カテプシンＥ特異的阻害剤
【課題】カテプシンEを特異的に阻害し、かつカテプシンEと類縁性の高いリソソーム酵素であるカテプシンDは阻害しない物質、及びカテプシンＥ阻害剤を提供する。
【解決手段】カテプシンＥ活性に対する阻害作用を有し、カテプシンＤ活性に対する阻害作用は実質的に有さず、かつアミノ酸数が6〜34の範囲であるペプチド。このペプチドを有効成分として含有するカテプシンＥ阻害剤。これらは、Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ−ｖｉｒｕｓ法を用いた、分子淘汰操作により作製した、ペプチドライブラリから得られた。
【解決手段】カテプシンＥ活性に対する阻害作用を有し、カテプシンＤ活性に対する阻害作用は実質的に有さず、かつアミノ酸数が6〜34の範囲であるペプチド。このペプチドを有効成分として含有するカテプシンＥ阻害剤。これらは、Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ−ｖｉｒｕｓ法を用いた、分子淘汰操作により作製した、ペプチドライブラリから得られた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、類縁のプロテアーゼ（カテプシンＤ、Ｂ、Ｌ、Ｈ、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼなど）は阻害せず、カテプシンＥを特異的に阻害するペプチドに関する。さらに本発明は、このペプチドを有効成分として含有するカテプシンＥ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
カテプシンＤ、Ｅは共に細胞内アスパラギン酸プロテアーゼであり、両者の酵素学的性質は非常に似たものであるが、カテプシンＤが赤血球を除くすべての組織・細胞に普遍的に存在しているのに対し、カテプシンＥは免疫担当細胞や皮膚などに限局的に存在することが知られている。山本らは、カテプシンE遺伝子欠損マウス（ノックアウトマウス）を作製し、カテプシンＥの機能解析を進めてきた（Yamamoto,K. Cathepsin E and D:biosynthesis, processing and subcellular location.Adv.Exp.Med.Biol., 362, 223-9(1995)、非特許文献１）。カテプシンE欠損マウスは無菌環境下で飼育しても、全く異常を示さないが、通常環境下に移すとアトピー性皮膚炎様症状を示した。病理組織学的にもヒトにおけるアトピー性皮膚炎症状と酷似した症状を示した。カテプシンE欠損マウスから調製したマクロファージを用いた研究では、正常マクロファージに比べて、殺菌能、細胞生存率、遊走能などの細胞機能に著明な低下があることが示されている。このことは、カテプシンE欠損が宿主の免疫応答自体に低下や不調をもたらし、それが何らかの外的刺激によってアトピー性皮膚炎などの個体の病態を発症させていることを示唆している。事実、カテプシンE欠損マウスでは、慢性関節リウマチのモデルである実験的関節炎が誘導されると、野生型マウスに比べてその病態に著しい増悪が見られることが示されている。カテプシンE欠損が炎症性サイトカインの分泌パターンを変化させ、関節炎を増悪させることが考えられる。一方、正常マウス（DBA/1J）にコラーゲン関節炎を起こさせると、血清中のカテプシンE活性は対照マウスの約2.5倍（p<0.001）に上昇していることが示されている。（筑波 隆幸、山本 健二：アトピー性皮膚炎とカテプシンE. 日薬理誌（Folia Pharmacol.Jpn.）122,15-20(2003)、非特許文献２）このことは、カテプシンE欠損という極端なケースを除けば、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患等においては、一般的にカテプシンEの活性増加が生じていると考えられる。このことは、慢性関節リウマチ患者の滑液中のカテプシンE活性が病態に比例して増大するという山本らの報告とよく一致する。
【０００３】
また、各種癌細胞を用いた実験から、カテプシンEが癌細胞表面のTRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)を特異的に切断遊離させ、TRAILとその受容体を介するシグナリングによって癌細胞をアポトーシスに誘導することが明らかにされている。（山本ら：未発表）。TRAILはCD4+T細胞、NK細胞、単球、樹状細胞、好中球などにも発現していることから、これらの細胞を介して癌細胞をアポトーシスに誘導する一方で、自らの細胞をもアポトーシスに誘導して宿主免疫細胞系を破綻させる可能性も示唆されている。このことは、カテプシンEの過剰発現がTRAILを介するアポトーシス誘導機構を惹起させ、Th1型の免疫反応の破綻を誘導し、自己免疫疾患等の種々の疾患を生む可能性を強く示唆している。
【０００４】
一方、カテプシンDについてもノックアウトマウスを用いた研究により、カテプシンDがリソソーム蛋白分解系における必須の酵素であること、および同酵素の欠損により神経性セロイド様リポフスチン蓄積症(Neuronal Ceroid Lipofuscinoses; NCLs)と呼ばれる神経変性疾患に非常に類似した病態を呈することを示すことが報告されている。(Shimizu T, et al. J. Neurochem., 94(3), 680-90 (2005) 、非特許文献3)
【０００５】
以上のような知見から、カテプシンD,E活性の増大及び低下は、自己免疫疾患等の様々な病態に繋がると考えられ、その際の過剰な活性を抑える薬剤はこうした病態の改善に大いに役立つものと期待される。カテプシンEに対する阻害剤についてはこれまで放線菌由来のペプスタチンA(Umezawa,H.,Aoyagi,T.,Morishima,H.,Matsuzaki,M, and Hamada,M.Pepstatin, a new pepsin inhibitor produced by Actinomycetes.J.Antibiot.,23,259-62(1970)、非特許文献４）と回虫から分離されたAscaris pepsin inhibitor (Kageyama,T. Molecular cloning, expression and characterization of an Ascaris inhibitor for pepsin and cathepsin E. Eur. J. Biochem.,253.804-9(1998)、非特許文書５)が知られている。
【非特許文献１】Yamamoto,K. Cathepsin E and D:biosynthesis, processing and subcellular location.Adv.Exp.Med.Biol., 362, 223-9(1995)
【非特許文献２】筑波 隆幸、山本 健二：アトピー性皮膚炎とカテプシンE. 日薬理誌（Folia Pharmacol.Jpn.）122,15-20(2003)
【非特許文献３】Shimizu T, Hayashi Y, Yamasaki R, Yamada J, Zhang J, Ukai K, Koike M, Mine K, von Figura K, Peters C, Saftig P, Fukuda T, Uchiyama Y, Nakanishi H.Proteolytic degradation of glutamate decarboxylase mediates disinhibition of hippocampal CA3 pyramidal cells in cathepsin D-deficient mice. J. Neurochem., 94(3), 680-90(2005)
【非特許文献４】Umezawa,H., Aoyagi,T., Morishima,H., Matsuzaki,M, and Hamada,M. Pepstatin, a new pepsin inhibitor produced by Actinomycetes. J. Antibiot.,23,259-62(1970)
【非特許文献５】Kageyama,T. Molecular cloning, expression and characterization of an Ascaris inhibitor for pepsin and cathepsin E. Eur. J. Biochem.,253.804-9(1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
放線菌由来のペプスタチンAはアスパラギン酸プロテアーゼ群に共通の阻害剤で特異性がない。回虫ペプシン阻害剤（Ascaris pepsin inhibitor）はペプシンに対すると同様にカテプシンEを強く阻害し、他のアスパラギン酸プロテアーゼは阻害しないが、高分子タンパク質で細胞毒性が強いという欠点がある。そのため、カテプシンEに特異的な阻害剤として実用的なものは知られていないのが現状である。
【０００７】
そこで本発明の目的は、カテプシンEを特異的に阻害し、かつカテプシンEと類縁性の高いリソソーム酵素であるカテプシンDは阻害しない物質及びカテプシンE特異的阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、最近一本鎖DNAからなるカテプシンE阻害分子（特許出願2005-235819）を得ることに成功した。しかし、阻害特異性の点で更なる改良の必要を感じ、ペプチド型制御剤の開発に着手し、該研究を完成するに至った。その結果、カテプシンDに対しては殆ど阻害活性を持たず、カテプシンEを特異的に阻害するペプチドを見出し、本発明を完成させた。さらに、本研究ではカテプシンDを特異的に活性化するような性質を持つものも得られてきた。
【０００９】
本発明は以下のとおりである。
