本発明は、ガンを処置する組成物および方法、ならびに、ＤＮＡ修復経路に特異的な治療用化合物に対するガン細胞の反応性を評価する／モニターする方法に関する。以下の工程を含む、ガンを処置するための方法が提供される：ａ）ガン細胞がＤＮＡ修復経路を欠損している（例えば、ファンコニ貧血）かどうかを決定する工程、およびｂ）ＤＮＡ損傷剤または、工程（ａ）で同定された経路（例えば、ミスマッチ修復経路または非相同末端結合修復経路）以外の少なくとも１つの異なるＤＮＡ修復経路に特異的な阻害剤を投与する工程。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００６年１０月２０日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８５３，２０８および２００７年３月１９日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８９５，６０６（これらの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府によって後援された研究の声明
本発明は、ＮＩＨ助成金ＲＯ１−ＨＬ５２７２５、ＲＯ１−ＤＫ４３８８９、およびＰＯ１−ＨＬ５４７８５、およびＴ４３ＣＡ０９３６１のもとで政府支援によって行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般的に、ガンを処置する方法に関する。さらに具体的には、本発明は、治療用化合物に対するガン細胞の反応性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡ修復は、細胞がそのゲノムをコードするＤＮＡ分子の損傷を特定し修正するプロセスの総称をいう。ヒト細胞においては、正常な代謝活性と環境的要因（例えば、紫外線）のいずれもがＤＮＡの損傷を引き起こし得、それにより、１日あたり細胞１個あたり１００万個程度の数の個々の分子の損傷が生じ得る。これらの損傷の多くはＤＮＡ分子の構造的な損傷を引き起こし、影響を受けたＤＮＡがコードする遺伝子を転写する細胞の能力が変化してしまうかまたは失われてしまう可能性がある。他の損傷によっては、細胞のゲノムに有害な変異が誘導される可能性があり、これは、それが有糸分裂を受けた後のその娘細胞の生存性に影響を及ぼすであろう。結果として、ＤＮＡの修復プロセスは、それがＤＮＡ構造の中に起きたあらゆる損傷に対して迅速に反応できるように、常に活発でなければならない。
【０００５】
ＤＮＡの修復速度は、細胞のタイプ、細胞の年齢、および細胞外環境を含む多くの要因に依存する。多量のＤＮＡ損傷、またはそのＤＮＡによって行われたもはや有効ではないように修復された損傷が蓄積した細胞は、可能性のある３つの状態にうちの１つに入り得る：老化として知られている不可逆的な休眠状態；アポトーシスもしくはプログラムされた細胞死としても知られている細胞自殺；または腫瘍の形成に至る可能性がある無秩序な細胞分裂。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、腫瘍細胞はＤＮＡ修復経路およびＤＮＡの損傷に対する応答経路が変化してしまっていること、そしてこれらの経路のうちの１つが失われることが、特定のクラスのＤＮＡ損傷剤に対してガンをさらに敏感にすることの発見に基づく。さらに具体的には、本発明は、細胞の中の２つのＤＮＡ修復経路の欠損が致命的であることの発見にも一部基づく。
【０００７】
本発明により、被験体のガンを処置する方法が提供される。１つの実施形態においては、ガンを処置する方法には以下の工程が含まれる：（ａ）ガン細胞がＤＮＡ修復経路を欠損しているか否かを決定する工程、および（ｂ）ＤＮＡ損傷剤または工程（ａ）において同定されたものとは異なる少なくとも１つのＤＮＡ修復経路に特異的な阻害剤を被験体に投与する工程。別の実施形態においては、被験体のガンを処置する方法には以下の工程が含まれる：（ａ）ガン細胞がＤＮＡ修復経路を欠損しているか否かを決定する工程、（ｂ）ガン細胞の中でアップレギュレートされているＤＮＡ修復経路のタンパク質または遺伝子を同定する工程、ならびに、（ｃ）ＤＮＡ損傷剤または工程（ｂ）において同定されたＤＮＡ修復経路のタンパク質または遺伝子に特異的な阻害剤を被験体に投与する工程。
【０００８】
本発明によってはまた、以下の工程を含む、特定のガン細胞に対する治療薬を選択するための方法も提供される：（ａ）正常な細胞と比較して、ガン細胞の１つ以上のＤＮＡ修復経路の欠損を決定する工程、および（ｂ）ＤＮＡ損傷剤または工程（ａ）において同定されたＤＮＡ経路とは異なる少なくとも１つのＤＮＡ修復経路に特異的な阻害剤を選択する工程。
【０００９】
本発明によってはまた、化学療法薬に対するガン細胞の耐性または感受性を決定する方法も提供される。１つの実施形態においては、化学療法薬に対するガン細胞の耐性を決定する方法には、ＤＮＡ修復経路の欠損を同定する工程が含まれる。この場合、欠損の存在は、その細胞がＤＮＡ修復経路に特異的な化学療法薬に耐性であることを示す。別の実施形態においては、化学療法薬に対するガン細胞の感受性を決定する方法には、ＤＮＡ修復経路の欠損を同定する工程が含まれ、この場合、欠損が存在しないことは、その細胞がＤＮＡ修復経路に特異的な化学療法薬に対して感受性であることを示す。
【００１０】
本発明によってはまた、処置に対するガン細胞の反応性を同定し、調節する方法も提供される。１つの実施形態においては、ＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対するガン細胞の反応性を同定する方法には、相同組み換えと架橋による修復（ＦＡ／ＨＲ）のＤＮＡ修復経路の欠損を同定する工程が含まれ、この場合、欠損の存在は、その細胞がＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対して感受性であることを示すが、存在しない場合には、効力は、その細胞がＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対して耐性であることを示す。別の実施形態においては、ＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対するガン細胞の反応性を増大させる方法には、ガン細胞を相同組み換えと架橋による修復（ＦＡ／ＨＲ）のＤＮＡ修復経路の阻害剤と接触させる工程が含まれる。別の実施形態においては、ＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤に対するガン細胞の反応性を同定する方法には、ＭＡＰ２ＫＡＰ２のリン酸化を検出する工程が含まれ、この場合、リン酸化の存在は、その細胞がＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤に対して感受性であることを示し、一方、リン酸化が存在しないことは、その細胞がＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤に対して耐性であることを示す。別の実施形態においては、ＦＡ／ＨＲ ＤＮＡ修復経路の阻害剤に対するガン細胞の反応性を同定する方法には、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）ＤＮＡ修復経路の欠損を同定する工程が含まれ、ここでは、欠損が存在することは、その細胞がＦＡ／ＨＲ ＤＮＡ修復経路の阻害剤に対して感受性であることを示し、一方、欠損が存在しない場合には、効力は、その細胞がＦＡ／ＨＲ ＤＮＡ修復経路の阻害剤に対して耐性であることを示す。
【００１１】
本発明によってはまた、ガンを有している被験体の処置の有効性を評価するか、またはその処置をモニターする方法も提供される。１つの実施形態においては、ガンを有している被験体の処置の有効性を評価する方法には、以下の工程が含まれる：（ａ）被験体由来の試料中のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳ１〜２５９から選択される２つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの有効量のレベルを測定する工程、および（ｂ）２つ以上のＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの有効量のレベルを参照値に対して比較する工程。別の実施形態においては、ガンを有している被験体の処置をモニターする方法には、以下の工程が含まれる：（ａ）第１の時点での被験体由来の第１の試料中のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳ １〜２５９から２つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの有効量のレベルを検出する工程、（ｂ）第２の時点での被験体由来の第２の試料中の２つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの有効量のレベルを検出する工程、および（ｃ）工程（ａ）で検出された２つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの有効量のレベルを工程（ｂ）で検出された量に対して、または参照値に対して比較する工程。別の実施形態においては、ガンを有している被験体の処置をモニターする方法には以下の工程が含まれる：（ａ）ガン細胞が第１の時点でＤＮＡ修復経路において欠損しているか否かを決定する工程、（ｂ）ガン細胞が、第２の時点で、工程（ａ）において同定されたＤＮＡ修復経路において欠損しているか否かを決定する工程。この場合、ＤＮＡ修復経路の欠損の減少は、処置が有効ではないことを示し、一方、ＤＮＡ修復経路の増大またはそれに変化がないことは、処置が有効であることを示す。
【００１２】
本発明によってはまた、以下を含む２つ以上のＤＮＡ修復経路に由来する少なくとも２つのタンパク質を有しているパネルも提供される：塩基除去修復（ＢＥＲ）、相同組み換えと架橋による修復（ＦＡ／ＨＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、非相同末端結合修復（ＮＨＥＪ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、損傷乗り越えＤＮＡ合成（ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＴＬＳ）、およびＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）。１つの実施形態においては、パネルには、少なくとも１つのファンコニ貧血タンパク質（Ｆａｎｃｏｎｉ Ａｎｅｍｉａ ｐｒｏｔｅｉｎ）と少なくとも１つのミスマッチ修復タンパク質（Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）が含まれる。別の実施形態においては、パネルには、ＤＮＡの修復またはＤＮＡの損傷の認識および調節タンパク質に関係している経路の指標である１つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳが含まれる。
【００１３】
他の場所で定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されている方法および材料と同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書中に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配するであろう。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定するようには意図されない。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、以下に詳細に記載される説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、ｓｉＲＮＡスクリーニングを示している図である。図１Ｂは、ＦＡ経路が欠損している細胞に対して選択的に毒性である上位１０個のｓｉＲＮＡ標的を示しているグラフである。
【図２】図２Ａは、ｓｉＲＮＡを標的化するＡＴＭでの処理後の細胞の生存性を示している、免疫ブロットの写真とそれに伴うグラフ表示である。図２Ｂは、ｓｉＲＮＡを標的化するＦＡＮＣＧでの処理後の細胞の生存性を示している免疫ブロットの写真とそれに伴うグラフ表示である。図２Ｃは、Ｆａｎｃｇ＋／− ＡＴＭ＋／−異種交配マウスの子孫における遺伝子型の頻度を示しているグラフである。
【図３−１】図３Ａは、ＦＡＮＣＧ欠損ＥＵＦＡ３２６細胞株の中でのＡＴＭの自己リン酸化を示している免疫ブロットの写真である。図３Ｂは、ＦＡＮＣＣ欠損ＥＵＦＡ４２６細胞株の中でのＡＴＭの自己リン酸化を示している免疫ブロットの写真である。図３Ｃは、ＦＡＮＣＡ欠損ＥＵＦＡ６９１４細胞株の中でのＡＴＭの自己リン酸化を示している免疫ブロットの写真である。図３Ｄは、ＦａｎｃＧ−／− ＭＥＦ細胞株とＦａｎｃＧ野生型ＭＥＦ細胞株の中でのＡＴＭの自己リン酸化を示している免疫ブロットの写真である。図３Ｅは、ＡＴＭキナーゼアッセイを示している免疫ブロットの写真である。
【図３−２】図３Ｆは、電離放射線での処理の前および後の、ＡＴＭの自己リン酸化とＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化を示している免疫ブロットの写真である。図３Ｇは、ＡＴＭに対するｓｉＲＮＡでの処理後のＤＮＡの断裂を比較するＣｏｍｅｔアッセイを示しているグラフとそれに伴う視野の写真である。
【図４】図４Ａは、ＦＡＮＣＣ欠損ＥＵＦＡ４２６細胞における漸増濃度のＫＵ５５９３３での処理後７２時間の用量生存性（ｄｏｓｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）曲線を示しているグラフである。図４Ｂは、ＦＡＮＣＧ欠損ＥＵＦＡ３２６細胞における漸増濃度のＫＵ５５９３３での処理後７２時間の用量生存性曲線を示しているグラフである。図４Ｃは、ＦＡＮＣＤ２欠損ＰＤ２０細胞における漸増濃度のＫＵ５５９３３での処理後７２時間の用量生存性曲線を示しているグラフである。図４Ｄは、ＦＡＮＣＥ欠損ＤＦ１１７９細胞における漸増濃度のＫＵ５５９３３での処理後７２時間の用量生存性曲線を示しているグラフである。図４Ｅは、Ｆａｎｃｇ−／− ＭＥＦ細胞対Ｆａｎｃｇ＋／＋ ＭＥＦ細胞における漸増濃度のＫＵ５５９３３での処理後７２時間の用量生存性曲線を示しているグラフである。図４Ｆは、ＦＡＮＣＣ変異体ＥＵＦＡ４２６細胞の中のコロニー数を比較する、１４日のコロニーカウントアッセイを示しているグラフである。図４Ｇは、ＦＡＮＣＣ変異体ＥＵＦＡ４２６細胞株の中でのＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化、ＡＴＭ自己リン酸化、およびＨ２ＡＸリン酸化を示している免疫ブロットの写真である。
【図５】図５Ａは、ＫＵ５５９３３での処理の０時間後、２４時間後、および４８時間後の有糸分裂中期スプレッド（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｓｐｒｅａｄ）について測定した、細胞あたりの染色体の断裂の数を示しているグラフである。図５Ｂは、ＫＵ５５９３３での処理の前および後のＦＡＮＣＥ欠損ＥＵＦＡ１３０細胞株の細胞周期プロフィールを示しているヨウ化プロピジウムフローサイトメトリーの提示である。図５Ｃは、ＫＵ５５９３３の０時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後に２Ｎ未満のＤＮＡ（ｓｕｂ Ｇ０集団）を含む細胞の提示を示しているグラフである。
【図６】図６Ａは、内因性のＤＮＡの損傷が、野生型細胞においては複製フォークの行き詰まり（ｓｔａｌｌ）を引き起こし、そしてＡＴＭおよびＡＴＲ修復経路を引き起こすＤＮＡの断裂を生じる事を示している、模式的な提示である。図６Ｂは、細胞が行き詰まった複製フォークの修復のためにＡＴＭ依存性経路に頼る機能性のＦＡ経路が存在しないことを示している模式的な提示である。図６Ｃは、ＦＡ経路が欠損している細胞においてＡＴＭ機能が失われた場合には、行き詰まったＤＮＡの複製を再度確立させるための機構が存在せず、壊滅的なＤＮＡの損傷と死が生じることを示している模式的な提示である。
【図７】図７は、電離放射線での処理後のＰｒｋｄｃ^{ｓｃ／ｓｃ}マウス、およびＦａｎｃｄ２^−／−；Ｐｒｋｄｃ^{ｓｃ／ｓｃ}マウスの生存率を示しているグラフである。
【図８】図８は、電離放射線での処理後の野生型マウス、Ｆａｎｃｄ２^−／−マウス、Ｐｒｋｄｃ^{ｓｃ／ｓｃ}マウス、およびＦａｎｃｄ２^−／−；Ｐｒｋｄｃ^{ｓｃ／ｓｃ}マウスの全ＤＮＡ含有量を示しているグラフである。
【図９】図９は、光活性化ソラレンでの処理後の、野生型マウス、Ｆａｎｃｄ２^−／−マウス、Ｐｒｋｄｃ^{ｓｃ／ｓｃ}マウス、およびＦａｎｃｄ２^−／−；Ｐｒｋｄｃ^{ｓｃ／ｓｃ}マウスの全ＤＮＡ含有量を示しているグラフである。
【図１０】図１０は、ｓｈＭｌｈ１Ａ、ｓｈＭｌｈ１Ｂ、またはそれらの組み合わせでの処理後の、ヒトＦＡ−Ａ線維芽細胞の中でのＭｌｈ１の発現を示している免疫ブロットの写真である。
【図１１】図１１は、ＤＯＸ処理後のｓｈＭｌｈ１ＡとｓｈＭｌｈ１Ｂの組み合わせで処理した細胞の増殖の低下を示しているグラフである。
【図１２】図１２は、Ｍｌｈ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、それに続いてシスプラチンで処理した、またはシスプラチンで処理しなかった、ＨｅＬａ細胞中でのＭｌｈ１の発現とＦＡＮＣＤ２のユビキチン化を示している免疫ブロットの写真である。
【図１３】図１３は、ＰＶＵＩＩを有しているＦｒａｎｃｄ２ ｃＤＮＡでのレトロウイルス修正（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）後に二重変異細胞の中で形成されたコロニーの数を示しているグラフである。
【図１４】図１４は、ＰＶＵＩＩを有しているＦａｎｃｄ２ ｃＤＮＡでのレトロウイルス修正後の二重変異細胞のコロニー形成能力の低下が、修正されていない細胞の中でのタンパク質の取り込みの増大の結果ではないことを示している、ＦＡＣＳ分析の提示である。
【図１５】図１５は、ガンの処置方法に対するＤＮＡ修復の影響を示している模式図である。
【図１６】図１６は、乳ガンの処置レジメンの中での化学療法薬の使用を評価することにおけるＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの使用の模式的なグラフ提示である。
【図１７】図１７は、様々なガンの処置レジメンにおける化学療法薬の使用を評価することにおけるＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの使用の模式的なグラフ提示である。
【図１８】図１８は、乳ガンの処置レジメンの中での化学療法薬の使用を評価することにおける、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの使用と６個のＤＮＡ修復経路の機能性の模式的なグラフ提示である。
【図１９−１】図１９Ａは、他の生物体のＦＡＮＣＥ配列でヒトＦＡＮＣＥの中のＣｈｋ１（Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）のリン酸化モチーフが取り囲まれている配列のアラインメントの模式図である。図１９Ｂは、空のベクター（ｐＭＭＰ）、ｐＭＭＰ−ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥ、ｐＭＭＰ−ＦＬＡＧ−Ｔ３４６Ａ、ｐＭＭＰ−ＦＬＡＧ−Ｓ３７４Ａ、ｐＭＭＰ−ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ（Ｔ３４６Ａ、Ｓ３７４Ａの二重変異体）でのＦＡ−Ｅリンパ芽球細胞株ＥＵＦＡ１３０のＭＭＣ感受性の相補性を示している線グラフである。示されるレトロウイルス上清を作成し、ＥＵＦＡ１３０細胞に形質導入するために使用した。ピューロマイシン耐性細胞を選択し、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）感受性を、「材料および方法」に記載されるように決定した。示される値は、別の４回の実験による平均±標準偏差（ＳＤ）である。
【図１９−２】図１９Ｃは、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化の回復を示しているウェスタンブロットの写真である。示される安定にトランスフェクトされたＦＡ−Ｅリンパ芽球細胞株は、未処理のままとしたか、または示したように、様々な線量の電離放射線（ＩＲ）に曝したかのいずれかとし、６時間後に回収した。ウェスタンブロッティングは、抗ＦＡＮＣＤ２抗体または抗ＦＬＡＧ抗体を用いて行った。図１９Ｄは、ＦＡＮＣＤ２核焦点の形成の回復を示している細胞培養物の写真である。ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ（ＥＵＦＡ１３０＋ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥ）を安定に発現しているＥＵＦＡ１３０（ＦＡ−Ｅ）リンパ芽球、および二重変異体ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ（ＥＵＦＡ１３０＋ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を安定に発現しているＥＵＦＡ１３０（ＦＡ−Ｅ）リンパ芽球は、未処理のままとしたか、または、ＩＲ（１０Ｇｙ）で処理したかのいずれかとし、６時間後に固定し、免疫蛍光分析を抗ＦＡＮＣＤ２（ＦＩ−１７）抗体を使用して行った。倍率×６３０。図１９Ｅは、ＦＡＮＣＤ２焦点の定量を示している棒グラフである。４個を上回る異なる焦点を有している細胞をポジティブとカウントした。２００細胞／試料を分析した。示される値は、３回の別々の実験による平均±ＳＤである。
【図２０−１】図２０Ａは、ＧＳＴ−ＦＡＮＣＥペプチド融合タンパク質を示している模式図である。これには、インビトロでのキナーゼアッセイのために作成し、基質として使用したＦＡＮＣＥの示される領域が含まれており、アラニンに変異したスレオニン（３４６）および／またはセリン（３７４）残基が示されている（左のパネル）。ＧＳＴ−ＦＡＮＣＥペプチド融合タンパク質を、［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰと精製された組み換え体Ｃｈｋ１とともにインキュベートした。反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィー（右のパネル）による分析の前にＳＤＳ試料緩衝液の添加によって停止させた。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃ（２００−２５６）ペプチド融合タンパク質とＧＳＴを、Ｃｈｋ１についてのポジティブ対照基質およびネガティブ対照基質として使用して、インビトロでのキナーゼアッセイの効果を明らかにした。図２０Ｂは、インビトロでのキナーゼアッセイを示している写真である。インビトロでのキナーゼアッセイは、野生型のＦＡＮＣＥタンパク質（ｒＦＡＮＣＥｗｔ）と二重変異体（ｒＴＳ／ＡＡ）の組み換えＦＡＮＣＥタンパク質（１４９〜５３６）をリン酸化させるために、ＧＳＴ、精製された組み換え体Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、またはＭＫ２を使用したインビトロでのキナーゼアッセイを使用して行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後の免疫ブロッティングによって、ホスホ−Ｔ３４６−ＦＡＮＣＥ（ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ）、ホスホ−Ｓ３７４−ＦＡＮＣＥ（ｐＳ３７４−ＦＡＮＣＥ）抗体を用いて分析した。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃ（２００−２５６）ペプチド融合タンパク質とＧＳＴを、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、およびＭＫ２のポジティブ対照基質およびネガティブ対照基質として使用して、インビトロでのキナーゼアッセイの効果を明らかにした。図２０Ｃは、Ｃｈｋ１がインビボでＦＡＮＣＥをリン酸化することを示している免疫ブロットの写真である。ＥＵＦＡ１３０（ＦＡ−Ｅ）リンパ芽球には、示したように、空のベクター、ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ、ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ（二重変異体）を安定に発現させた。細胞は未処理のままとしたか、またはＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）で処理したかのいずれかとし、３時間後に、免疫沈降を抗ＦＬＡＧ抗体を使用して行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のウェスタンブロットによって、抗ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥおよび抗ｐＳ３７４−ＦＡＮＣＥホスホ特異的、ならびに抗ＦＬＡＧ抗体を用いて分析した。
【図２０−２】図２０Ｄは、空のベクター（ＥＵＦＡ１３０＋Ｖｅｃ．）およびＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ（ＥＵＦＡ１３０＋ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥ）を安定に発現しているＥＵＦＡ１３０（ＦＡ−Ｅ）リンパ芽球の写真である。これらは、未処理のままとしたか、またはＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）で処理したかのいずれかとし、その後、２時間固定した。免疫蛍光試験を、抗ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ抗体を使用して行った（左のパネル）。倍率×６３０。ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰ（対照）、Ｃｈｋ１、またはＡＴＲに対して標的化させたｓｉＲＮＡで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を未処理のままとしたか、またはＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）で処理したかのいずれかとし、固定する前に２時間インキュベートし、免疫蛍光分析を、抗ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ抗体を使用して行った（右のパネル）。倍率×４００。図２０Ｅは、ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点の定量を示している棒グラフである。４個を上回る焦点を有している細胞をポジティブとカウントした。１００細胞／試料を分析した。示される値は、３回の別々の実験による平均±ＳＤである。ＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）の処理を行った場合のｐＴ３４６ＦＡＮＣＥ焦点の形成は、ＡＴＲまたはＣｈｋ１がｓｉＲＮＡで抑制されているＨｅＬａ細胞の中で大幅に減少した。
【図２１】図２１Ａは、ＧＦＰ（対照）またはＣｈｋ１に対して標的化させられたｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を示している一連の写真である。トランスフェクションの７２時間後に、細胞をＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）で処理し、固定および溶解の前に３時間または６時間、インキュベートし、免疫蛍光分析を抗ＦＡＮＣＤ２抗体を使用して行った。倍率×４００。図２１Ｂは、全細胞抽出物のウェスタンブロットの写真である。抗β−チューブリンブロットをローディング対照として使用した（Ｂ）。図２１Ｃは、ＦＡＮＣＤ２焦点の定量を示している棒グラフである。４個を上回る異なる焦点を有している細胞をポジティブとカウントした。２００細胞／試料を分析した。示される値は、３回の別々の実験による平均±ＳＤである。
【図２２】図２２Ａは、ＤＮＡ損傷後に追跡調査した、ホスホ−Ｔ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点およびＦＡＮＣＤ２焦点のＴ／ｔｈｅ速度論を示している一連の写真である。ＨｅＬａ細胞は、未処理のままとしたか、またはＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）で処理したかのいずれかとし、固定の前に、示されるように様々な時間（３０分、２時間、、４時間、６時間、８時間）インキュベートし、免疫蛍光分析を、抗ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ抗体および抗ＦＡＮＣＤ２（ＦＩ−１７）抗体を使用して行った。倍率×４００。図２２Ｂは、ポジティブとしてカウントした４個を上回る異なる焦点を有している細胞の分析を示している棒グラフである。２００細胞／試料。示される値は、３回の別々の実験による平均±ＳＤである。図２２Ｃは、４時間の紫外線照射の後の、ＨｅＬａ細胞中でのホスホ−Ｔ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点およびＦＡＮＣＤ２焦点の共局在の一連の写真である。倍率×６３０。
【図２３】図２３Ａは、Ｃｈｋ１によるＦＡＮＣＥのリン酸化はＭＭＣによって媒介される細胞死を修正することはないが、ＭＭＣ処理後に細胞周期の進行を修正し、そしてＤＮＡ合成を促進することを示している棒グラフである。野生型ＦＡＮＣＥ（ＥＵＦＡ１３０＋ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）またはＦＡＮＣＥの二重変異体（ＥＵＦＡ１３０＋ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を安定に発現しているＦＡ−Ｅ細胞（ＥＵＦＡ１３０）は、空のベクター（ＥＵＦＡ１３０＋Ｖｅｃ．）を安定に発現している細胞と比較した場合には、ＭＭＣ処理の２４時間後に、細胞周期の後期Ｓ／Ｇ２期に蓄積することはない。示される値は、３回の別々の実験による平均±ＳＤである。図２３Ｂは、Ｃｈｋ１によるＦＡＮＣＥのリン酸化はＭＭＣによって媒介される細胞死を修正することはないが、ＭＭＣ処理後に細胞周期の進行を修正し、ＤＮＡの合成を促進することを示している棒グラフである。空のベクター（ＥＵＦＡ１３０＋Ｖｅｃ．）を安定に発現しているＦＡ−Ｅ細胞は、野生型ＦＡＮＣＥ（ＥＵＦＡ１３０＋ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）またはＦＡＮＣＥの二重変異体（ＥＵＦＡ１３０＋ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を安定に発現しているＦＡ−Ｅ細胞と比較した場合には、ＭＭＣ １６０ｎｇ／ｍｌでの処理の２４時間後にはＤＮＡ合成が低下していた。示される値は、３回の別々の実験による平均±ＳＤである。図２３Ｃは、Ｃｈｋ１によるＦＡＮＣＥのリン酸化はＭＭＣによって媒介される細胞死を修正することはないが、ＭＭＣ処理後には細胞周期の進行を修正し、ＤＮＡ合成を促進することを示している棒グラフである。ＦＡＮＣＥの二重変異体（ＥＵＦＡ１３０＋ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）または空のベクター（ＥＵＦＡ１３０＋Ｖｅｃ．）を安定に発現しているＦＡ−Ｅ細胞は、野生型ＦＡＮＣＥを発現している細胞と比較した場合には、ＭＭＣ（１６０ｎｇ／ｍｌ）処理の４８時間後および７２時間後に、ｓｕｂ Ｇ１細胞の高い割合を示した。示される値は、３回の別々の実験による平均±ＳＤである。
【図２４−１】図２４Ａは、Ｃｈｋ１によるＦＡＮＣＥのリン酸化がその分解を促進することを示しているウェスタンブロットの写真である。ＨｅＬａ細胞は、未処理のままとしたか、または６０Ｊ／ｍ^２の紫外線照射によって処理したかのいずれかとし、溶解の前に、示される様々な時間、インキュベートした。全細胞抽出物を示される抗体で免疫ブロットした。抗β−チューブリンブロットをローディング対照として使用した。図２４Ｂは、Ｃｈｋ１によるＦＡＮＣＥのリン酸化がその分解を促進することを示しているウェスタンブロットの写真である。ＨｅＬａ細胞を、二重チミジンブロックによって同調させ、その後、Ｓ期に入るように開放した。開放の１時間後、細胞を未処理のままとした（対照）か、またはＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２、１５時間）、ＨＵ（２ｍＭ、２４時間）、ＭＭＣ（１６０ｎｇ／ｍｌ、２４時間）、およびシスプラチン（１０μＭ、２４時間）で処理したかのいずれかを行った．全細胞抽出物を、示される抗体でのウェスタンブロットによって分析した。抗β−チューブリンブロットをローディング対照として使用した。図２４Ｃは、Ｃｈｋ１によるＦＡＮＣＥのリン酸化がその分解を促進することを示しているウェスタンブロットの写真である。ＥＵＦＡ１３０（ＦＡ−Ｅ）リンパ芽球は、示されるように、ｐＭＭＰ（空のベクター）、ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ、ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ（二重変異体）を安定に発現していた。細胞は、未処理のままとしたか、またはＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）で処理したかのいずれかを行い、８時間後、全細胞抽出物を、示される抗体でのウェスタンブロットによって分析した。抗β−チューブリンブロットをローディング対照として使用した。図２４Ｄは、Ｃｈｋ１によるＦＡＮＣＥのリン酸化がその分解を促進することを示しているウェスタンブロットの写真である。Ｕ２ＯＳ細胞は未処理のままとしたか、またはＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）で処理したかのいずれかとし、細胞培養の最後の２時間の間に示される試料に２５μＭのＭＧ１３２を加えて、あるいは加えずに、３時間インキュベートした。全細胞抽出物を、示される抗体でのウェスタンブロットによって分析した。抗β−チューブリンブロットをローディング対照として使用した。図２４Ｅは、Ｃｈｋ１によるＦＡＮＣＥのリン酸化がその分解を促進することを示しているウェスタンブロットの写真である。ＦＡＮＣＥのインビボでのユビキチン化。空のベクター（ａ）、ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ（ｂ）、およびＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ（二重変異体）（ｃ）を安定に発現しているＵ２ＯＳを、ＨＡ−ユビキチンをコードしているｃＤＮＡを用いることなく、またはそれらを用いて一時的にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に、細胞を未処理のままとしたか、またはＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）で処理したかのいずれかを行い、２時間インキュベートし、その後、ＳＤＳ変性緩衝液の中で細胞を溶解させた。ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔおよび二重変異体タンパク質を、抗ＦＬＡＧ抗体免疫沈降によって単離した。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に泳動させ、抗ＨＡ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体で免疫ブロットした。
【図２４−２】図２４Ｆは、ＡＴＲ−Ｃｈｋ１経路によるＦＡ／ＢＲＣＡ経路の活性化を示している模式的なモデルである。ＤＮＡの損傷または複製の停止（ＭＭＣ、ＵＶ、ＩＲ、ＨＵ）は、ＡＴＲ依存性のＦＡＮＣＤ２（６）のリン酸化およびＦＡＮＣＥのＣｈｋ１依存性リン酸化を活性化させる。モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２とリン酸化ＦＡＮＣＥはいずれにも、ＭＭＣ耐性が必要である。ＦＡＮＣＤ２の非ユビキチン化変異体（Ｋ５６１Ｒ）またはＦＡＮＣＥの非リン酸化変異体（ＴＳ／ＡＡ）は、ＭＭＣ過敏性を修正できなかった。
【図２５】図２５Ａは、ＦＡ−Ｅ患者由来の繊維芽細胞株（ＤＦ１１７９）の変異分析を示しているブロットの写真である。ＤＦ１１７９（ＦＡ−Ｅ）細胞とＵ２ＯＳ細胞（対照）から精製したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を特異的なプライマー対を使用して行い、ｃＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。図２５Ｂは、ＦＡ−Ｅ線維芽細胞株（ＤＦ１１７９）の中でのＦＡＮＣＥ遺伝子の変異を、ＦＡＮＣＥのエキソン１からエキソン１０までの範囲にまたがる様々なプライマーを使用する直接のＤＮＡ配列決定によって確認できたことを示している模式図である。示されるクロマトグラムは、ＦＡＮＣＥの１１１１位でのＣからＴへの点変異がミスセンス変異（Ｒ３７１Ｗ、ＡｒｇからＴｒｐ）を生じることを示している。図２５Ｃは、ＦＡＮＣＥ変異を示している模式図である。図２５Ｄは、野生型ＦＡＮＣＥでＦＡ−Ｅ繊維芽細胞株ＤＦ１１７９のＭＭＣ感受性が相補されるが、ＦＡＮＣＥの二重変異体（ＴＳ／ＡＡ）を用いた場合には相補されないことを示している線グラフである。空のベクター（ｐＭＭＰ）、ｐＭＭＰ−ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ、ｐＭＭＰ−ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ（Ｔ３４６Ａ、Ｓ３７４Ａの二重変異体）を有しているＦＡ−Ｅ線維芽細胞株ＤＦ１１７９のＭＭＣ感受性。示されるレトロウイルス上清を作成し、これをＤＦ１１７９細胞に形質導入するために使用した。ピューロマイシン耐性細胞を選択し、ＭＭＣ感受性を以下に記載されるように決定した。示される値は、４回の別々の実験による平均±標準偏差（ＳＤ）である。
【図２６】図２６Ａ〜Ｄは、ＤＮＡの損傷に応答したホスホ−Ｔ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点の形成を説明する。Ａ、Ｂ．低用量のＤＮＡ損傷に応答したホスホ−Ｔ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点の形成。ＨｅＬａ細胞を低用量のＤＮＡ損傷：ＵＶ（１０Ｊ／ｍ^２）、ＩＲ（２Ｇｙ）、またはＭＭＣ（４０ｎｇ／ｍｌ）に対して暴露し、固定の前に、示されるさまざまな時間の間インキュベートし、免疫蛍光分析を、抗ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ抗体を使用して行った。倍率×４００（Ａ）。４個を上回る異なるｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点を有している細胞をポジティブとカウントした。２００細胞／試料を分析した。示される値は、３回の別々の実験による平均±ＳＤである（Ｂ）。Ｃ、Ｄ．ホスホ−Ｔ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点の形成に対するＣｈｋ１阻害剤の効果。ＨｅＬａ細胞を、Ｃｈｋ１阻害剤Ｇｏｅ６９７６およびＳＢ２１８０７８（５μＭ）を伴って、または伴わずに、３０分間前処理し、その後、ＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）に暴露し、固定の前に３時間インキュベートし、免疫蛍光分析を抗ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ抗体を使用して行った。倍率×４００（Ｃ）。４個を上回る異なるｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点を有している細胞をポジティブとカウントした。２００細胞／試料を分析した。示される値は、３回の別々の実験による平均±ＳＤである（Ｄ）。
【図２７】図２７Ａは、空のベクター（ＤＦ１１７９＋Ｖｅｃ．）、野生型ＦＡＮＣＥ（ＤＦ１１７９＋ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）、または二重変異体（ＤＦ１１７９＋ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を安定に発現しているＦＡ−Ｅ線維芽細胞（ＤＦ１１７９）を示しているブロットである。ＦＡ−Ｅ線維芽細胞（ＤＦ１１７９）は、未処理のままとしたか、またはＵＶ（６０Ｊ／ｍ^２）で処理したかのいずれかとし、６時間インキュベートし、全細胞抽出物について抗ＦＬＡＧを用いて免疫沈降を行い、免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、続いて、ウェスタンブロット分析によって、抗ＦＡＮＣＡ抗体、抗ＦＡＮＣＧ抗体、抗ＦＡＮＣＣ抗体、および抗ＦＬＡＧ抗体を用いて分析した。重鎖ＩｇＧをローディング対照として使用した。図２７Ｂは、Ｕ２ＯＳ細胞、ＧＭ０６３７細胞、またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示しているブロットである。これらの細胞は、未処理のままとしたか、または６０Ｊ／ｍ^２のＵＶで処理したかのいずれかとし、３時間または８時間インキュベートし、全細胞抽出物を、示される抗体を用いてウェスタンブロットについて分析した。抗β−チューブリンブロットをローディング対照として使用した。
