インターフェロンα変異体およびそのポリエチレングリコール誘導体
ＩＦＮ−α変異体が、既存のＩＦＮ−αにおいて８５位または８６位におけるＴｙｒをＣｙｓに置換することによって得られる。高いインビトロ抗ウイルス活性および延長されたインビボ半減期を有するそれらのポリエチレングリコール誘導体もまた提供され、この場合、ポリエチレングリコール成分がＩＦＮ−α変異体のフリーＣｙｓ残基に共有結合により結合する。ＩＦＮ−α変異体のＰＥＧ誘導体の調製方法、および、そのような誘導体を含む医療用組成物もまた提供される。試験結果は、本発明のＩＦＮ−α変異体は、調製することが容易であり、また、高い活性を有することを示した。ゆえに、それらのポリエチレングリコール誘導体は、体内における延長された寿命、および、低いクリアランス速度を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＦＮ−α変異体およびそのポリエチレングリコール誘導体の調製方法および使用に関連する。具体的には、本発明は、部位特異的変異誘発技術を使用するα−インターフェロンの部位特異的変異誘発、これにより、ＩＮＦ−αにおいて８５位または８６位におけるＴｙｒをＣｙｓに置換すること、および、その部位をポリエチレングリコールと共有結合により結合することを含む方法に関連する。本発明はまた、インターフェロンを、Ｃｙｓを使用して特異的に修飾する方法、インターフェロンα変異体のポリエチレングリコール誘導体の抽出および精製、ならびに、ガンおよび炎症性疾患におけるその使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンは、広いスペクトルの抗ウイルス性、抗細胞増殖および免疫調節を有する重要な家族性サイトカインの１つのタイプである。哺乳動物のインターフェロンは、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンωなどに分けることができ、この場合、ＩＮＦ−αはさらに、１０を超える種類のサブタイプに分けることができる。実際の臨床研究によれば、αタイプのインターフェロンが重要な抗ウイルス性および抗腫瘍性の薬物である。現在、主に、ｒｈＩＦＮα１ｂ、ｒｈＩＦＮα２ａおよびｒｈＩＦＮα２ｂが中国では最も広く臨床において使用される。
【０００３】
加えて、研究では、ヒトＩＦＮ−αのＩ型ファミリーは、２０を超える遺伝子をそのメンバーとして有し、それらのほとんどが機能的なタンパク質をコードし、また、約９０％の相同性をヌクレオチドレベルで相互に関して有することが示されている。かなりの数のインターフェロン誘導体またはインターフェロンアナログが遺伝子工学によって作製され得る。現在、最も注目すべきものがＩｎｆｅｒｇｅｎ（ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１）であり、これは、１３種類のα型インターフェロンの遺伝子配列相同性に基づいてＡｍｇｅｎ（合衆国企業）によって設計され、インターフェロンα２ｂの５倍〜１０倍大きい抗ウイルス活性によるＣ型肝炎の処置のために１９９７年に米国食品医薬品局によってリストに収載されることが承認された完全に新規なタンパク質工学薬物である。中国特許出願公開ＣＮ１５１１８４９Ａ（出願人：ＢＥＩＪＩＮＧ ＴＲＩ−ＰＲＩＭＥ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＣＯ．，ＬＴＤ）は、インビトロでの相同的組換え法によって得られ、活性および安定性においてＩｎｆｅｒｇｅｎよりも大きな利点を有する様々なインターフェロンαファミリー分子を開示した。
【０００４】
しかしながら、インターフェロンα１ｂ、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂまたはＩｎｆｅｒｇｅｎを問わず、タンパク質薬物として、これらはすべてが、不良な安定性、大きい血漿クリアランス、短いインビボ半減期、抗原抗体反応を生じやすいことなどのために、臨床処置では制限される。様々な遺伝子工学技術により、組換えタンパク質の大規模な合成が可能になり、また、異種のタンパク質によって誘導される免疫原性問題が大きく解決され、しかし、急速な血漿クリアランスおよび低い生物学的利用能のような不都合な点は依然として克服することができない。そのような不都合な点の結果が下記の通りである。インターフェロンの頻繁な注射が、血漿における効果的な治療濃度を達成するために要求され、そのうえ、それぞれの注射の後で、血中濃度のより大きな変動が、薬物濃度の頂上値および谷値の形成とともに引き起こされ、従って、このことは、処置費用、ならびに、薬物投与の不便さおよび有害な反応の危険性を増大させる可能性がある。そのため、様々な試みが、タンパク質薬物の効力を高めるための様々な薬物送達技術（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を取り入れるために行われている。現在、薬物送達技術の中で、最も広く研究されているのが、ペグ化技術（ＰＥＧＮＯＬＯＧＹ）である。
【０００５】
タンパク質のペグ化技術が、タンパク質型薬物のインビボでの薬物動態学特性を改善するためにこの１０年で新たに開発される。この技術では、活性化されたポリエチレングリコール分子［ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ］がタンパク質分子の表面に結合させられ、従って、これにより、タンパク質の立体構造が影響を受け、最終的には、タンパク質の様々な生化学的性質における変化、例えば、増大した化学的安定性、プロテアーゼ加水分解に対する抵抗性の改善された能力、免疫原性および毒性の低下または消失、延長されたインビボ半減期、ならびに、低下した血漿クリアランスなどが引き起こされる。
【０００６】
ＰＥＧ成分は、エチレンモノマーの重合によって得られる不活性な長い鎖の両親媒性分子である。現在、広範囲の様々なＰＥＧ分子が利用可能である。活性化されたＰＥＧの活性な官能基を処理分子の特別な位置（例えば、アミン、チオールまたは他の求核性物質）に連結することができる。ほとんどの場合、ＰＥＧ誘導体の共有結合性の結合を、リシンのアミノ基およびペプチド分子のＮ末端を修飾部位として使用することによって達成することができ、この場合、それぞれの連結部分により、異なるイソ型が決定される。薬物の研究開発プロセスの期間中、ＰＥＧのイソ型分布は非常に重要である。製造物の生物学的活性が特定のイソ型分布混合物との密接な関係を有するので、製造物は分布要求に従って規定されなければならない。ＰＥＧのイソ型分布が、製造プロセスを変更すること、および、比例的ロフティング（ｌｏｆｔｉｎｇ）を含めて、薬物開発プロセス全体の期間中において一貫していることが証明されなければならない。実際の製造では、ＰＥＧのイソ型分布により、多大の困難が製造物のプロセス制御および品質評価にもたらされる。
【０００７】
上記の問題は部位特異的なペグ化によって回避することができる。ますますの関心が、特定のタンパク質部位をペグ化することに注がれている。これは、特定のタンパク質部位をペグ化することにより、非常に特異的なペグ化製造物を得ることができ、また、修飾された製造物の純度を効果的に制御することができ、このことはプロセスをより簡略にし、また、評価することがはるかにより容易な製造物をもたらすからである。タンパク質の非常に選択的なペグ化を分子内のシステイン（Ｃｙｓ）部位の使用によって行うことができる。フリーのスルフヒドリルを有するタンパク質はほとんんどなく、しかし、スルフヒドリルは、タンパク質の立体構造を維持するための重要な共有結合性の結合である。この部位における化学的修飾は、多くの場合、より大きな損傷を分子構造に引き起こし、従って、タンパク質の活性を失わせる。遺伝子工学を使用する手段により、この目的を達成することができる。タンパク質またはペプチドが異なれば、構造および性質が異なること、ならびに、何が導入され得るか、および、ＰＥＧ修飾剤がどこに導入され得るかに留意することは価値がある。遺伝子工学手段によって人為的に増やされたＣｙｓは分子内のミスマッチまたは分子間の組合せを引き起こし、このことは、分子の不安定性、または、正規でないポリマーの形成の原因となる。この点で、包括的な配列分析および分子構造の正確なシミュレーションは、ある考えを提供する。
【０００８】
配列分析により、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂおよびＩＦＮ−ｃｏｎ１を含めて、大多数のＩＦＮ−α分子が４個のシステインを有し、この場合、ジスルフィド結合が、１位におけるＣｙｓと、９９位におけるＣｙｓとの間、および、２９位におけるＣｙｓと、１３９位におけるＣｙｓとの間で形成されて存在することが見出された。本発明者は、この特徴もまた維持したインビトロでの相同的組換えによる新しいタイプのインターフェロン（ＭＩＦＮ）が得られる。ＩＦＮ−α１ｂおよびそれ以外のαファミリーインターフェロンは構造において明白に異なっており、前者は、第５のＣｙｓを、正常なジスルフィド結合を形成する上記の４つのＣｙｓとは離れた８６位に有する。小試験では、インターフェロンの部位特異的ペグ化がこの部位の使用によって実施できることが見出された。従って、この特徴との組合せで、他のＩＦＮ−αのペグ化は、同じ結果をもたらすことが予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】中国特許出願公開ＣＮ１５１１８４９Ａ（出願人：ＢＥＩＪＩＮＧ ＴＲＩ−ＰＲＩＭＥ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＣＯ．，ＬＴＤ）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】付属３ＸＣ「インターフェロンの生物学的活性の測定」（「中華人民共和国薬局方」の２００５年版）
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、インターフェロン−α変異体を提供することである。そのアミノ酸配列の８５位または８６位におけるアミノ酸が、大きい生物学的活性だけでなく、良好な安定性、水溶性、病原性に対する抵抗性のような利点を有するポリエチレングリコール誘導体を形成するためにポリエチレングリコールと結合させることができるＣｙｓに変異させられる。
【００１２】
ＩＦＮ−αの８５位または８６位は通常、チロシン（Ｔｙｒ）であり、このチロシン（Ｔｙｒ）は、比較的保存された区域に位置している。本発明により、αインターフェロンが、ＴｙｒをＣｙｓに変異することによって改変され、また、一連のポリエチレングリコール誘導体を生じさせるためにポリエチレングリコールと反応する一連の変異体が得られる。
【００１３】
本発明の技術的解決策が、現在一般に使用されているαインターフェロンの下記の４つのタイプによってさらに例示される。
【００１４】
ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５（アミノ酸配列は、付属の配列番号１〜配列番号４を参照のこと）が、４つの既存のインターフェロン（ＭＩＦＮ、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１、ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂ）の部位特異的変異誘発、および、８６位におけるアミノ酸をＣｙｓに置換すること（ＭＩＦＮおよびＩＦＮ−Ｃｏｎ１）、または、８５位におけるアミノ酸をＣｙｓに置換すること（ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂ）によって得られる。タンパク質をコードする組換えプラスミドが、目的の遺伝子をそれぞれ組換え、得られた組換え遺伝子をインビトロ部位特異的変異誘発技術の使用によって発現ベクターｐＥＴ−２３ｂに挿入することによって得られる。別個に、これら４つのレコン（ｒｅｃｏｎ）は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）レシピエト細胞において効率的および安定的に発現する。発現産物は封入体の形態で存在し、発現量は総細菌タンパク質の３０％超を占める。疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーおよびＳ−１００ゲル排除クロマトグラフィーを連続して使用する精製の後、高い純度を有するＭＩＦＮＣｙｓ８６およびＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６が得られる。そして、ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィー、モノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーおよびＳ−１００ゲル排除クロマトグラフィーを使用する精製の後、高い純度を有するＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５が得られる。
【００１５】
本発明において記載される変異体が、たとえ、ＩＦＮ−αの８５位または８６位におけるＴｒｙをＣｙｓに変異することによって得られるとしても、しかし、ＩＦＮ−αの鎖の長さは完全には一致していないので、本明細書におけるＴｙｒは、変異の場所を例示するためだけであることが当業者には理解されなければならない。当業者は、ＩＦＮ−αに対する様々な改変を行うことができる。例えば、当業者はいくつかの部位を変異させることができ、従って、既存のαインターフェロンとは異なり、しかし、既存のαインターフェロンに関して同じ機能または類似する機能を有するアミノ酸配列を得ることができる。しかしながら、上記の得られた配列は、本発明において記載される対応する部位での変異および改変を行うことができ、改善された成績を得ることができる。従って、本発明のＩＦＮ−α変異体もまた、これらの配列を含む。
【００１６】
本発明は様々なインターフェロン−α変異体ポリエチレングリコール誘導体を提供し、この場合、ポリエチレングリコールは直鎖であってもよく、分枝構造を同様に有することができる。ＩＦＮ−α変異体が５０００ダルトン〜４００００ダルトンのそのようなＰＥＧによりペグ化され、結果は、ペグ化されたタンパク質の半減期が、増大したＰＥＧ分子量とともに様々な程度に延びたことを示した。
【００１７】
本発明はまた、インターフェロン−α変異体ポリエチレングリコール誘導体の調製方法および精製方法を提供する。
【００１８】
最後に、本発明はインターフェロン−α変異体ポリエチレングリコール誘導体のインビトロでの薬力学および薬物動態学の試験方法および結果を提供し、これらは、インターフェロン−α変異体ポリエチレングリコール誘導体が、免疫調節障害（例えば、腫瘍疾患または感染性疾患など）の処置または防止のために使用されたとき、より良好な技術的パラメーターを有することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】「ＭＩＦＮＣｙｓ８６の遺伝子の構築および増幅」（実施例１Ａ）における２ラウンドのＰＣＲ生成物のアガロース電気泳動図を示す。レーン１はＤＮＡマーカーを表し、レーン２は１回目のラウンドのＰＣＲ反応系における反応系１の生成物を表し、レーン３は１回目のラウンドのＰＣＲにおける反応系２の生成物を表し、レーン４は２回目のラウンドのＰＣＲ生成物を表す。
