オリゴヌクレオチドの分析法
オリゴヌクレオチドの分析法を提供する。この方法は、オリゴヌクレオチドの混合物を、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下で脱塩することおよび／またはオンライン脱塩によって脱塩すること、脱塩されたオリゴヌクレオチド混合物を質量分析計へ導入すること、および質量分析計によって混合物に含まれる１種以上のオリゴヌクレオチドを定量することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオリゴヌクレオチドの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは医薬分野において現在かなり関心がもたれている。そのような化合物は、成長するオリゴヌクレオチド鎖へのシントンの段階的付加によって一般に合成される。単一ヌクレオチドの付加の基本的順序は、一般に脱保護−結合（couple）−酸化−キャップである。所望の配列アセンブリーの完成時には、合成中の競合反応を防ぐために用いられた保護基は除去される。そして、オリゴヌクレオチドが固相法を用いて合成される最も一般的な状況では、オリゴヌクレオチドは固体支持体から切り離される。従って、一般的な２２量体オリゴヌクレオチドの合成には多くの個別的な処理工程が含まれる。関与する工程数を考慮すると、現代のオリゴヌクレオチド合成化学は効率が高く、また、潜在的に反応性の部位が多く存在するにもかかわらず、少量の不純物が合成中にしばしば形成される。カップリング／キャッピング効率が１００％未満であるため、一般に、そのような不純物は予想よりも短い配列、あるいは副反応に起因するかもしれない予想分子量以上のものからなる成分を含む。従って、オリゴヌクレオチド生成物中に存在する不純物レベルの識別でき、且つ定量できる必要がある。
【０００３】
オリゴヌクレオチド中に存在する不純物の定量法には、定量のために紫外線検出、特性決定のために質量分光分析を伴うＨＰＬＣクロマトグラフィーが一般的に含まれる。国際公開第２００６／１０７７７５号には、オリゴヌクレオチドがクロマトグラフィーによって部分的に分離され、分離されたオリゴヌクレオチドの定量が、同時溶出オリゴヌクレオチドの質量分析による定量と組み合わせたＵＶ分析によって実施される方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０７７７５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この方法は多くの時間を必要とするクロマトグラフィー分析および複数の定量法を必要とする。従って、より速くかつより簡単な分析に適した別の方法を見つけ出すことが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の側面では、
ａ）オリゴヌクレオチドの混合物を、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下で脱塩すること；
ｂ）オリゴヌクレオチドの脱塩された混合物を質量分析計へ導入すること；および
ｃ）混合物に含まれる１種以上のオリゴヌクレオチドを質量分析計によって定量すること
を含む方法を提供する。
【０００７】
本発明の第２の側面では、
ａ）オリゴヌクレオチドの混合物をオン−ライン脱塩すること；
ｂ）オリゴヌクレオチドの脱塩した混合物を質量分析計へ導入すること；および
ｃ）混合物に含まれる１種以上のオリゴヌクレオチドを質量分析計によって定量すること
を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施例１における脱塩処理の結果を示す。すなわち、上のクロマトグラムはＵＶ分光計記録を示し、下のクロマトグラムは質量分析計記録を示す。
【図２】図２は、実施例１のオリゴヌクレオチド試料中に存在する不純物の質量スペクトルを示す。
【図３】図３は、不純物がスパイクされたオリゴヌクレオチド試料について得られたプロットを示す。
【図４】図４は、実施例２のオリゴヌクレオチド試料について、各濃度レベルで、三連一組の反復試験における各質量の強度を平均し、試料対標準の平均強度比を試料濃度に対してプロットしたグラフである。
【図５】図５は、実施例２のオリゴヌクレオチド試料中に通常存在する不純物（例えば、ＰＯおよびＮ−１成分）についてのプロットを示す。
【図６】図６は、実施例３のオリゴヌクレオチド試料について、ソフトウエアのＭａｘＥｎｔ機能を用いたｍ／ｚスペクトルのデコンボリューション後のプロットを示す。
【図７】図７は、実施例４のオリゴヌクレオチド試料について、ソフトウエアのＭａｘＥｎｔ機能を用いたｍ／ｚスペクトルのデコンボリューション後のプロットを示す。
【図８】図８は、粗製オリゴヌクレオチド合成溶液の分析結果を示す。
【図９】図９は、単一ストランド領域を示すRNA二重鎖のデコンボリューション後のスペクトルを示す。
【図１０】図１０は、二重鎖領域を示すRNA二重鎖のデコンボリューション後のスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の方法で用いることができるオリゴヌクレオチドの混合物は、一般的には固相化学合成、好ましくはホスホロアミダイトアプローチによる合成の生成物である。そのような混合物は主成分として目標の完全な長さのオリゴヌクレオチド生成物および様々な量の不純物、例えば、ショートマーまたはしばしばｎ−ｘ配列と呼ばれる破損配列（ｎはオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの数、ｘは正の整数であり、ｘ＜ｎであり、例えばｎ−１、ｎ−２およびｎ−３配列）；付加物、例えばアセチル付加物、イソブチリル付加物、クロラール挿入物；アクリロニトリル付加から生じるシアノエチル付加物、メチル付加物および関連する群；１つ以上の核酸塩基を欠いた配列、例えば脱プリン化または脱ピリミジン化配列；しばしば核酸塩基のアミノ基への付加による、特別なヌクレオシドを含む配列；ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド中のモノホスホジエステル不純物および類似の硫黄欠損不純物；およびショートマーまたは破損配列上を含む、オリゴヌクレオチド上の付加ホスフェート基を含む。
【００１０】
使用可能なオリゴヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド並びにデオキシリボ−およびリボヌクレオチドを含むキメラ化合物が含まれる。オリゴヌクレオチドは単一ストランドでも二重鎖でもよい。１種以上の変形体、例えばホスホロチオエート結合、２’−変形体、例えば２’−Ｏ−アルキル、特にメチル；２’−Ｏ−アルコキシアルキル、例えばメトキシエチル；２’−Ｃ−アリル；および２’−フルオロ変形体が存在してもよい。脱塩基部分および異常な核酸塩基、例えばイノシンおよびヒポキサンチンが存在してもよい。オリゴヌクレオチドはＤ形態、Ｌ形態でもよく、あるいはＤおよびＬ−ヌクレオチドの混合物を含んでいてもよい。多くの態様では、オリゴヌクレオチドはストランド当たり７０以下、一般には５〜５０の核酸塩基、例えばストランド当たり１６〜２５の核酸塩基を含む。多くの態様では、オリゴヌクレオチドの混合物は医薬品を構成する。
【００１１】
合成オリゴヌクレオチド混合物は、普通は不揮発性塩、一般に無機塩、例えばナトリウム塩を、外部の塩としてまたはオリゴヌクレオチドに対する対イオンとして含む。そのような塩は質量分析法による分析を妨げる。そのような不揮発性塩をオリゴヌクレオチドから除去するプロセスは脱塩として知られている。脱塩は本技術分野で公知の方法、例えばアルコール沈殿、イオン交換法、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン対逆相液体クロマトグラフィー（「ＲＰＬＣ」）によって実施することができる。オリゴヌクレオチドを脱塩するためには、不揮発性対イオン、一般的にナトリウムイオンを揮発性対イオン、例えばアンモニウムイオン、特に有機アンモニウムイオンと交換する。そのような交換はオリゴヌクレオチドを揮発性対イオン、好ましくはアンモニウム塩の溶液と接触させることによって通常行われる。使用可能なアンモニウム塩の例はＮＨ４＋、並びに第１、第２および第３アンモニウム塩であって、これらは１つ以上のアルキル、アリール、アルカリールまたはアラルキル部分を含む。存在させることができる好ましいアルキル基はＣ１−８アルキル基、特にＣ１−４アルキル基であって、これらは第１、第２および第３アルキル基である。存在させることができる好ましいアリール基はフェニル基である。存在させることができる好ましいアルカリール基はＣ１−８アルキルフェニル基である。存在させることができる好ましいアラルキル基はフェニルＣ１−８アルキル基、特にベンジルまたはフェニルエチル基である。一般的に用いられるアンモニウム塩には酸、特に炭酸またはカルボン酸で形成される塩、例えばカーボネート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテートおよびプロピオネート塩がある。穏やかな酸性の揮発性化合物、例えばハロゲン化Ｃ１−４アルコール、特にヘキサフルオロイソプロパノールのようなポリフッ化アルコールがアンモニウム塩の形成に用いうる。