【図２８】図２８は、Ｃｈｋ１阻害剤で処理したＨｅｌａ細胞がＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化の増大を示すことを示しているウェスタンブロットの写真である。ヒトＨｅＬａ細胞をＣｈｋ１阻害剤Ｇ０６９７６で処理した。ＨｅＬａ細胞溶解物の画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後に、ＦＡＮＣＤ２タンパク質に対する抗体を用いた免疫ブロッティングを行った。Ｃｈｋ１阻害剤で処理した細胞は、ファンコニ貧血経路の活性の指標であるＦＡＮＣＤ２のユビキチン化形態の高いレベルを示した。
【図２９】図２９は、ＥＵＦＡ４２６（ＦＡＮＣＣ欠損）細胞の中でのＣｈｋ１に対するｓｉＲＮＡの毒性を示している棒グラフである。細胞の生存性の決定を、ＦＡＮＣＣを含むレトロウイルスでＦＡＮＣＣ遺伝子の発現が相補されたＥＵＦＡ４２６細胞およびＥＵＦＡ４２６細胞に適用した。細胞の生存性アッセイは、ＬａｃＺまたはＣｈｋ１ ｓｉＲＮＡ（それぞれ、ＬａｃＺｓｉおよびＣｈｋ１ｓｉ）の導入を標準的なプロトコールによって行った後に決定した。
【図３０】図３０は、ファンコニ貧血欠損細胞が細胞生存性の測定においてＣｈｋ１阻害剤に対して過敏であることを示している線グラフである。コロニー形成性の細胞の生存性アッセイは、ＥＵＦＡ３２６（ＦＡＮＣＧ欠損）ヒト細胞およびＥＵＦＡ３２６＋Ｇ（ＦＡＮＣＧで相補された）ヒト細胞の、示される様々な用量のＣｈｋ１キナーゼ阻害剤Ｇ０６９７６に対する暴露の後に完了した。それぞれの暴露量で、ＦＡＮＣ−細胞に対するディファレンシャルな細胞死滅が存在していた。
【図３１】図３１は、ファンコニ貧血欠損細胞は、Ｃｈｋ１阻害剤とのインキュベーションの後に染色体の断裂が増えることを示している棒グラフと一連の模式図であり、細胞周期の変化を示している。ＦＡＮＣＥ欠損細胞株ＥＵＦＡ１３０（ＦＥ変異体）と、相補によってＦＡＮＣＥ遺伝子で修正されたＥＵＦＡ１３０（ＦＥ修正）を２つの分析によって比較した。上段のパネルにおいては、染色体の断裂のレベルを、１ｕＭのＧ０６９７６への暴露後０時間および４８時間でスコアした。染色体の断裂の数を５０個の細胞から定量した。下段のパネルにおいては、ＦＥ変異体とＦＥ修正細胞を、細胞周期の期における細胞の割合について比較した。
【図３２】図３２は、自然発生したヒトの腫瘍（既知のＢＲＣＡ１もしくはＢＲＣＡ２欠損、またはファンコニ貧血欠損と明らかには関係していない）の中のファンコニ貧血経路の破壊の例を示しているチャートである。
【図３３】図３３は、ヒト卵巣細胞株２００８がＣｈｋ１阻害剤またはＡｔｍ阻害剤による阻害に過敏であることを示している写真と棒グラフである。２００８および２００８＋Ｆ細胞の細胞生存性を、Ｃｈｋ１キナーゼ阻害剤Ｇ０６９７６、およびＡｔｍキナーゼ阻害剤ＫＵ５５９３３での処理後に試験した。対照または上記阻害剤とともにインキュベーションした後の７〜１０日後の組織培養プレートのメチレンブルー染色が示される。Ｇ０６９７６処理についての細胞コロニーアッセイの定量を右のパネルに示す。Ｇ０６７９６は、２００８卵巣ガン細胞の有意な過敏性を引き起こすが、この細胞はＦＡＮＣＦの発現を回復した。
【図３４】図３４は、ＦＡＮＣＡ欠損細胞が、ＦＡＮＣＡ遺伝子で相補されている同じ細胞との比較により、ＰＡＲＰ１阻害剤に対して過敏であることを示している棒グラフである。「ＦＡＮＣＡ変異体」は、ヒトＦＡＮＣＡ欠損患者の細胞株である。「ＦＡＮＣＡ修正」は、ＦＡＮＣＡ遺伝子がレトロウイルス形質導入によって再導入されている同じ細胞である。細胞の生存性は、コロニー形成の量によって測定した。
【図３５−１】図３５Ａ〜Ｂ。免疫組織化学分析によって１１個のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーを用いて分析した頭頸部ガン腫瘍マイクロアレイ。Ｈｅａｄ ＆ Ｎｅｃｋ ＴＭＡの連続切片をＩＨＣのために調製した。この実験で使用した抗体は、以下のエピトープに対する抗体であった：ＭＳＨ２（ミスマッチ修復）、ＰＴ２０５６ ＤＮＡＰＫ（非相同末端結合）、ＦＡＮＣＤＤ２（ＦＡ／相同組み換え）、ＰＳ ＨＳＰ２７（ＭａｐＫａｐキナーゼ２基質）、ＰＴ３３４ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２（ＤＮＡ損傷のシグナル伝達）、ＭＬＨ１（ミスマッチ修復）、ＭＳＨ６（ミスマッチ修復）、ＰＡＲ（塩基除去修復）、ＰＡＲＰ１（塩基除去修復）、ＸＰＦ（ヌクレオチド除去修復）。画像分析は、図３６に示されるように、ＴＭＡに由来する９個のガンの標本のグループについて行った。
【図３５−２】図３５Ｃ。免疫組織化学分析によって１１個のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーを用いて分析した頭頸部ガン腫瘍マイクロアレイ。Ｈｅａｄ ＆ Ｎｅｃｋ ＴＭＡの連続切片をＩＨＣのために調製した。この実験で使用した抗体は、以下のエピトープに対する抗体であった：ＭＳＨ２（ミスマッチ修復）、ＰＴ２０５６ ＤＮＡＰＫ（非相同末端結合）、ＦＡＮＣＤＤ２（ＦＡ／相同組み換え）、ＰＳ ＨＳＰ２７（ＭａｐＫａｐキナーゼ２基質）、ＰＴ３３４ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２（ＤＮＡ損傷のシグナル伝達）、ＭＬＨ１（ミスマッチ修復）、ＭＳＨ６（ミスマッチ修復）、ＰＡＲ（塩基除去修復）、ＰＡＲＰ１（塩基除去修復）、ＸＰＦ（ヌクレオチド除去修復）。画像分析は、図３６に示されるように、ＴＭＡに由来する９個のガンの標本のグループについて行った。
【図３６】頭頸部ガンの患者に由来する９個の腫瘍コアを用いた１１個のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーのＩＨＣ染色パターンの比較。頭頸部ガンの患者に由来する腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、ＤＮＡ修復とＤＮＡの損傷シグナル伝達の生体マーカーの１つのグループを用いて調べた。点線の黄色い丸は、アレイの中の１つの患者の腫瘍を示す。同様に、点線の紫色の丸は、ＴＭＡの中の第２の患者の腫瘍を示している。染色のレベルは、マーカーあたり、および腫瘍の標本あたりのバリエーションを示すために、Ｈ：高い、Ｍ：中程度、またはＬ：低いと幅を持たせて見積もった。評価した生体マーカーは、左側から右側に向かって以下である（上段：ＭＳＨ２、ＤＮＡＰＫ、ＥＲＣＣ１、ＦＡＮＣＤ２）（中段：ＨＳＰ２７、ＭａｐＫａｐキナーゼ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６）（下段：ＰＡＲ、ＰＡＲＰ１、ＸＰＦ）。
【図３７−１】図３７Ａ〜Ｂ。ヒトの前立腺ガンの標本についてのＤＮＡ修復生体マーカーの分析の例。Ａ．３つの患者の腫瘍の標本の提示が、様々な経路に由来する５個のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーを用いて説明される。同じＴＭＡの連続切片を、５個の生体マーカーのそれぞれでＩＨＣ染色した。腫瘍のコアの画像を、画像分析によって解釈するために高倍率でＴＭＡから撮影した。Ｂ．患者１、２、および３についての生体マーカーあたりのバリエーション。着色した出力は、これらの３つの例である標本についての前立腺ガン患者のバリエーションを明らかにしている。
【図３７−２】図３７Ａ〜Ｂ。ヒトの前立腺ガンの標本についてのＤＮＡ修復生体マーカーの分析の例。Ａ．３つの患者の腫瘍の標本の提示が、様々な経路に由来する５個のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーを用いて説明される。同じＴＭＡの連続切片を、５個の生体マーカーのそれぞれでＩＨＣ染色した。腫瘍のコアの画像を、画像分析によって解釈するために高倍率でＴＭＡから撮影した。Ｂ．患者１、２、および３についての生体マーカーあたりのバリエーション。着色した出力は、これらの３つの例である標本についての前立腺ガン患者のバリエーションを明らかにしている。
【図３７−３】図３７Ａ〜Ｂ。ヒトの前立腺ガンの標本についてのＤＮＡ修復生体マーカーの分析の例。Ａ．３つの患者の腫瘍の標本の提示が、様々な経路に由来する５個のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーを用いて説明される。同じＴＭＡの連続切片を、５個の生体マーカーのそれぞれでＩＨＣ染色した。腫瘍のコアの画像を、画像分析によって解釈するために高倍率でＴＭＡから撮影した。Ｂ．患者１、２、および３についての生体マーカーあたりのバリエーション。着色した出力は、これらの３つの例である標本についての前立腺ガン患者のバリエーションを明らかにしている。
【図３８−１】図３８Ａ〜Ｂ。ヒトの非小細胞性肺ガン（ＮＳＣＬＣ）標本について明らかになったＤＮＡ修復生体マーカーの分析の例。Ａ．４つの患者の腫瘍の標本の提示が、異なる経路に由来する５個のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーを用いて説明される。他のＴＭＡを用いて上記に記載されたように、ＮＳＣＬＣ ＴＭＡの連続切片を、図に示されるように５個の生体マーカーのそれぞれで染色した。腫瘍のコアの画像を、画像分析による解釈のために、高倍率でＴＭＡから撮影した。Ｂ．出力を記載するための着色スキームを使用した、患者１〜４についての生体マーカーあたりのバリエーション。
【図３８−２】図３８Ａ〜Ｂ。ヒトの非小細胞性肺ガン（ＮＳＣＬＣ）標本について明らかになったＤＮＡ修復生体マーカーの分析の例。Ａ．４つの患者の腫瘍の標本の提示が、異なる経路に由来する５個のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーを用いて説明される。他のＴＭＡを用いて上記に記載されたように、ＮＳＣＬＣ ＴＭＡの連続切片を、図に示されるように５個の生体マーカーのそれぞれで染色した。腫瘍のコアの画像を、画像分析による解釈のために、高倍率でＴＭＡから撮影した。Ｂ．出力を記載するための着色スキームを使用した、患者１〜４についての生体マーカーあたりのバリエーション。
【図３８−３】図３８Ａ〜Ｂ。ヒトの非小細胞性肺ガン（ＮＳＣＬＣ）標本について明らかになったＤＮＡ修復生体マーカーの分析の例。Ａ．４つの患者の腫瘍の標本の提示が、異なる経路に由来する５個のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーを用いて説明される。他のＴＭＡを用いて上記に記載されたように、ＮＳＣＬＣ ＴＭＡの連続切片を、図に示されるように５個の生体マーカーのそれぞれで染色した。腫瘍のコアの画像を、画像分析による解釈のために、高倍率でＴＭＡから撮影した。Ｂ．出力を記載するための着色スキームを使用した、患者１〜４についての生体マーカーあたりのバリエーション。
【図３９】図３９Ａ〜Ｆ。漿液性卵巣ガンの連続切片からの関心領域の選択（ＲＯＩ）。腫瘍標本の連続切片。緑色と黄色の四角は、ヘマトキシリンとエオシンでの染色に基づいて選択した、選択された領域の中に大きな腫瘍の容積を有している領域を示す。
【図４０Ａ】図４０Ａ〜Ｄ。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のＩＨＣ染色パターンについての頭頸部ガンの６人の患者の比較。４つのマーカーのＩＨＣ染色は、Ａ：ＦＡＮＣＤ２、Ｂ：ＭＬＨ１、Ｃ：ＸＰＦ、およびＤ：ＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２を用いて示す。Ａ〜Ｄのそれぞれの部分において、６人の頭頸部ガンの患者に、２７、２６、および２３（上段のパネル）、および２１、１６、９（下段のパネル）と番号を付けた。
【図４０Ｂ】図４０Ａ〜Ｄ。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のＩＨＣ染色パターンについての頭頸部ガンの６人の患者の比較。４つのマーカーのＩＨＣ染色は、Ａ：ＦＡＮＣＤ２、Ｂ：ＭＬＨ１、Ｃ：ＸＰＦ、およびＤ：ＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２を用いて示す。Ａ〜Ｄのそれぞれの部分において、６人の頭頸部ガンの患者に、２７、２６、および２３（上段のパネル）、および２１、１６、９（下段のパネル）と番号を付けた。
【図４０Ｃ】図４０Ａ〜Ｄ。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のＩＨＣ染色パターンについての頭頸部ガンの６人の患者の比較。４つのマーカーのＩＨＣ染色は、Ａ：ＦＡＮＣＤ２、Ｂ：ＭＬＨ１、Ｃ：ＸＰＦ、およびＤ：ＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２を用いて示す。Ａ〜Ｄのそれぞれの部分において、６人の頭頸部ガンの患者に、２７、２６、および２３（上段のパネル）、および２１、１６、９（下段のパネル）と番号を付けた。
【図４０Ｄ】図４０Ａ〜Ｄ。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のＩＨＣ染色パターンについての頭頸部ガンの６人の患者の比較。４つのマーカーのＩＨＣ染色は、Ａ：ＦＡＮＣＤ２、Ｂ：ＭＬＨ１、Ｃ：ＸＰＦ、およびＤ：ＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２を用いて示す。Ａ〜Ｄのそれぞれの部分において、６人の頭頸部ガンの患者に、２７、２６、および２３（上段のパネル）、および２１、１６、９（下段のパネル）と番号を付けた。
【図４１Ａ】図４１Ａ〜Ｅ。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のＩＨＣ染色パターンについての卵巣ガンの６人の患者の比較。４つのマーカーのＩＨＣ染色は、Ａ：ＦＡＮＣＤ２、Ｂ：ＭＬＨ１、Ｃ：ＸＰＦ、Ｄ：ＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２、およびＥ：Ｋｉ６７を用いて示す。Ａ−５のそれぞれの部分において、６人の頭頸部ガンの患者に、３７、３８、および３９（上段のパネル）、および４、４０、４１（下段のパネル）と番号を付けた。
【図４１Ｂ】図４１Ａ〜Ｅ。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のＩＨＣ染色パターンについての卵巣ガンの６人の患者の比較。４つのマーカーのＩＨＣ染色は、Ａ：ＦＡＮＣＤ２、Ｂ：ＭＬＨ１、Ｃ：ＸＰＦ、Ｄ：ＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２、およびＥ：Ｋｉ６７を用いて示す。Ａ−５のそれぞれの部分において、６人の頭頸部ガンの患者に、３７、３８、および３９（上段のパネル）、および４、４０、４１（下段のパネル）と番号を付けた。
【図４１Ｃ】図４１Ａ〜Ｅ。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のＩＨＣ染色パターンについての卵巣ガンの６人の患者の比較。４つのマーカーのＩＨＣ染色は、Ａ：ＦＡＮＣＤ２、Ｂ：ＭＬＨ１、Ｃ：ＸＰＦ、Ｄ：ＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２、およびＥ：Ｋｉ６７を用いて示す。Ａ−５のそれぞれの部分において、６人の頭頸部ガンの患者に、３７、３８、および３９（上段のパネル）、および４、４０、４１（下段のパネル）と番号を付けた。
【図４１Ｄ】図４１Ａ〜Ｅ。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のＩＨＣ染色パターンについての卵巣ガンの６人の患者の比較。４つのマーカーのＩＨＣ染色は、Ａ：ＦＡＮＣＤ２、Ｂ：ＭＬＨ１、Ｃ：ＸＰＦ、Ｄ：ＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２、およびＥ：Ｋｉ６７を用いて示す。Ａ−５のそれぞれの部分において、６人の頭頸部ガンの患者に、３７、３８、および３９（上段のパネル）、および４、４０、４１（下段のパネル）と番号を付けた。
【図４１Ｅ】図４１Ａ〜Ｅ。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のＩＨＣ染色パターンについての卵巣ガンの６人の患者の比較。４つのマーカーのＩＨＣ染色は、Ａ：ＦＡＮＣＤ２、Ｂ：ＭＬＨ１、Ｃ：ＸＰＦ、Ｄ：ＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２、およびＥ：Ｋｉ６７を用いて示す。Ａ−５のそれぞれの部分において、６人の頭頸部ガンの患者に、３７、３８、および３９（上段のパネル）、および４、４０、４１（下段のパネル）と番号を付けた。
【図４２】頭頸部ガンのＦＡＮＣＤ２（ＦＡ／ＨＲ）およびＸＰＦ（ヌクレオチド除去修復）生体マーカーの比較。頭頸部ガンの患者（Ｎ＝３５）を、ＦＡＮＣＤ２およびＸＰＦ生体マーカーを用いてＩＨＣによって評価した。２つのマーカーは、それぞれ、ファンコニ貧血／相同組み換えおよびヌクレオチド切断修復経路の構成成分である。病状についてのスコアは、１から１２の目盛りで、Ｉ（強さ）×Ｑ（量）として表す。患者を、それぞれのマーカーについて、＞６のスコアに対する６またはそれ未満の生体マーカーのスコアに基づいて４象限に分類した。丸の数は、１つの４象限あたりの患者の数を示す。
【図４３】再発後の生検を用いて比較した、外科手術による切除後の卵巣ガン患者の腫瘍の標本のＤＮＡ修復生体マーカーの評価。画像分析は、患者１５および患者１５Ｒ（再発）の標本について目的の同じ領域全体にわたって行った。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーは、写真の挿入に記載されるとおりであり、ＦＡＮＣＤ２、ＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２、ＭＬＨ１、およびＸＰＦが列挙される。画像データは、再発の際のＦＡＮＣＤ２およびＰＴ３３４Ｍａｐｋａｐキナーゼ２の発現レベルの増大の傾向、ＭＬＨ１生体マーカーについての比較的わずかな変化、およびＸＰＦ生体マーカーについてのわずかに低いレベルを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍細胞は変化してしまったＤＮＡ修復およびＤＮＡの損傷応答の経路を有していること、ならびに、これらの経路のうちの１つが失われることにより、特定のクラスのＤＮＡ損傷剤に対して、ガン細胞がより敏感になることの観察に関係する。ガンの治療手順（例えば、化学療法および放射線治療）は、細胞死を生じるＤＮＡの損傷を修復する細胞の能力を圧倒的に大きくすること（ｏｖｅｒｗｈｅｌｍｉｎｇ）によって作用する。さらに具体的には、本発明は、細胞の２つのＤＮＡ損傷経路の中での欠損が致命的であることの発見に一部基づく。したがって、腫瘍の照射および薬物に対する反応性は、ガン細胞の中の６個の主要なＤＮＡ修復経路の完全性を決定することによって予想することができる（図１５）。ＤＮＡ修復とＤＮＡ損傷経路の状態は、乳ガンについての１つ以上の化学療法または放射線治療を用いた治療の決定を推進するであろう（図１６および図１８）。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷の生体マーカーが、定義された薬剤に対する特異的感受性、および／または化学療法に対する耐性をモニターすることにおいて有用であり得る理由の一例もまた示される（図１６〜１８）。同様に、ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷経路の状態は、様々なガンにおける化学療法薬のタイプの決定を評価するための手段であり得る（図１７）。
【００１７】
したがって、本発明により、ＤＮＡ修復経路が変化してしまったことを決定することによる、治療薬に対するガン細胞の反応性（例えば、感受性または耐性）を決定する方法が提供される。これらの方法はまた、ガンまたは他の細胞増殖性の障害について処置および治療を受けている被験体をモニターするため、ならびに、ガンまたは他の細胞増殖性の障害を有している被験体において有効であろう治療法および処置を選択するためにも有用である。この場合、そのような処置および治療法の選択および使用により、ガンまたは他の細胞増殖性の障害の進行が遅らせられる。本発明はさらに、ＤＮＡ修復経路の変化を検出することにおいて有用である生体マーカーに関する。
【００１８】
いくつかの基準によって区別することができる主要なＤＮＡ修復経路が６つ存在している。これらは、一本鎖の損傷を修復する３つのグループと、二本鎖の損傷を修復する３つのグループに分けることができる。一本鎖の損傷の修復経路には、塩基除去修復（ＢＥＲ）；ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）；ミスマッチ修復（ＭＭＲ）；相同組み換え／ファンコニ貧血経路（ＨＲ／ＦＡ）；非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、および損傷乗り越え（ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ）ＤＮＡ合成（ＴＬＳ）が含まれる。
【００１９】
ＢＥＲ、ＮＥＲ、およびＭＭＲは１本鎖ＤＮＡの損傷を修復する。二重ヘリックスの２つの鎖のうちの一方だけが損傷を有している場合には、他方の鎖を、損傷を受けた鎖の修正を導くための鋳型として使用することができる。ＤＮＡの２本の対合した分子のうちの一方の損傷を修復するためには、損傷したヌクレオチドを除去し、これを損傷を受けていないＤＮＡ鎖の中に見られるものに対して相補的な損傷を受けていないヌクレオチドで置き換える、除去修復機構が多数存在している。ＢＥＲは、酸化、アルキル化、加水分解、または脱アミノ化反応によって引き起こされた１つのヌクレオチドが原因である損傷を修復する。ＮＥＲは、２〜３０塩基の、より長い鎖に影響を与える損傷を修復する。このプロセスは、チミン二量体、ならびに一本鎖の断裂（ＵｖｒＡＢＣエンドヌクレアーゼのような酵素で修復された）のような、大きなヘリックスを歪める変化を認識する。転写共役修復（ＴＣＲ）として知られているＮＥＲの特別な形態は、活発に転写されている遺伝子に対して高い優先度でＮＥＲ修復酵素を配置する。ＭＭＲは、ＤＮＡ複製後に誤って対合したヌクレオチドを生じる、ＤＮＡ複製および組み換えの間違いを修正する。
【００２０】
ＮＥＨＪとＨＲは、二本鎖のＤＮＡ損傷を修復する。二本鎖の損傷は、分裂中の細胞にとって特に危険である。ＮＨＥＪ経路は、損傷が起こったＤＮＡの領域をまだ細胞が複製していない場合に作動する。このプロセスでは、断裂してしまったＤＮＡ鎖の２つの末端を鋳型を用いることなく直接結合させるので、プロセスにおいては配列情報が失われてしまう。したがって、この修復機構は必然的に突然変異誘発性である。しかし、細胞が分裂中ではなく、そのＤＮＡが複製されていない場合には、ＮＨＥＪ経路は細胞のオプションにすぎない。ＮＨＥＪは、連結させられた２つのＤＮＡ断片の一本鎖である末端の間で対合する偶然、または微視的相同性（ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ）に頼る。高等真核生物には、ＮＨＥＪには依存しない複数の「二重安全装置」である経路が存在する。組み換え修復には、断裂の修復のための鋳型として使用される、同じ配列またはほぼ同じ配列の存在が必要である。この修復プロセスに関係している酵素的機構は、有糸分裂の間の染色体の乗り換えを担っている機構とほぼ同じである。この経路は、鋳型として新しく作成された娘染色分体（すなわち、これもまたセントロメアによって損傷をうけた領域に連結させられる同じコピー）を使用して、損傷を受けた染色体が修復されることを可能にする。この機構によって修復された二本鎖の断裂は、通常、一本鎖の断裂、または対合していない損傷（これらはいずれも、複製フォークの崩壊を生じる）を超えて合成することを試みる複製機構によって引き起こされる。
【００２１】
損傷乗り越え修復は、任意の他の機構によっては修復されていないＤＮＡの損傷を修復する、間違いが多い（ほぼ間違いが保証されている）最終手段である方法である。ＤＮＡ修復機構は、ＤＮＡ損傷部位を越えて複製を続けることができず、そのために、複製フォークの進行は、損傷を受けた塩基に遭遇すると行き詰るであろう。損傷乗り越え修復経路は、損傷部位に別の塩基を挿入し、それによって染色体の複製を継続するために、複製が損傷を受けた塩基をバイパスすることを可能にする、特異的なＤＮＡポリメラーゼによって媒介される。損傷乗り越え修復機構によって挿入された塩基は鋳型に依存するが、恣意的ではない。例えば、１つのヒトポリメラーゼは、チミンニ量体を超えて合成を行う場合には、アデニン塩基を挿入する。
【００２２】
正常なヒト細胞に類似しているガン細胞は、ＤＮＡ損傷に応答してそれらの増殖を停止することができる。細胞周期の停止は、細胞内のチェックポイントキナーゼの複合アレイによって、少なくとも一部行われる。チェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１（ＣＨＥＫ１）、Ｃｈｋ２（ＣＨＥＫ２）、およびＭａｐＫａｐキナーゼ２（ＭＫ２、Ｃｈｋ３））は、一旦活性化されると、異なる段階（すなわち、Ｇ１／Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、または紡錘体の段階）で細胞周期を停止させることによって細胞増殖を終える。細胞周期の停止によっては、増殖を再開する前に、ＤＮＡ損傷を修復する機会が提供される。
【００２３】
細胞は、ＤＮＡ損傷に応答してＣｈｋ１キナーゼを活性化させる。Ｃｈｋ１は、複数のタンパク質基質（エフェクタータンパク質）をリン酸化し、これは続いて、チェックポイント応答に寄与する。例えば、Ｃｈｋ１は、タンパク質Ｃｄｃ２５ｃをリン酸化させ、それにより、細胞周期のＧ２期からＭ期への移行のブロックを導く。このチェックポイントは、細胞（正常な細胞とガン細胞の両方）が、有糸分裂（Ｍ）期に入る前にそれらのＤＡを修復することを可能にする。
【００２４】
ガン細胞には、高レベルのＤＮＡ損傷が蓄積する。この損傷は、それらの高くなった増殖活性によって、または、化学療法もしくは電離放射線への暴露によって生じ得る。ガン細胞は、多くの場合は、Ｃｈｋ１−キナーゼによって媒介されるＧ２／Ｍ細胞周期チェックポイントに非常に依存する。Ｃｈｋ１への大きな依存はまた、腫瘍細胞が別の重要なチェックポイント媒介因子であるｐ５３タンパク質を持たないことによっても生じる。したがって、Ｃｈｋ１の阻害により、腫瘍細胞の生命維持に必要なチェックポイントがノックアウトされる。このチェックポイントがなければ、腫瘍細胞は、修復されていないままのＤＮＡ損傷が残っているにもかかわらず、有糸分裂へと進行して、「細胞分裂異常」、しいては細胞死に至る。この原理に基づいて、Ｃｈｋ１阻害剤が開発されている。７−ヒドロキシ−スタウロスポリン（ＵＣＮ０１）は、臨床開発が最も進んでおり、ＩＩ相臨床試験の段階にある。しかし、ＵＣＮ０１は、望ましくない毒性を発現する可能性があるその長い半減期の理由から、臨床的には問題がある。したがって、阻害剤で最も適切に処置できる患者を特定することが、重要な臨床上の課題である。広い意味でのＣｈｋ１阻害剤の場合には、サブグループとして患者の応答者を同定することが重要であり、その結果、これらの患者は、機能するであろう治療に対するより優れたターゲットであり得る。同様に、Ｃｈｋ１阻害剤での処置によって明らかに利益が得られないであろう、したがって、Ｃｈｋ１阻害剤に伴う毒性を回避する可能性がある患者もまた同定することができる。本明細書中に明らかに記載されるように、ＤＮＡ損傷に応答して、Ｃｈｋ１は、２つの保存されている部位（スレオニン３４６とセリン３７４）上にあるＦＡコア複合体のＦＡＮＣＥサブユニットを直接リン酸化する。リン酸化されたＦＡＮＣＥは、核焦点にアセンブリして、ＦＡＮＣＤ２と一緒に局在化する。ＦＡＮＣＥの非リン酸化変異形態（ＦＡＮＣＥ−Ｔ３４６Ａ／Ｓ３７４Ａ）は、ＦＡＮＣＥ欠損細胞株の中で発現された場合には、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化、ＦＡＮＣＤ２焦点のアセンブリ、および正常なＳ期への進行を可能にする。しかし、変異体ＦＡＮＣＥタンパク質は、トランスフェクトされた細胞のマイトマイシンＣ過敏性を補うことはできない。まとめると、これらの結果は、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の調節、およびＤＮＡの架橋修復の調節におけるＣｈｋ１の新規の役割を明らかにしている。ＦＡＮＣＥのＣｈｋ１によって媒介されるリン酸化は、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化とは関係のない機能に必要である。
【００２５】
ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷応答のマーカー
患者は治療に対して様々な程度の反応性を有しており、動的様式での処置の能力を識別するために複数の方法が必要である。細胞性のＤＮＡ修復経路に対する変化（例えば、活性、異常に活性、抑制された、下方調節された、または不活性）の同定が、治療用化合物に対する応答をモニタリングし、予想することにおいて有用である。したがって、本発明には、ＤＮＡ修復およびＤＮＡの損傷応答に関係している生体マーカーが含まれる。本発明は、本明細書中に開示される生体マーカーの検出による、治療用化合物（例えば、化学療法薬）に対して耐性を生じる、または治療薬に対して感受性があるか、あるいはそのような素因があるかのいずれかである被験体を同定するための方法を特徴とする。これらの生体マーカーはまた、ガンおよび細胞増殖性の障害について処置および治療を受けている被験体をモニタリングするため、ならびに、ガンおよび細胞増殖性障害を有している被験体において有効である治療法および処置を選択するためにも有用である。
【００２６】
用語「生体マーカー」には、本発明の状況においては、タンパク質、核酸、タンパク質および核酸の多形、元素、代謝物、および他の分析物が含まれるが、これらに限定されない。生体マーカーにはまた、変異したタンパク質または変異した核酸も含まれ得る。用語「分析物」は、本明細書中で使用される場合には、測定される任意の物質を意味し得、そしてこれには、電解質および元素（例えば、カルシウム）も含まれ得る。
【００２７】
治療用化合物に対して耐性または感受性を有しているか、あるいは、治療用化合物に対して耐性または感受性を生じる素因がある被験体においてそのレベルが変化するタンパク質、核酸、多形、および代謝物が表１にまとめられ、これらはまとめて、本明細書中では特に「ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷応答タンパク質、すなわちＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲ」と呼ばれる。
【００２８】
ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの発現は、当該分野で公知の任意の方法を使用してタンパク質または核酸のレベルで決定される。例えば、核酸レベルでは、これらの配列のうちの１つ以上を特異的に認識するプローブを使用するノーザンハイブリダイゼーション分析を、遺伝子発現を決定するために使用することができる。あるいは、発現は、逆転写に基づくＰＣＲアッセイを使用して、例えば、遺伝子のディファレンシャルに発現された配列に特異的なプライマーを使用して測定される。発現はまた、タンパク質レベルでも、すなわち、本明細書中に記載される遺伝子産物によってコードされるペプチド、またはその活性のレベルを測定することによって、決定することもできる。そのような方法は当該分野で周知であり、例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体、アプタマー、または分子インプリントに基づく免疫アッセイが含まれる。任意の生物学的材料を、タンパク質またはその活性の検出／定量のために使用することができる。あるいは、適切な方法を、分析される個々のタンパク質の活性にしたがってマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を決定するために選択することができる。
【００２９】
ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲタンパク質は任意の適切な様式で検出されるが、通常は、患者に由来する試料がＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲタンパク質に結合する抗体と接触させられ、その後、反応産物の存在またはそれが存在しないことを検出することによって検出される。抗体は、上記で詳細に議論されたように、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、または上記の断片であり得、反応産物の検出工程は任意の適切な免疫アッセイを用いて行われ得る。被験体に由来する試料は、通常は、上記のような生物学的液体であり、上記方法を行うために使用される生物学的液体の同じ試料であり得る。試料はまた、患者に由来する組織標本の形態でもあり得る。この場合、標本は、パラフィンに包埋された組織、組織の凍結切片、および新しく単離された組織のような様々な形式の、免疫組織化学反応に適している。免疫検出方法は抗体に基づくが、組織の状況での抗体への結合のより高感度な決定を可能にするさらに別の技術が多数存在している。当業者は、様々な免疫組織化学反応のストラテジーをよく知っているであろう。
【００３０】
本発明にしたがって行われる免疫アッセイは、ホモジニアスアッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）またはヘテロジニアスアッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）であり得る。ホモジニアスアッセイにおいては、免疫学的反応には、通常、特異的抗体（例えば、抗ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲタンパク質抗体）、標識された分析物、および目的の試料が含まれる。標識から生じるシグナルは、標識された分析物に対して抗体が結合すると、直接または間接的に修飾される。免疫学的反応とその範囲の検出のいずれもが、均質な溶液の中で行われる。使用することができる免疫化学的標識としては、フリーラジカル、放射性同位元素、蛍光色素、酵素、バクテリオファージ、または補酵素が挙げられる。
【００３１】
ヘテロジニアスアッセイのアプローチにおいては、試薬は通常、試料、抗体、および検出シグナルを生じさせるための手段である。上記のような試料を使用することができる。抗体は、一般的には、支持体（例えば、ビーズ、プレート、またはスライド）上に固定され、そして液相中に抗原を含むと予想される標本と接触させられる。その後、支持体は、液相から分離され、支持体相または液相のいずれかが、そのようなシグナルを生じさせるための検出可能なシグナルを使用する手段について試験される。シグナルは、試料中の分析物の存在に関係する。検出可能なシグナルを生じさせるための手段には、放射標識、蛍光標識、または酵素標識の使用が含まれる。例えば、検出される抗原に第２の結合部位が含まれる場合には、その部位に結合する抗体を検出基に結合させることができ、分離工程の前に液相の反応溶液に添加することができる。固体支持体上の検出基の存在は、試験試料中の抗原の存在を示す。適切な免疫アッセイの例は放射免疫アッセイ、免疫蛍光方法、化学発光方法、電気化学的発光方法、または酵素結合免疫アッセイである。
【００３２】
当業者は、本明細書中に開示される方法を実行するために有用であり得る多数の特異的な免疫アッセイ形式とそのバリエーションをよく知っているであろう。一般的には、Ｅ．Ｍａｇｇｉｏ，Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，（１９８０）（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）を参照のこと；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」と題された、Ｓｋｏｌｄらの米国特許第４，７２７，０２２号、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎｓ」と題されたＦｏｒｒｅｓｔらの米国特許第４，６５９，６７８号、「Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」と題されたＤａｖｉｄらの米国特許第４，３７６，１１０号、「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｓｓａｙｓ」と題されたＬｉｔｍａｎらの米国特許第４，２７５，１４９号、「Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ」と題されたＭａｇｇｉｏらの米国特許第４，２３３，４０２号、および「Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ ａｓ Ｌａｂｅｌ」と題されたＢｏｇｕｓｌａｓｋｉらの米国特許第４，２３０，７６７号もまた参照のこと。
【００３３】
抗体は、公知の技術（例えば、受動的結合）にしたがって、診断アッセイに適している固体支持体（例えば、ラテックスまたはポリスチレンのような材料から作られたビーズ、プレート、スライド、またはウェル）に結合させられる。同様に、本明細書中に記載される抗体は、公知の技術にしたがって検出可能な基（例えば、放射標識（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、および蛍光標識（例えば、フルオレセイン））に結合させることができる。
【００３４】
当業者は、表１のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳのいずれかに対する抗体、核酸プローブ（例えば、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ）を日常的に行われているように作成することができる。
【００３５】
本発明にはまた、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳ検出試薬（例えば、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲ核酸の一部に相補的である相同な核酸配列（例えば、オリゴヌクレオチド配列）を有していることによって１つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲ核酸を特異的に同定する核酸、あるいは、キットの形態で一緒にパッケージされているＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲ核酸によってコードされるタンパク質に対する抗体）も含まれる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲ遺伝子の断片である。例えば、オリゴヌクレオチドは、２００、１５０、１００、５０、２５、１０、またはそれ未満のヌクレオチドの長さである。キットには、核酸または抗体（すでに固体マトリックスに結合させられているか、もしくはマトリックスにそれらを結合させるための試薬とは別々にパッケージされているかのいずれか）、対照の処方物（ポジティブおよび／またはネガティブ）、および／または検出標識が容器の中に別々に含まれ得る。アッセイを実施するための説明書（例えば、書面による、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）がキットの中に含まれる場合がある。例えば、アッセイは、当該分野で公知であるように、ノーザンハイブリダイゼーション、またはサンドイッチＥＬＩＳＡの形態であり得る。
【００３６】
例えば、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲ検出試薬は、固体マトリックス（例えば、少なくとも１つのＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲ検出部位を形成する多孔性の細片）上に固定される。多孔性の細片の測定または検出領域には、核酸を含む複数の部位が含まれ得る。細片にはまた、ネガティブ対照および／またはポジティブ対照のための部位も含まれ得る。あるいは、対照部位は、試験細片とは別の細片上に配置される。状況に応じて、様々な検出部位には、様々な量の固定された核酸（すなわち、第１の検出部位の中には多量、続く部位にはより少ない量）が含まれ得る。試験試料が添加されると、検出可能なシグナルを提示する部位の数により、試料中に存在するＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲの量の量的指標が提供される。検出部位は、任意の適切な検出可能な形状になるように構成され得、通常は、試験細片の幅全体に及ぶ棒または点の形状である。
【００３７】
あるいは、キットには、１つ以上の核酸配列が含まれている核酸基質アレイが含まれる。アレイ上の核酸は、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲ１〜２５９によって提示される１つ以上の核酸配列を特異的に同定する。様々な実施形態においては、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲ１〜２５９によって提示される配列のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、４０、または５０、あるいはそれ以上の配列の発現が、アレイへの結合によって同定される。基質アレイは、例えば、「固体の基体」（例えば、米国特許第５，７４４，３０５号に記載されているような「チップ」）上であり得る。あるいは、基質アレイは、溶液アレイ（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ｃｙｖｅｒａ，Ｖｉｔｒａ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ’Ｍｏｓａｉｃ．）であり得る。
【００３８】
好ましくは、キットには、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの検出のための抗体が含まれる。
【００３９】
【表１−１】