[1]カテプシンＥ活性に対する阻害作用を有し、カテプシンＤ活性に対する阻害作用は実質的に有さず、かつアミノ酸数が6〜34の範囲であるペプチド。
[2]前記ペプチドはカテプシンＢ活性に対する阻害作用も実質的に有さない[1]に記載のペプチド。
[3]前記ペプチドは配列表の配列番号1〜58に記載のアミノ酸配列を有する[1]または[2]に記載のペプチド。
[4]前記ペプチドは配列表の配列番号1〜30に記載のアミノ酸配列を有する[1]または[2]に記載のペプチド。
[5]前記ペプチドは配列表の配列番号31〜47に記載のアミノ酸配列を有する[1]または[2]に記載のペプチド。
[6]前記ペプチドは配列表の配列番号48〜58に記載のアミノ酸配列を有する[1]または[2]に記載のペプチド。
[7]前記ペプチドはカテプシンＤ活性に対する増強作用を有する[1]または[2]に記載のペプチド。
[8]前記ペプチドは配列表の配列番号2、3、4、6、10、35、38、39、41に示されるアミノ酸配列を有する[7]に記載のペプチド。
[9]前記ペプチドはカテプシンＨ活性、カテプシンＬ活性、トリプシン活性、キモトリプシン活性及びコラゲナーゼ活性に対する阻害作用を実質的に有さない[1]〜[8]のいずれかに記載のペプチド。
[10][1]〜[9]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するカテプシンＥ阻害剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の化合物はペプチド型であり、分子量も1,000〜3,000Da程度でＤＮＡ型阻害分子と比べて約1/30〜1/10程度に小型化している。また、標的分子のカテプシンＥに対して強い阻害活性を示し、かつ類縁性の高いリソソーム酵素であるカテプシンＤや他のカテプシンＢ、Ｌ、Ｈは殆ど阻害しないという高い特異性を持つものや、カテプシンＤのみを特異的に活性化するなどの特徴を持ったものが得られている。このことは副作用の観点からも治療薬として優れた特性となりうると期待される。
【００１１】
また、当該化合物の調製法としても、ペプスタチンＡが微生物の発酵産物から精製するのに対して、より容易に、かつ大量に人工合成できる長所を持っている。さらに、本分子を基本骨格としてさらに高活性で特異性が高く、安全性、体内動態等薬剤適性の高い誘導体を得ることも容易であるという利点もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のペプチドは、カテプシンＥ活性に対する阻害作用を有し、カテプシンＤ活性に対する阻害作用は実質的に有さず、かつアミノ酸数が6〜34の範囲である。本発明のペプチドは、さらにカテプシンＢ活性に対する阻害作用も実質的に有さない。このような本発明のペプチドとしては、配列表の配列番号1〜58に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。
【００１３】
本発明のペプチドは、いずれも以下に示す分子淘汰操作により得た。
【００１４】
本発明ではin-vitro-virus（IVV）法（特開2004-275149号公報参照）を用いて8アミノ酸のランダム領域を持ったペプチドライブラリを作製し、それらを用いてターゲット分子であるカテプシンEに対する親和性で分子の淘汰を行った。さらに、SF-link法（特開2005-168411号公報参照）を組み合わせて阻害活性で淘汰するという作業を行って、目的のペプチドを得た。以下に一連の操作の概略を示す。詳細な操作方法は実施例に示す。
【００１５】
1) 表1に示した20種のアミノ酸に対応するDNAブロックを用いて、YLBS法(特開2002-315577号公報参照)によりランダム8アミノ酸に対応するDNAライブラリーを作製した。
【００１６】
【表１】
【００１７】
2）作製したDNAライブラリーを元に、図1に示すようなコンストラクトを持つDNAを作製し、それを元にd-IVVペプチドライブラリ群を作製した。
3）図2に示す手順に従って、d-IVVペプチドライブラリ群の中からカテプシンEに強く結合するペプチドアプタマーを淘汰した。
4) SFリンク法の導入により、淘汰ステップにおいて結合はするが阻害活性のない分子は除かれる（図3）。これにより、カテプシンE阻害活性の高まったペプチド分子群を効率的に選択してくることが出来る。
5）上記分子淘汰操作を、条件を変えて複数回（９回）行い、カテプシンE阻害活性を持つ分子として、表2-1に示す30のペプチドを得た。
【００１８】
【表２−１】
【００１９】
表2-1に示す30のペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号1〜30に示す。表2-1に示す30のペプチドは、上記SFリンク法により得られたペプチドである(ペプチド名称の記号の最初にSFと表記)。但し、配列番号3及び12のペプチドは、配列番号2及び11のペプチドの配列を基に、化学合成法によって入手した。いずれのペプチドもN末端の8アミノ酸が可変領域であり(表2-1の各ペプチドの欄には可変領域のみを示す)、C末端にGGRPPTIFFRLKDYKDDDDK(20アミノ酸)が付加しており、ペプチド全体では、28アミノ酸からなる。但し、配列番号25(SF-R7#12) は、可変領域のアミノ酸数が9であり、ペプチド全体では、29アミノ酸からなる。配列番号29(SF-R9#10)は、変領域のアミノ酸数が7であり、ペプチド全体では、27アミノ酸からなる。
【００２０】
表2-1に示す30のペプチドのカテプシンE阻害活性は、表2-2に示す。表2-2に示す結果から、本発明の配列番号1〜30のペプチドは、いずれも高いカテプシンE阻害活性を有することが分かる。
【００２１】
【表２−２】
【００２２】
6）表2-1に示すペプチドの中から、阻害活性が高く配列的に特徴のある3種のペプチドを元に、再度YLBS法を用いて新たなライブラリー構築を行った（図4）。その中から表3-1に、配列番号31〜46として示すカテプシンE阻害活性を持つペプチド分子群を得た。
【００２３】
【表３−１】
【００２４】
表3-1に示す配列番号31〜48のペプチドは、配列表の配列番号31〜48にアミノ酸配列が示され、YLBS法を用いて構築した新たなライブラリーから得られたペプチドであることから、ペプチド名称の記号の最初にASACR(All-Steps-All-Combination Round)と表記した。All-Steps-All-Combination(ASAC)は新たなライブラリーの名称であり、そのライブラリーを用いて淘汰サイクルを回したもの(Round)の中から得られたクローンという意味
でASACRと表記した。
【００２５】
7）上記SFリンク法に用いたライブラリー及びYLBS法に用いたライブラリーを用いてMMV(Multi Micro vessel)を用いた淘汰実験を行い、表3-1に、配列番号47〜58として示すカテプシンE阻害活性を持つペプチド分子群を得た。MMVは多重並列微量容器を用いてより迅速に阻害活性を有するペプチドを見つけ出すための方法論である。表3-1に示す配列番号47〜58のペプチドは、配列表の配列番号47〜58にアミノ酸配列が示され、MMV法を用いて得られたペプチドであることから、ペプチド名称の記号の最初にMMVと表記した。
【００２６】
表3-1に示すペプチドのカテプシンE阻害活性は、表3-2に示す。表3-2に示す結果から、本発明の配列番号31〜58のペプチドは、いずれも高いカテプシンE阻害活性を有することが分かる。
【００２７】
【表３−２】
【００２８】
8）表2-1及び3-1に示されるペプチド分子群の中から、表2-2及び3-2に示す阻害強度の高いものやアミノ酸長の短いものを中心に化学合成法によってペプチド合成を行い、各種プロテアーゼに対する阻害活性特異性などを解析した。その結果を表2-3及び3-3に示す。
【００２９】
【表２−３】
【００３０】
【表３−３】
【００３１】
表2-3及び3-3に示す結果から明らかなように、本発明の前記ペプチドには、カテプシンＤ活性に対する増強作用を有するペプチドも含まれる。そのようなペプチドとしては、例えば、配列表の配列番号2、3、4、6、10、35、38、39、41に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。
【００３２】
さらに、表1-3及び3-3に示す結果から明らかなように、本発明のペプチドには、カテプシンＨ活性、カテプシンＬ活性、トリプシン活性、キモトリプシン活性及びコラゲナーゼ活性に対する阻害作用も実質的に有さないペプチドもある。
【００３３】
本発明のペプチドは、配列表の配列番号1〜58に記載されたアミノ酸配列に基づいて、例えば、公知のペプチド合成法を用いて適宜合成することができる。ペプチド合成法には、一般にＦｍｏｃ法およびＢｏｃ法による固相・液相合成法があり、いずれの方法を用いても本発明のペプチドを合成することは可能である。ペプチド合成法により合成されたペプチドは、公知の方法により精製したものであることが適当である。
【００３４】
本発明のペプチドは、これを有効成分として含有するカテプシンＥ阻害剤に用いることだできる。本発明のカテプシンＥ阻害剤は、カテプシンＥに対して優れた阻害活性を有し、そればかりではなく、カテプシンＤ活性に対する阻害活性は有さない、カテプシンＥ特異的阻害剤である。さらに、含有されるペプチドの種類によっては、カテプシンＤ活性に対する増強作用を有する場合もある。加えて、本発明のカテプシンＥ阻害剤は、含有されるペプチドの種類によって、カテプシンＨ活性、カテプシンＬ活性、トリプシン活性、キモトリプシン活性及びコラゲナーゼ活性に対する阻害作用も実質的に有さない場合もある。
【００３５】
