イヌリンの新たな多形形態エプシロン・イヌリンおよびその組成物
【課題】イヌリンの新たな多形形態エプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）の精製法を開発し、ｅＩＮを含む組成物の調製を可能とする。
【解決手段】エプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）は、例えば好ましい重合度を持つイヌリンを８０℃に加熱し完全に水に高濃度で溶解したものを５０−８５℃に最低１５分から２時間あるいはそれ以上の間維持することによって調製できる。
【解決手段】エプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）は、例えば好ましい重合度を持つイヌリンを８０℃に加熱し完全に水に高濃度で溶解したものを５０−８５℃に最低１５分から２時間あるいはそれ以上の間維持することによって調製できる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌリンの新たな多形形態であるエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌリンは、直鎖状にフルクトースが側鎖なく結合し末端に１つのグルコースが結合したβ−Ｄ−（２→１）ポリフルクトフラノシルα−Ｄ−グルコース ファミリーから成る単純で不活性な多糖類である。従ってイヌリン組成物は、単純で中性の多糖から成る公知の組成であるが、分子量は多様であり１６キロダルトン（ｋＤ）以下またはそれを超える範囲に及ぶ。イヌリンは、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）の貯蔵炭水化物であり、ダリアの球根から安価に得られる。イヌリンは比較的疎水性のポリオキシエチレン様の骨格を有し、この珍しい構造に加えてイオン化されない性質が、再結晶による容易に、非常に純粋なイヌリンの調製を可能にしている。自然界ではイヌリンは重合度（ＤＰ）６０程度あるいはそれ以上のフルクトースから成り、様々な溶解度や特性等を持つ。
【０００３】
イヌリンの分子組成は周知であるが、報告されている溶解性は様々である。例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（第１３版，２００１年）では、「低温の水および有機溶媒にわずかに可溶性であり、高温には可溶性」としてイヌリンを記述しており、一方、定量的研究（Ｐｈｅｌｐｓ，ＣＦ，１９６５）によれば、水からの沈殿によって得られる第１のものと、エタノールからの沈殿によって得られる第２のものの、二つの性質が異なるイヌリンの形態が存在し、両方とも３７℃で水に実質的に可溶性であることを示唆した。また、イヌリンの懸濁液は、静止したままであると溶解性がより低くなることも公知である。水からの沈殿によって得られる形態は、αイヌリン（ａＩＮ）と称され、エタノールからの沈殿によって得られる形態は、βイヌリン（ｂＩＮ）として公知である。
【０００４】
ａＩＮもｂＩＮも室温でしだいに水に対する溶解度が減少することが観察された（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｍ．，１９８６）。この事がγイヌリン（ｇＩＮあるいはガムリン）と称される、粒子状イヌリンの第３の多形形態の発見を導き、国際特許ＷＯ８７／０２６７９号において開示されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。また、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｍ．，１９８６およびＣｏｏｐｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｔｅｅｌｅ，Ｅ．Ｊ．，１９８８）も参照されたい。
【０００５】
この第３の多形形態は、３７℃で水に実質的に不溶性であるが、濃縮された溶液（例えば５０ｍｇ／ｍｌ）において、４５℃以上の温度でのみ、αおよびβ多形形態のように可溶性である。ｇＩＮの際立った特徴は、５０％ＯＤ７００熱転移点（薄い溶液の溶解相転移）が４７±１℃というシャープな溶解点を持つことである。
【０００６】
その後、デルタ・イヌリン（ｄＩＮあるいはデルティン）と称される、粒子状イヌリンの第四の多形形態が発見された。デルタ・イヌリンは５０℃で水に不溶性であり、国際特許ＷＯ２００６／０２４１００号において開示されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。実際ｄＩＮは、濃縮された溶液（例えば５０ｍｇ／ｍｌ）において、７０−８０℃に加熱された場合にのみ可溶性である。ｄＩＮは、薄い溶液の５０％ＯＤ７００熱転移点が５３−５８℃ということで特徴づけられる。ｄＩＮは、濃縮されたｇＩＮ溶液を５５℃以上に加熱することにより簡便に調製できる。
【０００７】
これら既知の４種類のイヌリン多形形態は、２３℃で急速に溶解する形態（β２３０イヌリン）から、３７℃で８分の半減期で可溶性の形態（α３７８イヌリン）を経て、３７℃で実質的に不溶性の形態（ｇＩＮ）さらに５０℃で実質的に不溶性の形態（ｄＩＮ）という水性媒体における異なった溶解率によって特徴付けられる。後半の２つの多形形態は３７℃で不溶性であり、もしこの温度を持つ人間のような生物体に導入されてもそれぞれの粒子形態を維持できる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、これらの多形形態が１９７０年代の、イヌリンの水溶液は生理学的に不活性（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｄｅｘ，１９７９）であり抗原性も腎毒性も無い（Ｖｅｒｒｏｕｓｔ，ＰＪ ｅｔ ａｌ．，１９７４）が、にもかかわらず粒子形態のイヌリンは免疫学的に活性であり、特に補体の副経路（ＡＰＣ）の活性因子として働く（Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ａｎｄ Ｍ Ｃａｒｔｅｒ，１９８６）という観察の少なくとも一部を説明できると考えられる。
【０００８】
このようにイヌリンは、様々な溶解性やその他の特性を持つ明瞭に異なる形態を取り得る。本発明はエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）と呼ばれる新規な多形形態のイヌリンに関する。
【先行技術文献】
【０００９】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＡＵ８６／００３１１（ＷＯ８７／０２６７９）ｔｉｔｌｅｄ″Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔ″
【特許文献２】ＰＣＴ／ＡＵ８９／００３４９（ＷＯ９０／０１９４９）ｔｉｔｌｅｄ″Ｇａｍｍａ ｉｎｕｌｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ″
【特許文献３】ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００１３２８（ＷＯ２００６／０２４１００）ｔｉｔｌｅｄ″Ｎｅｗ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｆｏｒｍ ｏｆ ｉｎｕｌｉｎ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ”
【非特許文献１】Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ，ａ ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ．Ｖａｃｃｉｎｅ ９：４０８−４１５（１９９１ａ）．
【非特許文献２】Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ｅｔ ａｌ．Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ（ｇａｍｍａ ｉｎｕｌｉｎ／ａｌｕｍ ｈｙｂｒｉｄ ａｄｊｕｖａｎｔ）ｈａｓ ｇｒｅａｔｅｒ ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ ｔｈａｎ ａｌｕｍ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ２７：１３１−１３４（１９９１ｂ）．
【非特許文献３】Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ａｎｄ ＥＪ Ｓｔｅｅｌｅ．Ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇａｍｍａ ｉｎｕｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ６６：３４５−３５２（１９８８）．
【非特許文献４】Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ａｎｄ ＥＪ Ｓｔｅｅｌｅ．Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ，ａ ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｇａｍｍａ ｉｎｕｌｉｎ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｌｕｍ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ９：３５１−３５７（１９９１）．
【非特許文献５】Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ａｎｄ Ｍ Ｃａｒｔｅｒ．Ａｎｔｉ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ″ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒｍｓ″ｏｆ ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｉｎｕｌｉｎ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ２３（８）：８９５−９０１（１９８６）．
【非特許文献６】Ｐｈｅｌｐｓ，ＣＦ．Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｎｕｌｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ９５：４１−４７（１９６５）．
【非特許文献７】Ｓｔｅｐｈｅｎ，ＡＭ，ＧＯ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ ＰＡ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（ｅｄｓ）．Ｆｏｏｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＦＬ（２００６）．
【非特許文献８】Ｖｅｒｒｏｕｓｔ，ＰＪ ｅｔ ａｌ．Ｌａｃｋ ｏｆ ｎｅｐｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ６：１５７−１６９（１９７４）．
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第１の態様によると、十分に精製されたイヌリンであって、希薄懸濁液（＜０．５
れる。
【００１１】
５８℃であるエプシロン多形形態のイヌリン粒子から成る薬理学的または免疫学的組成物が提供される。
【００１２】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、注射剤あるいは経口、経腸、経膣、経皮または経眼剤として調製され得る。組成物はまた、活性成分が例えばワクチン抗原（遺伝子組換え抗原を含む）、抗原ペプチドまたは抗イディオタイプ抗体を含むものとも成り得る。さらに組成物は、リンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激因子、マクロファージ刺激因子あるいはエンドトキシンの様な免疫調節剤の一つあるいはそれ以上を含むものとも成り得る。
【００１３】
本発明の第３の態様によると、第１あるいは第２の態様に基づく組成物の有効量を投与することによる、例えば感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした免疫応答を刺激するための方法が提供される。
【００１４】
関連した本発明の第４の態様によると、第１あるいは第２の態様に基づく組成物の有効量を投与することによる、例えば感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした免疫応答を促進するための方法が提供される。
【００１５】
本発明の第５の態様によると、ガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）および／またはデルタ・イヌリン
提供される。
【００１６】
本発明の第６の態様によると、１０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度のイヌリン溶液を約５０℃から約８５℃の範囲の温度で、最低１５分から２週間もしくはそれ以上維持する
ン多形形態のイヌリンを調整する方法が提供される。
【００１７】
本発明の更なる態様によると、多形形態のイヌリン混合物の分画方法であって、溶解
ロン多形形態のイヌリンから成る懸濁液から沈殿させる方法であり、高分子量のイヌリン画分を得た後のイヌリン溶液からエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を得、さらに低分子量のイヌリン画分を得る方法が提供される。
【００１８】
本発明の更なる態様によると、希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点が
分に精製されたイヌリンであって、そのイヌリン精製物が水またはエタノールのような溶媒中のスラリーを加熱し調製された前駆体のエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を溶解し、その後アルファ・イヌリン（ａＩＮ），ベータ・イヌリン（ｂＩＮ），ガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）あるいはデルタ・イヌリン（ｄＩＮ）のうち一つあるいはそれ以上のイヌリンを沈殿させることにより調製したものが提供される。
【００１９】
本発明の更なる態様によると、エプシロン多形形態のイヌリン懸濁液中のイヌリンの存在や濃度を測定する方法であって、その方法が希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点を測定する方法が提供される。
