インターロイキン−１受容体アンタゴニストを送達するための方法および組成物
インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）に富んだ溶液を生成および使用する方法および組成物。インターロイキン−１受容体アンタゴニストを生成および単離するための方法は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストを生産するために、脂肪組織および／または脂肪細胞をポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートすることを含む。ポリアクリルアミドビーズからインターロイキン−１受容体アンタゴニストが単離され、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得る。患者において炎症部位を治療するための方法は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を炎症部位に投与することを含む。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００９年８月２７日に提出された米国実用特許出願(U．S． Utility Application)第１２／５４９，０１５号に基づく優先権を主張し、該米国実用特許出願は、２００９年２月２７日に提出された米国特許出願第１２／３９４，７２３号の一部継続出願であり、該米国特許出願は、２００８年２月２７日提出の米国仮出願第６１／０３１，８０３号；２００８年１１月２１日提出の米国仮出願第６１／１１６，９４０号；および２００９年２月２４日提出の米国仮出願第６１／１５５，０４８号の利益を主張する。上記各出願に記載された総ての記載内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
緒言
本技術は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストを含んでなる組成物、およびそのような組成物を生成し、単離し、送達するための方法に関する。
【０００３】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）には、リンパ球およびマクロファージを刺激し、食細胞を活性化し、プロスタグランジン生産を増加させ、骨関節の変性に寄与し、骨髄細胞増殖を増加させることができ、多くの慢性炎症状態に関与するサイトカインのファミリーが含まれる。ＩＬ−１は、マクロファージ、単球および樹状細胞によって生成され、感染に対する炎症応答の一部である。
【０００４】
ＩＬ−１の作用様式は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＬ−１ｒａ；「ＩＲＡＰ」としても知られる）によって影響を与えることができる。ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１と、細胞表面上の同じ受容体と結合し、それによってＩＬ−１がその細胞にシグナルを送るのを妨げる。ＩＬ−１ｒａは、単球、マクロファージ、好中球、多形核細胞（ＰＭＮ）および他の細胞を含む白血球から分泌され、Arend WP, Malyak M, Guthridge CJ, Gabay C (1998) " Interleukin-1 receptor antagonist: role in biology" Annu. Rev. Immunol. 16: 27-55によって記載されているように、種々のＩＬ−１関連の免疫応答および炎症応答を調整することができる。ＩＬ−１ｒａの生産は、付着免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、他のサイトカインおよび細菌成分またはウイルス成分を含むいくつかの物質によって刺激を受ける。ＩＬ−１ｒａは、関節炎、大腸炎および肉芽腫性肺疾患において重要な天然の抗炎症性タンパク質である。
【０００５】
ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１が重要な役割を果たす自己免疫疾患である関節リウマチの治療において使用することができ、その疾患と関連がある炎症および軟骨破壊を低減させる。例えば、Kineret（商標）(アナキンラ)は、ＩＬ−１ｒａの組換え非グリコシル化型(Amgen Manufacturing, Ltd., Thousand Oaks, California)である。様々な組換え型インターロイキン−１阻害薬および治療の方法は、２００３年７月２９日発行の米国特許第６，５９９，８７３号、Sommer et al.；１９９１年１２月２４日発行の米国特許第５，０７５，２２２号、Hannum et al.；および２００５年９月８日公開の米国出願公開第２００５／０１９７２９３号、Mellis et al.に記載されている。加えて、体液からＩＬ−１ｒａを生産するための方法は、自己体液の使用を含み、そのような方法は、２００３年９月２３日発行の米国特許第６，６２３，４７２号、Reincke et al.；２００４年３月３０日発行の米国特許第６，７１３，２４６号、Reinecke et al.；および２００４年７月６日発行の米国特許第６，７５９，１８８号、Reinecke et al.に記載されている。
【０００６】
ＩＬ−１ｒａを使用する組成物および方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＩＬ−１ｒａは、２０００年８月１日発行の米国特許第６，０９６，７２８号、Collins et al.に記載されているように、ヒアルロン酸を含む組成物の一部として送達されている。しかしながら、多くのそのような方法および組成物は、ＩＬ−１ｒａの安定性および半減期、並びに提供されるＩＬ−１ｒａの量および割合についての問題に関わっている。それゆえに、ＩＬ−１ｒａを送達する改善された方法が望ましく、炎症の管理を含む、インターロイキン−１受容体によって媒介される病態および病変の治療に有用であるであろう。
【発明の開示】
【０００７】
概要
本技術は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法およびヒトまたは動物の対象における炎症の部位にそのような溶液を投与するための方法を提供する。そのような溶液を生成するための方法は、ポリアクリルアミドビーズとともに脂肪組織をインキュベートすることを含む。インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液は、その後、そのポリアクリルアミドビーズから分離される。脂肪組織はその対象から得ることができる。
【０００８】
ヒトまたは動物の対象においてインターロイキン−１受容体によって媒介される病態（炎症など）を治療する方法は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液とフィブリノーゲンを同時投与することを含む。様々な実施形態では、そのような方法は、トロンビンおよび塩化カルシウムの対象への投与をさらに含んでなる。炎症部位は、例えば、関節炎、例えば、変形性関節症と関連している場合がある。好ましくは、ＩＬ−１ｒａの溶液は自己由来のものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本技術は、詳細な説明および添付の図面からより十分に理解されるようになる。
【図１】本技術の実施形態による、ＩＬ−１ｒａ溶液を生産するための第１の方法の概略図である。
【図２】本技術の１つの実施形態による、白血球および血小板を含んでなる液体容量を分離するために使用される典型的装置の部分断面図である。
【図３Ａ】本技術の１つの実施形態による、白血球および血小板の容量をポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートするための典型的装置の断面図である。
【図３Ｂ】本技術の１つの実施形態による、白血球および血小板の容量をポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートするための典型的装置の断面図である。
【図４】本技術の方法において使用され得る血液成分分離装置である。
【図５】図４の血液成分分離装置の側面図であり、該装置の主要チャンバーの内部を例示している。
【図６】本技術の実施形態による、ＩＬ−１ｒａを送達するための方法の概略図である。
【図７】本技術の１つの実施形態による、ＩＬ−１ｒａを送達するための典型的装置の部分断面図である。
【００１０】
本明細書において示された図は、ある特定の実施形態を説明するために、本技術のものの間で材料および方法の一般的特徴を例示することを目的としていることに留意すべきである。これらの図は、いかなる所定の実施形態の特徴を正確に反映することはできず、必ずしも特定の実施形態をこの技術の範囲内で定義しまたは限定するものではない。
【００１１】
詳細な説明
次の技術の説明は、１以上の発明の対象、製造および使用の性質を単に例示するものであり、この出願においてあるいはこの出願の優先権を主張して提出された他の出願またはそれらの出願から発行される特許において特許請求された任意の特定発明の範囲、用途または使用を限定するものではない。本明細書において示された技術の説明の概説では、次の定義と限定されないガイドラインを考慮する。
【００１２】
本明細書において用いられる見出し（「緒言」および「概要」など）および小見出しは、開示の範囲内での主題の一般的構成のみを目的としており、技術またはその任意の態様の開示を限定するものではない。特に、「緒言」において開示される内容は新規技術を含むものであり、先行技術を引用するという性質のものはない。「概要」において開示される内容は、技術またはその任意の実施形態の全範囲を網羅的にまたは完全に開示するものではない。便宜上、この明細書の項中で材料を特定の有用性があるとして分類しまたは論じるが、その材料が任意の所定の組成物において使用される場合に、その材料が本明細書におけるその分類に従って必ずまたは単独で作用するに違いないと断定するものではない。
【００１３】
本明細書における参考文献の引用は、それらの参考文献が、先行技術でありまたは本明細書において開示される技術の特許性に関連していることを認めるという性質のものではない。この明細書の「詳細な説明」項において引用される総ての参考文献は、全体として引用することにより本明細書の一部とされる。
【００１４】
技術の実施形態を示しているが、説明および具体例は、例示のみを目的としたものであり、技術の範囲を限定するものではない。さらに、記述された特徴を有する多数の実施形態の引用は、追加の特徴を有する他の実施形態、または記述された特徴の異なる組合せを組み込んた他の実施形態を排除するものではない。具体例は、この技術の装置およびシステムの作製および使用の方法の例示のために提供され、特に明記されない限り、この技術の所定の実施形態が作製されたまたは検証されたこと、あるいは作製されていないまたは検証されていないことを意味するものではない。
【００１５】
本明細書において用いられるように、「好ましい(preferred)」および「好ましくは(preferably)」という単語は、ある特定の状況下である特定の利益を供与する技術の実施形態を意味する。しかしながら、同じまたは他の状況下で、他の実施形態もまた好ましいことがある。さらに、１以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用でないということを意味するものではなく、技術の範囲の他の実施形態を排除するものではない。
【００１６】
本明細書において言及されるように、総ての組成百分率は、特に断りのない限り、全組成の重量基準による。本明細書において用いられるように、「含む(include)」という単語およびその変形は非限定的であることが意図されており、リストにおける項目の引用により、この技術の材料、組成物、装置および方法において同様に有用であり得る他の類似の項目は排除されない。同様に、「できる(can)」および「してよい(may)」という用語およびそれらの変形は非限定的であることが意図されており、ある実施形態がある特定の要素または特徴を含んでなることができるまたは含んでなってよいという引用により、それらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態は排除されない。
【００１７】
本明細書において用いられる「１つの(a)」および「１つの(an)」は、「少なくとも１つの(at least one)」項目が存在すること；可能な場合には、複数の同様の項目が存在し得ることを示している。値に付けられる場合の「約(about)」は、計算または測定では値の多少の不正確さを許容する(値の正確さにいくらか近づいており;その値におおよそまたは合理的に近く;近似的である)ことを示している。いくつかの理由で、「約(about)」によってもたらされる不正確さが当技術分野でこのような通常の意味で理解されない場合には、本明細書において用いられる「約(about)」は、そのようなパラメーターを測定するまたは使用する通常の方法によって起こる可能性がある変動を少なくとも示している。加えて、範囲の開示は、全範囲内での総ての個別値および細分された範囲の開示を含む。
【００１８】
本技術は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）に関し、ＩＬ−１ｒａを生成する方法、そのような方法によって生産されるＩＬ−１ｒａを含んでなる組成物、ＩＬ−１ｒａを使用する方法、ＩＬ−１ｒａを含んでなる治療方法、ならびにＩＬ−１ｒａの生成、単離および投与のための装置が含まれる。
【００１９】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法は、次の側面を含むことができる。いくつかの実施形態では、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法は、脂肪細胞を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させることおよびインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得るために、液体容量をそのポリアクリルアミドビーズおよび脂肪細胞から分離することを含む。本技術の機構、有用性または機能を限定することなく、ポリアクリルアミドビーズは、脂肪細胞によるＩＬ−１ｒａ生産のアクチベーターとして機能を果たすように思われる。いくつかの点で、ポリアクリルアミドビーズ表面との脂肪細胞の接触は、脂肪細胞によるＩＬ−１ｒａ生産および分泌を刺激するように思われる。また、ＩＬ−１ｒａ生産量と白血球濃度との間に相関があるようにも思われ、その点で脂肪組織は白血球を含んでよい。よって、本技術では、脂肪組織および解離脂肪組織を使用して脂肪細胞を得るが、その場合、白血球は脂肪組織およびその脂肪組織から得られる脂肪細胞の両方に存在してよい。
【００２０】
前記方法は、次の側面をさらに含むことができる。脂肪細胞の液体容量は、単離脂肪組織の一部であり得る；その場合、例えば、脂肪組織は他の細胞種を含んでよい。脂肪細胞とポリアクリルアミドビーズの接触は、脂肪細胞の液体容量をポリアクリルアミドビーズとともに約３０秒から約２４時間までに及ぶ期間インキュベートすることを含む。また、その接触は、ポリアクリルアミドビーズとの脂肪細胞の液体容量の接触に加えて、白血球を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させることも含んでよい。白血球の液体容量は、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿であり得る。また、白血球は、骨髄から得ることもできる。いくつかの実施形態では、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得るための分離は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を含んでなる上清を得るために、脂肪細胞の液体容量とポリアクリルアミドビーズを遠心分離することを含む。得られた、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液は、約３０，０００ｐｇ／ｍＬ〜約１１０，０００ｐｇ／ｍＬのインターロイキン−１受容体アンタゴニストを含み得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、患者において炎症性疾患を治療するために有用な、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するために方法が提供される。これらの方法は、患者から脂肪組織を得ることおよびポリアクリルアミドビーズを含む濃縮装置アセンブリーにその脂肪組織を装入することを含む。ポリアクリルアミドビーズと脂肪組織の混合物は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成するためにインキュベートされる。濃縮装置アセンブリーは、その後、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得るために、そのポリアクリルアミドビーズおよび脂肪組織からインターロイキン−１受容体アンタゴニストを分離する遠心速度で回転させる。濃縮装置アセンブリーへの装入には、脂肪組織をポリアクリルアミドビーズとともに約３０秒〜約２４時間の期間インキュベートすることが含まれる。その装入は、白血球を含んでなる液体容量を濃縮装置アセンブリーに装入することをさらに含んでよい。白血球の液体容量は、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿の組合せの形であり得る。
【００２２】
本技術はまた、患者において１以上の炎症部位を治療する方法も含む。そのような方法は、脂肪細胞を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させることを含む。その後、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得るために、そのポリアクリルアミドビーズおよび脂肪細胞から液体容量が分離される。インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液は、患者の１以上の炎症部位に投与される。使用される脂肪組織は患者から得ることができる；すなわち、自己由来のものであってよい。その方法は、変形性関節症に関連する炎症を治療するために適用することができる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本方法は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液の投与に加えて、炎症部位にフィブリノーゲン、トロンビンおよびカルシウムを投与することを含む。例えば、方法は、（ｉ）インターロイキン−１受容体アンタゴニストおよびフィブリノーゲンを含んでなる第１の溶液と、（ｉｉ）トロンビンおよびカルシウムを含んでなる第２の溶液とを同時投与することを含み得る。
【００２４】
本方法において使用されるトロンビンは、全血または血漿およびカルシウム溶液を血液単離装置に装入することを含む方法によって作製し得る。全血または血漿は、少なくとも約２０分間、少なくとも約２０℃の温度で加熱する。加熱した全血または血漿を遠心分離することによってトロンビンを単離する。全血または血漿は患者から得ることができる。
【００２５】
また、患者において炎症性疾患を治療する方法も提供される。そのような方法は、患者から脂肪組織を得ることおよびポリアクリルアミドビーズを含む濃縮装置アセンブリーにその脂肪組織を装入することを含む。ビーズと脂肪組織の混合物は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成するためにインキュベートされる。濃縮装置アセンブリーは、その後、そのポリアクリルアミドビーズからインターロイキン−１受容体アンタゴニストを分離しインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得る遠心速度で回転させる。全血は、患者から得られ、カルシウム溶液とともに血液単離装置に装入される。全血は、少なくとも約２０分間少なくとも約２０℃の温度で加熱する。加熱した全血を遠心分離し凝固画分を得る。その後、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液と凝固画分は患者の炎症部位に投与される。
