ウイルス性肝炎におけるｓＬＤＬＲ
本発明はウイルス性肝炎における可溶性ＬＤＬ受容体（ｓＬＤＬＲ）の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性肝炎、とりわけＨＢＶ感染における可溶性ＬＤＬ受容体（ｓＬＤＬＲ）の治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
すべての真核生物の原形質膜の構成成分であるコレステロールは、高等生物における細胞の増殖および生存に不可欠なものである。しかしながら、コレステロールの血清濃度が高いと、全身の動脈におけるアテロームプラークの形成により疾患および死の原因となる。哺乳類におけるコレステロール合成の主な部位は肝臓である。かなりな量のコレステロールが腸によっても形成される。これらの臓器によるコレステロール形成率は、食事供給源から吸収されるコレステロールの量によく反応する。肝臓および腸の外側の細胞は、コレステロールを新たに合成するよりもむしろ血清からコレステロールを捕捉する。コレステロールや他の脂質は、リポタンパク質により体液で運ばれ、リポタンパク質は比重の増加にしたがって分類される。リポタンパク質は疎水性脂質の芯とそれを取り囲む極性脂質とアポタンパク質の殻とからなる粒子である。これらのリポタンパク質には２つの役割があり、非常に疎水性の高い脂質を可溶化し、そして特定の標的細胞および組織の内外への特定の脂質の移動を制御するシグナルを含む。コレステロールは、非肝細胞の原形質膜上の特異的受容体に結合する低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）により体液で運ばれる。受容体−ＬＤＬ複合体は、その後受容体介在性エンドサイトーシスとして知られる輸送機序により細胞内に取り込まれる（Goldsteinら、1979）。低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体は、哺乳類の細胞において多数のリガンドのエンドサイトーシスを介在する、構造的に関連した細胞表面受容体ファミリーのプロトタイプである。
【０００３】
ヒトＬＤＬ受容体についてクローンニングされた５．３キロベースのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、５つの構造的ドメインを明らかにし、そのうちのいくつかは他のタンパク質と配列相同性を共有する。そのＮＨ2−末端リガンド結合ドメインは３２２残基からなり、４７個のシステイン残基を含む。このドメインの後に４つの別のドメインが続き、１つ目は約３５０アミノ酸残基からなり、ＥＧＦ受容体に相同性を有し、２つ目はＯ−結合糖に富んだ４８アミノ酸残基からなり、３つ目は２２アミノ酸残基の１回膜貫通ドメインであり、そして４つ目は５０アミノ酸残基の細胞質ドメインである（Yamamotoら、1984）。
【０００４】
抗ウイルス活性を示す可溶型ＬＤＬＲ、ｓＬＤＬＲは、インターフェロン誘導細胞の培養上清から（Fischerら、1993）および体液中（Fischerら、1994）で同定、単離された。ＩＦＮによる抗ウイルス状態の誘導に関与するいくつかのインターフェロン誘導タンパク質が同定された。抗ウイルス活性を示すそのタンパク質の１つがヒト羊膜ＷＩＳＨ細胞の培養上清中で産生され蓄積された。このタンパク質は均質にまで精製され、ｓＬＤＬＲと同定された（ＥＰ０５５３６６７およびFischerら、1993参照）。ｓＬＤＬＲは、インターフェロンに応答して抗ウイルス状態に入った哺乳類細胞により培地に分泌されることがわかった。インターフェロンと対照的に、ｓＬＤＬＲは細胞において抗ウイルス状態を誘導しないが、それ自身が抗ウイルス性である。ｓＬＤＬＲは明らかにウイルスの複製、成熟および出芽の過程全体にわたって存在しなければならないことがわかった。これは、ｓＬＤＬＲがウイルスの集合（assembly）または出芽の阻害を導く複雑な過程に関与しているということを示唆する（未公開データ）。近年、Ｃ型肝炎ウイルスのエンドサイトーシスが、培養細胞上のＬＤＬ受容体により媒介されるということが示された（Agnelloら、1999）。
【０００５】
肝臓の損傷や障害には様々な要因がある。ウイルスもしくは細菌感染、アルコール依存症、免疫学的疾患、または癌などによるものである。
【０００６】
Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスによるウイルス性肝炎は、世界中の多数の人々を苦しめる管理がうまくいっていない疾患である。既知の肝炎ウイルスの数は絶えず増加している。ＢおよびＣ型肝炎ウイルスはさておき、ウイルス関連肝炎の原因となる少なくとも４つの他のウイルスがこれまでに発見されており、Ａ型、Ｄ型、Ｅ型およびＧ型肝炎ウイルスと呼ばれている。
【０００７】
ラミブジン（３ＴＣ）、商品名エピビル（Epivir）という抗ＨＩＶ治療は、Ｂ型肝炎の治療にも承認されている。研究では、エピビルがＢ型肝炎ウイルスの量を非常に低いレベルに減少させることができるが、この効果は必ずしも充分なものではない。
【０００８】
アデフォビルジピボキシル（ＡＤＶ）は、慢性Ｂ型肝炎に効果を示すもう１つのＨＩＶ治療薬である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ｓＬＤＬＲがＨＢＶによる肝臓感染症の治療および／または予防に有効であるという知見に基づくものである。
【００１０】
本発明の第１の目的は、ＨＢＶによる肝臓感染症の治療および／または予防のための新規な手段を提供することである。したがって、本発明はＨＢＶによるウイルス性肝炎の治療および／または予防のための医薬の製造のためのｓＬＤＬＲの使用に関する。
【００１１】
遺伝子医療的アプローチを適用し、ｓＬＤＬＲを肝臓に送達するために、本発明のさらなる側面は、病状の治療および／または予防のためのｓＬＤＬＲのコーディング配列を含む発現ベクターの使用に関する。本発明はさらに、ＨＢＶによる肝臓感染症の予防および／または治療のための、ｓＬＤＬＲの内因性遺伝子活性化の使用、およびｓＬＤＬＲを発現するように遺伝子操作された細胞の使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ウイルス性肝炎、とりわけＨＢＶウイルスによる肝炎におけるｓＬＤＬＲの有益な効果の発見に基づくものである。
【００１３】
本発明の第１の側面によれば、ｓＬＤＬＲはＨＢＶによるウイルス性肝臓感染症の治療および／または予防のための医薬の製造のために使用される。
【００１４】
本発明によれば、ｓＬＤＬＲは、慢性活性肝炎（慢性進行性肝炎とも呼ばれる）の治療および／または予防のための医薬の製造のためにも使用される。慢性活性肝炎は、肝臓細胞を損傷する肝臓の継続的な炎症である。慢性活性肝炎の原因には、ウイルス感染とその他のものとがある。その疾患は、肝臓細胞の壊死または死、活発な炎症、および肝不全、肝硬変および死をもたらし得る線維症によって特徴付けられる。発症率は１００００人に１人である。危険因子は、自己免疫疾患、Ｃ型肝炎の感染経験、または６ヵ月以上のＡ型肝炎またはＢ型肝炎抗原陽性である。
【００１５】
持続性慢性肝炎は、軽度で非進行性の肝臓炎症の形態であり、本発明によれば用語「肝臓感染症」に包含される疾患でもある。
【００１６】
本発明において使用するためのｓＬＤＬＲポリペプチドまたはタンパク質のムテインを得るために使用することができる、タンパク質におけるアミノ酸置換の製造法の例には、米国特許、ＭａｒｋらのＲＥ３３，６５３号、４，９５９，３１４号、４，５８８，５８５号および４，７３７，４６２号、Ｋｏｔｈｓらの５，１１６，９４３号、Ｎａｍｅｎらの４，９６５，１９５号、Ｃｈｏｎｇらの４，８７９，１１１号、ならびにＬｅｅらの５，０１７，６９１号明細書に示されたようなあらゆる既知の方法工程や、米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Ｓｈａｗら）に示されたリジン置換タンパク質が含まれる。
