キノコ由来成分及びトレハロースを含む組成物
【課題】キノコ由来成分をその生理活性物質の活性を失うことなく飲食品等に添加する技術を提供することを目的とする。
【解決手段】キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、キノコ由来成分に含まれる生理活性物質の活性が上昇する。
【解決手段】キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、キノコ由来成分に含まれる生理活性物質の活性が上昇する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコ由来成分及びトレハロースを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近キノコ類の栄養効果が注目されている。キノコには、ビタミン、ミネラル、タンパク質（アミノ酸）、βグルカン等の糖類、食物繊維等の多くの栄養素が含まれており、その成分の生理活性が明らかにされてきている。クレスチン、レンチナン、シゾフィラン（いずれも商品名）などの有効成分は、キノコ由来の成分であり、医薬品としてその有用性が認められている。また、免疫賦活作用や抗腫瘍作用を期待して、アガリクス、メシマコブ、霊芝（マンネンタケ）、カバノアナタケ、ハナビラタケ等の子実体や菌糸体の乾燥物や抽出物を健康食品素材として利用することが試みられている（特許文献１、２及び３）。さらに、健康食品素材としてだけでなく、美容を目的とした用途も注目されてきている。
【０００３】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞、及びコラーゲン等の細胞外マトリクスにより構成されている。特に、表皮の底に存在している線維芽細胞が、コラーゲンやエラスチンといった皮膚の弾力を保ち、ハリの元となる物質を生産している。この線維芽細胞は、紫外線の照射や乾燥等の外的因子の影響、又は加齢によって、コラーゲンやエラスチン産生能が低下し、うるおいが失われ、キメが崩れ、シワの原因になると言われている。
【０００４】
成長期では、繊維芽細胞のコラーゲン産生量は、古いコラーゲンが廃棄される量よりも多く、常に新しいコラーゲンで満たされているが、成長期を過ぎると、産生されるコラーゲン量が減少し、シワ等の皮膚の老化症状を引き起こす。
これらのことは、コラーゲン産生量減少が老化の初期段階に起こることを示唆し、皮膚のコラーゲン産生量を増加させる食品の開発が進められてきた。
【０００５】
キノコ由来のコラーゲン産生促進効果を有する素材としては、カバノアナタケの抽出物が知られている（特許文献４）。さらに、近年、ハナビラタケの抽出物もコラーゲン産生促進効果を有することが報告された（特許文献５）。
【０００６】
ハナビラタケは、ヒダナシタケ目に属する非常に僅少なキノコで、歯ごたえがよく、その純白の色合いと葉牡丹のような形態が特徴である。これまで、このハナビラタケは成長が遅く人工栽培は非常に困難であるとされてきたが、最近になって、比較的短期間で栽培可能な新しい栽培法が確立され、商業規模での供給が可能となってきている。また、ヒダナシタケ目に属するキノコで、食用及び／又は薬用として用いられているものとして、ハナビラタケ以外にも霊芝、マイタケ、アンズタケ等がある。
【０００７】
ハナビラタケの粉末は、口当たりが悪く、摂取しにくいという問題があった。そのため、粉末を顆粒状や錠剤などに加工したり、カプセルに封入するなどして摂取しやすくすることが行われていた。
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１０９７０号公報
【特許文献２】特開２００１−１３１０８３号公報
【特許文献３】特開２００３−１８３１７６号公報
【特許文献４】特開２００４−２０３７７７号公報
【特許文献５】特開２００６−１３７６８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、顆粒に加工した場合も、飲み込みにくいと感じる場合があり、摂取する上で問題となっていた。特に、病気で体力の落ちた人にとって食感は重要であり、摂取し続けるためにも摂取する者の嗜好性に合わせた飲食品等への加工が必要であった。したがって、キノコ由来成分を、加工によってもその活性を失うことなく飲食品等に添加するための組成物の開発が必要とされていた。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、キノコ由来成分をその生理活性物質の活性を失うことなく飲食品等に添加することのできる組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、キノコ由来成分及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物が提供される。本発明の組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇している。
また、本発明によれば、上記組成物を含む食品添加剤が提供される。本発明の食品添加剤は、キノコ由来成分を摂取する者の嗜好性に合わせた飲食品等への加工を可能とするものであり、キノコの食感を改善することができる。キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇していることは言うまでもない。
また、本発明によれば、上記組成物又は上記食品添加剤を含む飲食品が提供される。本発明の飲食品は、キノコ由来成分及びトレハロースを含むことにより、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇しているだけでなく、キノコの食感が改善されている。
また、本発明によれば、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースを含む組成物が提供される。本発明の組成物は、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分に含まれる生理活性物質の活性が上昇している。
また、本発明によれば、上記組成物を含む食品添加剤が提供される。本発明の食品添加剤は、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分を摂取する者の嗜好性に合わせた飲食品等への加工を可能とするものであり、キノコの食感を改善することができる。ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分に含まれる生理活性物質の活性が上昇していることは言うまでもない。
また、本発明によれば、上記組成物又は上記食品添加剤を含む飲食品が提供される。本発明の飲食品は、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースを含むことにより、キノコ由来成分の生理活性物質の活性が上昇しているだけでなく、キノコの食感が改善されている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、キノコ由来成分にトレハロースが加えられているため、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇するという効果を奏する。
また、本発明によれば、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分に含まれる生理活性物質の活性が上昇するという効果を奏する。
本発明の組成物は、飲食品等に添加してもその活性が低下せず、食品添加剤として用いることができる。
本発明の飲食品は、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇しているだけでなく、キノコの食感が改善されており、摂取し続けることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
