グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチド
本発明は、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明は、また、ポリペプチドを含んでなる核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞ならびにポリペプチドを製造する方法および使用する方法に関する。本発明は、また、本発明のグルコアミラーゼを含んでなる組成物ならびにデンプン転化法、醸造法、例えば、発酵生成物またはシロップを製造する方法におけるこのような組成物の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a) 配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1) 配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c) 配列番号2のアミノ酸1〜556の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号37のアミノ酸1〜561の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【請求項２】
下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a) 配列番号5の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜575のアミノ酸に対して少なくとも70% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1) 配列番号40の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜565のアミノ酸に対して少なくとも70% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号4のヌクレオチド55〜2189とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号6のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c) 配列番号5のアミノ酸1〜575の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号40のアミノ酸1〜565の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【請求項３】
下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a) 配列番号26の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1) 配列番号24の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜548のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a2) 配列番号43の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜523のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも低いストリンジェンシイ条件下に配列番号25のヌクレオチド55〜1719中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c) 配列番号26のアミノ酸1〜556の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号24のアミノ酸1〜548の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号43のアミノ酸1〜523の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【請求項４】
それぞれ配列番号2または37の成熟部分、またはグルコアミラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５】
それぞれ配列番号5または40、またはグルコアミラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号24、26または43、またはグルコアミラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型である、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドが配列番号5のアミノ酸1〜575または配列番号40のアミノ酸1〜565の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型である、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが配列番号26のアミノ酸1〜556または配列番号24のアミノ酸1〜548の1または2以上のアミノ酸または配列番号43のアミノ酸1〜523の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型である、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号2中のアミノ酸1〜455または配列番号37のアミノ酸1〜561の触媒領域を含んでなる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号5中のアミノ酸1〜475または配列番号40のアミノ酸1〜561に位置する触媒領域を含んでなる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号26中のアミノ酸1〜451または配列番号24のアミノ酸1〜455または配列番号43のアミノ酸1〜418に位置する触媒領域を含んでなる、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に位置する結合性ドメインを含んでなる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に位置する結合性ドメインを含んでなる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号26のアミノ酸463〜556または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に位置する結合性ドメインを含んでなる、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
大腸菌 (E. coli) DSM 17106中に収容されているプラスミドpHUda595中に含有されるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
大腸菌 (E. coli) DSM 17105中に収容されているプラスミドpHUda594中に含有されるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
下記から成る群から選択される、炭水化物結合性アフィニティーを有するポリペプチド:
(a) i) それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
ii) それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
iii) それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
(b) 低いストリンジェンシイの条件下に下記から成る群から選択されるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド:
(i) それぞれ配列番号3のヌクレオチド1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖;
(ii) それぞれ配列番号6のヌクレオチド1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749の相補鎖;
(iii) それぞれ配列番号25のヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1399〜1620の相補鎖;
(c) 炭水化物結合性アフィニティーを有する (a) または (b) のフラグメント。
【請求項１９】
