インターロイキン１０産生促進剤
【課題】ＩＬ−１０の産生を促進させる作用を有し、且つ、長期に渡って摂取可能な安全性の高い医薬、飲食品を提供すること。
【解決手段】ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物と、ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌を組み合わせてなるＩＬ−１０産生促進剤。
【解決手段】ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物と、ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌を組み合わせてなるＩＬ−１０産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン（以下、ＩＬ−ということもある）１０の産生不足による疾患の予防又は治療薬として有用なＩＬ−１０産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌、ウィルス等の微生物の感染、腫瘍、細胞傷害などに対して生体は免疫反応によって対応するが、その免疫反応は、免疫担当細胞間の直接的あるいは間接的な相互作用により調節されている。そして、免疫応答の調節にはリンパ球、マクロファージ等が産生するインターロイキン、ＴＮＦ−α等のサイトカインが重要な役割を演じている。
【０００３】
現在、インターロイキンに属するサイトカインとしては２９種類が知られているが、その一つであるＩＬ−１０については次のような作用が確認されている。
【０００４】
（１）単球／マクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α産生を抑制する。
（２）単球／マクロファージからのＩＬ−１レセプターアンタゴニストの産生を増強する。
（３）単球／マクロファージのＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子、ＣＤ８６分子の発現を抑制する。
（４）Ｔ細胞の増殖を抑制する。
（５）Ｔ細胞からのＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５産生を抑制する。
（６）ＩＬ−１０産生調節性Ｔ細胞を誘導する。
（７）好酸球、好中球、マスト細胞からのＩＬ−１、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α産生を抑制する。
（８）ＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強する。
（９）Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を抑制し、ＩｇＧ産生を増強する。
【０００５】
これらの作用があることにより、ＩＬ−１０は自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、乾癬、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍など、多くの疾患の予防、治療に利用可能になるものと期待されている。
【０００６】
プロバイオティクスによりＩＬ−１０の産生を誘導する試みとしては、ラクトコッカス属乳酸菌によるＩＬ−１０産生の誘導（特許文献１）、ラクトバチルス・アシドフィルス菌株によるＩＬ−１０産生の誘導（特許文献２）等が報告されているが、これらのいずれについても未だ十分な効果は得られていない。
【特許文献１】特開２００５−１５４３８７号公報
【特許文献２】特開２００４−２７７３８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明の目的は、ＩＬ−１０の産生不足による疾患、例えば自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、乾癬、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍等の予防・治療に有用であり、かつ日常的に使用できる安全な医薬、飲食品に利用できるＩＬ−１０産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、全く意外なことに、（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物と、（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌を組み合わせたときＩＬ−１０の産生が顕著に促進されることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物と、（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌を組み合わせてなるＩＬ−１０産生促進剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＩＬ−１０産生促進剤は、長期間経口摂取しても安全であり、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、乾癬、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍等のＩＬ−１０産生不足による多くの疾患の予防と治療の目的に有効かつ安全に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、「ＩＬ−１２産生誘導能を有さない」とは、被験物質をマウス腹腔マクロファージ系に添加して２４時間培養後に上清を回収し、上清中のＩＬ−１２ｐ７０の濃度をＥＬＩＳＡで定量したとき、１０ｎｇ／ｍｌ未満であることを意味し、特に３ｎｇ／ｍｌ未満であるのが好ましい。「ＩＬ−１２産生誘導能を有する」とは同系においてＩＬ−１２ｐ７０濃度が１０ｎｇ／ｍｌ以上であることを意味し、特に２０ｎｇ／ｍｌ以上であるのが好ましい。
【００１２】
本発明において、「微生物」とは細菌菌体、酵母菌体及び不活化ウィルスを含む意味に用いられ、「微生物処理物」とは用いられる細菌、酵母又はウィルスに何らかの処理を加えたものをいい、その処理は特に限定されない。前記処理物としては、具体的には、微生物の超音波などによる破砕液、微生物の酵素処理液、それらを濾過ないし遠心分離など固液分離手段によって分離した固体残渣等が挙げられる。また、細胞壁又はウイルス膜を酵素もしくは機械的手段により除去した処理液、これらの濃縮物、これらの希釈物またはこれらの乾燥物なども含まれる。また、微生物を界面活性剤等によって溶解した後、エタノール等によって沈殿させて得られる核酸含有画分も含まれる。さらに、前記微生物の超音波などによる破砕液、細胞の酵素処理液などに対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの分離・精製処理をさらに行ったものも含まれる。さらに、細菌菌体及び酵母菌体では死菌体も含まれ、該死菌体は、例えば、加熱処理、抗生物質などの薬物による処理、ホルマリンなどの化学物質による処理、紫外線による処理、γ線などの放射線による処理により得ることができる。これら処理のうち、特に超音波処理、酵素処理、加熱処理が好ましい。
さらに、前記処理物は、化学的に合成されたもの、例えばＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、イミダゾキノリン系化合物、イミダゾキノリン系化合物及びリポペプチド等であってもよく、具体的には、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ等のＤＮＡ、ポリウリジン等の一本鎖ＲＮＡは市販の核酸合成装置により合成することが可能であり、イミダゾキノリン系化合物は、自体公知の方法により製造することが可能であり、Pam3-Cys-Ser-Lys4、Pam2-Cys-Gly-Asp-Pro-Lys-His-Pro-Lys-Ser-Phe等のリポペプチドは公知のペプチド合成法（固相合成法、液相合成法等）を利用して製造することもできる。
【００１３】
本発明において、（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物としては、菌体消化酵素による消化率が３０％以上の細菌若しくは酵母又は微生物処理物が挙げられる。一方、（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌としては、菌体消化酵素による消化率が１０％以下の細菌が挙げられる。
本発明において、「菌体消化酵素による消化率」とは、Ｎ−アセチルムラミダーゼの一種であるＭ−１酵素（ＥＣ ３．２．１．１７）による消化試験を行った際の被験物質の消化率を意味する。具体的には、以下に示す消化試験を行い、被験物質の消化率を算出することができる。
まず、４ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・マレイト緩衝液（ｐＨ７．０）中に被験物質を２ｍｇ／ｍｌで懸濁し、Ｍ−１酵素を添加（１０μｇ／ｍｌ）して３７℃で１０分反応を行った後、１００℃、５分の加熱処理により酵素活性を失活させた。反応液に対してＳＤＳ溶液を添加し（終濃度２％）、ボルテックスにて十分攪拌してプロトプラスト状の被験物質を溶解させた後、濁度（ＯＤ６００）を測定した。消化率の算出には以下の式を用いた。