＜発明の経緯＞
本発明者は、キノコ由来成分をその生理活性物質の活性を失うことなく飲食品等に添加する技術を提供することを目的として、研究を進めてきた。しかしながら、キノコ由来成分のみを食品に添加しても、キノコ由来成分の有する生理活性物質の活性が失われてしまうという結果が得られた。本発明者は、キノコ由来成分にトレハロースを加えることによって、キノコ由来成分に含まれる生理活性物質の活性が上昇し、飲食品等に添加してもその活性が低下しないことを見出し、本発明を開発するに至った。
【００１３】
＜用語＞
本発明において、キノコとは、担子菌、子のう菌に属し子実体形成するものをいう。
【００１４】
また、本発明において、キノコ由来成分とは、キノコに含まれる生理活性物質の活性を有すればよい。好ましくは、キノコ粉末又はキノコ抽出成分であってもよい。さらに好ましくは、キノコの乾燥粉末であってもよい。
【００１５】
また、本発明において、キノコ由来成分の生理活性物質の活性とは、繊維芽細胞増殖活性、繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性、免疫増強活性、チロシナーゼ阻害活性、メラニン化抑制活性又はメラニンポリマー還元活性のうち、１又は２以上の活性をいう。
【００１６】
＜キノコの種類＞
以下の実施例においては、ハナビラタケ粉末及びトレハロースを添加して製造したパンを用いて実験を行っているが、本実施形態で用いられるキノコは、キノコ由来成分の生理活性物質の活性を有する担子菌類もしくは子のう菌類のキノコであればハナビラタケでなくてもよい。好ましくは、ハラタケ目もしくはヒダナシタケ目に属するキノコであり、ハラタケ目に属するキノコとしては、ヒラタケ科ではヒラタケ、タモギタケ、シイタケ、エリンギ、バイリング、キシメジ科ではハタケシメジ、ホンシメジ、ブナシメジ、ムラサキシメジ、マツタケ、ニオウシメジ、ナラタケ、ナラタケモドキ、ムキタケ、エノキタケ、オキナタケ科ではヤナギマツタケ、モエギタケ科ではナメコ、クリタケ、イグチ科ではヤマドリタケモドキ、ヒダナシタケ目に属するキノコとしては、アンズタケ科ではアンズタケ、サンゴハリタケ科ではヤマブシタケ、スエヒロタケ科ではスエヒロタケ、ミミナミハタケ科ではイタチナミハタケ、タコウキン科ではアミスギタケ、ツヤウチワタケ、スジウチワタケモドキ、ホウネンタケ、ヒイロタケ、ニッケイタケ、シハイタケ、シロカイメンタケ、クジラタケ、ホウロクタケ、マンネンタケ科ではマンネンタケ、サルノコシカケ科ではマイタケ、サルノコシカケなどがある。
【００１７】
＜飲食品の種類＞
また、キノコ由来成分を添加する飲食品は、パンでなくともよい。パン以外の飲食品としては、穀飯添加剤、菓子類、惣菜類、漬物類、発酵食品（ヨーグルト、納豆、ミソなど）、健康飲料、アルコール飲料、レトルト食品、麺類、水産加工品、肉加工品などがある。
【００１８】
＜含有量＞
また、以下の実施例においては、ハナビラタケ粉末を１ｇ又は２ｇ添加しパンを製造しているが、キノコ由来成分の添加量は、飲食品がキノコ由来成分の生理活性物質の活性を有する量であればよく、１、２若しくは５ｇ以上であってもよい。また、キノコ由来成分の添加量の上限としては、キノコ由来成分を添加して飲食品を製造する上でその妨げにならない量であればよく、３０、２０若しくは１０ｇ以下であってもよい。
【００１９】
また、以下の実施例においては、トレハロースを１５ｇ添加しパンを製造しているが、トレハロースの添加量は、飲食品がキノコ由来成分の生理活性物質の活性を有する量であればよく、５、１０若しくは１５ｇ以上であってもよい。また、トレハロースの添加量の上限としては、トレハロースを添加して飲食品を製造する上でその妨げにならない量であればよく、５０、４０、３０若しくは２０ｇ以下であってもよい。
【００２０】
また、添加するキノコ由来成分とトレハロースの比率は、飲食品がキノコ由来成分の生理活性物質の活性を有する比率であればよく、１：５０、２：１５、１：５、２：５、３：５、１：１若しくは６：１であってもよい。
【００２１】
＜作用効果＞
以下、本実施形態の作用効果について説明する。
キノコ由来成分及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例で示されているように、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇している。
ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例で示されているように、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇している。
ハナビラタケ由来成分及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例で示されているように、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇している。
また、キノコの乾燥粉末及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物は、キノコの乾燥粉末にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例で示されているように、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇しているだけでなく、キノコを乾燥することでタンパク質の安定化、ビタミンＤ量の増加、添加できる量の増加、安定的な長期保管などの作用が得られる。これに対し、生鮮キノコは多量の水分を有するため、酵素による有用成分の分解、栄養成分の不安定化、雑菌汚染、キノコ由来の生理活性成分としての実質的な添加量の制限などの問題が生じる可能性がある。
また、キノコは古くから食用又は薬用として用いられてきたものであり、トレハロースもまた食品添加剤として用いられてきたものであるので、キノコ由来成分及びトレハロースは食品添加剤として使用することが可能である。したがって、キノコ由来成分を、摂取する者の嗜好性に合わせた飲食品等への加工が可能であり、キノコの食感を改善し、摂取し続けることができる。
上記組成物及び食品添加剤を添加してパンを製造することが可能である。パンに添加することにより、以下の実施例で示されているように、飲み込みにくいと感じたりするようなキノコ由来成分を摂取する上での問題は改善された。
ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースを含む組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例に示されているように、キノコ由来成分の生理活性物質の活性が上昇している。
ハナビラタケ由来成分及びトレハロースを含む組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例に示されているように、ハナビラタケ由来成分の生理活性物質の活性が上昇している。
また、ヒダナシタケ目に属するキノコの乾燥粉末及びトレハロースを含む組成物は、キノコの乾燥粉末にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例で示されているように、キノコ由来成分の生理活性物質の活性が上昇しているだけでなく、キノコを乾燥することでタンパク質の安定化、ビタミンＤ量の増加、添加できる量の増加、安定的な長期保管などの作用が得られる。これに対し、生鮮キノコは多量の水分を有するため、酵素による有用成分の分解、栄養成分の不安定化、雑菌汚染、添加量の制限などの問題が生じる可能性がある。
また、キノコは古くから食用又は薬用として用いられてきたものであり、トレハロースもまた食品添加剤として用いられてきたものであるので、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースは食品添加剤として使用することが可能である。したがって、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分を、摂取する者の嗜好性に合わせた飲食品等への加工が可能であり、キノコの食感を改善することができる。