炭水化物結合性アフィニティーがデンプン結合性アフィニティーである、請求項18に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して少なくとも60%の同一性、それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して好ましくは少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、またはより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項18または19に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561を含んでなる、請求項17に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して少なくとも60% の同一性、それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して好ましくは少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、またはより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項18または19に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565を含んでなる、請求項22に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して少なくとも60% の同一性、それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して好ましくは少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、またはより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項18または19に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523を含んでなる、請求項24に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
ポリペプチドが、それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561またはそれぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565またはそれぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に比較してアミノ酸の少なくとも1つの置換、欠失および/または挿入を有するアミノ酸を含んでなる人工変異型である、請求項18〜25のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２７】
ポリペプチドが、それぞれ配列番号3中の位置1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737; またはそれぞれ配列番号6の位置1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749; またはそれぞれ配列番号25中の位置1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1339〜1620に示すポリヌクレオチド配列の炭水化物結合性ドメインエンコーディング部分によりコードされるアミノ酸配列に比較して、アミノ酸の少なくとも1つの置換、欠失および/または挿入を有するアミノ酸配列を含んでなる人工変異型である、請求項18〜26のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２８】
低いストリンジェンシイの条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、下記から成る群から選択されるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる、請求項18〜27のいずれかに記載のポリペプチド:
(i) それぞれ配列番号3のヌクレオチド1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖;
(ii) それぞれ配列番号6のヌクレオチド1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749の相補鎖;
(iii) それぞれ配列番号25のヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1339〜1620の相補鎖。
【請求項２９】
リンカー領域が配列番号22に示すリンカーで置換されている、請求項1〜28のいずれかに記載のポリペプチドから成るグルコアミラーゼ活性を有するハイブリッドポリペプチド。
【請求項３０】
請求項1〜29のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項３１】
発現宿主におけるポリペプチドの産生を指令する1または2以上の制御配列に作用可能に連結された請求項30に記載のポリペプチドを含んでなる核酸構築物。
【請求項３２】
請求項31に記載の核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター。
【請求項３３】
請求項31に記載の核酸構築物または請求項32に記載の組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項３４】
下記の工程を含んでなる請求項1〜29のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法:
(a) ポリペプチドの産生を促進する条件下に、野生型の形態においてポリペプチドを産生することができる細胞を培養し、そして
(b) ポリペプチドを回収する。
【請求項３５】
下記の工程を含んでなる請求項1〜29のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法:
(a) ポリペプチドの産生を促進する条件下に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物を含んでなる宿主細胞を培養し、そして
(b) ポリペプチドを回収する。
【請求項３６】
下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(a) 配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1) 配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b) 配列番号1のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(b1) 配列番号36のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c) 配列番号3のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1) 配列番号38のヌクレオチド55〜1737に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【請求項３７】
下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(a) 配列番号5の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜575のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1) 配列番号40の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜565のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b) 配列番号4のヌクレオチド55〜2189に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(b1) 配列番号39のヌクレオチド55〜2182に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c) 配列番号6のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1) 配列番号41のヌクレオチド55〜1749に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号4のヌクレオチド55〜2189とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号6のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【請求項３８】
下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(a) 配列番号26の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1) 配列番号24の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜548のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a2) 配列番号43の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜523のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b) 配列番号23のヌクレオチド117〜2249に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c) 配列番号25のヌクレオチド52〜1719に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1) 配列番号42のヌクレオチド52〜1620に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または少なくとも低いストリンジェンシイ条件下に配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号25のヌクレオチド52〜1719中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【請求項３９】
