インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）Ｉ突然変異体
【課題】 腎疾患のようなＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を特徴とする疾患の治療のために有用であるインシュリン様成長因子（ＩＧＦｓ）のあるアゴニストを提供する。
【解決手段】天然配列ヒト型ＩＧＦ−Ｉの位置１６，２５，又は４９のアミノ酸残基、或いは位置３及び４９のアミノ酸残基が、アラニン、グリシン、又はセリン残基で置換されたインシュリン様成長因子Ｉの突然変異体からなる。
【解決手段】天然配列ヒト型ＩＧＦ−Ｉの位置１６，２５，又は４９のアミノ酸残基、或いは位置３及び４９のアミノ酸残基が、アラニン、グリシン、又はセリン残基で置換されたインシュリン様成長因子Ｉの突然変異体からなる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、多様な疾患の治療の為のインシュリン様成長因子（ＩＧＦｓ）のあるアゴニストの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
インシュリン様成長因子I及びII（各々，ＩＧＦ−I及びＩＧＦ−II）はインビボにおいて、細胞増殖，細胞分化，細胞死の阻害，及びインシュリン様活性を含む多数の作用を媒介する（Clark 及びRobinson, Cytokine Growth Factor Rev., 7: 65-80(1996); Jones 及びClemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34(1995)）。これらの分裂促進及び代謝応答の殆どは、インシュリン受容体と密接に関連しているα２β２異種四量体であるＩＧＦ−I受容体の活性化により始まる（McInnes 及びSykes, Biopoly., 43:339-366(1998); Ullrich ら，EMBO J., 5:2503-2512(1986)）。両タンパク質は、チロシンキナーゼスーパーファミリーの一員であり、共通の細胞内シグナルカスケードを共有する（Jones 及びClemmons, 同上）。ＩＧＦ−インシュリンハイブリッド受容体は単離されているが、それらの機能は不明である。ＩＧＦ−Iとインシュリン受容体は，特定のリガンドとナノモルレベルの親和力で結合する。ＩＧＦ−Iとインシュリンは、親和力が１００−１０００倍低いにもかかわらず，各々の非同族受容体と交差反応が可能である（Jones 及びClemmons, 同上）。ＩＧＦ−I受容体の細胞外部分の一部を表す結晶構造が、最近、報告されている（Garrett 等., Nature, 394: 395-399(1998)）。
【０００３】
インシュリンとは異なり、ＩＧＦ−Iの活性と半減期は、６個のＩＧＦ−I結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１−６）と恐らくは付加的により遠縁の部類のタンパク質によって調節されている（Jones 及びClemmons, 同上; Baxter ら., Endocrinology, 139: 4036(1998））。ＩＧＢＰは、それらが可溶性なのか又は細胞膜付随なのかによって、ＩＧＦ活性を阻害又は増強することが可能である（Bach 及びRechler, Diabetes Reviews, 3: 38-61(1995)）。ＩＧＦＢＰは、親和性と特異性を変化させることによってＩＧＦ−I及びＩＧＦ−IIと結合する（Jones 及びClemmons, 同上; Bach 及びRechler, 同上）。例えば、ＩＧＦＢＰ−３は同じ親和力でＩＧＦ−I及びＩＧＦ−IIと結合するのに対して、ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＢＦ−６は、それらがＩＧＦ−Iに結合する場合よりも非常に高い親和力でＩＧＦ−IIと結合する（Bach 及びRechler,同上; Ohら., Endocrinology, 132, 1337-1344(1993)）。
【０００４】
古典的なＩＧＦＢＰは、分子量が２２−３１kDaで、合計１６−２０のシステインをアミノ及びカルボキシ末端の保存ドメインに有している（Bach 及びRechler, 同上; Clemmons, Cytokines Growth Factor Rev., 8: 45-62(1997); Martin 及びBaxter, Curr. Op. Endocrinol. Diab., 16- 21(1994)）。両システイン高含有領域を接続する中央部のドメインは、単に弱く保存されており、ＩＧＦＢＰに特異的なプロテアーゼの切断部位を有している。（Cherauesk 等., J. Biol. Chem., 270: 11377-11382(1995); Clemmons 等., ; Conover, Prog. Growth Factor Res., 6: 301-309(1995)）。ＩＧＢＦＰのさらなる制御は、リン酸化及びグリコシル化によって成される（Bach 及びRechler, 同上; Clemmons 等.,同上）。ＩＧＦＢＰファミリーメンバーの原型の高画像度の構造は入手されていない。しかし、最近、ＩＧＦ結合活性を保った、ＩＧＦＢＰ−５の二つのＮ末端断片のＮＭＲによる構造が報告されている（Kalus等., EMBO J., 17: 6558-6572(1998)）。
【０００５】
ＩＧＦ−Iは、プロインシュリンに対して高い相同性を有する７０個のアミノ酸から成る一本鎖タンパク質である。他のインシュリンスーパーファミリーとは異なり、ＩＧＦのＣ領域は翻訳後にタンパク質分解性の除去を受けない。ＩＧＦ−I（Cooke 等., Biochemistry, 30: 5484-5491(1991); Hua等., J.Mol.Biol., 259: 297-313(1996)）、ｍｉｎｉ−ＩＧＦ−I（加工によってＣ鎖を欠いた変異体；DeWolf ら., Protein Science, 5: 2193-2202(1996)）、及びＩＧＦ−II（Terasawa 等., EMBO J., 13: 5590-5597(1994); Torres等., J.Mol. Biol., 248: 385-401(1995)）のＮＭＲ解析による構造が報告されている。ＩＧＦ−Iの特定のエピトープが、受容体及び結合タンパク質と結合することは一般的に認められている。受容体不活性ＩＧＦ変異体が、結合タンパク質から内因性のＩＧＦ−Iをとって代わることができ、その結果として純ＩＧＦ−I作用をインビボで起せることは、動物モデルにおいて実証されている（Loddick 等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1894-1898(1998); Lowman 等., Biochemistry, 37: 8870-8878(1998)）。残基Ｙ２４、Ｙ２９、Ｙ３１、及びＹ６０が受容体への結合に関与している一方で、そのＩＧＦ変異体はやはりＩＧＦＢＰへ結合する（Bayne等., J.Biol.Chem., 265: 15648-15652(1990); Bayne等.,J.Biol.Chem., 264: 11004-11008(1989); Cascieri 等., Biochemistry, 27: 3229-3233(1988); Lowman 等., 同上）。
さらに、（１−２７、ｇｌｙ４、３８−７０）−ｈＩＧＦ−Iと称される変異体は、ヒトＩＧＦ−IのＣ領域の残基２８−３７が４残基グリシン架橋によって置換されており、ＩＧＦＢＰと結合するがＩＧＦレセプターとは結合しないことが発見されている（Bar 等., Endocrinology, 127: 3243- 3245(1990)）。
【０００６】
多数の突然変異誘発研究は、ＩＧＦ−IのＩＧＦＢＰ結合エピトープの特徴づけに取り組んでいる（Bagly 等., Biochem.J., 259: 665-671(1989); Baxter 等., J.Biol.Chem., 267: 60-65(1992); Bayne等., J.Biol.Chem.,263:6233-6239(1988); Clemmons 等., J.Biol.Chem. 263:12210-12216(1990); Clemmons 等., Endocrinology, 131: 890-895(1992); Oh 等., 同上）。要約すると、Ｎ末端の残基３及び４と、残基８−１７を含むへリックス領域は、ＩＧＦＢＰとの結合にとって重要であることが発見された。その上に、ＩＧＦＢＰ−１、−２、及び−５へ結合する残基４９−５１に関与するエピトープが同定された（Clemmons等., Endocinology, 同上, 1992）。さらには、Ｎ末端の最初の３個のアミノ酸を欠く不完全な形のＩＧＦ−I（ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Iと呼ばれる）が２５倍低い親和力でＩＧＦＢＰ−３と結合することが証明された（Heading 等., J. Biol. Chem.., 271: 13948-13952(1996); U.S. Pat. Nos. 5,077,276; 5, 164,370; 5,470,828）。
【０００７】
Ｎ末端へリックス構造の露出したアミノ酸残基の結合への貢献を特徴付けることを試みる為に、幾つかのＩＧＦ−Iのアラニン変異体が構築された（Janson 等., Biochemistry., 36: 4108-4117(1997)）。しかし、これら変異体タンパク質の円二色性スペクトルは、野生型ＩＧＦ−Iと比較して構造変化があることを示し、ＩＧＦＢＰ結合への貢献を変異した測鎖へ明確に起因させることを困難にした。つい最近の研究では難解な手法が用いられ、ＩＧＦ−I上のＩＧＦＢＰ−１結合エピトープが異核NMR分光法によって調べられた（Jansson 等., J.Biol.Chem. 273: 24701-24707(1998)）。筆者らは、さらに、残基Ｒ３６、Ｒ３７、及びＲ５０が機能的にＩＧＦＢＰ−１への結合へ関与していることを同定した。
【０００８】
他のＩＧＦ−I変異体が開示されている。例えば、特許文献では、ＷＯ９６／３３２１６は、原型ＩＧＦ−Iの１−６９の残基を有する切断変異体について記述している。ＥＰ７４２，２２８は、省略型Ｃドメインを有する自然発生した単鎖ＩＧＦ−Iに由来する二本鎖ＩＧＦ−Isuperagonistsについて開示している。ＩＧＦ−Iアナログの公式：ＢＣｎ，Ａで、ＢはＩＧＦ−IのＢドメイン又はその機能アナログ、ＣはＩＧＦ−IのＣドメイン又はその機能アナログ、ｎはＣドメインのアミノ酸数で６−１２個であり、ＡはＩＧＦ−IのＡドメイン又はその機能アナログである。
さらに、Cascieri 等., Biochemistry, 27: 3229-3233(1988)は、３個が１型ＩＧＦ受容体への親和力が低下していた、ＩＧＦ−Iの４個の変異体について開示した。これらの変異体は：（Ｐｈｅ２３、Ｐｈｅ２４、Ｔｙｒ２５）ＩＧＦ−I（１、２型ＩＧＦ及びインシュリン受容体への親和力がヒトＩＧＦ−Iと同等）、（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−I及び（Ｓｅｒ２４）ＩＧＦ−I（ヒト胎盤１型ＩＧＦ受容体、胎盤インシュリン受容体、及びラット及びマウス細胞の１型ＩＧＦ受容体への親和力がＩＧＦ−Iよりも低い）、そしてdesoctapeptide（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−I（位置２４の芳香族性の消失がｈＩＧＦ−Iのカルボキシ末端のＤ領域の欠損と連結している）。これら４個の変異体は、ヒト血清結合タンパク質へ標準的な親和力を有している。
【０００９】
Bayne 等., J.Biol.Chem., 264: 11004-11008(1988)は、ＩＧＦ−Iの３個の構造アナログを開示している：（１−６２）ＩＧＦ−Iで、ＩＧＦ−IのＣ−末端のＤ領域の８個のアミノ酸を欠くもの、ＩＧＦ−IのＣ領域の残基２８−３７が４残基グリシン架橋によって置換されているもの；及び（１−２７，Ｇｌｙ４，３８−６２）ＩＧＦ−Iで、Ｃ領域のグリシン置換とＤ領域欠失したものである。Peterkofsky 等., Endocrinology, 128: 1769-1779(1991)は、Bayne等のＧｌｙ４変異体（Bayne等., 同上, Vol.264. U.S. Pat. No. 5,714,460 ）を使用したデーターを開示し、神経障害の治療の為にＩＧＦ−I又はＩＧＦ−Iの濃度を増加させる化合物に関するものである。
【００１０】
Cascieri 等., J.Biol.Chem. 264: 2199-2202(1989)は、ＩＧＦ−IのＡ領域の特定の残基が、インシュリンＡ鎖上のこれらに相当する残基と置換されている３個のＩＧＦ−Iアナログを開示している。これらアナログは：（Ｉｌｅ４１、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｎ４６、Ｔｈｒ４９、Ｓｅｒ５０、Ｉｌｅ５１、Ｓｅｒ５３、Ｔｙｒ５５、Ｇｌｎ５６）ＩＧＦ−IでＡ鎖変異体で、その残基４１がスレオニンからイソロイシンへ置き換えられ、そしてＡ領域の残基４２−５６は置換されている；（Ｔｈｒ４９、Ｓｅｒ５０、Ｉｌｅ５１）ＩＧＦ−I；及び（Ｔｙｒ５５、Ｇｌｎ５６）ＩＧＦ−I。
【００１１】
ＷＯ９４／０４５６９は、特定の結合分子について開示し、それは天然ＩＧＦＢＰ以外で、ＩＧＦ−Iへ結合が可能であり、そしてＩＧＦ−Iの生物活性を増大することが可能である。ＷＯ９８／４５４２７は１９９８年１０月１５日に公開され、Lowman等., 同上、は、ファージディスプレイ法によるＩＧＦ−Iアゴニストの同定を開示している。また、ＷＯ９７／３９０３２は、ＩＧＦＢＰのリガンド阻害剤とその使用方法について開示している。さらに、U.S. Pat No. 5,891, 722 は、遊離ＩＧＦＢＰ−１へ結合親和性を有する抗体、膣液の遊離ＩＧＦＢＰ−１の存在によって指示される、遊離ＩＧＦＢＰ及び膣液中の羊水の存在に基づく胎膜における破裂を検出する装置と方法について開示している。
これらの成果にもかかわらず、ＩＧＦ−IのＩＧＦＢＰ結合エピトープの概論は、統一的ではなく、解像度が低い。これまでの研究は、殆どが相同的なインシュリンの領域をＩＧＦ−I或いは切断タンパク質（例、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−I）挿入することに関したのもで、ミスフォールディングと真の結合決定基に起因される作用を区別するものではなかった。すべてのこれらの研究結果を結びつけることは、放射線標識リガンド結合分析からバイオセンサー分析の範囲の異なった技術を使用してＩＧＦ変異体とＩＧＦＢＰの複合体を分析するという事実から、さらに複雑なことである。
【００１２】
ＧＨ／ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ系が同化及び代謝恒常性の制御に関与しており、この系の欠如は成長、生理、及び糖血症の制御へ逆作用する（Jones 等., Endocr. Rev., 16: 3-34(1995); Davidson, Endocr. Rev., 8: 115-131(1987); Moses, Curr. Opin. Endo. Diab., 4: 16-25(1997)。さらに最近のデーターは、血漿レベルとＧＨ及びＩＧＨ−Iの生物活性の制御においてＩＧＦＢＰの役割の拡大を示唆しいる（Jones 等., 同上；Lewitt 等., Endrocrinology, 129: 2254-2256(1991); Rosenfield 等., “成長ホルモン非感受性症候群のＩＧＦ−１による治療”:インシュリン様成長因子とそれらの制御タンパク質. Eds Baxter RC, Gluckman PD, Rosenfield RG. Excerpta Medica, Amsterdam(1994), pp357-464; Lee 等., Pro.Soc.Exp.Biol.Med.,216:319-357(1997); Cox等., J.Clin.Endocrinol.Metab.,135:1913-1920(1995); Lewitt等., Endrocrinology, 133: 1797-1802(1993))。ＩＧＦＮＢＰレベルの交互変化は、ＩＧＦ過剰又は不足の臨床的症状へつながる可能性があり、そして又ＧＨ耐性へ貢献する（Barreca 等., JCEM, 83: 3534-3541(1998); Shmueli等., Hepatology, 24: 127-133(1996); Murphy 等., Prog. Growth Factor Res., 6: 425-432(1996); Rajkumar 等., Endrocrinology, 136: 4039-4034(1995); Hall 等., Acta Endocrinol.(Copenh), 118: 321-326(1998); Ross 等., Clin. Endocrinol., 35: 47-54(1991); Scharf 等., J.Hepatology, 25: 689-699(1996))。
【００１３】
ＩＧＦとＧＨの生物活性の制御に最も重要であると思われる二つのＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３である。ＩＧＦＢＰ−３は、血漿においてＩＧＦ−IとＩＧＦ−IIの全レベルの制御に最も重要であると思われる。ＩＧＦＢＰ−３は、ＧＨ依存性タンパク質であり、ＧＨ欠乏或いは耐性の場合に減少する（Jones 等., 同上; Rosenfild等., 同上 ., Scharf 等., 同上.,) 。ＩＧＦＢＰ−１は、一般的にはＩＧＦ活性の阻害剤と考えられており、糖尿病、腎疾患、うっ血性心不全、肝疾患、栄養失調、消耗症候群、及び殆どの異化状態などのＧＨ耐性状態の殆どの場合において増加する（Lewitt 等., 1993, 同上; Barreca等., 同上; Scharf等., 同上; Bereket等., Endocrinology, 137: 2238-2245(1996); Crown とHolly, Clin. Nutrit.,14: 321-328(1995); Underwood とBackeljauw, J.Int.Med., 234: 571-577(1993); Thraikill 等., J.Clin.Endo.Metab., 82(4): 1181-1187(1997)）。殆どのこれらの疾患の状態は、次の生化学的側面を特徴とする：乱れたグルコース制御、炎症、過剰ＩＧＦＢＰ−１レベル、低ＩＧＦＢＰ−３レベル、低ＩＧＦ生物活性、及び過剰ＧＨレベル（Jones等., 同上; Barreca等., 同上; Crown とHolly等., 同上; Bereket等., Clinical Endocrinology, 45(3): 321-326(1996); Batch等., J.Clin.Endo.Metab., 73:964-968(1991); Powell等., The Southwest Pediatric Nephrology Study Group, Kidney Int., 51: 1970-1979(1997)）。
【００１４】
グルココルチコイドは、タンパク質合成の減少とタンパク質異化の増加（Simmons 等,. J.Clin. Invest., 73: 412-420(1984))、尿中の窒素排泄の増加（Sapir 等., Clin. Sci. Mol. Med., 53: 215-220(1997)）と関連している。これらの結果は、部分的には成長ホルモン分泌の減少（Trainer等., J.Endrocrinol.134: 513-517(1991))又は組織レベルへのグルココルチコイドの直接作用（Baron 等., Am.J.Physiol. 263: E489-E492(1992)）によって媒介されている可能性があり、その結果として局所的なＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰの生成の妨害（McCarthy等., Endocrinology, 126: 1569-1575(1990); Lee等., 同上）及びインシュリン作用の拮抗作用（Horber等., Diabetes, 40: 141-149(1991)）となる。ラットを用いた以前の研究は、グルココルチコイド類似体、例えばデキサメタゾンの異化作用は、組み換え型ヒトＩＧＦ−１及びその類似体によって相殺される（Tomas 等., Biochem.J., 282: 91-97(1992)）ことが実証されている。さらに、インシュリンがタンパク質の異化分解を回復させることが示されている（Woolfson等., N.Eng.J.Med., 300: 14-17(1979)）。
【００１５】
併用療法も開示されている。例えば、Fuller等., Biochem Soc Trans, 19: 277S(1991）は、心臓のタンパク質合成を刺激する為のインシュリンとＩＧＦの使用について示している。Umpleby等., Europ.J.Clin.Invest., 24: 337-344(1994)は、タンパク質合成への影響を判定する為に、一晩飢餓状態にした犬のインシュリンとＩＧＦによる治療を開示した。さらに、U.S. Pat. No. 5,994,303は、窒素バランスとタンパク質の減少を相殺する為のインシュリンとＩＧＦ−Iの組み合わせ使用について開示している。
【００１６】
腎疾患に関しては、ＩＧＦ−Iが多様な作用を腎臓で発揮することが報告されている（Hammerman とMiller, Am.J.Physiol., 265: F1-F14(1993)）。末端肥大症の患者に観察される腎臓の増大が、腎糸球体の濾過速度の著しい増大に伴うことは、数十年間にわたって認知されてきた（O'SheaとLayish, J.Am.Soc.Nephrol.,3:157-161(1992)）。U.S.Pat. No.5,273,961は、急性腎疾患の危険のある哺乳類の予防的治療の方法について開示している。標準的な腎臓の機能を有するヒトペプチドを注入すると、腎糸球体の濾過速度と腎血漿の流量が増加した（Guler等., Acta Endocrinol., 121: 101-106(1989); Guler等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2868-2872(1989); Hirschberg等., Kidney Int., 43:387-397(1993); U.S. Pat. No. 5,106,832）。さらに、中程度に腎臓機能が減少したヒトは、短期間（４日間）のＩＧＦ−Iの投与に反応し、腎糸球体の濾過速度と腎血漿の流量が増加した。従って、ＩＧＦ−Iは、慢性腎疾患の状況での強力な治療薬である（O'Shea等., Am. J. Physiol. 264: F917-F922(1993)）。
【００１７】
ＩＧＦ−I又はその類似体を使用し、多嚢胞性腎疾患と関連した徴候、腎形成異常症、及び／又は腎形成不全などの腎疾患に苦しむ哺乳類を治療することは、U.S.Pat No. 5,985,830 に開示されている。この特許は、さらにＩＧＦ−Iが、慢性的な器官損傷に苦しむ哺乳類の糸球体と腎臓発育を促進する効果的な薬剤であることが開示されている。
さらに、ＩＧＦ−Iを末期の慢性腎疾患の状況へ投与すると、腎臓の機能が数日間に渡って増強することが可能である。末期の慢性腎疾患が、透析又は移植のみで治療することが可能な状況であること、そしてその発生が急増していることから、これは重要である。糖尿病患者と高齢者は、この状況を有する傾向にある。およそ６０％末期慢性腎疾患は患者血液透析、約１０％は腹膜透析、そして残りの約３０％が移植を受ける。毎年、アメリカでは、５０，０００人以上の患者が透析治療を始める。毎年、さらなる末期腎疾患になった２５％の患者が透析を受けることを拒否する。これら透析を受けている患者の看護の費用は、現在、平均して一月当たり２億ドルである。さらに、患者は透析によって支障のある生活様式を見せる。ＩＧＦ−Iが末期慢性腎疾患を体験している方々の腎臓機能を増強することが可能であるにもかかわらず、ＩＧＦ−Iの短期投与によって誘導された腎糸球体の濾過速度と腎血漿の流量の増加は長期投与の間は持続せず、副作用の発生率は高い（Miller等., Kidney International, 46: 201-207(1994)）。
【００１８】
ＩＧＦ−Iと高感受性組織との相互作用の動力学は、複雑で完全に理解されていない。循環ＩＧＦ−Iの生物活性は血漿ＩＧＦＢＰのレベルによって制御され、両物質がＩＧＦ−Iの作用を促進及び阻害する（CohickとClemmons, Annu. Rev. Physiol., 55: 131-153(1993); Kupfer等., J.Clin.Invest., 91: 391-396(1993)）。さらに、組織に存在するＩＧＦＢＰは、循環ＩＧＦ−Iとその受容体の相互作用を制御する。組織ＩＧＦ−I受容体の密度は、循環ＩＧＦ−Iのレベルの変化によって変化する。腎臓においては、ＩＧＦ−I受容体の数は、循環ＩＧＦ−Iのレベルに反比例している（Hise等., Clin.Sci., 83: 223-239(1991)）。
ある環境下において、上昇した循環ＩＧＦ−Iのレベルが、腎臓機能の長期に渡る変化に関連している又は直接の原因であることは知られている。例えば、末端肥大症患者の循環ＧＨとＩＧＦ−Iの上昇を伴うインシュリンとＰＡＨのクリアランスの増大は、一年に渡って持続する（Kkos等., Acta Endocrinol., 21: 226-236(1956)）。クレアチンのクリアランスの増大が、ＧＨ非感受性のラロン型小人萎縮症へＩＧＦ−Iを投与した最初の１２日間に起こった。この増大は、次の５９日間に渡って進行性であった（Walker等., J.Pediatr., 121: 641-646(1992)）。
【００１９】
ＧＨは、肝臓においてＩＧＦＢＰ３の合成を刺激する（HammermanとMiller, 同上; CohickとClemmons, 同上; Kupfer等., 同上）。下垂体ＧＨの放出のＩＧＦ−Iによる阻害から生じる循環ＧＨのレベルの低下が、ＩＧＦ−Iを投与されたヒトにおいて循環ＩＧＦＢＰ３の低下の結果となると考えられている。ＧＨ非感受性のために、ＩＧＦＢＰ３のレベルは低く、そしてラロン型小人萎縮症においては、ＩＧＦ−Iによって増加する（Kenety等., Acta Endocrinol., 128: 144-149(1993)）。ＩＧＦ−Iエフェクタ−系のこの相違や他の点は、これら個人のＩＧＦ−Iへの不応性の欠如を説明することが可能である。
【００２０】
Walker., 同上は、ＩＧＦ−Iが尿のカルシュウム排泄又は尿量を増加させることを発見した。Miller等., 同上は、そのような作用を確認しなかった。ＩＧＦ−Iは，さらに、近傍の尿細管の刷子縁膜を通過するリン酸輸送を促進する（QuigleyとBaum, J.Clin.Invest., 88:368-374(1991)）。長期の末端肥大症患者は、顕著な腎肥大と過剰な糸球体濾過速度を有し、ヒトにおける循環ＧＨとＩＧＦ−Iの長期に渡る上昇を伴う過剰ろ過が腎臓の傷害とはならないことを示唆した（Ikkos等., 同上; Hoogenberg等., Acta Endocrinol., 129: 151-157(1993)）。
慢性腎疾患などの慢性疾患の治療の為の断続的なＩＧＦ−Iの投与は、U.S. Pat. Nos. 5,565,428及び5,741,776に開示されている。
【００２１】
臨床状況下では、循環ＩＧＦ−Iのレベルは末期前慢性腎疾患（ＣＲＦ）において標準であり、末期腎疾患においては僅かに減少する(Power等.,Am.J.Kidney Dis.,10:287-292(1987); Blum等., Pediatr.Nephrol.,5:539-544(1991);Tonshoff等., J.Clin.Endocrinol.Metab.,80:2684-2691(1995); Tonshoff等., Peditar.Nephrol.,10:269-274(1996)）。対照的に、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、及び低分子ＩＧＦＢＰ−３断片は、腎機能不全の程度と関連し、慢性腎疾患の血清中に増加する（Lee等., Pediatr.Res., 26:308-315(1989); Liu等., J.Clin.Endocrinol.Metab., 70:620-628(1990); Powell等., Pediatr. Res., 33: 136-143(1993)）。ＩＧＦ−Iの生物活性は、I型ＩＧＦ受容体を介して媒介される。ＩＧＦＢＰが、１型ＩＧＦ受容体と結合するのと同等或いはより高い親和力でＩＧＦと結合しするため、ＣＲＦ血清中の過剰な不飽和の高親和性ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦとの結合に関して１型ＩＧＦ受容体と競合することによって、対象となる組織においてＩＧＦの作用を阻害する能力を有する（Tonshoff等., Prog. Growth Factor Res., 6: 481-491(1996)）。実際に、ＣＲＦにおけるＩＧＦＢＰレベルの増加は、インビトロ（Blum等., 同上）とインビボ（Tonshoff等., 同上, 1995）の両方におけるＩＧＦ生物活性の阻害剤であると同定されている。
【００２２】
ＣＲＦでのＩＧＦ−IとＩＧＦＢＰの生成速度については、ほとんど知られていない。標準ＩＧＦを越える増加したＩＧＦＢＰの一群は、ＣＲＦで減少したＩＧＦ−I分泌速度を示すことが示唆されているが、これは標準条件下において、増加したＩＧＦ結合能が直ちに肝臓で生成されたＩＧＦで飽和されることが予想されるためである（Blum, Acta Paediatr. Scand. [Suppl] 379: 24-31(1991)）。臨床ＣＲＦにおける血漿ＩＧＦＢＰレベルの以前の分析は、増大したＩＧＦＢＰ−２の生成速度は、ＣＲＦ血漿中の上昇したＩＧＦＢＰレベルへ貢献するであろうことを同じく示唆した（Tonshoff等., 同上, 1995）。これら二つの仮説は、肝ＩＧＦ−I遺伝子の発現とＩＧＦＢＰ−１、２、３、及び４の血漿レベルを実験用尿毒症のモデルラットで分析することによって調べられた（Tonshoff等.,Endocinology, 138:938-946(1997)）。筆者らは、肝ＩＧＦ−Iの減少及びＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−２遺伝子発現の増加が、実験用尿毒症で生じることを発見した。
腎臓に対するＩＧＦ−Iの影響についての完全な考察としては、例えば、Hammerman及びMiller, Am. J. Physiol., 265:F1-F14(1993)及びHammerman及びMiller, J.Am.Soc.Nephrol., 5: 1-11(1994)を参照のこと。
【００２３】
腎疾患を含む、ＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を有する患者の治療には、主に高ＩＧＦＢＰ−１レベルであるＩＧＦＢＰの異常分布のために、ＩＧＦ−Iによる治療は有効ではない。従って、ＩＧＦＢＰ−３への結合能を失わずにＩＧＦＢＰ−１への親和力が減少したＩＧＦ−I変異体が、そのような調節不全を特徴とする臨床状況為への唯一で効果的な治療法となる可能性がある。
【００２４】
（発明の概要）
従って、一実施態様では、 本発明はＩＧＦ−I変異体を提供し、それは天然配列ヒト型ＩＧＦ−Iの位置１６、２５、又は４９のアミノ酸残基、 又は位置３及び４９のアミノ酸残基がアラニン、グリシン、又はセリン残基へ置換されている。
また、ここに提供されているのは、容器、好ましくは製薬的に許容可能な容器に含まれる変異体を含む組成物である。好ましくは、この組成物は無菌である。
さらに、ここに提供されるのは、上記に記載した変異体を哺乳類へ投与することを含む哺乳類のＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を特徴とする疾患の治療方法である。哺乳類は、好ましくはヒトで、疾患は好ましくは腎疾患、さらに好ましくは腎不全である。
【００２５】
ここに示すペプチドは、単独、或いは特定の治療の為の活性剤、例えば腎疾患の為のＢＱ−１２３のような腎臓活性剤と供に投与することが可能である。
また、ここで考察されているのは、ここで取り上げられるペプチドと哺乳類のＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を特徴とする疾患の治療の為に組成物を使用する使用者への説明書を含む、製薬的に許容される組成物を含有する容器を含むキットである。疾患が腎疾患である場合は、このキットは任意的にさらに腎臓活性分子を含有する容器を含む。
ここに示すペプチドの同定の為に、ヒトＩＧＦ−Iは一価の繊維状ファージミド粒子に表示され（US Pat. Nos. 5,750, 373 及び 5,821,047）、その完全なアラニンスキャンニング突然変異誘発（Cunningham及びWells, Sience, 244: 1081-1085 (1989); US Pat No. 5,834,250）をファージディスプレイ法によりおこなった（「ダーボ−アラスキャン」）（Cunningham等., EMBO J. 13: 2508-2515(1994); Lowman, Methods Mol. Biol., 87: 249-264(1998)）。ＩＧＦ−ファージミド変異体は、ＩＧＦ−IにあるＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３の為の結合決定基の地図を描く為に使用された。ＩＧＦＢＰ−１或いはＩＧＦＢＰ−３に特異的に結合してインビボにおけるこれらタンパク質のクリアランス半減期の調節し、タンパク質分解安定性の向上させ、又は組織分布の変更をする結合タンパク質特異的ＩＧＦ変異体を発生する為に、アラニンスキャンニングは結合タンパク質の為の特異的決定基を明らかにする。さらに、多様なＩＧＦ−結合抗体、又は他のペプチドやタンパク質でＩＧＦ−Iと結合するもののエピトープを地図化することは有益であると言える。
【００２６】
（実施態様）
Ａ．定義
ここで使用される治療目的の為の“哺乳類”とは、哺乳類に分類されるすべての動物に関してであり、ヒト、家畜、及び飼育動物、そして動物園、スポーツ用、又はペット動物、例えば犬、馬、猫、羊、豚、牛などを含む。好ましい哺乳類はヒトである。“大人ではない”という用語は、哺乳類において出生時（低体重乳児を含む）から思春期を含み、後者はまだ潜在成長力に達していない場合に相当する。
【００２７】
ここで使用される“ＩＧＦ”は、天然インシュリン様成長因子−I、及び別名ｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−Iとして知られている脳ＩＧＦなどのそれらの天然変異体と同様に天然インシュリン様成長因子−IIに相当する。
【００２８】
ここで使用される“ＩＧＦ−I”は、牛、羊、豚、及び馬、好ましくはヒトを含むすべての種の天然インシュリン様成長因子−Iに相当し、外部からの投与について言及する場合は、天然、合成、又は組み換え体であろうと、どのソースからのものについても天然インシュリン様成長因子−Iに相当する。“天然配列”ヒトＩＧＦ−Iは、その配列が図４（配列番号：１）に示されており、例えば１９８７年８月５日に公開されたEP 230,869；１９８４年１２月１９日に公開されたEP128,773；又は１９８８年１０月２６日に公開されたEP288,451に記載の方法によって調製される。さらに好ましくは、この天然配列ＩＧＦ−Iは、臨床検査の為に、組み換え体によって生成され，そしてジェネンテク，インコーポレィテッド，サウス サン フランシスコ，カルフォルニアより入手可能である。
【００２９】
ここで使用される“ＩＧＦ−II”は、牛、羊、豚、及び馬、好ましくはヒトを含むすべての種の天然インシュリン様成長因子−Iに相当し、外部からの投与については、天然、合成、又は組み換え体であろうと、どのソースからのものについても天然インシュリン様成長因子−Iに相当する。例えば、EP128,733に記載の方法によって、その調整が可能である。
【００３０】
“ＩＧＦＢＰ”又は“ＩＧＦ結合タンパク質”は、循環性であろうとなかろうと（例えば、血清又は組織）、ＩＧＦ−I又はＩＧＦ−IIと会合、又は結合する、或いは複合体となるタンパク質又はポリペプチドに相当する。このような結合タンパク質には、受容体が含まれない。この定義には、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、Ｍａｃ２５（ＩＧＦＢＰ−７）、及びＩＧＦＢＰと高い相同性を有する他のタンパク質と同様にプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）又は内皮細胞特異性細胞（ＥＳＭ−１）が含まれる。Ｍａｃ２５は、例えば、Swisshelm等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:4472-4476(1995)及び Oh等., J. Biol. Chem. 271: 30322-30325(1996)に記載されている。ＰＳＦは、Yamauchi等., Biochemical Journal, 303: 591-598(1994)に記載されている。ＥＳM−１は、Lassalle等., J.Biol.Chem. 271: 20458-20464(1996)に記載されている。他の同定されたＩＧＦＢＰについては、例えば、１９９０年６月２７日に公開されたEP 375,438；１９９０年５月２３日に公開さたEP369,943；１９８９年１０月５日に公開されたWO89/09268；Wood等., Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185(1988)；Brinkman等., The EMBO J., 2417-2423(1988)；Lee等., Mol. Endocrinol., 2:1176-1185(1988)；Brewer等., BBRC,152:1289-1297(1988)；１９８８年１２月７日に公開されたEP294,021；Baxter等.,BBRC,147:408-415(1987)；Leung等., Nature, 330: 537-543(1987)；Martin等., J. Biol. Chem., 261: 8754-8760(1986)；Baxter等., Comp.Biochem.Physiol., 91B:229-235(1988)；１９８９年９月２１日に公開されたWO89/08667；１９８９年１０月１９日に公開されたWO89/09792；及びBrinkert等., EMBO J., 8:2497-2502(1989)を参照のこと。
【００３１】
“体液”という用語は、哺乳類からの液体の生物学的サンプル、好ましくはヒトからのものに相当する。この体液は、血清、血漿、リンパ液、滑膜液、濾胞性液、羊水液、乳、全血液、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、発汗、粘液、組織培養培地、組織抽出物、細胞抽出物などの水性液体を含む。
【００３２】
ここで使用される“ヒトＩＧＦ受容体”は、ヒトにおいて発見されたＩＧＦの為のすべての受容体に相当し、胎盤１型ＩＧＦ−I受容体のような、ヒトＩＧＦ−I及びＩＧＦ−IIが結合するヒトの１型及び２型ＩＧＦ受容体を含む。
“ペプチド”とは、少なくとも２個のアミノ酸を有するＩＧＦ−Iアゴニスト／ＩＧＦ−II変異体を含み、少なくとも５０個のアミノ酸を有するポリペプチドを含む。その定義は、ペプチド誘導体、それらの塩類、又は光学異性体を含む。
【００３３】
“ＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を特徴とする疾患”とは、同化と代謝恒常性の制御に関与しているＧＨ／ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ系の欠陥を伴う、又は陥っている哺乳類の状態に相当する。これらの疾患は、成長、生理、及び／又は糖血症制御に欠陥のあること、及びＩＧＦ過剰又は欠乏、及び／又はＩＧＦＢＰ−３レベルの減少及び／又はＩＧＦＢＰ−１レベルの増加によって明らかになるＧＨ耐性及び／又は欠乏の臨床的症状を伴う欠陥を特徴とする。例としては、高血糖性疾患、腎臓疾患、うっ血性心臓疾患、肝疾患、栄養失調、ターナー症候群、エイズによる消耗性疾患のようなタンパク質合成の減少を伴う消耗病候群、哺乳類において重い病気以外の疾患に比較してＩＧＢＦＢＰレベル（例えばＩＧＦＢＰ−１レベル）が増加することを特徴とする異化状態、窒素バランスの減少を伴う疾患、グルココルチコイド過多によって生じるタンパク質異化作用などの疾患がある。グルココルチコイドの過多を伴う一例としては、多量のステロイドホルモン治療にさらされている新生児と思春期前の哺乳類のような、ネフローゼ症候群又は全繊毛萎縮症の子供達のような実質上標準的な成長の維持が切望されている患者である。治療によって頻繁に併発する腎不全症、又は、被験者が大人ではない場合に時に重要だが、他の疾患の治療を受けている患者の好転した成長を促進する体重の減少を最小化するという理由から、例えば異化及び腎疾患を治療する場合には、さらなる相乗作用が関与する。