【００１２】
オンライン脱塩が、オリゴヌクレオチドの混合物を脱塩し、そして脱塩されたオリゴヌクレオチド混合物を中間での手動による介入なしに、好ましくは脱塩された混合の中間加工または中間処理なしに、質量分析計へ移すプロセスを指すことは明らかなことであろう。オンライン脱塩は、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下で行われるのが最も好ましい。
【００１３】
サイズ排除クロマトグラフィーはオリゴヌクレオチド混合物の溶液を媒質、一般には多孔質ビーズへ通すことを含み、多孔質ビーズは、特定サイズ未満の物質が媒質へ入り込むことを可能にし、その媒質への通過を遅らせるが、これにより、より大きな物質は通過する。オリゴヌクレオチドを脱塩する場合、不揮発性塩は媒質の中へ進み、従って、オリゴヌクレオチドから分離される。
【００１４】
サイズ排除クロマトグラフィーが脱塩に用いられるとき、オリゴヌクレオチド混合物は、最も一般的には水溶液の形でサイズ排除クロマトグラフィー媒質を通り抜ける。流量およびカラムの大きさは、オリゴヌクレオチド混合物が１０分未満、最も好ましくは５分未満で溶出するように一般に選択される。オリゴヌクレオチドの溶出は、望ましいならば、イン−ラインＵＶ検出によって定性的に検出することができ、あるいは好ましくは、溶出液は定量分析のために質量分析計へ直接移される。オリゴヌクレオチド混合物の溶出後、クロマトグラフィー媒質上に保持された塩は、好ましくは廃棄するために、洗浄によって除去することができる。
【００１５】
イオン対逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）は、疎水性の差に基づくオリゴヌクレオチド混合物成分のクロマトグラフィー分離を行うために条件が通常選択される、オリゴヌクレオチド分析の周知の技術である。本発明では、従来のＲＰＬＣ媒質、一般にアルキル化されたシリカ媒質、例えばＲＰ Ｃ−１８が用いられるが、溶出条件はオリゴヌクレオチド混合物が単一ピークとして溶出するように選択される。条件は、オリゴヌクレオチド溶液の導入時に、比較的より疎水性のオリゴヌクレオチドはＲＰＬＣ媒質に保持されるが、親水性の不所望な塩はカラムをすみやかに通過するように選択される。多くの態様では、溶媒条件は、オリゴヌクレオチドの保持、その後のオリゴヌクレオチドの溶出と共に、不所望な塩のすみやかな通過を促すために変更される。溶媒勾配が用いられるが、多くの態様では、一般に親水性溶媒である投入溶媒から一般に疎水性溶媒である溶出溶媒へ大きく変更するのが好ましい。
【００１６】
ＲＰＬＣを用いて脱塩するとき、水性または好ましくは水に混和性の有機溶液（主に水性）を用いてオリゴヌクレオチド混合物をＲＰＬＣ媒質へ投入するのが好ましい。好ましくは、投入溶液は少なくとも６０％ｖ／ｖ水、一般に少なくとも７５％ｖ／ｖ水、特に少なくとも８５％ｖ／ｖ水、最も好ましくは少なくとも９０％ｖ／ｖ水を含む。最も好ましくは、投入溶液は揮発性対イオンの塩を含む。不揮発性塩を溶出した後、溶出溶媒をＲＰＬＣ媒質に通すことによってオリゴヌクレオチド混合物を溶出する。好ましくは、オリゴヌクレオチド混合物は、水と水混和性有機溶液（主に有機物）との混合物で溶出する。好ましくは、溶出溶液は少なくとも５５％ｖ／ｖ有機溶媒、一般に少なくとも６５％ｖ／ｖ有機溶媒、特に少なくとも７５％ｖ／ｖ有機溶媒を含む。溶出溶液は揮発性対イオンの塩をさらに含む。存在させることができる水混和性有機溶媒には、ＨＰＬＣで一般に用いられるもの、例えば、メタノールまたはエタノールのようなＣ１−３アルコールおよびＣ１−３トニリルが含まれる。アセトニトリルは投入用および溶出用の両溶液に用いられる好ましい有機溶媒である。最も好ましくは、投入用および溶出用の両溶液は揮発性対イオンの塩、一般に上記のようなアンモニウム塩、好ましくはトリアルキルアミンおよび酸よりなる塩を含む。好ましいトリアルキルアミンには、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジメチルブチルアミンおよびジエチルブチルアミンが含まれる。好ましい酸には、炭酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸およびプロピオン酸が含まれる。ジメチルブチルアミンおよび酢酸を含むバッファーが最も好ましい。ある態様では、移動相はほぼ中性のｐＨ、例えば６〜８、好ましくは６．５〜７．５に緩衝化される。オリゴヌクレオチド混合物が一般に１０分未満、最も好ましくは５分未満で溶出するような条件を選択するのが有利である。オリゴヌクレオチドの溶出混合物は検出法を介在させることなく、質量分析計に直接通してもよいが、多くの態様では、オリゴヌクレオチドの溶出は、定量的質量分析の前に、最も好ましくはインラインＵＶ検出によって、定性的に検出されるのが好ましい。
【００１７】
オリゴヌクレオチド混合物の脱塩は、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下で行われる。好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、特に少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のオリゴヌクレオチドが同時溶出する。
【００１８】
多くの態様では、脱塩は、不揮発性塩、特にナトリウム塩が質量分析計による分析を妨げない濃度に低下させるように行われる。オリゴヌクレオチド混合物は、不揮発性塩、特にナトリウム付加物がオリゴヌクレオチド混合物の２０％ｖ／ｖ未満、より好ましくは１０％ｖ／ｖ未満、特に５％ｖ／ｖ未満、とりわけ２％ｖ／ｖ未満よりなる程度に脱塩されるのが好ましい。
【００１９】
本発明で用いられる質量分析法はいわゆるソフトイオン化技術、例えば大気圧化学イオン化、特にエレクトロスプレーイオン化よりなるのが好ましい。
多くの好ましい態様では、脱塩段階における移動相の性質は、質量分析計によってもたらされるオリゴヌクレオチドの電荷状態が崩壊して単一の又は主として単一の電荷状態となるように選択される。好ましい電荷状態は−３、−４および−５である。
【００２０】
他の態様では、脱塩段階における移動相の性質は、質量分析計によってもたらされるオリゴヌクレオチドの電荷状態が単一のまたは主として単一の電荷状態に崩壊しない、従って、多電荷状態に維持されるように選択される。そのような状態の例は、穏やかな酸性の揮発性化合物、例えばハロゲン化Ｃ１−４アルコール、特にヘキサフルオロイソプロパノールのようなポリフッ素化アルコールを用いて脱塩段階でアンモニウム塩を形成することである。そのような条件は二重鎖オリゴヌクレオチドの分析において特に有利である。
【００２１】
オリゴヌクレオチド混合物の定量分析は、定められたピークの質量スペクトルピーク面積または高さを、既知量の試料のピークからの面積または高さと比較することによって実施することができる。これは、デコンボリューションを行い又は行わずに、１つ以上の電荷状態イオンの抽出イオンクロマトグラムにより実施しても、あるいはデータのスムージングを行い、セントロイド法で処理（すなわち、面積または高さデータの垂直ラインに還元）してもよい。ある態様では、望ましい生成物に似た分子量の不純物の場合、不純物および生成物の応答ファクターは同じであると思われる。従って、既知不純物または生成物のいずれかに対する較正プロットを定量に用いることができる。異なる応答ファクターを有する不純物の場合、不純物に対する較正プロットを形成することができ、あるいは不純物の量は特定の不純物の既知量を加え、応答対量の関係をプロットすることによって測定される。
【００２２】
本発明の方法は合成オリゴヌクレオチドの定量分析、とりわけ合成オリゴヌクレオチドのマルチバッチ分析における不純物の迅速プロファイリングに特に適している。
次の実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００２３】
実施例１
移動相Ａ（５ｍＭ ＤＭＢＡＡ、５％ＡＣＮ）の製造
氷酢酸（０．３ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（５０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
移動相Ｂ（５ｍＭ ＤＭＢＡＡ、８０％ＡＣＮ）の製造
氷酢酸（０．３ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（８０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
装置
Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）２．５ミクロンカラム、寸法４．６ｍｍ×５０ｍｍを取り付けた、Ｗａｔｅｒｓ ＺＱ２０００質量分析計プラスＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９５ＲＰＬＣプラス９９６ＰＤＡ。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： ２５Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １００℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ２０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ７９０Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： １５００−１９００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００２４】
【表１】
【００２５】
オリゴヌクレオチド試料
移動相Ａ中の十分に脱保護された２２量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液（固相ホスホロアミダイト化学によって製造され、７０４３の分子量を有する）をＲＰＬＣカラムへ投入し、上記勾配表に示した段階的条件を用いて溶出した。オリゴヌクレオチドの溶出はＵＶによって検出し、溶出液は質量分析計で分析した。
【００２６】
十分な脱塩がなされたことは図１に示されており、上のクロマトグラムはＵＶ分光計記録を示し、下のクロマトグラムは質量分析計記録を示す。塩のピークは、質量分析計記録において０．５分で溶出することをはっきり示している。
【００２７】
質量分析計ソフトウエアを用いる３〜３．７５分にわたるオリゴヌクレオチドピークの分析は図２に示す質量スペクトルを生じた。データは、オリゴヌクレオチド混合物が主に−４の電荷状態にあったことを示した。
【００２８】
オリゴヌクレオチド試料の分析を２回さらに繰り返した。
完全な長さのオリゴヌクレオチドと比較して２つの５−末端ヌクレオチド（ＴおよびＣ）を欠いたＮ−２不純物の既知量でスパイクされたオリゴヌクレオチドの試料について、分析法を三連一組で再度反復した。１％、３％および５％ｗ／ｗのＮ−２不純物を含有する試料を製造した。測定されたスパイクの百分率として表される各試料の平均ピーク面積をプロットしてグラフにした。
【００２９】
図３は、試料中に存在するＮ−２不純物の量が１．３％であったことを示す。
実施例２
移動相Ａ（５ｍＭ ＤＭＢＡＡ、３％ＡＣＮ）の製造
氷酢酸（０．３ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（３０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
移動相Ｂ（５ｍＭ ＤＭＢＡＡ、４０％ＡＣＮ）の製造
氷酢酸（０．３ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（４００ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
【００３０】
使用した装置およびカラムは実施例１に記載のものと同じであった。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： ２５Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １３０℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ６０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ６００Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０．５
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： １３５０−２０００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００３１】
【表２】
【００３２】
オリゴヌクレオチド試料
内部標準として２５量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（分子量７７７６）の１ｍｇ／ｍＬ水溶液を含有する１組の試料を製造した。試料は関心のあるオリゴヌクレオチドである２２量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（分子量７０４８）を内部標準に対して１５０％〜１０％で変化する割合で含有した。試料はＲＰＬＣカラムおよび上記勾配表に示す段階的条件を用いて三連一組の分析を実施した。
【００３３】
試料については−４の電荷状態そして内部標準については−４および−５の電荷状態の信号強度を評価に用いた。各濃度レベルで、三連一組の反復試験における各質量の強度を平均し、試料対標準の平均強度比を試料濃度に対してプロットした（図４）。
【００３４】
同様な処理を、オリゴヌクレオチド試料中に通常存在する不純物（例えば、ＰＯおよびＮ−１成分）に用いることができる。低レベルでは直線性が示され（図５）、これらの不純物は低レベルで定量するとき主ピークの代わりとしての役割を果たすこともある。
【００３５】
実施例３
移動相Ａ（１％ＨＦＩＰ、０．２％ＴＥＡ、３％ＡＣＮ）の製造
ヘキサフルオロイソプロパノール（１０．０ｍＬ）、トリエチルアミン（２．０ｍＬ）およびアセトニトリル（３０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
移動相Ｂ（１％ＨＦＩＰ、０．２％ＴＥＡ、１２％ＡＣＮ）の製造
ヘキサフルオロイソプロパノール（１０．０ｍＬ）、トリエチルアミン（２．０ｍＬ）およびアセトニトリル（１２０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
【００３６】
使用した装置およびカラムは実施例１に記載のものと同じであった。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： １０Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １３０℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ６０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ６００Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０．５
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： ６０２−２０００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００３７】
【表３】
【００３８】
オリゴヌクレオチド試料
内部標準として２５量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（分子量７７７６）の１ｍｇ／ｍＬ水溶液を含有する１組の試料を製造した。試料は、対象オリゴヌクレオチドである２２量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（分子量７０４８）を内部標準に対して１５０％〜１０％で変化する割合で含有した。試料はＲＰＬＣカラムおよび上記勾配表に示す段階的条件を用いて三連一組の分析を実施した。
【００３９】
ソフトウエアのＭａｘＥｎｔ機能を用いてｍ／ｚスペクトルを解析した。各濃度レベルで、三連一組の反復試験におけるデコンボリューション後の各質量の強度を平均し、試料対標準の平均強度比を試料濃度に対してプロットした（図６）。
【００４０】
実施例４
移動相Ａ（５ｍＭ ＤＭＢＡＦ、３％ＡＣＮ）の製造
ギ酸８８％（０．２２ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（３０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
移動相Ｂ（５ｍＭ ＤＭＢＡＦ、４０％ＡＣＮ）の製造
ギ酸８８％（０．２２ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（４００ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
【００４１】
