カニ殻由来のカルシウム塩結晶抑制物質
【課題】 カルシウム結晶化抑制作用を有する安全なタンパク質を簡単な工程により安価に得る。該タンパク質を含有するカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤、飲食物、飼料も提供する。
【解決手段】 得られるカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質をカニ殻から抽出して得る。該タンパク質を有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤、ならびに該タンパク質を含有する飲食物および飼料。
【解決手段】 得られるカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質をカニ殻から抽出して得る。該タンパク質を有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤、ならびに該タンパク質を含有する飲食物および飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カニ殻から得られるタンパク質の新規な用途に関し、より具体的には、カニ殻から得られるカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質を有効成分とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤、ならびにこれを含有してなる飲食物および飼料に関する。さらに本発明は、カルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質をカニ殻から容易に得る方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム摂取基準量は、１８歳以上の成人女性では１日６００ｍｇ、妊婦・授乳婦ではそれぞれ＋３００ｍｇ、＋５００ｍｇと設定させているが、厚生労働省が行っている平成１３年の国民栄養調査で、日本人のカルシウム摂取量を調べてみると、１日６００ｍｇを下回っており、最近（平成２年〜平成１３年）で見ても６００ｍｇを平均で上回った年は一度もない状態が続いている。飽食の時代と呼ばれる現代においても、他の栄養素、ミネラルが充足しているのに対して、カルシウムだけが不足している状況が続いる。
【０００３】
このようなカルシウムの摂取不足は、骨粗鬆症、高血圧、イライラ等の重大な疾病を引き起こすことが知られており、カルシウムの摂取不足は、社会的問題となっている。さらに、食物として胃腸管内で摂取されるカルシウムは、複雑な機構で腸管から血液内に吸収されるが、カルシウム塩やカルシウム剤の腸管内における吸収率は５０％以下であり、半分以上が吸収されずに体外に排出されるという報告もある。そのため、腸管内でのカルシウムの吸収性を高める物質の開発も行われている。
【０００４】
その１つとして、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）が開発されている。ＣＰＰは、カゼインにトリプシンを作用させ、加水分解した分解物中に得られるホスホペプチドであり、カルシウムと結合して可溶性複合体を形成する。このため、水溶液中でカルシウムが沈殿するのを抑制することでカルシウムを可溶化し、カルシウムの吸収率を高めると考えられている（非特許文献１、特許文献１、特許文献２参照）。しかしながら、ＣＰＰは、カゼインの酵素分解物であるため、原料であるカゼインを酵素反応させる必要があり手間がかかり、また酵素分解の副産物であるペプチドが苦味を呈するため、飲食品へ混合する場合にはこの苦味ペプチドを十分に分離する必要がある等幾つかの問題点を有しており、また価格も大変高価である。
【０００５】
ポリ−Ｌ−グルタミン酸も腸管内でカルシウムの吸収率を高める作用（非特許文献２参照）を有することが知られているが、これは合成品であるため食品添加物として許可されておらず、安全性等のため利用されていない。また、微生物により産生されるポリ−γ−グルタミン酸（特許文献３参照）は、カルシウム結晶化抑制活性が低く、かつ溶液の粘度が極めて高いため、取扱いが不便である。
【０００６】
さらに、カルシウムの吸収を促進する物質としては、骨由来のペプチド（特許文献４参照）、酪酸を基本成分とするもの（特許文献５参照）があるが、これらは製造上並びに利用上の問題があり実用化には至っていない。
【特許文献１】特開昭５８−１７０４４０号公報
【特許文献２】特開平７−２４１１７２号公報
【特許文献３】特開平３−３０６４８号公報
【特許文献４】特開平４−１６１６５号公報
【特許文献５】特開平４−１０８３６０号公報
【非特許文献１】ジャパンフードサイエンス、第１巻、第２１〜３２頁（１９９０年）
【非特許文献２】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第５８巻，第１６６２〜１６６５頁（１９９４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の問題点を解決し、簡単かつ安価にカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、カニ殻、特にズワイガニ殻から得られるタンパク質が、カルシウムの結晶化を抑制し、これによりカルシウムの吸収を促進する効果を有することを見出した。また、キレート剤を用いてカニ殻を抽出し、有機溶媒にて分画するという簡単な方法により、かかるタンパク質を製造できることを見出した。そして本発明者らは、それらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）カニ殻から得られるカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質を有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤、
（２）前記カニ殻がズワイガニ殻由来である、（１）記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤、
（３）（１）または（２）記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物、
（４）（１）または（２）記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飼料、
（５）さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする（３）記載の飲食物、
（６）さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする（４）記載の飼料、
（７）キレート剤または有機酸を用いてカニ殻を抽出することを特徴とする、カニ殻からカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質の製造方法、
（８）（７）記載の方法により得ることのできる、カルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のカニ殻から得られるタンパク質は、カルシウム結晶化抑制・吸収促進作用が、従来技術で得られた物質と比較して顕著に優れている。本発明のタンパク質を有効成分とする本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤及びこれを含有してなる飲食物並びに飼料は、優れたカルシウムの結晶化抑制・吸収促進効果を奏する。また、本発明により得られるカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤はカニ殻から得られるので安全性が高く、熱安定性も極めて高い。さらに本発明によれば、該カニ殻タンパク質を簡単かつ安価に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
上述のごとく、本発明は、１の態様において、カニ殻から得られるカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質を有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤に関するものである。カルシウム結晶化を抑制することにより、体内、特に腸管において吸収されるカルシウム量が増大する。したがって、本明細書において「カルシウム結晶化抑制」という場合には、特に断らない限り「カルシウム吸収促進」の意味も包含するものとする。
【００１２】
カニの種類は特に限定されないが、好ましいカニとしてズワイガニが挙げられる。また、生のカニでも、ゆでたカニでもどちらの状態でもよいが、ゆでた状態のカニの殻から効率よく抽出される。実施例８で示すように、本発明のカニ殻由来のタンパク質は熱安定性が極めて高いので、ボイルしたカニ殻からでも活性の高いタンパク質が得られる。