【００３４】
これら疾患の殆どは、次の生化学的側面を特徴とする：乱れたグルコース制御、炎症、過剰ＩＧＦＢＰ−１レベル、低ＩＧＦＢＰ−３レベル、低ＩＧＦ生物活性、及び過剰ＧＨレベル。これらの状態の確認は、標準的臨床的手法、例えば、分子レベルのＥＬＩＳＡ(,酵素結合免疫測定法）、臨床化学、ＲＩＡ（放射線免疫検定法）、又はバイオアッセイ（生物学的検定法）によって可能である（参照、例えば、Jones等., 同上; Davidson, 同上; Moses, 同上; Lewitt 等., 1991, 同上; Rosenfield等., 同上; Lee等., 1997, 同上; Cox等., 同上; Lewitt等., 1993 同上; Barreca等., 同上; Schmueli等., 同上; Murphy等., 同上; Rajkumar等., 同上; Hall等., 同上; Ross等., 同上; Scharf等., 同上; Bereket等., Endocrinology,同上;Crown及びHolly, 同上; Underwood及びBackelijauw等., 同上; Thraikill等., 同上; Bereket等., Clinical Endocrinology同上; Batch等., 同上; 及びPowell等., 1997同上; ）。
【００３５】
ここで使用される、用語“高血糖性疾患”は、高インスリン血症及び高脂血症、例えば肥満患者、及びメンデンホール症候群、ウェルナー症候群、妖精症、脂肪萎縮性糖尿病、及び他の脂肪萎縮症などのインシュリン耐糖性糖尿病と同様にI型及びII型糖尿病のようなすべての型の糖尿病に相当する。好ましい高血糖性疾患は糖尿病であり、特にI型及びII型である。“糖尿病”そのものは、不適切なインシュリンの生成と利用が関与する進行性の炭水化物代謝の疾患に相当し、高血糖と糖尿を特徴とする。
【００３６】
ここで使用される、用語“高血糖性薬剤”とは、膵臓及びインシュリンによるインシュリンの分泌を起こす分泌促進物質、好ましくは経口投与剤に相当する。ヒトの使用でここにおいてさらに好ましくは、インシュリン及びスルホニル尿素類の高血糖性薬剤である。例としては、グリブリド、glipizide、グリクラジドが含まれる。さらに、インシュリン感受性を促進する薬剤、例えばビグアナイド類がこの定義に入り、そして同じく好ましい。
【００３７】
ここで使用される“インシュリン”とは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、好ましくはヒトを含む全ての種、及び天然、合成、又は組み換え体に関わらず全てのソースからの全てのタイプのインシュリンに相当する。例えば、Diabetes Mellitus - Theory and Practice, fourth edition, Harold Rifkin, MD, Ed. (Elsevier, New York, 1990), Chapter29, and U.S. Pharmacist, 18(Nov. Suppl.)p.38-40(1993)に報告されている全てのインシュリン薬剤は、この点で適している。Jens Brange, Galenics of Insuline, The Physico-chemical and Pharaceutical Aspects of Insulin and Insulin Preparations(Springer-Verlag, New York, 1987), page 17-40 において言及されているような、市場にある全ての各型のヒトインシュリンが含まれている。これらには、レギュラーインシュリン、イソフェン・インシュリンとも呼ばれるＮＰＨ（Neutral Protamine Hagedorn）インシュリン、７０％のＮＰＨ−インシュリンと３０％のレギュラーインシュリンから成る７０／３０インシュリン、Semilente インシュリン、UltraLente インシュリン、Lente インシュリン、及びHumalog インシュリンが含まれる。ここで動物への使用として好まれるのは、ヒトインシュリンをヒトの治療へ使用するなど、治療を受ける対象となる特定の種の型のインシュリンである。
【００３８】
ここで定義される“腎疾患”とは、任意に透析を必要とする可能性がある前歴の急性或いは慢性腎疾患と関連している腎機能不全症で、限定されないが、例えば、慢性腎臓機能不全、末期慢性腎疾患、一次及び二次糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、間質性腎炎、腎盂腎炎など、糖尿病患者のKimmelstiel-Wilson、及び腎移植後の腎不全；同様に急性腎疾患及び虚血による腎尿細管壊死；糖尿病又は自己免疫性腎障害と関連する腎機能障害；臓器移植の為に投与される腎毒性薬又は腎毒性免疫抑制剤への副作用；腎臓移植後の患者の急性拒絶反応；腎多嚢胞病及び関連する徴候；腎形成異常；腎形成不全；先天性腎異常；他の疾患で脊髄のbifida、solitary 腎臓、interuterine 成長阻害、成長異常を伴う小児科の症候群（例えば、ターナー症候群及びダウン症候群）、及び同様な疾患；慢性臓器障害に苦しむ者、小さな腎臓の移植を経験した者(臓器のさらなる成長が除去された場合）、尿細管の中毒に苦しむ対象者、化学療法を経験している対象者（例えば、癌患者）、及び同様な場合；尿毒症、タンパク尿症、及び無尿症のような身体所見を含む。このような疾患は、必ずＩＧＦ−Iによる治療から恩恵を受けるであろうし、好ましくは末期前又は末期慢性腎疾患或いは慢性腎不全症である。
ここで使用される“腎臓活性分子”は、電解質の再吸収及び保持を促進、又は他の点では腎疾患を治療する為に作用する。例は下記に提供される。
【００３９】
ここで使用される、用語“治療”は、治療上の処置、及び予防的又は再発防止の二者に相当する。治療を要する者とは、疾患を患う傾向にある者、又は疾患と診断された者、或いは疾患を予防する者と供に、すでに疾患を患っている者である。継続治療又は投与とは、一日又はそれ以上の治療の中断を除く、少なくとも一日を基本単位とする治療に相当する。間欠治療又は投与、治療又は投与を断続的方法でおこなうことは、連続的ではない治療に相当し、むしろ本質的には循環である。ここにおける治療法は、連続的でも断続的でもよい。
【００４０】
ここで使用される、血清交換及び外因性ＩＧＦの組織レベルという文脈中の“活性”又は“生物学的に活性”ＩＧＦとは、その受容体に結合する、さもなければ、ここで言及される内因性又は外因性ＩＧＦの生物活性のような生物活性を生じさせることに相当する。
【００４１】
Ｂ．発明を実行する為の様式
ここの本発明は、一つの側面において、野生型ヒトＩＧＦ−Iの位置１６、２５、又は４９のアミノ酸、或いは天然配列ヒトＩＧＦ−Iの位置３及び４９がアラニン、グリシン、及び／又はセリン残基と置換されたことに関する。好ましくは、当該の１個又は２個のアミノ酸がアラニン又はグリシン残基、最も好ましくはアラニンと置換される。
【００４２】
本発明のペプチドは、化学合成或いは組み替え技術を用いることによって作製することが可能である。これらの技術は、当該技術分野においては知られている技術である。化学合成、特に固相合成法は、短いペプチド（５０残基未満）又はＤ−チロシン、オルニチン、アミノアジピン酸、及びその類似物などの非天然或いは異常アミノ酸を含むペプチドの合成に好まれる。組み替え法は、長いペプチドに好まれる。組み替え法が選択された場合には、合成遺伝子がデノボ合成される、又は天然遺伝子が、例えばカセット式変異誘発法によって構築される。下記に示されるのは、模範的な一般的組み換え法である。
精製ＩＧＦ及びそのアミノ酸配列から、例えば組み替えＤＮＡ技術によってＩＧＦ親分子のペプチジル変異体であるＩＧＦ変異体の生成が可能である。これらの技術は、簡略化された形で、天然又は合成であろうと、ペプチドをコードする遺伝子を取り出す；遺伝子を適切なベクターへ挿入する；ベクターを適切な宿主へ挿入する；遺伝子発現の為に宿主を培養する；それによって生産されたそしてペプチドを回収又は単離すことを意図する。好ましくは、回収されたペプチドは、その後、相応する程度まで精製される。
【００４３】
若干より詳しくは、ペプチジルＩＧＦ変異体をコードするＤＮＡは、適した宿主で発現するようにクローン化及び操作される。親ペプチドをコードするＤＮＡは、ゲノムライブラリー、ペプチドを発現する細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、又は合成的に構築されたＤＮＡ配列によって得ることが可能である（Sambrook等., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2ded.), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989）。
そして、親ＤＮＡは、宿主細胞の形質転換に使用される適切なプラスミド又はベクターへ挿入される。一般には、宿主との関連において、宿主と適合する種由来の複製及びコントロール配列を含むプラスミドベクターが使用される。ベクターは、通常、形質転換細胞の形質選択を提供できるタンパク質又はペプチドをコードする配列と同様に、複製部位を持つ。
例えば、大腸菌は、大腸菌由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用することによって形質転換される（Mandel等., J.Mol.Biol.53:154(1970)）。プラスミドは、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、それ故に選択が容易な方法を提供する。他のベクターは、発現にしばしば重要な異なったプロモーターのような、異なった特徴を含む。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０、及びｐＰＬ−ｌａｍｂｄａは、ｔａｃ、ｔｒｐ、又はＰＬプロモーターを持つ、程なく入手可能な発現ベクターである（Pharmacia biotechnology）。
【００４４】
好ましいベクターは、ｐＢ０４７５である。このベクターは、宿主間を往復することを可能にするファージ及び大腸菌の為の複製開始点を有し、それによって突然変異誘発及び発現を容易にする（Cunningham等., Science, 243: 1330-1336(1989); U.S.Pat. No. 5,580,723）。他の好ましいベクターは、ｐＲ１Ｔ５及びｐＲ１Ｔ２Ｔである（Pharmacia Biotechnology）。これらのベクターは、挿入された遺伝子が融合タンパク質として発現できるように、プロテインＡのＺドメインが適切なプロモーターに続いて含まれている。
他の好ましいベクターは、前記に示したベクターの適切な特徴を組み合わせることによる標準的技術を使用することで構築が可能である。適切な特徴とは、プロモーター、リボゾーム結合部位、decorsin又はornatin遺伝子、或いは遺伝子融合（プロテインＡのＺドメイン及びdecorsin又はornatinとそのリンカー）、抗生物質耐性マーカー、及び適切な複製開始点を含む。
【００４５】
宿主細胞は、原核生物又は真核生物でよい。原核生物は、親ＩＧＦ−Iポリペプチド、断片置換ペプチド、及びペプチド変異体を生産する為に、ＤＮＡ配列のクローニング及び発現の為に好まれる。例えば、大腸菌Ｋ−１２株２９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１４４６）は、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１５３７）、及び大腸菌ｃ６００及びｃ６００ｈｆｌ、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ガンマ、原栄養／ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７３２５）、枯草菌のような桿菌、ネズミチフス菌又はセラチア・マルセッセンス菌のような腸内細菌，及び様々なシュードモナス属と同様に使用される。好ましい原核生物は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。原核生物において発現された場合、ペプチドはＮ末端メチオニン又はホルミルメチオニンを含み、グリコシル化されていない。融合タンパク質の場合は、Ｎ末端メチオニン又はホルミルメチオニンが融合タンパク質のアミノ末端に、又は融合タンパク質のシグナル配列が存在する。これらの例は、限定的というよりも実証となることを意図されている。
原核生物に加えて、酵母培養菌、又は多細胞生物由来の細胞のような真核生物が使用することができる。基本的には、そのような全ての細胞が機能する。しかし、関心は脊椎動物細胞についてがもっとも大きく、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は再現性のある方法になっている（Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors(1973)）。このような有用な宿主株化細胞は、ＶＥＲＯ及びHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の株化細胞、Ｗ１３８，２９３，ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、及びＭＤＣＫ株化細胞である。
【００４６】
前記方法の変形は、所望するペプチドをコードする遺伝子が、ベクター中の他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコードする遺伝子と関連している場合に、遺伝子融合を意図するものである。これは、所望するペプチドが他のタンパク質又はペプチドと融合し、宿主細胞によって生産される結果となる。「他の」タンパク質又はペプチドとは、多くの場合、細胞から分泌が可能なタンパク質又はペプチドのことで、所望するペプチドの培養液からの単離及び精製、そして所望するペプチドが菌体内に止まる場合に生じる宿主細胞を破壊する必要性を除くことを可能にする。もう一つの方法としては、融合タンパク質は細胞内に発現することが可能である。
遺伝子融合は、必須ではないが、後のこれら遺伝子産物の精製のみならず大腸菌における異種ペプチドの発現を容易にする（Harris, Genetic Engineering, Willianson, R., Ed.(Academic Press, London, Vol.4, 1983), p.127; Ljunguist等., Eur.J.Biochem., 186: 557-561(1989)及びLjungquist等., Eur.J.Biochem., 186: 563-569(1989)）。プロテインＡ融合は、プロテインＡの結合、より詳しくはプロテインＡのＺドメインのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製の為の「親和性取っ手」を提供することから、頻繁に使用される。多くの異種タンパク質が大腸菌内で直接に発現されると分解されることが知られているが、融合タンパク質として発現された場合は安定である（Marston, Biochem J., 240: 1(1986)）。
【００４７】
融合タンパク質は、メチオニン、又はヒドロキシアミン、アスパラギン及びグリシン残基間を切断する臭化シアンのような化学薬品を使用することによって切断が可能である。標準的な組み替えＤＮＡ技術を使用することによって、これらアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対は、所望するペプチドをコードする遺伝子の５' 末端の即前に挿入することができる。
もう一つの方法としては、融合タンパク質のタンパク質分解による切断を使用することが可能である（Cater, Protein Purification: From Molecular Mechanism to Large-Scale Process, Ladish等., eds.(American Chemical Society Symposium Series No.427,1990), Ch13, page 181-193）。
第Ｘａ因子、トロンビン、及びサブチリシン又はその変異体、他の多数のプロテアーゼが、融合タンパク質の切断に首尾よく使用されている。典型的には、プロテアーゼによる切断を受けやすいペプチドリンカーは、「他の」のタンパク質（例えばプロテインＡのＺドメイン）と所望するペプチドとの間に挿入される。組み替えＤＮＡ技術を使用すると、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対は、他のタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子断片の間に挿入される。タンパク質分解による正確なリンカーを含む部分精製融合タンパク質の切断は、その結果、天然融合タンパク質、又は還元型或いは変性融合タンパク質についておこなうことができる。
【００４８】
ペプチドは、融合タンパク質として発現した場合は、適切に折り畳まれる或いは折り畳まれないことがある。さらに、切断部位を含有する特定のペプチドリンカーは、プロテアーゼへ接触可能又は接触不可能なことがある。これらの要因が、融合タンパク質は変性及び再折り畳みがなされるべきなのか、もしそうならば、これらの手段を切断の前又は後に用いられるべきなのかを確定する。
変性及び再折り畳みが必要な場合は、通常は、ペプチドは塩酸グアニジンのようなカオトロピック剤によって処理され、その後、例えばペプチドが天然構造へと再折り畳むような適切な割合、ｐＨ、及び温度において、還元及び酸化型ジチオスレイトール又はグルタチオンを含有する酸化還元緩衝液によって処理される。
【００４９】
ペプチドが組み替えＤＮＡ技術によって調製されない場合は、ペプチドは、一般的に、Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85: 2149(1963)に記載されているような固相合成法によって調製されるが、当該技術分野において周知である他の同等な化学合成法も使用可能である。固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適合する樹脂と連結することによってＣ末端から開始する。そのような開始物質は、α−アミノ基が保護されたアミノ酸をクロロメチル化された樹脂又はヒドロキシメチル化された樹脂にへエステル結合すること、又はＢＨＡ樹脂或いはＭＢＨＡ樹脂へアミド結合することによって調製が可能である。ヒドロキシメチル化樹脂の調製方法は、Bodansky等., Chem.Ind.(London), 38: 1597-1598(1966)に記載されている。クロロメチル化樹脂は、BioRad Laboratories, Richmond, CA 及び Lab. system, Inc.より入手可能である。そのような樹脂の調製方法は、Stwart等., "Sold Phase Peptide Synthesis"(Freeman & Co., San Francisco 1969), 第１章, pp.1-6 に記載されている。ＢＨＡ及びＭＢＨＡ樹脂担体は、商業的に入手可能で、一般的には、合成された所望のポリペプチドが、Ｃ末端に置換されていないアミドを有している場合のみに使用される。
【００５０】
アミノ酸は、ペプチド結合の形成に関する技術分野のにおいて周知の技術を使用することによりペプチド鎖と連結される。一つの方法は、カルボキシル基のペプチド断片の遊離Ｎ末端アミノ基との反応をさらに受けやすくする誘導体へとアミノ酸を変換することを含む。例えば、アミノ酸は、保護されたアミノ酸のクロロギ酸エチル、クロロギ酸フェニル、ｓｅｃ−クロロギ酸ブチル、クロロギ酸イソブチル、塩化ピバロイル、又は類似の酸塩化物との反応によって混合無水酸化物への変換が可能である。他の選択としては、アミノ酸は、２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、又はエステル型の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの活性型エステルへ変換へ可能である。
その他のカップリング法は、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド又はＮ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミドなどの適したカップリング剤を使用することを含む。他のカップリング剤で、当該技術に熟練している者に明らかなものは、E.Gross & J.Meienhofer, The Peptide: Analysis, Structure, Biology, Vol.I: Major Method of Peptide Bond Formation(Academic Press, New York, 1979)に記載されている。
【００５１】
ペプチド合成に使用される各々のアミノ酸のα−アミノ酸基は、側鎖がそれらの活性α−アミノ機能に関与することを防ぐ為に、カップリング反応中は保護されるべきことが認識されなければならない。あるアミノ酸が反応性の側鎖機能基（例えば、メルカプト(スルフヒドリル）、アミノ、カルボキシ、及び水酸基（ヒドロキシ））を有し、そのような機能基は、初期とそれに続くカップリング段階において、適した保護基によって化学反応から同じく保護されなければならないことも認識されなければならない。当該技術分野で知られている適した保護基は、Gross & .Meienhofer, The Peptide: Analysis, Structure, Biology, Vol.3:" Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis"(Academic Press, New York, 1981)に記載されている。
【００５２】
ペプチド合成に使用される特定の側鎖保護基の選択では、次の一般的規則が順守される。
α−アミノ保護基は（ａ）カップリング反応が用いられている条件下においては、α−アミノ機能を不活性にする、（ｂ）側鎖保護基を除かない及びペプチド断片の構造を改変しない条件下においては、カップリング反応後は容易に除去可能でなけれならない、（ｃ）カップリング直前の活性化においては、ラセミ化の可能性を除去しなければならない。側鎖保護基は（ａ）カップリング反応が用いられている条件下においては、側鎖機能基を不活性にする、（ｂ）α−アミノ保護基を除去の際に用いられている条件下では、安定でなけれならない、（ｃ）ペプチド鎖の構造を改変しない条件下では、所望のアミノ酸ペプチドの完成時には容易に除去可能でなければならない。
【００５３】
ペプチド合成に有用な保護基が、それらの除去の為に使用される薬剤との反応性によって変わることは、当該技術分野に熟練した者には明らかなことである。例えば、トリフェニルメチル及び２−（ｐ−ビフェニニル）イソプロピキシルカルボニルのようなある保護基は、温和な酸性の条件においては、非常に弱くそして開裂する可能性がある。ｔ−ブチルロキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ−アミロキシカルボニル、アダマンチル−オキシカルボニル、及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルのような他の保護基は、不安定とは言えず、トリフロオロ酢酸塩、塩酸、又は酢酸中の三フッ化ホウ素などの中程度の強酸性をそれらの除去の為に必要とする。さらには、ベンゾイルオキシカルボニル（ＣＢＺ又はＺ）、ハロベンゾイルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンゾイルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、及びイソプロピルオキシカルボニルなどの他の保護基は、やはり不安定とは言えず、フッ化水素、臭化水素、又はトリフルオロ酢酸中のホウ化トリフルオロ酢酸などの強酸をそれらの除去の為に必要とする。
有用なアミノ酸保護基の種類は：
【００５４】
（１）α-アミノ酸基については、（ａ）芳香族ウレタン型保護基、例えばフルオレニルメチルカルボニル（ＦＭＯＣ）ＣＢＺ、及び置換されたＣＢＺ、例えばｐ-クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ-６-ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ-ブロモベンジルカルボニル及びｐ-メトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ-クロロベンジルオキシカルボニル、２,４-ジクロロベンジルオキシカルボニル、２,６-ジクロロベンジルオキシカルボニルなど；（ｂ）脂肪族ウレタン型保護基、例えばＢＯＣ、ｔ-アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２-(ｐ-ビフェニリル)-イソプロピルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルなど；（ｃ）シクロアルキルウレタン型保護基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びシクロへキシルオキシカルボニル；及び（ｄ）アリールカルボニル。好ましいα-アミノ保護基はＢＯＣ及びＦＭＯＣである。
（２）Ｌｙｓに存在する側鎖アミノ基については、保護は、ＢＯＣ、ｐ-クロロベンジルオキシカルボニル等といった上記（１）に述べた任意の基によってなされる。
（３）Ａｒｇのグアニジド基については、保護は、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、アダマンチルオキシカルボニル、２,２,５,７,８-ペンタメチルクロマン-６-スルホニル又は２,３,６-トリメチル-４-メトキシフェニルスルホニル、又はＢＯＣによってなされる。
（４）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒのヒドロキシル基については、保護は、例えば、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、例えばｔ-ブチル；ベンジル（ＢＺＬ）；置換ＢＺＬ、例えばｐ-メトキシベンジル、ｐ-ニトロベンジル、ｐ-クロロベンジル、ｏ-クロロベンジル、及び２,６-ジクロロベンジル。
（５）Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシル基については、保護は、例えば、ＢＺＬ、ｔ-ブチル、シクロへキシル、シクロペンチルなどの基を用いたエステル化によってなされる。
（６）Ｈｉｓのイミダゾール窒素については、トシル部が好ましく使用される。
（７）Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基については、テトラヒドロピラニル、tert-ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４-ブロモベンジル、又は２,６-ジクロロベンジルなどの保護基が好ましく使用される。好ましい保護基は２,６-ジクロロベンジルである。
（８）Ａｓｎ又はＧｌｎの側鎖アミノ基については、キサンチル（Ｘａｎ）が好ましく用いられる。
（９）Ｍｅｔについては、アミノ酸は好ましくは保護せずに残す。
（１０）Ｃｙｓのチオ基については、ｐ-メトキシベンジルが典型的に用いられる。
【００５５】
Ｃ-末端アミノ酸、例えばＬｙｓは、Ｎ-アミノ位置において適切に選択された保護基、Ｌｙｓの場合はＢＯＣによって保護される。ＢＯＣ-Ｌｙｓ-ＯＨは、最初にベンジルヒドリルアミン又はクロロメチル化樹脂に、Horiki等, Chemistry Letters, 165-168 (1978)に記載された方法に従って又はイソプロピルカルボジイミドを用いて約２５℃で２時間攪拌しながら結合させる。ＢＯＣ保護アミノ酸の樹脂支持体への結合に続いて、α-アミノ酸保護基を、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はＴＦＡ単品を用いるなどして除去する。脱保護は、約０℃から室温までの温度で実施する。他の標準的な開裂試薬、例えばジオキサン中のＨＣｌ、及び特定のα-アミノ保護基の除去条件は文献に記載されている。
【００５６】
α-アミノ保護基の除去の後、残ったα-アミノ及び側鎖保護アミノ酸を望まれる順序で段階的に結合させる。合成において各アミノ酸を別々に添加する代わりに、固相合成機に添加する前に互いに結合させてよいものもある。適当なカップリング試薬は当業者の技量の範囲内である。カップリング試薬として特に好ましいのは、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジイミドである。
各保護アミノ酸又はアミノ酸配列は固相反応器に過剰に導入し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はＣＨ２Ｃｌ２又はそれらの混合物の媒体中でカップリングを適切に実施させる。不完全なカップリングが生じた場合、次のアミノ酸のカップリングに先立つＮ-アミノ保護基を除去する前にカップリング方法を繰り返す。合成の各段階でのカップリング反応の成功を監視してもよい。合成を監視する好ましい方法は、Kaiser等, Anal. Biochem., 34: 595 (1970)に記載されたニンヒドリン反応である。カップリング反応は、周知の方法、例えばBIOSEARCH 9500(商品名)ペプチド合成機を使用して自動的に実施できる。
【００５７】
所望のペプチド配列が完成したら、保護ペプチドを樹脂支持体から切断し、全ての保護基を除去しなければならない。切断反応及び保護基の除去は、同時に又は段階的に好ましく達成される。樹脂支持体がクロロメチル化ポリスチレン樹脂である場合、ペプチドを樹脂に繋留している結合は、Ｃ末端残基の遊離カルボキシル基と樹脂マトリクス上に存在する多数のクロロメチル基の一つの間のエステル結合である。繋留結合は、エステル結合を切断でき樹脂マトリクスを透過できることが知られた試薬によって切断できる。
【００５８】
一つの特に便利な方法は、液体無水フッ化水素での処理による。この試薬はペプチドを樹脂から切断するだけでなく、全ての保護基を除去するであろう。従って、この試薬を使用することは、完全に保護されたペプチドを直接に生じる。クロロメチル化樹脂を使用した場合、フッ化水素処理は遊離のペプチド酸の形成をもたらす。ベンズヒドリルアミン樹脂を使用した場合、フッ化水素処理により直接に遊離のペプチドアミンとなる。アニソール及びジメチルスルホキシドの存在下での０℃で１時間のフッ化水素との反応は、同時に側鎖保護基を除去し、樹脂からペプチドを解放する。
保護基を除去することなくペプチドを切断することが望まれる場合、保護ペプチド−樹脂にメタノール分解を施して、Ｃ-末端カルボキシル基がメチル化された保護ペプチドを生成させることができる。このメチルエステルは、次いで、温和なアルカリ条件下で遊離のＣ-末端カルボキシル基を与える。次いで、ペプチド鎖上の保護基を液体フッ化水素などの強酸で処理することにより除去する。メタノール分解についての特に有用な技術は、Moore等, Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp., M. Goodman及びJ. Meinhofer, 編, (John Wiley, N.Y., 1977), p. 518-521のものであり、そこでは保護ペプチド−樹脂がクラウンエーテルの存在下でメタノール及びシアン化カリウムで処理される。
【００５９】
クロロメチル化樹脂を使用した場合に保護されたペプチドを樹脂から切断する他の方法は、加アンモニア分解又はヒドラジンでの処理である。必要ならば、得られるC-末端アミド又はヒドラジドは加水分解して遊離のＣ-末端カルボキシル部とでき、保護基は従来技術により除去できる。
また、Ｎ-末端α-アミノ基に存在する保護基も、保護ペプチドが支持体から切断される前又は後に優先的に除去してよいと認められる。
本発明のポリペプチドの精製は、典型的には従来の手法、例えば分離用ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣを含む）又は他の周知のクロマトグラフィ技術、例えばゲル浸透、イオン交換、分配クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（モノクローナル抗体カラムを含む）、又は向流分配によって達成される。
【００６０】
本発明のペプチドは、重合によって安定化させてもよい。これは、モノマー鎖を多官能性架橋試薬で直接的に、又は多官能性ポリマーを介して間接的に架橋させることにより達成される。通常は、２つの実質的に同一のポリペプチドが、二官能性架橋試薬を用いてそれらのＣ-又はＮ-末端において架橋する。試薬は、末端アミノ及び／又はカルボキシル基を架橋するために使用される。一般に、両末端カルボキシル基又は両末端アミノ基が互いに架橋するが、適切な架橋試薬を選択することにより、一方のポリペプチドのアルファアミノが他方のポリペプチドの末端カルボキシル基と架橋する。好ましくは、ポリペプチドはそれらのＣ-末端においてシステインで置換されている。この分野で良く知られた条件下で、末端システイン間でジスルフィド結合が形成され、それによりポリペプチド鎖が架橋される。例えば、ジスルフィド架橋は、遊離のシステインの金属触媒酸化により又は適切に修飾されたシステイン残基の求核置換によって便利に形成される。架橋試薬の選択は、ポリペプチドに存在するアミノ酸の反応性側鎖の個性に依存するであろう。例えば、ジスルフィド架橋は、システインがポリペプチドのＣ-末端以外のさらなる部位に存在する場合には好ましくないであろう。また、この範囲には、メチレン架橋で架橋したペプチドも包含される。
【００６１】
Ｎ-末端アミノ及びＣー末端カルボキシル基以外の、ペプチド上の好適な架橋部位は、リジン残基上に見られるイプシロンアミノ基、並びにペプチドの内部残基又はフランキング配列に導入された残基の側鎖に位置するアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル及びヒドロキシル基を含む。外部から添加された架橋試薬を介する架橋は、例えば、当業者に馴染み深い多くの試薬を用いて、例えば、ポリペプチドのカルボジイミド処理を介して適当に達成される。好適な多官能性（通常は二官能性）架橋試薬の他の例は文献に見いだされる。
本発明のペプチドは、環化によって立体配置的に安定化させてもよい。ペプチドは通常、一のペプチドの−及びＣ-末端ドメインを本発明の他のペプチドの対応するドメインに共有結合させることにより環化され、２又はそれ以上の反復ペプチド配列を含み、各反復ペプチドが実質的に同じ配列を有するシクロ-オリゴマーを形成する。さらに、環化したペプチド（シクロ-オリゴマー又はシクロ-モノマーのいずれか）は、架橋して１−３の環状構造を形成し、その中には２から６のペプチドが含まれる。ペプチドは好ましくはα-アミノ及び主鎖カルボキシル基（頭部から尾部）を介して共有結合せず、−及びＣ-末端ドメインに位置する残基の側鎖を介して架橋する。よって結合部位は一般に残基の側鎖間になるであろう。
【００６２】
ここで考慮されるようなモノ-又はポリ環化ペプチドを調製するために、多くの好適な方法自体は知られている。Ｌｙｓ／Ａｓｐ環化は、Ｌｙｓ／ＡｓｐについてＦｍｏｃ／９-フルオレニルメチル（ＯＦｍ）側鎖保護を持つ固相支持体上でＮａ-Ｂｏｃ-アミノ酸を用いて達成され；この方法は、環化に続くピペリジン処理によって完了する。
Ｇｌｕ及びＬｙｓ側鎖も、環状又は二環状ペプチドの調製において架橋され；このペプチドはｐ-メチルベンズヒドリルアミン樹脂上の固相化学によって合成される。ペプチドは樹脂から切断されて脱保護される。環状ペプチドは、希釈メチルホルムアミド中のジフェニルホスホリルアジドを用いて形成される。これに代わる方法については、Schiller等, Peptide Protein Res., 25: 171-177 (1985)を参照のこと。米国特許第4,547,489号参照。
【００６３】
ジスルフィド架橋又は環化されたペプチドは従来の方法により生成される。Pelton等（J. Med. Chem., 29: 2370-2375 (1986)）の方法は、シクロ-モノマーの調製についてPelton等に記載された希釈反応混合物よりも濃厚な溶液中で反応を実施することにより多くの割合でシクロ-オリゴマーが生成されることを除いて好ましい。同じ化学は、ダイマー又はシクロ-オリゴマー又はシクロ-モノマーの合成に有用である。また有用なのはチオメチレン架橋である。Lebl及びHruby, Tetrahedron Letters, 25: 2067-2068 (1984)。また、Cody等, J. Med. Chem., 28: 583 (1985)参照。
望ましい環状又は重合性ポリペプチドは、ゲル濾過に次ぐ逆相高圧液体クロマトグラフィ又は他の従来の手法により精製される。ペプチドは滅菌濾過され、従来からの薬理学的に許容される媒体中に処方される。
【００６４】
ここに記載するプロセス必要とされる出発材料は文献で知られているか、又は周知の方法及び周知の出発材料から調製できる。
４つの異なる置換基に結合した炭素原子から生成されたペプチドが不斉の場合、ペプチドはジアステレオマー、エナンチオマー又はそれらの混合物として存在しうる。上記の合成は、出発材料又は中間体としてラセミ化合物、エナンチオマー又はジアステレオマーを用いてもよい。そのような合成から得られるジアステレオマー生成物は、クロマトグラフィ又は結晶化法によって分離しうる。同様に、エナンチオマー混合物は、同様の技術又はこの分野で知られた他の技術によって分離してよい。各不斉炭素原子は、存在する場合は、２つの立体配置Ｒ又はＳの一方でよく、それらともに本発明の範囲内である。
【００６５】
本発明のペプチドは、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下注射或いは注入、又は移植）、経鼻、肺、膣、直腸、舌下、又は投与の局所的方法を含む全ての適切な方法による哺乳類への投与が可能であり、各々の投与方法に適した投薬形態を定式化することができる。具体的なの投与方法は、例えば、ペプチドを使用することによる副作用で感知又は予知されるもの全て、投与されているペプチドの種類、及び治されるべき特定の種類の疾患を含む患者の病歴によって決まる。最も好ましくは、投与は、連続注入（例えば、遅放出装置、又は浸透ポンプ或いは皮膚用パッチ剤のような小型ポンプ）、又は注射（例えば、静脈又は皮下の方法）による。
治療に使用されるペプチドは定式化され、そして良い医療診断、患者個人の臨床状況（特にペプチドによる治療の副作用）、疾患の種類、ペプチドの到達部位、投与方法、投与予定、及び開業医が把握している他の要因を考慮することと一致する方法で投薬される。従って、ここにおける目的の為のペプチドの有効量は、このような考慮によって定められ、量は哺乳類と所望する効果にとって薬の生物学的利用能とならなければならない。
【００６６】
好ましい投与とは、ＩＧＦ−Iの効果を再生するための、約４−８週間に渡る１日に２回の慢性投与である。注射が好ましいが、連続皮下（ＳＣ）注入のための輸液用器具を使用することによる慢性輸液も用いることができる。静脈内嚢溶液も用いることができる。問題の疾患への適切な投与量を選択するための重要な要因は、測定により得られた結果で、糖尿病の場合では、例えば、標準範囲を概算するための血中ブドウ糖の減少、又は医師によって判断される疾患の治療方法を評価する他の基準である。
一般的な考え方としては、一服の非経口投与された薬学的に有効なペプチドの量は、用量反応曲線によって測定可能な範囲にある。例えば、ＩＧＦＢＰに結合したＩＧＦ又は血中ＩＧＦは、服用を決めるための治療を受けている哺乳類の体液によって測定が可能である。代替方法としては、増加するペプチドを患者へ投与し、ＩＧＦ−I及びＩＧＦ−IIのために患者の血清レベルを調べることができる。下記の実施例３にある、ヒト血清中のＩＧＦＢＰをＩＧＦ−Iトレーサーに置換することを参照のこと。
特に、ペプチドの適切な服用を決める一つの方法は、体又は血中などの生物的体液中のＩＧＦレベルの測定を伴う。それらを測定する方法は、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡを含むすべての方法によっておこなうことが可能である。ＩＧＦレベルを測定した後、単回投与又は複数回投与の使用により体液はペプチドと接触する。この接触段階の後、ＩＧＦレベルは体液中で再測定される。体液中のＩＧＦレベルが所望する効力が生じるための十分な量によって低下した場合、その場合は、その分子の服用は最高の効力が生じるように調製可能である。この方法は、インビトロ又はインビボで実行できる。好ましくは、この方法は、インビボで実行される、すなわち体液が哺乳類から抽出され、ＩＧＦレベルが測定された後、ここでのポリペプチドは単回又は複数回投与の使用によって投与され（すなわち、接触回数は哺乳類への投与によって達成される）、そしてＩＧＦレベルは、哺乳類から抽出された体液から測定される。