使用した装置およびカラムは実施例１に記載のものと同じであった。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： １０Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １３０℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ６０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ６００Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０．１
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： ６０２−２０００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００４２】
【表４】
【００４３】
オリゴヌクレオチド試料
末端ホスフェート基を有する５８量体ホスホジエステルオリゴヌクレオチド（分子量１７９５０）の１ｍｇ／ｍｌ水溶液をＲＰＬＣカラムへ投入し、上記勾配表に示す段階的条件を用いて溶出した。オリゴヌクレオチドの溶出はＵＶによって検出し、溶出液は質量分析計によって分析した。
【００４４】
ソフトウエアのＭａｘＥｎｔ機能を用いてｍ／ｚスペクトルをデコンボリューションした。オリゴヌクレオチド、並びにその不純物および付加物の分子量は図７に示す。
実施例５
使用した装置およびカラムは実施例１に記載のものと同じであった。
【００４５】
移動相ＡおよびＢは実施例３に記載のように製造した。
移動相Ｃはアセトニトリルからなっていた。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： １０Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １３０℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ６０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ６００Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０．１
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： ６０２−２０００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００４６】
【表５】
【００４７】
オリゴヌクレオチド試料
いくらかのロックされた核酸（ＬＮＡ）を含有する１６量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの粗生成物合成溶液をＲＰＬＣカラムへ投入し、上記勾配表に示す段階的条件を用いて溶出した。オリゴヌクレオチドの溶出はＵＶによって検出し、溶出液は質量分析計によって分析した。
【００４８】
ジメトキシトリチル保護基（ＤＭＴ）は合成完了時には完全な長さのオリゴヌクレオチドに通常結合している。この疎水性基は溶出のために５０％アセトニトリルの特別な工程を必要とした。図８は、一般的なショートマー不純物（ＤＭＴ−ｏｆｆ）に続く主なオリゴヌクレオチド（ＤＭＴ−ｏｎ）の溶出を明らかに示している。
実施例６
用いた装置およびカラムは実施例１に記載のものと同じであった。移動相は実施例３に記載のように製造した。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： １０Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １３０℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ６０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ６００Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０．０
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： ６０２−１４００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００４９】
【表６】
【００５０】
オリゴヌクレオチド試料
標準および２’−Ｏメチルヌクレオチドのいずれも含む２１量体ホスホジエステルＲＮＡオリゴヌクレオチドを２３量体相補的ＲＮＡストランドと混合して、二重鎖形成を誘導した。試料をＲＰＬＣカラムに投入し、上記勾配表に示す段階的条件を用いて溶出した。オリゴヌクレオチドの溶出はＵＶによって検出し、溶出液は質量分析計によって分析した。
【００５１】
図９および図１０ではそれぞれ、両シングルストランドが観察され、二重鎖はカリウム付加物のクラスターとして観察される。
実施例２〜６は、いかに多様な成分が、本発明の方法の後に、例えば実施例１に記載の定量法を用いる定量分析で検出できるかを示すものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はオリゴヌクレオチドの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは医薬分野において現在かなり関心がもたれている。そのような化合物は、成長するオリゴヌクレオチド鎖へのシントンの段階的付加によって一般に合成される。単一ヌクレオチドの付加の基本的順序は、一般に脱保護−結合（couple）−酸化−キャップである。所望の配列アセンブリーの完成時には、合成中の競合反応を防ぐために用いられた保護基は除去される。そして、オリゴヌクレオチドが固相法を用いて合成される最も一般的な状況では、オリゴヌクレオチドは固体支持体から切り離される。従って、一般的な２２量体オリゴヌクレオチドの合成には多くの個別的な処理工程が含まれる。関与する工程数を考慮すると、現代のオリゴヌクレオチド合成化学は効率が高く、また、潜在的に反応性の部位が多く存在するにもかかわらず、少量の不純物が合成中にしばしば形成される。カップリング／キャッピング効率が１００％未満であるため、一般に、そのような不純物は予想よりも短い配列、あるいは副反応に起因するかもしれない予想分子量以上のものからなる成分を含む。従って、オリゴヌクレオチド生成物中に存在する不純物レベルの識別でき、且つ定量できる必要がある。
【０００３】
オリゴヌクレオチド中に存在する不純物の定量法には、定量のために紫外線検出、特性決定のために質量分光分析を伴うＨＰＬＣクロマトグラフィーが一般的に含まれる。国際公開第２００６／１０７７７５号には、オリゴヌクレオチドがクロマトグラフィーによって部分的に分離され、分離されたオリゴヌクレオチドの定量が、同時溶出オリゴヌクレオチドの質量分析による定量と組み合わせたＵＶ分析によって実施される方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０７７７５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この方法は多くの時間を必要とするクロマトグラフィー分析および複数の定量法を必要とする。従って、より速くかつより簡単な分析に適した別の方法を見つけ出すことが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の側面では、
ａ）オリゴヌクレオチドの混合物を、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下で脱塩すること；
ｂ）オリゴヌクレオチドの脱塩された混合物を質量分析計へ導入すること；および
ｃ）混合物に含まれる１種以上のオリゴヌクレオチドを質量分析計によって定量すること
を含む方法を提供する。
【０００７】
本発明の第２の側面では、
ａ）オリゴヌクレオチドの混合物をオン−ライン脱塩すること；
ｂ）オリゴヌクレオチドの脱塩した混合物を質量分析計へ導入すること；および
ｃ）混合物に含まれる１種以上のオリゴヌクレオチドを質量分析計によって定量すること
を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施例１における脱塩処理の結果を示す。すなわち、上のクロマトグラムはＵＶ分光計記録を示し、下のクロマトグラムは質量分析計記録を示す。
【図２】図２は、実施例１のオリゴヌクレオチド試料中に存在する不純物の質量スペクトルを示す。
【図３】図３は、不純物がスパイクされたオリゴヌクレオチド試料について得られたプロットを示す。
【図４】図４は、実施例２のオリゴヌクレオチド試料について、各濃度レベルで、三連一組の反復試験における各質量の強度を平均し、試料対標準の平均強度比を試料濃度に対してプロットしたグラフである。
【図５】図５は、実施例２のオリゴヌクレオチド試料中に通常存在する不純物（例えば、ＰＯおよびＮ−１成分）についてのプロットを示す。
【図６】図６は、実施例３のオリゴヌクレオチド試料について、ソフトウエアのＭａｘＥｎｔ機能を用いたｍ／ｚスペクトルのデコンボリューション後のプロットを示す。