【００１３】
本発明のカニ殻から得られるタンパク質を抽出する方法としては、一般的に行われている破砕方法を用いることができる。例えば、加圧型破壊、機械的磨砕、超音波処理、ホモジナイザー等の物理的破砕方法を用いることができる。これにより得られた破砕物を水性媒体で抽出する。媒体は水、食塩水、酸溶液、またはＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤を使用することでタンパク質を抽出する。好ましくは、キレート剤または有機酸を含む水溶液を媒体として用いて抽出を行う。キレート剤および有機酸は種々のものが知られており、適宜選択して使用することができるが、安全性の高いものが好ましい。好ましいキレート剤としてはＥＤＴＡなどがあり、好ましい有機酸としてはクエン酸などがあげられる。媒体として緩衝液を用いてｐＨを調節してもよい。好ましいｐＨ範囲は中性付近、例えば、５ないし９である。このようにして、カニ殻からタンパク質を効率よく抽出することができる。上記タンパク質の抽出物は、必要に応じ、公知の手段、例えば硫酸アンモニウム等の塩析やエタノール等の有機溶剤による沈澱、等電点沈殿法による分画、イオン交換、吸着、ゲル濾過、疎水もしくはアフイニティー等のクロマトグラフィーを用いて精製してもよく、透析や濃縮過程を施してもよい。また、目的タンパク質の抽出後の残渣から、キチン、キトサンなどの有用物質をさらに抽出することも可能である。
【００１４】
上記の方法によって得られたカニ殻抽出物中の本発明のタンパク質の分子量は６０００〜２０００００の範囲であり、０．５μｇ／ｍｌのタンパク質濃度でカルシウムの結晶化を抑制することが認められた。また、抽出物をＣａｒｒｅｚ試薬で処理すると、活性の低下が認められたことから活性の中心はタンパク質であることも確認されている。
【００１５】
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤として、上記の方法で調製した抽出物をそのまま使用してもよく、さらに上記の方法で調製した精製標品を使用してもよい。一般には、上記抽出物または精製標品を適当な液体担体に溶解するかもしくは分散させ、または適当な粉末担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、所望する場合にはさらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、漫透剤、湿潤剤、安定剤等を添加し、液剤、注射剤、カプセル剤、錠剤、粉剤等の製剤の形で、カルシウムの結晶化の抑制を目的として膵臓結石の予防や治療に使用することができ、あるいはカルシウムの吸収促進を目的として骨粗鬆症の予防や治療、高血圧の予防や治療、イライラの予防や治療などに使用することができる。さらには、歯磨の組成物として使用することができる。
【００１６】
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を、特にカルシウムの吸収促進を目的として使用する場合には、公知のカルシウム剤（例えば、炭酸カルシウム剤など）とともに使用することができる。
【００１７】
本発明は、もう１つの態様において、上記カニ殻由来のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物に関するものである。本発明の飲食物としては、各種飲食物、例えば、清涼飲料水、果汁飲料、醗酵飲料並びに牛乳等の飲料、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、ビスケット並びにチョコレート等の菓子、アイスクリーム、氷菓等の冷菓、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、ハム、ソーセージ等の畜肉製品、カマボコ、チクワ等の魚肉練り製品、パン、ホットケーキ、各種惣菜類、プリン、スープ等があげられる。かかる飲食物を摂取することにより、膵臓結石の予防や治療、あるいは骨粗鬆症の予防や治療、高血圧の予防や治療、イライラの予防や治療などを行うことができる。
【００１８】
本発明は、さらにもう１つの態様において、上記カニ殻由来のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飼料に関するものである。本発明の飼料としてはドックフード、キャットフード等のペットフード、家畜（トリを含む）の餌等があげられる。かかる飼料を動物に与えることにより、例えば、骨折を予防することができ、割れにくい殻の卵を得ることができる。
【００１９】
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有する飲食物および飼料を、特にカルシウムの吸収促進を目的として使用する場合には、カルシウムを配合してもよく、あるいはカルシウムを豊富に含有する原料、例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズ等の乳製品とともに配合してもよい。ここに、カルシウムとは一般にカルシウム塩の形態となったものを指す。例えば、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウムなどの塩があげられる。
【００２０】
以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２１】
ズワイガニ殻からのカルシウム結晶化抑制タンパク質（粗抽出液）の調製
１００℃、３０分間でボイルしたズワイガニの殻１００ｇを、ミキサーで粉砕した。粉砕後の粉末約１００ｇに０．５ＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を５００ｍｌ添加し、４℃条件下で３日間攪拌（８００ｒｐｍ）した。その後、１１，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収し、ろ紙でろ過を行った。ろ液約４００ｍｌに約４００ｍｌのミリＱ水を加え、２倍に希釈し、限外ろ過装置（アミコン社製）で約１００ｍｌまで濃縮した。これを緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））で透析を行った。これをさらに限外ろ過装置（アミコン社製）で約３０ｍｌまで濃縮を行い、これを粗抽出液とした。
【実施例２】
【００２２】
ズワイガニ殻からのカルシウム結晶化抑制タンパク質の精製
実施例１で精製した粗抽出液にエタノールを最終濃度０−２０％、２０−４０％、４０−６０％、６０−８０％になるように添加し、氷温で０．５時間放置し、２０％以上の画分を１１，０００ｒｐｍ、１５分間遠心して沈殿を回収し、１ｍｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））に懸濁した。エタノール濃度％はｖ／ｖである。
【００２３】
緩衝液Ａで平衡化した陰イオンクロマトグラフィー（ＳｕｐｅｒＱ）に上記サンプルを供し、塩化ナトリウムの濃度勾配０−１Ｍでタンパク質を溶出させ、一定量ごとに分画し、実施例３に示したカルシウム結晶化抑制を指標にして、目的タンパク質の活性評価を行った。その結果、濃度勾配０．５−０．６Ｍの画分に目的タンパク質が多く含まれ、この画分を集め、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎによって約０．５ｍｌまで濃縮し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動による確認を行ったところ、目的タンパク質は約６ｋＤａ付近の異なった分子量をもつ、２つのペプチドで構成されたヘテロマーであることが判明した。
【実施例３】
【００２４】
カルシウム結晶化抑制効果の測定１
ＮａＨＣＯ３水溶液とＣａＣｌ２水溶液との反応からＣａＣＯ３が析出する反応（ＮａＨＣＯ３＋ＣａＣｌ２→ＣａＣＯ３＋ＨＣｌ＋ＮａＣｌ）を利用して、カルシウム結晶化抑制効果を判定した。
【００２５】
すなわち、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した炭酸水素ナトリウム水溶液（１．５ｍｌ）に、実施例１で調製した粗抽出液を３０μｌ添加し、スターラーで十分に攪拌した。その後、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した塩化カルシウム水溶液（１．５ｍｌ）を添加し、２５℃において反応させた。反応過程中、波長５７０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。
【００２６】
最終タンパク質濃度としてカニ殻抽出タンパク質を２μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ含むもの、対照として１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加したものについてカルシウム結晶化抑制効果を試験し、その結果を図１に示す。