【００１４】
【数１】
【００１５】
（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌としては、例えば、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガッセリ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・デルブルッキー、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、スタフィロコッカス・アウレウス、大腸菌等が挙げられる。細菌のうち、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、スタフィロコッカス・アウレウス、大腸菌が好ましく、（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌との併用により特に強くＩＬ−１０の産生を誘導する点から特にラクトバチルス・プランタラムが好ましい。
（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない酵母としては、特に限定されないが、例えば、サッカロマイセス・セルビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンスが挙げられ、サッカロマイセス・セルビシエを好適に用いることができる。
【００１６】
（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない微生物処理物としては、特に限定されないが、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、スタフィロコッカス・アウレウス、大腸菌等の細菌、サッカロマイセス・セルビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス等の酵母及びインフルエンザウイルス等の不活化ウィルス等の微生物の処理物が挙げられる。このうち、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８又はＴＬＲ９のリガンドとなり得る処理物が好ましく、当該処理物としては、例えば、ペプチドグリカン、プロトプラスト、ザイモサン、リポテイコ酸、細胞壁テイコ酸、リポポリサッカライド、ＤＮＡ（非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ等）、一本鎖ＲＮＡ（ポリウリジン等）、イミダゾキノリン化合物（ガルディモッド等）、リポタンパク質、リポペプチド（Pam3-Cys-Ser-Lys4、Pam2-Cys-Gly-Asp-Pro-Lys-His-Pro-Lys-Ser-Phe等）、リポマンナン、リポアラビノマンナン、ムラミルジペプチド、マイコバクテリウムボビス、ＯＫ−４３２、丸山ワクチン等が挙げられ、ペプチドグリカン、プロトプラスト、ザイモサン、リポテイコ酸、細胞壁テイコ酸、リポポリサッカライド、ＤＮＡ（非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ等）、イミダゾキノリン化合物（ガルディモッド等）がさらに好ましく、（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌との併用により特に強くＩＬ−１０の産生を誘導する点及び取り扱いやすさ等から特にペプチドグリカン、プロトプラスト、リポテイコ酸、リポポリサッカライド、ＤＮＡ、イミダゾキノリン化合物が好ましい。このイミダゾキノリン化合物としては、例えばガルディモッド、イミクイモッド、Ｒ８４８等が挙げられ、特にガルディモッドが好ましい。また、このＤＮＡとしては特に限定されないが、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡを好適に用いることができる。
【００１７】
（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌としては、例えばラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ゼアエ等のラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌が挙げられる。（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物との併用により特に強くＩＬ−１０の産生を誘導する点から、特にラクトバチルス・カゼイが好ましい。
【００１８】
成分（Ａ）や（Ｂ）に細菌又は酵母を使用する場合、細菌又は酵母の形態は特に制限されず、生菌又は加熱菌体（死菌体）のいずれでもよく、又凍結乾燥したものであってもよく、あるいはこれらを含む培養物として利用することもできる。ここで、本発明の成分（Ａ）、（Ｂ）は各々１種でもよいし、２種以上用いてもよい。
【００１９】
本発明の成分（Ａ）と（Ｂ）を組み合わせると、全く意外にも強力なＩＬ−１０産生促進作用を奏する。従って、本発明のＩＬ−１０産生促進剤は、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、乾癬、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍等の様々な疾病の治療や改善、或いはその予防等の目的に利用できる。
ここで、ＩＬ−１０産生促進作用を有するとは、次式により求められるＩＬ−１０産生増加能が１３０％以上のものを意味し、好ましくは１５０％以上のものを意味する。
【００２０】
【数２】
【００２１】
本発明において成分（Ａ）と（Ｂ）との組み合わせによって、ＩＬ−１０産生が促進されるメカニズムは明らかではないが、成分（Ａ）及び（Ｂ）のマクロファージにおける消化性の差が影響していることが考えられる。すなわち、成分（Ａ）はマクロファージ内で速やかに消化され、菌体等の消化産物がマクロファージ内に速やかに蓄積し、成分（Ｂ）は逆にゆっくりと消化され、マクロファージ内に長時間菌体のまま保持される。ここで本発明者らはマクロファージによる消化性とＩＬ−１２産生誘導能には負の相関があることを見出しており、易消化性である成分（Ａ）はＩＬ−１２産生をほとんど誘導せず、難消化性である成分（Ｂ）は強くＩＬ−１２を誘導する。マクロファージからのＩＬ−１０産生は、複数のステップにより制御されているが、菌体等の消化産物と未消化の菌体は各々別のステップのトリガーになっており、両者、つまり成分（Ａ）、（Ｂ）共に存在するとマクロファージからのＩＬ−１０産生が強く誘導されるものと考えられる。また、ＴＬＲリガンドも、上記の菌体等の消化産物と同様に、未消化の菌体とは別のステップのトリガーになっていると考えられる。
【００２２】
特に、上記成分（Ａ）及び（Ｂ）がヒトの腸内フローラを構成するものであったり、酪農乳製品に古くから利用されてきた乳酸菌やビフィズス菌からなるものである場合は、長期間経口摂取しても安全であるだけでなく、整腸作用、抗腫瘍作用、抗変異作用、血圧低下作用、抗潰瘍作用、コレステロール低下作用等、乳酸菌やビフィズス菌に期待される周知の有用作用を複合的に作用させることができ、好適に利用することができる。
【００２３】
さらに、本発明のＩＬ−１０産生促進剤は炎症性サイトカインであるＩＬ−１２の産生を抑制する効果を奏することが明らかになっており、上記各種疾患の治療や改善、或いはその予防がさらに容易になることが期待される。
【００２４】
本発明のＩＬ−１０産生促進剤は経口投与又は非経口投与のいずれも使用できるが、経口投与が望ましい。投与に関しては、有効成分である成分（Ａ）及び（Ｂ）を投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。
【００２５】
本発明のＩＬ−１０産生促進剤の有効成分である成分（Ａ）及び（Ｂ）を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、その好適な投与量は成分（Ａ）、（Ｂ）（細菌又は酵母）については乾燥重量で１日当たり１μｇ〜１０ｇ（菌体数では１０6〜１０13ｃｆｕ）、より好ましくは１ｍｇ〜１ｇ（菌体数では１０9〜１０12ｃｆｕ）である。また成分（Ａ）（微生物処理物）については１日当たり１μｇ〜１０ｇ、より好ましくは１ｍｇ〜１ｇである。このとき、成分（Ａ）と（Ｂ）との配合比率に厳格な制限はないが、成分（Ａ）：成分（Ｂ）は１：０．０３〜３０が好ましく、より好ましくは１：０．３〜１０である。
【００２６】
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固体剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２７】
また、本発明のＩＬ−１０産生促進剤は、上記のような医薬品製剤として用いるだけでなく、飲食品等として用いることもできる。この場合には、本発明の成分（Ａ）及び（Ｂ）をそのまま、または種々の栄養成分を加えて、飲食品中に含有せしめればよい。この飲食品は、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、乾癬、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍等の改善、予防等に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品又はその容器には、前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。具体的に本発明のＩＬ−１０産生促進剤を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。
