ガン細胞に特異的な抗体を見出すための方法およびそれによって見出される抗体
正常な細胞に対してではなく、ガン細胞に結合する抗体が、負の選択プロセスを使用して同定される。本発明の方法は、ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；該抗血清をヒト赤血球と接触させる工程；および該抗血清の、該ヒト赤血球に結合しない部分を回収する工程を包含する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、前記抗血清を、ヒト白血球に結合する抗体と接触させる工程；および、該抗血清の、該ヒト白血球に結合しない部分を回収する工程をさらに包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は米国仮特許出願第６０／５８６，８１１号（２００４年７月１０日出願）の優先権を主張する（その開示はその全体が本明細書中に援用される）。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、望ましい特徴を有する抗体を多様な抗体の集団から選択するための方法に関連する。より具体的には、本開示は、ガン細胞には結合するが、ヒトの赤血球にも、白血球にも、正常な組織細胞にも結合しない抗体を同定するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の背景）
モノクローナル抗体治療の有望性が実現され始めようとしている。効力が、腫瘍細胞の表面抗原（例えば、Ｂ細胞イディオタイプ、悪性Ｂ細胞上のＣＤ２０、白血病性芽細胞上のＣＤ３３、乳ガン上のＨＥＲ２／ｎｅｕなど）を標的とする抗体を使用する臨床研究において認められている。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕオンコプロテインの過剰発現を伴う一部の転移性乳ガン患者において目的の応答をもたらしている。これらの興奮させる結果は、抗体に基づく新しいガン治療戦略を開発するために既存のアプローチのさらなる精緻化のための基礎を提供している。転移性結腸ガンの処置におけるＥｒｂｉｔｕｘ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｃ２２５、抗ＥＧＦｒ、ＩｍＣｌｏｎｅ）、ならびに、結腸ガン、腎細胞ガンおよび他の充実性腫瘍の処置におけるＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ、抗ｖＥＧＦｒ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含めた化学療法との併用または非併用でのモノクローナル抗体の最近の臨床結果は、モノクローナル抗体がガン患者のために有益であり得ることを強く実証している。現在、多数の臨床試験が、前立腺ガンの処置のためにモノクローナル抗体を用いて行われている。
【０００４】
ハイブリドーマ技術、ファージディスプレーまたは他の技術（例えば、リボソームディスプレーおよび酵母ディスプレーなど）によるマウスモノクローナル抗体の作製が基礎科学および臨床科学の両方のために特に重要である。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ＥｒｂｉｔｕｘおよびＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂはもともと、抗原により免疫されたマウスからスクリーニングされた。
【０００５】
多くの研究が、細胞全体による免疫、続いて、ガン細胞の表面分子に結合する抗体のスクリーニングによって、ガン細胞に対する抗体を見い出すために行われている。このアプローチの理論は非常に魅力的ではあるが、数年の努力の後でも、治療抗体はほとんど見出されていなかった。このアプローチは、いくつかの理由から困難であることが判明している。１つの理由は、ガン細胞は多くの共通する表面抗原を正常な細胞と共有するので、ガン細胞が免疫原として使用されたとしても、マウスにおける免疫応答が腫瘍特異的でないことである。従って、腫瘍特異的な抗体についてスクリーニングすることは非常に困難かつ／または無益であることが判明し得る。
【０００６】
ガン細胞が共通の抗原を正常な細胞と共有することは一般的な現象である。従来、負の選択および正の選択が、腫瘍特異的な抗体についてスクリーニングするために使用されている。腫瘍特異的な抗体についてスクリーニングすることを容易にするために、負の選択は、正の選択を妨害する、正常な細胞およびガン細胞の両方に共通する抗原の問題に取り組むために使用される一般的な方法である。数多くの刊行物では、正常な組織細胞が、ガン細胞および正常な細胞の両方にある共通の抗原に結合する望ましくない抗体をサブトラクションするために使用されている。非特許文献１〜３を参照のこと。しかしながら、これらの刊行物のほとんどは１つのタイプの正常な組織細胞または１対の正常な細胞株をサブトラクションのために使用しているだけである。
【０００７】
以前の試みはまた、サブトラクティブ免疫と呼ばれる代わりの方法によってこの問題を解決するために行われていた。集中的な研究が、過去１５年間にわたってサブトラクティブ免疫を用いて行われている。サブトラクティブ免疫は細胞全体でのパンニング工程の代わりに免疫工程に焦点を合わせている。サブトラクティブ免疫では、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の生成を高めることができる異なった免疫寛容化アプローチが利用される。サブトラクティブ免疫は、目的とする抗原に構造的または機能的に関連し得る免疫優性抗原またはそうでない場合には望ましくない抗原に対して宿主動物を寛容化することに基づいている。宿主動物の寛容化は３つの方法（ハイゾーン寛容化、新生児寛容化または薬物誘導寛容化）のうちの１つによって達成することができる。寛容化された動物には、その後、所望の抗原が接種され、その後の免疫応答によって生じた抗体が所望の反応性についてスクリーニングされる。しかしながら、最近の研究では、新生児「寛容化」は、免疫学的意味での寛容性ではなく、免疫偏向を誘導することが示唆された。新生児は免疫特権を有しないが、免疫様式に依存して、ＴＨ２応答またはＴＨ１応答を生じさせる。シクロホスファミドを用いた化学的免疫抑制は最も効果的なサブトラクティブ免疫技術であった。当業者が理解するように、正常細胞による免疫、その後のシクロホスファミド処置は、正常細胞の抗原との反応性を有する増殖中の免疫細胞のすべてを殺すことになる。しかしながら、このレジメンではまた、Ｂ細胞の成熟および分化のために要求されるヘルパーＴ細胞のすべてが殺される。従って、このレジメンの後に、腫瘍抗原に対して特異的な抗体を誘発させるためのガン細胞免疫が続く場合、ＩｇＭイソタイプの低親和性抗体のみが生じるだけである。
【非特許文献１】Ｚｉｊｌｓｔｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３（４月１１日）、３０３（３）：７３３〜４４
【非特許文献２】Ｈｏｏｐｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００３（３月２７日）、２２（１２）：１７８３〜９４
【非特許文献３】Ｆｏｓｓ、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００２（１月）、２９（３ Ｓｕｐｐｌ ７）：５〜１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ガン細胞の表面分子に結合する抗体を同定するために抗体ライブラリーをスクリーニングするための改善された方法を有することは好都合である。ガン罹患個体を処置するための改善された方法もまた望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
正常な細胞に対してではなく、ガン細胞に結合する抗体が、負の選択プロセスを使用して同定される。ガン細胞を用いた動物の免疫によって生じる抗体のライブラリーが、赤血球および／または白血球、ならびに、必要に応じて、他の正常な細胞（すなわち、非ガン性細胞）と接触させられる。これらの血球および／または正常な細胞は、そのような細胞に結合する抗体とともに除かれ、これにより、ガン細胞には結合するが、（負の選択プロセスの除去効果に起因して）正常な細胞にはほとんど結合を示さないかまたは全く結合を示さない抗体を同定するためにガン細胞に対してパンニングすることができる抗体のサブライブラリーが残る。このような抗体は治療目的および／または診断目的のために使用することができる。
【００１０】
従って、１つの実施形態において、本発明の方法は、ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；該抗血清をヒトの血球（赤血球および／または白血球）および必要に応じて正常な組織細胞と接触させる工程；ならびに、該抗血清のうちの、該ヒト赤血球に結合しない部分を回収する工程を含む。別の実施形態において、ガン細胞により免疫された被験体からの抗血清が集められ；ヒトの血球（赤血球および／または白血球）および必要に応じて正常な組織細胞に結合する抗体が該抗血清から除かれ；そして、前記ガン細胞に結合する抗体が該抗血清から除かれる。さらに別の実施形態において、本発明の方法は、ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；ヒト赤血球に結合する抗体、および、少なくとも１つの他のタイプの非ガン性細胞に結合する抗体を該抗血清から除く工程；ならびに、該ガン細胞に結合する抗体を該抗血清から回収する工程を含む。
【００１１】
特に有用な実施形態において、これらの方法は、ファージディスプレーされた抗体ライブラリーを、ガン細胞により免疫された被験体から集められた細胞を使用して作製する工程；ヒト赤血球に結合するライブラリーメンバーを除いてサブライブラリーを作製する工程；および、該ガン細胞に結合する抗体を呈示するメンバーを該サブライブラリーから回収する工程を含む。
【００１２】
別の実施形態において、本開示は、以下のいずれかを含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体に関連する：
【００１３】
【化７−１】
【００１４】
【化７−２】
他の実施形態において、本開示は、配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体に関連する。
【００１５】
前記抗体のいずれかをコードする単離された核酸、そのような単離された核酸を含有する発現ベクター、および、そのような発現ベクターによりトランスフェクションされた宿主細胞もまた意図される。
【００１６】
さらに別の実施形態において、本開示は、ガン細胞をハプテン（例えば、ジニトロフェニルなど）と接触させる工程；ファージディスプレーされた抗体ライブラリーを、該ガン細胞により免疫された被験体から集められた細胞を使用して作製する工程；ヒト赤血球に結合するライブラリーメンバーを除いてサブライブラリーを作製する工程；および、該ガン細胞に結合する抗体を呈示するメンバーを該サブライブラリーから回収する工程を含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書中に記載される主題のより完全な理解のために、添付されている線図を考慮して、下記の詳細な説明を参照すべきである。
【００１８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
厳しい負の選択が、腫瘍特異的な抗体についてスクリーニングするために本開示に従って使用される。本開示による厳しい負の選択戦略には、細胞全体でのパンニング時におけるヒト血球および必要に応じて正常組織細胞による多段階のサブトラクションが含まれる。本発明の方法では、正常なヒト細胞（特に、血球）に結合する選択された抗体の数が著しく低下する。これらの方法は、細胞全体でのパンニング法による改善された抗体多様性を示し、ガンの診断剤および治療剤のための腫瘍特異的な抗体を選択するための方法を提供する。治療目的のために、本明細書中に記載される方法に従って同定された抗体は、正常な血球に対する低下した副作用を有するようである。この特徴により、ガン治療のための抗体の安全性プロフィールが改善されるはずである。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、選択された標的に結合することができる、完全な抗体または抗体フラグメントをいう。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、操作された抗体（キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体およびヒト化抗体、完全なヒト抗体、ならびに、人為的に選択された抗体が挙げられる）、ならびに、ファージディスプレー技術または代わりの技術を使用して作製される合成または半合成の抗体が含まれる。小さいフラグメント（例えば、ＦｖおよびｓｃＦｖなど）は、その小さいサイズ、および、その結果としての優れた組織分布によって、診断適用および治療適用のために有利な性質を有する。
【００２０】
本発明の抗体は、抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。抗体ライブラリーを作製するための様々な技術が当業者の範囲内である。ＲａｄｅｒおよびＢａｒｂａｓ、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）；米国特許第６，２９１，１６１号（Ｌｅｒｎｅｒら）ならびに同時係属中の米国特許出願公開第２００４００７２１６４Ａ１号および同第２００４０１０１８８６Ａ１号を参照のこと（それらの開示は本参照によりその全体が本明細書中に援用される）。抗体は、例えば、免疫剤および所望される場合にはアジュバントの１回または複数回の注射によって被験体において惹起させることができる。免疫剤には、任意のタイプのガン細胞またはそのフラグメントが含まれ得る。代表的には、免疫剤および／またはアジュバントは複数回の皮下注射または腹腔内注射によって被験体に注射される。好適なアジュバントとしては、ガン細胞ワクチンに関連して使用されているアジュバント、例えば、非メチル化ＣｐＧモチーフおよびカルメットゲラン杆菌（ＢＣＧ）などが挙げられるが、これらに限定されない。免疫プロトコルが、過度な実験を用いることなく当業者によって選択され得る。
【００２１】
任意のタイプのガン細胞を、本発明の方法に従って被験体を免疫するために使用することができる。好適なタイプのガン細胞としては、造血系悪性疾患、メラノーマ、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、結腸ガン、頭頸部ガン、肺ガン、腎臓ガン、胃ガン、膵臓ガン、肝臓ガン、膀胱ガンおよび脳のガンが挙げられるが、これらに限定されない。ガン細胞は様々な供給源から得ることができる。例えば、ガン細胞の一次サンプルを外科的技法または生検によって患者から直接に得ることができる。ガン細胞はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ，Ｉｎｃ．（「ＮＤＲＩ」）（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から入手することができる。様々なタイプのガン細胞がまた、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）（「ＡＴＣＣ」）または他の寄託機関（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅなど）に寄託されており、そのような機関から入手可能である。ガン細胞のフラグメント（例えば、細胞膜またはミトコンドリアなど）が免疫剤として使用される場合、当業者の範囲に含まれる様々な技術を、ガン細胞を破壊し、免疫における使用のための好適な成分を単離するために用いることができる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ガン細胞上のエピトープに対する抗体応答の強化が、ハプテン（例えば、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）など）による修飾によって達成される。ＤＮＰは、ガン細胞を、免疫系によってより容易に認識されるようにする非常に免疫原性のハプテンである。ＤＮＰは、ハプテンの立体配置を有する芳香族化合物（ニトロ基で二置換されたベンゼン環）である。ハプテンは、抗体に結合することができるが、それ自身では抗体応答を誘発することができず、しかし、キャリアタンパク質に連結されたときには抗体応答を誘発する抗原性決定基である。ＤＮＰ修飾された自己ガン細胞ワクチンは、遅延型過敏性、前炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γなど）の放出、ならびに、ＣＤ４およびＣＤ８の両方のＴ細胞サブセットの増幅によって特徴づけられる堅固な免疫応答を誘発することが示されている。低密度抗原のＤＮＰ修飾はＢ細胞を免疫原部位に優先的に引き寄せ、ＤＮＰ修飾の抗原に対する応答におけるＢ細胞の認識および増幅を可能にする。免疫原へのＢ細胞移動およびその後の増幅のプロセスは炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｒｏｙ）サイトカインの放出によってさらに助けられ得る。ＤＮＰ修飾を、当業者の範囲に含まれる様々な技術を使用して、例えば、Ｂｅｒｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２：４０３（２００４）；およびＳｏｊｋａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ １：２００（２００２）に記載される技術などを使用して達成することができる。
【００２３】
一旦免疫応答が被験体において誘発されると、抗体を選択プロセスのために集めることができる。抗体を産生または含有する組織からの細胞が、最後の免疫が行われてから約３日後〜５日後に被験体から集められる。好適な組織としては、血液、脾臓、リンパ節および骨髄が挙げられる。
【００２４】