【００４０】
【表１−２】

【００４１】
【表１−３】

【００４２】
【表１−４】

【００４３】
【表１−５】

【００４４】
【表１−６】

【００４５】
【表１−７】

【００４６】
【表１−８】

【００４７】
【表１−９】

【００４８】
【表１−１０】

【００４９】
【表１−１１】

【００５０】
【表１−１２】

治療方法
抗原に対する細胞の反応性（例えば、耐性または感受性）は、細胞の中のＤＮＡ修復経路の欠損を同定することによって決定される。細胞は、例えば、ガン細胞である。ＤＮＡ修復経路は、塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、相同組み換え／ファンコニ貧血（ＦＡ）経路、非相同末端結合、または損傷乗り越えＤＮＡ合成である（図１６〜１８）。
【００５１】
特定のＤＮＡ修復経路における欠損の存在は、細胞が、そのＤＮＡ経路に特異的である薬剤に対して耐性であることを示す。一方、欠損がないことは、その細胞がそのＤＮＡ経路に特異的な薬剤に対して感受性があることを示す。
【００５２】
耐性とは、細胞が薬剤に反応することができないことを意味する。例えば、化学療法薬に対する耐性は、その薬物が損傷を受けないか、または薬物によって死滅させられないことを意味する。感受性とは、細胞が薬剤に対し応答することを意味する。例えば、化学療法薬に対する感受性とは、薬物が損傷を受けるか、または薬物によって死滅させられることを意味する。
【００５３】
例えば、ＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対する細胞の反応性は、相同組み換え／ＦＡ経路の欠損を同定することによって特定される。相同組み換え／ＦＡ経路の欠損の存在は、細胞がＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対して感受性であることを示す。一方、欠損がないことは、細胞がＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対して耐性であることを示す。架橋剤としては、例えば、シスプラチンが挙げられる。相同組み換え／ＦＡ経路の阻害剤に対するガン細胞の反応性は、ミスマッチ修復ＤＮＡ経路の欠損を同定することによって特定される。ミスマッチ修復ＤＮＡ経路における欠損の存在は、細胞が相同組み換え／ＦＡ経路の阻害剤に対して感受性であることを示す。一方、欠損がないことは、細胞が、相同組み換え／ＦＡ経路の阻害剤に対して耐性であることを示す。相同組み換え／ＦＡ経路の阻害剤としては、例えば、クルクミン、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、またはアルステルパウロン（ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｏｎｅ）が挙げられる。
【００５４】
治療薬に対するガン細胞の感受性は、１つ以上のＤＮＡ修復経路のタンパク質または遺伝子の活性を阻害するかまたは低下させることによって増大させられる。正常に作動しないＤＮＡ修復経路の数を増大させることによって、ガン細胞がＤＮＡ損傷を修復することができる機構の数を減少させ、それによって細胞を治療薬の作用に対してより感受性にすることができる。例えば、相同組み換え／ＦＡ経路の阻害因子とガン細胞を接触させることによる、ガン細胞のＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対する感受性である。適切な阻害剤としては、ＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤が挙げられる。
【００５５】
細胞中のＤＮＡ修復経路の欠損を決定することにより、特定の細胞について細胞死または損傷を誘導することができる治療薬。その細胞に適している治療薬は、欠損経路以外のＤＮＡ経路を特異的に標的化する。標的化される経路は、様々なタイプのＤＮＡ損傷を修復する経路である。例えば、欠損している経路が一本鎖の断裂を修復する経路である場合には、標的化される経路は二本鎖の断裂を修復する経路である。同様に、欠損している経路が二本鎖の断裂を修復する経路である場合には、標的化される経路は一本鎖を修復する経路である。
【００５６】
あるいは、標的化される経路は、欠損経路の余っていて使われていない（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）経路である。「余っていて使われていない（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）経路」とは、その経路が同様のＤＮＡ損傷を修復することを意味する。例えば、ＢＥＲ、ＮＥＲ、およびＭＭＲは全て、一本鎖の断裂を修復し、したがって、余っていて使われていない経路である。したがって、ＢＥＲ経路が欠損経路である場合には、ＮＥＲまたはＭＭＲ経路が標的化されることが有利である。同様に、ＮＥＲ経路が欠損経路である場合には、ＢＥＲまたはＭＭＲ経路が標的化されることが有利である。同様に、ＭＭＲ経路が欠損経路である場合には、ＮＥＲまたはＢＥＲ経路が標的化されることが有利である。同様に、ＮＨＥＪ経路が欠損経路である場合には、ＨＲ／ＦＡ経路が標的化されることが有利である。同様に、ＨＲ／ＦＡとＮＨＥＪはいずれも二本鎖の断裂を修復し、したがって余っていて使われていない経路である。したがって、ＦＲ／ＦＡ経路が欠損経路である場合には、ＮＨＥＪ経路が標的化されることが有利である。同様に、ＮＨＥＪ経路が欠損経路である場合には、ＨＲ／ＦＡ経路が標的化されることが有利である。
【００５７】
特異的なＤＮＡ修復経路を標的化する薬物は当該分野で公知であり、例えば、表２に列挙される薬物が含まれる。
【００５８】
【表２−１】

