意に程度の劣る一部の活性が他の鎖長の脂肪酸基質について観察され得ることである。従って、優先性は実質的なものであるが、絶対的なものではない。
【０１３５】
好適な実施態様において、修飾酵素を発現する遺伝的に改変した植物は、本明細書で説明するように、遺伝子修復オリゴヌクレオベースの使用を介して、該酵素に変異を導入することにより製造する。該方法は、対象となる標的遺伝子に特異的な変異を含む遺伝子修復オリゴヌクレオベースを、当該技術分野にて周知の多くの方法（例えば、マイクロキャリヤー、マイクロファイバー、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクション）のいずれかにより、植物細胞に導入し、その変異酵素を有する細胞、種子または植物を同定することからなる。
【０１３６】
本明細書にて使用する場合、用語“標的遺伝子”とは、修飾すべき酵素をエンコードする遺伝子をいう。
【０１３７】
遺伝子修復オリゴヌクレオベース
本発明は以下に詳細に記載するコンフォメーションと化学的性質を有する“遺伝子修復オリゴヌクレオベース”により実施し得る。本発明の“遺伝子修復オリゴヌクレオベース”とは、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド不含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、および下記の特許および特許公開公報に記載された他の遺伝子修復分子である。本発明の“遺伝子修復オリゴヌクレオベース”は、公刊された科学文献および特許文献にも記載されているが、そこでは他の名称、例えば、“遺伝子組換えオリゴヌクレオベース”；“ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド”；“キメラオリゴヌクレオチド”；“混合二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）”；“ＲＮＡ ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＤＯ）”；“遺伝子標的オリゴヌクレオチド”；“ゲノプラスト”；“一本鎖修飾オリゴヌクレオチド”；“一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異性ベクター”；“二本鎖変異性ベクター”；および“ヘテロ二本鎖変異性ベクター”などを使用している。
【０１３８】
クミエックによって米国特許第５，５６５，３５０号（クミエックＩ）に、またクミエックによって米国特許第５，７３１，１８１号（クミエックII）（参照により本明細書の一部とする）に記載されたコンフォメーションと化学的性質を有するオリゴヌクレオベースは、本発明の“遺伝子修復オリゴヌクレオベース”としての使用に適している。クミエックＩおよび／またはクミエックIIにおける遺伝子修復オリゴヌクレオベースは、二本の相補的ストランドを含み、その一方は、他方のストランドのＤＮＡ型ヌクレオチドに塩基対合するＲＮＡ型ヌクレオチドの少なくとも１セグメント（“ＲＮＡ−セグメント”）を含む。
【０１３９】
クミエックIIは、プリンおよびピリミジン塩基含有非ヌクレオチドがヌクレオチドと置き換え得ることを開示している。本発明に使用し得るさらなる遺伝子修復分子が米国特許第５，７５６，３２５号；第５，８７１，９８４号；第５，７６０，０１２号；第５，８８８，９８３号；第５，７９５，９７２号；第５，７８０，２９６号；第５，９４５，３３９号；第６，００４，８０４号；および第６，０１０，９０７号に、また国際特許ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７；さらに、国際特許公開ＷＯ９８／４９３５０；ＷＯ９９／０７８６５；ＷＯ９９／５８７２３；ＷＯ９９／５８７０２；およびＷＯ９９／４０７８９（これらの全文をそれぞれ参照により本明細書の一部とする）に開示されている。
【０１４０】
一実施態様において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースは、混合二本鎖オリゴヌクレオチドであり、その場合、混合二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ型のヌクレオチドは、その２'−ヒドロキシルをフルオロ、クロロまたはブロモ官能基と置き換えることにより、または２'−Ｏ上に置換基を置くことにより、ＲＮアーゼ抵抗性とする。適切な置換基はクミエックIIが教示する置換基を包含する。替わり得る置換基は、米国特許第５，３３４，７１１号（スプロート；Sproat）が教示する置換基および欧州特許公開第６２９ ３８７号および第６７９ ６５７号（共に、マーチン（Martin）出願）（参照により本明細書の一部とする）が教示する置換基である。本明細書にて使用する場合、リボヌクレオチドの２'−フルオロ、クロロまたはブロモ誘導体またはマーチン出願もしくはスプロートに記載された置換基で置換された２'−ＯＨを有するリボヌクレオチドは、“２'−置換リボヌクレオチド”と呼称する。本明細書にて使用する場合、“ＲＮＡ型ヌクレオチド”は、未置換ホスホジエステル連結により、またはクミエックＩまたはクミエックIIが教示する非天然連結のいずれかにより、混合二本鎖オリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドに連結する２'−ヒドロキシルまたは２'−置換ヌクレオチドを意味する。本明細書にて使用する場合、用語“デオキシリボ型ヌクレオチド”とは、２'−Ｈを有するヌクレオチドを意味し、このものは未置換ホスホジエステル連結により、またはクミエックＩまたはクミエックIIが教示する非天然連結のいずれかにより、遺伝子修復オリゴヌクレオベースの他のヌクレオチドに連結し得る。
【０１４１】
本発明の特定の実施態様において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースは未置換ホスホジエステル結合によってのみ連結する混合二本鎖オリゴヌクレオチドである。替わり得る実施態様において、該連結は置換ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体およびクミエックIIが教示する非リン酸ベースの連結によるものである。さらに別の実施態様において、混合二本鎖オリゴヌクレオチドにおける各ＲＮＡ型ヌクレオチドは、２'−置換ヌクレオチドである。２'−置換リボヌクレオチドの特に好適な実施態様は、２'−フルオロ、２'−メトキシ、２'−プロピルオキシ、２'−アリルオキシ、２'−ヒドロキシルエチルオキシ、２'−メトキシエチルオキシ、２'−フルオロプロピルオキシおよび２'−トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。２'−置換リボヌクレオチドのより好適な実施態様は、２'−フルオロ、２'−メトキシ、２'−メトキシエチルオキシ、および２'−アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の実施態様において、混合二本鎖オリゴヌクレオチドは未置換ホスホジエステル結合により連結する。
【０１４２】
単一の型の２'−置換ＲＮＡ型ヌクレオチドのみを有する混合二本鎖オリゴヌクレオチドはさらに簡便に合成されるが、本発明の方法は、２種以上の型のＲＮＡ型ヌクレオチドを有する混合二本鎖オリゴヌクレオチドで実施する。ＲＮＡセグメントの機能は、２つのＲＮＡ型トリヌクレオチドの間にデオキシヌクレオチドを導入することにより惹起される分断により影響され得ない、従って、用語ＲＮＡセグメントは“分断ＲＮＡセグメント”などを包含する。未分断ＲＮＡセグメントは隣接ＲＮＡセグメントと呼称する。替わり得る実施態様において、ＲＮＡセグメントはＲＮアーゼ抵抗性ヌクレオチドおよび未置換２'−ＯＨヌクレオチドを交互に含み得る。混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１００個未満のヌクレオチド、そしてより好ましくは８５個未満のヌクレオチドではあるが、５０個を超えるヌクレオチドである。第一と第二のストランドはワトソン−クリック塩基対合する。一実施態様において、混合二本鎖オリゴヌクレオチドのストランドは、第一と第二のストランドが、単一の３'および単一の５'末端をもつ単一のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントであるように一本鎖のヘキサ、ペンタまたはテトラ−ヌクレオチドなどのリンカーによって共有結合する。３'および５'末端は“ヘアピンキャップ”を付加することにより保護し、それによって３'および５'末端ヌクレオチドを隣り合うヌクレオチドにワトソン−クリック対合させる。第二のヘアピンキャップは、さらに、３'および５'末端から離れた第一および第二のストランド間の結合位置に置くことができ、その結果、第一および第二のストランド間のワトソン−クリック対合が安定化する。
【０１４３】
第一および第二のストランドは標的遺伝子の２つのフラグメントと相同である、すなわち、標的遺伝子と同一の配列を有する２ヶ所の領域を含む。相同領域はＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含み、ＤＮＡセグメントを結合する１つ以上のＤＮＡ型ヌクレオチドを含み得、またその間のＤＮＡセグメント内には含まれていないＤＮＡ型ヌクレオチドをも含み得る。２つの相同性領域が、“異種領域”と呼ばれる標的遺伝子の配列とは異なる配列を有する領域により隔てられ、またそれぞれが隣接している。該異種領域は１個、２個または３個のミスマッチヌクレオチドを含み得る。ミスマッチヌクレオチドは隣接しているか、あるいは標的遺伝子と相同である１個または２個のヌクレオチドにより隔てられている。あるいは、異種領域は１個の挿入、または１個、２個、３個、または５個以下のヌクレオチドを含み得る。あるいは、混合二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、標的遺伝子の配列と、混合二本鎖オリゴヌクレオチドから１個、２個、３個、または５個以下のヌクレオチドが欠失した分だけ異なり得る。異種領域の長さと位置は、この場合、喩え混合二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが異種領域内にないとしても、欠失の長さであると思われる。２つの相同領域に相補性である標的遺伝子のフラグメント間の距離は、一つまたは複数の置換を意図する場合、異種領域の長さに一致させる。異種領域が挿入を含む場合、相同領域はそれによって混合二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、それらの相補性相同フラグメントが遺伝子にあるよりもさらに離れて隔てられ、その逆は異種領域が欠失をエンコードする場合に適用し得る。
【０１４４】
混合二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡセグメントはそれぞれ相同性領域、すなわち、標的遺伝子のフラグメントに配列が同一である領域、の一部であり、そのセグメントは共に、好ましくは少なくとも１３個のＲＮＡ型ヌクレオチド、そして好ましくは１６個ないし２５個のＲＮＡ型ヌクレオチド、またはさらにより好ましくは１８〜２２個のＲＮＡ型ヌクレオチド、または最も好ましくは２０個のヌクレオチドを含む。一実施態様において、相同性領域のＲＮＡセグメントは介在するＤＮＡセグメントにより隔てられ、また隣接している、すなわち、ＤＮＡセグメントにより“連結”されている。一実施態様において、異種領域の各ヌクレオチドは介在するＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。混合二本鎖オリゴヌクレオチドの異種領域を含む介在ＤＮＡセグメントは、“ミューテーターセグメント”と呼称される。
【０１４５】
本発明の別の実施態様において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異ベクター（ＳＳＯＭＶ）であり、このものは国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７、米国特許第６，２７１，３６０号、第６，４７９，２９２号、および第７，０６０，５００号（参照によりその全文を本明細書の一部とする）に開示されている。ＳＳＯＭＶの配列は、米国特許第５，７５６，３２５号；第５，８７１，９８４号；第５，７６０，０１２号；第５，８８８，９８３号；第５，７９５，９７２号；第５，７８０，２９６号；第５，９４５，３３９号；第６，００４，８０４号；および第６，０１０，９０７号および国際特許公開ＷＯ９８／４９３５０；ＷＯ９９／０７８６５；ＷＯ９９／５８７２３；ＷＯ９９／５８７０２；およびＷＯ９９／４０７８９に記載されている変異ベクターと同じ原理に基づいている。ＳＳＯＭＶの配列は、ミューテーター領域と呼称される所望の遺伝子改変を含む領域により隔てられた標的配列と相同である２つの領域を含む。ミューテーター領域は、標的配列の相同性配列を隔てる配列と同じ長さであるが異なる配列をもつ配列を有し得る。かかるミューテーター領域は置換を起こし得る。あるいは、ＳＳＯＭＶの相同性配列は互いに隣接し得るが、一方、同じ配列をもつ標的遺伝子の領域は、１個、２個またはそれ以上のヌクレオチドによって隔てられている。かかるＳＳＯＭＶはＳＳＯＭＶに欠けているヌクレオチドの標的遺伝子からの欠失を惹き起こす。最終的に、相同性領域に一致する標的遺伝子の配列は、標的遺伝子において隣接し得るが、ＳＳＯＭＶの配列において、１個または２個以上のヌクレオチドにより隔てられている。かかるＳＳＯＭＶは標的遺伝子配列において挿入の原因となる。
【０１４６】
ＳＳＯＭＶのヌクレオチドは、未修飾ホスホジエステル結合により連結されたデオキシリボヌクレオチドであるが、ただし、３'−末端および／または５'−末端ヌクレオチドの連結、あるいは２つの３'−末端および／または５'−末端ヌクレオチドの連結は、ホスホロチオアートまたはホスホアミデートであり得る。本明細書にて使用する場合、ヌクレオチドの連結はＳＳＯＭＶのヌクレオチド間の連結であり、３'−末端ヌクレオチドまたは５'−末端ヌクレオチド間の連結および保護置換基を含んでいない（上記参照）。具体的実施態様において、ＳＳＯＭＶの長さは２１個ないし５５個のデオキシヌクレオチドであり、相同性領域の長さは、従って、少なくとも２０個のデオキシヌクレオチドの合計の長さであって、少なくとも２つの相同性領域はそれぞれ少なくとも８個のデオキシヌクレオチドの長さをもつべきである。
【０１４７】
ＳＳＯＭＶは標的遺伝子のコーディングまたは非コーディングストランドに相補的であるように設計することができる。所望の変異が１個の塩基の置換である場合、ミューテーターヌクレオチドは双方がピリミジンであることが好ましい。所望の機能的結果を得ることと矛盾しない限り、該ミューテーターヌクレオチドと相補性ストランドの標的ヌクレオチドは共にピリミジンであることが好ましい。特に好適なのは、トランスバージョン変異をエンコードするＳＳＯＭＶ、すなわち、ＣまたはＴミューテーターヌクレオチドが、それぞれ相補性ストランドのＣまたはＴヌクレオチドとミスマッチしているＳＳＯＭＶである。
【０１４８】
オリゴデオキシヌクレオチドに加えて、ＳＳＯＭＶはリンカーを介して５'−末端炭素に付着する５'−保護置換基を含み得る。リンカーの化学的性質はその長さ以外あまり重要ではなく、その長さは少なくとも６個の原子の長さとすべきであり、リンカーは柔軟性に富むべきである。様々な非毒性の置換基は、例えば、ビオチン、コレステロールまたはその他のステロイド類または非インターカレーションカチオン性蛍光色素などが使用し得る。ＳＳＯＭＶ調製の試薬として特に好適なものは、グレン・リサーチ（スターリング、バージニア）がＣｙ３．ＴＭ．およびＣｙ５．ＴＭ．として販売される試薬であり、これらはオリゴヌクレオチドに取り込まれて、３，３，３'，３'−テトラメチルＮ，Ｎ'−イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニンをそれぞれ生成する保護ホスホロアミダイトである。Ｃｙ３が最も好適である。インドカルボシアニンがＮ−オキシアルキル置換されている場合、そのものは５'−末端リン酸エステルをもつホスホジエステルを介して、オリゴデオキシヌクレオチドの５'−末端に常套的に連結させ得る。該色素とオリゴデオキシヌクレオチド間の色素リンカーの化学的性質はそれ程問題ではなく、合成し易いように選択する。市販品として入手可能なＣｙ３ホスホルアミダイトをそのまま使用する場合、得られる５'−修飾は保護置換基とリンカーとからなり、それらはＮ−ヒドロキシプロピル、Ｎ'−ホスファチジルプロピル ３，３，３'，３'−テトラメチル インドモノカルボシアニンである。
【０１４９】
好適な実施態様において、インドカルボシアニン色素はインドール環の３および３'位でテトラ置換されている。理論的に限定されるものではないが、これらの置換は、色素がインターカレーションを受けることから色素を保護する。これらの位置として置換基を同定することは重要ではない。ＳＳＯＭＶはさらに３'保護置換基を有し得る。再度、３'保護置換基の化学的性質は重要ではない。
【０１５０】
修飾酵素
