キャピラリープレートを用いた試料注入方法
【課題】
試料の乾燥を抑えることによって微量の試料でも注入できるようにする。
【解決手段】
各分離流路１２の一端（カソード端）は、基板表面に開口したそれぞれのサンプルリザーバである小容量リザーバ１４ａに接続され、基板表面には全ての小容量リザーバ１４ａを含む大きさの大容量リザーバ１６ａが壁８で囲まれて形成されている。各分離流路１２の他端（アノード端）は基板表面に形成された共通のリザーバ１６ｂに接続されるように開口している。小容量リザーバを満たすように大容量リザーバに第１の液体を入れ、第１の液体よりも比重の重い第２の液体に溶解した試料を第１の液体を通過してそれぞれのキャピラリー流路の小容量リザーバ１４ａに注入する。
試料の乾燥を抑えることによって微量の試料でも注入できるようにする。
【解決手段】
各分離流路１２の一端（カソード端）は、基板表面に開口したそれぞれのサンプルリザーバである小容量リザーバ１４ａに接続され、基板表面には全ての小容量リザーバ１４ａを含む大きさの大容量リザーバ１６ａが壁８で囲まれて形成されている。各分離流路１２の他端（アノード端）は基板表面に形成された共通のリザーバ１６ｂに接続されるように開口している。小容量リザーバを満たすように大容量リザーバに第１の液体を入れ、第１の液体よりも比重の重い第２の液体に溶解した試料を第１の液体を通過してそれぞれのキャピラリー流路の小容量リザーバ１４ａに注入する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生化学、分子生物学、臨床などの分野において、極微量のタンパク質や核酸、薬物などを分析する方法に関し、特に複数のキャピラリー流路を備えたキャピラリープレートのそれぞれのキャピラリー流路で試料成分の分離を行なうために各キャピラリー流路に試料を注入する方法に関するものである。
そのようなキャピラリープレートは、キャピラリー電気泳動や液体クロマトグラフィーに用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
極微量のタンパク質や核酸などを分析する場合には、従来から電気泳動装置が用いられている。その代表的なものとしてキャピラリーチューブを用いたキャピラリー電気泳動装置がある。しかし、キャピラリーチューブを用いた装置は、その取扱いが煩雑である。そこで、取扱いを容易にするとともに、分析の高速化と装置の小型化を目的として、基板内部に複数のキャピラリー流路を形成したキャピラリープレートが提案され、使用されている（特許文献１，２参照。）。
【０００３】
キャピラリープレートはキャピラリー流路が電気泳動用の分離流路又は液体クロマトグラフィー用のカラムとなり、両端部が基板表面に開口している。一端側の開口は試料注入用のサンプルリザーバとなっており、分析に先立ちサンプルリザーバに試料が注入される。
キャピラリー電気泳動や液体クロマトグラフィーにおける試料注入の際には、まずサンプルリザーバを洗浄し、残液を全て除去した後に試料を注入し、その後サンプルリザーバからキャピラリー流路内に試料を導入して分離を行なう。
【特許文献１】特開２００２−３１０９９０号公報
【特許文献２】特開２００３−１６６９７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
キャピラリー電気泳動や液体クロマトグラフィーにおいては、その分離性能の向上のためにキャピラリー部やカラム部が高温状態となっている場合が多い。その環境にてサンプルリザーバに微量な試料を注入した場合、試料が短時間の間に乾燥してしまう問題がある。
また、そのために、試料の量を低減することができないという問題もある。
本発明は、試料の乾燥を抑えることによって微量の試料でも注入できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、複数のキャピラリー流路を備えたキャピラリープレートのそれぞれのキャピラリー流路で試料成分の分離を行なうために各キャピラリー流路に試料を注入する方法であって、キャピラリープレートの少なくとも試料注入側に複数のキャピラリー流路の試料注入部を含む容量の大容量リザーバを設け、その大容量リザーバの底部にそれぞれのキャピラリー流路の試料注入部ごとの小容量リザーバを設け、試料注入に先立ち、小容量リザーバを満たすように大容量リザーバに第１の液体を入れ、第１の液体よりも比重の重い第２の液体に溶解した試料を第１の液体を通過してそれぞれのキャピラリーの小容量リザーバに注入する。
これにより、試料は第２の液体に溶解された状態で第１の液体の底に沈むように小容量リザーバに入っていく。そして、小容量リザーバでは試料は第１の液体によって空気と断絶され、乾燥を防ぐことができる。