【００２８】
さらに飲食品としては、有効成分である細菌又は酵母を含有する発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵乳製品が好適に用いられる。これら発酵乳飲食品の製造は定法に従って製造することができる。例えば発酵乳は、殺菌した乳培地に成分（Ａ）及び（Ｂ）を接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。この時、他の微生物と同時に接種培養してもよい。次いで別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品とすることができる。このようにして得られる発酵乳は、プレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。
【００２９】
また、本発明のＩＬ−１０産生促進剤においては、成分（Ａ）、（Ｂ）は同時に投与してもよく、或いは、成分（Ａ）又は（Ｂ）のどちらか一方を先に投与してもよい。特に同時に投与するのが好ましく、ヒトを含むあらゆる哺乳動物に適用できる。従って、成分（Ａ）のみを含有する組成物と成分（Ｂ）のみを含有する組成物を別個にしてもよく、成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する組成物としてもよい。
【実施例】
【００３０】
以下、試験例及び実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。
【００３１】
試験例１
（１）細菌及び微生物処理物
ラクトバチルス・カゼイ（ＹＩＴ ９０２９）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（ＹＩＴ ４０６５）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（ＹＩＴ ４００７）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＡＴＣＣ ７４６９）、ラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ １４９１７）、ラクトバチルス・アシドフィルス（ＡＴＣＣ ４３５６）について、ラクトバチルス属乳酸菌は２００ｍｌのＤｉｆｃｏTM Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ培地（ＢＤ社）を用いて、また、ビフィズス菌は１％グルコースを含む２００ｍｌのＧＡＭ培地（ニッスイ）を用いて、それぞれ３７℃で２０時間培養した。菌体は遠心分離（８０００回転、１０分）により集菌し、滅菌ミリＱ水を用いて遠心洗浄を３回繰り返した後、２００ｍｌの滅菌ミリＱ水に懸濁して、１００℃で３０分間の加熱処理をした後、凍結乾燥した。ホルマリン固定化スタフィロコッカス・アウレウス（商品名：パンソルビン）はカルビオケミ社より、ホルマリン固定化大腸菌（ＡＴＣＣ １１３０３）及びスタフィロコッカス・アウレウス由来のペプチドグリカンはシグマ社より、酵母（サッカロマイセス・セルビシエ）由来のザイモサンはモレキュラープローブ社よりそれぞれ購入した。
細菌由来のプロトプラストの調製方法としては、特に限定されないが、具体的には以下に示す方法を好適に用いることができる。グラム陽性菌加熱死菌体を４ｍＭの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・マレイト緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、Ｍ−１酵素を添加して３７℃で１６時間反応させて、細胞壁を消化させた。遠心分離により不溶性成分を回収してプロトプラストとした。
細菌由来の細胞壁テイコ酸の調製方法としては、特に限定されないが、具体的には以下に示す方法を好適に用いることができる。ラクトバチルス・プランタラムやスタフィロコッカス・アウレウス等の細胞壁にテイコ酸を含有するグラム陽性菌加熱死菌体を４ｍＭの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・マレイト緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、Ｍ−１酵素を添加して３７℃で１６時間反応させて、細胞壁を消化させた。遠心分離により不溶性成分を除去した後、上清をミリQ水に対して透析した後、凍結乾燥して粗細胞壁テイコ酸画分とした。
スタフィロコッカス・アウレウス由来のリポテイコ酸、大腸菌由来のリポポリサッカライド、ウイルス由来一本鎖RNAと類似の構造を持つイミダゾキノリン誘導体であるガルディモッド、及び非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡはいずれもインビボジェン社より購入した。
【００３２】
（２）マウス腹腔マクロファージの調製と培養
日本ＳＬＣ社より購入した９週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に４％チオグリコレート（ディフコ社）溶液２ｍｌを投与した。４日後に腹腔内に誘導されてくる細胞をハンクス溶液（シグマ社）１０ｍｌを用いて回収し、腹腔マクロファージとした。腹腔マクロファージはハンクス溶液で３回洗浄後、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地（シグマ社）に懸濁した。９６ウエル培養プレート（ヌンク社）に腹腔マクロファージ（１×１０5個／ウエル／０．２ｍｌ）をまき、細菌（１０μｇ／ｍｌ）または微生物処理物（１又は１０μｇ／ｍｌ）を単独で、または、混合して添加して３７℃で培養した。２４時間後の培養上清を回収し、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の濃度をELISAで定量した。ELISAでのＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の濃度の定量方法について以下に説明する。９６ウエルELISAプレートに抗マウスＩＬ−１２抗体（クローン９Ａ５、２００倍希釈、ファーミンジェン社）または抗マウスＩＬ−１０抗体（クローンＪＥＳ５−ＳＸＣ１、５００倍希釈、ファーミンジェン社）を４℃で一晩吸着させた。１％牛血清アルブミンでブロッキングした後、２０倍または４倍に希釈した培養上清または標準ＩＬ−１２ｐ７０（ファーミンジェン社）またはＩＬ−１０（ファーミンジェン社）を添加して室温で９０分間反応させた。０．０５％トライトンＸ１００を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩＬ−１２抗体（クローンＣ１７．８、１０００倍希釈、ファーミンジェン社）またはビオチン標識抗マウスＩＬ−１０抗体（クローンＪＥＳ５−２Ａ５、２０００倍希釈、ファーミンジェン社）を添加して室温で９０分間反応させた。０．０５％トライトンＸ１００を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ（２００００倍希釈、セロテック社）を添加して室温で３０分間反応させた。０．０５％トライトンＸ１００を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ＴＭＢ試薬を添加して室温で１０分間反応させ、１Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光値を測定した。標準ＩＬ−１２ｐ７０またはＩＬ−１０から検量線を作成し、培養上清中の濃度を算出した。
【００３３】
（３）試験結果
成分（Ａ）及び（Ｂ）を単独で添加した場合のＩＬ−１０、１２の産生量、成分（Ａ）と成分（Ｂ）とを組み合わせて添加した場合のＩＬ−１０、１２の産生量、成分（Ａ）同士、成分（Ｂ）同士を組み合わせて添加した場合のＩＬ−１０、１２の産生量を表１に示した。成分（Ａ）とラクトバチルス・カゼイとを組み合わせて添加した場合、両成分単独でのＩＬ−１０誘導量を加算した値以上に相乗的にＩＬ−１０産生が強く誘導された。ＩＬ−１０産生の相乗的な誘導は成分（Ａ）がラクトバチルス・プランタラム、ペプチドグリカン、プロトプラスト、リポテイコ酸、細胞壁テイコ酸、ＤＮＡ、イミダゾキノリン化合物である場合に特に顕著であった。また、ラクトバチルス・プランタラムとラクトバチルス・ラムノーサスとを組み合わせて添加した場合も同様に相乗的にＩＬ−１０産生が強く誘導された。ＩＬ−１０産生の相乗的な誘導効果は成分（Ｂ）がラクトバチルス・カゼイである場合に特に顕著であった。一方、成分（Ａ）同士、成分（Ｂ）同士を組み合わせて添加した場合はＩＬ−１０産生の相乗的な誘導効果は認められなかった。
【００３４】
【表１】
【００３５】
試験例２
（１）Ｎ−アセチルムラミダーゼ処理
ラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ １４９１７）、ラクトバチルス・アシドフィルス（ＡＴＣＣ ４３５６）、ラクトバチルス・カゼイ（ＹＩＴ ９０２９）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＡＴＣＣ ７４６９）を４ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・マレイト緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し（２ｍｇ／ｍｌ）、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（Ｍ−１酵素、生化学工業）を添加（１０μｇ／ｍｌ）して３７℃で１０分反応させた。１００℃、５分の加熱処理により酵素活性を失活させた後、反応液に対して１／４容量の１０％ＳＤＳ溶液を添加し、ボルテックスにて十分攪拌してプロトプラスト状の被験物質を溶解させた。その後、６００ｎｍの吸光度を測定し、消化率を算出した。
さらに、菌株保存機関より入手したラクトバチルス・カゼイ４株、ラクトバチルス・ラムノーサス４株、ラクトバチルス・ゼアエ１株、ラクトバチルス・ファーメンタム３株、ラクトバチルス・ガッセリ４株、ラクトバチルス・ジョンソニー４株、ラクトバチルス・アシドフィルス４株、ラクトバチルス・デルブルッキー４株、ラクトバチルス・ヘルベティカス４株、ラクトバチルス・プランタラム４株の３６株の乳酸桿菌について、同様にＮ−アセチルムラミダーゼ処理による消化率を調べた。また、マウス腹腔マクロファージ培養系にこれらの乳酸桿菌を添加（１０μｇ／ｍｌ）して２４時間培養し、上清中に誘導されるＩＬ−１２量をELISAで測定した。
【００３６】
（２）試験結果
ラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ １４９１７）、ラクトバチルス・アシドフィルス（ＡＴＣＣ ４３５６）、ラクトバチルス・カゼイ（ＹＩＴ ９０２９）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＡＴＣＣ ７４６９）のＮ−アセチルムラミダーゼ処理による消化率を表２に示した。
Ｎ−アセチルムラミダーゼ処理による成分（Ａ）の消化率は４３．５％以上であり、成分（Ｂ）の消化率は５．７％以下であった。
【００３７】
【表２】
【００３８】
乳酸菌３６株のＮ−アセチルムラミダーゼ処理による消化率を横軸に、マウス腹腔マクロファージ培養系におけるＩＬ−１２誘導量を縦軸にプロットし、図１に示した。
３６株の乳酸菌について、Ｎ−アセチルムラミダーゼ処理による消化率とＩＬ−１２誘導活性を調べ、両者の関係を解析したところ、消化率とＩＬ−１２誘導量との間に負の相関（ｒ＝０．７４７）が認められた。すなわち、菌体消化酵素による消化率が高いものはＩＬ−１２誘導活性が弱く、逆に、菌体消化酵素による消化率が低いものはＩＬ−１２誘導活性が強いことがわかった。
【００３９】
実施例１ 錠剤の製造（１）
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
（処方） （ｍｇ）
ラクトバチルス・プランタラム １０
ラクトバチルス・カゼイ １０
微結晶セルロース １００
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム ０．５
メチルセルロース １２
【００４０】
実施例２ 錠剤の製造（２）
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
（処方） （ｍｇ）
リポテイコ酸 １０
ラクトバチルス・カゼイ １０
微結晶セルロース １００
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム ０．５
メチルセルロース １２
【００４１】
実施例３ 錠剤の製造（３）
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
（処方） （ｍｇ）
非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ １０
ラクトバチルス・カゼイ １０
微結晶セルロース １００
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム ０．５
メチルセルロース １２
【００４２】
実施例４ 清涼飲料の製造
下記の処方で処方したものを加熱殺菌後、褐色瓶にホットパック充填を行い、清涼飲料水を得た。
（処方） （ｇ）
ビフィドバクテリウム・ブレーベ ０．４
ラクトバチルス・カゼイ ０．４
香料 ０．８
クエン酸 ０．２
果糖 ４
スクラロース ０．００１
水 ９４．１９９
【００４３】
実施例５ 発酵乳製品の製造（１）
１５％脱脂乳に３％グルコースを添加し、１２０℃で３秒間殺菌した後、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）ＹＩＴ ９０２９株を１％接種し、３７℃でｐＨ３．６まで培養してヨーグルトベース２１０ｇを得た。一方、砂糖９７ｇ、クエン酸鉄０．２ｇ、ラクトバチルス・アシドフィルス１ｇを水に溶解し、水を加え全量を７９０ｇとし、この溶液を１１０℃で３秒間殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を１ｇ添加した後、１５Ｍｐａで均質化して容器に充填して発酵乳製品を得た。この発酵乳製品中のラクトバチルス・カゼイの初発菌数は１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００４４】
実施例６ 発酵乳製品の製造（２）
１５％脱脂乳に３％グルコースを添加し、１２０℃で３秒間殺菌した後、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）ＹＩＴ ９０２９株を１％接種し、３７℃でｐＨ３．６まで培養してヨーグルトベース２１０ｇを得た。一方、砂糖９７ｇ、クエン酸鉄０．２ｇ、ペプチドグリカン１ｇを水に溶解し、水を加え全量を７９０ｇとし、この溶液を１１０℃で３秒間殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を１ｇ添加した後、１５Ｍｐａで均質化して容器に充填して発酵乳製品を得た。この発酵乳製品中のラクトバチルス・カゼイの初発菌数は１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】乳酸菌３６株のＮ−アセチルムラミダーゼ処理による消化率と、マウス腹腔マクロファージ培養系におけるＩＬ−１２誘導量との関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン（以下、ＩＬ−ということもある）１０の産生不足による疾患の予防又は治療薬として有用なＩＬ−１０産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌、ウィルス等の微生物の感染、腫瘍、細胞傷害などに対して生体は免疫反応によって対応するが、その免疫反応は、免疫担当細胞間の直接的あるいは間接的な相互作用により調節されている。そして、免疫応答の調節にはリンパ球、マクロファージ等が産生するインターロイキン、ＴＮＦ−α等のサイトカインが重要な役割を演じている。
【０００３】
現在、インターロイキンに属するサイトカインとしては２９種類が知られているが、その一つであるＩＬ−１０については次のような作用が確認されている。
【０００４】
（１）単球／マクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α産生を抑制する。
（２）単球／マクロファージからのＩＬ−１レセプターアンタゴニストの産生を増強する。
（３）単球／マクロファージのＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子、ＣＤ８６分子の発現を抑制する。
（４）Ｔ細胞の増殖を抑制する。
（５）Ｔ細胞からのＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５産生を抑制する。
（６）ＩＬ−１０産生調節性Ｔ細胞を誘導する。
（７）好酸球、好中球、マスト細胞からのＩＬ−１、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α産生を抑制する。
（８）ＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強する。
（９）Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を抑制し、ＩｇＧ産生を増強する。
【０００５】
これらの作用があることにより、ＩＬ−１０は自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、乾癬、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍など、多くの疾患の予防、治療に利用可能になるものと期待されている。
【０００６】
プロバイオティクスによりＩＬ−１０の産生を誘導する試みとしては、ラクトコッカス属乳酸菌によるＩＬ−１０産生の誘導（特許文献１）、ラクトバチルス・アシドフィルス菌株によるＩＬ−１０産生の誘導（特許文献２）等が報告されているが、これらのいずれについても未だ十分な効果は得られていない。