【００５９】
【表２−２】

テモゾロミドは、重要な毒性のある損傷の形成を引き起こすアルキル化剤Ｏ−６メチルグアニン（Ｏ−６ＭＧ）である。この損傷を修復するＤＮＡ修復タンパク質であるＭＧＭＴの不活化は、脳腫瘍の患者のより長い生存性と関係があることが示されている（Ｈｅｇｉ ＭＥ，ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０：１８７１−４）。手術することができない膠芽細胞腫におけるさらなる実験もまた、テモゾロミドに対する反応がＭＧＭＴと関係があることを示していた（Ｐａｚ ＭＦ，ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０：４９３３−８）。
【００６０】
ＰＡＲＰ１阻害剤は、現在、腫瘍形成性の適応症について最も広く研究されている薬物のクラスのうちの１つである。いくつかの会社が、異なる化学的タイプのＰＡＲＰ１阻害剤の臨床試験を進めている（Ｒａｔｎａｍ ａｎｄ Ｌｏｗ，２００７にまとめられている）。ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２の欠損（例えば、乳ガンおよび卵巣ガンについての前兆として遺伝的に分類された女性に起こり、そしてこれらはＨＲ経路の２つの重要な因子である）によっては、腫瘍細胞が、ＰＡＲＰ１阻害剤に対して過敏になることが示されている（Ｂｒｙａｎｔら、２００５；Ｆａｒｍｅｒら、２００５）。これらの研究は、臨床試験でのＰＡＲＰ１阻害剤の使用によって追跡調査されており（Ｂｒｏｄｙ，Ｌ．Ｃ．（２００５）Ｔｒｅａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ｗｅａｋｎｅｓｓ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３，９４９−９５０；Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．ら、（２００５）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ＢＲＣＡ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５，３８８−３９３）、これにより、この腫瘍の弱さを標的とするＤＮＡ修復の成分に対する選択的なガン治療の可能性が生じる。ＨＲの欠損のスペクトルの特定は、おそらく、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２を超えて広がり、おそらく、ＨＲ ＤＮＡ修復タンパク質およびＦＡ ＤＮＡ修復タンパク質のうちの任意のものが関与している。
【００６１】
ＡＴＭセリンスレオニンキナーゼは、相同組み換え経路においていくつかの公知の基質を有する。この酵素の阻害は、相同組み換えの不活化を標的化することが明らかにされている（１つの例示的な論文は、Ｈｉｃｋｓｏｎ，Ｉ．ら、（２００４）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ＡＴＭ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４，９１５２−９１５９）。
【００６２】
ＤＮＡＰＫ酵素は、非相同末端結合ＤＮＡ修復経路のセリンスレオニンキナーゼである。ＤＮＡＰＫのキナーゼ活性は、この経路における不可欠な工程を提供する。酵素活性が失われることによるか、または薬物での処理によるＤＮＡＰＫの阻害によっては、処理された細胞の、放射線、および鎖の断裂である他の形態のＤＮＡの損傷に対する感受性が導かれる。
【００６３】
ユビキチンおよびｓｕｍｏリガーゼを標的化する化合物もまた、これらの薬剤についての標的酵素が他のＤＮＡ修復タンパク質を修飾することが公知であるので、ＤＮＡ修復の阻害に関係していると考えられている。ユビキチンおよびＳＵＭＯリガーゼは、相同組み換え、損傷乗り越え修復、ヌクレオチド除去修復、および塩基除去修復の工程の重要な構成成分である。したがって、このクラスの酵素に対する阻害剤は、指定されたＤＮＡ修復経路を遮断するであろう。
【００６４】
複数の方法が、被験体のガンまたは細胞増殖性疾患を処置する、その症状を緩和する、その進行をモニターする、またはその発症を遅らせるために有用である。ガンおよび細胞増殖性障害は、例えば、ガン細胞がＤＮＡ修復経路にて欠損しているか否かを決定すること、そしてＤＮＡ損傷剤または少なくとも１つの異なるＤＮＡ修復経路に特異的な阻害剤を投与することによって処置される。状況に応じて、アップレギュレートされているＤＮＡ修復経路のタンパク質または遺伝子が細胞の中で同定され、そしてＤＮＡ損傷剤または、その中のタンパク質または遺伝子がアップレギュレートされているＤＮＡ修復経路に特異的な阻害剤が投与される。
【００６５】
ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲタンパク質、核酸、または代謝物の有効量の発現によってはまた、ガンまたは細胞増殖性障害の処置の経過をモニターすることも可能となる。この方法においては、生物学的試料は、ガンまたは細胞増殖性障害についての処置（例えば、化学療法による処置）を受けている被験体から提供される。所望される場合には、生物学的試料は、処置の前、処置の間、または処置後の様々な時点で被験体から得られる。その後、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲタンパク質、核酸、または代謝物の有効量の発現が決定され、参照（例えば、そのガンもしくは細胞増殖性障害の状態が明らかである対照個体または集団）、あるいは指標値に対して比較される。参照試料または指標値は、処置を受けてた１つ以上の個体から得ることができるか、または導くことができる。あるいは、参照試料または指標値は、処置を受けていない１つ以上の個体から得ることができるか、または導くことができる。例えば、試料は、ガンまたは細胞増殖性障害についての最初の処置を受け、処置の進行をモニターするために、その後に糖尿病の処置を受けた被験体から集めることができる。
【００６６】
個体の遺伝的構成要素の差異によっては、様々な薬物を代謝するそれらの相対的な能力に差が生じ得る。したがって、本明細書中に開示されるＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲは、薬剤が被験体のガンまたは細胞増殖性障害を処置または予防するために適しているか否かを決定するために、選択された被験体から、推定される治療薬または予防薬を試験することを可能にする。
【００６７】
特異的な被験体に適切である治療薬を同定するためには、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲタンパク質、核酸、または代謝物の１つ以上の被験体に由来する試験試料中での発現が、決定される。
【００６８】
試験試料中でのＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲの発現のパターンが測定され、参照プロフィール（例えば、治療用化合物についての参照発現プロフィール）に対して比較される。比較は、同時に測定されたか、または時間的に異なるタイミングで測定された試験試料と参照試料について行うことができる。後者の例は、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの発現レベルについての情報が集められているコンパイルされた発現情報（例えば、配列データベース）の使用である。
【００６９】
参照試料（例えば、対照試料）が治療用化合物に対して感受性のある細胞に由来する場合には、試験試料と参照試料の中のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲタンパク質の量の類似性は、治療用化合物での処置が有効であるであろうことを示す。しかし、試験試料と参照試料の中のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲの量の変化は、その化合物での処置によってあまり好ましくない臨床結果または予後が生じるであろうことを示す。対照的に、参照試料（例えば、対照試料）が治療用化合物に耐性である細胞に由来する場合には、試験試料と参照試料の中のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲタンパク質の量の類似性は、その化合物での処置によってあまり好ましくない臨床結果または予後が生じるであろうことを示す。しかし、試験試料と参照試料の中のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲの量の変化は、その治療用化合物での処置が有効であるであろうことを示す。
【００７０】
「有効」とは、その処置によって、被験体の中でのＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲタンパク質の量の減少、その大きさの縮小、罹患率の低下、またはガンの転移の可能性の低下が導かれることを意味する。処置が予防的に適用される場合には、「有効」は、その処置により、ガンまたは細胞増殖性障害の形成を遅らせるか、または防ぐことを意味する。ガンおよび細胞増殖性障害の評価は標準的な臨床的プロトコールを使用して行われる。
【００７１】
ガンには、固形腫瘍（例えば、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、肺ガン、腎臓ガン、胃ガン、結腸ガン、精巣ガン、頭頸部ガン、膵臓ガン、脳腫瘍、黒色種）、ならびに、組織形成体の他の腫瘍および血液細胞のガン（例えば、リンパ腫および白血病（急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、およびＢ細胞リンパ腫を含む））が含まれる。
【００７２】
「細胞増殖性障害」には、細胞の増殖、活性化、接着、成長、分化、または移動のプロセスに影響を与える障害が含まれる。本明細書中で使用される場合は、「細胞増殖、活性化、接着、成長、分化、または移動のプロセス」は、それにより細胞の数、大きさ、活性化状態、または含有量が増大するプロセス、それにより細胞が他の細胞とは異なる特徴の特別なセットを生じるプロセス、あるいは、それによって細胞が特定の位置もしくは刺激により近い範囲に移動するか、または特定の位置もしくは刺激から離れるプロセスである。異常に調節された増殖、活性化、接着、分化、または移動を特徴とする「細胞増殖性障害」には、自己免疫疾患および炎症性疾患、例えば、炎症性または免疫系の障害、および／あるいは細胞増殖性障害が含まれる。
【００７３】
被験体は哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物は、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシである。被験体は、ガンまたは細胞増殖性障害を有しているとすでに診断されており、そしてガンまたは細胞増殖性障害についての処置をすでに受けている可能性がある。
【００７４】
被験体は、ガンまたは細胞増殖性障害に罹患しているか、またはそれらを発症するリスクがある。ガンまたは細胞増殖性障害に罹患しているか、またはそれらを発症するリスクがある被験体は、当該分野で公知の方法によって同定される。
【００７５】
「特定のＤＮＡ修復経路に特異的な薬剤」とは、その薬剤によって特定のＤＮＡ修復経路が修正するＤＮＡ損傷のタイプが誘導されることを意味する。
【００７６】
「欠損」とは、細胞が、その経路を通じてＤＮＡ損傷を修復する能力が低下しているかまたはその能力が失われている（ａｂｒｏｇａｔｅｄ）ことを意味する。活性は、（好ましくは、同じ組織に由来する）正常な（すなわち、ガンではない）細胞と比較して決定され得る。経路の欠損は当該分野で公知の方法によって決定される。例えば、ＨＲ修復経路の活性は、ＤＮＡ損傷剤に対して応答する核の中のＲａｄ５１を含む焦点の形成を測定することによって決定することができる。ＨＲ修復経路が欠損している細胞は、そのような焦点を生じる能力がない。Ｒａｄ５１焦点の存在は、標準的な免疫蛍光技術を使用して決定することができる。あるいは、欠損は、発現を測定すること（例えば、対照と比較した増大または低下）、本明細書中に記載される１つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの配列のバリエーションまたは翻訳後修飾を検出することによって決定される。
【００７７】
翻訳後修飾には、例えば、リン酸化、ユビキチン化、ｓｕｍｏ化、アセチル化、アルキル化、メチル化、グリシル化（ｇｌｙｃｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化（ｌｉｐｏｙｌａｔｉｏｎ）、ホスホパンテテイニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、セレン化（ｓｅｌｅｎａｔｉｏｎ）、およびＣ末端アミド生成が含まれる。例えば、相同組み換え／ＦＡ経路における欠損は、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化を検出することによって決定される。同様に、ガン細胞のＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤に対する反応性は、ＭＡＰ２ＫＡＰ２タンパク質のリン酸化を検出することによって決定される。リン酸化は、細胞がＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤に対して反応性であることを示す。対照的に、リン酸化されないことは、細胞がＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤に対して耐性であることを示す。
【００７８】
変異または多形のような配列のバリエーションには、野生型のヌクレオチド配列と比較した、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換が含まれ得る。１つ以上のバリエーションは、核酸配列のコード領域の中に存在する場合も、また、非コード領域の中に存在する場合もあり、そして、ＤＮＡ修復経路の構成成分であるポリペプチドの発現または機能を低下させる場合も、また、完全に失わせる場合もある。言い換えると、変異体核酸は、活性が低下しているかまたは活性を失った変異体ポリペプチドをコードする場合があり、また、例えば、調節エレメントの活性の変化により、細胞の中での発現がほとんどないかもしくは発現が全くない野生型のポリペプチドをコードする場合もある。変異体核酸は、野生型配列と比較して、１個、２個、３個、４個またはそれ以上の変異または多形を有し得る。
【００７９】
ＤＮＡ修復経路の構成成分をコードする核酸の中での１つ以上のバリエーションの存在は、例えば、試験試料の１つ以上の細胞の中で、１つ以上の変異または多形を含むコード核酸配列の存在を検出することによって、あるいは、核酸配列によってコードされる変異体である構成成分のポリペプチドの存在を検出することによって、決定される。
【００８０】
個々のものから得られた試料の中での、特定の核酸配列（例えば、ＤＮＡ修復経路の構成成分の発現もしくは活性を低下させるかまたは失わせる変異あるいは多形を有している核酸配列）の存在あるいはそれが存在しないことを決定するためには、様々な方法を利用できる。さらに、個体または試料の核酸が配列決定されている場合には、配列情報を保有することができ、その後、もともとの核酸自体に頼ることなく検索することができる。したがって、例えば、配列分析ソフトウェアを使用して配列情報のデータベースをスキャンすることにより、配列の変化または変異を同定することができる。
【００８１】
本発明のいくつかの態様にしたがう方法には、試料から得られた核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）に対するオリゴヌクレオチドプローブの結合を決定する工程が含まれ得る。プローブには、１つ以上の変異または多形を含む核酸配列に特異的に結合し、１つ以上の変異または多形を含まない核酸配列には特異的に結合しないヌクレオチド配列が含まれる場合があり、また、その逆である場合もある。オリゴヌクレオチドプローブには標識が含まれる場合があり、プローブの結合は、標識の存在を検出することによって決定することができる。
【００８２】
方法には、標的核酸に対する１つ以上（例えば、２つ）のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーションが含まれ得る。核酸が二本鎖ＤＮＡである場合には、ハイブリダイゼーションの前には、一般的には、一本鎖ＤＮＡを生じさせるための変性が行われるであろう。ハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ手順の一部として行われる場合も、また、ＰＣＲを含まないプロービング手順の一部として行われる場合もある。１つの例示的な手順は、ＰＣＲと低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの組み合わせである。
【００８３】
標的核酸（例えば、ＤＮＡ）に対するプローブの結合は、当業者の活動場所（ｄｉｓｐｏｓａｌ）で、様々な技術のうちの任意のものを使用して測定することができる。例えば、プローブは、放射標識される場合も、蛍光標識される場合も、また、酵素標識される場合もある。プローブの標識を使用しない他の方法としては、制限断片長の多形についての試験、ＰＣＲを使用する増幅、ＲＮ’ａｓｅ切断、および対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのプロービングが挙げられる。プロービングでは、標準的なサザンブロッティング技術が使用され得る。例えば、ＤＮＡは、細胞から抽出することができ、様々な制限酵素で処理することができる。その後、制限断片が、アガロースゲル上での電気泳動によって分離され、その後、変性、ニトロセルロース膜への移動が行われる。標識されたプローブが、膜上のＤＮＡ断片にハイブリダイズさせられ、結合が決定され得る。
【００８４】
当業者は、オリゴヌクレオチドの長さと塩基の組成、温度などの要因を考慮して、選択的なハイブリダイゼーションのための所望されるストリンジェンシーに適している条件を使用することが十分に可能である。１７から３０塩基のオリゴヌクレオチドについての適切な選択的ハイブリダイゼーション条件には、６×ＳＳＣの中で４２℃で一晩のハイブリダイゼーション、および４２℃から６５℃まで連続的に温度を上昇させながらの６×ＳＳＣの中での洗浄が含まれる。他の適切な条件とプロトコールは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：第３版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ＮＹ、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２）に記載されている。
【００８５】
核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはｃＤＮＡ、またはそれらの増幅させられた領域であり得、これらは、その中に多形または変異が存在することを同定するかあるいは決定するために配列決定され得る。多形または変異は、上記に示されるように、得られた配列をその構成成分のデータベース配列と比較することによって同定することができる。具体的には、ポリペプチド構成成分の機能の、ひいては、ＤＮＡ修復経路全体としての無効化または喪失を引き起こす、１つ以上の多形または変異の存在が決定され得る。
【００８６】
配列決定は、標準的な技術の範囲のうちの任意の１つを使用して行われ得る。増幅産物の配列決定には、例えば、イソプロパノールでの沈殿、再懸濁、およびＴａｑＦＳ＋Ｄｙｅターミネーター配列決定キットを使用する配列決定が含まれ得る。伸張産物はＡＢＩ ３７７ ＤＮＡシーケンサー上に電気泳動され得、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒソフトウェアを使用してデータが分析され得る。
【００８７】
ＰＣＲのような、プライマーの１つ以上の対を使用する特異的増幅反応は、核酸配列の中の関心領域（例えば、変異または多形を含むと疑われる配列の部分）を増幅させるために、便利に使用され得る。増幅された核酸は、その後、上記のように配列決定さ得、そして／またはＤＮＡ修復経路の構成成分の発現もしくは活性を低下させるかまたは失わせる変異あるいは多形の存在またはそれが存在しないことを決定するために、任意の他の方法で試験される。適切な増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる（例えば、「ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｉｎｎｉｓら編，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３（１９８７），Ｅｈｒｌｉｃｈ（編），ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９、ならびに、Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６４３−１６５０（１９９１）にまとめられている）。
【００８８】
ガンと関係している変異および多形はまた、変異体（すなわち、突然変異体または対立遺伝子変異体）ポリペプチドの存在を検出することによって、タンパク質レベルで検出される場合もある。
【００８９】
ＤＮＡ修復の欠損として個体由来の試料中のガン細胞を同定する方法には、試料をその経路の変異体（例えば、突然変異体）ポリペプチド構成成分に対して特異的な結合メンバーと接触させる工程、および試料に対する特異的な結合メンバーの結合を決定する工程が含まれ得る。試料に対する特異的な結合メンバーの結合は、試料中の細胞のＤＮＡ修復経路の変異体ポリペプチドである構成成分の存在の指標であり得る。本発明の複数の態様において使用される好ましい特異的結合分子としては、抗体、およびその断片または誘導体（「抗体分子」）が挙げられる。
【００９０】
正常な試料と試験試料に対する結合メンバー（例えば、抗体）の反応性は、任意の適切な手段によって決定され得る。個々のレポーター分子でのタグ化が１つの可能性である。レポーター分子は、検出可能な、そして好ましくは測定可能なシグナルを直接、あるいは間接的に生じ得る。レポーター分子の結合は、直接、または間接的な共有結合（例えば、ペプチド結合による）によって行われる場合も、あるいは、共有結合以外の結合によって行われる場合もある。ペプチド結合による連結は、結合分子（例えば、抗体）とレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組み換え発現の結果であり得る。
【００９１】
本発明の様々な特徴をさらに説明するために、実施例が以下に提供される。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法論を説明する。これらの実施例は、請求される本発明を限定するものではない。
【００９２】
（実施例１）
ｓｉＲＮＡの同定はＦＡ経路が欠損している細胞に対する選択的毒性を標的化する
ＥＵＦＡ３２６細胞株は、患者由来のＦＡ−Ｇ繊維芽細胞株である。この細胞株を、同系のＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株を作成するために、ＦＡＮＣＧを発現する構築物で予め修正した（Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら、Ｂｌｏｏｄ ９６（９）：３２２４−３２３０，２０００）。これらの細胞株は、これらが同等の速度で増殖し、そしてｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでの遺伝子のノックダウンについて同等のレベルを示すことが明らかであるので、スクリーニングの目的のために選択した。
【００９３】
３５６のＤＮＡ損傷応答遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むＱｉａｇｅｎ ＤＮＡ修復ｓｉＲＮＡライブラリーを、スクリーニングアッセイに使用した。このライブラリーの特徴は、的外れな作用のリスクを低下させるために、それぞれの個々の遺伝子を標的化する２つの個々のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むことである。図１は、ＦＡ経路が欠損している細胞に必要なＤＮＡ損傷応答遺伝子の同定を示す。図１、パネルＡは、ｓｉＲＮＡスクリーニングの模式図を示す。細胞を、１日目に１ウェルあたり１０００個の細胞で、９６ウェルプレートにプレートした。２日目には、それぞれのウェルを、１つのＤＮＡ損傷応答遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。６日目には、細胞の生存性を、ＡＴＰ活性化生体発光アッセイを使用して測定した。スクリーニングを２回繰り返した。
【００９４】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションの後、ＥＵＦＡ３２６細胞株とＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株との間での相対的な生存性を、それぞれのオリゴヌクレオチドについて計算した。アッセイを２回繰り返し、ＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株に対するＥＵＦＡ３２６細胞株の平均の相対的生存性を、それぞれの遺伝子標的について計算した。それぞれの遺伝子に標的についての平均の標準誤差（ＳＥＭ）とともに、ＥＵＦＡ３２６細胞株とＥＵＦＡ３２６Ｅ細胞株との間での平均の相対的生存性を、４回の別々の測定から計算した。それぞれのｓｉＲＮＡ標的についての４つの生存性の値は、個々の遺伝子を標的化する２つのオリゴヌクレオチドによる２連の結果を示す。表３は、修正されたＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株と比較して、ＦＡ経路が欠損しているＥＵＦＡ３２６細胞に対して選択的に毒性である、上位１０個のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド標的を示す。図１、パネルＢには、ＥＵＦＡ３２６Ｃ修正細胞株と比較した場合に、ＦＡ経路が欠損しているＥＵＦＡ３２６細胞株に対して選択的に毒性である上位１０個のｓｉＲＮＡ標的がグラフによって示される。Ｙ軸は、ＥＵＦＡ３２６修正細胞株と比較したＥＵＦＡ３２６細胞株の相対的生存性を示す。４回の測定によるＳＥＭが標的について提供される。ＧＦＰは、哺乳動物ではない標的を用いた場合の対照ｓｉＲＮＡである。
【００９５】
重要なことは、塩基除去修復遺伝子ＰＡＲＰ１またはＮＥＩＬ１のいずれかのノックダウンが、ＦＡ経路が欠損している細胞に対して選択的毒性があり、修正された細胞と比較して、ＰＡＲＰ１ノックダウンについては６４％、そしてＮＥＩＬ１ノックダウンについては７４％の相対的生存率があったことが明らかになったことである。これは、ＦＡ経路が欠損しているＭＥＦ細胞がＰＡＲＰ阻害剤によるＢＥＲの破壊に対して選択的に感受性があるという最近の実験報告（ＭｃＣａｂｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６（１６）：８１０９−８１１５，２００６）と一致しており、スクリーニングアッセイが、新規の標的と、複数のＤＮＡ修復経路の間での関係を明らかにするための有効なアプローチであることを示している。加えて、ＤＮＡ修復経路における他のタンパク質の枯渇もまた、上記実験において細胞の生存性の低下を導く。例えば、ＥＵＦＡ３２６／ＥＵＦＡ３２６Ｇ生存性の比もまた、他のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷応答遺伝子のｓｉＲＮＡノックダウンによって変化した（表３）。
【００９６】
したがって、ＰＡＲＰ１および他のＢＥＲ酵素（例えば、ＮＥＩＬ１、他のウラシルデグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｓ）、ＤＮＡポリメラーゼβ）の阻害剤、ならびに、タンパク質：タンパク質結合の崩壊によるＢＥＲ作用の阻害剤は、本発明において記載されるように、ＤＮＡ修復とＤＮＡ損傷応答経路の活性／枯渇を監視することを含む、生体マーカーストラテジーを組み入れることによって、臨床において有用性を有し得る。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の調節、ならびに／またはタンパク質レベルを同定するＤＮＡＲ生体マーカーは、ＤＮＡ修復および／またはＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のうちの１つの１つ以上の標的タンパク質メンバーを阻害する薬物、および薬物のクラスに特に関係がある。
【００９７】
本実施例に示すように、１つのタイプのＰＡＲＰ１阻害剤（ＰＡＲＰ１についてのｓｉＲＮＡ）を、ＦＡ遺伝子が枯渇している細胞の過敏性を定義するために使用した。ｓｉＲＮＡ実験に加えて、ＰＡＲＰ１の選択的阻害剤（例えば、低分子、ペプチド、治療用抗体、および他の生物製剤（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））は同様の結果を有するであろうと推測された。ＰＡＲＰ１阻害剤は、単剤療法として、あるいは、他の化学療法薬または放射線との併用療法として、腫瘍学における処置の決定のために評価される臨床材料に対して適用されると、選択的有用性を有し得る。ファンコニ貧血経路についてのＤＮＡＲ生体マーカーによって定義されているガンを有している患者は、ＰＡＲＰ１阻害剤に対して特に感受性があるかまたは耐性である患者のサブセットを同定することが期待される。ＤＮＡ修復および損傷経路の１つ以上のＤＮＡ修復状態を理解することは、薬物のクラスの反応性対耐性の重要な決定要因である。
【００９８】
本明細書中に示されるようなＤＮＡ修復の欠損をモニターすることは、化学療法に加えて、標的特異的治療法に対する腫瘍の反応性を評価することを意味する。ＤＮＡ修復経路（ＦＡ欠損）の分子をモニタリングすることによるＤＮＡ修復の変化と、他の経路の変化を同定することとのつながりをさらに評価するために、第２のＤＮＡ修復またはＤＮＡ損傷タンパク質の阻害剤とのインキュベーションを使用した。変化したＤＮＡ修復状態が既知である細胞が他の同定された経路のタンパク質の阻害に対して過敏である場合には、細胞が第２のタンパク質および経路に過剰に依存するようになることの暗示である。
【００９９】
したがって、ＦＡ欠損とＰＡＲＰ１との間のつながりの同定もまた、ＰＡＲＰ１阻害剤に対するこれらの細胞の過敏性を試験することによって試験した。ＦＡＮＣＡ欠損細胞を、レトロウイルス形質導入によって導入されたＦＡＮＣＡ遺伝子で補われたＦＡＮＣＡ欠損細胞と比較した。図３４に示す実験においては、ＦＡＮＣＡ欠損細胞は、ＰＡＲＰ１阻害剤である４−アミノ−１，８−ナフタリミドに対して特異的感受性があった。この知見は、ＤＮＡ修復経路の変化（ＦＡの欠損）の一例の評価を、別のタンパク質または経路の阻害剤の適用に直接使用できることを示している。この発見の適用は、腫瘍学における有用な治療用のストラテジーであろう。
【０１００】
（実施例２）
ＦＡ経路とＡＴＭ機能を同時に失うことは細胞にとって有毒である
興味深いことに、ＴＰ５３ＢＰ１またはＡＴＭのノックダウンは、ＦＡ経路が欠損しているＥＵＦＡ３２６細胞に対して選択的に毒性であり、ＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株と比較した場合には、それぞれ、６０％および７０％の相対的生存率を有していた（表３および図１Ｂ）。ＮＢＳ１のノックダウンもまた、ＥＵＦＡ３２６細胞の選択的毒性を明らかにしたが、対照ｓｉＧＦＰオリゴヌクレオチドを用いた場合と、生存性のＳＥＭは重複していた（表３および図１Ｂ）。ＮＢＳ１とＴＰ５３ＢＰ１は、二本鎖のＤＮＡの断裂（ＤＳＢ）に対するＡＴＭによって媒介される応答に関係していることがこれまでに報告されている。したがって、これらのデータは、ＦＡ経路が欠損している細胞におけるＡＴＭ ＤＳＢシグナル伝達経路に対する過剰な依存性を示していた。
【０１０１】