【００２０】
本発明の更なる態様によると、放射線や化学療法による免疫抑制を治療または予防する方法であって、その方法が第１または第２態様に基づく組成物の有効量を投与する方法が提供される。
【００２１】
本明細書に記載した特徴および利点はすべて限定的ではなく、特に当業者には、添付図面、実施例および特許請求の範囲を読めば、多くの追加的な特徴および利点が明確であろう。さらに、実施例で使用した言葉は、読み易さや指示的であることを第一義としたものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものでは無い。
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、ｅＩＮと称される新規の多形形態の粒子状イヌリンの調製および使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、イヌリンを５８℃以上で１５分から２週間あるいはそれ以上加熱し、その後およそ６０℃から７６℃で５時間程度保持することにより純粋なｅＩＮと称される新規の多形形態の粒子状イヌリンを調製する事に成功し、それに基き本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、ａＩＮ，ｂＩＮ，ｇＩＮあるいはｄＩＮより長鎖のイヌリンを簡便に調製することを可能にする。
【発明を実施するための形態】
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
好ましい実施態様に関する図および記載は、例示的なものである。下記の議論より、本明細書に記載された構造や方法を代替する実施態様は、本発明の請求項の原理から外れることなく実施できることは明白に理解されるべきである。
【００２６】
いくつかの実施態様では、添付した図の様な詳細な引用がなされるであろう。可能な限り図においては文献番号のようなものが用いられると理解されるべきである。図は開示されたシステム（あるいは方法）の態様を例示する目的でのみ用いられる。以下の記載から本発明のさまざまな修正及び変更を、この発明の原理から外れることなく実施できることは、当業者には明白であろう。
【００２７】
本発明は、エプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）と命名された新規な、第５の多形形態のイヌリン粒子を同定した。ａＩＮ，ｂＩＮ，ｇＩＮおよびｄＩＮと似た特徴がｅＩＮでもまた見られるが、しかしながら識別できる特徴と効用もまた備える。
【００２８】
ることにより同定され、この事がｄＩＮとは異なり、ｅＩＮは、濃厚なイヌリンの懸濁液を
度で加熱することによりｅＩＮに変換できることを発見した。例えば、ｄＩＮの濃厚な懸濁液を急速に加熱すると７３℃以下で完全に溶解する事が見つかっている。予期せぬことに、同じ試料を６０−８０℃の間で徐々に加熱すると、７３℃では溶解しないペースト状の沈殿が生じた。調べてみたところ、この高温で生じたイヌリンの沈殿物はａＩＮ，ｂＩＮ，ｇＩＮおよびｄＩＮとは異なる特徴を持っており、希薄懸濁液の５０％ＯＤ７００熱転移点が一段高い、新規な第５のイヌリンの多形形態（エプシロン・イヌリン）の存在を示唆した。
【００２９】
この様に、本発明の第１の態様によれば、十分に精製されたイヌリンであって、希薄
リンが提供される。
【００３０】
本明細書において用いられるとき、「イヌリン」という用語は、イヌリン、β−Ｄ−［２→１］−ポリフルクトフラノシルα−Ｄ−グルコースだけでなく、例えばこの末端のグルコースを除くことが可能であるインベルターゼまたはイヌラーゼ酵素を用いて、イヌリンからの末端グルコースの酵素的除去によって得られる可能性があるβ−Ｄ−［２→１］ポリフルクトースを含む、イヌリンの誘導体も含むと理解されるべきである。この用語の範囲内に含まれる他の誘導体は、例えば公知の方法によるアルキル、アリール、またはアシル基での化学的置換によって、遊離の水酸基がエーテル化またはエステル化されたイヌリンの誘導体である。
【００３１】
本発明のエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）は、希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点が好ましくは、約５８℃から約８０℃の範囲にある。
【００３２】
本発明のｅＩＮの一つの局面では、５９℃以下では水溶媒に溶解度が低く、より好ましくは、７５℃以下で水溶媒に溶解度が低い。
【００３３】
ｅＩＮ粒子の単一分子は、約５から約５０キロダルトン（ｋＤ）の範囲の分子量を持つ。
【００３４】
ｅＩＮ粒子の単一分子の重合度（ＤＰ）は、多くの場合高い（即ちフルクトースの重合度２５以上、好ましくはフルクトースの重合度３５以上）。
【００３５】
好ましくは、ｅＩＮはジメチルスルホキシド（水素結合を中和する事が知られている溶媒）に対しａＩＮ，ｂＩＮ，ｇＩＮおよびｄＩＮのそれぞれと比較してより低い溶解度示す。
【００３６】
他の多形形態のイヌリンと同様にｅＩＮ溶解と再結晶化により可逆的に他の多形形態に変換される事がわかった。このことにより、ｅＩＮがイヌリン分子の構造内の化学的あるいは共有結合の変化というより、イヌリン分子の形態的再編成の結果によると推測される。
【００３７】
ｅＩＮは、ダリア、チコリ、アーティチョーク、玉ねぎおよびニンニクなど様々な植物から精製されたイヌリンや、シュークロース、グルコースあるいはフルクトースから合成されたイヌリンまたは当業者によく知られた方法で重合度を増したイヌリンから調整可能である。
【００３８】
本明細書において用いられるとき、「十分に精製された試料」という用語は、本質的に他の多糖体や他の外来性の生物学的原料（例えば植物由来の物質）を含まないイヌリンを意味するものと理解されるべきである。この様な試料は、外来性の生物学的原料が１０％（重量比）以下のものであり、よく知られているチコリからのイヌリンの商業的な生産に用いられる熱水抽出および精製工程（Ｓｔｅｐｈｅｎ，ＡＭ，ｅｔ ａｌ．，２００６）を含む当業者によく知られた、いかなる方法によっても調整可能である。
【００３９】
デルタ・イヌリンおよびｇＩＮは、免疫学的に活性であり、単独あるいは水酸化アルミニウムのような抗原結合担体材料と共に、特にワクチンのアジュバントとして有効であることがすでに解っている（Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ａｎｄ ＥＪ Ｓｔｅｅｌｅ，１９９１，Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ｅｔ ａｌ．，１９９１ａ，Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ｅｔ ａｌ．，１９９１ｂ．ＷＯ９０／０１９４９およびＷＯ２００６／０２４１００）。後述の実施例６において、本発明者等は、ｅＩＮもまた免疫学的に活性である事のみで無く、ｇＩＮおよびｄＩＮをしのぐレベルの免疫活性を持ち、ｅＩＮを含むアジュバントが、今日までに研究あるいは開発されたいかなるイヌリンよりも強力である可能性を提供する。
【００４０】
更にｅＩＮは、５つのイヌリンの多形形態の中で最も熱安定的であり、この事はｅＩＮ粒子の懸濁液が他の多形形態が溶解する温度においても不溶性のままである事を意味する。この事は、８５℃まで加熱する製造工程の場合ｅＩＮが最も熱安定的に有利であることにつながる。更に、もしｅＩＮが、熱安定性が要求されるアジュバントとして用いられる場合、ｅＩＮ粒子が高い気温の中でも安定であることを意味する。
【００４１】
第２の局面においては、本発明は希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点が
成物を提供する。
【００４２】
好ましくは、本発明のｅＩＮ粒子の組成物は、５９℃以下の水溶性溶媒に溶けにくく、より好ましくは、７５℃以下で溶けにくい。
【００４３】
好ましくは、本発明のｅＩＮ粒子は約１００ｎｍから約１０μｍの範囲の直径を持ち、より好ましくは約１μｍから約５μｍの範囲である。
【００４４】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、注射剤あるいは経口、経腸、経膣、経皮または経眼剤として調製され得る。組成物はまた、活性成分が例えばワクチン抗原（遺伝子組換え抗原を含む）、抗原ペプチドまたは抗イディオタイプ抗体を含むものとも成り得る。追加的または代替的に活性成分は、リンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激因子、マクロファージ刺激因子、エンドトキシン、ポリヌクレチド分子（例えばワクチン抗原をコードしているもの）あるいは組換えウイルスベクター、微生物（例えば微生物の抽出物）またはウイルス（例えば不活化または弱毒化されたウイルス）でもあり得る。実際、本発明の組成物は、不活化または弱毒化されたウイルスが活性成分である場合に使用される事に特に適している。
【００４５】
本発明の組成物に含まれる事に適する好ましいワクチン抗原は、細菌、ウイルス、酵母菌、カビ、原虫および他の微生物の抗原の一部またはすべて、あるいはヒト、動物または植物由来の病原体および花粉やその他のアレルゲン、特に毒素（例えばミツバチやスズメバチの毒）およびハウスダストダニや犬猫のフケのような喘息を引き起こすアレルゲンを含む。
【００４６】
特に好まれるワクチン抗原は、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白（例えば不活化された季節性インフルエンザウイルスおよび季節性のＨ１、Ｈ３、Ｂ株またはパンデミックＨ５株の組換えＨＡ抗原）、インフルエンザ核蛋白、ロタウイルスの外層カプシド蛋白、ｇｐ１２０のごときヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）表面抗原、ヒトパピローマウイルスＥ７抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原（例えばＨＢｓ抗原）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）表面抗原、不活化日本脳炎ウイルス、（狂犬病を引き起こす）リッサウイルス表面抗原等のウイルス抗原、および赤痢菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス（例えばプロテアーゼおよびアドヘジン蛋白）、ヘリコバクター・ピロリ（例えばウレアーゼ）、リステリア・モノサイトゲネシス、結核菌（例えばＢＣＧ）、マイコバクテリア・アビウム（例えばｈｓｐ６５）、クラミジア・トラコマチス、カンジダ・アルビカンス（例えば外膜蛋白）、肺炎球菌、髄膜炎菌（例えばクラス１外膜蛋白）、炭疽菌（炭疽の原因菌）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｑ熱の原因菌であるが自己免疫型糖尿病（即ち１型糖尿病）に対し長期にわたる防御反応を誘導できる）等の微生物由来の抗原およびマラリアを引き起こす原虫（特にプラスモディウム・ファルシパラムおよびプラスモディウム・バイバックス）である。
【００４７】
他に特に好まれる抗原は、癌抗原（即ち一つあるいはそれ以上の癌に付随する抗原）例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン−１（ＭＵＣ−１）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ｐ５３およびｒａｓの異常産物およびメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）である。
【００４８】
本発明の組成物がワクチン抗原である場合、その組成物は好ましくは抗原結合担体材料を含むものである。抗原結合担体材料は、例えばマグネシウム、カルシウム、またはアルミニウムのリン酸塩、硫酸塩、水酸化物（例えば水酸化アルミニウムおよび／または硫酸アルミニウム）の様な金属塩または沈殿物のうち一つまたはそれ以上、および／または蛋白質、脂質、硫酸化またはリン酸化多糖（例えばヘパリン、デキストラン、もしくはセルロース誘導体）を含む有機酸およびキチン（ポリＮ−アセチルグルコサミン）もしくはそれらの脱アセチル化誘導体、または塩基性セルロース誘導体のような有機塩基、および／または他の抗原のうち一つまたはそれ以上である。抗原結合担体材料は、溶解性の乏しい任意の材料（水酸化アルミニウム（アラム）ゲルまたはその水和塩複合体）の粒子でもよい。典型的には、抗原結合担体材料は凝集する傾向は無く、または凝集を避けるように処理される。最も好ましくは、抗原結合担体材料は、水酸化アルミニウム（アラム）ゲル、リン酸アルミニウムゲルまたはリン酸カルシウムゲルである。
【００４９】
抗原結合担体材料が存在する場合、例えばｅＩＮと共に結晶化するなどしてｅＩＮの内部に存在する事が好ましい。粒子状のイヌリンと金属塩の様な抗原結合担体材料の共結晶は、以下の方法で組成される：
（ａ）ｅＩＮ粒子の懸濁液を加熱する事によりイヌリン溶液またはイヌリン部分溶液を用意する
（ｂ）当該溶液に一つまたはそれ以上の金属のリン酸化合物を加える
（ｃ）当該溶液からイヌリンを再結晶化する
（ｄ）再結晶化したイヌリンをｅＩＮに再び変換する
（ｅ）ｅＩＮと一つまたはそれ以上の金属のリン酸化合物が共結晶したものを分離する
【００５０】
ステップ（ａ）のイヌリン溶液またはイヌリン部分溶液は、５５℃で約３０分あるいはｅＩＮ粒子の一部が溶解し完全には溶解しない時間加熱する事により調整される。ステップ（ｃ）のイヌリンの再結晶化は、約４℃にする事により調整される。ステップ（ｄ）の再結晶化したイヌリンのｅＩＮへの再変換は、それぞれ約３７℃、４５℃、＞４８℃と段階的に温度を変化させる事により調整される。ステップ（ｅ）のｅＩＮの共結晶の分離は、例えば遠心分離し残存するイヌリン溶液を洗い除く事により調整される。
【００５１】
金属塩の様な抗原結合担体材料とｅＩＮを組み合わせた粒子の直径は、約１００ｎｍから約１０μｍの範囲であり、より好ましくは約１μｍから約５μｍの範囲である。抗原結合担体材料とｅＩＮを組み合わせた粒子のイヌリンと抗原結合担体材料の比率（重量比）は、１：２０から２００：１の範囲であり得る。
【００５２】
更に本発明の組成物は、リンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激因子、マクロファージ刺激因子あるいはエンドトキシンの様な免疫調節剤の一つあるいはそれ以上を含むものでもあり得る。
【００５３】
第３の局面においては、本発明は第１あるいは第２の態様に基づく組成物の有効量を投与することによる、例えば感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした免疫応答を刺激するための方法を提供する。
【００５４】