【００２７】
蒸留水の場合、約１０秒迄に急激な吸光度の上昇が観察され、約２００秒後に最大値を示し、反応が完了した。カニ殻抽出タンパク質（最終タンパク質濃度４．５μｇ／ｍｌ）を添加した場合、吸光度の上昇が認められず、完全にカルシウムの結晶化を抑制した。カニ殻抽出タンパク質（最終タンパク質濃度２μｇ／ｍｌ）を添加した場合、カルシウム結晶の核形成の遅れが認められた。
【実施例４】
【００２８】
カルシウム結晶化抑制効果の測定２
実施例３のカルシウム結晶化抑制効果測定方法に準じ、実施例１で調製した粗抽出液について、波長５７０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定することによりカルシウム結晶抑制効果を試験し、核形成が開始した時間と濃度との関係を図２に示す。
【００２９】
カニ殻粗抽出液（最終タンパク質濃度４．５μｇ／ｍｌ）の場合、吸光度の上昇は認められず、完全にカルシウムの結晶化を抑制した。また、カニ殻粗抽出液（最終タンパク質濃度２μｇ／ｍｌ）の場合、カルシウム結晶の核形成の遅れが認められた。
【実施例５】
【００３０】
カルシウム結晶化反応阻害効果の測定３
次に、実施例３の測定方法に準じ、カルシウム結晶化反応が進んでいる際のカニ殻抽出液の反応阻害効果を試験した。試験は、最初にカルシウム結晶化を進行させ、６０秒後にカニ殻抽出液を最終タンパク質濃度４．５μｇ／ｍｌになるように添加し、波長５７０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。その結果を図３に示す。
【００３１】
カニ殻粗抽出液を添加すると、その後の吸光度の上昇が認められたが、カニ殻粗抽出液無添加系と比較すると吸光度の上昇は抑制されていた。完全にカルシウム結晶成長が阻害されるのではなく、核発生阻害を有していることが確認された。
【実施例６】
【００３２】
リン酸カルシウム結晶への効果
第二リン酸カルシウム６ｍｇに実施例２で調製したカニ殻タンパク質をそれぞれ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で２４時間攪拌した。なお、この際には、カニ殻タンパク質を希釈する際に用いた５０ｍＭのイミダゾール緩衝液を用いた。０時間と２４時間後の反応液を０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液のリン酸含量をホスファＣ−テストワコー（和光純薬工業社製）で測定し、ブランクとの相対値を測定することによって、結晶成長制御率（促進作用率）を算出した。つまり、次式にその式を表す。
【００３３】
第二リン酸カルシウム結晶成長の制御率（％）＝
［（Ｃｘ−Ｃ２４）／（Ｃ０−Ｃ２４）］ｘ１００
Ｃｘ：試料溶液の無機リン酸濃度（ｍＭ）
Ｃ０：リンブランクの０時間における無機リン濃度（ｍＭ）
Ｃ２４：リンブランクの２４時間後における無機リン濃度（ｍＭ）
【００３４】
その結果、５μｇ／ｍｌの場合−３２．７％、１０μｇ／ｍｌの場合−２．０％、５０μｇ／ｍｌの場合４４．３％、１００μｇ／ｍｌの場合８７％であり、このようにカニ殻抽出タンパク質がリン酸の再結晶化を促進していることが確認された。
【実施例７】
【００３５】
他の物質とのカルシウム結晶化抑制効果の比較
実施例３の結果より、蒸留水の場合、約１０秒後迄に急激な吸光度の上昇が見られ、約２００秒後に最大値を示して反応が完了した。従って、カニ殻抽出タンパク質（４μｇ／ｍｌ）と他の物質、すなわちカゼインホスホペプチド（ＣＰＰＩＩＩ）（２μｇ／ｍｌ）、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（２μｇ／ｍｌ）、ポリ−γ−グルタミン酸（２μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ（１．５×１０−４Ｍ）、クエン酸（０．４×１０−４Ｍ）、ホスビチン（１５μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（１５μｇ／ｍｌ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（１５μｇ／ｍｌ）、アルブミン（１０μｇ／ｍｌ）、ラクトフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、リパーゼ（１０μｇ／ｍｌ）、トリプシノーゲン（１０μｇ／ｍｌ）、α−キモトリプシノーゲンＡ（１０μｇ／ｍｌ）、α−アミラーゼ（１０μｇ／ｍｌ）、エステラーゼ（１０μｇ／ｍｌ）について、以下に示す式１により、反応２００秒後の吸光度から阻害率を算出し。他の物質とのカルシウム結晶化抑制効果を比較検討した。その結果を表１に示す。
【００３６】
表１に示すように、実施例１の方法に準じ調製したカニ殻抽出タンパク質（最終タンパク質濃度４μｇ／ｍｌ）を添加した場合、結晶化阻害率は１００％であり、他の物質と比較してみると、カルシウム可溶化剤として知られるカゼインホスホペプチド（ＣＰＰＩＩＩ）で６２．８％、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（シグマ社製；Ｎｏ．Ｐ−４８８６，ナトリウム塩）で５９．４％、納豆より抽出しエタノール沈澱して精製されたポリ−γ−グルタミン酸で４９．０％の阻害率であった。ＥＤＴＡやクエン酸のようなキレート剤ではそれぞれ１４．４％と２４．５％の阻害率であり、また、炭酸カルシウムの結晶化を阻害すると報告されているホスビチンは３０．１％の阻害率であった。その他、リンタンパク質や酵素類を添加しても大きな結晶化阻害効果は観察されなかった。本発明のカニ殻より抽出したタンパク質は低濃度で著しくカルシウムの結晶化を阻害した。
【表１】
【実施例８】
【００３７】
熱安定性の検討
実施例１で得た粗抽出液のエタノール２０％以上の画分をサンプルとして、本発明のカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質の熱安定性を調べた。１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、最終タンパク質濃度２．０μｇ／ｍｌとし、各温度に３０分保った後、実施例３に記載のカルシウム結晶化抑制効果の測定１の方法に従ってカルシウム結晶化抑制活性を測定した。結果を表２に示す。
【表２】
本発明のカニ殻由来のカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質は熱に対して非常に安定で、１００℃での処理によっても失活しないことがわかった。
【実施例９】
【００３８】
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。以下の実施例において％は（ｗ／ｗ）である。
ガムベース ２０．０％、砂糖 ５５．０％、ブドウ糖 ２３．７％、軟化剤 １．０％、抽出タンパク質 ０．３％
【実施例１０】
【００３９】
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース ２０．０％、キシリトール ７５．０％、還元麦芽糖 ３．８％、軟化剤 １．０％、抽出タンパク質 ０．２％
【実施例１１】
【００４０】
下記の処方に従って錠菓を調製した。
砂糖 ７５．０％、乳糖 ２０．０％、グリセリン脂肪酸エステル ０．２％、香料 ０．４％、抽出タンパク質 ０．１％、精製水 ４．３％
【実施例１２】
【００４１】
下記の処方に従ってチョコレートを調製した。
砂糖 ４１．０％、カカオマス １５．０％、全脂粉乳 ２５．０％、ココアバター １８．０％、乳化剤 ０．３％、香料 ０．４％、抽出タンパク質 ０．３％
【実施例１３】
【００４２】
下記の処方に従って飲料を調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ５．００％、砂糖 ４．５０％、酸味料 １．２８％、香料 ０．２０％、抽出タンパク質 ０．０２％、精製水 ８９．００％
【実施例１４】
【００４３】
下記の処方に従って飲料を調製した。
オレンジ果汁 ８５．２５％、砂糖 １１．７０％、クエン酸 ２．００％、香料 １．００％、抽出タンパク質 ０．０５％
【実施例１５】
【００４４】
下記の処方に従ってアイスクリームを調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ０．５％、砂糖 ８．７％、酸味料 １．２％、香料 ０．３％、精製水 ８９．０％、安定剤 ０．２％、抽出タンパク質 ０．１％
【実施例１６】
【００４５】
下記の処方に従ってドックフードを調製した。
トウモロコシ ３３．０％、小麦粉 ３５．０％、大豆粕 ２１．０％、米ぬか（脱脂） ５．５％、ミートミール ５．０％、ミネラルミックス ０．２％、抽出タンパク質 ０．３％
【実施例１７】
【００４６】
下記の処方に従ってカプセル剤を調製した。