上記組成物及び食品添加剤を添加してパンを製造することが可能である。パンに添加することにより、以下の実施例で示されているように、飲み込みにくいと感じたりするようなキノコ由来成分を摂取する上での問題は改善された。
上記組成物又は食品添加剤を添加して飲食品を製造することが可能であるので、以下の実施例に示されているように、キノコ由来成分の摂取をする者の嗜好性に合わせた飲食品等へ加工することができるため、キノコの食感を改善し、摂取し続けることができる。
また、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによってキノコ由来成分の生理活性物質の活性が上昇するメカニズムは明らかとなっていないが、トレハロースが有する、親水性、乾燥保護作用、ミネラル結合作用、不飽和脂肪酸分解保護作用及びＳＯＤ様物質の保護作用のうちの１又は２以上の作用による可能性が考えられる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１ ヒト正常線維芽細胞増殖試験及びＰＩＰ（コラーゲン産生）試験
１．試験方法
評価に用いたハナビラタケ抽出液は、ハナビラタケ子実体乾燥物を室温にて６０分間抽出後、ろ過処理した水溶液と、１０５℃、６０分間抽出後、ろ過処理した熱水抽出液を用いた。細胞培養実験には、さらに０．２μｍフィルターによりろ過滅菌して用いた。
（１） 細胞培養
予備試験（data not shown）の結果を基に、培養２４時間におけるヒト正常線維芽細胞の増殖率を測定した。測定にはCellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（プロメガ株式会社製）を用いた。
（ｉ） ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）を前培養した。
（ｉｉ） 前培養し、静止期にある細胞をトリプシン処理して細胞浮遊液を作製、細胞数を計数した。
（ｉｉｉ） 本細胞を９６穴マイクロプレートに１×１０５細胞／ｗｅｌｌで播種した。
（ｉｖ） 無血清培地で１６時間培養した。
（ｖ） 培地を評価サンプル添加培地に交換した。
［１］ 対照（ネガティブコントロール、無添加、細胞あり）
［２］ １００μg／mlハナビラタケ子実体乾燥物の抽出液（１００Ｗ）
［３］ １０００μg／mlハナビラタケ子実体乾燥物の抽出液（１０００Ｗ）
［４］ １００μg／mlハナビラタケ子実体乾燥物の熱水抽出液（１００Ｈ）
［５］ １０００μg／mlハナビラタケ子実体乾燥物の熱水抽出液（１０００Ｈ）
（ｖｉ） 無血清培地で２４時間培養した。
（ｖｉｉ） 培地を回収後、細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（プロメガ株式会社製）を使用し、ＭＴＳ法にて、測定した。
（ｖｉｉｉ）回収した培地中のプロコラーゲン（ＰＩＰ）量は、ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて定量した。
【００２４】
（２）培養中に生産されたＩ型コラーゲン前躯体（ＰＩＰ）の定量
ヒト正常線維芽細胞が産生し、培地中に放出されたＩ型コラーゲン前躯体の定量は、ＥＬＩＳＡ法によって行った。測定キットは、プロコラーゲン タイプ・Ｉペプチド（ＰＩＰ）ＥＩＡキット（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
定量法は、メーカーの使用手順に従ったが、操作の概要は以下のとおりである。
（ｉ） 標識抗体溶液を１００μｌずつ抗体プレートの各ｗｅｌｌに加えた。
（ｉｉ） 所定濃度のＰＩＰ標準溶液および検体を２０μｌずつ各ｗｅｌｌに加えた。
（ｉｉｉ） ３７℃で２時間インキュベーションして反応させた。
（ｉｖ） 反応溶液を捨て、ＰＢＳで４回洗浄した。
（ｖ） 基質溶液（ＴＭＢＺ）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ加えた。
（ｖｉ） 室温（２０‐３０℃）で１５分間反応させた。
（ｖｉｉ） Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＮ硫酸）を１００μｌずつｗｅｌｌに加え混和し、呈色反応を停止させた。
（ｖｉｉｉ）波長４９２ｎｍで各呈色反応の吸光度を測定した。
（ｉｘ） 横軸にＰＩＰ標準溶液の濃度を、縦軸に対応する吸光度をプロットして、標準曲線を作成した。本標準曲線を基に、各検体の吸光度から対応するＰＩＰ濃度を推量した。
【００２５】
２．結果
（１）ハナビラタケ抽出液のヒト正常線維芽細胞増殖に対する作用
細胞培養期間を２４時間に設定して本期間における細胞増殖を調べ、培養２４時間後の細胞増殖の結果を図１に示した。評価サンプルは、水抽出及び熱水抽出液のどちらにおいても細胞増殖を促進した。特に、１００μｇ／ml濃度が最も増殖率が高かった。
また、光学顕微鏡により細胞の形態変化を観察したが、評価サンプル添加によって、特徴的な形態変化は見られなかった。
これらのことにより、評価サンプルの細胞毒性は無いものと考えられた。
（２）ハナビラタケ抽出液のヒト線維芽細胞のプロコラーゲン産生への作用
細胞培養期間を２４時間に設定して、本期間におけるプロコラーゲン産生へのハナビラタケ抽出液の作用を調べ、培養２４時間後のプロコラーゲン産生量を図２に示した。評価サンプルは、水抽出及び熱水抽出液のどちらにおいてもプロコラーゲン産生量を増加させた。また、評価サンプルのプロコラーゲン産生量は、濃度依存的に増加した。
本結果は、ハナビラタケ抽出液にプロコラーゲンを産生する作用があることを示唆した。
【００２６】
３．考察
今回の試験結果から、ハナビラタケ水抽出液および熱水抽出液の両者に、ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）の増殖を促進する作用があることが判明した。中でも熱水抽出液は、水抽出液よりも増殖を促進することが判明した。
またハナビラタケ水抽出液及び熱水抽出液ともに、ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）のプロコラーゲン産生量を促進する作用があることが判明した。プロコラーゲン産生は、濃度依存的であった。
細胞増殖率とプロコラーゲン産生量を比較した場合、増殖率は、低濃度の１００μｇ／mlが高かった。しかし、プロコラーゲン産生量は、高濃度の１０００μg／mlが多いという結果であった。
プロコラーゲンには、それが接する細胞に対して、増殖・分化シグナルを与えるという情報伝達の働きも担っていることがわかってきている。１００μg／mlでは、細胞増殖率が高かったのに対し、プロコラーゲン産生量は低かった。これらの関係は、産生されたプロコラーゲンにより刺激をうけ、細胞増殖が促進され、その後プロコラーゲンがコラーゲンとして利用されたためではないかと推測している。
以上のことから、ハナビラタケ抽出液には、線維芽細胞増殖作用及び、プロコラーゲン産生促進作用があることが示唆された。
【００２７】
実施例２ キノコ由来成分含有食品抽出液のヒト正常線維芽細胞増殖試験
１．試験方法
評価に用いたハナビラタケ由来成分及びトレハロースは、ハナビラタケ粉末及びトレハロースが添加されたパンから熱水で抽出することにより得られた。
ハナビラタケ子実体を４０−６０℃で熱風乾燥した乾燥物を破砕機で粉砕し、６０メッシュパスの粉体を得た。得られたハナビラタケ粉末及び／又はトレハロースを、小麦粉（強力粉）２８０ｇ、イースト６ｇ、食塩６ｇ、ショートニング１２ｇ、水２００ｇに添加し、一般的な方法でパンを製造した。添加するハナビラタケ粉末の量は、０ｇ、１ｇ又は２ｇとした。添加するトレハロースの量は、０ｇ又は１５ｇとした。いずれの添加量においても、パンの製造を妨げることはなく、食感も良好であった。