【図７】図７は、実施例４のオリゴヌクレオチド試料について、ソフトウエアのＭａｘＥｎｔ機能を用いたｍ／ｚスペクトルのデコンボリューション後のプロットを示す。
【図８】図８は、粗製オリゴヌクレオチド合成溶液の分析結果を示す。
【図９】図９は、単一ストランド領域を示すRNA二重鎖のデコンボリューション後のスペクトルを示す。
【図１０】図１０は、二重鎖領域を示すRNA二重鎖のデコンボリューション後のスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の方法で用いることができるオリゴヌクレオチドの混合物は、一般的には固相化学合成、好ましくはホスホロアミダイトアプローチによる合成の生成物である。そのような混合物は主成分として目標の完全な長さのオリゴヌクレオチド生成物および様々な量の不純物、例えば、ショートマーまたはしばしばｎ−ｘ配列と呼ばれる破損配列（ｎはオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの数、ｘは正の整数であり、ｘ＜ｎであり、例えばｎ−１、ｎ−２およびｎ−３配列）；付加物、例えばアセチル付加物、イソブチリル付加物、クロラール挿入物；アクリロニトリル付加から生じるシアノエチル付加物、メチル付加物および関連する群；１つ以上の核酸塩基を欠いた配列、例えば脱プリン化または脱ピリミジン化配列；しばしば核酸塩基のアミノ基への付加による、特別なヌクレオシドを含む配列；ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド中のモノホスホジエステル不純物および類似の硫黄欠損不純物；およびショートマーまたは破損配列上を含む、オリゴヌクレオチド上の付加ホスフェート基を含む。
【００１０】
使用可能なオリゴヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド並びにデオキシリボ−およびリボヌクレオチドを含むキメラ化合物が含まれる。オリゴヌクレオチドは単一ストランドでも二重鎖でもよい。１種以上の変形体、例えばホスホロチオエート結合、２’−変形体、例えば２’−Ｏ−アルキル、特にメチル；２’−Ｏ−アルコキシアルキル、例えばメトキシエチル；２’−Ｃ−アリル；および２’−フルオロ変形体が存在してもよい。脱塩基部分および異常な核酸塩基、例えばイノシンおよびヒポキサンチンが存在してもよい。オリゴヌクレオチドはＤ形態、Ｌ形態でもよく、あるいはＤおよびＬ−ヌクレオチドの混合物を含んでいてもよい。多くの態様では、オリゴヌクレオチドはストランド当たり７０以下、一般には５〜５０の核酸塩基、例えばストランド当たり１６〜２５の核酸塩基を含む。多くの態様では、オリゴヌクレオチドの混合物は医薬品を構成する。
【００１１】
合成オリゴヌクレオチド混合物は、普通は不揮発性塩、一般に無機塩、例えばナトリウム塩を、外部の塩としてまたはオリゴヌクレオチドに対する対イオンとして含む。そのような塩は質量分析法による分析を妨げる。そのような不揮発性塩をオリゴヌクレオチドから除去するプロセスは脱塩として知られている。脱塩は本技術分野で公知の方法、例えばアルコール沈殿、イオン交換法、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン対逆相液体クロマトグラフィー（「ＲＰＬＣ」）によって実施することができる。オリゴヌクレオチドを脱塩するためには、不揮発性対イオン、一般的にナトリウムイオンを揮発性対イオン、例えばアンモニウムイオン、特に有機アンモニウムイオンと交換する。そのような交換はオリゴヌクレオチドを揮発性対イオン、好ましくはアンモニウム塩の溶液と接触させることによって通常行われる。使用可能なアンモニウム塩の例はＮＨ４＋、並びに第１、第２および第３アンモニウム塩であって、これらは１つ以上のアルキル、アリール、アルカリールまたはアラルキル部分を含む。存在させることができる好ましいアルキル基はＣ１−８アルキル基、特にＣ１−４アルキル基であって、これらは第１、第２および第３アルキル基である。存在させることができる好ましいアリール基はフェニル基である。存在させることができる好ましいアルカリール基はＣ１−８アルキルフェニル基である。存在させることができる好ましいアラルキル基はフェニルＣ１−８アルキル基、特にベンジルまたはフェニルエチル基である。一般的に用いられるアンモニウム塩には酸、特に炭酸またはカルボン酸で形成される塩、例えばカーボネート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテートおよびプロピオネート塩がある。穏やかな酸性の揮発性化合物、例えばハロゲン化Ｃ１−４アルコール、特にヘキサフルオロイソプロパノールのようなポリフッ化アルコールがアンモニウム塩の形成に用いうる。
【００１２】
オンライン脱塩が、オリゴヌクレオチドの混合物を脱塩し、そして脱塩されたオリゴヌクレオチド混合物を中間での手動による介入なしに、好ましくは脱塩された混合の中間加工または中間処理なしに、質量分析計へ移すプロセスを指すことは明らかなことであろう。オンライン脱塩は、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下で行われるのが最も好ましい。
【００１３】
サイズ排除クロマトグラフィーはオリゴヌクレオチド混合物の溶液を媒質、一般には多孔質ビーズへ通すことを含み、多孔質ビーズは、特定サイズ未満の物質が媒質へ入り込むことを可能にし、その媒質への通過を遅らせるが、これにより、より大きな物質は通過する。オリゴヌクレオチドを脱塩する場合、不揮発性塩は媒質の中へ進み、従って、オリゴヌクレオチドから分離される。
【００１４】
サイズ排除クロマトグラフィーが脱塩に用いられるとき、オリゴヌクレオチド混合物は、最も一般的には水溶液の形でサイズ排除クロマトグラフィー媒質を通り抜ける。流量およびカラムの大きさは、オリゴヌクレオチド混合物が１０分未満、最も好ましくは５分未満で溶出するように一般に選択される。オリゴヌクレオチドの溶出は、望ましいならば、イン−ラインＵＶ検出によって定性的に検出することができ、あるいは好ましくは、溶出液は定量分析のために質量分析計へ直接移される。オリゴヌクレオチド混合物の溶出後、クロマトグラフィー媒質上に保持された塩は、好ましくは廃棄するために、洗浄によって除去することができる。
【００１５】
イオン対逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）は、疎水性の差に基づくオリゴヌクレオチド混合物成分のクロマトグラフィー分離を行うために条件が通常選択される、オリゴヌクレオチド分析の周知の技術である。本発明では、従来のＲＰＬＣ媒質、一般にアルキル化されたシリカ媒質、例えばＲＰ Ｃ−１８が用いられるが、溶出条件はオリゴヌクレオチド混合物が単一ピークとして溶出するように選択される。条件は、オリゴヌクレオチド溶液の導入時に、比較的より疎水性のオリゴヌクレオチドはＲＰＬＣ媒質に保持されるが、親水性の不所望な塩はカラムをすみやかに通過するように選択される。多くの態様では、溶媒条件は、オリゴヌクレオチドの保持、その後のオリゴヌクレオチドの溶出と共に、不所望な塩のすみやかな通過を促すために変更される。溶媒勾配が用いられるが、多くの態様では、一般に親水性溶媒である投入溶媒から一般に疎水性溶媒である溶出溶媒へ大きく変更するのが好ましい。
【００１６】
ＲＰＬＣを用いて脱塩するとき、水性または好ましくは水に混和性の有機溶液（主に水性）を用いてオリゴヌクレオチド混合物をＲＰＬＣ媒質へ投入するのが好ましい。好ましくは、投入溶液は少なくとも６０％ｖ／ｖ水、一般に少なくとも７５％ｖ／ｖ水、特に少なくとも８５％ｖ／ｖ水、最も好ましくは少なくとも９０％ｖ／ｖ水を含む。最も好ましくは、投入溶液は揮発性対イオンの塩を含む。不揮発性塩を溶出した後、溶出溶媒をＲＰＬＣ媒質に通すことによってオリゴヌクレオチド混合物を溶出する。好ましくは、オリゴヌクレオチド混合物は、水と水混和性有機溶液（主に有機物）との混合物で溶出する。好ましくは、溶出溶液は少なくとも５５％ｖ／ｖ有機溶媒、一般に少なくとも６５％ｖ／ｖ有機溶媒、特に少なくとも７５％ｖ／ｖ有機溶媒を含む。溶出溶液は揮発性対イオンの塩をさらに含む。存在させることができる水混和性有機溶媒には、ＨＰＬＣで一般に用いられるもの、例えば、メタノールまたはエタノールのようなＣ１−３アルコールおよびＣ１−３トニリルが含まれる。アセトニトリルは投入用および溶出用の両溶液に用いられる好ましい有機溶媒である。最も好ましくは、投入用および溶出用の両溶液は揮発性対イオンの塩、一般に上記のようなアンモニウム塩、好ましくはトリアルキルアミンおよび酸よりなる塩を含む。好ましいトリアルキルアミンには、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジメチルブチルアミンおよびジエチルブチルアミンが含まれる。好ましい酸には、炭酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸およびプロピオン酸が含まれる。ジメチルブチルアミンおよび酢酸を含むバッファーが最も好ましい。ある態様では、移動相はほぼ中性のｐＨ、例えば６〜８、好ましくは６．５〜７．５に緩衝化される。オリゴヌクレオチド混合物が一般に１０分未満、最も好ましくは５分未満で溶出するような条件を選択するのが有利である。オリゴヌクレオチドの溶出混合物は検出法を介在させることなく、質量分析計に直接通してもよいが、多くの態様では、オリゴヌクレオチドの溶出は、定量的質量分析の前に、最も好ましくはインラインＵＶ検出によって、定性的に検出されるのが好ましい。