脂肪酸生合成経路に関与する酵素をエンコードする遺伝子は、変異の好適な標的である。一部の実施態様において、標的遺伝子はアシルＡＣＰチオエステラーゼをエンコードする。他の実施態様において、標的遺伝子はケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）をエンコードする。変異は、酵素活性を低下させるかまたは除去するように、または酵素活性を改変（例えば、基質選択性の変更）するように設計することができる。一部の実施態様においては、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を修飾する。ある種の実施態様においては、Δ１２デサチュラーゼをエンコードするＦＡＤ２遺伝子を標的として、リノレン酸（１８：３）およびリノール酸（１８：２）のレベルを低下させ、オレイン酸（１８：１）のレベルを上昇させる。
【０１５１】
本発明の特定の実施態様においては、未変性のアシルＡＣＰチオエステラーゼを変異させる。一例においては、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）のアシルＡＣＰチオエステラーゼは、配列番号２（SEQ ID NO:2）のアミノ酸残基９１〜３９７に相当する領域を変異させる。好適な実施態様においては、１つ以上の変異が配列番号２のアミノ酸残基１２８〜１４７、配列番号２のアミノ酸残基１７５〜２０６、配列番号２のアミノ酸残基２５４〜２９７、配列番号２のアミノ酸残基３３３〜３３５、または配列番号２のアミノ酸残基３６５〜３９７に相当する領域の位置に存在する。
【０１５２】
本発明の他の実施態様においては、未変性のケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）酵素を変異させる。一例において、ＫＡＳ酵素はＫＡＳII酵素であり、配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３８５に相当する領域で変異させる。好適な実施態様においては、１つ以上の変異が配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３５２または配列番号３のアミノ酸残基３５５〜３８５に相当する領域の位置に存在する。より好適な実施態様において、１つ以上の変異が配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３４０またはさらに配列番号３のアミノ酸残基３３１〜３３７に相当する領域に存在する。一部の実施態様において、配列番号３の３３７位置の保存ロイシン残基に相当するアミノ酸が変異を受けている。特定の実施態様においては、配列番号３の３３７位置の保存ロイシン残基に相当するアミノ酸が変異を受け、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまたはヒスチジンとなっている。他の実施態様においては、配列番号３の３３１位置の保存フェニルアラニン残基に相当するアミノ酸が変異を受ける。ある種の実施態様においては、配列番号３の３３１位置の保存フェニルアラニン残基に相当するアミノ酸が変異を受け、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、システイン、またはバリンとなる。
【０１５３】
遺伝子修復オリゴヌクレオベースの植物細胞への送達
植物細胞を遺伝子修復オリゴヌクレオベースで形質転換する本発明方法においては、一般に知られるいずれの方法も使用し得る。例示される方法は、マイクロキャリヤーまたはマイクロファイバー、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションの使用であり、以下に記載のとおりである。
【０１５４】
一部の実施態様において、金属マイクロキャリヤー（微粒子）はセルロース細胞壁をもつ植物細胞にＤＮＡの大きなフラグメントを発射貫通（バイオリスティック（Biolistic）送達）により導入するために使用するもので、関連技術分野の当業者に周知である。マイクロキャリヤーを選択する一般的技法およびそれらを発射する装置については、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，１００，７９２号；および第５，２０４，２５３号に記載されている。
【０１５５】
本発明の方法においてマイクロキャリヤーを使用するための具体的な条件については、国際特許公開ＷＯ９９／０７８６５、ＵＳ０９／１２９，２９８に記載されている。例えば、氷冷マイクロキャリヤー（６０ｍｇ／ｍＬ）、混合二本鎖オリゴヌクレオチド（６０ｍｇ／ｍＬ）、２．５Ｍ−ＣａＣｌ2および０．１Ｍスペルミジンをこの順序で加える；混合物を緩やかに、例えば、ボルテックスにより１０分間かき混ぜ、室温で１０分間放置し、次いで直ちにマイクロキャリヤーを５倍容量のエタノールに希釈し、遠心分離し、１００％エタノールに再懸濁する。例示として、粘着性溶液中の成分濃度は、８〜１０μｇ／μＬのマイクロキャリヤー、１４〜１７μｇ／μＬの混合二本鎖オリゴヌクレオチド、１．１〜１．４Ｍ−ＣａＣｌ2および１８〜２２ｍＭスペルミジンを含有する。一例において、該成分濃度は、８μｇ／μＬのマイクロキャリヤー、１６．５μｇ／μＬの混合二本鎖オリゴヌクレオチド、１．３Ｍ−ＣａＣｌ2および２１ｍＭスペルミジンである。
【０１５６】
遺伝子修復オリゴヌクレオベースはまた、本発明実施のためにマイクロファイバーを用いて植物細胞に導入させ、細胞壁と細胞膜を貫通させる。コフィー（Coffee；米国特許第５，３０２，５２３号）は、ブラック・メキシコ・スイートコーンの懸濁トウモロコシ培養株の形質転換を容易にするために、３０×０．５μｍおよび１０×０．３μｍのシリコンカーバイドファイバーを使用することについて記載している。マイクロファイバーを用いる植物細胞の形質転換のためには、ＤＮＡの導入に使用し得る機械技法が、遺伝子修復オリゴヌクレオベースの送達に使用し得る。
【０１５７】
遺伝子修復オリゴヌクレオベースのマイクロファイバー送達の一例は、以下のとおりである。無菌のマイクロファイバー（２μｇ）を、約１０μｇの混合二本鎖オリゴヌクレオチドを含む植物培養培地１５０μＬに懸濁する。懸濁培養液を静置し、等容積のパック細胞と無菌ファイバー／ヌクレオチド懸濁液を１０分間ボルテックス処理し、プレートに播く。選択培地は、直ちに適用するか、または特定の形質にとって適切である場合、約１２０時間までの遅れで適用する。
【０１５８】
替わりとなる実施態様において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースは植物の部分に由来するプロトプラストのエレクトロポレーションにより、植物細胞に送達し得る。プロトプラストは当業者周知の技法に従って、植物の部分、特に葉を酵素処理することにより形成させる。（参照：e.g., Gallois et al., 1996, Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp et al., 1999, Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, N.J.）。プロトプラストはエレクトロポレーションの前に、増殖培地にて培養する必要がない。エレクトロポレーションの例証としての条件は、総容量０．３ｍＬ中、３×１０5個のプロトプラストであり、その場合の遺伝子修復オリゴヌクレオベースの濃度は０．６〜４μｇ／ｍＬである。
【０１５９】
さらに別の替わり得る実施態様において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースは植物細胞のホイスカー（whiskers）またはマイクロインジェクションにより植物細胞に送達することができる。いわゆるホイスカー技法については、文献（Frame et al., 1994, Plant J. 6:941-948）に記載されたとおりに実質的に実施される。遺伝子修復オリゴヌクレオベースをホイスカーに加え、それを使用して植物細胞を形質転換する。遺伝子修復オリゴヌクレオベースは、植物細胞中でリコンビナーゼおよび／または遺伝子修復複合体を形成し得るタンパク質をエンコードする配列からなるプラスミドと同時培養するとよい；その結果、遺伝子修復がオリゴヌクレオチドと標的遺伝子中の標的配列の間で触媒される。
【０１６０】
修飾酵素を有する植物の選択
修飾酵素を発現する植物または植物細胞は、多くの手段のいずれかを介して同定することができる。一方法において、同時変換戦略は、同じ実験において選択可能な変換（すなわち、マーカー）および非選択性変換（例えば、対象の標的遺伝子）の両方を標的とするために、遺伝子修復オリゴヌクレオベース（ＲＯＮ）を使用する。例えば、カノーラ中のＡＬＳ（またはＡＨＡＳ）遺伝子は、１個のアミノ酸変化により修飾して、インビトロで、イミダゾリノン（ＩＭＩ）分類の除草剤に対し、（遺伝子変換を介して）耐性を提供し得る。ＡＬＳ遺伝子と他の標的遺伝子／対立遺伝子の変換を標的とし、生成するＩＭＩに対し再生するカルスを選択する遺伝子修復オリゴヌクレオベースを同時に送達することで、変換適格個体群を同定する。この方法においては、ＲＯＮが送達されなかった、またはＲＯＮにより特定された変換を伝達し得なかった細胞が排除されよう。関与していない遺伝子を標的とするＲＯＮの送達は選択的であるとは期待されないので、ある頻度で、ＡＬＳ変換を有する再生カルスは、他の標的遺伝子の一つにおいて変換を示すことが期待される。変換事象は一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析により解明し得よう。
【０１６１】
このように、ゲノムＤＮＡは、変換適格と見做されたプロトプラストから再生させた個々の植物からの葉部材料から抽出し、個々のＤＮＡサンプルは、各標的についてのＳＮＰ検出技法、例えば、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳＰＣＲ）により検出する。各標的についての推定陽性の植物を硬化させ、土壌に移す。陽性植物の配列変化を独立して確認するために、標的遺伝子の適切な領域をＰＣＲ増幅し、得られるアンプリコンを直接配列決定するか、またはクローン化して多重挿入断片を配列決定する。多重変化が同じ遺伝子でなされている場合、変換体は、標的遺伝子から変換したＡＬＳ耐性遺伝子の分離を可能とするその親株に戻し交配する。
【０１６２】
別法として、変異の対象遺伝子への取り込みは、抽出した核酸中の一ヌクレオチド変異を検出するために設計された多くの分子生物学技法のいずれかによって同定することができる（例えば、ＰＣＲおよび一ヌクレオチドプライマー伸張分析法などの増幅方法）。より大きな変異は、変異すべき標的遺伝子の領域を増幅し、配列決定することにより検出し得る。
【０１６３】
別法として、修飾酵素を含む植物または植物細胞は、例えば、該植物が産生した脂肪酸の組成を分析することにより同定することができる。従って、該植物を成長させて、油を抽出し、当該技術分野にて既知の方法（例えば、ガスクロマトグラフィー）により分析することができる。
【０１６４】
２種のチオエステラーゼ導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生産
中鎖脂肪酸の長さの異なるアシル基質に優先性を有するチオエステラーゼをエンコードする２種の導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、当該技術分野で周知の方法により生成させ得る。
【０１６５】
このように、植物チオエステラーゼは様々な起源から入手することができる。有意な量の中鎖脂肪酸を産生する植物は、中鎖優先性植物チオエステラーゼをエンコードするＤＮＡ配列の好適な供給源である。例えば、クフェア属の幾つかの種は、その種子中に中鎖脂肪酸を含むトリグリセリドを蓄積する（例えば、プロカンベンズ（procumbens）、ルテア（lutea）、フッケリアナ（hookeriana）、ハイソピフォリア（hyssopifolia）、ライチイ（wrightii）およびインフラタ（inflata））。さらに、ニレ（Ulmus americana）が有意な中鎖脂肪酸を含むことが示されている。さらに、クスノキ科（Lauraceae）の一員、例えば、ピサ（Pisa）（Actinodophne hookeri）、ゲッケイジュ（Laurus nobilis）、およびカリフォルニアベイ（Umbellularia californica）が中鎖脂肪酸を含む種子を産生する。さらなる供給源は、ニクズク科（Myristicaceae）、ニガキ科（Simarubaceae）、ボキシア科（Vochysiaceae）、およびサルバドラ科（Salvadoraceae）、およびエリスマ（Erisma）、ピクラムニア（Picramnia）およびビロラ（Virola）の多雨林種であり、これらはＣ１４脂肪酸を蓄積すると報告されている。中鎖優先チオエステラーゼを貯留する植物の幾つかの例とそれらの好適な基質を表１に示す。
【０１６６】
【表１】
【０１６７】
その他の植物もまた特定の脂肪酸アシル鎖長に優先性を有する所望のチオエステラーゼの供給源となり得る。かかるさらなる植物チオエステラーゼは、種々植物油のトリアシルグリセリド組成物を分析することにより同定し得る。特異的チオエステラーゼの存在は、適切なアシル−ＡＣＰ基質を用いるアッセイにより確認し得る。例えば、Ｃ１０−優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼについてのアッセイは、国際公開ＷＯ９１／１６４２１に記載されており、かかる分析に使用することができる。
【０１６８】
対象の植物チオエステラーゼをエンコードするＤＮＡ配列を含む植物発現構築物は、多様な植物において、取分け、食用および工業用の植物油の生産に利用される植物において使用し得る。好適な植物は油料種子作物であり、限定されるものではないが、ナタネ（カノーラおよび高エルシン酸品種）、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、クフェア、ダイズ、ラッカセイ、ヤシの実と油料パーム、およびトウモロコシなどを包含する。
【０１６９】
宿主細胞が植物細胞である発現構築物は、植物中で機能的である調節領域（例えば、プロモーターおよびターミネーター領域）を含む。従って、得られるトランスジェニック植物にて発現するべきタンパク質をエンコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、未変性遺伝子に見出されるプロモーターなど、転写開始調節領域またはプロモーターにその５'末端で結合する。多数の他の転写開始領域が利用可能であり、それらは構造遺伝子機能の多様な構成的または誘導的転写を提供する。植物について使用する転写開始領域の中には、ＣａＭＶ ３５Ｓおよびノパリンおよびマンノピンシンターゼに対してなどの構造遺伝子と関連する、またはナピン、ＡＣＰプロモーターなどと関連する領域が存在する。かかる構造遺伝子に相当する転写／翻訳開始領域は、それぞれの開始コドンの５'上流直近に見出される。対象の植物宿主に本来存在するプロモーターまたは修飾プロモーターなど、すなわち一遺伝子起源に由来する転写開始領域または異なる遺伝子起源に由来する翻訳開始領域を有するプロモーター、対象の植物チオエステラーゼをエンコードする配列を含むプロモーター、または増強プロモーター、例えば、二重３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターなど、ある種のプロモーターを所望する場合、標準的技法により当該配列を一緒に結合し得る。植物中に中鎖チオエステラーゼの発現を望む殆どの適用の場合、種子特異的プロモーターの使用が好ましい。さらに、組換え構築物を宿主細胞に導入する方法によっては、発現構築物中にさらなる成分が必要とされ得る。例えば、形質転換細胞用の選択マーカーをエンコードするＤＮＡを、発現構築物に含み得る。従って、該構築物は、細胞傷害剤（例えば、抗生物質、重金属、毒素など）に対する耐性、栄養要求性宿主に原栄養体を提供する補完性、ウイルス免疫性などを提供し得る。異なる宿主種の数によっては、発現構築物またはその成分を導入し、１種以上のマーカーが採用されるが、その場合、選択のための異なる条件を異なる宿主に使用する。
【０１７０】
種々の植物形質転換法が当該技術分野において周知である。例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）感染、マイクロインジェクション、ＤＮＡ粒子衝撃、およびエレクトロポレーションを経由する形質転換が一般に使用される。さらに、新規方法として作物を形質転換することが利用可能であり、かかる方法も使用し得る。植物の形質転換の例は米国特許第５，６６７，９９７号に見出し得る。
【０１７１】
１つを超える導入遺伝子を発現するためには、発現構築物を各導入遺伝子について生成させ得る。次いで、植物を、第一の導入遺伝子と植物選択性マーカーを含有してなる第一の発現構築物で形質転換する。選択培地上で成長させた再生体は、例えば、ウエスタンブロッティング法により導入遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。導入遺伝子を発現する植物は成熟するまで成長させ、種子を定着させて、そこから第二世代の植物を生成させる（Ｔ２）。
【０１７２】