一旦細胞が集められると、ＲＮＡが、当業者に知られている技術を使用してその細胞から単離され、コンビナトリアル抗体ライブラリーが調製される。一般に、コンビナトリアル抗体ライブラリーを調製するための技術は、抗体の単離されたＲＮＡを使用して、抗体またはその一部分（例えば、軽鎖および／または重鎖など）をコードする標的配列を増幅することを含む。従って、例えば、天然では多様である抗体ｍＲＮＡのサンプルを用いて出発して、第１鎖ｃＤＮＡを、テンプレートを提供するために作製することができる。その場合、従来のＰＣＲまたは他の増幅技術を、ライブラリーを作製するために用いることができる。いくつかの実施形態では、抗体Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ重鎖フラグメントに複合体化されたκ軽鎖またはλ軽鎖（Ｆｄ））を発現するファージライブラリーが、米国特許出願第１０／２５１，０８５号（その開示は本参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載される方法を使用してプラスミドベクターにおいて構築される。
【００２５】
ファージディスプレーライブラリーは、その後、ガン細胞に対する抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、抗体の結合特異性が、インビトロ結合アッセイによって、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などによって決定される。そのような技術およびアッセイがこの分野では知られている。抗体の結合親和性を、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０））のスキャッチャード分析によって決定され得る。
【００２６】
本明細書中に記載される方法によれば、ガン細胞に対する正の選択を行った後、ヒト血球（赤血球または白血球または両者のいずれか）、および、必要に応じて、正常な（すなわち、非ガン性の）組織細胞が、ライブラリーのスクリーニングの前に厳しいサブトラクションを行う際の吸収剤として使用される。サブトラクションプロセスにおいて使用される適切なヒト正常組織細胞としては、肝臓、肺、心臓、腎臓、腸、胃、膀胱、脾臓、膵臓、骨髄、脳、胸腺、前立腺、卵巣、精巣および皮膚などのような組織から単離された内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞および他の細胞が挙げられる。適切な組織は、例えば、正常なドナーから、または、後期段階の胎児から、または、これらの組織から樹立された細胞株から得ることができる。
【００２７】
サブトラクションは、抗体のライブラリーを正常な細胞と接触させ、その後、正常な細胞を、それに結合した何らかの抗体と一緒に除くことによって行うことができる。細胞の除去を、当業者の範囲に含まれる任意の技術（例えば、遠心分離など）を使用して達成することができる。未結合の抗体を含有する上清が保持される。なぜならこれは、上清が、正常な細胞に対してではなく、ガン細胞に結合する抗体のサブライブラリーを含有する部分であるからである。正常な細胞に結合する抗体のすべてを確実に除くことを助けるために、複数回のサブトラクションが行われる。複数回のサブトラクションを、同じタイプまたは異なるタイプの細胞を使用して行うことができる。特に有用な実施形態において、赤血球を使用する少なくとも３回のサブトラクションが行われる。１つの実施形態において、サブトラクションが赤血球（異なる細胞型（例えば、Ａ型、Ｂ型など）を用いて３回）および白血球（１回）の両方により行われる。他の実施形態において、複数回のサブトラクションが、少なくとも２つのタイプの非ガン性細胞（すなわち、少なくとも１つのタイプの血球および少なくとも１つの他のタイプの正常な組織細胞）を使用して行われる。好都合なことに、正常な組織は、免疫のために使用されたガン細胞と同じタイプの組織に由来し得る。例えば、被験体が膵臓ガン細胞により免疫されたならば、正常な（すなわち、非ガン性の）膵臓組織細胞が、サブトラクションを行うために使用される。
【００２８】
負の選択を行う際には、赤血球または他の吸収剤細胞に対する抗体ファージの比率が、過度な実験を伴うことなく当業者によって選択され得る。いくつかの実施形態において、赤血球１個あたり７００個〜１０００個のファージを使用することができる。
【００２９】
十分な数のライブラリーメンバーを提供するために、サブライブラリーは、各回のサブトラクションの間において、そして／または、ガン細胞に結合する抗体についてのスクリーニングの前に増幅することができる。増幅のための技術は当業者の範囲内である。
【００３０】
負の選択プロセスの後、組換えライブラリーに由来する抗体を、標的特異性に基づいて抗体を単離するために、ガン細胞またはガン細胞に由来するポリペプチドを使用して選択することができる。上記で記されたように、ガン細胞に結合する抗体を選択するための適切な技術は当業者の範囲内である。
【００３１】
ハイブリドーマ法もまた、所望の特徴を有する抗体を同定するために使用することができる。そのような技術は当業者の範囲内である。ハイブリドーマ法では、マウス、ウサギ、ラット、ハムスターまたは他の適切な宿主動物が代表的には、ガン細胞に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘発するために、（同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２４２６１号（発明の名称：「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｓｋｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ａｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ」、これはＥｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌラベル番号ＥＬ９８３５６８２７８ＵＳで２００５年７月８日に出願された）（その開示はその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されるようにマスキングされた）ガン細胞により免疫される。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫することができる。その後、リンパ球は、好適な融合剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞が形成される（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）、ｐｐ．５９〜１０３；Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）、ｐｐ．５１〜６３を参照のこと、これらの開示は本参照により本明細書中に援用される）。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を好ましくは含有する適切な培養培地において培養される。その後、ハイブリドーマ細胞が培養されている培養培地を、当業者の範囲に含まれる技術（例えば、ＦＡＣＳ分析など）を使用して、ガン細胞に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができ、また、本開示の方法に従って負の選択に供してもよい。所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈手順によってサブクローン化し、そして標準的な方法によって増殖させ得る。あるいは、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物において腹水としてインビボで増殖させ得る。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地または腹水から単離または精製される。
【００３２】
ガン細胞に結合するが、正常な細胞に対する結合をほとんどまたは全く示さないモノクローナル抗体を、当業者の範囲に含まれる組換えＤＮＡ法によって作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して、（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定することができる。（抗体を同定するために用いられた特定の選択方法に依存して）ハイブリドーマ細胞またはファージがそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立ち得る。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、その後、発現ベクターは、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るために、宿主細胞（例えば、そうでない場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは、ＮＳＯ細胞または他のミエローマ細胞など）にトランスフェクションされる。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインについてのコード配列を相同的なマウス配列の代わりに置換することによって、または、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部を免疫グロブリンのコード配列に共有結合的に連結することによって改変することができる。
【００３３】
さらなる実施形態では、ガン細胞において特有に発現するタンパク質を、本開示による抗体を用いて、当業者に周知の方法によって同定するための方法が提供される。１つの方法において、Ｆａｂ抗原またはｓｃＦｖ抗原が免疫沈降および質量分析によって同定される。具体的には、これらの抗体についての抗原を同定するための１つのそのような方法では、ｓｃＦｖが、細胞表面がビオチン化されたガン細胞のミクロソーム画分から調製された溶解産物から抗原を免疫沈降させるために使用される。具体的には、ガン細胞がＰＢＳ（ｐＨ８．０）における０．５ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンの溶液により３０秒間標識される。ＰＢＳにより洗浄して未反応のビオチンを除いた後、細胞を窒素キャビテーションによって破壊し、ミクロソーム画分を示差的遠心分離によって単離する。ミクロソーム画分をＮＰ４０溶解緩衝液に再懸濁し、正常なマウス血清およびプロテインＡセファロースにより徹底的に予備クリアランスする。抗原を、ラット抗ＨＡアガロースビーズに結合させたＨＡタグ化ｓｃＦｖ抗体により免疫沈降させる。免疫沈降後、抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を使用するウエスタンブロットによって、または、クーマシーＧ−２５０染色によって検出する。ガン細胞に結合しない抗体を陰性対照として使用する。抗原のバンドをクーマシー染色ゲルから切り出し、質量分析（ＭＳ）によって同定する。免疫沈降した抗原はまた、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）またはマイクロキャピラリー逆相ＨＰＬＣナノエレクトロスプレータンデム質量分析（μＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって同定することができる。同定された抗原は、その後、当業者の範囲に含まれる技術を使用してそれに対するさらなる抗体を誘発させるための免疫原として使用され得る。
【００３４】
本開示に従って、ガン細胞には結合するが、正常な細胞に対する結合をほとんどまたは全く示さない本発明の抗体にはさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体が含まれ得る。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラな免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖またはフラグメント（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗原結合性部分配列など）である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラットまたはウサギなど）のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体あるいは移入されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含む場合がある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ（代表的には２つ）の可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが１つまたは複数の非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そして、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２））。
【００３５】
非ヒト抗体をヒト化するための方法が当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、１個または複数個のアミノ酸残基がヒト以外の供給源からヒト化抗体に導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、代表的には「ドナー」の可変ドメインから得られるので、「ドナー」残基と呼ばれることが多い。ヒト化は本質的には、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））の方法に従って実施され得る。従って、そのような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクトではないヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラな抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際、ヒト化抗体は代表的には、すべてまたは一部のＣＤＲ残基、および、可能であれば、一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体において類似した部位に由来する残基によって置換されたヒト抗体である。
【００３６】
本発明の抗体は一価の抗体であってもよい。一価の抗体を調製するための様々な方法が当該分野で周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリンの軽鎖および改変された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、重鎖の架橋を妨げるように、一般にはＦｃ領域内の任意のところで短縮化される。あるいは、関係したシステイン残基が、架橋を妨げるように、別のアミノ酸残基で置換されるか、または、欠失される。インビトロ方法もまた、一価の抗体を調製するために適切である。抗体のフラグメント（特に、Ｆａｂフラグメント）を作製するための抗体の消化を、当該分野で公知の慣用的な方法を使用して達成することができる。
【００３７】
他の実施形態では、二重特異性抗体が意図される。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体（好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体）である。この場合において、結合特異性の一方はガン細胞に対してであり、もう一方は任意の他の抗原に対するものであり、好ましくは、細胞表面のタンパク質または受容体または受容体サブユニットに対するものである。
【００３８】
二重特異性抗体を作製するための方法が当業者の範囲内である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいている（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７〜５３９（１９８３））。所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合することができる。融合は好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインの内部である。免疫グロブリン重鎖融合体、および、所望されるならば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが別々の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に同時トランスフェクションされる。二重特異性抗体を作製するための例示的な現在知られている方法のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０（１９８６）；国際特許出願公開ＷＯ９６／２７０１１；Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）；Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｙ．Ｍｅｄ．、１７５：２１７〜２２５（１９９２）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）；Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８（１９９４）；およびＴｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：６０（１９９１）を参照のこと。
【００３９】
本発明の抗体はガン患者に治療剤として投与することができる。本発明の抗体は、ヒトの血球または正常な組織細胞に対する結合をホトンドまたは全く示さないので、低下した副作用が、他の抗体治療と比較して観察され得る。
【００４０】