【００１７】
オリゴヌクレオチド混合物の脱塩は、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下で行われる。好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、特に少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のオリゴヌクレオチドが同時溶出する。
【００１８】
多くの態様では、脱塩は、不揮発性塩、特にナトリウム塩が質量分析計による分析を妨げない濃度に低下させるように行われる。オリゴヌクレオチド混合物は、不揮発性塩、特にナトリウム付加物がオリゴヌクレオチド混合物の２０％ｖ／ｖ未満、より好ましくは１０％ｖ／ｖ未満、特に５％ｖ／ｖ未満、とりわけ２％ｖ／ｖ未満よりなる程度に脱塩されるのが好ましい。
【００１９】
本発明で用いられる質量分析法はいわゆるソフトイオン化技術、例えば大気圧化学イオン化、特にエレクトロスプレーイオン化よりなるのが好ましい。
多くの好ましい態様では、脱塩段階における移動相の性質は、質量分析計によってもたらされるオリゴヌクレオチドの電荷状態が崩壊して単一の又は主として単一の電荷状態となるように選択される。好ましい電荷状態は−３、−４および−５である。
【００２０】
他の態様では、脱塩段階における移動相の性質は、質量分析計によってもたらされるオリゴヌクレオチドの電荷状態が単一のまたは主として単一の電荷状態に崩壊しない、従って、多電荷状態に維持されるように選択される。そのような状態の例は、穏やかな酸性の揮発性化合物、例えばハロゲン化Ｃ１−４アルコール、特にヘキサフルオロイソプロパノールのようなポリフッ素化アルコールを用いて脱塩段階でアンモニウム塩を形成することである。そのような条件は二重鎖オリゴヌクレオチドの分析において特に有利である。
【００２１】
オリゴヌクレオチド混合物の定量分析は、定められたピークの質量スペクトルピーク面積または高さを、既知量の試料のピークからの面積または高さと比較することによって実施することができる。これは、デコンボリューションを行い又は行わずに、１つ以上の電荷状態イオンの抽出イオンクロマトグラムにより実施しても、あるいはデータのスムージングを行い、セントロイド法で処理（すなわち、面積または高さデータの垂直ラインに還元）してもよい。ある態様では、望ましい生成物に似た分子量の不純物の場合、不純物および生成物の応答ファクターは同じであると思われる。従って、既知不純物または生成物のいずれかに対する較正プロットを定量に用いることができる。異なる応答ファクターを有する不純物の場合、不純物に対する較正プロットを形成することができ、あるいは不純物の量は特定の不純物の既知量を加え、応答対量の関係をプロットすることによって測定される。
【００２２】
本発明の方法は合成オリゴヌクレオチドの定量分析、とりわけ合成オリゴヌクレオチドのマルチバッチ分析における不純物の迅速プロファイリングに特に適している。
次の実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００２３】
実施例１
移動相Ａ（５ｍＭ ＤＭＢＡＡ、５％ＡＣＮ）の製造
氷酢酸（０．３ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（５０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
移動相Ｂ（５ｍＭ ＤＭＢＡＡ、８０％ＡＣＮ）の製造
氷酢酸（０．３ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（８０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
装置
Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）２．５ミクロンカラム、寸法４．６ｍｍ×５０ｍｍを取り付けた、Ｗａｔｅｒｓ ＺＱ２０００質量分析計プラスＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９５ＲＰＬＣプラス９９６ＰＤＡ。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： ２５Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １００℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ２０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ７９０Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： １５００−１９００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００２４】
【表１】
【００２５】
オリゴヌクレオチド試料
移動相Ａ中の十分に脱保護された２２量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液（固相ホスホロアミダイト化学によって製造され、７０４３の分子量を有する）をＲＰＬＣカラムへ投入し、上記勾配表に示した段階的条件を用いて溶出した。オリゴヌクレオチドの溶出はＵＶによって検出し、溶出液は質量分析計で分析した。
【００２６】
十分な脱塩がなされたことは図１に示されており、上のクロマトグラムはＵＶ分光計記録を示し、下のクロマトグラムは質量分析計記録を示す。塩のピークは、質量分析計記録において０．５分で溶出することをはっきり示している。
【００２７】
質量分析計ソフトウエアを用いる３〜３．７５分にわたるオリゴヌクレオチドピークの分析は図２に示す質量スペクトルを生じた。データは、オリゴヌクレオチド混合物が主に−４の電荷状態にあったことを示した。
【００２８】
オリゴヌクレオチド試料の分析を２回さらに繰り返した。
完全な長さのオリゴヌクレオチドと比較して２つの５−末端ヌクレオチド（ＴおよびＣ）を欠いたＮ−２不純物の既知量でスパイクされたオリゴヌクレオチドの試料について、分析法を三連一組で再度反復した。１％、３％および５％ｗ／ｗのＮ−２不純物を含有する試料を製造した。測定されたスパイクの百分率として表される各試料の平均ピーク面積をプロットしてグラフにした。
【００２９】
図３は、試料中に存在するＮ−２不純物の量が１．３％であったことを示す。
実施例２
移動相Ａ（５ｍＭ ＤＭＢＡＡ、３％ＡＣＮ）の製造
氷酢酸（０．３ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（３０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
移動相Ｂ（５ｍＭ ＤＭＢＡＡ、４０％ＡＣＮ）の製造
氷酢酸（０．３ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（４００ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
【００３０】
使用した装置およびカラムは実施例１に記載のものと同じであった。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： ２５Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １３０℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ６０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ６００Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０．５
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： １３５０−２０００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００３１】
【表２】
【００３２】
オリゴヌクレオチド試料