【００６７】
服用を決定するもう一つの方法は、ペプチドへの抗体又はＬＩＦＡフォーマットにおけるもう一つのペプチドの検出方法を使用することである。これは、ＩＧＦＢＰへ結合している内因性又は外因性ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰへ結合しているペプチドの量の検出を可能にする。
服用を決めるもう一つの方法は、血中の“遊離”又は活性ＩＧＦのレベルを測定することであろう。ある用途においては、“遊離”ＩＧＦのレベルは、効力及び有効服用量又は服用の適切な指標である。
【００６８】
例えば、一つの方法は、ＩＧＦ結合タンパク質に結合した内因性又は外因性ＩＧＦ、又はここにおけるペプチドの総量の検出、或いは生物体液中の非結合ＩＧＦレベルの検出することが記載されている。この方法は、次を含む：
（ａ）体液を１）ペプチドの存在下において、ＩＧＦ結合部位がＩＧＦ結合タンパク質との結合に利用可能な状態でペプチド上に残存するような固相担体へ付着したポリペプチド（例えば、ペプチド上のエピトープの第一抗体）に対して特異的なペプチドを検出する媒介と接触させ、その結果によって媒介とＩＧＦ結合タンパク質間に複合体を形成する；及び２）一定の期間中に、ＩＧＦ結合タンパク質上の全ての利用可能なＩＧＦ結合部位を飽和するの十分なペプチドと接触させ、その結果によって飽和複合体を形成する；
（ｂ）ペプチドがＩＧＦ結合タンパク質と結合している時に、結合に利用可能なＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ上のエピトープに特異的な第二抗体のような）へ特異的な検出可能なラベルされた第二の媒介と飽和複合体を接触させる；及び
（ｃ）生物体液中のＩＧＦＢＰの指標として結合しているラベル化媒介の総量、及びそれから体液中に存在する結合したペプチドの総量、ＩＧＦ結合タンパク質、結合したＩＧＦ，又は活性ＩＧＦの指標として結合しているラベル化媒介の総量の数量的な分析。
前記の方法により投薬量を決定すると、一般的に、使用するペプチドの総量の見積もりが可能である、すなわち、前記に記したように、この方法はかなりの治療上の自由裁量が前提としているが、患者の体重のｋｇに基づいて、約１０μｇ／ｋｇ／日から２００μｇ／ｋｇ／日が使用可能である。例えば、慢性腎疾患の治療においては、一日の投与量は、好ましくは約１０から１６０μｇ／ｋｇ、より好ましくは２０から１００μｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは約２５から７５μｇ／ｋｇである。
【００６９】
さらなる方法が、特定のＩＧＦＢＰ上のＩＧＦの分布を見積もるために提供されている、例えば、ＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３に関してＬＩＦＡフォーマットを使用ことである。
ペプチドは、徐放性システムによって適正に投与される。徐放性組成物の適正な例は、造形品の形の半浸透性ポリマー基質、例えばフイルム、又はマイクロカプセルを含む。半浸透性ポリマー基質は、ポリ乳酸（U.S. Pat. No. 3,773,919. EP58, 481）、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタミン酸の共重合体（Sidman等., Biopolymers, 22,547-556(1983)）、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリル酸)(Langer等., J.Biomed.Mater.Res., 15:167-277(1981), 及びLanger, Chem.Tech., 12: 98-105(1982))、エチレンビニル酢酸（Langer等., 同上）又はポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)を含む。徐放性組成物は、また、リポソーム包含ペプチドを含む。ペプチドを包含するリポソームは、それ自体で知られている方法で調整される：DE 3,218,121；Epstein等., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692(1985)；Hwang等., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88, 046；EP 143,949；EP 142,641；Japanese Pat. Appln. 83-118008；U.S. Pat. Nos. 4,485,045 及び4,544,545；及びEP 102,324。通常、リポソームは脂質含有量が約３０モルパーセントコレステロールを越える小さな単層形(約２００から８００オームストロング）で、その選択された部分は最も効果的な治療のために調節されている。
【００７０】
長い寿命を有するポリエチレングリコール化されたペプチドを、例えば、１９９５年１１月３０日に公開されたWO95/32003に記載の共役技術に基づいて利用することも可能である。
非経口投与のためには、一実施態様は、ペプチドは、一般的に、製薬的、或いは非経口的に許容可能な担体、すなわち使用投薬量及び濃度が投与対象者にとって無毒、そして製剤中の他の成分と共存可能な担体と供に所望する純度でそれぞれを単位投与量の注射可能な形態(溶液、懸濁液、又は乳濁液)の中で混合することによって製剤化される。例えば、製剤は、好ましくは酸化剤、及びポリペプチドに対して有害だと知られている他のペプチドを含まない。
一般的に、製剤は、ペプチドを均等且つ密接に液体担体又は細粒固体担体、或いは両方と接触させることによって調製される。そして、必要ならば、産物は所望の製剤形態へ成形される。好ましくは、担体は非経口担体で、さらに好ましくは、溶液は、受給者の血液と等張である。そのような担体媒介物の例としては、水、生理食塩水、リンガー液、緩衝化された溶液、デキストロース液を含む。非溶液媒介物、不揮発性油及びオレイン酸エチルなどもここでは有用である。
【００７１】
担体は、等張性及び化学的安定性を高める物質のような微量の添加物を適当に含んでいる。このような物質は、使用投与量及び濃度において投与対象者へは無毒であり、リン酸、クエン酸、コハク酸などの緩衝液、及び有機酸とそれらの塩類；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量(１０残基より少ない)ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又はイムノグロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、又はアルギニンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、及びセルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ(エチレンジアミン4酢酸)などのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン；ポリソルベート、poloamers、又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)；及び／又は塩類、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２などを含む。
ペプチドは、一般的に、これら媒介物中でｐＨ４．５又はおよそ４．５から８で製剤化される。前記の賦形剤、担体、又は安定化剤のいくつかの使用が、塩類やペプチドを形成する結果となることは理解される。最終調製は、安定な液体又は凍結乾燥固形物となる。
【００７２】
製薬的組成物としてのペプチドの典型的な製剤形態が、下記に論じられている。一般に受け入れている製薬的な慣習を必要とするように、遊離酸又は塩基の形或いは製薬的に許容可能な塩としての、およそ０．５から５００ｍｇのペプチド又はペプチドの混合物は、製薬的に許容可能な媒介物、担体、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香料、などと混合される。これら組成物の活性成分の総量はこのようなので、示唆された範囲内の適正な投薬量が得られる。
治療投与に使用されるペプチドは、無菌でなければならない。無菌性は、無菌濾過膜(例えば、０．２ミクロンの膜)による濾過によって容易に達成する。一般的に、治療組成物は、例えば静脈注射用の溶液袋、又は皮下注射針により穴をあけることが可能な栓を有するバイアルなど、無菌引き込み口を有する容器へ配置される。
【００７３】
通常、ペプチドは、例えば、封管されたアンプル又はバイアルに、水溶液又は再構成用の凍結乾燥製剤として、単一又は多投与量容器に貯蔵される。凍結乾燥製剤の例としては、１０-ｍＬバイアルを５ｍＬの無菌濾過済みの１％(Ｗ／Ｖ)ペプチド水溶液で満たし、この混合物を凍結乾燥する。注入液は、静菌性の注射用水を使用する凍結乾燥ペプチドの再構成によって調製する。
ここにおけるペプチドと、血中ＩＧＦを増加させる又はペプチドの効果を促進する一つ或いはさらに他の適正な試薬による併用療法も、本発明の一部である。一般的に、これらの試薬は、ここにおけるペプチドが生成ＩＧＦを放出することを可能にする。例えば、ペプチドとの組み合わせでは、他の活性分子を投与することが望ましい。例えば、消耗又は異化状態のためには、ペプチドはＭＥＧＡＳＥＴＭのような食欲促進剤と共に投与することが可能である。
その上、ペプチドは適正に投与され、投与のための受容体又は抗体或いは抗体断片と結合する。
さらなる併用療法は、ヒト成長ホルモン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−５のような成長ホルモンを含む。
【００７４】
高血糖性疾患の治療では、ペプチドは、スルホニル尿素又は全ての種類のインシュリンのような高血糖剤の有効量とと共に適切に投与される。高血糖剤は、非経口、鼻腔内、経口、又は他の全ての効果的なルートを含む全ての適切な手法によって哺乳類へ投与される。最も好ましくは、投与は経口ルートである。例えば、アップジョンより１．２５、２．５、５ｍｇ錠剤濃度で市販されているＭＩＣＲＯＮＡＳＥＴＭ錠剤(グリブリド)は、経口投与に適している。この疾患に処方されるII型糖尿病用の通常継続投与量は、一般的には、１．２５から２０ｍｇ／日又はおよそその範囲で、単回投与又は適正と判断される一日当たりの分割投与で与えられる(Physician's Desk Reference, 2563-2565(1995))。処方に使用可能なグリブリドを基礎とする錠剤の他の例は、ＧＬＹＮＡＳＥＴＭ商標薬(アップジョン)及びＤＩＡＢＥＴＡＴＭ商標薬(ヘキスト-ルセル)を含む。ＧＬＵＣＯＴＲＯＬＴＭ(プラット)は、グリピシド(１-シクロヘキサン-３-［ｐ-[２-(５-メチルピラジンカルボキシアミド)エチル]フェニル]スルフォニル]尿素)錠剤の登録商標で、５及び１０ｍｇ効力の両方が入手可能で、さらには食事療法に続き低血糖症の治療を必要とするII型糖尿病患者、又は他のスルホニル尿素へ反応しなくなった患者へ処方される(Physician's Desk Reference, 1902-1903(1995))。ビグアナイド剤(メトホルミン及びフェンホルミン)又はtroglitozoneのようなスルホニル尿素以外の低血糖剤、或いはインシュリンの作用へ影響する他の薬剤の使用も可能である。
【００７５】
うっ血性心臓疾患の治療においては、体血管抵抗の低減及び循環性うっ血の軽減に対して、ＡＣＥ阻害剤がここにおけるペプチドとともに有用である可能性がある。ＡＣＥ阻害剤は、これら登録商標で命名されたものには限定されないが、Accupril(登録商標、quinapril)、Altrace(登録商標、ramipril)、Capoten(登録商標、captopril)、Lotensin(登録商標、benazepril)、Monopril(登録商標、fosinopril)、Prinivil(登録商標、lisinopril)、Vasotec(登録商標、enalapril)、及びZestril(登録商標、lisinopril)を含む。ＡＣＥ阻害剤の一例は、登録商標Capoten(登録商標）で売られている。無商標ではcaptoprilとなるこのＡＣＥ阻害剤は、化学的には１-[(２Ｓ)-３-メルカプト-２-メチルプロピオニル]-Ｌ-プロリンと表される。
腎疾患では、ペプチドは、例えば心房性ナトリウム利尿ペプチド(ＡＮＰ）、ＡＮＰ類似体、又は受容体活性を有する或いは有しないそれの全ての変異体、urodilatin、ヒトＢ型ナトリウム利尿性ペプチド(ＢＮＰ）、アンジオテンシン受容体アンタゴニスト、バソプレシン及びその類似体のような電解質の再吸収と保持を促進する腎活性分子、及び抗体又はペプチドアンタゴニストのようなエンドセリンアンタゴニストとともに適切に投与される。一例は、ＢＱ−１２３(Ihara等., Life Science, 50: 247-250(1992); JP 51-94254A １９９３年８月３日公開; Webb等., Biochem. Biophys. Res. Comm., 185: 887-892(1992))で、エンドセリンＡ受容体の潜在的及び特異的遮断剤であり、エンドセリン−１、ＣＴ−１ではなく、マウスＬＩＦ、又はフェニレフリンによって誘導される肥大性活性のみを遮断する環状ペンタペプチドである。その他の例は、Ihara等., Biochem. Biophys. Res. Comm., 178: 132-137(1991)によって記載されているＢＱ−１２３の親化合物である。さらなる例は、EP 647,236；EP647,449；EP633,259(phenyl-sulfonyl-amino-pyrimidine derivaties)；EP601,386(sulfonamide compounds)；U.S. Pat. No.5,292,740(phenylsulfonylamidopyrimidines)；及びU.S. Pat.No. 5,270,313(phenyl-sulfonyl-aminopyrimidine derivaties)に記載のものを含む。その上、アンジオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)阻害剤は、腎疾患のＩＧＦ−I治療に関連して有益である。
【００７６】
さらに、食事及び運動療法などのＩＧＦの状況を操作する他の方法も本発明の一部としての併用療法と考えられている。例えば、ペプチドを、ケト酸補助剤などの栄養補助剤との組み合わせる又は組み合わせないＥＮＳＵＲＥＴＭなどの高カロリーの食事又は食物とともに投与できる。
ここにおける発明は、ペプチドをコードする核酸を使用する哺乳類のための遺伝子治療を使用することも意図している。一般的には、遺伝子治療は、哺乳類のＩＧＦレベルを増加(過剰発現)させるために使用される。ペプチドをコードする核酸は、この目的のために使用される。一度、アミノ酸配列が明らかになると、遺伝子コードの縮重を使用することによって幾つかの核酸分子を作ること、及びその中から遺伝子治療ヘ使用するものを選択することが可能である。
遺伝子治療の目的の為に、核酸(選択的にベクターに含まれる)を患者の細胞へ導入する二つの主要な方法がある：インビボ及びエキソビボである。インビボデリバリーにおいては、普通は、核酸は直接にプチドを必要とする患者の部位ヘ注入される。エキソビボの治療においては、患者の細胞が取り出され、核酸はこれら単離された細胞へ導入され、そして改良された細胞は患者へ直接又は、例えば、患者へ移植される多孔質膜によってカプセル化される。U.S. Patent Nos. 4,892,538 及び5,283,187を参照のこと。
【００７７】
生細胞へ核酸を導入することを可能にする多様な技術がある。技術は、核酸をインビトロで培養細胞へ転移するのか、又はインビボで意図された細胞へ転移するのかによって変わる。インビトロで哺乳類細胞へ核酸を転移するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション(電気穿孔法)、マイクロインジェクション(微量注入法)、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。遺伝子のエキソビボ輸送に頻繁に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
最近、好まれるインビボの核酸転移技術は、ウイルスベクターによるトランスフェクション(アデノウイルス、,単純疱疹Iウイルス、又はアデノ随伴ウイルスなど)及び脂質を基礎とするシステム(遺伝子の脂質媒介転移に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌ、など)である。ある状況では、細胞表層膜又は標的細胞ヘ特異的な抗体、標的細胞上の受容体へのリガンドなどの標的細胞を標的とする薬剤を核酸のソースへ供給することが望ましい。リポソームが使用された場合は、エンドサイトーシス(飲食作用)と関連している細胞表層膜タンパク質と結合するタンパク質は、標的化及び／又は取り込みを容易にすることに使用される、例えば、キャプシドタンパク質又はそれの断片、特定の細胞の向性、サイクリングで内部移行を受けるタンパク質への抗体、及び細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を増進するタンパク質。受容体媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等., J.Biol.Chem., 262:4429-4432(1987)；及びWanger等., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87:3410-3414(1990)に記載されている。最近、知られている遺伝子標識及び遺伝子治療の手順は、Anderson等., Science,256:808-813(1992)を参照のこと。WO93/25673及びそれに引用されている参考文献も参照のこと。
【００７８】
本発明のために、キットも意図されている。典型的なキットは、製薬的に許容可能な緩衝液にあるペプチドを含むペプチド製剤の為の容器、好ましくはバイアル、及び使用者へ製薬的薬剤を哺乳類のＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を特徴とする疾患の治療へ使用することを指示した製品折り込み広告又はラベルのような取扱い説明書を含む。キットは、選択的に、腎疾患のための腎活性分子のような組合せ分子のための容器、好ましくはバイアルを含む。
本発明は、下記の実施例の参照によってさらに十分に理解できる。しかし、それらは、本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。ここにおいて言及された全ての文献及び特許の引用文は、参考文献によって明白に含まれている。
【００７９】
実施例１
ＩＧＦ−Ｉ及び構造変異体のアラニン−スキャンニング突然変異誘発
序：
アラニン−スキャンニング突然変異誘発法（上掲のCunningham及びWells）を用いてＩＧＦ−Ｉの各側鎖のβ炭素を越えた部分を取り除いた。ついでＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３に対するペプチドの結合の自由エネルギーへのこれらの原子の寄与を競合ファージＥＬＩＳＡ法によって検査した。このアッセイでは、ＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３を用いてＩＧＦ−ファージ変異体がＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３被覆免疫吸着プレートへ結合するのを阻害する。結合タンパク質の滴定列から結合性（ＩＣ５０）を計算することができる。幾つかの変異体はまたＢＩＡＣＯＲＥＴＭアッセイにおける直接結合性についても調べた。
実施例では、通常のαアミノ酸は、中間体と最終生成物を指すとき、標準的な一文字又は三文字アミノ酸コードによって記述される。通常のαアミノ酸とはｍＲＮＡの指示下でタンパク質内に導入されるアミノ酸を意味する。標準的な略語はメルクインデクス、１０版、pp Misc-2−Misc-3に列挙されている。特に断らない限り、通常のαアミノ酸はα炭素原子において自然のもしくは「Ｌ」立体配置を有している。「Ｄ」がコードの先にくる場合は、これは通常のαアミノ酸とは反対の鏡像異性体を表している。ノルロイシン（Nle）及びオルニチン（Orn）のような改変された又は普通でないαアミノ酸は米国特許商標庁オフィシャルガゼット１１１４ＴＭＯＧ、１９９０年５月１５日に記載されているように示した。以下に記載するＩＧＦ変異体を用いた実験の結果に基づいて、ここに請求されたタイプの分子が治療される患者における活性ＩＧＦ量を増加させるであろうと予測される。
【００８０】
材料と方法：
ファージミドベクターの作成と突然変異誘発
成熟ヒトＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を、ＰＣＲプライマー5'-AGCTGCTTTGATATGCATCTCCCGAAACTCTGTGCGGT-3'（配列番号：４）及び5'-GAGCGATCTGGGTCTAGACAGATTTAGCGGGTTTCAG-3'（配列番号：５）を用いてｐＢＫＩＧＦ２Ｂ（米国特許第５３４２７６３号）から増幅した。得られた断片をＮｓｉＩ及びＸｂａＩで切断し、先にＮｓｉＩ及びＸｂａＩで消化させたｐＨ０７５３中に結合させた。ｐＨ０７５３はｐｈＧＨａｍ−ｇ３の派生体（Lowman等, Biochemistry, 30: 10832-10838 (1991)）であり、アルカリホスファターゼプロモータ（ＰｈｏＡ）の更なるＸｂａＩ部位がオリゴヌクレオチド5'-AAAAGGGTATGTAGAGGTTGAGGT-3'（配列番号：６）を用いて欠失させられている。ＩＧＦ−１オープンリーディングフレームを含む連結ベクターｐＨ０７５３は、ｐＩＧＦ−ｇ３と命名した。これは、大腸菌バクテリオファージＭ１３由来の遺伝子ＩＩＩタンパク質の断片（残基２４９−４０６）に融合した二重突然変異Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖを有するＩＧＦ−１をコードしている。このＩＧＦＢＰ−１及び−３へのＩＧＦ−Ｉ変異体の結合性は野生型ＩＧＦ−Ｉとは区別できないことが分かった。アラニン突然変異誘発は鋳型として一本鎖プラスミドｐＩＧＦ−ｇ３を用いて実施した（Kunkel等, Methods Enzymol., 204: 125-139 (1991)）。システインとアラニンを除くＩＧＦ−Ｉの全ての残基が個々にアラニンに置換された。得られた作成物をＤＮＡ配列決定によって検証した。
【００８１】
ＩＧＦＢＰ−１及び−３へのファージにディスプレイされたＩＧＦ変異体の結合性（ファージＥＬＩＳＡ）
免疫吸着プレート（Nunc, MAXISOR PTM, ９６ウェル）を、ｐＨ７．２のＰＢＳバッファー中１μｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３を１００μｌ／ウェルで用いて４℃にて一晩かけて被覆した。ついでプレートを室温で２時間の間０．５％のＴＷＥＥＮ２０ＴＭ／ＰＢＳ（また結合バッファーとして使用）で阻害した（ウシ血清アルブミンのようなタンパク質様阻害剤は潜在的なＩＧＦ又はＩＧＦＢＰ汚染を防止するために避けた）。ファージミドベクターで新しく形質転換した大腸菌細胞（XL1-Blue, Stratagene）をＭ１３−ＶＣＳヘルパーファージ（Stratagene）の存在下で５ｍLの２ＹＴ培地（上掲のSambrook等）中で一晩かけて増殖させた。ファージ粒子を収集し、Cabilly, S. (編), Combinatorial Peptide Library Protocols (Humena Press Inc.: Totowa, NJ, 1009), pp.249-264中のLowman, H.B., 「Pharge Dsiplay of Peptide Libraries on Protein Scaffolds」に記載されたようにしてＰＢＳバッファー中に再懸濁させた。ついで、ファージ濃度を基準化し、各変異体に対して０．２−０．４の最大ＥＬＩＳＡシグナルを生じさせた（上掲のCabilly, S. (編)のLowman）。可溶型競合体の３倍連続希釈物を、先に決定した濃度でファージを含む結合バッファー（０．５％のＴＷＥＥＮＴＭ２０／ＰＢＳ）で非吸着マイクロタイタープレート（Nunc, F, ９６ウェル）上に調製した。競合タンパク質の希釈範囲はＩＧＦＢＰ−１に対して５μｍとＩＧＦＢＰ−３に対して５００ｎＭで出発して１０６の規模まで広げた。阻止後、固定化した標的を含むプレートを０．０５％のＴＷＥＥＮＴＭ／ＰＢＳバッファーで洗浄し、ついで室温で１時間の間８０μｌ／ウェルの前もって混合されているファージ−競合体溶液と共にインキュベートした。洗浄後、結合したファージを、０．５％のＴＷＥＥＮＴＭ／ＰＢＳ中に一次ウサギ抗ファージポリクローナル抗体と二次ヤギ抗ウサギモノクローナル抗体−西洋わさびペルオキシダーゼ抱合体を含む溶液を８０μｌ／ウェル用いて検出した。ｏ−フェニレンジアミン（Sigma）とテトラメチルベンジジン（Kirkegaard及びPerry）を色素生産物質として使用し、生成物をそれぞれ４９２及び４５０ｎｍで検出した。ＩＣ５０値は、結合データを基準飽和曲線に一致させることにより決定された（上掲のCabilly, S. (編)のLowman）。各ＩＧＦ−Ｉ変異体の少なくとも二つの個々のクローンが検定された。表Ｉの数は個々に評価されたＩＣ５０値の平均±標準偏差を表している。
【００８２】
ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３の発現と精製
Mortensen等, Endocrinology, 138: 2073-2080 (1997)により記載されているようにして、ヒトＩＧＦＢＰ−１をＣＨＯ細胞中で発現させ、条件培地から精製した。組換えヒトＩＧＦＢＰ−３をまたクローニングし、哺乳動物細胞で発現させた（Wood等, Mol. Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988)）。条件培地からの精製は、ＩＧＦアフィニティーカラム（Martin及びBaxter, J. Biol. Chem., 261:8754-8760 (1986)）を用いて、本質的にＩＧＦＢＰ−１に対して記述された手順に従った。
【００８３】
可溶型ＩＧＦ−Ｉ変異体の発現と精製
プラスミドｐＢＫＩＧＦ２Ｂ（米国特許第５３４２７６３号）はＰｐｈｏＡプロモータの制御下でｌａｍＢのリーダーペプチドに融合したヒト野生型ＩＧＦ−Ｉを発現する。部位特異的突然変異誘発の簡単化のために、ファージｆ１複製起点（F1 ori）をプラスミドｐＢＫＩＧＦ２Ｂ中に導入した。そのために、f1 oriを含む４６６ｂｐのＢａｍＨＩ断片をｐＨ０７５３から切除し（上掲のLowman,1991）、プラスミドｐＢＫＩＧＦ２ＢをＥｃｏＲＩで線形化した。ベクターと断片の双方をクレノー酵素で処理して、平滑末端連結に先立って付着末端制限部位を充填した。Ｍ１３ＶＣＳヘルパーファージの存在下で一本鎖ファージミドＤＮＡをつくり出す能力について正しい作成物を選択した。得られたファージミドベクターをｐＢＫＩＧＦ２Ｂ−ｆ１−ｏｒｉと名付け、Kunkel等, Methods Enzymol., 204: 125-139 (1991)の手順を使用して対象のＩＧＦ−Ｉala−変異体を作成するために鋳型として用いた。突然変異誘発の各工程はＤＮＡ配列決定により確認した。
ＩＧＦ−Ｉ変異体の発現は、ＩＧＦ−Ｉ野生型に対して記述されているようなもの（Joly等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2773-2777 (1998)）であったが、オキシドレダクターゼの一過性の過剰発現が伴わなかった。精製手順は、過去のプロトコールに基づき（Cleland, J. L. (編), Protein Folding In Vivo and In Vitro (American Chemical Society, Washington,DC, 1993), pp.178-188)中の Chang及びSwartz, "Single-Step Solubilization and Folding of IGF-1 Aggregates from Escherichia coli）、僅かに適合化させた。典型的には、６ｇの湿った細胞ペースト（２４時間成長させた２リットルの低ホスフェート培地と等価）を５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．５の２５ｍＭのトリス-ＨＣｌの１５０ｍｌ中に再懸濁させた。細胞をマイクロフルイダイザー（Microfluidics Corp., Newton, MA）中で溶解させ、蓄積したＩＧＦ−Ｉ凝集物を含む屈折粒子を１２０００ｘｇで遠心分離により収集した。屈折粒子を溶解バッファーで２回、１％のＮ−ラウロイル−サルコシン（Sigma）を含む溶解バッファーで２回洗浄して膜タンパク質を抽出し、溶解バッファーで再び２回洗浄した。洗浄した屈折体を、２Mの尿素、１００ｍMのＮａＣｌ、２０％のＭｅＯＨ、及び２ｍＭのＤＴＴを含むｐＨ１０．４の５０ｍＭのＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸；Sigma）バッファー中におよそ２ｍｇ／ｍｌで再懸濁させた。この手順は屈折体の可溶化と続くＩＧＦ−Ｉ変異体の酸化リフォールディングを組み合わせるものである（上掲のChangとSwartz）。室温で３時間後、リフォールディング溶液を、５０ｋＤａの分子量カットオフ性を持つマイクロコンセントレーター膜（Centricon, Amicon）を通して濾過した。殆どの単量体ＩＧＦ−Ｉが溶出液中に回収される一方、より高分子の汚染物は未透過物中に集中していた。この時点で、ＩＧＦ−Ｉ画分は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析から判断したところ、＞９５％の純度であった。ＩＧＦスワップ（二つの非天然ジスルフィドを含む；Hober等, Biochemistry, 31: 1749-1756 (1992)；Miller等, Biochemistry, 32: 5203-5213 (1993)）から正しくジスルフィド結合したＩＧＦ−Ｉを分離するために、リフォールディング溶液を５％の酢酸で酸性化し、４ｍｌ／分でＤｙｎａｍａｘＴＭＣ１８半調製用ＨＰＬＣカラム（Varian；１０．０ｍｍＩＤ）に充填した。バッファーはＨ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（Ａ）及びアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ（Ｂ）であった。ジスルフィド異性体の分離は次の勾配：０−３０％Ｂを２０分、３０−４５％Ｂを６０分を適用して達成された。ＩＧＦ−スワップに対する未変性ＩＧＦ−Ｉの比は各変異体に対して通常は約２：１であり、ＩＧＦ−スワップは未変性ＩＧＦ−Ｉより先の勾配で溶出した。各変異体の分子量は質量分析により検証した。ＨＰＬＣ精製後に、試料を凍結乾燥し、１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４中におよそ１ｍｇ／ｍｌで再構成した。
【００８４】
バイオセンサーによる反応速度測定
ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ変異体の結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ−２０００リアルタイム反応速度相互作用分析システム（Biacore, Inc., Piscataway, NJ）を使用して会合（ｋａ）速度と解離（ｋｄ）速度を測定することにより決定した。カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, BIAcore Inc.）をＥＤＣ（Ｎ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボイミドヒドロクロリド）及びＮＨＳ（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド）で活性化させた。固定化については、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中のＩＧＦ変異体を５０μｇ／ｍｌの濃度でバイオセンサーチップに注入し、およそ４５０−６００ＲＵ（共鳴応答単位）の共有的に結合したタンパク質を生成した。未反応群は１Ｍのエタノールアミンの注入で阻害した。反応速度の測定を、２５℃で２０μｌ／分の流量を用いて、流れるバッファー（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％卵白アルブミン、０．１％アジ化ナトリウム）中ＩＧＦＢＰ−１かＩＧＦＢＰ−３の何れかの２倍の連続希釈物（１μＭで開始）を注入することにより実施した。会合速度（ｋａ）と解離速度（ｋｄ）はＢＩＡＣＯＲＥＴＭ評価ソフトウェア３．０バージョンにおいて１：１のラングミュアー（Langmuir）TM会合モデルを用いて別個に計算した。平行解離定数（ＫＤ）はｋｄ／ｋａとして計算した。
【００８５】
結果
ＩＧＦ−１の一価ファージディスプレイ
ＩＧＦ−Ｉの７０のアミノ酸残基の迅速かつ包括的なアラニンスキャンのために、タンパク質がファージＭ１２の表面に一価的にディスプレイされるかどうかが最初に決定された（Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)）。ファージディスプレイ技術は迅速な一本鎖ＤＮＡ突然変異誘発の利点を、対応するファージ粒子の単なる単離によって、得られた変異体タンパク質の簡単な生成と組み合わせるものである（例えば上掲のCunningham等, 1994）。成熟ヒトＩＧＦ−ＩがＭ１３遺伝子ＩＩＩ産物のカルボキシ末端ドメインに融合されたベクターが作成された。この作成物は大腸菌の細胞膜周辺腔に融合タンパク質を向かわせ、タンパク質の一価ディスプレイを可能にするｓｔＩＩシグナル配列を含んでいる（上掲のBass等；上掲のLowman等, 1991）。クローニングのために、ＩＧＦ−１の最初のアミノ酸と最後のアミノ酸を変えた：得られた変異体Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖは続くアラニンスキャンニング突然変異誘発のための鋳型作成物として使用した。
ＩＧＦ−Ｉ Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖをディスプレイするファージ粒子を単離し、ＩＧＦＢＦに対するその親和性についての結合競合ファージＥＬＩＳＡ法において検定したとき、その実験で決定されたＩＣ５０はＩＧＦＢＰ−１に対しては８．５ｎＭ、ＩＧＦＢＰ−３に対しては０．５ｎＭであった（図．１）。これらの値は野生型ＩＧＦ−Ｉを使用するＢＩＡＣＯＲＥＴＭ実験により決定された解離定数（上掲のHeding等）とよく一致している。放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定された野生型ＩＧＦ−Ｉ親和性は、ＩＧＦＢＰ−１に対して〜２．８ｎＭ、ＩＧＦＢＰ−３に対して〜０．８ｎＭであり、更にファージＥＬＩＳＡ法から導かれたＩＣ５０値を裏付けている。また、ＩＧＦ−Ｉ Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖをディスプレイするファージ粒子は、マイクロタイタープレート上に固定した１１の独立したモノクローナルマウス抗ＩＧＦ−Ｉ抗体によって効率的に捕捉された。これらの結果を併せると、ディスプレイされたＩＧＦ変異体が正しく折り畳まれ、ファージ粒子の表面に接近可能であることが示唆される。
【００８６】
ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３へのＩＧＦ−Ｉ結合のＡｌａ−スキャンニング突然変異誘発
Ｇ１Ｓ−Ａ７０ＶＩＧＦ−Ｉの全ての残基を、４固の未変性アラニン及び６個のシステインを除いて、記述したＧ１Ｓ−Ａ７０ＶＩＧＦ−ＩｇＩＩＩベクターを鋳型として使用して、個々にアラニンで置換した。また、単一変異体Ｓ１Ｇ及びＶ７０Ａ及び野生型ＩＧＦ−Ｉを修復する二重変異体を作成した。これらの作成物の各々が大腸菌において発現され、ファージにディスプレイされた。ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３への結合性に対するＩＣ５０値は図１に示したような競合ファージＥＬＩＳＡ法によって測定した。各変異体の少なくとも二つの異なったクローンを試験した。得られたＩＣ５０値は表１に列挙し、Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖに対する各変異体に対するＩＣ５０の減少又は増加は図２にグラフで表す。
【００８７】
【００８８】
アラニン変異体の大部分はファージＥＬＩＳＡ法においてＩＣ５０値の僅かな変化を生じただけであった。重要なことは、野生型ＩＧＦ−Ｉがバックグラウンドにおいてアラニン置換が実施されたＧ１Ｓ−Ａ７０Ｖと同じ親和性をＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３に対して示したことである。アラニンに変化したときほんの僅かな残基だけが有意な（＞１０倍）親和性の損失を引き起こした：ＩＧＦＢＰ−１結合に対してはＥ３、Ｇ７、Ｌ１０、Ｖ１１、Ｆ２５、Ｒ３６、Ｐ３９、Ｆ４９及びＰ６３；ＩＧＦＢＰ−３結合に対してＶ１１、Ｒ３６、Ｐ３９、及びＰ６３。グリシンとプロリンのａｌａ−置換はタンパク質骨格の構造的な攪乱に至りうることを述べておく（Di Cera, Chem. Rev., 98: 1563-1591 (1998)）。
結合親和性におけるほんの僅かな緩やかな改善がアラニン置換によって見出された。Ｓ１Ａ，Ｄ１２Ａ及びＤ４５ＡはＩＧＦＢＰ−１結合性においておよそ２倍の増加を示す一方、Ｓ３５Ａ及びＴ４１ＡはＩＧＦＮＢＰ−３に対して同様の効果を示した。しかしながら、ＩＣ５０値の２倍の変化がこれらの実験における精度の限界である。
【００８９】
ＩＧＦＢＰ特異性決定因子
Ｅ３Ａ、Ｇ７Ａ、Ｌ１０Ａ、Ｆ２５Ａ及びＦ４９はＩＧＦＢＰ−１対ＩＧＦＢＰ−３の結合において差次的な効果を示した。これらの５つのＩＧＦ−Ｉ単一アラニン変異体において、ＩＧＦＢＰ−１の相対ＩＣ５０はＩＧＦＢＰ−３のものとは４倍以上異なっていた（図２；表１、相対的特異性）。Ｅ３ＡとＦ４９Ａはこの群において最も大きな相対特異性因子を示した。Ｅ３のアラニン置換はＩＧＦＢＰ−３の親和性には実質的に効果を持っておらず（１．４倍）、ＩＧＦＢＰ−１への結合は３４倍弱くされている。更に劇的なことには、Ｆ４９Ａの親和性はＩＧＦＢＰ−１に対しては１００倍以上減少しているがＢＰ−３に対しては３．６倍だけである。この結果は、ファージＥＬＩＳＡ法による直接の比較において示した。ＩＧＦ−Ｉ Ｆ４９Ａをディスプレイするファージ粒子を可溶型ＩＧＦＢＰ−１（図３Ａ）又はＩＧＦＢＰ−３（図３Ｂ）の存在下でＩＧＦＢＰ−３被覆ウェルに添加した。ＩＧＦ−Ｉ Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖをディスプレイしている対照ファージと比較して、Ｆ４９Ａの結合曲線はＩＧＦＢＰ−１競合において１０２以上シフトした（図３Ａ）。これに対して、結合曲線はＩＧＦＢＰ−３競合においては同様であり、ＩＣ５０値の差異はファクター４未満であった（図３Ｂ）。よって、Ｅ３とＦ４９はＩＧＦ−Ｉ分子においてＩＧＦＢＰ−１結合のための二つの主要な特異性決定因子である。
残基Ｇ７、Ｌ１０及びＦ２５は、アラニンによって置換されたときＩＧＦＢＰ−３に対するよりもＩＧＦＢＰ−１に対する親和性の顕著な損失を示したが、両方のＩＧＦＢＰの結合に対して重要であると思われた。ＩＧＦＢＰ−３に対しては、ＩＧＦＢＰ−３に対してよりもＩＧＦＢＰ−１に対してより強く結合する変異体のような、有意な特異性決定因子は特定されなかった。しかし、変異Ｅ９Ａ、Ｄ１２Ａ、Ｆ２３Ａ、Ｙ２４Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｓ３４Ａ及びＤ４５ＡはＩＧＦＢＰ−１結合性についてよりもＩＧＦＢＰ−３に対して僅かに大きな（約２倍）効果を有していた。
【００９０】
精製された可溶型ＩＧＦ変異体のＢＩＡＣＯＲＥＴＭ測定