【０００６】
試料を溶解する第２の液体としては、粘性が低く、揮発しにくい液体が好ましい。第１の液体として水又はそれに近い比重の液体を使用する場合、第２の液体としては、水を基本として構成され、多価アルコール、糖類及びその他の親水性高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも一つを含むことができる。これらの化合物は、水に易溶であり化学的に安定性も高い。試料が核酸やタンパク質などの生体高分子であって、キャピラリー流路において電気泳動による分離を行なう場合は、これらの化合物は、試料を分析に適した状態に保つことができる。
【０００７】
多価アルコールとしては、２価アルコール、３価アルコール、例えば、エチレングリコール、グリセロール、ペンタエリスリトール、プロピレングリコール及びマンニトールなどが挙げられる。糖類としては、単糖類とこれが複数個縮合した少糖類、多糖類を含み、具体的にはグルコース、スクロース、デキストラン等が挙げられる。第２の液体に多価アルコールを含む場合、溶液中に好ましくは、５〜８０（ｗ／ｖ）％、更に好ましくは２０〜６０（ｗ／ｖ）％含む。第２の液体に糖類を含む場合は、溶液中に、好ましくは、５〜８０（ｗ／ｖ）％、更に好ましくは２０〜６０（ｗ／ｖ）％含む。
【０００８】
本発明におけるキャピラリープレートは、基板に複数のキャピラリー流路を備えたものであればよい。キャピラリー流路の一例は、一方の基板の表面に微細な溝を形成し、その表面に他の基板を重ねて接合することにより形成されたものである。キャピラリー流路の他の例は、キャピラリーチューブであり、その場合のキャピラリープレートは基板にキャピラリーチューブを配列して基板と一体化したものである。
【０００９】
小容量リザーバは大容量リザーバより径の小さい窪みとして形成することができる。
また、大容量リザーバの底面にそれぞれのキャピラリー流路の先端が開口し、大容量リザーバの底面は前記開口の周辺部のみが親水性、それ以外が疎水性となるように表面処理が施されていることにより、前記開口とその周辺部の親水性部分により小容量リザーバを形成することもできる。
【発明の効果】
【００１０】
従来のキャピラリー電気泳動や液体クロマトグラフィーにおいては、試料を分離機構に注入する際に乾燥させないためにある程度の液量が必要であった。そこで、本発明では、大容量リザーバに液体を入れ、その液体を通過して、その液体よりも比重の重い液体に溶解した試料をそれぞれのキャピラリー流路の小容量リザーバに注入するようにしたので、試料は大容量リザーバの液体によって空気と断絶されるので、高温環境で試料の蒸発の危険を伴なわない安定した試料の滴下と注入を行なうことができ、乾燥を防ぐことができる。そして、試料の乾燥を防止することにより、試料の量を低減することができる。
【００１１】
小容量リザーバがサンプルリザーバとなるので、試料が微量でも安定して試料を注入できる。
また、大容量リザーバ内部に複数のキャピラリー流路の小容量リザーバを備えるので、キャピラリー流路へのゲルの充填や洗浄、小容量リザーバへの試料の滴下、及びキャピラリー流路での電気泳動といった工程を複数のキャピラリー流路について同時に行なうのが可能であり、作業性の向上と時間短縮を行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を参照して本発明をＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System：微小電気的・機械的システム）キャピラリープレートを電気泳動部材として用いた実施例を詳細に説明する。
図１において、（Ａ）はキャピラリープレートからなる電気泳動部材におけるキャピラリー流路の平面図、（Ｂ）はカソード端におけるサンプルリザーバ（小容量リザーバ）部分の拡大平面図、（Ｃ）はカソード端部の斜視図、（Ｄ）はカソード端の断面図である。
【００１３】
電気泳動部材は一対の板材１０ａ，１０ｂが接合されたものである。一方の板材１０ａにはキャピラリー流路からなる分離流路１２が複数本、例えば３８４本形成されており、互いに交差しないように配列されている。
各分離流路１２の一端（カソード端）は基板表面に開口したそれぞれのサンプルリザーバである小容量リザーバ１４ａに接続され、基板表面には全ての小容量リザーバ１４ａを含む大きさの大容量リザーバ１６ａが壁８で囲まれて形成されている。各分離流路１２の他端（アノード端）は基板表面に形成された共通のリザーバ１６ｂに接続されるように開口している。
【００１４】