【００１７】
用語「融合タンパク質」は、他のタンパク質に融合された、ｓＬＤＬＲ、またはウイルス性ｓＬＤＬＲ、またはそれらのムテインまたはフラグメントを含むポリペプチドであって、たとえば体液中での長時間の滞留時間を有するポリペプチドを意味する。したがって、ｓＬＤＬＲは、他のタンパク質やポリペプチドなど、たとえばイムノグロブリンやそのフラグメントなどに融合されてもよい。
【００１８】
本明細書において用いられる「機能的誘導体」は、ｓＬＤＬＲおよびそれらのムテインおよび融合タンパク質の誘導体を含み、残基の側鎖に存在する官能基、またはＮ−もしくはＣ−末端基から、本技術分野において既知の手段により製造することができ、それらが依然として薬学的に許容できる、すなわちｓＬＤＬＲの活性と実質的に同様のタンパク質の活性が損なわれておらず、かつそれを含む組成物に毒性を与えない限り、本発明に含まれる。
【００１９】
これらの誘導体は、たとえば抗原性部位を隠し、体液におけるｓＬＤＬＲの滞留を延長するポリエチレングリコール側鎖を含み得る。他の誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル、カルボキシル基のアンモニアとの反応または一級アミンもしくは二級アミンとの反応によるアミド、アシル部分（たとえばアルカノイルまたは炭素環アロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離のアミノ基のＮ−アシル誘導体、アシル部分と形成される遊離のヒドロキシル基（たとえばセリルまたはトレオニル残基のもの）のＯ−アシル誘導体が含まれる。
【００２０】
ｓＬＤＬＲ、ムテインおよび融合タンパク質の「活性画分」として、本発明は、ｓＬＤＬＲと実質的に同様の活性を有するならば、タンパク質分子のみ、またはそこに結合した関連分子または残基、たとえば糖またはリン酸残基を伴うポリペプチド鎖のあらゆるフラグメントまたは前駆体、またはタンパク質分子もしくは糖残基それら自体の会合体（aggregates）を含める。
【００２１】
本発明の非常に好ましい実施態様において、用いられるｓＬＤＬＲは、ｓＬＤＬＲ、またはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは円順列誘導体である。これらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質または機能的誘導体は、ｓＬＤＬＲの生物学的活性を保持し、好ましくは本質的に少なくともｓＬＤＬＲと同様の活性を有する。理想的には、このようなタンパク質は、未修飾のｓＬＤＬＲと比較してさらに高い生物学的活性を有する。好ましい活性画分は、ｓＬＤＬＲの活性より良好な活性を有する、またはより良好な安定性またはより低い毒性もしくは免疫原性などのさらなる利点を有する、または大量生産が容易であるか、または精製が容易である。
【００２２】
ｓＬＤＬＲの機能的誘導体は、タンパク質の性質、たとえば安定性、半減期、バイオアベイラビリティー、人体による寛容、または免疫原性を改善するためにポリマーにコンジュゲートされてもよい。この目標を達成するために、ｓＬＤＬＲは、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合され得る。ＰＥＧ化は、たとえば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載された既知の方法により実施できる。
【００２３】
したがって、本発明の好ましい実施態様においては、使用されるｓＬＤＬＲは、ＰＥＧ化されている。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施態様において、使用されるｓＬＤＬＲは、ｓＬＤＬＲの全てまたは一部を含む融合タンパク質であり、イムノグロブリンの全てまたは一部に融合される。当業者は、得られる融合タンパク質はｓＬＤＬＲの生物学的活性を保持することを理解するであろう。この融合は、直接でもよく、または出来るだけ短い１〜３のアミノ酸残基長またはより長いたとえば１３アミノ酸残基長の短いリンカーペプチドを介してもよい。そのリンカーは、ｓＬＤＬＲ配列とイムノグロブリン配列との間に導入される、たとえば配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、またはＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを含む１３アミノ酸リンカー配列であり得る。得られる融合タンパク質は、体液中の滞留時間（半減期）の延長、特異的活性の増加、発現レベルの増加、または融合タンパク質の精製が容易であるといったように性質が改善されている。
【００２５】
好ましい実施態様において、ｓＬＤＬＲは、Ｉｇ分子の定常領域と融合される。好ましくは、たとえば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインなどの重鎖領域に融合される。ｓＬＤＬＲとイムノグロブリンの部分とを含む特定の融合タンパク質の産生は、たとえば国際公開第９９／０９０６３号パンフレットの実施例１１に記載されている。Ｉｇ分子の他のアイソマーも本発明による融合タンパク質の産生に適しており、たとえばアイソフォームＩｇＧ2またはＩｇＧ4、またはＩｇＭやＩｇＡなどの他のＩｇクラスなどがある。融合タンパク質は、単量体または多量体、ヘテロ多量体またはホモ多量体のいずれでもよい。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様において、ｓＬＤＬＲは、約０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される。そのうえ、更に好ましい実施態様において、ｓＬＤＬＲは、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、または１〜１００μｇ／ｋｇ体重または約１０〜５０μｇ／ｋｇ体重の量で使用される。
【００２７】
本発明はさらに、肝臓感染症の予防および／または治療のための医薬の製造におけるｓＬＤＬＲのコーディング配列を含む発現ベクターの使用に関する。したがって、遺伝子治療的アプローチが、該疾患を治療および／または予防するために使用される。有利には、その後、ｓＬＤＬＲの発現がインサイチュで起こる。
【００２８】
本発明はさらに、肝臓感染症、関節炎または炎症性大腸炎の治療および／または予防のための医薬の製造におけるｓＬＤＬＲを産生するよう遺伝的に改変されている細胞の使用に関する。
【００２９】
「薬学的に許容され得る」との定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げず、投与されるホストに対して毒性がない、あらゆる担体を包含することを意味する。たとえば、非経口投与として、活性タンパク質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン、リンガー液などのビヒクル中で注射のための単位投与形態に処方されてもよい。
【００３０】
本発明の医薬組成物の活性成分は、多様な方法で個体に投与することができる。投与経路には、皮内、経皮（たとえば徐放製剤で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内経路が含まれる。任意のその他の治療的に有効な投与経路が使用でき、たとえば、上皮または内皮組織を介した吸収や、活性薬剤をコードするＤＮＡ分子を患者に投与し（たとえばベクターを用いて）、活性薬剤がインビボで発現および分泌されるようにする遺伝子治療がある。加えて、本発明のタンパク質は、薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどの生物学的に活性な薬剤である他の成分と共に投与することができる。