【図２】陽性クローンを「ＭＩＦＮＣｙｓ８６組換えプラスミドの構築、形質転換および同定」（実施例２Ａ）におけるテンプレートとするＰＣＲ生成物のアガロース電気泳動図を示す。レーン１はＤＮＡマーカーを表し、レーン２〜レーン８は単一コロニーのＰＣＲ生成物をそれぞれ表し、この場合、２、４、５、６、７、８が陽性クローンである。
【図３】４つの変異型組換えプラスミド（実施例２Ａ〜実施例２Ｄ）のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ二重消化の電気泳動図を示す。レーン１はＤＮＡマーカーを表し、レーン２はプラスミドベクターｐＥＴ−２３ｂを表し、レーン３、レーン７は、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる消化の前および後におけるＭＩＦＮＣｙｓ８６の組換えプラスミドをそれぞれ表し、レーン４、レーン８は、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる消化の前および後におけるＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６の組換えプラスミドをそれぞれ表し、レーン５、レーン９は、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる消化の前および後におけるＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５の組換えプラスミドをそれぞれ表し、レーン６、レーン１０は、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる消化の前および後におけるＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５の組換えプラスミドをそれぞれ表す。
【図４】精製されたＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５のＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを示す（実施例３Ａ〜実施例３Ｄ）。レーン１はタンパク質マーカーを表し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５は、精製されたＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５を表す。
【図５】ＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ＫＤ）との、ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５によって行われた連結反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを示す（実施例４）。レーン１はタンパク質マーカーを表し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５は、ＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ＫＤ）との、ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５によって行われた連結反応の生成物をそれぞれ表す。
【図６】ＰＥＧ−ＭＡＬ（４０ＫＤ）との、ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５によって行われた連結反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを示す（実施例４）。レーン１はタンパク質マーカーを表し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５は、ＰＥＧ−ＭＡＬ（４０ＫＤ）との、ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５によって行われた連結反応の生成物をそれぞれ表す。
【図７】インターフェロン−α変異体の４種類の精製されたＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ＫＤ）誘導体のＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを示す（実施例５）。レーン１はタンパク質マーカーを表し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５は、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５をそれぞれ表す。
【図８】インターフェロン−α変異体の４種類の精製されたＰＥＧ−ＭＡＬ（４０ＫＤ）誘導体のＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを示す（実施例５）。レーン１はタンパク質マーカーを表し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５は、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５をそれぞれ表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明が具体的な実施例との組合せでさらに例示される。これらの実施例は、本発明の保護範囲を限定することなく本発明を説明するために意図されるだけであることを理解しなければならない。
【００２１】
具体的に定義されない限り、本明細書中で使用される用語は、関連した技術分野において広く知られている用語に対応する。標準的な化学記号および省略記号が、完全な名称と交換可能に使用され得る。例えば、「ＰＥＧ」および「ポリエチレングリコール」は同じ意味を有し、「インターフェロンα」、「ＩＦＮ−α」および「αインターフェロン」もまた、同じ意味を有する。
【００２２】
別途詳しく記されない限り、本明細書中で使用され、しかし、明示的には例示されない技術および方法、または、簡略的に例示される技術および方法は、この技術分野で従来から使用される技術および方法を示しており、この技術分野で使用される広く知られている技術および方法に従って実施することができる。キットの適用が、製造者または供給者によって提供される説明書に従って行われる。
【００２３】
本発明において、ＭＩＦＮ、ＩＮＦ−Ｃｏｎ１、ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂを含む４つのタンパク質のアナログを、アミノ酸の機能的に等価な分子の置換、付加または欠失によって得ることができる。例えば、類似する性質を有する１つまたは複数のアミノ酸残基を元の配列における対応するアミノ酸残基に代わって使用すること、従って、元のタンパク質配列を変化させて、サイレントな変化を形成することが、この技術分野では広く知られている。
【００２４】
本発明において、ポリエチレングリコール誘導体におけるポリエチレングリコール成分が直鎖構造または分岐構造を有し得ることが当業者には広く知られている。前記ポリエチレングリコール誘導体は、スルフヒドリル反応を行うことができ、また、システイン残基のスルフヒドリルと反応することができるペグ化された試薬であり、これらには、マレイミド−ＰＥＧ、ビニルスルホン−ＰＥＧ、ヨードアセトアミド−ＰＥＧおよびｎ−ピリジルジスルフィド−ＰＥＧなどが含まれ、好ましくはマレイミド−ＰＥＧである。約５０００ダルトン、１００００ダルトン、１２０００ダルトン、２００００ダルトン、３００００ダルトンおよび４０，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧによる４つのＩＦＮ−α変異体のペグ化を行い、ＰＥＧ−インターフェロンの誘導体をそれぞれ得ることが、本発明において試みられている。得られたデータは、ペグ化されたタンパク質の半減期が、ＰＥＧの分子量が大きくなるとともに様々な程度に増大したことを示した。本発明の実施例では、ＰＥＧ化されたインターフェロン誘導体の作製、精製方法、ならびに、薬力学試験および薬物動態学試験が、低分子量体および高分子量体を代表するものとして２００００ダルトンおよび４００００ダルトンの分子量を有するペグ化された試薬をそれぞれ使用して具体的に例示される。
【００２５】
好ましい実施例において、ＰＥＧ試薬は、Ｎｅｋｔａｒ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓおよびＢＥＩＪＩＮＧ ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＣＯ．，ＬＴＤ．によって提供されるｍＰＥＧ−ＭＡＬ［これはまた、ＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ＫＤ）として記載される］またはｍＰＥＧ２−ＭＡＬ［これはまた、ＰＥＧ−ＭＡＬ（４０ＫＤ）として記載される］であり、時には、本明細書中で使用されるようにｍＰＥＧ−ＭＡＬおよびｍＰＥＧ２−ＭＡＬは一般に、ＰＥＧ−ＭＡＬまたはＰＥＧと略記される。
【００２６】
本発明において、ＭＩＦＮ、ＩＮＦ−Ｃｏｎ１、ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂを含む４つのαインターフェロンの工学細菌が、ＢＥＩＪＩＮＧ ＴＲＩ−ＰＲＩＭＥ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＣＯ．，ＬＴＤによって提供された。対応する細菌の名称は、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２３ｂ−ＭＩＦＮ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２３ｂ−ＩＮＦ−Ｃｏｎ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２３ｂ−ＩＦＮα−２ａおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２３ｂ−ＩＦＮα−２ｂであった。
【００２７】
実施例１Ａ ＭＩＦＮＣｙｓ８６をコードする遺伝子の構築および増幅
ＰＣＲインビトロ部位特異的変異誘発技術（ＰＣＲ−ＳＤＭ）を使用して、部位特異的変異誘発を重複伸長によって行うことができた。部位特異的変異誘発技術は成熟しており、確定した手順を有した。特定の試験に従って調節することができたことは、プライマーの位置長さ、および、ＰＣＲ反応条件であった。実際、本発明の保護範囲に含まれた、部位特異的変異誘発の目的を達成することができた様々な組合せが存在した。本実施例は好ましい実施形態を示す（同様に、実施例１Ｂ〜実施例１Ｄもまた、好ましい実施形態を示す）。２対のプライマーを設計した。上流側プライマーＰ１はＴ７プロモータープライマー（ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ）であり、Ｐ３の配列はｇｇａａａａａｔｔｃｔｇｃａｃｃｇａａｃｔｇｔであった；下流側プライマーＰ２はＴ７ターミネータープライマー（ｇｃｔａｇｔｔａｔｔｇｃｔｃａｇｃｇｇ）であり、Ｐ４の配列はａｃａｇｔｔｃｇｇｔｇｃａｇａａｔｔｔｔｔｃｃであった。変異部位がＰ３およびＰ４に含まれた。
【００２８】
ＭＩＦＮのプラスミドをテンプレートとして抽出した。１回目のラウンドのＰＣＲでは、２つの反応系が含まれた。反応系１は、プライマーＰ１、プライマーＰ４を含み、これらにより、変異部位およびその上流側ＤＮＡ配列が増幅された。反応系２は、プライマーＰ２、プライマーＰ３を含み、これらにより、変異部位およびその下流側ＤＮＡ配列が増幅された。反応条件は下記の通りであった：９４℃／４分、９４℃／１分、その後、５５℃／２分、７２℃／２分、合計で３０サイクル。２回目のラウンドのＰＣＲは重複伸長ＰＣＲであり、この場合、１回目のラウンドのＰＣＲ生成物をテンプレートとして選び、Ｐ１、Ｐ２をＰＣＲ増幅のためのプライマーとして選んだ。反応条件は下記の通りであった：９４℃／４分、９４℃／１分、その後、５６℃／２分、７２℃／２分、合計で３０サイクル。図１は、これら２ラウンドのＰＣＲ生成物のアガロース電気泳動図を示す。
【００２９】
２回目のラウンドのＰＣＲの生成物をアガロース電気泳動によってアッセイした。約７２０ｂｐを有する選ばれたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにより二重消化した後、約５００ｂｐを有する目的のＤＮＡフラグメントを、保存のために電気泳動を使用して回収した。
【００３０】
実施例１Ｂ ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６をコードする遺伝子の構築および増幅
２対のプライマーを設計した。上流側プライマーＰ１はＴ７プロモータープライマー（ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ）であり、Ｐ３の配列はｇｇａｔａａａｔｔｃｔｇｃａｃｃｇａａｃｔｇｔであり、下流側プライマーＰ２はＴ７ターミネータープライマー（ｇｃｔａｇｔｔａｔｔｇｃｔｃａｇｃｇｇ）であり、Ｐ４の配列はａｃａｇｔｔｃｇｇｔｇｃａｇａａｔｔｔａｔｃｃであった。変異部位がＰ３およびＰ４に含まれた。
【００３１】
ＰＣＲ手順は、１回目のラウンドのＰＣＲの反応テンプレートがＩＦＮ−Ｃｏｎ１のプラスミドであったことを除いて、実施例１Ａと同様とした。２回目のラウンドのＰＣＲの生成物をアガロース電気泳動によってアッセイした。約７２０ｂｐを有する選ばれたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにより二重消化した後、約５００ｂｐを有する目的のＤＮＡフラグメントを、保存のために電気泳動を使用して回収した。
【００３２】
実施例１Ｃ ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５をコードする遺伝子の構築および増幅
プライマーの設計は実施例１Ｂと同様とした。ＰＣＲ手順は、１回目のラウンドのＰＣＲの反応テンプレートがＩＦＮα−２ａのプラスミドであったことを除いて、実施例１Ａと同様とした。２回目のラウンドのＰＣＲの生成物をアガロース電気泳動によってアッセイした。約７２０ｂｐを有する選ばれたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにより二重消化した後、約５００ｂｐを有する目的のＤＮＡフラグメントを、保存のために電気泳動を使用して回収した。
【００３３】
実施例１Ｄ ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５をコードする遺伝子の構築および増幅