本発明の抗体はまた、ガン性細胞をインビボで検出するために利用することができる。これは、抗体を標識し、標識された抗体を被験体に投与し、その後、被験体を画像化することによって達成される。本開示に従った診断的画像化のために有用な標識の例は、放射性標識（例えば、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃおよび１８８Ｒｎなど）、蛍光性標識（例えば、フルオレセインおよびローダミンなど）、核磁気共鳴活性な標識（陽電子放射断層撮影法（「ＰＥＴ」）走査装置によって検出可能な陽電子放射同位体）、化学発光剤（例えば、ルシフェリンなど）および酵素マーカー（例えば、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼなど）である。短距離放射線放出剤（例えば、短距離検出器プローブ（例えば、経直腸プローブなど）によって検出可能な同位体など）もまた用いることができる。これらの同位体および経直腸検出器プローブは、組み合わせて使用されたとき、前立腺窩再発および骨盤結節性疾患を検出することにおいて特に有用である。この抗体は、当該分野で公知の技術を使用してそのような試薬により標識され得る。抗体の放射性標識化に関連する技術については、例えば、ＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ、Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８３）を参照のこと（これは本明細書に参考として援用される）。また、Ｄ．Ｃｏｌｃｈｅｒら、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ Ａｔｈｙｍｉｃ Ｍｉｃｅ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１：８０２〜８１６（１９８６）も参照のこと（これは本明細書に参考として援用される）。
【００４１】
本開示による放射性標識された抗体は、インビトロ診断試験のために使用することができる。抗体、その結合性部分、プローブまたはリガンドの比活性は、放射能標識の半減期、同位体純度、および、標識が生物学的因子にどのように組み込まれるかに依存する。免疫アッセイ試験では、比活性が高いほど、一般に感度が良好である。抗体を放射性同位体で標識するための様々な手順は、当該分野で一般に公知である。
【００４２】
放射性標識された抗体を患者に投与することができ、ここで、放射性標識された抗体は、その抗体が反応する抗原を有する腫瘍に局在し、そして、放射性標識された抗体が、公知の技術を使用して、例えば、ガンマカメラまたは放射断層撮影法を使用する放射性核走査などを使用してインビボで検出または「画像化」される。例えば、Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍａｇｉｎｇ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、ｐｐ．６５〜８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８５）を参照のこと（これは本明細書に参考として援用される）。あるいは、陽電子放射長軸断面断層撮影走査装置（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓａｘｉａｌ ｔｏｍｇｒａｐｈｙ ｓｃａｎｎｅｒ）（例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ国立研究所に設置された指定のＰｅｔ ＶＩなど）を使用することができ、この場合、放射性標識は陽電子（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎ）を放射する。
【００４３】
発蛍光団および発色団で標識された生物学的因子を、当該分野で公知の標準的な部分から調製することができる。抗体および他のタンパク質は、約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するので、蛍光性部分は、３１０ｎｍを超える波長で、好ましくは、４００ｎｍを超える波長で実質的な吸収を有するように選択されるべきである。様々な適切な蛍光体および発色団が、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６２：５２６（１９６８）；およびＢｒａｎｄ，Ｌ．ら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１：８４３〜８６８（１９７２）によって記載される（これらは本明細書に参考として援用される）。抗体を、従来の手順によって、例えば、米国特許第３，９４０，４７５号、同第４，２８９，７４７号および同第４，３７６，１１０号（これらは本明細書に参考として援用される）に開示される手順などによって蛍光性の発色団基で標識することができる。
【００４４】
本発明の抗体はまた、ガン性細胞をインビボで殺すか、または除去するために利用することができる。これは、細胞傷害性薬物に結合した抗体を、そのような処置を必要とする被験体に投与することを含む。この抗体はガン細胞を認識するので、抗体が結合するそのような細胞はどれも破壊される。厳しいサブトラクション技術が使用されるので、破壊される正常な細胞の量は最小限である。
【００４５】
本開示の抗体は、治療的薬物、放射線放出化合物、植物起源、真菌起源または細菌起源の分子、生物学的タンパク質、および、それらの混合物を含めて、様々な細胞傷害性薬物を送達するために使用することができる。細胞傷害性薬物は、細胞内で作用する細胞傷害性薬物であり得、例えば、短距離高エネルギーα線放射体をはじめとする短距離放射線放射体などが可能である。酵素活性な毒素およびそのフラグメントが、例えば、ジフテリア毒素Ａフラグメント、ジフテリア毒素の非結合性の活性なフラグメント、外毒素Ａ（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サクリン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）のある種のタンパク質、ディアンチン（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）のある種のタンパク質、ヨウシュウヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）のタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（Ｍｏｒｏｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）の阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の阻害剤、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）によって例示される。免疫毒素の酵素活性なポリペプチドを調製するための手順が国際特許出願公開ＷＯ８４／０３５０８および同ＷＯ８５／０３５０８に記載される（これらは本明細書に参考として援用される）。ある種の細胞傷害性部分は、例えば、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキサート、ネオカルジノスタチンおよび白金に由来する。
【００４６】
抗体を細胞傷害性薬剤と結合体化するための手順は、以前から記載されている。
【００４７】
あるいは、抗体を、腫瘍部位において局在化したとき、細胞数個分の直径の殺傷をもたらす高エネルギー放射線放射体、例えば、放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、γ線放射体など）などに結合することができる。例えば、Ｓ．Ｅ．Ｏｒｄｅｒ、「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、ｐｐ．３０３〜３１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８５）を参照のこと（これは本明細書に参考として援用される）。他の好適な放射性同位体としては、α線放射体（例えば、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉおよび２１１Ａｔなど）およびβ線放射体（例えば、１８６Ｒｅおよび９０Ｙなど）が挙げられる。放射線治療は、前立腺ガンが比較的放射線感受性の腫瘍であるので、前立腺ガンに関連して特に効果的であることが期待される。
【００４８】
抗体が、ガン細胞を殺すために、または除去するために単独で使用される場合、そのような殺傷または除去は、内因性の宿主免疫機能（例えば、補体媒介または抗体媒介による細胞の細胞毒性など）を開始させることによって行うことができる。
【００４９】
抗体投与経路は、既知の方法に従って、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、脳内経路、筋肉内経路、皮下経路、眼内経路、動脈内経路、クモ膜下経路、吸入経路または病巣内経路による注射または注入に従って、あるいは、持続放出システムによってである。抗体は好ましくは、注入またはボーラス注射によって連続的に投与される。抗体を局所様式または全身様式で投与することができる。
【００５０】
本発明の抗体は、医薬的に許容され得るキャリアとの混合物で調製することができる。本適用の化合物を処方および投与するための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る。このような治療用組成物は、好ましくは液体または（凍結乾燥された）粉末エアロゾルとして、静脈内に、あるいは、鼻または肺を介して投与することができる。この組成物はまた、所望に応じて非経口的または皮下に投与することができる。全身投与されるとき、この治療用組成物は、無菌で発熱物質を含有せず、かつ、ｐＨ、等張性および安定性について十分に考慮して、非経口投与に許容され得る溶液であるべきである。これらの条件は当業者に公知である。
【００５１】
使用に適切な医薬組成物には、本発明の抗体の１つまたは複数が、それらの意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療に効果的な量は、疾患の症状を防止するか、または軽減するか、または改善するために、あるいは、処置されている被験体の生存を延ばすために効果的な抗体の量を意味する。治療に効果的な量の決定は、特に、本明細書中に提供される詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内である。治療に効果的な投薬量を、様々なインビトロ方法およびインビボ方法を使用することによって決定することができる。
【００５２】
さらなる実施形態において、本明細書中前記に記載されるガン結合性抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡが作製される。用語ＤＮＡには、コードする一本鎖ＤＮＡ、前記コードＤＮＡおよびそれに対する相補的ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ、または、これらの相補的な（一本鎖）ＤＮＡそのものが含まれる。
【００５３】
さらに、本明細書中に開示されるガン結合性抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする真のＤＮＡ配列あるいはその変異体を有する酵素的または化学的に合成されたＤＮＡであり得る。真のＤＮＡの変異体は、１つまたは複数のアミノ酸が欠失されたか、あるいは、１つまたは複数の他のアミノ酸と交換された、上記抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。好ましくは、前記改変は、ヒト化および発現最適化の適用においては抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側である。変異体ＤＮＡという用語はまた、１つまたは複数のヌクレオチドが他のヌクレオチドによって置換され、その新しいコドンが同じアミノ酸をコードするサイレントな変異体を包含する。変異体配列という用語にはまた、縮重配列が含まれる。縮重配列は、限定されない数のヌクレオチドが、最初にコードされたアミノ酸配列の変化を生じさせることなく他のヌクレオチドによって置換されているという点で、遺伝暗号の意味の範囲内で縮重している。そのような縮重配列は、その異なる制限部位、あるいは、重鎖のマウス可変ドメインおよび／または軽鎖のマウス可変ドメインの最適な発現を得るために特定の宿主（特に、大腸菌）によって好まれる特定のコドンの頻度、あるいはそのような制限部位と頻度の両者に起因して有用であり得る。
【００５４】
変異（体）の用語は、当該分野で公知の方法に従って真のＤＮＡのインビトロ変異誘発によって得られるＤＮＡ変異体を含むことが意図される。
【００５５】
完全な四量体免疫グロブリン分子の組み立ておよびキメラ抗体の発現のために、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡインサートが、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡと融合され、その後、例えば、ハイブリッドベクターへの組み込みの後、適切な宿主細胞に移される。
【００５６】
ヒトＩＧｇ重鎖定常ドメイン（例えば、γ１、γ２、γ３またはγ４、好ましくはγ１またはγ４）に融合された、本明細書中に開示される細胞株に対する抗体の重鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡもまた提供される。ヒト定常ドメインのκまたはλ（好ましくはκ）に融合された、本明細書中に開示される細胞株に対する抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡもまた提供される。
【００５７】
別の実施形態は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインがスペーサー基によって連結される組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡに関連し、この組換えＤＮＡは、必要に応じて、宿主細胞における抗体のプロセシングを容易にするシグナル配列、あるいは、抗体の精製を容易にするペプチドおよび／または切断部位および／またはペプチドスペーサーおよび／またはエフェクター分子をコードするＤＮＡを含むか、あるいはそのようなシグナル配列とＤＮＡの両者を含む。
【００５８】
エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断適用または治療適用において有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡであることが意図される。従って、毒素または酵素（特に、プロドラッグの活性化を触媒することができる酵素）であるエフェクター分子が特に示される。そのようなエフェクター分子をコードするＤＮＡは、天然に存在する酵素または毒素をコードするＤＮＡまたはその変異体の配列を有し、当該分野で周知の方法によって調製され得る。
【実施例】
【００５９】
当業者が、本明細書中に記載される組成物および方法をより良好に実施することができるように、下記の実施例が例示目的のために示される。
【００６０】
（実施例１）
様々なガン細胞株により免疫されたマウスからの抗血清は、ヒト赤血球（ＲＢＣ）と交差反応することが示された。７つの異なるガン細胞株を使用して、３１匹のＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した（表１を参照のこと）。これらのマウスの免疫応答を４回の免疫後、元のガン細胞株に対して試験した。免疫前の事前採血血清および免疫後の事後採血血清を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって元のガン細胞株に対して試験した。表１に示されるように、すべてのマウスが、注射されたガン細胞に対する非常に強い免疫応答を生じることが見出された。同じ抗ガン血清をヒトＲＢＣに対して試験した場合、サンプルのすべてがヒトＲＢＣと交差反応することが見出された。本研究では、ガン細胞およびヒト血球は細胞表面に共通の抗原をともに有するという事実に起因して、マウスは、ガン細胞免疫の後でヒトＲＢＣに対する著しい量の抗体を生じることが見出された。従って、ガン細胞およびＲＢＣ細胞の両方における共通の抗原を標的とする抗体は、細胞全体でのパンニングによるガン治療抗体のスクリーニングを妨害し得る。
【００６１】
【表１】
ガン細胞により免疫されたマウスからの抗血清を合計で３回にわたってＲＢＣサブトラクションに供した。このサブトラクションの後での残留抗体は、ＲＢＣに対する結合活性を劇的に失っていたが、ガン細胞に対する結合活性は変化していなかった（図１を参照のこと）。このことは、ガン治療抗体のスクリーニングを妨害し得る、ＲＢＣ細胞およびガン細胞の両方での共通の抗原に対する抗体の大きな集団が存在していたことを示している。従って、腫瘍非特異的な抗体をサブトラクションによって除くことができ、これは、細胞全体でのパンニング中に正常な細胞に結合する抗体のために生じた任意の環境である。（ＲＢＣに結合しなかった）サブトラクション後に残った抗体の大きな集団の細胞全体でのパンニングにより、腫瘍特異的な抗体の選択が可能となる。
【００６２】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを腎細胞ガン（「ＲＣＣ」）細胞株Ｃａｋｉ−１により免疫した。Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−４６）は明細胞腎臓ガン細胞株である。第１回目のＲＢＣサブトラクションを行うために、各マウスから得られた５００μｌのそれぞれの事後採血血清（１：１０希釈）を、穏やかに撹拌しながら、５×１０８個の正常なヒト赤血球Ａ型と（１００μｌの１×ＰＢＳ−１％ＢＳＡにおいて）４℃で１時間インキュベーションした。赤血球を微量遠心分離器において１８００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清をＦＡＣＳ分析および次回のサブトラクションのために保存した。２回目および３回目のサブトラクションをこれと同じ様式で行った。ＦＡＣＳ分析を、赤血球およびＣａｋｉ−１腫瘍細胞を用いたそれぞれのサブトラクションからの血清に対して行った。比較のために、ＦＡＣＳ分析を、サブトラクションを行わない事前採血血清および事後採血血清に対して行った。
【００６３】
負の選択プロセスの後で残留するポリクローナル抗体は、ガン患者を処置する際の治療剤として使用することができる。
【００６４】
（実施例２）
（厳しいＲＢＣサブトラクションを用いたＰＣ３細胞パンニング、および、用いないＰＣ３細胞パンニング）
正常細胞（特に、ヒト血球）と交差反応する抗体の百分率を減少させるために、細胞全体でのパンニングを、厳しいＲＢＣ／正常細胞サブトラクションを用いて行った。細胞全体でのパンニングにおいて使用された正常細胞は前立腺上皮細胞のＰｒＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能）であった。ＲＢＣサブトラクションを用いたパンニングから得られた最終的な抗体を、ＲＢＣサブトラクションを用いない類似したパンニングから得られた抗体と比較した。