ファージＥＬＩＳＡ法によって得られた結果の妥当性の確認のために、特異的アラニン変異体を発現させ、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ装置を用いた反応速度分析のために精製した。野生型ＩＧＦ−Ｉの解離定数（ＫＤ）はＩＧＦＢＰ−１に対しては１３ｎＭで、ＩＧＦＢＰ−３に対しては１．５ｎＭであると決定された（図５Ａと５Ｂ；表２）。ＩＧＦＢＰに対する親和性の差異は、ＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−Ｉの１０倍速い会合速度（ｋａ）のためである（３．２ｘ１０５対３．２ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１）。これらの結果はファージＥＬＩＳＡによって測定された絶対ＩＣ５０値とよく対応している（図１Ａ及び１Ｂ；表Ｉ）。予想されるように、二重変異体Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖは野生型とは本質的に区別ができない反応速度パラメータを示した（表２）。
Ｖ１１Ａ、Ｒ３６Ａ及びＰ３９Ａは、これらの変異体はファージに正しくディスプレイされなかったので、抗体認識実験（上を参照）に基づいて試験した。Ｒ３６ＡとＰ３９Ａは双方の結合タンパク質に対して野生型の反応速度を示したが、Ｖ１１ＡはＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３の双方に対して親和性の５倍の減少を示した。
更に、可溶型ＩＧＦ変異体Ｔ４Ａを試験することが決定された。この残基は以前の刊行物（上掲のBayne等, J. Biol. Chem., 263; 上掲のClemmons等, 1990）においてはＩＧＦＢＰ結合に関連していたが、ここでのファージアッセイでは穏やかな効果を示していた。野生型ＩＧＦ−Ｉに対するＴ４ＡのＫＤ値の増加はファージＥＬＩＳＡ法により測定されたＩＣ５０比よりおよそ２−３倍高かった（表２）。ファージ及びバイオセンサー分析により得られた結果の間の大きな矛盾はＦ１６Ａに対して見られた。この場合、二つの方法は因子４だけ異なっていた。
最初のα−へリックス(螺旋)領域における変異はＩＧＦタンパク質構造に不安定化効果を有していることが示されている（上掲のJansson等, 1997）。如何なる理論にも制約を受けるものではないが、ファージの表面上のｇ３融合タンパク質は再び折り畳まれ精製された可溶型タンパク質よりも更に安定であるかもしれないと思われる。これは、二つの残基が構造的に感受性のＮ末端へリックスの外側に位置しているＦ２５ＡとＦ４９Ａに対して得られたＢＩＡＣＯＲＥＴＭの結果によって裏付けられている。ＫＤとＩＣ５０におけるそれぞれの変化はこれらの二つの変異体に対してすばらしく一致している（表２）。ＩＧＦＢＰへの結合に対するＦ４９Ａの差次的効果はＢＩＡＣＯＲＥＴＭ分析によって確認された。７０倍の親和性の減少がＩＧＦＢＰ−１結合に対して測定され（図５Ｃ；表２）、ＩＧＦＢＰ−３結合性は４倍だけ減少した（図５Ｄ；表２）。
【００９１】
【００９２】
Ｎ末端ＩＧＦ−Ｉ残基の役割
驚いたことに、ＩＧＦＢＰ−３の相互作用は、ＩＧＦＢＰ−３がおよそ１０倍高い親和性をもってＩＧＦ−Ｉに結合するという事実にも拘わらず、ＩＧＦＢＰ−１との相互作用よりも、アラニン置換に影響を受ける度合いは一般にかなり少なかった。Ｐ６３Ａとは別に、何れのアラニン変異体もＩＧＦＢＰ−３親和性の＞６倍の低減を示さなかった（図２と表１）。
バイオセンサーの実験においてdes(１−３)−ＩＧＦ−Ｉが２５倍低減した親和性でもってＩＧＦＢＰ−３に結合することが過去に示されている（上掲のHeding等）。ＩＧＦ−Ｉのこの天然に生じる型は最初の３つのＮ末端残基を欠いており、おそらくはＩＧＦＢＰ結合性の低減のために分裂促進能力の増加を示す（上掲のBagley等）。最初の３つアミノ酸側鎖の何れもＩＧＦＢＰ−３の結合に対するエネルギーを助長しないにもかかわらず（表１）、des(１−３)−ＩＧＦ−ＩがＩＧＦＢＰ−３結合において妥協されるので、如何なる理論に制約されるものではないが、バックボーン相互作用が関与しているかも知れないとの仮説が立てられる。
この仮説は、最初の３個のＮ末端アミノ酸を置換する三重アラニン変異体（Ａｌａ(１−３)-ＩＧＦ−Ｉ）をファージ上にディスプレイすることにより試験された。その領域のバックボーンがＩＧＦＢＰ−３との相互作用に寄与しているならば、この変異体は結合できなければならない。しかし、ＩＧＦＢＰ−１への結合性はＥ３側鎖の欠落のために低減していなければならない（表１）。位置１及び２におけるＩＧＦＢＰ−１との潜在的なバックボーンの相互作用を試験するため、対照としてdes(１−２)−ＩＧＦ−Ｉ変異体を産生した。予想されたように、Ａｌａ(１−３)-ＩＧＦ−ＩはＥ３Ａと同様にＩＧＦＢＰ−１親和性を減少させたが、ＩＧＦＢＰ−３親和性における変化は示さなかった（表１；図２）。des(１−２)−ＩＧＦ−Ｉに対しては、双方の結合タンパク質に対して親和性の差は観察されなかった。des(１−３)−ＩＧＦ−Ｉ（上掲のHeding等）に関する知見と併せると、これらの結果は、如何なる理論にも限定されるものではないが、ＩＧＦ−Ｉの残基３及び４の間のペプチドバックボーンがＩＧＦＢＰ−３との重要な相互作用を媒介する。
【００９３】
検討
ＩＧＦ−Ｉの表面上の機能性ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３結合エピトープがアラニンスキャンニング突然変異誘発により証明された。両方の結合エピトープは図６に示されている。個々のＩＧＦ−Ｉ側鎖相互作用はＩＧＦＢＰ−３に対してよりもＩＧＦＢＰ−１への結合に対して更に重要な役割を果たしている。二つの主要な結合部分がＩＧＦＢＰ−１に対して見いだされる（図６Ａ）。一つが（Ｇ７、Ｌ１０、Ｖ１１、Ｌ１４、Ｆ２５、Ｉ４３、及びＶ４４からなる）Ｎ末端ヘリックスの上面に位置し、一つが（Ｅ３、Ｔ４、Ｌ５、Ｆ１６、Ｖ１７及びＬ５４からなる）下面に位置している。これらの二つの結合部分はＦ４９とＲ５０によって架橋されている。ＩＧＦＢＰ−３に対しては、結合エピトープはより散在性であり、Ｇ２２、Ｆ２３及びＹ２４を含むようにずれている（図６Ｂ）。ＩＧＦＢＰ−３の結合性は一般にアラニン置換にはあまり感受性ではない。実際、親和性の最も大なる減少は（Ｐ６３Ａの他、以下参照）Ｇ７Ａに対して見られる６倍の減少である。最もありそうなことは、如何なる理論にも制約を受けるものではないが、ＩＧＦ−Ｉ主鎖バックボーンから派生する相互作用がＩＧＦＢＰ−３の結合性に寄与していることである。この仮説は更にＡｌａ（１−３）−ＩＧＦ変異体での実験により実証される。単一及び三重アラニン置換はＩＧＦＢＰ−３結合性への効果を持たないが、最初の３個のアミノ酸の欠失の結果、２５倍の親和性の減少した（上掲のBagley等；上掲のClemmons等；上掲のHeding等）。要約すると、ＩＧＦ−Ｉは異なった結合様式を用いてＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３に結合する；数個のアミノ酸側鎖の相互作用がＩＧＦＢＰ−１への結合に重要である一方、バックボーン相互作用がＩＧＦＢＰ−３への結合に対して主要な活動的な役割を担うように思われる。
【００９４】
最近の刊行物では、異核ＮＭＲスペクトロスコピーによるＩＧＦＢＰ−１に対するＩＧＦ−Ｉの結合エピトープが調査されている（上掲のJansson等, 1998）。著者はとりわけＩＧＦ−Ｉ残基２９、３０、３６、３７、４０、４１、６３、６５、及び６６が３０℃でのＩＧＦＢＰ−１との複合体生成時に化学シフトによる攪乱を受けることを見いだしている。更に、Janssonと共同研究者はR36、R37及びR50が機能性結合エピトープの一部であると特定し、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ実験でそのアラニン変異体を試験した。著者により観察された親和性の最も大きな変化はＲ５０Ａに対する３倍の減少であった。しかし、ホルモンの最初のＮＭＲでの研究において既に観察されているＩＧＦ−Ｉの構造上の柔軟性のために（上掲のCooke等）、Jansson等は、Ｆ４９を含み、多くの残基をＮＭＲスペクトルに完全には指定することはできなかった。
タンパク質−タンパク質界面の同様な研究において、僅かな側鎖残基だけが大部分の自由結合エネルギーに寄与することが見いだされた（Clackson及びWells, Science, 267:383-386 (1995); Kelley等, Biochemistry, 34: 10383-10392 (1995)）。同じことがＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ−１相互作用に対しても当てはまる。しかし、ここでは、ＶＩＩａ因子への組織因子の結合に対して注目されたように、重要な側鎖から派生した結合自由エネルギー値の大きさ（ΔΔＧ）は成長ホルモンの場合よりも小さい（上掲のKelley等）。支配的なΔΔＧの寄与を持つ残基は成長ホルモン-レセプター界面におけるようにＩＧＦ−Ｉ表面上でクラスター形成しないが（上掲のClackson及びWells）、連続的なＩＧＦＢＰ−１結合エピトープをなお形成した（図６Ａ）。これに対して、ＩＧＦ−Ｉ上のＩＧＦＢＰ−３結合エピトープは不連続であり、側鎖は非常に穏やかな個々の結合エネルギーを導いた。
【００９５】
ＩＧＦ−ＩにおけるアラニンによるＰ６３の置換により、競合ファージＥＬＩＳＡにおいて使用された濃度範囲で測定できない両方の結合タンパク質の親和性の減少が生じた。しかし、残基Ｐ６３は主結合エピトープに対してＩＧＦ−Ｉ分子の反対側に位置している。更に、グリシンとプロリンのアラニン置換が構造変化に至りうることが着目された（上掲のDi Cera）。また、上掲のJansson等, 1998は、ＩＧＦ−ＩのＣ末端部分は直接のＩＧＦＢＰ−１接触には関与していないが、むしろ複合体生成時に間接的な立体配置変化を受けると結論した。ＩＧＦ−１上の抗体結合部位の広範な特徴付けはManes等, Endocrinology, 138: 905-915 (1997)によりなされている。彼らは、Ｃ末端Ｄドメインを認識する抗体との複合体におけるＩＧＦ−ＩへのＩＧＦＢＰ−１又は−３の同時の結合を示した。これらの結果は、残基Ｐ６３で始まるＤドメインがＩＧＦＢＰ−１又は−３の結合に関与していないという以前の知見を更に裏付けている（上掲のBayne等, 1988）。
【００９６】
ファージＥＬＩＳＡにより得られたＩＣ５０比とＢＩＡＣＯＲＥＴＭの結果の間の主たる矛盾は残基Ｆ１６で観察された。既に述べたように、アラニンによるこの残基の置換によりＩＧＦ−Ｉ分子の構造変化が誘導された（上掲のJansson等, 1997）。同じ効果がＢＩＡＣＯＲＥＴＭの結果におけるＫＤで見られたが、親和性の減少はファージＥＬＩＳＡ実験ではそれ程顕著ではなかった（表２を参照）。双方のＢＩＡＣＯＲＥＴＭの測定では精製工程の間に再び折り畳まれたＩＧＦ−Ｆ１６Ａが使用された（上掲のJansson等, 1997）。しかし、ファージディスプレイでは、対象のタンパク質は大腸菌の分泌機構によって自然に転位置される。一価ファージディスプレイにおける低タンパク質量（ファージ粒子当たり＜１分子）は凝集を嫌い誤って折り畳む。また、切断したｇ３ファージタンパク質へＩＧＦ−Ｉを融合させるとペプチドの未変性の構造に安定化効果を働かせるかもしれない。
循環中のＩＧＦ−Ｉの大部分はＩＧＦＢＰ−３と酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）と名付けられた第３のタンパク質との複合体として見いだされる（上掲のBachとRechler；Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8:45-62 (1997); 上掲のJonesとClemmons）。１５０ｋＤの分子量のこの三元複合体は脈管構造壁を横断できず、ＩＧＦに対する循環リザーバとして作用する。この機構によってＩＧＦ−Ｉの半減期が劇的に増加する（Simpson等, Grwoth Horm IGF Res, 8: 83-95 (1998)）。ＩＧＦＢＰ−３の量はＩＧＦ−Ｉによってポジティブに調節される。これに対してＩＧＦＢＰ−１の役割はそれ程明確ではない。このクラスの結合タンパク質は一般にはＩＧＦＢＰ−３程豊富ではなく、その量はインスリンによりネガティブに調節される（上掲のBachとRechler；上掲のClemmons, 1997; 上掲のJonesとClemmons）。
【００９７】
ここでの結果に基づいて、ＩＧＦ−ＩのＩＧＦＢＰ特異的変異体が得られる。幾つかのアラニン変異の組み合わせが、ＩＧＦＢＰ−３の高親和性結合性を保持しながら非常に弱くＩＧＦＢＰ−１に結合する変異体を産生する。ＩＧＦＢＰ−３にもはや結合しないＩＧＦＢＰ−１特異的変異体のデザインはＩＧＦ−Ｉのファージディスプレイと特定の位置でのアミノ酸の無作為化を含みうる（上掲のCunningham等；LowmanとWells, J. Mol. Biol., 243:564-578 (1993)）。
【００９８】
結論：
ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３への結合に対して重要なＩＧＦ−Ｉの残基を同定した。特定のＩＧＦＢＰに対する結合特異性を決定する幾つかの残基が見いだされた。最近の刊行物（上掲のLoddick；上掲のLowman等, 1998）では、生物学的利用能のある「遊離の」ＩＧＦ−Ｉの増加プールが結合タンパク質から内在性ＩＧＦ−Ｉを置換することにより産生された動物実験が報告されている。ＩＧＦＢＰ特異的ＩＧＦ−Ｉ変異体はここに記載したように診断のためにまた治療のために使用することができる。
【００９９】
実施例２
腎疾患の治療に関するある種の変異体の特徴付け
ＩＧＦ−Ｉ変異体の作成
実施例１（及びDubaquieとLowman, Biochemistry, 38: 6386 (1999)）において、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３、又は双方の結合タンパク質への結合親和性が低減されたＩＧＦ−Ｉ変異体が同定された。特に、ＩＧＦ−Ｉの全アラニンスキャンニング突然変異誘発は、ＩＧＦＢＰ−１への結合のための特異性決定因子としてグルタミン酸３（Ｅ３）及びフェニルアラニン４９（Ｆ４９）、並びにある程度フェニルアラニン１６（Ｆ１６）及びフェニルアラニン２５（Ｆ２５）を同定した。ファージディスプレイアラニンスキャンニングの結果は、位置３と４９の側鎖の双方がＩＧＦＢＰ−１との複合体生成のためのかなりの結合エネルギーに選択的に寄与する一方（Ｅ３Ａに対して〜３０倍、Ｆ４９Ａに対して〜１００倍の親和性の損失）、ＩＧＦＢＰ−３に対する結合エネルギーにおけるその寄与は検出できないか（Ｅ３Ａ）、僅かである（Ｆ４９Ａに対して〜４倍）ことが示唆された（実施例１と上掲のDubaquieとLowmanを参照）。
ＩＧＦＢＰ−３に対する更に改善された特異性は、点突然変異の効果が結合自由エネルギーへの寄与に対してしばしば相加的であるので、ＩＧＦ−Ｉの累積性突然変異によって達成される可能性が高かった（Wells, Biochemistry 29: 8509 (1990)）。従って、ＩＧＦ−Ｉの二重変異体であるＥ３Ａ／Ｆ４９Ａは単一の分子に点突然変異Ｅ３Ａ及びＦ４９Ａを組み合わせることにより作成した。Ｆ１６Ａはより小なるＩＧＦＢＰ-特異性効果を示したが（実施例１及び上掲のDubaquieとLowman）、二重変異体Ｆ１６Ａ／Ｆ４９Ａもまた作成した。
【０１００】
また作成したのは、結合実験のためのＩＧＦ−Ｉの部位特異的固定化を容易にするために、単一の推定不対システイニルチオールを含むＩＧＦ−Ｉの新しい点突然変異Ｙ３１Ｃである。Ｙ３１Ｃは、ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３に対する結合エピトープの外側にあるので選択された（上掲のDubaquieとLowman）。この固定化技術により、注入された分析物（すなわちＩＧＦ結合タンパク質）が結合するための均一なリガンド集団が確保される（CunninghamとWells, J. Mol. Biol., 234: 554 (1993)）。過去に用いられていたアミン結合に対するこの方法の利点は、ＩＧＦ−ＩのＮ末端が阻害されず、チップマトリックスへの全ての潜在的なアミン結合がないことである。これは、ＩＧＦ−ＩのＮ末端の側鎖と相互作用すると信じられている（上掲のDubaquieとLowman）ＩＧＦＢＰ−１の結合分析に対して特に重要でありうる。ファージにディスプレイされたＹ３１ＣはＩＧＦＢ−１とＩＧＦＢＰ−３の双方に対して野生型様の親和性を示し、残基３１の回りの領域が得セプター結合において重要であるが結合タンパク質との接触を形成しないという考えを裏付けている（上掲のJ. Biol. Chem., 264: 11004 (1988); 上掲のBayne等, J. Biol. Chem., 265: 15648 (1989)）。
Ｆ４９Ａを含むＩＧＦ−Ｉの単一アラニン変異体並びにＥ３Ａ／Ｆ４９Ａ二重変異体を発現させ、精製し、再び折り畳んで、ＨＰＬＣ分析によって判断して適切なジスルフィド異性体を得た（ここの実施例１及び上掲のDubaquieとLowman）。これらの変異体を特異的結合タンパク質結合・レセプター活性化アッセイにおいて試験した。
【０１０１】
ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３結合親和性
ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３に対するこれら変異体の結合親和性をＢＩＡＣＯＲＥＴＭ分析を使用して野生型ＩＧＦ−Ｉのものと比較した。固定化したＩＧＦ−Ｉ又は変異体に対するＩＧＦＢＰ−３結合での反応速度実験（表３）を実施例１及び上掲のDubaquieとLowmanに記載されているようにして実施し、Ｆ４９ＡＩＧＦ−Ｉ及び野生型ＩＧＦ−Ｉと比較した。この実験では、二重変異体Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ａは野生型よりＩＧＦＢＰ−３への結合親和性が約２０倍弱く、二重変異体Ｆ１６Ａ／Ｆ４９Ａは約６６倍弱かった（表３）。
【０１０２】
【０１０３】
ＩＧＦ−ＩへのＩＧＦＢＰ−１の結合の測定に対しては、ジスルフィド結合を介してセンサーチップ表面に固定化された単一システインＩＧＦ−Ｉ変異体Ｙ３１Ｃを使用して反応速度実験を実施した（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステム・マニュアル・サプリメント５ａ−１, Pharmacia (1991)）。結果は、バイオセンサーチップに非特異的アミン結合を介して固定された野生型ＩＧＦ−Ｉを使用して測定された結合親和性と一致している（表４）（実施例１及び上掲のDubaquieとLowman）。
【０１０４】
【０１０５】
IGFBP-1に対するＦ４９Ａ及びＥ３Ａ／Ｆ４９Ａの結合は正確な反応速度の測定のためにはあまりに弱かった。従って、対応する親和性を推定するために競合結合実験（１９９８年１０月１５日公開の国際公開第９８／４５４２７号）を実施した。上述したようなＢＩＡＣＯＲＥＴＭバイオセンサーチップに固定化された単一のシステインＩＧＦ−Ｉ変異体Ｙ３１Ｃを用いた。最大半減抑制濃度値（ＩＣ５０）を生じる競合結合実験を次のようにして実施した：５０ｎＭのＩＧＦＢＰ−１を所望のＩＧＦ変異体の希釈列と共にインキュベートした。これらのタンパク質混合液をシステイン結合ＩＧＦ−ＩＹ３１Ｃ（２００応答単位）を含むＢ１チップに５μＬ／分で注入した。結合したＩＧＦＢＰ−１の量を、２０分の注入後の非特異的結合を引くことにより決定し、ＩＧＦ変異体濃度に対してプロットした（図７）。結果を表５に示す。
【０１０６】
【０１０７】
野生型ＩＧＦ−Ｉに比較して、Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９ＡはＩＧＦＢＰ−１に対して激しく低下した結合親和性を有していた。Ｆ４９Ａは１．６±０．２μＭ（表５）のＩＣ５０でＩＧＦＢＰ−１に結合し、ＩＧＦＢＰ−３に対して６．３±１．７ｎＭの高親和性解離定数（ＫＤ）を保持した（表３）。ＩＧＦＢＰ−１へのＥ３Ａ／Ｆ４９Ａの結合は、６４±９μＭ（表Ｖ）の推定ＩＣ５０で、更に弱いことが分かり、ＩＧＦＢＰ−３に対してはほんの中程度に低減した親和性（ＫＤ＝２２．２±１０．３ｎＭ）を持っていた（表３）。これらのインビトロ測定は何れのＩＧＦ変異体も生理的条件下でＩＧＦＢＰ−１に安定に結合するであろうことを示唆している。
【０１０８】
ＩＧＦのＩ型レセプターの活性化のＫＩＲＡアッセイ
キナーゼレセプター活性化アッセイ（ＫＩＲＡ）はリガンドによる細胞外刺激時の細胞質ＩＧＦレセプターリン酸化の度合いを特異的かつ定量的に監視する（Sadick等, J. Pharm. Biomed. Analysis, 19(6): 883-891 (1998)）。幾つかのＩＧＦ変異体Ｇ１Ｓ／Ａ７０Ｖ、Ｔ４Ａ、Ｖ１１Ａ、Ｆ１６Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｆ１６Ａ／Ｆ４９Ａ、Ｒ３６Ａ、Ｐ３９Ａ及びＦ４９Ａをレセプター活性化の単一濃度アッセイにおいて試験した。Ｆ１６Ａ／Ｆ４９Ａを除くこれら変異体のＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３結合親和性は表ＩＩ及び上掲のDubaquieとLowmanに示されている。表６はＢＩＡＣＯＲＥＴＭ測定からの相対的親和性と特異性をまとめているものである。
ＫＩＲＡアッセイに対しては、変異体濃度は、光学密度測定に基づき、大まかに１３ｎＭ（「高濃度」）又は１．３ｎＭ（「低濃度」）と推定された。各ＩＧＦ変異体に対して得られた信号を野生型ＩＧＦ−Ｉの基準希釈列の信号と比較し、ＫＩＲＡアッセイにおいて観察された活性に対応する見かけのＩＧＦ−Ｉ濃度によって報告した（図８Ａ−８Ｂ）。正確な相対的効力は測定されなかったが、これらの結果は、試験した全ての変異体がＩＧＦのＩ型レセプターを活性化する能力を維持していることを示している。
【０１０９】
【０１１０】
表６は、Ｆ４９Ａに加えて、Ｆ１６ＡとＦ２５Ａは共にＩＧＦＢＰ−１に対する親和性が大幅に減少しているがＩＧＦＢＰ−３に対してはその度合いは少ないことを示している。両方ともなおＫＩＲＡアッセイに基づく生物活性を保持している（図８）。
Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９Ａの相対的効力を決定するために、ＫＩＲＡアッセイにおいて連続希釈を使用してＩ型ＩＧＦレセプターを活性化するその能力を測定した。図９Ａ−９Ｂに示されているように、Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９Ａは共に野生型ＩＧＦ−Ｉとは区別できないＩＧＦレセプター活性化曲線を示している。最大半減有効濃度（ＥＣ５０）は、Ｆ４９Ａに対して２０．０±１．３ｎｇ／ｍｌ、Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ａに対して１８．９±０．２ｎｇ／ｍｌ、野生型ＩＧＦ−Ｉに対して１９．８±０．６ｎｇ／ｍｌであった。これらの結果は、両方のＩＧＦ変異体が十分に生物活性であることを強く示唆している。
【０１１１】
ラットにおけるＩＧＦ−Ｉ変異体の血液浄化と腎臓蓄積
活性ＩＧＦ分子の腎臓への蓄積は慢性もしくは急性腎不全において潜在的に有益であろう。これれあの病状はＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−２が異常に高レベルで、ＩＧＦ−Ｉ剛性の低減が組み合わされ、最終的に異化作用を導くことにより特徴付けられる（上掲のToenshoff等, 1997）。
Ｆ４９Ａ及びＥ３Ａ／Ｆ４９Ａ ＩＧＦ−Ｉの予備的薬理学的性質を評価するために、両方のタンパク質を放射標識し、ラットに静脈内投与した。図１０Ａは両方の分子が動物の血液から除去される速度の時間経過を示す。そのＩＧＦＢＰ親和性の低減から予測されるように、双方の変異体は野生型ヒトＩＧＦ−Ｉと比較してより速い速度で除去された。興味深いことに、二重変異体（Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ａ）は単一変異体（Ｆ４９Ａ）よりも速く除去され、血清中の主要な結合タンパク質ＩＧＦＢＰ−３に対するそれぞれの親和性とよく相関している（表３）。図１０Ｂは異なった器官中のＩＧＦ変異体に対する血液対組織比を示している。大多数の放射標識ＩＧＦ分子が腎臓において検出されたが、肝臓、脾臓、心臓、及び膵臓における放射能レベルは更に低かった。変異体Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９Ａが野生型ＩＧＦ−Ｉと比較して腎臓において統計的に有意なより高レベルで蓄積することは明らかである。
【０１１２】
ＩＧＦ−Ｉ変異体の円偏光二色性分析
Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９Ａ ＩＧＦ−Ｉの円偏光二色性スペクトルを分析して、導入された変異がタンパク質構造に主要な変化をもたらすかどうかを試験した。構造的な不安定化はタンパク分解の感受性の増加に至り、ＩＧＦ変異体のより速やかな血液浄化速度に対する別の説明を提供する。しかしながら、図１１に示されているように、両方の変異体は野生型ＩＧＦ−Ｉに対して記録されたものと実質的に同一のスペクトルを有している。ＩＧＦ−ＩのＮＭＲスペクトロスコピーから予想されるように、ＣＤスペクトルはα−ヘリックスとランダムコイルの双方のエレメントを明らかにする（Coole等, Biochemistry, 30: 5484 (1991)）。ＩＧＦ−Ｉの熱安定性は、おそらくは室温で既に存在する比較的高い含量（〜３０％）のランダムコイルのために、円偏光二色によって精確に決定することはできない（Jansson等, Biochemistry, 36: 4108 (1997)）。両方の変異体のＣＤスペクトルが野生型ＩＧＦ−Ｉからの有意な逸脱を示していないという事実は、導入された変異がＩＧＦ−Ｉの全体構造を変えないことの表れである。
【０１１３】
結論
上に提示した証拠から、単一及び二重変異体Ｆ１６Ａ、Ｆ１６Ｇ、Ｆ１６Ｓ、Ｆ２５Ａ、Ｆ２５Ｇ、Ｆ２５Ｓ、Ｆ４９Ａ、Ｆ４９Ｇ、Ｆ４９Ｓ、Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ａ、Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ｇ、Ｅ３Ｇ／Ｆ４９Ａ、Ｅ３Ｇ／Ｆ４９Ｇ、Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ｓ、Ｅ３Ｓ／Ｆ４９Ａ、Ｅ３Ｓ／Ｆ４９Ａ、Ｅ３Ｓ／Ｆ４９Ｓ、Ｅ３Ｇ／Ｆ４９Ｓ、及びＥ３Ｓ／Ｆ４９Ｇ ＩＧＦ−Ｉは、アラニン置換変異体がＩＧＦＢＰ−３と結合する能力を大幅に喪失することなくＩＧＦＢＰ−１に対して低い親和性を示し多くの試験において生物活性であるので、ＧＨ／ＩＧＦ軸調節不全により特徴付けられる疾患を治療するのに有効であると予想される。更に、かかる変異体は、Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９Ａが野生型ＩＧＦ−Ｉと比較してまた他の器官と比較して腎臓に統計的に有意なより高いレベルで蓄積し、アラニン置換変異体がＩＧＦＢＰ−１にほんの僅かに結合するだけで、実験的尿毒症においてＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−２遺伝子の発現の増大が見られるので（上掲のToenshoff等, 1997）、腎疾患の治療に効果的であると予想される。
【０１１４】
実施例３
ヒトの治療
この実施例は、ＩＧＦＢＰの一又は複数に結合する外来性に投与されるペプチドが如何にして内在性ＩＧＦを置換するかの原理とヒトへの使用に対するここでのペプチドの服用方法を示す。
この実験では１２週間の間４種の用量（１０、２０、４０又は８０μｇ／ｋｇ）で毎日２回の注射によって組換えヒトＩＧＦ−Ｉ又はプラセボをヒトＩＩ型糖尿病患者に投与した。血液試料を治療前、治療中に２週間毎に、治療の１２週後（ＥＰ）に採取した。１０μｇ／日のＩＧＦ−Ｉで治療された患者から採取された試料ではＩＧＦ−ＩＩを測定しなかった以外は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦＢＰ−３の濃度を全ての試料について測定した。
【０１１５】
国際公開第９８／４５４２７号の図４３は患者の血液中のＩＧＦ−Ｉ濃度を示している。予期できなかった知見は、４０及び８０μｇのＩＧＦ−Ｉを投与する「プラトー」効果であった；これら二種の用量で同じＩＧＦ−Ｉ全血液濃度に達した。
国際公開第９８／４５４２７号の図４４は患者の血液中のＩＧＦ−ＩＩ濃度を示している。ＩＧＦ−Ｉの上昇量と対照的に、ＩＧＦ−ＩＩの量はＩＧＦ−Ｉ濃度の上昇に対するほぼ鏡像的なパターンで低下する。上昇するＩＧＦ−Ｉ濃度のプラトー効果と同様に、現象するＩＧＦ−ＩＩ濃度もまたプラトーに達した。
国際公開第９８／４５４２７号の図４５は患者の血液中のＩＧＦＢＰ−３濃度を示している。血液中のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩのパターンの明らかな変化と対照的に、ＩＧＦＢＰ−３の濃度は統計的に有意な又は明らかな変化パターンを示さなかった。
国際公開第９８／４５４２７号の図４３と図４４の考察から、全ＩＧＦ濃度（ＩＧＦ−ＩプラスＩＧＦ−ＩＩ）が治療では殆ど変化を示していないことが明らかにされる。これは、ＩＧＦ−１の濃度の上昇がＩＧＦ−ＩＩの濃度の低下に密接に合致するためである。３つの図の全の考察により、患者の血液中のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ濃度の用量依存的変化はＩＧＦＢＰ−３結合タンパク質能の低下により達成されなかったことが分かる（ＩＧＦＢＰ−３は血液中の主要な結合タンパク質である）。
ＩＧＦ−ＩＩの濃度の低下とＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ濃度のプラトー化の明白な説明は、ＩＧＦ結合タンパク質能力が有限量であり、この実験において用いられたＩＧＦ−Ｉの用量が結合タンパク質からのＩＧＦ−ＩＩの用量依存的な置換を引き起こしたことである。
【０１１６】
活性なＩＧＦの濃度を亢進させる能力を持つ分子は全てこの実施例においてＩＧＦ−Ｉに対して示されたものと同様な活性を示すと予想することはこの実施例の知見の論理的な拡張である。また、用いられたＩＧＦ−Ｉの用量と立証されたＩＧＦＢＰ及びＩＧＦ−１及びＩＧＦ−ＩＩの濃度から、活性な内在性ＩＧＦの量を増大させるにはどれくらいのペプチドが与えられなければならないかを計算することは簡単である。ＩＧＦ−Ｉに対するモルサイズ、ＩＧＦＢＰへのペプチドの親和性及びその生物学的利用能がヒトにおいて活性なＩＧＦを増加させた用量に達するために考慮される他の変量である。
本発明を止む終えずある特定の方法と材料を参照してここで検討した。これら特定の方法と材料の検討は本発明の範囲に対して限定をなすものでは決してなく、本発明の目的を達成するために好適な全ての代替の材料と方法まで拡張されるものと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ−１Ｂ】ＩＧＦＢＰ-１（図１Ａ）及びＩＧＦＢＰ-３（図１Ｂ）に結合する変異体、Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖ ＩＧＦ-ＩのファージＥＬＩＳＡを示す図である。1μg/mlのＩＧＦＢＰ-１（図１Ａ）又はＩＧＦＢＰ-３（図１Ｂ）でコートしたミクロタイタープレートを、Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖを表示するファージ粒子とともに、表示した量の可溶性競合タンパク質、ＩＧＦＢＰ-１（図１Ａ）又はＩＧＦＢＰ-３（図１Ｂ）の存在下でインキュベートした。競合物の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）、即ち、その特定の実験においてファージミドの半最大結合をもたらす競合物の阻害濃度を各ＩＧＦＢＰについて示した。
【図２Ａ−２Ｂ】ファージＥＬＩＳＡにより試験したＩＧＦ-Ｉ変異体についてのＩＧＦＢＰ親和性の低下又は向上を示す図である。各ＩＧＦ-Ｉアラニン変異体の相対的ＩＣ５０値（ＩＣ５０ｍｕｔ／ＩＣ５０Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖ）（ＩＧＦ-ＩＧ１Ｓ-Ａ７０Ｖ）に対する結合性タンパク質についての各変異体の親和性変化）をＩＧＦＢＰ-１（黒棒）及びＩＧＦＢＰ-３（白棒）について示した。データは下記の表１から取った。相対的ＩＣ５０＜１は親和性の向上；値＞１は親和性の低下を示す。星印は、これら特定の変異体が、抗体結合性で判断した場合、ファージ上に表示されていなかったことを示す。
【図３Ａ−３Ｂ】競合的ファージＥＬＩＳＡにおける、ファージ上に表示されたＩＧＦ-Ｉ変異体Ｆ４９Ａの、各々ＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-３に対する結合特異性を示す図である。Ｆ４９Ａ（四角）を表示するファージミド粒子は、ＩＧＦＢＰ-３でコートしたプレートに、表示した量の可溶性ＩＧＦＢＰ-１（図３Ａ）又はＩＧＦＢＰ-３（図３Ｂ）の存在下で結合した。野生型様ＩＧＦ-Ｉ変異体Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖ（丸印）を表現するファージで同じ実験を平行して行った。絶対的なＩＣ５０値については下記の表Ｉ及びＩＩを参照のこと。データ点は、平均+-標準偏差、n=2である。免疫吸着プレートを1μg/mlのＩＧＦＢＰ-３でコートし、野生型ＩＧＦ-Ｉファージ（ＷＴ、丸印）及び異ｆｇ-Ｆ４９Ａファージ（Ｆ４９Ａ、四角）を平行して用いて下記の実施例に記載したようにＥＬＩＳＡを実施した。実験は２回行い、データ点は平均+-標準偏差で示した。実際の実験におけるＩＣ５０値を図に示した。
【図４】天然配列ヒトＩＧＦ-Ｉ（ｗｔＩＧＦと称する）（配列番号：１）、天然配列ヒトプロインシュリン（プロインシュリンと称する）（配列番号：２）、及び天然配列ヒトインシュリン（インシュリン（Ｂ鎖）に次いでインシュリン（Ａ鎖）と称する）（配列番号：３）の配列アラインメントを示す図である。星印及び傍点は、各々３つの配列間での表示したアミノ酸位置での配列同一性及び配列相同性を示す。
【図５Ａ−５Ｄ】固定化ＩＧＦ-Ｉ変異体へのＩＧＦＢＰ結合のバイオセンサー分析を示す。センサーグラムは、固定化した野生型ＩＧＦ-Ｉ（図５Ａ、５Ｂ）又はＦ４９Ａ変異体（図５Ｃ、５Ｄ）へのＩＧＦＢＰ-１（図５Ａ、５Ｃ）又はＩＧＦＢＰ-３（図５Ｂ、５Ｄ）の結合について示した。核実験のリガンド濃度は、1μM、500nM、及び250nMであった。速度論的パラメータについては表ＩＩを参照のこと。
【図６Ａ−６Ｂ】各々ＩＧＦ-Ｉ表面上のＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-３についての機能的結合エピトープのモデルを示す図である。アミノ酸鎖は、それらの結合エネルギー（表Ｉ）に対する相対的寄与に従って分類し、次のように色分けした：効果無し（灰色）；見かけの親和性の２−５倍の低下（黄色）；５−１０倍（橙色）；１０−１００倍（明赤色）；＞１００倍（暗赤色）。利用可能なら場合は、下記の表ＩのファージＥＬＩＳＡ実験からの数を使用した。Ｖ１１Ａ、Ｒ３６Ａ及びＰ３９Ａ変異体（表２）に代えてBIAcore(商品名)データを使用した。ＩＧＦ-ＩのＮＭＲ構造（Cooke等, 上掲）を、プログラムInsight II(商品名)（MSI, San Diego, CA）を用いて表現した。ＩＧＦＢＰ-１についての結合エピトープ（図６）は、Ｎ-末端螺旋（残基８−１７）の「上」及び「下」表面に位置し、エネルギー的に重要な残基Ｆ４９によって連結されている。ＩＧＦＢＰ-３については（図６Ｂ）、個々のＩＧＦ-Ｉ側鎖は極くわずかしか結合エネルギーに寄与しない。結合性エピトープはＮ-末端から移動し、新たにＧ２２、Ｆ２３、Ｙ２４を包含する。
【図７】Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ａ(四角)及びＦ４９Ａ(丸印)のために、競合的ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ結合実験によって決定した結合ＩＧＦＢＰ−１の総量をＩＧＦ変異体濃度に対してプロットした図である。
【図８Ａ−８Ｂ】各々は、ＩＧＦ−ＫＩＲＡ光学密度(OD)分析を使用した、幾つかのＩＧＦ−I変異体の１３ｎＭ(高濃度)及び１．３ｎＭ(低濃度)変異体濃度における算出されたＩＧＦ−I活性をｎＭ単位で示した図である。各々のＩＧＦ変異体から得られたシグナルは、その野生型ＩＧＦ−Iの標準希釈系と比較され、観察された活性に一致する見かけのＩＧＦ−I濃度によって報告された。
【図９Ａ−９Ｂ】ＫＩＲＡ検定の連続希釈を使用して測定された野生型ＩＧＦ−Iに加えて、Ｆ４９ＡＩＧＦ−I(図．９Ａ)及びＥ３Ａ／Ｆ４９Ａ(図．９Ｂ)のＩＧＦ受容体活性化曲線を示している図である。変異体は四角で表され、そして野生型ＩＧＦ−Iは丸印で表されている。
【図１０Ａ−１０Ｂ】放射線標識されてラットへ静脈投与されたＦ４９Ａ及びＥ３Ａ／Ｆ４９ＡＩＧＦ−Iの予備的薬理学的特性の評価を示した図である。図１０Ａは、両分子が動物の血液から消失した割合の時間経過を示し、四角は野生型ＩＧＦ−Iを表し、丸印はＥ３Ａ／Ｆ４９ＡＩＧＦ−Iを表し、そしてダイヤモンド印はＦ４９ＡＩＧＦ−Iを表す。図１０Ｂは、異なった器官、すなわち腎臓、肝臓、脾臓、心臓、及び膵臓におけるこれら二つのＩＧＦ変異体の組織と血液の比率を５、１５、３０分において表し、実線は野生型ＩＧＦ−Iを表し、点線はＥ３Ａ／Ｆ４９ＡＩＧＦ−Iを表し、そして縞模様の線はＦ４９ＡＩＧＦ−Iを表す。
【図１１】野生型ＩＧＦ−I(丸印)、Ｆ４９ＡＩＧＦ−I(四角)、及びＥ３Ａ／Ｆ４９ＡＩＧＦ−I(ダイヤモンド)の円偏光二色性スペクトルを示している。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、多様な疾患の治療の為のインシュリン様成長因子（ＩＧＦｓ）のあるアゴニストの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
インシュリン様成長因子I及びII（各々，ＩＧＦ−I及びＩＧＦ−II）はインビボにおいて、細胞増殖，細胞分化，細胞死の阻害，及びインシュリン様活性を含む多数の作用を媒介する（Clark 及びRobinson, Cytokine Growth Factor Rev., 7: 65-80(1996); Jones 及びClemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34(1995)）。これらの分裂促進及び代謝応答の殆どは、インシュリン受容体と密接に関連しているα２β２異種四量体であるＩＧＦ−I受容体の活性化により始まる（McInnes 及びSykes, Biopoly., 43:339-366(1998); Ullrich ら，EMBO J., 5:2503-2512(1986)）。両タンパク質は、チロシンキナーゼスーパーファミリーの一員であり、共通の細胞内シグナルカスケードを共有する（Jones 及びClemmons, 同上）。ＩＧＦ−インシュリンハイブリッド受容体は単離されているが、それらの機能は不明である。ＩＧＦ−Iとインシュリン受容体は，特定のリガンドとナノモルレベルの親和力で結合する。ＩＧＦ−Iとインシュリンは、親和力が１００−１０００倍低いにもかかわらず，各々の非同族受容体と交差反応が可能である（Jones 及びClemmons, 同上）。ＩＧＦ−I受容体の細胞外部分の一部を表す結晶構造が、最近、報告されている（Garrett 等., Nature, 394: 395-399(1998)）。
【０００３】
インシュリンとは異なり、ＩＧＦ−Iの活性と半減期は、６個のＩＧＦ−I結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１−６）と恐らくは付加的により遠縁の部類のタンパク質によって調節されている（Jones 及びClemmons, 同上; Baxter ら., Endocrinology, 139: 4036(1998））。ＩＧＢＰは、それらが可溶性なのか又は細胞膜付随なのかによって、ＩＧＦ活性を阻害又は増強することが可能である（Bach 及びRechler, Diabetes Reviews, 3: 38-61(1995)）。ＩＧＦＢＰは、親和性と特異性を変化させることによってＩＧＦ−I及びＩＧＦ−IIと結合する（Jones 及びClemmons, 同上; Bach 及びRechler, 同上）。例えば、ＩＧＦＢＰ−３は同じ親和力でＩＧＦ−I及びＩＧＦ−IIと結合するのに対して、ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＢＦ−６は、それらがＩＧＦ−Iに結合する場合よりも非常に高い親和力でＩＧＦ−IIと結合する（Bach 及びRechler,同上; Ohら., Endocrinology, 132, 1337-1344(1993)）。
【０００４】