製造したパンから、２０倍量の蒸留水を用いて６０分間熱水抽出した。細胞培養実験には、さらに０．２μｍフィルターによりろ過滅菌して用いた。
【００２８】
（２） 細胞培養
予備試験（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）の結果を基に、培養２４時間におけるヒト正常線維芽細胞の増殖率を測定した。測定にはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（プロメガ株式会社製）を用いた。
（ｉ） ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）を前培養した。
（ｉｉ） 前培養し、静止期にある細胞をトリプシン処理して細胞浮遊液を作製、細胞数を形数した。
（ｉｉｉ） 本細胞を９６穴マイクロプレートに１×１０５細胞／ｗｅｌｌで播種した。
（ｉｖ） 無血清培地で１６時間培養した。
（ｖ） 培地を評価サンプル添加培地に交換した。
［１］ 無添加（Ｄ．Ｗ．）
［２］ ハナビラタケ及びトレハロース無添加のパンからの抽出液（パン）
［３］ ハナビラタケ１ｇ、トレハロース０ｇ添加したパンからの抽出液（Ｓｃｒ１ｇ）
［４］ ハナビラタケ２ｇ、トレハロース０ｇ添加したパンからの抽出液（Ｓｃｒ２ｇ）
［５］ ハナビラタケ０ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液（Ｔｒｅ１５ｇ）
［６］ ハナビラタケ１ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液（Ｓｃｒ１ｇ＋Ｔｒｅ１５ｇ）
［７］ ハナビラタケ２ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液（Ｓｃｒ２ｇ＋Ｔｒｅ１５ｇ）
（ｖｉ） 無血清培地で２４時間培養した。
（ｖｉｉ） 培地を回収後、細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（プロメガ株式会社製）を使用し、ＭＴＳ法にて、測定した。
【００２９】
２．結果
細胞培養期間を２４時間に設定して本期間における細胞増殖を調べ、培養２４時間後の細胞増殖の結果を図３に示した。無添加の区、ハナビラタケ及びトレハロース無添加のパンからの抽出液を添加した区ではヒト正常線維芽細胞増殖活性はみられなかった。ハナビラタケのみを添加したパンからの抽出液を添加した区及びトレハロースのみを添加したパンからの抽出液を添加した区においても、ヒト正常線維芽細胞増殖活性がみられなかったのに対し、ハナビラタケ２ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液を添加した区では増殖活性がみられた。特に、ハナビラタケ１ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液を添加した区と比べても、ハナビラタケ２ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液を添加した区では、ヒト正常線維芽細胞増殖活性が著しく上昇していた。
【００３０】
３．考察
今回の試験結果から、ハナビラタケ及びトレハロースを添加して製造したパンには、ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）の増殖を促進する活性があることが判明した。
これに対し、ハナビラタケのみ、又はトレハロースのみを添加して製造したパンからの抽出液にはヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）の増殖活性がみられなかった。その要因として、ハナビラタケ由来成分は、飲食品に添加されることによりその生理活性物質の活性が低下したと考えられる。また、パンの製造工程には１８０〜３５０℃で加熱する工程が含まれるため、生理活性物質の活性が低下したと考えられる。一方、ハナビラタケ２ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液を添加した区においてヒト正常線維芽細胞増殖活性が著しく上昇していたのは、トレハロースが有する親水性、乾燥保護作用、ミネラル結合作用、不飽和脂肪酸分解保護作用及びＳＯＤ様物質の保護作用のうちの１又は２以上の作用による可能性が考えられる。
以上のことから、ハナビラタケ及びトレハロースを添加することによって、線維芽細胞増殖活性が相乗的に上昇することが示された。
本発明により、キノコ由来成分にトレハロースを加えることによって、キノコ由来成分をその生理活性を失うことなく飲食品に添加する技術が提供された。
【００３１】
供試細胞「ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）について」
供試細胞は、独立行政法人 理化学研究所より譲渡されたヒト正常線維芽細胞を使用した。このＮＢＩＲＧＢ株は、独立行政法人 理化学研究所で新たに培養化された人新生児皮膚線維芽細胞である。
線維芽細胞には、真皮成分（コラーゲン・エラスチン・ヒアルロン酸）を産生する働きやコラーゲンを束ねて真皮の構造を作る働きがある。そこで、化粧品原料の有用性を試験する目的でしばしば、増殖作用試験及びプロコラーゲン産生試験に用いられている細胞である。
培養条件は以下に示したとおりである。
培地：ＭＥＭ ＡＬＰＨＡ ＋１０％ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）
培養温度：３７℃
ＣＯ２濃度（％）：５％
【００３２】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。例えば、パンに添加するハナビラタケの量は、２ｇを超えてもよい。ハナビラタケを７ｇ添加しても、パンを製造することは可能であり、パンの食感も良好であったことが確認されている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒト正常線維芽細胞増殖試験の結果を示したグラフである。
【図２】ヒト正常線維芽細胞ＰＩＰ（コラーゲン産生）試験の結果を示したグラフである。
【図３】キノコ由来成分含有食品抽出物のヒト正常線維芽細胞増殖試験の結果を示したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコ由来成分及びトレハロースを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近キノコ類の栄養効果が注目されている。キノコには、ビタミン、ミネラル、タンパク質（アミノ酸）、βグルカン等の糖類、食物繊維等の多くの栄養素が含まれており、その成分の生理活性が明らかにされてきている。クレスチン、レンチナン、シゾフィラン（いずれも商品名）などの有効成分は、キノコ由来の成分であり、医薬品としてその有用性が認められている。また、免疫賦活作用や抗腫瘍作用を期待して、アガリクス、メシマコブ、霊芝（マンネンタケ）、カバノアナタケ、ハナビラタケ等の子実体や菌糸体の乾燥物や抽出物を健康食品素材として利用することが試みられている（特許文献１、２及び３）。さらに、健康食品素材としてだけでなく、美容を目的とした用途も注目されてきている。
【０００３】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞、及びコラーゲン等の細胞外マトリクスにより構成されている。特に、表皮の底に存在している線維芽細胞が、コラーゲンやエラスチンといった皮膚の弾力を保ち、ハリの元となる物質を生産している。この線維芽細胞は、紫外線の照射や乾燥等の外的因子の影響、又は加齢によって、コラーゲンやエラスチン産生能が低下し、うるおいが失われ、キメが崩れ、シワの原因になると言われている。
【０００４】
成長期では、繊維芽細胞のコラーゲン産生量は、古いコラーゲンが廃棄される量よりも多く、常に新しいコラーゲンで満たされているが、成長期を過ぎると、産生されるコラーゲン量が減少し、シワ等の皮膚の老化症状を引き起こす。