Ｔ２世代は二回目の形質転換に使用するが、その際、第二の導入遺伝子および第二の植物選択性マーカーを含んでなる第二発現構築物を使用する。（植物選択性マーカーの除去または不活性化の方法は当該技術分野にて既知である；例えば、ＷＯ９２／０１３７０に開示されているように）。再生体は選択培地上で成熟するまで成長させ、種子を定着させ、そこから次世代の植物を生成させる（Ｔ３）。Ｔ３世代を野生型植物に比較して、中鎖脂肪酸の増加についてスクリーニングする。
【０１７３】
中鎖脂肪酸とモノ不飽和脂肪酸の所望のバランスをもつ油を含む遺伝的に修飾した植物の生成
一部の実施態様において、リノレン酸（１８：３）およびリノール酸（１８：２）のレベル低下並びにオレイン酸（１８：１）のレベル上昇は、Δ１２デサチュラーゼ（ＦＡＤ２遺伝子）の発現または活性を低下させることにより、遺伝的に修飾した植物において達成させる；好ましくは、標的とするＦＡＤ２遺伝子は、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、クフェア、またはトウモロコシＦＡＤ２遺伝子である。好適な実施態様において、ＦＡＤ２の発現または活性は、遺伝子のコード配列にストップコドンを創出するか；またはヌクレオチドを欠失もしくは付加させて、フレームシフト変異を創出することにより低下させる。
【０１７４】
ある種の好適な実施態様においては、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を遺伝的に修飾した植物において修飾し、パルミトレン酸（Ｃ１６：１）および／またはオレイン酸（１８：１）のレベルを上昇させる；好ましくは、遺伝的に修飾した植物は、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、クフェア、およびトウモロコシからなる群より選択される。ある種の好適な実施態様において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現または活性は、モノ不飽和脂肪酸の産生増大を促進し、飽和脂肪酸を減少させるために増大させる；より好ましくは、遺伝的に改変した植物において、Ｃ１６：１および／またはＣ１８：１のレベルを未変性の植物に比べて増大させ、Ｃ１６：０および／またはＣ１８：０のレベルを低下させる。他の実施態様において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、遺伝的に修飾した植物がＣ１６：１のレベルを上昇させて産生するように修飾する。ある種の実施態様において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、パルミトイル−ＡＣＰにより活性の上昇を示すように修飾する。参照例：Cahoon, E. B. およびShanklin, J, 2000,“植物種子油の代謝エンジニアリング用脂肪酸デサチュラーゼ変異体を選択するための基質依存変異体相補性”, Proc. Nat. Acad. Sci. 97(22): 12350-12355。関連する実施態様において、Ｃ１６：０の産生増大は、マカダミア（Macadamia integrifolia）、グミの１種（sea buckthorn；Hippophae rhamnoides）またはウングイスカティ（Doxantha unguis-cati）からのΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子でナタネを形質転換することにより達成される。ある種の実施態様において、ＫＡＳII遺伝子の活性または発現は、１８：１および１６：１脂肪酸のさらにより高いレベルを達成するために、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子の修飾に加えて、本明細書に開示した方法により低下させる；より好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物のＰＴＥ酵素もまた、本明細書に開示するように修飾して、短鎖脂肪酸のレベルを上昇させ産生させる；より好適な実施態様において、遺伝的に修飾した植物のΔ１２デサチュラーゼもまた、低下した活性または発現を有するように修飾する。
【０１７５】
ある種の好適な実施態様において、植物（好ましくは、ナタネ、ワタ、アマ、ラッカセイ、ヤシ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、またはトウモロコシ植物）は遺伝的に修飾して、本明細書に開示するように、短／中鎖脂肪酸のレベルを以下のように上昇させる；（１）パルミトイルチオエステラーゼ（ＰＴＥ）の基質特異性を改変して、カプリロイル−ＡＣＰ（Ｃ８）、カプロイルーＡＣＰ（Ｃ１０）、およびラウロイル−ＡＣＰ（Ｃ１２）により活性を上昇させるか、または短鎖長特異性をもつ、クフェア、ココヤシ、ヤシ、ババスヤシ、ブラジル産ホンダヤシ（Astrocaryum vulgare）、ニレ（Ulmus Americana）、ニホンケヤキ（Zelkova serrata）またはカリフォルニアベイ（Umbellularia californica）からのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子で形質転換する；および（２）ＫＡＳII遺伝子の活性を低下させる。ある種の好適な実施態様において、植物は、ＰＴＥおよび／またはＫＡＳII遺伝子を本明細書に開示するように改変することにより、短／中鎖脂肪酸のレベルが上昇するように遺伝的に修飾する；また、さらに、Δ１２デサチュラーゼの発現または活性を低下させることにより、ポリ不飽和脂肪酸のレベルが低下（好ましくは、Ｃ１８：２およびＣ１８：３のレベル低下）するように修飾する；より好ましくは、該植物はさらにΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を修飾してパルミトレン酸（Ｃ１６：１）および／またはオレイン酸（１８：１）のレベルを上昇させ、Ｃ１６：０および／またはＣ１８：０のレベルを低下するように修飾する。
【０１７６】
脂肪酸メチルエステルの予測される融点の計算
脂肪酸メチルエステル配合物の予測される融点ＰTmは、配合物１００ｇ当たりの重量で表わす各脂肪酸メチルエステルの量および以下の等式を用いて算出する。
PTm = [A(-71.0)(10.0) + B(-40.0)(4.5) + C(-18.0)(1.2) + D(5.2)(1.0) + E(19.0)(0.60) + F(30.7)(1.35) + G(37.8)(2.15) + H(-19.9)(1.10) + I(-35.0)(0.65) + J(-57)(0.2) + K(54.5)(10.0) + L(53.0)(2.0) + M(57.4)(2.0)]*(0.01)
Ａは配合物中のカプロン酸ＭＥ（６：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｂは配合物中のカプリル酸ＭＥ（８：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｃは配合物中のカプリン酸ＭＥ（１０：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｄは配合物中のラウリン酸ＭＥ（１２：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｅは配合物中のミリスチン酸ＭＥ（１４：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｆは配合物中のパルミチン酸ＭＥ（１６：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｇは配合物中のステアリン酸ＭＥ（１８：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｈは配合物中のオレイン酸ＭＥ（１８：１）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｉは配合物中のリノール酸ＭＥ（１８：２）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｊは配合物中のリノレン酸ＭＥ（１８：３）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｋは配合物中のアラキドン酸ＭＥ（２０：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；
Ｌは配合物中のベヘン酸ＭＥ（２２：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である；および
Ｍは配合物中のリグノセリン酸ＭＥ（２４：０）のパーセント（ｗ／ｗ）である。
【０１７７】
一部の実施態様においては、予測される融点を用いて、バイオディーゼルとしての使用に適する配合物を同定し得る。これらの実施態様において、予測される融点をカットオフ値と比較する（すなわち、バイオディーゼルとしての所望の融点）。カットオフ値未満またはそれに等しい予測融点を有する配合物は、バイオディーゼルとしての使用に適している。
【０１７８】
以下の実施例は本発明を説明するためのものである。これらの実施例は決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例１】
【０１７９】
脂肪酸メチルエステル配合物１
下記の表に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する脂肪酸メチルエステル配合物（“配合物１”）は、下記表に提示した容量を用いて脂肪酸メチルエステルを共に混合し、１００ｇとして配合物１を調製する。
【表２】
【０１８０】
配合物１の予測融点ＰTmは、本発明方法により算出した場合、−４１．６℃である。
【実施例２】
【０１８１】
脂肪酸メチルエステル配合物２
下記の表に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する脂肪酸メチルエステル配合物（“配合物２”）は、下記表に提示した容量を用いて脂肪酸メチルエステルを共に混合し、１００ｇとして配合物２を調製する。
【表３】
【０１８２】
配合物２の予測融点ＰTmは、本発明方法により算出した場合、−２４．３℃である。
【実施例３】
【０１８３】
脂肪酸メチルエステル配合物３
下記の表に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する脂肪酸メチルエステル配合物（“配合物３”）は、下記表に提示した容量を用いて脂肪酸メチルエステルを共に混合し、１００ｇとして配合物３を調製する。
【表４】
【０１８４】
配合物３の予測融点ＰTmは、本発明方法により算出した場合、−１５．０℃である。
【実施例４】
【０１８５】
脂肪酸メチルエステル配合物４
下記の表に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する脂肪酸メチルエステル配合物（“配合物４”）は、下記表に提示した容量を用いて脂肪酸メチルエステルを共に混合し、１００ｇとして配合物４を調製する。
【表５】
【０１８６】
配合物４の予測融点ＰTmは、本発明方法により算出した場合、−１１．９℃である。
【実施例５】
【０１８７】
油配合物Ａ
下記に示す脂肪酸組成を有する２種の油の配合物（“配合物４”）は、下記に示す脂肪酸組成を有するココヤシ油とクフェア・ラセオラタ（Cuphea lanceolata）油を共に混合することにより調製する。
【表６】
【０１８８】
配合物Ａは７５重量％の上記ココヤシ油と２５重量％の上記クフェア・ランセオラタ油とを混合することにより調製し得る。クフェア・ランセオラタ油２５ｇ（２５ｇ／０．９２ｇ／ｍｌ＝２７．２ｍＬ）は７５ｇのダイズ油（７５ｇ／０．９２４ｇ／ｍＬ＝８１．２ｍＬ）と組合わせて１００ｇの配合物Ａとする。
【実施例６】
【０１８９】
油からＦＡＭＥへの変換
様々なタイプの市販植物油（ダイズ、カノーラ、トウモロコシ、マカダミア、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、クルミ、ヤシ、ココヤシ、およびヒマシ油を含む）は小売先から入手した。各油２００ｇをガラス製スクリューキャップ式瓶に秤量し、２倍容量（ｗ／ｖ）のナトリウムメトキシド試薬（５％ｗ／ｖナトリウムメトキシド／メタノール）と組合わせた。室温で２時間混合した後、ヘキサン５０ｍｌを加え、激しく混合し、相分離させた。低部グリセロール含有層を除き、廃棄した。上層部はロータリーエバポレーター中、減圧下に処理し、ヘキサンと残余の揮発成分を除去した。ＦＡＭＥの最終溶液を窒素ガス下、しっかりとキャップをしたガラス瓶に室温で保存した。
【実施例７】
【０１９０】
脂肪酸からＦＡＭＥへの変換
様々な脂肪酸、または脂肪酸の混合物１００グラムをガラス瓶に秤量し、２００ｍｌの無水メタノール／１％硫酸と組合わせた。各混合物を窒素ガスで蔽い、容器にしっかりと蓋をした。反応容器を５０℃のインキュベーターオーブン中に４時間置いた。インキュベーションの間、混合物を時々振盪して反応物を混合した。混合物をガラス製分液漏斗に移し、１００ｍｌの５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液を加えた。混合物を激しく振盪し、静置して相分離した。低部水層を除去廃棄した。上層を清浄な乾燥瓶に移し、５ｇの無水硫酸ナトリウムと組合わせた。この混合物を目視し得るすべての水滴が除かれるまで激しく振盪した。次いで、この混合物をワットマン１濾紙により濾過した。硫酸ナトリウムと濾過装置をヘキサンで洗い、追加のＦＡＭＥを回収し、洗液を非水性フラクションに加えた。合併した濾液と洗液をロータリーエバポレーターに容れ、減圧下でヘキサンと残余の揮発性分を除去した。ＦＡＭＥの最終溶液を褐色のガラス瓶に移し、窒素ガスで蔽い、テフロン（登録商標）内張りしたキャップでしっかりと蓋をし、４℃で保存した。他のエステルについては、上で用いたメタノールの代わりに、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、またはｔ−ブタノールに置き換えるプロトコールに従って合成した。
【実施例８】
【０１９１】
アルキルエステル混合物の低温試験
アルキルエステルおよびエステル混合物の低温での性質は、上記の油または脂肪酸から得られた純アルキルエステルまたはエステル混合物の一部をピペットで採取し、１０ｍｍ×１００ｍｍのガラス試験管に容れ、最終容量１．０ｍｌとして試験した。試験管はポリプロピレンスナップキャップで蓋をし、樹脂ラックに容れた。次いで、ラックに容れた試験管をサンプルの頂部の上、１〜２ｃｍの深さまで、５０％エチレングリコール／水の冷却溶液に沈めた。一連の水浴を用いて、連続的に試験サンプルを０、−１０、−１５、−２０、および−２５℃とした。サンプルをその試験温度に１時間保持し、各試験管を引き出して、曇りの存在、固化、および流動／流れ特性について試験した。さらに、選択したサンプルを独立した試験研究所（インターテック−カレブ−ブレット（Intertek-Caleb-Brett）ラボラトリーズ）に送り、ディーゼル燃料に適切なＡＳＴＭ標準法（ＡＳＴＭ Ｄ−９７−０６、ＡＳＴＭ Ｄ−２５００−０５、およびＡＳＴＭ Ｄ６３７１）を用いて、流動点、曇り点、および低温フィルタープラッギングについて評価した。エステルおよびエステル混合物の曇り点は、ポータブル型ディーゼル燃料曇り点分析計モデルＣＰＡ−Ｔ３０（フェーズ・テクノロジー・コープ）によっても測定した。１０ｍｌ容量の樹脂シリンジをエステルまたはエステル混合物で満たし、該装置に注入した。１０分後に、装置は正確な曇り点温度読取値を与えた。
【実施例９】
【０１９２】
Ｂ１００種子油および＃２ディーゼルの融点
一連のＢ１００バイオディーゼル流体（脂肪酸アルキルエステル）は、植物油、例えば、ダイズ、カノーラ、トウモロコシ、マカダミア、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、クルミ、ヤシ、ココヤシ、およびヒマシ油などから、実施例６に記載した手順に従って調製した。これらの燃料は、低温流動性について、実施例８に記載した手順に従って、市販品として入手した石油系ディーゼル＃２（シェル・オイル（株）、サンディエゴ、カリフォルニア）と比較した。＋２０℃と−２０℃の間の色々な温度で各流体をインキュベートしたときの効果を下記表に示す；この表は該流体が所定の温度で１時間インキュベートした後に液体であったか、または固体であったかを示す（流動点）。ディーゼル燃料は−１５℃まで液体のままであったが、−２０℃では１時間後に固体であった。対照的に、植物油に基づく脂肪酸メチルエステルは相当により低い温度で固化した。パーム油メチルエステルは＋５℃で固体であった。最良に機能する植物油に基づくエステルはカノーラとヒマのものであったが、共に−１５℃で固体であった。このように、植物油メチルエステルのいずれもが、−２０℃未満の曇り点のディーゼル燃料または標的に等しい低温度性をもたなかった。
【表７】
【実施例１０】
【０１９３】
ダイズおよびカノーラＢ１００の融点を低下させるＣ８およびＣ１０ＦＡＭＥ