本発明のカテプシンＥ阻害剤は、実験試薬として利用できるばかりではなく、カテプシンＥが関連する慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患等の治療薬あるいは予防薬としての利用も期待できる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３７】
実施例１
1)PCR増幅
YLBS法によって作製したランダム8アミノ酸に対応するDNAライブラリーを元に、PCRによって図1に示したIVV用コンストラクトを作製する。以下にPCRの条件を示す。
【化１】
【００３８】
プログラム
90℃ 2分
90℃ 30秒
60℃ 1分
72℃ 30秒
90℃ 30秒、60℃ 1分及び72℃ 30秒を30サイクル行い、得られたDNAは電気泳動法で確認し、QIAquick(QIAGEN)で精製する。
【００３９】
2)RNA作製
【化２】
混合物を37℃で4時間反応させ、RQ1 RNase free DNase 0.5μlを加えてさらに15分間37℃で反応させたあと精製する。
RNase free water 90μl、PCI(フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール) 100μlを加えて激しく撹拌する。遠心して上清をとり2-プロパノール 90μl, プライマー リムーバー(Edge BioSystems) 10μlを加えて撹拌、15000rpmで１０分遠心する。80% EtOHで沈殿物を洗い15000rpmで３分遠心。上清を取り除き乾燥後H2O 20μlを加えて溶解させる。
【００４０】
3)ピューロマイシンリンカーとRNAのライゲーション
【化３】
【００４１】
【化４】
80℃で２分反応させた後、１秒ごとに0.1℃温度を下げ、70℃まで下がったら1分反応させる。これを10℃ごとに繰り返し、4℃まで緩やかに温度を下げる。
【００４２】
アニーリング
【化５】
混合物を25℃で2時間反応させ、RNeasy mini(QIAGEN)で精製する。
【００４３】
4)翻訳（IVV（in vitro virus）化）
【化６】
37℃で1時間反応後、2M KCl 23μl, 1M MgCl2 3.8μlを添加し37℃で2時間反応させる。
【００４４】
5)逆転写 (d-IVV(DNA-in vitro virus)化)
反応物のストレプトアビジン磁気ビーズへの結合
ストレプトアビジン磁気ビーズ（TaKaRa）20μlを洗浄し、2×binding バッファー 75μlを加えて懸濁し、翻訳反応物75μlを加えて室温で1時間穏やかに撹拌する。
ビーズを洗浄し、以下の反応混合物を加えて逆転写反応を行う。
【化７】
25℃で5分反応させた後、45℃で1時間、穏やかに撹拌する。
【００４５】
6)制限酵素処理
ビーズを洗浄し、以下の反応混合物を加えて酵素反応を行う。
【化８】
37℃で1時間穏やかに撹拌し、上清を回収する。
【００４６】
7) 反応物の精製
Ni-NTA アガロース(QIAGEN) 100μlをバッファー(50mM NaH2PO4, 0.3M NaCl, pH8.0)で平衡化し、回収した上清を室温で1時間、穏やかに撹拌して吸着させる。10, 20mM イミダゾール添加バッファーでレジンを洗浄し、250mM イミダゾールで溶出させる。BioSpin(Bio-Rad)を用いて精製し、溶液中のイミダゾールを除く。
【００４７】
8) Factor Xa処理
精製した250mM イミダゾール溶出画分に以下の反応混合物を加えて酵素反応を行う。
【化９】
37℃で2時間反応させ、Xa removal resin(QIAGEN) 50μlで精製し、factor Xaを除く。
【００４８】
9)反応物の精製
Ni-NTA アガロース(QIAGEN) 100μlをバッファーで平衡化し、回収した上清を室温で1時間、穏やかに撹拌して吸着させる。上清を回収しBioSpin(Bio-Rad)を用いてd-IVVを精製する。
【００４９】
10）ペプチドアプタマーの試験管内スクリーニング
【化１０】
【００５０】
10-1ライブラリーとカテプシンEとの結合
選択 バッファー 100μlに溶かしたIVVライブラリー中(約１pmol)にカテプシンEを結合させたビーズ5μl (カテプシンE 5 pmol 相当)を入れ、25℃で30分間反応させる。
【００５１】
10-2 非特異的吸着の除去
選択 バッファー 200μlを加え、チューブを軽くかき混ぜた後、15000rpm で1分間遠心し、上清を廃棄する。洗浄 バッファー 1 200μlを加え、チューブを軽くかき混ぜた後、15000rpmで1分間遠心し、上清を廃棄する。洗浄 バッファー 2 を200μl加え、チューブを軽くかき混ぜた後、15000rpmで1分間遠心し、上清を廃棄する。
各ラウンドにおける洗浄回数は表4のとおり。
【００５２】
【表４】
【００５３】
10-3 吸着サンプルの回収
洗浄後のビーズに溶出 バッファー 1 を100μl加え、37℃、5分インキュベーションした後15000rpmで 1分間遠心し、上清を回収する（2回繰り返す）。
回収後のビーズにさらに溶出 バッファー 2 を100μl加え、95℃、5分インキュベーションした後15000rpmで1分間遠心し、上清を回収する（2回繰り返す）。
回収した上清をBioSpinで精製する。精製後の溶液をテンプレートにして次ラウンド用のコンストラクトDNA作製のためのPCR増幅を行う（実施例1のPCRと同条件）。
以降ステップ1〜10を繰り返して淘汰サイクルを重ねることで、より強い阻害活性を持ったペプチドを選択してくる（本研究では9サイクル行った）。
【００５４】
11) 淘汰産物のクローン化
ある程度淘汰が進んだ後のDNAライブラリー（本研究では5ラウンド以降のDNAライブラリー）に対し、TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローン化を行う。（方法はキットに付属のマニュアルに従う）。得られたクローンＤＮＡに対して再度実施例1〜9のステップを繰り返し、d-IVV作製を行った。
【００５５】
12）カテプシンE阻害活性検定
12-1 11で作製した各クローンのd-IVVにRNaseH（TOYOBO）を加えて37℃で１時間インキュベーションし、DNA部分を消化しペプチド型にする。（以下ペプチド溶液と表記）
12-2 96穴プレートにH2O 66μlと10×セレクションバッファー（0.5M酢酸ナトリウム(pH4.5), 1M NaCl）10μlとカテプシンE溶液（3.36mM）3μlを混ぜたものを室温で5分インキュベーションする。
12-3 この溶液にペプチド溶液を10μl加え、室温で15分インキュベーションする。（ブランクとして水を10μl加えたものも同時に作製）
12-4 この溶液に50μMカテプシンE基質（（株）ペプチド研 Code:3200-v）10μlを加え、40℃で10分間反応させる。
12-5 10分後、FluPolo (TaKaRa)で測定する。（360nm 励起, 430nm 発光）カテプシンEの活性が高いものほど430nmのピークが高くなるので、ブランクとの値を比較することによってペプチドの阻害活性が求まる。
【００５６】
求まった阻害活性（ペプチドについての阻害活性）を前記表2-2に示す。
【００５７】
表2-2には、ペプチドについての阻害活性以外に、合成 ペプチドについての阻害活性、及びIC50のデータを示す。
【００５８】
合成ペプチドについての阻害活性は、再現性をみるため、化学合成によって作製したペプチドについて測定したデータである。測定方法は12-2から12-5と同様でペプチド1μgを使用した。具体的には実施例４に示す。
【００５９】
IC50は活性を50％阻害するペプチド濃度を指し、数値が低いほど阻害活性が強いものであることを意味しています。測定方法は12-2から12-5と同様で、ペプチド（合成ペプチドを使用）量を0.001μg, 0.01μg, 0.1μg, 1μg, 10μg, 20μgとしてそれぞれ測定し、それらの値から阻害活性が50％になるときのペプチド濃度を求めた。
【００６０】
実施例2
表2-1に示されたクローンの中から、阻害活性が高く、特徴的な配列をもった3つのクローン配列を元に再度4アミノ酸からなるブロック配列を設計し（表5、図4）、それらのブロックに対し、YLBS法を用いて新たなライブラリー(ASACライブラリー)を作製した。
以下にASACライブラリー作製のための実験条件を示す。
【００６１】
【化１１】
【００６２】
【表５】
【００６３】
表5に示す16種のブロックDNA配列にYLBSを行うために必要な配列(5'-Half stem, 3'Half stem (下記))をそれぞれ5'側、3'側に付加したものを有機合成によって作製する。（5'-Half, 3'-Halfと名付ける、16種×2、計32本）
5'-Half stem
5'GGCTCGCGAA TACTGCGAAG AAAGGTCGT 3'
3'-Half stem
5'CGATCTCAC TCCTTCGCAG TATTCGCGAG CC 3'
【００６４】
【化１２】
【００６５】
【化１３】
【００６６】
次段反応用の5'-Half,3'-Halfを作製するために、連結後の産物をテンプレートにしてPCRを行う。
【００６７】
【化１４】
【化１５】
【００６８】
PCR後の産物をエタノール沈殿により精製、5'-Half調製用PCR、3'-Half調製用PCR産物についてそれぞれ別々に以下の反応を行う。
【００６９】
【化１６】
【００７０】
【化１７】
【００７１】
得られた(a)、(b)の溶液が次段反応用の3'Half,5'Halfとなり、それらを元にハイブリダイゼーションのステップに戻り、ここまでの操作を所定のブロック数（今回は8ブロック）に到達するまで繰り返す。
【００７２】
このようにして作製したライブラリー（ASACライブラリー、図4）を元に再度IVVコンストラクトを作製し、カテプシンE阻害ペプチドの淘汰を行った。実験条件は実施例1の1)〜12)のステップとほぼ同一である。異なる点を以下に示す。