抽出タンパク質 ５０．０％、乳糖 ４８．０％、ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合末をハードカプセルに充填した。
【実施例１８】
【００４７】
下記の処方に従って注射剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．０５％、ブドウ糖 １．００％、注射用水 ９８．９５％
上記混合溶液をメンブランフィルターで濾過後に再び除菌濾過を行い、その濾過液を無菌的にバイアルに分注し、窒素ガスを充填した後、密封して注射剤とした。
【実施例１９】
【００４８】
下記の処方に従って錠剤を調製した。
抽出タンパク質 ２０．０％、直打用微粒Ｎｏ．２０９（富士化学社製） ４８．０、％結晶セルロース ３０．０％、ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合未を打錠して、１錠２００ｍｇの錠剤とした。直打用微粒Ｎｏ．２０９はメタケイ酸アルミン酸マグネシウム２０％、トウモロコシデンプン３０％、乳糖５０％を含有していた。
【実施例２０】
【００４９】
下記の処方に従ってシロップ剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．１％、単シロップ ３０．０％、精製水 ６９．９％
抽出タンパク質を、精製水で完全に溶解し、単シロップを加えて混合し、シロップ剤とした。
【実施例２１】
【００５０】
下記の処方に従ってキャンディを調製した。
抽出タンパク質 ０．２％、砂糖 ５０．０％、水飴 ３５．３％、香料 ０．５％、精製水 １４．０％
【実施例２２】
【００５１】
下記の処方に従ってビスケットを調製した。
抽出タンパク質 ０．５％、小麦粉 ５０．６％、コーンスターチ ５．１％、砂糖 １２．７％、マーガリン ６．５％、食塩 ０．３％、炭酸ナトリウム １．３％、炭酸アンモニウム ０．５％、大豆レシチン ０．３％、全卵 ４．１％、香料 ０．３％、精製水 １７．８％
上記材料を混合してドウを形成し、延展後これを成型してオーブンで焙焼し、ビスケットを製造した。
【００５２】
下記に、カルシウム吸収促進を目的として、カルシウムと共に本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有した飲食物及び飼料の実施例を記載する。
【実施例２３】
【００５３】
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース ２０．０％、砂糖 ５５．０％、ブドウ糖 ２３．０％、軟化剤 １．０％、炭酸カルシウム ０．５％、抽出タンパク質 ０．５％
【実施例２４】
【００５４】
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース ２０．０％、砂糖 ７５．０％、還元麦芽糖 ３．６％、軟化剤 １．０％、第二リン酸カルシウム ０．２％、抽出タンパク質 ０．２％
【実施例２５】
【００５５】
下記の処方に従って錠菓を調製した。
砂糖 ７４．０％、乳糖 ２０．０％、グリセリン脂肪酸エステル ０．２％、香料 ０．４％、炭酸カルシウム ０．８％、抽出タンパク質 ０．３％、精製水 ４．５％
【実施例２６】
【００５６】
下記の処方に従ってチョコレートを調製した。
砂糖 ４１．０％、カカオマス １５．０％、全脂粉乳 ２５．０％、ココアバター １８．０％、炭酸カルシウム ０．３％、乳化剤 ０．３％、香料 ０．２％、抽出タンパク質 ０．２％
【実施例２７】
【００５７】
下記の処方に従って飲料を調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ５．００％、砂糖 ４．５０％、酸味料 １．２７％、香料 ０．２０％、抽出タンパク質 ０．０２％、塩化カルシウム ０．０１％、精製水 ８９．００％
【実施例２８】
【００５８】
下記の処方に従って飲料を調製した。
オレンジ果汁 ８５．２０％、砂糖 １１．７０％、クエン酸 ２．００％、香料 １．００％、塩化カルシウム ０．０５％、抽出タンパク質 ０．０５％
【実施例２９】
【００５９】
下記の処方に従ってアイスクリームを調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ０．３％、砂糖 ８．７％、酸味料 １．０％、香料 ０．２％、精製水 ８９．０％、安定剤 ０．３％、塩化カルシウム ０．２％、抽出タンパク質 ０．３％
【実施例３０】
【００６０】
下記の処方に従って産卵鶏用飼料を調製した。
トウモロコシ ５１．０％、マイロ １５．３％、大豆粕 １７．０％、魚粉 ３．３％、米ぬか ８．２％、食塩 ０．２％、動物性油脂 ３．０％、ビタミンミックス ０．２％、乳酸カルシウム １．０％、抽出タンパク質 ０．８％
【実施例３１】
【００６１】
下記の処方に従ってカプセル剤を調製した。
抽出タンパク質 ５０．０％、乳糖 ４７．０％、第二リン酸カルシウム １．０％、ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合末をハードカプセルに充填した。
【実施例３２】
【００６２】
下記の処方に従って注射剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．０５％、ブドウ糖 １．００％、第二リン醸カルシウム １．００％、注射用水 ９７．００％
上記混合溶液をメンブランフィルターで濾過後に再び除菌濾過を行い、その濾過液を無菌的にバイアルに分注し、窒素ガスを充填した後、密封して注射剤とした。
【実施例３３】
【００６３】
下記の処方に従って錠剤を調製した。
抽出タンパク質 ２０．０％、直打用微粒Ｎｏ．２０９（富士化学社製） ３７．０％、結晶セルロース ３３．０％、ＣＭＣカルシウム ８．０％、ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合末を打錠して、１錠２００ｍｇの錠剤とした。直打用微粒Ｎｏ．２０９はメタケイ酸アルミン酸マグネシウム２０％、トウモロコシデンプン３０％、乳糖５０％を含有していた。
【実施例３４】
【００６４】
下記の処方に従ってシロップ剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．１％、単シロップ ３０．０％、精製水 ６９．８％、炭酸カルシウム ０．１％
抽出タンパク質を、精製水で完全に溶解し、シロップを加えて混合し、シロップ剤とした。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明によれば、カニ殻から安全で熱安定性の高いカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質が容易に得られるので、本発明は、飲食品、飼料、医薬品等の分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、実施例３記載の方法に従って本発明のカニ殻抽出タンパク質のカルシウム結晶化抑制効果を調べた結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例４記載の方法に従って本発明のカニ殻抽出タンパク質のカルシウム結晶化抑制効果を調べた結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例５記載の方法に従って本発明のカニ殻抽出タンパク質のカルシウム結晶化反応阻害効果を調べた結果を示す図である。実線はカニ殻粗抽出液を反応開始から６０秒後（矢印で示す）に添加した系の吸光度を示し、点線はカニ殻粗抽出液無添加系の吸光度を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カニ殻から得られるタンパク質の新規な用途に関し、より具体的には、カニ殻から得られるカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質を有効成分とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤、ならびにこれを含有してなる飲食物および飼料に関する。さらに本発明は、カルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質をカニ殻から容易に得る方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム摂取基準量は、１８歳以上の成人女性では１日６００ｍｇ、妊婦・授乳婦ではそれぞれ＋３００ｍｇ、＋５００ｍｇと設定させているが、厚生労働省が行っている平成１３年の国民栄養調査で、日本人のカルシウム摂取量を調べてみると、１日６００ｍｇを下回っており、最近（平成２年〜平成１３年）で見ても６００ｍｇを平均で上回った年は一度もない状態が続いている。飽食の時代と呼ばれる現代においても、他の栄養素、ミネラルが充足しているのに対して、カルシウムだけが不足している状況が続いる。
【０００３】