古典的なＩＧＦＢＰは、分子量が２２−３１kDaで、合計１６−２０のシステインをアミノ及びカルボキシ末端の保存ドメインに有している（Bach 及びRechler, 同上; Clemmons, Cytokines Growth Factor Rev., 8: 45-62(1997); Martin 及びBaxter, Curr. Op. Endocrinol. Diab., 16- 21(1994)）。両システイン高含有領域を接続する中央部のドメインは、単に弱く保存されており、ＩＧＦＢＰに特異的なプロテアーゼの切断部位を有している。（Cherauesk 等., J. Biol. Chem., 270: 11377-11382(1995); Clemmons 等., ; Conover, Prog. Growth Factor Res., 6: 301-309(1995)）。ＩＧＢＦＰのさらなる制御は、リン酸化及びグリコシル化によって成される（Bach 及びRechler, 同上; Clemmons 等.,同上）。ＩＧＦＢＰファミリーメンバーの原型の高画像度の構造は入手されていない。しかし、最近、ＩＧＦ結合活性を保った、ＩＧＦＢＰ−５の二つのＮ末端断片のＮＭＲによる構造が報告されている（Kalus等., EMBO J., 17: 6558-6572(1998)）。
【０００５】
ＩＧＦ−Iは、プロインシュリンに対して高い相同性を有する７０個のアミノ酸から成る一本鎖タンパク質である。他のインシュリンスーパーファミリーとは異なり、ＩＧＦのＣ領域は翻訳後にタンパク質分解性の除去を受けない。ＩＧＦ−I（Cooke 等., Biochemistry, 30: 5484-5491(1991); Hua等., J.Mol.Biol., 259: 297-313(1996)）、ｍｉｎｉ−ＩＧＦ−I（加工によってＣ鎖を欠いた変異体；DeWolf ら., Protein Science, 5: 2193-2202(1996)）、及びＩＧＦ−II（Terasawa 等., EMBO J., 13: 5590-5597(1994); Torres等., J.Mol. Biol., 248: 385-401(1995)）のＮＭＲ解析による構造が報告されている。ＩＧＦ−Iの特定のエピトープが、受容体及び結合タンパク質と結合することは一般的に認められている。受容体不活性ＩＧＦ変異体が、結合タンパク質から内因性のＩＧＦ−Iをとって代わることができ、その結果として純ＩＧＦ−I作用をインビボで起せることは、動物モデルにおいて実証されている（Loddick 等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1894-1898(1998); Lowman 等., Biochemistry, 37: 8870-8878(1998)）。残基Ｙ２４、Ｙ２９、Ｙ３１、及びＹ６０が受容体への結合に関与している一方で、そのＩＧＦ変異体はやはりＩＧＦＢＰへ結合する（Bayne等., J.Biol.Chem., 265: 15648-15652(1990); Bayne等.,J.Biol.Chem., 264: 11004-11008(1989); Cascieri 等., Biochemistry, 27: 3229-3233(1988); Lowman 等., 同上）。
さらに、（１−２７、ｇｌｙ４、３８−７０）−ｈＩＧＦ−Iと称される変異体は、ヒトＩＧＦ−IのＣ領域の残基２８−３７が４残基グリシン架橋によって置換されており、ＩＧＦＢＰと結合するがＩＧＦレセプターとは結合しないことが発見されている（Bar 等., Endocrinology, 127: 3243- 3245(1990)）。
【０００６】
多数の突然変異誘発研究は、ＩＧＦ−IのＩＧＦＢＰ結合エピトープの特徴づけに取り組んでいる（Bagly 等., Biochem.J., 259: 665-671(1989); Baxter 等., J.Biol.Chem., 267: 60-65(1992); Bayne等., J.Biol.Chem.,263:6233-6239(1988); Clemmons 等., J.Biol.Chem. 263:12210-12216(1990); Clemmons 等., Endocrinology, 131: 890-895(1992); Oh 等., 同上）。要約すると、Ｎ末端の残基３及び４と、残基８−１７を含むへリックス領域は、ＩＧＦＢＰとの結合にとって重要であることが発見された。その上に、ＩＧＦＢＰ−１、−２、及び−５へ結合する残基４９−５１に関与するエピトープが同定された（Clemmons等., Endocinology, 同上, 1992）。さらには、Ｎ末端の最初の３個のアミノ酸を欠く不完全な形のＩＧＦ−I（ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Iと呼ばれる）が２５倍低い親和力でＩＧＦＢＰ−３と結合することが証明された（Heading 等., J. Biol. Chem.., 271: 13948-13952(1996); U.S. Pat. Nos. 5,077,276; 5, 164,370; 5,470,828）。
【０００７】
Ｎ末端へリックス構造の露出したアミノ酸残基の結合への貢献を特徴付けることを試みる為に、幾つかのＩＧＦ−Iのアラニン変異体が構築された（Janson 等., Biochemistry., 36: 4108-4117(1997)）。しかし、これら変異体タンパク質の円二色性スペクトルは、野生型ＩＧＦ−Iと比較して構造変化があることを示し、ＩＧＦＢＰ結合への貢献を変異した測鎖へ明確に起因させることを困難にした。つい最近の研究では難解な手法が用いられ、ＩＧＦ−I上のＩＧＦＢＰ−１結合エピトープが異核NMR分光法によって調べられた（Jansson 等., J.Biol.Chem. 273: 24701-24707(1998)）。筆者らは、さらに、残基Ｒ３６、Ｒ３７、及びＲ５０が機能的にＩＧＦＢＰ−１への結合へ関与していることを同定した。
【０００８】
他のＩＧＦ−I変異体が開示されている。例えば、特許文献では、ＷＯ９６／３３２１６は、原型ＩＧＦ−Iの１−６９の残基を有する切断変異体について記述している。ＥＰ７４２，２２８は、省略型Ｃドメインを有する自然発生した単鎖ＩＧＦ−Iに由来する二本鎖ＩＧＦ−Isuperagonistsについて開示している。ＩＧＦ−Iアナログの公式：ＢＣｎ，Ａで、ＢはＩＧＦ−IのＢドメイン又はその機能アナログ、ＣはＩＧＦ−IのＣドメイン又はその機能アナログ、ｎはＣドメインのアミノ酸数で６−１２個であり、ＡはＩＧＦ−IのＡドメイン又はその機能アナログである。
さらに、Cascieri 等., Biochemistry, 27: 3229-3233(1988)は、３個が１型ＩＧＦ受容体への親和力が低下していた、ＩＧＦ−Iの４個の変異体について開示した。これらの変異体は：（Ｐｈｅ２３、Ｐｈｅ２４、Ｔｙｒ２５）ＩＧＦ−I（１、２型ＩＧＦ及びインシュリン受容体への親和力がヒトＩＧＦ−Iと同等）、（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−I及び（Ｓｅｒ２４）ＩＧＦ−I（ヒト胎盤１型ＩＧＦ受容体、胎盤インシュリン受容体、及びラット及びマウス細胞の１型ＩＧＦ受容体への親和力がＩＧＦ−Iよりも低い）、そしてdesoctapeptide（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−I（位置２４の芳香族性の消失がｈＩＧＦ−Iのカルボキシ末端のＤ領域の欠損と連結している）。これら４個の変異体は、ヒト血清結合タンパク質へ標準的な親和力を有している。
【０００９】
Bayne 等., J.Biol.Chem., 264: 11004-11008(1988)は、ＩＧＦ−Iの３個の構造アナログを開示している：（１−６２）ＩＧＦ−Iで、ＩＧＦ−IのＣ−末端のＤ領域の８個のアミノ酸を欠くもの、ＩＧＦ−IのＣ領域の残基２８−３７が４残基グリシン架橋によって置換されているもの；及び（１−２７，Ｇｌｙ４，３８−６２）ＩＧＦ−Iで、Ｃ領域のグリシン置換とＤ領域欠失したものである。Peterkofsky 等., Endocrinology, 128: 1769-1779(1991)は、Bayne等のＧｌｙ４変異体（Bayne等., 同上, Vol.264. U.S. Pat. No. 5,714,460 ）を使用したデーターを開示し、神経障害の治療の為にＩＧＦ−I又はＩＧＦ−Iの濃度を増加させる化合物に関するものである。
【００１０】
Cascieri 等., J.Biol.Chem. 264: 2199-2202(1989)は、ＩＧＦ−IのＡ領域の特定の残基が、インシュリンＡ鎖上のこれらに相当する残基と置換されている３個のＩＧＦ−Iアナログを開示している。これらアナログは：（Ｉｌｅ４１、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｎ４６、Ｔｈｒ４９、Ｓｅｒ５０、Ｉｌｅ５１、Ｓｅｒ５３、Ｔｙｒ５５、Ｇｌｎ５６）ＩＧＦ−IでＡ鎖変異体で、その残基４１がスレオニンからイソロイシンへ置き換えられ、そしてＡ領域の残基４２−５６は置換されている；（Ｔｈｒ４９、Ｓｅｒ５０、Ｉｌｅ５１）ＩＧＦ−I；及び（Ｔｙｒ５５、Ｇｌｎ５６）ＩＧＦ−I。
【００１１】
ＷＯ９４／０４５６９は、特定の結合分子について開示し、それは天然ＩＧＦＢＰ以外で、ＩＧＦ−Iへ結合が可能であり、そしてＩＧＦ−Iの生物活性を増大することが可能である。ＷＯ９８／４５４２７は１９９８年１０月１５日に公開され、Lowman等., 同上、は、ファージディスプレイ法によるＩＧＦ−Iアゴニストの同定を開示している。また、ＷＯ９７／３９０３２は、ＩＧＦＢＰのリガンド阻害剤とその使用方法について開示している。さらに、U.S. Pat No. 5,891, 722 は、遊離ＩＧＦＢＰ−１へ結合親和性を有する抗体、膣液の遊離ＩＧＦＢＰ−１の存在によって指示される、遊離ＩＧＦＢＰ及び膣液中の羊水の存在に基づく胎膜における破裂を検出する装置と方法について開示している。
これらの成果にもかかわらず、ＩＧＦ−IのＩＧＦＢＰ結合エピトープの概論は、統一的ではなく、解像度が低い。これまでの研究は、殆どが相同的なインシュリンの領域をＩＧＦ−I或いは切断タンパク質（例、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−I）挿入することに関したのもで、ミスフォールディングと真の結合決定基に起因される作用を区別するものではなかった。すべてのこれらの研究結果を結びつけることは、放射線標識リガンド結合分析からバイオセンサー分析の範囲の異なった技術を使用してＩＧＦ変異体とＩＧＦＢＰの複合体を分析するという事実から、さらに複雑なことである。
【００１２】
ＧＨ／ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ系が同化及び代謝恒常性の制御に関与しており、この系の欠如は成長、生理、及び糖血症の制御へ逆作用する（Jones 等., Endocr. Rev., 16: 3-34(1995); Davidson, Endocr. Rev., 8: 115-131(1987); Moses, Curr. Opin. Endo. Diab., 4: 16-25(1997)。さらに最近のデーターは、血漿レベルとＧＨ及びＩＧＨ−Iの生物活性の制御においてＩＧＦＢＰの役割の拡大を示唆しいる（Jones 等., 同上；Lewitt 等., Endrocrinology, 129: 2254-2256(1991); Rosenfield 等., “成長ホルモン非感受性症候群のＩＧＦ−１による治療”:インシュリン様成長因子とそれらの制御タンパク質. Eds Baxter RC, Gluckman PD, Rosenfield RG. Excerpta Medica, Amsterdam(1994), pp357-464; Lee 等., Pro.Soc.Exp.Biol.Med.,216:319-357(1997); Cox等., J.Clin.Endocrinol.Metab.,135:1913-1920(1995); Lewitt等., Endrocrinology, 133: 1797-1802(1993))。ＩＧＦＮＢＰレベルの交互変化は、ＩＧＦ過剰又は不足の臨床的症状へつながる可能性があり、そして又ＧＨ耐性へ貢献する（Barreca 等., JCEM, 83: 3534-3541(1998); Shmueli等., Hepatology, 24: 127-133(1996); Murphy 等., Prog. Growth Factor Res., 6: 425-432(1996); Rajkumar 等., Endrocrinology, 136: 4039-4034(1995); Hall 等., Acta Endocrinol.(Copenh), 118: 321-326(1998); Ross 等., Clin. Endocrinol., 35: 47-54(1991); Scharf 等., J.Hepatology, 25: 689-699(1996))。
【００１３】
ＩＧＦとＧＨの生物活性の制御に最も重要であると思われる二つのＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３である。ＩＧＦＢＰ−３は、血漿においてＩＧＦ−IとＩＧＦ−IIの全レベルの制御に最も重要であると思われる。ＩＧＦＢＰ−３は、ＧＨ依存性タンパク質であり、ＧＨ欠乏或いは耐性の場合に減少する（Jones 等., 同上; Rosenfild等., 同上 ., Scharf 等., 同上.,) 。ＩＧＦＢＰ−１は、一般的にはＩＧＦ活性の阻害剤と考えられており、糖尿病、腎疾患、うっ血性心不全、肝疾患、栄養失調、消耗症候群、及び殆どの異化状態などのＧＨ耐性状態の殆どの場合において増加する（Lewitt 等., 1993, 同上; Barreca等., 同上; Scharf等., 同上; Bereket等., Endocrinology, 137: 2238-2245(1996); Crown とHolly, Clin. Nutrit.,14: 321-328(1995); Underwood とBackeljauw, J.Int.Med., 234: 571-577(1993); Thraikill 等., J.Clin.Endo.Metab., 82(4): 1181-1187(1997)）。殆どのこれらの疾患の状態は、次の生化学的側面を特徴とする：乱れたグルコース制御、炎症、過剰ＩＧＦＢＰ−１レベル、低ＩＧＦＢＰ−３レベル、低ＩＧＦ生物活性、及び過剰ＧＨレベル（Jones等., 同上; Barreca等., 同上; Crown とHolly等., 同上; Bereket等., Clinical Endocrinology, 45(3): 321-326(1996); Batch等., J.Clin.Endo.Metab., 73:964-968(1991); Powell等., The Southwest Pediatric Nephrology Study Group, Kidney Int., 51: 1970-1979(1997)）。
【００１４】
グルココルチコイドは、タンパク質合成の減少とタンパク質異化の増加（Simmons 等,. J.Clin. Invest., 73: 412-420(1984))、尿中の窒素排泄の増加（Sapir 等., Clin. Sci. Mol. Med., 53: 215-220(1997)）と関連している。これらの結果は、部分的には成長ホルモン分泌の減少（Trainer等., J.Endrocrinol.134: 513-517(1991))又は組織レベルへのグルココルチコイドの直接作用（Baron 等., Am.J.Physiol. 263: E489-E492(1992)）によって媒介されている可能性があり、その結果として局所的なＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰの生成の妨害（McCarthy等., Endocrinology, 126: 1569-1575(1990); Lee等., 同上）及びインシュリン作用の拮抗作用（Horber等., Diabetes, 40: 141-149(1991)）となる。ラットを用いた以前の研究は、グルココルチコイド類似体、例えばデキサメタゾンの異化作用は、組み換え型ヒトＩＧＦ−１及びその類似体によって相殺される（Tomas 等., Biochem.J., 282: 91-97(1992)）ことが実証されている。さらに、インシュリンがタンパク質の異化分解を回復させることが示されている（Woolfson等., N.Eng.J.Med., 300: 14-17(1979)）。
【００１５】
併用療法も開示されている。例えば、Fuller等., Biochem Soc Trans, 19: 277S(1991）は、心臓のタンパク質合成を刺激する為のインシュリンとＩＧＦの使用について示している。Umpleby等., Europ.J.Clin.Invest., 24: 337-344(1994)は、タンパク質合成への影響を判定する為に、一晩飢餓状態にした犬のインシュリンとＩＧＦによる治療を開示した。さらに、U.S. Pat. No. 5,994,303は、窒素バランスとタンパク質の減少を相殺する為のインシュリンとＩＧＦ−Iの組み合わせ使用について開示している。
【００１６】
腎疾患に関しては、ＩＧＦ−Iが多様な作用を腎臓で発揮することが報告されている（Hammerman とMiller, Am.J.Physiol., 265: F1-F14(1993)）。末端肥大症の患者に観察される腎臓の増大が、腎糸球体の濾過速度の著しい増大に伴うことは、数十年間にわたって認知されてきた（O'SheaとLayish, J.Am.Soc.Nephrol.,3:157-161(1992)）。U.S.Pat. No.5,273,961は、急性腎疾患の危険のある哺乳類の予防的治療の方法について開示している。標準的な腎臓の機能を有するヒトペプチドを注入すると、腎糸球体の濾過速度と腎血漿の流量が増加した（Guler等., Acta Endocrinol., 121: 101-106(1989); Guler等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2868-2872(1989); Hirschberg等., Kidney Int., 43:387-397(1993); U.S. Pat. No. 5,106,832）。さらに、中程度に腎臓機能が減少したヒトは、短期間（４日間）のＩＧＦ−Iの投与に反応し、腎糸球体の濾過速度と腎血漿の流量が増加した。従って、ＩＧＦ−Iは、慢性腎疾患の状況での強力な治療薬である（O'Shea等., Am. J. Physiol. 264: F917-F922(1993)）。
【００１７】
ＩＧＦ−I又はその類似体を使用し、多嚢胞性腎疾患と関連した徴候、腎形成異常症、及び／又は腎形成不全などの腎疾患に苦しむ哺乳類を治療することは、U.S.Pat No. 5,985,830 に開示されている。この特許は、さらにＩＧＦ−Iが、慢性的な器官損傷に苦しむ哺乳類の糸球体と腎臓発育を促進する効果的な薬剤であることが開示されている。
さらに、ＩＧＦ−Iを末期の慢性腎疾患の状況へ投与すると、腎臓の機能が数日間に渡って増強することが可能である。末期の慢性腎疾患が、透析又は移植のみで治療することが可能な状況であること、そしてその発生が急増していることから、これは重要である。糖尿病患者と高齢者は、この状況を有する傾向にある。およそ６０％末期慢性腎疾患は患者血液透析、約１０％は腹膜透析、そして残りの約３０％が移植を受ける。毎年、アメリカでは、５０，０００人以上の患者が透析治療を始める。毎年、さらなる末期腎疾患になった２５％の患者が透析を受けることを拒否する。これら透析を受けている患者の看護の費用は、現在、平均して一月当たり２億ドルである。さらに、患者は透析によって支障のある生活様式を見せる。ＩＧＦ−Iが末期慢性腎疾患を体験している方々の腎臓機能を増強することが可能であるにもかかわらず、ＩＧＦ−Iの短期投与によって誘導された腎糸球体の濾過速度と腎血漿の流量の増加は長期投与の間は持続せず、副作用の発生率は高い（Miller等., Kidney International, 46: 201-207(1994)）。
【００１８】
ＩＧＦ−Iと高感受性組織との相互作用の動力学は、複雑で完全に理解されていない。循環ＩＧＦ−Iの生物活性は血漿ＩＧＦＢＰのレベルによって制御され、両物質がＩＧＦ−Iの作用を促進及び阻害する（CohickとClemmons, Annu. Rev. Physiol., 55: 131-153(1993); Kupfer等., J.Clin.Invest., 91: 391-396(1993)）。さらに、組織に存在するＩＧＦＢＰは、循環ＩＧＦ−Iとその受容体の相互作用を制御する。組織ＩＧＦ−I受容体の密度は、循環ＩＧＦ−Iのレベルの変化によって変化する。腎臓においては、ＩＧＦ−I受容体の数は、循環ＩＧＦ−Iのレベルに反比例している（Hise等., Clin.Sci., 83: 223-239(1991)）。
ある環境下において、上昇した循環ＩＧＦ−Iのレベルが、腎臓機能の長期に渡る変化に関連している又は直接の原因であることは知られている。例えば、末端肥大症患者の循環ＧＨとＩＧＦ−Iの上昇を伴うインシュリンとＰＡＨのクリアランスの増大は、一年に渡って持続する（Kkos等., Acta Endocrinol., 21: 226-236(1956)）。クレアチンのクリアランスの増大が、ＧＨ非感受性のラロン型小人萎縮症へＩＧＦ−Iを投与した最初の１２日間に起こった。この増大は、次の５９日間に渡って進行性であった（Walker等., J.Pediatr., 121: 641-646(1992)）。
【００１９】
ＧＨは、肝臓においてＩＧＦＢＰ３の合成を刺激する（HammermanとMiller, 同上; CohickとClemmons, 同上; Kupfer等., 同上）。下垂体ＧＨの放出のＩＧＦ−Iによる阻害から生じる循環ＧＨのレベルの低下が、ＩＧＦ−Iを投与されたヒトにおいて循環ＩＧＦＢＰ３の低下の結果となると考えられている。ＧＨ非感受性のために、ＩＧＦＢＰ３のレベルは低く、そしてラロン型小人萎縮症においては、ＩＧＦ−Iによって増加する（Kenety等., Acta Endocrinol., 128: 144-149(1993)）。ＩＧＦ−Iエフェクタ−系のこの相違や他の点は、これら個人のＩＧＦ−Iへの不応性の欠如を説明することが可能である。
【００２０】
Walker., 同上は、ＩＧＦ−Iが尿のカルシュウム排泄又は尿量を増加させることを発見した。Miller等., 同上は、そのような作用を確認しなかった。ＩＧＦ−Iは，さらに、近傍の尿細管の刷子縁膜を通過するリン酸輸送を促進する（QuigleyとBaum, J.Clin.Invest., 88:368-374(1991)）。長期の末端肥大症患者は、顕著な腎肥大と過剰な糸球体濾過速度を有し、ヒトにおける循環ＧＨとＩＧＦ−Iの長期に渡る上昇を伴う過剰ろ過が腎臓の傷害とはならないことを示唆した（Ikkos等., 同上; Hoogenberg等., Acta Endocrinol., 129: 151-157(1993)）。
慢性腎疾患などの慢性疾患の治療の為の断続的なＩＧＦ−Iの投与は、U.S. Pat. Nos. 5,565,428及び5,741,776に開示されている。
【００２１】
臨床状況下では、循環ＩＧＦ−Iのレベルは末期前慢性腎疾患（ＣＲＦ）において標準であり、末期腎疾患においては僅かに減少する(Power等.,Am.J.Kidney Dis.,10:287-292(1987); Blum等., Pediatr.Nephrol.,5:539-544(1991);Tonshoff等., J.Clin.Endocrinol.Metab.,80:2684-2691(1995); Tonshoff等., Peditar.Nephrol.,10:269-274(1996)）。対照的に、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、及び低分子ＩＧＦＢＰ−３断片は、腎機能不全の程度と関連し、慢性腎疾患の血清中に増加する（Lee等., Pediatr.Res., 26:308-315(1989); Liu等., J.Clin.Endocrinol.Metab., 70:620-628(1990); Powell等., Pediatr. Res., 33: 136-143(1993)）。ＩＧＦ−Iの生物活性は、I型ＩＧＦ受容体を介して媒介される。ＩＧＦＢＰが、１型ＩＧＦ受容体と結合するのと同等或いはより高い親和力でＩＧＦと結合しするため、ＣＲＦ血清中の過剰な不飽和の高親和性ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦとの結合に関して１型ＩＧＦ受容体と競合することによって、対象となる組織においてＩＧＦの作用を阻害する能力を有する（Tonshoff等., Prog. Growth Factor Res., 6: 481-491(1996)）。実際に、ＣＲＦにおけるＩＧＦＢＰレベルの増加は、インビトロ（Blum等., 同上）とインビボ（Tonshoff等., 同上, 1995）の両方におけるＩＧＦ生物活性の阻害剤であると同定されている。
【００２２】
ＣＲＦでのＩＧＦ−IとＩＧＦＢＰの生成速度については、ほとんど知られていない。標準ＩＧＦを越える増加したＩＧＦＢＰの一群は、ＣＲＦで減少したＩＧＦ−I分泌速度を示すことが示唆されているが、これは標準条件下において、増加したＩＧＦ結合能が直ちに肝臓で生成されたＩＧＦで飽和されることが予想されるためである（Blum, Acta Paediatr. Scand. [Suppl] 379: 24-31(1991)）。臨床ＣＲＦにおける血漿ＩＧＦＢＰレベルの以前の分析は、増大したＩＧＦＢＰ−２の生成速度は、ＣＲＦ血漿中の上昇したＩＧＦＢＰレベルへ貢献するであろうことを同じく示唆した（Tonshoff等., 同上, 1995）。これら二つの仮説は、肝ＩＧＦ−I遺伝子の発現とＩＧＦＢＰ−１、２、３、及び４の血漿レベルを実験用尿毒症のモデルラットで分析することによって調べられた（Tonshoff等.,Endocinology, 138:938-946(1997)）。筆者らは、肝ＩＧＦ−Iの減少及びＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−２遺伝子発現の増加が、実験用尿毒症で生じることを発見した。
腎臓に対するＩＧＦ−Iの影響についての完全な考察としては、例えば、Hammerman及びMiller, Am. J. Physiol., 265:F1-F14(1993)及びHammerman及びMiller, J.Am.Soc.Nephrol., 5: 1-11(1994)を参照のこと。
【００２３】
腎疾患を含む、ＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を有する患者の治療には、主に高ＩＧＦＢＰ−１レベルであるＩＧＦＢＰの異常分布のために、ＩＧＦ−Iによる治療は有効ではない。従って、ＩＧＦＢＰ−３への結合能を失わずにＩＧＦＢＰ−１への親和力が減少したＩＧＦ−I変異体が、そのような調節不全を特徴とする臨床状況為への唯一で効果的な治療法となる可能性がある。
【００２４】
（発明の概要）
従って、一実施態様では、 本発明はＩＧＦ−I変異体を提供し、それは天然配列ヒト型ＩＧＦ−Iの位置１６、２５、又は４９のアミノ酸残基、 又は位置３及び４９のアミノ酸残基がアラニン、グリシン、又はセリン残基へ置換されている。
また、ここに提供されているのは、容器、好ましくは製薬的に許容可能な容器に含まれる変異体を含む組成物である。好ましくは、この組成物は無菌である。
さらに、ここに提供されるのは、上記に記載した変異体を哺乳類へ投与することを含む哺乳類のＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を特徴とする疾患の治療方法である。哺乳類は、好ましくはヒトで、疾患は好ましくは腎疾患、さらに好ましくは腎不全である。
【００２５】
ここに示すペプチドは、単独、或いは特定の治療の為の活性剤、例えば腎疾患の為のＢＱ−１２３のような腎臓活性剤と供に投与することが可能である。
また、ここで考察されているのは、ここで取り上げられるペプチドと哺乳類のＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を特徴とする疾患の治療の為に組成物を使用する使用者への説明書を含む、製薬的に許容される組成物を含有する容器を含むキットである。疾患が腎疾患である場合は、このキットは任意的にさらに腎臓活性分子を含有する容器を含む。
ここに示すペプチドの同定の為に、ヒトＩＧＦ−Iは一価の繊維状ファージミド粒子に表示され（US Pat. Nos. 5,750, 373 及び 5,821,047）、その完全なアラニンスキャンニング突然変異誘発（Cunningham及びWells, Sience, 244: 1081-1085 (1989); US Pat No. 5,834,250）をファージディスプレイ法によりおこなった（「ダーボ−アラスキャン」）（Cunningham等., EMBO J. 13: 2508-2515(1994); Lowman, Methods Mol. Biol., 87: 249-264(1998)）。ＩＧＦ−ファージミド変異体は、ＩＧＦ−IにあるＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３の為の結合決定基の地図を描く為に使用された。ＩＧＦＢＰ−１或いはＩＧＦＢＰ−３に特異的に結合してインビボにおけるこれらタンパク質のクリアランス半減期の調節し、タンパク質分解安定性の向上させ、又は組織分布の変更をする結合タンパク質特異的ＩＧＦ変異体を発生する為に、アラニンスキャンニングは結合タンパク質の為の特異的決定基を明らかにする。さらに、多様なＩＧＦ−結合抗体、又は他のペプチドやタンパク質でＩＧＦ−Iと結合するもののエピトープを地図化することは有益であると言える。
【００２６】
（実施態様）
Ａ．定義
ここで使用される治療目的の為の“哺乳類”とは、哺乳類に分類されるすべての動物に関してであり、ヒト、家畜、及び飼育動物、そして動物園、スポーツ用、又はペット動物、例えば犬、馬、猫、羊、豚、牛などを含む。好ましい哺乳類はヒトである。“大人ではない”という用語は、哺乳類において出生時（低体重乳児を含む）から思春期を含み、後者はまだ潜在成長力に達していない場合に相当する。
【００２７】
ここで使用される“ＩＧＦ”は、天然インシュリン様成長因子−I、及び別名ｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−Iとして知られている脳ＩＧＦなどのそれらの天然変異体と同様に天然インシュリン様成長因子−IIに相当する。
【００２８】
ここで使用される“ＩＧＦ−I”は、牛、羊、豚、及び馬、好ましくはヒトを含むすべての種の天然インシュリン様成長因子−Iに相当し、外部からの投与について言及する場合は、天然、合成、又は組み換え体であろうと、どのソースからのものについても天然インシュリン様成長因子−Iに相当する。“天然配列”ヒトＩＧＦ−Iは、その配列が図４（配列番号：１）に示されており、例えば１９８７年８月５日に公開されたEP 230,869；１９８４年１２月１９日に公開されたEP128,773；又は１９８８年１０月２６日に公開されたEP288,451に記載の方法によって調製される。さらに好ましくは、この天然配列ＩＧＦ−Iは、臨床検査の為に、組み換え体によって生成され，そしてジェネンテク，インコーポレィテッド，サウス サン フランシスコ，カルフォルニアより入手可能である。
【００２９】
ここで使用される“ＩＧＦ−II”は、牛、羊、豚、及び馬、好ましくはヒトを含むすべての種の天然インシュリン様成長因子−Iに相当し、外部からの投与については、天然、合成、又は組み換え体であろうと、どのソースからのものについても天然インシュリン様成長因子−Iに相当する。例えば、EP128,733に記載の方法によって、その調整が可能である。
【００３０】
“ＩＧＦＢＰ”又は“ＩＧＦ結合タンパク質”は、循環性であろうとなかろうと（例えば、血清又は組織）、ＩＧＦ−I又はＩＧＦ−IIと会合、又は結合する、或いは複合体となるタンパク質又はポリペプチドに相当する。このような結合タンパク質には、受容体が含まれない。この定義には、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、Ｍａｃ２５（ＩＧＦＢＰ−７）、及びＩＧＦＢＰと高い相同性を有する他のタンパク質と同様にプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）又は内皮細胞特異性細胞（ＥＳＭ−１）が含まれる。Ｍａｃ２５は、例えば、Swisshelm等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:4472-4476(1995)及び Oh等., J. Biol. Chem. 271: 30322-30325(1996)に記載されている。ＰＳＦは、Yamauchi等., Biochemical Journal, 303: 591-598(1994)に記載されている。ＥＳM−１は、Lassalle等., J.Biol.Chem. 271: 20458-20464(1996)に記載されている。他の同定されたＩＧＦＢＰについては、例えば、１９９０年６月２７日に公開されたEP 375,438；１９９０年５月２３日に公開さたEP369,943；１９８９年１０月５日に公開されたWO89/09268；Wood等., Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185(1988)；Brinkman等., The EMBO J., 2417-2423(1988)；Lee等., Mol. Endocrinol., 2:1176-1185(1988)；Brewer等., BBRC,152:1289-1297(1988)；１９８８年１２月７日に公開されたEP294,021；Baxter等.,BBRC,147:408-415(1987)；Leung等., Nature, 330: 537-543(1987)；Martin等., J. Biol. Chem., 261: 8754-8760(1986)；Baxter等., Comp.Biochem.Physiol., 91B:229-235(1988)；１９８９年９月２１日に公開されたWO89/08667；１９８９年１０月１９日に公開されたWO89/09792；及びBrinkert等., EMBO J., 8:2497-2502(1989)を参照のこと。
【００３１】
“体液”という用語は、哺乳類からの液体の生物学的サンプル、好ましくはヒトからのものに相当する。この体液は、血清、血漿、リンパ液、滑膜液、濾胞性液、羊水液、乳、全血液、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、発汗、粘液、組織培養培地、組織抽出物、細胞抽出物などの水性液体を含む。
【００３２】
ここで使用される“ヒトＩＧＦ受容体”は、ヒトにおいて発見されたＩＧＦの為のすべての受容体に相当し、胎盤１型ＩＧＦ−I受容体のような、ヒトＩＧＦ−I及びＩＧＦ−IIが結合するヒトの１型及び２型ＩＧＦ受容体を含む。
“ペプチド”とは、少なくとも２個のアミノ酸を有するＩＧＦ−Iアゴニスト／ＩＧＦ−II変異体を含み、少なくとも５０個のアミノ酸を有するポリペプチドを含む。その定義は、ペプチド誘導体、それらの塩類、又は光学異性体を含む。
【００３３】
“ＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を特徴とする疾患”とは、同化と代謝恒常性の制御に関与しているＧＨ／ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ系の欠陥を伴う、又は陥っている哺乳類の状態に相当する。これらの疾患は、成長、生理、及び／又は糖血症制御に欠陥のあること、及びＩＧＦ過剰又は欠乏、及び／又はＩＧＦＢＰ−３レベルの減少及び／又はＩＧＦＢＰ−１レベルの増加によって明らかになるＧＨ耐性及び／又は欠乏の臨床的症状を伴う欠陥を特徴とする。例としては、高血糖性疾患、腎臓疾患、うっ血性心臓疾患、肝疾患、栄養失調、ターナー症候群、エイズによる消耗性疾患のようなタンパク質合成の減少を伴う消耗病候群、哺乳類において重い病気以外の疾患に比較してＩＧＢＦＢＰレベル（例えばＩＧＦＢＰ−１レベル）が増加することを特徴とする異化状態、窒素バランスの減少を伴う疾患、グルココルチコイド過多によって生じるタンパク質異化作用などの疾患がある。グルココルチコイドの過多を伴う一例としては、多量のステロイドホルモン治療にさらされている新生児と思春期前の哺乳類のような、ネフローゼ症候群又は全繊毛萎縮症の子供達のような実質上標準的な成長の維持が切望されている患者である。治療によって頻繁に併発する腎不全症、又は、被験者が大人ではない場合に時に重要だが、他の疾患の治療を受けている患者の好転した成長を促進する体重の減少を最小化するという理由から、例えば異化及び腎疾患を治療する場合には、さらなる相乗作用が関与する。
【００３４】
これら疾患の殆どは、次の生化学的側面を特徴とする：乱れたグルコース制御、炎症、過剰ＩＧＦＢＰ−１レベル、低ＩＧＦＢＰ−３レベル、低ＩＧＦ生物活性、及び過剰ＧＨレベル。これらの状態の確認は、標準的臨床的手法、例えば、分子レベルのＥＬＩＳＡ(,酵素結合免疫測定法）、臨床化学、ＲＩＡ（放射線免疫検定法）、又はバイオアッセイ（生物学的検定法）によって可能である（参照、例えば、Jones等., 同上; Davidson, 同上; Moses, 同上; Lewitt 等., 1991, 同上; Rosenfield等., 同上; Lee等., 1997, 同上; Cox等., 同上; Lewitt等., 1993 同上; Barreca等., 同上; Schmueli等., 同上; Murphy等., 同上; Rajkumar等., 同上; Hall等., 同上; Ross等., 同上; Scharf等., 同上; Bereket等., Endocrinology,同上;Crown及びHolly, 同上; Underwood及びBackelijauw等., 同上; Thraikill等., 同上; Bereket等., Clinical Endocrinology同上; Batch等., 同上; 及びPowell等., 1997同上; ）。
【００３５】
ここで使用される、用語“高血糖性疾患”は、高インスリン血症及び高脂血症、例えば肥満患者、及びメンデンホール症候群、ウェルナー症候群、妖精症、脂肪萎縮性糖尿病、及び他の脂肪萎縮症などのインシュリン耐糖性糖尿病と同様にI型及びII型糖尿病のようなすべての型の糖尿病に相当する。好ましい高血糖性疾患は糖尿病であり、特にI型及びII型である。“糖尿病”そのものは、不適切なインシュリンの生成と利用が関与する進行性の炭水化物代謝の疾患に相当し、高血糖と糖尿を特徴とする。
【００３６】
ここで使用される、用語“高血糖性薬剤”とは、膵臓及びインシュリンによるインシュリンの分泌を起こす分泌促進物質、好ましくは経口投与剤に相当する。ヒトの使用でここにおいてさらに好ましくは、インシュリン及びスルホニル尿素類の高血糖性薬剤である。例としては、グリブリド、glipizide、グリクラジドが含まれる。さらに、インシュリン感受性を促進する薬剤、例えばビグアナイド類がこの定義に入り、そして同じく好ましい。
【００３７】
ここで使用される“インシュリン”とは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、好ましくはヒトを含む全ての種、及び天然、合成、又は組み換え体に関わらず全てのソースからの全てのタイプのインシュリンに相当する。例えば、Diabetes Mellitus - Theory and Practice, fourth edition, Harold Rifkin, MD, Ed. (Elsevier, New York, 1990), Chapter29, and U.S. Pharmacist, 18(Nov. Suppl.)p.38-40(1993)に報告されている全てのインシュリン薬剤は、この点で適している。Jens Brange, Galenics of Insuline, The Physico-chemical and Pharaceutical Aspects of Insulin and Insulin Preparations(Springer-Verlag, New York, 1987), page 17-40 において言及されているような、市場にある全ての各型のヒトインシュリンが含まれている。これらには、レギュラーインシュリン、イソフェン・インシュリンとも呼ばれるＮＰＨ（Neutral Protamine Hagedorn）インシュリン、７０％のＮＰＨ−インシュリンと３０％のレギュラーインシュリンから成る７０／３０インシュリン、Semilente インシュリン、UltraLente インシュリン、Lente インシュリン、及びHumalog インシュリンが含まれる。ここで動物への使用として好まれるのは、ヒトインシュリンをヒトの治療へ使用するなど、治療を受ける対象となる特定の種の型のインシュリンである。