植物油由来メチルエステルの低温度での性質は、短鎖脂肪酸メチルエステルの添加により改善された。ダイズ油メチルエステルは−１０℃で固体であった。ダイズ油メチルエステルに３０％（ｖ／ｖ）のＣ８メチルエステル（オクタン酸メチル）を加えた場合、その混合物は−１０℃で液体のままであった。Ｃ８メチルエステルを６０％（ｖ／ｖ）に増加した場合、混合物は−２０℃で液体のままであった。Ｃ１０メチルエステル（デカン酸メチル）の添加は、ダイズ由来のメチルエステルの流動点に対し、同一の効果を示した。カノーラ油由来のメチルエステルの低温度性能もまた、短鎖メチルエステルの添加により改善された。４０％のＣ８メチルエステルをカノーラメチルエステルに加えると、観測される流動点は−２０℃に低下した。Ｃ１０メチルエステルのカノーラへの添加は、観測される流動点に対し同様の効果を示した。カノーラまたはダイズメチルエステルにＣ８／Ｃ１０エステルの混合物を添加しても、混合物の流動点を低下させた。
【表８】
【実施例１１】
【０１９４】
種々の全油Ｂ２−Ｂ１００バイオディーゼル配合物の融解性
ディーゼル燃料と植物油由来メチルエステルとの混合物についてもまた低温度での性質について試験した。ディーゼル燃料は、２％（Ｂ２）、５％（Ｂ５）、２０％（Ｂ２０）（ｖ／ｖ）植物油由来メチルエステルと、純植物油由来メチルエステル（Ｂ１００）と共に試験した。植物油由来メチルエステルをディーゼル燃料に添加しても、Ｂ２０配合物を除き、混合物の流動点に観察し得る効果はなかった。カノーラ、ヒマおよびダイズはＢ２０流動点に効果を示さなかったが、一方、トウモロコシ、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、ヤシ、およびココヤシは、すべて純ディーゼル燃料に比べて、Ｂ２０配合物の観察される流動点を上昇させた。
【表９】
【実施例１２】
【０１９５】
融点に対する長鎖飽和体の効果
脂肪酸メチルエステルについて、上に詳述した低温度性能につき試験した。下記図表はＣ１８：１メチルエステル（オクタデセン酸メチル）に長鎖飽和脂肪酸を加える効果を示す。純Ｃ１８：１メチルエステルは−２０℃で液体であるが、Ｃ１８：０オクタデカン酸メチルを添加すると、混合物中に存在するＣ１８：０が２％と僅かであっても、観察される流動点を＋５℃も上昇させる；１％Ｃ１８：０では、混合物の流動点は０℃である。同様に、Ｃ１８：１とのＣ１６混合物は劇的に流動点を上昇させる。９％（ｖ／ｖ）Ｃ１６メチルエステル（ヘキサデカン酸メチル）と９１％Ｃ１８：１との混合物は、−５℃で固体であった。Ｃ１６：０が３％と少ない場合でも、−１５℃で固体となった。Ｃ１４：０メチルエステル（テトラデカン酸メチル）は、１％という低濃度で、−２０℃で固体を生じ、３０％Ｃ１４：０は−１０℃で固体であった。Ｃ１２：０（ドデカン酸メチル）との混合物は、興味深い予期せぬ結果を提供した。１％ないし５％のＣ１２レベルで、混合物は−２０℃で固体であったが、Ｃ１８：１との６％ないし２０％のＣ１２混合物は−２０℃で液体のままであった。従って、バイオディーゼル中、６〜２０％の、またはより好ましくは６〜１０％のＣ１２：０の存在は、低温流動性に対して驚くほど有益な作用を示す。このように、長鎖飽和ＦＡＭＥがＣ１８：１との混合物の流動点を有意に上昇させる一方、Ｃ１４はその効果が相当に小さく、Ｃ１２は２０％（ｖ／ｖ）までの濃度で殆ど効果を示さなかった。
【表１０】
【実施例１３】
【０１９６】
遺伝的に修飾したナタネ植物
ナタネ植物について、本明細書にて考察したように、中鎖脂肪酸とモノ不飽和脂肪酸との所望のバランスをもつ油を生成するように遺伝的に修飾する；すなわち、ナタネ植物を遺伝的に修飾して、相対的に上昇した短鎖／中鎖脂肪酸；相対的に上昇したレベルのモノ不飽和Ｃ１６：０およびＣ１８：０脂肪酸；および相対的に減少したレベルのポリ不飽和Ｃ１８：２およびＣ１８：３脂肪酸を有するようになる。以下の遺伝的修飾を実施する：（１）ＦＡＤ２遺伝子のコーディング配列にストップコドンを導入する遺伝子修復オリゴヌクレオチドベースを用いてΔ１２デサチュラーゼの活性を低下させ、リノレン酸（１８：３）およびリノール酸（１８：２）のレベルを低下させ、同様にオレイン酸（１８：１）のレベルを上昇させる；（２）マカダミア（Macadamia integrifolia）からのΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子でナタネ植物を形質転換することにより、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子の活性を修飾して、パルミトレン酸（１６：１）のレベルを上昇させる；（３）遺伝子修復オリゴヌクレオチドベースを用いてストップコドンをＫＡＳII遺伝子のコーディング配列に導入することによりケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳII）の活性を低下させる；（４）パルミトイルチオエステラーゼ（ＰＴＥ）の基質特異性は、カプリロイル−ＡＣＰ（Ｃ８）、カプロイル−ＡＣＰ（Ｃ１０）、およびラウロイル−ＡＣＰ（Ｃ１２）により活性が上昇し、結果として、短い鎖長特異性を有するクフェア・アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子でナタネ植物を形質転換して、短鎖および中鎖脂肪酸のレベルが上昇するように改変する。遺伝的に修飾したナタネ植物は以下の脂肪酸組成を有する油を産生する：Ｃ８は油の約５％を占める；Ｃ１０は油の約５％を占める；Ｃ１２は油の約１５％を占める；Ｃ１６：１およびＣ１８：１は共に油の約７０％を占める；そしてＣ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２およびＣ１８：３はそれぞれが油の１％未満を占める。該油のメチルエステルは約−２０℃で液体である。
【実施例１４】
【０１９７】
曇り点に対するアルキル−エステル化の効果
種々の脂肪酸（Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４およびＣ１８）は、実施例７に記載した一般的プロトコールを用いて、アルキルエステル（メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、またはイソプロピルエステル）に変換し、脂肪酸アルキルエステルの曇り点を評価した。これらの実験結果を図７に示す。予測されるように、各タイプのアルキルエステルについて、長鎖脂肪酸は短鎖脂肪酸よりもより高い曇り点を示した（すなわち、Ｃ８＜Ｃ１０＜Ｃ１２＜Ｃ１４＜Ｃ１８）。長鎖脂肪酸。驚くべきことに、各タイプの脂肪酸について、イソプロピルエステル脂肪酸が、他のタイプのアルキルエステル化脂肪酸に比べて、最も高い曇り点を示した。イソプロピルエステル化脂肪酸以外に、より長い鎖のエステルは一般に短い鎖のアルキルエステルよりも低い曇り点を示した（すなわち、メチルエステル＞エチルエステル＞ｎ−プロピルエステル＞ｎ−ブチルエステル）。従って、これらの実験に基づき、ｎ−ブチルエステルがバイオディーゼルにとって最も好ましい低温流動性を示し、イソプロピルエステルがバイオディーゼルにとって最も好ましからざる低温流動性を示す。さらに、直鎖のアルキルエステルが、対応する分枝鎖アルキルエステルに比較して、より好適な低温流動性を示す。
【０１９８】
他に特に断りのない限り、本明細書にて使用する技術的および科学的用語は、すべて本発明の属する技術分野の通常の技能を有する者が共通して理解する意味と同じ意味を有する。
【０１９９】
本明細書に記載し、説明した本発明は、いずれかの構成要素または限定がなく、本明細書に具体的に開示されていなくても、適切に実施し得るものである。従って、例えば、用語“含んでなる”、“包含する”、“含有する”などは包括的に、限定なしに読み取るべきものである。さらに、本明細書にて使用する用語および表現は、説明の手段であって、限定の手段ではなく、かかる用語および表現を用いて、開示し記載した特徴またはその一部と同等のものを除外しようとするものではないが、本発明の特許請求の範囲内で多様な変更態様が可能であることは明確に理解される。
【０２００】
従って、理解すべきことは、本発明が好適な実施態様および本発明の最適の特徴により具体的に開示されているとしても、本明細書に具体的に記載開示されている変更態様、改善および変動は当業者が頼りとし得るものであること、またかかる変更態様、改善および変動は本発明の範囲内のものであることである。ここに提示した材料、方法、および実施例は好適な実施態様の代表的なものであり、例示であって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０２０１】
本発明につき本明細書には幅広く一般的に記載してきた。一般的な開示に含まれる狭い種概念および下位概念の部類のそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これはその一群からある対象を除く条件つきまたは否定的限定のある本発明の一般的記載をも含み、除外されている物質が本明細書に具体的に列挙してあるか否かには関係ない。
【０２０２】
さらに、本発明の特徴または側面がマーカッシュ群により記載されている場合、当業者は、当該発明がそのものに関してマーカッシュ群の個々のメンバーまたはサブグループのメンバーとして記載されているものであることを認識されたい。
【０２０３】
本明細書にて言及した出版物、特許出願、特許、およびその他の引用文献は、すべて、それぞれを参照により個々に組み入れたと同じ程度に、その全体を参照により本明細書の一部とする。抵触のある場合は、本明細書が、その定義をも含めて、規制する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸混合物であって、
８０％ないし１００％の８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸および１２〜１８個の炭素を有するモノ不飽和脂肪酸；
５％ないし８０％のカプリル酸（Ｃ８：０）およびカプリン酸（Ｃ１０：０）；および
２０％未満のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなり；
その場合、当該モノ不飽和脂肪酸が重量で該混合物の５％ないし９５％を占め；また
その場合、当該混合物が１２個を超える炭素を有する２０％未満のポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸を含有してなり；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；またその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、およびイソプロピルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる；
脂肪酸混合物。
【請求項２】
脂肪酸混合物であって、
８０％ないし１００％の８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸および１２〜１８個の炭素を有するモノ不飽和脂肪酸；
５％ないし８０％のカプリル酸（Ｃ８：０）およびカプリン酸（Ｃ１０：０）；および
２０％未満のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなり；
その場合、当該モノ不飽和脂肪酸が重量で該混合物の５％ないし９５％を占め；また
その場合、当該混合物が１２個を超える炭素を有する２０％未満のポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸を含有してなり；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；またその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が、直鎖アルキルエステルを含有してなる；
脂肪酸混合物。
【請求項３】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、基本的に直鎖アルキルエステルからなるものである請求項２に記載の混合物。
【請求項４】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステルおよびｎ−ブチルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる請求項２または３に記載の混合物。
【請求項５】
該混合物が６％ないし２０％のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなる請求項１または２に記載の混合物。
【請求項６】
カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）が共に該混合物の２０％ないし４０％を占める請求項１または２に記載の混合物。
【請求項７】
オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に該混合物の５０％ないし８５％を占める請求項１または２に記載の混合物。
【請求項８】
オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に該混合物の５０％ないし８５％を占める請求項１〜７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９】
ステアリン酸（１８：０）およびパルミチン酸（１６：０）が該混合物の４％未満を占める請求項１〜８のいずれかに記載の混合物。
【請求項１０】
ミリスチン酸（１４：０）が該混合物の２％未満を占める請求項１〜９のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１】
リノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）が共に該混合物の３％未満を占める請求項１〜１０のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２】
アラキドン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）およびリグノセリン酸（Ｃ２４：０）が該混合物の１％未満を占める請求項１〜１１のいずれかに記載の混合物。
【請求項１３】
当該混合物が、
５５％ないし６５％のオレイン酸（Ｃ１８：１）；
５％ないし１５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；
１５％ないし２５％のカプリン酸（Ｃ１０：０）；および
５％ないし１５％のカプリル酸（Ｃ８：０）；
を含有してなる請求項１または２に記載の混合物。
【請求項１４】
カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）が共に該混合物の６０％ないし８５％を占める請求項１または２に記載の混合物。
【請求項１５】
オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に該混合物の１５％ないし４０％を占める請求項１または２に記載の混合物。
【請求項１６】
オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に該混合物の５０％ないし８５％を占める請求項１５に記載の混合物。
【請求項１７】
ステアリン酸（１８：０）およびパルミチン酸（１６：０）が該混合物の４％未満を占める請求項１２〜１６のいずれかに記載の混合物。
【請求項１８】
ミリスチン酸（１４：０）が該混合物の２％未満を占める請求項１２〜１７のいずれかに記載の混合物。
【請求項１９】
リノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）が共に該混合物の３％未満を占める請求項１２〜１８のいずれかに記載の混合物。
【請求項２０】
アラキドン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）およびリグノセリン酸（Ｃ２４：０）が該混合物の１％未満を占める請求項１２〜１９のいずれかに記載の混合物。
【請求項２１】
当該混合物が、
５５％ないし６５％のオレイン酸（Ｃ１８：１）；
５％ないし１５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；
１５％ないし２５％のカプリン酸（Ｃ１０：０）；および
５％ないし１５％のカプリル酸（Ｃ８：０）
を含有してなる請求項１または２に記載の混合物。
【請求項２２】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも１０％を占める請求項１〜２１のいずれかに記載の混合物。
【請求項２３】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも２０％を占める請求項１〜２２のいずれかに記載の混合物。
【請求項２４】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも３０％を占める請求項１〜２３のいずれかに記載の混合物。
【請求項２５】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも４０％を占める請求項１〜２４のいずれかに記載の混合物。