プライマーの設計は実施例１Ｂと同様とした。ＰＣＲ手順は、１回目のラウンドのＰＣＲの反応テンプレートがＩＦＮα−２ｂのプラスミドであったことを除いて、実施例１Ａと同様とした。２回目のラウンドのＰＣＲの生成物をアガロース電気泳動によってアッセイした。約７２０ｂｐを有する選ばれたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにより二重消化した後、約５００ｂｐを有する目的のＤＮＡフラグメントを、保存のために電気泳動を使用して回収した。
【００３４】
実施例２Ａ ＭＩＦＮＣｙｓ８６の組換えプラスミドの構築、形質転換および同定
プラスミドの構築および形質転換において、組換えプラスミドの構築を、多くの種類の制限酵素を使用し、また、連結反応の変更可能な条件を採用することによって完了することができた。本実施例では、研究室で一般に使用されるＪＭ１０９およびＤＨ５αが宿主細胞として選ばれた。このことは、他の宿主を形質転換のために使用することを排除しなかった。科学の原理、利便性および効率に基づいて、本実施例に示される組換えプラスミドの構築、形質転換および同定の実施形態が好ましかった（同様に、２Ｂ〜２Ｄに示される実施形態が好ましかった）。
【００３５】
ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる二重消化の後、プラスミドベクターｐＥＴ−２３ｂをアガロースゲル電気泳動によって回収し、実施例１Ａにおける最後の回収から得られる目的のＤＮＡフラグメントと連結した。連結反応条件：２ｘＲａｐｉｄ緩衝液、４μｌ〜５μｌ；Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１μｌ；標的フラグメント、１μｌ〜２μｌ；ベクター、３μｌ；４℃で一晩の連結。
【００３６】
ＪＭ１０９コンピテント細胞またはＤＨ５αコンピテント細胞を調製し、上述の連結生成物により形質転換し、ベンジルアンモニア平板に被覆し、３７℃で一晩培養した。
【００３７】
単一コロニーをテンプレートとして選ぶ。実施例１において示されるプライマーＰ１、プライマーＰ２を、ＰＣＲ増幅のために使用し、ＰＣＲ生成物のアガロース電気泳動の後（電気泳動図が図２に示される）、特定のバンドが陽性クローンについては約７２０ｂｐにおいて生じた。少量の陽性クローンの培養、それらからのプラスミドの抽出およびＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる二重消化の後、特定のバンドが約３ｋｂおよび５００ｂｐにおいてそれぞれ生じた（アガロース電気泳動図が図３に示された）。このことは、予想されたことと一致しており、組換えプラスミドの構築の成功を予備的に例示する。その配列をさらに確認するために、自動シーケンサーＡＢＩ３７７を、Ｔ７をユニバーサルプライマーとして用いる配列決定を行うために使用した。結果は、得られた配列が目的の配列と一致していたことを示した。
【００３８】
実施例２Ｂ ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６の組換えプラスミドの構築、形質転換および同定
本実施例において連結される遺伝子フラグメントは、実施例１Ｂにおいて回収された目的の遺伝子フラグメントであった。連結、形質転換および同定の操作で使用された技術および方法は、実施例２Ａにおいて使用された技術および方法と同じであった。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化の同定のための電気泳動図を図３に示した。同様に、その配列をさらに確認するために、自動シーケンサーＡＢＩ３７７を、Ｔ７をユニバーサルプライマーとして用いる配列決定を行うために使用した。結果は、得られた配列が目的の配列と一致していることを示した。
【００３９】
実施例２Ｃ ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５の組換えプラスミドの構築、形質転換および同定
本実施例において連結される遺伝子フラグメントは、実施例１Ｃにおいて回収された目的の遺伝子フラグメントであった。連結、形質転換および同定の操作で使用された技術および方法は、実施例２Ａにおいて使用された技術および方法と同じであった。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化の同定のための電気泳動図を図３に示した。同様に、その配列をさらに確認するために、自動シーケンサーＡＢＩ３７７を、Ｔ７をユニバーサルプライマーとして用いる配列決定を行うために使用した。結果は、得られた配列が目的の配列と一致していることを示した。
【００４０】
実施例２Ｄ ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５の組換えプラスミドの構築、形質転換および同定
本実施例において連結される遺伝子フラグメントは、実施例１Ｄにおいて回収された目的の遺伝子フラグメントであった。連結、形質転換および同定の操作で使用された技術および方法は、実施例２Ａにおいて使用された技術および方法と同じであった。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化の同定のための電気泳動図を図３に示した。同様に、その配列をさらに確認するために、自動シーケンサーＡＢＩ３７７を、Ｔ７をユニバーサルプライマーとして用いる配列決定を行うために使用した。結果は、得られた配列が目的の配列と一致していることを示した。
【００４１】
実施例３Ａ ＭＩＦＮＣｙｓ８６の発現および精製
実施例２Ａから得られる組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）または他の好適な宿主に形質転換し、その後、誘導発現を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主とする発現ＭＩＦＮＣｙｓ８６は、主として封入体の形態で存在し、総細菌タンパク質の３０％〜５０％を占めた。
【００４２】
粗精製：集めた細菌をＴＥとともに溶解した。超音波処理後、封入体を集め、その後、６ｍｏｌ／Ｌ〜８ｍｏｌ／ＬのＧｕ・ＨＣｌまたは尿素により溶解し、室温で一晩撹拌するか、または、４℃で一晩保ち、０．０５ｍｏｌ／Ｌ〜０．２ｍｏｌ／Ｌのホウ酸（ｐＨ８．０〜１０．５）溶液により復元した。復元溶液を４℃で一晩保った。４℃での遠心分離の後、上清を集めた。これは、ほぼ純粋なＭＩＦＮＣｙｓ８６であった。
【００４３】
精密精製：疎水性クロマトグラフィー、ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーおよびＳ−１００ゲル排除クロマトグラフィーを含む３工程の精製プロセスを連続して用いた。詳細な工程は下記の通りであった。復元溶液を、１０％〜３０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する溶液に希釈し、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーカラムに負荷し、２カラム体積の１０％〜３０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４により洗浄し、その後、１５％〜３５％のグリコールエチレンにより溶出し、その後、集められた溶出ピーク成分を溶液Ａ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜８０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５〜１０．５）により完全に透析した。透析された溶出液を、溶液Ａで完全に平衡化されたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦクロマトグラフィーカラムに負荷し、その後、溶液Ｂ（０．２ｍｏｌ／Ｌ〜０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有する溶液Ａ）により溶出し、溶出ピークを集めた。そして、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦイオン交換クロマトグラフィーの溶出ピーク分画物を、溶液Ｃ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜４０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢ＋２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜４０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、Ｐｈ６．５〜７．５）で完全に平衡化されたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００クロマトグラフィーカラムに完全に負荷し、溶液Ｃにより洗浄し、その後、溶出ピークを集めた。上記精製手順の後、得られたＭＩＦＮＣｙｓ８６は、９５％を超える純度を有していた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを図４に示した）。
【００４４】
実施例３Ｂ ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６の発現および精製
実施例２Ｂから得られる組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）または他の好適な宿主に形質転換し、その後、誘導発現を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主とする発現ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６は、主として封入体の形態で存在し、総細菌タンパク質の３０％〜５０％を占めた。
【００４５】
本実施例における精製方法は、実施例３Ａにおいて使用された精製方法と同じであった。得られたＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６は、９５％を超える純度を有していた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを図４に示した）。
【００４６】
実施例３Ｃ ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５の発現および精製
実施例２Ｃから得られる組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）または他の好適な宿主に形質転換し、その後、誘導発現を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主とする発現ＩＦＮα−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６は、主として封入体の形態で存在し、総細菌タンパク質の３０％〜５０％を占めた。
【００４７】
粗精製：本実施例における粗精製方法は、実施例３Ａにおいて使用された方法と同じであった。
【００４８】
精密精製：疎水性クロマトグラフィー、ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーおよびＳ−１００ゲル排除クロマトグラフィーを含む３工程の精製プロセスを連続して用いた。詳細な工程は下記の通りであった。復元溶液を３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈し、その後、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦイオン交換クロマトグラフィーカラムに負荷し、０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有する３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）溶液により溶出し、その後、溶出ピークを集めた。そして、上記工程からの溶出サンプルをＰＢＳ（ｐＨ７．０）により３倍希釈し、その後、ＩＦＮα−２ａモノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷し、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有する０．３ｍｏｌ／ＬのＧｌｙ溶液（ｐＨ２．５）により溶出し、その後、溶出ピークを集めた。その後、上記工程からの溶出サンプルを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００クロマトグラフィーカラムに負荷し、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）により溶出した。得られたＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５は、９５％を超える純度を有していた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを図４に示した）。
【００４９】
実施例３Ｄ ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５の発現および精製
実施例２Ｄから得られる組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）または他の好適な宿主に形質転換し、その後、誘導発現を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主とする発現ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５は、主として封入体の形態で存在し、総細菌タンパク質の３０％〜５０％を占めた。
【００５０】
粗精製：本実施例における粗精製方法は、実施例３Ａにおいて使用された方法と同じであった。
【００５１】
精密精製：疎水性クロマトグラフィー、ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーおよびＳ−１００ゲル排除クロマトグラフィーを含む３工程の精製プロセスを連続して用いた。具体的な工程は下記の通りであった。復元溶液を３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈し、その後、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦイオン交換クロマトグラフィーカラムに負荷し、０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有する３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）溶液により溶出し、その後、溶出ピークを集めた。そして、上記工程からの溶出サンプルをＰＢＳ（ｐＨ７．０）により３倍希釈し、その後、ＩＦＮα−２ｂモノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷し、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有する０．３ｍｏｌ／ＬのＧｌｙ溶液により溶出し、その後、溶出ピークを集めた。その後、上記工程からの溶出サンプルを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００クロマトグラフィーカラムに負荷し、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）により溶出した。得られたＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５は、９５％を超える純度を有していた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを図４に示した）。