関連する第４の局面においては、本発明は第１あるいは第２の態様に基づく組成物の有効量を投与することによる、例えば感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした免疫応答を促進するための方法を提供する。
【００５５】
本明細書において用いられるとき、「有効量」という用語は、所望の効果を提供するために、非毒性であるが十分な量の試料／免疫学的組成物を含むという意味である。必要とされる正確な量は、治療される種、被験者の年齢および一般的状態、治療される状態の重症度、投与される特定の試料／免疫学的組成物および投与の形態などの要因に依存して、被験者ごとで異なるであろう。従って、正確な「有効量」を明記する事は不可能である。しかしながら当業者は、任意の症例に対し適切な「有効量」を日常的に決定する事ができる。
【００５６】
第３および第４の局面の方法によれば、単核免疫細胞（例えば単核球、マクロファージおよび樹状細胞）の機能および／またはヒトやヒト以外の動物の補体系を活性化または調節する事により、例えば細菌、マイコプラズマ、カビ、ウイルス、原虫またはその他の微生物による感染あるいは、蠕虫や寄生虫の感染、あるいはこのような感染に伴う免疫病理の治療または予防、アレルギーやリュウマチの様な免疫疾患の治療、免疫システムの異常に関連する自己免疫病、免疫不全病または神経学的、皮膚学的、腎、呼吸器または消化器系疾患あるいは腫瘍や癌の治療または予防のため、免疫反応を刺激／促進する事ができる。本発明はさらに、第１あるいは第２の態様に基づく組成物の有効量を投与することによる、癌の治療および予防にも及ぶことを理解されるべきである。
【００５７】
第５の局面においては、本発明はガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）および／またはデルタ・イヌリン
提供する。
【００５８】
このｅＩＮの調整方法は、基本的にｄＩＮの懸濁液からの＞５５℃という最適変換温度に基づくものである。このことは、ａＩＮからｇＩＮへの最適変換温度（すなわち４４−４５℃）およびｇＩＮからｄＩＮへの最適変換温度（すなわち５３−５５℃）と異なる。
好ましくは、第５の局面は以下のステップによる：
それ以上加熱する。
（ｂ）その後懸濁液を約６０から約７６℃の範囲で５時間以内加熱し、ｅＩＮを形成させ更に随意で、
（ｃ）形成されたｅＩＮの少なくとも一部分を分離する。
【００５９】
ステップ（ａ）において、懸濁液を好ましくは約１．５時間から１０時間、更に好ましくは約３時間加熱する。ステップ（ｂ）において、懸濁液を好ましくは約０．５時間から５時間、更に好ましくは約３時間加熱する。ステップ（ｃ）において、ｅＩＮ粒子の分離には、例えば懸濁液を遠心分離するか、もしくはタンジェンシャル・フローろ過のような分離過程を用いる。
【００６０】
エプシロン・イヌリンはまた、様々な分子量のイヌリン分子が混合した溶液から直接調整することも可能である。
【００６１】
この場合第５の局面の変法として本発明の第６の局面は、１０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度のイヌリン溶液を約５０℃から約８５℃の範囲の温度で、最低１５分から２週間もしくはそれ以上維持する方法により、希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移
【００６２】
本発明者等は、ｅＩＮの形成がａＩＮ、ｂＩＮ、ｇＩＮまたはｄＩＮより高い平均重合度（ＤＰ）を持つイヌリン分子を選択する事であることも発見した。このように、ｅＩＮを調整する工程は、様々なＤＰを持つイヌリンの混合物（植物由来のイヌリンの典型）から簡便に、高いＤＰ（即ちフルクトースの重合度３０以上、好ましくはフルクトースの重合度３５以上）を持つｅＩＮと可溶性または低い重合度の非ｅＩＮを分画する方法を提供する。ｅＩＮは、妥当な温度で再溶解し再結晶化すると高収率でｇＩＮおよびｄＩＮを産生するので、この方法（即ち高ＤＰイヌリンを効率的に分画するような方法）で調整されたｅＩＮの一つの使用法は、高収率でｇＩＮおよびｄＩＮを産生する方法である。ｅＩＮを出発材料とすることにより、本発明者らは以前示されたｇＩＮおよびｄＩＮ形成にそれぞれの最適な温度より低い温度で、可溶化された濃度の高いｅＩＮからｇＩＮおよびｄＩＮが最適に再結晶化できることを示した。
【００６３】
従って本発明の更なる局面は、様々な分子量のイヌリン混合物の分画方法を提供する。この方法は、溶解したイヌリンと希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点
あり、高分子量のイヌリン画分を得た後のイヌリン溶液からエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を得、さらに低分子量のイヌリン画分を得る方法を提供する。
【００６４】
あるエプシロン多形形態のイヌリンが大部分を占める前駆体調製物から、十分に精製されたイヌリンであって、そのイヌリン精製物が水またはエタノールのような溶媒中のスラリーを加熱し調製された前駆体のエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を溶解し、その後アルファ・イヌリン（ａＩＮ），ベータ・イヌリン（ｂＩＮ），ガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）あるいはデルタ・イヌリン（ｄＩＮ）のうち一つあるいはそれ以上のイヌリンを沈殿させることにより調製したものを提供する。
【００６５】
本発明の更なる局面は、エプシロン多形形態のイヌリン懸濁液中のイヌリンの存在や濃度を測定する方法であって、その方法が希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点を測定する方法を提供する。
【００６６】
本発明の更なる局面は、放射線や化学療法による免疫抑制を治療または予防する方法であって、その方法が第１または第２態様に基づく組成物の有効量を投与する方法を提供する。
【００６７】
以下、本発明の範囲を限定するものとは決して解釈されるべきではない実施例と付随する図により本発明を説明する。
【実施例】
【実施例１】
【００６８】
−エプシロン・イヌリンの同定
材料と方法
ガラスの試験管に７ｍｌの１１２ｍｇ／ｍｌの濃度のｄＩＮ懸濁液を入れウォーターバスで段階的に図１中の■で示した温度に加熱した（徐々に加熱とは１分間に約１℃上昇させることであり、図中に示した温度でそれぞれ５分間平衡化した）。平衡化後０．５ｍｌのサンプルを採取後ただちに遠心分離し、上精中の濃度を決定した。急速加熱では、ガラスの試験管に入れた２０℃の１．０ｍｌのｄＩＮ水溶液を、いくつかの温度のウォーターバスに５分間浸し（急速に加熱）、同様に測定した。
【００６９】
結果
急速に加熱した場合、上精中の濃度は７０−７２℃まで直線的に上昇し、イヌリンは完全に溶解し溶液は無色となった。
【００７０】
徐々に加熱した場合、ｄＩＮは約６５℃まで急速に加熱した場合と同様に溶解した（図１）。驚いたことに６５−７０℃ではペースト状の沈殿が生じ７５℃まで溶解せず、高温では溶解度の直線からかい離した（図１）。この結果は、懸濁液を６５℃以上まで徐々に加熱すると新たなイヌリンの形態を生じることを予期せず示した。この沈殿はエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）と命名された。その後の研究によりｅＩＮがイヌリンの新規の多形形態でありユニークな特性により他の形態と容易に区別できることが確認された。
【００７１】
外観は、ｇＩＮとｄＩＮが乳白色で自然沈降性があるのに対し、最初にｄＩＮを加熱して得たｅＩＮは灰色がかったペースト状で粘度のあるものであった。このようなｅＩＮの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察によるとｅＩＮ粒子は前駆体であるｇＩＮやｄＩＮ粒子と同様の大きさであるがより低密度であり、ｇＩＮやｄＩＮからイヌリンの一部が除かれたか濾されたことを示唆した。しかしながら、ｅＩＮを溶解し（図９および１２に示すように）再結晶化すると粒子の懸濁液は、他の多形形態のイヌリンと同様のミルク様の外観を示した。
【実施例２】
【００７２】
−ｅＩＮの測定
イヌリンのアルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ多形形態は、それぞれの希薄懸濁液（０５ｍｇ／ｍｌ以下）の濁度変化のより測定される温度依存性溶解度に基づき容易に同定および測定可能である。このような希薄懸濁液を段階的に加熱してゆくと、濁度（７００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ７００））は一定の間安定しているが臨界温度で突然低下し、このことはバッチ間で再現性があり、精製された各多形形態それぞれに特徴的である。従って５０％ＯＤ７００熱転移点は、各多形形態を特徴づけるパラメーターとなる。本実施例ではｅＩＮの５０％ＯＤ７００熱転移点を測定した。
【００７３】
材料と方法
１種類のｄＩＮと３種類のｅＩＮサンプルについて以下の通り測定した。各サンプルを５ｍｌのＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。ガラスの試験管に入れた希釈されたサンプルを一緒に２２℃から段階的にウォーターバスで加熱（あらかじめ決めた温度に設定し５−１０分かけて平衡化した）し、各サンプルのＯＤ７００を測定した。その後試験管をウォーターバス戻し次に高い温度に移した。
【００７４】
結果
ｅＩＮの場合、５０％ＯＤ７００熱転移点は５９−６８℃であった（図２）。このことによりｅＩＮはｇＩＮ（５０％ＯＤ７００熱転移点４７−４８℃、図３および４）、ｄＩＮ（５０％ＯＤ７００熱転移点５３−５８℃、図４）あるいは様々なアルファおよびベータ・イヌリン（５０％ＯＤ７００熱転移点１０−４０℃、図３）と識別できる。図２−４は、ｄＩＮとｅＩＮの希薄懸濁液の溶解度が明らかに異なる温度は５８−６０℃であり、この温度でｄＩＮは溶解しｅＩＮは不溶性のままである（図１３も参照されたい）。この様に５９℃に加温して不溶性のイヌリン（すなわちｅＩＮ）と溶解したイヌリン（すなわち非ｅＩＮ）のパーセンテージを測定することにより、未知の希薄懸濁液中のｅＩＮの含量を推定することが可能である。
【実施例３】
【００７５】
−ｅＩＮの調製
材料と方法
１．エプシロン・イヌリンは濃縮されたｄＩＮ懸濁液を適温で加熱することにより調製可能である。図５はｄＩＮからｅＩＮを調製するための最適温度（６０−６８℃）そしてａＩＮからｇＩＮを調製するための最適温度（４４−４５℃）およびｇＩＮからｄＩＮを調製するための最適温度（５３−５５℃）を示した図である。
【００７６】
図５に示された最適温度は、１ｍｌの各イヌリン調製物（約１００ｍｇ／ｍｌ）を様々な温度で２０分間加熱し、０．１ｍｌのサンプルをガラス試験管内で５ｍｌのＰＢＳで希釈した。これらの試料をウォーターバスで１０分間それぞれ４０℃（ｇＩＮ）、４９℃（ｄＩＮ）、または６０℃（ｅＩＮ）で加熱後ＯＤ７００を測定した（値は得られた最高のＯＤ値に対するパーセンテージで表した）。
【００７７】
２．ｅＩＮはまた、好ましい重合度を持つイヌリン粉末（例えばダリアやチコリの根から抽出されたイヌリン）を８０℃に加熱し完全に水に高濃度で溶解したものを５０−８５℃、より好ましくは、５０−６５℃に最低１５分から２時間あるいはそれ以上の間維持することによっても調製できる。この時ｅＩＮは溶液から白色の沈殿として生じる。
【００７８】
結果
図６は、本実施例の前半に記載した方法によるｅＩＮへの転換率を示す。図は特に、６６℃におけるｄＩＮからｅＩＮへの転換率を示す。転換は最適温度では１０−１５分で５０％完了し、８０−９０分後には大部分が転換した。図７はｇＩＮとｄＩＮが最適温度でほぼ同様な転換率を持つことを示す。各多形形態の収量は、各々の多形形態が由来するものの６５−８０％であり（図８）、この事は転換過程が原料中に存在する分子集団中の微量な成分を選択しているのではなく、むしろ全分子集団中の主要な成分をより熱安定的な型に再編成している事を示す。図９および１０は、ある温度に保たれたイヌリン溶液から再結晶化された特定のイヌリン多形形態が、温度依存的であり、各多形形態の収量は、熱変換で見られたもの（図８）と同様のパターンであることを示す。この様にｅＩＮは、５０℃以上の温度で沈殿し易い。
【実施例４】
【００７９】
−ｅＩＮの可逆性
既知の４つの多形形態のイヌリンは、高温の水で再溶解し、より低い温度で再結晶化することで、各多形形態が由来する以前の多形形態に変換でき、更に適当な温度処理によりベータ型→アルファ型→ガンマ型→デルタ型と変換できる。この事は図１１に示されており、ここではｄＩＮを８０℃で溶解した後、５℃または３７℃で再結晶化し典型的なａＩＮとｇＩＮ温度溶解度曲線を得た。さらにｇＩＮを５６℃に保持する事により典型的なｄＩＮ温度溶解度曲線を得た。本実施例ではｅＩＮ再変換能について検討した。
【００８０】
材料と方法
エプシロン・イヌリンを８０℃で溶解し、より低い温度で再結晶化し徐々に高温で処理を行った。
【００８１】
図１２に示すように、この過程でａＩＮ、ｇＩＮ、ｄＩＮそして最後にｅＩＮが再び得られた。このように、ｅＩＮもまた再溶解と再結晶が可能である事が示された。しかしながらこの実験で、ｅＩＮ溶液から５℃で再結晶化したものは典型的なａＩＮの特徴を持つが、３７℃で再結晶化したものはｇＩＮよりｄＩＮに近い熱転移点を示した。この様にｅＩＮの形成は可逆的であるが、粗製イヌリンが使われた場合、ｅＩＮを可溶化後再結晶化する際、通常の至適形成温度より低い温度でイヌリンの多形形態が形成される傾向がある。この事は、各イヌリン多形形態の至適形成温度は、必ずしも一定ではなく、製造に使用されるイヌリンのＤＰにより変化することを示す。従って本実施例で使用したもの（平均ＤＰが２７）より高いＤＰの原料が使用される場合、ｇＩＮおよびｄＩＮは漸次より低い温度で形成されるであろう。よって、ｅＩＮの一つの使用法は、イヌリンの分画を得ることであり、より簡便に高収率でｇＩＮおよびｄＩＮを得るのに用いることができる。
【実施例５】
【００８２】
−ｅＩＮの識別特性
既知の４つの多形形態のイヌリンは、各々の希薄懸濁液の濁度により熱転移点を測定することで識別でき、この事は上述の通りｅＩＮにもあてはまる。さらに、熱変換または直接結晶化する場合、形成温度でｅＩＮを他の多形形態から識別できることもすでに示した。しかしながら、濁度の変化は様々な多形形態の特徴や特性の中の一つに過ぎない。本実施例では、ｅＩＮを他の多形形態のイヌリンから識別する他の物理的パラメーターを検討した。
【００８３】
材料と方法
１．イヌリンの水に対する溶解度
ｄＩＮとｅＩＮの溶解度は、様々な温度で平衡化しながら比較した。水に懸濁したｄＩＮ（１１２ｍｇ／ｍｌ）とｅＩＮ（４５−７４ｍｇ／ｍｌ）のサンプル（０．５ｍｌ）を１．５ｍｌのエッペンドルフ・チューブに入れそれぞれの測定温度のウォーターバスに１５分間完全に沈めた後、ただちに遠心分離し上精の屈折度を測定した。
【００８４】
２．イヌリンのジメチルスルホキシドに対する溶解度