【請求項２６】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも５０％を占める請求項１〜２５のいずれかに記載の混合物。
【請求項２７】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも６０％を占める請求項１〜２６のいずれかに記載の混合物。
【請求項２８】
１２個を超える炭素を有するポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸が共に該混合物の１５％未満を占める請求項１〜２７のいずれかに記載の混合物。
【請求項２９】
１２個を超える炭素を有するポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸が共に該混合物の１０％未満を占める請求項１〜２８のいずれかに記載の混合物。
【請求項３０】
１２個を超える炭素を有するポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸が共に該混合物の５％未満を占める請求項１〜２９のいずれかに記載の混合物。
【請求項３１】
１２個を超える炭素を有するポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸が共に該混合物の３％未満を占める請求項１〜３０のいずれかに記載の混合物。
【請求項３２】
該混合物が油である請求項１〜３１のいずれかに記載の混合物。
【請求項３３】
該混合物が少なくとも２種の異なる油の配合物である請求項１〜３２のいずれかに記載の混合物。
【請求項３４】
該アルキル−エステル化脂肪酸が直鎖アルキルエステルを含有してなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項３５】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的に直鎖アルキルエステルからなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項３６】
該アルキル−エステル化脂肪酸が分枝鎖アルキルエステルを含有しない請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項３７】
該エステル化脂肪酸がイソプロピルエステルではない請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項３８】
該エステル化脂肪酸がメチルエステルを含有してなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項３９】
該エステル化脂肪酸が、基本的にメチルエステルからなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４０】
該エステル化脂肪酸がエチルエステルを含有してなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４１】
該エステル化脂肪酸が、基本的にエチルエステルからなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４２】
該エステル化脂肪酸がｎ−プロピルエステルを含有してなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４３】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−プロピルエステルからなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４４】
該エステル化脂肪酸がｎ−ブチルエステルを含有してなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４５】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−ブチルエステルからなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４６】
２種以上の油の配合物であって、当該配合物が少なくとも５０重量％の飽和中鎖脂肪酸、ミリストレン酸（Ｃ１４：１）、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなり、その場合、当該中鎖脂肪酸がカプリル酸（Ｃ８：０）からなり、またその場合、当該カプリル酸が該配合物の約２５重量％まで、またミリスチン酸（Ｃ１４：０）および飽和長鎖脂肪酸が１０重量％未満を構成し；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；そしてその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、およびイソプロピルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる；
配合物。
【請求項４７】
２種以上の油の配合物であって、当該配合物が少なくとも５０重量％の飽和中鎖脂肪酸、ミリストレン酸（Ｃ１４：１）、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなり、その場合、当該中鎖脂肪酸がカプリル酸（Ｃ８：０）からなり、またその場合、当該カプリル酸が該配合物の約２５重量％まで、またミリスチン酸（Ｃ１４：０）および飽和長鎖脂肪酸が１０重量％未満を構成し；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；そしてその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が直鎖アルキルエステルを含有してなる；
配合物。
【請求項４８】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、基本的に直鎖アルキルエステルからなる請求項４７に記載の配合物。
【請求項４９】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステルおよびｎ−ブチルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる請求項４７または４８に記載の配合物。
【請求項５０】
当該中鎖脂肪酸がカプリン酸（Ｃ１０：０）を含有してなり、またその場合のカプリン酸が、該配合物の約３０ないし約６０重量％を構成する請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５１】
当該中鎖脂肪酸がラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなり、またその場合のラウリン酸が該配合物の約５ないし約２０重量％を構成する請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５２】
当該配合物が８％未満のミリスチン酸および飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５３】
当該配合物が６％未満のミリスチン酸および飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５４】
当該配合物が約１５％ないし約４０％の飽和中鎖脂肪酸および約６０％ないし約８５％のモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５５】
当該配合物が約６０％ないし約８５％の飽和中鎖脂肪酸および約１５％ないし約４０％のモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５６】
当該モノ不飽和長鎖脂肪酸がパルミトレン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、またはその組合せを含有してなる請求項４６〜５５のいずれかに記載の配合物。
【請求項５７】
当該配合物が内燃機関での燃料としての使用に適するものである請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５８】
当該油が、カノーラ、ナタネ、ヤシ油、ヤシ殻、ココヤシ、ホシダネヤシ、ヒマワリ、ベニバナ、クフェア、オリーブ、マカダミア、ババスーヤシ、ヒマ、ラッカセイ、ワタ、アマ種子、亜麻仁、コフネヤシ、およびジャトロファからなる群より選択される請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５９】
当該油の１種以上が遺伝的に修飾した植物に由来し、その場合、当該植物は飽和中鎖脂肪酸を産生するように修飾したものである請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項６０】
当該配合物が−１０℃未満またはそれに等しい融点を有する請求項４６〜５８のいずれかに記載の配合物。
【請求項６１】
当該配合物が−２０℃未満またはそれに等しい融点を有する請求項４６〜５８のいずれかに記載の配合物。
【請求項６２】
該アルキル−エステル化脂肪酸が直鎖アルキルエステルを含有してなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６３】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的に直鎖アルキルエステルからなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６４】
該アルキル−エステル化脂肪酸が分枝鎖アルキルエステルを含有しない請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６５】
該アルキル−エステル化脂肪酸がイソプロピルエステルではない請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６６】
該アルキル−エステル化脂肪酸がメチルエステルを含有してなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６７】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的にメチルエステルからなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６８】
該アルキル−エステル化脂肪酸がエチルエステルを含有してなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６９】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的にエチルエステルからなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項７０】
該アルキル−エステル化脂肪酸がｎ−プロピルエステルを含有してなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項７１】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的にｎ−プロピルエステルからなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項７２】
該アルキル−エステル化脂肪酸がｎ−ブチルエステルを含有してなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項７３】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的にｎ−ブチルエステルからなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項７４】
脂肪酸混合物であって、
少なくとも５０重量％の中鎖脂肪酸、ミリストレン酸（Ｃ１４：１）、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなり、その場合、当該飽和中鎖脂肪酸がカプリル酸（Ｃ８：０）を含有してなり、その場合の当該カプリル酸が該配合物の約２５重量％まで、またミリスチン酸（Ｃ１４：０）および飽和長鎖脂肪酸が１０重量％未満を構成し；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；そしてその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、およびイソプロピルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる；
混合物。
【請求項７５】
脂肪酸混合物であって、
少なくとも５０重量％の中鎖脂肪酸、ミリストレン酸（Ｃ１４：１）、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなり、その場合、当該飽和中鎖脂肪酸がカプリル酸（Ｃ８：０）を含有してなり、その場合の当該カプリル酸が該配合物の約２５重量％まで、またミリスチン酸（Ｃ１４：０）および飽和長鎖脂肪酸が１０重量％未満を構成し；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；そしてその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が、直鎖アルキルエステルを含有してなる；
混合物。
【請求項７６】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的に直鎖のアルキルエステルからなる請求項７５に記載の混合物。
【請求項７７】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステルおよびｎ−ブチルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる請求項７５または７６に記載の混合物。
【請求項７８】
当該中鎖脂肪酸がカプリン酸（Ｃ１０：０）を含有してなり、その場合、当該カプリン酸が該配合物の約３０ないし約６０重量％を構成する請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項７９】
当該飽和中鎖脂肪酸がラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなり、その場合、当該ラウリン酸が該配合物の約５ないし約２０重量％を構成する請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８０】
当該中鎖脂肪酸が１２個以下の炭素を有する脂肪酸を含有してなる請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８１】
当該混合物が８％未満のミリスチン酸および飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８２】
当該混合物が６％未満のミリスチン酸および飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８３】
当該混合物が約１５％ないし約４０％の飽和中鎖脂肪酸および約６０％ないし約８５％のモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８４】
当該混合物が約６０％ないし約８５％の中鎖脂肪酸および約１５％ないし約４０％のモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８５】
当該モノ不飽和長鎖脂肪酸が、パルミトレン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、またはその組合せを含有してなる請求項７４〜８４のいずれかに記載の配合物。
【請求項８６】
当該混合物が−１０℃以下の融点を有する請求項７４〜８５のいずれかに記載の混合物。
【請求項８７】
当該混合物が−２０℃以下の融点を有する請求項７４〜８５のいずれかに記載の混合物。
【請求項８８】
該アルキル−エステル化脂肪酸が直鎖アルキルエステルを含有してなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項８９】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的に直鎖のアルキルエステルからなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９０】
該アルキル−エステル化脂肪酸が分枝鎖アルキルエステルを含有しない請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９１】
該エステル化脂肪酸が、イソプロピルエステルではない請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９２】
該エステル化脂肪酸が、メチルエステルを含有してなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９３】
該エステル化脂肪酸が、基本的にメチルエステルからなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９４】