【００２６】
治療方法は、次の側面をさらに含むことができる。ポリアクリルアミドビーズを含む濃縮装置アセンブリーへの脂肪組織の装入は、脂肪組織とともに白血球を含んでなる液体容量を装入することおよびインターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成するために、ビーズ、脂肪組織および白血球の混合物をインキュベートすることを含むことができる。白血球の液体容量は、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿であり得る。また、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液および凝固画分とともにフィブリノーゲンを患者の炎症部位に投与してもよい。少なくとも１つには変形性関節症が原因となって起こる炎症を治療するためにそれらの方法を使用することができる。
【００２７】
次に、図１に関し、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成するための方法１００についての概略図を示している。脂肪組織は、ステップ１１０において患者から単離される。この脂肪組織は、ステップ１３０で直接使用してよく、またはステップ１２０で処理して脂肪細胞を準備してもよい。
【００２８】
脂肪組織とは、任意の脂肪組織、白色脂肪組織または褐色脂肪組織のいずれかを意味し、その脂肪組織は、皮下、大網／内臓、乳房、生殖腺の脂肪組織または他の脂肪組織の部位から得られるものでよい。いくつかの実施形態では、脂肪組織は、吸引脂肪組織切除術または脂肪吸引術によって分離されたヒト皮下脂肪から得られるものである。脂肪細胞は、任意の好適な方法を用いて脂肪組織および／または組織部分から単離されたおよび／または遊離されたものでよく、そのような方法には、機械による破壊遠心分離などの当技術分野で公知の方法が含まれる。脂肪細胞はまた、酵素消化を用いて単離することもできる。例えば、脂肪細胞は、脂肪吸引物から単離し、音波処理および／または酵素消化によって処理し、遠心分離によって濃縮することができる。脂肪組織から単離された脂肪細胞は、洗浄し、ペレット化してよい。
【００２９】
脂肪組織および脂肪細胞を単離するための方法は、次の側面を含むことができる。約５０ｃｃの脂肪組織は、吸引による脂肪吸引チューメセント法によって、吸引ホースおよび脂肪吸引カニューレに取り付けられている専用の収集容器内に収集される。収集容器は、ガーゼタイプのグリッドフィルターを備えていてよく、そのフィルターはチューメセント液を通過させ、固形脂肪組織を保持する。脂肪組織収集後、収集容器は吸引装置から外され、遠心分離装置に再び取り付けられる。フィルターユニットは、およそ１００マイクロメートルの孔径を有するフィルターをさらに備えていてよい。一度、脂肪組織が収容されている収集容器が遠心分離装置に取り付けられたら、脂肪組織は音波処理される。音波処理後、装置全体が遠心バケットに挿入される、例えば、３００×ｇで５分間遠心分離機にかけられる。遠心分離後、収集容器はフィルターユニットとともに取り外され、廃棄することができる。脂肪細胞を含有するペレットは、その後、生体適合性溶液、例えば、自己血漿、血漿濃縮物および多血小板血漿などに再懸濁することができる。
【００３０】
脂肪組織はまた、消化酵素や、隣接する細胞間の結合を弱めるキレート化剤で処理してよく、目に見えるほどの細胞破砕なしに、脂肪組織を、脂肪細胞を含む単一細胞の懸濁液に分散させることが可能である。解離後、細胞と解離組織の懸濁液から脂肪細胞を単離することができる。
【００３１】
脂肪組織の単離および／または分画のための様々な方法および装置には、Leach et al.の米国特許第７，３７４，６７８号および同第７，１７９，３９１号およびLeach et al.の米国出願公開第２００９／００１４３９１号、同第２００８／０２８３４７４号および同第２００７／０２０８３２１号によって記載されているものが含まれる。脂肪細胞を単離するために、GPS（商標）Platelet Concentrate System(Biomet, Warsaw, IN)などの装置を使用してよい。これらの方法は、脂肪組織を得るために患者において脂肪吸引を行うことにより脂肪細胞を得ること、その脂肪組織を酵素によって消化すること、およびこれらの装置を使用して脂肪細胞を抽出しことおよび／または洗浄することを含み得る。
【００３２】
図１のステップ１３０において示されるように、脂肪組織および／または脂肪細胞はポリアクリルアミドビーズと接触させる。いくつかの実施形態では、脂肪組織および／または脂肪細胞は、白血球および血小板の液体容量の液体の一部を除去するのに有効な期間、ポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートされる。インキュベーションは、約３０秒〜約７２時間にわたって行ってよく、約２０℃〜約４１℃の温度で行ってよい。例えば、インキュベーションは、約１分〜約４８時間であってよく、約５分〜約１２時間であってよく、または約１０分〜約６時間であってよい。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約３７℃で行われる。いくつかの実施形態では、脂肪組織および／または脂肪細胞はインキュベートせず、続いて処理を行うことが必要である場合のみポリアクリルアミドビーズと接触させる。接触は、周囲条件において、例えば、約２０〜２５℃の温度で行ってよい。
【００３３】
ステップ１３０で使用されるポリアクリルアミドビーズは、ポリアクリルアミドゲルから形成された比較的均一なビーズを生産するための、当技術分野で公知の、管理され標準化されたプロトコールを用いてアクリルアミドモノマーを重合することによって形成することができる。一般的に、ポリアクリルアミドは、好適な二官能性架橋剤、最も一般的にはＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ビスアクリルアミド）を用いてアクリルアミドを重合することによって形成される。ゲル重合は、通常、過硫酸アンモニウムによって開始され、反応速度は、触媒（Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）など）の添加によって速められる。様々な実施形態では、ポリアクリルアミドビーズは、微アニオン性（負電荷）を付与する、ビーズ１ミリリットル当たり０．５マイクロモルのカルボキシル基を含んでなる。また、ビーズは、ｐＨの変化に対して一般に強く、多くの水性溶液および有機溶液中で安定している。ポリアクリルアミドゲルは、総アクリルアミド濃度を調整することによって、広範囲の孔径で形成することができる。さらに、ポリアクリルアミドビーズは多くのサイズで形成することができ、比較的均一なサイズ分布を有し得る。ビーズサイズは、直径数マイクロメートルから直径数ミリメートルまでに及んでよい。例えば、様々なタイプのBio-Gel（商標）Pポリアクリルアミドゲルビーズ(Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA)は、約４５μｍ未満から約１８０μｍまでに及ぶ粒径を有する。ポリアクリルアミドビーズは、SNF Floerger (Riceboro, Georgia, USA)、Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois, USA)およびPolymers, Inc. (Fayetteville, Arkansas, USA)からも入手可能である。
【００３４】
一度、重合したら、ポリアクリルアミドビーズは、乾燥させ粉末状形態で保存することができる。乾燥ビーズは、水に不溶であるが、再水和するとかなり膨張し得る。再水和によりポリアクリルアミドビーズはゲルコンシステンシーに戻り、乾燥状態のサイズの約２〜約３倍となる。このように、乾燥ポリアクリルアミドビーズは、液体容量の一部を吸収するために使用してよく、ビーズ孔径より小さい溶質を含み、脂肪細胞および／または脂肪組織によって生産されたＩＬ−１ｒａを濃縮するのに役立つ。例えば、ステップ１３０で乾燥ポリアクリルアミドビーズを脂肪細胞および／または脂肪組織と合わせることによって、ＩＬ−１ｒａの生産を活性化し、また、乾燥ビーズが再水和し膨張するため総液体容量が減少する。
【００３５】
本技術の機構、有用性または機能を限定することなく、ポリアクリルアミドビーズは、脂肪細胞によるＩＬ−１ｒａ生産のアクチベーターとして機能を果たす。そのため、乾燥ポリアクリルアミドビーズの場合、脂肪細胞の容量から液体を吸収し、その結果、生成されたＩＬ−１ｒａを濃縮するだけでなく、ビーズはさらに、脂肪細胞によるＩＬ−１ｒａ生産を刺激するための表面として機能を果たす。ＩＬ−１ｒａ量の増加は、サンプル容量の減少により単に濃度が上昇したことによるものではなく、ＩＬ−１ｒａの生産および／または放出を増加させるための、ポリアクリルアミドビーズによる脂肪細胞の活性化によるものであると思われる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１ｒａを生成するために、白血球を含んでなる液体容量、例えば、多血小板血漿および／または全血などもポリアクリルアミドビーズと脂肪組織および／または脂肪細胞に添加してよい。血液を遠心分離し、白血球および血小板を含有する多血小板血漿（ＰＲＰ）を単離することができ、これは沈降分離後バフィーコート層に存在し得る。ステップ１２０において多血小板血漿を単離するために使用できる装置の一例を図２に示している。
【００３７】
これに関連して、図２で示される装置２００は容器２０５（チューブなど）を備えており、その容器は、血液充填後に遠心機に置かれる。容器２０５には、アイソレーター２１０とブイ２１５を有するブイシステムが備わっている。ブイ２１５は、遠心分離の際に選択平衡位置に達するように向けられた選択密度を有し；この位置は密度が高い方の血液画分と密度が低い方の血液画分の間にある。ブイ２１５は、遠心分離の間に容器２０５内の血液を少なくとも２つの画分に分けるが、それらの画分が実質的に混合することはなく、それらの２画分の間の位置にブイが沈降することによって行われる。これに関連して、アイソレーター２１０とブイ２１５は多血小板血漿２２０を含んでなる層を明確にし、密度が低い方の乏血小板血漿２２５はアイソレーター２１０より上に一般的に分画され、密度が高い方の赤血球２３０はブイ２１５より下に一般的に分画される。遠心分離後、白血球を含有する多血小板血漿を抽出するために、シリンジまたはチューブをブイシステムの一部と相互に連結し得る。様々な実施形態では、上記装置を使用して、全血より最大約８倍高い血小板濃度と全血より最大約５倍高い白血球濃度を有する多血小板血漿を生成し得る。その多血小板血漿は、全血中に存在する白血球の約８０％〜約９０％を含んでなり得る。上記装置は市販されており、Biomet Biologies, LLC (Warsaw, Indiana, USA)のGPS（登録商標）II Platelet Concentrate SystemおよびBiomet Biologies, LLC (Warsaw, Indiana, USA)のGPS（登録商標）III Platelet Separation Systemなどがある。
【００３８】
ステップ１２０において多血小板血漿を単離するために使用し得る装置も、例えば、２００２年６月４日発行の米国特許第６，３９８，９７２号、Blasetti et al.；２００３年１１月１８日発行の米国特許第６，６４９，０７２号、Brandt et al.；２００４年９月１４日発行の米国特許第６，７９０，３７１号、Dolocek；２００６年３月１４日発行の米国特許第７，０１１，８５２号、Sukavaneshvar et al.；２００４年１２月１６日公開の米国出願公開第２００４／０２５１２１７号、Leach et al.（引用することにより本明細書の一部とされる）；２００５年５月２６日公開の米国出願公開第２００５／０１０９７１６号、Leach et al.（引用することにより本明細書の一部とされる）；２００５年９月８日公開の米国出願公開第２００５／０１９６８７４号、Dorian et al.（引用することにより本明細書の一部とされる）；および２００６年８月１０日公開の米国出願公開第２００６／０１７５２４２号、Dorian et al.（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている。
【００３９】
他の方法を使用して、多血小板血漿を単離してもよい。例えば、全血は、ブイシステムを使用せずに遠心分離することができ、全血を多段階で遠心分離してもよく、連続フロー式遠心分離法を用いることもでき、また濾過も用いることができる。加えて、血小板のペレット化を妨げるために低速遠心分離ステップを用いて赤血球から血漿を抽出することによって、多血小板血漿を含む血液成分を生産することができる。他の実施形態では、血液の遠心分離により生じるバフィーコート画分を、残留血漿から抽出し、再懸濁して多血小板血漿を形成することができる。
【００４０】
GPS（登録商標）Platelet Concentrate and Separation Systemsに加えて、他の市販装置も、ステップ１２０において多血小板血漿を単離するするために使用してよく、そのような装置には、Medtronic, Inc. (Minneapolis, Minnesota, USA)から市販されているMagellan（商標）Autologous Platelet Separator System; Harvest Technologies Corporation (Plymouth, Massachusetts, USA)から市販されているSmartPReP（商標）; DePuy (Warsaw, Indiana, USA); Cytomedix, Inc. (Rockville, Maryland, USA)から市販されているAutoloGel（商標）Process; EmCyte Corporation (Fort Myers, Florida, USA)から市販されているGenesisCS System; およびBiomet 3i, Inc. (Palm Beach Gardens, Florida, USA)から市販されているPCCS Systemが挙げられる。
【００４１】
患者から採取された血液は抗凝固薬と混合してよい。好適な抗凝固薬としては、ヘパリン、クエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、抗凝固クエン酸デキストロース溶液（ＡＣＤ）およびそれらの混合物が挙げられる。抗凝固薬は、対象からの採血に使用されるシリンジに入れてよく、または採血後に血液と混合してもよい。
【００４２】
白血球はまた、当技術分野で公知の他の方法を用いて調製してもよい。例えば、全血から、赤血球を溶解することによって、または密度勾配を利用した全血の遠心分離によって（この場合、白血球は遠心管の底に沈降する）白血球を調製してよい。密度遠心分離の例としては、Ficoll-Paque（商標）Plus(GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, New Jersey, USA)が挙げられる。場合によって、単核および多形核細胞をさらに分離するために、密度勾配を使用してよい。また、全血から濾過を用いて白血球を調製してもよい；例としては、Acelere（商標）MNC Harvest System (Pall Life Sciences, Ann Arbor, Michigan, USA)が挙げられる。白血球は骨髄から得ることもできる。
【００４３】
さらに図１に関し、ステップ１４０において示されるように、ポリアクリルアミドビーズとのインキュベーション後にＩＬ−１ｒａに富んだ溶液はそのポリアクリルアミドビーズと脂肪組織および／または脂肪細胞から単離される。単離は、液体容量を取り除きビーズを残すことによって行ってよい。場合によって、ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を取り除く前に、遠心分離によってビーズを沈降させてよい。また、濾過によって分離を行ってもよく、その場合、例えば、遠心力を用いることによってまたは真空を用いることによって、ポリアクリルアミドビーズはフィルターに保持され、ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液はそのフィルターを通過する。ステップ１３０におけるポリアクリルアミドビーズとのインキュベーションで乾燥ポリアクリルアミドビーズを利用する場合、ビーズは再水和することで膨張するために液体容量が減少し得る結果、得られたＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は濃縮される。濃度の上昇を維持するために、分離ステップ１４０では、ビーズに圧力がかからないようにまたは膨張したビーズから液体が流れ出ないように細心の注意を払うべきである。例えば、高遠心力または高真空では、ビーズがつぶれおよび／またはビーズの内部容量から液体が流れ出る可能性がある。
【００４４】
場合によって、ステップ１３０による、ポリアクリルアミドビーズとのインキュベーションと、ステップ１４０による、得られたＩＬ−１ｒａに富んだ溶液の単離とは、単一装置を使用して行ってよい。脂肪組織および／または脂肪細胞をポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートするための装置の例を図３Ａおよび図３Ｂに示している。これに関連して、装置３００は、上方チャンバー３０５と下方チャンバー３１０を備えている。上方チャンバー３０５には端壁３１５があり、その端壁を通ってゲルビーズ撹拌器３２５の撹拌軸３２０が伸びている。また、装置３００には入口３３０もあり、その入口は端壁３１５を通って上方チャンバー３０５に達している。また、装置３００には出口３３５もあり、その出口は導管３４０と通じている。上方チャンバー３０５の床にはフィルター３４５が備わっており、フィルターの上面は乾燥した濃縮用ポリアクリルアミドビーズ３５０を支えている。
【００４５】
使用中、脂肪組織および／または脂肪細胞を含有する流体３５５は、入口３３０を介して上方チャンバー３０５に注入され、ポリアクリルアミドビーズ３５０と混合される。流体３５５とポリアクリルアミドビーズ３５０は、撹拌軸３２０およびゲルビーズ撹拌器３２５を回転させて、流体３５５とビーズ３５０を混合する手助けをすることによって混合され得る。混合された流体３５５とポリアクリルアミドビーズ３５０は、次いで、所望の温度で所望の期間インキュベートされる。装置３００は、その後、遠心分離され、その結果、液体は下方チャンバー３１０に移動し、一方、ポリアクリルアミドビーズ３５０はフィルター３４５に保持される。それによって、得られたＩＬ−１ｒａ溶液３６０からポリアクリルアミドビーズ３５０が分離され、その溶液は下方チャンバー３１０に集まる。溶液３６０は、出口３３５を介して装置から取り出される。
【００４６】
図３の例示的な装置は、２００６年８月１０日公開の米国出願公開第２００６／０１７５２６８号、Dorian et al.；および２００６年１１月２日公開の米国出願公開第２００６／０２４３６７６号、Swift et al. において開示されており；それらの米国出願公開の双方は引用することにより本明細書の一部とされる。そのような装置はBiomet Biologies, LLC (Warsaw, Indiana, USA)のPlasmax（商標）Plus Plasma Concentratorとして市販されている。
【００４７】
さらに図１に関し、ステップ１５０では、ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液はヒトまたは動物の対象（患者）に投与される。ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を受ける患者は、ステップ１１０における脂肪組織を得た同じ患者であってよい。この場合、その方法により自己由来のＩＬ−１ｒａ調製物が提供される。投与は、様々な手段を用いて、例えば、シリンジを使用したＩＬ−１ｒａに富んだ溶液の注射、外科的適用、または別の外科的手法との併用適用によって行ってよい。しかしながら、インターロイキン−１受容体の刺激に関連している作用（炎症および変形性関節症による炎症など）に影響を与えるためにＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を部位にまたは部位に近接して植え込み、注射し、あるいは投与する任意の生物医学上許容されるプロセスまたは手法を、ステップ１５０が含み得ると理解される。例えば、自己由来のＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は、関節炎による炎症を治療するために、注射を介して患者に投与され得る。注射は、炎症関節の滑膜腔にまたは炎症関節の滑膜腔内に、あるいは関節にまたは関節近くに位置づけられる。