分離流路１２の幅は１０〜１０００μｍ、好ましくは５０〜１３０μｍであり、深さは１０〜１０００μｍ、好ましくは２０〜６０μｍである。他方の板材１０ｂには分離流路１２の両端に対応する位置に貫通穴が形成されている。一端側の貫通穴は小容量リザーバ１４ａであり、小容量リザーバ１４ａのサイズは直径が１０μｍ〜３ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜２ｍｍであり、数１０ｎＬ〜数μＬの試料を注入するのに適した大きさに設定されている。両板材１０ａと１０ｂは、分離流路１２が内側になるように張り合わされて、一体の板材となっている。
【００１５】
板材１０ａへの分離流路１２の形成はリソグラフィーとエッチング（ウエットエッチング又はドライエッチング）により形成することができる。板材１０ｂへの貫通穴の形成はサンドブラストやレーザドリルなどの方法により形成することができる。
【００１６】
小容量リザーバ１４ａは大容量リザーバ１６ａによって領域全体を覆われており、その斜視図を示す（Ｃ）のように、全ての小容量リザーバ１４ａは大容量リザーバ１６ａ内に設けられ、リザーバ１６ａとつながっている。他端側のリザーバ１６ｂも全ての分離流路１２の他端側の開口が配置されている領域を覆っており、全ての分離流路１２の他端側の開口はリザーバ１６ｂとつながっている。
基板を構成する板材１０ａ，１０ｂの材質としては、石英ガラスやホウ珪酸系ガラス、樹脂などを用いることができ、泳動分離された成分を光学的に検出する場合には透明な材質を選択する。光以外の検出手段を使用する場合は、板材１０ａ，１０ｂの材質は透明なものに限定されるものではない。
【００１７】
小容量リザーバ１４ａの内壁を親水性、大容量リザーバ１６ａの底面又は底面から内壁面にかけて疎水性としてもよい。
【００１８】
そのような親水性と疎水性の表面処理としては、種々の方法を挙げることができる。例えば、板材としてガラス板を使用した場合には、酸で処理することにより親水性を持たせることができ、樹脂コーティング、フッ素樹脂加工、シランカップリング剤処理などにより疎水性を持たせることができる。
【００１９】
図２に他のキャピラリープレートにおけるカソード側の断面図を示す。小容量リザーバ１４ａは板材１０ａの表面側に凹部として形成され、その底部で分離流路１２とつながっている。複数の小容量リザーバ１４ａが大容量リザーバ１６ａに覆われて、大容量リザーバ１６ａの底面上に形成されている。
図３はさらに他のキャピラリープレートにおけるカソード側の断面図を示す。小容量リザーバ１４ａは分離流路１２と同程度の大きさの開口として形成されている。
【００２０】
これら図２又は図３に示されるキャピラリープレートにおいても、小容量リザーバ１４ａと、大容量リザーバ１６ａの底面のうち小容量リザーバ１４ａの開口部の狭い範囲の周辺部が親水性、その外側が疎水性となるように表面処理を施してもよい。これにより、注入された試料は親水性処理が施された部分に保持されることになり、その親水性領域が小容量リザーバとなる。その親水性領域の大きさは、保持される試料量が数１０ｎＬ〜数μＬとなるのに適した大きさに設定される。
【００２１】
次に図１のキャピラリープレートにおける試料注入動作を図４を参照して説明する。
（１）キャピラリープレートを５０℃の恒温状態に保つ。
（２）カソード側の大容量リザーバ１６ａに純水、例えば超純水のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を満たし、アノード側からシリンジで加圧して全ての分離流路１２にゲルを充填する。
（３）分離流路１２から小容量リザーバ１４ａに流出したゲルは、大容量リザーバ１６ａの純水中に拡散するので、リザーバ１４ａ，１６ａ内の水及びゲルを吸引ノズルによって吸引し、リザーバ１４ａ，１６ａ内を洗浄する。
【００２２】
（４）リザーバ１４ａ，１６ａ内の洗浄後、カソード側リザーバ１６ａとアノード側リザーバ１６ｂにバッファ溶液を満たし、両リザーバ１６ａ，１６ｂ間に電圧を印加してプレセパレーションを行ない、ゲル中の夾雑物イオンをアノード電極又はカソード電極に移動させる。印加電圧は、例えば１２５Ｖ／ｃｍで、印加時間は５分間である。
（５）カソード側リザーバ１６ａのバッファ溶液を吸引し、リザーバ１６ａ内を洗浄した後、リザーバ１６ａ内を純水、例えば超純水のＭｉｌｌｉ−Ｑ水で満たす。
（６）その後、純水で満たされたリザーバ１６ａの各小容量リザーバ１４ａに順次又は複数個を単位としてピペッター６によって試料９を滴下する。試料滴下は、ピペッター６の先端を小容量リザーバ１４ａの近くまで降下させて行なう。試料９は水よりも比重の大きいエチレングリコールなどの溶媒に溶解した状態で、容量として０．１〜数μＬ程度の微量試料が分注される。このときも、キャピラリープレートは５０℃の恒温状態が維持されている。