下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法:
(a) α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、
(b) 工程 (a) において得られた液化物質を請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼで糖化し、そして
(c) 発酵生物により糖化物質を発酵させる。
【請求項４０】
発酵後、好ましくは蒸留により、発酵生成物を回収する、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
工程 (b) および (c) を順次にまたは同時に (すなわち、SSFプロセス) 実施する、請求項39または40に記載の方法。
【請求項４２】
発酵生成物がエタノールである、請求項39〜41のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
デンプン含有出発物質が全穀粒、好ましくは全トウモロコシまたはコムギ穀粒である、請求項39〜42のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
発酵生物がサッカロマイセス (Saccharomyces) の菌株である、請求項39〜43のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
工程 (a) の前に、下記の工程をさらに含んでなる、請求項39〜44のいずれかに記載の方法:
x) デンプン含有物質の粒度を減少させ、そして
y) デンプン含有物質および水を含んでなるスラリーを形成する。
【請求項４６】
スラリーを糊化温度より上に加熱する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
スラリーを95〜140℃、好ましくは105〜125℃の温度において1〜15分間、好ましくは3〜10分間、特に約5分間ジェット煮沸する、請求項45に記載の方法。
【請求項４８】
下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法:
(a) 請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼおよび/または
i) 配列番号2中のアミノ酸1〜556または配列番号37中のアミノ酸1〜561として示す配列を有するグルコアミラーゼまたは前記配列に対して少なくとも75%の同一性を有するグルコアミラーゼおよび/または
ii) 配列番号5中のアミノ酸1〜575または配列番号40中のアミノ酸1〜565として示す配列を有するグルコアミラーゼまたは前記配列に対して少なくとも70%の同一性を有するグルコアミラーゼおよび/または
iii) 配列番号24中のアミノ酸1〜548または配列番号26中のアミノ酸1〜556または配列番号43中のアミノ酸1〜523として示す配列を有するグルコアミラーゼまたは前記配列に対して少なくとも60%の同一性を有するグルコアミラーゼ、
でデンプン含有物質の初期糊化温度より低い温度においてデンプン含有物質を糖化し、そして
(b) 発酵生物を使用して発酵させる。
【請求項４９】
このプロセスを1〜250時間、好ましくは25〜190時間、より好ましくは30〜180時間、より好ましくは40〜170時間、さらにより好ましくは50〜160時間、なおより好ましくは60〜150時間、さらになおより好ましくは70〜140時間、最も好ましくは80〜130時間の間実施する、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
このプロセスをpH 3〜7、好ましくはpH 3.5〜6、より好ましくはpH 4〜5において実施する、請求項48または49に記載の方法。
【請求項５１】
乾燥固形分 (DS) が20〜55重量%、好ましくは25〜40重量%、より好ましくは30〜35重量%の範囲内である、請求項48〜50のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
糖濃度が糖化および発酵の間において約6重量%より低いレベルに保持される、請求項48〜51のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
工程 (a) 前に水およびデンプン含有物質を含んでなるスラリーを調製する、請求項48〜52のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
デンプン含有物質の粒度を0.1〜0.5 mmの粒度に減少することによって、デンプン含有物質を調製する、請求項48〜53のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
デンプン含有物質の粒度の減少を微粉砕により実施する、請求項48〜53のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
デンプン含有物質が粒状デンプンである、請求項48〜55のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
デンプン含有物質が全穀粒である、請求項48〜55のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
糖化および発酵を同時に実施する、請求項48〜57のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
同時の糖化および発酵または工程 (b) における発酵の間の温度が28℃〜36℃、例えば、29℃〜35℃、例えば、30℃〜34℃、例えば、約32℃である、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
グルコアミラーゼが0.001〜10 AGU/g DS、好ましくは0.01〜5 AGU/g DS、特に0.1〜0.5 AGU/g DSの量で存在する、請求項48〜59のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
α-アミラーゼが存在する、請求項48〜60のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
α-アミラーゼが真菌α-アミラーゼであり、好ましくはアスペルギルス (Aspergillus) 属、アスペルギルス・ニガー (A. niger) 、アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 、アスペルギルス・アワモリ (A. awamori) またはアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) の菌株に由来し、またはリゾムコル (Rhizomucor) 属、好ましくはリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) の菌株に由来し、またはメリピルス (Meripilus) 属、好ましくはメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) の菌株に由来する真菌α-アミラーゼである、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
真菌α-アミラーゼがα-アミラーゼの触媒ドメイン (CD) および炭水化物結合性モジュール/ドメイン (CBM) および必要に応じてリンカーまたは野生型真菌酸性α-アミラーゼ触媒ドメイン (CD) および炭水化物結合性モジュール (CBM) および必要に応じてリンカーを含んでなるハイブリッド酵素である、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
ハイブリッドα-アミラーゼが触媒ドメインJA118およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) SBD (配列番号28) をもつフンガミル変異型、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBD (配列番号29) をもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼリンカーおよびSBD (配列番号30) をもつメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) α-アミラーゼから成る群から選択される、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