このようなカルシウムの摂取不足は、骨粗鬆症、高血圧、イライラ等の重大な疾病を引き起こすことが知られており、カルシウムの摂取不足は、社会的問題となっている。さらに、食物として胃腸管内で摂取されるカルシウムは、複雑な機構で腸管から血液内に吸収されるが、カルシウム塩やカルシウム剤の腸管内における吸収率は５０％以下であり、半分以上が吸収されずに体外に排出されるという報告もある。そのため、腸管内でのカルシウムの吸収性を高める物質の開発も行われている。
【０００４】
その１つとして、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）が開発されている。ＣＰＰは、カゼインにトリプシンを作用させ、加水分解した分解物中に得られるホスホペプチドであり、カルシウムと結合して可溶性複合体を形成する。このため、水溶液中でカルシウムが沈殿するのを抑制することでカルシウムを可溶化し、カルシウムの吸収率を高めると考えられている（非特許文献１、特許文献１、特許文献２参照）。しかしながら、ＣＰＰは、カゼインの酵素分解物であるため、原料であるカゼインを酵素反応させる必要があり手間がかかり、また酵素分解の副産物であるペプチドが苦味を呈するため、飲食品へ混合する場合にはこの苦味ペプチドを十分に分離する必要がある等幾つかの問題点を有しており、また価格も大変高価である。
【０００５】
ポリ−Ｌ−グルタミン酸も腸管内でカルシウムの吸収率を高める作用（非特許文献２参照）を有することが知られているが、これは合成品であるため食品添加物として許可されておらず、安全性等のため利用されていない。また、微生物により産生されるポリ−γ−グルタミン酸（特許文献３参照）は、カルシウム結晶化抑制活性が低く、かつ溶液の粘度が極めて高いため、取扱いが不便である。
【０００６】
さらに、カルシウムの吸収を促進する物質としては、骨由来のペプチド（特許文献４参照）、酪酸を基本成分とするもの（特許文献５参照）があるが、これらは製造上並びに利用上の問題があり実用化には至っていない。
【特許文献１】特開昭５８−１７０４４０号公報
【特許文献２】特開平７−２４１１７２号公報
【特許文献３】特開平３−３０６４８号公報
【特許文献４】特開平４−１６１６５号公報
【特許文献５】特開平４−１０８３６０号公報
【非特許文献１】ジャパンフードサイエンス、第１巻、第２１〜３２頁（１９９０年）
【非特許文献２】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第５８巻，第１６６２〜１６６５頁（１９９４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の問題点を解決し、簡単かつ安価にカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、カニ殻、特にズワイガニ殻から得られるタンパク質が、カルシウムの結晶化を抑制し、これによりカルシウムの吸収を促進する効果を有することを見出した。また、キレート剤を用いてカニ殻を抽出し、有機溶媒にて分画するという簡単な方法により、かかるタンパク質を製造できることを見出した。そして本発明者らは、それらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）カニ殻から得られるカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質を有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤、
（２）前記カニ殻がズワイガニ殻由来である、（１）記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤、
（３）（１）または（２）記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物、
（４）（１）または（２）記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飼料、
（５）さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする（３）記載の飲食物、
（６）さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする（４）記載の飼料、
（７）キレート剤または有機酸を用いてカニ殻を抽出することを特徴とする、カニ殻からカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質の製造方法、
（８）（７）記載の方法により得ることのできる、カルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のカニ殻から得られるタンパク質は、カルシウム結晶化抑制・吸収促進作用が、従来技術で得られた物質と比較して顕著に優れている。本発明のタンパク質を有効成分とする本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤及びこれを含有してなる飲食物並びに飼料は、優れたカルシウムの結晶化抑制・吸収促進効果を奏する。また、本発明により得られるカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤はカニ殻から得られるので安全性が高く、熱安定性も極めて高い。さらに本発明によれば、該カニ殻タンパク質を簡単かつ安価に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
上述のごとく、本発明は、１の態様において、カニ殻から得られるカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質を有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤に関するものである。カルシウム結晶化を抑制することにより、体内、特に腸管において吸収されるカルシウム量が増大する。したがって、本明細書において「カルシウム結晶化抑制」という場合には、特に断らない限り「カルシウム吸収促進」の意味も包含するものとする。
【００１２】
カニの種類は特に限定されないが、好ましいカニとしてズワイガニが挙げられる。また、生のカニでも、ゆでたカニでもどちらの状態でもよいが、ゆでた状態のカニの殻から効率よく抽出される。実施例８で示すように、本発明のカニ殻由来のタンパク質は熱安定性が極めて高いので、ボイルしたカニ殻からでも活性の高いタンパク質が得られる。
【００１３】
本発明のカニ殻から得られるタンパク質を抽出する方法としては、一般的に行われている破砕方法を用いることができる。例えば、加圧型破壊、機械的磨砕、超音波処理、ホモジナイザー等の物理的破砕方法を用いることができる。これにより得られた破砕物を水性媒体で抽出する。媒体は水、食塩水、酸溶液、またはＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤を使用することでタンパク質を抽出する。好ましくは、キレート剤または有機酸を含む水溶液を媒体として用いて抽出を行う。キレート剤および有機酸は種々のものが知られており、適宜選択して使用することができるが、安全性の高いものが好ましい。好ましいキレート剤としてはＥＤＴＡなどがあり、好ましい有機酸としてはクエン酸などがあげられる。媒体として緩衝液を用いてｐＨを調節してもよい。好ましいｐＨ範囲は中性付近、例えば、５ないし９である。このようにして、カニ殻からタンパク質を効率よく抽出することができる。上記タンパク質の抽出物は、必要に応じ、公知の手段、例えば硫酸アンモニウム等の塩析やエタノール等の有機溶剤による沈澱、等電点沈殿法による分画、イオン交換、吸着、ゲル濾過、疎水もしくはアフイニティー等のクロマトグラフィーを用いて精製してもよく、透析や濃縮過程を施してもよい。また、目的タンパク質の抽出後の残渣から、キチン、キトサンなどの有用物質をさらに抽出することも可能である。
【００１４】
上記の方法によって得られたカニ殻抽出物中の本発明のタンパク質の分子量は６０００〜２０００００の範囲であり、０．５μｇ／ｍｌのタンパク質濃度でカルシウムの結晶化を抑制することが認められた。また、抽出物をＣａｒｒｅｚ試薬で処理すると、活性の低下が認められたことから活性の中心はタンパク質であることも確認されている。
【００１５】
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤として、上記の方法で調製した抽出物をそのまま使用してもよく、さらに上記の方法で調製した精製標品を使用してもよい。一般には、上記抽出物または精製標品を適当な液体担体に溶解するかもしくは分散させ、または適当な粉末担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、所望する場合にはさらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、漫透剤、湿潤剤、安定剤等を添加し、液剤、注射剤、カプセル剤、錠剤、粉剤等の製剤の形で、カルシウムの結晶化の抑制を目的として膵臓結石の予防や治療に使用することができ、あるいはカルシウムの吸収促進を目的として骨粗鬆症の予防や治療、高血圧の予防や治療、イライラの予防や治療などに使用することができる。さらには、歯磨の組成物として使用することができる。