【００７３】
10-2の非特異的吸着の除去は、以下のように変更した。
選択 バッファー 200μlを加え、チューブを軽くかき混ぜた後、15000rpm で1分間遠心し、上清を廃棄する。洗浄 バッファー 3 (50mM酢酸ナトリウム(pH4.5),2M NaCl)200μlを加え、チューブを軽くかき混ぜた後、15000rpmで1分間遠心し、上清を廃棄する。同様の操作を５回繰り返す。
【００７４】
求まった阻害活性は、前記表2-2の配列番号31〜46として示す。
【００７５】
実施例3
MMV(Multi Micro vessel)を用いた淘汰実験方法を示す。
MMV中での阻害活性測定
１．[MMV中でのPCR反応]
1-1 MMV用プラスチック容器（アズワン バランスディッシュBD-1）に1×PCRバッファー＋0.2mM dNTP溶液の溶液2mlを入れる。
1-2 保存用ビーカーから薬匙を用いてMMV1を取り出し、上記容器に入れる。
1-3 この容器を恒温振とう器(TAITEC製Bioshaker V.BR-36)中で37℃、30分振とうする。
1-4 振とう後、MMV1中のウェル内溶液を排出用MMVを用いて遠心移送で排出する。（遠心移送操作の詳細については図5にて説明、以下同様）
1-5 PCR溶液(下記100分子/0.5μlとなるようにテンプレートを添加する)をシリコンコーティングした500μlチューブ内で調製する。
1-6 PCR溶液をＭＭＶ1のウェル内にピペッティング及び遠心で入れる（以下注入と表記）、気泡が無くなることで注入を確認。
1-7 ピンセットを用いて、MMV1をPCR用の枠に入れ、MMVと同サイズ(2.5cm×2.5cm)に切り取ったパラフィルム、及び8％ゲルシート(0.75mm厚)でフタをする。
1-8 MMV1を枠ごとビニール袋の中に入れ(枠に入れた後は手で操作可能)、内部に乾燥防止のため水20μlを入れる。その後、空気を抜きながら熱により枠の外側をシールし、パッキング。
1-9 PCR装置（エッペンドルフ社、Mastercycler gradient）のヒートブロック上に銅板（3cm×7cm厚さ0.2mm）を敷き、その上にパッキングしたＭＭＶを乗せ、発砲スチロール片を上に乗せ、装置のフタが枠に密着するまで押さえる。（押さえすぎるとゲルがつぶれることがあるので注意）
1-10下記のプログラムでPCRを行う。
【００７６】
【化１８】
【００７７】
2．[MMV中での転写翻訳反応]
2-1 MMV用プラスチック容器にPUREsystem低分子溶液（下記）2mlを入れる。
2-2 1-2, 1-3, 1-4と同様にしてバッファー交換する。（交換後のMMVをMMV2とする）
2-3 PCR後のＭＭＶ1を薬匙で枠から取り出し、ピンセットを用いてフタとパラフィルムを静かに取り除く。
2-4 ＭＭＶ1中の溶液を転写翻訳反応用のＭＭＶ2に遠心移送
2-5 Dynabeads (TAKARA)80μlを1.5 mlチューブに取り、添付バッファーで洗浄、上清を廃棄。
2-6 上清廃棄後のチューブにPUREsystem(Wako)500μlを入れ、ビーズが拡散するようによく攪拌。（PUREsystem溶液）
2-7 PUREsystem溶液を保存用ビーカーから薬匙を用いて取り出したMMVソース3（穴の径が1/2のもの）に注入。（MMVソースは試料移送専用のMMVのことを指す）
2-8 MMV2にMMVソース3中の溶液を遠心移送※
2-9 PUREsystem低分子溶液を入れたMMV用プラスチック容器に薬匙を用いてMMV2を移し、フタをする。（乾燥防止のため）
2-10 恒温槽(TAITEC製Bioshaker V.BR-36)中で37℃2時間反応 (10分おきに磁石をMMVの上下にあててビーズ振とう。（往復20回程）)
【００７８】
【化１９】
【００７９】
3．[MMV中でのXa切断処理]
3-1 転写翻訳反応後のMMV2を薬匙でガラス板上に移し、下から磁石でビーズを固定した状態でろ紙を用いて上清を吸収、廃棄。
3-2 Xa溶液（下記）を1.5mlチューブ内で調製し、保存用ビーカーから薬匙を用いて取り出したMMVソース4に注入。
3-3 MMV2中にMMVソース4中の溶液を遠心移送する。
3-4 1×Xaバッファーを入れたMMV用プラスチック容器に薬匙を用いてMMV2を移し、フタをする。
3-5 恒温槽(TAITEC製Bioshaker V.BR-36)中で37℃1時間反応(10分おきに磁石をMMVの上下に当てビーズ振とう（往復20回程）)
3-6 反応後のMMV2に2.5cm×2.5cmに切り取ったパラフィルムでフタをし、その上から磁石を当てる。その状態でフタを取ることでビーズを除去する。
【００８０】
【化２０】
【００８１】
4．[MMV中での阻害活性測定]
4-1 MMV用プラスチック容器に1×セレクションバッファー（下記）2mlを入れる。
4-2 1-2, 1-3, 1-4と同様にしてバッファー交換する。（交換後のMMVをMMV5とする）
4-3 MMV2中の溶液をMMV5に遠心移送。
4-4 活性測定溶液（下記）を1.5 mlチューブ内で調製し、保存用ビーカーから薬匙を用いて取り出したMMVソース6（穴の径が1/2のもの）に注入。
4-5 MMV5にMMVソース6中の溶液を遠心移送。
4-6 1×セレクションバッファーを入れたMMV用プラスチック容器に薬匙を用いてMMV5を移し、フタをする。
4-7 恒温槽(TAITEC製Bioshaker V.BR-36)中で40℃、10分反応。
4-8 蛍光イメージャー(BioRad Gel-DocXR)のランプの部分に0.8%(w/v)クロム酸カリウム水溶液（320〜340nmの波長の光を通す）100mlを入れた容器、また、カメラ部にプラスチックフィルター(360nm以上の波長を通す)を取り付ける。
4-9 薬匙を用いてMMV5をガラス板上に移し、蛍光イメージャーに入れ、基質の蛍光を測定する。（インヒビターのあるウェル中では蛍光強度が弱くなっていることが予想される）
【００８２】
【化２１】
【００８３】
4-9で蛍光を測定した後、蛍光強度が低かったウェル中のDNAを回収してPCR増幅(PCR条件は実施例1(1)と同様)を行い、その後、実施例1の11),12)に従ってMMV由来クローンの阻害活性測定を行った。求まった阻害活性は、前記表3-2の配列番号47〜58として示す。
【００８４】
実施例4
表2-1及び3-1に示されるペプチド分子群の中から、表1-2及び3-2に示す阻害強度の高いものやアミノ酸長の短いペプチドを中心に、化学合成法によってペプチド合成した。ペプチド合成は、東レリサーチセンターに依頼した。得られたペプチドの純度等は逆相HPLC精製、純度95％以上である。
【００８５】
合成したペプチドの各種プロテアーゼに対する阻害活性特異性などを解析した。その結果を前記表1-3及び3-3に示す。各種プロテアーゼに対する阻害活性は以下に示す方法で測定した。
【００８６】
各種プロテアーゼに対する特異性測定
カテプシンE（CE）カテプシンD（CD）の阻害活性測定
【００８７】
【化２２】
【００８８】
カテプシンB、カテプシンL、カテプシンHの阻害活性測定
【化２３】
【００８９】
トリプシン、キモトリプシン、及びコラゲナーゼの阻害活性測定法を以下に示す。
トリプシン, キモトリプシンの阻害活性測定
【化２４】
【００９０】
コラゲナーゼの阻害活性測定
【化２５】
【００９１】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、カテプシンEが関連する技術分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】IVV-SF-linkペプチドライブラリ群作成コンストラクト説明図。
【図２】ペプチドアプタマー淘汰サイクルの説明図。
【図３】SF-link法の説明図。
【図４】ASACライブラリーの原料と作製方法の説明図。
【図５】遠心移送の説明図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、類縁のプロテアーゼ（カテプシンＤ、Ｂ、Ｌ、Ｈ、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼなど）は阻害せず、カテプシンＥを特異的に阻害するペプチドに関する。さらに本発明は、このペプチドを有効成分として含有するカテプシンＥ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
カテプシンＤ、Ｅは共に細胞内アスパラギン酸プロテアーゼであり、両者の酵素学的性質は非常に似たものであるが、カテプシンＤが赤血球を除くすべての組織・細胞に普遍的に存在しているのに対し、カテプシンＥは免疫担当細胞や皮膚などに限局的に存在することが知られている。山本らは、カテプシンE遺伝子欠損マウス（ノックアウトマウス）を作製し、カテプシンＥの機能解析を進めてきた（Yamamoto,K. Cathepsin E and D:biosynthesis, processing and subcellular location.Adv.Exp.Med.Biol., 362, 223-9(1995)、非特許文献１）。カテプシンE欠損マウスは無菌環境下で飼育しても、全く異常を示さないが、通常環境下に移すとアトピー性皮膚炎様症状を示した。病理組織学的にもヒトにおけるアトピー性皮膚炎症状と酷似した症状を示した。カテプシンE欠損マウスから調製したマクロファージを用いた研究では、正常マクロファージに比べて、殺菌能、細胞生存率、遊走能などの細胞機能に著明な低下があることが示されている。このことは、カテプシンE欠損が宿主の免疫応答自体に低下や不調をもたらし、それが何らかの外的刺激によってアトピー性皮膚炎などの個体の病態を発症させていることを示唆している。事実、カテプシンE欠損マウスでは、慢性関節リウマチのモデルである実験的関節炎が誘導されると、野生型マウスに比べてその病態に著しい増悪が見られることが示されている。カテプシンE欠損が炎症性サイトカインの分泌パターンを変化させ、関節炎を増悪させることが考えられる。一方、正常マウス（DBA/1J）にコラーゲン関節炎を起こさせると、血清中のカテプシンE活性は対照マウスの約2.5倍（p<0.001）に上昇していることが示されている。（筑波 隆幸、山本 健二：アトピー性皮膚炎とカテプシンE. 日薬理誌（Folia Pharmacol.Jpn.）122,15-20(2003)、非特許文献２）このことは、カテプシンE欠損という極端なケースを除けば、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患等においては、一般的にカテプシンEの活性増加が生じていると考えられる。このことは、慢性関節リウマチ患者の滑液中のカテプシンE活性が病態に比例して増大するという山本らの報告とよく一致する。