５０μｌの精製されたｇＩＮ，ｄＩＮおよびｅＩＮ（ＰＢＳ中で５０ｍｇ／ｍｌ）サンプルと４５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液を混合し同一の最終濃度となるようにした。水とＤＭＳＯの混合により熱を生じるのでＤＭＳＯの希釈は、アイスバス中でガラスの試験管を用いて行った。５分後試験管を２５℃のウォーターバスに１５分間置きその後氷に戻し、氷冷したＰＢＳ（４．５ｍｌ）を加え２５℃のウォーターバスに１５分間置きＯＤ７００を測定した。
【００８５】
結果
ｄＩＮとｅＩＮはそれぞれの測定温度で水に対して異なる溶解度を示したが、変化は直線的であり濃度の影響は少なかった（図１３）。直線的な部分を延長してＸ軸と交差する点すなわち溶解度０となる温度は、５０％ＯＤ７００熱転移点と近似していた。カーブはほぼ完全溶解まで続いた。７２℃（ｄＩＮ）または７５℃（ｅＩＮ）以上でそれぞれほぼ完全に溶解した。ガンマ・イヌリンもほぼ同様な挙動を示し、Ｘ軸と交差する点が４７℃で溶解点が６５℃であった（データは示していない）。この様な特徴的な溶解性もまた多形形態の識別に使え、６０−６５℃で何度か洗浄することで大きな損失無くｅＩＮを下位の多形形態のものから選択可能である。
【００８６】
水溶性の溶媒であるＤＭＳＯは、水系中で電媒常数を上昇させることが知られており、このことで水素結合を大いに弱める。イヌリンの水懸濁液は、０℃に至るまでＤＭＳＯに完全に溶解性であり、その後もし水で希釈しても溶解したままであるがエタノールで再沈殿することができる。細かなＤＭＳＯ濃度の差で溶解度を比較すると（図１４）、ｇＩＮ，ｄＩＮおよびｅＩＮは、それぞれ溶解が始まる時に異なる臨界ＤＭＳＯ濃度を示した。特にｇＩＮは最も容易にＤＭＳＯに溶解し、ｅＩＮは最も難溶であり、水素結合の強さは、ベータ→アルファ→ガンマ→デルタ→エプシロンの順に強いことを示唆した。
【実施例６】
【００８７】
−ｅＩＮの用法
既知の四つの多形形態の内の二つ、すなわちｇＩＮとｄＩＮは免疫学的に活性であり特に同時に投与された抗原に特異的な抗体を誘導する（つまりアジュバント効果がある）ことが解った。本実施例では、ｅＩＮもまた同様な免疫学的活性を持つか否か検討した。
【００８８】
材料と方法
ｅＩＮにアジュバント活性があるか調べるために、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ抗原）単独あるいはｅＩＮまたはｄＩＮと共に免疫した。
【００８９】
結果
実験結果は図１５に示す。ｅＩＮをＨＢｓ抗原に添加すると抗ＨＢｓ抗体の産生を有意に促進し、抗体価の幾何平均値および最小防御抗体価を１０ｍＩＵ／ｍｌとした場合の抗体陽転率の両者ともに上昇する事が判明した。同じ量を使用した場合ｅＩＮはｄＩＮより効果がある事も判明した。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）およびｅＩＮを含む組成物は、ワクチンのアジュバントとしてあるいは免疫を刺激または促進する用途にも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１はｄＩＮ懸濁液を徐々に加熱した場合（■）と急速に加熱した場合（○）のｅＩＮ生成率を示した図である。
【図２】図２はｄＩＮとｅＩＮの熱転移吸光度を比較した図である。ガラス管に入った５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁されたそれぞれのサンプル（０．５ｍｇ／ｍｌ）をウォーターバスで加熱した。それぞれのＯＤ７００（７００ｎｍにおける吸光度）値は各温度で平衡化した後測定した。
【図３】図３はａＩＮ，ｂＩＮおよびｇＩＮの熱転移吸光度を示した図である。ガラス管に入った５ｍｌのそれぞれのサンプル（０．５ｍｇ／ｍｌ）をウォーターバスで加熱した。それぞれのＯＤ７００値は各温度で平衡化した後測定した。記号：＋，４種類のｇＩＮバッチ；△，▲，□，ａＩＮｓ；○，ｂＩＮ（Ｃｏｏｅｒ，ＰＤ ａｎｄ ＥＪ Ｓｔｅｅｌｅ，１９９１より引用）。
【図４】図４は２種類のｄＩＮバッチと同じ材料から調製したｇＩＮの熱転移吸光度を示した図である。それぞれのＯＤ７００値は各温度で平衡化した後測定した（ＷＯ２００６／０２４１００より引用）。
【図５】図５はａＩＮ，ｇＩＮまたはｄＩＮからそれぞれｇＩＮ，ｄＩＮおよびｅＩＮを調製するための最適温度を示した図である。値はＯＤ７００の最高値に対するパーセンテージで表している。
【図６】図６は６６℃という最適温度におけるｄＩＮからｅＩＮへの転換率を示した図である。ｄＩＮ懸濁液（５ｍｌ，５０ｍｇ／ｍｌ）をウォーターバスで６６℃に加熱後一定間隔でサンプルを採取し５ｍｌのＰＢＳに０．５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。すべてのサンプルはその後ｅＩＮのアッセイのため６０℃で１０分間加熱した。
【図７】図７はａＩＮまたはｇＩＮからそれぞれｇＩＮおよびｄＩＮへの転換率をそれぞれの最適温度（４５℃および５５℃）で示した図である。ａＩＮまたはｇＩＮ懸濁液（５ｍｌ，５０ｍｇ／ｍｌ）をウォーターバスで４５℃または５５℃に加熱後一定間隔でサンプルを採取し５ｍｌのＰＢＳに０．５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。すべてのサンプルはその後ｇＩＮおよびｄＩＮのアッセイのため３７℃または５０℃で１０分間加熱した。
【図８】図８は無精製イヌリンから得られるａＩＮ，ｄＩＮ，ｇＩＮおよびｅＩＮの典型的な収量を示した棒グラフである。粗イヌリンを１３０ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解し５℃で１週間以上ａＩＮを結晶化させ、その後ｇＩＮ（４５℃），ｄＩＮ（５５℃）そしてｅＩＮ（６６℃）を得た。各段階の上精の屈折率を不溶性画分を評価するために測定した。「水溶性」イヌリンは、最初の結晶化段階でａＩＮとならなかったものの量である。
【図９】図９は様々な温度でイヌリン溶液をインキュベートした場合の様々な多形形態の粒子状イヌリンの収量を示したものである。イオン交換および滅菌フィルターを通過させた粗イヌリン溶液を１００ｍｇ／ｍｌに調整し、示された温度のウォーターバスまたは部屋に３週間置いた。７日毎に上精の屈折率を測定し、沈殿したイヌリンのパーセンテージを計算した。
【図１０】図１０は各懸濁液の３週間目の熱転移吸光度を示す。氷上に置かれた５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に希釈（０．５ｍｇ／ｍｌ）された、各未分画懸濁液を含むガラスの試験管を一緒にウォーターバスで加熱した。それぞれの温度で平衡化した後、各サンプルのＯＤ７００を測定し、０℃におけるＯＤ７００値のパーセンテージで表した。
【図１１】図１１はｄＩＮの可逆性を示した図である。３種類のイヌリンサンプル（ｄＩＮを溶解後それぞれ５℃または３７℃で結晶化もしくは３７℃の後５６℃に加温した）をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、図に示した温度にウォーターバスで段階的に加熱し平衡化した後吸光度を測定した（ＷＯ２００６／０２４１００より引用）。
【図１２】図１２はｅＩＮの可逆性を示した図である。ｅＩＮサンプルを８０℃で溶解後５℃，３７℃または５０℃で結晶化した。５０℃サンプルの半量は６６℃で２時間加熱し再びｅＩＮに変換した。
【図１３】図１３はｄＩＮとｅＩＮの溶解度を示した図である。０．５ｍｌのｄＩＮ（１１２ｍｇ／ｍｌ）およびｅＩＮ（４５−７４ｍｇ／ｍｌ）サンプルを１．５ｍｌのエッペンドルフ チューブに入れ、１５分間ウォーターバスに完全に沈めた後素早く遠心分離し上精の屈折率を測定した。
【図１４】図１４は３種類の多形形態のイヌリンのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に対する溶解度を示した図である。５０μｌの精製されたｇＩＮ，ｄＩＮおよびｅＩＮ（ＰＢＳ中で５０ｍｇ／ｍｌ）サンプルと４５０μｌのＤＭＳＯを混合した。
【図１５】図１５はｄＩＮより優れたｅＩＮのアジュバント能を示した棒グラフである。１群１０匹の３５日齢のＢａｌｂ／ｃマウスに０．２ｍｇのｄＩＮまたはｅＩＮをアジュバントとして添加した０．５μｇのＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を一回筋注した。３週間後マウスから採血し抗ＨＢｓ抗体価をＡＵＳＡＢ▲Ｒ▼アッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）で測定した。（Ａ）ｅＩＮをアジュバントとして添加したＨＢｓＡｇを接種したマウスは統計学的に有意（ｐ＜０．０５）に高い抗体価を得た。（Ｂ）ｅＩＮをアジュバントとして添加したＨＢｓＡｇを接種したすべてのマウスがＢ型肝炎ウイルスに対する、１０ｍＩＵ／ｍｌの抗体価を陽性のカットオフ値とした感染防御抗体価を得たが、ｄＩＮをアジュバントとして添加したＨＢｓＡｇを接種した群では６０％のマウスのみが感染防御抗体価を得た（ｐ＜０．０５、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）。
【符号の説明】
【００９１】
［図１］（■）：徐々に加熱した場合、（○）急速に加熱した場合。
［図２］（●）：ｄＩＮロットＰＣＳＰ５．３、（□）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ２．２、（△）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ３．２、（×）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ４．２。
［図３］（＋）：４種類のｇＩＮロット、（△，▲，□）：ａＩＮｓ、（○）：ｂＩＮ。
［図４］（■）：ｇＩＮロット３、（□）：ｄＩＮロット３、（▲）：ｇＩＮロット４、（△）：ｄＩＮロット４。
［図５］（●）：アルファからガンマ、（■）：ガンマからデルタ、（□）：デルタからエプシロン。
［図７］（●）：ｇＩＮからｄＩＮ、（○）：ａＩＮからｇＩＮ。
［図９］（▲）：５℃で結晶化、（△）：２２℃で結晶化、（■）：３７℃で結晶化、（□）：５２℃で結晶化。
［図１０］（▲）：５℃で結晶化、（△）：２２℃で結晶化、（■）：３７℃で結晶化、（□）：５２℃で結晶化。
［図１１］（■）：５℃で結晶化、（○）：３７℃で結晶化、（△）：３７℃の後５６℃に加温。
［図１２］（◇）：５℃、（□）：３７℃、（△）：５０℃（●）：５０℃から６６℃。
［図１３］（○）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ２、（□）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ３、（△）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ４、（■）：ｄＩＮ。
［図１４］（■）：ｇＩＮ、（□）：ｄＩＮ、（△）：ｅＩＮ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌリンの新たな多形形態であるエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌリンは、直鎖状にフルクトースが側鎖なく結合し末端に１つのグルコースが結合したβ−Ｄ−（２→１）ポリフルクトフラノシルα−Ｄ−グルコース ファミリーから成る単純で不活性な多糖類である。従ってイヌリン組成物は、単純で中性の多糖から成る公知の組成であるが、分子量は多様であり１６キロダルトン（ｋＤ）以下またはそれを超える範囲に及ぶ。イヌリンは、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）の貯蔵炭水化物であり、ダリアの球根から安価に得られる。イヌリンは比較的疎水性のポリオキシエチレン様の骨格を有し、この珍しい構造に加えてイオン化されない性質が、再結晶による容易に、非常に純粋なイヌリンの調製を可能にしている。自然界ではイヌリンは重合度（ＤＰ）６０程度あるいはそれ以上のフルクトースから成り、様々な溶解度や特性等を持つ。
【０００３】
イヌリンの分子組成は周知であるが、報告されている溶解性は様々である。例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（第１３版，２００１年）では、「低温の水および有機溶媒にわずかに可溶性であり、高温には可溶性」としてイヌリンを記述しており、一方、定量的研究（Ｐｈｅｌｐｓ，ＣＦ，１９６５）によれば、水からの沈殿によって得られる第１のものと、エタノールからの沈殿によって得られる第２のものの、二つの性質が異なるイヌリンの形態が存在し、両方とも３７℃で水に実質的に可溶性であることを示唆した。また、イヌリンの懸濁液は、静止したままであると溶解性がより低くなることも公知である。水からの沈殿によって得られる形態は、αイヌリン（ａＩＮ）と称され、エタノールからの沈殿によって得られる形態は、βイヌリン（ｂＩＮ）として公知である。
【０００４】
ａＩＮもｂＩＮも室温でしだいに水に対する溶解度が減少することが観察された（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｍ．，１９８６）。この事がγイヌリン（ｇＩＮあるいはガムリン）と称される、粒子状イヌリンの第３の多形形態の発見を導き、国際特許ＷＯ８７／０２６７９号において開示されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。また、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｍ．，１９８６およびＣｏｏｐｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｔｅｅｌｅ，Ｅ．Ｊ．，１９８８）も参照されたい。
【０００５】
この第３の多形形態は、３７℃で水に実質的に不溶性であるが、濃縮された溶液（例えば５０ｍｇ／ｍｌ）において、４５℃以上の温度でのみ、αおよびβ多形形態のように可溶性である。ｇＩＮの際立った特徴は、５０％ＯＤ７００熱転移点（薄い溶液の溶解相転移）が４７±１℃というシャープな溶解点を持つことである。
【０００６】
その後、デルタ・イヌリン（ｄＩＮあるいはデルティン）と称される、粒子状イヌリンの第四の多形形態が発見された。デルタ・イヌリンは５０℃で水に不溶性であり、国際特許ＷＯ２００６／０２４１００号において開示されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。実際ｄＩＮは、濃縮された溶液（例えば５０ｍｇ／ｍｌ）において、７０−８０℃に加熱された場合にのみ可溶性である。ｄＩＮは、薄い溶液の５０％ＯＤ７００熱転移点が５３−５８℃ということで特徴づけられる。ｄＩＮは、濃縮されたｇＩＮ溶液を５５℃以上に加熱することにより簡便に調製できる。