【特許文献１】特開２００５−１５４３８７号公報
【特許文献２】特開２００４−２７７３８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明の目的は、ＩＬ−１０の産生不足による疾患、例えば自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、乾癬、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍等の予防・治療に有用であり、かつ日常的に使用できる安全な医薬、飲食品に利用できるＩＬ−１０産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、全く意外なことに、（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物と、（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌を組み合わせたときＩＬ−１０の産生が顕著に促進されることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物と、（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌を組み合わせてなるＩＬ−１０産生促進剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＩＬ−１０産生促進剤は、長期間経口摂取しても安全であり、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、乾癬、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍等のＩＬ−１０産生不足による多くの疾患の予防と治療の目的に有効かつ安全に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、「ＩＬ−１２産生誘導能を有さない」とは、被験物質をマウス腹腔マクロファージ系に添加して２４時間培養後に上清を回収し、上清中のＩＬ−１２ｐ７０の濃度をＥＬＩＳＡで定量したとき、１０ｎｇ／ｍｌ未満であることを意味し、特に３ｎｇ／ｍｌ未満であるのが好ましい。「ＩＬ−１２産生誘導能を有する」とは同系においてＩＬ−１２ｐ７０濃度が１０ｎｇ／ｍｌ以上であることを意味し、特に２０ｎｇ／ｍｌ以上であるのが好ましい。
【００１２】
本発明において、「微生物」とは細菌菌体、酵母菌体及び不活化ウィルスを含む意味に用いられ、「微生物処理物」とは用いられる細菌、酵母又はウィルスに何らかの処理を加えたものをいい、その処理は特に限定されない。前記処理物としては、具体的には、微生物の超音波などによる破砕液、微生物の酵素処理液、それらを濾過ないし遠心分離など固液分離手段によって分離した固体残渣等が挙げられる。また、細胞壁又はウイルス膜を酵素もしくは機械的手段により除去した処理液、これらの濃縮物、これらの希釈物またはこれらの乾燥物なども含まれる。また、微生物を界面活性剤等によって溶解した後、エタノール等によって沈殿させて得られる核酸含有画分も含まれる。さらに、前記微生物の超音波などによる破砕液、細胞の酵素処理液などに対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの分離・精製処理をさらに行ったものも含まれる。さらに、細菌菌体及び酵母菌体では死菌体も含まれ、該死菌体は、例えば、加熱処理、抗生物質などの薬物による処理、ホルマリンなどの化学物質による処理、紫外線による処理、γ線などの放射線による処理により得ることができる。これら処理のうち、特に超音波処理、酵素処理、加熱処理が好ましい。
さらに、前記処理物は、化学的に合成されたもの、例えばＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、イミダゾキノリン系化合物、イミダゾキノリン系化合物及びリポペプチド等であってもよく、具体的には、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ等のＤＮＡ、ポリウリジン等の一本鎖ＲＮＡは市販の核酸合成装置により合成することが可能であり、イミダゾキノリン系化合物は、自体公知の方法により製造することが可能であり、Pam3-Cys-Ser-Lys4、Pam2-Cys-Gly-Asp-Pro-Lys-His-Pro-Lys-Ser-Phe等のリポペプチドは公知のペプチド合成法（固相合成法、液相合成法等）を利用して製造することもできる。
【００１３】
本発明において、（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物としては、菌体消化酵素による消化率が３０％以上の細菌若しくは酵母又は微生物処理物が挙げられる。一方、（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌としては、菌体消化酵素による消化率が１０％以下の細菌が挙げられる。
本発明において、「菌体消化酵素による消化率」とは、Ｎ−アセチルムラミダーゼの一種であるＭ−１酵素（ＥＣ ３．２．１．１７）による消化試験を行った際の被験物質の消化率を意味する。具体的には、以下に示す消化試験を行い、被験物質の消化率を算出することができる。
まず、４ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・マレイト緩衝液（ｐＨ７．０）中に被験物質を２ｍｇ／ｍｌで懸濁し、Ｍ−１酵素を添加（１０μｇ／ｍｌ）して３７℃で１０分反応を行った後、１００℃、５分の加熱処理により酵素活性を失活させた。反応液に対してＳＤＳ溶液を添加し（終濃度２％）、ボルテックスにて十分攪拌してプロトプラスト状の被験物質を溶解させた後、濁度（ＯＤ６００）を測定した。消化率の算出には以下の式を用いた。
【００１４】
【数１】
【００１５】
（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌としては、例えば、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガッセリ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・デルブルッキー、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、スタフィロコッカス・アウレウス、大腸菌等が挙げられる。細菌のうち、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、スタフィロコッカス・アウレウス、大腸菌が好ましく、（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌との併用により特に強くＩＬ−１０の産生を誘導する点から特にラクトバチルス・プランタラムが好ましい。
（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない酵母としては、特に限定されないが、例えば、サッカロマイセス・セルビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンスが挙げられ、サッカロマイセス・セルビシエを好適に用いることができる。
【００１６】
（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない微生物処理物としては、特に限定されないが、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、スタフィロコッカス・アウレウス、大腸菌等の細菌、サッカロマイセス・セルビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス等の酵母及びインフルエンザウイルス等の不活化ウィルス等の微生物の処理物が挙げられる。このうち、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８又はＴＬＲ９のリガンドとなり得る処理物が好ましく、当該処理物としては、例えば、ペプチドグリカン、プロトプラスト、ザイモサン、リポテイコ酸、細胞壁テイコ酸、リポポリサッカライド、ＤＮＡ（非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ等）、一本鎖ＲＮＡ（ポリウリジン等）、イミダゾキノリン化合物（ガルディモッド等）、リポタンパク質、リポペプチド（Pam3-Cys-Ser-Lys4、Pam2-Cys-Gly-Asp-Pro-Lys-His-Pro-Lys-Ser-Phe等）、リポマンナン、リポアラビノマンナン、ムラミルジペプチド、マイコバクテリウムボビス、ＯＫ−４３２、丸山ワクチン等が挙げられ、ペプチドグリカン、プロトプラスト、ザイモサン、リポテイコ酸、細胞壁テイコ酸、リポポリサッカライド、ＤＮＡ（非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ等）、イミダゾキノリン化合物（ガルディモッド等）がさらに好ましく、（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌との併用により特に強くＩＬ−１０の産生を誘導する点及び取り扱いやすさ等から特にペプチドグリカン、プロトプラスト、リポテイコ酸、リポポリサッカライド、ＤＮＡ、イミダゾキノリン化合物が好ましい。このイミダゾキノリン化合物としては、例えばガルディモッド、イミクイモッド、Ｒ８４８等が挙げられ、特にガルディモッドが好ましい。また、このＤＮＡとしては特に限定されないが、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡを好適に用いることができる。