【００５２】
実施例４ ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５のＰＥＧカップリング
本発明において、インターフェロンαの４つの変異体を、様々な分子量を有するＰＥＧとカップリングすることができた。好ましい実施例において、ＰＥＧには、およそ２０ＫＤおよび４０ＫＤの分子量をそれぞれ有するｍＰＥＧ−ＭＡＬおよびｍＰＥＧ２−ＭＡＬが含まれた。
【００５３】
１）ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５の濃縮
上記４つのインターフェロンα誘導体は、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦクロマトグラフィーカラムによってそれぞれ濃縮することができる。具体的な方法は下記の通りであった。実施例３Ａ〜実施例３Ｄのいずれか１つから得られる精製されたタンパク質サンプルを１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜８０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜８．５）の溶液により２倍以上希釈し、ＤＥＡＥクロマトグラフィーカラムに負荷し、２０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢ緩衝液（ｐＨ７．６）＋３００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌにより溶出して、目的タンパク質の濃縮された溶液を得た。
【００５４】
２）ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５のｍＰＥＧ−ＭＡＬとのカップリング
ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５をｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＭＡＬとカップリングした。従って、モノペグ化された誘導体はそれぞれ、下記のように記述される。ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５。
【００５５】
ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５をｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＭＡＬとカップリングした。従って、モノペグ化された誘導体はそれぞれ、下記のように記述される：ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５。
【００５６】
このカップリング反応は、下記のような具体的工程を有した。
適量の濃縮された溶液を本発明の工程１）から取り、タンパク質濃度について８ｍｇ／ｍｌ〜１２ｍｇ／ｍｌに調節した。ＰＥＧ粉末を１：１のモル比により加え、ＰＥＧ粉末が溶解し得るように穏やかに振とうし、その後、４℃で一晩反応した。すなわち、反応時間は１０時間を超えることが望ましい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、（図５〜図６に示されるように）カップリング反応の程度が検出された。
【００５７】
実施例５ インターフェロン−α変異体の誘導体の精製
ペグ化生成物を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。具体的な条件は下記の通りであった。反応液を、２５ｍｍｏｌのｐＨ８．０のＴｒｉｓ緩衝液系を使用して２０倍〜３０倍希釈し、その後、平衡化されたＤＥＡＥカラムに３ｍｌ／分〜４ｍｌ／分の流速により負荷し、ベースライン平衡に達した後、２５ｍＭのｐＨ８．０のＴｒｉｓにおける８０ｍＭのＮａＣｌ濃度により溶出して、目的タンパク質の溶出ピークを得た。得られた組換えタンパク質の最終純度は９５％を超えていた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを図７〜図８に示した）。
【００５８】
実施例６ ４種類のインターフェロンα、それらの変異体およびそれらの変異体のポリエチレングリコール誘導体のインビトロ抗ウイルス活性の測定
ＷＩＳＨ−ＶＳＶシステムを使用する細胞変性効果阻害アッセイを、インビトロでのインターフェロン抗ウイルス活性を求めるために採用した（これは、先行技術分野において一般に広く知られている方法であった）。具体的な参考文献が付属３ＸＣ「インターフェロンの生物学的活性の測定」（「中華人民共和国薬局方」の２００５年版）に示された。
【００５９】
本実施例では、１６のインターフェロン（または誘導体）のインビトロ抗ウイルス活性について測定された。これらには、詳しくは、下記が含まれた。
４種類のインターフェロンα：ＭＩＦＮ、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１、ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂ、および
ＩＮＦ−αの４種類の変異体：ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５（これらは本発明において実施例３Ａ〜実施例３Ｄによって調製された）。
同様にまた、８種類のポリエチレングリコール誘導体が存在した。
ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５（これらは本発明において実施例５によって調製された）。
【００６０】
それらのインビトロ抗ウイルス活性アッセイ結果を下記の表１〜表４に示した。
【表１】
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
実施例７ ラットの薬物動態学研究
表５に示される薬物動態学スキームによって、１２のインターフェロン（または誘導体）をインビトロ抗ウイルス活性について測定した。これらには、詳しくは、下記が含まれた。
ＩＮＦ−αの４種類の変異体：ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５（これらは本発明において実施例３Ａ〜実施例３Ｄによって調製された）、および
８種類のポリエチレングリコール誘導体：ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５（これらは本発明において実施例５によって調製された）。
【表５】
【００６５】
上記の試験スキームにおいて、血液サンプルをラットの眼周囲から集め、その後、遠心分離して血清を集めた。血清サンプルにおけるインターフェロンの含有量をＣＰＥ法（ＷＩＳＨ／ＶＳＶシステム）によって求めた。
【表６】
【００６６】
ＳＤラットにおけるＭＩＦＮＣｙｓ８６およびそのＰＥＧ誘導体の代謝が一次吸収のコンパートメントモデルと一致していたことが、３Ｐ８７ソフトウエアによるフィッティングの後で見出された。ペグ化はＭＩＦＮＣｙｓ８６の薬物動態学特性を著しく改善することができた。ＭＩＦＮＣｙｓ８６と比較した場合、ｍＰＥＧ−ＭＩＦＮＣｙｓ８６は、吸収の半減期、ピーク時間、および、排出半減期が著しく延長され、薬物時間曲線下面積が著しく増大し、クリアランス速度が著しく低下した。ペグ化が体内におけるＭＩＦＮＣｙｓ８６の平均寿命を延ばすことができ、また、クリアランス速度を減少させることができたことを認めることができる。
【００６７】
同じ結果が、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６およびそのＰＥＧ誘導体、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびそのＰＥＧ誘導体、ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５およびそのＰＥＧ誘導体の薬物動態学試験において見出された。すなわち、非修飾体と比較した場合、ペグ化されたインターフェロンは、吸収の半減期、ピーク時間および排出半減期が著しく延長され、薬物時間曲線下面積が著しく増大し、クリアランス速度が著しく低下した。
【００６８】
それにより、ペグ化が体内におけるＭＩＦＮＣｙｓ８６の平均寿命を延ばすことができ、また、クリアランス速度を減少させることができることを証明することができる。
【００６９】
現時点において、本発明が、相当に詳しい記載とともに実施されてきた。好ましい実施例は、ある種の改変および改善が、本発明の保護範囲から逸脱することなく、記載されるような発明に対して行われ得るので、本発明を例示することができるのみであり、しかし、本発明を限定することはできない。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
動物実験では、本発明のインターフェロン変異体のポリエチレングリコール誘導体は体内におけるインターフェロンの平均寿命を延ばすことができ、また、クリアランス速度を減少させることができ、また、実質的に高い抗ウイルス活性を有したことが示された。従って、本発明において記載される方法、または、当業者には広く知られている方法に従って、本発明は、本発明のインターフェロン変異体を調製するために実施することができ、その後、本発明のインターフェロン変異体はさらに、ポリエチレングリコールに対して共有結合により結合され、免疫調節疾患（例えば、腫瘍疾患または感染性疾患など）の防止および処置のための薬物に開発される。
【００７１】
配列リストが添付される：
アミノ酸およびヌクレオチドの配列リストが添付されていますので、参照願いたい。この場合、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１、ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂのヌクレオチド配列は公知であり、具体的な実施例では、対応する部位のコドンのみがｔｇｃに変異させられる。従って、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５のＤＮＡ配列は本発明において添付されていない。
配列番号１はＭＩＦＮＣｙｓ８６のアミノ酸配列を示す。
配列番号２はＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６のアミノ酸配列を示す。
配列番号３はＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５のアミノ酸配列を示す。
配列番号４はＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５アミノ酸配列を示す。
配列番号５はＭＩＦＮＣｙｓ８６のＤＮＡ配列を示す。
配列番号６〜配列番号９はプライマーＰ１〜プライマーＰ４のヌクレオチド配列をそれぞれ示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＦＮ−α変異体およびそのポリエチレングリコール誘導体の調製方法および使用に関連する。具体的には、本発明は、部位特異的変異誘発技術を使用するα−インターフェロンの部位特異的変異誘発、これにより、ＩＮＦ−αにおいて８５位または８６位におけるＴｙｒをＣｙｓに置換すること、および、その部位をポリエチレングリコールと共有結合により結合することを含む方法に関連する。本発明はまた、インターフェロンを、Ｃｙｓを使用して特異的に修飾する方法、インターフェロンα変異体のポリエチレングリコール誘導体の抽出および精製、ならびに、ガンおよび炎症性疾患におけるその使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンは、広いスペクトルの抗ウイルス性、抗細胞増殖および免疫調節を有する重要な家族性サイトカインの１つのタイプである。哺乳動物のインターフェロンは、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンωなどに分けることができ、この場合、ＩＮＦ−αはさらに、１０を超える種類のサブタイプに分けることができる。実際の臨床研究によれば、αタイプのインターフェロンが重要な抗ウイルス性および抗腫瘍性の薬物である。現在、主に、ｒｈＩＦＮα１ｂ、ｒｈＩＦＮα２ａおよびｒｈＩＦＮα２ｂが中国では最も広く臨床において使用される。
【０００３】
加えて、研究では、ヒトＩＦＮ−αのＩ型ファミリーは、２０を超える遺伝子をそのメンバーとして有し、それらのほとんどが機能的なタンパク質をコードし、また、約９０％の相同性をヌクレオチドレベルで相互に関して有することが示されている。かなりの数のインターフェロン誘導体またはインターフェロンアナログが遺伝子工学によって作製され得る。現在、最も注目すべきものがＩｎｆｅｒｇｅｎ（ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１）であり、これは、１３種類のα型インターフェロンの遺伝子配列相同性に基づいてＡｍｇｅｎ（合衆国企業）によって設計され、インターフェロンα２ｂの５倍〜１０倍大きい抗ウイルス活性によるＣ型肝炎の処置のために１９９７年に米国食品医薬品局によってリストに収載されることが承認された完全に新規なタンパク質工学薬物である。中国特許出願公開ＣＮ１５１１８４９Ａ（出願人：ＢＥＩＪＩＮＧ ＴＲＩ−ＰＲＩＭＥ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＣＯ．，ＬＴＤ）は、インビトロでの相同的組換え法によって得られ、活性および安定性においてＩｎｆｅｒｇｅｎよりも大きな利点を有する様々なインターフェロンαファミリー分子を開示した。
【０００４】