【０００７】
これら既知の４種類のイヌリン多形形態は、２３℃で急速に溶解する形態（β２３０イヌリン）から、３７℃で８分の半減期で可溶性の形態（α３７８イヌリン）を経て、３７℃で実質的に不溶性の形態（ｇＩＮ）さらに５０℃で実質的に不溶性の形態（ｄＩＮ）という水性媒体における異なった溶解率によって特徴付けられる。後半の２つの多形形態は３７℃で不溶性であり、もしこの温度を持つ人間のような生物体に導入されてもそれぞれの粒子形態を維持できる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、これらの多形形態が１９７０年代の、イヌリンの水溶液は生理学的に不活性（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｄｅｘ，１９７９）であり抗原性も腎毒性も無い（Ｖｅｒｒｏｕｓｔ，ＰＪ ｅｔ ａｌ．，１９７４）が、にもかかわらず粒子形態のイヌリンは免疫学的に活性であり、特に補体の副経路（ＡＰＣ）の活性因子として働く（Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ａｎｄ Ｍ Ｃａｒｔｅｒ，１９８６）という観察の少なくとも一部を説明できると考えられる。
【０００８】
このようにイヌリンは、様々な溶解性やその他の特性を持つ明瞭に異なる形態を取り得る。本発明はエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）と呼ばれる新規な多形形態のイヌリンに関する。
【先行技術文献】
【０００９】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＡＵ８６／００３１１（ＷＯ８７／０２６７９）ｔｉｔｌｅｄ″Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔ″
【特許文献２】ＰＣＴ／ＡＵ８９／００３４９（ＷＯ９０／０１９４９）ｔｉｔｌｅｄ″Ｇａｍｍａ ｉｎｕｌｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ″
【特許文献３】ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００１３２８（ＷＯ２００６／０２４１００）ｔｉｔｌｅｄ″Ｎｅｗ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｆｏｒｍ ｏｆ ｉｎｕｌｉｎ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ”
【非特許文献１】Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ，ａ ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ．Ｖａｃｃｉｎｅ ９：４０８−４１５（１９９１ａ）．
【非特許文献２】Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ｅｔ ａｌ．Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ（ｇａｍｍａ ｉｎｕｌｉｎ／ａｌｕｍ ｈｙｂｒｉｄ ａｄｊｕｖａｎｔ）ｈａｓ ｇｒｅａｔｅｒ ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ ｔｈａｎ ａｌｕｍ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ２７：１３１−１３４（１９９１ｂ）．
【非特許文献３】Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ａｎｄ ＥＪ Ｓｔｅｅｌｅ．Ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇａｍｍａ ｉｎｕｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ６６：３４５−３５２（１９８８）．
【非特許文献４】Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ａｎｄ ＥＪ Ｓｔｅｅｌｅ．Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ，ａ ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｇａｍｍａ ｉｎｕｌｉｎ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｌｕｍ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ９：３５１−３５７（１９９１）．
【非特許文献５】Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ａｎｄ Ｍ Ｃａｒｔｅｒ．Ａｎｔｉ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ″ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒｍｓ″ｏｆ ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｉｎｕｌｉｎ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ２３（８）：８９５−９０１（１９８６）．
【非特許文献６】Ｐｈｅｌｐｓ，ＣＦ．Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｎｕｌｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ９５：４１−４７（１９６５）．
【非特許文献７】Ｓｔｅｐｈｅｎ，ＡＭ，ＧＯ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ ＰＡ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（ｅｄｓ）．Ｆｏｏｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＦＬ（２００６）．
【非特許文献８】Ｖｅｒｒｏｕｓｔ，ＰＪ ｅｔ ａｌ．Ｌａｃｋ ｏｆ ｎｅｐｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ６：１５７−１６９（１９７４）．
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第１の態様によると、十分に精製されたイヌリンであって、希薄懸濁液（＜０．５
れる。
【００１１】
５８℃であるエプシロン多形形態のイヌリン粒子から成る薬理学的または免疫学的組成物が提供される。
【００１２】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、注射剤あるいは経口、経腸、経膣、経皮または経眼剤として調製され得る。組成物はまた、活性成分が例えばワクチン抗原（遺伝子組換え抗原を含む）、抗原ペプチドまたは抗イディオタイプ抗体を含むものとも成り得る。さらに組成物は、リンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激因子、マクロファージ刺激因子あるいはエンドトキシンの様な免疫調節剤の一つあるいはそれ以上を含むものとも成り得る。
【００１３】
本発明の第３の態様によると、第１あるいは第２の態様に基づく組成物の有効量を投与することによる、例えば感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした免疫応答を刺激するための方法が提供される。
【００１４】
関連した本発明の第４の態様によると、第１あるいは第２の態様に基づく組成物の有効量を投与することによる、例えば感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした免疫応答を促進するための方法が提供される。
【００１５】
本発明の第５の態様によると、ガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）および／またはデルタ・イヌリン
提供される。
【００１６】
本発明の第６の態様によると、１０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度のイヌリン溶液を約５０℃から約８５℃の範囲の温度で、最低１５分から２週間もしくはそれ以上維持する
ン多形形態のイヌリンを調整する方法が提供される。
【００１７】
本発明の更なる態様によると、多形形態のイヌリン混合物の分画方法であって、溶解
ロン多形形態のイヌリンから成る懸濁液から沈殿させる方法であり、高分子量のイヌリン画分を得た後のイヌリン溶液からエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を得、さらに低分子量のイヌリン画分を得る方法が提供される。
【００１８】
本発明の更なる態様によると、希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点が
分に精製されたイヌリンであって、そのイヌリン精製物が水またはエタノールのような溶媒中のスラリーを加熱し調製された前駆体のエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を溶解し、その後アルファ・イヌリン（ａＩＮ），ベータ・イヌリン（ｂＩＮ），ガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）あるいはデルタ・イヌリン（ｄＩＮ）のうち一つあるいはそれ以上のイヌリンを沈殿させることにより調製したものが提供される。
【００１９】
本発明の更なる態様によると、エプシロン多形形態のイヌリン懸濁液中のイヌリンの存在や濃度を測定する方法であって、その方法が希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点を測定する方法が提供される。
【００２０】
本発明の更なる態様によると、放射線や化学療法による免疫抑制を治療または予防する方法であって、その方法が第１または第２態様に基づく組成物の有効量を投与する方法が提供される。
【００２１】
本明細書に記載した特徴および利点はすべて限定的ではなく、特に当業者には、添付図面、実施例および特許請求の範囲を読めば、多くの追加的な特徴および利点が明確であろう。さらに、実施例で使用した言葉は、読み易さや指示的であることを第一義としたものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものでは無い。
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、ｅＩＮと称される新規の多形形態の粒子状イヌリンの調製および使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、イヌリンを５８℃以上で１５分から２週間あるいはそれ以上加熱し、その後およそ６０℃から７６℃で５時間程度保持することにより純粋なｅＩＮと称される新規の多形形態の粒子状イヌリンを調製する事に成功し、それに基き本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、ａＩＮ，ｂＩＮ，ｇＩＮあるいはｄＩＮより長鎖のイヌリンを簡便に調製することを可能にする。
【発明を実施するための形態】
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
好ましい実施態様に関する図および記載は、例示的なものである。下記の議論より、本明細書に記載された構造や方法を代替する実施態様は、本発明の請求項の原理から外れることなく実施できることは明白に理解されるべきである。
【００２６】
いくつかの実施態様では、添付した図の様な詳細な引用がなされるであろう。可能な限り図においては文献番号のようなものが用いられると理解されるべきである。図は開示されたシステム（あるいは方法）の態様を例示する目的でのみ用いられる。以下の記載から本発明のさまざまな修正及び変更を、この発明の原理から外れることなく実施できることは、当業者には明白であろう。
【００２７】
本発明は、エプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）と命名された新規な、第５の多形形態のイヌリン粒子を同定した。ａＩＮ，ｂＩＮ，ｇＩＮおよびｄＩＮと似た特徴がｅＩＮでもまた見られるが、しかしながら識別できる特徴と効用もまた備える。
【００２８】
ることにより同定され、この事がｄＩＮとは異なり、ｅＩＮは、濃厚なイヌリンの懸濁液を
度で加熱することによりｅＩＮに変換できることを発見した。例えば、ｄＩＮの濃厚な懸濁液を急速に加熱すると７３℃以下で完全に溶解する事が見つかっている。予期せぬことに、同じ試料を６０−８０℃の間で徐々に加熱すると、７３℃では溶解しないペースト状の沈殿が生じた。調べてみたところ、この高温で生じたイヌリンの沈殿物はａＩＮ，ｂＩＮ，ｇＩＮおよびｄＩＮとは異なる特徴を持っており、希薄懸濁液の５０％ＯＤ７００熱転移点が一段高い、新規な第５のイヌリンの多形形態（エプシロン・イヌリン）の存在を示唆した。
【００２９】
この様に、本発明の第１の態様によれば、十分に精製されたイヌリンであって、希薄
リンが提供される。
【００３０】
本明細書において用いられるとき、「イヌリン」という用語は、イヌリン、β−Ｄ−［２→１］−ポリフルクトフラノシルα−Ｄ−グルコースだけでなく、例えばこの末端のグルコースを除くことが可能であるインベルターゼまたはイヌラーゼ酵素を用いて、イヌリンからの末端グルコースの酵素的除去によって得られる可能性があるβ−Ｄ−［２→１］ポリフルクトースを含む、イヌリンの誘導体も含むと理解されるべきである。この用語の範囲内に含まれる他の誘導体は、例えば公知の方法によるアルキル、アリール、またはアシル基での化学的置換によって、遊離の水酸基がエーテル化またはエステル化されたイヌリンの誘導体である。
【００３１】
本発明のエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）は、希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点が好ましくは、約５８℃から約８０℃の範囲にある。
【００３２】
本発明のｅＩＮの一つの局面では、５９℃以下では水溶媒に溶解度が低く、より好ましくは、７５℃以下で水溶媒に溶解度が低い。
【００３３】
ｅＩＮ粒子の単一分子は、約５から約５０キロダルトン（ｋＤ）の範囲の分子量を持つ。
【００３４】
ｅＩＮ粒子の単一分子の重合度（ＤＰ）は、多くの場合高い（即ちフルクトースの重合度２５以上、好ましくはフルクトースの重合度３５以上）。
【００３５】