ＦＡ経路が欠損している細胞にＡＴＭ機能が必要であることを確認するために、ＥＵＦＡ３２６細胞株とＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株に別のＡＴＭ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。図２は、ＦＡ経路とＡＴＭ機能が合わせて失われることが細胞にとって有毒であることを示す。図２、パネルＡの、ウェスタンブロットのレーン１および３と、グラフの棒１および３は、ＦＡ経路が欠損しているＥＵＦＡ３２６細胞株を示す。ウェスタンブロットのレーン２および４と、７２時間の生存性のグラフの棒２および４は、修正されたＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株を示す。それぞれの細胞株を、対照であるＧＦＰ ｓｉＲＮＡ（レーン１および２）またはｓｉＲＮＡ標的化ＡＴＭ（レーン３および４）で、７２時間処理した。生存性は、個々の細胞株についてのｓｉＲＮＡ処理を行わなかった対照に対する割合（％）として表す。図２、パネルＢにおいては、ウェスタンブロットのレーン１および３と、７２時間の生存性のグラフの棒１および３は、ＡＴＭ欠損ＡＴ２２細胞株を示し、ウェスタンブロットのレーン２および４と、生存性のグラフの棒２および４は、ＡＴ２２−ＡＴＭ修正細胞株を示す。それぞれの細胞株は、対照であるＧＦＰ ｓｉＲＮＡ（レーン１および２）またはｓｉＲＮＡ標的化ＦＡＮＣＧ（レーン３および４）で７２時間処理した。生存性は、個々の細胞株についてのｓｉＲＮＡ処理を行わなかった対照に対する割合として表す。図２、パネルＣは、Ｆａｎｃｇ＋／− ＡＴＭ＋／−異種交配マウスの子孫における遺伝子型の頻度のグラフによる提示を示す。黒色の棒は、それぞれの遺伝子型についての測定した頻度を示し、一方、白色の棒は、メンデル遺伝学によって計算した頻度を示す。
【０１０２】
スクリーニングの結果と一致して、ＥＵＦＡ３２６細胞株は、ＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株（ＧＦＰｓｉ対照の７５．５％の生存率）よりもＡＴＭノックダウン（ＧＦＰｓｉ対照の５４．９％の生存率）に対してより感受性が高かった（図２Ａ）。ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化は、ＦＡ経路の活性化のマーカーである（Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７（２）：２４９−２６２，２００１）。ＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株においては、ＡＴＭ ｓｉＲＮＡでの処理により、ＧＦＰｓｉ対照（図２Ａ、レーン２）と比較してウェスタンブロッティングによって示されるように、ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化が生じ（図２Ａ、レーン４）、このことは、ＦＡ経路が、外部からの遺伝子毒性のストレスがない場合にもなお、ＡＴＭの発現が失われることによって活性化されることを示している。
【０１０３】
ＦＡ経路が欠損している細胞は、ＡＴＭの発現を失うことを寛容できないので、逆もまた真であるかどうか、すなわち、ＡＴＭ欠損細胞がＦＡ経路の喪失に対して感受性があるかどうかを問うた。ＡＴＭ欠損ＡＴ２２細胞、および同系のＡＴＭ修正細胞株を、ｓｉＲＮＡ標的化ＦＡＮＣＧでトランスフェクトし、細胞の生存性を７２時間で測定した（図２Ｂ）。ＡＴＭ欠損細胞株は、修正された細胞株（ＧＦＰｓｉ 対照の７３．１％の生存性）よりもＦＡＮＣＧの喪失に対して感受性が高く（ＧＦＰｓｉ対照の５８．３％の生存性）、このことは、ＦＡ経路とＡＴＭ機能の両方を同時に失うことが細胞にとって有毒であるとの仮説をさらにサポートしている。ＡＴＭ上のセリン１９８１のリン酸化は、ＡＴＭ活性化のマーカーとしてこれまでに報告されている（Ｂａｋｋｅｎｉｓｔ ａｎｄ Ｋａｓｔａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４２１（６９２２）：４９９−５０６，２００３）。ＦＡＮＣＧに対するｓｉＲＮＡでの処理によっては、ＧＦＰ対照ｓｉＲＮＡで処理した同じ細胞株（図２Ｂ、レーン２）と比較して、ウェスタンブロットによって測定した場合には、ＡＴＭ修正細胞株においてＡＴＭ自己リン酸化が生じた（図２Ｂ、レーン４）。これらの結果は、ＡＴＭがＦＡ経路の喪失に応答して活性化されることを示していた。
【０１０４】
ガンの処置におけるＤＮＡ応答経路の標的化の確認が、２つのグループによって最近明らかにされている。これらの前臨床的実験においては、塩基除去修復の構成成分であるＰＡＲＰ１の阻害により、ＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ２が欠損している（したがって、相同組み換えが欠損している）細胞に対する特異的な毒性が生じたが、ＤＮＡ修復の細胞構成成分に対しては小さな影響しか有していなかった（Ｂｒｙａｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ ４３４（７０３５）：９１３−９１７，２００５；Ｆａｒｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４３４（７０３５）：９１７−９２１，２００５）。
【０１０５】
ＦＡ経路の欠損は、多数の様々な腫瘍のタイプにおいて報告されており、したがって、別のＤＮＡ損傷応答経路の阻害が、ＦＡ経路の機能を失った細胞に対して選択的に毒性であり得るかどうかを問うた。ｓｉＲＮＡスクリーニングアプローチによって、ＦＡ経路が欠損している細胞の生存に必要であるとして、ＡＴＭ ＤＮＡ損傷応答キナーゼを同定した。さらに、ＡＴＭ欠損細胞は、ＦＡＮＣＧの喪失に対して感受性があり、このことは、ＡＴＭとＦＡ経路機能の両方を合わせて喪失することが細胞にとって有害であることを示している。興味深いことに、ＦＡ経路が欠損している細胞は、ＡＴＭの構成的活性化を有することが明らかであり、これは、細胞周期のＳ期の間に優性であった。ＡＴＭはＦＡ経路が欠損している細胞の中で活性であったが、活性のレベルは放射線照射した細胞と比較した場合には、比較的低かった。これらのデータは、ＡＴＭの活性化を生じる内因性のＤＮＡの損傷は比較的低レベルであり、ほとんどがＤＮＡ合成の間に生じることを示している。これは、ＦＡＮＣＡまたはＦＡＮＣＤ２について免疫枯渇状態にあるアフリカツメガエルの卵細胞が正常な細胞と比較して、ＤＮＡ複製の間に自発的なＤＳ ＤＮＡの断裂を高いレベルで有することを明らかにした最近の研究と一致している（Ｓｏｂｅｃｋら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２６（２）：４２５−４３７，２００６）。ヒトＦＡ細胞株の中で観察された低レベルのＡＴＭ活性化は、これらの自発的なＳ期でのＤＮＡの断裂に応答すると予想される。ｓｉＲＮＡによるＡＴＭの阻害によりＦＡ経路が欠損している細胞において選択的な細胞死を生じることの観察は、このＡＴＭのＳ期活性化が、比較的低いにもかかわらず、細胞の生存に重要であることを示している。
【０１０６】
したがって、Ａｔｍキナーゼおよび他のＤＮＡ損傷シグナル伝達工程の阻害剤は、本発明に記載されるように、ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷応答経路の活性／枯渇を監視することを含む、生体マーカーストラテジーの取り込みにより、臨床で高い有用性を有し得る。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の調節ならびに／またはタンパク質レベルを同定するＤＮＡＲ生体マーカーは、ＤＮＡ修復および／またはＤＮＡ損傷シグナル伝達経路のうちの１つの１つ以上の標的タンパク質メンバーを阻害する薬物、ならびにそのような薬物のクラスと特に関係している。
【０１０７】
実施例２〜７に示すように、Ａｔｍの選択的阻害剤（例えば、小分子、ペプチド、治療用抗体、および他の生物製剤）は同様の結果を有するであろうと推測される。Ａｔｍ阻害剤は、腫瘍学において処置の決定のために評価される臨床材料に対して適用される場合には、単剤療法として、または他の化学療法薬もしくは放射線治療との併用療法として、選択的有用性を有し得る。ファンコニ貧血経路についてのＤＮＡＲ生体マーカーによって定義されているガンを有している患者は、Ａｔｍ阻害剤に対して特に感受性があるかまたは耐性である患者のサブセットを同定することが期待されるであろう。ＤＮＡ修復および損傷経路の１つ以上のＤＮＡ修復状態を理解することは、薬物のクラスの反応性対耐性の重要な決定要因である。
【０１０８】
（実施例３）
マウスのＦａｎｃｇとＡｔｍの二重ノックアウトは胚性致死を生じる
ＡＴＭ経路は、ＦＡＮＣＤ２のＡＴＭによって媒介されるリン酸化を通じた電離放射線処理後にＦＡ経路に収斂することが知られている（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｃｅｌｌ １０９（４）：４５９−４７２，２００２）。したがって、ＦＡおよびＡＴＭ経路を、Ｆａｎｃｇ＋／− Ａｔｍ＋／−マウスの異種交配によって研究した。一貫した観察は、Ａｔｍ−／− Ｆａｎｃｇ−／−子孫の着床前の致死である（図２Ｃ）。表４は、メンデル遺伝学によって推定した頻度と比較した、交配させたＦａｎｃＧ＋／− Ａｔｍ＋／−マウス由来の子孫の遺伝子型の頻度を示す。興味深いことに、Ｆａｎｃｇ＋／− Ａｔｍ−／−先祖とＦａｎｃｇ−／− Ａｔｍ＋／−先祖もまた、メンデル遺伝学によって予想されたよりも低い頻度を有していた（それぞれ、１２．５％対１６．４７％、および８．５４％対１２．５％）。ＦＡＮＣＧ−／− ＡＴＭ−／−マウスが生存できないこと（図２Ｅおよび表４）がさらに、ＦＡ経路が存在しない状況でのＡＴＭの機能の重要性を強調している。これらのデータは、ｓｉＲＮＡスクリーニングと一致しており、細胞がＡＴＭとＦＡ経路の機能の両方を失うことを寛容できないであろうことを示している。
【０１０９】
（実施例４）
ＦＡ経路が欠損している細胞は、ＤＮＡの断裂を防ぐためにＡＴＭの構成的な活性化を示す
ＦＡ経路が欠損している細胞のＡＴＭ機能の喪失に対する感受性の根底にある機構もまた研究した。ＦＡ経路が機能性である細胞とＦＡ経路が欠損している細胞の同系の対に由来するタンパク質を抽出し、ＡＴＭの自己リン酸化をウェスタンブロッティングによって測定した。
【０１１０】
図３は、ＦＡ経路が欠損している細胞がＡＴＭの構成的な活性化を示すことを示している。図３、パネルＡは、ＦＡＮＣＧ欠損ＥＵＦＡ３２６細胞株（レーン１）と同系の修正された細胞株（レーン２）との間でＡＴＭの自己リン酸化を比較するウェスタンブロットを示す。図３、パネルＢは、ＦＡＮＣＣ欠損ＥＵＦＡ４２６細胞株（レーン１）と同系の修正された細胞株（レーン２）との間でＡＴＭの自己リン酸化を比較するウェスタンブロットを示す。図３、パネルＣは、ＦＡＮＣＡ欠損ＥＵＦＡ６９１４細胞株（レーン１）と同系の修正された細胞株（レーン２）との間でＡＴＭの自己リン酸化を比較するウェスタンブロットを示す。図３、パネルＤは、ＦａｎｃＧ−／− ＭＥＦ細胞株（レーン１）とＦａｎｃＧ野生型ＭＥＦ細胞株（レーン２）との間でＡＴＭの自己リン酸化を比較するウェスタンブロットを示す。図３、パネルＥは、組み換え体ｐ５３上のセリン１５に対する、ＦＡ経路が欠損しているＥＵＦＡ３２６細胞とＦＡ経路が完全であるＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞から免疫沈降させたＡＴＭのキナーゼ活性を比較するＡＴＭキナーゼアッセイを示す。図３、パネルＦは、ベースライン（レーン１および２）と１０Ｇｙの電離放射線の照射の６時間後（レーン３および４）の、ＦＡ経路が欠損しているＥＵＦＡ３２６細胞（レーン１および３）とＦＡ経路が修正されたＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞（レーン２および４）の中でのＡＴＭ自己リン酸化とＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化を評価するウェスタンブロットを示す。図３、パネルＧは、ＡＴＭに対するｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの７２時間後の、ＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞に対してＥＵＦＡ３２６細胞中でのＤＮＡ断裂を比較するＣｏｍｅｔアッセイを示す。パネル（ｉ）は、Ｃｏｍｅｔアッセイによって測定したＤＮＡ損傷のグラフによる記述を示す。Ｙ軸は、ＤＮＡ断裂の尺度であるｃｏｍｅｔ末端の長さを示す。黒色の棒はＥＵＦＡ３２６細胞株を示し、白色の棒はＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株を示す。棒１および２については、細胞を、対照である、ＧＦＰに対するｓｉＲＮＡで処理した。棒３および４については、細胞を、ＡＴＭを標的化するｓｉＲＮＡで処理した。ＳＥＭは、２回の実験での１００回のカウントにより、それぞれの棒について示す。パネル（ｉｉ）は、７２時間での、ＡＴＭ ｓｉＲＮＡで処理した３２６Ｇ細胞株の典型的な領域を示す。パネル（ｉｉｉ）は、７２時間での、ＡＴＭ ｓｉＲＮＡで処理した３２６細胞株の典型的な領域を示す。
【０１１１】
それぞれの場合において、ＦＡ欠損細胞株ＥＵＦＡ３２６（ＦＡＮＣＧ欠損）、ＥＵＦＡ４２６（ＦＡＮＣＣ欠損）、ＥＵＦＡ６９１４（ＦＡＮＣＡ欠損）株は、同系の修正された細胞株であるＥＵＦＡ３２６＋ＦＡＮＣＧ、ＥＵＦＡ４２６＋ＦＡＮＣＣ、ＥＵＦＡ６９１４＋ＦＡＮＣＡ（図３Ａ〜Ｃ、それぞれのブロットのレーン２）と比較して、ＡＴＭの構成的な活性化を示した（図３Ａ〜Ｃ、それぞれのブロットのレーン１）。ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化のベースラインレベルにより、対応するＦＡ経路が欠損している細胞株と比較して、それぞれの修正された細胞株において正常なＦＡ経路機能を確認した（図３Ａ〜Ｃ、それぞれのブロットにおいてレーン１に対してレーン２を比較）。セリン１９８７でのＡｔｍの自己リン酸化もまた、Ｆａｎｃｇ野生型マウスから採取したＭＥＦＳに対してＦａｎｃｇ欠損マウスに由来する一次ＭＥＦＳの中でのＡｔｍの活性化の尺度として実験した（図３Ｄ）。ヒト繊維芽細胞株と一致して、Ｆａｎｃｇ欠損ＭＥＦＳは、Ｆａｎｃｇ野生型ＭＥＦＳ（図３Ｄ、レーン１）と比較すると、Ａｔｍのベースライン活性化を有していた（図３Ｄ、レーン２）。Ｆａｎｃｄ２のベースラインのモノユビキチン化もまた、Ｆａｎｃｇ−／−細胞株と比較してＦａｎｃｇ＋／＋ＭＥＦ細胞において観察し、これは、野生型細胞における機能性のＦＡ経路を示していた（図３Ｄ、レーン１に対してレーン２を比較）。
【０１１２】
ＦＡ細胞の中でのＡＴＭの構成的活性化をさらに確認するために、インビトロでのキナーゼアッセイを、ＥＵＦＡ３２６細胞株とＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株から採取した溶解物中のＡＴＭ活性について行った。ウェスタンブロットのデータと一致して、ＦＡＮＣＧ変異ＥＵＦＡ３２６細胞株から免疫沈降させたＡＴＭは、修正されたＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株（図３Ｅ、レーン２）と比較して、組み換え体ｐ５３のＡＴＭによって媒介されるリン酸化の増加を示した（図３Ｅ、レーン１）。
【０１１３】
次に、ＦＡ経路が欠損している細胞のなかで観察されたＡＴＭの活性化が、ＡＴＭ機能の異常調節が原因であるかどうかを問うた。ＡＴＭは、電離放射線によって強く活性化される。したがって、ＥＵＦＡ３２６細胞とＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞に１０Ｇｙｓの電離放射線を照射し、ウェスタンブロッティングによってＡＴＭの自己リン酸化を測定した（図３Ｆ）。ＦＡ経路が欠損している細胞株（ＥＵＦＡ３２６）と修正された細胞株（ＥＵＦＡ３２６Ｇ）のいずれにおいても、照射によっては、ＡＴＭの自己リン酸化の顕著な増大が生じ、このことは正常なＡＴＭ活性化を示していた（図３Ｆ、レーン１および２をレーン３および４と比較）。興味深いことに、ＥＵＦＡ３２６細胞株は、修正された細胞株よりも大きなＡＴＭ活性化を示し（図３Ｆ、レーン３と４を比較）、このことは、ＡＴＭがＤＮＡの損傷後のＦＡ経路機能の喪失を埋め合わせることができるモデルをサポートしている。
【０１１４】
ＡＴＭは、ＤＮＡの中の二本鎖の断裂（ＤＳＢ）に対する応答に関係している。したがって、ＦＡ経路が欠損している細胞の中での構成的なＡＴＭの活性化が自発的なＤＮＡの断裂の修復に必要であり得るかどうかを問うた。この疑問に着手するために、ＦＡＮＣＧ欠損ＥＵＦＡ３２６細胞株と修正されたＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株をＡＴＭを標的化するｓｉＲＮＡ、または対照ＧＦＰ配列で処理し、７２時間後にそれぞれの細胞株について単細胞電気泳動（Ｃｏｍｅｔアッセイ）を行った。それぞれの細胞株によるＣｏｍｅｔ末端の平均の長さが、細胞１個あたりのＤＮＡ断裂の平均数の尺度である。対照ｓｉＲＮＡを用いた場合には、ＥＵＦＡ３２６細胞株は、修正されたＥＵＦＡ３２６Ｇ細胞株と比較して、２倍多い数のＤＮＡ断裂を示した。このことは、ＦＡ経路が欠損している細胞が、ＦＡ経路が機能的である細胞と比較して、より多量の自発的なＤＮＡ断裂を有することが報告された他の実験と一致する。ＡＴＭを標的化するｓｉＲＮＡでの処理の後、ＥＵＦＡ３２６細胞株は、５７．６％のＤＮＡ断裂の増加を有していたＥＵＦＡＧ細胞株と比較して、９２．０％のＤＮＡ断裂の増加を示した。これらのデータは、ＦＡ経路が欠損している細胞の中での構成的なＡＴＭの活性化が、内因性のＤＮＡ損傷後のＤＮＡの断裂の蓄積を防ぐためには不可欠であることを示している。
【０１１５】
（実施例５）
ＦＡ経路が欠損している細胞はＡＴＭ阻害剤ＫＵ５５９３３に対して感受性である
化合物ＫＵ５５９３３がＡＴＭの高特異的競合ＡＴＭ結合部位阻害剤であることが、最近報告されている（Ｈｉｃｋｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４（２４）：９１５２−９１５９，２００４）。ｓｉＲＮＡのデータの観点から、ＦＡ経路が欠損している細胞がこの阻害剤での処理に対して選択的に感受性であるはずであることが、この理由である。この仮説を試験するために、漸増用量のＫＵ５５９３３で処理した、ＦＡ経路が欠損している細胞株と修正された細胞株の同系の対の用量生存性曲線を比較した。図４は、ＦＡ経路が欠損している細胞がＡＴＭ阻害剤ＫＵ５５９３３に対して選択的に感受性であることを示している。標準誤差の棒を伴う３回の別々の実験による７２時間の用量生存性曲線（未処理の対照に対する割合（％）として計算した）は、漸増濃度のＫＵ５５９３３に対する反応を比較する。図４、パネルＡは、同系のＦＡ経路が修正された細胞株（点線）に対してＦＡＮＣＣ欠損ＥＵＦＡ４２６細胞（実線）を示す。図４、パネルＢは、同系のＦＡ経路が修正された細胞株（点線）に対してＦＡＮＣＧ欠損ＥＵＦＡ３２６細胞（実線）を示す。図４、パネルＣは、同系のＦＡ経路が修正された細胞株（点線）に対してＦＡＮＣＤ２欠損ＰＤ２０細胞（実線）を示す。図４、パネルＤは、同系のＦＡ経路が修正された細胞株（点線）に対してＦＡＮＣＥ欠損ＤＦ１１７９細胞（実線）を示す。図４、パネルＥは、Ｆａｎｃｇ＋／＋ ＭＥＦ細胞（点線）に対してＦａｎｃｇ−／− ＭＥＦ細胞（実線）を示す。図４、パネルＦは、同系のＦＡＮＣＣが修正された細胞株（レーン１および２）に対してＦＡＮＣＣ変異体ＥＵＦＡ４２６細胞（レーン１および２）の中のコロニーの数を比較する、１４日のコロニーカウントアッセイを示す。レーン１および３は、未処理の対照を示す。レーン２および４は、播種の前に１０μＭのＫＵ５５９３３で２４時間処理した細胞を示す。コロニー数は、それぞれの細胞株について、未処理の対照に対する割合（％）として示す。実験を３回繰り返し、平均の標準誤差をそれぞれのデータのセットについて示す。図４、パネルＧは、ＦＡＮＣＣ変異体ＥＵＦＡ４２６細胞株（レーン１および３）と同系のＦＡＮＣＣが修正された細胞株（レーン２および４）の中でのＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化、ＡＴＭの自己リン酸化、およびＨ２ＡＸのリン酸化を比較するウェスタンブロット示す。レーン１および２は、未処理の対照を示す。レーン３および４は、１０μＭのＫＵ５５９３３で２４時間処理した細胞を示す。ＫＵ５５９３３に対するＦａｎｃＧ−／− ＭＥＦの感受性もまた、野生型ＭＥＦと比較して試験した。それぞれの場合において、ＦＡ経路が欠損している細胞株は、ＫＵ５５９３３に対して高い感受性を示した。それぞれの場合のＫＵ５５９３３についての有効用量の範囲は５μＭから２０μＭの間であり、これは、特異的なＡＴＭの阻害についての以前に公開された濃度範囲に相当していた（Ｈｉｃｋｓｏｎら、２００４）。
【０１１６】
ＦＡ経路が欠損している細胞において観察されたＫＵ５５９３３に対する感受性がアッセイ依存性ではないことを確認するために、コロニーカウントを、ＦＡＮＣＣ変異体細胞株と修正されたＥＵＦＡ４２６細胞株を使用して行った。この細胞株は、これが低密度で播種された場合にははっきりと見えるコロニーを形成するとの理由から選択した。それぞれの細胞株を１０μＭのＫＵ５５９３３で２４時間処理し、その後、細胞をコロニーカウントアッセイのために播種した。１４日後、ＦＡＮＣＣ変異体細胞株は、ＦＡ経路の能力が高いＥＵＦＡ４２６Ｃ細胞株と比較して、コロニーのおよそ５０％の減少を示した（図４Ｆ）。
【０１１７】
ＥＵＦＡ４２６細胞とＥＵＦＡ４２６Ｃ細胞をコロニーカウントアッセイのために播種したのと同時に、一定の割合をウェスタンブロッティングによるＡＴＭおよびＦＡＮＣＤ２活性の分析のために回収した。ＫＵ５５９３３での処理の後は、ＡＴＭのリン酸化はもはやＥＵＦＡ４２６細胞株の中では観察されず、これは完全な阻害と一致していた（図４Ｇ、レーン１および３を比較）。興味深いことに、Ｈ２ＡＸのリン酸化もまた減少し、これは、ＡＴＭがＦＡ経路が欠損している細胞の中でのＨ２ＡＸのリン酸化を主に担っていることを示している（図４Ｇ、レーン１および３を比較）。ＦＡ経路が機能的であるＥＵＦＡ４２６Ｃ細胞株の中でのＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化の増加もまた、未処理の対照（図４Ｇ、レーン２）と比較して、ＫＵ５５９３３での処理の後に観察された（図４Ｇ、レーン４）。この結果は、ＦＡ経路がＫＵ５５９３３によるＡＴＭ活性の阻害後に活性化されることを示している。
【０１１８】
最近まで、ＡＴＭの薬理学的阻害は、ＡＴＲおよびＤＮＡ−ＰＫをもまた標的化するＷｏｒｔｍａｎｉｎのような薬物を用いた場合には、比較的非特異的であった。最近、特異的ＡＴＭ阻害剤であるＫＵ５５９３３が開発され、有効濃度でのこれらの的外れな作用を示さないことが報告されている（Ｈｉｃｋｓｏｎら、２００４）。この薬物がＦＡ経路が欠損している細胞に対して選択的に毒性であり得るかどうか、それにより、ＦＡ経路が欠損している腫瘍についての可能な処置ストラテジーが提供されるかどうかを問うた。試験したＦＡ細胞株においては、ＦＡ経路機能の喪失はＫＵ５５９３３に対して細胞を特異的に感作させ、このことは、この化合物が治療的役割を有している可能性があることを示唆していた。
【０１１９】
ＫＵ５５９３３でのＦＡ経路が欠損している細胞の処理によっては、修正された細胞株と比較して、顕著な染色体の断裂が生じた。これらの染色体の断裂は、ほぼおそらく、Ｓ期の間に修復されなかったＤＳ ＤＮＡの断裂の残留を示している。興味深いことに、ＦＡ経路の能力が高い細胞株においては染色体の断裂の証拠は存在せず、このことは、ＦＡ経路がＤＳ ＤＮＡの断裂を伴わずに効率よくフォークを修復し、それによってＡＴＭの必要性をなくしたか、あるいは、ＦＡ経路がＡＴＭとは無関係にＤＳ ＤＮＡを修復できたかのいずれかを示唆している。第２の仮説のサポートにおいては、ＦＡ経路の高い活性が、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化の増大によって測定されるように、ＫＵ５５９３３での処理後にＦＡ経路が完全である細胞の中で観察された。
【０１２０】
まとめると、これらのデータは、ＦＡ経路が欠損している細胞に対するＫＵ５５９３３によって媒介される細胞毒性の特異性を示している。ガン治療に関して、これは、これがＡＴＭ阻害剤についての正常細胞とガン細胞との間での可能な治療ウィンドウを示すとの理由から期待されている。さらに、腫瘍組織の中でのＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化の喪失または構成的なＡＴＭの活性化の存在の同定により、このタイプの処置について患者を選択するための有用な生体マーカーが示され得る。
【０１２１】
（実施例６）
ＫＵ５５９３３での処理はＦＡ経路が欠損している細胞において染色体の断裂と細胞死を生じる
ＡＴＭは主に二本鎖ＤＮＡの断裂に応答し、そして上記データはＦＡ経路が欠損している細胞の中での必要性を示していたので、これらの細胞がＫＵ５５９３３での処理の後に染色体の断裂を示す場合があると仮定した。このことを試験するために、ＦＡＮＣＥ変異体リンパ芽球細胞株（ＥＵＦＡ１１７９）と修正されたリンパ芽球細胞株（ＥＵＦＡ１１７９Ｅ）を使用した。ＦＡＮＣＥ修正細胞株ＥＵＦＡ１１７９については、ＦＡＮＣＥ変異体ＥＵＦＡ１１７９細胞株と比較して、マイトマイシンＣによって誘導された染色体の断裂の完全な修正が明らかになり、このことは、ＦＡ経路の完全な修正を示している。したがって、これらの細胞株は、ＫＵ５５９３３での処理の後のゲノムの安定性に対するＦＡ経路の状態の影響を測定するためには理想的であった。
【０１２２】
図５は、ＫＵ５５９３３での処理が、ＦＡ経路が欠損している細胞においては選択的な染色体の断裂と細胞死を生じることを示す。図５、パネルＡは、２０μＭのＫＵ５５９３３での処理の０時間後、２４時間後、および４８時間後の有糸分裂中期スプレッド（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｓｐｒｅａｄ）について測定した、細胞１個あたりの染色体断裂の数のグラフによる提示を示す。黒色の棒は、ＦＡＮＣＥ欠損ＥＵＦＡ１３０細胞株を示す。白色の棒は、同系のＦＡＮＣＥ修正細胞株を示す。平均値は、３回の別々の実験から計算し、ＳＥＭをそれぞれの棒について示す。図５、パネルＢは、２０μＭのＫＵ５５９３３での処理の前（パネル１）と処理の７２時間後（パネル２）の、同系のＦＡＮＣＥ修正細胞株に対するＦＡＮＣＥ欠損ＥＵＦＡ１３０細胞株の細胞周期プロフィールを示している、ヨウ化プロピジウムフローサイトメトリーを示す。平均の割合は３回の別々の実験から計算し、ＳＥＭをそれぞれの値について示す。図５、パネルＣは、ＫＵ５５９３３での処理の０時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後に２Ｎ未満のＤＮＡを含んでいる細胞（ｓｕｂ−Ｇ０集団）のグラフによる提示を示す。黒色の棒はＦＡＮＣＥ欠損ＥＵＦＡ１３０細胞株を示す。白色の棒は同系のＦＡＮＣＥ修正細胞株を示す。平均の割合は３回の別々の実験から計算し、ＳＥＭをそれぞれの棒について示す。
【０１２３】
それぞれの細胞株を２０μＭのＫＵ５５９３３で２４時間、および４８時間処理し、染色体の断裂を、有糸分裂中期スプレッドについて顕微鏡によって評価した（図５Ａ）。処理前は、修正されたＥＵＦＡ１１７９Ｅ細胞株と比較して、ＥＵＦＡ１１７９細胞株においては少数ではあったが、より多数の細胞１個あたりの染色体の断裂が観察され（０．００５（ＳＥＭ ０．００５）と比較して０．０８０（ＳＥＭ ０．０２））、これは、ＦＡ細胞について以前に報告された自発的な染色体の損傷と一致した。ＫＵ５５９３３での処理の２４時間後および４８時間後には、ＥＵＦＡ１１７９細胞株は、細胞１個当たりの染色体の断裂において、９倍（０．７１０（ＳＥＭ ０．１１０））および１２倍（１．０６０（ＳＥＭ ０．０６０））の増加を示したが、ＥＵＦＡ１１７９Ｅ細胞株は、染色体の断裂に関してベースラインから有意な変化はなかった。
【０１２４】
次に、ＫＵ５５９３３が細胞周期効果により、ＦＡ経路が欠損している細胞におけるその選択的毒性を発揮できるかどうかを問うた。ＥＵＦＡ１３０細胞株とＥＵＦＡ１３０Ｅ細胞株は、これらがベースラインで同程度のプロフィールを有しているので、細胞周期の分析に有用である（図５、パネルＢ１）。それぞれの細胞株をＫＵ５５９３３で処理し、細胞周期プロフィールを、ヨウ化プロピジウムフローサイトメトリーを使用して、２４時間後、４８時間後、および７２時間後に測定した。２４時間では、それぞれの細胞株は、Ｇ１期に同程度の中度の蓄積を示した。しかし、それよりも遅い時点では、ＦＡＮＣＥ変異体ＥＵＦＡ１３０細胞株は、ＥＵＦＡ１３０Ｅ細胞株と比較して、２Ｎ未満のＤＮＡ含有量を有している細胞（ｓｕｂ−Ｇ０集団）の蓄積の増大を示した（７２時間の時点を図５、パネルＢ２に示す）。このｓｕｂ−Ｇ０集団は細胞死を示し、そしてＥＵＦＡ１３０細胞株とＥＵＦＡ１３０Ｅ細胞株における、Ｋｕ５５９３３での処理の２４時間後、４８時間後、および７２時間後をグラフで示す（図４Ｃ）。それぞれの時点で、ＦＡ経路が欠損しているＥＵＦＡ１３０細胞株は、ＥＵＦＡ１３０Ｅ細胞株よりも有意に多い細胞死を示した。まとめると、これらのデータは、ＦＡ経路が欠損している細胞の中でのＡＴＭの阻害が、壊滅的なＤＮＡの損傷を生じ、結果として細胞死を導くことを示している。
【０１２５】
（実施例７）
ＡＴＭとＦＡ経路との関係
図６は、ＦＡ経路とＡＴＭが、ＤＮＡ複製が行き詰った後に互いにどのようにして補い合うことができるかのモデルを示す。図６、パネルＡは、内因性のＤＮＡ損傷により、複製フォークの行き詰まりを引き起こすＤＮＡの断裂が生じることを示している。フォークの行き詰まりに応答して、ＡＴＲは、ＤＮＡ修復経路をコーディネートするＦＡ経路を活性化させ、それにより、ＤＮＡ合成を再度確立させる。ＡＴＭはまた、ＤＮＡ複製フォークが行き詰まった二本鎖ＤＮＡの断裂を検出することもでき、おそらくは、細胞周期の調節とＤＮＡ修復における役割を通じて、ＦＡ経路とは無関係にＤＮＡ合成を再度確立させることができる。図６、パネルＢは、機能性のＦＡ経路が存在しない場合には、細胞は、複製フォークの行き詰まりを修復するためにはＡＴＭ依存性の経路に頼ることを示している。図６、パネルＣは、ＦＡ経路が欠損している細胞の中でＡＴＭ機能が失われている場合には、行き詰まったＤＮＡ複製を再度確立するための機構が存在せず、それにより壊滅的なＤＮＡの損傷と死が生じることを示している。
【０１２６】
図６、パネルＡは、内因性の損傷によりＤＮＡの断裂が生じる正常な細胞を示している。ＤＮＡの断裂は、ＡＴＲを活性化させ、その後、ＦＡ経路を活性化させるＤＮＡ複製フォークの行き詰まりを引き起こす。ＦＡ経路は、その後、フォークを安定化させ、その修復をコーディネートする。別のＡＴＭによって媒介される経路もまた存在している。この経路においては、ＡＴＭは、フォークが行き詰まったＤＳ ＤＮＡの断裂を検出し、細胞周期を停止させている媒介因子であるタンパク質をリン酸化して、修復する。図６、パネルＢは、ＦＡ経路が欠損している細胞の中での事象の順序を示す。これらの細胞の中では、行き詰まったフォークは主に、ＡＴＭに依存する経路によって修復される。ＤＮＡ複製フォークの行き詰まりに応答するＡＴＭの実際の役割は明らかではないが、これは、ＤＮＡ損傷応答のチェックポイントを活性化させることができ、それにより、相同組み換えまたは非相同末端結合による効率的な修復のための時間を提供することができる。最近のデータもまた、ＡＴＭがＡｒｔｅｍｉｓのリン酸化により、ＮＨＥＪに対して直接的なシグナル伝達の役割を有している可能性があることを示唆している（Ｒｉｂａｌｌｏら、Ｍｏｌ細胞１６（５）：７１５−７２４，２００４）。興味深いことに、ＦＡ経路が欠損している細胞は、修正された細胞（図４Ｇ、レーン２）と比較してＨ２ＡＸのリン酸化の増加を示した（図４Ｇ、レーン１）。ＫＵ５５９３３はこのＨ２ＡＸのリン酸化を阻害した（図４Ｇ、レーン３）。Ｈ２ＡＸは、ＡＴＭ、ＡＴＲ、およびＤＮＡ−ＰＫによってリン酸化され得る。このデータは、ＡＴＭが主に、ＦＡ経路が欠損している細胞の中の崩壊した複製フォークに応答するＨ２ＡＸのリン酸化に関係していることを示している。
【０１２７】