【０００３】
また、各種癌細胞を用いた実験から、カテプシンEが癌細胞表面のTRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)を特異的に切断遊離させ、TRAILとその受容体を介するシグナリングによって癌細胞をアポトーシスに誘導することが明らかにされている。（山本ら：未発表）。TRAILはCD4+T細胞、NK細胞、単球、樹状細胞、好中球などにも発現していることから、これらの細胞を介して癌細胞をアポトーシスに誘導する一方で、自らの細胞をもアポトーシスに誘導して宿主免疫細胞系を破綻させる可能性も示唆されている。このことは、カテプシンEの過剰発現がTRAILを介するアポトーシス誘導機構を惹起させ、Th1型の免疫反応の破綻を誘導し、自己免疫疾患等の種々の疾患を生む可能性を強く示唆している。
【０００４】
一方、カテプシンDについてもノックアウトマウスを用いた研究により、カテプシンDがリソソーム蛋白分解系における必須の酵素であること、および同酵素の欠損により神経性セロイド様リポフスチン蓄積症(Neuronal Ceroid Lipofuscinoses; NCLs)と呼ばれる神経変性疾患に非常に類似した病態を呈することを示すことが報告されている。(Shimizu T, et al. J. Neurochem., 94(3), 680-90 (2005) 、非特許文献3)
【０００５】
以上のような知見から、カテプシンD,E活性の増大及び低下は、自己免疫疾患等の様々な病態に繋がると考えられ、その際の過剰な活性を抑える薬剤はこうした病態の改善に大いに役立つものと期待される。カテプシンEに対する阻害剤についてはこれまで放線菌由来のペプスタチンA(Umezawa,H.,Aoyagi,T.,Morishima,H.,Matsuzaki,M, and Hamada,M.Pepstatin, a new pepsin inhibitor produced by Actinomycetes.J.Antibiot.,23,259-62(1970)、非特許文献４）と回虫から分離されたAscaris pepsin inhibitor (Kageyama,T. Molecular cloning, expression and characterization of an Ascaris inhibitor for pepsin and cathepsin E. Eur. J. Biochem.,253.804-9(1998)、非特許文書５)が知られている。
【非特許文献１】Yamamoto,K. Cathepsin E and D:biosynthesis, processing and subcellular location.Adv.Exp.Med.Biol., 362, 223-9(1995)
【非特許文献２】筑波 隆幸、山本 健二：アトピー性皮膚炎とカテプシンE. 日薬理誌（Folia Pharmacol.Jpn.）122,15-20(2003)
【非特許文献３】Shimizu T, Hayashi Y, Yamasaki R, Yamada J, Zhang J, Ukai K, Koike M, Mine K, von Figura K, Peters C, Saftig P, Fukuda T, Uchiyama Y, Nakanishi H.Proteolytic degradation of glutamate decarboxylase mediates disinhibition of hippocampal CA3 pyramidal cells in cathepsin D-deficient mice. J. Neurochem., 94(3), 680-90(2005)
【非特許文献４】Umezawa,H., Aoyagi,T., Morishima,H., Matsuzaki,M, and Hamada,M. Pepstatin, a new pepsin inhibitor produced by Actinomycetes. J. Antibiot.,23,259-62(1970)
【非特許文献５】Kageyama,T. Molecular cloning, expression and characterization of an Ascaris inhibitor for pepsin and cathepsin E. Eur. J. Biochem.,253.804-9(1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
放線菌由来のペプスタチンAはアスパラギン酸プロテアーゼ群に共通の阻害剤で特異性がない。回虫ペプシン阻害剤（Ascaris pepsin inhibitor）はペプシンに対すると同様にカテプシンEを強く阻害し、他のアスパラギン酸プロテアーゼは阻害しないが、高分子タンパク質で細胞毒性が強いという欠点がある。そのため、カテプシンEに特異的な阻害剤として実用的なものは知られていないのが現状である。
【０００７】
そこで本発明の目的は、カテプシンEを特異的に阻害し、かつカテプシンEと類縁性の高いリソソーム酵素であるカテプシンDは阻害しない物質及びカテプシンE特異的阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、最近一本鎖DNAからなるカテプシンE阻害分子（特許出願2005-235819）を得ることに成功した。しかし、阻害特異性の点で更なる改良の必要を感じ、ペプチド型制御剤の開発に着手し、該研究を完成するに至った。その結果、カテプシンDに対しては殆ど阻害活性を持たず、カテプシンEを特異的に阻害するペプチドを見出し、本発明を完成させた。さらに、本研究ではカテプシンDを特異的に活性化するような性質を持つものも得られてきた。
【０００９】
本発明は以下のとおりである。
[1]カテプシンＥ活性に対する阻害作用を有し、カテプシンＤ活性に対する阻害作用は実質的に有さず、かつアミノ酸数が6〜34の範囲であるペプチド。
[2]前記ペプチドはカテプシンＢ活性に対する阻害作用も実質的に有さない[1]に記載のペプチド。
[3]前記ペプチドは配列表の配列番号1〜58に記載のアミノ酸配列を有する[1]または[2]に記載のペプチド。
[4]前記ペプチドは配列表の配列番号1〜30に記載のアミノ酸配列を有する[1]または[2]に記載のペプチド。
[5]前記ペプチドは配列表の配列番号31〜47に記載のアミノ酸配列を有する[1]または[2]に記載のペプチド。
[6]前記ペプチドは配列表の配列番号48〜58に記載のアミノ酸配列を有する[1]または[2]に記載のペプチド。
[7]前記ペプチドはカテプシンＤ活性に対する増強作用を有する[1]または[2]に記載のペプチド。
[8]前記ペプチドは配列表の配列番号2、3、4、6、10、35、38、39、41に示されるアミノ酸配列を有する[7]に記載のペプチド。
[9]前記ペプチドはカテプシンＨ活性、カテプシンＬ活性、トリプシン活性、キモトリプシン活性及びコラゲナーゼ活性に対する阻害作用を実質的に有さない[1]〜[8]のいずれかに記載のペプチド。
[10][1]〜[9]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するカテプシンＥ阻害剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の化合物はペプチド型であり、分子量も1,000〜3,000Da程度でＤＮＡ型阻害分子と比べて約1/30〜1/10程度に小型化している。また、標的分子のカテプシンＥに対して強い阻害活性を示し、かつ類縁性の高いリソソーム酵素であるカテプシンＤや他のカテプシンＢ、Ｌ、Ｈは殆ど阻害しないという高い特異性を持つものや、カテプシンＤのみを特異的に活性化するなどの特徴を持ったものが得られている。このことは副作用の観点からも治療薬として優れた特性となりうると期待される。
【００１１】
また、当該化合物の調製法としても、ペプスタチンＡが微生物の発酵産物から精製するのに対して、より容易に、かつ大量に人工合成できる長所を持っている。さらに、本分子を基本骨格としてさらに高活性で特異性が高く、安全性、体内動態等薬剤適性の高い誘導体を得ることも容易であるという利点もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のペプチドは、カテプシンＥ活性に対する阻害作用を有し、カテプシンＤ活性に対する阻害作用は実質的に有さず、かつアミノ酸数が6〜34の範囲である。本発明のペプチドは、さらにカテプシンＢ活性に対する阻害作用も実質的に有さない。このような本発明のペプチドとしては、配列表の配列番号1〜58に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。
【００１３】
本発明のペプチドは、いずれも以下に示す分子淘汰操作により得た。
【００１４】