しかしながら、インターフェロンα１ｂ、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂまたはＩｎｆｅｒｇｅｎを問わず、タンパク質薬物として、これらはすべてが、不良な安定性、大きい血漿クリアランス、短いインビボ半減期、抗原抗体反応を生じやすいことなどのために、臨床処置では制限される。様々な遺伝子工学技術により、組換えタンパク質の大規模な合成が可能になり、また、異種のタンパク質によって誘導される免疫原性問題が大きく解決され、しかし、急速な血漿クリアランスおよび低い生物学的利用能のような不都合な点は依然として克服することができない。そのような不都合な点の結果が下記の通りである。インターフェロンの頻繁な注射が、血漿における効果的な治療濃度を達成するために要求され、そのうえ、それぞれの注射の後で、血中濃度のより大きな変動が、薬物濃度の頂上値および谷値の形成とともに引き起こされ、従って、このことは、処置費用、ならびに、薬物投与の不便さおよび有害な反応の危険性を増大させる可能性がある。そのため、様々な試みが、タンパク質薬物の効力を高めるための様々な薬物送達技術（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を取り入れるために行われている。現在、薬物送達技術の中で、最も広く研究されているのが、ペグ化技術（ＰＥＧＮＯＬＯＧＹ）である。
【０００５】
タンパク質のペグ化技術が、タンパク質型薬物のインビボでの薬物動態学特性を改善するためにこの１０年で新たに開発される。この技術では、活性化されたポリエチレングリコール分子［ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ］がタンパク質分子の表面に結合させられ、従って、これにより、タンパク質の立体構造が影響を受け、最終的には、タンパク質の様々な生化学的性質における変化、例えば、増大した化学的安定性、プロテアーゼ加水分解に対する抵抗性の改善された能力、免疫原性および毒性の低下または消失、延長されたインビボ半減期、ならびに、低下した血漿クリアランスなどが引き起こされる。
【０００６】
ＰＥＧ成分は、エチレンモノマーの重合によって得られる不活性な長い鎖の両親媒性分子である。現在、広範囲の様々なＰＥＧ分子が利用可能である。活性化されたＰＥＧの活性な官能基を処理分子の特別な位置（例えば、アミン、チオールまたは他の求核性物質）に連結することができる。ほとんどの場合、ＰＥＧ誘導体の共有結合性の結合を、リシンのアミノ基およびペプチド分子のＮ末端を修飾部位として使用することによって達成することができ、この場合、それぞれの連結部分により、異なるイソ型が決定される。薬物の研究開発プロセスの期間中、ＰＥＧのイソ型分布は非常に重要である。製造物の生物学的活性が特定のイソ型分布混合物との密接な関係を有するので、製造物は分布要求に従って規定されなければならない。ＰＥＧのイソ型分布が、製造プロセスを変更すること、および、比例的ロフティング（ｌｏｆｔｉｎｇ）を含めて、薬物開発プロセス全体の期間中において一貫していることが証明されなければならない。実際の製造では、ＰＥＧのイソ型分布により、多大の困難が製造物のプロセス制御および品質評価にもたらされる。
【０００７】
上記の問題は部位特異的なペグ化によって回避することができる。ますますの関心が、特定のタンパク質部位をペグ化することに注がれている。これは、特定のタンパク質部位をペグ化することにより、非常に特異的なペグ化製造物を得ることができ、また、修飾された製造物の純度を効果的に制御することができ、このことはプロセスをより簡略にし、また、評価することがはるかにより容易な製造物をもたらすからである。タンパク質の非常に選択的なペグ化を分子内のシステイン（Ｃｙｓ）部位の使用によって行うことができる。フリーのスルフヒドリルを有するタンパク質はほとんんどなく、しかし、スルフヒドリルは、タンパク質の立体構造を維持するための重要な共有結合性の結合である。この部位における化学的修飾は、多くの場合、より大きな損傷を分子構造に引き起こし、従って、タンパク質の活性を失わせる。遺伝子工学を使用する手段により、この目的を達成することができる。タンパク質またはペプチドが異なれば、構造および性質が異なること、ならびに、何が導入され得るか、および、ＰＥＧ修飾剤がどこに導入され得るかに留意することは価値がある。遺伝子工学手段によって人為的に増やされたＣｙｓは分子内のミスマッチまたは分子間の組合せを引き起こし、このことは、分子の不安定性、または、正規でないポリマーの形成の原因となる。この点で、包括的な配列分析および分子構造の正確なシミュレーションは、ある考えを提供する。
【０００８】
配列分析により、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂおよびＩＦＮ−ｃｏｎ１を含めて、大多数のＩＦＮ−α分子が４個のシステインを有し、この場合、ジスルフィド結合が、１位におけるＣｙｓと、９９位におけるＣｙｓとの間、および、２９位におけるＣｙｓと、１３９位におけるＣｙｓとの間で形成されて存在することが見出された。本発明者は、この特徴もまた維持したインビトロでの相同的組換えによる新しいタイプのインターフェロン（ＭＩＦＮ）が得られる。ＩＦＮ−α１ｂおよびそれ以外のαファミリーインターフェロンは構造において明白に異なっており、前者は、第５のＣｙｓを、正常なジスルフィド結合を形成する上記の４つのＣｙｓとは離れた８６位に有する。小試験では、インターフェロンの部位特異的ペグ化がこの部位の使用によって実施できることが見出された。従って、この特徴との組合せで、他のＩＦＮ−αのペグ化は、同じ結果をもたらすことが予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】中国特許出願公開ＣＮ１５１１８４９Ａ（出願人：ＢＥＩＪＩＮＧ ＴＲＩ−ＰＲＩＭＥ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＣＯ．，ＬＴＤ）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】付属３ＸＣ「インターフェロンの生物学的活性の測定」（「中華人民共和国薬局方」の２００５年版）
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、インターフェロン−α変異体を提供することである。そのアミノ酸配列の８５位または８６位におけるアミノ酸が、大きい生物学的活性だけでなく、良好な安定性、水溶性、病原性に対する抵抗性のような利点を有するポリエチレングリコール誘導体を形成するためにポリエチレングリコールと結合させることができるＣｙｓに変異させられる。
【００１２】
ＩＦＮ−αの８５位または８６位は通常、チロシン（Ｔｙｒ）であり、このチロシン（Ｔｙｒ）は、比較的保存された区域に位置している。本発明により、αインターフェロンが、ＴｙｒをＣｙｓに変異することによって改変され、また、一連のポリエチレングリコール誘導体を生じさせるためにポリエチレングリコールと反応する一連の変異体が得られる。
【００１３】
本発明の技術的解決策が、現在一般に使用されているαインターフェロンの下記の４つのタイプによってさらに例示される。
【００１４】
ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５（アミノ酸配列は、付属の配列番号１〜配列番号４を参照のこと）が、４つの既存のインターフェロン（ＭＩＦＮ、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１、ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂ）の部位特異的変異誘発、および、８６位におけるアミノ酸をＣｙｓに置換すること（ＭＩＦＮおよびＩＦＮ−Ｃｏｎ１）、または、８５位におけるアミノ酸をＣｙｓに置換すること（ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂ）によって得られる。タンパク質をコードする組換えプラスミドが、目的の遺伝子をそれぞれ組換え、得られた組換え遺伝子をインビトロ部位特異的変異誘発技術の使用によって発現ベクターｐＥＴ−２３ｂに挿入することによって得られる。別個に、これら４つのレコン（ｒｅｃｏｎ）は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）レシピエト細胞において効率的および安定的に発現する。発現産物は封入体の形態で存在し、発現量は総細菌タンパク質の３０％超を占める。疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーおよびＳ−１００ゲル排除クロマトグラフィーを連続して使用する精製の後、高い純度を有するＭＩＦＮＣｙｓ８６およびＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６が得られる。そして、ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィー、モノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーおよびＳ−１００ゲル排除クロマトグラフィーを使用する精製の後、高い純度を有するＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５が得られる。
【００１５】
本発明において記載される変異体が、たとえ、ＩＦＮ−αの８５位または８６位におけるＴｒｙをＣｙｓに変異することによって得られるとしても、しかし、ＩＦＮ−αの鎖の長さは完全には一致していないので、本明細書におけるＴｙｒは、変異の場所を例示するためだけであることが当業者には理解されなければならない。当業者は、ＩＦＮ−αに対する様々な改変を行うことができる。例えば、当業者はいくつかの部位を変異させることができ、従って、既存のαインターフェロンとは異なり、しかし、既存のαインターフェロンに関して同じ機能または類似する機能を有するアミノ酸配列を得ることができる。しかしながら、上記の得られた配列は、本発明において記載される対応する部位での変異および改変を行うことができ、改善された成績を得ることができる。従って、本発明のＩＦＮ−α変異体もまた、これらの配列を含む。
【００１６】
本発明は様々なインターフェロン−α変異体ポリエチレングリコール誘導体を提供し、この場合、ポリエチレングリコールは直鎖であってもよく、分枝構造を同様に有することができる。ＩＦＮ−α変異体が５０００ダルトン〜４００００ダルトンのそのようなＰＥＧによりペグ化され、結果は、ペグ化されたタンパク質の半減期が、増大したＰＥＧ分子量とともに様々な程度に延びたことを示した。
【００１７】
本発明はまた、インターフェロン−α変異体ポリエチレングリコール誘導体の調製方法および精製方法を提供する。
【００１８】
最後に、本発明はインターフェロン−α変異体ポリエチレングリコール誘導体のインビトロでの薬力学および薬物動態学の試験方法および結果を提供し、これらは、インターフェロン−α変異体ポリエチレングリコール誘導体が、免疫調節障害（例えば、腫瘍疾患または感染性疾患など）の処置または防止のために使用されたとき、より良好な技術的パラメーターを有することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】「ＭＩＦＮＣｙｓ８６の遺伝子の構築および増幅」（実施例１Ａ）における２ラウンドのＰＣＲ生成物のアガロース電気泳動図を示す。レーン１はＤＮＡマーカーを表し、レーン２は１回目のラウンドのＰＣＲ反応系における反応系１の生成物を表し、レーン３は１回目のラウンドのＰＣＲにおける反応系２の生成物を表し、レーン４は２回目のラウンドのＰＣＲ生成物を表す。
【図２】陽性クローンを「ＭＩＦＮＣｙｓ８６組換えプラスミドの構築、形質転換および同定」（実施例２Ａ）におけるテンプレートとするＰＣＲ生成物のアガロース電気泳動図を示す。レーン１はＤＮＡマーカーを表し、レーン２〜レーン８は単一コロニーのＰＣＲ生成物をそれぞれ表し、この場合、２、４、５、６、７、８が陽性クローンである。
【図３】４つの変異型組換えプラスミド（実施例２Ａ〜実施例２Ｄ）のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ二重消化の電気泳動図を示す。レーン１はＤＮＡマーカーを表し、レーン２はプラスミドベクターｐＥＴ−２３ｂを表し、レーン３、レーン７は、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる消化の前および後におけるＭＩＦＮＣｙｓ８６の組換えプラスミドをそれぞれ表し、レーン４、レーン８は、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる消化の前および後におけるＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６の組換えプラスミドをそれぞれ表し、レーン５、レーン９は、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる消化の前および後におけるＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５の組換えプラスミドをそれぞれ表し、レーン６、レーン１０は、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる消化の前および後におけるＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５の組換えプラスミドをそれぞれ表す。
【図４】精製されたＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５のＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを示す（実施例３Ａ〜実施例３Ｄ）。レーン１はタンパク質マーカーを表し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５は、精製されたＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５を表す。
【図５】ＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ＫＤ）との、ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５によって行われた連結反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを示す（実施例４）。レーン１はタンパク質マーカーを表し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５は、ＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ＫＤ）との、ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５によって行われた連結反応の生成物をそれぞれ表す。
【図６】ＰＥＧ−ＭＡＬ（４０ＫＤ）との、ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５によって行われた連結反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを示す（実施例４）。レーン１はタンパク質マーカーを表し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５は、ＰＥＧ−ＭＡＬ（４０ＫＤ）との、ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５によって行われた連結反応の生成物をそれぞれ表す。