【００３１】
非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内）投与に関して、活性タンパク質は、薬学的に許容され得る非経口用ビヒクル（たとえば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）、および等張性を維持する添加剤（たとえばマンニトール）または化学的安定性を維持する添加剤（たとえば、保存料および緩衝剤）と共に、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として製剤されることができる。製剤は通常使用される技術により滅菌される。
【００３２】
本発明の活性タンパク質のバイオアベイラビリティーは、国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されているように、体内におけるその分子の半減期を増加させるコンジュゲート手法、たとえばその分子のポリエチレングリコールへの連結を用いることによって改善することもできる。
【００３３】
治療的に有効量の活性タンパク質は、アンタゴニストの種類、ＩＬ−１８に対するアンタゴニストの親和性、アンタゴニストにより示される未解決の細胞毒性、投与経路、患者の臨床症状（内因性ＩＬ−１８活性の非毒性レベルを維持するのが望ましいことなど）などの多くの変数の関数となるであろう。
【００３４】
「治療的に有効量」とは、投与された場合、ｓＬＤＬＲがＨＢＶウイルスの阻害をもたらす量である。単回または複数回投与として個体に投与される投与量は、ｓＬＤＬＲ薬物動態特性、投与経路、患者の症状および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の範囲、併用療法、治療頻度ならびに期待される効果などの多様な因子によって変わる。確立された投与量範囲の調整および操作は充分に当業者の能力の範囲内であり、ならびに個体におけるＩＬ−１８の阻害を測定するインビトロおよびインビボ法の範囲内である。
【００３５】
本発明によれば、ｓＬＤＬＲは、約０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される。さらに好ましいｓＬＤＬＲの量は、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、または約１〜１００μｇ／ｋｇ体重または約１０〜５０μｇ／ｋｇ体重の量である。
【００３６】
本発明による好ましい投与経路は、皮下経路による投与である。本発明によれば筋肉内投与がさらに好ましい。
【００３７】
さらに好ましい実施態様において、ｓＬＤＬＲは毎日、または一日おきに投与される。
【００３８】
日用量は通常、分割投与で、または所望の結果を得るために有効な徐放形態で投与される。２回目またはその後の投与は、初回または前回個体に投与された用量と同じまたはより少ない量、またはより多い量の投薬量で行うことができる。２回目またはその後の投与は、疾患の発症中または発症前に投与することができる。
【００３９】
本発明によれば、ｓＬＤＬＲは、他の治療計画または薬剤に先立って、または同時に、または連続して（たとえば、多剤投与計画）、治療的に有効量で、その計画の有効性に従って医師により決定されたように、個体に予防的または治療的に投与することができる。他の治療薬剤と同時に投与される活性薬剤は、同一または異なる組成物で投与することができる。
【００４０】
ここに本発明を説明したように、以下の実施例を参照することにより容易に理解されるであろう。この実施例は、例として提供されるものであり、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【００４１】
実施例１：ｓＬＤＬＲの製造
１．１ ＨＳＬＤＬＲフラグメントのＰＣＲ増幅
＋２９２および＋３３１フラグメントＬＤＬＲ遺伝子を、完全ＬＤＬＲ遺伝子をテンプレートとして用いてＰＣＲ増幅により単離した。増幅は、テンプレート１ｎｇ、各プライマー４００ｎｇ（６．１節参照）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物、２ｍＭのＭｇＣｌ2、５Ｕ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）を、酵素を補足した緩衝液中に含有する反応混合物において、総反応容量１００μｌで行なった。まず９４℃で２分加熱し、３１回の熱サイクル（１分９４℃、１分６５℃、２分７２℃）、その後７２℃で１０分処理した。
【００４２】
１．２ プラスミドＤＮＡの製造
プラスミドＤＮＡを市販のキット（キアゲン、ＤＮＡ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、カタログ番号１２１６２）を用いて製造者により記載されたプロトコールにしたがって製造した。
【００４３】
１．３ トランスフェクションと遺伝子増幅
ＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞（ＤＨＦＲ活性欠損）を１０％ＦＢＳ補足Ｆ１２中で増殖させた。トランスフェクションは、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ）（ギブコ、ＢＲＬ）を用いて製造者により記載されたプロトコールにしたがってカチオン性リポソームにより行なった。トランスフェクションの７２時間後、細胞を選択培地に移した。ＤＨＦＲ活性発現細胞はコロニーを形成し、コロニーをトリプシン浸漬ペーパーディスクを用いて細胞を持ちあげることにより単離し、ｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性についてスクリーニングした。
【００４４】
遺伝子増幅は以下の手順で行われた。
【００４５】
選択培地で増殖されたコロニー（ＤＨＦＲ活性陽性）を、低密度（４０００細胞個／ｃｍ2）で５−６のＴフラスコに播種し、各フラスコは、メトトレキサートを０（対照として）〜１００ｎＭまでの範囲の濃度で増加させながら含有した。
【００４６】
１．ＭＴＸに曝した約１０日後、耐性コロニーがＴフラスコの一部で顕微鏡的に可視化された。約１０％の細胞生存率を示す培養物が次の増幅工程に選択された。
２．細胞が低密度（４０００細胞個／ｃｍ2）で５−６のＴフラスコに再播種され、各フラスコは、異なる濃度のメトトレキサートを含有した。細胞は工程１で選択された濃度（最低濃度）から、選択濃度の１０倍（最高濃度）までの範囲でＭＴＸの濃度を増加させながら再播種された。
３．工程１〜２が次の増幅ラウンドとして繰り返された。
４．最終の遺伝子増幅ラウンドの後、細胞は限界希釈によりサブクローニングされた。
５．ｒ−ｈｓＬＤＬＲを従来の方法により細胞から得た。
【００４７】
１．４ バイオアッセイ
判定量的バイオアッセイを開発段階を通して生成物をモニターするために使用した。アッセイは、ＩＦＮ−βに使用されるバイオアッセイと同様ＣＰＥ阻害アッセイとした。開発の初期段階では、ＩＦＮ−βを標準として使用した。後に精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲのバッチにより置き換えた。
【００４８】