【００１７】
（Ｂ）ＩＬ−１２産生誘導能を有する細菌としては、例えばラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ゼアエ等のラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌が挙げられる。（Ａ）ＩＬ−１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物との併用により特に強くＩＬ−１０の産生を誘導する点から、特にラクトバチルス・カゼイが好ましい。
【００１８】
成分（Ａ）や（Ｂ）に細菌又は酵母を使用する場合、細菌又は酵母の形態は特に制限されず、生菌又は加熱菌体（死菌体）のいずれでもよく、又凍結乾燥したものであってもよく、あるいはこれらを含む培養物として利用することもできる。ここで、本発明の成分（Ａ）、（Ｂ）は各々１種でもよいし、２種以上用いてもよい。
【００１９】
本発明の成分（Ａ）と（Ｂ）を組み合わせると、全く意外にも強力なＩＬ−１０産生促進作用を奏する。従って、本発明のＩＬ−１０産生促進剤は、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、乾癬、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍等の様々な疾病の治療や改善、或いはその予防等の目的に利用できる。
ここで、ＩＬ−１０産生促進作用を有するとは、次式により求められるＩＬ−１０産生増加能が１３０％以上のものを意味し、好ましくは１５０％以上のものを意味する。
【００２０】
【数２】
【００２１】
本発明において成分（Ａ）と（Ｂ）との組み合わせによって、ＩＬ−１０産生が促進されるメカニズムは明らかではないが、成分（Ａ）及び（Ｂ）のマクロファージにおける消化性の差が影響していることが考えられる。すなわち、成分（Ａ）はマクロファージ内で速やかに消化され、菌体等の消化産物がマクロファージ内に速やかに蓄積し、成分（Ｂ）は逆にゆっくりと消化され、マクロファージ内に長時間菌体のまま保持される。ここで本発明者らはマクロファージによる消化性とＩＬ−１２産生誘導能には負の相関があることを見出しており、易消化性である成分（Ａ）はＩＬ−１２産生をほとんど誘導せず、難消化性である成分（Ｂ）は強くＩＬ−１２を誘導する。マクロファージからのＩＬ−１０産生は、複数のステップにより制御されているが、菌体等の消化産物と未消化の菌体は各々別のステップのトリガーになっており、両者、つまり成分（Ａ）、（Ｂ）共に存在するとマクロファージからのＩＬ−１０産生が強く誘導されるものと考えられる。また、ＴＬＲリガンドも、上記の菌体等の消化産物と同様に、未消化の菌体とは別のステップのトリガーになっていると考えられる。
【００２２】
特に、上記成分（Ａ）及び（Ｂ）がヒトの腸内フローラを構成するものであったり、酪農乳製品に古くから利用されてきた乳酸菌やビフィズス菌からなるものである場合は、長期間経口摂取しても安全であるだけでなく、整腸作用、抗腫瘍作用、抗変異作用、血圧低下作用、抗潰瘍作用、コレステロール低下作用等、乳酸菌やビフィズス菌に期待される周知の有用作用を複合的に作用させることができ、好適に利用することができる。
【００２３】
さらに、本発明のＩＬ−１０産生促進剤は炎症性サイトカインであるＩＬ−１２の産生を抑制する効果を奏することが明らかになっており、上記各種疾患の治療や改善、或いはその予防がさらに容易になることが期待される。
【００２４】
本発明のＩＬ−１０産生促進剤は経口投与又は非経口投与のいずれも使用できるが、経口投与が望ましい。投与に関しては、有効成分である成分（Ａ）及び（Ｂ）を投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。
【００２５】
本発明のＩＬ−１０産生促進剤の有効成分である成分（Ａ）及び（Ｂ）を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、その好適な投与量は成分（Ａ）、（Ｂ）（細菌又は酵母）については乾燥重量で１日当たり１μｇ〜１０ｇ（菌体数では１０6〜１０13ｃｆｕ）、より好ましくは１ｍｇ〜１ｇ（菌体数では１０9〜１０12ｃｆｕ）である。また成分（Ａ）（微生物処理物）については１日当たり１μｇ〜１０ｇ、より好ましくは１ｍｇ〜１ｇである。このとき、成分（Ａ）と（Ｂ）との配合比率に厳格な制限はないが、成分（Ａ）：成分（Ｂ）は１：０．０３〜３０が好ましく、より好ましくは１：０．３〜１０である。
【００２６】
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固体剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２７】
また、本発明のＩＬ−１０産生促進剤は、上記のような医薬品製剤として用いるだけでなく、飲食品等として用いることもできる。この場合には、本発明の成分（Ａ）及び（Ｂ）をそのまま、または種々の栄養成分を加えて、飲食品中に含有せしめればよい。この飲食品は、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、乾癬、臓器移植時の拒絶反応、ウィルス感染、腫瘍等の改善、予防等に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品又はその容器には、前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。具体的に本発明のＩＬ−１０産生促進剤を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。
【００２８】
さらに飲食品としては、有効成分である細菌又は酵母を含有する発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵乳製品が好適に用いられる。これら発酵乳飲食品の製造は定法に従って製造することができる。例えば発酵乳は、殺菌した乳培地に成分（Ａ）及び（Ｂ）を接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。この時、他の微生物と同時に接種培養してもよい。次いで別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品とすることができる。このようにして得られる発酵乳は、プレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。
【００２９】
また、本発明のＩＬ−１０産生促進剤においては、成分（Ａ）、（Ｂ）は同時に投与してもよく、或いは、成分（Ａ）又は（Ｂ）のどちらか一方を先に投与してもよい。特に同時に投与するのが好ましく、ヒトを含むあらゆる哺乳動物に適用できる。従って、成分（Ａ）のみを含有する組成物と成分（Ｂ）のみを含有する組成物を別個にしてもよく、成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する組成物としてもよい。
【実施例】
【００３０】
以下、試験例及び実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。
【００３１】
試験例１
（１）細菌及び微生物処理物
ラクトバチルス・カゼイ（ＹＩＴ ９０２９）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（ＹＩＴ ４０６５）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（ＹＩＴ ４００７）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＡＴＣＣ ７４６９）、ラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ １４９１７）、ラクトバチルス・アシドフィルス（ＡＴＣＣ ４３５６）について、ラクトバチルス属乳酸菌は２００ｍｌのＤｉｆｃｏTM Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ培地（ＢＤ社）を用いて、また、ビフィズス菌は１％グルコースを含む２００ｍｌのＧＡＭ培地（ニッスイ）を用いて、それぞれ３７℃で２０時間培養した。菌体は遠心分離（８０００回転、１０分）により集菌し、滅菌ミリＱ水を用いて遠心洗浄を３回繰り返した後、２００ｍｌの滅菌ミリＱ水に懸濁して、１００℃で３０分間の加熱処理をした後、凍結乾燥した。ホルマリン固定化スタフィロコッカス・アウレウス（商品名：パンソルビン）はカルビオケミ社より、ホルマリン固定化大腸菌（ＡＴＣＣ １１３０３）及びスタフィロコッカス・アウレウス由来のペプチドグリカンはシグマ社より、酵母（サッカロマイセス・セルビシエ）由来のザイモサンはモレキュラープローブ社よりそれぞれ購入した。