【００２３】
（７）各小容量リザーバ１４ａにカソード電極を挿入し、アノード電極との間に電圧を印加して流路１２への試料注入を行なう。試料注入のための印加電圧は、例えば５０Ｖ／ｃｍで、印加時間は４０秒間である。
（８）リザーバ１６ａの純水とともに小容量リザーバ１４ａ内の残った試料も吸引して洗浄した後、リザーバ１４ａ，１６ａ内をバッファ溶液で満たす。
【００２４】
（９）リザーバ１６ａにカソード電極を挿入し、アノード電極との間に泳動電圧を印加して試料の電気泳動分離と信号検出を行なう。泳動分離のための印加電圧は、７０〜３００Ｖ／ｃｍが適当であり、例えば１２５Ｖ／ｃｍである。
電極はリザーバ１６ａ，１６ｂにそれぞれ予め設けておいてもよく、別途挿入するようにしてもよい。また、試料注入側ではリザーバ１４ａごとに電極を設けておいてもよく、別途挿入するようにしてもよい。
【００２５】
測定条件は、次の通りである。
ＤＮＡ試料はサイクルシークエンシング用試薬キットBigDye v3.1（アプライドバイオシステムズ社製）により作成した。鋳型ＤＮＡは１２．５ｎｇ／μＬのｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ（東洋紡社製）及びプライマーは合成プライムを使用した。
その他条件はキット取り扱い説明に従い、エタノール沈殿処理を行なった後、乾燥固化した標品を得た。
【００２６】
上記乾燥標品は、５０％エチレングリコール、０．４ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．０４ｍＭのＥＤＴＡの各成分を含む試料調製液を用いて、乾燥標品対試料調製液が１：８になるように溶解させ、シークエンサーに供する試料液を調製した。各試料液は図１に示すキャピラリープレート上に形成されたサンプルリザーバ１４ａへピペッターで注入した。サンプルリザーバ１４ａ上面は水で満たされており、ピペッターの先端はサンプルリザーバ１４ａの開口から約０．５ｍｍ離れた真上から試料液を滴下した。
【００２７】
以上の条件で行なった電気泳動パターンの一例を図５に示す。
泳動パターンは検出部で泳動分離されたＤＮＡサンプルに励起光を照射し、その蛍光を検出したものであり、横軸は励起光で走査したときの走査番号を表し、時間に対応している。縦軸は蛍光強度である。グラフは４種類の塩基Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）及びＴ（チミン）に対応して４つの波形を含んでいる。
実施例による結果では、泳動分離された各ピークの蛍光検出の信号強度は大きく、かつ良好な分離状態を示していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明の試料注入方法は、生化学、分子生物学又は臨床などの分野において利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明が適用されるキャピラリープレートの一例を示す図であり、（Ａ）はキャピラリー流路の平面図、（Ｂ）はカソード端におけるサンプルリザーバ（小容量リザーバ）部分の拡大平面図、（Ｃ）はカソード端部の斜視図、（Ｄ）はカソード端の断面図である。
【図２】他のキャピラリープレートにおけるカソード側の端部の断面図である。
【図３】さらに他のキャピラリープレートにおけるカソード側の端部の断面図である。
【図４】水中での試料の滴下を示すカソード側の端部の断面図である
【図５】電気泳動分離の結果の一例を示す波形図である。
【符号の説明】
【００３０】
６ ピペッター
８ 壁
９ 試料
１０ａ、１０ｂ 板材
１２ 分離流路
１４ａ 小容量リザーバ
１６ａ 大容量リザーバ
【技術分野】
【０００１】
本発明は生化学、分子生物学、臨床などの分野において、極微量のタンパク質や核酸、薬物などを分析する方法に関し、特に複数のキャピラリー流路を備えたキャピラリープレートのそれぞれのキャピラリー流路で試料成分の分離を行なうために各キャピラリー流路に試料を注入する方法に関するものである。
そのようなキャピラリープレートは、キャピラリー電気泳動や液体クロマトグラフィーに用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
極微量のタンパク質や核酸などを分析する場合には、従来から電気泳動装置が用いられている。その代表的なものとしてキャピラリーチューブを用いたキャピラリー電気泳動装置がある。しかし、キャピラリーチューブを用いた装置は、その取扱いが煩雑である。そこで、取扱いを容易にするとともに、分析の高速化と装置の小型化を目的として、基板内部に複数のキャピラリー流路を形成したキャピラリープレートが提案され、使用されている（特許文献１，２参照。）。