ＷＩＳＨ細胞を、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で、１０％ＦＢＳおよび４ｍＭグルタミンを補足した１×ＭＥＭで培養した。アッセイの２４時間前に、指数関数的に増殖した細胞を９６−ウェルＴＣプレートに、４００００細胞個／ウェルで播種した。検査されるべきサンプルおよび標準物質を希釈し、細胞含有ウェル中に分散させた。ＶＳＶを直ちにウェルにＭＯＩ ０．５ｐｆｕ／細胞で添加した。プレートを３７℃で１６〜１８時間インキュベートし、ついでエタノールで洗浄した。生存している細胞の単層をグラムクリスタルバイオレット（Gram Crystal Violet）染色により観察した。標準物質と比較した細胞変性効果の定量は、標準濃度に対する色密度をプロットすることにより行なわれた。
【００４９】
実施例２：ウイルス感染ヘパトーマ細胞からのＨＢＶ放出阻害
ｓＬＤＬＲの病原性ウイルスを阻害する能力が、ＮＩＡＩＤ抗微生物獲得調整機関（ＡＡＣＦ）により評価された。コンフルエントな２．２．１５細胞（ＨＢＶ感染ヒトＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）、構造的にＨＢＶウイルス粒子を出芽している）培養物を、９６ウェル平底組織培養プレート上に、２％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した（Korba & Gerin, Antivir.Res. 19:55-70, 1992）。培養物（２つの複製プレート上の４つの試験濃度のそれぞれにつき６つ）を、連続９日間毎日ｓＬＤＬ化合物で処理した。培地を毎日新しい試験化合物と交換した。培養培地中のＨＢＶウイルス粒子ＤＮＡを最後の処理の２４時間後に定量ブロットハイブリダイゼーションにより評価した。ニュートラルレッド色素（５１０ｎＭでの取り込み色素の吸光度［Ａ５１０］）の取り込みを使用して、最後の処理の２４時間後の毒素の相対レベルを決定した（Korba & Gerin, Antivir.Res. 19:55-70, 1992）。値は、同じプレート上に保持された未処理の細胞の９つの独立した培養物の平均のＡ５１０値の百分率として示す。毒性分析のための培養物は、抗ウイルス分析に使用したストック細胞の同一プールで同時に播種され、同一の方法で保持された。全部で３つの培養物を各濃度の試験化合物で処理した。毒性分析は、１０倍高いレベルの試験化合物を利用した（３倍連続希釈法で）。ＣＣ５０、ＥＣ５０、ＥＣ９０、およびＳ．Ｉ．（ＣＣ５０／ＥＣ９０）を算出した。ラミブジン（３ＴＣ）を陽性アッセイ対照として使用した。以下の結果が得られた。
【００５０】
【表１】
【００５１】
したがって、ｓＬＤＬＲは、毒性をはるかに下回る濃度でウイルス感染細胞からのＨＢＶウイルス粒子の形成を阻害した。
【００５２】
さらに、ｓＬＤＬＲで行った試験は、以下の表に示すように、アデフォビルジピボキシル耐性変異体と同様に全ての試験ラミブジンに対して活性であったことを示した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
特定の実施態様の前述の記載は、他のものが現在の知識を適用することにより実施できるように本発明の一般的な性質を明らかにし、多様な適用に対して一般的な概念から逸脱することなくそのような特定の実施態様を容易に改変および／または適合し、したがってそのような適合および改変は、開示された実施態様と同等の意味および範囲内に包含されることを意図されるべきである。本明細書において用いられる表現や専門用語は、説明を目的とするものであり、限定を目的とするものではないことが理解されるべきである。
【００５５】
［参考文献］
Agnello et al, (1999), PNAS, 96:12766-12771
Fischer et al, (1993), Science, Vol.262, 250-253
Goldstein et al, (1979), Nature, 279, 679-685
Yamamoto et al, (1984), Cell, Vol.39, 27-38
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性肝炎、とりわけＨＢＶ感染における可溶性ＬＤＬ受容体（ｓＬＤＬＲ）の治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
すべての真核生物の原形質膜の構成成分であるコレステロールは、高等生物における細胞の増殖および生存に不可欠なものである。しかしながら、コレステロールの血清濃度が高いと、全身の動脈におけるアテロームプラークの形成により疾患および死の原因となる。哺乳類におけるコレステロール合成の主な部位は肝臓である。かなりな量のコレステロールが腸によっても形成される。これらの臓器によるコレステロール形成率は、食事供給源から吸収されるコレステロールの量によく反応する。肝臓および腸の外側の細胞は、コレステロールを新たに合成するよりもむしろ血清からコレステロールを捕捉する。コレステロールや他の脂質は、リポタンパク質により体液で運ばれ、リポタンパク質は比重の増加にしたがって分類される。リポタンパク質は疎水性脂質の芯とそれを取り囲む極性脂質とアポタンパク質の殻とからなる粒子である。これらのリポタンパク質には２つの役割があり、非常に疎水性の高い脂質を可溶化し、そして特定の標的細胞および組織の内外への特定の脂質の移動を制御するシグナルを含む。コレステロールは、非肝細胞の原形質膜上の特異的受容体に結合する低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）により体液で運ばれる。受容体−ＬＤＬ複合体は、その後受容体介在性エンドサイトーシスとして知られる輸送機序により細胞内に取り込まれる（Goldsteinら、1979）。低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体は、哺乳類の細胞において多数のリガンドのエンドサイトーシスを介在する、構造的に関連した細胞表面受容体ファミリーのプロトタイプである。
【０００３】
ヒトＬＤＬ受容体についてクローンニングされた５．３キロベースのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、５つの構造的ドメインを明らかにし、そのうちのいくつかは他のタンパク質と配列相同性を共有する。そのＮＨ2−末端リガンド結合ドメインは３２２残基からなり、４７個のシステイン残基を含む。このドメインの後に４つの別のドメインが続き、１つ目は約３５０アミノ酸残基からなり、ＥＧＦ受容体に相同性を有し、２つ目はＯ−結合糖に富んだ４８アミノ酸残基からなり、３つ目は２２アミノ酸残基の１回膜貫通ドメインであり、そして４つ目は５０アミノ酸残基の細胞質ドメインである（Yamamotoら、1984）。
【０００４】
抗ウイルス活性を示す可溶型ＬＤＬＲ、ｓＬＤＬＲは、インターフェロン誘導細胞の培養上清から（Fischerら、1993）および体液中（Fischerら、1994）で同定、単離された。ＩＦＮによる抗ウイルス状態の誘導に関与するいくつかのインターフェロン誘導タンパク質が同定された。抗ウイルス活性を示すそのタンパク質の１つがヒト羊膜ＷＩＳＨ細胞の培養上清中で産生され蓄積された。このタンパク質は均質にまで精製され、ｓＬＤＬＲと同定された（ＥＰ０５５３６６７およびFischerら、1993参照）。ｓＬＤＬＲは、インターフェロンに応答して抗ウイルス状態に入った哺乳類細胞により培地に分泌されることがわかった。インターフェロンと対照的に、ｓＬＤＬＲは細胞において抗ウイルス状態を誘導しないが、それ自身が抗ウイルス性である。ｓＬＤＬＲは明らかにウイルスの複製、成熟および出芽の過程全体にわたって存在しなければならないことがわかった。これは、ｓＬＤＬＲがウイルスの集合（assembly）または出芽の阻害を導く複雑な過程に関与しているということを示唆する（未公開データ）。近年、Ｃ型肝炎ウイルスのエンドサイトーシスが、培養細胞上のＬＤＬ受容体により媒介されるということが示された（Agnelloら、1999）。