ハイブリッドα-アミラーゼがアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) リンカーおよびデンプン結合性ドメイン (SBD) をもつアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α-アミラーゼである、請求項63に記載の方法。
【請求項６６】
α-アミラーゼが0.01〜10 AFAU/g DS、好ましくは0.1〜5 AFAU/g DS、特に0.3〜2 AFAU/g DSの量で存在する、請求項61〜64のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼを0.1〜10 AGU/AFAU、好ましくは0.30〜5 AGU/AFAU、特に0.5〜3 AGU/AFAUの比で添加する、請求項48〜66のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
他のグルコアミラーゼをまた添加する、請求項48〜67のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
他のグルコアミラーゼがアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼまたはそれらの混合物から成る群から選択される、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
発酵生成物を発酵後に回収する、請求項48〜69のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
発酵生成物がアルコール、好ましくはエタノール、特に燃料エタノール、飲用エタノールおよび/または工業用エタノールである、請求項48〜70のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
デンプン含有物質が塊茎、根、幹、果実、種子または全穀粒から得られる、請求項48〜71のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
デンプン含有物質がトウモロコシ、穂軸、コムギ、オオムギ、ライムギ、マイロ、サゴヤシ、カッサバ (cassava) 、カッサバ (manioc) 、タピオカ、モロコシ、イネまたはジャガイモから得られる、請求項48〜72のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
デンプン含有物質が粒状デンプンである、請求項48〜73のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
工程 (a) における糖化間の温度が30℃〜75℃、好ましくは45〜60℃である、請求項48〜74のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
工程 (a) または (b) を順次にまたは同時に (すなわち、1工程発酵) 実施する、請求項48〜75のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
下記の工程を含んでなる、デンプン含有物質からシロップを製造する方法:
(a) α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、そして
(b) 工程 (a) において得られた物質を請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼで糖化する。
【請求項７８】
シロップの精製、転化および/または回収をさらに含んでなる、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
シロップおよび/または発酵生成物を製造するための請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼの使用。
【請求項８０】
出発物質が糊化または非糊化デンプン含有物質である、請求項79に記載の使用。
【請求項８１】
醸造のための請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼの使用。
【請求項８２】
請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼを含んでなる組成物。
【請求項８３】
α-アミラーゼをさらに含んでなる、請求項82に記載の組成物。
【請求項８４】
α-アミラーゼが酸性α-アミラーゼ、好ましくは真菌酸性α-アミラーゼである、請求項83に記載の組成物。
【請求項８５】
α-アミラーゼが真菌由来である、請求項83または84に記載の組成物。
【請求項８６】
α-アミラーゼがアスペルギルス (Aspergillus) 属、アスペルギルス・ニガー (A. niger) 、アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 、アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) またはアスペルギルス・カワチイ (A. kawachii) の菌株、またはリゾムコル (Rhizomucor) 属、好ましくはリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) の菌株、またはメリピルス (Meripilus) 属、好ましくはメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) の菌株に由来する、請求項83〜85のいずれかに記載の組成物。
【請求項８７】
α-アミラーゼがハイブリッドであり、好ましくは触媒ドメインJA118およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) SBD (配列番号28) をもつフンガミル変異型、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBD (配列番号29) をもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼまたはアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼリンカーおよびSBD (配列番号30) をもつメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) α-アミラーゼである、請求項83〜85のいずれかに記載の組成物。
【請求項８８】
他のグルコアミラーゼをさらに含んでなる、請求項82〜87のいずれかに記載の組成物。
【請求項８９】
グルコアミラーゼがアスペルギルス (Aspergillus) 属、好ましくはアスペルギルス・ニガー (A. niger) 、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) またはアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) の菌株、アテリア (Athelia) 属、好ましくはアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) の菌株、タラロマイセス (Talaromyces) 属、好ましくはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) の菌株、リゾプス (Rhizopus) 属、例えば、リゾプス・ニビウス (Rhizopus nivius) の菌株、またはフミコラ (Humicola) 、好ましくはフミコラ・グリセアvar. テラモイデス (Humicola grisea var. thermoides) の菌株に由来する、請求項88に記載の組成物。
【請求項９０】
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼに由来するグルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBDをもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼに由来するα-アミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するグルコアミラーゼを含んでなる、請求項88または89に記載の組成物。
【請求項９１】
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) に由来するグルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBDをもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼに由来するα-アミラーゼおよびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) に由来するグルコアミラーゼを含んでなる、請求項88または89に記載の組成物。
【請求項１】
下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a) 配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1) 配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c) 配列番号2のアミノ酸1〜556の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号37のアミノ酸1〜561の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【請求項２】