【００６５】
マウスを、ＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１４３５）として知られている前立腺ガン細胞により免疫した。ＰＣ３細胞株を使用することにはいくつかの利点がある。第１に、ＰＣ３細胞株は腺ガン株であり、腺ガン（前立腺ガンの９５％）をインビボで模倣するために使用することができる。第２に、この細胞株はホルモン非依存的であり、ホルモン不応性の前立腺ガン（「ＨＲＰＣ」）を有する疾患集団を模倣するために使用することができる。第３の利点は、ＰＣ３細胞が非常に攻撃的な腫瘍増殖表現型を有することである。この細胞株は齧歯類動物モデルにおいて転移性である。加えて、ＰＣ３細胞はまた、インビトロで非常に迅速に増殖し、細胞パンニング環境において操作が容易である。
【００６６】
（ライブラリーＤＮＡの作製）
総ＲＮＡをマウス脾臓サンプルから単離し、メッセンジャーＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴａｓｅ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して合成した。第２鎖ｃＤＮＡ合成、ならびに、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの重鎖フラグメントおよびκ軽鎖フラグメントの増幅を、米国特許出願第１０／２５１，０８５号（その開示は本参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載される方法に従って行った。増幅フラグメントを精製し、適切な制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ＩｇＧ１κライブラリーについてはＦａｂ発現ベクターのＰＡＸ２４３ｍＧ１Ｋに挿入し、ＩｇＧ２ａκライブラリーについてはＰＡＸ２４３ｍＧ２ａＫに挿入した。
【００６７】
（形質転換のために使用された大腸菌株）
ライブラリー構築を、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞および／またはＸＬ−１ ｂｌｕｅ細胞をエレクトロポレーションすることによって行った。ライブラリーＤＮＡを、Ｈｉ−Ｓｐｅｅｄ ｍａｘｉ調製キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）を使用して大腸菌細胞の一晩培養物から精製した。
【００６８】
（ファージ増幅のＩＰＴＧ誘導）
パンニングのために、ライブラリーＤＮＡをＥＲ２７３８細胞にエレクトロポレーションし、ファージ産生をＶＣＳＭ１３ヘルパーファージおよび１ｍＭのＩＰＴＧの添加により３０℃で一晩誘導した。
【００６９】
細胞全体でのパンニングを、所望の特徴を有する抗体を選択するために使用する。パンニングプロセスが図２に概略的にまとめられている。発現ＥＬＩＳＡを行って、Ｆａｂ発現クローンを同定する。一旦Ｆａｂ発現クローンが同定されたら、細胞ＥＬＩＳＡを行って、ＰＣ３細胞と結合するクローンを同定する。
【００７０】
正の選択のためのＰＣ３細胞でのパンニングの後、異なる負の選択プロセスを使用する２つの実験を行った。最初に、サブトラクションパンニングを、前立腺上皮細胞だけを用いて行った。このパンニングから得られたクローンのすべてが赤血球陽性クローンであった。２回目のパンニングおよび３回目のパンニングから得られた産生クローンを、抗体発現ＥＬＩＳＡ、ＲＢＣ−ＦＡＣＳ、ＰＣ３細胞ＥＬＩＳＡおよびＰｒＥＣ細胞ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした。ＰＣ３（＋）／ＰｒＥＣ（−）の表現型を有する前立腺上皮細胞パンニング由来のクローンをＤＮＡ配列決定のために選んだ。
【００７１】
第２の実験では、前立腺上皮細胞および赤血球の両方を用いたサブトラクションパンニングを行った。赤血球サブトラクションパンニングを３工程で行った。最初に、１回目の結果から得られた合計で３．８×１０１２個のファージを、細胞１個あたり７００個のファージの比率で、５．４×１０９個のＡＢ型赤血球と混合し、４℃で２時間インキュベーションした。その後、非結合のファージを５．４×１０９個のＡ型赤血球と４℃で２時間インキュベーションした。最後に、非結合のファージを５．４×１０９個のＢ型赤血球と４℃でさらに２時間インキュベーションした。この厳しい赤血球サブトラクションにより、ガン細胞および赤血球の両方に共通する抗原に結合する抗体の大部分が除かれる。２回目のパンニングおよび３回目のパンニングから得られた産生クローンを、抗体発現ＥＬＩＳＡ、ＲＢＣ−ＦＡＣＳ、ＰＣ３細胞ＥＬＩＳＡおよびＰｒＥＣ細胞ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした。細胞全体での組合せパンニング（すなわち、ＰＣ３細胞での正のパンニング、ならびに、前立腺上皮細胞および赤血球での負のパンニング）から得られ、ＰＣ３（＋）／ＲＢＣ（−）／ＰｒＥＣ（−）の表現型を有するクローンをＤＮＡ配列決定のために選んだ。ＰＣ３細胞ＥＬＩＳＡデータはまた、ＰＣ３細胞ＦＡＣＳを使用して妥当であることが確認される。
【００７２】
（インビトロでの抗体の確認）
細菌溶解産物由来の精製されたマウスＦａｂを、抗Ｆａｂカラムを使用して得る。免疫組織化学（ＩＨＣ）もまた行う。前立腺腫瘍アレイを使用して、腫瘍細胞に対するそれぞれのＦａｂの結合パターンを評価する。正常組織アレイを使用して、正常な細胞に対するそれぞれのＦａｂの結合を評価する。
【００７３】
抗原シグナチャーのウエスタンブロット分析を下記のように行う：９個の細胞株からなるパネルに由来する総細胞溶解産物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動する。ローディングの順序および用いられた具体的な細胞株を下記の表２に示す。その後、それぞれのＦａｂを、それぞれの細胞株において同定された抗原の分子量を決定するための一次抗体として使用する。線状エピトープを認識するそれぞれの特有のＦａｂは、どの細胞株においても、異なった抗原結合パターンを呈示し、「抗原シグナチャー」をもたらす（図３を参照のこと）。線状エピトープを認識しないＦａｂは抗原シグナチャーを呈示せず、しかし、依然として抗原を免疫沈降することができる。それぞれのパンニングに由来する抗原の数が抗原シグナチャーによって比較される。免疫沈降および質量分析での分析を抗原同定のために使用する。具体的には、それぞれのＦａｂを、その抗原をＰＣ３細胞膜調製物から免疫沈降させるために使用する。抗原のバンドを、ペプチド消化／マッピングによる抗原の質量分析での分析および同定のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（還元型）から切り出し、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ施設（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に送付する。
【００７４】
【表２】
赤血球サブトラクションを用いない場合、３回の細胞全体でのパンニングの後の合計で１５３６個の産生クローンから、ＰＣ３ガン細胞に結合する２１個のクローンが得られた。２１個のクローンのすべてが赤血球と結合することが見出された。２１個のクローンの配列は、Ｌ５２−２群、Ｅ２３群、１１Ｆ９群およびＥ２７群の４つの大きな群にまとめられた（図４Ａおよび図４Ｂ）。１１Ｆ９は、分子量が２０Ｋｄのタンパク質に結合する。各群におけるクローンの配列は１対のアミノ酸の違いを有するだけである。Ｆａｂ Ｌ５２−２およびＦａｂ Ｅ２３は、ＰｒＥＣ細胞上ではなく、赤血球およびＰＣ３細胞上で非常に発現するＣＤ５５に結合する。Ｆａｂ Ｅ２７は未知の抗原に結合する。これらの結果は、ＰＣ３細胞が、正の選択を妨害する、赤血球に対する著しい量の共通する抗原を発現することを示唆していた。
【００７５】
赤血球サブトラクションを使用した場合、３回の細胞全体でのパンニング（Ｒ３）の後の合計で４４１６個の産生クローンから、ＰＣ３ガン細胞に結合する１４６個のクローンが得られた。１４６個のクローンのうち、２４個は赤血球と結合しないことが見出された。これら２４個のクローンを配列決定した。２回目のパンニングからの２つのクローンの添加により、合計で１０個のクローンが得られ、これらは異なるＦａｂ配列を有していた（図４Ａおよび図４Ｂ）。これらの最終的な１０個のクローンはＰＣ３ガン細胞に結合するが、ヒト赤血球には結合しない。これら１０個のクローンのうち、５個はＰｒＥＣに結合しない。赤血球サブトラクションを伴わない細胞全体でのパンニングからの抗体との比較において、厳しいサブトラクションは実際に、抗体の多様性を増大させ、かつ、ＰＣ３（＋）／ＰｒＥＣ（−／＋）／ＲＢＣ（−）である望ましいプロフィールをもたらした。
【００７６】
【表３】
様々な改変が、本明細書中に開示された実施形態に対して行われ得ることが理解される。例えば、当業者は理解するように、本明細書中に記載される具体的な配列は、抗体または抗体フラグメントの機能性に必ずしも悪影響を及ぼすことなくわずかに変化させることができる。例えば、抗体の配列における１個だけまたは複数個のアミノ酸の置換を、抗体またはフラグメントの機能性を破壊することなく頻繁に行うことができる。従って、本明細書中に記載される具体的な抗体に対する同一性の程度が７０％よりも高い抗体は本開示の範囲内であることが理解されるべきである。特に有用な実施形態では、本明細書中に記載される具体的な抗体に対する同一性が約８０％よりも高い抗体が意図される。他の有用な実施形態においては、本明細書中に記載される具体的な抗体に対する同一性が約９０％よりも高い抗体が意図される。従って、上記の記載は、限定として解釈すべきではなく、単に好ましい実施形態の例示として解釈しなければならない。当業者は、本開示の範囲および精神に含まれる他の改変を想定する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、ヒト赤血球によりサブトラクションされた抗ガン血清のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図２】図２は、抗体ライブラリーのパンニング、正常な細胞に結合する抗体のサブトラクション、および、ガン性細胞に結合する抗体についてのスクリーニングに関与する工程を概略的に示す。
【図３】図３は、線状エピトープを用いたＰＣ３抗体についての抗原シグナチャーを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、図２のプロセスを使用して同定された抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１〜配列番号１６）を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図２のプロセスを使用して同定された抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７〜配列番号３２）を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は米国仮特許出願第６０／５８６，８１１号（２００４年７月１０日出願）の優先権を主張する（その開示はその全体が本明細書中に援用される）。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、望ましい特徴を有する抗体を多様な抗体の集団から選択するための方法に関連する。より具体的には、本開示は、ガン細胞には結合するが、ヒトの赤血球にも、白血球にも、正常な組織細胞にも結合しない抗体を同定するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の背景）
モノクローナル抗体治療の有望性が実現され始めようとしている。効力が、腫瘍細胞の表面抗原（例えば、Ｂ細胞イディオタイプ、悪性Ｂ細胞上のＣＤ２０、白血病性芽細胞上のＣＤ３３、乳ガン上のＨＥＲ２／ｎｅｕなど）を標的とする抗体を使用する臨床研究において認められている。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕオンコプロテインの過剰発現を伴う一部の転移性乳ガン患者において目的の応答をもたらしている。これらの興奮させる結果は、抗体に基づく新しいガン治療戦略を開発するために既存のアプローチのさらなる精緻化のための基礎を提供している。転移性結腸ガンの処置におけるＥｒｂｉｔｕｘ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｃ２２５、抗ＥＧＦｒ、ＩｍＣｌｏｎｅ）、ならびに、結腸ガン、腎細胞ガンおよび他の充実性腫瘍の処置におけるＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ、抗ｖＥＧＦｒ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含めた化学療法との併用または非併用でのモノクローナル抗体の最近の臨床結果は、モノクローナル抗体がガン患者のために有益であり得ることを強く実証している。現在、多数の臨床試験が、前立腺ガンの処置のためにモノクローナル抗体を用いて行われている。
【０００４】
ハイブリドーマ技術、ファージディスプレーまたは他の技術（例えば、リボソームディスプレーおよび酵母ディスプレーなど）によるマウスモノクローナル抗体の作製が基礎科学および臨床科学の両方のために特に重要である。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ＥｒｂｉｔｕｘおよびＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂはもともと、抗原により免疫されたマウスからスクリーニングされた。
【０００５】
多くの研究が、細胞全体による免疫、続いて、ガン細胞の表面分子に結合する抗体のスクリーニングによって、ガン細胞に対する抗体を見い出すために行われている。このアプローチの理論は非常に魅力的ではあるが、数年の努力の後でも、治療抗体はほとんど見出されていなかった。このアプローチは、いくつかの理由から困難であることが判明している。１つの理由は、ガン細胞は多くの共通する表面抗原を正常な細胞と共有するので、ガン細胞が免疫原として使用されたとしても、マウスにおける免疫応答が腫瘍特異的でないことである。従って、腫瘍特異的な抗体についてスクリーニングすることは非常に困難かつ／または無益であることが判明し得る。
【０００６】
ガン細胞が共通の抗原を正常な細胞と共有することは一般的な現象である。従来、負の選択および正の選択が、腫瘍特異的な抗体についてスクリーニングするために使用されている。腫瘍特異的な抗体についてスクリーニングすることを容易にするために、負の選択は、正の選択を妨害する、正常な細胞およびガン細胞の両方に共通する抗原の問題に取り組むために使用される一般的な方法である。数多くの刊行物では、正常な組織細胞が、ガン細胞および正常な細胞の両方にある共通の抗原に結合する望ましくない抗体をサブトラクションするために使用されている。非特許文献１〜３を参照のこと。しかしながら、これらの刊行物のほとんどは１つのタイプの正常な組織細胞または１対の正常な細胞株をサブトラクションのために使用しているだけである。
【０００７】
以前の試みはまた、サブトラクティブ免疫と呼ばれる代わりの方法によってこの問題を解決するために行われていた。集中的な研究が、過去１５年間にわたってサブトラクティブ免疫を用いて行われている。サブトラクティブ免疫は細胞全体でのパンニング工程の代わりに免疫工程に焦点を合わせている。サブトラクティブ免疫では、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の生成を高めることができる異なった免疫寛容化アプローチが利用される。サブトラクティブ免疫は、目的とする抗原に構造的または機能的に関連し得る免疫優性抗原またはそうでない場合には望ましくない抗原に対して宿主動物を寛容化することに基づいている。宿主動物の寛容化は３つの方法（ハイゾーン寛容化、新生児寛容化または薬物誘導寛容化）のうちの１つによって達成することができる。寛容化された動物には、その後、所望の抗原が接種され、その後の免疫応答によって生じた抗体が所望の反応性についてスクリーニングされる。しかしながら、最近の研究では、新生児「寛容化」は、免疫学的意味での寛容性ではなく、免疫偏向を誘導することが示唆された。新生児は免疫特権を有しないが、免疫様式に依存して、ＴＨ２応答またはＴＨ１応答を生じさせる。シクロホスファミドを用いた化学的免疫抑制は最も効果的なサブトラクティブ免疫技術であった。当業者が理解するように、正常細胞による免疫、その後のシクロホスファミド処置は、正常細胞の抗原との反応性を有する増殖中の免疫細胞のすべてを殺すことになる。しかしながら、このレジメンではまた、Ｂ細胞の成熟および分化のために要求されるヘルパーＴ細胞のすべてが殺される。従って、このレジメンの後に、腫瘍抗原に対して特異的な抗体を誘発させるためのガン細胞免疫が続く場合、ＩｇＭイソタイプの低親和性抗体のみが生じるだけである。
【非特許文献１】Ｚｉｊｌｓｔｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３（４月１１日）、３０３（３）：７３３〜４４
【非特許文献２】Ｈｏｏｐｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００３（３月２７日）、２２（１２）：１７８３〜９４
【非特許文献３】Ｆｏｓｓ、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００２（１月）、２９（３ Ｓｕｐｐｌ ７）：５〜１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ガン細胞の表面分子に結合する抗体を同定するために抗体ライブラリーをスクリーニングするための改善された方法を有することは好都合である。ガン罹患個体を処置するための改善された方法もまた望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