【００１６】
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を、特にカルシウムの吸収促進を目的として使用する場合には、公知のカルシウム剤（例えば、炭酸カルシウム剤など）とともに使用することができる。
【００１７】
本発明は、もう１つの態様において、上記カニ殻由来のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物に関するものである。本発明の飲食物としては、各種飲食物、例えば、清涼飲料水、果汁飲料、醗酵飲料並びに牛乳等の飲料、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、ビスケット並びにチョコレート等の菓子、アイスクリーム、氷菓等の冷菓、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、ハム、ソーセージ等の畜肉製品、カマボコ、チクワ等の魚肉練り製品、パン、ホットケーキ、各種惣菜類、プリン、スープ等があげられる。かかる飲食物を摂取することにより、膵臓結石の予防や治療、あるいは骨粗鬆症の予防や治療、高血圧の予防や治療、イライラの予防や治療などを行うことができる。
【００１８】
本発明は、さらにもう１つの態様において、上記カニ殻由来のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飼料に関するものである。本発明の飼料としてはドックフード、キャットフード等のペットフード、家畜（トリを含む）の餌等があげられる。かかる飼料を動物に与えることにより、例えば、骨折を予防することができ、割れにくい殻の卵を得ることができる。
【００１９】
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有する飲食物および飼料を、特にカルシウムの吸収促進を目的として使用する場合には、カルシウムを配合してもよく、あるいはカルシウムを豊富に含有する原料、例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズ等の乳製品とともに配合してもよい。ここに、カルシウムとは一般にカルシウム塩の形態となったものを指す。例えば、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウムなどの塩があげられる。
【００２０】
以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２１】
ズワイガニ殻からのカルシウム結晶化抑制タンパク質（粗抽出液）の調製
１００℃、３０分間でボイルしたズワイガニの殻１００ｇを、ミキサーで粉砕した。粉砕後の粉末約１００ｇに０．５ＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を５００ｍｌ添加し、４℃条件下で３日間攪拌（８００ｒｐｍ）した。その後、１１，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収し、ろ紙でろ過を行った。ろ液約４００ｍｌに約４００ｍｌのミリＱ水を加え、２倍に希釈し、限外ろ過装置（アミコン社製）で約１００ｍｌまで濃縮した。これを緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））で透析を行った。これをさらに限外ろ過装置（アミコン社製）で約３０ｍｌまで濃縮を行い、これを粗抽出液とした。
【実施例２】
【００２２】
ズワイガニ殻からのカルシウム結晶化抑制タンパク質の精製
実施例１で精製した粗抽出液にエタノールを最終濃度０−２０％、２０−４０％、４０−６０％、６０−８０％になるように添加し、氷温で０．５時間放置し、２０％以上の画分を１１，０００ｒｐｍ、１５分間遠心して沈殿を回収し、１ｍｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））に懸濁した。エタノール濃度％はｖ／ｖである。
【００２３】
緩衝液Ａで平衡化した陰イオンクロマトグラフィー（ＳｕｐｅｒＱ）に上記サンプルを供し、塩化ナトリウムの濃度勾配０−１Ｍでタンパク質を溶出させ、一定量ごとに分画し、実施例３に示したカルシウム結晶化抑制を指標にして、目的タンパク質の活性評価を行った。その結果、濃度勾配０．５−０．６Ｍの画分に目的タンパク質が多く含まれ、この画分を集め、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎによって約０．５ｍｌまで濃縮し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動による確認を行ったところ、目的タンパク質は約６ｋＤａ付近の異なった分子量をもつ、２つのペプチドで構成されたヘテロマーであることが判明した。
【実施例３】
【００２４】
カルシウム結晶化抑制効果の測定１
ＮａＨＣＯ３水溶液とＣａＣｌ２水溶液との反応からＣａＣＯ３が析出する反応（ＮａＨＣＯ３＋ＣａＣｌ２→ＣａＣＯ３＋ＨＣｌ＋ＮａＣｌ）を利用して、カルシウム結晶化抑制効果を判定した。
【００２５】
すなわち、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した炭酸水素ナトリウム水溶液（１．５ｍｌ）に、実施例１で調製した粗抽出液を３０μｌ添加し、スターラーで十分に攪拌した。その後、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した塩化カルシウム水溶液（１．５ｍｌ）を添加し、２５℃において反応させた。反応過程中、波長５７０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。
【００２６】
最終タンパク質濃度としてカニ殻抽出タンパク質を２μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ含むもの、対照として１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加したものについてカルシウム結晶化抑制効果を試験し、その結果を図１に示す。
【００２７】
蒸留水の場合、約１０秒迄に急激な吸光度の上昇が観察され、約２００秒後に最大値を示し、反応が完了した。カニ殻抽出タンパク質（最終タンパク質濃度４．５μｇ／ｍｌ）を添加した場合、吸光度の上昇が認められず、完全にカルシウムの結晶化を抑制した。カニ殻抽出タンパク質（最終タンパク質濃度２μｇ／ｍｌ）を添加した場合、カルシウム結晶の核形成の遅れが認められた。
【実施例４】
【００２８】
カルシウム結晶化抑制効果の測定２
実施例３のカルシウム結晶化抑制効果測定方法に準じ、実施例１で調製した粗抽出液について、波長５７０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定することによりカルシウム結晶抑制効果を試験し、核形成が開始した時間と濃度との関係を図２に示す。
【００２９】
カニ殻粗抽出液（最終タンパク質濃度４．５μｇ／ｍｌ）の場合、吸光度の上昇は認められず、完全にカルシウムの結晶化を抑制した。また、カニ殻粗抽出液（最終タンパク質濃度２μｇ／ｍｌ）の場合、カルシウム結晶の核形成の遅れが認められた。
【実施例５】
【００３０】
カルシウム結晶化反応阻害効果の測定３
次に、実施例３の測定方法に準じ、カルシウム結晶化反応が進んでいる際のカニ殻抽出液の反応阻害効果を試験した。試験は、最初にカルシウム結晶化を進行させ、６０秒後にカニ殻抽出液を最終タンパク質濃度４．５μｇ／ｍｌになるように添加し、波長５７０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。その結果を図３に示す。
【００３１】
カニ殻粗抽出液を添加すると、その後の吸光度の上昇が認められたが、カニ殻粗抽出液無添加系と比較すると吸光度の上昇は抑制されていた。完全にカルシウム結晶成長が阻害されるのではなく、核発生阻害を有していることが確認された。
【実施例６】
【００３２】
リン酸カルシウム結晶への効果
第二リン酸カルシウム６ｍｇに実施例２で調製したカニ殻タンパク質をそれぞれ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で２４時間攪拌した。なお、この際には、カニ殻タンパク質を希釈する際に用いた５０ｍＭのイミダゾール緩衝液を用いた。０時間と２４時間後の反応液を０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液のリン酸含量をホスファＣ−テストワコー（和光純薬工業社製）で測定し、ブランクとの相対値を測定することによって、結晶成長制御率（促進作用率）を算出した。つまり、次式にその式を表す。