該エステル化脂肪酸が、エチルエステルを含有してなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９５】
該エステル化脂肪酸が、基本的にエチルエステルからなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９６】
該エステル化脂肪酸が、ｎ−プロピルエステルを含有してなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９７】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−プロピルエステルからなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９８】
該エステル化脂肪酸が、ｎ−ブチルエステルを含有してなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９９】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−ブチルエステルからなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項１００】
脂肪酸アルキルエステルの混合物であって、
少なくとも５０重量％の飽和中鎖脂肪酸アルキルエステル、ミリストレン酸アルキルエステル、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステル、および
１０重量％未満のミリスチン酸アルキルエステルおよび飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなり；その場合、該アルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、およびイソプロピルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる混合物。
【請求項１０１】
脂肪酸アルキルエステルの混合物であって、
少なくとも５０重量％の飽和中鎖脂肪酸アルキルエステル、ミリストレン酸アルキルエステル、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステル、および
１０重量％未満のミリスチン酸アルキルエステルおよび飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなり；その場合、該アルキル−エステル化脂肪酸が、直鎖アルキルエステルを含有してなる混合物。
【請求項１０２】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、基本的に直鎖のアルキルエステルからなる請求項１０１に記載の混合物。
【請求項１０３】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステルおよびｎ−ブチルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる請求項１０１または１０２に記載の混合物。
【請求項１０４】
当該中鎖脂肪酸アルキルエステルがカプリル酸アルキルエステル（Ｃ８：０）を含有してなり、またその場合、当該カプリル酸アルキルエステルが該配合物の約２５重量％までを構成する請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１０５】
当該中鎖脂肪酸アルキルエステルがカプリン酸アルキルエステル（Ｃ１０：０）を含有してなり、またその場合、当該カプリン酸アルキルエステルが該配合物の約３０ないし約６０重量％を構成する請求項７０に記載の混合物。
【請求項１０６】
当該中鎖脂肪酸アルキルエステルがラウリン酸アルキルエステル（Ｃ１２：０）を含有してなり、またその場合、当該ラウリン酸アルキルエステルが該配合物の約５ないし約２０重量％を構成する請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１０７】
当該中鎖脂肪酸アルキルエステルが１２個以下の炭素を有する脂肪酸アルキルエステルを含有してなる請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１０８】
当該混合物が８％未満のミリスチン酸アルキルエステルおよび飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなる請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１０９】
当該混合物が６％未満のミリスチン酸アルキルエステルおよび飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなる請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１１０】
当該混合物が約１５％ないし約４０％の中鎖脂肪酸アルキルエステルおよび約６０％ないし約８５％のモノ不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなる請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１１１】
当該混合物が約６０％ないし約８５％の中鎖脂肪酸アルキルエステルおよび約１５％ないし約４０％のモノ不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなる請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１１２】
当該モノ不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルが、パルミトレン酸脂肪酸アルキルエステル（Ｃ１６：１），オレイン酸脂肪酸アルキルエステル（Ｃ１８：１）、またはその組合せを含有してなる請求項１００〜１１１のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１３】
該アルキル−エステル化脂肪酸が直鎖アルキルエステルを含有してなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１４】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的に直鎖アルキルエステルからなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１５】
該アルキル−エステル化脂肪酸が分枝鎖アルキルエステルを含有しない請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１６】
該エステル化脂肪酸が、イソプロピルエステルではない請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１７】
該エステル化脂肪酸が、基本的にメチルエステルからなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１８】
該エステル化脂肪酸が、エチルエステルを含有してなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１９】
該エステル化脂肪酸が、基本的にエチルエステルからなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２０】
該エステル化脂肪酸が、ｎ−プロピルエステルを含有してなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２１】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−プロピルエステルからなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２２】
該エステル化脂肪酸が、ｎ−ブチルエステルを含有してなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２３】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−ブチルエステルからなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２４】
当該混合物が−１０℃未満またはそれに等しい融点を有する請求項１００〜１２３のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２５】
当該混合物が−２０℃未満またはそれに等しい融点を有する請求項１００〜１２３のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２６】
当該混合物が、
１５％ないし２５％のカプリル酸エチルエステル（Ｃ８）；
２５％ないし３５％のカプリン酸エチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸エチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１２７】
当該混合物が、
１５％ないし２５％のカプリル酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ８）；
２５％ないし３５％のカプリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１２８】
当該混合物が、
５％ないし１５％のカプリル酸エチルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸エチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸エチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１２９】
当該混合物が、
５％ないし１５％のカプリル酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３０】
当該混合物が、
５％ないし１５％のカプリル酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３１】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸エチルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸エチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸エチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３２】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３３】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３４】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸エチルエステル（Ｃ８）；
２５％ないし３５％のカプリン酸エチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸エチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３５】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ８）；
２５％ないし３５％のカプリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３６】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ８）；
２５％ないし３５％のカプリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３７】
当該混合物が内燃機関での燃料としての使用に適する請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１３８】
当該混合物が燃料添加物、機能的流体、または凝固点降下剤としての使用に適する請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１３９】
請求項１００または１０１に記載の混合物および石油ディーゼルを含有してなるバイオディーゼル配合物。
【請求項１４０】
当該混合物が１％、２％、５％、１０％、１５％、および２０％からなる群より選択される配合物の部分を含有してなる請求項１３９記載のバイオディーゼル配合物。
【請求項１】
脂肪酸混合物であって、
８０％ないし１００％の８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸および１２〜１８個の炭素を有するモノ不飽和脂肪酸；
５％ないし８０％のカプリル酸（Ｃ８：０）およびカプリン酸（Ｃ１０：０）；および
２０％未満のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなり；
その場合、当該モノ不飽和脂肪酸が重量で該混合物の５％ないし９５％を占め；また
その場合、当該混合物が１２個を超える炭素を有する２０％未満のポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸を含有してなり；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；またその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、およびイソプロピルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる；
脂肪酸混合物。
【請求項２】
脂肪酸混合物であって、
８０％ないし１００％の８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸および１２〜１８個の炭素を有するモノ不飽和脂肪酸；
５％ないし８０％のカプリル酸（Ｃ８：０）およびカプリン酸（Ｃ１０：０）；および
２０％未満のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなり；
その場合、当該モノ不飽和脂肪酸が重量で該混合物の５％ないし９５％を占め；また
その場合、当該混合物が１２個を超える炭素を有する２０％未満のポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸を含有してなり；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；またその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が、直鎖アルキルエステルを含有してなる；
脂肪酸混合物。
【請求項３】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、基本的に直鎖アルキルエステルからなるものである請求項２に記載の混合物。
【請求項４】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステルおよびｎ−ブチルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる請求項２または３に記載の混合物。
【請求項５】
該混合物が６％ないし２０％のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなる請求項１または２に記載の混合物。
【請求項６】
カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）が共に該混合物の２０％ないし４０％を占める請求項１または２に記載の混合物。
【請求項７】
オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に該混合物の５０％ないし８５％を占める請求項１または２に記載の混合物。
【請求項８】
オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に該混合物の５０％ないし８５％を占める請求項１〜７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９】
ステアリン酸（１８：０）およびパルミチン酸（１６：０）が該混合物の４％未満を占める請求項１〜８のいずれかに記載の混合物。
【請求項１０】
ミリスチン酸（１４：０）が該混合物の２％未満を占める請求項１〜９のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１】
リノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）が共に該混合物の３％未満を占める請求項１〜１０のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２】