【０００５】
肝臓の損傷や障害には様々な要因がある。ウイルスもしくは細菌感染、アルコール依存症、免疫学的疾患、または癌などによるものである。
【０００６】
Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスによるウイルス性肝炎は、世界中の多数の人々を苦しめる管理がうまくいっていない疾患である。既知の肝炎ウイルスの数は絶えず増加している。ＢおよびＣ型肝炎ウイルスはさておき、ウイルス関連肝炎の原因となる少なくとも４つの他のウイルスがこれまでに発見されており、Ａ型、Ｄ型、Ｅ型およびＧ型肝炎ウイルスと呼ばれている。
【０００７】
ラミブジン（３ＴＣ）、商品名エピビル（Epivir）という抗ＨＩＶ治療は、Ｂ型肝炎の治療にも承認されている。研究では、エピビルがＢ型肝炎ウイルスの量を非常に低いレベルに減少させることができるが、この効果は必ずしも充分なものではない。
【０００８】
アデフォビルジピボキシル（ＡＤＶ）は、慢性Ｂ型肝炎に効果を示すもう１つのＨＩＶ治療薬である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ｓＬＤＬＲがＨＢＶによる肝臓感染症の治療および／または予防に有効であるという知見に基づくものである。
【００１０】
本発明の第１の目的は、ＨＢＶによる肝臓感染症の治療および／または予防のための新規な手段を提供することである。したがって、本発明はＨＢＶによるウイルス性肝炎の治療および／または予防のための医薬の製造のためのｓＬＤＬＲの使用に関する。
【００１１】
遺伝子医療的アプローチを適用し、ｓＬＤＬＲを肝臓に送達するために、本発明のさらなる側面は、病状の治療および／または予防のためのｓＬＤＬＲのコーディング配列を含む発現ベクターの使用に関する。本発明はさらに、ＨＢＶによる肝臓感染症の予防および／または治療のための、ｓＬＤＬＲの内因性遺伝子活性化の使用、およびｓＬＤＬＲを発現するように遺伝子操作された細胞の使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ウイルス性肝炎、とりわけＨＢＶウイルスによる肝炎におけるｓＬＤＬＲの有益な効果の発見に基づくものである。
【００１３】
本発明の第１の側面によれば、ｓＬＤＬＲはＨＢＶによるウイルス性肝臓感染症の治療および／または予防のための医薬の製造のために使用される。
【００１４】
本発明によれば、ｓＬＤＬＲは、慢性活性肝炎（慢性進行性肝炎とも呼ばれる）の治療および／または予防のための医薬の製造のためにも使用される。慢性活性肝炎は、肝臓細胞を損傷する肝臓の継続的な炎症である。慢性活性肝炎の原因には、ウイルス感染とその他のものとがある。その疾患は、肝臓細胞の壊死または死、活発な炎症、および肝不全、肝硬変および死をもたらし得る線維症によって特徴付けられる。発症率は１００００人に１人である。危険因子は、自己免疫疾患、Ｃ型肝炎の感染経験、または６ヵ月以上のＡ型肝炎またはＢ型肝炎抗原陽性である。
【００１５】
持続性慢性肝炎は、軽度で非進行性の肝臓炎症の形態であり、本発明によれば用語「肝臓感染症」に包含される疾患でもある。
【００１６】
本発明において使用するためのｓＬＤＬＲポリペプチドまたはタンパク質のムテインを得るために使用することができる、タンパク質におけるアミノ酸置換の製造法の例には、米国特許、ＭａｒｋらのＲＥ３３，６５３号、４，９５９，３１４号、４，５８８，５８５号および４，７３７，４６２号、Ｋｏｔｈｓらの５，１１６，９４３号、Ｎａｍｅｎらの４，９６５，１９５号、Ｃｈｏｎｇらの４，８７９，１１１号、ならびにＬｅｅらの５，０１７，６９１号明細書に示されたようなあらゆる既知の方法工程や、米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Ｓｈａｗら）に示されたリジン置換タンパク質が含まれる。
【００１７】
用語「融合タンパク質」は、他のタンパク質に融合された、ｓＬＤＬＲ、またはウイルス性ｓＬＤＬＲ、またはそれらのムテインまたはフラグメントを含むポリペプチドであって、たとえば体液中での長時間の滞留時間を有するポリペプチドを意味する。したがって、ｓＬＤＬＲは、他のタンパク質やポリペプチドなど、たとえばイムノグロブリンやそのフラグメントなどに融合されてもよい。
【００１８】
本明細書において用いられる「機能的誘導体」は、ｓＬＤＬＲおよびそれらのムテインおよび融合タンパク質の誘導体を含み、残基の側鎖に存在する官能基、またはＮ−もしくはＣ−末端基から、本技術分野において既知の手段により製造することができ、それらが依然として薬学的に許容できる、すなわちｓＬＤＬＲの活性と実質的に同様のタンパク質の活性が損なわれておらず、かつそれを含む組成物に毒性を与えない限り、本発明に含まれる。
【００１９】
これらの誘導体は、たとえば抗原性部位を隠し、体液におけるｓＬＤＬＲの滞留を延長するポリエチレングリコール側鎖を含み得る。他の誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル、カルボキシル基のアンモニアとの反応または一級アミンもしくは二級アミンとの反応によるアミド、アシル部分（たとえばアルカノイルまたは炭素環アロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離のアミノ基のＮ−アシル誘導体、アシル部分と形成される遊離のヒドロキシル基（たとえばセリルまたはトレオニル残基のもの）のＯ−アシル誘導体が含まれる。
【００２０】
ｓＬＤＬＲ、ムテインおよび融合タンパク質の「活性画分」として、本発明は、ｓＬＤＬＲと実質的に同様の活性を有するならば、タンパク質分子のみ、またはそこに結合した関連分子または残基、たとえば糖またはリン酸残基を伴うポリペプチド鎖のあらゆるフラグメントまたは前駆体、またはタンパク質分子もしくは糖残基それら自体の会合体（aggregates）を含める。
【００２１】
本発明の非常に好ましい実施態様において、用いられるｓＬＤＬＲは、ｓＬＤＬＲ、またはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは円順列誘導体である。これらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質または機能的誘導体は、ｓＬＤＬＲの生物学的活性を保持し、好ましくは本質的に少なくともｓＬＤＬＲと同様の活性を有する。理想的には、このようなタンパク質は、未修飾のｓＬＤＬＲと比較してさらに高い生物学的活性を有する。好ましい活性画分は、ｓＬＤＬＲの活性より良好な活性を有する、またはより良好な安定性またはより低い毒性もしくは免疫原性などのさらなる利点を有する、または大量生産が容易であるか、または精製が容易である。
【００２２】
ｓＬＤＬＲの機能的誘導体は、タンパク質の性質、たとえば安定性、半減期、バイオアベイラビリティー、人体による寛容、または免疫原性を改善するためにポリマーにコンジュゲートされてもよい。この目標を達成するために、ｓＬＤＬＲは、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合され得る。ＰＥＧ化は、たとえば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載された既知の方法により実施できる。
【００２３】