【図７】インターフェロン−α変異体の４種類の精製されたＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ＫＤ）誘導体のＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを示す（実施例５）。レーン１はタンパク質マーカーを表し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５は、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５をそれぞれ表す。
【図８】インターフェロン−α変異体の４種類の精製されたＰＥＧ−ＭＡＬ（４０ＫＤ）誘導体のＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを示す（実施例５）。レーン１はタンパク質マーカーを表し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５は、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５をそれぞれ表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明が具体的な実施例との組合せでさらに例示される。これらの実施例は、本発明の保護範囲を限定することなく本発明を説明するために意図されるだけであることを理解しなければならない。
【００２１】
具体的に定義されない限り、本明細書中で使用される用語は、関連した技術分野において広く知られている用語に対応する。標準的な化学記号および省略記号が、完全な名称と交換可能に使用され得る。例えば、「ＰＥＧ」および「ポリエチレングリコール」は同じ意味を有し、「インターフェロンα」、「ＩＦＮ−α」および「αインターフェロン」もまた、同じ意味を有する。
【００２２】
別途詳しく記されない限り、本明細書中で使用され、しかし、明示的には例示されない技術および方法、または、簡略的に例示される技術および方法は、この技術分野で従来から使用される技術および方法を示しており、この技術分野で使用される広く知られている技術および方法に従って実施することができる。キットの適用が、製造者または供給者によって提供される説明書に従って行われる。
【００２３】
本発明において、ＭＩＦＮ、ＩＮＦ−Ｃｏｎ１、ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂを含む４つのタンパク質のアナログを、アミノ酸の機能的に等価な分子の置換、付加または欠失によって得ることができる。例えば、類似する性質を有する１つまたは複数のアミノ酸残基を元の配列における対応するアミノ酸残基に代わって使用すること、従って、元のタンパク質配列を変化させて、サイレントな変化を形成することが、この技術分野では広く知られている。
【００２４】
本発明において、ポリエチレングリコール誘導体におけるポリエチレングリコール成分が直鎖構造または分岐構造を有し得ることが当業者には広く知られている。前記ポリエチレングリコール誘導体は、スルフヒドリル反応を行うことができ、また、システイン残基のスルフヒドリルと反応することができるペグ化された試薬であり、これらには、マレイミド−ＰＥＧ、ビニルスルホン−ＰＥＧ、ヨードアセトアミド−ＰＥＧおよびｎ−ピリジルジスルフィド−ＰＥＧなどが含まれ、好ましくはマレイミド−ＰＥＧである。約５０００ダルトン、１００００ダルトン、１２０００ダルトン、２００００ダルトン、３００００ダルトンおよび４０，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧによる４つのＩＦＮ−α変異体のペグ化を行い、ＰＥＧ−インターフェロンの誘導体をそれぞれ得ることが、本発明において試みられている。得られたデータは、ペグ化されたタンパク質の半減期が、ＰＥＧの分子量が大きくなるとともに様々な程度に増大したことを示した。本発明の実施例では、ＰＥＧ化されたインターフェロン誘導体の作製、精製方法、ならびに、薬力学試験および薬物動態学試験が、低分子量体および高分子量体を代表するものとして２００００ダルトンおよび４００００ダルトンの分子量を有するペグ化された試薬をそれぞれ使用して具体的に例示される。
【００２５】
好ましい実施例において、ＰＥＧ試薬は、Ｎｅｋｔａｒ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓおよびＢＥＩＪＩＮＧ ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＣＯ．，ＬＴＤ．によって提供されるｍＰＥＧ−ＭＡＬ［これはまた、ＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ＫＤ）として記載される］またはｍＰＥＧ２−ＭＡＬ［これはまた、ＰＥＧ−ＭＡＬ（４０ＫＤ）として記載される］であり、時には、本明細書中で使用されるようにｍＰＥＧ−ＭＡＬおよびｍＰＥＧ２−ＭＡＬは一般に、ＰＥＧ−ＭＡＬまたはＰＥＧと略記される。
【００２６】
本発明において、ＭＩＦＮ、ＩＮＦ−Ｃｏｎ１、ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂを含む４つのαインターフェロンの工学細菌が、ＢＥＩＪＩＮＧ ＴＲＩ−ＰＲＩＭＥ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＣＯ．，ＬＴＤによって提供された。対応する細菌の名称は、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２３ｂ−ＭＩＦＮ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２３ｂ−ＩＮＦ−Ｃｏｎ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２３ｂ−ＩＦＮα−２ａおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２３ｂ−ＩＦＮα−２ｂであった。
【００２７】
実施例１Ａ ＭＩＦＮＣｙｓ８６をコードする遺伝子の構築および増幅
ＰＣＲインビトロ部位特異的変異誘発技術（ＰＣＲ−ＳＤＭ）を使用して、部位特異的変異誘発を重複伸長によって行うことができた。部位特異的変異誘発技術は成熟しており、確定した手順を有した。特定の試験に従って調節することができたことは、プライマーの位置長さ、および、ＰＣＲ反応条件であった。実際、本発明の保護範囲に含まれた、部位特異的変異誘発の目的を達成することができた様々な組合せが存在した。本実施例は好ましい実施形態を示す（同様に、実施例１Ｂ〜実施例１Ｄもまた、好ましい実施形態を示す）。２対のプライマーを設計した。上流側プライマーＰ１はＴ７プロモータープライマー（ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ）であり、Ｐ３の配列はｇｇａａａａａｔｔｃｔｇｃａｃｃｇａａｃｔｇｔであった；下流側プライマーＰ２はＴ７ターミネータープライマー（ｇｃｔａｇｔｔａｔｔｇｃｔｃａｇｃｇｇ）であり、Ｐ４の配列はａｃａｇｔｔｃｇｇｔｇｃａｇａａｔｔｔｔｔｃｃであった。変異部位がＰ３およびＰ４に含まれた。
【００２８】
ＭＩＦＮのプラスミドをテンプレートとして抽出した。１回目のラウンドのＰＣＲでは、２つの反応系が含まれた。反応系１は、プライマーＰ１、プライマーＰ４を含み、これらにより、変異部位およびその上流側ＤＮＡ配列が増幅された。反応系２は、プライマーＰ２、プライマーＰ３を含み、これらにより、変異部位およびその下流側ＤＮＡ配列が増幅された。反応条件は下記の通りであった：９４℃／４分、９４℃／１分、その後、５５℃／２分、７２℃／２分、合計で３０サイクル。２回目のラウンドのＰＣＲは重複伸長ＰＣＲであり、この場合、１回目のラウンドのＰＣＲ生成物をテンプレートとして選び、Ｐ１、Ｐ２をＰＣＲ増幅のためのプライマーとして選んだ。反応条件は下記の通りであった：９４℃／４分、９４℃／１分、その後、５６℃／２分、７２℃／２分、合計で３０サイクル。図１は、これら２ラウンドのＰＣＲ生成物のアガロース電気泳動図を示す。
【００２９】
２回目のラウンドのＰＣＲの生成物をアガロース電気泳動によってアッセイした。約７２０ｂｐを有する選ばれたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにより二重消化した後、約５００ｂｐを有する目的のＤＮＡフラグメントを、保存のために電気泳動を使用して回収した。
【００３０】
実施例１Ｂ ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６をコードする遺伝子の構築および増幅
２対のプライマーを設計した。上流側プライマーＰ１はＴ７プロモータープライマー（ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ）であり、Ｐ３の配列はｇｇａｔａａａｔｔｃｔｇｃａｃｃｇａａｃｔｇｔであり、下流側プライマーＰ２はＴ７ターミネータープライマー（ｇｃｔａｇｔｔａｔｔｇｃｔｃａｇｃｇｇ）であり、Ｐ４の配列はａｃａｇｔｔｃｇｇｔｇｃａｇａａｔｔｔａｔｃｃであった。変異部位がＰ３およびＰ４に含まれた。
【００３１】
ＰＣＲ手順は、１回目のラウンドのＰＣＲの反応テンプレートがＩＦＮ−Ｃｏｎ１のプラスミドであったことを除いて、実施例１Ａと同様とした。２回目のラウンドのＰＣＲの生成物をアガロース電気泳動によってアッセイした。約７２０ｂｐを有する選ばれたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにより二重消化した後、約５００ｂｐを有する目的のＤＮＡフラグメントを、保存のために電気泳動を使用して回収した。
【００３２】
実施例１Ｃ ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５をコードする遺伝子の構築および増幅
プライマーの設計は実施例１Ｂと同様とした。ＰＣＲ手順は、１回目のラウンドのＰＣＲの反応テンプレートがＩＦＮα−２ａのプラスミドであったことを除いて、実施例１Ａと同様とした。２回目のラウンドのＰＣＲの生成物をアガロース電気泳動によってアッセイした。約７２０ｂｐを有する選ばれたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにより二重消化した後、約５００ｂｐを有する目的のＤＮＡフラグメントを、保存のために電気泳動を使用して回収した。
【００３３】
実施例１Ｄ ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５をコードする遺伝子の構築および増幅
プライマーの設計は実施例１Ｂと同様とした。ＰＣＲ手順は、１回目のラウンドのＰＣＲの反応テンプレートがＩＦＮα−２ｂのプラスミドであったことを除いて、実施例１Ａと同様とした。２回目のラウンドのＰＣＲの生成物をアガロース電気泳動によってアッセイした。約７２０ｂｐを有する選ばれたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにより二重消化した後、約５００ｂｐを有する目的のＤＮＡフラグメントを、保存のために電気泳動を使用して回収した。
【００３４】
実施例２Ａ ＭＩＦＮＣｙｓ８６の組換えプラスミドの構築、形質転換および同定
プラスミドの構築および形質転換において、組換えプラスミドの構築を、多くの種類の制限酵素を使用し、また、連結反応の変更可能な条件を採用することによって完了することができた。本実施例では、研究室で一般に使用されるＪＭ１０９およびＤＨ５αが宿主細胞として選ばれた。このことは、他の宿主を形質転換のために使用することを排除しなかった。科学の原理、利便性および効率に基づいて、本実施例に示される組換えプラスミドの構築、形質転換および同定の実施形態が好ましかった（同様に、２Ｂ〜２Ｄに示される実施形態が好ましかった）。
【００３５】
ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる二重消化の後、プラスミドベクターｐＥＴ−２３ｂをアガロースゲル電気泳動によって回収し、実施例１Ａにおける最後の回収から得られる目的のＤＮＡフラグメントと連結した。連結反応条件：２ｘＲａｐｉｄ緩衝液、４μｌ〜５μｌ；Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１μｌ；標的フラグメント、１μｌ〜２μｌ；ベクター、３μｌ；４℃で一晩の連結。
【００３６】
ＪＭ１０９コンピテント細胞またはＤＨ５αコンピテント細胞を調製し、上述の連結生成物により形質転換し、ベンジルアンモニア平板に被覆し、３７℃で一晩培養した。
【００３７】
単一コロニーをテンプレートとして選ぶ。実施例１において示されるプライマーＰ１、プライマーＰ２を、ＰＣＲ増幅のために使用し、ＰＣＲ生成物のアガロース電気泳動の後（電気泳動図が図２に示される）、特定のバンドが陽性クローンについては約７２０ｂｐにおいて生じた。少量の陽性クローンの培養、それらからのプラスミドの抽出およびＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩによる二重消化の後、特定のバンドが約３ｋｂおよび５００ｂｐにおいてそれぞれ生じた（アガロース電気泳動図が図３に示された）。このことは、予想されたことと一致しており、組換えプラスミドの構築の成功を予備的に例示する。その配列をさらに確認するために、自動シーケンサーＡＢＩ３７７を、Ｔ７をユニバーサルプライマーとして用いる配列決定を行うために使用した。結果は、得られた配列が目的の配列と一致していたことを示した。
【００３８】
実施例２Ｂ ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６の組換えプラスミドの構築、形質転換および同定
本実施例において連結される遺伝子フラグメントは、実施例１Ｂにおいて回収された目的の遺伝子フラグメントであった。連結、形質転換および同定の操作で使用された技術および方法は、実施例２Ａにおいて使用された技術および方法と同じであった。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化の同定のための電気泳動図を図３に示した。同様に、その配列をさらに確認するために、自動シーケンサーＡＢＩ３７７を、Ｔ７をユニバーサルプライマーとして用いる配列決定を行うために使用した。結果は、得られた配列が目的の配列と一致していることを示した。
【００３９】
実施例２Ｃ ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５の組換えプラスミドの構築、形質転換および同定