アラキドン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）およびリグノセリン酸（Ｃ２４：０）が該混合物の１％未満を占める請求項１〜１１のいずれかに記載の混合物。
【請求項１３】
当該混合物が、
５５％ないし６５％のオレイン酸（Ｃ１８：１）；
５％ないし１５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；
１５％ないし２５％のカプリン酸（Ｃ１０：０）；および
５％ないし１５％のカプリル酸（Ｃ８：０）；
を含有してなる請求項１または２に記載の混合物。
【請求項１４】
カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２：０）が共に該混合物の６０％ないし８５％を占める請求項１または２に記載の混合物。
【請求項１５】
オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に該混合物の１５％ないし４０％を占める請求項１または２に記載の混合物。
【請求項１６】
オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトレン酸（１６：１）が共に該混合物の５０％ないし８５％を占める請求項１５に記載の混合物。
【請求項１７】
ステアリン酸（１８：０）およびパルミチン酸（１６：０）が該混合物の４％未満を占める請求項１２〜１６のいずれかに記載の混合物。
【請求項１８】
ミリスチン酸（１４：０）が該混合物の２％未満を占める請求項１２〜１７のいずれかに記載の混合物。
【請求項１９】
リノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）が共に該混合物の３％未満を占める請求項１２〜１８のいずれかに記載の混合物。
【請求項２０】
アラキドン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）およびリグノセリン酸（Ｃ２４：０）が該混合物の１％未満を占める請求項１２〜１９のいずれかに記載の混合物。
【請求項２１】
当該混合物が、
５５％ないし６５％のオレイン酸（Ｃ１８：１）；
５％ないし１５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；
１５％ないし２５％のカプリン酸（Ｃ１０：０）；および
５％ないし１５％のカプリル酸（Ｃ８：０）
を含有してなる請求項１または２に記載の混合物。
【請求項２２】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも１０％を占める請求項１〜２１のいずれかに記載の混合物。
【請求項２３】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも２０％を占める請求項１〜２２のいずれかに記載の混合物。
【請求項２４】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも３０％を占める請求項１〜２３のいずれかに記載の混合物。
【請求項２５】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも４０％を占める請求項１〜２４のいずれかに記載の混合物。
【請求項２６】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも５０％を占める請求項１〜２５のいずれかに記載の混合物。
【請求項２７】
モノ不飽和脂肪酸が該混合物の少なくとも６０％を占める請求項１〜２６のいずれかに記載の混合物。
【請求項２８】
１２個を超える炭素を有するポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸が共に該混合物の１５％未満を占める請求項１〜２７のいずれかに記載の混合物。
【請求項２９】
１２個を超える炭素を有するポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸が共に該混合物の１０％未満を占める請求項１〜２８のいずれかに記載の混合物。
【請求項３０】
１２個を超える炭素を有するポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸が共に該混合物の５％未満を占める請求項１〜２９のいずれかに記載の混合物。
【請求項３１】
１２個を超える炭素を有するポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸が共に該混合物の３％未満を占める請求項１〜３０のいずれかに記載の混合物。
【請求項３２】
該混合物が油である請求項１〜３１のいずれかに記載の混合物。
【請求項３３】
該混合物が少なくとも２種の異なる油の配合物である請求項１〜３２のいずれかに記載の混合物。
【請求項３４】
該アルキル−エステル化脂肪酸が直鎖アルキルエステルを含有してなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項３５】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的に直鎖アルキルエステルからなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項３６】
該アルキル−エステル化脂肪酸が分枝鎖アルキルエステルを含有しない請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項３７】
該エステル化脂肪酸がイソプロピルエステルではない請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項３８】
該エステル化脂肪酸がメチルエステルを含有してなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項３９】
該エステル化脂肪酸が、基本的にメチルエステルからなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４０】
該エステル化脂肪酸がエチルエステルを含有してなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４１】
該エステル化脂肪酸が、基本的にエチルエステルからなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４２】
該エステル化脂肪酸がｎ−プロピルエステルを含有してなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４３】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−プロピルエステルからなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４４】
該エステル化脂肪酸がｎ−ブチルエステルを含有してなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４５】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−ブチルエステルからなる請求項１〜３３のいずれかに記載の混合物。
【請求項４６】
２種以上の油の配合物であって、当該配合物が少なくとも５０重量％の飽和中鎖脂肪酸、ミリストレン酸（Ｃ１４：１）、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなり、その場合、当該中鎖脂肪酸がカプリル酸（Ｃ８：０）からなり、またその場合、当該カプリル酸が該配合物の約２５重量％まで、またミリスチン酸（Ｃ１４：０）および飽和長鎖脂肪酸が１０重量％未満を構成し；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；そしてその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、およびイソプロピルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる；
配合物。
【請求項４７】
２種以上の油の配合物であって、当該配合物が少なくとも５０重量％の飽和中鎖脂肪酸、ミリストレン酸（Ｃ１４：１）、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなり、その場合、当該中鎖脂肪酸がカプリル酸（Ｃ８：０）からなり、またその場合、当該カプリル酸が該配合物の約２５重量％まで、またミリスチン酸（Ｃ１４：０）および飽和長鎖脂肪酸が１０重量％未満を構成し；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；そしてその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が直鎖アルキルエステルを含有してなる；
配合物。
【請求項４８】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、基本的に直鎖アルキルエステルからなる請求項４７に記載の配合物。
【請求項４９】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステルおよびｎ−ブチルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる請求項４７または４８に記載の配合物。
【請求項５０】
当該中鎖脂肪酸がカプリン酸（Ｃ１０：０）を含有してなり、またその場合のカプリン酸が、該配合物の約３０ないし約６０重量％を構成する請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５１】
当該中鎖脂肪酸がラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなり、またその場合のラウリン酸が該配合物の約５ないし約２０重量％を構成する請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５２】
当該配合物が８％未満のミリスチン酸および飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５３】
当該配合物が６％未満のミリスチン酸および飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５４】
当該配合物が約１５％ないし約４０％の飽和中鎖脂肪酸および約６０％ないし約８５％のモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５５】
当該配合物が約６０％ないし約８５％の飽和中鎖脂肪酸および約１５％ないし約４０％のモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５６】
当該モノ不飽和長鎖脂肪酸がパルミトレン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、またはその組合せを含有してなる請求項４６〜５５のいずれかに記載の配合物。
【請求項５７】
当該配合物が内燃機関での燃料としての使用に適するものである請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５８】
当該油が、カノーラ、ナタネ、ヤシ油、ヤシ殻、ココヤシ、ホシダネヤシ、ヒマワリ、ベニバナ、クフェア、オリーブ、マカダミア、ババスーヤシ、ヒマ、ラッカセイ、ワタ、アマ種子、亜麻仁、コフネヤシ、およびジャトロファからなる群より選択される請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項５９】
当該油の１種以上が遺伝的に修飾した植物に由来し、その場合、当該植物は飽和中鎖脂肪酸を産生するように修飾したものである請求項４６または４７に記載の配合物。
【請求項６０】
当該配合物が−１０℃未満またはそれに等しい融点を有する請求項４６〜５８のいずれかに記載の配合物。
【請求項６１】
当該配合物が−２０℃未満またはそれに等しい融点を有する請求項４６〜５８のいずれかに記載の配合物。
【請求項６２】
該アルキル−エステル化脂肪酸が直鎖アルキルエステルを含有してなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６３】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的に直鎖アルキルエステルからなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６４】
該アルキル−エステル化脂肪酸が分枝鎖アルキルエステルを含有しない請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６５】
該アルキル−エステル化脂肪酸がイソプロピルエステルではない請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６６】
該アルキル−エステル化脂肪酸がメチルエステルを含有してなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６７】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的にメチルエステルからなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６８】
該アルキル−エステル化脂肪酸がエチルエステルを含有してなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項６９】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的にエチルエステルからなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項７０】
該アルキル−エステル化脂肪酸がｎ−プロピルエステルを含有してなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項７１】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的にｎ−プロピルエステルからなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項７２】
該アルキル−エステル化脂肪酸がｎ−ブチルエステルを含有してなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項７３】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的にｎ−ブチルエステルからなる請求項４６〜６１のいずれかに記載の配合物。
【請求項７４】
脂肪酸混合物であって、
少なくとも５０重量％の中鎖脂肪酸、ミリストレン酸（Ｃ１４：１）、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなり、その場合、当該飽和中鎖脂肪酸がカプリル酸（Ｃ８：０）を含有してなり、その場合の当該カプリル酸が該配合物の約２５重量％まで、またミリスチン酸（Ｃ１４：０）および飽和長鎖脂肪酸が１０重量％未満を構成し；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；そしてその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、およびイソプロピルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる；
混合物。
【請求項７５】
脂肪酸混合物であって、
少なくとも５０重量％の中鎖脂肪酸、ミリストレン酸（Ｃ１４：１）、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなり、その場合、当該飽和中鎖脂肪酸がカプリル酸（Ｃ８：０）を含有してなり、その場合の当該カプリル酸が該配合物の約２５重量％まで、またミリスチン酸（Ｃ１４：０）および飽和長鎖脂肪酸が１０重量％未満を構成し；
その場合、当該脂肪酸がアルキル−エステル化されており；そしてその場合のアルキル−エステル化脂肪酸が、直鎖アルキルエステルを含有してなる；
混合物。
【請求項７６】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的に直鎖のアルキルエステルからなる請求項７５に記載の混合物。
【請求項７７】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステルおよびｎ−ブチルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる請求項７５または７６に記載の混合物。
【請求項７８】
当該中鎖脂肪酸がカプリン酸（Ｃ１０：０）を含有してなり、その場合、当該カプリン酸が該配合物の約３０ないし約６０重量％を構成する請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項７９】