好ましくは、ｅＩＮはジメチルスルホキシド（水素結合を中和する事が知られている溶媒）に対しａＩＮ，ｂＩＮ，ｇＩＮおよびｄＩＮのそれぞれと比較してより低い溶解度示す。
【００３６】
他の多形形態のイヌリンと同様にｅＩＮ溶解と再結晶化により可逆的に他の多形形態に変換される事がわかった。このことにより、ｅＩＮがイヌリン分子の構造内の化学的あるいは共有結合の変化というより、イヌリン分子の形態的再編成の結果によると推測される。
【００３７】
ｅＩＮは、ダリア、チコリ、アーティチョーク、玉ねぎおよびニンニクなど様々な植物から精製されたイヌリンや、シュークロース、グルコースあるいはフルクトースから合成されたイヌリンまたは当業者によく知られた方法で重合度を増したイヌリンから調整可能である。
【００３８】
本明細書において用いられるとき、「十分に精製された試料」という用語は、本質的に他の多糖体や他の外来性の生物学的原料（例えば植物由来の物質）を含まないイヌリンを意味するものと理解されるべきである。この様な試料は、外来性の生物学的原料が１０％（重量比）以下のものであり、よく知られているチコリからのイヌリンの商業的な生産に用いられる熱水抽出および精製工程（Ｓｔｅｐｈｅｎ，ＡＭ，ｅｔ ａｌ．，２００６）を含む当業者によく知られた、いかなる方法によっても調整可能である。
【００３９】
デルタ・イヌリンおよびｇＩＮは、免疫学的に活性であり、単独あるいは水酸化アルミニウムのような抗原結合担体材料と共に、特にワクチンのアジュバントとして有効であることがすでに解っている（Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ａｎｄ ＥＪ Ｓｔｅｅｌｅ，１９９１，Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ｅｔ ａｌ．，１９９１ａ，Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ ｅｔ ａｌ．，１９９１ｂ．ＷＯ９０／０１９４９およびＷＯ２００６／０２４１００）。後述の実施例６において、本発明者等は、ｅＩＮもまた免疫学的に活性である事のみで無く、ｇＩＮおよびｄＩＮをしのぐレベルの免疫活性を持ち、ｅＩＮを含むアジュバントが、今日までに研究あるいは開発されたいかなるイヌリンよりも強力である可能性を提供する。
【００４０】
更にｅＩＮは、５つのイヌリンの多形形態の中で最も熱安定的であり、この事はｅＩＮ粒子の懸濁液が他の多形形態が溶解する温度においても不溶性のままである事を意味する。この事は、８５℃まで加熱する製造工程の場合ｅＩＮが最も熱安定的に有利であることにつながる。更に、もしｅＩＮが、熱安定性が要求されるアジュバントとして用いられる場合、ｅＩＮ粒子が高い気温の中でも安定であることを意味する。
【００４１】
第２の局面においては、本発明は希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点が
成物を提供する。
【００４２】
好ましくは、本発明のｅＩＮ粒子の組成物は、５９℃以下の水溶性溶媒に溶けにくく、より好ましくは、７５℃以下で溶けにくい。
【００４３】
好ましくは、本発明のｅＩＮ粒子は約１００ｎｍから約１０μｍの範囲の直径を持ち、より好ましくは約１μｍから約５μｍの範囲である。
【００４４】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、注射剤あるいは経口、経腸、経膣、経皮または経眼剤として調製され得る。組成物はまた、活性成分が例えばワクチン抗原（遺伝子組換え抗原を含む）、抗原ペプチドまたは抗イディオタイプ抗体を含むものとも成り得る。追加的または代替的に活性成分は、リンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激因子、マクロファージ刺激因子、エンドトキシン、ポリヌクレチド分子（例えばワクチン抗原をコードしているもの）あるいは組換えウイルスベクター、微生物（例えば微生物の抽出物）またはウイルス（例えば不活化または弱毒化されたウイルス）でもあり得る。実際、本発明の組成物は、不活化または弱毒化されたウイルスが活性成分である場合に使用される事に特に適している。
【００４５】
本発明の組成物に含まれる事に適する好ましいワクチン抗原は、細菌、ウイルス、酵母菌、カビ、原虫および他の微生物の抗原の一部またはすべて、あるいはヒト、動物または植物由来の病原体および花粉やその他のアレルゲン、特に毒素（例えばミツバチやスズメバチの毒）およびハウスダストダニや犬猫のフケのような喘息を引き起こすアレルゲンを含む。
【００４６】
特に好まれるワクチン抗原は、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白（例えば不活化された季節性インフルエンザウイルスおよび季節性のＨ１、Ｈ３、Ｂ株またはパンデミックＨ５株の組換えＨＡ抗原）、インフルエンザ核蛋白、ロタウイルスの外層カプシド蛋白、ｇｐ１２０のごときヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）表面抗原、ヒトパピローマウイルスＥ７抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原（例えばＨＢｓ抗原）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）表面抗原、不活化日本脳炎ウイルス、（狂犬病を引き起こす）リッサウイルス表面抗原等のウイルス抗原、および赤痢菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス（例えばプロテアーゼおよびアドヘジン蛋白）、ヘリコバクター・ピロリ（例えばウレアーゼ）、リステリア・モノサイトゲネシス、結核菌（例えばＢＣＧ）、マイコバクテリア・アビウム（例えばｈｓｐ６５）、クラミジア・トラコマチス、カンジダ・アルビカンス（例えば外膜蛋白）、肺炎球菌、髄膜炎菌（例えばクラス１外膜蛋白）、炭疽菌（炭疽の原因菌）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｑ熱の原因菌であるが自己免疫型糖尿病（即ち１型糖尿病）に対し長期にわたる防御反応を誘導できる）等の微生物由来の抗原およびマラリアを引き起こす原虫（特にプラスモディウム・ファルシパラムおよびプラスモディウム・バイバックス）である。
【００４７】
他に特に好まれる抗原は、癌抗原（即ち一つあるいはそれ以上の癌に付随する抗原）例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン−１（ＭＵＣ−１）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ｐ５３およびｒａｓの異常産物およびメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）である。
【００４８】
本発明の組成物がワクチン抗原である場合、その組成物は好ましくは抗原結合担体材料を含むものである。抗原結合担体材料は、例えばマグネシウム、カルシウム、またはアルミニウムのリン酸塩、硫酸塩、水酸化物（例えば水酸化アルミニウムおよび／または硫酸アルミニウム）の様な金属塩または沈殿物のうち一つまたはそれ以上、および／または蛋白質、脂質、硫酸化またはリン酸化多糖（例えばヘパリン、デキストラン、もしくはセルロース誘導体）を含む有機酸およびキチン（ポリＮ−アセチルグルコサミン）もしくはそれらの脱アセチル化誘導体、または塩基性セルロース誘導体のような有機塩基、および／または他の抗原のうち一つまたはそれ以上である。抗原結合担体材料は、溶解性の乏しい任意の材料（水酸化アルミニウム（アラム）ゲルまたはその水和塩複合体）の粒子でもよい。典型的には、抗原結合担体材料は凝集する傾向は無く、または凝集を避けるように処理される。最も好ましくは、抗原結合担体材料は、水酸化アルミニウム（アラム）ゲル、リン酸アルミニウムゲルまたはリン酸カルシウムゲルである。
【００４９】
抗原結合担体材料が存在する場合、例えばｅＩＮと共に結晶化するなどしてｅＩＮの内部に存在する事が好ましい。粒子状のイヌリンと金属塩の様な抗原結合担体材料の共結晶は、以下の方法で組成される：
（ａ）ｅＩＮ粒子の懸濁液を加熱する事によりイヌリン溶液またはイヌリン部分溶液を用意する
（ｂ）当該溶液に一つまたはそれ以上の金属のリン酸化合物を加える
（ｃ）当該溶液からイヌリンを再結晶化する
（ｄ）再結晶化したイヌリンをｅＩＮに再び変換する
（ｅ）ｅＩＮと一つまたはそれ以上の金属のリン酸化合物が共結晶したものを分離する
【００５０】
ステップ（ａ）のイヌリン溶液またはイヌリン部分溶液は、５５℃で約３０分あるいはｅＩＮ粒子の一部が溶解し完全には溶解しない時間加熱する事により調整される。ステップ（ｃ）のイヌリンの再結晶化は、約４℃にする事により調整される。ステップ（ｄ）の再結晶化したイヌリンのｅＩＮへの再変換は、それぞれ約３７℃、４５℃、＞４８℃と段階的に温度を変化させる事により調整される。ステップ（ｅ）のｅＩＮの共結晶の分離は、例えば遠心分離し残存するイヌリン溶液を洗い除く事により調整される。
【００５１】
金属塩の様な抗原結合担体材料とｅＩＮを組み合わせた粒子の直径は、約１００ｎｍから約１０μｍの範囲であり、より好ましくは約１μｍから約５μｍの範囲である。抗原結合担体材料とｅＩＮを組み合わせた粒子のイヌリンと抗原結合担体材料の比率（重量比）は、１：２０から２００：１の範囲であり得る。
【００５２】
更に本発明の組成物は、リンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激因子、マクロファージ刺激因子あるいはエンドトキシンの様な免疫調節剤の一つあるいはそれ以上を含むものでもあり得る。
【００５３】
第３の局面においては、本発明は第１あるいは第２の態様に基づく組成物の有効量を投与することによる、例えば感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした免疫応答を刺激するための方法を提供する。
【００５４】
関連する第４の局面においては、本発明は第１あるいは第２の態様に基づく組成物の有効量を投与することによる、例えば感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした免疫応答を促進するための方法を提供する。
【００５５】
本明細書において用いられるとき、「有効量」という用語は、所望の効果を提供するために、非毒性であるが十分な量の試料／免疫学的組成物を含むという意味である。必要とされる正確な量は、治療される種、被験者の年齢および一般的状態、治療される状態の重症度、投与される特定の試料／免疫学的組成物および投与の形態などの要因に依存して、被験者ごとで異なるであろう。従って、正確な「有効量」を明記する事は不可能である。しかしながら当業者は、任意の症例に対し適切な「有効量」を日常的に決定する事ができる。
【００５６】
第３および第４の局面の方法によれば、単核免疫細胞（例えば単核球、マクロファージおよび樹状細胞）の機能および／またはヒトやヒト以外の動物の補体系を活性化または調節する事により、例えば細菌、マイコプラズマ、カビ、ウイルス、原虫またはその他の微生物による感染あるいは、蠕虫や寄生虫の感染、あるいはこのような感染に伴う免疫病理の治療または予防、アレルギーやリュウマチの様な免疫疾患の治療、免疫システムの異常に関連する自己免疫病、免疫不全病または神経学的、皮膚学的、腎、呼吸器または消化器系疾患あるいは腫瘍や癌の治療または予防のため、免疫反応を刺激／促進する事ができる。本発明はさらに、第１あるいは第２の態様に基づく組成物の有効量を投与することによる、癌の治療および予防にも及ぶことを理解されるべきである。
【００５７】
第５の局面においては、本発明はガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）および／またはデルタ・イヌリン
提供する。
【００５８】
このｅＩＮの調整方法は、基本的にｄＩＮの懸濁液からの＞５５℃という最適変換温度に基づくものである。このことは、ａＩＮからｇＩＮへの最適変換温度（すなわち４４−４５℃）およびｇＩＮからｄＩＮへの最適変換温度（すなわち５３−５５℃）と異なる。
好ましくは、第５の局面は以下のステップによる：
それ以上加熱する。
（ｂ）その後懸濁液を約６０から約７６℃の範囲で５時間以内加熱し、ｅＩＮを形成させ更に随意で、
（ｃ）形成されたｅＩＮの少なくとも一部分を分離する。
【００５９】
ステップ（ａ）において、懸濁液を好ましくは約１．５時間から１０時間、更に好ましくは約３時間加熱する。ステップ（ｂ）において、懸濁液を好ましくは約０．５時間から５時間、更に好ましくは約３時間加熱する。ステップ（ｃ）において、ｅＩＮ粒子の分離には、例えば懸濁液を遠心分離するか、もしくはタンジェンシャル・フローろ過のような分離過程を用いる。
【００６０】
エプシロン・イヌリンはまた、様々な分子量のイヌリン分子が混合した溶液から直接調整することも可能である。
【００６１】
この場合第５の局面の変法として本発明の第６の局面は、１０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度のイヌリン溶液を約５０℃から約８５℃の範囲の温度で、最低１５分から２週間もしくはそれ以上維持する方法により、希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移
【００６２】
本発明者等は、ｅＩＮの形成がａＩＮ、ｂＩＮ、ｇＩＮまたはｄＩＮより高い平均重合度（ＤＰ）を持つイヌリン分子を選択する事であることも発見した。このように、ｅＩＮを調整する工程は、様々なＤＰを持つイヌリンの混合物（植物由来のイヌリンの典型）から簡便に、高いＤＰ（即ちフルクトースの重合度３０以上、好ましくはフルクトースの重合度３５以上）を持つｅＩＮと可溶性または低い重合度の非ｅＩＮを分画する方法を提供する。ｅＩＮは、妥当な温度で再溶解し再結晶化すると高収率でｇＩＮおよびｄＩＮを産生するので、この方法（即ち高ＤＰイヌリンを効率的に分画するような方法）で調整されたｅＩＮの一つの使用法は、高収率でｇＩＮおよびｄＩＮを産生する方法である。ｅＩＮを出発材料とすることにより、本発明者らは以前示されたｇＩＮおよびｄＩＮ形成にそれぞれの最適な温度より低い温度で、可溶化された濃度の高いｅＩＮからｇＩＮおよびｄＩＮが最適に再結晶化できることを示した。
【００６３】
従って本発明の更なる局面は、様々な分子量のイヌリン混合物の分画方法を提供する。この方法は、溶解したイヌリンと希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点
あり、高分子量のイヌリン画分を得た後のイヌリン溶液からエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を得、さらに低分子量のイヌリン画分を得る方法を提供する。
【００６４】