したがって、本発明の好ましい実施態様においては、使用されるｓＬＤＬＲは、ＰＥＧ化されている。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施態様において、使用されるｓＬＤＬＲは、ｓＬＤＬＲの全てまたは一部を含む融合タンパク質であり、イムノグロブリンの全てまたは一部に融合される。当業者は、得られる融合タンパク質はｓＬＤＬＲの生物学的活性を保持することを理解するであろう。この融合は、直接でもよく、または出来るだけ短い１〜３のアミノ酸残基長またはより長いたとえば１３アミノ酸残基長の短いリンカーペプチドを介してもよい。そのリンカーは、ｓＬＤＬＲ配列とイムノグロブリン配列との間に導入される、たとえば配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、またはＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを含む１３アミノ酸リンカー配列であり得る。得られる融合タンパク質は、体液中の滞留時間（半減期）の延長、特異的活性の増加、発現レベルの増加、または融合タンパク質の精製が容易であるといったように性質が改善されている。
【００２５】
好ましい実施態様において、ｓＬＤＬＲは、Ｉｇ分子の定常領域と融合される。好ましくは、たとえば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインなどの重鎖領域に融合される。ｓＬＤＬＲとイムノグロブリンの部分とを含む特定の融合タンパク質の産生は、たとえば国際公開第９９／０９０６３号パンフレットの実施例１１に記載されている。Ｉｇ分子の他のアイソマーも本発明による融合タンパク質の産生に適しており、たとえばアイソフォームＩｇＧ2またはＩｇＧ4、またはＩｇＭやＩｇＡなどの他のＩｇクラスなどがある。融合タンパク質は、単量体または多量体、ヘテロ多量体またはホモ多量体のいずれでもよい。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様において、ｓＬＤＬＲは、約０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される。そのうえ、更に好ましい実施態様において、ｓＬＤＬＲは、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、または１〜１００μｇ／ｋｇ体重または約１０〜５０μｇ／ｋｇ体重の量で使用される。
【００２７】
本発明はさらに、肝臓感染症の予防および／または治療のための医薬の製造におけるｓＬＤＬＲのコーディング配列を含む発現ベクターの使用に関する。したがって、遺伝子治療的アプローチが、該疾患を治療および／または予防するために使用される。有利には、その後、ｓＬＤＬＲの発現がインサイチュで起こる。
【００２８】
本発明はさらに、肝臓感染症、関節炎または炎症性大腸炎の治療および／または予防のための医薬の製造におけるｓＬＤＬＲを産生するよう遺伝的に改変されている細胞の使用に関する。
【００２９】
「薬学的に許容され得る」との定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げず、投与されるホストに対して毒性がない、あらゆる担体を包含することを意味する。たとえば、非経口投与として、活性タンパク質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン、リンガー液などのビヒクル中で注射のための単位投与形態に処方されてもよい。
【００３０】
本発明の医薬組成物の活性成分は、多様な方法で個体に投与することができる。投与経路には、皮内、経皮（たとえば徐放製剤で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内経路が含まれる。任意のその他の治療的に有効な投与経路が使用でき、たとえば、上皮または内皮組織を介した吸収や、活性薬剤をコードするＤＮＡ分子を患者に投与し（たとえばベクターを用いて）、活性薬剤がインビボで発現および分泌されるようにする遺伝子治療がある。加えて、本発明のタンパク質は、薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどの生物学的に活性な薬剤である他の成分と共に投与することができる。
【００３１】
非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内）投与に関して、活性タンパク質は、薬学的に許容され得る非経口用ビヒクル（たとえば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）、および等張性を維持する添加剤（たとえばマンニトール）または化学的安定性を維持する添加剤（たとえば、保存料および緩衝剤）と共に、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として製剤されることができる。製剤は通常使用される技術により滅菌される。
【００３２】
本発明の活性タンパク質のバイオアベイラビリティーは、国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されているように、体内におけるその分子の半減期を増加させるコンジュゲート手法、たとえばその分子のポリエチレングリコールへの連結を用いることによって改善することもできる。
【００３３】
治療的に有効量の活性タンパク質は、アンタゴニストの種類、ＩＬ−１８に対するアンタゴニストの親和性、アンタゴニストにより示される未解決の細胞毒性、投与経路、患者の臨床症状（内因性ＩＬ−１８活性の非毒性レベルを維持するのが望ましいことなど）などの多くの変数の関数となるであろう。
【００３４】
「治療的に有効量」とは、投与された場合、ｓＬＤＬＲがＨＢＶウイルスの阻害をもたらす量である。単回または複数回投与として個体に投与される投与量は、ｓＬＤＬＲ薬物動態特性、投与経路、患者の症状および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の範囲、併用療法、治療頻度ならびに期待される効果などの多様な因子によって変わる。確立された投与量範囲の調整および操作は充分に当業者の能力の範囲内であり、ならびに個体におけるＩＬ−１８の阻害を測定するインビトロおよびインビボ法の範囲内である。
【００３５】
本発明によれば、ｓＬＤＬＲは、約０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される。さらに好ましいｓＬＤＬＲの量は、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、または約１〜１００μｇ／ｋｇ体重または約１０〜５０μｇ／ｋｇ体重の量である。
【００３６】
本発明による好ましい投与経路は、皮下経路による投与である。本発明によれば筋肉内投与がさらに好ましい。
【００３７】
さらに好ましい実施態様において、ｓＬＤＬＲは毎日、または一日おきに投与される。
【００３８】
日用量は通常、分割投与で、または所望の結果を得るために有効な徐放形態で投与される。２回目またはその後の投与は、初回または前回個体に投与された用量と同じまたはより少ない量、またはより多い量の投薬量で行うことができる。２回目またはその後の投与は、疾患の発症中または発症前に投与することができる。
【００３９】
本発明によれば、ｓＬＤＬＲは、他の治療計画または薬剤に先立って、または同時に、または連続して（たとえば、多剤投与計画）、治療的に有効量で、その計画の有効性に従って医師により決定されたように、個体に予防的または治療的に投与することができる。他の治療薬剤と同時に投与される活性薬剤は、同一または異なる組成物で投与することができる。
【００４０】