内部標準として２５量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（分子量７７７６）の１ｍｇ／ｍＬ水溶液を含有する１組の試料を製造した。試料は関心のあるオリゴヌクレオチドである２２量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（分子量７０４８）を内部標準に対して１５０％〜１０％で変化する割合で含有した。試料はＲＰＬＣカラムおよび上記勾配表に示す段階的条件を用いて三連一組の分析を実施した。
【００３３】
試料については−４の電荷状態そして内部標準については−４および−５の電荷状態の信号強度を評価に用いた。各濃度レベルで、三連一組の反復試験における各質量の強度を平均し、試料対標準の平均強度比を試料濃度に対してプロットした（図４）。
【００３４】
同様な処理を、オリゴヌクレオチド試料中に通常存在する不純物（例えば、ＰＯおよびＮ−１成分）に用いることができる。低レベルでは直線性が示され（図５）、これらの不純物は低レベルで定量するとき主ピークの代わりとしての役割を果たすこともある。
【００３５】
実施例３
移動相Ａ（１％ＨＦＩＰ、０．２％ＴＥＡ、３％ＡＣＮ）の製造
ヘキサフルオロイソプロパノール（１０．０ｍＬ）、トリエチルアミン（２．０ｍＬ）およびアセトニトリル（３０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
移動相Ｂ（１％ＨＦＩＰ、０．２％ＴＥＡ、１２％ＡＣＮ）の製造
ヘキサフルオロイソプロパノール（１０．０ｍＬ）、トリエチルアミン（２．０ｍＬ）およびアセトニトリル（１２０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
【００３６】
使用した装置およびカラムは実施例１に記載のものと同じであった。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： １０Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １３０℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ６０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ６００Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０．５
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： ６０２−２０００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００３７】
【表３】
【００３８】
オリゴヌクレオチド試料
内部標準として２５量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（分子量７７７６）の１ｍｇ／ｍＬ水溶液を含有する１組の試料を製造した。試料は、対象オリゴヌクレオチドである２２量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（分子量７０４８）を内部標準に対して１５０％〜１０％で変化する割合で含有した。試料はＲＰＬＣカラムおよび上記勾配表に示す段階的条件を用いて三連一組の分析を実施した。
【００３９】
ソフトウエアのＭａｘＥｎｔ機能を用いてｍ／ｚスペクトルを解析した。各濃度レベルで、三連一組の反復試験におけるデコンボリューション後の各質量の強度を平均し、試料対標準の平均強度比を試料濃度に対してプロットした（図６）。
【００４０】
実施例４
移動相Ａ（５ｍＭ ＤＭＢＡＦ、３％ＡＣＮ）の製造
ギ酸８８％（０．２２ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（３０ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
移動相Ｂ（５ｍＭ ＤＭＢＡＦ、４０％ＡＣＮ）の製造
ギ酸８８％（０．２２ｍＬ）、ジメチルブチルアミン（０．７ｍＬ）およびアセトニトリル（４００ｍＬ）を水に溶解し、１リットルの体積にした。
【００４１】
使用した装置およびカラムは実施例１に記載のものと同じであった。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： １０Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １３０℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ６０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ６００Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０．１
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： ６０２−２０００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００４２】
【表４】
【００４３】
オリゴヌクレオチド試料
末端ホスフェート基を有する５８量体ホスホジエステルオリゴヌクレオチド（分子量１７９５０）の１ｍｇ／ｍｌ水溶液をＲＰＬＣカラムへ投入し、上記勾配表に示す段階的条件を用いて溶出した。オリゴヌクレオチドの溶出はＵＶによって検出し、溶出液は質量分析計によって分析した。
【００４４】
ソフトウエアのＭａｘＥｎｔ機能を用いてｍ／ｚスペクトルをデコンボリューションした。オリゴヌクレオチド、並びにその不純物および付加物の分子量は図７に示す。
実施例５
使用した装置およびカラムは実施例１に記載のものと同じであった。
【００４５】
移動相ＡおよびＢは実施例３に記載のように製造した。
移動相Ｃはアセトニトリルからなっていた。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： １０Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １３０℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ６０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ６００Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０．１
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： ６０２−２０００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００４６】
【表５】
【００４７】
オリゴヌクレオチド試料
いくらかのロックされた核酸（ＬＮＡ）を含有する１６量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの粗生成物合成溶液をＲＰＬＣカラムへ投入し、上記勾配表に示す段階的条件を用いて溶出した。オリゴヌクレオチドの溶出はＵＶによって検出し、溶出液は質量分析計によって分析した。
【００４８】
ジメトキシトリチル保護基（ＤＭＴ）は合成完了時には完全な長さのオリゴヌクレオチドに通常結合している。この疎水性基は溶出のために５０％アセトニトリルの特別な工程を必要とした。図８は、一般的なショートマー不純物（ＤＭＴ−ｏｆｆ）に続く主なオリゴヌクレオチド（ＤＭＴ−ｏｎ）の溶出を明らかに示している。
実施例６
用いた装置およびカラムは実施例１に記載のものと同じであった。移動相は実施例３に記載のように製造した。
パラメーター
極性： ネガティブＥＳＩ
細管： ３ｋＶ
コーン： １０Ｖ
抽出器： ３Ｖ
ＲＦレンズ： ０．５Ｖ
源の温度： １３０℃
脱溶媒温度： ４００℃
コーンガス流： ６０Ｌ／時
脱溶媒ガス流： ６００Ｌ／時
ＬＭ １分解能： １５
ＨＭ １分解能： １５
イオンエネルギー１： ０．０
マルチプライヤー： ６５０Ｖ
質量範囲： ６０２−１４００
波長： ２５０−２７０ｎｍ
勾配表：
【００４９】
【表６】
【００５０】
オリゴヌクレオチド試料
標準および２’−Ｏメチルヌクレオチドのいずれも含む２１量体ホスホジエステルＲＮＡオリゴヌクレオチドを２３量体相補的ＲＮＡストランドと混合して、二重鎖形成を誘導した。試料をＲＰＬＣカラムに投入し、上記勾配表に示す段階的条件を用いて溶出した。オリゴヌクレオチドの溶出はＵＶによって検出し、溶出液は質量分析計によって分析した。
【００５１】
図９および図１０ではそれぞれ、両シングルストランドが観察され、二重鎖はカリウム付加物のクラスターとして観察される。
実施例２〜６は、いかに多様な成分が、本発明の方法の後に、例えば実施例１に記載の定量法を用いる定量分析で検出できるかを示すものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）オリゴヌクレオチドの混合物を、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下で脱塩すること；