ＡＴＭによって媒介される経路は、ＦＡ経路が存在しない場合にはあまり有効ではない可能性があり、これは、ＦＡ細胞の中で見られる散発性の染色体の断裂の主な原因となるが、細胞の大部分が生存することを可能にするには十分である。しかし、ＦＡ経路が欠損している細胞に対するＫＵ５５９３３の添加（図６、パネルＣ）によっては、ＡＴＭによって媒介される経路が阻害され、これにより、行き詰まったフォークの修復の機構がないままとなってしまう。これにより、ＤＳ ＤＮＡの断裂が残ったままとなり、染色体の損傷、そして最終的には細胞死が生じる。マウスモデルにおいては、ＡＴＭ ＦＡＮＣＧ二重ノックアウト胚の死は、壊滅的なＤＮＡ損傷が原因で極めて早い段階で起こると予想される。
【０１２８】
（実施例８）
Ｆａｎｃｄ２、Ｐｋｒｄｃ、およびＭｌｈ１の分析
いくつかの遺伝的実験を、Ｆａｎｃｄ２／Ｐｋｒｄｃ、Ｆａｎｃｄ２／Ｒａｄ５２、Ｆａｎｃｄ２／Ｍｌｈ１ノックアウトマウスの作成に続いて行った。雄と雌のいずれのＦａｎｃｄ２−／−マウスも生殖能力がなく、１５〜１８ヶ月で上皮腫瘍の発症を示した。わずかな出生率の低下もまた、いくつかの株のバックグラウンドについて観察された。Ｆａｎｃｄ２／Ｐｋｒｄｃマウスは胚性致死ではなく、生まれた時には正常なメンデル比を示し、そして特筆すべき成体の表現形は示さなかった。
【０１２９】
本発明者らの発見をさらに裏付けるために、二重変異体マウスに４２０ｒａｄｓの電離放射線を照射した。１１匹のＳＣＩＤマウスのうちではわずかに３匹しか同じ線量では死亡しなかったが、３匹の二重変異体マウスのうちの３匹がＩＲの投与後に極めて迅速に死亡し、このことは、Ｆａｎｃｄ２がＩＲによって誘導されるＤＮＡ損傷の修復においてＮＨＥＪとは異なる経路において機能することを示している（図７）。これらの結果は、二重変異体マウスが高い放射線感受性を有していることを示している。
【０１３０】
ＤＳＢの修復におけるＦａｎｃｄ２の役割を調べるために、本発明者らは、ＳＣＩＤマウスに対してＦａｎｃｄ２ノックアウトマウスを交配させた。ＳＣＩＤマウスは、ＮＨＥＪに必要なタンパク質であるＤＮＡ−ＰＫの触媒サブユニットをコードする遺伝子の中のナンセンス変異が原因で、ＮＨＥＪの中に欠損を有している。野生型、二重変異体細胞、ＳＣＩＤ細胞、および単一変異体Ｆａｎｃｄ２細胞を、漸増量のＩＲ後に細胞増殖アッセイにおいて比較した。Ｆａｎｃｄ２細胞と野生型細胞は、漸増量のＩＲに対して特に感受性ではなかったが、ＳＩＣＤ細胞は感受性があった（図８）。興味深いことに、二重変異体細胞はＳＣＩＤ細胞よりも感受性があり、これは、Ｆａｎｃｄ２が、ＮＨＥＪとは異なるＤＳＢ応答経路において機能することを示している。
【０１３１】
同じ遺伝子型を、漸増量の光活性化ソラレンに対して暴露させた。ＳＣＩＤ細胞は野生型細胞よりも大きな感受性はなかったが、二重変異体はＳＣＩＤ細胞と同じ程度の感受性があった（図９）。これらの結果は、ＮＨＥＪがＩＣＬの修復においてはほとんど役割を果たしていないか、全く役割を果たしていないことを示している。
【０１３２】
図７〜９の結果は、ＮＨＥＪが、ＩＣＬの修復においてはほとんど役割を果たしていないか、全く役割を果たしていないことを示している。これらの結果はまた、Ｆａｎｃｄ２が、ＩＲによって誘導された損傷の後に、インビトロおよびインビボのいずれにおいても、ＮＨＥＪとは異なるＤＮＡの損傷応答経路において機能すること：Ｆａｎｃｄ２が制限酵素によって誘導されたＤＳＢの修復において機能すること、ならびに、Ｆａｎｃｄ２が、ＩＣＬ修復の間に、ＤＳＢ形成の後の相同組み換え工程を制御するように機能し得ることも示している。
【０１３３】
Ｆａｎｃｄ２／Ｍｌｈ１マウスは胚性致死ではなく、生まれたときには正常なメンデル比を示し、その寿命のうちの遅い時期に腫瘍（例えば、腸の、または白血病）を発症する。Ｆａｎｃｄ２／Ｍｌｈ１交配マウスは、１／１６の確率で二重変異体を生じると予想される。しかし、二重変異体は得られなかった。具体的には、７３の胚を回収し、６の二重変異体が得られると予想して、ＥＤ１５で培養した。二重変異体は観察されなかった。４０の胚を回収し、ＥＤ１２で培養した場合も、二重変異体は観察されなかった。
【０１３４】
Ｍｌｈ１の誘導性のノックダウンをヒトＦＡ−Ａ繊維芽細胞の中で行い、ＤＯＸによって誘導されるｓｈＲＮＡ（ｓｈＭｌｈ１ＡおよびｓｈＭｌｈ１Ｂ、またはそれらの組み合わせ）の発現を試験した。図１０の免疫ブロットの結果は、ｓｈＭｌｈ１ＡとｓｈＭｌｈ１Ｂの組み合わせがＭｌｈ１タンパク質の発現を効率よくサイレンシングさせたことを示している。図１１は、９６ウェル増殖アッセイにおける、ＤＯＸでの処理の後にｓｈＭｌｈ１ＡとｓｈＭｌｈ１Ｂの組み合わせで処理した細胞の増殖の低下をグラフで示している（ｎ＝４）。Ｍｌｈ１の役割をさらに評価するために、ＨｅＬａ細胞をＭｌｈ１ ｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクトし、その後、１０μＭのシスプラチンを伴って、または伴わずに２４時間処理した（図１２）。これらの結果は、Ｍｌｈ１ ｓｉＲＮＡでの誘導とシスプラチンでの処理の後のＦａｎｃｄ２のモノユビキチン化を示している。ＩＲが様々なＤＮＡ損傷を誘導するので、Ｆａｎｃｄ２ ｃＤＮＡでレトロウイルスによって修正した二重変異体と二重変異体細胞を、ＰＶＵＩＩでエレクトロポレーションした。ＰＶＵＩＩは、平滑末端ＤＳＢを生じる制限酵素である。このコロニー形成アッセイは、二重変異体細胞のコロニー形成能力が低下していることを示していた（図１３）。タンパク質を取り込む細胞の能力についての対照として、両方の遺伝子型をＧＦＰでエレクトロポレーションした。図１４のＦＡＣＳ分析によって示されるように、いずれの遺伝子型も、ＧＦＰを取り込むそれらの能力についてはほぼ等しく、これは、ＰｖｕＩＩエレクトロポレーション後の低下したコロニー形成能力が、修正されていない細胞の中でのタンパク質の取り込みの増加が原因ではないことを示している。
【０１３５】
図１０〜１４の結果は、Ｍｌｈ１によって媒介されるＳ期チェックポイントが、ＦＡ変異体細胞の生存に必要であることを示している。これは、Ａｔｍによって媒介されるＭｌｈ１のリン酸化の結果である可能性がある。しかし、ｐ５３の欠失もまた、このチェックポイントを無効にしてしまうが、これは合成致死（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｅｔｈａｌ）ではない。結果はまた、組み換えを抑制することができないことにより、細胞分裂異常（ｍｉｔｏｔｉｃ ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ）（欠失、転座など）が生じることも示している。Ｆａｎｃｄ２／Ｍｌｈ１二重変異体は、初期胚性致死であり、Ｆａｎｃｄ２−／−／Ｍｌｈ１＋／−とＦａｎｃｄ２＋／−／Ｍｌｈ１−／−は少ない（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）。ＦＡＮＣＡ繊維芽細胞の中でのＭｌｈ１の誘導性のノックダウンは、ＭＭＣ感受性を有意に増大させることが示されている。この結果は有意である。ヒト結腸ガンのうちの２０〜２５％が、Ｍｌｈ１のサイレンシングが原因であるマイクロサテライト不安定性を有するので、ＦＡ経路の阻害剤は結腸の腫瘍を特異的に標的化できるからである。
【０１３６】
（実施例９）
２つの保存されている部位でのＦＡＮＣＥのリン酸化がＭＭＣ耐性には必要である
ＦＡ／ＢＲＣＡ経路におけるＣｈｋ１の役割を試験するために、１１個のＦＡタンパク質の一次アミノ酸配列を、Ｃｈｋ１リン酸化コンセンサス配列（−７（Ｌｅｕ／Ａｒｇ）−６（Ｘａａ）−（Ｌｅｕ／疎水性／Ａｒｇ）−４（塩基性／Ｖａｌ）−３（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−２（Ｔｙｒ／Ｘａａ）−１（Ｘａａ）Ｓｅｒ＋１（Ｐｈｅ／Ｍｅｔ／疎水性）についてスキャンした（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、Ｊ）。２つの高度に保存されているリン酸化部位：Ｔｈｒ３４６とＳｅｒ３７４を、ＦＡＮＣＥタンパク質のカルボキシ末端領域の中で同定した（図１９Ａ）。これらの推定されるリン酸化部位の機能的関係を決定するために、それぞれの部位を、全長のＦＡＮＣＥタンパク質の中で個別に、または組み合わせてのいずれかで変異させた。患者に由来するＦＡ−Ｅ細胞株、ＥＵＦＡ１３０リンパ芽球、およびＤＦ１１７９線維芽細胞を、野生型ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）、変異体ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−Ｔ３４６ＡまたはＦＬＡＧ−Ｓ３７４Ａ）、あるいは、二重点変異体ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）（図１９Ｂ）のいずれかをコードするｃＤＮＡでレトロウイルス形質導入した（図２５）。ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔを発現している細胞はＭＭＣ耐性であったが、二重変異体ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を発現している細胞は、ＭＭＣに対して過敏なままであった。ＦＡＮＣＥの単一点変異体を発現している細胞は、ほとんどＭＭＣ感受性を示さなかった（図９Ｂ）。
【０１３７】
ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化を回復させるＦＡＮＣＥ変異体タンパク質の能力を試験した（図１９Ｃ）。先に記載したように、ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔはＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化を回復させ（図１９Ｃ、レーン６〜１０）、そして、ＩＲによって生じたＤＮＡ損傷は、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化をさらに活性化させた。二重変異体ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）もまた、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化を回復させた。二重変異体ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を発現している細胞は、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化について高い基底レベルを有しており（図１９Ｃ、レーン１１と６を比較）、ＤＮＡ損傷後にはさらなるＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化を示すことはできなかった（図１９Ｃ、レーン１１〜１５）。
【０１３８】
二重変異体ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を発現しているＦＡ−Ｅ細胞の中でのＦＡＮＣＤ２核焦点のアセンブリ（図１９Ｄ、Ｅ）を決定した。ＦＡＮＣＥの野生型と二重変異体（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）はいずれも、ＦＡＮＣＤ２焦点の形成を回復した（図１９Ｄ）。ＦＡＮＣＥタンパク質の二重変異体（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を発現している細胞は、ＦＡＮＣＤ２焦点について高い基底レベルを有しており、ＤＮＡ損傷後にＦＡＮＣＤ２焦点をアップレギュレートすることはできなかった（図１９Ｅ）。したがって、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化のレベルと関係している（ウェスタンブロットによる、図１９Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＦＡＮＣＥ上のＴｈｒ３４６とＳｅｒ３７４のリン酸化は、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化と焦点形成には必要ないが、ＭＭＣ耐性には必要であることを示唆している。
【０１３９】
（実施例１０）
インビトロおよびインビボでのＣｈｋ１によるＦＡＮＣＥのリン酸化
Ｃｈｋ１がＦＡＮＣＥを直接リン酸化するかどうかを決定するために、２つの高度に保存されているスレオニンとセリンの、インビトロでのＣｈｋ１によるリン酸化を試験した。ＦＡＮＣＥの様々な領域を含むグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ペプチド融合タンパク質（図２０Ａ、左側のパネル）を作成した。Ｔｈｒ３４６もしくはＳｅｒ３７４、または両方の残基のいずれかを含む３種類のＧＳＴペプチド融合タンパク質（３３２−３６５）ＷＴ、（３４９−３８２）ＷＴ、および（３３２−３８２）ＷＴ（しかし、ＴｈｒからＡｌａ、もしくはＳｅｒからＡｌａの単一変異または二重変異を有しているＧＳＴ融合タンパク質ではない）を、インビトロでＣｈｋ１によってリン酸化させた（図２０Ａ、右のパネル）。
【０１４０】
Ｃｈｋ１によるＴ３４６およびＳ３７４でのＦＡＮＣＥのリン酸化をさらに実験するために、ウサギのポリクローナル抗血清を、推定されるリン酸化された残基を含むＦＡＮＣＥペプチド：ＳＤＬＧＬＬＲＬＣｐＴ（３４６）ＷＬ（抗ｐＴ３４６）に対して、またはＬＦＬＧＲＩＬｐＳ（３７４）ＬＴＳＳ（抗ｐＳ３７４）に対して作成した。精製した組み換え体であるＦＡＮＣＥタンパク質の野生型（ｒＦＡＮＣＥｗｔ）または二重変異体（ｒＴＳ／ＡＡ）をＣｈｋ１とともに、または２つの関連するチェックポイントキナーゼＣｈｋ２およびＭＡＰＫＡＰ２（ＭＫ２）とともに、インビトロでインキュベートした（図２０Ｂ）。ＦＡＮＣＥについての抗ホスホ抗体（抗ｐＴ３４６および抗ｐＳ３７４）は、インビトロで、Ｃｈｋ１によりリン酸化された組換え体ＦＡＮＣＥタンパク質（ｒＦＡＮＣＥｗｔ）を特異的に認識した（図２０Ｂ、レーン３）。組み換え体ＦＡＮＣＥ（ｒＦＡＮＣＥｗｔ）は、インビトロでは、Ｃｈｋ２またはＭＡＰＫＡＰ２によってはリン酸化されなかった（図２０Ｂ、レーン４および５）。抗体の特異性は、ＦＡＮＣＥの二重変異体タンパク質（ｒＴＳ／ＡＡ）およびＧＳＴとの反応性がないことによって明らかであった（図２０Ｂ、レーン６〜１５）。
【０１４１】
その後、ＦＡＮＣＥが、ＤＮＡ損傷の後でインビボでリン酸化されるかどうかを決定した（図２０Ｃ）。ＦＡＮＣＥの２つの抗ホスホ抗体（抗ｐＴ３４６，抗ｐＳ３７４）を使用して、ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥ免疫複合体を、野生型ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）または二重変異体（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を安定に発現しているＦＡ−Ｅ細胞から免疫ブロットした。ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の強力な活性化因子であるＵＶ線への細胞の暴露の後、抗ｐＴ３４６抗血清と抗ｐＳ３７４抗血清はＦＡＮＣＥｗｔを検出したが、二重変異体タンパク質（ＴＳ／ＡＡ）を検出することはなかった。まとめると、これらの結果により、抗体の特異性と、これらの２つの残基のＤＮＡ損傷によって誘導されるリン酸化を確認した。
【０１４２】
免疫蛍光試験を使用して、Ｃｈｋ１によるＦＡＮＣＥのインビボでのリン酸化を明らかにした。抗ｐＴ３４６抗血清は、ＤＮＡ損傷に対する細胞の暴露の後で、修正されたＦＡ−Ｅリンパ芽球（ＥＵＦＡ１３０＋ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥ）の中の活性化されたＦＡＮＣＥタンパク質を検出したが、ベクターおよび二重変異体（ＴＳ／ＡＡ）を安定に発現しているＦＡ−Ｅ細胞の中では検出することはなかった（図２０Ｄ、左のパネル）。興味深いことに、抗ｐＴ３４６抗体によって検出されたリン酸化されたＦＡＮＣＥタンパク質は、ＤＮＡ損傷によって誘導される核焦点にアセンブリしていた（図２０Ｄ、図Ｓ２、ＡおよびＢ）。ＵＶもまた、ＨｅＬａ細胞の中でｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点を活性化させ、ＡＴＲに特異的なｓｉＲＮＡまたはＣｈｋ１は、ＵＶ誘導性のｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点を減少させた（図２０、Ｄ〜Ｅ）。Ｃｈｋ１阻害剤（Ｇｏｅ６９７６またはＳＢ２１８０７８）での前処理によっては、ＵＶ暴露後のｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点の形成が減少した（図２６、ＣおよびＤ）。
【０１４３】
（実施例１１）
Ｃｈｋ１のｓｉＲＮＡノックダウンによりＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化とＦＡＮＣＤ２焦点について高い基底レベルが生じる
ＤＮＡ損傷後のＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化とＦＡＮＣＤ２焦点形成に対する、Ｃｈｋ１のｓｉＲＮＡノックダウンの効果を試験した（図２１）。Ｃｈｋ１のｓｉＲＮＡノックダウンは、ＦＡＮＣＤ２焦点形成（図２１Ａ）とＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化（図２１Ｂ、レーン４）についての基底レベルの上昇を生じた。ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化と核焦点の形成は、ＤＮＡ損傷後にさらに増大することはなかった（図２１Ｂ、レーン４〜６、および図２１Ｃ）。これらの結果は、Ｃｈｋ１活性の破壊がＦＡＮＣＥ（ＴＳ／ＡＡ）二重変異体の細胞性の表現形を模倣することを示している。
【０１４４】
（実施例１２）
ＦＡＮＣＤ２焦点とホスホ−Ｔ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点の共局在
ＤＮＡ損傷後のホスホ−Ｔ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点とＦＡＮＣＤ２焦点のアセンブリを試験した（図２２）。未処理のＨｅＬａ細胞は、ホスホ−Ｔ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点も、またＦＡＮＣＤ２焦点も示さなかった（図２２Ａ）。ＵＶ線によるＤＮＡの損傷は、３０分までにＴ３４６でのＦＡＮＣＥのリン酸化と焦点形成を活性化させ、これらの焦点は８時間後を超えると観察されなかった。ＦＡＮＣＤ２焦点は、ＵＶ後３０分で蓄積し始め、８時間でピークに達した。ホスホ−Ｔ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点形成とＦＡＮＣＤ２焦点形成の速度論を図２２Ｂにグラフに示す。二重染色は、ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ焦点とＦＡＮＣＤ２焦点は一緒に局在化するが（図２２Ｃ）、異なる速度論を示すことを明らかにした（図２２Ｂ）。
【０１４５】
（実施例１３）
Ｃｈｋ１によって媒介されるＦＡＮＣＥのリン酸化はＭＭＣ耐性に必要であるが、ＤＮＡ複製または正常な細胞周期の進行には必要はない
最近の実験は、ＦＡコア複合体がさらに別の複製とチェックポイントの活性を有しており、これらはＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化とは連動していないことを示している。Ｃｈｋ１によるＦＡＮＣＥのリン酸化が正常なＳ期への進行に必要であるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＤＮＡ複製とＳ期への進行を回復する、ＦＡＮＣＥ野生型（ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）または二重変異体（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）の能力を比較した（図２３ＡおよびＢ）。ＭＭＣ処理の２４時間後、野生型ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）を発現しているＦＡ−Ｅ細胞（ＥＵＦＡ１３０）または二重変異体（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を発現しているＦＡ−Ｅ細胞（ＥＵＦＡ１３０）はいずれも、ＤＮＡ複製については同じように完全な能力があり、Ｓ期後期およびＧ２期の細胞周期に蓄積していなかった。予想したとおり、空のベクターを含むＦＡ−Ｅ細胞は停止しており、Ｓ期後期とＧ２基に蓄積しており、そしてＤＮＡ合成の減少を示した（図２３ＡおよびＢ）。さらに、二重変異体タンパク質（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）はＦＡコア複合体を安定化させ、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化を回復した（図１９Ｃ）。
【０１４６】
ＦＡＮＣＥの二重変異体が、ＦＡ−Ｅ細胞株の中で発現された場合に、ＭＭＣによって媒介される細胞死を防ぐことができるかどうかを試験した。細胞死は核の断片化を生じる（ｓｕｂ−Ｇ１集団）。そして、これを、ＭＭＣ処理の後にフローサイトメトリーによって評価した。図２３Ｃに示すように、同等のレベルのｓｕｂ−Ｇ１細胞が、空のベクターを安定に発現しているＦＡ−Ｅ細胞とＦＡＮＣＥの二重変異体（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を安定に発現しているＦＡ−Ｅ細胞の中に、ＭＭＣ処理後に存在していた。対照的に、野生型ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）で修正されたＦＡ−Ｅ細胞は、断片化された核を有している細胞について有意に低い割合を示した。これらの結果は、ＦＡＮＣＥの二重変異体（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を含む完全なＦＡコア複合体は、ＦＡ−Ｅ細胞の細胞周期異常を修正できるが、ＭＭＣに対する耐性を与えることはできないことを明らかにしており、これにより、Ｃｈｋ１によって媒介されるＦＡＮＣＥのリン酸化が架橋耐性（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）に必要であることが確認される（表５）（図２２Ｄ）。
【０１４７】
（実施例１４）
Ｃｈｋ１によって媒介されるＦＡＮＣＥのリン酸化はＦＡＮＣＥの分解を促進する
ＤＮＡ損傷後のホスホ−ＦＡＮＣＥ−Ｔ３４６焦点の消滅（図２２Ａ）は、ＦＡＮＣＥが調節されたタンパク質分解を受けるであろうことを示唆していた。この仮説を試験するために、本発明者らは、ＵＶ損傷後のＦＡＮＣＥの細胞性レベルを試験した（図２４Ａ）。わずか３０分後に、Ｃｈｋ１の活性化とＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化が観察された（図２４Ａ、レーン２）。４時間から６時間までに、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化は最大となり、ＦＡＮＣＥレベルは低下し（図２４Ａ、レーン４〜６）、そしてＦＡＮＣＥの分解もまた、ＵＶ線量依存性の様式で観察された。
【０１４８】
ＨｅＬａ細胞を、二重のチミジンブロックでＧ１期−Ｓ期境界に同調させ、ＤＮＡ損傷による処理の１時間前にＳ期へと細胞を解放した。ＦＡＮＣＥタンパク質のレベルは、遺伝子毒性ストレス（ＵＶ、ＨＵ、ＭＭＣ、またはシスプラチン）がＤＮＡ複製を受けている細胞に与えられた場合には、有意に低下した（図２４Ｂ、レーン２〜５）。ＵＶ誘導性のＦＡＮＣＥの分解はまた、Ｕ２ＯＳ、ＧＭ０６３７、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む他の細胞株においても観察された（図２７Ｂ）。
【０１４９】
Ｃｈｋ１依存性のリン酸化がＦＡＮＣＥの安定性を調節するかどうかを試験した（図２４Ｃ）。野生型ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）または二重変異体ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を安定に発現しているＦＡ−Ｅ（ＥＵＦＡ１３０）細胞を試験した。ＵＶ処理後、野生型ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）は分解されたが（図２４Ｃ、レーン３と４を比較）、二重変異体ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）は安定であった（図２４Ｃ、レーン５と６を比較）。
【０１５０】
ＦＡＮＣＥの分解におけるユビキチン−プロテオソーム経路の役割（図２４Ｄ）を試験した。細胞を、プロテオソーム阻害剤であるＭＧ１３２の存在下、またはそれが存在しない条件下で、ＵＶで処理した。ＭＧ１３２処理は、ＦＡＮＣＥのＵＶ誘導性の分解をブロックした（図２４Ｄ、レーン３）。ＨＡ−ユビキチン構築物をコードするｃＤＮＡを、野生型ＦＡＮＣＥ（ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔ）または二重変異体（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を安定に発現しているＵ２ＯＳ細胞に一時的にトランスフェクトした。ＦＬＡＧタグ化ＦＡＮＣＥを免疫沈降させ、抗ＨＡ抗体と抗ＦＬＡＧ抗体で免疫ブロットした。ＵＶへの暴露の後、ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥｗｔのポリユビキチン化産物の高分子量のラダーは、ＵＶへの暴露によって大幅に増加し（図２４Ｅ、レーン８）、これは、空のベクターまたは二重変異体（ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡ）を発現している細胞の中には存在しなかった（図２４Ｅ、それぞれ、レーン７および９）。このことは、ＤＮＡ損傷後には、ＦＡＮＣＥのリン酸化がそのポリユビキチン化へと進行することを示している。まとめると、これらの結果は、Ｃｈｋ１によって媒介されるＦＡＮＣＥのリン酸化はユビキチンによって媒介されるＦＡＮＣＥの分解を促進することを示している。ＦＡＮＣＥの分解に必要な特異的なＥ３ユビキチンリガーゼ複合体は判らないままである。
【０１５１】
（実施例１５）
Ｃｈｋ１阻害剤で処理したヒト細胞はファンコニ貧血経路の高い活性を示す
ファンコニ貧血経路の活性は、分子レベルでＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化を評価することによってモニターすることができる。ヒトＨｅＬａ細胞は、多くの基準により、実行可能なＦＡ−ＨＲ経路を有することがこれまでに示されている。阻害剤であるＧ０６９７６でこれらの細胞を処理することによる、ＨｅＬａ細胞に対するＣｈｋ１阻害剤の効果を試験した。処理後、ＨｅＬａ溶解物を、ＦＡＮＣＤ２抗体での免疫ブロッティングによって試験した（図２８）。大きな移動度のＦＡＮＣＤ２−Ｌバンドは、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化形態である。より移動度の小さいバンドがユビキチン化されていないＦＡＮＣＤ２である。Ｇ０６９７６で処理したＨｅＬａ細胞は、高いレベルのＦＡＮＣＤ２−モノユビキチン化を示し、これは、Ｃｈｅｋ１の阻害により、ＦＡ−ＨＲ経路に対するこれらの細胞の依存性の増大が導かれることを示している。
【０１５２】
（実施例１６）
ＦＡ細胞は、Ｃｈｋ１ ｓｉＲＮＡの枯渇によるＣｈｋ１の阻害に過敏である
ＥＵＦＡ４２６ヒト細胞は、ファンコニ貧血患者から単離されたＦＡＮＣＣ欠損細胞である。これまでの実験で、これらの細胞は分子レベルでＦＡＮＣＣタンパク質が欠損しており、遺伝子毒性の要因および照射による様々なＤＮＡ損傷ストレスの後のＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化のブロックを含む、ファンコニ貧血−相同組み換え（ＦＡ−ＨＲ）ＤＮＡ修復経路において下流の工程を活性化させることができないことが明らかになった。ＦＡＮＣＣ遺伝子レトロウイルスで補われたＥＵＦＡ４２６レベルは、ＦＡＮＣＣレベルを回復させ、そして遺伝子毒性のストレスおよび照射に対するこれらの細胞の過敏性を補うことが観察された。
【０１５３】
ＥＵＦＡ４２６細胞とＥＵＦＡ４２６＋Ｃ細胞を、これまでの実験での標準的なプロトコールにしたがってＣｈｋ１キナーゼのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。対照のために、同じ細胞を、対照であるＬａｃＺ ｓｉＲＮＡでもまたトランスフェクトした。細胞の生存性を、ＬａｃＺ ｓｉＲＮＡおよびＣｈｋ１ ｓｉＲＮＡを用いた場合と比較して、トランスフェクトしなかった細胞（対照）についてスコアした。ＥＵＦＡ４２６細胞は、Ｃｈｋ１ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの後に、低い生存性を有していたことが明らかになった（図２９）。ＥＵＦＡ４２６＋Ｃ細胞（ＦＡＮＣＣレベルが回復した）を用いた場合には、Ｃｈｋ１ ｓｉＲＮＡの存在下での細胞の生存性のレベルは有意に高くなった。したがって、ＦＡＮＣＣ欠損細胞は、ｓｉＲＮＡの枯渇によるＣｈｋ１キナーゼ活性の喪失に対して選択的に過敏である。
【０１５４】
（実施例１７）
ＦＡ−ＨＲ欠損細胞はＣｈｋ１の阻害に過敏である
ファンコニ貧血欠損細胞の感受性もまた、既知のＣｈｋ１キナーゼ阻害剤であるＧ０６９７６を用いて試験することによって試験した。この実験においては、ＦＡＮＣＧ相補グループの遺伝子が欠損していることが公知であるファンコニ貧血患者から単離したＥＵＦＡ３２６細胞を評価した。加えて、レトロウイルス形質導入によりＦＡＮＣＧで補ったＥＵＦＡ３２６細胞を比較した。これまでの実験は、免疫ブロッティングによって、これらの細胞はＦＡＮＣＧタンパク質が欠損していること、そして、遺伝子毒性の要因および照射による様々なＤＮＡ損傷ストレスの後のＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化のブロックを含む、ファンコニ貧血−相同組み換え（ＦＡ−ＨＲ）ＤＮＡ修復経路の下流の工程を活性化できないことが明らかにした。ＦＡＮＣＧ遺伝子レトロウイルスで補われたＥＵＦＡ３２６レベルは、ＦＡＮＣＧレベルを回復し、そして遺伝子毒性ストレスまたは照射に対するこれらの細胞の過敏性を補うことが観察された（図３０）。
【０１５５】
ＥＵＦＡ３２６（ＦＡＮＣＧ欠損）細胞とＥＵＦＡ３２６＋Ｇ（ＦＡＮＣＧ相補）細胞を、Ｃｈｋ１阻害剤に対する感受性について試験した。細胞の生存性の決定においては、ＥＵＦＡ３２６細胞は、全ての用量でＥＵＦＡ３２６＋Ｇ細胞と比較して、Ｃｈｋ１阻害剤Ｇ０６９７６に対して過敏であった。
【０１５６】
（実施例１８）
Ｃｈｋ１阻害剤でのＦＡ−ＨＲ欠損細胞の処理により多数の染色体の損傷と断裂が導かれる
ＦＡＮＣＥ欠損ヒト線維芽細胞株ＥＵＦＡ１３０と、レトロウイルスからＦＡＮＣＥの発現が安定に再導入された補われたＥＵＦＡ１３０を、ゲノムの安定性と細胞周期の制御についていくつかの試験において比較した。ＥＵＦＡ１３０＋Ｅ細胞は、免疫ブロッティングによりＦＡＮＣＥレベルが回復したことが示された。
【０１５７】
ＥＵＦＡ１３０細胞とＥＵＦＡ１３０＋Ｅ細胞を低密度でプレートし、その後、１ｕＭのＣｈｋ１阻害剤Ｇ０６９７６で処理し、その後、様々な細胞周期の期での細胞の分布について試験した。Ｃｈｋ１阻害剤が、ヨウ化プロピジウム染色により、Ｇ１細胞およびｓｕｂ−Ｇ１細胞集団の細胞の割合の増加を引き起こしたことが明らかとなった。ｓｕｂ−Ｇ１細胞は、細胞のアポトーシスへの侵入の指標である。
【０１５８】
加えて、染色体断裂のレベルを、Ｃｈｋ１阻害剤で処理したＥＵＦＡ１３細胞とＥＵＦＡ１３０＋Ｅ細胞についてスコアした。ＥＵＦＡ１３０細胞は、低いレベルの染色体断裂を有していた（図３１）。Ｃｈｋ１阻害剤とのインキュベーションの後、染色体断裂のレベルは劇的に増加した。対照的に、ＥＵＦＡ１３０＋Ｅ細胞は、Ｃｈｋ１阻害剤での処理の後、染色体断裂の低いレベルを回復した。