ここに本発明を説明したように、以下の実施例を参照することにより容易に理解されるであろう。この実施例は、例として提供されるものであり、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【００４１】
実施例１：ｓＬＤＬＲの製造
１．１ ＨＳＬＤＬＲフラグメントのＰＣＲ増幅
＋２９２および＋３３１フラグメントＬＤＬＲ遺伝子を、完全ＬＤＬＲ遺伝子をテンプレートとして用いてＰＣＲ増幅により単離した。増幅は、テンプレート１ｎｇ、各プライマー４００ｎｇ（６．１節参照）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物、２ｍＭのＭｇＣｌ2、５Ｕ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）を、酵素を補足した緩衝液中に含有する反応混合物において、総反応容量１００μｌで行なった。まず９４℃で２分加熱し、３１回の熱サイクル（１分９４℃、１分６５℃、２分７２℃）、その後７２℃で１０分処理した。
【００４２】
１．２ プラスミドＤＮＡの製造
プラスミドＤＮＡを市販のキット（キアゲン、ＤＮＡ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、カタログ番号１２１６２）を用いて製造者により記載されたプロトコールにしたがって製造した。
【００４３】
１．３ トランスフェクションと遺伝子増幅
ＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞（ＤＨＦＲ活性欠損）を１０％ＦＢＳ補足Ｆ１２中で増殖させた。トランスフェクションは、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ）（ギブコ、ＢＲＬ）を用いて製造者により記載されたプロトコールにしたがってカチオン性リポソームにより行なった。トランスフェクションの７２時間後、細胞を選択培地に移した。ＤＨＦＲ活性発現細胞はコロニーを形成し、コロニーをトリプシン浸漬ペーパーディスクを用いて細胞を持ちあげることにより単離し、ｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性についてスクリーニングした。
【００４４】
遺伝子増幅は以下の手順で行われた。
【００４５】
選択培地で増殖されたコロニー（ＤＨＦＲ活性陽性）を、低密度（４０００細胞個／ｃｍ2）で５−６のＴフラスコに播種し、各フラスコは、メトトレキサートを０（対照として）〜１００ｎＭまでの範囲の濃度で増加させながら含有した。
【００４６】
１．ＭＴＸに曝した約１０日後、耐性コロニーがＴフラスコの一部で顕微鏡的に可視化された。約１０％の細胞生存率を示す培養物が次の増幅工程に選択された。
２．細胞が低密度（４０００細胞個／ｃｍ2）で５−６のＴフラスコに再播種され、各フラスコは、異なる濃度のメトトレキサートを含有した。細胞は工程１で選択された濃度（最低濃度）から、選択濃度の１０倍（最高濃度）までの範囲でＭＴＸの濃度を増加させながら再播種された。
３．工程１〜２が次の増幅ラウンドとして繰り返された。
４．最終の遺伝子増幅ラウンドの後、細胞は限界希釈によりサブクローニングされた。
５．ｒ−ｈｓＬＤＬＲを従来の方法により細胞から得た。
【００４７】
１．４ バイオアッセイ
判定量的バイオアッセイを開発段階を通して生成物をモニターするために使用した。アッセイは、ＩＦＮ−βに使用されるバイオアッセイと同様ＣＰＥ阻害アッセイとした。開発の初期段階では、ＩＦＮ−βを標準として使用した。後に精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲのバッチにより置き換えた。
【００４８】
ＷＩＳＨ細胞を、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で、１０％ＦＢＳおよび４ｍＭグルタミンを補足した１×ＭＥＭで培養した。アッセイの２４時間前に、指数関数的に増殖した細胞を９６−ウェルＴＣプレートに、４００００細胞個／ウェルで播種した。検査されるべきサンプルおよび標準物質を希釈し、細胞含有ウェル中に分散させた。ＶＳＶを直ちにウェルにＭＯＩ ０．５ｐｆｕ／細胞で添加した。プレートを３７℃で１６〜１８時間インキュベートし、ついでエタノールで洗浄した。生存している細胞の単層をグラムクリスタルバイオレット（Gram Crystal Violet）染色により観察した。標準物質と比較した細胞変性効果の定量は、標準濃度に対する色密度をプロットすることにより行なわれた。
【００４９】
実施例２：ウイルス感染ヘパトーマ細胞からのＨＢＶ放出阻害
ｓＬＤＬＲの病原性ウイルスを阻害する能力が、ＮＩＡＩＤ抗微生物獲得調整機関（ＡＡＣＦ）により評価された。コンフルエントな２．２．１５細胞（ＨＢＶ感染ヒトＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）、構造的にＨＢＶウイルス粒子を出芽している）培養物を、９６ウェル平底組織培養プレート上に、２％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した（Korba & Gerin, Antivir.Res. 19:55-70, 1992）。培養物（２つの複製プレート上の４つの試験濃度のそれぞれにつき６つ）を、連続９日間毎日ｓＬＤＬ化合物で処理した。培地を毎日新しい試験化合物と交換した。培養培地中のＨＢＶウイルス粒子ＤＮＡを最後の処理の２４時間後に定量ブロットハイブリダイゼーションにより評価した。ニュートラルレッド色素（５１０ｎＭでの取り込み色素の吸光度［Ａ５１０］）の取り込みを使用して、最後の処理の２４時間後の毒素の相対レベルを決定した（Korba & Gerin, Antivir.Res. 19:55-70, 1992）。値は、同じプレート上に保持された未処理の細胞の９つの独立した培養物の平均のＡ５１０値の百分率として示す。毒性分析のための培養物は、抗ウイルス分析に使用したストック細胞の同一プールで同時に播種され、同一の方法で保持された。全部で３つの培養物を各濃度の試験化合物で処理した。毒性分析は、１０倍高いレベルの試験化合物を利用した（３倍連続希釈法で）。ＣＣ５０、ＥＣ５０、ＥＣ９０、およびＳ．Ｉ．（ＣＣ５０／ＥＣ９０）を算出した。ラミブジン（３ＴＣ）を陽性アッセイ対照として使用した。以下の結果が得られた。
【００５０】
【表１】
【００５１】
したがって、ｓＬＤＬＲは、毒性をはるかに下回る濃度でウイルス感染細胞からのＨＢＶウイルス粒子の形成を阻害した。
【００５２】
さらに、ｓＬＤＬＲで行った試験は、以下の表に示すように、アデフォビルジピボキシル耐性変異体と同様に全ての試験ラミブジンに対して活性であったことを示した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
特定の実施態様の前述の記載は、他のものが現在の知識を適用することにより実施できるように本発明の一般的な性質を明らかにし、多様な適用に対して一般的な概念から逸脱することなくそのような特定の実施態様を容易に改変および／または適合し、したがってそのような適合および改変は、開示された実施態様と同等の意味および範囲内に包含されることを意図されるべきである。本明細書において用いられる表現や専門用語は、説明を目的とするものであり、限定を目的とするものではないことが理解されるべきである。
【００５５】
［参考文献］
Agnello et al, (1999), PNAS, 96:12766-12771
Fischer et al, (1993), Science, Vol.262, 250-253
Goldstein et al, (1979), Nature, 279, 679-685