下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a) 配列番号5の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜575のアミノ酸に対して少なくとも70% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1) 配列番号40の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜565のアミノ酸に対して少なくとも70% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号4のヌクレオチド55〜2189とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号6のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c) 配列番号5のアミノ酸1〜575の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号40のアミノ酸1〜565の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【請求項３】
下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a) 配列番号26の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1) 配列番号24の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜548のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a2) 配列番号43の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜523のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも低いストリンジェンシイ条件下に配列番号25のヌクレオチド55〜1719中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c) 配列番号26のアミノ酸1〜556の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号24のアミノ酸1〜548の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1) 配列番号43のアミノ酸1〜523の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【請求項４】
それぞれ配列番号2または37の成熟部分、またはグルコアミラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５】
それぞれ配列番号5または40、またはグルコアミラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号24、26または43、またはグルコアミラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型である、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドが配列番号5のアミノ酸1〜575または配列番号40のアミノ酸1〜565の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型である、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが配列番号26のアミノ酸1〜556または配列番号24のアミノ酸1〜548の1または2以上のアミノ酸または配列番号43のアミノ酸1〜523の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型である、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号2中のアミノ酸1〜455または配列番号37のアミノ酸1〜561の触媒領域を含んでなる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号5中のアミノ酸1〜475または配列番号40のアミノ酸1〜561に位置する触媒領域を含んでなる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号26中のアミノ酸1〜451または配列番号24のアミノ酸1〜455または配列番号43のアミノ酸1〜418に位置する触媒領域を含んでなる、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に位置する結合性ドメインを含んでなる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に位置する結合性ドメインを含んでなる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号26のアミノ酸463〜556または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に位置する結合性ドメインを含んでなる、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
大腸菌 (E. coli) DSM 17106中に収容されているプラスミドpHUda595中に含有されるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
大腸菌 (E. coli) DSM 17105中に収容されているプラスミドpHUda594中に含有されるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
下記から成る群から選択される、炭水化物結合性アフィニティーを有するポリペプチド:
(a) i) それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
ii) それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
iii) それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
(b) 低いストリンジェンシイの条件下に下記から成る群から選択されるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド:
(i) それぞれ配列番号3のヌクレオチド1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖;
(ii) それぞれ配列番号6のヌクレオチド1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749の相補鎖;
(iii) それぞれ配列番号25のヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1399〜1620の相補鎖;
(c) 炭水化物結合性アフィニティーを有する (a) または (b) のフラグメント。
【請求項１９】
炭水化物結合性アフィニティーがデンプン結合性アフィニティーである、請求項18に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して少なくとも60%の同一性、それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して好ましくは少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、またはより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項18または19に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561を含んでなる、請求項17に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して少なくとも60% の同一性、それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して好ましくは少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、またはより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項18または19に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565を含んでなる、請求項22に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して少なくとも60% の同一性、それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して好ましくは少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、またはより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項18または19に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523を含んでなる、請求項24に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