正常な細胞に対してではなく、ガン細胞に結合する抗体が、負の選択プロセスを使用して同定される。ガン細胞を用いた動物の免疫によって生じる抗体のライブラリーが、赤血球および／または白血球、ならびに、必要に応じて、他の正常な細胞（すなわち、非ガン性細胞）と接触させられる。これらの血球および／または正常な細胞は、そのような細胞に結合する抗体とともに除かれ、これにより、ガン細胞には結合するが、（負の選択プロセスの除去効果に起因して）正常な細胞にはほとんど結合を示さないかまたは全く結合を示さない抗体を同定するためにガン細胞に対してパンニングすることができる抗体のサブライブラリーが残る。このような抗体は治療目的および／または診断目的のために使用することができる。
【００１０】
従って、１つの実施形態において、本発明の方法は、ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；該抗血清をヒトの血球（赤血球および／または白血球）および必要に応じて正常な組織細胞と接触させる工程；ならびに、該抗血清のうちの、該ヒト赤血球に結合しない部分を回収する工程を含む。別の実施形態において、ガン細胞により免疫された被験体からの抗血清が集められ；ヒトの血球（赤血球および／または白血球）および必要に応じて正常な組織細胞に結合する抗体が該抗血清から除かれ；そして、前記ガン細胞に結合する抗体が該抗血清から除かれる。さらに別の実施形態において、本発明の方法は、ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；ヒト赤血球に結合する抗体、および、少なくとも１つの他のタイプの非ガン性細胞に結合する抗体を該抗血清から除く工程；ならびに、該ガン細胞に結合する抗体を該抗血清から回収する工程を含む。
【００１１】
特に有用な実施形態において、これらの方法は、ファージディスプレーされた抗体ライブラリーを、ガン細胞により免疫された被験体から集められた細胞を使用して作製する工程；ヒト赤血球に結合するライブラリーメンバーを除いてサブライブラリーを作製する工程；および、該ガン細胞に結合する抗体を呈示するメンバーを該サブライブラリーから回収する工程を含む。
【００１２】
別の実施形態において、本開示は、以下のいずれかを含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体に関連する：
【００１３】
【化７−１】
【００１４】
【化７−２】
他の実施形態において、本開示は、配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体に関連する。
【００１５】
前記抗体のいずれかをコードする単離された核酸、そのような単離された核酸を含有する発現ベクター、および、そのような発現ベクターによりトランスフェクションされた宿主細胞もまた意図される。
【００１６】
さらに別の実施形態において、本開示は、ガン細胞をハプテン（例えば、ジニトロフェニルなど）と接触させる工程；ファージディスプレーされた抗体ライブラリーを、該ガン細胞により免疫された被験体から集められた細胞を使用して作製する工程；ヒト赤血球に結合するライブラリーメンバーを除いてサブライブラリーを作製する工程；および、該ガン細胞に結合する抗体を呈示するメンバーを該サブライブラリーから回収する工程を含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書中に記載される主題のより完全な理解のために、添付されている線図を考慮して、下記の詳細な説明を参照すべきである。
【００１８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
厳しい負の選択が、腫瘍特異的な抗体についてスクリーニングするために本開示に従って使用される。本開示による厳しい負の選択戦略には、細胞全体でのパンニング時におけるヒト血球および必要に応じて正常組織細胞による多段階のサブトラクションが含まれる。本発明の方法では、正常なヒト細胞（特に、血球）に結合する選択された抗体の数が著しく低下する。これらの方法は、細胞全体でのパンニング法による改善された抗体多様性を示し、ガンの診断剤および治療剤のための腫瘍特異的な抗体を選択するための方法を提供する。治療目的のために、本明細書中に記載される方法に従って同定された抗体は、正常な血球に対する低下した副作用を有するようである。この特徴により、ガン治療のための抗体の安全性プロフィールが改善されるはずである。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、選択された標的に結合することができる、完全な抗体または抗体フラグメントをいう。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、操作された抗体（キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体およびヒト化抗体、完全なヒト抗体、ならびに、人為的に選択された抗体が挙げられる）、ならびに、ファージディスプレー技術または代わりの技術を使用して作製される合成または半合成の抗体が含まれる。小さいフラグメント（例えば、ＦｖおよびｓｃＦｖなど）は、その小さいサイズ、および、その結果としての優れた組織分布によって、診断適用および治療適用のために有利な性質を有する。
【００２０】
本発明の抗体は、抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。抗体ライブラリーを作製するための様々な技術が当業者の範囲内である。ＲａｄｅｒおよびＢａｒｂａｓ、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）；米国特許第６，２９１，１６１号（Ｌｅｒｎｅｒら）ならびに同時係属中の米国特許出願公開第２００４００７２１６４Ａ１号および同第２００４０１０１８８６Ａ１号を参照のこと（それらの開示は本参照によりその全体が本明細書中に援用される）。抗体は、例えば、免疫剤および所望される場合にはアジュバントの１回または複数回の注射によって被験体において惹起させることができる。免疫剤には、任意のタイプのガン細胞またはそのフラグメントが含まれ得る。代表的には、免疫剤および／またはアジュバントは複数回の皮下注射または腹腔内注射によって被験体に注射される。好適なアジュバントとしては、ガン細胞ワクチンに関連して使用されているアジュバント、例えば、非メチル化ＣｐＧモチーフおよびカルメットゲラン杆菌（ＢＣＧ）などが挙げられるが、これらに限定されない。免疫プロトコルが、過度な実験を用いることなく当業者によって選択され得る。
【００２１】
任意のタイプのガン細胞を、本発明の方法に従って被験体を免疫するために使用することができる。好適なタイプのガン細胞としては、造血系悪性疾患、メラノーマ、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、結腸ガン、頭頸部ガン、肺ガン、腎臓ガン、胃ガン、膵臓ガン、肝臓ガン、膀胱ガンおよび脳のガンが挙げられるが、これらに限定されない。ガン細胞は様々な供給源から得ることができる。例えば、ガン細胞の一次サンプルを外科的技法または生検によって患者から直接に得ることができる。ガン細胞はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ，Ｉｎｃ．（「ＮＤＲＩ」）（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から入手することができる。様々なタイプのガン細胞がまた、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）（「ＡＴＣＣ」）または他の寄託機関（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅなど）に寄託されており、そのような機関から入手可能である。ガン細胞のフラグメント（例えば、細胞膜またはミトコンドリアなど）が免疫剤として使用される場合、当業者の範囲に含まれる様々な技術を、ガン細胞を破壊し、免疫における使用のための好適な成分を単離するために用いることができる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ガン細胞上のエピトープに対する抗体応答の強化が、ハプテン（例えば、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）など）による修飾によって達成される。ＤＮＰは、ガン細胞を、免疫系によってより容易に認識されるようにする非常に免疫原性のハプテンである。ＤＮＰは、ハプテンの立体配置を有する芳香族化合物（ニトロ基で二置換されたベンゼン環）である。ハプテンは、抗体に結合することができるが、それ自身では抗体応答を誘発することができず、しかし、キャリアタンパク質に連結されたときには抗体応答を誘発する抗原性決定基である。ＤＮＰ修飾された自己ガン細胞ワクチンは、遅延型過敏性、前炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γなど）の放出、ならびに、ＣＤ４およびＣＤ８の両方のＴ細胞サブセットの増幅によって特徴づけられる堅固な免疫応答を誘発することが示されている。低密度抗原のＤＮＰ修飾はＢ細胞を免疫原部位に優先的に引き寄せ、ＤＮＰ修飾の抗原に対する応答におけるＢ細胞の認識および増幅を可能にする。免疫原へのＢ細胞移動およびその後の増幅のプロセスは炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｒｏｙ）サイトカインの放出によってさらに助けられ得る。ＤＮＰ修飾を、当業者の範囲に含まれる様々な技術を使用して、例えば、Ｂｅｒｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２：４０３（２００４）；およびＳｏｊｋａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ １：２００（２００２）に記載される技術などを使用して達成することができる。
【００２３】
一旦免疫応答が被験体において誘発されると、抗体を選択プロセスのために集めることができる。抗体を産生または含有する組織からの細胞が、最後の免疫が行われてから約３日後〜５日後に被験体から集められる。好適な組織としては、血液、脾臓、リンパ節および骨髄が挙げられる。
【００２４】
一旦細胞が集められると、ＲＮＡが、当業者に知られている技術を使用してその細胞から単離され、コンビナトリアル抗体ライブラリーが調製される。一般に、コンビナトリアル抗体ライブラリーを調製するための技術は、抗体の単離されたＲＮＡを使用して、抗体またはその一部分（例えば、軽鎖および／または重鎖など）をコードする標的配列を増幅することを含む。従って、例えば、天然では多様である抗体ｍＲＮＡのサンプルを用いて出発して、第１鎖ｃＤＮＡを、テンプレートを提供するために作製することができる。その場合、従来のＰＣＲまたは他の増幅技術を、ライブラリーを作製するために用いることができる。いくつかの実施形態では、抗体Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ重鎖フラグメントに複合体化されたκ軽鎖またはλ軽鎖（Ｆｄ））を発現するファージライブラリーが、米国特許出願第１０／２５１，０８５号（その開示は本参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載される方法を使用してプラスミドベクターにおいて構築される。
【００２５】
ファージディスプレーライブラリーは、その後、ガン細胞に対する抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、抗体の結合特異性が、インビトロ結合アッセイによって、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などによって決定される。そのような技術およびアッセイがこの分野では知られている。抗体の結合親和性を、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０））のスキャッチャード分析によって決定され得る。
【００２６】
本明細書中に記載される方法によれば、ガン細胞に対する正の選択を行った後、ヒト血球（赤血球または白血球または両者のいずれか）、および、必要に応じて、正常な（すなわち、非ガン性の）組織細胞が、ライブラリーのスクリーニングの前に厳しいサブトラクションを行う際の吸収剤として使用される。サブトラクションプロセスにおいて使用される適切なヒト正常組織細胞としては、肝臓、肺、心臓、腎臓、腸、胃、膀胱、脾臓、膵臓、骨髄、脳、胸腺、前立腺、卵巣、精巣および皮膚などのような組織から単離された内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞および他の細胞が挙げられる。適切な組織は、例えば、正常なドナーから、または、後期段階の胎児から、または、これらの組織から樹立された細胞株から得ることができる。
【００２７】
サブトラクションは、抗体のライブラリーを正常な細胞と接触させ、その後、正常な細胞を、それに結合した何らかの抗体と一緒に除くことによって行うことができる。細胞の除去を、当業者の範囲に含まれる任意の技術（例えば、遠心分離など）を使用して達成することができる。未結合の抗体を含有する上清が保持される。なぜならこれは、上清が、正常な細胞に対してではなく、ガン細胞に結合する抗体のサブライブラリーを含有する部分であるからである。正常な細胞に結合する抗体のすべてを確実に除くことを助けるために、複数回のサブトラクションが行われる。複数回のサブトラクションを、同じタイプまたは異なるタイプの細胞を使用して行うことができる。特に有用な実施形態において、赤血球を使用する少なくとも３回のサブトラクションが行われる。１つの実施形態において、サブトラクションが赤血球（異なる細胞型（例えば、Ａ型、Ｂ型など）を用いて３回）および白血球（１回）の両方により行われる。他の実施形態において、複数回のサブトラクションが、少なくとも２つのタイプの非ガン性細胞（すなわち、少なくとも１つのタイプの血球および少なくとも１つの他のタイプの正常な組織細胞）を使用して行われる。好都合なことに、正常な組織は、免疫のために使用されたガン細胞と同じタイプの組織に由来し得る。例えば、被験体が膵臓ガン細胞により免疫されたならば、正常な（すなわち、非ガン性の）膵臓組織細胞が、サブトラクションを行うために使用される。
【００２８】
負の選択を行う際には、赤血球または他の吸収剤細胞に対する抗体ファージの比率が、過度な実験を伴うことなく当業者によって選択され得る。いくつかの実施形態において、赤血球１個あたり７００個〜１０００個のファージを使用することができる。
【００２９】
十分な数のライブラリーメンバーを提供するために、サブライブラリーは、各回のサブトラクションの間において、そして／または、ガン細胞に結合する抗体についてのスクリーニングの前に増幅することができる。増幅のための技術は当業者の範囲内である。
【００３０】
負の選択プロセスの後、組換えライブラリーに由来する抗体を、標的特異性に基づいて抗体を単離するために、ガン細胞またはガン細胞に由来するポリペプチドを使用して選択することができる。上記で記されたように、ガン細胞に結合する抗体を選択するための適切な技術は当業者の範囲内である。
【００３１】
ハイブリドーマ法もまた、所望の特徴を有する抗体を同定するために使用することができる。そのような技術は当業者の範囲内である。ハイブリドーマ法では、マウス、ウサギ、ラット、ハムスターまたは他の適切な宿主動物が代表的には、ガン細胞に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘発するために、（同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２４２６１号（発明の名称：「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｓｋｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ａｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ」、これはＥｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌラベル番号ＥＬ９８３５６８２７８ＵＳで２００５年７月８日に出願された）（その開示はその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されるようにマスキングされた）ガン細胞により免疫される。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫することができる。その後、リンパ球は、好適な融合剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞が形成される（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）、ｐｐ．５９〜１０３；Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）、ｐｐ．５１〜６３を参照のこと、これらの開示は本参照により本明細書中に援用される）。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を好ましくは含有する適切な培養培地において培養される。その後、ハイブリドーマ細胞が培養されている培養培地を、当業者の範囲に含まれる技術（例えば、ＦＡＣＳ分析など）を使用して、ガン細胞に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができ、また、本開示の方法に従って負の選択に供してもよい。所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈手順によってサブクローン化し、そして標準的な方法によって増殖させ得る。あるいは、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物において腹水としてインビボで増殖させ得る。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地または腹水から単離または精製される。
【００３２】