【００３８】
ここで定義される“腎疾患”とは、任意に透析を必要とする可能性がある前歴の急性或いは慢性腎疾患と関連している腎機能不全症で、限定されないが、例えば、慢性腎臓機能不全、末期慢性腎疾患、一次及び二次糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、間質性腎炎、腎盂腎炎など、糖尿病患者のKimmelstiel-Wilson、及び腎移植後の腎不全；同様に急性腎疾患及び虚血による腎尿細管壊死；糖尿病又は自己免疫性腎障害と関連する腎機能障害；臓器移植の為に投与される腎毒性薬又は腎毒性免疫抑制剤への副作用；腎臓移植後の患者の急性拒絶反応；腎多嚢胞病及び関連する徴候；腎形成異常；腎形成不全；先天性腎異常；他の疾患で脊髄のbifida、solitary 腎臓、interuterine 成長阻害、成長異常を伴う小児科の症候群（例えば、ターナー症候群及びダウン症候群）、及び同様な疾患；慢性臓器障害に苦しむ者、小さな腎臓の移植を経験した者(臓器のさらなる成長が除去された場合）、尿細管の中毒に苦しむ対象者、化学療法を経験している対象者（例えば、癌患者）、及び同様な場合；尿毒症、タンパク尿症、及び無尿症のような身体所見を含む。このような疾患は、必ずＩＧＦ−Iによる治療から恩恵を受けるであろうし、好ましくは末期前又は末期慢性腎疾患或いは慢性腎不全症である。
ここで使用される“腎臓活性分子”は、電解質の再吸収及び保持を促進、又は他の点では腎疾患を治療する為に作用する。例は下記に提供される。
【００３９】
ここで使用される、用語“治療”は、治療上の処置、及び予防的又は再発防止の二者に相当する。治療を要する者とは、疾患を患う傾向にある者、又は疾患と診断された者、或いは疾患を予防する者と供に、すでに疾患を患っている者である。継続治療又は投与とは、一日又はそれ以上の治療の中断を除く、少なくとも一日を基本単位とする治療に相当する。間欠治療又は投与、治療又は投与を断続的方法でおこなうことは、連続的ではない治療に相当し、むしろ本質的には循環である。ここにおける治療法は、連続的でも断続的でもよい。
【００４０】
ここで使用される、血清交換及び外因性ＩＧＦの組織レベルという文脈中の“活性”又は“生物学的に活性”ＩＧＦとは、その受容体に結合する、さもなければ、ここで言及される内因性又は外因性ＩＧＦの生物活性のような生物活性を生じさせることに相当する。
【００４１】
Ｂ．発明を実行する為の様式
ここの本発明は、一つの側面において、野生型ヒトＩＧＦ−Iの位置１６、２５、又は４９のアミノ酸、或いは天然配列ヒトＩＧＦ−Iの位置３及び４９がアラニン、グリシン、及び／又はセリン残基と置換されたことに関する。好ましくは、当該の１個又は２個のアミノ酸がアラニン又はグリシン残基、最も好ましくはアラニンと置換される。
【００４２】
本発明のペプチドは、化学合成或いは組み替え技術を用いることによって作製することが可能である。これらの技術は、当該技術分野においては知られている技術である。化学合成、特に固相合成法は、短いペプチド（５０残基未満）又はＤ−チロシン、オルニチン、アミノアジピン酸、及びその類似物などの非天然或いは異常アミノ酸を含むペプチドの合成に好まれる。組み替え法は、長いペプチドに好まれる。組み替え法が選択された場合には、合成遺伝子がデノボ合成される、又は天然遺伝子が、例えばカセット式変異誘発法によって構築される。下記に示されるのは、模範的な一般的組み換え法である。
精製ＩＧＦ及びそのアミノ酸配列から、例えば組み替えＤＮＡ技術によってＩＧＦ親分子のペプチジル変異体であるＩＧＦ変異体の生成が可能である。これらの技術は、簡略化された形で、天然又は合成であろうと、ペプチドをコードする遺伝子を取り出す；遺伝子を適切なベクターへ挿入する；ベクターを適切な宿主へ挿入する；遺伝子発現の為に宿主を培養する；それによって生産されたそしてペプチドを回収又は単離すことを意図する。好ましくは、回収されたペプチドは、その後、相応する程度まで精製される。
【００４３】
若干より詳しくは、ペプチジルＩＧＦ変異体をコードするＤＮＡは、適した宿主で発現するようにクローン化及び操作される。親ペプチドをコードするＤＮＡは、ゲノムライブラリー、ペプチドを発現する細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、又は合成的に構築されたＤＮＡ配列によって得ることが可能である（Sambrook等., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2ded.), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989）。
そして、親ＤＮＡは、宿主細胞の形質転換に使用される適切なプラスミド又はベクターへ挿入される。一般には、宿主との関連において、宿主と適合する種由来の複製及びコントロール配列を含むプラスミドベクターが使用される。ベクターは、通常、形質転換細胞の形質選択を提供できるタンパク質又はペプチドをコードする配列と同様に、複製部位を持つ。
例えば、大腸菌は、大腸菌由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用することによって形質転換される（Mandel等., J.Mol.Biol.53:154(1970)）。プラスミドは、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、それ故に選択が容易な方法を提供する。他のベクターは、発現にしばしば重要な異なったプロモーターのような、異なった特徴を含む。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０、及びｐＰＬ−ｌａｍｂｄａは、ｔａｃ、ｔｒｐ、又はＰＬプロモーターを持つ、程なく入手可能な発現ベクターである（Pharmacia biotechnology）。
【００４４】
好ましいベクターは、ｐＢ０４７５である。このベクターは、宿主間を往復することを可能にするファージ及び大腸菌の為の複製開始点を有し、それによって突然変異誘発及び発現を容易にする（Cunningham等., Science, 243: 1330-1336(1989); U.S.Pat. No. 5,580,723）。他の好ましいベクターは、ｐＲ１Ｔ５及びｐＲ１Ｔ２Ｔである（Pharmacia Biotechnology）。これらのベクターは、挿入された遺伝子が融合タンパク質として発現できるように、プロテインＡのＺドメインが適切なプロモーターに続いて含まれている。
他の好ましいベクターは、前記に示したベクターの適切な特徴を組み合わせることによる標準的技術を使用することで構築が可能である。適切な特徴とは、プロモーター、リボゾーム結合部位、decorsin又はornatin遺伝子、或いは遺伝子融合（プロテインＡのＺドメイン及びdecorsin又はornatinとそのリンカー）、抗生物質耐性マーカー、及び適切な複製開始点を含む。
【００４５】
宿主細胞は、原核生物又は真核生物でよい。原核生物は、親ＩＧＦ−Iポリペプチド、断片置換ペプチド、及びペプチド変異体を生産する為に、ＤＮＡ配列のクローニング及び発現の為に好まれる。例えば、大腸菌Ｋ−１２株２９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１４４６）は、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１５３７）、及び大腸菌ｃ６００及びｃ６００ｈｆｌ、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ガンマ、原栄養／ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７３２５）、枯草菌のような桿菌、ネズミチフス菌又はセラチア・マルセッセンス菌のような腸内細菌，及び様々なシュードモナス属と同様に使用される。好ましい原核生物は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。原核生物において発現された場合、ペプチドはＮ末端メチオニン又はホルミルメチオニンを含み、グリコシル化されていない。融合タンパク質の場合は、Ｎ末端メチオニン又はホルミルメチオニンが融合タンパク質のアミノ末端に、又は融合タンパク質のシグナル配列が存在する。これらの例は、限定的というよりも実証となることを意図されている。
原核生物に加えて、酵母培養菌、又は多細胞生物由来の細胞のような真核生物が使用することができる。基本的には、そのような全ての細胞が機能する。しかし、関心は脊椎動物細胞についてがもっとも大きく、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は再現性のある方法になっている（Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors(1973)）。このような有用な宿主株化細胞は、ＶＥＲＯ及びHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の株化細胞、Ｗ１３８，２９３，ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、及びＭＤＣＫ株化細胞である。
【００４６】
前記方法の変形は、所望するペプチドをコードする遺伝子が、ベクター中の他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコードする遺伝子と関連している場合に、遺伝子融合を意図するものである。これは、所望するペプチドが他のタンパク質又はペプチドと融合し、宿主細胞によって生産される結果となる。「他の」タンパク質又はペプチドとは、多くの場合、細胞から分泌が可能なタンパク質又はペプチドのことで、所望するペプチドの培養液からの単離及び精製、そして所望するペプチドが菌体内に止まる場合に生じる宿主細胞を破壊する必要性を除くことを可能にする。もう一つの方法としては、融合タンパク質は細胞内に発現することが可能である。
遺伝子融合は、必須ではないが、後のこれら遺伝子産物の精製のみならず大腸菌における異種ペプチドの発現を容易にする（Harris, Genetic Engineering, Willianson, R., Ed.(Academic Press, London, Vol.4, 1983), p.127; Ljunguist等., Eur.J.Biochem., 186: 557-561(1989)及びLjungquist等., Eur.J.Biochem., 186: 563-569(1989)）。プロテインＡ融合は、プロテインＡの結合、より詳しくはプロテインＡのＺドメインのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製の為の「親和性取っ手」を提供することから、頻繁に使用される。多くの異種タンパク質が大腸菌内で直接に発現されると分解されることが知られているが、融合タンパク質として発現された場合は安定である（Marston, Biochem J., 240: 1(1986)）。
【００４７】
融合タンパク質は、メチオニン、又はヒドロキシアミン、アスパラギン及びグリシン残基間を切断する臭化シアンのような化学薬品を使用することによって切断が可能である。標準的な組み替えＤＮＡ技術を使用することによって、これらアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対は、所望するペプチドをコードする遺伝子の５' 末端の即前に挿入することができる。
もう一つの方法としては、融合タンパク質のタンパク質分解による切断を使用することが可能である（Cater, Protein Purification: From Molecular Mechanism to Large-Scale Process, Ladish等., eds.(American Chemical Society Symposium Series No.427,1990), Ch13, page 181-193）。
第Ｘａ因子、トロンビン、及びサブチリシン又はその変異体、他の多数のプロテアーゼが、融合タンパク質の切断に首尾よく使用されている。典型的には、プロテアーゼによる切断を受けやすいペプチドリンカーは、「他の」のタンパク質（例えばプロテインＡのＺドメイン）と所望するペプチドとの間に挿入される。組み替えＤＮＡ技術を使用すると、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対は、他のタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子断片の間に挿入される。タンパク質分解による正確なリンカーを含む部分精製融合タンパク質の切断は、その結果、天然融合タンパク質、又は還元型或いは変性融合タンパク質についておこなうことができる。
【００４８】
ペプチドは、融合タンパク質として発現した場合は、適切に折り畳まれる或いは折り畳まれないことがある。さらに、切断部位を含有する特定のペプチドリンカーは、プロテアーゼへ接触可能又は接触不可能なことがある。これらの要因が、融合タンパク質は変性及び再折り畳みがなされるべきなのか、もしそうならば、これらの手段を切断の前又は後に用いられるべきなのかを確定する。
変性及び再折り畳みが必要な場合は、通常は、ペプチドは塩酸グアニジンのようなカオトロピック剤によって処理され、その後、例えばペプチドが天然構造へと再折り畳むような適切な割合、ｐＨ、及び温度において、還元及び酸化型ジチオスレイトール又はグルタチオンを含有する酸化還元緩衝液によって処理される。
【００４９】
ペプチドが組み替えＤＮＡ技術によって調製されない場合は、ペプチドは、一般的に、Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85: 2149(1963)に記載されているような固相合成法によって調製されるが、当該技術分野において周知である他の同等な化学合成法も使用可能である。固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適合する樹脂と連結することによってＣ末端から開始する。そのような開始物質は、α−アミノ基が保護されたアミノ酸をクロロメチル化された樹脂又はヒドロキシメチル化された樹脂にへエステル結合すること、又はＢＨＡ樹脂或いはＭＢＨＡ樹脂へアミド結合することによって調製が可能である。ヒドロキシメチル化樹脂の調製方法は、Bodansky等., Chem.Ind.(London), 38: 1597-1598(1966)に記載されている。クロロメチル化樹脂は、BioRad Laboratories, Richmond, CA 及び Lab. system, Inc.より入手可能である。そのような樹脂の調製方法は、Stwart等., "Sold Phase Peptide Synthesis"(Freeman & Co., San Francisco 1969), 第１章, pp.1-6 に記載されている。ＢＨＡ及びＭＢＨＡ樹脂担体は、商業的に入手可能で、一般的には、合成された所望のポリペプチドが、Ｃ末端に置換されていないアミドを有している場合のみに使用される。
【００５０】
アミノ酸は、ペプチド結合の形成に関する技術分野のにおいて周知の技術を使用することによりペプチド鎖と連結される。一つの方法は、カルボキシル基のペプチド断片の遊離Ｎ末端アミノ基との反応をさらに受けやすくする誘導体へとアミノ酸を変換することを含む。例えば、アミノ酸は、保護されたアミノ酸のクロロギ酸エチル、クロロギ酸フェニル、ｓｅｃ−クロロギ酸ブチル、クロロギ酸イソブチル、塩化ピバロイル、又は類似の酸塩化物との反応によって混合無水酸化物への変換が可能である。他の選択としては、アミノ酸は、２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、又はエステル型の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの活性型エステルへ変換へ可能である。
その他のカップリング法は、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド又はＮ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミドなどの適したカップリング剤を使用することを含む。他のカップリング剤で、当該技術に熟練している者に明らかなものは、E.Gross & J.Meienhofer, The Peptide: Analysis, Structure, Biology, Vol.I: Major Method of Peptide Bond Formation(Academic Press, New York, 1979)に記載されている。
【００５１】
ペプチド合成に使用される各々のアミノ酸のα−アミノ酸基は、側鎖がそれらの活性α−アミノ機能に関与することを防ぐ為に、カップリング反応中は保護されるべきことが認識されなければならない。あるアミノ酸が反応性の側鎖機能基（例えば、メルカプト(スルフヒドリル）、アミノ、カルボキシ、及び水酸基（ヒドロキシ））を有し、そのような機能基は、初期とそれに続くカップリング段階において、適した保護基によって化学反応から同じく保護されなければならないことも認識されなければならない。当該技術分野で知られている適した保護基は、Gross & .Meienhofer, The Peptide: Analysis, Structure, Biology, Vol.3:" Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis"(Academic Press, New York, 1981)に記載されている。
【００５２】
ペプチド合成に使用される特定の側鎖保護基の選択では、次の一般的規則が順守される。
α−アミノ保護基は（ａ）カップリング反応が用いられている条件下においては、α−アミノ機能を不活性にする、（ｂ）側鎖保護基を除かない及びペプチド断片の構造を改変しない条件下においては、カップリング反応後は容易に除去可能でなけれならない、（ｃ）カップリング直前の活性化においては、ラセミ化の可能性を除去しなければならない。側鎖保護基は（ａ）カップリング反応が用いられている条件下においては、側鎖機能基を不活性にする、（ｂ）α−アミノ保護基を除去の際に用いられている条件下では、安定でなけれならない、（ｃ）ペプチド鎖の構造を改変しない条件下では、所望のアミノ酸ペプチドの完成時には容易に除去可能でなければならない。
【００５３】
ペプチド合成に有用な保護基が、それらの除去の為に使用される薬剤との反応性によって変わることは、当該技術分野に熟練した者には明らかなことである。例えば、トリフェニルメチル及び２−（ｐ−ビフェニニル）イソプロピキシルカルボニルのようなある保護基は、温和な酸性の条件においては、非常に弱くそして開裂する可能性がある。ｔ−ブチルロキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ−アミロキシカルボニル、アダマンチル−オキシカルボニル、及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルのような他の保護基は、不安定とは言えず、トリフロオロ酢酸塩、塩酸、又は酢酸中の三フッ化ホウ素などの中程度の強酸性をそれらの除去の為に必要とする。さらには、ベンゾイルオキシカルボニル（ＣＢＺ又はＺ）、ハロベンゾイルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンゾイルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、及びイソプロピルオキシカルボニルなどの他の保護基は、やはり不安定とは言えず、フッ化水素、臭化水素、又はトリフルオロ酢酸中のホウ化トリフルオロ酢酸などの強酸をそれらの除去の為に必要とする。
有用なアミノ酸保護基の種類は：
【００５４】
（１）α-アミノ酸基については、（ａ）芳香族ウレタン型保護基、例えばフルオレニルメチルカルボニル（ＦＭＯＣ）ＣＢＺ、及び置換されたＣＢＺ、例えばｐ-クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ-６-ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ-ブロモベンジルカルボニル及びｐ-メトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ-クロロベンジルオキシカルボニル、２,４-ジクロロベンジルオキシカルボニル、２,６-ジクロロベンジルオキシカルボニルなど；（ｂ）脂肪族ウレタン型保護基、例えばＢＯＣ、ｔ-アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２-(ｐ-ビフェニリル)-イソプロピルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルなど；（ｃ）シクロアルキルウレタン型保護基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びシクロへキシルオキシカルボニル；及び（ｄ）アリールカルボニル。好ましいα-アミノ保護基はＢＯＣ及びＦＭＯＣである。
（２）Ｌｙｓに存在する側鎖アミノ基については、保護は、ＢＯＣ、ｐ-クロロベンジルオキシカルボニル等といった上記（１）に述べた任意の基によってなされる。
（３）Ａｒｇのグアニジド基については、保護は、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、アダマンチルオキシカルボニル、２,２,５,７,８-ペンタメチルクロマン-６-スルホニル又は２,３,６-トリメチル-４-メトキシフェニルスルホニル、又はＢＯＣによってなされる。
（４）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒのヒドロキシル基については、保護は、例えば、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、例えばｔ-ブチル；ベンジル（ＢＺＬ）；置換ＢＺＬ、例えばｐ-メトキシベンジル、ｐ-ニトロベンジル、ｐ-クロロベンジル、ｏ-クロロベンジル、及び２,６-ジクロロベンジル。
（５）Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシル基については、保護は、例えば、ＢＺＬ、ｔ-ブチル、シクロへキシル、シクロペンチルなどの基を用いたエステル化によってなされる。
（６）Ｈｉｓのイミダゾール窒素については、トシル部が好ましく使用される。
（７）Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基については、テトラヒドロピラニル、tert-ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４-ブロモベンジル、又は２,６-ジクロロベンジルなどの保護基が好ましく使用される。好ましい保護基は２,６-ジクロロベンジルである。
（８）Ａｓｎ又はＧｌｎの側鎖アミノ基については、キサンチル（Ｘａｎ）が好ましく用いられる。
（９）Ｍｅｔについては、アミノ酸は好ましくは保護せずに残す。
（１０）Ｃｙｓのチオ基については、ｐ-メトキシベンジルが典型的に用いられる。
【００５５】
Ｃ-末端アミノ酸、例えばＬｙｓは、Ｎ-アミノ位置において適切に選択された保護基、Ｌｙｓの場合はＢＯＣによって保護される。ＢＯＣ-Ｌｙｓ-ＯＨは、最初にベンジルヒドリルアミン又はクロロメチル化樹脂に、Horiki等, Chemistry Letters, 165-168 (1978)に記載された方法に従って又はイソプロピルカルボジイミドを用いて約２５℃で２時間攪拌しながら結合させる。ＢＯＣ保護アミノ酸の樹脂支持体への結合に続いて、α-アミノ酸保護基を、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はＴＦＡ単品を用いるなどして除去する。脱保護は、約０℃から室温までの温度で実施する。他の標準的な開裂試薬、例えばジオキサン中のＨＣｌ、及び特定のα-アミノ保護基の除去条件は文献に記載されている。
【００５６】
α-アミノ保護基の除去の後、残ったα-アミノ及び側鎖保護アミノ酸を望まれる順序で段階的に結合させる。合成において各アミノ酸を別々に添加する代わりに、固相合成機に添加する前に互いに結合させてよいものもある。適当なカップリング試薬は当業者の技量の範囲内である。カップリング試薬として特に好ましいのは、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジイミドである。
各保護アミノ酸又はアミノ酸配列は固相反応器に過剰に導入し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はＣＨ２Ｃｌ２又はそれらの混合物の媒体中でカップリングを適切に実施させる。不完全なカップリングが生じた場合、次のアミノ酸のカップリングに先立つＮ-アミノ保護基を除去する前にカップリング方法を繰り返す。合成の各段階でのカップリング反応の成功を監視してもよい。合成を監視する好ましい方法は、Kaiser等, Anal. Biochem., 34: 595 (1970)に記載されたニンヒドリン反応である。カップリング反応は、周知の方法、例えばBIOSEARCH 9500(商品名)ペプチド合成機を使用して自動的に実施できる。
【００５７】
所望のペプチド配列が完成したら、保護ペプチドを樹脂支持体から切断し、全ての保護基を除去しなければならない。切断反応及び保護基の除去は、同時に又は段階的に好ましく達成される。樹脂支持体がクロロメチル化ポリスチレン樹脂である場合、ペプチドを樹脂に繋留している結合は、Ｃ末端残基の遊離カルボキシル基と樹脂マトリクス上に存在する多数のクロロメチル基の一つの間のエステル結合である。繋留結合は、エステル結合を切断でき樹脂マトリクスを透過できることが知られた試薬によって切断できる。
【００５８】
一つの特に便利な方法は、液体無水フッ化水素での処理による。この試薬はペプチドを樹脂から切断するだけでなく、全ての保護基を除去するであろう。従って、この試薬を使用することは、完全に保護されたペプチドを直接に生じる。クロロメチル化樹脂を使用した場合、フッ化水素処理は遊離のペプチド酸の形成をもたらす。ベンズヒドリルアミン樹脂を使用した場合、フッ化水素処理により直接に遊離のペプチドアミンとなる。アニソール及びジメチルスルホキシドの存在下での０℃で１時間のフッ化水素との反応は、同時に側鎖保護基を除去し、樹脂からペプチドを解放する。
保護基を除去することなくペプチドを切断することが望まれる場合、保護ペプチド−樹脂にメタノール分解を施して、Ｃ-末端カルボキシル基がメチル化された保護ペプチドを生成させることができる。このメチルエステルは、次いで、温和なアルカリ条件下で遊離のＣ-末端カルボキシル基を与える。次いで、ペプチド鎖上の保護基を液体フッ化水素などの強酸で処理することにより除去する。メタノール分解についての特に有用な技術は、Moore等, Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp., M. Goodman及びJ. Meinhofer, 編, (John Wiley, N.Y., 1977), p. 518-521のものであり、そこでは保護ペプチド−樹脂がクラウンエーテルの存在下でメタノール及びシアン化カリウムで処理される。
【００５９】
クロロメチル化樹脂を使用した場合に保護されたペプチドを樹脂から切断する他の方法は、加アンモニア分解又はヒドラジンでの処理である。必要ならば、得られるC-末端アミド又はヒドラジドは加水分解して遊離のＣ-末端カルボキシル部とでき、保護基は従来技術により除去できる。
また、Ｎ-末端α-アミノ基に存在する保護基も、保護ペプチドが支持体から切断される前又は後に優先的に除去してよいと認められる。
本発明のポリペプチドの精製は、典型的には従来の手法、例えば分離用ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣを含む）又は他の周知のクロマトグラフィ技術、例えばゲル浸透、イオン交換、分配クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（モノクローナル抗体カラムを含む）、又は向流分配によって達成される。
【００６０】
本発明のペプチドは、重合によって安定化させてもよい。これは、モノマー鎖を多官能性架橋試薬で直接的に、又は多官能性ポリマーを介して間接的に架橋させることにより達成される。通常は、２つの実質的に同一のポリペプチドが、二官能性架橋試薬を用いてそれらのＣ-又はＮ-末端において架橋する。試薬は、末端アミノ及び／又はカルボキシル基を架橋するために使用される。一般に、両末端カルボキシル基又は両末端アミノ基が互いに架橋するが、適切な架橋試薬を選択することにより、一方のポリペプチドのアルファアミノが他方のポリペプチドの末端カルボキシル基と架橋する。好ましくは、ポリペプチドはそれらのＣ-末端においてシステインで置換されている。この分野で良く知られた条件下で、末端システイン間でジスルフィド結合が形成され、それによりポリペプチド鎖が架橋される。例えば、ジスルフィド架橋は、遊離のシステインの金属触媒酸化により又は適切に修飾されたシステイン残基の求核置換によって便利に形成される。架橋試薬の選択は、ポリペプチドに存在するアミノ酸の反応性側鎖の個性に依存するであろう。例えば、ジスルフィド架橋は、システインがポリペプチドのＣ-末端以外のさらなる部位に存在する場合には好ましくないであろう。また、この範囲には、メチレン架橋で架橋したペプチドも包含される。
【００６１】
Ｎ-末端アミノ及びＣー末端カルボキシル基以外の、ペプチド上の好適な架橋部位は、リジン残基上に見られるイプシロンアミノ基、並びにペプチドの内部残基又はフランキング配列に導入された残基の側鎖に位置するアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル及びヒドロキシル基を含む。外部から添加された架橋試薬を介する架橋は、例えば、当業者に馴染み深い多くの試薬を用いて、例えば、ポリペプチドのカルボジイミド処理を介して適当に達成される。好適な多官能性（通常は二官能性）架橋試薬の他の例は文献に見いだされる。
本発明のペプチドは、環化によって立体配置的に安定化させてもよい。ペプチドは通常、一のペプチドの−及びＣ-末端ドメインを本発明の他のペプチドの対応するドメインに共有結合させることにより環化され、２又はそれ以上の反復ペプチド配列を含み、各反復ペプチドが実質的に同じ配列を有するシクロ-オリゴマーを形成する。さらに、環化したペプチド（シクロ-オリゴマー又はシクロ-モノマーのいずれか）は、架橋して１−３の環状構造を形成し、その中には２から６のペプチドが含まれる。ペプチドは好ましくはα-アミノ及び主鎖カルボキシル基（頭部から尾部）を介して共有結合せず、−及びＣ-末端ドメインに位置する残基の側鎖を介して架橋する。よって結合部位は一般に残基の側鎖間になるであろう。
【００６２】
ここで考慮されるようなモノ-又はポリ環化ペプチドを調製するために、多くの好適な方法自体は知られている。Ｌｙｓ／Ａｓｐ環化は、Ｌｙｓ／ＡｓｐについてＦｍｏｃ／９-フルオレニルメチル（ＯＦｍ）側鎖保護を持つ固相支持体上でＮａ-Ｂｏｃ-アミノ酸を用いて達成され；この方法は、環化に続くピペリジン処理によって完了する。
Ｇｌｕ及びＬｙｓ側鎖も、環状又は二環状ペプチドの調製において架橋され；このペプチドはｐ-メチルベンズヒドリルアミン樹脂上の固相化学によって合成される。ペプチドは樹脂から切断されて脱保護される。環状ペプチドは、希釈メチルホルムアミド中のジフェニルホスホリルアジドを用いて形成される。これに代わる方法については、Schiller等, Peptide Protein Res., 25: 171-177 (1985)を参照のこと。米国特許第4,547,489号参照。
【００６３】
ジスルフィド架橋又は環化されたペプチドは従来の方法により生成される。Pelton等（J. Med. Chem., 29: 2370-2375 (1986)）の方法は、シクロ-モノマーの調製についてPelton等に記載された希釈反応混合物よりも濃厚な溶液中で反応を実施することにより多くの割合でシクロ-オリゴマーが生成されることを除いて好ましい。同じ化学は、ダイマー又はシクロ-オリゴマー又はシクロ-モノマーの合成に有用である。また有用なのはチオメチレン架橋である。Lebl及びHruby, Tetrahedron Letters, 25: 2067-2068 (1984)。また、Cody等, J. Med. Chem., 28: 583 (1985)参照。
望ましい環状又は重合性ポリペプチドは、ゲル濾過に次ぐ逆相高圧液体クロマトグラフィ又は他の従来の手法により精製される。ペプチドは滅菌濾過され、従来からの薬理学的に許容される媒体中に処方される。
【００６４】
ここに記載するプロセス必要とされる出発材料は文献で知られているか、又は周知の方法及び周知の出発材料から調製できる。
４つの異なる置換基に結合した炭素原子から生成されたペプチドが不斉の場合、ペプチドはジアステレオマー、エナンチオマー又はそれらの混合物として存在しうる。上記の合成は、出発材料又は中間体としてラセミ化合物、エナンチオマー又はジアステレオマーを用いてもよい。そのような合成から得られるジアステレオマー生成物は、クロマトグラフィ又は結晶化法によって分離しうる。同様に、エナンチオマー混合物は、同様の技術又はこの分野で知られた他の技術によって分離してよい。各不斉炭素原子は、存在する場合は、２つの立体配置Ｒ又はＳの一方でよく、それらともに本発明の範囲内である。
【００６５】
本発明のペプチドは、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下注射或いは注入、又は移植）、経鼻、肺、膣、直腸、舌下、又は投与の局所的方法を含む全ての適切な方法による哺乳類への投与が可能であり、各々の投与方法に適した投薬形態を定式化することができる。具体的なの投与方法は、例えば、ペプチドを使用することによる副作用で感知又は予知されるもの全て、投与されているペプチドの種類、及び治されるべき特定の種類の疾患を含む患者の病歴によって決まる。最も好ましくは、投与は、連続注入（例えば、遅放出装置、又は浸透ポンプ或いは皮膚用パッチ剤のような小型ポンプ）、又は注射（例えば、静脈又は皮下の方法）による。
治療に使用されるペプチドは定式化され、そして良い医療診断、患者個人の臨床状況（特にペプチドによる治療の副作用）、疾患の種類、ペプチドの到達部位、投与方法、投与予定、及び開業医が把握している他の要因を考慮することと一致する方法で投薬される。従って、ここにおける目的の為のペプチドの有効量は、このような考慮によって定められ、量は哺乳類と所望する効果にとって薬の生物学的利用能とならなければならない。
【００６６】
好ましい投与とは、ＩＧＦ−Iの効果を再生するための、約４−８週間に渡る１日に２回の慢性投与である。注射が好ましいが、連続皮下（ＳＣ）注入のための輸液用器具を使用することによる慢性輸液も用いることができる。静脈内嚢溶液も用いることができる。問題の疾患への適切な投与量を選択するための重要な要因は、測定により得られた結果で、糖尿病の場合では、例えば、標準範囲を概算するための血中ブドウ糖の減少、又は医師によって判断される疾患の治療方法を評価する他の基準である。
一般的な考え方としては、一服の非経口投与された薬学的に有効なペプチドの量は、用量反応曲線によって測定可能な範囲にある。例えば、ＩＧＦＢＰに結合したＩＧＦ又は血中ＩＧＦは、服用を決めるための治療を受けている哺乳類の体液によって測定が可能である。代替方法としては、増加するペプチドを患者へ投与し、ＩＧＦ−I及びＩＧＦ−IIのために患者の血清レベルを調べることができる。下記の実施例３にある、ヒト血清中のＩＧＦＢＰをＩＧＦ−Iトレーサーに置換することを参照のこと。
特に、ペプチドの適切な服用を決める一つの方法は、体又は血中などの生物的体液中のＩＧＦレベルの測定を伴う。それらを測定する方法は、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡを含むすべての方法によっておこなうことが可能である。ＩＧＦレベルを測定した後、単回投与又は複数回投与の使用により体液はペプチドと接触する。この接触段階の後、ＩＧＦレベルは体液中で再測定される。体液中のＩＧＦレベルが所望する効力が生じるための十分な量によって低下した場合、その場合は、その分子の服用は最高の効力が生じるように調製可能である。この方法は、インビトロ又はインビボで実行できる。好ましくは、この方法は、インビボで実行される、すなわち体液が哺乳類から抽出され、ＩＧＦレベルが測定された後、ここでのポリペプチドは単回又は複数回投与の使用によって投与され（すなわち、接触回数は哺乳類への投与によって達成される）、そしてＩＧＦレベルは、哺乳類から抽出された体液から測定される。
【００６７】
服用を決定するもう一つの方法は、ペプチドへの抗体又はＬＩＦＡフォーマットにおけるもう一つのペプチドの検出方法を使用することである。これは、ＩＧＦＢＰへ結合している内因性又は外因性ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰへ結合しているペプチドの量の検出を可能にする。
服用を決めるもう一つの方法は、血中の“遊離”又は活性ＩＧＦのレベルを測定することであろう。ある用途においては、“遊離”ＩＧＦのレベルは、効力及び有効服用量又は服用の適切な指標である。
【００６８】
例えば、一つの方法は、ＩＧＦ結合タンパク質に結合した内因性又は外因性ＩＧＦ、又はここにおけるペプチドの総量の検出、或いは生物体液中の非結合ＩＧＦレベルの検出することが記載されている。この方法は、次を含む：
（ａ）体液を１）ペプチドの存在下において、ＩＧＦ結合部位がＩＧＦ結合タンパク質との結合に利用可能な状態でペプチド上に残存するような固相担体へ付着したポリペプチド（例えば、ペプチド上のエピトープの第一抗体）に対して特異的なペプチドを検出する媒介と接触させ、その結果によって媒介とＩＧＦ結合タンパク質間に複合体を形成する；及び２）一定の期間中に、ＩＧＦ結合タンパク質上の全ての利用可能なＩＧＦ結合部位を飽和するの十分なペプチドと接触させ、その結果によって飽和複合体を形成する；
（ｂ）ペプチドがＩＧＦ結合タンパク質と結合している時に、結合に利用可能なＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ上のエピトープに特異的な第二抗体のような）へ特異的な検出可能なラベルされた第二の媒介と飽和複合体を接触させる；及び
（ｃ）生物体液中のＩＧＦＢＰの指標として結合しているラベル化媒介の総量、及びそれから体液中に存在する結合したペプチドの総量、ＩＧＦ結合タンパク質、結合したＩＧＦ，又は活性ＩＧＦの指標として結合しているラベル化媒介の総量の数量的な分析。
前記の方法により投薬量を決定すると、一般的に、使用するペプチドの総量の見積もりが可能である、すなわち、前記に記したように、この方法はかなりの治療上の自由裁量が前提としているが、患者の体重のｋｇに基づいて、約１０μｇ／ｋｇ／日から２００μｇ／ｋｇ／日が使用可能である。例えば、慢性腎疾患の治療においては、一日の投与量は、好ましくは約１０から１６０μｇ／ｋｇ、より好ましくは２０から１００μｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは約２５から７５μｇ／ｋｇである。
【００６９】
さらなる方法が、特定のＩＧＦＢＰ上のＩＧＦの分布を見積もるために提供されている、例えば、ＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３に関してＬＩＦＡフォーマットを使用ことである。