本実施例において連結される遺伝子フラグメントは、実施例１Ｃにおいて回収された目的の遺伝子フラグメントであった。連結、形質転換および同定の操作で使用された技術および方法は、実施例２Ａにおいて使用された技術および方法と同じであった。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化の同定のための電気泳動図を図３に示した。同様に、その配列をさらに確認するために、自動シーケンサーＡＢＩ３７７を、Ｔ７をユニバーサルプライマーとして用いる配列決定を行うために使用した。結果は、得られた配列が目的の配列と一致していることを示した。
【００４０】
実施例２Ｄ ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５の組換えプラスミドの構築、形質転換および同定
本実施例において連結される遺伝子フラグメントは、実施例１Ｄにおいて回収された目的の遺伝子フラグメントであった。連結、形質転換および同定の操作で使用された技術および方法は、実施例２Ａにおいて使用された技術および方法と同じであった。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化の同定のための電気泳動図を図３に示した。同様に、その配列をさらに確認するために、自動シーケンサーＡＢＩ３７７を、Ｔ７をユニバーサルプライマーとして用いる配列決定を行うために使用した。結果は、得られた配列が目的の配列と一致していることを示した。
【００４１】
実施例３Ａ ＭＩＦＮＣｙｓ８６の発現および精製
実施例２Ａから得られる組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）または他の好適な宿主に形質転換し、その後、誘導発現を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主とする発現ＭＩＦＮＣｙｓ８６は、主として封入体の形態で存在し、総細菌タンパク質の３０％〜５０％を占めた。
【００４２】
粗精製：集めた細菌をＴＥとともに溶解した。超音波処理後、封入体を集め、その後、６ｍｏｌ／Ｌ〜８ｍｏｌ／ＬのＧｕ・ＨＣｌまたは尿素により溶解し、室温で一晩撹拌するか、または、４℃で一晩保ち、０．０５ｍｏｌ／Ｌ〜０．２ｍｏｌ／Ｌのホウ酸（ｐＨ８．０〜１０．５）溶液により復元した。復元溶液を４℃で一晩保った。４℃での遠心分離の後、上清を集めた。これは、ほぼ純粋なＭＩＦＮＣｙｓ８６であった。
【００４３】
精密精製：疎水性クロマトグラフィー、ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーおよびＳ−１００ゲル排除クロマトグラフィーを含む３工程の精製プロセスを連続して用いた。詳細な工程は下記の通りであった。復元溶液を、１０％〜３０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する溶液に希釈し、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーカラムに負荷し、２カラム体積の１０％〜３０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４により洗浄し、その後、１５％〜３５％のグリコールエチレンにより溶出し、その後、集められた溶出ピーク成分を溶液Ａ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜８０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５〜１０．５）により完全に透析した。透析された溶出液を、溶液Ａで完全に平衡化されたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦクロマトグラフィーカラムに負荷し、その後、溶液Ｂ（０．２ｍｏｌ／Ｌ〜０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有する溶液Ａ）により溶出し、溶出ピークを集めた。そして、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦイオン交換クロマトグラフィーの溶出ピーク分画物を、溶液Ｃ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜４０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢ＋２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜４０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、Ｐｈ６．５〜７．５）で完全に平衡化されたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００クロマトグラフィーカラムに完全に負荷し、溶液Ｃにより洗浄し、その後、溶出ピークを集めた。上記精製手順の後、得られたＭＩＦＮＣｙｓ８６は、９５％を超える純度を有していた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを図４に示した）。
【００４４】
実施例３Ｂ ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６の発現および精製
実施例２Ｂから得られる組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）または他の好適な宿主に形質転換し、その後、誘導発現を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主とする発現ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６は、主として封入体の形態で存在し、総細菌タンパク質の３０％〜５０％を占めた。
【００４５】
本実施例における精製方法は、実施例３Ａにおいて使用された精製方法と同じであった。得られたＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６は、９５％を超える純度を有していた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを図４に示した）。
【００４６】
実施例３Ｃ ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５の発現および精製
実施例２Ｃから得られる組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）または他の好適な宿主に形質転換し、その後、誘導発現を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主とする発現ＩＦＮα−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６は、主として封入体の形態で存在し、総細菌タンパク質の３０％〜５０％を占めた。
【００４７】
粗精製：本実施例における粗精製方法は、実施例３Ａにおいて使用された方法と同じであった。
【００４８】
精密精製：疎水性クロマトグラフィー、ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーおよびＳ−１００ゲル排除クロマトグラフィーを含む３工程の精製プロセスを連続して用いた。詳細な工程は下記の通りであった。復元溶液を３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈し、その後、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦイオン交換クロマトグラフィーカラムに負荷し、０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有する３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）溶液により溶出し、その後、溶出ピークを集めた。そして、上記工程からの溶出サンプルをＰＢＳ（ｐＨ７．０）により３倍希釈し、その後、ＩＦＮα−２ａモノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷し、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有する０．３ｍｏｌ／ＬのＧｌｙ溶液（ｐＨ２．５）により溶出し、その後、溶出ピークを集めた。その後、上記工程からの溶出サンプルを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００クロマトグラフィーカラムに負荷し、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）により溶出した。得られたＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５は、９５％を超える純度を有していた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを図４に示した）。
【００４９】
実施例３Ｄ ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５の発現および精製
実施例２Ｄから得られる組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）または他の好適な宿主に形質転換し、その後、誘導発現を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主とする発現ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５は、主として封入体の形態で存在し、総細菌タンパク質の３０％〜５０％を占めた。
【００５０】
粗精製：本実施例における粗精製方法は、実施例３Ａにおいて使用された方法と同じであった。
【００５１】
精密精製：疎水性クロマトグラフィー、ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーおよびＳ−１００ゲル排除クロマトグラフィーを含む３工程の精製プロセスを連続して用いた。具体的な工程は下記の通りであった。復元溶液を３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈し、その後、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦイオン交換クロマトグラフィーカラムに負荷し、０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有する３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）溶液により溶出し、その後、溶出ピークを集めた。そして、上記工程からの溶出サンプルをＰＢＳ（ｐＨ７．０）により３倍希釈し、その後、ＩＦＮα−２ｂモノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷し、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有する０．３ｍｏｌ／ＬのＧｌｙ溶液により溶出し、その後、溶出ピークを集めた。その後、上記工程からの溶出サンプルを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００クロマトグラフィーカラムに負荷し、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）により溶出した。得られたＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５は、９５％を超える純度を有していた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを図４に示した）。
【００５２】
実施例４ ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５のＰＥＧカップリング
本発明において、インターフェロンαの４つの変異体を、様々な分子量を有するＰＥＧとカップリングすることができた。好ましい実施例において、ＰＥＧには、およそ２０ＫＤおよび４０ＫＤの分子量をそれぞれ有するｍＰＥＧ−ＭＡＬおよびｍＰＥＧ２−ＭＡＬが含まれた。
【００５３】
１）ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５の濃縮
上記４つのインターフェロンα誘導体は、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦクロマトグラフィーカラムによってそれぞれ濃縮することができる。具体的な方法は下記の通りであった。実施例３Ａ〜実施例３Ｄのいずれか１つから得られる精製されたタンパク質サンプルを１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜８０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜８．５）の溶液により２倍以上希釈し、ＤＥＡＥクロマトグラフィーカラムに負荷し、２０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢ緩衝液（ｐＨ７．６）＋３００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌにより溶出して、目的タンパク質の濃縮された溶液を得た。
【００５４】
２）ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５のｍＰＥＧ−ＭＡＬとのカップリング
ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５をｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＭＡＬとカップリングした。従って、モノペグ化された誘導体はそれぞれ、下記のように記述される。ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５。
【００５５】
ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５をｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＭＡＬとカップリングした。従って、モノペグ化された誘導体はそれぞれ、下記のように記述される：ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５。
【００５６】
このカップリング反応は、下記のような具体的工程を有した。
適量の濃縮された溶液を本発明の工程１）から取り、タンパク質濃度について８ｍｇ／ｍｌ〜１２ｍｇ／ｍｌに調節した。ＰＥＧ粉末を１：１のモル比により加え、ＰＥＧ粉末が溶解し得るように穏やかに振とうし、その後、４℃で一晩反応した。すなわち、反応時間は１０時間を超えることが望ましい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、（図５〜図６に示されるように）カップリング反応の程度が検出された。