これらのことは、コラーゲン産生量減少が老化の初期段階に起こることを示唆し、皮膚のコラーゲン産生量を増加させる食品の開発が進められてきた。
【０００５】
キノコ由来のコラーゲン産生促進効果を有する素材としては、カバノアナタケの抽出物が知られている（特許文献４）。さらに、近年、ハナビラタケの抽出物もコラーゲン産生促進効果を有することが報告された（特許文献５）。
【０００６】
ハナビラタケは、ヒダナシタケ目に属する非常に僅少なキノコで、歯ごたえがよく、その純白の色合いと葉牡丹のような形態が特徴である。これまで、このハナビラタケは成長が遅く人工栽培は非常に困難であるとされてきたが、最近になって、比較的短期間で栽培可能な新しい栽培法が確立され、商業規模での供給が可能となってきている。また、ヒダナシタケ目に属するキノコで、食用及び／又は薬用として用いられているものとして、ハナビラタケ以外にも霊芝、マイタケ、アンズタケ等がある。
【０００７】
ハナビラタケの粉末は、口当たりが悪く、摂取しにくいという問題があった。そのため、粉末を顆粒状や錠剤などに加工したり、カプセルに封入するなどして摂取しやすくすることが行われていた。
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１０９７０号公報
【特許文献２】特開２００１−１３１０８３号公報
【特許文献３】特開２００３−１８３１７６号公報
【特許文献４】特開２００４−２０３７７７号公報
【特許文献５】特開２００６−１３７６８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、顆粒に加工した場合も、飲み込みにくいと感じる場合があり、摂取する上で問題となっていた。特に、病気で体力の落ちた人にとって食感は重要であり、摂取し続けるためにも摂取する者の嗜好性に合わせた飲食品等への加工が必要であった。したがって、キノコ由来成分を、加工によってもその活性を失うことなく飲食品等に添加するための組成物の開発が必要とされていた。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、キノコ由来成分をその生理活性物質の活性を失うことなく飲食品等に添加することのできる組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、キノコ由来成分及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物が提供される。本発明の組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇している。
また、本発明によれば、上記組成物を含む食品添加剤が提供される。本発明の食品添加剤は、キノコ由来成分を摂取する者の嗜好性に合わせた飲食品等への加工を可能とするものであり、キノコの食感を改善することができる。キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇していることは言うまでもない。
また、本発明によれば、上記組成物又は上記食品添加剤を含む飲食品が提供される。本発明の飲食品は、キノコ由来成分及びトレハロースを含むことにより、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇しているだけでなく、キノコの食感が改善されている。
また、本発明によれば、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースを含む組成物が提供される。本発明の組成物は、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分に含まれる生理活性物質の活性が上昇している。
また、本発明によれば、上記組成物を含む食品添加剤が提供される。本発明の食品添加剤は、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分を摂取する者の嗜好性に合わせた飲食品等への加工を可能とするものであり、キノコの食感を改善することができる。ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分に含まれる生理活性物質の活性が上昇していることは言うまでもない。
また、本発明によれば、上記組成物又は上記食品添加剤を含む飲食品が提供される。本発明の飲食品は、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースを含むことにより、キノコ由来成分の生理活性物質の活性が上昇しているだけでなく、キノコの食感が改善されている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、キノコ由来成分にトレハロースが加えられているため、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇するという効果を奏する。
また、本発明によれば、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分に含まれる生理活性物質の活性が上昇するという効果を奏する。
本発明の組成物は、飲食品等に添加してもその活性が低下せず、食品添加剤として用いることができる。
本発明の飲食品は、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇しているだけでなく、キノコの食感が改善されており、摂取し続けることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
＜発明の経緯＞
本発明者は、キノコ由来成分をその生理活性物質の活性を失うことなく飲食品等に添加する技術を提供することを目的として、研究を進めてきた。しかしながら、キノコ由来成分のみを食品に添加しても、キノコ由来成分の有する生理活性物質の活性が失われてしまうという結果が得られた。本発明者は、キノコ由来成分にトレハロースを加えることによって、キノコ由来成分に含まれる生理活性物質の活性が上昇し、飲食品等に添加してもその活性が低下しないことを見出し、本発明を開発するに至った。
【００１３】
＜用語＞
本発明において、キノコとは、担子菌、子のう菌に属し子実体形成するものをいう。
【００１４】
また、本発明において、キノコ由来成分とは、キノコに含まれる生理活性物質の活性を有すればよい。好ましくは、キノコ粉末又はキノコ抽出成分であってもよい。さらに好ましくは、キノコの乾燥粉末であってもよい。
【００１５】
また、本発明において、キノコ由来成分の生理活性物質の活性とは、繊維芽細胞増殖活性、繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性、免疫増強活性、チロシナーゼ阻害活性、メラニン化抑制活性又はメラニンポリマー還元活性のうち、１又は２以上の活性をいう。
【００１６】
＜キノコの種類＞
以下の実施例においては、ハナビラタケ粉末及びトレハロースを添加して製造したパンを用いて実験を行っているが、本実施形態で用いられるキノコは、キノコ由来成分の生理活性物質の活性を有する担子菌類もしくは子のう菌類のキノコであればハナビラタケでなくてもよい。好ましくは、ハラタケ目もしくはヒダナシタケ目に属するキノコであり、ハラタケ目に属するキノコとしては、ヒラタケ科ではヒラタケ、タモギタケ、シイタケ、エリンギ、バイリング、キシメジ科ではハタケシメジ、ホンシメジ、ブナシメジ、ムラサキシメジ、マツタケ、ニオウシメジ、ナラタケ、ナラタケモドキ、ムキタケ、エノキタケ、オキナタケ科ではヤナギマツタケ、モエギタケ科ではナメコ、クリタケ、イグチ科ではヤマドリタケモドキ、ヒダナシタケ目に属するキノコとしては、アンズタケ科ではアンズタケ、サンゴハリタケ科ではヤマブシタケ、スエヒロタケ科ではスエヒロタケ、ミミナミハタケ科ではイタチナミハタケ、タコウキン科ではアミスギタケ、ツヤウチワタケ、スジウチワタケモドキ、ホウネンタケ、ヒイロタケ、ニッケイタケ、シハイタケ、シロカイメンタケ、クジラタケ、ホウロクタケ、マンネンタケ科ではマンネンタケ、サルノコシカケ科ではマイタケ、サルノコシカケなどがある。