ペプチドは、徐放性システムによって適正に投与される。徐放性組成物の適正な例は、造形品の形の半浸透性ポリマー基質、例えばフイルム、又はマイクロカプセルを含む。半浸透性ポリマー基質は、ポリ乳酸（U.S. Pat. No. 3,773,919. EP58, 481）、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタミン酸の共重合体（Sidman等., Biopolymers, 22,547-556(1983)）、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリル酸)(Langer等., J.Biomed.Mater.Res., 15:167-277(1981), 及びLanger, Chem.Tech., 12: 98-105(1982))、エチレンビニル酢酸（Langer等., 同上）又はポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)を含む。徐放性組成物は、また、リポソーム包含ペプチドを含む。ペプチドを包含するリポソームは、それ自体で知られている方法で調整される：DE 3,218,121；Epstein等., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692(1985)；Hwang等., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88, 046；EP 143,949；EP 142,641；Japanese Pat. Appln. 83-118008；U.S. Pat. Nos. 4,485,045 及び4,544,545；及びEP 102,324。通常、リポソームは脂質含有量が約３０モルパーセントコレステロールを越える小さな単層形(約２００から８００オームストロング）で、その選択された部分は最も効果的な治療のために調節されている。
【００７０】
長い寿命を有するポリエチレングリコール化されたペプチドを、例えば、１９９５年１１月３０日に公開されたWO95/32003に記載の共役技術に基づいて利用することも可能である。
非経口投与のためには、一実施態様は、ペプチドは、一般的に、製薬的、或いは非経口的に許容可能な担体、すなわち使用投薬量及び濃度が投与対象者にとって無毒、そして製剤中の他の成分と共存可能な担体と供に所望する純度でそれぞれを単位投与量の注射可能な形態(溶液、懸濁液、又は乳濁液)の中で混合することによって製剤化される。例えば、製剤は、好ましくは酸化剤、及びポリペプチドに対して有害だと知られている他のペプチドを含まない。
一般的に、製剤は、ペプチドを均等且つ密接に液体担体又は細粒固体担体、或いは両方と接触させることによって調製される。そして、必要ならば、産物は所望の製剤形態へ成形される。好ましくは、担体は非経口担体で、さらに好ましくは、溶液は、受給者の血液と等張である。そのような担体媒介物の例としては、水、生理食塩水、リンガー液、緩衝化された溶液、デキストロース液を含む。非溶液媒介物、不揮発性油及びオレイン酸エチルなどもここでは有用である。
【００７１】
担体は、等張性及び化学的安定性を高める物質のような微量の添加物を適当に含んでいる。このような物質は、使用投与量及び濃度において投与対象者へは無毒であり、リン酸、クエン酸、コハク酸などの緩衝液、及び有機酸とそれらの塩類；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量(１０残基より少ない)ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又はイムノグロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、又はアルギニンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、及びセルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ(エチレンジアミン4酢酸)などのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン；ポリソルベート、poloamers、又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)；及び／又は塩類、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２などを含む。
ペプチドは、一般的に、これら媒介物中でｐＨ４．５又はおよそ４．５から８で製剤化される。前記の賦形剤、担体、又は安定化剤のいくつかの使用が、塩類やペプチドを形成する結果となることは理解される。最終調製は、安定な液体又は凍結乾燥固形物となる。
【００７２】
製薬的組成物としてのペプチドの典型的な製剤形態が、下記に論じられている。一般に受け入れている製薬的な慣習を必要とするように、遊離酸又は塩基の形或いは製薬的に許容可能な塩としての、およそ０．５から５００ｍｇのペプチド又はペプチドの混合物は、製薬的に許容可能な媒介物、担体、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香料、などと混合される。これら組成物の活性成分の総量はこのようなので、示唆された範囲内の適正な投薬量が得られる。
治療投与に使用されるペプチドは、無菌でなければならない。無菌性は、無菌濾過膜(例えば、０．２ミクロンの膜)による濾過によって容易に達成する。一般的に、治療組成物は、例えば静脈注射用の溶液袋、又は皮下注射針により穴をあけることが可能な栓を有するバイアルなど、無菌引き込み口を有する容器へ配置される。
【００７３】
通常、ペプチドは、例えば、封管されたアンプル又はバイアルに、水溶液又は再構成用の凍結乾燥製剤として、単一又は多投与量容器に貯蔵される。凍結乾燥製剤の例としては、１０-ｍＬバイアルを５ｍＬの無菌濾過済みの１％(Ｗ／Ｖ)ペプチド水溶液で満たし、この混合物を凍結乾燥する。注入液は、静菌性の注射用水を使用する凍結乾燥ペプチドの再構成によって調製する。
ここにおけるペプチドと、血中ＩＧＦを増加させる又はペプチドの効果を促進する一つ或いはさらに他の適正な試薬による併用療法も、本発明の一部である。一般的に、これらの試薬は、ここにおけるペプチドが生成ＩＧＦを放出することを可能にする。例えば、ペプチドとの組み合わせでは、他の活性分子を投与することが望ましい。例えば、消耗又は異化状態のためには、ペプチドはＭＥＧＡＳＥＴＭのような食欲促進剤と共に投与することが可能である。
その上、ペプチドは適正に投与され、投与のための受容体又は抗体或いは抗体断片と結合する。
さらなる併用療法は、ヒト成長ホルモン、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−５のような成長ホルモンを含む。
【００７４】
高血糖性疾患の治療では、ペプチドは、スルホニル尿素又は全ての種類のインシュリンのような高血糖剤の有効量とと共に適切に投与される。高血糖剤は、非経口、鼻腔内、経口、又は他の全ての効果的なルートを含む全ての適切な手法によって哺乳類へ投与される。最も好ましくは、投与は経口ルートである。例えば、アップジョンより１．２５、２．５、５ｍｇ錠剤濃度で市販されているＭＩＣＲＯＮＡＳＥＴＭ錠剤(グリブリド)は、経口投与に適している。この疾患に処方されるII型糖尿病用の通常継続投与量は、一般的には、１．２５から２０ｍｇ／日又はおよそその範囲で、単回投与又は適正と判断される一日当たりの分割投与で与えられる(Physician's Desk Reference, 2563-2565(1995))。処方に使用可能なグリブリドを基礎とする錠剤の他の例は、ＧＬＹＮＡＳＥＴＭ商標薬(アップジョン)及びＤＩＡＢＥＴＡＴＭ商標薬(ヘキスト-ルセル)を含む。ＧＬＵＣＯＴＲＯＬＴＭ(プラット)は、グリピシド(１-シクロヘキサン-３-［ｐ-[２-(５-メチルピラジンカルボキシアミド)エチル]フェニル]スルフォニル]尿素)錠剤の登録商標で、５及び１０ｍｇ効力の両方が入手可能で、さらには食事療法に続き低血糖症の治療を必要とするII型糖尿病患者、又は他のスルホニル尿素へ反応しなくなった患者へ処方される(Physician's Desk Reference, 1902-1903(1995))。ビグアナイド剤(メトホルミン及びフェンホルミン)又はtroglitozoneのようなスルホニル尿素以外の低血糖剤、或いはインシュリンの作用へ影響する他の薬剤の使用も可能である。
【００７５】
うっ血性心臓疾患の治療においては、体血管抵抗の低減及び循環性うっ血の軽減に対して、ＡＣＥ阻害剤がここにおけるペプチドとともに有用である可能性がある。ＡＣＥ阻害剤は、これら登録商標で命名されたものには限定されないが、Accupril(登録商標、quinapril)、Altrace(登録商標、ramipril)、Capoten(登録商標、captopril)、Lotensin(登録商標、benazepril)、Monopril(登録商標、fosinopril)、Prinivil(登録商標、lisinopril)、Vasotec(登録商標、enalapril)、及びZestril(登録商標、lisinopril)を含む。ＡＣＥ阻害剤の一例は、登録商標Capoten(登録商標）で売られている。無商標ではcaptoprilとなるこのＡＣＥ阻害剤は、化学的には１-[(２Ｓ)-３-メルカプト-２-メチルプロピオニル]-Ｌ-プロリンと表される。
腎疾患では、ペプチドは、例えば心房性ナトリウム利尿ペプチド(ＡＮＰ）、ＡＮＰ類似体、又は受容体活性を有する或いは有しないそれの全ての変異体、urodilatin、ヒトＢ型ナトリウム利尿性ペプチド(ＢＮＰ）、アンジオテンシン受容体アンタゴニスト、バソプレシン及びその類似体のような電解質の再吸収と保持を促進する腎活性分子、及び抗体又はペプチドアンタゴニストのようなエンドセリンアンタゴニストとともに適切に投与される。一例は、ＢＱ−１２３(Ihara等., Life Science, 50: 247-250(1992); JP 51-94254A １９９３年８月３日公開; Webb等., Biochem. Biophys. Res. Comm., 185: 887-892(1992))で、エンドセリンＡ受容体の潜在的及び特異的遮断剤であり、エンドセリン−１、ＣＴ−１ではなく、マウスＬＩＦ、又はフェニレフリンによって誘導される肥大性活性のみを遮断する環状ペンタペプチドである。その他の例は、Ihara等., Biochem. Biophys. Res. Comm., 178: 132-137(1991)によって記載されているＢＱ−１２３の親化合物である。さらなる例は、EP 647,236；EP647,449；EP633,259(phenyl-sulfonyl-amino-pyrimidine derivaties)；EP601,386(sulfonamide compounds)；U.S. Pat. No.5,292,740(phenylsulfonylamidopyrimidines)；及びU.S. Pat.No. 5,270,313(phenyl-sulfonyl-aminopyrimidine derivaties)に記載のものを含む。その上、アンジオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)阻害剤は、腎疾患のＩＧＦ−I治療に関連して有益である。
【００７６】
さらに、食事及び運動療法などのＩＧＦの状況を操作する他の方法も本発明の一部としての併用療法と考えられている。例えば、ペプチドを、ケト酸補助剤などの栄養補助剤との組み合わせる又は組み合わせないＥＮＳＵＲＥＴＭなどの高カロリーの食事又は食物とともに投与できる。
ここにおける発明は、ペプチドをコードする核酸を使用する哺乳類のための遺伝子治療を使用することも意図している。一般的には、遺伝子治療は、哺乳類のＩＧＦレベルを増加(過剰発現)させるために使用される。ペプチドをコードする核酸は、この目的のために使用される。一度、アミノ酸配列が明らかになると、遺伝子コードの縮重を使用することによって幾つかの核酸分子を作ること、及びその中から遺伝子治療ヘ使用するものを選択することが可能である。
遺伝子治療の目的の為に、核酸(選択的にベクターに含まれる)を患者の細胞へ導入する二つの主要な方法がある：インビボ及びエキソビボである。インビボデリバリーにおいては、普通は、核酸は直接にプチドを必要とする患者の部位ヘ注入される。エキソビボの治療においては、患者の細胞が取り出され、核酸はこれら単離された細胞へ導入され、そして改良された細胞は患者へ直接又は、例えば、患者へ移植される多孔質膜によってカプセル化される。U.S. Patent Nos. 4,892,538 及び5,283,187を参照のこと。
【００７７】
生細胞へ核酸を導入することを可能にする多様な技術がある。技術は、核酸をインビトロで培養細胞へ転移するのか、又はインビボで意図された細胞へ転移するのかによって変わる。インビトロで哺乳類細胞へ核酸を転移するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション(電気穿孔法)、マイクロインジェクション(微量注入法)、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。遺伝子のエキソビボ輸送に頻繁に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
最近、好まれるインビボの核酸転移技術は、ウイルスベクターによるトランスフェクション(アデノウイルス、,単純疱疹Iウイルス、又はアデノ随伴ウイルスなど)及び脂質を基礎とするシステム(遺伝子の脂質媒介転移に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌ、など)である。ある状況では、細胞表層膜又は標的細胞ヘ特異的な抗体、標的細胞上の受容体へのリガンドなどの標的細胞を標的とする薬剤を核酸のソースへ供給することが望ましい。リポソームが使用された場合は、エンドサイトーシス(飲食作用)と関連している細胞表層膜タンパク質と結合するタンパク質は、標的化及び／又は取り込みを容易にすることに使用される、例えば、キャプシドタンパク質又はそれの断片、特定の細胞の向性、サイクリングで内部移行を受けるタンパク質への抗体、及び細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を増進するタンパク質。受容体媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等., J.Biol.Chem., 262:4429-4432(1987)；及びWanger等., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87:3410-3414(1990)に記載されている。最近、知られている遺伝子標識及び遺伝子治療の手順は、Anderson等., Science,256:808-813(1992)を参照のこと。WO93/25673及びそれに引用されている参考文献も参照のこと。
【００７８】
本発明のために、キットも意図されている。典型的なキットは、製薬的に許容可能な緩衝液にあるペプチドを含むペプチド製剤の為の容器、好ましくはバイアル、及び使用者へ製薬的薬剤を哺乳類のＧＨ／ＩＧＦ軸の調節不全を特徴とする疾患の治療へ使用することを指示した製品折り込み広告又はラベルのような取扱い説明書を含む。キットは、選択的に、腎疾患のための腎活性分子のような組合せ分子のための容器、好ましくはバイアルを含む。
本発明は、下記の実施例の参照によってさらに十分に理解できる。しかし、それらは、本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。ここにおいて言及された全ての文献及び特許の引用文は、参考文献によって明白に含まれている。
【００７９】
実施例１
ＩＧＦ−Ｉ及び構造変異体のアラニン−スキャンニング突然変異誘発
序：
アラニン−スキャンニング突然変異誘発法（上掲のCunningham及びWells）を用いてＩＧＦ−Ｉの各側鎖のβ炭素を越えた部分を取り除いた。ついでＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３に対するペプチドの結合の自由エネルギーへのこれらの原子の寄与を競合ファージＥＬＩＳＡ法によって検査した。このアッセイでは、ＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３を用いてＩＧＦ−ファージ変異体がＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３被覆免疫吸着プレートへ結合するのを阻害する。結合タンパク質の滴定列から結合性（ＩＣ５０）を計算することができる。幾つかの変異体はまたＢＩＡＣＯＲＥＴＭアッセイにおける直接結合性についても調べた。
実施例では、通常のαアミノ酸は、中間体と最終生成物を指すとき、標準的な一文字又は三文字アミノ酸コードによって記述される。通常のαアミノ酸とはｍＲＮＡの指示下でタンパク質内に導入されるアミノ酸を意味する。標準的な略語はメルクインデクス、１０版、pp Misc-2−Misc-3に列挙されている。特に断らない限り、通常のαアミノ酸はα炭素原子において自然のもしくは「Ｌ」立体配置を有している。「Ｄ」がコードの先にくる場合は、これは通常のαアミノ酸とは反対の鏡像異性体を表している。ノルロイシン（Nle）及びオルニチン（Orn）のような改変された又は普通でないαアミノ酸は米国特許商標庁オフィシャルガゼット１１１４ＴＭＯＧ、１９９０年５月１５日に記載されているように示した。以下に記載するＩＧＦ変異体を用いた実験の結果に基づいて、ここに請求されたタイプの分子が治療される患者における活性ＩＧＦ量を増加させるであろうと予測される。
【００８０】
材料と方法：
ファージミドベクターの作成と突然変異誘発
成熟ヒトＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を、ＰＣＲプライマー5'-AGCTGCTTTGATATGCATCTCCCGAAACTCTGTGCGGT-3'（配列番号：４）及び5'-GAGCGATCTGGGTCTAGACAGATTTAGCGGGTTTCAG-3'（配列番号：５）を用いてｐＢＫＩＧＦ２Ｂ（米国特許第５３４２７６３号）から増幅した。得られた断片をＮｓｉＩ及びＸｂａＩで切断し、先にＮｓｉＩ及びＸｂａＩで消化させたｐＨ０７５３中に結合させた。ｐＨ０７５３はｐｈＧＨａｍ−ｇ３の派生体（Lowman等, Biochemistry, 30: 10832-10838 (1991)）であり、アルカリホスファターゼプロモータ（ＰｈｏＡ）の更なるＸｂａＩ部位がオリゴヌクレオチド5'-AAAAGGGTATGTAGAGGTTGAGGT-3'（配列番号：６）を用いて欠失させられている。ＩＧＦ−１オープンリーディングフレームを含む連結ベクターｐＨ０７５３は、ｐＩＧＦ−ｇ３と命名した。これは、大腸菌バクテリオファージＭ１３由来の遺伝子ＩＩＩタンパク質の断片（残基２４９−４０６）に融合した二重突然変異Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖを有するＩＧＦ−１をコードしている。このＩＧＦＢＰ−１及び−３へのＩＧＦ−Ｉ変異体の結合性は野生型ＩＧＦ−Ｉとは区別できないことが分かった。アラニン突然変異誘発は鋳型として一本鎖プラスミドｐＩＧＦ−ｇ３を用いて実施した（Kunkel等, Methods Enzymol., 204: 125-139 (1991)）。システインとアラニンを除くＩＧＦ−Ｉの全ての残基が個々にアラニンに置換された。得られた作成物をＤＮＡ配列決定によって検証した。
【００８１】
ＩＧＦＢＰ−１及び−３へのファージにディスプレイされたＩＧＦ変異体の結合性（ファージＥＬＩＳＡ）
免疫吸着プレート（Nunc, MAXISOR PTM, ９６ウェル）を、ｐＨ７．２のＰＢＳバッファー中１μｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３を１００μｌ／ウェルで用いて４℃にて一晩かけて被覆した。ついでプレートを室温で２時間の間０．５％のＴＷＥＥＮ２０ＴＭ／ＰＢＳ（また結合バッファーとして使用）で阻害した（ウシ血清アルブミンのようなタンパク質様阻害剤は潜在的なＩＧＦ又はＩＧＦＢＰ汚染を防止するために避けた）。ファージミドベクターで新しく形質転換した大腸菌細胞（XL1-Blue, Stratagene）をＭ１３−ＶＣＳヘルパーファージ（Stratagene）の存在下で５ｍLの２ＹＴ培地（上掲のSambrook等）中で一晩かけて増殖させた。ファージ粒子を収集し、Cabilly, S. (編), Combinatorial Peptide Library Protocols (Humena Press Inc.: Totowa, NJ, 1009), pp.249-264中のLowman, H.B., 「Pharge Dsiplay of Peptide Libraries on Protein Scaffolds」に記載されたようにしてＰＢＳバッファー中に再懸濁させた。ついで、ファージ濃度を基準化し、各変異体に対して０．２−０．４の最大ＥＬＩＳＡシグナルを生じさせた（上掲のCabilly, S. (編)のLowman）。可溶型競合体の３倍連続希釈物を、先に決定した濃度でファージを含む結合バッファー（０．５％のＴＷＥＥＮＴＭ２０／ＰＢＳ）で非吸着マイクロタイタープレート（Nunc, F, ９６ウェル）上に調製した。競合タンパク質の希釈範囲はＩＧＦＢＰ−１に対して５μｍとＩＧＦＢＰ−３に対して５００ｎＭで出発して１０６の規模まで広げた。阻止後、固定化した標的を含むプレートを０．０５％のＴＷＥＥＮＴＭ／ＰＢＳバッファーで洗浄し、ついで室温で１時間の間８０μｌ／ウェルの前もって混合されているファージ−競合体溶液と共にインキュベートした。洗浄後、結合したファージを、０．５％のＴＷＥＥＮＴＭ／ＰＢＳ中に一次ウサギ抗ファージポリクローナル抗体と二次ヤギ抗ウサギモノクローナル抗体−西洋わさびペルオキシダーゼ抱合体を含む溶液を８０μｌ／ウェル用いて検出した。ｏ−フェニレンジアミン（Sigma）とテトラメチルベンジジン（Kirkegaard及びPerry）を色素生産物質として使用し、生成物をそれぞれ４９２及び４５０ｎｍで検出した。ＩＣ５０値は、結合データを基準飽和曲線に一致させることにより決定された（上掲のCabilly, S. (編)のLowman）。各ＩＧＦ−Ｉ変異体の少なくとも二つの個々のクローンが検定された。表Ｉの数は個々に評価されたＩＣ５０値の平均±標準偏差を表している。
【００８２】
ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３の発現と精製
Mortensen等, Endocrinology, 138: 2073-2080 (1997)により記載されているようにして、ヒトＩＧＦＢＰ−１をＣＨＯ細胞中で発現させ、条件培地から精製した。組換えヒトＩＧＦＢＰ−３をまたクローニングし、哺乳動物細胞で発現させた（Wood等, Mol. Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988)）。条件培地からの精製は、ＩＧＦアフィニティーカラム（Martin及びBaxter, J. Biol. Chem., 261:8754-8760 (1986)）を用いて、本質的にＩＧＦＢＰ−１に対して記述された手順に従った。
【００８３】
可溶型ＩＧＦ−Ｉ変異体の発現と精製
プラスミドｐＢＫＩＧＦ２Ｂ（米国特許第５３４２７６３号）はＰｐｈｏＡプロモータの制御下でｌａｍＢのリーダーペプチドに融合したヒト野生型ＩＧＦ−Ｉを発現する。部位特異的突然変異誘発の簡単化のために、ファージｆ１複製起点（F1 ori）をプラスミドｐＢＫＩＧＦ２Ｂ中に導入した。そのために、f1 oriを含む４６６ｂｐのＢａｍＨＩ断片をｐＨ０７５３から切除し（上掲のLowman,1991）、プラスミドｐＢＫＩＧＦ２ＢをＥｃｏＲＩで線形化した。ベクターと断片の双方をクレノー酵素で処理して、平滑末端連結に先立って付着末端制限部位を充填した。Ｍ１３ＶＣＳヘルパーファージの存在下で一本鎖ファージミドＤＮＡをつくり出す能力について正しい作成物を選択した。得られたファージミドベクターをｐＢＫＩＧＦ２Ｂ−ｆ１−ｏｒｉと名付け、Kunkel等, Methods Enzymol., 204: 125-139 (1991)の手順を使用して対象のＩＧＦ−Ｉala−変異体を作成するために鋳型として用いた。突然変異誘発の各工程はＤＮＡ配列決定により確認した。
ＩＧＦ−Ｉ変異体の発現は、ＩＧＦ−Ｉ野生型に対して記述されているようなもの（Joly等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2773-2777 (1998)）であったが、オキシドレダクターゼの一過性の過剰発現が伴わなかった。精製手順は、過去のプロトコールに基づき（Cleland, J. L. (編), Protein Folding In Vivo and In Vitro (American Chemical Society, Washington,DC, 1993), pp.178-188)中の Chang及びSwartz, "Single-Step Solubilization and Folding of IGF-1 Aggregates from Escherichia coli）、僅かに適合化させた。典型的には、６ｇの湿った細胞ペースト（２４時間成長させた２リットルの低ホスフェート培地と等価）を５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．５の２５ｍＭのトリス-ＨＣｌの１５０ｍｌ中に再懸濁させた。細胞をマイクロフルイダイザー（Microfluidics Corp., Newton, MA）中で溶解させ、蓄積したＩＧＦ−Ｉ凝集物を含む屈折粒子を１２０００ｘｇで遠心分離により収集した。屈折粒子を溶解バッファーで２回、１％のＮ−ラウロイル−サルコシン（Sigma）を含む溶解バッファーで２回洗浄して膜タンパク質を抽出し、溶解バッファーで再び２回洗浄した。洗浄した屈折体を、２Mの尿素、１００ｍMのＮａＣｌ、２０％のＭｅＯＨ、及び２ｍＭのＤＴＴを含むｐＨ１０．４の５０ｍＭのＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸；Sigma）バッファー中におよそ２ｍｇ／ｍｌで再懸濁させた。この手順は屈折体の可溶化と続くＩＧＦ−Ｉ変異体の酸化リフォールディングを組み合わせるものである（上掲のChangとSwartz）。室温で３時間後、リフォールディング溶液を、５０ｋＤａの分子量カットオフ性を持つマイクロコンセントレーター膜（Centricon, Amicon）を通して濾過した。殆どの単量体ＩＧＦ−Ｉが溶出液中に回収される一方、より高分子の汚染物は未透過物中に集中していた。この時点で、ＩＧＦ−Ｉ画分は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析から判断したところ、＞９５％の純度であった。ＩＧＦスワップ（二つの非天然ジスルフィドを含む；Hober等, Biochemistry, 31: 1749-1756 (1992)；Miller等, Biochemistry, 32: 5203-5213 (1993)）から正しくジスルフィド結合したＩＧＦ−Ｉを分離するために、リフォールディング溶液を５％の酢酸で酸性化し、４ｍｌ／分でＤｙｎａｍａｘＴＭＣ１８半調製用ＨＰＬＣカラム（Varian；１０．０ｍｍＩＤ）に充填した。バッファーはＨ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（Ａ）及びアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ（Ｂ）であった。ジスルフィド異性体の分離は次の勾配：０−３０％Ｂを２０分、３０−４５％Ｂを６０分を適用して達成された。ＩＧＦ−スワップに対する未変性ＩＧＦ−Ｉの比は各変異体に対して通常は約２：１であり、ＩＧＦ−スワップは未変性ＩＧＦ−Ｉより先の勾配で溶出した。各変異体の分子量は質量分析により検証した。ＨＰＬＣ精製後に、試料を凍結乾燥し、１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４中におよそ１ｍｇ／ｍｌで再構成した。
【００８４】
バイオセンサーによる反応速度測定
ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ変異体の結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ−２０００リアルタイム反応速度相互作用分析システム（Biacore, Inc., Piscataway, NJ）を使用して会合（ｋａ）速度と解離（ｋｄ）速度を測定することにより決定した。カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, BIAcore Inc.）をＥＤＣ（Ｎ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボイミドヒドロクロリド）及びＮＨＳ（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド）で活性化させた。固定化については、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中のＩＧＦ変異体を５０μｇ／ｍｌの濃度でバイオセンサーチップに注入し、およそ４５０−６００ＲＵ（共鳴応答単位）の共有的に結合したタンパク質を生成した。未反応群は１Ｍのエタノールアミンの注入で阻害した。反応速度の測定を、２５℃で２０μｌ／分の流量を用いて、流れるバッファー（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％卵白アルブミン、０．１％アジ化ナトリウム）中ＩＧＦＢＰ−１かＩＧＦＢＰ−３の何れかの２倍の連続希釈物（１μＭで開始）を注入することにより実施した。会合速度（ｋａ）と解離速度（ｋｄ）はＢＩＡＣＯＲＥＴＭ評価ソフトウェア３．０バージョンにおいて１：１のラングミュアー（Langmuir）TM会合モデルを用いて別個に計算した。平行解離定数（ＫＤ）はｋｄ／ｋａとして計算した。
【００８５】
結果
ＩＧＦ−１の一価ファージディスプレイ
ＩＧＦ−Ｉの７０のアミノ酸残基の迅速かつ包括的なアラニンスキャンのために、タンパク質がファージＭ１２の表面に一価的にディスプレイされるかどうかが最初に決定された（Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)）。ファージディスプレイ技術は迅速な一本鎖ＤＮＡ突然変異誘発の利点を、対応するファージ粒子の単なる単離によって、得られた変異体タンパク質の簡単な生成と組み合わせるものである（例えば上掲のCunningham等, 1994）。成熟ヒトＩＧＦ−ＩがＭ１３遺伝子ＩＩＩ産物のカルボキシ末端ドメインに融合されたベクターが作成された。この作成物は大腸菌の細胞膜周辺腔に融合タンパク質を向かわせ、タンパク質の一価ディスプレイを可能にするｓｔＩＩシグナル配列を含んでいる（上掲のBass等；上掲のLowman等, 1991）。クローニングのために、ＩＧＦ−１の最初のアミノ酸と最後のアミノ酸を変えた：得られた変異体Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖは続くアラニンスキャンニング突然変異誘発のための鋳型作成物として使用した。
ＩＧＦ−Ｉ Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖをディスプレイするファージ粒子を単離し、ＩＧＦＢＦに対するその親和性についての結合競合ファージＥＬＩＳＡ法において検定したとき、その実験で決定されたＩＣ５０はＩＧＦＢＰ−１に対しては８．５ｎＭ、ＩＧＦＢＰ−３に対しては０．５ｎＭであった（図．１）。これらの値は野生型ＩＧＦ−Ｉを使用するＢＩＡＣＯＲＥＴＭ実験により決定された解離定数（上掲のHeding等）とよく一致している。放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定された野生型ＩＧＦ−Ｉ親和性は、ＩＧＦＢＰ−１に対して〜２．８ｎＭ、ＩＧＦＢＰ−３に対して〜０．８ｎＭであり、更にファージＥＬＩＳＡ法から導かれたＩＣ５０値を裏付けている。また、ＩＧＦ−Ｉ Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖをディスプレイするファージ粒子は、マイクロタイタープレート上に固定した１１の独立したモノクローナルマウス抗ＩＧＦ−Ｉ抗体によって効率的に捕捉された。これらの結果を併せると、ディスプレイされたＩＧＦ変異体が正しく折り畳まれ、ファージ粒子の表面に接近可能であることが示唆される。
【００８６】
ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３へのＩＧＦ−Ｉ結合のＡｌａ−スキャンニング突然変異誘発
Ｇ１Ｓ−Ａ７０ＶＩＧＦ−Ｉの全ての残基を、４固の未変性アラニン及び６個のシステインを除いて、記述したＧ１Ｓ−Ａ７０ＶＩＧＦ−ＩｇＩＩＩベクターを鋳型として使用して、個々にアラニンで置換した。また、単一変異体Ｓ１Ｇ及びＶ７０Ａ及び野生型ＩＧＦ−Ｉを修復する二重変異体を作成した。これらの作成物の各々が大腸菌において発現され、ファージにディスプレイされた。ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３への結合性に対するＩＣ５０値は図１に示したような競合ファージＥＬＩＳＡ法によって測定した。各変異体の少なくとも二つの異なったクローンを試験した。得られたＩＣ５０値は表１に列挙し、Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖに対する各変異体に対するＩＣ５０の減少又は増加は図２にグラフで表す。
【００８７】
【００８８】
アラニン変異体の大部分はファージＥＬＩＳＡ法においてＩＣ５０値の僅かな変化を生じただけであった。重要なことは、野生型ＩＧＦ−Ｉがバックグラウンドにおいてアラニン置換が実施されたＧ１Ｓ−Ａ７０Ｖと同じ親和性をＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３に対して示したことである。アラニンに変化したときほんの僅かな残基だけが有意な（＞１０倍）親和性の損失を引き起こした：ＩＧＦＢＰ−１結合に対してはＥ３、Ｇ７、Ｌ１０、Ｖ１１、Ｆ２５、Ｒ３６、Ｐ３９、Ｆ４９及びＰ６３；ＩＧＦＢＰ−３結合に対してＶ１１、Ｒ３６、Ｐ３９、及びＰ６３。グリシンとプロリンのａｌａ−置換はタンパク質骨格の構造的な攪乱に至りうることを述べておく（Di Cera, Chem. Rev., 98: 1563-1591 (1998)）。
結合親和性におけるほんの僅かな緩やかな改善がアラニン置換によって見出された。Ｓ１Ａ，Ｄ１２Ａ及びＤ４５ＡはＩＧＦＢＰ−１結合性においておよそ２倍の増加を示す一方、Ｓ３５Ａ及びＴ４１ＡはＩＧＦＮＢＰ−３に対して同様の効果を示した。しかしながら、ＩＣ５０値の２倍の変化がこれらの実験における精度の限界である。
【００８９】
ＩＧＦＢＰ特異性決定因子
Ｅ３Ａ、Ｇ７Ａ、Ｌ１０Ａ、Ｆ２５Ａ及びＦ４９はＩＧＦＢＰ−１対ＩＧＦＢＰ−３の結合において差次的な効果を示した。これらの５つのＩＧＦ−Ｉ単一アラニン変異体において、ＩＧＦＢＰ−１の相対ＩＣ５０はＩＧＦＢＰ−３のものとは４倍以上異なっていた（図２；表１、相対的特異性）。Ｅ３ＡとＦ４９Ａはこの群において最も大きな相対特異性因子を示した。Ｅ３のアラニン置換はＩＧＦＢＰ−３の親和性には実質的に効果を持っておらず（１．４倍）、ＩＧＦＢＰ−１への結合は３４倍弱くされている。更に劇的なことには、Ｆ４９Ａの親和性はＩＧＦＢＰ−１に対しては１００倍以上減少しているがＢＰ−３に対しては３．６倍だけである。この結果は、ファージＥＬＩＳＡ法による直接の比較において示した。ＩＧＦ−Ｉ Ｆ４９Ａをディスプレイするファージ粒子を可溶型ＩＧＦＢＰ−１（図３Ａ）又はＩＧＦＢＰ−３（図３Ｂ）の存在下でＩＧＦＢＰ−３被覆ウェルに添加した。ＩＧＦ−Ｉ Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖをディスプレイしている対照ファージと比較して、Ｆ４９Ａの結合曲線はＩＧＦＢＰ−１競合において１０２以上シフトした（図３Ａ）。これに対して、結合曲線はＩＧＦＢＰ−３競合においては同様であり、ＩＣ５０値の差異はファクター４未満であった（図３Ｂ）。よって、Ｅ３とＦ４９はＩＧＦ−Ｉ分子においてＩＧＦＢＰ−１結合のための二つの主要な特異性決定因子である。
残基Ｇ７、Ｌ１０及びＦ２５は、アラニンによって置換されたときＩＧＦＢＰ−３に対するよりもＩＧＦＢＰ−１に対する親和性の顕著な損失を示したが、両方のＩＧＦＢＰの結合に対して重要であると思われた。ＩＧＦＢＰ−３に対しては、ＩＧＦＢＰ−３に対してよりもＩＧＦＢＰ−１に対してより強く結合する変異体のような、有意な特異性決定因子は特定されなかった。しかし、変異Ｅ９Ａ、Ｄ１２Ａ、Ｆ２３Ａ、Ｙ２４Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｓ３４Ａ及びＤ４５ＡはＩＧＦＢＰ−１結合性についてよりもＩＧＦＢＰ−３に対して僅かに大きな（約２倍）効果を有していた。
【００９０】
精製された可溶型ＩＧＦ変異体のＢＩＡＣＯＲＥＴＭ測定
ファージＥＬＩＳＡ法によって得られた結果の妥当性の確認のために、特異的アラニン変異体を発現させ、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ装置を用いた反応速度分析のために精製した。野生型ＩＧＦ−Ｉの解離定数（ＫＤ）はＩＧＦＢＰ−１に対しては１３ｎＭで、ＩＧＦＢＰ−３に対しては１．５ｎＭであると決定された（図５Ａと５Ｂ；表２）。ＩＧＦＢＰに対する親和性の差異は、ＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−Ｉの１０倍速い会合速度（ｋａ）のためである（３．２ｘ１０５対３．２ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１）。これらの結果はファージＥＬＩＳＡによって測定された絶対ＩＣ５０値とよく対応している（図１Ａ及び１Ｂ；表Ｉ）。予想されるように、二重変異体Ｇ１Ｓ−Ａ７０Ｖは野生型とは本質的に区別ができない反応速度パラメータを示した（表２）。
Ｖ１１Ａ、Ｒ３６Ａ及びＰ３９Ａは、これらの変異体はファージに正しくディスプレイされなかったので、抗体認識実験（上を参照）に基づいて試験した。Ｒ３６ＡとＰ３９Ａは双方の結合タンパク質に対して野生型の反応速度を示したが、Ｖ１１ＡはＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３の双方に対して親和性の５倍の減少を示した。
更に、可溶型ＩＧＦ変異体Ｔ４Ａを試験することが決定された。この残基は以前の刊行物（上掲のBayne等, J. Biol. Chem., 263; 上掲のClemmons等, 1990）においてはＩＧＦＢＰ結合に関連していたが、ここでのファージアッセイでは穏やかな効果を示していた。野生型ＩＧＦ−Ｉに対するＴ４ＡのＫＤ値の増加はファージＥＬＩＳＡ法により測定されたＩＣ５０比よりおよそ２−３倍高かった（表２）。ファージ及びバイオセンサー分析により得られた結果の間の大きな矛盾はＦ１６Ａに対して見られた。この場合、二つの方法は因子４だけ異なっていた。
最初のα−へリックス(螺旋)領域における変異はＩＧＦタンパク質構造に不安定化効果を有していることが示されている（上掲のJansson等, 1997）。如何なる理論にも制約を受けるものではないが、ファージの表面上のｇ３融合タンパク質は再び折り畳まれ精製された可溶型タンパク質よりも更に安定であるかもしれないと思われる。これは、二つの残基が構造的に感受性のＮ末端へリックスの外側に位置しているＦ２５ＡとＦ４９Ａに対して得られたＢＩＡＣＯＲＥＴＭの結果によって裏付けられている。ＫＤとＩＣ５０におけるそれぞれの変化はこれらの二つの変異体に対してすばらしく一致している（表２）。ＩＧＦＢＰへの結合に対するＦ４９Ａの差次的効果はＢＩＡＣＯＲＥＴＭ分析によって確認された。７０倍の親和性の減少がＩＧＦＢＰ−１結合に対して測定され（図５Ｃ；表２）、ＩＧＦＢＰ−３結合性は４倍だけ減少した（図５Ｄ；表２）。
【００９１】
【００９２】
Ｎ末端ＩＧＦ−Ｉ残基の役割
驚いたことに、ＩＧＦＢＰ−３の相互作用は、ＩＧＦＢＰ−３がおよそ１０倍高い親和性をもってＩＧＦ−Ｉに結合するという事実にも拘わらず、ＩＧＦＢＰ−１との相互作用よりも、アラニン置換に影響を受ける度合いは一般にかなり少なかった。Ｐ６３Ａとは別に、何れのアラニン変異体もＩＧＦＢＰ−３親和性の＞６倍の低減を示さなかった（図２と表１）。
バイオセンサーの実験においてdes(１−３)−ＩＧＦ−Ｉが２５倍低減した親和性でもってＩＧＦＢＰ−３に結合することが過去に示されている（上掲のHeding等）。ＩＧＦ−Ｉのこの天然に生じる型は最初の３つのＮ末端残基を欠いており、おそらくはＩＧＦＢＰ結合性の低減のために分裂促進能力の増加を示す（上掲のBagley等）。最初の３つアミノ酸側鎖の何れもＩＧＦＢＰ−３の結合に対するエネルギーを助長しないにもかかわらず（表１）、des(１−３)−ＩＧＦ−ＩがＩＧＦＢＰ−３結合において妥協されるので、如何なる理論に制約されるものではないが、バックボーン相互作用が関与しているかも知れないとの仮説が立てられる。