【００４８】
本技術によって生産されたＩＬ−１ｒａに富んだ溶液の様々な調製物は、最終分離ＩＬ−１ｒａ産物を処理するための滅菌フィルターを含めることによって滅菌してよい。同様に、抗生物質を、インキュベーションの間にポリアクリルアミドビーズに含めてよく、または本明細書において記載される方法における１以上の様々なステップで添加してもよい。
【００４９】
本技術は、自己由来のＩＬ−１ｒａに富んだ濃縮血漿溶液を含む、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を調製するための改善された方法を提供し、そのような方法によって、非自己由来の材料または組換え材料を用いたときに起こる可能性がある免疫学的問題は軽減されおよび／または実質的に排除される。加えて、ＩＬ−１ｒａは患者の細胞によって生産されるため、自然翻訳後修飾（グリコシル化など）はすでに存在している。これは大部分の組換えタンパク質には当てはまらず、それらのタンパク質が原核生物宿主で生産されるためである。
【００５０】
本技術で生成されたＩＬ−１ｒａに富む溶液は、全血において一般に見られるＩＬ−１ｒａの濃度と比べてＩＬ−１ｒａの濃度が上昇しているとみなすことができる。例えば、本方法および組成物は、約３４，０００ｐｇ／ｍＬ〜約１０８，０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１ｒａを含み得るが、全血は約２００ｐｇ／ｍＬ〜約８００ｐｇ／ｍＬを含み得る。しかしながら、任意の所定の溶液中に存在する濃度は、本方法において使用される脂肪組織、脂肪細胞および／または白血球源中に存在する成分の初期レベルによって変化し得ることおよび濃度の上昇が初期レベルとの比較によるものであると理解される。一般的に、ＩＬ−１ｒａは、本溶液中に少なくとも約１０，０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約２５，０００ｐｇ／ｍｌ、または少なくとも約３０，０００ｐｇ／ｍｌの濃度で存在し、最大１０８，０００ｐｇ／ｍＬまたはそれ以上であり得る。
【００５１】
ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は、ＩＬ−１の作用に影響を与え、インターロイキン−１受容体を介するシグナル伝達を減弱するために、投与される。ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は、多くの組織および器官で発現されるインターロイキン−１型受容体とのＩＬ−１の結合を競合的に阻害することにより、天然に存在するＩＬ−１の生物活性（関節炎に関連する炎症および軟骨破壊を含む）を遮断するために使用される。例えば、ＩＬ−１によるプロテオグリカン喪失の結果としての骨吸収および組織損傷（軟骨破壊など）は、ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液の投与によって治療することができる。関節炎を有する患者では、滑膜および滑液において内因性ＩＬ−１ｒａが、これら患者においてＩＬ−１濃度を中和するのに有効な濃度で見られない場合があり、そのため、これらの病態およびこれらの部位を治療するために、本ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液が投与される。投与量、投与および治療頻度は、効果的な治療を達成するために、確立された医療行為に基づいて変更してよい。
【００５２】
さらに図１に関し、ステップ１５０では、ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液はヒトまたは動物の対象（すなわち、患者）に投与される。ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を受ける患者は、ステップ１１０における脂肪組織を得た同じ患者であってよい。この場合、その方法により自己由来のＩＬ−１ｒａ調製物が提供される。投与は、様々な手段を用いて、例えば、シリンジを使用したＩＬ−１ｒａに富んだ溶液の注射、外科的適用、または別の外科的手法との併用適用によって行ってよい。しかしながら、インターロイキン−１受容体の刺激に関連している作用（炎症など）に影響を与えるためにＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を部位内にまたは部位に近接して植え込み、注射し、あるいは投与する任意の生物医学上許容される方法または手法を、ステップ１５０が含み得ることは理解できる。例えば、自己由来のＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は、関節炎による炎症を治療するために、注射を介して患者に投与される。注射は、炎症関節の滑膜腔にまたは炎症関節の滑膜腔内に、あるいは関節にまたは関節近くに位置づけられる。
【００５３】
本技術は、さらに、ＩＬ−１ｒａを送達するための方法を提供する。そのような送達方法では、ＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの溶液を準備する。その場合、フィブリノーゲンは活性化されフィブリンマトリックスを形成し、フィブリンマトリックスが治療部位においてＩＬ−１ｒａを保護し保持する。フィブリンマトリックスは、ＩＬ−１ｒａの送達によって、in situで形成され得る。
【００５４】
フィブリノーゲンは、凝固因子およびカルシウムによる活性化によって三次元マトリックス中に架橋され得る。好適な凝固因子としては、トロンビン（例えば、ウシ、組換えヒト、混合ヒトまたは自己由来）、自己由来凝固タンパク質およびポリエチレングリコールが挙げられる。カルシウムはカルシウム塩の形態（塩化カルシウムなど）であってよい。
【００５５】
いくつかの実施形態では、凝固因子は、自己由来凝固タンパク質を、治療する予定の患者から得られた血液から得られる凝固画分または組成物として含んでなる。好適な凝固画分は、全血または血漿をカルシウム溶液（例えば、エタノール中塩化カルシウム）とともに血液単離装置に装入すること；その全血または血漿を少なくとも約２０℃の温度で少なくとも約２０分間加熱すること；および凝固画分を分離することからなる方法によって得ることができる。単離は、加熱した全血または血漿を遠心分離することによって行ってよい。好適な分離装置を図４および図５に示している。そのような装置は、Biomet Biologies LLC (Warsaw, Indiana, USA)のClotalyst Autologous Thrombin Collection Systemとして入手可能である。
【００５６】
図４および図５に関して、血液分離装置７００は、一般的に、円筒壁と、主要チャンバー７０２を限定する第１の端７０４および第２の端７０６とを有する本体を備えている。第１の端７０４には、第１の出入口７０８、第２の出入口７１０、第３の出入口７１２、ベント７１３およびフィルター７１４が存在する。第１の出入口７０８、第２の出入口７１０、第３の出入口７１２およびベント７１３は各々、第１の端７０４を通って伸び、装置７００外部と主要チャンバー７０２との間での流体連絡を可能にする。第１の出入口７０８には、第１のキャップ７１６を付けることができ、第２の出入口７１０には、第２のキャップ７１８を付けることができ、第３の出入口７１２には、第３のキャップ７２０を付けることができる。第１の出入口７０８用の第１の交換キャップ７２２は、第１の出入口７０８に第１のテザー７２４で取り付けることができる。第１の交換キャップ７２２を使用していない場合には第１のカバー７２６を第１の交換キャップ７２２に固定することができる。第２の出入口７１０用の第２の交換キャップ７２８は、第２の出入口７１０に第２のテザー７３０で取り付けることができる。第２の交換キャップ１２８を使用していない場合には第２のカバー７３２を第２の交換キャップ７２８に固定することができる。
【００５７】
第１の出入口７０８および第２の出入口７１０各々には止め弁が備わっており、材料（ガラスビーズ７４０など）が第１の出入口７０８および第２の出入口７１０を通って主要チャンバー７０２から出ないようになっている。止め弁は、任意の好適な弁、例えば、ダックビル弁などであり得る。
【００５８】
特に図５に関して、第３の出入口７１２には伸長チューブ部分７３４があり、その伸長チューブ部分は主要チャンバー７０２内に伸びている。伸長部分７３４は、第１の端７０４から主要チャンバー７０２内の最深部まで伸び、主要チャンバー７０２内からの選択材料（トロンビンおよび他の血液凝固因子など）の回収を可能にしている。例えば、下にさらに記載するように、主要チャンバー７０２に、全血、試薬（例えば、エタノールまたは他の好適な溶媒に溶解されたカルシウム化合物を含んでなるカルシウム溶液）、抗凝固薬およびガラスビーズを含める場合には、この混合物のインキュベーションおよび遠心分離によって、主要チャンバー７０２の第２の端７０６において赤血球、血漿およびガラスビーズをほぼ含んでなる凝固塊が形成する。凝固塊の上部では、第１の端７０４に最も近い凝固塊の側面において、トロンビンおよび様々な他の凝固因子を含んでなる流出物が形成される。第２の端７０６における凝固塊は、流出物と視覚的に区別することができる。伸長チューブ部分７３４を使用してトロンビンおよび他の凝固因子を抽出するために、伸長チューブ部分７３４は、主要チャンバー７０２内の凝固塊に最も近い流出物の部分のほぼ高さとなる最深部まで伸びる。
【００５９】
伸長部分７３４の遠位端には先端部７３６が備わっている。先端部７３６は、伸長部分７３４からほぼ直角に伸びている。その先端部にはくぼみまたはノッチ７３７がある。先端部７３６あたりの伸長部分７３４から２つの支柱７３９が放射状に広がり、主要チャンバー７０２の内部と接している。支柱７３９は、主要チャンバー７０２の内部に対して先端部７３６を片寄らせ、先端部７３６を主要チャンバー７０２内の定位置に保持する。先端部７３６が主要チャンバー７０２の内部と接すると、ノッチ７３７は、主要チャンバー７０２の内壁と先端部７３６との間に開口部またはクリアランスを形成し、ノッチ７３７を通って先端部７３６内への材料の通過を可能にしている。特に、主要チャンバー７０２が傾いて先端部７３６周囲の追加材料がノッチ７３７まできたときに、先端部７３６は、伸長部分７３４を通じて回収される材料の量を最大にする手助けをする。２本の支柱７３９と先端部７３６は、主要チャンバー７０２において伸長部分７３４を中央に置く手助けをしている。
【００６０】
出入口７０８、７１０および７１２は、好適な流体送達装置または流体輸送装置（シリンジなど）と協同するようにサイジングされている。例えば、第１の出入口７０８は、試薬シリンジと協同するようにサイジングすることができ、第１の出入口７０８から主要チャンバー７０２内への試薬の通過を可能にしており；第２の出入口７１０は、血液シリンジと協同するようにサイジングすることができ、第２の出入口７１０から主要チャンバー７０２内への血液の通過を可能にしており；第３の出入口７１２は、シリンジと協同するようにサイジングすることができ、主要チャンバー７０２内からの血液成分（トロンビンおよび他の凝固因子など）の回収を可能にしている。
【００６１】
フィルター７１４は、主要チャンバー７０２内から第３の出入口７１２を通って材料が回収される際に材料を濾過するための任意の好適なフィルターであり得る。フィルター７１４にはポリエステルスクリーンが含まれ、ポリエステルスクリーンは第１の出入口７０８および第２の出入口７１０の上に取り付けられる。ポリエステルスクリーンには開口部があり、開口部のサイズは約１５ミクロン〜約２５ミクロンの範囲内である。例えば、開口部のサイズは約１７ミクロンであり得る。フィルター７１４の代わりにまたはフィルター７１４に加えて、伸長部分７３４内にまたは先端部７３６にフィルター７１４と同様のフィルターを準備することもできる。
【００６２】
主要チャンバー７０２は、アクチベーター、例えば、ガラスビーズ７４０などをさらに含む。負に帯電したガラスビーズ表面は血液凝固因子の凝固および放出を活性化し、それによって主要チャンバー７０２の第２の端７０６において凝固塊を形成する。ガラスビーズ７４０は、任意の好適なタイプのガラスビーズ、例えば、ホウケイ酸ビーズなどであり得る。
【００６３】
図５の装置を使用して凝固因子を生産するための例示的な手順は、第１の出入口７０８からの主要チャンバー７０２内への、塩化カルシウムおよびエタノールを含んでなる試薬の注入によって開始する。試薬の注入が完了したら、第１の出入口７０８は第１の交換キャップ７２２を使用して閉鎖される。抗凝固薬が加えられた血液が第２の出入口７１０から主要チャンバー７０２内に注入される。血液の注入が完了したら、第２の出入口７１０は第２の交換キャップ７２８を使用して閉鎖される。所望により、シリンジおよび血液分離装置７００は約２５℃の温度に予熱される。
【００６４】
血液成分分離装置７００の内容物は、装置７００を繰り返し（例えば、約１２回）逆さにし、血液をガラスビーズと接触させることによって混合される。混合後、その装置はインキュベートされる。インキュベーションプロセスは、装置７００の内容物の約２５℃で約１５分間の加熱を可能にする温度および期間で行われる。インキュベーション期間が完了したら、主要チャンバー７０２の第２の端７０６において赤血球、血漿およびガラスビーズの凝固塊が形成する。インキュベーションの完了後、存在し得るゲルを除去し、分解するのに十分なだけ装置７００を振盪させる。その後、残留血液成分からトロンビンを分離するために、装置７００を好適な遠心機に入れ約３２００ＲＰＭで約１５分間回転させる。遠心分離後、トロンビンおよび他の凝固因子の流出物は凝固塊から分かれる。遠心分離の完了後、第３のキャップ７２０は取り外され、第３の出入口７１２、伸長部分７３４および先端部７３６を通って主要チャンバー７０２内からトロンビンおよび他の凝固因子の流出物を取り出すために、好適な抽出装置（シリンジなど）が使用される。
【００６５】
よって、本技術の送達方法は、治療部位においてフィブリンマトリックスを形成するために、ＩＬ−１ｒａ、フィブリノーゲン、トロンビンおよびカルシウムの投与を含み得る。外因性フィブリノーゲン、例えば、ウシトロンビンなどを、好ましくは、１，０００Ｕ／ｍＬで、ＩＬ−１ｒａの溶液に添加してよい。また、ＩＬ−１ｒａ溶液は、十分な量の内因性フィブリノーゲンをすでに含んでいることもある。ＩＬ−１ｒａの溶液および／またはフィブリノーゲンまたはその調製物が抗凝固薬、例えば、ＡＣＤ−Ａ（抗凝固クエン酸デキストロース溶液）などを含む場合には、フィブリノーゲンを活性化するための（トロンビンとの）カルシウムの添加は、抗凝固薬における任意のキレート剤の有効量を超える。
【００６６】
本方法を用いて製造されるＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は、脂肪細胞および／または脂肪組織とポリアクリルアミドビーズに全血および／または多血小板血漿がさらに加えられるときに、全血と比べての内因性フィブリノーゲン濃度の上昇をもたらすことができる。例えば、多血小板血漿、脂肪組織、ポリアクリルアミドビーズおよび図３に例示される装置を使用した上記方法の産出物は、全血と比べてＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの両方に富む溶液となる。そのような装置は、Biomet Biologies, LLC (Warsaw, Indiana, USA)のPlasmax（商標）Plus Plasma Concentratorとして市販されており、そのような装置には、２００６年８月１０日公開の米国出願公開第２００６／０１７５２６８号、Dorian et al．；および２００６年１１月２日公開の米国出願公開第２００６／０２４３６７６号、Swift et al.に記載されている使用装置および方法が含まれ；それらの米国出願公開の双方は引用することにより本明細書の一部とされる。このＩＬ−１ｒａに富みフィブリノーゲンにも富んだ溶液は、最初の全血および脂肪組織を得た患者を治療するために使用し得る；すなわち、自家移植治療。
【００６７】
全血、脂肪組織およびポリアクリルアミドビーズと、Plasmax（商標）Plus Plasma Concentratorとを使用した上記方法を用いて調製される、ＩＬ−１ｒａに富みフィブリノーゲンにも富んだ溶液は、全血と比べてフィブリノーゲン濃度が約３倍（３×）上昇している溶液を提供する。３×高い濃度のフィブリノーゲンから形成されるフィブリンマトリックス／血餅は、フィブリノーゲン基礎レベルから作製されるフィブリン塊よりも堅固であり、分解および吸収に対してより耐性がある。
【００６８】
図６に関しては、ＩＬ−１ｒａを送達するための概略図９００を示している。ステップ９１０において、ＩＬ−１ｒａの溶液が準備される。ＩＬ−１ｒａ溶液は、本開示において記載されている方法を用いて調製してよい。ステップ９２０ではＩＬ−１ｒａ溶液に外因性フィブリノーゲンが添加される。外因性フィブリノーゲンは、ＩＬ−１ｒａ溶液とは異なる供給源（異なる患者など）から調製してよく、またはウシ由来のものでもよい。また、外因性フィブリノーゲンは、ＩＬ−１ｒａ溶液とは異なる出発材料から調製してよいが、それでも同じ供給源または患者から調製してよい。例えば、ＩＬ−１ｒａ溶液および外因性フィブリノーゲンは、同じ患者から採取された異なる血液サンプルから調製してよい。あるいは、ステップ９３０で示されるように、ＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの両方が濃縮された溶液を、例えば、本明細書において記載されているように、ポリアクリルアミドビーズおよびPlasmax（商標）装置を使用することによって調製する。ステップ９４０では、トロンビンおよびカルシウムの溶液が準備され、ＩＬ−１ｒａの溶液とともに治療部位に併用投与される。その後は、ステップ９５０で示されるように、合わせられた溶液中のフィブリンがin situで架橋し、治療部位においてマトリックスを形成し、そのマトリックスがＩＬ−１ｒａを保護し、保持し、持続放出する役割を果たす。
【００６９】
ＩＬ−１ｒａの送達は、ＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの第１の溶液と、トロンビンおよびカルシウムの第２の溶液とを対象に同時投与することを含み得る。そのような実施形態では、第１の溶液と第２の溶液は、それらの溶液が混合され治療部位に注射された後に初めてフィブリノーゲンがフィブリンマトリックスを形成するように、投与まで別々に保存される。それらの溶液は、治療部位への送達直前に混合してよく、または治療部位において混合してもよい。
【００７０】
図７に関しては、医学的に適切な手順においてデュアルシリンジ装置１０００が使用されている。デュアルシリンジ装置１０００は、第１のバレル１００５と第２のバレル１０１０を備え、双方のバレルが混合チャンバー１０１５とつながっている。第１のプランジャー１０２０は第１のバレル１００５内に挿入され、第２のプランジャー１０２５は第２のバレル１０１０内に挿入される。第１のプランジャー１０２０と第２のプランジャー１０２５は部材１０３０によって連結されている。混合チャンバー１０１５はカニューレ１０３５とつながっている。デュアルシリンジ装置１０００には、第１のバレル１００５中にＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの第１の溶液１０４０と、第２のバレル１０１０中にトロンビンおよびカルシウムの第２の溶液１０４５とが入っている。同時投与の間、第１のバレル１００５と第２のバレル１０１０双方の内容物が混合チャンバー１０１５中に押し出されるように、部材１０３０は混合チャンバー１０１５に向かって押し進められる。混合された第１の溶液１０４０と第２の溶液１０４５は、カニューレ１０３５を通って移動し、患者の関節１０６０内の治療部位１０５５においてフィブリンマトリックス１０５０を形成する。
【００７１】