ポリペプチドが、それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561またはそれぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565またはそれぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に比較してアミノ酸の少なくとも1つの置換、欠失および/または挿入を有するアミノ酸を含んでなる人工変異型である、請求項18〜25のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２７】
ポリペプチドが、それぞれ配列番号3中の位置1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737; またはそれぞれ配列番号6の位置1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749; またはそれぞれ配列番号25中の位置1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1339〜1620に示すポリヌクレオチド配列の炭水化物結合性ドメインエンコーディング部分によりコードされるアミノ酸配列に比較して、アミノ酸の少なくとも1つの置換、欠失および/または挿入を有するアミノ酸配列を含んでなる人工変異型である、請求項18〜26のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２８】
低いストリンジェンシイの条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、下記から成る群から選択されるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる、請求項18〜27のいずれかに記載のポリペプチド:
(i) それぞれ配列番号3のヌクレオチド1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖;
(ii) それぞれ配列番号6のヌクレオチド1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749の相補鎖;
(iii) それぞれ配列番号25のヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1339〜1620の相補鎖。
【請求項２９】
リンカー領域が配列番号22に示すリンカーで置換されている、請求項1〜28のいずれかに記載のポリペプチドから成るグルコアミラーゼ活性を有するハイブリッドポリペプチド。
【請求項３０】
請求項1〜29のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項３１】
発現宿主におけるポリペプチドの産生を指令する1または2以上の制御配列に作用可能に連結された請求項30に記載のポリペプチドを含んでなる核酸構築物。
【請求項３２】
請求項31に記載の核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター。
【請求項３３】
請求項31に記載の核酸構築物または請求項32に記載の組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項３４】
下記の工程を含んでなる請求項1〜29のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法:
(a) ポリペプチドの産生を促進する条件下に、野生型の形態においてポリペプチドを産生することができる細胞を培養し、そして
(b) ポリペプチドを回収する。
【請求項３５】
下記の工程を含んでなる請求項1〜29のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法:
(a) ポリペプチドの産生を促進する条件下に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物を含んでなる宿主細胞を培養し、そして
(b) ポリペプチドを回収する。
【請求項３６】
下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(a) 配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1) 配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b) 配列番号1のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(b1) 配列番号36のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c) 配列番号3のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1) 配列番号38のヌクレオチド55〜1737に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【請求項３７】
下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(a) 配列番号5の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜575のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1) 配列番号40の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜565のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b) 配列番号4のヌクレオチド55〜2189に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(b1) 配列番号39のヌクレオチド55〜2182に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c) 配列番号6のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1) 配列番号41のヌクレオチド55〜1749に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号4のヌクレオチド55〜2189とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号6のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【請求項３８】
下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(a) 配列番号26の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1) 配列番号24の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜548のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a2) 配列番号43の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜523のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b) 配列番号23のヌクレオチド117〜2249に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c) 配列番号25のヌクレオチド52〜1719に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1) 配列番号42のヌクレオチド52〜1620に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または少なくとも低いストリンジェンシイ条件下に配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号25のヌクレオチド52〜1719中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【請求項３９】
下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法:
(a) α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、
(b) 工程 (a) において得られた液化物質を請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼで糖化し、そして