あるエプシロン多形形態のイヌリンが大部分を占める前駆体調製物から、十分に精製されたイヌリンであって、そのイヌリン精製物が水またはエタノールのような溶媒中のスラリーを加熱し調製された前駆体のエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を溶解し、その後アルファ・イヌリン（ａＩＮ），ベータ・イヌリン（ｂＩＮ），ガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）あるいはデルタ・イヌリン（ｄＩＮ）のうち一つあるいはそれ以上のイヌリンを沈殿させることにより調製したものを提供する。
【００６５】
本発明の更なる局面は、エプシロン多形形態のイヌリン懸濁液中のイヌリンの存在や濃度を測定する方法であって、その方法が希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点を測定する方法を提供する。
【００６６】
本発明の更なる局面は、放射線や化学療法による免疫抑制を治療または予防する方法であって、その方法が第１または第２態様に基づく組成物の有効量を投与する方法を提供する。
【００６７】
以下、本発明の範囲を限定するものとは決して解釈されるべきではない実施例と付随する図により本発明を説明する。
【実施例】
【実施例１】
【００６８】
−エプシロン・イヌリンの同定
材料と方法
ガラスの試験管に７ｍｌの１１２ｍｇ／ｍｌの濃度のｄＩＮ懸濁液を入れウォーターバスで段階的に図１中の■で示した温度に加熱した（徐々に加熱とは１分間に約１℃上昇させることであり、図中に示した温度でそれぞれ５分間平衡化した）。平衡化後０．５ｍｌのサンプルを採取後ただちに遠心分離し、上精中の濃度を決定した。急速加熱では、ガラスの試験管に入れた２０℃の１．０ｍｌのｄＩＮ水溶液を、いくつかの温度のウォーターバスに５分間浸し（急速に加熱）、同様に測定した。
【００６９】
結果
急速に加熱した場合、上精中の濃度は７０−７２℃まで直線的に上昇し、イヌリンは完全に溶解し溶液は無色となった。
【００７０】
徐々に加熱した場合、ｄＩＮは約６５℃まで急速に加熱した場合と同様に溶解した（図１）。驚いたことに６５−７０℃ではペースト状の沈殿が生じ７５℃まで溶解せず、高温では溶解度の直線からかい離した（図１）。この結果は、懸濁液を６５℃以上まで徐々に加熱すると新たなイヌリンの形態を生じることを予期せず示した。この沈殿はエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）と命名された。その後の研究によりｅＩＮがイヌリンの新規の多形形態でありユニークな特性により他の形態と容易に区別できることが確認された。
【００７１】
外観は、ｇＩＮとｄＩＮが乳白色で自然沈降性があるのに対し、最初にｄＩＮを加熱して得たｅＩＮは灰色がかったペースト状で粘度のあるものであった。このようなｅＩＮの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察によるとｅＩＮ粒子は前駆体であるｇＩＮやｄＩＮ粒子と同様の大きさであるがより低密度であり、ｇＩＮやｄＩＮからイヌリンの一部が除かれたか濾されたことを示唆した。しかしながら、ｅＩＮを溶解し（図９および１２に示すように）再結晶化すると粒子の懸濁液は、他の多形形態のイヌリンと同様のミルク様の外観を示した。
【実施例２】
【００７２】
−ｅＩＮの測定
イヌリンのアルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ多形形態は、それぞれの希薄懸濁液（０５ｍｇ／ｍｌ以下）の濁度変化のより測定される温度依存性溶解度に基づき容易に同定および測定可能である。このような希薄懸濁液を段階的に加熱してゆくと、濁度（７００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ７００））は一定の間安定しているが臨界温度で突然低下し、このことはバッチ間で再現性があり、精製された各多形形態それぞれに特徴的である。従って５０％ＯＤ７００熱転移点は、各多形形態を特徴づけるパラメーターとなる。本実施例ではｅＩＮの５０％ＯＤ７００熱転移点を測定した。
【００７３】
材料と方法
１種類のｄＩＮと３種類のｅＩＮサンプルについて以下の通り測定した。各サンプルを５ｍｌのＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。ガラスの試験管に入れた希釈されたサンプルを一緒に２２℃から段階的にウォーターバスで加熱（あらかじめ決めた温度に設定し５−１０分かけて平衡化した）し、各サンプルのＯＤ７００を測定した。その後試験管をウォーターバス戻し次に高い温度に移した。
【００７４】
結果
ｅＩＮの場合、５０％ＯＤ７００熱転移点は５９−６８℃であった（図２）。このことによりｅＩＮはｇＩＮ（５０％ＯＤ７００熱転移点４７−４８℃、図３および４）、ｄＩＮ（５０％ＯＤ７００熱転移点５３−５８℃、図４）あるいは様々なアルファおよびベータ・イヌリン（５０％ＯＤ７００熱転移点１０−４０℃、図３）と識別できる。図２−４は、ｄＩＮとｅＩＮの希薄懸濁液の溶解度が明らかに異なる温度は５８−６０℃であり、この温度でｄＩＮは溶解しｅＩＮは不溶性のままである（図１３も参照されたい）。この様に５９℃に加温して不溶性のイヌリン（すなわちｅＩＮ）と溶解したイヌリン（すなわち非ｅＩＮ）のパーセンテージを測定することにより、未知の希薄懸濁液中のｅＩＮの含量を推定することが可能である。
【実施例３】
【００７５】
−ｅＩＮの調製
材料と方法
１．エプシロン・イヌリンは濃縮されたｄＩＮ懸濁液を適温で加熱することにより調製可能である。図５はｄＩＮからｅＩＮを調製するための最適温度（６０−６８℃）そしてａＩＮからｇＩＮを調製するための最適温度（４４−４５℃）およびｇＩＮからｄＩＮを調製するための最適温度（５３−５５℃）を示した図である。
【００７６】
図５に示された最適温度は、１ｍｌの各イヌリン調製物（約１００ｍｇ／ｍｌ）を様々な温度で２０分間加熱し、０．１ｍｌのサンプルをガラス試験管内で５ｍｌのＰＢＳで希釈した。これらの試料をウォーターバスで１０分間それぞれ４０℃（ｇＩＮ）、４９℃（ｄＩＮ）、または６０℃（ｅＩＮ）で加熱後ＯＤ７００を測定した（値は得られた最高のＯＤ値に対するパーセンテージで表した）。
【００７７】
２．ｅＩＮはまた、好ましい重合度を持つイヌリン粉末（例えばダリアやチコリの根から抽出されたイヌリン）を８０℃に加熱し完全に水に高濃度で溶解したものを５０−８５℃、より好ましくは、５０−６５℃に最低１５分から２時間あるいはそれ以上の間維持することによっても調製できる。この時ｅＩＮは溶液から白色の沈殿として生じる。
【００７８】
結果
図６は、本実施例の前半に記載した方法によるｅＩＮへの転換率を示す。図は特に、６６℃におけるｄＩＮからｅＩＮへの転換率を示す。転換は最適温度では１０−１５分で５０％完了し、８０−９０分後には大部分が転換した。図７はｇＩＮとｄＩＮが最適温度でほぼ同様な転換率を持つことを示す。各多形形態の収量は、各々の多形形態が由来するものの６５−８０％であり（図８）、この事は転換過程が原料中に存在する分子集団中の微量な成分を選択しているのではなく、むしろ全分子集団中の主要な成分をより熱安定的な型に再編成している事を示す。図９および１０は、ある温度に保たれたイヌリン溶液から再結晶化された特定のイヌリン多形形態が、温度依存的であり、各多形形態の収量は、熱変換で見られたもの（図８）と同様のパターンであることを示す。この様にｅＩＮは、５０℃以上の温度で沈殿し易い。
【実施例４】
【００７９】
−ｅＩＮの可逆性
既知の４つの多形形態のイヌリンは、高温の水で再溶解し、より低い温度で再結晶化することで、各多形形態が由来する以前の多形形態に変換でき、更に適当な温度処理によりベータ型→アルファ型→ガンマ型→デルタ型と変換できる。この事は図１１に示されており、ここではｄＩＮを８０℃で溶解した後、５℃または３７℃で再結晶化し典型的なａＩＮとｇＩＮ温度溶解度曲線を得た。さらにｇＩＮを５６℃に保持する事により典型的なｄＩＮ温度溶解度曲線を得た。本実施例ではｅＩＮ再変換能について検討した。
【００８０】
材料と方法
エプシロン・イヌリンを８０℃で溶解し、より低い温度で再結晶化し徐々に高温で処理を行った。
【００８１】
図１２に示すように、この過程でａＩＮ、ｇＩＮ、ｄＩＮそして最後にｅＩＮが再び得られた。このように、ｅＩＮもまた再溶解と再結晶が可能である事が示された。しかしながらこの実験で、ｅＩＮ溶液から５℃で再結晶化したものは典型的なａＩＮの特徴を持つが、３７℃で再結晶化したものはｇＩＮよりｄＩＮに近い熱転移点を示した。この様にｅＩＮの形成は可逆的であるが、粗製イヌリンが使われた場合、ｅＩＮを可溶化後再結晶化する際、通常の至適形成温度より低い温度でイヌリンの多形形態が形成される傾向がある。この事は、各イヌリン多形形態の至適形成温度は、必ずしも一定ではなく、製造に使用されるイヌリンのＤＰにより変化することを示す。従って本実施例で使用したもの（平均ＤＰが２７）より高いＤＰの原料が使用される場合、ｇＩＮおよびｄＩＮは漸次より低い温度で形成されるであろう。よって、ｅＩＮの一つの使用法は、イヌリンの分画を得ることであり、より簡便に高収率でｇＩＮおよびｄＩＮを得るのに用いることができる。
【実施例５】
【００８２】
−ｅＩＮの識別特性
既知の４つの多形形態のイヌリンは、各々の希薄懸濁液の濁度により熱転移点を測定することで識別でき、この事は上述の通りｅＩＮにもあてはまる。さらに、熱変換または直接結晶化する場合、形成温度でｅＩＮを他の多形形態から識別できることもすでに示した。しかしながら、濁度の変化は様々な多形形態の特徴や特性の中の一つに過ぎない。本実施例では、ｅＩＮを他の多形形態のイヌリンから識別する他の物理的パラメーターを検討した。
【００８３】
材料と方法
１．イヌリンの水に対する溶解度
ｄＩＮとｅＩＮの溶解度は、様々な温度で平衡化しながら比較した。水に懸濁したｄＩＮ（１１２ｍｇ／ｍｌ）とｅＩＮ（４５−７４ｍｇ／ｍｌ）のサンプル（０．５ｍｌ）を１．５ｍｌのエッペンドルフ・チューブに入れそれぞれの測定温度のウォーターバスに１５分間完全に沈めた後、ただちに遠心分離し上精の屈折度を測定した。
【００８４】
２．イヌリンのジメチルスルホキシドに対する溶解度
５０μｌの精製されたｇＩＮ，ｄＩＮおよびｅＩＮ（ＰＢＳ中で５０ｍｇ／ｍｌ）サンプルと４５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液を混合し同一の最終濃度となるようにした。水とＤＭＳＯの混合により熱を生じるのでＤＭＳＯの希釈は、アイスバス中でガラスの試験管を用いて行った。５分後試験管を２５℃のウォーターバスに１５分間置きその後氷に戻し、氷冷したＰＢＳ（４．５ｍｌ）を加え２５℃のウォーターバスに１５分間置きＯＤ７００を測定した。
【００８５】
結果
ｄＩＮとｅＩＮはそれぞれの測定温度で水に対して異なる溶解度を示したが、変化は直線的であり濃度の影響は少なかった（図１３）。直線的な部分を延長してＸ軸と交差する点すなわち溶解度０となる温度は、５０％ＯＤ７００熱転移点と近似していた。カーブはほぼ完全溶解まで続いた。７２℃（ｄＩＮ）または７５℃（ｅＩＮ）以上でそれぞれほぼ完全に溶解した。ガンマ・イヌリンもほぼ同様な挙動を示し、Ｘ軸と交差する点が４７℃で溶解点が６５℃であった（データは示していない）。この様な特徴的な溶解性もまた多形形態の識別に使え、６０−６５℃で何度か洗浄することで大きな損失無くｅＩＮを下位の多形形態のものから選択可能である。
【００８６】
水溶性の溶媒であるＤＭＳＯは、水系中で電媒常数を上昇させることが知られており、このことで水素結合を大いに弱める。イヌリンの水懸濁液は、０℃に至るまでＤＭＳＯに完全に溶解性であり、その後もし水で希釈しても溶解したままであるがエタノールで再沈殿することができる。細かなＤＭＳＯ濃度の差で溶解度を比較すると（図１４）、ｇＩＮ，ｄＩＮおよびｅＩＮは、それぞれ溶解が始まる時に異なる臨界ＤＭＳＯ濃度を示した。特にｇＩＮは最も容易にＤＭＳＯに溶解し、ｅＩＮは最も難溶であり、水素結合の強さは、ベータ→アルファ→ガンマ→デルタ→エプシロンの順に強いことを示唆した。
【実施例６】
【００８７】
−ｅＩＮの用法
既知の四つの多形形態の内の二つ、すなわちｇＩＮとｄＩＮは免疫学的に活性であり特に同時に投与された抗原に特異的な抗体を誘導する（つまりアジュバント効果がある）ことが解った。本実施例では、ｅＩＮもまた同様な免疫学的活性を持つか否か検討した。
【００８８】
材料と方法
ｅＩＮにアジュバント活性があるか調べるために、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ抗原）単独あるいはｅＩＮまたはｄＩＮと共に免疫した。
【００８９】
結果
実験結果は図１５に示す。ｅＩＮをＨＢｓ抗原に添加すると抗ＨＢｓ抗体の産生を有意に促進し、抗体価の幾何平均値および最小防御抗体価を１０ｍＩＵ／ｍｌとした場合の抗体陽転率の両者ともに上昇する事が判明した。同じ量を使用した場合ｅＩＮはｄＩＮより効果がある事も判明した。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）およびｅＩＮを含む組成物は、ワクチンのアジュバントとしてあるいは免疫を刺激または促進する用途にも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１はｄＩＮ懸濁液を徐々に加熱した場合（■）と急速に加熱した場合（○）のｅＩＮ生成率を示した図である。
【図２】図２はｄＩＮとｅＩＮの熱転移吸光度を比較した図である。ガラス管に入った５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁されたそれぞれのサンプル（０．５ｍｇ／ｍｌ）をウォーターバスで加熱した。それぞれのＯＤ７００（７００ｎｍにおける吸光度）値は各温度で平衡化した後測定した。
【図３】図３はａＩＮ，ｂＩＮおよびｇＩＮの熱転移吸光度を示した図である。ガラス管に入った５ｍｌのそれぞれのサンプル（０．５ｍｇ／ｍｌ）をウォーターバスで加熱した。それぞれのＯＤ７００値は各温度で平衡化した後測定した。記号：＋，４種類のｇＩＮバッチ；△，▲，□，ａＩＮｓ；○，ｂＩＮ（Ｃｏｏｅｒ，ＰＤ ａｎｄ ＥＪ Ｓｔｅｅｌｅ，１９９１より引用）。
【図４】図４は２種類のｄＩＮバッチと同じ材料から調製したｇＩＮの熱転移吸光度を示した図である。それぞれのＯＤ７００値は各温度で平衡化した後測定した（ＷＯ２００６／０２４１００より引用）。
【図５】図５はａＩＮ，ｇＩＮまたはｄＩＮからそれぞれｇＩＮ，ｄＩＮおよびｅＩＮを調製するための最適温度を示した図である。値はＯＤ７００の最高値に対するパーセンテージで表している。
【図６】図６は６６℃という最適温度におけるｄＩＮからｅＩＮへの転換率を示した図である。ｄＩＮ懸濁液（５ｍｌ，５０ｍｇ／ｍｌ）をウォーターバスで６６℃に加熱後一定間隔でサンプルを採取し５ｍｌのＰＢＳに０．５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。すべてのサンプルはその後ｅＩＮのアッセイのため６０℃で１０分間加熱した。