図７で示される実施形態では、患者の関節１０６０は、大腿骨１０６５、脛骨１０７０、腓骨１０７５、膝蓋骨１０８０および軟骨１０８５を含む膝関節である。しかしながら、治療部位１０５５はヒト患者または動物の任意の関節内であってよく、そのような関節には肩、肘、手首、足首、股関節および脊椎が含まれると理解される。加えて、本方法は、他の組織（筋肉および腱など）内の部位における炎症を治療するためにも使用してよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、デュアルシリンジ装置１０００は、混合された第１の溶液１０４０と第２の溶液１０４５を投与するため、患者の関節１０６０の軟組織を突き通すために使用される。例えば、カニューレ１０３５は中空針（皮下注射針など）であってよい。あるいは、患者の関節１０６０において切開を行ってカニューレ１０３５の挿入が可能になるようにし、デュアルシリンジ装置８００が治療部位１０５５に入るようにしてよい。
【００７３】
いくつかの実施形態（示されていない）では、デュアルシリンジ装置１０００に混合チャンバー１０１５がなく、その代わりとして２本のカニューレ１０３５が備わっている。各カニューレは各バレルから治療部位１０５５に通じている。この場合、第１の溶液１０４０と第２の溶液１０４５は、別々のカニューレ１０３５を通って移動し、治療部位１０５５において混ざり合い、フィブリンマトリックス１０５０を形成する。いくつかの実施形態では、デュアルシリンジ装置の代わりに、２つの独立したシングルバレル型シリンジ装置が使用される。
【００７４】
本送達方法において形成されたフィブリンマトリックスは、炎症を悪化させることなく治療部位に存在することができる。フィブリンマトリックス内のＩＬ−１ｒａは酵素分解から保護されフィブリンマトリックスと結合し得ることから、そのマトリックスからＩＬ−１ｒａが経時的にゆっくりと放出される。それゆえに、そのような方法は、フィブリンマトリックス担体を含まないＩＬ−１ｒａの注射と比べて、ＩＬ−１ｒａの持続的な送達を提供することができる。
【００７５】
本技術は、２００８年２月２７日提出の米国仮出願第６１／０３１，８０３号、２００８年１１月２１日提出の米国仮出願第６１／１１６，９４０号および２００９年２月２４日提出の米国仮出願第６１／１５５，０４８号の態様を含み得るものであり、２００９年２月２７日提出の第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３５５４１号の態様を含んでいる。
【００７６】
次の具体例は、この技術の組成物および方法の作製および使用の方法の例示のために提供され、特に明記されない限り、この技術の所定の実施形態が作製されたまたは検証されたこと、あるいは作製されていないまたは検証されていないことを意味するものではない。
【実施例】
【００７７】
実施例１
脂肪細胞は次の通り調製する。脂肪組織を小片に細分し（約１ｃｍ３）、断続的に機械撹拌しながら水浴中３７℃で１８０分間、２ｍｇ／ｍＬ Ｉ型コラゲナーゼ(Worthington Biochemical Corp., Lakewood, N.J.)で消化する。培地または血液由来の溶液を加えることによって消化の効力を失わせることができる。細胞懸濁液を遠心分離機にかけ（３００×ｇ、２５℃で７分間）、続いて、細胞ペレットから上清の除去を行う。次いで、そのペレットを適合性のある溶液に再懸濁して、脂肪細胞を含んでなる液体容量を準備する。
【００７８】
あるいは、ペレットを対象から得た全血とともに懸濁し、Biomet Biologies, Inc. (Warsaw, Ind.)のGPS（商標）Platelet Concentrate Systemに加える。遠心分離後、多血小板血漿層（脂肪細胞も含む）をその装置から抽出する。
【００７９】
脂肪細胞（所望により多血小板血漿を含む）を、次いで、ポリアクリルアミドビーズと合わせて、ＩＬ−１ｒａの生産を刺激する。脂肪細胞およびポリアクリルアミドビーズをその溶液から分離して、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を得る。
【００８０】
実施例２
ＩＬ−１ｒａの治療用組成物を脂肪細胞から生成する。脂肪吸引処置(lipoaspiration/liposuction procedures)からヒト皮下脂肪組織を得、３７℃で１時間緩やかに撹拌しながらＩ型コラゲナーゼ溶液(Worthington Biochemical Corp., Lakewood, N.J.)でその組織を消化することによりヒト脂肪細胞の単離を行う。解離細胞を５００μｍおよび２５０μｍのＮｉｔｅｘフィルターで濾過する。その画分を３００×ｇで５分間遠心分離機にかける。上清を廃棄し、細胞ペレットを適合性のある溶液（血液由来の溶液など）に再懸濁する。
【００８１】
図３Ａおよび図３Ｂで示されるような装置において脂肪細胞をポリアクリルアミドビーズと合わせる。脂肪細胞を含有する流体３５５を、入口３３０を介して上方チャンバーに注入し、ポリアクリルアミドビーズ３５０と混合する。流体３５５とポリアクリルアミドビーズ３５０は、撹拌軸３２０およびゲルビーズ撹拌器３２５を回転させて、流体３５５とビーズ３５０を混合する手助けをすることによって混合し得る。混合した流体３５５とポリアクリルアミドビーズ３５０を、次いで、所望の温度で所望の期間インキュベートする。装置３００を、その後、遠心分離機にかけると、液体は下方チャンバー３１０に移動し、一方、ポリアクリルアミドビーズ３５０はフィルター３４５に保持される。それによって、得られたＩＬ−１ｒａ溶液３６０からポリアクリルアミドビーズ３５０が分離され、その溶液は下方チャンバー３１０に集まる。ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液３６０は、出口３３５を介して装置から取り出し得る。
【００８２】
実施例３
ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を次の通り作出する。患者から脂肪吸引術により脂肪組織を採取する。ＡＣＤ−Ａ(Braintree, Massachusetts, USA)（１０％）で抗凝固処理した全血（７０ｍＬ）を患者から採取する。全血測定用に一部（１０ｍＬ）を確保する。GPS（登録商標）II System (Biomet Biologies, LLC, Warsaw, Indiana, USA)を使用して多血小板血漿（ＰＲＰ）（６ｍＬ）を生産する。Woodell-May JE, Ridderman DN, Swift MJ, Higgins J. "Producing Accurate Platelet Counts for Platelet Rich Plasma: Validation of a Hematology Analyzer and Preparation Techniques for Counting" J Craniofac Surg (2005) Sep. 16(5):749-56に記載されているように、検証済みの手順に従って、全血サンプルおよびＰＲＰサンプルについて全血球計算値（ＣＢＣ）を収集する。
【００８３】
脂肪組織（約５グラム）およびＰＲＰ（約５ｍＬ）を改良型血漿濃縮装置(Plasmax（商標）, Biomet Biologies LLC, Warsaw, Indiana, USA)に加え、装置内でポリアクリルアミド乾燥ビーズとともに室温で２４時間インキュベートする。インキュベーション後、血漿濃縮装置を遠心分離機にかけて、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を分離する。
【００８４】
ゼロ時点でのＩＬ−１ｒａ基礎レベルを分析するために、脂肪組織、ＰＲＰおよびポリアクリルアミドサンプルを５０μＬのトロンビンおよび１０％ＣａＣｌ２（１，０００単位／ｍＬ）で活性化する。血餅が形成され、それを室温で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、血餅を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかける。血餅から血清を収集し、ＥＬＩＳＡ分析用に確保する。血漿濃縮装置からのＩＬ−１ｒａに富んだ溶液はトロンビンによる活性化を必要としないため直接試験する。総てのサンプルをＩＬ−１ｒａについて、ＥＬＩＳＡキット(IL-1ra Quantikine（商標）Kit, R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)を使用して分析する。
【００８５】
例示データを平均±標準偏差として示す。統計的有意性をスチューデントｔ−検定（ａ＝０．０５）により評価する。相関分析を用いて、ＩＬ−１ｒａ産出物および全血球計算値（ＣＢＣ）データを比較する。
【００８６】
ポリアクリルアミドビーズとの脂肪組織およびＰＲＰのインキュベーションから生成されるＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１ｒａレベルの上昇をもたらす。ＩＬ−１ｒａの血清基礎値（２１７±９８ｐｇ／ｍＬ）は、ドナー間で大きな変動があるにしても、Meijer H, Reinecke J, Becker C, Tholen G, Wehling P. "The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction" Inflamm. Res. 2003 Oct; 52(10): 404-7に記載されている、別の研究で認められた結果（７３±４．８ｐｇ／ｍＬ）と同様である。ポリアクリルアミドビーズとの脂肪組織およびＰＲＰのインキュベーション後の血漿濃縮装置の産出物では、ＩＬ−１ｒａ血清レベルは、血清基礎レベルと比べて統計的に高い。例えば、血漿濃縮装置でのポリアクリルアミドビーズとの脂肪組織およびＰＲＰの２４時間のインキュベーションでは、ＡＣＳ装置での２４時間のインキュベーションからすでに報告されているデータ（１０，２５４±１６５ｐｇ／ｍＬ）より高いＩＬ−１ｒａ量（約３６，０００ｐｇ／ｍＬ）となる。
【００８７】
実施例４
脂肪組織（１２０ｇ）を収集し、GPS（登録商標）III disposables (Biomet Biologies LLC, Warsaw, Indiana, USA)を使用して調製する。単離脂肪組織を改良型血漿濃縮装置(Plasmax（登録商標）、Biomet Biologies LLC, Warsaw, Indiana, USA)に装入し、処理する。産出物を４群に分ける；濃縮血漿中のＩＬ−１ｒａ（トロンビンによる活性化（１Ｍ ＣａＣｌ２中１０００Ｕ／ｍｌ）を行う）および濃縮血漿中のＩＬ−１ｒａ（トロンビンによる活性化（１Ｍ ＣａＣｌ２中１０００Ｕ／ｍｌ）を行わない）、または無細胞ＩＬ−１ｒａ（トロンビンによる活性化を行う）および無細胞ＩＬ−１ｒａ（トロンビンによる活性化を行わない）。ＥＬＩＳＡ(R&D Systems)を使用して経時的にＩＬ−１ｒａを測定する。
【００８８】
非凝固サンプルは、２４時間かけて平均４７．１±２．１ｎｇを生産する（ｐ＝０．３４）。無細胞サンプルは、変化することなく、２４時間かけて３３．７±１．５ｎｇを生産する（ｐ＝０．３８）。一度、凝固したら、ＩＬ−１ｒａの溶出は遅延し、１０時間後に２８％しか溶出されない。無細胞サンプルでの放出も遅延するが、１０時間後には利用可能なＩＬ−１ｒａの１００％が溶出される。
【００８９】
本明細書において記載される実施例および他の実施形態は、例示であり、本技術の組成物および方法の総ての範囲の説明において限定することを目的としていない。特定の実施形態、材料、組成物および方法の等価の変更、修飾および変形は、本技術の範囲内で行うことができ、実質的に同様の結果を示す。
【発明の背景】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００９年８月２７日に提出された米国実用特許出願(U．S． Utility Application)第１２／５４９，０１５号に基づく優先権を主張し、該米国実用特許出願は、２００９年２月２７日に提出された米国特許出願第１２／３９４，７２３号の一部継続出願であり、該米国特許出願は、２００８年２月２７日提出の米国仮出願第６１／０３１，８０３号；２００８年１１月２１日提出の米国仮出願第６１／１１６，９４０号；および２００９年２月２４日提出の米国仮出願第６１／１５５，０４８号の利益を主張する。上記各出願に記載された総ての記載内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
緒言
本技術は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストを含んでなる組成物、およびそのような組成物を生成し、単離し、送達するための方法に関する。
【０００３】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）には、リンパ球およびマクロファージを刺激し、食細胞を活性化し、プロスタグランジン生産を増加させ、骨関節の変性に寄与し、骨髄細胞増殖を増加させることができ、多くの慢性炎症状態に関与するサイトカインのファミリーが含まれる。ＩＬ−１は、マクロファージ、単球および樹状細胞によって生成され、感染に対する炎症応答の一部である。
【０００４】
ＩＬ−１の作用様式は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＬ−１ｒａ；「ＩＲＡＰ」としても知られる）によって影響を与えることができる。ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１と、細胞表面上の同じ受容体と結合し、それによってＩＬ−１がその細胞にシグナルを送るのを妨げる。ＩＬ−１ｒａは、単球、マクロファージ、好中球、多形核細胞（ＰＭＮ）および他の細胞を含む白血球から分泌され、Arend WP, Malyak M, Guthridge CJ, Gabay C (1998) " Interleukin-1 receptor antagonist: role in biology" Annu. Rev. Immunol. 16: 27-55によって記載されているように、種々のＩＬ−１関連の免疫応答および炎症応答を調整することができる。ＩＬ−１ｒａの生産は、付着免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、他のサイトカインおよび細菌成分またはウイルス成分を含むいくつかの物質によって刺激を受ける。ＩＬ−１ｒａは、関節炎、大腸炎および肉芽腫性肺疾患において重要な天然の抗炎症性タンパク質である。
【０００５】
ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１が重要な役割を果たす自己免疫疾患である関節リウマチの治療において使用することができ、その疾患と関連がある炎症および軟骨破壊を低減させる。例えば、Kineret（商標）(アナキンラ)は、ＩＬ−１ｒａの組換え非グリコシル化型(Amgen Manufacturing, Ltd., Thousand Oaks, California)である。様々な組換え型インターロイキン−１阻害薬および治療の方法は、２００３年７月２９日発行の米国特許第６，５９９，８７３号、Sommer et al.；１９９１年１２月２４日発行の米国特許第５，０７５，２２２号、Hannum et al.；および２００５年９月８日公開の米国出願公開第２００５／０１９７２９３号、Mellis et al.に記載されている。加えて、体液からＩＬ−１ｒａを生産するための方法は、自己体液の使用を含み、そのような方法は、２００３年９月２３日発行の米国特許第６，６２３，４７２号、Reincke et al.；２００４年３月３０日発行の米国特許第６，７１３，２４６号、Reinecke et al.；および２００４年７月６日発行の米国特許第６，７５９，１８８号、Reinecke et al.に記載されている。
【０００６】
ＩＬ−１ｒａを使用する組成物および方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＩＬ−１ｒａは、２０００年８月１日発行の米国特許第６，０９６，７２８号、Collins et al.に記載されているように、ヒアルロン酸を含む組成物の一部として送達されている。しかしながら、多くのそのような方法および組成物は、ＩＬ−１ｒａの安定性および半減期、並びに提供されるＩＬ−１ｒａの量および割合についての問題に関わっている。それゆえに、ＩＬ−１ｒａを送達する改善された方法が望ましく、炎症の管理を含む、インターロイキン−１受容体によって媒介される病態および病変の治療に有用であるであろう。
【発明の開示】
【０００７】
概要
本技術は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法およびヒトまたは動物の対象における炎症の部位にそのような溶液を投与するための方法を提供する。そのような溶液を生成するための方法は、ポリアクリルアミドビーズとともに脂肪組織をインキュベートすることを含む。インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液は、その後、そのポリアクリルアミドビーズから分離される。脂肪組織はその対象から得ることができる。
【０００８】
ヒトまたは動物の対象においてインターロイキン−１受容体によって媒介される病態（炎症など）を治療する方法は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液とフィブリノーゲンを同時投与することを含む。様々な実施形態では、そのような方法は、トロンビンおよび塩化カルシウムの対象への投与をさらに含んでなる。炎症部位は、例えば、関節炎、例えば、変形性関節症と関連している場合がある。好ましくは、ＩＬ−１ｒａの溶液は自己由来のものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本技術は、詳細な説明および添付の図面からより十分に理解されるようになる。
【図１】本技術の実施形態による、ＩＬ−１ｒａ溶液を生産するための第１の方法の概略図である。
【図２】本技術の１つの実施形態による、白血球および血小板を含んでなる液体容量を分離するために使用される典型的装置の部分断面図である。
【図３Ａ】本技術の１つの実施形態による、白血球および血小板の容量をポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートするための典型的装置の断面図である。
【図３Ｂ】本技術の１つの実施形態による、白血球および血小板の容量をポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートするための典型的装置の断面図である。
【図４】本技術の方法において使用され得る血液成分分離装置である。
【図５】図４の血液成分分離装置の側面図であり、該装置の主要チャンバーの内部を例示している。
【図６】本技術の実施形態による、ＩＬ−１ｒａを送達するための方法の概略図である。
【図７】本技術の１つの実施形態による、ＩＬ−１ｒａを送達するための典型的装置の部分断面図である。
【００１０】
本明細書において示された図は、ある特定の実施形態を説明するために、本技術のものの間で材料および方法の一般的特徴を例示することを目的としていることに留意すべきである。これらの図は、いかなる所定の実施形態の特徴を正確に反映することはできず、必ずしも特定の実施形態をこの技術の範囲内で定義しまたは限定するものではない。
【００１１】
詳細な説明
次の技術の説明は、１以上の発明の対象、製造および使用の性質を単に例示するものであり、この出願においてあるいはこの出願の優先権を主張して提出された他の出願またはそれらの出願から発行される特許において特許請求された任意の特定発明の範囲、用途または使用を限定するものではない。本明細書において示された技術の説明の概説では、次の定義と限定されないガイドラインを考慮する。
【００１２】
本明細書において用いられる見出し（「緒言」および「概要」など）および小見出しは、開示の範囲内での主題の一般的構成のみを目的としており、技術またはその任意の態様の開示を限定するものではない。特に、「緒言」において開示される内容は新規技術を含むものであり、先行技術を引用するという性質のものはない。「概要」において開示される内容は、技術またはその任意の実施形態の全範囲を網羅的にまたは完全に開示するものではない。便宜上、この明細書の項中で材料を特定の有用性があるとして分類しまたは論じるが、その材料が任意の所定の組成物において使用される場合に、その材料が本明細書におけるその分類に従って必ずまたは単独で作用するに違いないと断定するものではない。