【０１５９】
これらの実験は、Ｃｈｋ１阻害剤の存在下での染色体の損傷に対するＦＡ欠損細胞の選択的脆弱性を示している。組み合わせた実験の２つの部分は、Ｃｈｋ１阻害剤がＦＡ欠損細胞を優先的に細胞死へと導くことを示している。
【０１６０】
（実施例１９）
ヒト腫瘍細胞株は、Ｃｈｋ１キナーゼまたはＡｔｍキナーゼの阻害に対して感受性がある
ヒトのガンは、染色体再配置、欠失、増幅、突然変異、および／または多くの遺伝子の後成的なサイレンシングもしくは過剰発現を含む、多くの遺伝的変更を示す。ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷応答経路の遺伝子の場合には、ヒトのガンにおいてはこれらの遺伝子の修飾の有意な証拠が存在している。ファンコニ貧血−相同組み換え経路については、発現の変化または変異が腫瘍において頻繁に観察されることを示唆する十分な証拠が存在している（図３２）。
【０１６１】
ヒトの卵巣腫瘍細胞株２００８は、ＦＡ−ＨＲ経路が欠損していることが公知である。なぜなら、これらの細胞は、ＦＡＮＣＦプロモーターの過剰なメチル化によりＦＡＮＣＦ遺伝子の後成的なサイレンシングを有しているからである。ＦＡＮＣＦプロモーターの過剰なメチル化はＦＡＮＣＦの転写の減少を導き、結果として、細胞のＦＡＮＣＦタンパク質レベルが有意に低くなる。ＦＡＮＣＥの後成的なサイレンシングは、ヒトの腫瘍において頻繁に観察される事象である。２００８細胞株をＦＡＮＣＦ遺伝子でトランスフェクトし、別々に発現させると、これらの誘導した細胞（２００８＋Ｆ）は、ＦＡＮＣＦを高レベルで発現することが示された。
【０１６２】
その後、卵巣２００８細胞と２００８＋Ｆ細胞を、Ｃｈｋ１キナーゼ阻害剤Ｇ０６９７６またはＡｔｍキナーゼ阻害剤ＫＵ５５９３３での処理の後に細胞の生存性について比較し、そして細胞の生存性と増殖をコロニー形成性のアッセイにおいて試験した。細胞コロニーを標準的な手順によって染色し、視覚化した（図３３）。スコアしたコロニー数は、Ｃｈｋ１阻害剤での処理が細胞の生存性の有意な低下を導いたことを示している。したがって、２００８細胞はＣｈｋ１の阻害に対して過敏である。同様に、Ｇ０６９７６ Ａｔｍ阻害剤も、同程度の過敏性を導いた。したがって、ＦＡ欠損細胞は、ＤＮＡの損傷チェックポイントキナーゼの遮断のうちの２つに対して特に脆弱であり、これは、これらの細胞がそれらの生存についてこれらの経路に依存していることを示している。
【０１６３】
まとめると、これらの実験は、ＦＡ欠損の生体マーカーによる同定により、Ｃｈｋ１阻害剤の適用が有効である細胞のサブグループを同定できることを明らかにしている。Ｃｈｋ１阻害剤の選択的使用は、ＦＡＮＣＥ欠損細胞（図３１）およびＦＡＮＣＦ欠損卵巣ヒト腫瘍細胞（図３３）を用いてここに示したように、ＦＡ欠損について腫瘍の標本を評価することによって定義することができる。
【０１６４】
この発見は、これが、ＤＮＡ修復経路の状態が理解される状況下でのＣｈｋ１キナーゼ阻害剤の治療的有用性を指摘しているので、腫瘍学の臨床的状況において重要な効果を有する。本明細書中に示される例においては、ファンコニ貧血−相同組み換え経路の状態が、Ｃｈｋ１阻害剤に対する腫瘍の過敏性の予測の重要要素であることが明白である。この経路の状態は、おそらくは、経路全体の活性の様々な節点を反映している複数の生体マーカーの構成成分によって同定することができる。本発明によって、１つ、または１つ以上の経路の組み合わせによるＤＮＡ修復生体マーカーを評価するための手段が開示される。
【０１６５】
ＤＮＡ修復生体マーカーは、いくつかの状況に、特に適用可能である。このタイプの生体マーカーは、前臨床開発に、患者のサブ設定に、臨床試験の過程での薬物動態的生体マーカーとして、そして、臨床腫瘍学において治療の決定を行うために有用であろう。
【０１６６】
（実施例２０）
ヒトのガンにおけるＤＮＡ修復タンパク質の変化の証拠
ＤＮＡ修復経路のタンパク質を、その経路の活性についての生体マーカーとして、経路特異的変化、タンパク質特異的変化、または翻訳後のエピトープ特異的変化を使用して、免疫組織化学（ＩＨＣ）によってモニターした。
【０１６７】
ヒトのガンは、標本全体の多数の断片または腫瘍のマイクロアレイ（ＴＭＡ）を評価することができる、ホルマリンで固定されたパラフィンに包埋された（ＦＦＰＥ）標本の分析によって監視することができる。ＴＭＡのために、ガンと診断されたそれぞれの患者について、ヒトのガンを、腫瘍の３つの切片と、病理学的には正常な周辺組織の３つの切片を提示するような形式でアレイした。あるいは、患者に由来する同定された腫瘍の領域のＴＭＡを、互いに比較した。
【０１６８】
ヒトのガンにおけるＤＮＡ修復生体マーカーの発現パターンの動的性質を説明するために、同じガンのタイプのＴＭＡ［頭頸部扁平上皮細胞ガン］を広範囲にわたって分析した。図３５は、ヒトの頭頸部ガンの腫瘍のＴＭＡを示す。ここでは、腫瘍のコアを、１１種類のＤＮＡ修復生体マーカーに対する抗体でＩＨＣ染色した。生体マーカーには、ＴＭＡの連続切片に由来する、ＦＡ／ＨＦ成分（ＦＡＮＣＤ２）、非相同末端結合生体マーカー（ＰＴ２６０９ ＤＮＡＰＫ）、いくつかのヌクレオチド除去修復成分（ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１）、３個のミスマッチ修復成分（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、およびＭＳＨ６）、塩基除去修復生体マーカー（ＰＡＲＰ１、ＰＡＲ）、ならびに、ＤＮＡの損傷成分（ＰＴ３３４ Ｍａｐｋａｐキナーゼ２、Ｓ７８ ＨＳＰ２７）を含めた。それぞれの抗体は、ヒトのガンの検査に基づいてＩＨＣのために最適化されている。一般的には、ＤＮＡ修復およびＤＮＡの損傷タンパク質がこれらの組織の中で発現されているが、発現レベルと細胞性の局在化は様々であり得る。
【０１６９】
画像もまた、図３６に示すように、一人の患者の腫瘍コアに基づいて見えるようにできる。この患者のサブセットにおいては、頭頸部ガンに由来する９個の腫瘍のコアの選択が、９人の患者から示される。強調されたコアは、ＴＭＡ上の同じガンのコアの位置にある。したがって、この説明においては、１つの患者のコアを、それを取り囲むオレンジ色の点線で同定することができ、アレイの中の第２の患者のコアは、それを取り囲む紫色の点線を有する。ＩＨＣによる相対的な染色強度とスコアの評価を、比較のために、Ｈ：高い、Ｍ：中程度、またはＬ：低いとして列挙した。ＩＨＣ強度のレベルが患者ごとに相対的分布において変化するいくつかのマーカーが存在することに留意されたい。この実施例は、ガンにおけるＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達経路の複数の生体マーカーを比較することにおけるその有用性を説明する
ＤＮＡ修復生体マーカーの分析の別の例を、ヒトの前立腺ガンの標本について説明する。図３７Ａでは、３人の患者の腫瘍の標本の提示が、様々な経路に由来する５種類のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーを用いて説明される。同じＴＭＡの連続切片を、５種類の生体マーカーのそれぞれでＩＨＣ染色した。腫瘍のコアの画像を、画像分析により読み取るために高倍率でＴＭＡから撮影した。図３７Ｂは、患者１、２、および３について生体マーカーごとのバリエーションを示す。色をつけた出力は、これらの３つの例である標本についての前立腺ガン患者のバリエーションを提示する。重要なことは、ＤＮＡ修復生体マーカーが患者に応じて様々な程度に変化することである。図３７Ｂは、ＤＮＡ修復の生体マーカーＸＰＦとＦＡＮＣＤ２が、有意に異なる発現の結果を有している範囲を示す。
【０１７０】
ＤＮＡ修復生体マーカーの分析についてのさらなる例を、ヒトの非小細胞性肺ガン（ＮＳＣＬＣ）の標本について示す。図３８Ａにおいては、４人の患者の腫瘍標本の提示が、様々な経路に由来する５種類のＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーとともに説明される。他のＴＭＡを用いた上記の場合と同様に、ＮＳＣＬＣ ＴＭＡの連続切片を、図に示した５種類の生体マーカーのそれぞれで染色した。腫瘍のコアの画像を、画像分析により読み取るために高倍率でＴＭＡから撮影した。図３８Ｂは、出力を記載するための着色方法を使用する、患者１〜４についての生体マーカーごとのバリエーションを示す。重要なことは、ＤＮＡ修復の生体マーカーの相対的発現に関しては患者ごとにバリエーションがあることである。
【０１７１】
ヒトの腫瘍の全切片を、連続切片の視診によって評価した。腫瘍の中の関心領域（ＲＯＩ）は、ヘマトキシリンとエオシンの染色パターンを考慮することにより、そして、生体マーカーのグループの全体的な染色パターンによって、病理学の研究者のチームによって同定された。画像ファイルを、腫瘍の同じ領域が重なり合うように操作し、注釈をつけた。ＲＯＩを、この実施例では、図３９の緑色と黄色の四角によって示す。生体マーカーの分析のための６種類のＤＮＡ修復抗体を有しているＩＨＣによって染色した、６つの連続切片の１つのグループを示す。ＲＯＩの領域が、さらなる画像分析のための個々の切片の比較可能な領域の選択であることが、腫瘍の形態を調べることにより明らかである。標本のスライド上の絶対的な方向は様々であり得るが、ＲＯＩの選択が、同じ腫瘍の領域が、様々なＤＮＡ修復およびＤＮＡの損傷シグナル伝達の生体マーカーでの別々の染色を用いて評価され得るように図で表現されることに留意されたい。
【０１７２】
（実施例２１）
頭頸部ガンの患者のＤＮＡ修復生体マーカーのプロフィールの比較
頭頸部ガンの患者を、以下の図に示すようにＤＮＡ修復生体マーカーの１つのグループを使用して評価した。患者を、ドセタキセル、シスプラチン、５−ＦＵを含む化学的アジュバント（誘導）治療で処置し、放射線治療を行った。しかし、この化学的な放射線治療のレジメンに反応する能力があったか、または反応できなかったかの区別は、分子マーカーに関しては理解されていない。腫瘍の生検を治療前に行い、その時点で腫瘍標本をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。４種類のマーカー（Ａ＝ＦＡＮＣＤ２、Ｂ＝ＭＬＨ１、Ｃ＝ＸＰＦ、およびＤ＝ＰＴ３３４ ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２）もまた、６人の患者の腫瘍標本を用いて同時に分析し、結果を図４０に示す。図４０のサブセクションのそれぞれにおいて、標本材料は患者ごとに図の中の同じ相対的位置とし、患者には匿名で番号を付けた（患者２７、２６、２３、２１、１６、および９）。
【０１７３】
ＤＮＡ修復生体マーカーの病理学的スコアは、日常的に行っている病理学的スコア方法によって行うことができる。例えば、標本は、染色パターンの完全性について試験される。実施例に示すよりも高倍率でのこれらの生体マーカーでの質的分析は、染色が、以下に示す生体マーカーＦＡＮＣＤ２、ＸＰＦ、ＭＬＨ１、およびＫｉ６７について完全な核であることを示す。加えて、生体マーカーＰＴ３３４ ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２は、腫瘍の状況に応じた核と細胞質の染色を有している。例えば、卵巣腫瘍は核染色と細胞質染色の組み合わせを示すが、頭頸部ガンは主に核染色を示す。別のストラテジーは、染色パターンを解明するためにＩＨＣシグナルとアルゴリズムの機械によって行われた収集を使用することである。ＤＮＡ修復タンパク質については、一般的には、ＩＨＣパターンは核である。ポジティブピクセル（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｉｘｅｌｓ）は、核または核周辺（ｓｕｂｎｕｃｌｅａｒ）の分布のいずれかに見られ、例えば、核焦点を有する。図４０Ａ〜Ｄには、４種類の生体マーカーの核染色を示す。生体マーカーが患者ごとのバリエーションを示し、これらの相違には直接的な相関関係はないが、逆相関の可能性があることに留意すべきである。
【０１７４】
（実施例２２）
卵巣ガン患者のＤＮＡ修復生体マーカーのプロフィールの比較
この実験では、全ての患者は、３期または４期の卵巣ガンもしくは腹膜ガンを有しており、外科手術と、その後の白金を用いた化学療法で処置した。卵巣ガンの患者を、図３９に示すようにＤＮＡ修復生体マーカーの１つのグループを使用して評価した。４種類の生体マーカー（Ａ＝ＦＡＮＣＤ２、Ｂ＝ＭＬＨ１、Ｃ＝ＸＰＦ、Ｄ＝ＰＴ３３４ ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２、Ｅ＝Ｋｉ６７）を、６人の患者を用いて示す。図４１のそれぞれのサブセクションにおいては、同じ患者を図の中の同じ位置に示し、患者には匿名で番号を付けた（患者３７、３８、３９、４、４０、および４１）。マーカーＫｉ６７はＤＮＡ修復マーカーではないが、その代わりに、腫瘍の領域の中の細胞増殖能力の指標である。６人の患者は、この実施例においてはほぼ同じレベルの細胞増殖を有していたことに留意されたい。頭頸部ガンを用いた実施例と同様に、卵巣ガンを、核の生体マーカーの強度と量の差を識別するために、病理学によるスコアリングによって評価した。ＤＮＡ修復の生体マーカーは、ＩＨＣによる染色の強度に関して有意なバリエーションを示し、これは、これらの生体マーカーが患者の階層化、および／または治療に対する反応に関連している可能性があることを示している。
【０１７５】
（実施例２３）
ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーについての患者の集団の分析
病理学的スコアリングを使用して、生体マーカーのそれぞれを用いて発現の変化の傾向を区別した。４人の病理学者によってスコアリングシステムが確立された。ここでは、強度（Ｉ）と量（Ｑ）の測定を、それぞれの腫瘍標本から行った。Ｉスコアは、値１、２、および３までの範囲であり、順に強度が大きくなる。ここでは、１は弱く、２は中程度、そして３は強い。Ｑスコアは、１（１〜９％）、２（１０〜３９％）、３（４０〜６９％）、または４（７０〜１００％）と、マーカーについてポジティブであった核の割合に基づいて決定した。Ｉ×Ｑの組み合わせたスコアにより、１〜１２の範囲でスコアを得た。
【０１７６】
頭頸部ガンの標本を、互いに対してプロットした生体マーカーについて、個々の患者についての上記の基準とスコアによって評価した（図４２）。ＸＰＦについては、２５／３５人の患者が高い範囲の発現を有していた。また、ＦＡＮＣＤ２生体マーカーについても、１９／３５人の患者が高い発現レベルを有していた。しかし、同じ患者は、その時間のうちのほとんどについて両方のマーカーについて高い発現のグループにあったわけではない。ＦＡＮＣＤ２マーカーとＸＰＦマーカーの例を用いると、これは、患者のうちのおよそ半分は、１つのマーカーについて高いレベルを有しており、一方、他の患者は低いレベルを有していることを示す。患者のうちの１３／３５、すなわち、３７％は両方のマーカーについて高いレベルを有していたが、４／３５、すなわち、１１％は、両方のマーカーについて低いレベルを有していたことを観察した。したがって、ヒトのガン患者を、ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷の生体マーカーの使用に基づいて、サブグループに分けることができるか、または階層化することができる。
【０１７７】
（実施例２４）
ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷シグナル伝達の生体マーカーを使用する原発性の症状と再発の症状との関連性の評価
卵巣ガンの患者に由来する腫瘍標本を、一次生検（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｏｐｓｙ）（腫瘍の外科手術による切除）において評価し、卵巣ガンがシスプラチンでの化学療法の後に再発した場合には、追跡調査した。患者は、漿液性卵巣ガン、ＦＩＧＯグレード３、ＦＩＧＯステージ３ｃを有していた。ＤＮＡ修復およびＤＮＡの損傷シグナル伝達の４種類の生体マーカーを同時に調べた：ＦＡＮＣＤ２、ＭＬＨ１、ＸＰＦ、およびＰＴ３３４ ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２。図４３においては、４種類のマーカーによる画像を縦に並べた。ＩＨＣ発現パターンが変化していた生体マーカーのいくつかを観察し、これらがマーカーに応じて様々なレベルに変化することを観察した。したがって、いくつかのＤＮＡ修復生体マーカーは白金を用いた治療に対する反応を決定することにおいて影響力のあるマーカーであり得る。
【０１７８】
ファンコニ貧血タンパク質が細胞のシスプラチン感受性の重要な決定要素であることは明らかにされている（Ｃｈｉｒｎｏｍａｓ ａｎｄ ＤＡｎｄｒｅａ，２００６）。再発による卵巣ガンの標本の中での強度が増大するＦＡＮＣＤ２のような生体マーカーの同定は、ＦＡＮＣＤ２の増加と治療の間の白金耐性との間の相関の指標である。同様に、Ｍａｐｋａｐキナーゼ２酵素とシグナル伝達経路の過剰な活性化の指標であるＰＴ３３４ Ｍａｐｋａｐキナーゼ２生体マーカーが、ヒトのガンの白金を用いた治療に対する適応応答の第２の指標であることを観察した。
【０１７９】
（実施例２５）
一般的方法
細胞培養
ＨｅＬａ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＧＭ６９１４（ＦＡ−Ａ）、ＰＤ３２６（ＦＡ−Ｇ）、ＰＤ４２６（ＦＡ−Ｃ）、ＰＤ２０（ＦＡ−Ｄ２）、およびＥＵＦＡ４２３（ＦＡ−Ｄ１）は、１５％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＤＭＥＭの中で、加湿した５％のＣＯ_２インキュベーターの中で３７℃で増殖させた。別のＦＡ−Ｅ患者由来のＤＦ１１７９（ＦＡ−Ｅ）線維芽細胞は、Ｃｈａｎｇ培地（Ｉｒｉｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ａｋｉｋｏ Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡから懇意により提供された）の中で培養した。エプスタイン・バーウイルスＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球ＥＵＦＡ１３０（ＦＡ−Ｅ）は、１５％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０の中で維持した。
【０１８０】
ＤＮＡ損傷の作成
細胞に、蓋なしの１００ｍｍの皿の中でＰＢＳで１回洗浄した後、培地を全く用いることなく５０％〜７０％の細胞集密度で、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶを照射した。ＵＶ照射後、新しい培地を加え、示した時間の間培養し続け、その後、溶解させた。γ線の照射は、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ４０装置（ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ）を使用して行った。ＭＭＣ（Ｓｉｇｍａ）処理のためには、細胞を示した時間の間薬物に暴露し続け、その後、溶解させた。ヒトの線維芽細胞とリンパ芽球のＭＭＣ感受性アッセイは、原則として、以下のような変更を加えて記載されているように（５、７）行った。ヒトの繊維芽細胞とリンパ芽球を９６ウェルマイクロプレートに、適切な培地の中に１０００細胞／ウェルの密度で２連で播種した。ＭＭＣは、０〜２００μＭの最終濃度で添加した。その後、細胞を、５％のＣＯ_２インキュベーターの中で３７℃で５日間インキュベートし、その後、細胞の生存性を、特許権のある色素（ＣｙＱＵＡＮＴ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で核酸を染色することによって決定し、続いて、製造業者のプロトコールにしたがって蛍光マイクロプレートリーダーによって分析した。
【０１８１】
プラスミドと組み換えタンパク質の精製
ヒトＦＡＮＣＥ ｃＤＮＡ（Ｊ．ｄｅＷｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈ．Ｊｏｅｎｊｅ，Ｆｒｅｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから懇意により提供された）を、ＦＡＮＣＥのアミノ末端にＦＬＡＧタグを付加することによってレトロウイルスベクターｐＭＭＰ−ｐｕｒｏの中にサブクローニングして、ｐＭＭＰ−ｐｕｒｏ−ＦＬＡＧ−ＦＡＮＣＥを作成した。特異的な１つの二重変異（ｐＭＭＰ−ＦＬＡＧ−Ｔ３４６Ａ、ｐＭＭＰ−ＦＬＡＧ−Ｓ３７４Ａ、ｐＭＭＰ−ＦＬＡＧ−Ｔ３４６Ａ／Ｓ３７４Ａ（ＴＳ／ＡＡ））を、製造業者のプロトコールにしたがって、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して導入した。ｐＧＥＸ−ＦＡＮＣＥ（３３２−３６５）、ｐＧＥＸ−ＦＡＮＣＥ（３４９−３８２）、およびｐＧＥＸ−ＦＡＮＣＥ（３３２−３８２）の構築のために、対応する断片のＰＣＲ産物を、プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位に連結させた。Ｔ３４６Ａ、Ｓ３７４Ａ、およびＦＡＮＣＥの二重変異体（Ｔ３４６Ａ／Ｓ３７４Ａ−ＴＳ／ＡＡ）のｃＤＮＡは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作成した。組み換え体ＦＡＮＣＥ（１４９−５３６）野生型（ｒＦＡＮＣＥｗｔ）構築物は、ｐＥＴ３２ａ−ＰＰＳベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。組み換え体である二重変異体ＦＡＮＣＥ（ｒＴＳ／ＡＡ）については、Ｔ３４６ＡとＳ３７４Ａを有している１４９〜５３６の断片を、鋳型としてｐＭＭＰ−ＦＬＡＧ−ＴＳ／ＡＡを使用してＰＣＲによって作成した。生成物をｐＥＴ３２ａ−ＰＰＳベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。全ての構築物と変異体を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１８２】
ＦＡＮＣＥ配列（３３２〜３８２）にまたがるＧＳＴ−ＦＡＮＣＥ構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞の中で発現させた。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃ（２００〜２５６）構築物（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｙａｆｆｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡから懇意により提供された）をインビトロでのキナーゼアッセイのポジティブ対照として使用した。その後、ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンＳ−セファロースビーズ上で精製し、これをインビトロでのキナーゼ反応において基質として使用した。組み換え体ＦＡＮＣＥ野生型（ｒＦＡＮＣＥｗｔ）と二重変異体（ｒＴＳ／ＡＡ）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＰ細胞の中で発現させ、その後、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）結合ＨｉＴｒａｐキレート化ＨＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。組み換え体タンパク質を、正確なプロテアーゼとともにインキュベーションすることによりカラムから溶離させて、そのＮ末端Ｈｉｓタグ配列を切断し、ＨｉＴｒａｐＱＦＦ陰イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とＳ−２００ゲル濾過カラムによるさらなる精製を行った。
【０１８３】
レトロウイルス感染
ｐＭＭＰレトロウイルス上清の生産と、繊維芽細胞またはリンパ芽球の感染は、これまでに記載されているとおりに行った。
【０１８４】
抗ＦＡＮＣＥ抗体、抗ＦＡＮＣＥ−ホスホスレオニン−Ｔ３４６抗体、抗ＦＡＮＣＥ−ホスホセリン−Ｓ３７４抗体の作成
ＦＡＮＣＥに対するウサギのポリクローナル抗体を、抗原の供給源としてＦＡＮＣＥのＣ末端ペプチド５２１〜５３６を使用してＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｚｙｍｅｄ）によって作成した。ホスホ特異的抗体（抗ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥおよび抗ｐＳ３７４−ＦＡＮＣＥ）の作成のためには、ウサギを、ＦＡＮＣＥのアミノ酸３３７〜３４８または３６７−３７８から導いた、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）結合ＦＡＮＣＥホスホペプチド（ＳＤＬＧＬＬＲＬＣ（ｐＴ）ＷＬ）またはホスホペプチド（ＬＦＬＧＲＩＬ（ｐＳ）ＬＴＳＳ）でそれぞれ免疫化した。抗体を対応するリン酸化および非リン酸化ペプチド結合ゲルを使用して親和性によって精製した。
【０１８５】
免疫ブロッティング
細胞を溶解させ、全細胞抽出物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ニトロセルロース膜に移動させ、ウェスタンブロット分析（５）を行った。以下の抗体を使用した：抗ＦＡＮＣＤ２（ＦＩ−１７）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、抗ＨＡ（ＨＡ．１１、Ｂａｂｃｏｃｋ）、抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）（Ｓｉｇｍａ）、抗β−チューブリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、抗ＡＴＲ（Ｎ−１９）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、抗ホスホ−３１７−Ｃｈｋ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｃｈｋ１（Ｇ−４）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。
【０１８６】
インビトロでのキナーゼアッセイ
ＦＡＮＣＥのＧＳＴ融合タンパク質（２μｇ）を、精製した組み換え体Ｃｈｋ１（１００ｎｇ）（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに、１０μＣｉの［γ^３２Ｐ］−ＡＴＰを含む３０μｌのキナーゼ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣＬ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＭｎＣｌ_２、１ｍｍのＤＴＴ、１０μＭのＡＴＰ）の中でインキュベートした。キナーゼ反応を３０℃で３０分間インキュベートし、ＳＤＳ試料緩衝液の添加によって停止させ、５分間沸騰させ、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＸ線フィルムのオートラジオグラフィーによって分析した。インビトロでのキナーゼアッセイを、ポジティブ対照とネガティブ対照について、ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃ（２００〜２５６）およびＧＳＴを使用して行った。アッセイ条件は上記と同じとした。組み換え体ＦＡＮＣＥタンパク質（ｒＦＡＮＣＥｗｔおよびｒＴＳ／ＡＡ）（３μｇ）を１００ｎｇの精製した組み換え体Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＭＡＰＫＡＰ Ｋ２（ＭＫ２）（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、またはＧＳＴとともに、あるいはこれらを含まずに、３０μｌのキナーゼ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣＬ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＭｎＣｌ_２、１ｍｍのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ）の中で、３０℃で３０分間インキュベートした。キナーゼ反応をＳＤＳ試料緩衝液の添加によって停止させ、５分間沸騰させ、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、続いて、ウェスタンブロットによって抗ｐＴ３４６−ＦＡＮＣＥ抗体、抗ｐＳ３７４−ＦＡＮＣＥ抗体を用いて分析した。
【０１８７】
免疫沈降
免疫沈降はこれまでに記載されているとおりに行った。
【０１８８】
ｓｉＲＮＡとトランスフェクション
標的遺伝子の発現を、ＧＦＰに特異的なｓｉＲＮＡ（５’−ＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＣＴＣ−３’）、Ｃｈｋ１に特異的なｓｉＲＮＡ（５’−ＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＡＧＴＧＡＡＧＡ−３’）、ＡＴＲに特異的なｓｉＲＮＡ（５’−ＣＡＧＧＣＡＣＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡ−３’）の一時的な発現によってノックダウンさせた。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、製造業者のプロトコールにしたがって、Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。トランスフェクションの７２時間後、細胞をＤＮＡ損傷で処理した。
【０１８９】
免疫蛍光の顕微鏡試験
免疫蛍光顕微鏡試験のための細胞の準備は記載したとおりに行った、リンパ芽球細胞株を、ポリ−Ｄ−リジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でコーティングした培養スライド上で増殖させて、３６時間の間、接着を促進させ、その後、処理した。画像を、デジタルカメラを取り付けたＡｘｉｏｐｌａｎ ２結像型顕微鏡（ｉｍａｇｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して撮影し、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを使用して処理した。
【０１９０】
ＦＡＣＳ分析
Ｇ２／Ｍチェックポイントの分析とＤＮＡの複製は、これまでに記載されているとおりに行った（３０）。ｓｕｂ−Ｇ１集団を検出するためには、細胞を、ＭＭＣ（１６０ｎｇ／ｍｌ）での処理の０時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後に回収し、ＰＢＳで洗浄し、４℃で少なくとも１時間かけて７０％のエタノールの中で固定し（１０^６細胞／ｍｌ）、そして、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳの中で４℃で１５分間、透過処理した。ＰＢＳでの洗浄後、細胞を、２５／ｍｌ μｇのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ）と０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳの中に再懸濁させ、その後、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用してＦＡＣＳ分析を行った。細胞死は、ｓｕｂ−Ｇ１（２Ｎ未満のＤＮＡ含有量）集団として測定した。
【０１９１】
変異分析
変異は、特異的なプライマー対を使用した、ＤＦ１１７９細胞（ＦＡ−Ｅ）とＵ２ＯＳ細胞（対照）から精製した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅によって分析し、その後、両方の細胞株のｃＤＮＡを、ＦＡＮＣＥのエキソン１からエキソン１０までにまたがる様々なプライマーを使用してＤＮＡ配列決定によって分析した。
【０１９２】
【表３】