【００３３】
第二リン酸カルシウム結晶成長の制御率（％）＝
［（Ｃｘ−Ｃ２４）／（Ｃ０−Ｃ２４）］ｘ１００
Ｃｘ：試料溶液の無機リン酸濃度（ｍＭ）
Ｃ０：リンブランクの０時間における無機リン濃度（ｍＭ）
Ｃ２４：リンブランクの２４時間後における無機リン濃度（ｍＭ）
【００３４】
その結果、５μｇ／ｍｌの場合−３２．７％、１０μｇ／ｍｌの場合−２．０％、５０μｇ／ｍｌの場合４４．３％、１００μｇ／ｍｌの場合８７％であり、このようにカニ殻抽出タンパク質がリン酸の再結晶化を促進していることが確認された。
【実施例７】
【００３５】
他の物質とのカルシウム結晶化抑制効果の比較
実施例３の結果より、蒸留水の場合、約１０秒後迄に急激な吸光度の上昇が見られ、約２００秒後に最大値を示して反応が完了した。従って、カニ殻抽出タンパク質（４μｇ／ｍｌ）と他の物質、すなわちカゼインホスホペプチド（ＣＰＰＩＩＩ）（２μｇ／ｍｌ）、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（２μｇ／ｍｌ）、ポリ−γ−グルタミン酸（２μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ（１．５×１０−４Ｍ）、クエン酸（０．４×１０−４Ｍ）、ホスビチン（１５μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（１５μｇ／ｍｌ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（１５μｇ／ｍｌ）、アルブミン（１０μｇ／ｍｌ）、ラクトフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、リパーゼ（１０μｇ／ｍｌ）、トリプシノーゲン（１０μｇ／ｍｌ）、α−キモトリプシノーゲンＡ（１０μｇ／ｍｌ）、α−アミラーゼ（１０μｇ／ｍｌ）、エステラーゼ（１０μｇ／ｍｌ）について、以下に示す式１により、反応２００秒後の吸光度から阻害率を算出し。他の物質とのカルシウム結晶化抑制効果を比較検討した。その結果を表１に示す。
【００３６】
表１に示すように、実施例１の方法に準じ調製したカニ殻抽出タンパク質（最終タンパク質濃度４μｇ／ｍｌ）を添加した場合、結晶化阻害率は１００％であり、他の物質と比較してみると、カルシウム可溶化剤として知られるカゼインホスホペプチド（ＣＰＰＩＩＩ）で６２．８％、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（シグマ社製；Ｎｏ．Ｐ−４８８６，ナトリウム塩）で５９．４％、納豆より抽出しエタノール沈澱して精製されたポリ−γ−グルタミン酸で４９．０％の阻害率であった。ＥＤＴＡやクエン酸のようなキレート剤ではそれぞれ１４．４％と２４．５％の阻害率であり、また、炭酸カルシウムの結晶化を阻害すると報告されているホスビチンは３０．１％の阻害率であった。その他、リンタンパク質や酵素類を添加しても大きな結晶化阻害効果は観察されなかった。本発明のカニ殻より抽出したタンパク質は低濃度で著しくカルシウムの結晶化を阻害した。
【表１】
【実施例８】
【００３７】
熱安定性の検討
実施例１で得た粗抽出液のエタノール２０％以上の画分をサンプルとして、本発明のカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質の熱安定性を調べた。１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、最終タンパク質濃度２．０μｇ／ｍｌとし、各温度に３０分保った後、実施例３に記載のカルシウム結晶化抑制効果の測定１の方法に従ってカルシウム結晶化抑制活性を測定した。結果を表２に示す。
【表２】
本発明のカニ殻由来のカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質は熱に対して非常に安定で、１００℃での処理によっても失活しないことがわかった。
【実施例９】
【００３８】
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。以下の実施例において％は（ｗ／ｗ）である。
ガムベース ２０．０％、砂糖 ５５．０％、ブドウ糖 ２３．７％、軟化剤 １．０％、抽出タンパク質 ０．３％
【実施例１０】
【００３９】
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース ２０．０％、キシリトール ７５．０％、還元麦芽糖 ３．８％、軟化剤 １．０％、抽出タンパク質 ０．２％
【実施例１１】
【００４０】
下記の処方に従って錠菓を調製した。
砂糖 ７５．０％、乳糖 ２０．０％、グリセリン脂肪酸エステル ０．２％、香料 ０．４％、抽出タンパク質 ０．１％、精製水 ４．３％
【実施例１２】
【００４１】
下記の処方に従ってチョコレートを調製した。
砂糖 ４１．０％、カカオマス １５．０％、全脂粉乳 ２５．０％、ココアバター １８．０％、乳化剤 ０．３％、香料 ０．４％、抽出タンパク質 ０．３％
【実施例１３】
【００４２】
下記の処方に従って飲料を調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ５．００％、砂糖 ４．５０％、酸味料 １．２８％、香料 ０．２０％、抽出タンパク質 ０．０２％、精製水 ８９．００％
【実施例１４】
【００４３】
下記の処方に従って飲料を調製した。
オレンジ果汁 ８５．２５％、砂糖 １１．７０％、クエン酸 ２．００％、香料 １．００％、抽出タンパク質 ０．０５％
【実施例１５】
【００４４】
下記の処方に従ってアイスクリームを調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ０．５％、砂糖 ８．７％、酸味料 １．２％、香料 ０．３％、精製水 ８９．０％、安定剤 ０．２％、抽出タンパク質 ０．１％
【実施例１６】
【００４５】
下記の処方に従ってドックフードを調製した。
トウモロコシ ３３．０％、小麦粉 ３５．０％、大豆粕 ２１．０％、米ぬか（脱脂） ５．５％、ミートミール ５．０％、ミネラルミックス ０．２％、抽出タンパク質 ０．３％
【実施例１７】
【００４６】
下記の処方に従ってカプセル剤を調製した。
抽出タンパク質 ５０．０％、乳糖 ４８．０％、ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合末をハードカプセルに充填した。
【実施例１８】
【００４７】
下記の処方に従って注射剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．０５％、ブドウ糖 １．００％、注射用水 ９８．９５％
上記混合溶液をメンブランフィルターで濾過後に再び除菌濾過を行い、その濾過液を無菌的にバイアルに分注し、窒素ガスを充填した後、密封して注射剤とした。
【実施例１９】
【００４８】
下記の処方に従って錠剤を調製した。
抽出タンパク質 ２０．０％、直打用微粒Ｎｏ．２０９（富士化学社製） ４８．０、％結晶セルロース ３０．０％、ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合未を打錠して、１錠２００ｍｇの錠剤とした。直打用微粒Ｎｏ．２０９はメタケイ酸アルミン酸マグネシウム２０％、トウモロコシデンプン３０％、乳糖５０％を含有していた。
【実施例２０】
【００４９】
下記の処方に従ってシロップ剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．１％、単シロップ ３０．０％、精製水 ６９．９％
抽出タンパク質を、精製水で完全に溶解し、単シロップを加えて混合し、シロップ剤とした。
【実施例２１】
【００５０】
下記の処方に従ってキャンディを調製した。
抽出タンパク質 ０．２％、砂糖 ５０．０％、水飴 ３５．３％、香料 ０．５％、精製水 １４．０％
【実施例２２】
【００５１】
下記の処方に従ってビスケットを調製した。
抽出タンパク質 ０．５％、小麦粉 ５０．６％、コーンスターチ ５．１％、砂糖 １２．７％、マーガリン ６．５％、食塩 ０．３％、炭酸ナトリウム １．３％、炭酸アンモニウム ０．５％、大豆レシチン ０．３％、全卵 ４．１％、香料 ０．３％、精製水 １７．８％
上記材料を混合してドウを形成し、延展後これを成型してオーブンで焙焼し、ビスケットを製造した。
【００５２】
下記に、カルシウム吸収促進を目的として、カルシウムと共に本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有した飲食物及び飼料の実施例を記載する。
【実施例２３】
【００５３】
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース ２０．０％、砂糖 ５５．０％、ブドウ糖 ２３．０％、軟化剤 １．０％、炭酸カルシウム ０．５％、抽出タンパク質 ０．５％