【００１３】
本明細書における参考文献の引用は、それらの参考文献が、先行技術でありまたは本明細書において開示される技術の特許性に関連していることを認めるという性質のものではない。この明細書の「詳細な説明」項において引用される総ての参考文献は、全体として引用することにより本明細書の一部とされる。
【００１４】
技術の実施形態を示しているが、説明および具体例は、例示のみを目的としたものであり、技術の範囲を限定するものではない。さらに、記述された特徴を有する多数の実施形態の引用は、追加の特徴を有する他の実施形態、または記述された特徴の異なる組合せを組み込んた他の実施形態を排除するものではない。具体例は、この技術の装置およびシステムの作製および使用の方法の例示のために提供され、特に明記されない限り、この技術の所定の実施形態が作製されたまたは検証されたこと、あるいは作製されていないまたは検証されていないことを意味するものではない。
【００１５】
本明細書において用いられるように、「好ましい(preferred)」および「好ましくは(preferably)」という単語は、ある特定の状況下である特定の利益を供与する技術の実施形態を意味する。しかしながら、同じまたは他の状況下で、他の実施形態もまた好ましいことがある。さらに、１以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用でないということを意味するものではなく、技術の範囲の他の実施形態を排除するものではない。
【００１６】
本明細書において言及されるように、総ての組成百分率は、特に断りのない限り、全組成の重量基準による。本明細書において用いられるように、「含む(include)」という単語およびその変形は非限定的であることが意図されており、リストにおける項目の引用により、この技術の材料、組成物、装置および方法において同様に有用であり得る他の類似の項目は排除されない。同様に、「できる(can)」および「してよい(may)」という用語およびそれらの変形は非限定的であることが意図されており、ある実施形態がある特定の要素または特徴を含んでなることができるまたは含んでなってよいという引用により、それらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態は排除されない。
【００１７】
本明細書において用いられる「１つの(a)」および「１つの(an)」は、「少なくとも１つの(at least one)」項目が存在すること；可能な場合には、複数の同様の項目が存在し得ることを示している。値に付けられる場合の「約(about)」は、計算または測定では値の多少の不正確さを許容する(値の正確さにいくらか近づいており;その値におおよそまたは合理的に近く;近似的である)ことを示している。いくつかの理由で、「約(about)」によってもたらされる不正確さが当技術分野でこのような通常の意味で理解されない場合には、本明細書において用いられる「約(about)」は、そのようなパラメーターを測定するまたは使用する通常の方法によって起こる可能性がある変動を少なくとも示している。加えて、範囲の開示は、全範囲内での総ての個別値および細分された範囲の開示を含む。
【００１８】
本技術は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）に関し、ＩＬ−１ｒａを生成する方法、そのような方法によって生産されるＩＬ−１ｒａを含んでなる組成物、ＩＬ−１ｒａを使用する方法、ＩＬ−１ｒａを含んでなる治療方法、ならびにＩＬ−１ｒａの生成、単離および投与のための装置が含まれる。
【００１９】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法は、次の側面を含むことができる。いくつかの実施形態では、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法は、脂肪細胞を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させることおよびインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得るために、液体容量をそのポリアクリルアミドビーズおよび脂肪細胞から分離することを含む。本技術の機構、有用性または機能を限定することなく、ポリアクリルアミドビーズは、脂肪細胞によるＩＬ−１ｒａ生産のアクチベーターとして機能を果たすように思われる。いくつかの点で、ポリアクリルアミドビーズ表面との脂肪細胞の接触は、脂肪細胞によるＩＬ−１ｒａ生産および分泌を刺激するように思われる。また、ＩＬ−１ｒａ生産量と白血球濃度との間に相関があるようにも思われ、その点で脂肪組織は白血球を含んでよい。よって、本技術では、脂肪組織および解離脂肪組織を使用して脂肪細胞を得るが、その場合、白血球は脂肪組織およびその脂肪組織から得られる脂肪細胞の両方に存在してよい。
【００２０】
前記方法は、次の側面をさらに含むことができる。脂肪細胞の液体容量は、単離脂肪組織の一部であり得る；その場合、例えば、脂肪組織は他の細胞種を含んでよい。脂肪細胞とポリアクリルアミドビーズの接触は、脂肪細胞の液体容量をポリアクリルアミドビーズとともに約３０秒から約２４時間までに及ぶ期間インキュベートすることを含む。また、その接触は、ポリアクリルアミドビーズとの脂肪細胞の液体容量の接触に加えて、白血球を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させることも含んでよい。白血球の液体容量は、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿であり得る。また、白血球は、骨髄から得ることもできる。いくつかの実施形態では、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得るための分離は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を含んでなる上清を得るために、脂肪細胞の液体容量とポリアクリルアミドビーズを遠心分離することを含む。得られた、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液は、約３０，０００ｐｇ／ｍＬ〜約１１０，０００ｐｇ／ｍＬのインターロイキン−１受容体アンタゴニストを含み得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、患者において炎症性疾患を治療するために有用な、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するために方法が提供される。これらの方法は、患者から脂肪組織を得ることおよびポリアクリルアミドビーズを含む濃縮装置アセンブリーにその脂肪組織を装入することを含む。ポリアクリルアミドビーズと脂肪組織の混合物は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成するためにインキュベートされる。濃縮装置アセンブリーは、その後、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得るために、そのポリアクリルアミドビーズおよび脂肪組織からインターロイキン−１受容体アンタゴニストを分離する遠心速度で回転させる。濃縮装置アセンブリーへの装入には、脂肪組織をポリアクリルアミドビーズとともに約３０秒〜約２４時間の期間インキュベートすることが含まれる。その装入は、白血球を含んでなる液体容量を濃縮装置アセンブリーに装入することをさらに含んでよい。白血球の液体容量は、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿の組合せの形であり得る。
【００２２】
本技術はまた、患者において１以上の炎症部位を治療する方法も含む。そのような方法は、脂肪細胞を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させることを含む。その後、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得るために、そのポリアクリルアミドビーズおよび脂肪細胞から液体容量が分離される。インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液は、患者の１以上の炎症部位に投与される。使用される脂肪組織は患者から得ることができる；すなわち、自己由来のものであってよい。その方法は、変形性関節症に関連する炎症を治療するために適用することができる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本方法は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液の投与に加えて、炎症部位にフィブリノーゲン、トロンビンおよびカルシウムを投与することを含む。例えば、方法は、（ｉ）インターロイキン−１受容体アンタゴニストおよびフィブリノーゲンを含んでなる第１の溶液と、（ｉｉ）トロンビンおよびカルシウムを含んでなる第２の溶液とを同時投与することを含み得る。
【００２４】
本方法において使用されるトロンビンは、全血または血漿およびカルシウム溶液を血液単離装置に装入することを含む方法によって作製し得る。全血または血漿は、少なくとも約２０分間、少なくとも約２０℃の温度で加熱する。加熱した全血または血漿を遠心分離することによってトロンビンを単離する。全血または血漿は患者から得ることができる。
【００２５】
また、患者において炎症性疾患を治療する方法も提供される。そのような方法は、患者から脂肪組織を得ることおよびポリアクリルアミドビーズを含む濃縮装置アセンブリーにその脂肪組織を装入することを含む。ビーズと脂肪組織の混合物は、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成するためにインキュベートされる。濃縮装置アセンブリーは、その後、そのポリアクリルアミドビーズからインターロイキン−１受容体アンタゴニストを分離しインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得る遠心速度で回転させる。全血は、患者から得られ、カルシウム溶液とともに血液単離装置に装入される。全血は、少なくとも約２０分間少なくとも約２０℃の温度で加熱する。加熱した全血を遠心分離し凝固画分を得る。その後、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液と凝固画分は患者の炎症部位に投与される。
【００２６】
治療方法は、次の側面をさらに含むことができる。ポリアクリルアミドビーズを含む濃縮装置アセンブリーへの脂肪組織の装入は、脂肪組織とともに白血球を含んでなる液体容量を装入することおよびインターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成するために、ビーズ、脂肪組織および白血球の混合物をインキュベートすることを含むことができる。白血球の液体容量は、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿であり得る。また、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液および凝固画分とともにフィブリノーゲンを患者の炎症部位に投与してもよい。少なくとも１つには変形性関節症が原因となって起こる炎症を治療するためにそれらの方法を使用することができる。
【００２７】
次に、図１に関し、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を生成するための方法１００についての概略図を示している。脂肪組織は、ステップ１１０において患者から単離される。この脂肪組織は、ステップ１３０で直接使用してよく、またはステップ１２０で処理して脂肪細胞を準備してもよい。
【００２８】
脂肪組織とは、任意の脂肪組織、白色脂肪組織または褐色脂肪組織のいずれかを意味し、その脂肪組織は、皮下、大網／内臓、乳房、生殖腺の脂肪組織または他の脂肪組織の部位から得られるものでよい。いくつかの実施形態では、脂肪組織は、吸引脂肪組織切除術または脂肪吸引術によって分離されたヒト皮下脂肪から得られるものである。脂肪細胞は、任意の好適な方法を用いて脂肪組織および／または組織部分から単離されたおよび／または遊離されたものでよく、そのような方法には、機械による破壊遠心分離などの当技術分野で公知の方法が含まれる。脂肪細胞はまた、酵素消化を用いて単離することもできる。例えば、脂肪細胞は、脂肪吸引物から単離し、音波処理および／または酵素消化によって処理し、遠心分離によって濃縮することができる。脂肪組織から単離された脂肪細胞は、洗浄し、ペレット化してよい。
【００２９】
脂肪組織および脂肪細胞を単離するための方法は、次の側面を含むことができる。約５０ｃｃの脂肪組織は、吸引による脂肪吸引チューメセント法によって、吸引ホースおよび脂肪吸引カニューレに取り付けられている専用の収集容器内に収集される。収集容器は、ガーゼタイプのグリッドフィルターを備えていてよく、そのフィルターはチューメセント液を通過させ、固形脂肪組織を保持する。脂肪組織収集後、収集容器は吸引装置から外され、遠心分離装置に再び取り付けられる。フィルターユニットは、およそ１００マイクロメートルの孔径を有するフィルターをさらに備えていてよい。一度、脂肪組織が収容されている収集容器が遠心分離装置に取り付けられたら、脂肪組織は音波処理される。音波処理後、装置全体が遠心バケットに挿入される、例えば、３００×ｇで５分間遠心分離機にかけられる。遠心分離後、収集容器はフィルターユニットとともに取り外され、廃棄することができる。脂肪細胞を含有するペレットは、その後、生体適合性溶液、例えば、自己血漿、血漿濃縮物および多血小板血漿などに再懸濁することができる。
【００３０】
脂肪組織はまた、消化酵素や、隣接する細胞間の結合を弱めるキレート化剤で処理してよく、目に見えるほどの細胞破砕なしに、脂肪組織を、脂肪細胞を含む単一細胞の懸濁液に分散させることが可能である。解離後、細胞と解離組織の懸濁液から脂肪細胞を単離することができる。
【００３１】
脂肪組織の単離および／または分画のための様々な方法および装置には、Leach et al.の米国特許第７，３７４，６７８号および同第７，１７９，３９１号およびLeach et al.の米国出願公開第２００９／００１４３９１号、同第２００８／０２８３４７４号および同第２００７／０２０８３２１号によって記載されているものが含まれる。脂肪細胞を単離するために、GPS（商標）Platelet Concentrate System(Biomet, Warsaw, IN)などの装置を使用してよい。これらの方法は、脂肪組織を得るために患者において脂肪吸引を行うことにより脂肪細胞を得ること、その脂肪組織を酵素によって消化すること、およびこれらの装置を使用して脂肪細胞を抽出しことおよび／または洗浄することを含み得る。
【００３２】
図１のステップ１３０において示されるように、脂肪組織および／または脂肪細胞はポリアクリルアミドビーズと接触させる。いくつかの実施形態では、脂肪組織および／または脂肪細胞は、白血球および血小板の液体容量の液体の一部を除去するのに有効な期間、ポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートされる。インキュベーションは、約３０秒〜約７２時間にわたって行ってよく、約２０℃〜約４１℃の温度で行ってよい。例えば、インキュベーションは、約１分〜約４８時間であってよく、約５分〜約１２時間であってよく、または約１０分〜約６時間であってよい。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約３７℃で行われる。いくつかの実施形態では、脂肪組織および／または脂肪細胞はインキュベートせず、続いて処理を行うことが必要である場合のみポリアクリルアミドビーズと接触させる。接触は、周囲条件において、例えば、約２０〜２５℃の温度で行ってよい。
【００３３】
ステップ１３０で使用されるポリアクリルアミドビーズは、ポリアクリルアミドゲルから形成された比較的均一なビーズを生産するための、当技術分野で公知の、管理され標準化されたプロトコールを用いてアクリルアミドモノマーを重合することによって形成することができる。一般的に、ポリアクリルアミドは、好適な二官能性架橋剤、最も一般的にはＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ビスアクリルアミド）を用いてアクリルアミドを重合することによって形成される。ゲル重合は、通常、過硫酸アンモニウムによって開始され、反応速度は、触媒（Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）など）の添加によって速められる。様々な実施形態では、ポリアクリルアミドビーズは、微アニオン性（負電荷）を付与する、ビーズ１ミリリットル当たり０．５マイクロモルのカルボキシル基を含んでなる。また、ビーズは、ｐＨの変化に対して一般に強く、多くの水性溶液および有機溶液中で安定している。ポリアクリルアミドゲルは、総アクリルアミド濃度を調整することによって、広範囲の孔径で形成することができる。さらに、ポリアクリルアミドビーズは多くのサイズで形成することができ、比較的均一なサイズ分布を有し得る。ビーズサイズは、直径数マイクロメートルから直径数ミリメートルまでに及んでよい。例えば、様々なタイプのBio-Gel（商標）Pポリアクリルアミドゲルビーズ(Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA)は、約４５μｍ未満から約１８０μｍまでに及ぶ粒径を有する。ポリアクリルアミドビーズは、SNF Floerger (Riceboro, Georgia, USA)、Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois, USA)およびPolymers, Inc. (Fayetteville, Arkansas, USA)からも入手可能である。
【００３４】
一度、重合したら、ポリアクリルアミドビーズは、乾燥させ粉末状形態で保存することができる。乾燥ビーズは、水に不溶であるが、再水和するとかなり膨張し得る。再水和によりポリアクリルアミドビーズはゲルコンシステンシーに戻り、乾燥状態のサイズの約２〜約３倍となる。このように、乾燥ポリアクリルアミドビーズは、液体容量の一部を吸収するために使用してよく、ビーズ孔径より小さい溶質を含み、脂肪細胞および／または脂肪組織によって生産されたＩＬ−１ｒａを濃縮するのに役立つ。例えば、ステップ１３０で乾燥ポリアクリルアミドビーズを脂肪細胞および／または脂肪組織と合わせることによって、ＩＬ−１ｒａの生産を活性化し、また、乾燥ビーズが再水和し膨張するため総液体容量が減少する。
【００３５】
本技術の機構、有用性または機能を限定することなく、ポリアクリルアミドビーズは、脂肪細胞によるＩＬ−１ｒａ生産のアクチベーターとして機能を果たす。そのため、乾燥ポリアクリルアミドビーズの場合、脂肪細胞の容量から液体を吸収し、その結果、生成されたＩＬ−１ｒａを濃縮するだけでなく、ビーズはさらに、脂肪細胞によるＩＬ−１ｒａ生産を刺激するための表面として機能を果たす。ＩＬ−１ｒａ量の増加は、サンプル容量の減少により単に濃度が上昇したことによるものではなく、ＩＬ−１ｒａの生産および／または放出を増加させるための、ポリアクリルアミドビーズによる脂肪細胞の活性化によるものであると思われる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１ｒａを生成するために、白血球を含んでなる液体容量、例えば、多血小板血漿および／または全血などもポリアクリルアミドビーズと脂肪組織および／または脂肪細胞に添加してよい。血液を遠心分離し、白血球および血小板を含有する多血小板血漿（ＰＲＰ）を単離することができ、これは沈降分離後バフィーコート層に存在し得る。ステップ１２０において多血小板血漿を単離するために使用できる装置の一例を図２に示している。
【００３７】