ｂ）オリゴヌクレオチドの脱塩された混合物を質量分析計へ導入すること；および
ｃ）混合物に含まれる１種以上のオリゴヌクレオチドを質量分析計によって定量すること
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％のオリゴヌクレオチドが同時溶出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）オリゴヌクレオチドの混合物をオンライン脱塩すること；
ｂ）オリゴヌクレオチドの脱塩された混合物を質量分析計へ導入すること；および
ｃ）混合物に含まれる１種以上のオリゴヌクレオチドを質量分析計によって定量すること
を含む方法。
【請求項４】
オンライン脱塩が、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下でクロマトグラフィーによって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％のオリゴヌクレオチドが同時溶出する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
不揮発性塩付加物が２０％ｗ／ｗ未満、好ましくは５％ｗ／ｗ未満のオリゴヌクレオチド混合物を含む程度に、オリゴヌクレオチドの混合物が脱塩される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ナトリウム塩付加物が２％ｗ／ｗ未満のオリゴヌクレオチド混合物を含む程度に、オリゴヌクレオチドの混合物が脱塩される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドの混合物が逆相液体クロマトグラフィーによって脱塩される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
逆相液体クロマトグラフィーが、アンモニウム塩を含む移動相によるオリゴヌクレオチド混合物の溶出を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アンモニウム塩がＣ１−４アルキルｔ−アンモニウム塩、好ましくはジメチルブチルアンモニウム塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アンモニウム塩が、カーボネート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテートまたはプロピオネート塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
質量分析計中のオリゴヌクレオチド混合物の電荷状態が崩壊して単一の又は主として単一の電荷状態、好ましくは−３、−４および−５となる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドの製造方法であって、
ａ）オリゴヌクレオチドを合成すること、および
ｂ）該オリゴヌクレオチドの組成を分析すること、ここで、オリゴヌクレオチドは請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって分析される
の工程を含む方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが固相ホスホロアミダイト化学によって合成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが医薬品である、請求項１３および１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
ａ）オリゴヌクレオチドの混合物を、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下で脱塩すること；
ｂ）オリゴヌクレオチドの脱塩された混合物を質量分析計へ導入すること；および
ｃ）混合物に含まれる１種以上のオリゴヌクレオチドを質量分析計によって定量すること
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％のオリゴヌクレオチドが同時溶出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）オリゴヌクレオチドの混合物をオンライン脱塩すること；
ｂ）オリゴヌクレオチドの脱塩された混合物を質量分析計へ導入すること；および
ｃ）混合物に含まれる１種以上のオリゴヌクレオチドを質量分析計によって定量すること
を含む方法。
【請求項４】
オンライン脱塩が、オリゴヌクレオチド混合物の分離が実質的に生じないような条件下でクロマトグラフィーによって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％のオリゴヌクレオチドが同時溶出する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
不揮発性塩付加物が２０％ｗ／ｗ未満、好ましくは５％ｗ／ｗ未満のオリゴヌクレオチド混合物を含む程度に、オリゴヌクレオチドの混合物が脱塩される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ナトリウム塩付加物が２％ｗ／ｗ未満のオリゴヌクレオチド混合物を含む程度に、オリゴヌクレオチドの混合物が脱塩される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドの混合物が逆相液体クロマトグラフィーによって脱塩される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
逆相液体クロマトグラフィーが、アンモニウム塩を含む移動相によるオリゴヌクレオチド混合物の溶出を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アンモニウム塩がＣ１−４アルキルｔ−アンモニウム塩、好ましくはジメチルブチルアンモニウム塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アンモニウム塩が、カーボネート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテートまたはプロピオネート塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
質量分析計中のオリゴヌクレオチド混合物の電荷状態が崩壊して単一の又は主として単一の電荷状態、好ましくは−３、−４および−５となる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドの製造方法であって、
ａ）オリゴヌクレオチドを合成すること、および
ｂ）該オリゴヌクレオチドの組成を分析すること、ここで、オリゴヌクレオチドは請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって分析される
の工程を含む方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが固相ホスホロアミダイト化学によって合成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが医薬品である、請求項１３および１４のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５００３９４（Ｐ２０１２−５００３９４Ａ）
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２３４４０（Ｐ２０１１−５２３４４０）
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１９４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２０７５０
【国際公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（５０２４４９２９９）アベシア・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１９４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２０７５０
【国際公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（５０２４４９２９９）アベシア・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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