【００１７】
＜飲食品の種類＞
また、キノコ由来成分を添加する飲食品は、パンでなくともよい。パン以外の飲食品としては、穀飯添加剤、菓子類、惣菜類、漬物類、発酵食品（ヨーグルト、納豆、ミソなど）、健康飲料、アルコール飲料、レトルト食品、麺類、水産加工品、肉加工品などがある。
【００１８】
＜含有量＞
また、以下の実施例においては、ハナビラタケ粉末を１ｇ又は２ｇ添加しパンを製造しているが、キノコ由来成分の添加量は、飲食品がキノコ由来成分の生理活性物質の活性を有する量であればよく、１、２若しくは５ｇ以上であってもよい。また、キノコ由来成分の添加量の上限としては、キノコ由来成分を添加して飲食品を製造する上でその妨げにならない量であればよく、３０、２０若しくは１０ｇ以下であってもよい。
【００１９】
また、以下の実施例においては、トレハロースを１５ｇ添加しパンを製造しているが、トレハロースの添加量は、飲食品がキノコ由来成分の生理活性物質の活性を有する量であればよく、５、１０若しくは１５ｇ以上であってもよい。また、トレハロースの添加量の上限としては、トレハロースを添加して飲食品を製造する上でその妨げにならない量であればよく、５０、４０、３０若しくは２０ｇ以下であってもよい。
【００２０】
また、添加するキノコ由来成分とトレハロースの比率は、飲食品がキノコ由来成分の生理活性物質の活性を有する比率であればよく、１：５０、２：１５、１：５、２：５、３：５、１：１若しくは６：１であってもよい。
【００２１】
＜作用効果＞
以下、本実施形態の作用効果について説明する。
キノコ由来成分及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例で示されているように、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇している。
ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例で示されているように、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇している。
ハナビラタケ由来成分及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例で示されているように、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇している。
また、キノコの乾燥粉末及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物は、キノコの乾燥粉末にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例で示されているように、キノコ由来成分の繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性が上昇しているだけでなく、キノコを乾燥することでタンパク質の安定化、ビタミンＤ量の増加、添加できる量の増加、安定的な長期保管などの作用が得られる。これに対し、生鮮キノコは多量の水分を有するため、酵素による有用成分の分解、栄養成分の不安定化、雑菌汚染、キノコ由来の生理活性成分としての実質的な添加量の制限などの問題が生じる可能性がある。
また、キノコは古くから食用又は薬用として用いられてきたものであり、トレハロースもまた食品添加剤として用いられてきたものであるので、キノコ由来成分及びトレハロースは食品添加剤として使用することが可能である。したがって、キノコ由来成分を、摂取する者の嗜好性に合わせた飲食品等への加工が可能であり、キノコの食感を改善し、摂取し続けることができる。
上記組成物及び食品添加剤を添加してパンを製造することが可能である。パンに添加することにより、以下の実施例で示されているように、飲み込みにくいと感じたりするようなキノコ由来成分を摂取する上での問題は改善された。
ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースを含む組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例に示されているように、キノコ由来成分の生理活性物質の活性が上昇している。
ハナビラタケ由来成分及びトレハロースを含む組成物は、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例に示されているように、ハナビラタケ由来成分の生理活性物質の活性が上昇している。
また、ヒダナシタケ目に属するキノコの乾燥粉末及びトレハロースを含む組成物は、キノコの乾燥粉末にトレハロースが加えられていることによって、以下の実施例で示されているように、キノコ由来成分の生理活性物質の活性が上昇しているだけでなく、キノコを乾燥することでタンパク質の安定化、ビタミンＤ量の増加、添加できる量の増加、安定的な長期保管などの作用が得られる。これに対し、生鮮キノコは多量の水分を有するため、酵素による有用成分の分解、栄養成分の不安定化、雑菌汚染、添加量の制限などの問題が生じる可能性がある。
また、キノコは古くから食用又は薬用として用いられてきたものであり、トレハロースもまた食品添加剤として用いられてきたものであるので、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースは食品添加剤として使用することが可能である。したがって、ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分を、摂取する者の嗜好性に合わせた飲食品等への加工が可能であり、キノコの食感を改善することができる。
上記組成物及び食品添加剤を添加してパンを製造することが可能である。パンに添加することにより、以下の実施例で示されているように、飲み込みにくいと感じたりするようなキノコ由来成分を摂取する上での問題は改善された。
上記組成物又は食品添加剤を添加して飲食品を製造することが可能であるので、以下の実施例に示されているように、キノコ由来成分の摂取をする者の嗜好性に合わせた飲食品等へ加工することができるため、キノコの食感を改善し、摂取し続けることができる。
また、キノコ由来成分にトレハロースが加えられていることによってキノコ由来成分の生理活性物質の活性が上昇するメカニズムは明らかとなっていないが、トレハロースが有する、親水性、乾燥保護作用、ミネラル結合作用、不飽和脂肪酸分解保護作用及びＳＯＤ様物質の保護作用のうちの１又は２以上の作用による可能性が考えられる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１ ヒト正常線維芽細胞増殖試験及びＰＩＰ（コラーゲン産生）試験
１．試験方法
評価に用いたハナビラタケ抽出液は、ハナビラタケ子実体乾燥物を室温にて６０分間抽出後、ろ過処理した水溶液と、１０５℃、６０分間抽出後、ろ過処理した熱水抽出液を用いた。細胞培養実験には、さらに０．２μｍフィルターによりろ過滅菌して用いた。
（１） 細胞培養
予備試験（data not shown）の結果を基に、培養２４時間におけるヒト正常線維芽細胞の増殖率を測定した。測定にはCellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（プロメガ株式会社製）を用いた。
（ｉ） ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）を前培養した。
（ｉｉ） 前培養し、静止期にある細胞をトリプシン処理して細胞浮遊液を作製、細胞数を計数した。
（ｉｉｉ） 本細胞を９６穴マイクロプレートに１×１０５細胞／ｗｅｌｌで播種した。
（ｉｖ） 無血清培地で１６時間培養した。