当該飽和中鎖脂肪酸がラウリン酸（Ｃ１２：０）を含有してなり、その場合、当該ラウリン酸が該配合物の約５ないし約２０重量％を構成する請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８０】
当該中鎖脂肪酸が１２個以下の炭素を有する脂肪酸を含有してなる請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８１】
当該混合物が８％未満のミリスチン酸および飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８２】
当該混合物が６％未満のミリスチン酸および飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８３】
当該混合物が約１５％ないし約４０％の飽和中鎖脂肪酸および約６０％ないし約８５％のモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８４】
当該混合物が約６０％ないし約８５％の中鎖脂肪酸および約１５％ないし約４０％のモノ不飽和長鎖脂肪酸を含有してなる請求項７４または７５に記載の混合物。
【請求項８５】
当該モノ不飽和長鎖脂肪酸が、パルミトレン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、またはその組合せを含有してなる請求項７４〜８４のいずれかに記載の配合物。
【請求項８６】
当該混合物が−１０℃以下の融点を有する請求項７４〜８５のいずれかに記載の混合物。
【請求項８７】
当該混合物が−２０℃以下の融点を有する請求項７４〜８５のいずれかに記載の混合物。
【請求項８８】
該アルキル−エステル化脂肪酸が直鎖アルキルエステルを含有してなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項８９】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的に直鎖のアルキルエステルからなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９０】
該アルキル−エステル化脂肪酸が分枝鎖アルキルエステルを含有しない請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９１】
該エステル化脂肪酸が、イソプロピルエステルではない請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９２】
該エステル化脂肪酸が、メチルエステルを含有してなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９３】
該エステル化脂肪酸が、基本的にメチルエステルからなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９４】
該エステル化脂肪酸が、エチルエステルを含有してなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９５】
該エステル化脂肪酸が、基本的にエチルエステルからなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９６】
該エステル化脂肪酸が、ｎ−プロピルエステルを含有してなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９７】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−プロピルエステルからなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９８】
該エステル化脂肪酸が、ｎ−ブチルエステルを含有してなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９９】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−ブチルエステルからなる請求項７４〜８７のいずれかに記載の混合物。
【請求項１００】
脂肪酸アルキルエステルの混合物であって、
少なくとも５０重量％の飽和中鎖脂肪酸アルキルエステル、ミリストレン酸アルキルエステル、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステル、および
１０重量％未満のミリスチン酸アルキルエステルおよび飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなり；その場合、該アルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、およびイソプロピルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる混合物。
【請求項１０１】
脂肪酸アルキルエステルの混合物であって、
少なくとも５０重量％の飽和中鎖脂肪酸アルキルエステル、ミリストレン酸アルキルエステル、およびモノ不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステル、および
１０重量％未満のミリスチン酸アルキルエステルおよび飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなり；その場合、該アルキル−エステル化脂肪酸が、直鎖アルキルエステルを含有してなる混合物。
【請求項１０２】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、基本的に直鎖のアルキルエステルからなる請求項１０１に記載の混合物。
【請求項１０３】
該アルキル−エステル化脂肪酸が、メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステルおよびｎ−ブチルエステルからなる群より選択される１種以上のアルキルエステルを含有してなる請求項１０１または１０２に記載の混合物。
【請求項１０４】
当該中鎖脂肪酸アルキルエステルがカプリル酸アルキルエステル（Ｃ８：０）を含有してなり、またその場合、当該カプリル酸アルキルエステルが該配合物の約２５重量％までを構成する請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１０５】
当該中鎖脂肪酸アルキルエステルがカプリン酸アルキルエステル（Ｃ１０：０）を含有してなり、またその場合、当該カプリン酸アルキルエステルが該配合物の約３０ないし約６０重量％を構成する請求項７０に記載の混合物。
【請求項１０６】
当該中鎖脂肪酸アルキルエステルがラウリン酸アルキルエステル（Ｃ１２：０）を含有してなり、またその場合、当該ラウリン酸アルキルエステルが該配合物の約５ないし約２０重量％を構成する請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１０７】
当該中鎖脂肪酸アルキルエステルが１２個以下の炭素を有する脂肪酸アルキルエステルを含有してなる請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１０８】
当該混合物が８％未満のミリスチン酸アルキルエステルおよび飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなる請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１０９】
当該混合物が６％未満のミリスチン酸アルキルエステルおよび飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなる請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１１０】
当該混合物が約１５％ないし約４０％の中鎖脂肪酸アルキルエステルおよび約６０％ないし約８５％のモノ不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなる請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１１１】
当該混合物が約６０％ないし約８５％の中鎖脂肪酸アルキルエステルおよび約１５％ないし約４０％のモノ不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含有してなる請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１１２】
当該モノ不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルが、パルミトレン酸脂肪酸アルキルエステル（Ｃ１６：１），オレイン酸脂肪酸アルキルエステル（Ｃ１８：１）、またはその組合せを含有してなる請求項１００〜１１１のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１３】
該アルキル−エステル化脂肪酸が直鎖アルキルエステルを含有してなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１４】
該アルキル−エステル化脂肪酸が基本的に直鎖アルキルエステルからなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１５】
該アルキル−エステル化脂肪酸が分枝鎖アルキルエステルを含有しない請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１６】
該エステル化脂肪酸が、イソプロピルエステルではない請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１７】
該エステル化脂肪酸が、基本的にメチルエステルからなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１８】
該エステル化脂肪酸が、エチルエステルを含有してなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１１９】
該エステル化脂肪酸が、基本的にエチルエステルからなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２０】
該エステル化脂肪酸が、ｎ−プロピルエステルを含有してなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２１】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−プロピルエステルからなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２２】
該エステル化脂肪酸が、ｎ−ブチルエステルを含有してなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２３】
該エステル化脂肪酸が、基本的にｎ−ブチルエステルからなる請求項７０〜１１２のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２４】
当該混合物が−１０℃未満またはそれに等しい融点を有する請求項１００〜１２３のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２５】
当該混合物が−２０℃未満またはそれに等しい融点を有する請求項１００〜１２３のいずれかに記載の混合物。
【請求項１２６】
当該混合物が、
１５％ないし２５％のカプリル酸エチルエステル（Ｃ８）；
２５％ないし３５％のカプリン酸エチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸エチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１２７】
当該混合物が、
１５％ないし２５％のカプリル酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ８）；
２５％ないし３５％のカプリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１２８】
当該混合物が、
５％ないし１５％のカプリル酸エチルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸エチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸エチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１２９】
当該混合物が、
５％ないし１５％のカプリル酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３０】
当該混合物が、
５％ないし１５％のカプリル酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３１】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸エチルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸エチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸エチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３２】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３３】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ８）；
３０％ないし４０％のカプリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３４】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸エチルエステル（Ｃ８）；
２５％ないし３５％のカプリン酸エチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸エチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３５】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ８）；
２５％ないし３５％のカプリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−プロピルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３６】
当該混合物が、
５％ないし１０％のカプリル酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ８）；
２５％ないし３５％のカプリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１０）；
５％ないし２０％のラウリン酸ｎ−ブチルエステル（Ｃ１２）
を含有してなる請求項１００〜１２３に記載の混合物。
【請求項１３７】
当該混合物が内燃機関での燃料としての使用に適する請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１３８】
当該混合物が燃料添加物、機能的流体、または凝固点降下剤としての使用に適する請求項１００または１０１に記載の混合物。
【請求項１３９】
請求項１００または１０１に記載の混合物および石油ディーゼルを含有してなるバイオディーゼル配合物。
【請求項１４０】
当該混合物が１％、２％、５％、１０％、１５％、および２０％からなる群より選択される配合物の部分を含有してなる請求項１３９記載のバイオディーゼル配合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５０８０４７（Ｐ２０１１−５０８０４７Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４０６２１（Ｐ２０１０−５４０６２１）
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２６４１０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８５０３３
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５０８２０８４２１）サイバス，エルエルシー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２６４１０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８５０３３
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５０８２０８４２１）サイバス，エルエルシー (3)
【Ｆターム（参考）】
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