【０００３】
キャピラリープレートはキャピラリー流路が電気泳動用の分離流路又は液体クロマトグラフィー用のカラムとなり、両端部が基板表面に開口している。一端側の開口は試料注入用のサンプルリザーバとなっており、分析に先立ちサンプルリザーバに試料が注入される。
キャピラリー電気泳動や液体クロマトグラフィーにおける試料注入の際には、まずサンプルリザーバを洗浄し、残液を全て除去した後に試料を注入し、その後サンプルリザーバからキャピラリー流路内に試料を導入して分離を行なう。
【特許文献１】特開２００２−３１０９９０号公報
【特許文献２】特開２００３−１６６９７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
キャピラリー電気泳動や液体クロマトグラフィーにおいては、その分離性能の向上のためにキャピラリー部やカラム部が高温状態となっている場合が多い。その環境にてサンプルリザーバに微量な試料を注入した場合、試料が短時間の間に乾燥してしまう問題がある。
また、そのために、試料の量を低減することができないという問題もある。
本発明は、試料の乾燥を抑えることによって微量の試料でも注入できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、複数のキャピラリー流路を備えたキャピラリープレートのそれぞれのキャピラリー流路で試料成分の分離を行なうために各キャピラリー流路に試料を注入する方法であって、キャピラリープレートの少なくとも試料注入側に複数のキャピラリー流路の試料注入部を含む容量の大容量リザーバを設け、その大容量リザーバの底部にそれぞれのキャピラリー流路の試料注入部ごとの小容量リザーバを設け、試料注入に先立ち、小容量リザーバを満たすように大容量リザーバに第１の液体を入れ、第１の液体よりも比重の重い第２の液体に溶解した試料を第１の液体を通過してそれぞれのキャピラリーの小容量リザーバに注入する。
これにより、試料は第２の液体に溶解された状態で第１の液体の底に沈むように小容量リザーバに入っていく。そして、小容量リザーバでは試料は第１の液体によって空気と断絶され、乾燥を防ぐことができる。
【０００６】
試料を溶解する第２の液体としては、粘性が低く、揮発しにくい液体が好ましい。第１の液体として水又はそれに近い比重の液体を使用する場合、第２の液体としては、水を基本として構成され、多価アルコール、糖類及びその他の親水性高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも一つを含むことができる。これらの化合物は、水に易溶であり化学的に安定性も高い。試料が核酸やタンパク質などの生体高分子であって、キャピラリー流路において電気泳動による分離を行なう場合は、これらの化合物は、試料を分析に適した状態に保つことができる。
【０００７】
多価アルコールとしては、２価アルコール、３価アルコール、例えば、エチレングリコール、グリセロール、ペンタエリスリトール、プロピレングリコール及びマンニトールなどが挙げられる。糖類としては、単糖類とこれが複数個縮合した少糖類、多糖類を含み、具体的にはグルコース、スクロース、デキストラン等が挙げられる。第２の液体に多価アルコールを含む場合、溶液中に好ましくは、５〜８０（ｗ／ｖ）％、更に好ましくは２０〜６０（ｗ／ｖ）％含む。第２の液体に糖類を含む場合は、溶液中に、好ましくは、５〜８０（ｗ／ｖ）％、更に好ましくは２０〜６０（ｗ／ｖ）％含む。
【０００８】
本発明におけるキャピラリープレートは、基板に複数のキャピラリー流路を備えたものであればよい。キャピラリー流路の一例は、一方の基板の表面に微細な溝を形成し、その表面に他の基板を重ねて接合することにより形成されたものである。キャピラリー流路の他の例は、キャピラリーチューブであり、その場合のキャピラリープレートは基板にキャピラリーチューブを配列して基板と一体化したものである。
【０００９】
小容量リザーバは大容量リザーバより径の小さい窪みとして形成することができる。
また、大容量リザーバの底面にそれぞれのキャピラリー流路の先端が開口し、大容量リザーバの底面は前記開口の周辺部のみが親水性、それ以外が疎水性となるように表面処理が施されていることにより、前記開口とその周辺部の親水性部分により小容量リザーバを形成することもできる。
【発明の効果】
【００１０】