（ｖ） 培地を評価サンプル添加培地に交換した。
［１］ 対照（ネガティブコントロール、無添加、細胞あり）
［２］ １００μg／mlハナビラタケ子実体乾燥物の抽出液（１００Ｗ）
［３］ １０００μg／mlハナビラタケ子実体乾燥物の抽出液（１０００Ｗ）
［４］ １００μg／mlハナビラタケ子実体乾燥物の熱水抽出液（１００Ｈ）
［５］ １０００μg／mlハナビラタケ子実体乾燥物の熱水抽出液（１０００Ｈ）
（ｖｉ） 無血清培地で２４時間培養した。
（ｖｉｉ） 培地を回収後、細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（プロメガ株式会社製）を使用し、ＭＴＳ法にて、測定した。
（ｖｉｉｉ）回収した培地中のプロコラーゲン（ＰＩＰ）量は、ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて定量した。
【００２４】
（２）培養中に生産されたＩ型コラーゲン前躯体（ＰＩＰ）の定量
ヒト正常線維芽細胞が産生し、培地中に放出されたＩ型コラーゲン前躯体の定量は、ＥＬＩＳＡ法によって行った。測定キットは、プロコラーゲン タイプ・Ｉペプチド（ＰＩＰ）ＥＩＡキット（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
定量法は、メーカーの使用手順に従ったが、操作の概要は以下のとおりである。
（ｉ） 標識抗体溶液を１００μｌずつ抗体プレートの各ｗｅｌｌに加えた。
（ｉｉ） 所定濃度のＰＩＰ標準溶液および検体を２０μｌずつ各ｗｅｌｌに加えた。
（ｉｉｉ） ３７℃で２時間インキュベーションして反応させた。
（ｉｖ） 反応溶液を捨て、ＰＢＳで４回洗浄した。
（ｖ） 基質溶液（ＴＭＢＺ）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ加えた。
（ｖｉ） 室温（２０‐３０℃）で１５分間反応させた。
（ｖｉｉ） Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＮ硫酸）を１００μｌずつｗｅｌｌに加え混和し、呈色反応を停止させた。
（ｖｉｉｉ）波長４９２ｎｍで各呈色反応の吸光度を測定した。
（ｉｘ） 横軸にＰＩＰ標準溶液の濃度を、縦軸に対応する吸光度をプロットして、標準曲線を作成した。本標準曲線を基に、各検体の吸光度から対応するＰＩＰ濃度を推量した。
【００２５】
２．結果
（１）ハナビラタケ抽出液のヒト正常線維芽細胞増殖に対する作用
細胞培養期間を２４時間に設定して本期間における細胞増殖を調べ、培養２４時間後の細胞増殖の結果を図１に示した。評価サンプルは、水抽出及び熱水抽出液のどちらにおいても細胞増殖を促進した。特に、１００μｇ／ml濃度が最も増殖率が高かった。
また、光学顕微鏡により細胞の形態変化を観察したが、評価サンプル添加によって、特徴的な形態変化は見られなかった。
これらのことにより、評価サンプルの細胞毒性は無いものと考えられた。
（２）ハナビラタケ抽出液のヒト線維芽細胞のプロコラーゲン産生への作用
細胞培養期間を２４時間に設定して、本期間におけるプロコラーゲン産生へのハナビラタケ抽出液の作用を調べ、培養２４時間後のプロコラーゲン産生量を図２に示した。評価サンプルは、水抽出及び熱水抽出液のどちらにおいてもプロコラーゲン産生量を増加させた。また、評価サンプルのプロコラーゲン産生量は、濃度依存的に増加した。
本結果は、ハナビラタケ抽出液にプロコラーゲンを産生する作用があることを示唆した。
【００２６】
３．考察
今回の試験結果から、ハナビラタケ水抽出液および熱水抽出液の両者に、ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）の増殖を促進する作用があることが判明した。中でも熱水抽出液は、水抽出液よりも増殖を促進することが判明した。
またハナビラタケ水抽出液及び熱水抽出液ともに、ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）のプロコラーゲン産生量を促進する作用があることが判明した。プロコラーゲン産生は、濃度依存的であった。
細胞増殖率とプロコラーゲン産生量を比較した場合、増殖率は、低濃度の１００μｇ／mlが高かった。しかし、プロコラーゲン産生量は、高濃度の１０００μg／mlが多いという結果であった。
プロコラーゲンには、それが接する細胞に対して、増殖・分化シグナルを与えるという情報伝達の働きも担っていることがわかってきている。１００μg／mlでは、細胞増殖率が高かったのに対し、プロコラーゲン産生量は低かった。これらの関係は、産生されたプロコラーゲンにより刺激をうけ、細胞増殖が促進され、その後プロコラーゲンがコラーゲンとして利用されたためではないかと推測している。
以上のことから、ハナビラタケ抽出液には、線維芽細胞増殖作用及び、プロコラーゲン産生促進作用があることが示唆された。
【００２７】
実施例２ キノコ由来成分含有食品抽出液のヒト正常線維芽細胞増殖試験
１．試験方法
評価に用いたハナビラタケ由来成分及びトレハロースは、ハナビラタケ粉末及びトレハロースが添加されたパンから熱水で抽出することにより得られた。
ハナビラタケ子実体を４０−６０℃で熱風乾燥した乾燥物を破砕機で粉砕し、６０メッシュパスの粉体を得た。得られたハナビラタケ粉末及び／又はトレハロースを、小麦粉（強力粉）２８０ｇ、イースト６ｇ、食塩６ｇ、ショートニング１２ｇ、水２００ｇに添加し、一般的な方法でパンを製造した。添加するハナビラタケ粉末の量は、０ｇ、１ｇ又は２ｇとした。添加するトレハロースの量は、０ｇ又は１５ｇとした。いずれの添加量においても、パンの製造を妨げることはなく、食感も良好であった。
製造したパンから、２０倍量の蒸留水を用いて６０分間熱水抽出した。細胞培養実験には、さらに０．２μｍフィルターによりろ過滅菌して用いた。
【００２８】
（２） 細胞培養
予備試験（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）の結果を基に、培養２４時間におけるヒト正常線維芽細胞の増殖率を測定した。測定にはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（プロメガ株式会社製）を用いた。
（ｉ） ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）を前培養した。
（ｉｉ） 前培養し、静止期にある細胞をトリプシン処理して細胞浮遊液を作製、細胞数を形数した。
（ｉｉｉ） 本細胞を９６穴マイクロプレートに１×１０５細胞／ｗｅｌｌで播種した。
（ｉｖ） 無血清培地で１６時間培養した。
（ｖ） 培地を評価サンプル添加培地に交換した。
［１］ 無添加（Ｄ．Ｗ．）
［２］ ハナビラタケ及びトレハロース無添加のパンからの抽出液（パン）
［３］ ハナビラタケ１ｇ、トレハロース０ｇ添加したパンからの抽出液（Ｓｃｒ１ｇ）
［４］ ハナビラタケ２ｇ、トレハロース０ｇ添加したパンからの抽出液（Ｓｃｒ２ｇ）
［５］ ハナビラタケ０ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液（Ｔｒｅ１５ｇ）
［６］ ハナビラタケ１ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液（Ｓｃｒ１ｇ＋Ｔｒｅ１５ｇ）
［７］ ハナビラタケ２ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液（Ｓｃｒ２ｇ＋Ｔｒｅ１５ｇ）
（ｖｉ） 無血清培地で２４時間培養した。
（ｖｉｉ） 培地を回収後、細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（プロメガ株式会社製）を使用し、ＭＴＳ法にて、測定した。
【００２９】
２．結果