本発明ではin-vitro-virus（IVV）法（特開2004-275149号公報参照）を用いて8アミノ酸のランダム領域を持ったペプチドライブラリを作製し、それらを用いてターゲット分子であるカテプシンEに対する親和性で分子の淘汰を行った。さらに、SF-link法（特開2005-168411号公報参照）を組み合わせて阻害活性で淘汰するという作業を行って、目的のペプチドを得た。以下に一連の操作の概略を示す。詳細な操作方法は実施例に示す。
【００１５】
1) 表1に示した20種のアミノ酸に対応するDNAブロックを用いて、YLBS法(特開2002-315577号公報参照)によりランダム8アミノ酸に対応するDNAライブラリーを作製した。
【００１６】
【表１】
【００１７】
2）作製したDNAライブラリーを元に、図1に示すようなコンストラクトを持つDNAを作製し、それを元にd-IVVペプチドライブラリ群を作製した。
3）図2に示す手順に従って、d-IVVペプチドライブラリ群の中からカテプシンEに強く結合するペプチドアプタマーを淘汰した。
4) SFリンク法の導入により、淘汰ステップにおいて結合はするが阻害活性のない分子は除かれる（図3）。これにより、カテプシンE阻害活性の高まったペプチド分子群を効率的に選択してくることが出来る。
5）上記分子淘汰操作を、条件を変えて複数回（９回）行い、カテプシンE阻害活性を持つ分子として、表2-1に示す30のペプチドを得た。
【００１８】
【表２−１】
【００１９】
表2-1に示す30のペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号1〜30に示す。表2-1に示す30のペプチドは、上記SFリンク法により得られたペプチドである(ペプチド名称の記号の最初にSFと表記)。但し、配列番号3及び12のペプチドは、配列番号2及び11のペプチドの配列を基に、化学合成法によって入手した。いずれのペプチドもN末端の8アミノ酸が可変領域であり(表2-1の各ペプチドの欄には可変領域のみを示す)、C末端にGGRPPTIFFRLKDYKDDDDK(20アミノ酸)が付加しており、ペプチド全体では、28アミノ酸からなる。但し、配列番号25(SF-R7#12) は、可変領域のアミノ酸数が9であり、ペプチド全体では、29アミノ酸からなる。配列番号29(SF-R9#10)は、変領域のアミノ酸数が7であり、ペプチド全体では、27アミノ酸からなる。
【００２０】
表2-1に示す30のペプチドのカテプシンE阻害活性は、表2-2に示す。表2-2に示す結果から、本発明の配列番号1〜30のペプチドは、いずれも高いカテプシンE阻害活性を有することが分かる。
【００２１】
【表２−２】
【００２２】
6）表2-1に示すペプチドの中から、阻害活性が高く配列的に特徴のある3種のペプチドを元に、再度YLBS法を用いて新たなライブラリー構築を行った（図4）。その中から表3-1に、配列番号31〜46として示すカテプシンE阻害活性を持つペプチド分子群を得た。
【００２３】
【表３−１】
【００２４】
表3-1に示す配列番号31〜48のペプチドは、配列表の配列番号31〜48にアミノ酸配列が示され、YLBS法を用いて構築した新たなライブラリーから得られたペプチドであることから、ペプチド名称の記号の最初にASACR(All-Steps-All-Combination Round)と表記した。All-Steps-All-Combination(ASAC)は新たなライブラリーの名称であり、そのライブラリーを用いて淘汰サイクルを回したもの(Round)の中から得られたクローンという意味
でASACRと表記した。
【００２５】
7）上記SFリンク法に用いたライブラリー及びYLBS法に用いたライブラリーを用いてMMV(Multi Micro vessel)を用いた淘汰実験を行い、表3-1に、配列番号47〜58として示すカテプシンE阻害活性を持つペプチド分子群を得た。MMVは多重並列微量容器を用いてより迅速に阻害活性を有するペプチドを見つけ出すための方法論である。表3-1に示す配列番号47〜58のペプチドは、配列表の配列番号47〜58にアミノ酸配列が示され、MMV法を用いて得られたペプチドであることから、ペプチド名称の記号の最初にMMVと表記した。
【００２６】
表3-1に示すペプチドのカテプシンE阻害活性は、表3-2に示す。表3-2に示す結果から、本発明の配列番号31〜58のペプチドは、いずれも高いカテプシンE阻害活性を有することが分かる。
【００２７】
【表３−２】
【００２８】
8）表2-1及び3-1に示されるペプチド分子群の中から、表2-2及び3-2に示す阻害強度の高いものやアミノ酸長の短いものを中心に化学合成法によってペプチド合成を行い、各種プロテアーゼに対する阻害活性特異性などを解析した。その結果を表2-3及び3-3に示す。
【００２９】
【表２−３】
【００３０】
【表３−３】
【００３１】
表2-3及び3-3に示す結果から明らかなように、本発明の前記ペプチドには、カテプシンＤ活性に対する増強作用を有するペプチドも含まれる。そのようなペプチドとしては、例えば、配列表の配列番号2、3、4、6、10、35、38、39、41に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。
【００３２】
さらに、表1-3及び3-3に示す結果から明らかなように、本発明のペプチドには、カテプシンＨ活性、カテプシンＬ活性、トリプシン活性、キモトリプシン活性及びコラゲナーゼ活性に対する阻害作用も実質的に有さないペプチドもある。
【００３３】
本発明のペプチドは、配列表の配列番号1〜58に記載されたアミノ酸配列に基づいて、例えば、公知のペプチド合成法を用いて適宜合成することができる。ペプチド合成法には、一般にＦｍｏｃ法およびＢｏｃ法による固相・液相合成法があり、いずれの方法を用いても本発明のペプチドを合成することは可能である。ペプチド合成法により合成されたペプチドは、公知の方法により精製したものであることが適当である。
【００３４】
本発明のペプチドは、これを有効成分として含有するカテプシンＥ阻害剤に用いることだできる。本発明のカテプシンＥ阻害剤は、カテプシンＥに対して優れた阻害活性を有し、そればかりではなく、カテプシンＤ活性に対する阻害活性は有さない、カテプシンＥ特異的阻害剤である。さらに、含有されるペプチドの種類によっては、カテプシンＤ活性に対する増強作用を有する場合もある。加えて、本発明のカテプシンＥ阻害剤は、含有されるペプチドの種類によって、カテプシンＨ活性、カテプシンＬ活性、トリプシン活性、キモトリプシン活性及びコラゲナーゼ活性に対する阻害作用も実質的に有さない場合もある。
【００３５】
本発明のカテプシンＥ阻害剤は、実験試薬として利用できるばかりではなく、カテプシンＥが関連する慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患等の治療薬あるいは予防薬としての利用も期待できる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３７】
実施例１
1)PCR増幅
YLBS法によって作製したランダム8アミノ酸に対応するDNAライブラリーを元に、PCRによって図1に示したIVV用コンストラクトを作製する。以下にPCRの条件を示す。
【化１】
【００３８】
プログラム
90℃ 2分
90℃ 30秒
60℃ 1分
72℃ 30秒
90℃ 30秒、60℃ 1分及び72℃ 30秒を30サイクル行い、得られたDNAは電気泳動法で確認し、QIAquick(QIAGEN)で精製する。
【００３９】
2)RNA作製
【化２】
混合物を37℃で4時間反応させ、RQ1 RNase free DNase 0.5μlを加えてさらに15分間37℃で反応させたあと精製する。
RNase free water 90μl、PCI(フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール) 100μlを加えて激しく撹拌する。遠心して上清をとり2-プロパノール 90μl, プライマー リムーバー(Edge BioSystems) 10μlを加えて撹拌、15000rpmで１０分遠心する。80% EtOHで沈殿物を洗い15000rpmで３分遠心。上清を取り除き乾燥後H2O 20μlを加えて溶解させる。
【００４０】
3)ピューロマイシンリンカーとRNAのライゲーション
【化３】
【００４１】
【化４】
80℃で２分反応させた後、１秒ごとに0.1℃温度を下げ、70℃まで下がったら1分反応させる。これを10℃ごとに繰り返し、4℃まで緩やかに温度を下げる。
【００４２】
アニーリング
【化５】
混合物を25℃で2時間反応させ、RNeasy mini(QIAGEN)で精製する。
【００４３】
4)翻訳（IVV（in vitro virus）化）
【化６】
37℃で1時間反応後、2M KCl 23μl, 1M MgCl2 3.8μlを添加し37℃で2時間反応させる。
【００４４】
5)逆転写 (d-IVV(DNA-in vitro virus)化)
反応物のストレプトアビジン磁気ビーズへの結合
ストレプトアビジン磁気ビーズ（TaKaRa）20μlを洗浄し、2×binding バッファー 75μlを加えて懸濁し、翻訳反応物75μlを加えて室温で1時間穏やかに撹拌する。
ビーズを洗浄し、以下の反応混合物を加えて逆転写反応を行う。
【化７】
25℃で5分反応させた後、45℃で1時間、穏やかに撹拌する。
【００４５】
6)制限酵素処理
ビーズを洗浄し、以下の反応混合物を加えて酵素反応を行う。
【化８】
37℃で1時間穏やかに撹拌し、上清を回収する。
【００４６】
7) 反応物の精製
Ni-NTA アガロース(QIAGEN) 100μlをバッファー(50mM NaH2PO4, 0.3M NaCl, pH8.0)で平衡化し、回収した上清を室温で1時間、穏やかに撹拌して吸着させる。10, 20mM イミダゾール添加バッファーでレジンを洗浄し、250mM イミダゾールで溶出させる。BioSpin(Bio-Rad)を用いて精製し、溶液中のイミダゾールを除く。