【００５７】
実施例５ インターフェロン−α変異体の誘導体の精製
ペグ化生成物を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。具体的な条件は下記の通りであった。反応液を、２５ｍｍｏｌのｐＨ８．０のＴｒｉｓ緩衝液系を使用して２０倍〜３０倍希釈し、その後、平衡化されたＤＥＡＥカラムに３ｍｌ／分〜４ｍｌ／分の流速により負荷し、ベースライン平衡に達した後、２５ｍＭのｐＨ８．０のＴｒｉｓにおける８０ｍＭのＮａＣｌ濃度により溶出して、目的タンパク質の溶出ピークを得た。得られた組換えタンパク質の最終純度は９５％を超えていた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥダイアグラムを図７〜図８に示した）。
【００５８】
実施例６ ４種類のインターフェロンα、それらの変異体およびそれらの変異体のポリエチレングリコール誘導体のインビトロ抗ウイルス活性の測定
ＷＩＳＨ−ＶＳＶシステムを使用する細胞変性効果阻害アッセイを、インビトロでのインターフェロン抗ウイルス活性を求めるために採用した（これは、先行技術分野において一般に広く知られている方法であった）。具体的な参考文献が付属３ＸＣ「インターフェロンの生物学的活性の測定」（「中華人民共和国薬局方」の２００５年版）に示された。
【００５９】
本実施例では、１６のインターフェロン（または誘導体）のインビトロ抗ウイルス活性について測定された。これらには、詳しくは、下記が含まれた。
４種類のインターフェロンα：ＭＩＦＮ、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１、ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂ、および
ＩＮＦ−αの４種類の変異体：ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５（これらは本発明において実施例３Ａ〜実施例３Ｄによって調製された）。
同様にまた、８種類のポリエチレングリコール誘導体が存在した。
ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５（これらは本発明において実施例５によって調製された）。
【００６０】
それらのインビトロ抗ウイルス活性アッセイ結果を下記の表１〜表４に示した。
【表１】
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
実施例７ ラットの薬物動態学研究
表５に示される薬物動態学スキームによって、１２のインターフェロン（または誘導体）をインビトロ抗ウイルス活性について測定した。これらには、詳しくは、下記が含まれた。
ＩＮＦ−αの４種類の変異体：ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５（これらは本発明において実施例３Ａ〜実施例３Ｄによって調製された）、および
８種類のポリエチレングリコール誘導体：ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５、ｍＰＥＧ（２０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＭＩＦＮＣｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびｍＰＥＧ（４０ＫＤ）−ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５（これらは本発明において実施例５によって調製された）。
【表５】
【００６５】
上記の試験スキームにおいて、血液サンプルをラットの眼周囲から集め、その後、遠心分離して血清を集めた。血清サンプルにおけるインターフェロンの含有量をＣＰＥ法（ＷＩＳＨ／ＶＳＶシステム）によって求めた。
【表６】
【００６６】
ＳＤラットにおけるＭＩＦＮＣｙｓ８６およびそのＰＥＧ誘導体の代謝が一次吸収のコンパートメントモデルと一致していたことが、３Ｐ８７ソフトウエアによるフィッティングの後で見出された。ペグ化はＭＩＦＮＣｙｓ８６の薬物動態学特性を著しく改善することができた。ＭＩＦＮＣｙｓ８６と比較した場合、ｍＰＥＧ−ＭＩＦＮＣｙｓ８６は、吸収の半減期、ピーク時間、および、排出半減期が著しく延長され、薬物時間曲線下面積が著しく増大し、クリアランス速度が著しく低下した。ペグ化が体内におけるＭＩＦＮＣｙｓ８６の平均寿命を延ばすことができ、また、クリアランス速度を減少させることができたことを認めることができる。
【００６７】
同じ結果が、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６およびそのＰＥＧ誘導体、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびそのＰＥＧ誘導体、ＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５およびそのＰＥＧ誘導体の薬物動態学試験において見出された。すなわち、非修飾体と比較した場合、ペグ化されたインターフェロンは、吸収の半減期、ピーク時間および排出半減期が著しく延長され、薬物時間曲線下面積が著しく増大し、クリアランス速度が著しく低下した。
【００６８】
それにより、ペグ化が体内におけるＭＩＦＮＣｙｓ８６の平均寿命を延ばすことができ、また、クリアランス速度を減少させることができることを証明することができる。
【００６９】
現時点において、本発明が、相当に詳しい記載とともに実施されてきた。好ましい実施例は、ある種の改変および改善が、本発明の保護範囲から逸脱することなく、記載されるような発明に対して行われ得るので、本発明を例示することができるのみであり、しかし、本発明を限定することはできない。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
動物実験では、本発明のインターフェロン変異体のポリエチレングリコール誘導体は体内におけるインターフェロンの平均寿命を延ばすことができ、また、クリアランス速度を減少させることができ、また、実質的に高い抗ウイルス活性を有したことが示された。従って、本発明において記載される方法、または、当業者には広く知られている方法に従って、本発明は、本発明のインターフェロン変異体を調製するために実施することができ、その後、本発明のインターフェロン変異体はさらに、ポリエチレングリコールに対して共有結合により結合され、免疫調節疾患（例えば、腫瘍疾患または感染性疾患など）の防止および処置のための薬物に開発される。
【００７１】
配列リストが添付される：
アミノ酸およびヌクレオチドの配列リストが添付されていますので、参照願いたい。この場合、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１、ＩＦＮα−２ａおよびＩＦＮα−２ｂのヌクレオチド配列は公知であり、具体的な実施例では、対応する部位のコドンのみがｔｇｃに変異させられる。従って、ＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６、ＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５およびＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５のＤＮＡ配列は本発明において添付されていない。
配列番号１はＭＩＦＮＣｙｓ８６のアミノ酸配列を示す。
配列番号２はＩＦＮ−Ｃｏｎ１Ｃｙｓ８６のアミノ酸配列を示す。
配列番号３はＩＦＮα−２ａＣｙｓ８５のアミノ酸配列を示す。
配列番号４はＩＦＮα−２ｂＣｙｓ８５アミノ酸配列を示す。
配列番号５はＭＩＦＮＣｙｓ８６のＤＮＡ配列を示す。
配列番号６〜配列番号９はプライマーＰ１〜プライマーＰ４のヌクレオチド配列をそれぞれ示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン−αのアミノ酸配列の８５位または８６位におけるＴｙｒがＣｙｓに変異させられることを特徴とするインターフェロン−α変異体。
【請求項２】
配列番号１〜配列番号４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のインターフェロン−α変異体。
【請求項３】
請求項１または２に記載される前記インターフェロン−α変異体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項１または２に記載される前記インターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項５】
ＰＥＧ試薬により、インターフェロン−α変異体の８５位または８６位におけるＣｙｓの部位が修飾されることを特徴とする、請求項４に記載のインターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項６】
ポリエチレングリコールスルフヒドリル修飾剤をインターフェロン−α変異体の８５位または８６位におけるＣｙｓの部位と反応することによって得られ、ただし、前記ポリエチレングリコールスルフヒドリル修飾剤が、マレイミド−ＰＥＧ、ビニルスルホン−ＰＥＧ、ヨードアセトアミド−ＰＥＧおよびｎ−ピリジルジスルフィド−ＰＥＧから選択される、請求項４または５に記載のインターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項７】
ＰＥＧ試薬の平均分子量が５，０００ダルトン〜６０，０００ダルトンであることを特徴とする、請求項４または５に記載のインターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項８】
下記の工程：
ａ）インターフェロン−α変異体の高濃度溶液を調製する工程；
ｂ）ポリエチレングリコールを工程ａ）において記載されるインターフェロン−α変異体とカップリングする工程；
ｃ）インターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体を精製および抽出する工程
を含む、インターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体の調製方法。
【請求項９】
請求項４〜７のいずれか一項に記載されるインターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体を含む薬物組成物。
【請求項１０】
ウイルス感染症または腫瘍を処置または防止するための、請求項９に記載される前記薬物組成物の使用。
【請求項１】
インターフェロン−αのアミノ酸配列の８５位または８６位におけるＴｙｒがＣｙｓに変異させられることを特徴とするインターフェロン−α変異体。
【請求項２】
配列番号１〜配列番号４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のインターフェロン−α変異体。
【請求項３】
請求項１または２に記載される前記インターフェロン−α変異体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項１または２に記載される前記インターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項５】
ＰＥＧ試薬により、インターフェロン−α変異体の８５位または８６位におけるＣｙｓの部位が修飾されることを特徴とする、請求項４に記載のインターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項６】
ポリエチレングリコールスルフヒドリル修飾剤をインターフェロン−α変異体の８５位または８６位におけるＣｙｓの部位と反応することによって得られ、ただし、前記ポリエチレングリコールスルフヒドリル修飾剤が、マレイミド−ＰＥＧ、ビニルスルホン−ＰＥＧ、ヨードアセトアミド−ＰＥＧおよびｎ−ピリジルジスルフィド−ＰＥＧから選択される、請求項４または５に記載のインターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項７】
ＰＥＧ試薬の平均分子量が５，０００ダルトン〜６０，０００ダルトンであることを特徴とする、請求項４または５に記載のインターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項８】
下記の工程：
ａ）インターフェロン−α変異体の高濃度溶液を調製する工程；
ｂ）ポリエチレングリコールを工程ａ）において記載されるインターフェロン−α変異体とカップリングする工程；
ｃ）インターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体を精製および抽出する工程
を含む、インターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体の調製方法。
【請求項９】
請求項４〜７のいずれか一項に記載されるインターフェロン−α変異体のポリエチレングリコール誘導体を含む薬物組成物。
【請求項１０】
ウイルス感染症または腫瘍を処置または防止するための、請求項９に記載される前記薬物組成物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５１３３３３（Ｐ２０１０−５１３３３３Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４１７３９（Ｐ２００９−５４１７３９）
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００７／００３７１１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７４２３０
【国際公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【出願人】（５０９１７４６３５）北京三元基因工程有限公司 (1)
【出願人】（５０９１７４６４６）ベイジン バイオ‐テック デベロップメント カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００７／００３７１１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７４２３０
【国際公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【出願人】（５０９１７４６３５）北京三元基因工程有限公司 (1)
【出願人】（５０９１７４６４６）ベイジン バイオ‐テック デベロップメント カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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