細菌由来のプロトプラストの調製方法としては、特に限定されないが、具体的には以下に示す方法を好適に用いることができる。グラム陽性菌加熱死菌体を４ｍＭの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・マレイト緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、Ｍ−１酵素を添加して３７℃で１６時間反応させて、細胞壁を消化させた。遠心分離により不溶性成分を回収してプロトプラストとした。
細菌由来の細胞壁テイコ酸の調製方法としては、特に限定されないが、具体的には以下に示す方法を好適に用いることができる。ラクトバチルス・プランタラムやスタフィロコッカス・アウレウス等の細胞壁にテイコ酸を含有するグラム陽性菌加熱死菌体を４ｍＭの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・マレイト緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、Ｍ−１酵素を添加して３７℃で１６時間反応させて、細胞壁を消化させた。遠心分離により不溶性成分を除去した後、上清をミリQ水に対して透析した後、凍結乾燥して粗細胞壁テイコ酸画分とした。
スタフィロコッカス・アウレウス由来のリポテイコ酸、大腸菌由来のリポポリサッカライド、ウイルス由来一本鎖RNAと類似の構造を持つイミダゾキノリン誘導体であるガルディモッド、及び非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡはいずれもインビボジェン社より購入した。
【００３２】
（２）マウス腹腔マクロファージの調製と培養
日本ＳＬＣ社より購入した９週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に４％チオグリコレート（ディフコ社）溶液２ｍｌを投与した。４日後に腹腔内に誘導されてくる細胞をハンクス溶液（シグマ社）１０ｍｌを用いて回収し、腹腔マクロファージとした。腹腔マクロファージはハンクス溶液で３回洗浄後、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地（シグマ社）に懸濁した。９６ウエル培養プレート（ヌンク社）に腹腔マクロファージ（１×１０5個／ウエル／０．２ｍｌ）をまき、細菌（１０μｇ／ｍｌ）または微生物処理物（１又は１０μｇ／ｍｌ）を単独で、または、混合して添加して３７℃で培養した。２４時間後の培養上清を回収し、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の濃度をELISAで定量した。ELISAでのＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の濃度の定量方法について以下に説明する。９６ウエルELISAプレートに抗マウスＩＬ−１２抗体（クローン９Ａ５、２００倍希釈、ファーミンジェン社）または抗マウスＩＬ−１０抗体（クローンＪＥＳ５−ＳＸＣ１、５００倍希釈、ファーミンジェン社）を４℃で一晩吸着させた。１％牛血清アルブミンでブロッキングした後、２０倍または４倍に希釈した培養上清または標準ＩＬ−１２ｐ７０（ファーミンジェン社）またはＩＬ−１０（ファーミンジェン社）を添加して室温で９０分間反応させた。０．０５％トライトンＸ１００を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩＬ−１２抗体（クローンＣ１７．８、１０００倍希釈、ファーミンジェン社）またはビオチン標識抗マウスＩＬ−１０抗体（クローンＪＥＳ５−２Ａ５、２０００倍希釈、ファーミンジェン社）を添加して室温で９０分間反応させた。０．０５％トライトンＸ１００を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ（２００００倍希釈、セロテック社）を添加して室温で３０分間反応させた。０．０５％トライトンＸ１００を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ＴＭＢ試薬を添加して室温で１０分間反応させ、１Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光値を測定した。標準ＩＬ−１２ｐ７０またはＩＬ−１０から検量線を作成し、培養上清中の濃度を算出した。
【００３３】
（３）試験結果
成分（Ａ）及び（Ｂ）を単独で添加した場合のＩＬ−１０、１２の産生量、成分（Ａ）と成分（Ｂ）とを組み合わせて添加した場合のＩＬ−１０、１２の産生量、成分（Ａ）同士、成分（Ｂ）同士を組み合わせて添加した場合のＩＬ−１０、１２の産生量を表１に示した。成分（Ａ）とラクトバチルス・カゼイとを組み合わせて添加した場合、両成分単独でのＩＬ−１０誘導量を加算した値以上に相乗的にＩＬ−１０産生が強く誘導された。ＩＬ−１０産生の相乗的な誘導は成分（Ａ）がラクトバチルス・プランタラム、ペプチドグリカン、プロトプラスト、リポテイコ酸、細胞壁テイコ酸、ＤＮＡ、イミダゾキノリン化合物である場合に特に顕著であった。また、ラクトバチルス・プランタラムとラクトバチルス・ラムノーサスとを組み合わせて添加した場合も同様に相乗的にＩＬ−１０産生が強く誘導された。ＩＬ−１０産生の相乗的な誘導効果は成分（Ｂ）がラクトバチルス・カゼイである場合に特に顕著であった。一方、成分（Ａ）同士、成分（Ｂ）同士を組み合わせて添加した場合はＩＬ−１０産生の相乗的な誘導効果は認められなかった。
【００３４】
【表１】
【００３５】
試験例２
（１）Ｎ−アセチルムラミダーゼ処理
ラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ １４９１７）、ラクトバチルス・アシドフィルス（ＡＴＣＣ ４３５６）、ラクトバチルス・カゼイ（ＹＩＴ ９０２９）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＡＴＣＣ ７４６９）を４ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・マレイト緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し（２ｍｇ／ｍｌ）、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（Ｍ−１酵素、生化学工業）を添加（１０μｇ／ｍｌ）して３７℃で１０分反応させた。１００℃、５分の加熱処理により酵素活性を失活させた後、反応液に対して１／４容量の１０％ＳＤＳ溶液を添加し、ボルテックスにて十分攪拌してプロトプラスト状の被験物質を溶解させた。その後、６００ｎｍの吸光度を測定し、消化率を算出した。
さらに、菌株保存機関より入手したラクトバチルス・カゼイ４株、ラクトバチルス・ラムノーサス４株、ラクトバチルス・ゼアエ１株、ラクトバチルス・ファーメンタム３株、ラクトバチルス・ガッセリ４株、ラクトバチルス・ジョンソニー４株、ラクトバチルス・アシドフィルス４株、ラクトバチルス・デルブルッキー４株、ラクトバチルス・ヘルベティカス４株、ラクトバチルス・プランタラム４株の３６株の乳酸桿菌について、同様にＮ−アセチルムラミダーゼ処理による消化率を調べた。また、マウス腹腔マクロファージ培養系にこれらの乳酸桿菌を添加（１０μｇ／ｍｌ）して２４時間培養し、上清中に誘導されるＩＬ−１２量をELISAで測定した。
【００３６】
（２）試験結果
ラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ １４９１７）、ラクトバチルス・アシドフィルス（ＡＴＣＣ ４３５６）、ラクトバチルス・カゼイ（ＹＩＴ ９０２９）、ラクトバチルス・ラムノーサス（ＡＴＣＣ ７４６９）のＮ−アセチルムラミダーゼ処理による消化率を表２に示した。
Ｎ−アセチルムラミダーゼ処理による成分（Ａ）の消化率は４３．５％以上であり、成分（Ｂ）の消化率は５．７％以下であった。
【００３７】
【表２】
【００３８】
乳酸菌３６株のＮ−アセチルムラミダーゼ処理による消化率を横軸に、マウス腹腔マクロファージ培養系におけるＩＬ−１２誘導量を縦軸にプロットし、図１に示した。
３６株の乳酸菌について、Ｎ−アセチルムラミダーゼ処理による消化率とＩＬ−１２誘導活性を調べ、両者の関係を解析したところ、消化率とＩＬ−１２誘導量との間に負の相関（ｒ＝０．７４７）が認められた。すなわち、菌体消化酵素による消化率が高いものはＩＬ−１２誘導活性が弱く、逆に、菌体消化酵素による消化率が低いものはＩＬ−１２誘導活性が強いことがわかった。
【００３９】
実施例１ 錠剤の製造（１）
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
（処方） （ｍｇ）
ラクトバチルス・プランタラム １０
ラクトバチルス・カゼイ １０
微結晶セルロース １００
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム ０．５
メチルセルロース １２
【００４０】
実施例２ 錠剤の製造（２）
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
（処方） （ｍｇ）
リポテイコ酸 １０
ラクトバチルス・カゼイ １０
微結晶セルロース １００
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム ０．５
メチルセルロース １２
【００４１】
実施例３ 錠剤の製造（３）