従来のキャピラリー電気泳動や液体クロマトグラフィーにおいては、試料を分離機構に注入する際に乾燥させないためにある程度の液量が必要であった。そこで、本発明では、大容量リザーバに液体を入れ、その液体を通過して、その液体よりも比重の重い液体に溶解した試料をそれぞれのキャピラリー流路の小容量リザーバに注入するようにしたので、試料は大容量リザーバの液体によって空気と断絶されるので、高温環境で試料の蒸発の危険を伴なわない安定した試料の滴下と注入を行なうことができ、乾燥を防ぐことができる。そして、試料の乾燥を防止することにより、試料の量を低減することができる。
【００１１】
小容量リザーバがサンプルリザーバとなるので、試料が微量でも安定して試料を注入できる。
また、大容量リザーバ内部に複数のキャピラリー流路の小容量リザーバを備えるので、キャピラリー流路へのゲルの充填や洗浄、小容量リザーバへの試料の滴下、及びキャピラリー流路での電気泳動といった工程を複数のキャピラリー流路について同時に行なうのが可能であり、作業性の向上と時間短縮を行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を参照して本発明をＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System：微小電気的・機械的システム）キャピラリープレートを電気泳動部材として用いた実施例を詳細に説明する。
図１において、（Ａ）はキャピラリープレートからなる電気泳動部材におけるキャピラリー流路の平面図、（Ｂ）はカソード端におけるサンプルリザーバ（小容量リザーバ）部分の拡大平面図、（Ｃ）はカソード端部の斜視図、（Ｄ）はカソード端の断面図である。
【００１３】
電気泳動部材は一対の板材１０ａ，１０ｂが接合されたものである。一方の板材１０ａにはキャピラリー流路からなる分離流路１２が複数本、例えば３８４本形成されており、互いに交差しないように配列されている。
各分離流路１２の一端（カソード端）は基板表面に開口したそれぞれのサンプルリザーバである小容量リザーバ１４ａに接続され、基板表面には全ての小容量リザーバ１４ａを含む大きさの大容量リザーバ１６ａが壁８で囲まれて形成されている。各分離流路１２の他端（アノード端）は基板表面に形成された共通のリザーバ１６ｂに接続されるように開口している。
【００１４】
分離流路１２の幅は１０〜１０００μｍ、好ましくは５０〜１３０μｍであり、深さは１０〜１０００μｍ、好ましくは２０〜６０μｍである。他方の板材１０ｂには分離流路１２の両端に対応する位置に貫通穴が形成されている。一端側の貫通穴は小容量リザーバ１４ａであり、小容量リザーバ１４ａのサイズは直径が１０μｍ〜３ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜２ｍｍであり、数１０ｎＬ〜数μＬの試料を注入するのに適した大きさに設定されている。両板材１０ａと１０ｂは、分離流路１２が内側になるように張り合わされて、一体の板材となっている。
【００１５】
板材１０ａへの分離流路１２の形成はリソグラフィーとエッチング（ウエットエッチング又はドライエッチング）により形成することができる。板材１０ｂへの貫通穴の形成はサンドブラストやレーザドリルなどの方法により形成することができる。
【００１６】
小容量リザーバ１４ａは大容量リザーバ１６ａによって領域全体を覆われており、その斜視図を示す（Ｃ）のように、全ての小容量リザーバ１４ａは大容量リザーバ１６ａ内に設けられ、リザーバ１６ａとつながっている。他端側のリザーバ１６ｂも全ての分離流路１２の他端側の開口が配置されている領域を覆っており、全ての分離流路１２の他端側の開口はリザーバ１６ｂとつながっている。
基板を構成する板材１０ａ，１０ｂの材質としては、石英ガラスやホウ珪酸系ガラス、樹脂などを用いることができ、泳動分離された成分を光学的に検出する場合には透明な材質を選択する。光以外の検出手段を使用する場合は、板材１０ａ，１０ｂの材質は透明なものに限定されるものではない。
【００１７】
小容量リザーバ１４ａの内壁を親水性、大容量リザーバ１６ａの底面又は底面から内壁面にかけて疎水性としてもよい。
【００１８】
そのような親水性と疎水性の表面処理としては、種々の方法を挙げることができる。例えば、板材としてガラス板を使用した場合には、酸で処理することにより親水性を持たせることができ、樹脂コーティング、フッ素樹脂加工、シランカップリング剤処理などにより疎水性を持たせることができる。
【００１９】
図２に他のキャピラリープレートにおけるカソード側の断面図を示す。小容量リザーバ１４ａは板材１０ａの表面側に凹部として形成され、その底部で分離流路１２とつながっている。複数の小容量リザーバ１４ａが大容量リザーバ１６ａに覆われて、大容量リザーバ１６ａの底面上に形成されている。