ガン細胞に結合するが、正常な細胞に対する結合をほとんどまたは全く示さないモノクローナル抗体を、当業者の範囲に含まれる組換えＤＮＡ法によって作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して、（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定することができる。（抗体を同定するために用いられた特定の選択方法に依存して）ハイブリドーマ細胞またはファージがそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立ち得る。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、その後、発現ベクターは、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るために、宿主細胞（例えば、そうでない場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは、ＮＳＯ細胞または他のミエローマ細胞など）にトランスフェクションされる。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインについてのコード配列を相同的なマウス配列の代わりに置換することによって、または、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部を免疫グロブリンのコード配列に共有結合的に連結することによって改変することができる。
【００３３】
さらなる実施形態では、ガン細胞において特有に発現するタンパク質を、本開示による抗体を用いて、当業者に周知の方法によって同定するための方法が提供される。１つの方法において、Ｆａｂ抗原またはｓｃＦｖ抗原が免疫沈降および質量分析によって同定される。具体的には、これらの抗体についての抗原を同定するための１つのそのような方法では、ｓｃＦｖが、細胞表面がビオチン化されたガン細胞のミクロソーム画分から調製された溶解産物から抗原を免疫沈降させるために使用される。具体的には、ガン細胞がＰＢＳ（ｐＨ８．０）における０．５ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンの溶液により３０秒間標識される。ＰＢＳにより洗浄して未反応のビオチンを除いた後、細胞を窒素キャビテーションによって破壊し、ミクロソーム画分を示差的遠心分離によって単離する。ミクロソーム画分をＮＰ４０溶解緩衝液に再懸濁し、正常なマウス血清およびプロテインＡセファロースにより徹底的に予備クリアランスする。抗原を、ラット抗ＨＡアガロースビーズに結合させたＨＡタグ化ｓｃＦｖ抗体により免疫沈降させる。免疫沈降後、抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を使用するウエスタンブロットによって、または、クーマシーＧ−２５０染色によって検出する。ガン細胞に結合しない抗体を陰性対照として使用する。抗原のバンドをクーマシー染色ゲルから切り出し、質量分析（ＭＳ）によって同定する。免疫沈降した抗原はまた、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）またはマイクロキャピラリー逆相ＨＰＬＣナノエレクトロスプレータンデム質量分析（μＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって同定することができる。同定された抗原は、その後、当業者の範囲に含まれる技術を使用してそれに対するさらなる抗体を誘発させるための免疫原として使用され得る。
【００３４】
本開示に従って、ガン細胞には結合するが、正常な細胞に対する結合をほとんどまたは全く示さない本発明の抗体にはさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体が含まれ得る。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラな免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖またはフラグメント（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗原結合性部分配列など）である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラットまたはウサギなど）のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体あるいは移入されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含む場合がある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ（代表的には２つ）の可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが１つまたは複数の非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そして、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２））。
【００３５】
非ヒト抗体をヒト化するための方法が当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、１個または複数個のアミノ酸残基がヒト以外の供給源からヒト化抗体に導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、代表的には「ドナー」の可変ドメインから得られるので、「ドナー」残基と呼ばれることが多い。ヒト化は本質的には、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））の方法に従って実施され得る。従って、そのような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクトではないヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラな抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際、ヒト化抗体は代表的には、すべてまたは一部のＣＤＲ残基、および、可能であれば、一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体において類似した部位に由来する残基によって置換されたヒト抗体である。
【００３６】
本発明の抗体は一価の抗体であってもよい。一価の抗体を調製するための様々な方法が当該分野で周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリンの軽鎖および改変された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、重鎖の架橋を妨げるように、一般にはＦｃ領域内の任意のところで短縮化される。あるいは、関係したシステイン残基が、架橋を妨げるように、別のアミノ酸残基で置換されるか、または、欠失される。インビトロ方法もまた、一価の抗体を調製するために適切である。抗体のフラグメント（特に、Ｆａｂフラグメント）を作製するための抗体の消化を、当該分野で公知の慣用的な方法を使用して達成することができる。
【００３７】
他の実施形態では、二重特異性抗体が意図される。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体（好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体）である。この場合において、結合特異性の一方はガン細胞に対してであり、もう一方は任意の他の抗原に対するものであり、好ましくは、細胞表面のタンパク質または受容体または受容体サブユニットに対するものである。
【００３８】
二重特異性抗体を作製するための方法が当業者の範囲内である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいている（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７〜５３９（１９８３））。所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合することができる。融合は好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインの内部である。免疫グロブリン重鎖融合体、および、所望されるならば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが別々の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に同時トランスフェクションされる。二重特異性抗体を作製するための例示的な現在知られている方法のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０（１９８６）；国際特許出願公開ＷＯ９６／２７０１１；Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）；Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｙ．Ｍｅｄ．、１７５：２１７〜２２５（１９９２）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）；Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８（１９９４）；およびＴｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：６０（１９９１）を参照のこと。
【００３９】
本発明の抗体はガン患者に治療剤として投与することができる。本発明の抗体は、ヒトの血球または正常な組織細胞に対する結合をホトンドまたは全く示さないので、低下した副作用が、他の抗体治療と比較して観察され得る。
【００４０】
本発明の抗体はまた、ガン性細胞をインビボで検出するために利用することができる。これは、抗体を標識し、標識された抗体を被験体に投与し、その後、被験体を画像化することによって達成される。本開示に従った診断的画像化のために有用な標識の例は、放射性標識（例えば、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃおよび１８８Ｒｎなど）、蛍光性標識（例えば、フルオレセインおよびローダミンなど）、核磁気共鳴活性な標識（陽電子放射断層撮影法（「ＰＥＴ」）走査装置によって検出可能な陽電子放射同位体）、化学発光剤（例えば、ルシフェリンなど）および酵素マーカー（例えば、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼなど）である。短距離放射線放出剤（例えば、短距離検出器プローブ（例えば、経直腸プローブなど）によって検出可能な同位体など）もまた用いることができる。これらの同位体および経直腸検出器プローブは、組み合わせて使用されたとき、前立腺窩再発および骨盤結節性疾患を検出することにおいて特に有用である。この抗体は、当該分野で公知の技術を使用してそのような試薬により標識され得る。抗体の放射性標識化に関連する技術については、例えば、ＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ、Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８３）を参照のこと（これは本明細書に参考として援用される）。また、Ｄ．Ｃｏｌｃｈｅｒら、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ Ａｔｈｙｍｉｃ Ｍｉｃｅ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１：８０２〜８１６（１９８６）も参照のこと（これは本明細書に参考として援用される）。
【００４１】
本開示による放射性標識された抗体は、インビトロ診断試験のために使用することができる。抗体、その結合性部分、プローブまたはリガンドの比活性は、放射能標識の半減期、同位体純度、および、標識が生物学的因子にどのように組み込まれるかに依存する。免疫アッセイ試験では、比活性が高いほど、一般に感度が良好である。抗体を放射性同位体で標識するための様々な手順は、当該分野で一般に公知である。
【００４２】
放射性標識された抗体を患者に投与することができ、ここで、放射性標識された抗体は、その抗体が反応する抗原を有する腫瘍に局在し、そして、放射性標識された抗体が、公知の技術を使用して、例えば、ガンマカメラまたは放射断層撮影法を使用する放射性核走査などを使用してインビボで検出または「画像化」される。例えば、Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍａｇｉｎｇ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、ｐｐ．６５〜８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８５）を参照のこと（これは本明細書に参考として援用される）。あるいは、陽電子放射長軸断面断層撮影走査装置（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓａｘｉａｌ ｔｏｍｇｒａｐｈｙ ｓｃａｎｎｅｒ）（例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ国立研究所に設置された指定のＰｅｔ ＶＩなど）を使用することができ、この場合、放射性標識は陽電子（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎ）を放射する。
【００４３】
発蛍光団および発色団で標識された生物学的因子を、当該分野で公知の標準的な部分から調製することができる。抗体および他のタンパク質は、約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するので、蛍光性部分は、３１０ｎｍを超える波長で、好ましくは、４００ｎｍを超える波長で実質的な吸収を有するように選択されるべきである。様々な適切な蛍光体および発色団が、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６２：５２６（１９６８）；およびＢｒａｎｄ，Ｌ．ら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１：８４３〜８６８（１９７２）によって記載される（これらは本明細書に参考として援用される）。抗体を、従来の手順によって、例えば、米国特許第３，９４０，４７５号、同第４，２８９，７４７号および同第４，３７６，１１０号（これらは本明細書に参考として援用される）に開示される手順などによって蛍光性の発色団基で標識することができる。
【００４４】
本発明の抗体はまた、ガン性細胞をインビボで殺すか、または除去するために利用することができる。これは、細胞傷害性薬物に結合した抗体を、そのような処置を必要とする被験体に投与することを含む。この抗体はガン細胞を認識するので、抗体が結合するそのような細胞はどれも破壊される。厳しいサブトラクション技術が使用されるので、破壊される正常な細胞の量は最小限である。
【００４５】
本開示の抗体は、治療的薬物、放射線放出化合物、植物起源、真菌起源または細菌起源の分子、生物学的タンパク質、および、それらの混合物を含めて、様々な細胞傷害性薬物を送達するために使用することができる。細胞傷害性薬物は、細胞内で作用する細胞傷害性薬物であり得、例えば、短距離高エネルギーα線放射体をはじめとする短距離放射線放射体などが可能である。酵素活性な毒素およびそのフラグメントが、例えば、ジフテリア毒素Ａフラグメント、ジフテリア毒素の非結合性の活性なフラグメント、外毒素Ａ（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サクリン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）のある種のタンパク質、ディアンチン（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）のある種のタンパク質、ヨウシュウヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）のタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（Ｍｏｒｏｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）の阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の阻害剤、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）によって例示される。免疫毒素の酵素活性なポリペプチドを調製するための手順が国際特許出願公開ＷＯ８４／０３５０８および同ＷＯ８５／０３５０８に記載される（これらは本明細書に参考として援用される）。ある種の細胞傷害性部分は、例えば、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキサート、ネオカルジノスタチンおよび白金に由来する。
【００４６】
抗体を細胞傷害性薬剤と結合体化するための手順は、以前から記載されている。
【００４７】
あるいは、抗体を、腫瘍部位において局在化したとき、細胞数個分の直径の殺傷をもたらす高エネルギー放射線放射体、例えば、放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、γ線放射体など）などに結合することができる。例えば、Ｓ．Ｅ．Ｏｒｄｅｒ、「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、ｐｐ．３０３〜３１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８５）を参照のこと（これは本明細書に参考として援用される）。他の好適な放射性同位体としては、α線放射体（例えば、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉおよび２１１Ａｔなど）およびβ線放射体（例えば、１８６Ｒｅおよび９０Ｙなど）が挙げられる。放射線治療は、前立腺ガンが比較的放射線感受性の腫瘍であるので、前立腺ガンに関連して特に効果的であることが期待される。
【００４８】
抗体が、ガン細胞を殺すために、または除去するために単独で使用される場合、そのような殺傷または除去は、内因性の宿主免疫機能（例えば、補体媒介または抗体媒介による細胞の細胞毒性など）を開始させることによって行うことができる。