細胞培養期間を２４時間に設定して本期間における細胞増殖を調べ、培養２４時間後の細胞増殖の結果を図３に示した。無添加の区、ハナビラタケ及びトレハロース無添加のパンからの抽出液を添加した区ではヒト正常線維芽細胞増殖活性はみられなかった。ハナビラタケのみを添加したパンからの抽出液を添加した区及びトレハロースのみを添加したパンからの抽出液を添加した区においても、ヒト正常線維芽細胞増殖活性がみられなかったのに対し、ハナビラタケ２ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液を添加した区では増殖活性がみられた。特に、ハナビラタケ１ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液を添加した区と比べても、ハナビラタケ２ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液を添加した区では、ヒト正常線維芽細胞増殖活性が著しく上昇していた。
【００３０】
３．考察
今回の試験結果から、ハナビラタケ及びトレハロースを添加して製造したパンには、ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）の増殖を促進する活性があることが判明した。
これに対し、ハナビラタケのみ、又はトレハロースのみを添加して製造したパンからの抽出液にはヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）の増殖活性がみられなかった。その要因として、ハナビラタケ由来成分は、飲食品に添加されることによりその生理活性物質の活性が低下したと考えられる。また、パンの製造工程には１８０〜３５０℃で加熱する工程が含まれるため、生理活性物質の活性が低下したと考えられる。一方、ハナビラタケ２ｇ、トレハロース１５ｇ添加したパンからの抽出液を添加した区においてヒト正常線維芽細胞増殖活性が著しく上昇していたのは、トレハロースが有する親水性、乾燥保護作用、ミネラル結合作用、不飽和脂肪酸分解保護作用及びＳＯＤ様物質の保護作用のうちの１又は２以上の作用による可能性が考えられる。
以上のことから、ハナビラタケ及びトレハロースを添加することによって、線維芽細胞増殖活性が相乗的に上昇することが示された。
本発明により、キノコ由来成分にトレハロースを加えることによって、キノコ由来成分をその生理活性を失うことなく飲食品に添加する技術が提供された。
【００３１】
供試細胞「ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）について」
供試細胞は、独立行政法人 理化学研究所より譲渡されたヒト正常線維芽細胞を使用した。このＮＢＩＲＧＢ株は、独立行政法人 理化学研究所で新たに培養化された人新生児皮膚線維芽細胞である。
線維芽細胞には、真皮成分（コラーゲン・エラスチン・ヒアルロン酸）を産生する働きやコラーゲンを束ねて真皮の構造を作る働きがある。そこで、化粧品原料の有用性を試験する目的でしばしば、増殖作用試験及びプロコラーゲン産生試験に用いられている細胞である。
培養条件は以下に示したとおりである。
培地：ＭＥＭ ＡＬＰＨＡ ＋１０％ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）
培養温度：３７℃
ＣＯ２濃度（％）：５％
【００３２】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。例えば、パンに添加するハナビラタケの量は、２ｇを超えてもよい。ハナビラタケを７ｇ添加しても、パンを製造することは可能であり、パンの食感も良好であったことが確認されている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒト正常線維芽細胞増殖試験の結果を示したグラフである。
【図２】ヒト正常線維芽細胞ＰＩＰ（コラーゲン産生）試験の結果を示したグラフである。
【図３】キノコ由来成分含有食品抽出物のヒト正常線維芽細胞増殖試験の結果を示したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キノコ由来成分及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物。
【請求項２】
前記キノコがヒダナシタケ目に属するキノコである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記キノコがハナビラタケである、請求項２の組成物。
【請求項４】
前記キノコ由来成分がキノコの乾燥粉末である、請求項１から３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１から４の何れか１項に記載の組成物を含む食品添加剤。
【請求項６】
パン用である、請求項５に記載の食品添加剤。
【請求項７】
ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースを含む組成物。
【請求項８】
前記キノコがハナビラタケである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記キノコ由来成分がキノコの乾燥粉末である、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項７から９の何れか１項に記載の組成物を含む食品添加剤。
【請求項１１】
パン用である、請求項１０に記載の食品添加剤。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れか１項に記載の組成物又は食品添加剤を含む飲食品。
【請求項１３】
前記飲食品がパンである、請求項１２に記載の飲食品。
【請求項１】
キノコ由来成分及びトレハロースを含む、繊維芽細胞増殖活性及び／又は繊維芽細胞のコラーゲン産生促進活性を有する組成物。
【請求項２】
前記キノコがヒダナシタケ目に属するキノコである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記キノコがハナビラタケである、請求項２の組成物。
【請求項４】
前記キノコ由来成分がキノコの乾燥粉末である、請求項１から３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１から４の何れか１項に記載の組成物を含む食品添加剤。
【請求項６】
パン用である、請求項５に記載の食品添加剤。
【請求項７】
ヒダナシタケ目に属するキノコ由来成分及びトレハロースを含む組成物。
【請求項８】
前記キノコがハナビラタケである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記キノコ由来成分がキノコの乾燥粉末である、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項７から９の何れか１項に記載の組成物を含む食品添加剤。
【請求項１１】
パン用である、請求項１０に記載の食品添加剤。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れか１項に記載の組成物又は食品添加剤を含む飲食品。
【請求項１３】
前記飲食品がパンである、請求項１２に記載の飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−１１５１３５（Ｐ２００８−１１５１３５Ａ）
【公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０２０８７（Ｐ２００６−３０２０８７）
【出願日】平成１８年１１月７日（２００６．１１．７）
【出願人】（５０３３９７４２１）有限会社月夜野きのこ園 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月７日（２００６．１１．７）
【出願人】（５０３３９７４２１）有限会社月夜野きのこ園 (2)
【Ｆターム（参考）】
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