【実施例２４】
【００５４】
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース ２０．０％、砂糖 ７５．０％、還元麦芽糖 ３．６％、軟化剤 １．０％、第二リン酸カルシウム ０．２％、抽出タンパク質 ０．２％
【実施例２５】
【００５５】
下記の処方に従って錠菓を調製した。
砂糖 ７４．０％、乳糖 ２０．０％、グリセリン脂肪酸エステル ０．２％、香料 ０．４％、炭酸カルシウム ０．８％、抽出タンパク質 ０．３％、精製水 ４．５％
【実施例２６】
【００５６】
下記の処方に従ってチョコレートを調製した。
砂糖 ４１．０％、カカオマス １５．０％、全脂粉乳 ２５．０％、ココアバター １８．０％、炭酸カルシウム ０．３％、乳化剤 ０．３％、香料 ０．２％、抽出タンパク質 ０．２％
【実施例２７】
【００５７】
下記の処方に従って飲料を調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ５．００％、砂糖 ４．５０％、酸味料 １．２７％、香料 ０．２０％、抽出タンパク質 ０．０２％、塩化カルシウム ０．０１％、精製水 ８９．００％
【実施例２８】
【００５８】
下記の処方に従って飲料を調製した。
オレンジ果汁 ８５．２０％、砂糖 １１．７０％、クエン酸 ２．００％、香料 １．００％、塩化カルシウム ０．０５％、抽出タンパク質 ０．０５％
【実施例２９】
【００５９】
下記の処方に従ってアイスクリームを調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ０．３％、砂糖 ８．７％、酸味料 １．０％、香料 ０．２％、精製水 ８９．０％、安定剤 ０．３％、塩化カルシウム ０．２％、抽出タンパク質 ０．３％
【実施例３０】
【００６０】
下記の処方に従って産卵鶏用飼料を調製した。
トウモロコシ ５１．０％、マイロ １５．３％、大豆粕 １７．０％、魚粉 ３．３％、米ぬか ８．２％、食塩 ０．２％、動物性油脂 ３．０％、ビタミンミックス ０．２％、乳酸カルシウム １．０％、抽出タンパク質 ０．８％
【実施例３１】
【００６１】
下記の処方に従ってカプセル剤を調製した。
抽出タンパク質 ５０．０％、乳糖 ４７．０％、第二リン酸カルシウム １．０％、ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合末をハードカプセルに充填した。
【実施例３２】
【００６２】
下記の処方に従って注射剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．０５％、ブドウ糖 １．００％、第二リン醸カルシウム １．００％、注射用水 ９７．００％
上記混合溶液をメンブランフィルターで濾過後に再び除菌濾過を行い、その濾過液を無菌的にバイアルに分注し、窒素ガスを充填した後、密封して注射剤とした。
【実施例３３】
【００６３】
下記の処方に従って錠剤を調製した。
抽出タンパク質 ２０．０％、直打用微粒Ｎｏ．２０９（富士化学社製） ３７．０％、結晶セルロース ３３．０％、ＣＭＣカルシウム ８．０％、ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合末を打錠して、１錠２００ｍｇの錠剤とした。直打用微粒Ｎｏ．２０９はメタケイ酸アルミン酸マグネシウム２０％、トウモロコシデンプン３０％、乳糖５０％を含有していた。
【実施例３４】
【００６４】
下記の処方に従ってシロップ剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．１％、単シロップ ３０．０％、精製水 ６９．８％、炭酸カルシウム ０．１％
抽出タンパク質を、精製水で完全に溶解し、シロップを加えて混合し、シロップ剤とした。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明によれば、カニ殻から安全で熱安定性の高いカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質が容易に得られるので、本発明は、飲食品、飼料、医薬品等の分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、実施例３記載の方法に従って本発明のカニ殻抽出タンパク質のカルシウム結晶化抑制効果を調べた結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例４記載の方法に従って本発明のカニ殻抽出タンパク質のカルシウム結晶化抑制効果を調べた結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例５記載の方法に従って本発明のカニ殻抽出タンパク質のカルシウム結晶化反応阻害効果を調べた結果を示す図である。実線はカニ殻粗抽出液を反応開始から６０秒後（矢印で示す）に添加した系の吸光度を示し、点線はカニ殻粗抽出液無添加系の吸光度を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カニ殻から得られるカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質を有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤。
【請求項２】
前記カニ殻がズワイガニ殻由来である、請求項１記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤。
【請求項３】
請求項１または２記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物。
【請求項４】
請求項１または２記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飼料。
【請求項５】
さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする請求項３記載の飲食物。
【請求項６】
さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする請求項４記載の飼料。
【請求項７】
キレート剤または有機酸を用いてカニ殻を抽出することを特徴とする、カニ殻からのカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法により得ることのできる、カルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質。
【請求項１】
カニ殻から得られるカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質を有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤。
【請求項２】
前記カニ殻がズワイガニ殻由来である、請求項１記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤。
【請求項３】
請求項１または２記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物。
【請求項４】
請求項１または２記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飼料。
【請求項５】
さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする請求項３記載の飲食物。
【請求項６】
さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする請求項４記載の飼料。
【請求項７】
キレート剤または有機酸を用いてカニ殻を抽出することを特徴とする、カニ殻からのカルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法により得ることのできる、カルシウム結晶化抑制作用を有するタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２２５３１４（Ｐ２００６−２２５３１４Ａ）
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−４０７８６（Ｐ２００５−４０７８６）
【出願日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（３９９０３００６０）学校法人 関西大学 (208)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（３９９０３００６０）学校法人 関西大学 (208)
【Ｆターム（参考）】
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