これに関連して、図２で示される装置２００は容器２０５（チューブなど）を備えており、その容器は、血液充填後に遠心機に置かれる。容器２０５には、アイソレーター２１０とブイ２１５を有するブイシステムが備わっている。ブイ２１５は、遠心分離の際に選択平衡位置に達するように向けられた選択密度を有し；この位置は密度が高い方の血液画分と密度が低い方の血液画分の間にある。ブイ２１５は、遠心分離の間に容器２０５内の血液を少なくとも２つの画分に分けるが、それらの画分が実質的に混合することはなく、それらの２画分の間の位置にブイが沈降することによって行われる。これに関連して、アイソレーター２１０とブイ２１５は多血小板血漿２２０を含んでなる層を明確にし、密度が低い方の乏血小板血漿２２５はアイソレーター２１０より上に一般的に分画され、密度が高い方の赤血球２３０はブイ２１５より下に一般的に分画される。遠心分離後、白血球を含有する多血小板血漿を抽出するために、シリンジまたはチューブをブイシステムの一部と相互に連結し得る。様々な実施形態では、上記装置を使用して、全血より最大約８倍高い血小板濃度と全血より最大約５倍高い白血球濃度を有する多血小板血漿を生成し得る。その多血小板血漿は、全血中に存在する白血球の約８０％〜約９０％を含んでなり得る。上記装置は市販されており、Biomet Biologies, LLC (Warsaw, Indiana, USA)のGPS（登録商標）II Platelet Concentrate SystemおよびBiomet Biologies, LLC (Warsaw, Indiana, USA)のGPS（登録商標）III Platelet Separation Systemなどがある。
【００３８】
ステップ１２０において多血小板血漿を単離するために使用し得る装置も、例えば、２００２年６月４日発行の米国特許第６，３９８，９７２号、Blasetti et al.；２００３年１１月１８日発行の米国特許第６，６４９，０７２号、Brandt et al.；２００４年９月１４日発行の米国特許第６，７９０，３７１号、Dolocek；２００６年３月１４日発行の米国特許第７，０１１，８５２号、Sukavaneshvar et al.；２００４年１２月１６日公開の米国出願公開第２００４／０２５１２１７号、Leach et al.（引用することにより本明細書の一部とされる）；２００５年５月２６日公開の米国出願公開第２００５／０１０９７１６号、Leach et al.（引用することにより本明細書の一部とされる）；２００５年９月８日公開の米国出願公開第２００５／０１９６８７４号、Dorian et al.（引用することにより本明細書の一部とされる）；および２００６年８月１０日公開の米国出願公開第２００６／０１７５２４２号、Dorian et al.（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている。
【００３９】
他の方法を使用して、多血小板血漿を単離してもよい。例えば、全血は、ブイシステムを使用せずに遠心分離することができ、全血を多段階で遠心分離してもよく、連続フロー式遠心分離法を用いることもでき、また濾過も用いることができる。加えて、血小板のペレット化を妨げるために低速遠心分離ステップを用いて赤血球から血漿を抽出することによって、多血小板血漿を含む血液成分を生産することができる。他の実施形態では、血液の遠心分離により生じるバフィーコート画分を、残留血漿から抽出し、再懸濁して多血小板血漿を形成することができる。
【００４０】
GPS（登録商標）Platelet Concentrate and Separation Systemsに加えて、他の市販装置も、ステップ１２０において多血小板血漿を単離するするために使用してよく、そのような装置には、Medtronic, Inc. (Minneapolis, Minnesota, USA)から市販されているMagellan（商標）Autologous Platelet Separator System; Harvest Technologies Corporation (Plymouth, Massachusetts, USA)から市販されているSmartPReP（商標）; DePuy (Warsaw, Indiana, USA); Cytomedix, Inc. (Rockville, Maryland, USA)から市販されているAutoloGel（商標）Process; EmCyte Corporation (Fort Myers, Florida, USA)から市販されているGenesisCS System; およびBiomet 3i, Inc. (Palm Beach Gardens, Florida, USA)から市販されているPCCS Systemが挙げられる。
【００４１】
患者から採取された血液は抗凝固薬と混合してよい。好適な抗凝固薬としては、ヘパリン、クエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、抗凝固クエン酸デキストロース溶液（ＡＣＤ）およびそれらの混合物が挙げられる。抗凝固薬は、対象からの採血に使用されるシリンジに入れてよく、または採血後に血液と混合してもよい。
【００４２】
白血球はまた、当技術分野で公知の他の方法を用いて調製してもよい。例えば、全血から、赤血球を溶解することによって、または密度勾配を利用した全血の遠心分離によって（この場合、白血球は遠心管の底に沈降する）白血球を調製してよい。密度遠心分離の例としては、Ficoll-Paque（商標）Plus(GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, New Jersey, USA)が挙げられる。場合によって、単核および多形核細胞をさらに分離するために、密度勾配を使用してよい。また、全血から濾過を用いて白血球を調製してもよい；例としては、Acelere（商標）MNC Harvest System (Pall Life Sciences, Ann Arbor, Michigan, USA)が挙げられる。白血球は骨髄から得ることもできる。
【００４３】
さらに図１に関し、ステップ１４０において示されるように、ポリアクリルアミドビーズとのインキュベーション後にＩＬ−１ｒａに富んだ溶液はそのポリアクリルアミドビーズと脂肪組織および／または脂肪細胞から単離される。単離は、液体容量を取り除きビーズを残すことによって行ってよい。場合によって、ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を取り除く前に、遠心分離によってビーズを沈降させてよい。また、濾過によって分離を行ってもよく、その場合、例えば、遠心力を用いることによってまたは真空を用いることによって、ポリアクリルアミドビーズはフィルターに保持され、ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液はそのフィルターを通過する。ステップ１３０におけるポリアクリルアミドビーズとのインキュベーションで乾燥ポリアクリルアミドビーズを利用する場合、ビーズは再水和することで膨張するために液体容量が減少し得る結果、得られたＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は濃縮される。濃度の上昇を維持するために、分離ステップ１４０では、ビーズに圧力がかからないようにまたは膨張したビーズから液体が流れ出ないように細心の注意を払うべきである。例えば、高遠心力または高真空では、ビーズがつぶれおよび／またはビーズの内部容量から液体が流れ出る可能性がある。
【００４４】
場合によって、ステップ１３０による、ポリアクリルアミドビーズとのインキュベーションと、ステップ１４０による、得られたＩＬ−１ｒａに富んだ溶液の単離とは、単一装置を使用して行ってよい。脂肪組織および／または脂肪細胞をポリアクリルアミドビーズとともにインキュベートするための装置の例を図３Ａおよび図３Ｂに示している。これに関連して、装置３００は、上方チャンバー３０５と下方チャンバー３１０を備えている。上方チャンバー３０５には端壁３１５があり、その端壁を通ってゲルビーズ撹拌器３２５の撹拌軸３２０が伸びている。また、装置３００には入口３３０もあり、その入口は端壁３１５を通って上方チャンバー３０５に達している。また、装置３００には出口３３５もあり、その出口は導管３４０と通じている。上方チャンバー３０５の床にはフィルター３４５が備わっており、フィルターの上面は乾燥した濃縮用ポリアクリルアミドビーズ３５０を支えている。
【００４５】
使用中、脂肪組織および／または脂肪細胞を含有する流体３５５は、入口３３０を介して上方チャンバー３０５に注入され、ポリアクリルアミドビーズ３５０と混合される。流体３５５とポリアクリルアミドビーズ３５０は、撹拌軸３２０およびゲルビーズ撹拌器３２５を回転させて、流体３５５とビーズ３５０を混合する手助けをすることによって混合され得る。混合された流体３５５とポリアクリルアミドビーズ３５０は、次いで、所望の温度で所望の期間インキュベートされる。装置３００は、その後、遠心分離され、その結果、液体は下方チャンバー３１０に移動し、一方、ポリアクリルアミドビーズ３５０はフィルター３４５に保持される。それによって、得られたＩＬ−１ｒａ溶液３６０からポリアクリルアミドビーズ３５０が分離され、その溶液は下方チャンバー３１０に集まる。溶液３６０は、出口３３５を介して装置から取り出される。
【００４６】
図３の例示的な装置は、２００６年８月１０日公開の米国出願公開第２００６／０１７５２６８号、Dorian et al.；および２００６年１１月２日公開の米国出願公開第２００６／０２４３６７６号、Swift et al. において開示されており；それらの米国出願公開の双方は引用することにより本明細書の一部とされる。そのような装置はBiomet Biologies, LLC (Warsaw, Indiana, USA)のPlasmax（商標）Plus Plasma Concentratorとして市販されている。
【００４７】
さらに図１に関し、ステップ１５０では、ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液はヒトまたは動物の対象（患者）に投与される。ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を受ける患者は、ステップ１１０における脂肪組織を得た同じ患者であってよい。この場合、その方法により自己由来のＩＬ−１ｒａ調製物が提供される。投与は、様々な手段を用いて、例えば、シリンジを使用したＩＬ−１ｒａに富んだ溶液の注射、外科的適用、または別の外科的手法との併用適用によって行ってよい。しかしながら、インターロイキン−１受容体の刺激に関連している作用（炎症および変形性関節症による炎症など）に影響を与えるためにＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を部位にまたは部位に近接して植え込み、注射し、あるいは投与する任意の生物医学上許容されるプロセスまたは手法を、ステップ１５０が含み得ると理解される。例えば、自己由来のＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は、関節炎による炎症を治療するために、注射を介して患者に投与され得る。注射は、炎症関節の滑膜腔にまたは炎症関節の滑膜腔内に、あるいは関節にまたは関節近くに位置づけられる。
【００４８】
本技術によって生産されたＩＬ−１ｒａに富んだ溶液の様々な調製物は、最終分離ＩＬ−１ｒａ産物を処理するための滅菌フィルターを含めることによって滅菌してよい。同様に、抗生物質を、インキュベーションの間にポリアクリルアミドビーズに含めてよく、または本明細書において記載される方法における１以上の様々なステップで添加してもよい。
【００４９】
本技術は、自己由来のＩＬ−１ｒａに富んだ濃縮血漿溶液を含む、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を調製するための改善された方法を提供し、そのような方法によって、非自己由来の材料または組換え材料を用いたときに起こる可能性がある免疫学的問題は軽減されおよび／または実質的に排除される。加えて、ＩＬ−１ｒａは患者の細胞によって生産されるため、自然翻訳後修飾（グリコシル化など）はすでに存在している。これは大部分の組換えタンパク質には当てはまらず、それらのタンパク質が原核生物宿主で生産されるためである。
【００５０】
本技術で生成されたＩＬ−１ｒａに富む溶液は、全血において一般に見られるＩＬ−１ｒａの濃度と比べてＩＬ−１ｒａの濃度が上昇しているとみなすことができる。例えば、本方法および組成物は、約３４，０００ｐｇ／ｍＬ〜約１０８，０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１ｒａを含み得るが、全血は約２００ｐｇ／ｍＬ〜約８００ｐｇ／ｍＬを含み得る。しかしながら、任意の所定の溶液中に存在する濃度は、本方法において使用される脂肪組織、脂肪細胞および／または白血球源中に存在する成分の初期レベルによって変化し得ることおよび濃度の上昇が初期レベルとの比較によるものであると理解される。一般的に、ＩＬ−１ｒａは、本溶液中に少なくとも約１０，０００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約２５，０００ｐｇ／ｍｌ、または少なくとも約３０，０００ｐｇ／ｍｌの濃度で存在し、最大１０８，０００ｐｇ／ｍＬまたはそれ以上であり得る。
【００５１】
ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は、ＩＬ−１の作用に影響を与え、インターロイキン−１受容体を介するシグナル伝達を減弱するために、投与される。ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は、多くの組織および器官で発現されるインターロイキン−１型受容体とのＩＬ−１の結合を競合的に阻害することにより、天然に存在するＩＬ−１の生物活性（関節炎に関連する炎症および軟骨破壊を含む）を遮断するために使用される。例えば、ＩＬ−１によるプロテオグリカン喪失の結果としての骨吸収および組織損傷（軟骨破壊など）は、ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液の投与によって治療することができる。関節炎を有する患者では、滑膜および滑液において内因性ＩＬ−１ｒａが、これら患者においてＩＬ−１濃度を中和するのに有効な濃度で見られない場合があり、そのため、これらの病態およびこれらの部位を治療するために、本ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液が投与される。投与量、投与および治療頻度は、効果的な治療を達成するために、確立された医療行為に基づいて変更してよい。
【００５２】
さらに図１に関し、ステップ１５０では、ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液はヒトまたは動物の対象（すなわち、患者）に投与される。ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を受ける患者は、ステップ１１０における脂肪組織を得た同じ患者であってよい。この場合、その方法により自己由来のＩＬ−１ｒａ調製物が提供される。投与は、様々な手段を用いて、例えば、シリンジを使用したＩＬ−１ｒａに富んだ溶液の注射、外科的適用、または別の外科的手法との併用適用によって行ってよい。しかしながら、インターロイキン−１受容体の刺激に関連している作用（炎症など）に影響を与えるためにＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を部位内にまたは部位に近接して植え込み、注射し、あるいは投与する任意の生物医学上許容される方法または手法を、ステップ１５０が含み得ることは理解できる。例えば、自己由来のＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は、関節炎による炎症を治療するために、注射を介して患者に投与される。注射は、炎症関節の滑膜腔にまたは炎症関節の滑膜腔内に、あるいは関節にまたは関節近くに位置づけられる。
【００５３】
本技術は、さらに、ＩＬ−１ｒａを送達するための方法を提供する。そのような送達方法では、ＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの溶液を準備する。その場合、フィブリノーゲンは活性化されフィブリンマトリックスを形成し、フィブリンマトリックスが治療部位においてＩＬ−１ｒａを保護し保持する。フィブリンマトリックスは、ＩＬ−１ｒａの送達によって、in situで形成され得る。
【００５４】
フィブリノーゲンは、凝固因子およびカルシウムによる活性化によって三次元マトリックス中に架橋され得る。好適な凝固因子としては、トロンビン（例えば、ウシ、組換えヒト、混合ヒトまたは自己由来）、自己由来凝固タンパク質およびポリエチレングリコールが挙げられる。カルシウムはカルシウム塩の形態（塩化カルシウムなど）であってよい。
【００５５】
いくつかの実施形態では、凝固因子は、自己由来凝固タンパク質を、治療する予定の患者から得られた血液から得られる凝固画分または組成物として含んでなる。好適な凝固画分は、全血または血漿をカルシウム溶液（例えば、エタノール中塩化カルシウム）とともに血液単離装置に装入すること；その全血または血漿を少なくとも約２０℃の温度で少なくとも約２０分間加熱すること；および凝固画分を分離することからなる方法によって得ることができる。単離は、加熱した全血または血漿を遠心分離することによって行ってよい。好適な分離装置を図４および図５に示している。そのような装置は、Biomet Biologies LLC (Warsaw, Indiana, USA)のClotalyst Autologous Thrombin Collection Systemとして入手可能である。
【００５６】
図４および図５に関して、血液分離装置７００は、一般的に、円筒壁と、主要チャンバー７０２を限定する第１の端７０４および第２の端７０６とを有する本体を備えている。第１の端７０４には、第１の出入口７０８、第２の出入口７１０、第３の出入口７１２、ベント７１３およびフィルター７１４が存在する。第１の出入口７０８、第２の出入口７１０、第３の出入口７１２およびベント７１３は各々、第１の端７０４を通って伸び、装置７００外部と主要チャンバー７０２との間での流体連絡を可能にする。第１の出入口７０８には、第１のキャップ７１６を付けることができ、第２の出入口７１０には、第２のキャップ７１８を付けることができ、第３の出入口７１２には、第３のキャップ７２０を付けることができる。第１の出入口７０８用の第１の交換キャップ７２２は、第１の出入口７０８に第１のテザー７２４で取り付けることができる。第１の交換キャップ７２２を使用していない場合には第１のカバー７２６を第１の交換キャップ７２２に固定することができる。第２の出入口７１０用の第２の交換キャップ７２８は、第２の出入口７１０に第２のテザー７３０で取り付けることができる。第２の交換キャップ１２８を使用していない場合には第２のカバー７３２を第２の交換キャップ７２８に固定することができる。
【００５７】
第１の出入口７０８および第２の出入口７１０各々には止め弁が備わっており、材料（ガラスビーズ７４０など）が第１の出入口７０８および第２の出入口７１０を通って主要チャンバー７０２から出ないようになっている。止め弁は、任意の好適な弁、例えば、ダックビル弁などであり得る。
【００５８】
特に図５に関して、第３の出入口７１２には伸長チューブ部分７３４があり、その伸長チューブ部分は主要チャンバー７０２内に伸びている。伸長部分７３４は、第１の端７０４から主要チャンバー７０２内の最深部まで伸び、主要チャンバー７０２内からの選択材料（トロンビンおよび他の血液凝固因子など）の回収を可能にしている。例えば、下にさらに記載するように、主要チャンバー７０２に、全血、試薬（例えば、エタノールまたは他の好適な溶媒に溶解されたカルシウム化合物を含んでなるカルシウム溶液）、抗凝固薬およびガラスビーズを含める場合には、この混合物のインキュベーションおよび遠心分離によって、主要チャンバー７０２の第２の端７０６において赤血球、血漿およびガラスビーズをほぼ含んでなる凝固塊が形成する。凝固塊の上部では、第１の端７０４に最も近い凝固塊の側面において、トロンビンおよび様々な他の凝固因子を含んでなる流出物が形成される。第２の端７０６における凝固塊は、流出物と視覚的に区別することができる。伸長チューブ部分７３４を使用してトロンビンおよび他の凝固因子を抽出するために、伸長チューブ部分７３４は、主要チャンバー７０２内の凝固塊に最も近い流出物の部分のほぼ高さとなる最深部まで伸びる。
【００５９】