Yamamoto et al, (1984), Cell, Vol.39, 27-38
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓感染症の治療および／または予防のための医薬の製造のためのｓＬＤＬＲの使用。
【請求項２】
肝臓感染症がウイルス性である請求項１記載の使用。
【請求項３】
肝臓感染症が急性である請求項１記載の使用。
【請求項４】
肝臓感染症が慢性である請求項１記載の使用。
【請求項５】
ｓＬＤＬＲが、ｓＬＤＬＲ、またはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは円順列誘導体である請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ｓＬＤＬＲがＰＥＧ化されている請求項５記載の使用。
【請求項７】
ｓＬＤＬＲが融合タンパク質であり、かつイムノグロブリンの全てまたは一部に融合されたｓＬＤＬＲの全てまたは一部を含む請求項５記載の使用。
【請求項８】
融合タンパク質が、イムノグロブリンの定常領域の全てまたは一部を含む請求項７記載の使用。
【請求項９】
イムノグロブリンがＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプである請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ｓＬＤＬＲが、約０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
ｓＬＤＬＲが、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、または１〜１００μｇ／ｋｇ体重、または約１０〜５０μｇ／ｋｇ体重の量で使用される請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
ｓＬＤＬＲが皮下に投与される請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
ｓＬＤＬＲが筋肉内に投与される請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
ｓＬＤＬＲが毎日投与される請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
ｓＬＤＬＲが一日おきに投与される請求項１〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
肝臓感染症の治療および／または予防のための医薬の製造におけるｓＬＤＬＲのコーディング配列を含む発現ベクターの使用。
【請求項１７】
遺伝子治療のための請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
肝臓感染症の治療および／または予防のための医薬の製造における、細胞におけるｓＬＤＬＲの内因性産生を誘導および／または増強するためのベクターの使用。
【請求項１９】
肝臓感染症の治療および／または予防のための医薬の製造における、ｓＬＤＬＲを産生するように遺伝的に改変された細胞の使用。
【請求項２０】
ＨＢＶによる肝臓感染症の治療および／または予防方法であって、それを必要とするホストに有効阻害量のｓＬＤＬＲを投与することを含む方法。
【請求項１】
肝臓感染症の治療および／または予防のための医薬の製造のためのｓＬＤＬＲの使用。
【請求項２】
肝臓感染症がウイルス性である請求項１記載の使用。
【請求項３】
肝臓感染症が急性である請求項１記載の使用。
【請求項４】
肝臓感染症が慢性である請求項１記載の使用。
【請求項５】
ｓＬＤＬＲが、ｓＬＤＬＲ、またはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは円順列誘導体である請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ｓＬＤＬＲがＰＥＧ化されている請求項５記載の使用。
【請求項７】
ｓＬＤＬＲが融合タンパク質であり、かつイムノグロブリンの全てまたは一部に融合されたｓＬＤＬＲの全てまたは一部を含む請求項５記載の使用。
【請求項８】
融合タンパク質が、イムノグロブリンの定常領域の全てまたは一部を含む請求項７記載の使用。
【請求項９】
イムノグロブリンがＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプである請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ｓＬＤＬＲが、約０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
ｓＬＤＬＲが、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、または１〜１００μｇ／ｋｇ体重、または約１０〜５０μｇ／ｋｇ体重の量で使用される請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
ｓＬＤＬＲが皮下に投与される請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
ｓＬＤＬＲが筋肉内に投与される請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
ｓＬＤＬＲが毎日投与される請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
ｓＬＤＬＲが一日おきに投与される請求項１〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
肝臓感染症の治療および／または予防のための医薬の製造におけるｓＬＤＬＲのコーディング配列を含む発現ベクターの使用。
【請求項１７】
遺伝子治療のための請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
肝臓感染症の治療および／または予防のための医薬の製造における、細胞におけるｓＬＤＬＲの内因性産生を誘導および／または増強するためのベクターの使用。
【請求項１９】
肝臓感染症の治療および／または予防のための医薬の製造における、ｓＬＤＬＲを産生するように遺伝的に改変された細胞の使用。
【請求項２０】
ＨＢＶによる肝臓感染症の治療および／または予防方法であって、それを必要とするホストに有効阻害量のｓＬＤＬＲを投与することを含む方法。
【公表番号】特表２０１１−５０９２５４（Ｐ２０１１−５０９２５４Ａ）
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１１４０（Ｐ２０１０−５４１１４０）
【出願日】平成２１年１月７日（２００９．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００９／００００２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８７６２２
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月７日（２００９．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００９／００００２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８７６２２
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
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