図３はさらに他のキャピラリープレートにおけるカソード側の断面図を示す。小容量リザーバ１４ａは分離流路１２と同程度の大きさの開口として形成されている。
【００２０】
これら図２又は図３に示されるキャピラリープレートにおいても、小容量リザーバ１４ａと、大容量リザーバ１６ａの底面のうち小容量リザーバ１４ａの開口部の狭い範囲の周辺部が親水性、その外側が疎水性となるように表面処理を施してもよい。これにより、注入された試料は親水性処理が施された部分に保持されることになり、その親水性領域が小容量リザーバとなる。その親水性領域の大きさは、保持される試料量が数１０ｎＬ〜数μＬとなるのに適した大きさに設定される。
【００２１】
次に図１のキャピラリープレートにおける試料注入動作を図４を参照して説明する。
（１）キャピラリープレートを５０℃の恒温状態に保つ。
（２）カソード側の大容量リザーバ１６ａに純水、例えば超純水のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を満たし、アノード側からシリンジで加圧して全ての分離流路１２にゲルを充填する。
（３）分離流路１２から小容量リザーバ１４ａに流出したゲルは、大容量リザーバ１６ａの純水中に拡散するので、リザーバ１４ａ，１６ａ内の水及びゲルを吸引ノズルによって吸引し、リザーバ１４ａ，１６ａ内を洗浄する。
【００２２】
（４）リザーバ１４ａ，１６ａ内の洗浄後、カソード側リザーバ１６ａとアノード側リザーバ１６ｂにバッファ溶液を満たし、両リザーバ１６ａ，１６ｂ間に電圧を印加してプレセパレーションを行ない、ゲル中の夾雑物イオンをアノード電極又はカソード電極に移動させる。印加電圧は、例えば１２５Ｖ／ｃｍで、印加時間は５分間である。
（５）カソード側リザーバ１６ａのバッファ溶液を吸引し、リザーバ１６ａ内を洗浄した後、リザーバ１６ａ内を純水、例えば超純水のＭｉｌｌｉ−Ｑ水で満たす。
（６）その後、純水で満たされたリザーバ１６ａの各小容量リザーバ１４ａに順次又は複数個を単位としてピペッター６によって試料９を滴下する。試料滴下は、ピペッター６の先端を小容量リザーバ１４ａの近くまで降下させて行なう。試料９は水よりも比重の大きいエチレングリコールなどの溶媒に溶解した状態で、容量として０．１〜数μＬ程度の微量試料が分注される。このときも、キャピラリープレートは５０℃の恒温状態が維持されている。
【００２３】
（７）各小容量リザーバ１４ａにカソード電極を挿入し、アノード電極との間に電圧を印加して流路１２への試料注入を行なう。試料注入のための印加電圧は、例えば５０Ｖ／ｃｍで、印加時間は４０秒間である。
（８）リザーバ１６ａの純水とともに小容量リザーバ１４ａ内の残った試料も吸引して洗浄した後、リザーバ１４ａ，１６ａ内をバッファ溶液で満たす。
【００２４】
（９）リザーバ１６ａにカソード電極を挿入し、アノード電極との間に泳動電圧を印加して試料の電気泳動分離と信号検出を行なう。泳動分離のための印加電圧は、７０〜３００Ｖ／ｃｍが適当であり、例えば１２５Ｖ／ｃｍである。
電極はリザーバ１６ａ，１６ｂにそれぞれ予め設けておいてもよく、別途挿入するようにしてもよい。また、試料注入側ではリザーバ１４ａごとに電極を設けておいてもよく、別途挿入するようにしてもよい。
【００２５】
測定条件は、次の通りである。
ＤＮＡ試料はサイクルシークエンシング用試薬キットBigDye v3.1（アプライドバイオシステムズ社製）により作成した。鋳型ＤＮＡは１２．５ｎｇ／μＬのｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ（東洋紡社製）及びプライマーは合成プライムを使用した。
その他条件はキット取り扱い説明に従い、エタノール沈殿処理を行なった後、乾燥固化した標品を得た。
【００２６】
上記乾燥標品は、５０％エチレングリコール、０．４ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．０４ｍＭのＥＤＴＡの各成分を含む試料調製液を用いて、乾燥標品対試料調製液が１：８になるように溶解させ、シークエンサーに供する試料液を調製した。各試料液は図１に示すキャピラリープレート上に形成されたサンプルリザーバ１４ａへピペッターで注入した。サンプルリザーバ１４ａ上面は水で満たされており、ピペッターの先端はサンプルリザーバ１４ａの開口から約０．５ｍｍ離れた真上から試料液を滴下した。
【００２７】
以上の条件で行なった電気泳動パターンの一例を図５に示す。