伸長部分７３４の遠位端には先端部７３６が備わっている。先端部７３６は、伸長部分７３４からほぼ直角に伸びている。その先端部にはくぼみまたはノッチ７３７がある。先端部７３６あたりの伸長部分７３４から２つの支柱７３９が放射状に広がり、主要チャンバー７０２の内部と接している。支柱７３９は、主要チャンバー７０２の内部に対して先端部７３６を片寄らせ、先端部７３６を主要チャンバー７０２内の定位置に保持する。先端部７３６が主要チャンバー７０２の内部と接すると、ノッチ７３７は、主要チャンバー７０２の内壁と先端部７３６との間に開口部またはクリアランスを形成し、ノッチ７３７を通って先端部７３６内への材料の通過を可能にしている。特に、主要チャンバー７０２が傾いて先端部７３６周囲の追加材料がノッチ７３７まできたときに、先端部７３６は、伸長部分７３４を通じて回収される材料の量を最大にする手助けをする。２本の支柱７３９と先端部７３６は、主要チャンバー７０２において伸長部分７３４を中央に置く手助けをしている。
【００６０】
出入口７０８、７１０および７１２は、好適な流体送達装置または流体輸送装置（シリンジなど）と協同するようにサイジングされている。例えば、第１の出入口７０８は、試薬シリンジと協同するようにサイジングすることができ、第１の出入口７０８から主要チャンバー７０２内への試薬の通過を可能にしており；第２の出入口７１０は、血液シリンジと協同するようにサイジングすることができ、第２の出入口７１０から主要チャンバー７０２内への血液の通過を可能にしており；第３の出入口７１２は、シリンジと協同するようにサイジングすることができ、主要チャンバー７０２内からの血液成分（トロンビンおよび他の凝固因子など）の回収を可能にしている。
【００６１】
フィルター７１４は、主要チャンバー７０２内から第３の出入口７１２を通って材料が回収される際に材料を濾過するための任意の好適なフィルターであり得る。フィルター７１４にはポリエステルスクリーンが含まれ、ポリエステルスクリーンは第１の出入口７０８および第２の出入口７１０の上に取り付けられる。ポリエステルスクリーンには開口部があり、開口部のサイズは約１５ミクロン〜約２５ミクロンの範囲内である。例えば、開口部のサイズは約１７ミクロンであり得る。フィルター７１４の代わりにまたはフィルター７１４に加えて、伸長部分７３４内にまたは先端部７３６にフィルター７１４と同様のフィルターを準備することもできる。
【００６２】
主要チャンバー７０２は、アクチベーター、例えば、ガラスビーズ７４０などをさらに含む。負に帯電したガラスビーズ表面は血液凝固因子の凝固および放出を活性化し、それによって主要チャンバー７０２の第２の端７０６において凝固塊を形成する。ガラスビーズ７４０は、任意の好適なタイプのガラスビーズ、例えば、ホウケイ酸ビーズなどであり得る。
【００６３】
図５の装置を使用して凝固因子を生産するための例示的な手順は、第１の出入口７０８からの主要チャンバー７０２内への、塩化カルシウムおよびエタノールを含んでなる試薬の注入によって開始する。試薬の注入が完了したら、第１の出入口７０８は第１の交換キャップ７２２を使用して閉鎖される。抗凝固薬が加えられた血液が第２の出入口７１０から主要チャンバー７０２内に注入される。血液の注入が完了したら、第２の出入口７１０は第２の交換キャップ７２８を使用して閉鎖される。所望により、シリンジおよび血液分離装置７００は約２５℃の温度に予熱される。
【００６４】
血液成分分離装置７００の内容物は、装置７００を繰り返し（例えば、約１２回）逆さにし、血液をガラスビーズと接触させることによって混合される。混合後、その装置はインキュベートされる。インキュベーションプロセスは、装置７００の内容物の約２５℃で約１５分間の加熱を可能にする温度および期間で行われる。インキュベーション期間が完了したら、主要チャンバー７０２の第２の端７０６において赤血球、血漿およびガラスビーズの凝固塊が形成する。インキュベーションの完了後、存在し得るゲルを除去し、分解するのに十分なだけ装置７００を振盪させる。その後、残留血液成分からトロンビンを分離するために、装置７００を好適な遠心機に入れ約３２００ＲＰＭで約１５分間回転させる。遠心分離後、トロンビンおよび他の凝固因子の流出物は凝固塊から分かれる。遠心分離の完了後、第３のキャップ７２０は取り外され、第３の出入口７１２、伸長部分７３４および先端部７３６を通って主要チャンバー７０２内からトロンビンおよび他の凝固因子の流出物を取り出すために、好適な抽出装置（シリンジなど）が使用される。
【００６５】
よって、本技術の送達方法は、治療部位においてフィブリンマトリックスを形成するために、ＩＬ−１ｒａ、フィブリノーゲン、トロンビンおよびカルシウムの投与を含み得る。外因性フィブリノーゲン、例えば、ウシトロンビンなどを、好ましくは、１，０００Ｕ／ｍＬで、ＩＬ−１ｒａの溶液に添加してよい。また、ＩＬ−１ｒａ溶液は、十分な量の内因性フィブリノーゲンをすでに含んでいることもある。ＩＬ−１ｒａの溶液および／またはフィブリノーゲンまたはその調製物が抗凝固薬、例えば、ＡＣＤ−Ａ（抗凝固クエン酸デキストロース溶液）などを含む場合には、フィブリノーゲンを活性化するための（トロンビンとの）カルシウムの添加は、抗凝固薬における任意のキレート剤の有効量を超える。
【００６６】
本方法を用いて製造されるＩＬ−１ｒａに富んだ溶液は、脂肪細胞および／または脂肪組織とポリアクリルアミドビーズに全血および／または多血小板血漿がさらに加えられるときに、全血と比べての内因性フィブリノーゲン濃度の上昇をもたらすことができる。例えば、多血小板血漿、脂肪組織、ポリアクリルアミドビーズおよび図３に例示される装置を使用した上記方法の産出物は、全血と比べてＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの両方に富む溶液となる。そのような装置は、Biomet Biologies, LLC (Warsaw, Indiana, USA)のPlasmax（商標）Plus Plasma Concentratorとして市販されており、そのような装置には、２００６年８月１０日公開の米国出願公開第２００６／０１７５２６８号、Dorian et al．；および２００６年１１月２日公開の米国出願公開第２００６／０２４３６７６号、Swift et al.に記載されている使用装置および方法が含まれ；それらの米国出願公開の双方は引用することにより本明細書の一部とされる。このＩＬ−１ｒａに富みフィブリノーゲンにも富んだ溶液は、最初の全血および脂肪組織を得た患者を治療するために使用し得る；すなわち、自家移植治療。
【００６７】
全血、脂肪組織およびポリアクリルアミドビーズと、Plasmax（商標）Plus Plasma Concentratorとを使用した上記方法を用いて調製される、ＩＬ−１ｒａに富みフィブリノーゲンにも富んだ溶液は、全血と比べてフィブリノーゲン濃度が約３倍（３×）上昇している溶液を提供する。３×高い濃度のフィブリノーゲンから形成されるフィブリンマトリックス／血餅は、フィブリノーゲン基礎レベルから作製されるフィブリン塊よりも堅固であり、分解および吸収に対してより耐性がある。
【００６８】
図６に関しては、ＩＬ−１ｒａを送達するための概略図９００を示している。ステップ９１０において、ＩＬ−１ｒａの溶液が準備される。ＩＬ−１ｒａ溶液は、本開示において記載されている方法を用いて調製してよい。ステップ９２０ではＩＬ−１ｒａ溶液に外因性フィブリノーゲンが添加される。外因性フィブリノーゲンは、ＩＬ−１ｒａ溶液とは異なる供給源（異なる患者など）から調製してよく、またはウシ由来のものでもよい。また、外因性フィブリノーゲンは、ＩＬ−１ｒａ溶液とは異なる出発材料から調製してよいが、それでも同じ供給源または患者から調製してよい。例えば、ＩＬ−１ｒａ溶液および外因性フィブリノーゲンは、同じ患者から採取された異なる血液サンプルから調製してよい。あるいは、ステップ９３０で示されるように、ＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの両方が濃縮された溶液を、例えば、本明細書において記載されているように、ポリアクリルアミドビーズおよびPlasmax（商標）装置を使用することによって調製する。ステップ９４０では、トロンビンおよびカルシウムの溶液が準備され、ＩＬ−１ｒａの溶液とともに治療部位に併用投与される。その後は、ステップ９５０で示されるように、合わせられた溶液中のフィブリンがin situで架橋し、治療部位においてマトリックスを形成し、そのマトリックスがＩＬ−１ｒａを保護し、保持し、持続放出する役割を果たす。
【００６９】
ＩＬ−１ｒａの送達は、ＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの第１の溶液と、トロンビンおよびカルシウムの第２の溶液とを対象に同時投与することを含み得る。そのような実施形態では、第１の溶液と第２の溶液は、それらの溶液が混合され治療部位に注射された後に初めてフィブリノーゲンがフィブリンマトリックスを形成するように、投与まで別々に保存される。それらの溶液は、治療部位への送達直前に混合してよく、または治療部位において混合してもよい。
【００７０】
図７に関しては、医学的に適切な手順においてデュアルシリンジ装置１０００が使用されている。デュアルシリンジ装置１０００は、第１のバレル１００５と第２のバレル１０１０を備え、双方のバレルが混合チャンバー１０１５とつながっている。第１のプランジャー１０２０は第１のバレル１００５内に挿入され、第２のプランジャー１０２５は第２のバレル１０１０内に挿入される。第１のプランジャー１０２０と第２のプランジャー１０２５は部材１０３０によって連結されている。混合チャンバー１０１５はカニューレ１０３５とつながっている。デュアルシリンジ装置１０００には、第１のバレル１００５中にＩＬ−１ｒａおよびフィブリノーゲンの第１の溶液１０４０と、第２のバレル１０１０中にトロンビンおよびカルシウムの第２の溶液１０４５とが入っている。同時投与の間、第１のバレル１００５と第２のバレル１０１０双方の内容物が混合チャンバー１０１５中に押し出されるように、部材１０３０は混合チャンバー１０１５に向かって押し進められる。混合された第１の溶液１０４０と第２の溶液１０４５は、カニューレ１０３５を通って移動し、患者の関節１０６０内の治療部位１０５５においてフィブリンマトリックス１０５０を形成する。
【００７１】
図７で示される実施形態では、患者の関節１０６０は、大腿骨１０６５、脛骨１０７０、腓骨１０７５、膝蓋骨１０８０および軟骨１０８５を含む膝関節である。しかしながら、治療部位１０５５はヒト患者または動物の任意の関節内であってよく、そのような関節には肩、肘、手首、足首、股関節および脊椎が含まれると理解される。加えて、本方法は、他の組織（筋肉および腱など）内の部位における炎症を治療するためにも使用してよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、デュアルシリンジ装置１０００は、混合された第１の溶液１０４０と第２の溶液１０４５を投与するため、患者の関節１０６０の軟組織を突き通すために使用される。例えば、カニューレ１０３５は中空針（皮下注射針など）であってよい。あるいは、患者の関節１０６０において切開を行ってカニューレ１０３５の挿入が可能になるようにし、デュアルシリンジ装置８００が治療部位１０５５に入るようにしてよい。
【００７３】
いくつかの実施形態（示されていない）では、デュアルシリンジ装置１０００に混合チャンバー１０１５がなく、その代わりとして２本のカニューレ１０３５が備わっている。各カニューレは各バレルから治療部位１０５５に通じている。この場合、第１の溶液１０４０と第２の溶液１０４５は、別々のカニューレ１０３５を通って移動し、治療部位１０５５において混ざり合い、フィブリンマトリックス１０５０を形成する。いくつかの実施形態では、デュアルシリンジ装置の代わりに、２つの独立したシングルバレル型シリンジ装置が使用される。
【００７４】
本送達方法において形成されたフィブリンマトリックスは、炎症を悪化させることなく治療部位に存在することができる。フィブリンマトリックス内のＩＬ−１ｒａは酵素分解から保護されフィブリンマトリックスと結合し得ることから、そのマトリックスからＩＬ−１ｒａが経時的にゆっくりと放出される。それゆえに、そのような方法は、フィブリンマトリックス担体を含まないＩＬ−１ｒａの注射と比べて、ＩＬ−１ｒａの持続的な送達を提供することができる。
【００７５】
本技術は、２００８年２月２７日提出の米国仮出願第６１／０３１，８０３号、２００８年１１月２１日提出の米国仮出願第６１／１１６，９４０号および２００９年２月２４日提出の米国仮出願第６１／１５５，０４８号の態様を含み得るものであり、２００９年２月２７日提出の第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３５５４１号の態様を含んでいる。
【００７６】
次の具体例は、この技術の組成物および方法の作製および使用の方法の例示のために提供され、特に明記されない限り、この技術の所定の実施形態が作製されたまたは検証されたこと、あるいは作製されていないまたは検証されていないことを意味するものではない。
【実施例】
【００７７】
実施例１
脂肪細胞は次の通り調製する。脂肪組織を小片に細分し（約１ｃｍ３）、断続的に機械撹拌しながら水浴中３７℃で１８０分間、２ｍｇ／ｍＬ Ｉ型コラゲナーゼ(Worthington Biochemical Corp., Lakewood, N.J.)で消化する。培地または血液由来の溶液を加えることによって消化の効力を失わせることができる。細胞懸濁液を遠心分離機にかけ（３００×ｇ、２５℃で７分間）、続いて、細胞ペレットから上清の除去を行う。次いで、そのペレットを適合性のある溶液に再懸濁して、脂肪細胞を含んでなる液体容量を準備する。
【００７８】
あるいは、ペレットを対象から得た全血とともに懸濁し、Biomet Biologies, Inc. (Warsaw, Ind.)のGPS（商標）Platelet Concentrate Systemに加える。遠心分離後、多血小板血漿層（脂肪細胞も含む）をその装置から抽出する。
【００７９】
脂肪細胞（所望により多血小板血漿を含む）を、次いで、ポリアクリルアミドビーズと合わせて、ＩＬ−１ｒａの生産を刺激する。脂肪細胞およびポリアクリルアミドビーズをその溶液から分離して、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を得る。
【００８０】
実施例２
ＩＬ−１ｒａの治療用組成物を脂肪細胞から生成する。脂肪吸引処置(lipoaspiration/liposuction procedures)からヒト皮下脂肪組織を得、３７℃で１時間緩やかに撹拌しながらＩ型コラゲナーゼ溶液(Worthington Biochemical Corp., Lakewood, N.J.)でその組織を消化することによりヒト脂肪細胞の単離を行う。解離細胞を５００μｍおよび２５０μｍのＮｉｔｅｘフィルターで濾過する。その画分を３００×ｇで５分間遠心分離機にかける。上清を廃棄し、細胞ペレットを適合性のある溶液（血液由来の溶液など）に再懸濁する。
【００８１】
図３Ａおよび図３Ｂで示されるような装置において脂肪細胞をポリアクリルアミドビーズと合わせる。脂肪細胞を含有する流体３５５を、入口３３０を介して上方チャンバーに注入し、ポリアクリルアミドビーズ３５０と混合する。流体３５５とポリアクリルアミドビーズ３５０は、撹拌軸３２０およびゲルビーズ撹拌器３２５を回転させて、流体３５５とビーズ３５０を混合する手助けをすることによって混合し得る。混合した流体３５５とポリアクリルアミドビーズ３５０を、次いで、所望の温度で所望の期間インキュベートする。装置３００を、その後、遠心分離機にかけると、液体は下方チャンバー３１０に移動し、一方、ポリアクリルアミドビーズ３５０はフィルター３４５に保持される。それによって、得られたＩＬ−１ｒａ溶液３６０からポリアクリルアミドビーズ３５０が分離され、その溶液は下方チャンバー３１０に集まる。ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液３６０は、出口３３５を介して装置から取り出し得る。
【００８２】
実施例３
ＩＬ−１ｒａに富んだ溶液を次の通り作出する。患者から脂肪吸引術により脂肪組織を採取する。ＡＣＤ−Ａ(Braintree, Massachusetts, USA)（１０％）で抗凝固処理した全血（７０ｍＬ）を患者から採取する。全血測定用に一部（１０ｍＬ）を確保する。GPS（登録商標）II System (Biomet Biologies, LLC, Warsaw, Indiana, USA)を使用して多血小板血漿（ＰＲＰ）（６ｍＬ）を生産する。Woodell-May JE, Ridderman DN, Swift MJ, Higgins J. "Producing Accurate Platelet Counts for Platelet Rich Plasma: Validation of a Hematology Analyzer and Preparation Techniques for Counting" J Craniofac Surg (2005) Sep. 16(5):749-56に記載されているように、検証済みの手順に従って、全血サンプルおよびＰＲＰサンプルについて全血球計算値（ＣＢＣ）を収集する。
【００８３】
脂肪組織（約５グラム）およびＰＲＰ（約５ｍＬ）を改良型血漿濃縮装置(Plasmax（商標）, Biomet Biologies LLC, Warsaw, Indiana, USA)に加え、装置内でポリアクリルアミド乾燥ビーズとともに室温で２４時間インキュベートする。インキュベーション後、血漿濃縮装置を遠心分離機にかけて、ＩＬ−１ｒａに富む溶液を分離する。
【００８４】
ゼロ時点でのＩＬ−１ｒａ基礎レベルを分析するために、脂肪組織、ＰＲＰおよびポリアクリルアミドサンプルを５０μＬのトロンビンおよび１０％ＣａＣｌ２（１，０００単位／ｍＬ）で活性化する。血餅が形成され、それを室温で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、血餅を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかける。血餅から血清を収集し、ＥＬＩＳＡ分析用に確保する。血漿濃縮装置からのＩＬ−１ｒａに富んだ溶液はトロンビンによる活性化を必要としないため直接試験する。総てのサンプルをＩＬ−１ｒａについて、ＥＬＩＳＡキット(IL-1ra Quantikine（商標）Kit, R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)を使用して分析する。
【００８５】
例示データを平均±標準偏差として示す。統計的有意性をスチューデントｔ−検定（ａ＝０．０５）により評価する。相関分析を用いて、ＩＬ−１ｒａ産出物および全血球計算値（ＣＢＣ）データを比較する。
【００８６】
ポリアクリルアミドビーズとの脂肪組織およびＰＲＰのインキュベーションから生成されるＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１ｒａレベルの上昇をもたらす。ＩＬ−１ｒａの血清基礎値（２１７±９８ｐｇ／ｍＬ）は、ドナー間で大きな変動があるにしても、Meijer H, Reinecke J, Becker C, Tholen G, Wehling P. "The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction" Inflamm. Res. 2003 Oct; 52(10): 404-7に記載されている、別の研究で認められた結果（７３±４．８ｐｇ／ｍＬ）と同様である。ポリアクリルアミドビーズとの脂肪組織およびＰＲＰのインキュベーション後の血漿濃縮装置の産出物では、ＩＬ−１ｒａ血清レベルは、血清基礎レベルと比べて統計的に高い。例えば、血漿濃縮装置でのポリアクリルアミドビーズとの脂肪組織およびＰＲＰの２４時間のインキュベーションでは、ＡＣＳ装置での２４時間のインキュベーションからすでに報告されているデータ（１０，２５４±１６５ｐｇ／ｍＬ）より高いＩＬ−１ｒａ量（約３６，０００ｐｇ／ｍＬ）となる。
【００８７】
実施例４
脂肪組織（１２０ｇ）を収集し、GPS（登録商標）III disposables (Biomet Biologies LLC, Warsaw, Indiana, USA)を使用して調製する。単離脂肪組織を改良型血漿濃縮装置(Plasmax（登録商標）、Biomet Biologies LLC, Warsaw, Indiana, USA)に装入し、処理する。産出物を４群に分ける；濃縮血漿中のＩＬ−１ｒａ（トロンビンによる活性化（１Ｍ ＣａＣｌ２中１０００Ｕ／ｍｌ）を行う）および濃縮血漿中のＩＬ−１ｒａ（トロンビンによる活性化（１Ｍ ＣａＣｌ２中１０００Ｕ／ｍｌ）を行わない）、または無細胞ＩＬ−１ｒａ（トロンビンによる活性化を行う）および無細胞ＩＬ−１ｒａ（トロンビンによる活性化を行わない）。ＥＬＩＳＡ(R&D Systems)を使用して経時的にＩＬ−１ｒａを測定する。