(c) 発酵生物により糖化物質を発酵させる。
【請求項４０】
発酵後、好ましくは蒸留により、発酵生成物を回収する、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
工程 (b) および (c) を順次にまたは同時に (すなわち、SSFプロセス) 実施する、請求項39または40に記載の方法。
【請求項４２】
発酵生成物がエタノールである、請求項39〜41のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
デンプン含有出発物質が全穀粒、好ましくは全トウモロコシまたはコムギ穀粒である、請求項39〜42のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
発酵生物がサッカロマイセス (Saccharomyces) の菌株である、請求項39〜43のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
工程 (a) の前に、下記の工程をさらに含んでなる、請求項39〜44のいずれかに記載の方法:
x) デンプン含有物質の粒度を減少させ、そして
y) デンプン含有物質および水を含んでなるスラリーを形成する。
【請求項４６】
スラリーを糊化温度より上に加熱する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
スラリーを95〜140℃、好ましくは105〜125℃の温度において1〜15分間、好ましくは3〜10分間、特に約5分間ジェット煮沸する、請求項45に記載の方法。
【請求項４８】
下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法:
(a) 請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼおよび/または
i) 配列番号2中のアミノ酸1〜556または配列番号37中のアミノ酸1〜561として示す配列を有するグルコアミラーゼまたは前記配列に対して少なくとも75%の同一性を有するグルコアミラーゼおよび/または
ii) 配列番号5中のアミノ酸1〜575または配列番号40中のアミノ酸1〜565として示す配列を有するグルコアミラーゼまたは前記配列に対して少なくとも70%の同一性を有するグルコアミラーゼおよび/または
iii) 配列番号24中のアミノ酸1〜548または配列番号26中のアミノ酸1〜556または配列番号43中のアミノ酸1〜523として示す配列を有するグルコアミラーゼまたは前記配列に対して少なくとも60%の同一性を有するグルコアミラーゼ、
でデンプン含有物質の初期糊化温度より低い温度においてデンプン含有物質を糖化し、そして
(b) 発酵生物を使用して発酵させる。
【請求項４９】
このプロセスを1〜250時間、好ましくは25〜190時間、より好ましくは30〜180時間、より好ましくは40〜170時間、さらにより好ましくは50〜160時間、なおより好ましくは60〜150時間、さらになおより好ましくは70〜140時間、最も好ましくは80〜130時間の間実施する、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
このプロセスをpH 3〜7、好ましくはpH 3.5〜6、より好ましくはpH 4〜5において実施する、請求項48または49に記載の方法。
【請求項５１】
乾燥固形分 (DS) が20〜55重量%、好ましくは25〜40重量%、より好ましくは30〜35重量%の範囲内である、請求項48〜50のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
糖濃度が糖化および発酵の間において約6重量%より低いレベルに保持される、請求項48〜51のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
工程 (a) 前に水およびデンプン含有物質を含んでなるスラリーを調製する、請求項48〜52のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
デンプン含有物質の粒度を0.1〜0.5 mmの粒度に減少することによって、デンプン含有物質を調製する、請求項48〜53のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
デンプン含有物質の粒度の減少を微粉砕により実施する、請求項48〜53のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
デンプン含有物質が粒状デンプンである、請求項48〜55のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
デンプン含有物質が全穀粒である、請求項48〜55のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
糖化および発酵を同時に実施する、請求項48〜57のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
同時の糖化および発酵または工程 (b) における発酵の間の温度が28℃〜36℃、例えば、29℃〜35℃、例えば、30℃〜34℃、例えば、約32℃である、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
グルコアミラーゼが0.001〜10 AGU/g DS、好ましくは0.01〜5 AGU/g DS、特に0.1〜0.5 AGU/g DSの量で存在する、請求項48〜59のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
α-アミラーゼが存在する、請求項48〜60のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
α-アミラーゼが真菌α-アミラーゼであり、好ましくはアスペルギルス (Aspergillus) 属、アスペルギルス・ニガー (A. niger) 、アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 、アスペルギルス・アワモリ (A. awamori) またはアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) の菌株に由来し、またはリゾムコル (Rhizomucor) 属、好ましくはリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) の菌株に由来し、またはメリピルス (Meripilus) 属、好ましくはメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) の菌株に由来する真菌α-アミラーゼである、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
真菌α-アミラーゼがα-アミラーゼの触媒ドメイン (CD) および炭水化物結合性モジュール/ドメイン (CBM) および必要に応じてリンカーまたは野生型真菌酸性α-アミラーゼ触媒ドメイン (CD) および炭水化物結合性モジュール (CBM) および必要に応じてリンカーを含んでなるハイブリッド酵素である、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
ハイブリッドα-アミラーゼが触媒ドメインJA118およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) SBD (配列番号28) をもつフンガミル変異型、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBD (配列番号29) をもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼリンカーおよびSBD (配列番号30) をもつメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) α-アミラーゼから成る群から選択される、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
ハイブリッドα-アミラーゼがアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) リンカーおよびデンプン結合性ドメイン (SBD) をもつアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α-アミラーゼである、請求項63に記載の方法。
【請求項６６】
α-アミラーゼが0.01〜10 AFAU/g DS、好ましくは0.1〜5 AFAU/g DS、特に0.3〜2 AFAU/g DSの量で存在する、請求項61〜64のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼを0.1〜10 AGU/AFAU、好ましくは0.30〜5 AGU/AFAU、特に0.5〜3 AGU/AFAUの比で添加する、請求項48〜66のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
他のグルコアミラーゼをまた添加する、請求項48〜67のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
他のグルコアミラーゼがアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼまたはそれらの混合物から成る群から選択される、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
発酵生成物を発酵後に回収する、請求項48〜69のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
発酵生成物がアルコール、好ましくはエタノール、特に燃料エタノール、飲用エタノールおよび/または工業用エタノールである、請求項48〜70のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
デンプン含有物質が塊茎、根、幹、果実、種子または全穀粒から得られる、請求項48〜71のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
デンプン含有物質がトウモロコシ、穂軸、コムギ、オオムギ、ライムギ、マイロ、サゴヤシ、カッサバ (cassava) 、カッサバ (manioc) 、タピオカ、モロコシ、イネまたはジャガイモから得られる、請求項48〜72のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
デンプン含有物質が粒状デンプンである、請求項48〜73のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
工程 (a) における糖化間の温度が30℃〜75℃、好ましくは45〜60℃である、請求項48〜74のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
工程 (a) または (b) を順次にまたは同時に (すなわち、1工程発酵) 実施する、請求項48〜75のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
下記の工程を含んでなる、デンプン含有物質からシロップを製造する方法:
(a) α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、そして
(b) 工程 (a) において得られた物質を請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼで糖化する。
【請求項７８】
シロップの精製、転化および/または回収をさらに含んでなる、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
シロップおよび/または発酵生成物を製造するための請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼの使用。
【請求項８０】
出発物質が糊化または非糊化デンプン含有物質である、請求項79に記載の使用。
【請求項８１】
醸造のための請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼの使用。
【請求項８２】
請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼを含んでなる組成物。
【請求項８３】
α-アミラーゼをさらに含んでなる、請求項82に記載の組成物。
【請求項８４】
α-アミラーゼが酸性α-アミラーゼ、好ましくは真菌酸性α-アミラーゼである、請求項83に記載の組成物。
【請求項８５】
α-アミラーゼが真菌由来である、請求項83または84に記載の組成物。
【請求項８６】
α-アミラーゼがアスペルギルス (Aspergillus) 属、アスペルギルス・ニガー (A. niger) 、アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 、アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) またはアスペルギルス・カワチイ (A. kawachii) の菌株、またはリゾムコル (Rhizomucor) 属、好ましくはリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) の菌株、またはメリピルス (Meripilus) 属、好ましくはメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) の菌株に由来する、請求項83〜85のいずれかに記載の組成物。
【請求項８７】
α-アミラーゼがハイブリッドであり、好ましくは触媒ドメインJA118およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) SBD (配列番号28) をもつフンガミル変異型、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBD (配列番号29) をもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼまたはアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼリンカーおよびSBD (配列番号30) をもつメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) α-アミラーゼである、請求項83〜85のいずれかに記載の組成物。
【請求項８８】
他のグルコアミラーゼをさらに含んでなる、請求項82〜87のいずれかに記載の組成物。
【請求項８９】
グルコアミラーゼがアスペルギルス (Aspergillus) 属、好ましくはアスペルギルス・ニガー (A. niger) 、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) またはアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) の菌株、アテリア (Athelia) 属、好ましくはアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) の菌株、タラロマイセス (Talaromyces) 属、好ましくはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) の菌株、リゾプス (Rhizopus) 属、例えば、リゾプス・ニビウス (Rhizopus nivius) の菌株、またはフミコラ (Humicola) 、好ましくはフミコラ・グリセアvar. テラモイデス (Humicola grisea var. thermoides) の菌株に由来する、請求項88に記載の組成物。
【請求項９０】
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼに由来するグルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBDをもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼに由来するα-アミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するグルコアミラーゼを含んでなる、請求項88または89に記載の組成物。
【請求項９１】
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) に由来するグルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBDをもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼに由来するα-アミラーゼおよびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) に由来するグルコアミラーゼを含んでなる、請求項88または89に記載の組成物。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５２５０３５（Ｐ２００８−５２５０３５Ａ）
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４８５０１（Ｐ２００７−５４８５０１）
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４６７２４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６９２８９
【国際公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５００１３２０７４）ノボザイムス ノース アメリカ，インコーポレイティド (16)
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４６７２４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６９２８９
【国際公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５００１３２０７４）ノボザイムス ノース アメリカ，インコーポレイティド (16)
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
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