【図７】図７はａＩＮまたはｇＩＮからそれぞれｇＩＮおよびｄＩＮへの転換率をそれぞれの最適温度（４５℃および５５℃）で示した図である。ａＩＮまたはｇＩＮ懸濁液（５ｍｌ，５０ｍｇ／ｍｌ）をウォーターバスで４５℃または５５℃に加熱後一定間隔でサンプルを採取し５ｍｌのＰＢＳに０．５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。すべてのサンプルはその後ｇＩＮおよびｄＩＮのアッセイのため３７℃または５０℃で１０分間加熱した。
【図８】図８は無精製イヌリンから得られるａＩＮ，ｄＩＮ，ｇＩＮおよびｅＩＮの典型的な収量を示した棒グラフである。粗イヌリンを１３０ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解し５℃で１週間以上ａＩＮを結晶化させ、その後ｇＩＮ（４５℃），ｄＩＮ（５５℃）そしてｅＩＮ（６６℃）を得た。各段階の上精の屈折率を不溶性画分を評価するために測定した。「水溶性」イヌリンは、最初の結晶化段階でａＩＮとならなかったものの量である。
【図９】図９は様々な温度でイヌリン溶液をインキュベートした場合の様々な多形形態の粒子状イヌリンの収量を示したものである。イオン交換および滅菌フィルターを通過させた粗イヌリン溶液を１００ｍｇ／ｍｌに調整し、示された温度のウォーターバスまたは部屋に３週間置いた。７日毎に上精の屈折率を測定し、沈殿したイヌリンのパーセンテージを計算した。
【図１０】図１０は各懸濁液の３週間目の熱転移吸光度を示す。氷上に置かれた５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に希釈（０．５ｍｇ／ｍｌ）された、各未分画懸濁液を含むガラスの試験管を一緒にウォーターバスで加熱した。それぞれの温度で平衡化した後、各サンプルのＯＤ７００を測定し、０℃におけるＯＤ７００値のパーセンテージで表した。
【図１１】図１１はｄＩＮの可逆性を示した図である。３種類のイヌリンサンプル（ｄＩＮを溶解後それぞれ５℃または３７℃で結晶化もしくは３７℃の後５６℃に加温した）をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、図に示した温度にウォーターバスで段階的に加熱し平衡化した後吸光度を測定した（ＷＯ２００６／０２４１００より引用）。
【図１２】図１２はｅＩＮの可逆性を示した図である。ｅＩＮサンプルを８０℃で溶解後５℃，３７℃または５０℃で結晶化した。５０℃サンプルの半量は６６℃で２時間加熱し再びｅＩＮに変換した。
【図１３】図１３はｄＩＮとｅＩＮの溶解度を示した図である。０．５ｍｌのｄＩＮ（１１２ｍｇ／ｍｌ）およびｅＩＮ（４５−７４ｍｇ／ｍｌ）サンプルを１．５ｍｌのエッペンドルフ チューブに入れ、１５分間ウォーターバスに完全に沈めた後素早く遠心分離し上精の屈折率を測定した。
【図１４】図１４は３種類の多形形態のイヌリンのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に対する溶解度を示した図である。５０μｌの精製されたｇＩＮ，ｄＩＮおよびｅＩＮ（ＰＢＳ中で５０ｍｇ／ｍｌ）サンプルと４５０μｌのＤＭＳＯを混合した。
【図１５】図１５はｄＩＮより優れたｅＩＮのアジュバント能を示した棒グラフである。１群１０匹の３５日齢のＢａｌｂ／ｃマウスに０．２ｍｇのｄＩＮまたはｅＩＮをアジュバントとして添加した０．５μｇのＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を一回筋注した。３週間後マウスから採血し抗ＨＢｓ抗体価をＡＵＳＡＢ▲Ｒ▼アッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）で測定した。（Ａ）ｅＩＮをアジュバントとして添加したＨＢｓＡｇを接種したマウスは統計学的に有意（ｐ＜０．０５）に高い抗体価を得た。（Ｂ）ｅＩＮをアジュバントとして添加したＨＢｓＡｇを接種したすべてのマウスがＢ型肝炎ウイルスに対する、１０ｍＩＵ／ｍｌの抗体価を陽性のカットオフ値とした感染防御抗体価を得たが、ｄＩＮをアジュバントとして添加したＨＢｓＡｇを接種した群では６０％のマウスのみが感染防御抗体価を得た（ｐ＜０．０５、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）。
【符号の説明】
【００９１】
［図１］（■）：徐々に加熱した場合、（○）急速に加熱した場合。
［図２］（●）：ｄＩＮロットＰＣＳＰ５．３、（□）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ２．２、（△）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ３．２、（×）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ４．２。
［図３］（＋）：４種類のｇＩＮロット、（△，▲，□）：ａＩＮｓ、（○）：ｂＩＮ。
［図４］（■）：ｇＩＮロット３、（□）：ｄＩＮロット３、（▲）：ｇＩＮロット４、（△）：ｄＩＮロット４。
［図５］（●）：アルファからガンマ、（■）：ガンマからデルタ、（□）：デルタからエプシロン。
［図７］（●）：ｇＩＮからｄＩＮ、（○）：ａＩＮからｇＩＮ。
［図９］（▲）：５℃で結晶化、（△）：２２℃で結晶化、（■）：３７℃で結晶化、（□）：５２℃で結晶化。
［図１０］（▲）：５℃で結晶化、（△）：２２℃で結晶化、（■）：３７℃で結晶化、（□）：５２℃で結晶化。
［図１１］（■）：５℃で結晶化、（○）：３７℃で結晶化、（△）：３７℃の後５６℃に加温。
［図１２］（◇）：５℃、（□）：３７℃、（△）：５０℃（●）：５０℃から６６℃。
［図１３］（○）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ２、（□）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ３、（△）：ｅＩＮロットＰＣＳＰ４、（■）：ｄＩＮ。
［図１４］（■）：ｇＩＮ、（□）：ｄＩＮ、（△）：ｅＩＮ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
十分に精製されたイヌリンであって、希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点
【請求項２】
のイヌリン粒子から成る薬理学的または免疫学的組成物。
【請求項３】
ｅＩＮ粒子の直径が約１００ｎｍから約１０μｍを有する請求項２記載の組成物。
【請求項４】
抗原を結合するキャリアが水酸化アルミ（アラム）ゲル、リン酸アルミゲルおよびリン酸カルシウムルのうち少なくとも一つを含む、請求項２または３記載の組成物。
【請求項５】
活性成分がワクチン抗原、抗原ペプチドまたは抗体のうち少なくとも一つを含む、請求項２〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
免疫調節剤がリンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激因子、単核球またはマクロファージ刺激因子あるいはエンドトキシンのうち少なくとも一つを含む、請求項２〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の調製物または請求項２〜６のいずれか一項記載の組成物の有効量を投与することによる感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした、免疫応答を刺激するための方法。
【請求項８】
請求項１に記載の調製物または請求項２〜６のいずれか一項記載の組成物の有効量を投与することによる感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした、免疫応答を促進するための方法。
【請求項９】
のイヌリンを調整する方法であって、ガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）および／またはデルタ・イヌリ
【請求項１０】
のイヌリンを調整する方法であって、１０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度のイヌリン溶液を約５０℃から約８５℃の範囲の温度で、最低１５分から２週間もしくはそれ以上維持する方法。
【請求項１１】
多形形態のイヌリン混合物の分画方法であって、溶解したイヌリンと希薄懸濁液（＜０．５
懸濁液から沈殿させる方法であり、高分子量のイヌリン画分を得た後のイヌリン溶液からエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を得、さらに低分子量のイヌリン画分を得る方法。
【請求項１２】
のイヌリンが大部分を占める前駆体調製物から十分に精製されたイヌリンであって、そのイヌリン精製物が水またはエタノールのような溶媒中のスラリーを加熱し調製された前駆体のエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を溶解し、その後アルファ・イヌリン（ａＩＮ）、ベータ・イヌリン（ｂＩＮ）、ガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）あるいはデルタ・イヌリン（ｄＩＮ）のうち少なくとも一つのイヌリンを沈殿させることにより調製されたもの。
【請求項１３】
エプシロン多形形態のイヌリン懸濁液中のイヌリンの存在や濃度を測定する方法であって、その方法が希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点を測定する方法。
【請求項１４】
放射線や化学療法による免疫抑制を治療または予防する方法であって、その方法が請求項１に記載の調製物または請求項２〜６のいずれか一項記載の組成物の有効量を投与する方法。
【請求項１】
十分に精製されたイヌリンであって、希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点
【請求項２】
のイヌリン粒子から成る薬理学的または免疫学的組成物。
【請求項３】
ｅＩＮ粒子の直径が約１００ｎｍから約１０μｍを有する請求項２記載の組成物。
【請求項４】
抗原を結合するキャリアが水酸化アルミ（アラム）ゲル、リン酸アルミゲルおよびリン酸カルシウムルのうち少なくとも一つを含む、請求項２または３記載の組成物。
【請求項５】
活性成分がワクチン抗原、抗原ペプチドまたは抗体のうち少なくとも一つを含む、請求項２〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
免疫調節剤がリンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激因子、単核球またはマクロファージ刺激因子あるいはエンドトキシンのうち少なくとも一つを含む、請求項２〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の調製物または請求項２〜６のいずれか一項記載の組成物の有効量を投与することによる感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした、免疫応答を刺激するための方法。
【請求項８】
請求項１に記載の調製物または請求項２〜６のいずれか一項記載の組成物の有効量を投与することによる感染症、自己免疫病、免疫不全症、悪性新生物、退行性あるいは加齢性の疾患の予防や治療を目的とした、免疫応答を促進するための方法。
【請求項９】
のイヌリンを調整する方法であって、ガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）および／またはデルタ・イヌリ
【請求項１０】
のイヌリンを調整する方法であって、１０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度のイヌリン溶液を約５０℃から約８５℃の範囲の温度で、最低１５分から２週間もしくはそれ以上維持する方法。
【請求項１１】
多形形態のイヌリン混合物の分画方法であって、溶解したイヌリンと希薄懸濁液（＜０．５
懸濁液から沈殿させる方法であり、高分子量のイヌリン画分を得た後のイヌリン溶液からエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を得、さらに低分子量のイヌリン画分を得る方法。
【請求項１２】
のイヌリンが大部分を占める前駆体調製物から十分に精製されたイヌリンであって、そのイヌリン精製物が水またはエタノールのような溶媒中のスラリーを加熱し調製された前駆体のエプシロン・イヌリン（ｅＩＮ）を溶解し、その後アルファ・イヌリン（ａＩＮ）、ベータ・イヌリン（ｂＩＮ）、ガンマ・イヌリン（ｇＩＮ）あるいはデルタ・イヌリン（ｄＩＮ）のうち少なくとも一つのイヌリンを沈殿させることにより調製されたもの。
【請求項１３】
エプシロン多形形態のイヌリン懸濁液中のイヌリンの存在や濃度を測定する方法であって、その方法が希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点を測定する方法。
【請求項１４】
放射線や化学療法による免疫抑制を治療または予防する方法であって、その方法が請求項１に記載の調製物または請求項２〜６のいずれか一項記載の組成物の有効量を投与する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５０５３０２（Ｐ２０１３−５０５３０２Ａ）
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２９０６８（Ｐ２０１２−５２９０６８）
【出願日】平成２２年９月１７日（２０１０．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１２２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３２２２９
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（５１１２４６４７４）ヴァクシン プロプライエトリー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１７日（２０１０．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１２２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３２２２９
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（５１１２４６４７４）ヴァクシン プロプライエトリー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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