【００８８】
非凝固サンプルは、２４時間かけて平均４７．１±２．１ｎｇを生産する（ｐ＝０．３４）。無細胞サンプルは、変化することなく、２４時間かけて３３．７±１．５ｎｇを生産する（ｐ＝０．３８）。一度、凝固したら、ＩＬ−１ｒａの溶出は遅延し、１０時間後に２８％しか溶出されない。無細胞サンプルでの放出も遅延するが、１０時間後には利用可能なＩＬ−１ｒａの１００％が溶出される。
【００８９】
本明細書において記載される実施例および他の実施形態は、例示であり、本技術の組成物および方法の総ての範囲の説明において限定することを目的としていない。特定の実施形態、材料、組成物および方法の等価の変更、修飾および変形は、本技術の範囲内で行うことができ、実質的に同様の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法であって、
（ａ）脂肪細胞を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させること；および
（ｂ）該液体容量を該ポリアクリルアミドビーズおよび該脂肪細胞から分離して、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
脂肪細胞を含んでなる液体容量が、単離された脂肪組織の一部である、請求項１に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項３】
前記接触が、脂肪細胞を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズとともに約３０秒〜約２４時間の期間インキュベートすることを含んでなる、請求項１に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項４】
前記接触が、白血球を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させることをさらに含んでなる、請求項１に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項５】
前記白血球を含んでなる液体容量が、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿である、請求項４に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項６】
前記分離が、脂肪細胞の液体容量およびポリアクリルアミドビーズを遠心分離し、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を含んでなる上清を得ることを含んでなる、請求項１に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項７】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液が、約３０，０００ｐｇ／ｍＬ〜約１１０，０００ｐｇ／ｍＬのインターロイキン−１受容体アンタゴニストを含んでなる、請求項１に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項８】
患者において炎症性疾患を治療するためのインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法であって、
（ａ）患者から脂肪組織を得ること；
（ｂ）ポリアクリルアミドビーズを含む濃縮装置アセンブリーに該脂肪組織を装入し、ポリアクリルアミドビーズおよび脂肪組織の混合物をインキュベートし、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成すること；
（ｃ）インターロイキン−１受容体アンタゴニストを該ポリアクリルアミドビーズおよび脂肪組織から分離する遠心速度で該濃縮装置アセンブリーを回転させ、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項９】
前記装入が、脂肪組織をポリアクリルアミドビーズとともに約３０秒〜約２４時間の期間インキュベートすることを含んでなる、請求項８に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項１０】
前記装入が、白血球を含んでなる液体容量を濃縮装置アセンブリーに装入することをさらに含んでなる、請求項８に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項１１】
前記白血球を含んでなる液体容量が、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿である、請求項１０に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項１２】
患者における炎症部位の治療方法であって、
（ａ）脂肪細胞を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させること；
（ｂ）該液体容量を該ポリアクリルアミドビーズおよび該脂肪細胞から分離し、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得ること；および
（ｃ）該インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を、患者における炎症部位に投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項１３】
前記脂肪組織が、患者から由来のものである、請求項１２に記載の患者における炎症部位の治療方法。
【請求項１４】
前記炎症が、変形性関節症に関連する、請求項１２に記載の患者における炎症部位の治療方法。
【請求項１５】
前記投与が、炎症部位にフィブリノーゲン、トロンビン、およびカルシウムを投与することをさらに含んでなる、請求項１２に記載の患者における炎症部位の治療方法。
【請求項１６】
前記投与が、（ｉ）インターロイキン−１受容体アンタゴニストおよびフィブリノーゲンを含んでなる第１の溶液と、（ｉｉ）トロンビンおよびカルシウムを含んでなる第２の溶液とを同時投与することを含んでなる、請求項１２に記載の患者において炎症部位の治療方法。
【請求項１７】
前記トロンビンが、
（ａ）全血または血漿およびカルシウム溶液を血液単離装置に装入すること;
（ｂ）該全血または血漿を少なくとも約２０℃の温度で少なくとも約２０分間加熱すること；および
（ｃ）加熱した全血または血漿を遠心分離することによってトロンビンを単離すること
を含んでなる方法によって作製される、請求項１５に記載の患者における炎症部位の治療方法。
【請求項１８】
前記全血または血漿が、患者から得られる、請求項１７に記載の患者における炎症部位の治療方法。
【請求項１９】
患者における炎症性疾患の治療方法であって、
（ａ）患者から脂肪組織を得ること；
（ｂ）ポリアクリルアミドビーズを含む濃縮装置アセンブリーに該脂肪組織を装入し、ビーズおよび脂肪組織の混合物をインキュベートして、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成すること；
（ｃ）インターロイキン−１受容体アンタゴニストを該ポリアクリルアミドビーズから分離する遠心速度で該濃縮装置アセンブリーを回転させ、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得ること；
（ｄ）患者から全血を得ること；
（ｅ）該全血およびカルシウム溶液を血液単離装置に装入すること;
（ｆ）該全血を少なくとも約２０℃の温度で少なくとも約２０分間加熱すること；
（ｇ）加熱した全血を遠心分離し、凝固画分を得ること；および
（ｈ）該インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液および該凝固画分を、患者における炎症部位に投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
前記装入が、前記脂肪組織とともに白血球を含んでなる液体容量を、ポリアクリルアミドビーズを含む前記濃縮装置アセンブリーに装入し、ビーズ、脂肪組織、および白血球の混合物をインキュベートして、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成することをさらに含んでなる、請求項１９に記載の患者における炎症性疾患の治療方法。
【請求項２１】
前記白血球を含んでなる液体容量が、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿である、請求項２０に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項２２】
前記投与が、患者における炎症部位にフィブリノーゲンを投与することをさらに含んでなる、請求項１９に記載のヒト対象における炎症性疾患の治療方法。
【請求項２３】
前記炎症部位が、少なくとも１つには変形性関節症によるものである、請求項１９に記載のヒト対象における炎症性疾患の治療方法。
【請求項２４】
対象における炎症の治療に用いる組成物であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって作製される、組成物。
【請求項２５】
前記液体容量が、対象から得られる全血または血漿である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記炎症が、変形性関節症によるものである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項１】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法であって、
（ａ）脂肪細胞を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させること；および
（ｂ）該液体容量を該ポリアクリルアミドビーズおよび該脂肪細胞から分離して、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
脂肪細胞を含んでなる液体容量が、単離された脂肪組織の一部である、請求項１に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項３】
前記接触が、脂肪細胞を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズとともに約３０秒〜約２４時間の期間インキュベートすることを含んでなる、請求項１に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項４】
前記接触が、白血球を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させることをさらに含んでなる、請求項１に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項５】
前記白血球を含んでなる液体容量が、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿である、請求項４に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項６】
前記分離が、脂肪細胞の液体容量およびポリアクリルアミドビーズを遠心分離し、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を含んでなる上清を得ることを含んでなる、請求項１に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項７】
インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液が、約３０，０００ｐｇ／ｍＬ〜約１１０，０００ｐｇ／ｍＬのインターロイキン−１受容体アンタゴニストを含んでなる、請求項１に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項８】
患者において炎症性疾患を治療するためのインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法であって、
（ａ）患者から脂肪組織を得ること；
（ｂ）ポリアクリルアミドビーズを含む濃縮装置アセンブリーに該脂肪組織を装入し、ポリアクリルアミドビーズおよび脂肪組織の混合物をインキュベートし、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成すること；
（ｃ）インターロイキン−１受容体アンタゴニストを該ポリアクリルアミドビーズおよび脂肪組織から分離する遠心速度で該濃縮装置アセンブリーを回転させ、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項９】
前記装入が、脂肪組織をポリアクリルアミドビーズとともに約３０秒〜約２４時間の期間インキュベートすることを含んでなる、請求項８に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項１０】
前記装入が、白血球を含んでなる液体容量を濃縮装置アセンブリーに装入することをさらに含んでなる、請求項８に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項１１】
前記白血球を含んでなる液体容量が、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿である、請求項１０に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項１２】
患者における炎症部位の治療方法であって、
（ａ）脂肪細胞を含んでなる液体容量をポリアクリルアミドビーズと接触させること；
（ｂ）該液体容量を該ポリアクリルアミドビーズおよび該脂肪細胞から分離し、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得ること；および
（ｃ）該インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を、患者における炎症部位に投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項１３】
前記脂肪組織が、患者から由来のものである、請求項１２に記載の患者における炎症部位の治療方法。
【請求項１４】
前記炎症が、変形性関節症に関連する、請求項１２に記載の患者における炎症部位の治療方法。
【請求項１５】
前記投与が、炎症部位にフィブリノーゲン、トロンビン、およびカルシウムを投与することをさらに含んでなる、請求項１２に記載の患者における炎症部位の治療方法。
【請求項１６】
前記投与が、（ｉ）インターロイキン−１受容体アンタゴニストおよびフィブリノーゲンを含んでなる第１の溶液と、（ｉｉ）トロンビンおよびカルシウムを含んでなる第２の溶液とを同時投与することを含んでなる、請求項１２に記載の患者において炎症部位の治療方法。
【請求項１７】
前記トロンビンが、
（ａ）全血または血漿およびカルシウム溶液を血液単離装置に装入すること;
（ｂ）該全血または血漿を少なくとも約２０℃の温度で少なくとも約２０分間加熱すること；および
（ｃ）加熱した全血または血漿を遠心分離することによってトロンビンを単離すること
を含んでなる方法によって作製される、請求項１５に記載の患者における炎症部位の治療方法。
【請求項１８】
前記全血または血漿が、患者から得られる、請求項１７に記載の患者における炎症部位の治療方法。
【請求項１９】
患者における炎症性疾患の治療方法であって、
（ａ）患者から脂肪組織を得ること；
（ｂ）ポリアクリルアミドビーズを含む濃縮装置アセンブリーに該脂肪組織を装入し、ビーズおよび脂肪組織の混合物をインキュベートして、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成すること；
（ｃ）インターロイキン−１受容体アンタゴニストを該ポリアクリルアミドビーズから分離する遠心速度で該濃縮装置アセンブリーを回転させ、インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を得ること；
（ｄ）患者から全血を得ること；
（ｅ）該全血およびカルシウム溶液を血液単離装置に装入すること;
（ｆ）該全血を少なくとも約２０℃の温度で少なくとも約２０分間加熱すること；
（ｇ）加熱した全血を遠心分離し、凝固画分を得ること；および
（ｈ）該インターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液および該凝固画分を、患者における炎症部位に投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
前記装入が、前記脂肪組織とともに白血球を含んでなる液体容量を、ポリアクリルアミドビーズを含む前記濃縮装置アセンブリーに装入し、ビーズ、脂肪組織、および白血球の混合物をインキュベートして、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの溶液を形成することをさらに含んでなる、請求項１９に記載の患者における炎症性疾患の治療方法。
【請求項２１】
前記白血球を含んでなる液体容量が、全血、多血小板血漿、または全血および多血小板血漿である、請求項２０に記載のインターロイキン−１受容体アンタゴニストに富む溶液を生成するための方法。
【請求項２２】
前記投与が、患者における炎症部位にフィブリノーゲンを投与することをさらに含んでなる、請求項１９に記載のヒト対象における炎症性疾患の治療方法。
【請求項２３】
前記炎症部位が、少なくとも１つには変形性関節症によるものである、請求項１９に記載のヒト対象における炎症性疾患の治療方法。
【請求項２４】
対象における炎症の治療に用いる組成物であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって作製される、組成物。
【請求項２５】
前記液体容量が、対象から得られる全血または血漿である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記炎症が、変形性関節症によるものである、請求項２４に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５０２９２９（Ｐ２０１３−５０２９２９Ａ）
【公表日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２６９８８（Ｐ２０１２−５２６９８８）
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６８２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３１５２４
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５１０２０６１９８）バイオメット、バイオロジクス、リミテッド、ライアビリティー、カンパニー (4)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＴ ＢＩＯＬＯＧＩＣＳ， ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６８２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３１５２４
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５１０２０６１９８）バイオメット、バイオロジクス、リミテッド、ライアビリティー、カンパニー (4)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＴ ＢＩＯＬＯＧＩＣＳ， ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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