【００４７】
8) Factor Xa処理
精製した250mM イミダゾール溶出画分に以下の反応混合物を加えて酵素反応を行う。
【化９】
37℃で2時間反応させ、Xa removal resin(QIAGEN) 50μlで精製し、factor Xaを除く。
【００４８】
9)反応物の精製
Ni-NTA アガロース(QIAGEN) 100μlをバッファーで平衡化し、回収した上清を室温で1時間、穏やかに撹拌して吸着させる。上清を回収しBioSpin(Bio-Rad)を用いてd-IVVを精製する。
【００４９】
10）ペプチドアプタマーの試験管内スクリーニング
【化１０】
【００５０】
10-1ライブラリーとカテプシンEとの結合
選択 バッファー 100μlに溶かしたIVVライブラリー中(約１pmol)にカテプシンEを結合させたビーズ5μl (カテプシンE 5 pmol 相当)を入れ、25℃で30分間反応させる。
【００５１】
10-2 非特異的吸着の除去
選択 バッファー 200μlを加え、チューブを軽くかき混ぜた後、15000rpm で1分間遠心し、上清を廃棄する。洗浄 バッファー 1 200μlを加え、チューブを軽くかき混ぜた後、15000rpmで1分間遠心し、上清を廃棄する。洗浄 バッファー 2 を200μl加え、チューブを軽くかき混ぜた後、15000rpmで1分間遠心し、上清を廃棄する。
各ラウンドにおける洗浄回数は表4のとおり。
【００５２】
【表４】
【００５３】
10-3 吸着サンプルの回収
洗浄後のビーズに溶出 バッファー 1 を100μl加え、37℃、5分インキュベーションした後15000rpmで 1分間遠心し、上清を回収する（2回繰り返す）。
回収後のビーズにさらに溶出 バッファー 2 を100μl加え、95℃、5分インキュベーションした後15000rpmで1分間遠心し、上清を回収する（2回繰り返す）。
回収した上清をBioSpinで精製する。精製後の溶液をテンプレートにして次ラウンド用のコンストラクトDNA作製のためのPCR増幅を行う（実施例1のPCRと同条件）。
以降ステップ1〜10を繰り返して淘汰サイクルを重ねることで、より強い阻害活性を持ったペプチドを選択してくる（本研究では9サイクル行った）。
【００５４】
11) 淘汰産物のクローン化
ある程度淘汰が進んだ後のDNAライブラリー（本研究では5ラウンド以降のDNAライブラリー）に対し、TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローン化を行う。（方法はキットに付属のマニュアルに従う）。得られたクローンＤＮＡに対して再度実施例1〜9のステップを繰り返し、d-IVV作製を行った。
【００５５】
12）カテプシンE阻害活性検定
12-1 11で作製した各クローンのd-IVVにRNaseH（TOYOBO）を加えて37℃で１時間インキュベーションし、DNA部分を消化しペプチド型にする。（以下ペプチド溶液と表記）
12-2 96穴プレートにH2O 66μlと10×セレクションバッファー（0.5M酢酸ナトリウム(pH4.5), 1M NaCl）10μlとカテプシンE溶液（3.36mM）3μlを混ぜたものを室温で5分インキュベーションする。
12-3 この溶液にペプチド溶液を10μl加え、室温で15分インキュベーションする。（ブランクとして水を10μl加えたものも同時に作製）
12-4 この溶液に50μMカテプシンE基質（（株）ペプチド研 Code:3200-v）10μlを加え、40℃で10分間反応させる。
12-5 10分後、FluPolo (TaKaRa)で測定する。（360nm 励起, 430nm 発光）カテプシンEの活性が高いものほど430nmのピークが高くなるので、ブランクとの値を比較することによってペプチドの阻害活性が求まる。
【００５６】
求まった阻害活性（ペプチドについての阻害活性）を前記表2-2に示す。
【００５７】
表2-2には、ペプチドについての阻害活性以外に、合成 ペプチドについての阻害活性、及びIC50のデータを示す。
【００５８】
合成ペプチドについての阻害活性は、再現性をみるため、化学合成によって作製したペプチドについて測定したデータである。測定方法は12-2から12-5と同様でペプチド1μgを使用した。具体的には実施例４に示す。
【００５９】
IC50は活性を50％阻害するペプチド濃度を指し、数値が低いほど阻害活性が強いものであることを意味しています。測定方法は12-2から12-5と同様で、ペプチド（合成ペプチドを使用）量を0.001μg, 0.01μg, 0.1μg, 1μg, 10μg, 20μgとしてそれぞれ測定し、それらの値から阻害活性が50％になるときのペプチド濃度を求めた。
【００６０】
実施例2
表2-1に示されたクローンの中から、阻害活性が高く、特徴的な配列をもった3つのクローン配列を元に再度4アミノ酸からなるブロック配列を設計し（表5、図4）、それらのブロックに対し、YLBS法を用いて新たなライブラリー(ASACライブラリー)を作製した。
以下にASACライブラリー作製のための実験条件を示す。
【００６１】
【化１１】
【００６２】
【表５】
【００６３】
表5に示す16種のブロックDNA配列にYLBSを行うために必要な配列(5'-Half stem, 3'Half stem (下記))をそれぞれ5'側、3'側に付加したものを有機合成によって作製する。（5'-Half, 3'-Halfと名付ける、16種×2、計32本）
5'-Half stem
5'GGCTCGCGAA TACTGCGAAG AAAGGTCGT 3'
3'-Half stem
5'CGATCTCAC TCCTTCGCAG TATTCGCGAG CC 3'
【００６４】
【化１２】
【００６５】
【化１３】
【００６６】
次段反応用の5'-Half,3'-Halfを作製するために、連結後の産物をテンプレートにしてPCRを行う。
【００６７】
【化１４】
【化１５】
【００６８】
PCR後の産物をエタノール沈殿により精製、5'-Half調製用PCR、3'-Half調製用PCR産物についてそれぞれ別々に以下の反応を行う。
【００６９】
【化１６】
【００７０】
【化１７】
【００７１】
得られた(a)、(b)の溶液が次段反応用の3'Half,5'Halfとなり、それらを元にハイブリダイゼーションのステップに戻り、ここまでの操作を所定のブロック数（今回は8ブロック）に到達するまで繰り返す。
【００７２】
このようにして作製したライブラリー（ASACライブラリー、図4）を元に再度IVVコンストラクトを作製し、カテプシンE阻害ペプチドの淘汰を行った。実験条件は実施例1の1)〜12)のステップとほぼ同一である。異なる点を以下に示す。
【００７３】
10-2の非特異的吸着の除去は、以下のように変更した。
選択 バッファー 200μlを加え、チューブを軽くかき混ぜた後、15000rpm で1分間遠心し、上清を廃棄する。洗浄 バッファー 3 (50mM酢酸ナトリウム(pH4.5),2M NaCl)200μlを加え、チューブを軽くかき混ぜた後、15000rpmで1分間遠心し、上清を廃棄する。同様の操作を５回繰り返す。
【００７４】
求まった阻害活性は、前記表2-2の配列番号31〜46として示す。
【００７５】
実施例3
MMV(Multi Micro vessel)を用いた淘汰実験方法を示す。
MMV中での阻害活性測定
１．[MMV中でのPCR反応]
1-1 MMV用プラスチック容器（アズワン バランスディッシュBD-1）に1×PCRバッファー＋0.2mM dNTP溶液の溶液2mlを入れる。
1-2 保存用ビーカーから薬匙を用いてMMV1を取り出し、上記容器に入れる。
1-3 この容器を恒温振とう器(TAITEC製Bioshaker V.BR-36)中で37℃、30分振とうする。
1-4 振とう後、MMV1中のウェル内溶液を排出用MMVを用いて遠心移送で排出する。（遠心移送操作の詳細については図5にて説明、以下同様）
1-5 PCR溶液(下記100分子/0.5μlとなるようにテンプレートを添加する)をシリコンコーティングした500μlチューブ内で調製する。
1-6 PCR溶液をＭＭＶ1のウェル内にピペッティング及び遠心で入れる（以下注入と表記）、気泡が無くなることで注入を確認。
1-7 ピンセットを用いて、MMV1をPCR用の枠に入れ、MMVと同サイズ(2.5cm×2.5cm)に切り取ったパラフィルム、及び8％ゲルシート(0.75mm厚)でフタをする。
1-8 MMV1を枠ごとビニール袋の中に入れ(枠に入れた後は手で操作可能)、内部に乾燥防止のため水20μlを入れる。その後、空気を抜きながら熱により枠の外側をシールし、パッキング。
1-9 PCR装置（エッペンドルフ社、Mastercycler gradient）のヒートブロック上に銅板（3cm×7cm厚さ0.2mm）を敷き、その上にパッキングしたＭＭＶを乗せ、発砲スチロール片を上に乗せ、装置のフタが枠に密着するまで押さえる。（押さえすぎるとゲルがつぶれることがあるので注意）
1-10下記のプログラムでPCRを行う。
【００７６】
【化１８】
【００７７】
2．[MMV中での転写翻訳反応]
2-1 MMV用プラスチック容器にPUREsystem低分子溶液（下記）2mlを入れる。
2-2 1-2, 1-3, 1-4と同様にしてバッファー交換する。（交換後のMMVをMMV2とする）
2-3 PCR後のＭＭＶ1を薬匙で枠から取り出し、ピンセットを用いてフタとパラフィルムを静かに取り除く。
2-4 ＭＭＶ1中の溶液を転写翻訳反応用のＭＭＶ2に遠心移送
2-5 Dynabeads (TAKARA)80μlを1.5 mlチューブに取り、添付バッファーで洗浄、上清を廃棄。
2-6 上清廃棄後のチューブにPUREsystem(Wako)500μlを入れ、ビーズが拡散するようによく攪拌。（PUREsystem溶液）