【００４９】
抗体投与経路は、既知の方法に従って、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、脳内経路、筋肉内経路、皮下経路、眼内経路、動脈内経路、クモ膜下経路、吸入経路または病巣内経路による注射または注入に従って、あるいは、持続放出システムによってである。抗体は好ましくは、注入またはボーラス注射によって連続的に投与される。抗体を局所様式または全身様式で投与することができる。
【００５０】
本発明の抗体は、医薬的に許容され得るキャリアとの混合物で調製することができる。本適用の化合物を処方および投与するための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る。このような治療用組成物は、好ましくは液体または（凍結乾燥された）粉末エアロゾルとして、静脈内に、あるいは、鼻または肺を介して投与することができる。この組成物はまた、所望に応じて非経口的または皮下に投与することができる。全身投与されるとき、この治療用組成物は、無菌で発熱物質を含有せず、かつ、ｐＨ、等張性および安定性について十分に考慮して、非経口投与に許容され得る溶液であるべきである。これらの条件は当業者に公知である。
【００５１】
使用に適切な医薬組成物には、本発明の抗体の１つまたは複数が、それらの意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療に効果的な量は、疾患の症状を防止するか、または軽減するか、または改善するために、あるいは、処置されている被験体の生存を延ばすために効果的な抗体の量を意味する。治療に効果的な量の決定は、特に、本明細書中に提供される詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内である。治療に効果的な投薬量を、様々なインビトロ方法およびインビボ方法を使用することによって決定することができる。
【００５２】
さらなる実施形態において、本明細書中前記に記載されるガン結合性抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡが作製される。用語ＤＮＡには、コードする一本鎖ＤＮＡ、前記コードＤＮＡおよびそれに対する相補的ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ、または、これらの相補的な（一本鎖）ＤＮＡそのものが含まれる。
【００５３】
さらに、本明細書中に開示されるガン結合性抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする真のＤＮＡ配列あるいはその変異体を有する酵素的または化学的に合成されたＤＮＡであり得る。真のＤＮＡの変異体は、１つまたは複数のアミノ酸が欠失されたか、あるいは、１つまたは複数の他のアミノ酸と交換された、上記抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。好ましくは、前記改変は、ヒト化および発現最適化の適用においては抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側である。変異体ＤＮＡという用語はまた、１つまたは複数のヌクレオチドが他のヌクレオチドによって置換され、その新しいコドンが同じアミノ酸をコードするサイレントな変異体を包含する。変異体配列という用語にはまた、縮重配列が含まれる。縮重配列は、限定されない数のヌクレオチドが、最初にコードされたアミノ酸配列の変化を生じさせることなく他のヌクレオチドによって置換されているという点で、遺伝暗号の意味の範囲内で縮重している。そのような縮重配列は、その異なる制限部位、あるいは、重鎖のマウス可変ドメインおよび／または軽鎖のマウス可変ドメインの最適な発現を得るために特定の宿主（特に、大腸菌）によって好まれる特定のコドンの頻度、あるいはそのような制限部位と頻度の両者に起因して有用であり得る。
【００５４】
変異（体）の用語は、当該分野で公知の方法に従って真のＤＮＡのインビトロ変異誘発によって得られるＤＮＡ変異体を含むことが意図される。
【００５５】
完全な四量体免疫グロブリン分子の組み立ておよびキメラ抗体の発現のために、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡインサートが、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡと融合され、その後、例えば、ハイブリッドベクターへの組み込みの後、適切な宿主細胞に移される。
【００５６】
ヒトＩＧｇ重鎖定常ドメイン（例えば、γ１、γ２、γ３またはγ４、好ましくはγ１またはγ４）に融合された、本明細書中に開示される細胞株に対する抗体の重鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡもまた提供される。ヒト定常ドメインのκまたはλ（好ましくはκ）に融合された、本明細書中に開示される細胞株に対する抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡもまた提供される。
【００５７】
別の実施形態は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインがスペーサー基によって連結される組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡに関連し、この組換えＤＮＡは、必要に応じて、宿主細胞における抗体のプロセシングを容易にするシグナル配列、あるいは、抗体の精製を容易にするペプチドおよび／または切断部位および／またはペプチドスペーサーおよび／またはエフェクター分子をコードするＤＮＡを含むか、あるいはそのようなシグナル配列とＤＮＡの両者を含む。
【００５８】
エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断適用または治療適用において有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡであることが意図される。従って、毒素または酵素（特に、プロドラッグの活性化を触媒することができる酵素）であるエフェクター分子が特に示される。そのようなエフェクター分子をコードするＤＮＡは、天然に存在する酵素または毒素をコードするＤＮＡまたはその変異体の配列を有し、当該分野で周知の方法によって調製され得る。
【実施例】
【００５９】
当業者が、本明細書中に記載される組成物および方法をより良好に実施することができるように、下記の実施例が例示目的のために示される。
【００６０】
（実施例１）
様々なガン細胞株により免疫されたマウスからの抗血清は、ヒト赤血球（ＲＢＣ）と交差反応することが示された。７つの異なるガン細胞株を使用して、３１匹のＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した（表１を参照のこと）。これらのマウスの免疫応答を４回の免疫後、元のガン細胞株に対して試験した。免疫前の事前採血血清および免疫後の事後採血血清を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって元のガン細胞株に対して試験した。表１に示されるように、すべてのマウスが、注射されたガン細胞に対する非常に強い免疫応答を生じることが見出された。同じ抗ガン血清をヒトＲＢＣに対して試験した場合、サンプルのすべてがヒトＲＢＣと交差反応することが見出された。本研究では、ガン細胞およびヒト血球は細胞表面に共通の抗原をともに有するという事実に起因して、マウスは、ガン細胞免疫の後でヒトＲＢＣに対する著しい量の抗体を生じることが見出された。従って、ガン細胞およびＲＢＣ細胞の両方における共通の抗原を標的とする抗体は、細胞全体でのパンニングによるガン治療抗体のスクリーニングを妨害し得る。
【００６１】
【表１】
ガン細胞により免疫されたマウスからの抗血清を合計で３回にわたってＲＢＣサブトラクションに供した。このサブトラクションの後での残留抗体は、ＲＢＣに対する結合活性を劇的に失っていたが、ガン細胞に対する結合活性は変化していなかった（図１を参照のこと）。このことは、ガン治療抗体のスクリーニングを妨害し得る、ＲＢＣ細胞およびガン細胞の両方での共通の抗原に対する抗体の大きな集団が存在していたことを示している。従って、腫瘍非特異的な抗体をサブトラクションによって除くことができ、これは、細胞全体でのパンニング中に正常な細胞に結合する抗体のために生じた任意の環境である。（ＲＢＣに結合しなかった）サブトラクション後に残った抗体の大きな集団の細胞全体でのパンニングにより、腫瘍特異的な抗体の選択が可能となる。
【００６２】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを腎細胞ガン（「ＲＣＣ」）細胞株Ｃａｋｉ−１により免疫した。Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−４６）は明細胞腎臓ガン細胞株である。第１回目のＲＢＣサブトラクションを行うために、各マウスから得られた５００μｌのそれぞれの事後採血血清（１：１０希釈）を、穏やかに撹拌しながら、５×１０８個の正常なヒト赤血球Ａ型と（１００μｌの１×ＰＢＳ−１％ＢＳＡにおいて）４℃で１時間インキュベーションした。赤血球を微量遠心分離器において１８００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清をＦＡＣＳ分析および次回のサブトラクションのために保存した。２回目および３回目のサブトラクションをこれと同じ様式で行った。ＦＡＣＳ分析を、赤血球およびＣａｋｉ−１腫瘍細胞を用いたそれぞれのサブトラクションからの血清に対して行った。比較のために、ＦＡＣＳ分析を、サブトラクションを行わない事前採血血清および事後採血血清に対して行った。
【００６３】
負の選択プロセスの後で残留するポリクローナル抗体は、ガン患者を処置する際の治療剤として使用することができる。
【００６４】
（実施例２）
（厳しいＲＢＣサブトラクションを用いたＰＣ３細胞パンニング、および、用いないＰＣ３細胞パンニング）
正常細胞（特に、ヒト血球）と交差反応する抗体の百分率を減少させるために、細胞全体でのパンニングを、厳しいＲＢＣ／正常細胞サブトラクションを用いて行った。細胞全体でのパンニングにおいて使用された正常細胞は前立腺上皮細胞のＰｒＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能）であった。ＲＢＣサブトラクションを用いたパンニングから得られた最終的な抗体を、ＲＢＣサブトラクションを用いない類似したパンニングから得られた抗体と比較した。
【００６５】
マウスを、ＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１４３５）として知られている前立腺ガン細胞により免疫した。ＰＣ３細胞株を使用することにはいくつかの利点がある。第１に、ＰＣ３細胞株は腺ガン株であり、腺ガン（前立腺ガンの９５％）をインビボで模倣するために使用することができる。第２に、この細胞株はホルモン非依存的であり、ホルモン不応性の前立腺ガン（「ＨＲＰＣ」）を有する疾患集団を模倣するために使用することができる。第３の利点は、ＰＣ３細胞が非常に攻撃的な腫瘍増殖表現型を有することである。この細胞株は齧歯類動物モデルにおいて転移性である。加えて、ＰＣ３細胞はまた、インビトロで非常に迅速に増殖し、細胞パンニング環境において操作が容易である。
【００６６】
（ライブラリーＤＮＡの作製）
総ＲＮＡをマウス脾臓サンプルから単離し、メッセンジャーＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴａｓｅ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して合成した。第２鎖ｃＤＮＡ合成、ならびに、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの重鎖フラグメントおよびκ軽鎖フラグメントの増幅を、米国特許出願第１０／２５１，０８５号（その開示は本参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載される方法に従って行った。増幅フラグメントを精製し、適切な制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ＩｇＧ１κライブラリーについてはＦａｂ発現ベクターのＰＡＸ２４３ｍＧ１Ｋに挿入し、ＩｇＧ２ａκライブラリーについてはＰＡＸ２４３ｍＧ２ａＫに挿入した。
【００６７】
（形質転換のために使用された大腸菌株）
ライブラリー構築を、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞および／またはＸＬ−１ ｂｌｕｅ細胞をエレクトロポレーションすることによって行った。ライブラリーＤＮＡを、Ｈｉ−Ｓｐｅｅｄ ｍａｘｉ調製キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）を使用して大腸菌細胞の一晩培養物から精製した。
【００６８】
（ファージ増幅のＩＰＴＧ誘導）
パンニングのために、ライブラリーＤＮＡをＥＲ２７３８細胞にエレクトロポレーションし、ファージ産生をＶＣＳＭ１３ヘルパーファージおよび１ｍＭのＩＰＴＧの添加により３０℃で一晩誘導した。
【００６９】
細胞全体でのパンニングを、所望の特徴を有する抗体を選択するために使用する。パンニングプロセスが図２に概略的にまとめられている。発現ＥＬＩＳＡを行って、Ｆａｂ発現クローンを同定する。一旦Ｆａｂ発現クローンが同定されたら、細胞ＥＬＩＳＡを行って、ＰＣ３細胞と結合するクローンを同定する。
【００７０】
正の選択のためのＰＣ３細胞でのパンニングの後、異なる負の選択プロセスを使用する２つの実験を行った。最初に、サブトラクションパンニングを、前立腺上皮細胞だけを用いて行った。このパンニングから得られたクローンのすべてが赤血球陽性クローンであった。２回目のパンニングおよび３回目のパンニングから得られた産生クローンを、抗体発現ＥＬＩＳＡ、ＲＢＣ−ＦＡＣＳ、ＰＣ３細胞ＥＬＩＳＡおよびＰｒＥＣ細胞ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした。ＰＣ３（＋）／ＰｒＥＣ（−）の表現型を有する前立腺上皮細胞パンニング由来のクローンをＤＮＡ配列決定のために選んだ。
【００７１】
第２の実験では、前立腺上皮細胞および赤血球の両方を用いたサブトラクションパンニングを行った。赤血球サブトラクションパンニングを３工程で行った。最初に、１回目の結果から得られた合計で３．８×１０１２個のファージを、細胞１個あたり７００個のファージの比率で、５．４×１０９個のＡＢ型赤血球と混合し、４℃で２時間インキュベーションした。その後、非結合のファージを５．４×１０９個のＡ型赤血球と４℃で２時間インキュベーションした。最後に、非結合のファージを５．４×１０９個のＢ型赤血球と４℃でさらに２時間インキュベーションした。この厳しい赤血球サブトラクションにより、ガン細胞および赤血球の両方に共通する抗原に結合する抗体の大部分が除かれる。２回目のパンニングおよび３回目のパンニングから得られた産生クローンを、抗体発現ＥＬＩＳＡ、ＲＢＣ−ＦＡＣＳ、ＰＣ３細胞ＥＬＩＳＡおよびＰｒＥＣ細胞ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした。細胞全体での組合せパンニング（すなわち、ＰＣ３細胞での正のパンニング、ならびに、前立腺上皮細胞および赤血球での負のパンニング）から得られ、ＰＣ３（＋）／ＲＢＣ（−）／ＰｒＥＣ（−）の表現型を有するクローンをＤＮＡ配列決定のために選んだ。ＰＣ３細胞ＥＬＩＳＡデータはまた、ＰＣ３細胞ＦＡＣＳを使用して妥当であることが確認される。
【００７２】
（インビトロでの抗体の確認）
細菌溶解産物由来の精製されたマウスＦａｂを、抗Ｆａｂカラムを使用して得る。免疫組織化学（ＩＨＣ）もまた行う。前立腺腫瘍アレイを使用して、腫瘍細胞に対するそれぞれのＦａｂの結合パターンを評価する。正常組織アレイを使用して、正常な細胞に対するそれぞれのＦａｂの結合を評価する。
【００７３】
抗原シグナチャーのウエスタンブロット分析を下記のように行う：９個の細胞株からなるパネルに由来する総細胞溶解産物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動する。ローディングの順序および用いられた具体的な細胞株を下記の表２に示す。その後、それぞれのＦａｂを、それぞれの細胞株において同定された抗原の分子量を決定するための一次抗体として使用する。線状エピトープを認識するそれぞれの特有のＦａｂは、どの細胞株においても、異なった抗原結合パターンを呈示し、「抗原シグナチャー」をもたらす（図３を参照のこと）。線状エピトープを認識しないＦａｂは抗原シグナチャーを呈示せず、しかし、依然として抗原を免疫沈降することができる。それぞれのパンニングに由来する抗原の数が抗原シグナチャーによって比較される。免疫沈降および質量分析での分析を抗原同定のために使用する。具体的には、それぞれのＦａｂを、その抗原をＰＣ３細胞膜調製物から免疫沈降させるために使用する。抗原のバンドを、ペプチド消化／マッピングによる抗原の質量分析での分析および同定のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（還元型）から切り出し、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ施設（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に送付する。
【００７４】
【表２】
赤血球サブトラクションを用いない場合、３回の細胞全体でのパンニングの後の合計で１５３６個の産生クローンから、ＰＣ３ガン細胞に結合する２１個のクローンが得られた。２１個のクローンのすべてが赤血球と結合することが見出された。２１個のクローンの配列は、Ｌ５２−２群、Ｅ２３群、１１Ｆ９群およびＥ２７群の４つの大きな群にまとめられた（図４Ａおよび図４Ｂ）。１１Ｆ９は、分子量が２０Ｋｄのタンパク質に結合する。各群におけるクローンの配列は１対のアミノ酸の違いを有するだけである。Ｆａｂ Ｌ５２−２およびＦａｂ Ｅ２３は、ＰｒＥＣ細胞上ではなく、赤血球およびＰＣ３細胞上で非常に発現するＣＤ５５に結合する。Ｆａｂ Ｅ２７は未知の抗原に結合する。これらの結果は、ＰＣ３細胞が、正の選択を妨害する、赤血球に対する著しい量の共通する抗原を発現することを示唆していた。
【００７５】