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
（処方） （ｍｇ）
非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ １０
ラクトバチルス・カゼイ １０
微結晶セルロース １００
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム ０．５
メチルセルロース １２
【００４２】
実施例４ 清涼飲料の製造
下記の処方で処方したものを加熱殺菌後、褐色瓶にホットパック充填を行い、清涼飲料水を得た。
（処方） （ｇ）
ビフィドバクテリウム・ブレーベ ０．４
ラクトバチルス・カゼイ ０．４
香料 ０．８
クエン酸 ０．２
果糖 ４
スクラロース ０．００１
水 ９４．１９９
【００４３】
実施例５ 発酵乳製品の製造（１）
１５％脱脂乳に３％グルコースを添加し、１２０℃で３秒間殺菌した後、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）ＹＩＴ ９０２９株を１％接種し、３７℃でｐＨ３．６まで培養してヨーグルトベース２１０ｇを得た。一方、砂糖９７ｇ、クエン酸鉄０．２ｇ、ラクトバチルス・アシドフィルス１ｇを水に溶解し、水を加え全量を７９０ｇとし、この溶液を１１０℃で３秒間殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を１ｇ添加した後、１５Ｍｐａで均質化して容器に充填して発酵乳製品を得た。この発酵乳製品中のラクトバチルス・カゼイの初発菌数は１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００４４】
実施例６ 発酵乳製品の製造（２）
１５％脱脂乳に３％グルコースを添加し、１２０℃で３秒間殺菌した後、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）ＹＩＴ ９０２９株を１％接種し、３７℃でｐＨ３．６まで培養してヨーグルトベース２１０ｇを得た。一方、砂糖９７ｇ、クエン酸鉄０．２ｇ、ペプチドグリカン１ｇを水に溶解し、水を加え全量を７９０ｇとし、この溶液を１１０℃で３秒間殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を１ｇ添加した後、１５Ｍｐａで均質化して容器に充填して発酵乳製品を得た。この発酵乳製品中のラクトバチルス・カゼイの初発菌数は１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】乳酸菌３６株のＮ−アセチルムラミダーゼ処理による消化率と、マウス腹腔マクロファージ培養系におけるＩＬ−１２誘導量との関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物と、（Ｂ）インターロイキン１２産生誘導能を有する細菌を組み合わせてなるインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項２】
（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物が、菌体消化酵素による消化率が３０％以上のものである請求項１記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項３】
（Ｂ）インターロイキン１２産生誘導能を有する細菌が、菌体消化酵素による消化率が１０％以下のものである請求項１又は２記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項４】
（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない細菌又は酵母が、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、スタフィロコッカス・アウレウス、大腸菌及びサッカロマイセス・セルビシエから選ばれる１種以上のものである請求項１〜３の何れか１項記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項５】
（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない微生物処理物が、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８又はＴＬＲ９のリガンドである請求項１〜３の何れか１項記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項６】
（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない微生物処理物が、ペプチドグリカン、プロトプラスト、ザイモサン、リポテイコ酸、細胞壁テイコ酸、リポポリサッカライド、ＤＮＡ及びイミダゾキノリン化合物から選ばれる１種以上のものである請求項１〜３、及び５の何れか１項記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項７】
（Ｂ）インターロイキン１２産生誘導能を有する細菌が、ラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌である請求項１〜６の何れか１項記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項８】
（Ｂ）インターロイキン１２産生誘導能を有する細菌が、ラクトバチルス・カゼイである請求項１〜７の何れか１項記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項１】
（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物と、（Ｂ）インターロイキン１２産生誘導能を有する細菌を組み合わせてなるインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項２】
（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物が、菌体消化酵素による消化率が３０％以上のものである請求項１記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項３】
（Ｂ）インターロイキン１２産生誘導能を有する細菌が、菌体消化酵素による消化率が１０％以下のものである請求項１又は２記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項４】
（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない細菌又は酵母が、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、スタフィロコッカス・アウレウス、大腸菌及びサッカロマイセス・セルビシエから選ばれる１種以上のものである請求項１〜３の何れか１項記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項５】
（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない微生物処理物が、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８又はＴＬＲ９のリガンドである請求項１〜３の何れか１項記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項６】
（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない微生物処理物が、ペプチドグリカン、プロトプラスト、ザイモサン、リポテイコ酸、細胞壁テイコ酸、リポポリサッカライド、ＤＮＡ及びイミダゾキノリン化合物から選ばれる１種以上のものである請求項１〜３、及び５の何れか１項記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項７】
（Ｂ）インターロイキン１２産生誘導能を有する細菌が、ラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌である請求項１〜６の何れか１項記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【請求項８】
（Ｂ）インターロイキン１２産生誘導能を有する細菌が、ラクトバチルス・カゼイである請求項１〜７の何れか１項記載のインターロイキン１０産生促進剤。
【図１】
【公開番号】特開２００８−３１１５３（Ｐ２００８−３１１５３Ａ）
【公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１５５２２９（Ｐ２００７−１５５２２９）
【出願日】平成１９年６月１２日（２００７．６．１２）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１２日（２００７．６．１２）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【Ｆターム（参考）】
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