【０１９３】
【表４】

【０１９４】
【表５】

他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と組み合わせて記載されているが、上記の記載は、本発明を説明するように意図され、添付される特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するようには意図されない。他の態様、利点、および改変も、以下の特許請求の範囲に含まれる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、被験体のガンを処置する方法：
ａ）該ガン細胞がＤＮＡ修復経路を欠損しているか否かを決定する工程；および
ｂ）ＤＮＡ損傷剤、または工程（ａ）において同定された経路とは異なる少なくとも１つのＤＮＡ修復経路に特異的な阻害剤を、該被験体に投与する工程。
【請求項２】
以下の工程を含む、被験体のガンを処置する方法：
ａ）該ガン細胞がＤＮＡ修復経路を欠損しているか否かを決定する工程、
ｂ）該ガン細胞においてアップレギュレートされているＤＮＡ修復経路のタンパク質または遺伝子を同定する工程；および
ｃ）ＤＮＡ損傷剤、または工程（ｂ）において同定された該ＤＮＡ修復経路のタンパク質もしくは遺伝子に特異的な阻害剤を、該被験体に投与する工程。
【請求項３】
ＤＮＡ損傷剤、または工程（ａ）において同定された経路とは異なる少なくとも１つのＤＮＡ修復経路に特異的な阻害剤を、前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ガン細胞が、相同組み換えと架橋修復（ＦＡ／ＨＲ）によるＤＮＡ修復経路を欠損しており、前記薬剤がミスマッチ修復（ＭＭＲ）ＤＮＡ修復経路または非相同末端結合修復（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＮＨＥＪに特異的な前記薬剤がＡＴＭ阻害剤またはＤＮＡＰＫｃｓ阻害剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ガン細胞が、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）ＤＮＡ修復経路または非相同末端結合修復（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を欠損しており、前記薬剤が相同組み換えと架橋修復（ＦＡ／ＨＲ）によるＤＮＡ修復経路に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ損傷剤が、架橋剤、鎖を断裂させる薬剤（ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ａｇｅｎｔ）、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管破壊剤、放射線様作用薬剤、放射線増感剤、挿入剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アントラサイクリン、エトポシド、およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、特定のガン細胞について治療薬を選択するための方法：
ａ）正常な細胞と比較して、該ガン細胞における１つ以上ＤＮＡ修復経路の欠損を決定する工程；および
ｂ）ＤＮＡ損傷剤または工程（ａ）において同定されたＤＮＡ経路以外の少なくとも１つのＤＮＡ修復経路に特異的な阻害剤を選択する工程。
【請求項９】
ＤＮＡ修復経路の欠損を同定する工程を含む、化学療法薬に対するガン細胞の耐性を決定する方法であって、ここでは、該欠損の存在は、該細胞が該ＤＮＡ修復経路に特異的な化学療法薬に耐性であることを示す、方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ修復経路の欠損を同定する工程を含む、化学療法薬に対するガン細胞の感受性を決定する方法であって、ここでは、前記欠損が存在しないことは、前記細胞が前記ＤＮＡ修復経路に特異的な化学療法薬に対して感受性であることを示す、方法。
【請求項１１】
前記欠損が、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲの発現を測定することによって決定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記欠損が、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲの中の変異を検出することによって決定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記欠損が、ＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲの翻訳後修飾を検出することによって決定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記翻訳後修飾が、リン酸化、ユビキチン化、ｓｕｍｏ化、アセチル化、アルキル化、メチル化、グリシル化、グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイニル化、硫酸化、セレン化、およびＣ末端アミド生成からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ修復経路が以下からなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法：塩基除去修復（ＢＥＲ）、相同組み換えと架橋修復（ＦＡ／ＨＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、非相同末端結合修復（ＮＨＥＪ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、損傷乗り越えＤＮＡ合成（ＴＬＳ）、およびＤＮＡ損傷応答の制御（ＤＤＲ）。
【請求項１６】
相同組み換えと架橋による修復（ＦＡ／ＨＲ）のＤＮＡ修復経路の欠損を同定する工程を含む、ＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対するガン細胞の反応性を同定する方法であって、ここでは、該欠損の存在は、該細胞がＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対して感受性であることを示すが、存在しない場合には、効力は、該細胞がＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対して耐性であることを示す、方法。
【請求項１７】
前記架橋剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンＣ、またはメルファランである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＡ／ＨＲ ＤＮＡ修復経路の欠損が、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化を検出することによって決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ガン細胞を相同組み換えと架橋による修復（ＦＡ／ＨＲ）のＤＮＡ修復経路の阻害剤と接触させる工程を含む、ＤＮＡ架橋剤または電離放射線に対するガン細胞の反応性を増大させる方法。
【請求項２０】
前記架橋剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンＣ、またはメルファランである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記阻害剤が、ＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤またはＦＡ／ＨＲ ＤＮＡ修復経路の阻害剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＭＡＰ２ＫＡＰ２のリン酸化を検出する工程を含む、ＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤に対するガン細胞の反応性を同定する方法であって、ここでは、該リン酸化の存在は、該細胞がＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤に対して感受性であることを示し、一方、該リン酸化が存在しないことは、該細胞がＭＡＰ２ＫＡＰ２阻害剤に対して耐性であることを示す、方法。
【請求項２３】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）ＤＮＡ修復経路の欠損を同定する工程を含む、ＦＡ／ＨＲ ＤＮＡ修復経路の阻害剤に対するガン細胞の反応性を同定する方法であって、ここでは、該欠損の存在は、該細胞がＦＡ／ＨＲ ＤＮＡ修復経路の阻害剤に対して感受性であることを示し、一方、欠損が存在しない場合には、効力は、該細胞がＦＡ／ＨＲ ＤＮＡ修復経路の阻害剤に対して耐性であることを示す、方法。
【請求項２４】
前記ＦＡ／ＨＲ ＤＮＡ修復経路の阻害剤が、クルクミン、ベルケイド、またはアルステルパウロンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程を含む、ガンを有している被験体の処置をモニターする方法：
（ａ）第１の時点での該被験体由来の第１の試料中のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳ １〜２５９からなる群より選択される２つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの有効量のレベルを検出する工程；
（ｂ）第２の時点での該被験体由来の第２の試料中の２つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの有効量のレベルを検出する工程；および
（ｃ）工程（ａ）で検出された２つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの有効量のレベルを工程（ｂ）で検出された量に対して、または参照値に対して比較する工程。
【請求項２６】
以下の工程を含む、ガンを有している被験体の処置の有効性を評価する方法：
（ａ）該被験体由来の試料中のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳ１〜２５９からなる群より選択される２つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの有効量のレベルを測定する工程、および
（ｂ）該２つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳの有効量のレベルを参照値に対して比較する工程。
【請求項２７】
以下の工程を含む、ガンを有している被験体の処置をモニターする方法：
（ａ）該ガン細胞が第１の時点でＤＮＡ修復経路において欠損しているか否かを決定する工程；
（ｂ）該ガン細胞が、第２の時点で、工程（ａ）において同定された該ＤＮＡ修復経路において欠損しているか否かを決定する工程、
を含む方法であって、ここでは、該ＤＮＡ修復経路の該欠損の減少は、該処置が有効ではないことを示し、一方、該ＤＮＡ修復経路の増大またはそれに変化がないことは、該処置が有効であることを示す、方法。
【請求項２８】
以下からなる群より選択される２つ以上のＤＮＡ修復経路から選択される少なくとも２つのタンパク質を含むパネル：塩基除去修復（ＢＥＲ）、相同組み換えと架橋による修復（ＦＡ／ＨＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、非相同末端結合修復（ＮＨＥＪ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、損傷乗り越えＤＮＡ合成（ＴＬＳ）、およびＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）。
【請求項２９】
前記ＢＥＲ経路のタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項２８に記載のパネル：
【化１】

、およびアプラタキシン（Ａｐｔｘ）。
【請求項３０】
前記ＨＲ経路のタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項２８に記載のパネル：
【化２】

【請求項３１】
前記ＨＲ／ＦＡ経路のタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項２８に記載のパネル：
【化３】

【請求項３２】
前記ＭＭＲ経路のタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項２８に記載のパネル：
【化４】

【請求項３３】
前記ＤＤＲ経路のタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項２８に記載のパネル：
【化５】

【請求項３４】
前記ＮＥＲ経路のタンパク質が以下からなる群より選択される、請求項２８に記載のパネル：
【化６】

【請求項３５】
前記ＴＬＳ経路のタンパク質が、以下からなる群より選択される、請求項２８に記載のパネル：ＤＮＡＰＯＬη、ＤＮＡＰＯＬτ、ＤＮＡＰＯＬκ、ＲＥＶ１、ＤＮＡＰＯＬζ、ＤＮＡＰＯＬθ、ＰＣＮＡ、ＵＢＣ１３、ＭＭＳ２、ＲＡＤ５、ｈＲＡＤ６Ａ、ｈＲＡＤ６Ｂ、ＲＡＤ１８、ＷＲＮ、およびＵＳＰ１。
【請求項３６】
前記ＮＨＥＪ経路のタンパク質が、以下からなる群より選択される、請求項２８に記載のパネル：ＳＩＲＴ６、Ｈ２Ａ、ＡＲＰ４、ＡＲＰ８、Ｉｎｏ８０、ＳＷＲ１、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＤＮＡＰＫｃｓ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＰＳＯ２、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼ４、ＸＬＦ、ＤＮＡＰＯＬλ、ＰＮＫ、ＭＥＴＮＡＳＥ、およびＴＲＦ２。
【請求項３７】
以下からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質がさらに含まれている、請求項２８に記載のパネル：ＭＧＭＴ、ＴＤＰ１、ＤＮＡＰＯＬμ、ｈＡＢＨ１、ｈＡＢＨ２、ｈＡＢＨ３、ｈＡＢＨ４、ｈＡＢＨ５、ｈＡＢＨ６、ｈＡＢＨ７、ｈＡＢＨ８、ＴＯＰＯ１、ＴＯＰＯＩＩ、ＵＢＣ９、ＵＢＬ１、およびＭＭＳ２１。
【請求項３８】
少なくとも１つのファンコニ貧血タンパク質と少なくとも１つのミスマッチ修復タンパク質を含むパネル。
【請求項３９】
ＤＮＡＰＫＰｃｓタンパク質またはＰＡＲＰをさらに含む、請求項３８に記載のパネル。
【請求項４０】
前記ファンコニ貧血タンパク質が以下からなる群より選択される、請求項３８に記載のパネル：ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＪ、ＦＡＮＣＬ、およびＦＡＮＣＭ。
【請求項４１】
前記ミスマッチ修復タンパク質が以下からなる群より選択される、請求項３８に記載のパネル：ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５、およびＭＳＨ６。
【請求項４２】
ＤＮＡ修復またはＤＮＡの損傷の認識および調節タンパク質に関係している経路の指標である１つ以上のＤＮＡＲＭＡＲＫＥＲＳを含むパネル。
【請求項４３】
請求項２８〜４２のいずれか１項に記載のパネルを検出するための複数の検出試薬を含むアレイ。

【図１】

【図２】

【図３−１】

【図３−２】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９−１】

【図１９−２】

【図２０−１】

【図２０−２】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４−１】

【図２４−２】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５−１】

【図３５−２】

【図３６】

【図３７−１】

【図３７−２】

【図３７−３】

【図３８−１】

【図３８−２】

【図３８−３】

【図３９】

【図４０Ａ】

【図４０Ｂ】

【図４０Ｃ】

【図４０Ｄ】

【図４１Ａ】

【図４１Ｂ】

【図４１Ｃ】

【図４１Ｄ】

【図４１Ｅ】

【図４２】

【図４３】

【公表番号】特表２０１０−５０６９３９（Ｐ２０１０−５０６９３９Ａ）
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３３４０５（Ｐ２００９−５３３４０５）
【出願日】平成１９年１０月２２日（２００７．１０．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２４３９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６６６２４
【国際公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【出願人】（５９２０９０６９２）ダナ　ファーバー　キャンサー　インスティテュート，インコーポレイテッド (20)
【出願人】（５０９１１０９６５）ドナー，　インコーポレイテッド (3)
【出願人】（５０６１２４２３９）オレゴン　ヘルス　アンド　サイエンス　ユニバーシティ (8)
【Ｆターム（参考）】