泳動パターンは検出部で泳動分離されたＤＮＡサンプルに励起光を照射し、その蛍光を検出したものであり、横軸は励起光で走査したときの走査番号を表し、時間に対応している。縦軸は蛍光強度である。グラフは４種類の塩基Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）及びＴ（チミン）に対応して４つの波形を含んでいる。
実施例による結果では、泳動分離された各ピークの蛍光検出の信号強度は大きく、かつ良好な分離状態を示していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明の試料注入方法は、生化学、分子生物学又は臨床などの分野において利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明が適用されるキャピラリープレートの一例を示す図であり、（Ａ）はキャピラリー流路の平面図、（Ｂ）はカソード端におけるサンプルリザーバ（小容量リザーバ）部分の拡大平面図、（Ｃ）はカソード端部の斜視図、（Ｄ）はカソード端の断面図である。
【図２】他のキャピラリープレートにおけるカソード側の端部の断面図である。
【図３】さらに他のキャピラリープレートにおけるカソード側の端部の断面図である。
【図４】水中での試料の滴下を示すカソード側の端部の断面図である
【図５】電気泳動分離の結果の一例を示す波形図である。
【符号の説明】
【００３０】
６ ピペッター
８ 壁
９ 試料
１０ａ、１０ｂ 板材
１２ 分離流路
１４ａ 小容量リザーバ
１６ａ 大容量リザーバ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のキャピラリー流路を備えたキャピラリープレートのそれぞれのキャピラリー流路で試料成分の分離を行なうために各キャピラリー流路に試料を注入する方法において、
キャピラリープレートの少なくとも試料注入側に複数のキャピラリー流路の試料注入部を含む容量の大容量リザーバを設け、その大容量リザーバの底部にそれぞれのキャピラリー流路の試料注入部ごとの小容量リザーバを設け、
試料注入に先立ち、小容量リザーバを満たすように大容量リザーバに第１の液体を入れ、
第１の液体よりも比重の重い第２の液体に溶解した試料を第１の液体を通過してそれぞれのキャピラリー流路の小容量リザーバに注入することを特徴とする試料注入方法。
【請求項２】
小容量リザーバは大容量リザーバより径の小さい窪みとして形成されている請求項１に記載の試料注入方法。
【請求項３】
大容量リザーバの底面にそれぞれのキャピラリー流路の先端が開口し、大容量リザーバの底面は前記開口の周辺部のみが親水性、それ以外が疎水性となるように表面処理が施されていることにより、前記開口とその周辺部の親水性部分により小容量リザーバが形成されている請求項１に記載の試料注入方法。
【請求項１】
複数のキャピラリー流路を備えたキャピラリープレートのそれぞれのキャピラリー流路で試料成分の分離を行なうために各キャピラリー流路に試料を注入する方法において、
キャピラリープレートの少なくとも試料注入側に複数のキャピラリー流路の試料注入部を含む容量の大容量リザーバを設け、その大容量リザーバの底部にそれぞれのキャピラリー流路の試料注入部ごとの小容量リザーバを設け、
試料注入に先立ち、小容量リザーバを満たすように大容量リザーバに第１の液体を入れ、
第１の液体よりも比重の重い第２の液体に溶解した試料を第１の液体を通過してそれぞれのキャピラリー流路の小容量リザーバに注入することを特徴とする試料注入方法。
【請求項２】
小容量リザーバは大容量リザーバより径の小さい窪みとして形成されている請求項１に記載の試料注入方法。
【請求項３】
大容量リザーバの底面にそれぞれのキャピラリー流路の先端が開口し、大容量リザーバの底面は前記開口の周辺部のみが親水性、それ以外が疎水性となるように表面処理が施されていることにより、前記開口とその周辺部の親水性部分により小容量リザーバが形成されている請求項１に記載の試料注入方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２５０６２１（Ｐ２００６−２５０６２１Ａ）
【公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−６５５２７（Ｐ２００５−６５５２７）
【出願日】平成１７年３月９日（２００５．３．９）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月９日（２００５．３．９）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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