2-7 PUREsystem溶液を保存用ビーカーから薬匙を用いて取り出したMMVソース3（穴の径が1/2のもの）に注入。（MMVソースは試料移送専用のMMVのことを指す）
2-8 MMV2にMMVソース3中の溶液を遠心移送※
2-9 PUREsystem低分子溶液を入れたMMV用プラスチック容器に薬匙を用いてMMV2を移し、フタをする。（乾燥防止のため）
2-10 恒温槽(TAITEC製Bioshaker V.BR-36)中で37℃2時間反応 (10分おきに磁石をMMVの上下にあててビーズ振とう。（往復20回程）)
【００７８】
【化１９】
【００７９】
3．[MMV中でのXa切断処理]
3-1 転写翻訳反応後のMMV2を薬匙でガラス板上に移し、下から磁石でビーズを固定した状態でろ紙を用いて上清を吸収、廃棄。
3-2 Xa溶液（下記）を1.5mlチューブ内で調製し、保存用ビーカーから薬匙を用いて取り出したMMVソース4に注入。
3-3 MMV2中にMMVソース4中の溶液を遠心移送する。
3-4 1×Xaバッファーを入れたMMV用プラスチック容器に薬匙を用いてMMV2を移し、フタをする。
3-5 恒温槽(TAITEC製Bioshaker V.BR-36)中で37℃1時間反応(10分おきに磁石をMMVの上下に当てビーズ振とう（往復20回程）)
3-6 反応後のMMV2に2.5cm×2.5cmに切り取ったパラフィルムでフタをし、その上から磁石を当てる。その状態でフタを取ることでビーズを除去する。
【００８０】
【化２０】
【００８１】
4．[MMV中での阻害活性測定]
4-1 MMV用プラスチック容器に1×セレクションバッファー（下記）2mlを入れる。
4-2 1-2, 1-3, 1-4と同様にしてバッファー交換する。（交換後のMMVをMMV5とする）
4-3 MMV2中の溶液をMMV5に遠心移送。
4-4 活性測定溶液（下記）を1.5 mlチューブ内で調製し、保存用ビーカーから薬匙を用いて取り出したMMVソース6（穴の径が1/2のもの）に注入。
4-5 MMV5にMMVソース6中の溶液を遠心移送。
4-6 1×セレクションバッファーを入れたMMV用プラスチック容器に薬匙を用いてMMV5を移し、フタをする。
4-7 恒温槽(TAITEC製Bioshaker V.BR-36)中で40℃、10分反応。
4-8 蛍光イメージャー(BioRad Gel-DocXR)のランプの部分に0.8%(w/v)クロム酸カリウム水溶液（320〜340nmの波長の光を通す）100mlを入れた容器、また、カメラ部にプラスチックフィルター(360nm以上の波長を通す)を取り付ける。
4-9 薬匙を用いてMMV5をガラス板上に移し、蛍光イメージャーに入れ、基質の蛍光を測定する。（インヒビターのあるウェル中では蛍光強度が弱くなっていることが予想される）
【００８２】
【化２１】
【００８３】
4-9で蛍光を測定した後、蛍光強度が低かったウェル中のDNAを回収してPCR増幅(PCR条件は実施例1(1)と同様)を行い、その後、実施例1の11),12)に従ってMMV由来クローンの阻害活性測定を行った。求まった阻害活性は、前記表3-2の配列番号47〜58として示す。
【００８４】
実施例4
表2-1及び3-1に示されるペプチド分子群の中から、表1-2及び3-2に示す阻害強度の高いものやアミノ酸長の短いペプチドを中心に、化学合成法によってペプチド合成した。ペプチド合成は、東レリサーチセンターに依頼した。得られたペプチドの純度等は逆相HPLC精製、純度95％以上である。
【００８５】
合成したペプチドの各種プロテアーゼに対する阻害活性特異性などを解析した。その結果を前記表1-3及び3-3に示す。各種プロテアーゼに対する阻害活性は以下に示す方法で測定した。
【００８６】
各種プロテアーゼに対する特異性測定
カテプシンE（CE）カテプシンD（CD）の阻害活性測定
【００８７】
【化２２】
【００８８】
カテプシンB、カテプシンL、カテプシンHの阻害活性測定
【化２３】
【００８９】
トリプシン、キモトリプシン、及びコラゲナーゼの阻害活性測定法を以下に示す。
トリプシン, キモトリプシンの阻害活性測定
【化２４】
【００９０】
コラゲナーゼの阻害活性測定
【化２５】
【００９１】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、カテプシンEが関連する技術分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】IVV-SF-linkペプチドライブラリ群作成コンストラクト説明図。
【図２】ペプチドアプタマー淘汰サイクルの説明図。
【図３】SF-link法の説明図。
【図４】ASACライブラリーの原料と作製方法の説明図。
【図５】遠心移送の説明図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテプシンＥ活性に対する阻害作用を有し、カテプシンＤ活性に対する阻害作用は実質的に有さず、かつアミノ酸数が6〜34の範囲であるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドはカテプシンＢ活性に対する阻害作用も実質的に有さない請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは配列表の配列番号1〜58に記載のアミノ酸配列を有する請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは配列表の配列番号1〜30に記載のアミノ酸配列を有する請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは配列表の配列番号31〜47に記載のアミノ酸配列を有する請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは配列表の配列番号48〜58に記載のアミノ酸配列を有する請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドはカテプシンＤ活性に対する増強作用を有する請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドは配列表の配列番号2、3、4、6、10、35、38、39、41に示されるアミノ酸配列を有する請求項7に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドはカテプシンＨ活性、カテプシンＬ活性、トリプシン活性、キモトリプシン活性及びコラゲナーゼ活性に対する阻害作用を実質的に有さない請求項1〜8のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含有するカテプシンＥ阻害剤。
【請求項１】
カテプシンＥ活性に対する阻害作用を有し、カテプシンＤ活性に対する阻害作用は実質的に有さず、かつアミノ酸数が6〜34の範囲であるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドはカテプシンＢ活性に対する阻害作用も実質的に有さない請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは配列表の配列番号1〜58に記載のアミノ酸配列を有する請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは配列表の配列番号1〜30に記載のアミノ酸配列を有する請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは配列表の配列番号31〜47に記載のアミノ酸配列を有する請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは配列表の配列番号48〜58に記載のアミノ酸配列を有する請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドはカテプシンＤ活性に対する増強作用を有する請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドは配列表の配列番号2、3、4、6、10、35、38、39、41に示されるアミノ酸配列を有する請求項7に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドはカテプシンＨ活性、カテプシンＬ活性、トリプシン活性、キモトリプシン活性及びコラゲナーゼ活性に対する阻害作用を実質的に有さない請求項1〜8のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含有するカテプシンＥ阻害剤。
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−３３２０８５（Ｐ２００７−３３２０８５Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６６９５２（Ｐ２００６−１６６９５２）
【出願日】平成１８年６月１６日（２００６．６．１６）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１９０５４８）国立大学法人埼玉大学 (292)
【出願人】（５０５３８９５６９）財団法人埼玉県中小企業振興公社 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１６日（２００６．６．１６）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１９０５４８）国立大学法人埼玉大学 (292)
【出願人】（５０５３８９５６９）財団法人埼玉県中小企業振興公社 (7)
【Ｆターム（参考）】
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