この仮説は、最初の３個のＮ末端アミノ酸を置換する三重アラニン変異体（Ａｌａ(１−３)-ＩＧＦ−Ｉ）をファージ上にディスプレイすることにより試験された。その領域のバックボーンがＩＧＦＢＰ−３との相互作用に寄与しているならば、この変異体は結合できなければならない。しかし、ＩＧＦＢＰ−１への結合性はＥ３側鎖の欠落のために低減していなければならない（表１）。位置１及び２におけるＩＧＦＢＰ−１との潜在的なバックボーンの相互作用を試験するため、対照としてdes(１−２)−ＩＧＦ−Ｉ変異体を産生した。予想されたように、Ａｌａ(１−３)-ＩＧＦ−ＩはＥ３Ａと同様にＩＧＦＢＰ−１親和性を減少させたが、ＩＧＦＢＰ−３親和性における変化は示さなかった（表１；図２）。des(１−２)−ＩＧＦ−Ｉに対しては、双方の結合タンパク質に対して親和性の差は観察されなかった。des(１−３)−ＩＧＦ−Ｉ（上掲のHeding等）に関する知見と併せると、これらの結果は、如何なる理論にも限定されるものではないが、ＩＧＦ−Ｉの残基３及び４の間のペプチドバックボーンがＩＧＦＢＰ−３との重要な相互作用を媒介する。
【００９３】
検討
ＩＧＦ−Ｉの表面上の機能性ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３結合エピトープがアラニンスキャンニング突然変異誘発により証明された。両方の結合エピトープは図６に示されている。個々のＩＧＦ−Ｉ側鎖相互作用はＩＧＦＢＰ−３に対してよりもＩＧＦＢＰ−１への結合に対して更に重要な役割を果たしている。二つの主要な結合部分がＩＧＦＢＰ−１に対して見いだされる（図６Ａ）。一つが（Ｇ７、Ｌ１０、Ｖ１１、Ｌ１４、Ｆ２５、Ｉ４３、及びＶ４４からなる）Ｎ末端ヘリックスの上面に位置し、一つが（Ｅ３、Ｔ４、Ｌ５、Ｆ１６、Ｖ１７及びＬ５４からなる）下面に位置している。これらの二つの結合部分はＦ４９とＲ５０によって架橋されている。ＩＧＦＢＰ−３に対しては、結合エピトープはより散在性であり、Ｇ２２、Ｆ２３及びＹ２４を含むようにずれている（図６Ｂ）。ＩＧＦＢＰ−３の結合性は一般にアラニン置換にはあまり感受性ではない。実際、親和性の最も大なる減少は（Ｐ６３Ａの他、以下参照）Ｇ７Ａに対して見られる６倍の減少である。最もありそうなことは、如何なる理論にも制約を受けるものではないが、ＩＧＦ−Ｉ主鎖バックボーンから派生する相互作用がＩＧＦＢＰ−３の結合性に寄与していることである。この仮説は更にＡｌａ（１−３）−ＩＧＦ変異体での実験により実証される。単一及び三重アラニン置換はＩＧＦＢＰ−３結合性への効果を持たないが、最初の３個のアミノ酸の欠失の結果、２５倍の親和性の減少した（上掲のBagley等；上掲のClemmons等；上掲のHeding等）。要約すると、ＩＧＦ−Ｉは異なった結合様式を用いてＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３に結合する；数個のアミノ酸側鎖の相互作用がＩＧＦＢＰ−１への結合に重要である一方、バックボーン相互作用がＩＧＦＢＰ−３への結合に対して主要な活動的な役割を担うように思われる。
【００９４】
最近の刊行物では、異核ＮＭＲスペクトロスコピーによるＩＧＦＢＰ−１に対するＩＧＦ−Ｉの結合エピトープが調査されている（上掲のJansson等, 1998）。著者はとりわけＩＧＦ−Ｉ残基２９、３０、３６、３７、４０、４１、６３、６５、及び６６が３０℃でのＩＧＦＢＰ−１との複合体生成時に化学シフトによる攪乱を受けることを見いだしている。更に、Janssonと共同研究者はR36、R37及びR50が機能性結合エピトープの一部であると特定し、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ実験でそのアラニン変異体を試験した。著者により観察された親和性の最も大きな変化はＲ５０Ａに対する３倍の減少であった。しかし、ホルモンの最初のＮＭＲでの研究において既に観察されているＩＧＦ−Ｉの構造上の柔軟性のために（上掲のCooke等）、Jansson等は、Ｆ４９を含み、多くの残基をＮＭＲスペクトルに完全には指定することはできなかった。
タンパク質−タンパク質界面の同様な研究において、僅かな側鎖残基だけが大部分の自由結合エネルギーに寄与することが見いだされた（Clackson及びWells, Science, 267:383-386 (1995); Kelley等, Biochemistry, 34: 10383-10392 (1995)）。同じことがＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ−１相互作用に対しても当てはまる。しかし、ここでは、ＶＩＩａ因子への組織因子の結合に対して注目されたように、重要な側鎖から派生した結合自由エネルギー値の大きさ（ΔΔＧ）は成長ホルモンの場合よりも小さい（上掲のKelley等）。支配的なΔΔＧの寄与を持つ残基は成長ホルモン-レセプター界面におけるようにＩＧＦ−Ｉ表面上でクラスター形成しないが（上掲のClackson及びWells）、連続的なＩＧＦＢＰ−１結合エピトープをなお形成した（図６Ａ）。これに対して、ＩＧＦ−Ｉ上のＩＧＦＢＰ−３結合エピトープは不連続であり、側鎖は非常に穏やかな個々の結合エネルギーを導いた。
【００９５】
ＩＧＦ−ＩにおけるアラニンによるＰ６３の置換により、競合ファージＥＬＩＳＡにおいて使用された濃度範囲で測定できない両方の結合タンパク質の親和性の減少が生じた。しかし、残基Ｐ６３は主結合エピトープに対してＩＧＦ−Ｉ分子の反対側に位置している。更に、グリシンとプロリンのアラニン置換が構造変化に至りうることが着目された（上掲のDi Cera）。また、上掲のJansson等, 1998は、ＩＧＦ−ＩのＣ末端部分は直接のＩＧＦＢＰ−１接触には関与していないが、むしろ複合体生成時に間接的な立体配置変化を受けると結論した。ＩＧＦ−１上の抗体結合部位の広範な特徴付けはManes等, Endocrinology, 138: 905-915 (1997)によりなされている。彼らは、Ｃ末端Ｄドメインを認識する抗体との複合体におけるＩＧＦ−ＩへのＩＧＦＢＰ−１又は−３の同時の結合を示した。これらの結果は、残基Ｐ６３で始まるＤドメインがＩＧＦＢＰ−１又は−３の結合に関与していないという以前の知見を更に裏付けている（上掲のBayne等, 1988）。
【００９６】
ファージＥＬＩＳＡにより得られたＩＣ５０比とＢＩＡＣＯＲＥＴＭの結果の間の主たる矛盾は残基Ｆ１６で観察された。既に述べたように、アラニンによるこの残基の置換によりＩＧＦ−Ｉ分子の構造変化が誘導された（上掲のJansson等, 1997）。同じ効果がＢＩＡＣＯＲＥＴＭの結果におけるＫＤで見られたが、親和性の減少はファージＥＬＩＳＡ実験ではそれ程顕著ではなかった（表２を参照）。双方のＢＩＡＣＯＲＥＴＭの測定では精製工程の間に再び折り畳まれたＩＧＦ−Ｆ１６Ａが使用された（上掲のJansson等, 1997）。しかし、ファージディスプレイでは、対象のタンパク質は大腸菌の分泌機構によって自然に転位置される。一価ファージディスプレイにおける低タンパク質量（ファージ粒子当たり＜１分子）は凝集を嫌い誤って折り畳む。また、切断したｇ３ファージタンパク質へＩＧＦ−Ｉを融合させるとペプチドの未変性の構造に安定化効果を働かせるかもしれない。
循環中のＩＧＦ−Ｉの大部分はＩＧＦＢＰ−３と酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）と名付けられた第３のタンパク質との複合体として見いだされる（上掲のBachとRechler；Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8:45-62 (1997); 上掲のJonesとClemmons）。１５０ｋＤの分子量のこの三元複合体は脈管構造壁を横断できず、ＩＧＦに対する循環リザーバとして作用する。この機構によってＩＧＦ−Ｉの半減期が劇的に増加する（Simpson等, Grwoth Horm IGF Res, 8: 83-95 (1998)）。ＩＧＦＢＰ−３の量はＩＧＦ−Ｉによってポジティブに調節される。これに対してＩＧＦＢＰ−１の役割はそれ程明確ではない。このクラスの結合タンパク質は一般にはＩＧＦＢＰ−３程豊富ではなく、その量はインスリンによりネガティブに調節される（上掲のBachとRechler；上掲のClemmons, 1997; 上掲のJonesとClemmons）。
【００９７】
ここでの結果に基づいて、ＩＧＦ−ＩのＩＧＦＢＰ特異的変異体が得られる。幾つかのアラニン変異の組み合わせが、ＩＧＦＢＰ−３の高親和性結合性を保持しながら非常に弱くＩＧＦＢＰ−１に結合する変異体を産生する。ＩＧＦＢＰ−３にもはや結合しないＩＧＦＢＰ−１特異的変異体のデザインはＩＧＦ−Ｉのファージディスプレイと特定の位置でのアミノ酸の無作為化を含みうる（上掲のCunningham等；LowmanとWells, J. Mol. Biol., 243:564-578 (1993)）。
【００９８】
結論：
ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３への結合に対して重要なＩＧＦ−Ｉの残基を同定した。特定のＩＧＦＢＰに対する結合特異性を決定する幾つかの残基が見いだされた。最近の刊行物（上掲のLoddick；上掲のLowman等, 1998）では、生物学的利用能のある「遊離の」ＩＧＦ−Ｉの増加プールが結合タンパク質から内在性ＩＧＦ−Ｉを置換することにより産生された動物実験が報告されている。ＩＧＦＢＰ特異的ＩＧＦ−Ｉ変異体はここに記載したように診断のためにまた治療のために使用することができる。
【００９９】
実施例２
腎疾患の治療に関するある種の変異体の特徴付け
ＩＧＦ−Ｉ変異体の作成
実施例１（及びDubaquieとLowman, Biochemistry, 38: 6386 (1999)）において、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３、又は双方の結合タンパク質への結合親和性が低減されたＩＧＦ−Ｉ変異体が同定された。特に、ＩＧＦ−Ｉの全アラニンスキャンニング突然変異誘発は、ＩＧＦＢＰ−１への結合のための特異性決定因子としてグルタミン酸３（Ｅ３）及びフェニルアラニン４９（Ｆ４９）、並びにある程度フェニルアラニン１６（Ｆ１６）及びフェニルアラニン２５（Ｆ２５）を同定した。ファージディスプレイアラニンスキャンニングの結果は、位置３と４９の側鎖の双方がＩＧＦＢＰ−１との複合体生成のためのかなりの結合エネルギーに選択的に寄与する一方（Ｅ３Ａに対して〜３０倍、Ｆ４９Ａに対して〜１００倍の親和性の損失）、ＩＧＦＢＰ−３に対する結合エネルギーにおけるその寄与は検出できないか（Ｅ３Ａ）、僅かである（Ｆ４９Ａに対して〜４倍）ことが示唆された（実施例１と上掲のDubaquieとLowmanを参照）。
ＩＧＦＢＰ−３に対する更に改善された特異性は、点突然変異の効果が結合自由エネルギーへの寄与に対してしばしば相加的であるので、ＩＧＦ−Ｉの累積性突然変異によって達成される可能性が高かった（Wells, Biochemistry 29: 8509 (1990)）。従って、ＩＧＦ−Ｉの二重変異体であるＥ３Ａ／Ｆ４９Ａは単一の分子に点突然変異Ｅ３Ａ及びＦ４９Ａを組み合わせることにより作成した。Ｆ１６Ａはより小なるＩＧＦＢＰ-特異性効果を示したが（実施例１及び上掲のDubaquieとLowman）、二重変異体Ｆ１６Ａ／Ｆ４９Ａもまた作成した。
【０１００】
また作成したのは、結合実験のためのＩＧＦ−Ｉの部位特異的固定化を容易にするために、単一の推定不対システイニルチオールを含むＩＧＦ−Ｉの新しい点突然変異Ｙ３１Ｃである。Ｙ３１Ｃは、ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３に対する結合エピトープの外側にあるので選択された（上掲のDubaquieとLowman）。この固定化技術により、注入された分析物（すなわちＩＧＦ結合タンパク質）が結合するための均一なリガンド集団が確保される（CunninghamとWells, J. Mol. Biol., 234: 554 (1993)）。過去に用いられていたアミン結合に対するこの方法の利点は、ＩＧＦ−ＩのＮ末端が阻害されず、チップマトリックスへの全ての潜在的なアミン結合がないことである。これは、ＩＧＦ−ＩのＮ末端の側鎖と相互作用すると信じられている（上掲のDubaquieとLowman）ＩＧＦＢＰ−１の結合分析に対して特に重要でありうる。ファージにディスプレイされたＹ３１ＣはＩＧＦＢ−１とＩＧＦＢＰ−３の双方に対して野生型様の親和性を示し、残基３１の回りの領域が得セプター結合において重要であるが結合タンパク質との接触を形成しないという考えを裏付けている（上掲のJ. Biol. Chem., 264: 11004 (1988); 上掲のBayne等, J. Biol. Chem., 265: 15648 (1989)）。
Ｆ４９Ａを含むＩＧＦ−Ｉの単一アラニン変異体並びにＥ３Ａ／Ｆ４９Ａ二重変異体を発現させ、精製し、再び折り畳んで、ＨＰＬＣ分析によって判断して適切なジスルフィド異性体を得た（ここの実施例１及び上掲のDubaquieとLowman）。これらの変異体を特異的結合タンパク質結合・レセプター活性化アッセイにおいて試験した。
【０１０１】
ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３結合親和性
ＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３に対するこれら変異体の結合親和性をＢＩＡＣＯＲＥＴＭ分析を使用して野生型ＩＧＦ−Ｉのものと比較した。固定化したＩＧＦ−Ｉ又は変異体に対するＩＧＦＢＰ−３結合での反応速度実験（表３）を実施例１及び上掲のDubaquieとLowmanに記載されているようにして実施し、Ｆ４９ＡＩＧＦ−Ｉ及び野生型ＩＧＦ−Ｉと比較した。この実験では、二重変異体Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ａは野生型よりＩＧＦＢＰ−３への結合親和性が約２０倍弱く、二重変異体Ｆ１６Ａ／Ｆ４９Ａは約６６倍弱かった（表３）。
【０１０２】
【０１０３】
ＩＧＦ−ＩへのＩＧＦＢＰ−１の結合の測定に対しては、ジスルフィド結合を介してセンサーチップ表面に固定化された単一システインＩＧＦ−Ｉ変異体Ｙ３１Ｃを使用して反応速度実験を実施した（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステム・マニュアル・サプリメント５ａ−１, Pharmacia (1991)）。結果は、バイオセンサーチップに非特異的アミン結合を介して固定された野生型ＩＧＦ−Ｉを使用して測定された結合親和性と一致している（表４）（実施例１及び上掲のDubaquieとLowman）。
【０１０４】
【０１０５】
IGFBP-1に対するＦ４９Ａ及びＥ３Ａ／Ｆ４９Ａの結合は正確な反応速度の測定のためにはあまりに弱かった。従って、対応する親和性を推定するために競合結合実験（１９９８年１０月１５日公開の国際公開第９８／４５４２７号）を実施した。上述したようなＢＩＡＣＯＲＥＴＭバイオセンサーチップに固定化された単一のシステインＩＧＦ−Ｉ変異体Ｙ３１Ｃを用いた。最大半減抑制濃度値（ＩＣ５０）を生じる競合結合実験を次のようにして実施した：５０ｎＭのＩＧＦＢＰ−１を所望のＩＧＦ変異体の希釈列と共にインキュベートした。これらのタンパク質混合液をシステイン結合ＩＧＦ−ＩＹ３１Ｃ（２００応答単位）を含むＢ１チップに５μＬ／分で注入した。結合したＩＧＦＢＰ−１の量を、２０分の注入後の非特異的結合を引くことにより決定し、ＩＧＦ変異体濃度に対してプロットした（図７）。結果を表５に示す。
【０１０６】
【０１０７】
野生型ＩＧＦ−Ｉに比較して、Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９ＡはＩＧＦＢＰ−１に対して激しく低下した結合親和性を有していた。Ｆ４９Ａは１．６±０．２μＭ（表５）のＩＣ５０でＩＧＦＢＰ−１に結合し、ＩＧＦＢＰ−３に対して６．３±１．７ｎＭの高親和性解離定数（ＫＤ）を保持した（表３）。ＩＧＦＢＰ−１へのＥ３Ａ／Ｆ４９Ａの結合は、６４±９μＭ（表Ｖ）の推定ＩＣ５０で、更に弱いことが分かり、ＩＧＦＢＰ−３に対してはほんの中程度に低減した親和性（ＫＤ＝２２．２±１０．３ｎＭ）を持っていた（表３）。これらのインビトロ測定は何れのＩＧＦ変異体も生理的条件下でＩＧＦＢＰ−１に安定に結合するであろうことを示唆している。
【０１０８】
ＩＧＦのＩ型レセプターの活性化のＫＩＲＡアッセイ
キナーゼレセプター活性化アッセイ（ＫＩＲＡ）はリガンドによる細胞外刺激時の細胞質ＩＧＦレセプターリン酸化の度合いを特異的かつ定量的に監視する（Sadick等, J. Pharm. Biomed. Analysis, 19(6): 883-891 (1998)）。幾つかのＩＧＦ変異体Ｇ１Ｓ／Ａ７０Ｖ、Ｔ４Ａ、Ｖ１１Ａ、Ｆ１６Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｆ１６Ａ／Ｆ４９Ａ、Ｒ３６Ａ、Ｐ３９Ａ及びＦ４９Ａをレセプター活性化の単一濃度アッセイにおいて試験した。Ｆ１６Ａ／Ｆ４９Ａを除くこれら変異体のＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３結合親和性は表ＩＩ及び上掲のDubaquieとLowmanに示されている。表６はＢＩＡＣＯＲＥＴＭ測定からの相対的親和性と特異性をまとめているものである。
ＫＩＲＡアッセイに対しては、変異体濃度は、光学密度測定に基づき、大まかに１３ｎＭ（「高濃度」）又は１．３ｎＭ（「低濃度」）と推定された。各ＩＧＦ変異体に対して得られた信号を野生型ＩＧＦ−Ｉの基準希釈列の信号と比較し、ＫＩＲＡアッセイにおいて観察された活性に対応する見かけのＩＧＦ−Ｉ濃度によって報告した（図８Ａ−８Ｂ）。正確な相対的効力は測定されなかったが、これらの結果は、試験した全ての変異体がＩＧＦのＩ型レセプターを活性化する能力を維持していることを示している。
【０１０９】
【０１１０】
表６は、Ｆ４９Ａに加えて、Ｆ１６ＡとＦ２５Ａは共にＩＧＦＢＰ−１に対する親和性が大幅に減少しているがＩＧＦＢＰ−３に対してはその度合いは少ないことを示している。両方ともなおＫＩＲＡアッセイに基づく生物活性を保持している（図８）。
Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９Ａの相対的効力を決定するために、ＫＩＲＡアッセイにおいて連続希釈を使用してＩ型ＩＧＦレセプターを活性化するその能力を測定した。図９Ａ−９Ｂに示されているように、Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９Ａは共に野生型ＩＧＦ−Ｉとは区別できないＩＧＦレセプター活性化曲線を示している。最大半減有効濃度（ＥＣ５０）は、Ｆ４９Ａに対して２０．０±１．３ｎｇ／ｍｌ、Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ａに対して１８．９±０．２ｎｇ／ｍｌ、野生型ＩＧＦ−Ｉに対して１９．８±０．６ｎｇ／ｍｌであった。これらの結果は、両方のＩＧＦ変異体が十分に生物活性であることを強く示唆している。
【０１１１】
ラットにおけるＩＧＦ−Ｉ変異体の血液浄化と腎臓蓄積
活性ＩＧＦ分子の腎臓への蓄積は慢性もしくは急性腎不全において潜在的に有益であろう。これれあの病状はＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−２が異常に高レベルで、ＩＧＦ−Ｉ剛性の低減が組み合わされ、最終的に異化作用を導くことにより特徴付けられる（上掲のToenshoff等, 1997）。
Ｆ４９Ａ及びＥ３Ａ／Ｆ４９Ａ ＩＧＦ−Ｉの予備的薬理学的性質を評価するために、両方のタンパク質を放射標識し、ラットに静脈内投与した。図１０Ａは両方の分子が動物の血液から除去される速度の時間経過を示す。そのＩＧＦＢＰ親和性の低減から予測されるように、双方の変異体は野生型ヒトＩＧＦ−Ｉと比較してより速い速度で除去された。興味深いことに、二重変異体（Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ａ）は単一変異体（Ｆ４９Ａ）よりも速く除去され、血清中の主要な結合タンパク質ＩＧＦＢＰ−３に対するそれぞれの親和性とよく相関している（表３）。図１０Ｂは異なった器官中のＩＧＦ変異体に対する血液対組織比を示している。大多数の放射標識ＩＧＦ分子が腎臓において検出されたが、肝臓、脾臓、心臓、及び膵臓における放射能レベルは更に低かった。変異体Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９Ａが野生型ＩＧＦ−Ｉと比較して腎臓において統計的に有意なより高レベルで蓄積することは明らかである。
【０１１２】
ＩＧＦ−Ｉ変異体の円偏光二色性分析
Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９Ａ ＩＧＦ−Ｉの円偏光二色性スペクトルを分析して、導入された変異がタンパク質構造に主要な変化をもたらすかどうかを試験した。構造的な不安定化はタンパク分解の感受性の増加に至り、ＩＧＦ変異体のより速やかな血液浄化速度に対する別の説明を提供する。しかしながら、図１１に示されているように、両方の変異体は野生型ＩＧＦ−Ｉに対して記録されたものと実質的に同一のスペクトルを有している。ＩＧＦ−ＩのＮＭＲスペクトロスコピーから予想されるように、ＣＤスペクトルはα−ヘリックスとランダムコイルの双方のエレメントを明らかにする（Coole等, Biochemistry, 30: 5484 (1991)）。ＩＧＦ−Ｉの熱安定性は、おそらくは室温で既に存在する比較的高い含量（〜３０％）のランダムコイルのために、円偏光二色によって精確に決定することはできない（Jansson等, Biochemistry, 36: 4108 (1997)）。両方の変異体のＣＤスペクトルが野生型ＩＧＦ−Ｉからの有意な逸脱を示していないという事実は、導入された変異がＩＧＦ−Ｉの全体構造を変えないことの表れである。
【０１１３】
結論
上に提示した証拠から、単一及び二重変異体Ｆ１６Ａ、Ｆ１６Ｇ、Ｆ１６Ｓ、Ｆ２５Ａ、Ｆ２５Ｇ、Ｆ２５Ｓ、Ｆ４９Ａ、Ｆ４９Ｇ、Ｆ４９Ｓ、Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ａ、Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ｇ、Ｅ３Ｇ／Ｆ４９Ａ、Ｅ３Ｇ／Ｆ４９Ｇ、Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ｓ、Ｅ３Ｓ／Ｆ４９Ａ、Ｅ３Ｓ／Ｆ４９Ａ、Ｅ３Ｓ／Ｆ４９Ｓ、Ｅ３Ｇ／Ｆ４９Ｓ、及びＥ３Ｓ／Ｆ４９Ｇ ＩＧＦ−Ｉは、アラニン置換変異体がＩＧＦＢＰ−３と結合する能力を大幅に喪失することなくＩＧＦＢＰ−１に対して低い親和性を示し多くの試験において生物活性であるので、ＧＨ／ＩＧＦ軸調節不全により特徴付けられる疾患を治療するのに有効であると予想される。更に、かかる変異体は、Ｆ４９ＡとＥ３Ａ／Ｆ４９Ａが野生型ＩＧＦ−Ｉと比較してまた他の器官と比較して腎臓に統計的に有意なより高いレベルで蓄積し、アラニン置換変異体がＩＧＦＢＰ−１にほんの僅かに結合するだけで、実験的尿毒症においてＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−２遺伝子の発現の増大が見られるので（上掲のToenshoff等, 1997）、腎疾患の治療に効果的であると予想される。
【０１１４】
実施例３
ヒトの治療
この実施例は、ＩＧＦＢＰの一又は複数に結合する外来性に投与されるペプチドが如何にして内在性ＩＧＦを置換するかの原理とヒトへの使用に対するここでのペプチドの服用方法を示す。
この実験では１２週間の間４種の用量（１０、２０、４０又は８０μｇ／ｋｇ）で毎日２回の注射によって組換えヒトＩＧＦ−Ｉ又はプラセボをヒトＩＩ型糖尿病患者に投与した。血液試料を治療前、治療中に２週間毎に、治療の１２週後（ＥＰ）に採取した。１０μｇ／日のＩＧＦ−Ｉで治療された患者から採取された試料ではＩＧＦ−ＩＩを測定しなかった以外は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦＢＰ−３の濃度を全ての試料について測定した。
【０１１５】
国際公開第９８／４５４２７号の図４３は患者の血液中のＩＧＦ−Ｉ濃度を示している。予期できなかった知見は、４０及び８０μｇのＩＧＦ−Ｉを投与する「プラトー」効果であった；これら二種の用量で同じＩＧＦ−Ｉ全血液濃度に達した。
国際公開第９８／４５４２７号の図４４は患者の血液中のＩＧＦ−ＩＩ濃度を示している。ＩＧＦ−Ｉの上昇量と対照的に、ＩＧＦ−ＩＩの量はＩＧＦ−Ｉ濃度の上昇に対するほぼ鏡像的なパターンで低下する。上昇するＩＧＦ−Ｉ濃度のプラトー効果と同様に、現象するＩＧＦ−ＩＩ濃度もまたプラトーに達した。
国際公開第９８／４５４２７号の図４５は患者の血液中のＩＧＦＢＰ−３濃度を示している。血液中のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩのパターンの明らかな変化と対照的に、ＩＧＦＢＰ−３の濃度は統計的に有意な又は明らかな変化パターンを示さなかった。
国際公開第９８／４５４２７号の図４３と図４４の考察から、全ＩＧＦ濃度（ＩＧＦ−ＩプラスＩＧＦ−ＩＩ）が治療では殆ど変化を示していないことが明らかにされる。これは、ＩＧＦ−１の濃度の上昇がＩＧＦ−ＩＩの濃度の低下に密接に合致するためである。３つの図の全の考察により、患者の血液中のＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ濃度の用量依存的変化はＩＧＦＢＰ−３結合タンパク質能の低下により達成されなかったことが分かる（ＩＧＦＢＰ−３は血液中の主要な結合タンパク質である）。
ＩＧＦ−ＩＩの濃度の低下とＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ濃度のプラトー化の明白な説明は、ＩＧＦ結合タンパク質能力が有限量であり、この実験において用いられたＩＧＦ−Ｉの用量が結合タンパク質からのＩＧＦ−ＩＩの用量依存的な置換を引き起こしたことである。
【０１１６】
活性なＩＧＦの濃度を亢進させる能力を持つ分子は全てこの実施例においてＩＧＦ−Ｉに対して示されたものと同様な活性を示すと予想することはこの実施例の知見の論理的な拡張である。また、用いられたＩＧＦ−Ｉの用量と立証されたＩＧＦＢＰ及びＩＧＦ−１及びＩＧＦ−ＩＩの濃度から、活性な内在性ＩＧＦの量を増大させるにはどれくらいのペプチドが与えられなければならないかを計算することは簡単である。ＩＧＦ−Ｉに対するモルサイズ、ＩＧＦＢＰへのペプチドの親和性及びその生物学的利用能がヒトにおいて活性なＩＧＦを増加させた用量に達するために考慮される他の変量である。
本発明を止む終えずある特定の方法と材料を参照してここで検討した。これら特定の方法と材料の検討は本発明の範囲に対して限定をなすものでは決してなく、本発明の目的を達成するために好適な全ての代替の材料と方法まで拡張されるものと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ−１Ｂ】ＩＧＦＢＰ-１（図１Ａ）及びＩＧＦＢＰ-３（図１Ｂ）に結合する変異体、Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖ ＩＧＦ-ＩのファージＥＬＩＳＡを示す図である。1μg/mlのＩＧＦＢＰ-１（図１Ａ）又はＩＧＦＢＰ-３（図１Ｂ）でコートしたミクロタイタープレートを、Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖを表示するファージ粒子とともに、表示した量の可溶性競合タンパク質、ＩＧＦＢＰ-１（図１Ａ）又はＩＧＦＢＰ-３（図１Ｂ）の存在下でインキュベートした。競合物の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）、即ち、その特定の実験においてファージミドの半最大結合をもたらす競合物の阻害濃度を各ＩＧＦＢＰについて示した。
【図２Ａ−２Ｂ】ファージＥＬＩＳＡにより試験したＩＧＦ-Ｉ変異体についてのＩＧＦＢＰ親和性の低下又は向上を示す図である。各ＩＧＦ-Ｉアラニン変異体の相対的ＩＣ５０値（ＩＣ５０ｍｕｔ／ＩＣ５０Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖ）（ＩＧＦ-ＩＧ１Ｓ-Ａ７０Ｖ）に対する結合性タンパク質についての各変異体の親和性変化）をＩＧＦＢＰ-１（黒棒）及びＩＧＦＢＰ-３（白棒）について示した。データは下記の表１から取った。相対的ＩＣ５０＜１は親和性の向上；値＞１は親和性の低下を示す。星印は、これら特定の変異体が、抗体結合性で判断した場合、ファージ上に表示されていなかったことを示す。
【図３Ａ−３Ｂ】競合的ファージＥＬＩＳＡにおける、ファージ上に表示されたＩＧＦ-Ｉ変異体Ｆ４９Ａの、各々ＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-３に対する結合特異性を示す図である。Ｆ４９Ａ（四角）を表示するファージミド粒子は、ＩＧＦＢＰ-３でコートしたプレートに、表示した量の可溶性ＩＧＦＢＰ-１（図３Ａ）又はＩＧＦＢＰ-３（図３Ｂ）の存在下で結合した。野生型様ＩＧＦ-Ｉ変異体Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖ（丸印）を表現するファージで同じ実験を平行して行った。絶対的なＩＣ５０値については下記の表Ｉ及びＩＩを参照のこと。データ点は、平均+-標準偏差、n=2である。免疫吸着プレートを1μg/mlのＩＧＦＢＰ-３でコートし、野生型ＩＧＦ-Ｉファージ（ＷＴ、丸印）及び異ｆｇ-Ｆ４９Ａファージ（Ｆ４９Ａ、四角）を平行して用いて下記の実施例に記載したようにＥＬＩＳＡを実施した。実験は２回行い、データ点は平均+-標準偏差で示した。実際の実験におけるＩＣ５０値を図に示した。
【図４】天然配列ヒトＩＧＦ-Ｉ（ｗｔＩＧＦと称する）（配列番号：１）、天然配列ヒトプロインシュリン（プロインシュリンと称する）（配列番号：２）、及び天然配列ヒトインシュリン（インシュリン（Ｂ鎖）に次いでインシュリン（Ａ鎖）と称する）（配列番号：３）の配列アラインメントを示す図である。星印及び傍点は、各々３つの配列間での表示したアミノ酸位置での配列同一性及び配列相同性を示す。
【図５Ａ−５Ｄ】固定化ＩＧＦ-Ｉ変異体へのＩＧＦＢＰ結合のバイオセンサー分析を示す。センサーグラムは、固定化した野生型ＩＧＦ-Ｉ（図５Ａ、５Ｂ）又はＦ４９Ａ変異体（図５Ｃ、５Ｄ）へのＩＧＦＢＰ-１（図５Ａ、５Ｃ）又はＩＧＦＢＰ-３（図５Ｂ、５Ｄ）の結合について示した。核実験のリガンド濃度は、1μM、500nM、及び250nMであった。速度論的パラメータについては表ＩＩを参照のこと。
【図６Ａ−６Ｂ】各々ＩＧＦ-Ｉ表面上のＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-３についての機能的結合エピトープのモデルを示す図である。アミノ酸鎖は、それらの結合エネルギー（表Ｉ）に対する相対的寄与に従って分類し、次のように色分けした：効果無し（灰色）；見かけの親和性の２−５倍の低下（黄色）；５−１０倍（橙色）；１０−１００倍（明赤色）；＞１００倍（暗赤色）。利用可能なら場合は、下記の表ＩのファージＥＬＩＳＡ実験からの数を使用した。Ｖ１１Ａ、Ｒ３６Ａ及びＰ３９Ａ変異体（表２）に代えてBIAcore(商品名)データを使用した。ＩＧＦ-ＩのＮＭＲ構造（Cooke等, 上掲）を、プログラムInsight II(商品名)（MSI, San Diego, CA）を用いて表現した。ＩＧＦＢＰ-１についての結合エピトープ（図６）は、Ｎ-末端螺旋（残基８−１７）の「上」及び「下」表面に位置し、エネルギー的に重要な残基Ｆ４９によって連結されている。ＩＧＦＢＰ-３については（図６Ｂ）、個々のＩＧＦ-Ｉ側鎖は極くわずかしか結合エネルギーに寄与しない。結合性エピトープはＮ-末端から移動し、新たにＧ２２、Ｆ２３、Ｙ２４を包含する。
【図７】Ｅ３Ａ／Ｆ４９Ａ(四角)及びＦ４９Ａ(丸印)のために、競合的ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ結合実験によって決定した結合ＩＧＦＢＰ−１の総量をＩＧＦ変異体濃度に対してプロットした図である。
【図８Ａ−８Ｂ】各々は、ＩＧＦ−ＫＩＲＡ光学密度(OD)分析を使用した、幾つかのＩＧＦ−I変異体の１３ｎＭ(高濃度)及び１．３ｎＭ(低濃度)変異体濃度における算出されたＩＧＦ−I活性をｎＭ単位で示した図である。各々のＩＧＦ変異体から得られたシグナルは、その野生型ＩＧＦ−Iの標準希釈系と比較され、観察された活性に一致する見かけのＩＧＦ−I濃度によって報告された。
【図９Ａ−９Ｂ】ＫＩＲＡ検定の連続希釈を使用して測定された野生型ＩＧＦ−Iに加えて、Ｆ４９ＡＩＧＦ−I(図．９Ａ)及びＥ３Ａ／Ｆ４９Ａ(図．９Ｂ)のＩＧＦ受容体活性化曲線を示している図である。変異体は四角で表され、そして野生型ＩＧＦ−Iは丸印で表されている。
【図１０Ａ−１０Ｂ】放射線標識されてラットへ静脈投与されたＦ４９Ａ及びＥ３Ａ／Ｆ４９ＡＩＧＦ−Iの予備的薬理学的特性の評価を示した図である。図１０Ａは、両分子が動物の血液から消失した割合の時間経過を示し、四角は野生型ＩＧＦ−Iを表し、丸印はＥ３Ａ／Ｆ４９ＡＩＧＦ−Iを表し、そしてダイヤモンド印はＦ４９ＡＩＧＦ−Iを表す。図１０Ｂは、異なった器官、すなわち腎臓、肝臓、脾臓、心臓、及び膵臓におけるこれら二つのＩＧＦ変異体の組織と血液の比率を５、１５、３０分において表し、実線は野生型ＩＧＦ−Iを表し、点線はＥ３Ａ／Ｆ４９ＡＩＧＦ−Iを表し、そして縞模様の線はＦ４９ＡＩＧＦ−Iを表す。
【図１１】野生型ＩＧＦ−I(丸印)、Ｆ４９ＡＩＧＦ−I(四角)、及びＥ３Ａ／Ｆ４９ＡＩＧＦ−I(ダイヤモンド)の円偏光二色性スペクトルを示している。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然配列ヒト型ＩＧＦ−Iの位置１６、２５、又は４９のアミノ酸残基、或いは位置３及び４９のアミノ酸残基が、アラニン、グリシン、又はセリン残基で置換されたインシュリン様成長因子Iの変異体。
【請求項２】
天然配列ヒト型ＩＧＦ−Iのアミノ酸残基がアラニン又はグリシンで置換された請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
天然配列ヒト型のＩＧＦ−Iのアミノ酸残基が、アラニンで置換された請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
請求項１に記載した変異体を担体に含んでなる組成物。
【請求項５】
腎臓活性分子をさらに含む請求項４の組成物。
【請求項６】
担体が無菌である請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１の変異体の有効量を哺乳類へ投与することを含む、哺乳類の成長ホルモン／インシュリン様成長因子(ＧＨ／ＩＧＦ)軸調節不全を特徴とする疾患の治療方法。
【請求項８】
疾患が高血糖性傷、腎臓疾患、うっ血性心不全、肝不全、栄養失調、消耗病症群、又は異化状態で、その時の哺乳類のインシュリン様成長因子結合タンパク質ＩＧＦＢＰ−１のレベルがこれら疾患ではない状態時のレベルに対して増加した場合の請求項７に記載の方法。
【請求項９】
疾患が腎疾患である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
腎臓疾患が慢性又は急性である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
腎臓活性分子の有効量を投与することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類がヒトである請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
両アミノ酸残基がアラニンへ置換された請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の変異体を含む製薬的組成物と、組成物を哺乳類の成長ホルモン／インシュリン様成長因子軸の調節不全を特徴とする疾患の治療へ使用する為の使用者向け取り扱い説明書を含んでなる容器からなる一式。
【請求項１５】
疾患が高血糖性傷害、腎疾患、うっ血性心不全、肝不全、栄養失調、消耗病症群、又は異化状態で、その時の哺乳類のインシュリン様成長因子結合タンパク質−１のレベルが、これら疾患時のレベルに対して増加した場合の請求項１４に記載の一式。
【請求項１６】
疾患が腎疾患である請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
腎臓活性分子を含む容器をさらに含む請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
疾患が慢性又は急性腎疾患である請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
哺乳類がヒトである請求項１４に記載のキット。
【請求項２０】
変異体の両アミノ酸残基がアラニン残基に置換された請求項１４に記載のキット。
【請求項１】
天然配列ヒト型ＩＧＦ−Iの位置１６、２５、又は４９のアミノ酸残基、或いは位置３及び４９のアミノ酸残基が、アラニン、グリシン、又はセリン残基で置換されたインシュリン様成長因子Iの変異体。
【請求項２】
天然配列ヒト型ＩＧＦ−Iのアミノ酸残基がアラニン又はグリシンで置換された請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
天然配列ヒト型のＩＧＦ−Iのアミノ酸残基が、アラニンで置換された請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
請求項１に記載した変異体を担体に含んでなる組成物。
【請求項５】
腎臓活性分子をさらに含む請求項４の組成物。
【請求項６】
担体が無菌である請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１の変異体の有効量を哺乳類へ投与することを含む、哺乳類の成長ホルモン／インシュリン様成長因子(ＧＨ／ＩＧＦ)軸調節不全を特徴とする疾患の治療方法。
【請求項８】
疾患が高血糖性傷、腎臓疾患、うっ血性心不全、肝不全、栄養失調、消耗病症群、又は異化状態で、その時の哺乳類のインシュリン様成長因子結合タンパク質ＩＧＦＢＰ−１のレベルがこれら疾患ではない状態時のレベルに対して増加した場合の請求項７に記載の方法。
【請求項９】
疾患が腎疾患である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
腎臓疾患が慢性又は急性である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
腎臓活性分子の有効量を投与することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類がヒトである請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
両アミノ酸残基がアラニンへ置換された請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の変異体を含む製薬的組成物と、組成物を哺乳類の成長ホルモン／インシュリン様成長因子軸の調節不全を特徴とする疾患の治療へ使用する為の使用者向け取り扱い説明書を含んでなる容器からなる一式。
【請求項１５】
疾患が高血糖性傷害、腎疾患、うっ血性心不全、肝不全、栄養失調、消耗病症群、又は異化状態で、その時の哺乳類のインシュリン様成長因子結合タンパク質−１のレベルが、これら疾患時のレベルに対して増加した場合の請求項１４に記載の一式。
【請求項１６】
疾患が腎疾患である請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
腎臓活性分子を含む容器をさらに含む請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
疾患が慢性又は急性腎疾患である請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
哺乳類がヒトである請求項１４に記載のキット。
【請求項２０】
変異体の両アミノ酸残基がアラニン残基に置換された請求項１４に記載のキット。
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【公開番号】特開２００６−３２８０７４（Ｐ２００６−３２８０７４Ａ）
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１７１５１７（Ｐ２００６−１７１５１７）
【出願日】平成１８年６月２１日（２００６．６．２１）
【分割の表示】特願２０００−５９２３２１（Ｐ２０００−５９２３２１）の分割
【原出願日】平成１２年１月５日（２０００．１．５）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２１日（２００６．６．２１）
【分割の表示】特願２０００−５９２３２１（Ｐ２０００−５９２３２１）の分割
【原出願日】平成１２年１月５日（２０００．１．５）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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