赤血球サブトラクションを使用した場合、３回の細胞全体でのパンニング（Ｒ３）の後の合計で４４１６個の産生クローンから、ＰＣ３ガン細胞に結合する１４６個のクローンが得られた。１４６個のクローンのうち、２４個は赤血球と結合しないことが見出された。これら２４個のクローンを配列決定した。２回目のパンニングからの２つのクローンの添加により、合計で１０個のクローンが得られ、これらは異なるＦａｂ配列を有していた（図４Ａおよび図４Ｂ）。これらの最終的な１０個のクローンはＰＣ３ガン細胞に結合するが、ヒト赤血球には結合しない。これら１０個のクローンのうち、５個はＰｒＥＣに結合しない。赤血球サブトラクションを伴わない細胞全体でのパンニングからの抗体との比較において、厳しいサブトラクションは実際に、抗体の多様性を増大させ、かつ、ＰＣ３（＋）／ＰｒＥＣ（−／＋）／ＲＢＣ（−）である望ましいプロフィールをもたらした。
【００７６】
【表３】
様々な改変が、本明細書中に開示された実施形態に対して行われ得ることが理解される。例えば、当業者は理解するように、本明細書中に記載される具体的な配列は、抗体または抗体フラグメントの機能性に必ずしも悪影響を及ぼすことなくわずかに変化させることができる。例えば、抗体の配列における１個だけまたは複数個のアミノ酸の置換を、抗体またはフラグメントの機能性を破壊することなく頻繁に行うことができる。従って、本明細書中に記載される具体的な抗体に対する同一性の程度が７０％よりも高い抗体は本開示の範囲内であることが理解されるべきである。特に有用な実施形態では、本明細書中に記載される具体的な抗体に対する同一性が約８０％よりも高い抗体が意図される。他の有用な実施形態においては、本明細書中に記載される具体的な抗体に対する同一性が約９０％よりも高い抗体が意図される。従って、上記の記載は、限定として解釈すべきではなく、単に好ましい実施形態の例示として解釈しなければならない。当業者は、本開示の範囲および精神に含まれる他の改変を想定する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、ヒト赤血球によりサブトラクションされた抗ガン血清のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図２】図２は、抗体ライブラリーのパンニング、正常な細胞に結合する抗体のサブトラクション、および、ガン性細胞に結合する抗体についてのスクリーニングに関与する工程を概略的に示す。
【図３】図３は、線状エピトープを用いたＰＣ３抗体についての抗原シグナチャーを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、図２のプロセスを使用して同定された抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１〜配列番号１６）を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図２のプロセスを使用して同定された抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７〜配列番号３２）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；
該抗血清をヒト赤血球と接触させる工程；および
該抗血清の、該ヒト赤血球に結合しない部分を回収する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記抗血清を、ヒト白血球に結合する抗体と接触させる工程；および、該抗血清の、該ヒト白血球に結合しない部分を回収する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗血清を、ヒト非ガン性細胞に結合する抗体と接触させる工程；および、該抗血清の、該ヒト非ガン性細胞に結合しない部分を回収する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；
ヒト赤血球に結合する抗体を該抗血清から除く工程；および、
該ガン細胞に結合する抗体を該抗血清から回収する工程
を包含する、方法。
【請求項５】
ヒト白血球に結合する抗体を前記抗血清から除く工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒト非ガン性細胞に結合する抗体を前記抗血清から除く工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ａ）ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；
ｂ）該抗血清から、
ｉ）ヒト赤血球に結合する抗体、および
ｉｉ）内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、肝臓細胞、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、腸細胞、胃細胞、膀胱細胞、脾臓細胞、膵臓細胞、骨髄細胞、脳細胞、胸腺細胞、前立腺細胞、卵巣細胞、精巣細胞および皮膚細胞からなる群から選択される少なくとも１つの他のタイプの非ガン性細胞に結合する抗体
を除く工程；ならびに
ｃ）その後、該ガン細胞に結合する抗体を該抗血清から回収する工程
を包含する、方法。
【請求項８】
ヒト白血球に結合する抗体を前記抗血清から除く工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ）ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；
ｂ）ヒト赤血球を該抗血清と混合する工程；
ｃ）該ヒト赤血球およびそれに結合した抗体を混合物から除き、該抗血清の第１の部分を回収する工程；
ｄ）ヒト赤血球を該抗血清の該第１の部分と混合する工程；
ｅ）該ヒト赤血球およびそれに結合した抗体を混合物から除き、該抗血清の第２の部分を回収する工程；
ｆ）ヒト赤血球を該抗血清の該第２の部分と混合する工程；
ｇ）該ヒト赤血球およびそれに結合した抗体を混合物から除き、該抗血清の第３の部分を回収する工程；ならびに
ｈ）該ガン細胞に結合する抗体を該抗血清の該第３の部分から回収する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
ｉ）ヒト白血球を前記抗血清の前記第３の部分と混合する工程；
ｊ）該ヒト白血球およびそれに結合した抗体を混合物から除き、前記抗血清の第４の部分を回収する工程；ならびに
ｋ）前記ガン細胞に結合する抗体を該抗血清の該第４の部分から回収する工程
をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）ファージディスプレーされた抗体ライブラリーを、ガン細胞により免疫された被験体から集められた細胞を使用して作製する工程；
ｂ）ヒト赤血球に結合するライブラリーメンバーを除いて、サブライブラリーを作製する工程；および
ｃ）該ガン細胞に結合する抗体を呈示するメンバーを該サブライブラリーから回収する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
ヒト白血球に結合するライブラリーメンバーを除く工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
正常な組織細胞に結合するライブラリーメンバーを除く工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
【化１】
からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項１５】
【化２】
からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項１６】
【化３】
からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項１７】
【化４】
からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項１８】
【化５】
からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項１９】
【化６】
からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項２０】
配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項２１】
請求項１４〜２０のいずれかに記載される抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載される単離された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載される発現ベクターによりトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２４】
ａ）ガン細胞をハプテンと接触させる工程；
ｂ）ファージディスプレーされた抗体ライブラリーを、該ガン細胞により免疫された被験体から集められた細胞を使用して作製する工程；
ｃ）ヒト赤血球に結合するライブラリーメンバーを除いてサブライブラリーを作製する工程；および
ｄ）該ガン細胞に結合する抗体を呈示するメンバーを該サブライブラリーから回収する工程
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記ハプテンがジニトロフェニルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト白血球に結合するライブラリーメンバーを除く工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
正常な組織細胞に結合するライブラリーメンバーを除く工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
配列番号４、配列番号２０、配列番号３３、配列番号４４、配列番号５７、配列番号７１、配列番号８３および配列番号９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｃｄｃｐ１に結合する抗体。
【請求項１】
ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；
該抗血清をヒト赤血球と接触させる工程；および
該抗血清の、該ヒト赤血球に結合しない部分を回収する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記抗血清を、ヒト白血球に結合する抗体と接触させる工程；および、該抗血清の、該ヒト白血球に結合しない部分を回収する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗血清を、ヒト非ガン性細胞に結合する抗体と接触させる工程；および、該抗血清の、該ヒト非ガン性細胞に結合しない部分を回収する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；
ヒト赤血球に結合する抗体を該抗血清から除く工程；および、
該ガン細胞に結合する抗体を該抗血清から回収する工程
を包含する、方法。
【請求項５】
ヒト白血球に結合する抗体を前記抗血清から除く工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒト非ガン性細胞に結合する抗体を前記抗血清から除く工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ａ）ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；
ｂ）該抗血清から、
ｉ）ヒト赤血球に結合する抗体、および
ｉｉ）内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、肝臓細胞、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、腸細胞、胃細胞、膀胱細胞、脾臓細胞、膵臓細胞、骨髄細胞、脳細胞、胸腺細胞、前立腺細胞、卵巣細胞、精巣細胞および皮膚細胞からなる群から選択される少なくとも１つの他のタイプの非ガン性細胞に結合する抗体
を除く工程；ならびに
ｃ）その後、該ガン細胞に結合する抗体を該抗血清から回収する工程
を包含する、方法。
【請求項８】
ヒト白血球に結合する抗体を前記抗血清から除く工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ）ガン細胞により免疫された被験体から抗血清を集める工程；
ｂ）ヒト赤血球を該抗血清と混合する工程；
ｃ）該ヒト赤血球およびそれに結合した抗体を混合物から除き、該抗血清の第１の部分を回収する工程；
ｄ）ヒト赤血球を該抗血清の該第１の部分と混合する工程；
ｅ）該ヒト赤血球およびそれに結合した抗体を混合物から除き、該抗血清の第２の部分を回収する工程；
ｆ）ヒト赤血球を該抗血清の該第２の部分と混合する工程；
ｇ）該ヒト赤血球およびそれに結合した抗体を混合物から除き、該抗血清の第３の部分を回収する工程；ならびに
ｈ）該ガン細胞に結合する抗体を該抗血清の該第３の部分から回収する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
ｉ）ヒト白血球を前記抗血清の前記第３の部分と混合する工程；
ｊ）該ヒト白血球およびそれに結合した抗体を混合物から除き、前記抗血清の第４の部分を回収する工程；ならびに
ｋ）前記ガン細胞に結合する抗体を該抗血清の該第４の部分から回収する工程
をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）ファージディスプレーされた抗体ライブラリーを、ガン細胞により免疫された被験体から集められた細胞を使用して作製する工程；
ｂ）ヒト赤血球に結合するライブラリーメンバーを除いて、サブライブラリーを作製する工程；および
ｃ）該ガン細胞に結合する抗体を呈示するメンバーを該サブライブラリーから回収する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
ヒト白血球に結合するライブラリーメンバーを除く工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
正常な組織細胞に結合するライブラリーメンバーを除く工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
【化１】
からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項１５】
【化２】
からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項１６】
【化３】
からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項１７】
【化４】
からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項１８】
【化５】
からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項１９】
【化６】
からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項２０】
配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前立腺ガン細胞に結合する抗体。
【請求項２１】
請求項１４〜２０のいずれかに記載される抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載される単離された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載される発現ベクターによりトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２４】
ａ）ガン細胞をハプテンと接触させる工程；
ｂ）ファージディスプレーされた抗体ライブラリーを、該ガン細胞により免疫された被験体から集められた細胞を使用して作製する工程；
ｃ）ヒト赤血球に結合するライブラリーメンバーを除いてサブライブラリーを作製する工程；および
ｄ）該ガン細胞に結合する抗体を呈示するメンバーを該サブライブラリーから回収する工程
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記ハプテンがジニトロフェニルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト白血球に結合するライブラリーメンバーを除く工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
正常な組織細胞に結合するライブラリーメンバーを除く工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
配列番号４、配列番号２０、配列番号３３、配列番号４４、配列番号５７、配列番号７１、配列番号８３および配列番号９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｃｄｃｐ１に結合する抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【公表番号】特表２００８−５０５６４５（Ｐ２００８−５０５６４５Ａ）
【公表日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２０５３３（Ｐ２００７−５２０５３３）
【出願日】平成１７年７月８日（２００５．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２４２６０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１７１７３
【国際公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月８日（２００５．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２４２６０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１７１７３
【国際公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】
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