ケモカイン変異体の治療への使用
ヒトＣＣＬ２のようなホモ二量体形成ケモカインの変異体であって、二量体化界面において水素結合パターンを変更させる単一アミノ酸置換を有し、絶対的単量体として作用する変異体は、天然のケモカインに拮抗することができ、また、インビボにおいて抗炎症作用を有する。これらの変異体は、炎症、自己免疫疾患、または感染症を治療するための薬学的組成物の有効成分として使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケモカイン変異体、および具体的にはヒトＣＣＬ２変異体の新規の治療への使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、小さな分泌性の炎症促進性タンパク質であり、白血球が指向的に血液から傷害部位へと移動するのを仲介する。ケモカインファミリーは、このタンパク質ファミリーの特徴である保存的システインの位置によって、一連の膜受容体に結合するＣケモカイン、Ｃ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、およびＣ−Ｘ3−Ｃケモカインに構造的に分けることができる（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＥＪ ａｎｄ Ｌｏｌｉｓ Ｅ，２００２）。
【０００３】
これらの膜受容体は、全て７へリックス（ｈｅｐｔａｈｅｌｉｃａｌ）Ｇ−タンパク質共役レセプターであり、ケモカインが標的細胞上でその生物学的活性を発揮するのを可能にし、それらの状態および／または種類によってレセプターの特異的な組み合わせを提示することができる。ケモカインの生理学的作用は、同時発生的な相互作用の複雑かつ集積的なシステムによるものであり、これらのレセプターは、しばしば、重複するリガンド特異性を有するため、単一のレセプターが異なったケモカインに結合し、また、単一のケモカインが異なったレセプターに結合することができる。
【０００４】
ケモカインは、通常、傷害部位で産生され、白血球の遊走および活性化をもたらし、炎症、免疫、ホメオスタシス、造血および血管形成のプロセスにおいて基本的な役割を果たしている。ケモカインを治療薬として使用することに短所となる点（具体的には、凝集しやすく、無差別に結合すること）があったとしても、これらの分子は、特異的なケモカインおよびそれらのレセプターを、白血球の過剰な動員および活性化を防止する目的で阻害することにより、上記プロセスに関連した病気への治療的介入を行うための優れた標的候補物質であると考えられている（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ Ｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ，２００１；Ｇｏｄｅｓｓａｒｔ Ｎ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ ＳＬ，２００１）。
【０００５】
構造と活性の関係について調べると、ケモカインには、それらのレセプターと相互作用する可動アミノ末端領域（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）、および２番目のシステインの後にある、立体配置的に固定したループ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｉｇｉｄ ｌｏｏｐ）という、２つの主な部位があることが示される。ケモカインは、ループ領域を用いてレセプター上にドッキングし、この接触によってアミノ末端領域の結合が促進され、レセプターの活性化をもたらす。このようにアミノ末端領域が重要なことは、このドメインを改変または短くした天然および合成のケモカインを試験することによっても明らかになっている。アミノ酸のタンパク質分解、突然変異誘発、または化学修飾の後にこのような処理を行うと、これらの分子を活性化または不活性化することができ、アゴニストおよび／またはアンタゴニストとしての活性を有する化合物を生成する。このように、アミノ末端領域を特異的に改変されたケモカインには、炎症性および自己免疫性の病気を治療する可能性がある（Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９９９）。
【０００６】
ＣＣＬ２は、単球遊走因子タンパク質−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ １：ＭＣＰ−１）または単球走化活性因子（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ：ＭＣＡＦ）としても知られているが、様々な炎症性疾患、様々なタイプの腫瘍、心臓同種移植片、ＡＩＤＳ、および結核における傷害および感染のシグナルに応答して、単球およびリンパ球の動員を促進することができるため、炎症において中心的役割を果たしていると見なされている（Ｙｏｓｈｕｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｇｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＣＣＬ２に関連する生理学的作用が、トランスジェニック動物を用いて広範に研究されており、このケモカインが、炎症モデルにおいて単球の動員を調節するだけでなく、ヘルパーＴの応答およびアテローム性動脈硬化症の開始に関係するサイトカインの発現も調節していることを明らかにすることができた。
【０００７】
構造上、ＣＣＬ２は、Ｃ末端にあるαへリックスで覆われたＮ末端ループおよびβシートからなり、特定の実験条件では単量体として検出されてはいるものの、ホモ二量体を形成する（Ｈａｎｄｅｌ Ｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋｉｍ ＫＳ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）。その他多くのケモカインについては、ＣＣＬ２に関連した結合活性およびその他の性質における欠失または置換されたアミノ酸の役割を評価するために、Ｎ末端切断型または単一部位置換型の変異体を発現させてＣＣＬ２の突然変異体が作成されている構造−活性研究の例が数多く文献に記載されている（Ｇｏｎｇ Ｊ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ，１９９５；Ｚｈａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｔｅｉｔｚ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｇｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈ Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｅｅｔ ＢＴ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【０００８】
特に、ＣＣＬ２レセプター結合および活性化における二量体化の役割が研究されて、二量体化を妨害する、末端領域における様々な変異が、レセプター結合親和性、走化性の促進、アデニル酸シクラーゼの阻害、およびカルシウム流出の促進など、ＣＣＬ２の作用のいくつかを変更し得ることが示された（Ｐａａｖｏｌａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。本明細書においてＰ８Ａ＊と呼ばれる、Ｐａａｖｏｌａによって記載された突然変異体は、二量体化はしないが、本来の能力と効力を維持しているのに対し、本明細書においてＹ１３Ａ＊と呼ばれる、Ｐａａｖｏｌａによって記載された別の絶対的な単量体突然変異体（ｏｂｌｉｇａｔｅ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｍｕｔａｎｔ）は、インビトロにおいて１００倍低い結合親和性を有し、インビトロにおいてアデニル酸シクラーゼのそれほど強力でないインヒビターであってカルシウム流出の刺激因子であり、また、細胞培養液中において走化性を促進することができないことが示された。Ｙ１３Ａ＊と同様、突然変異体である［１＋９−７６］ＭＣＰ−１（第２〜８位の残基がないＣＣＬ２変異体）は、インビトロにおいてＣＣＬ２の作用に拮抗する。
【０００９】
Ｐ８Ａ置換を含むＣＣＬ２突然変異体の結合特性も、実験モデルにおいて、ウイルスのケモカイン結合タンパク質Ｍ３の認識に基づいて調べられ、このウイルスタンパク質がＣＣＬ２の突然変異体に効率的に結合することが実証された（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，２００２）。さらに、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａなど、ケモカインの単量体変異体は、インビトロでは、完全な活性をもち、二量体型と区別することができないが、インビボでは活性をもたない（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００１０】
生じたタンパク質の二量体化特性に影響しない残基を含む、ＣＣＬ２の突然変異体の例が、ＣＣＬ２に対するアンタゴニストとしての性質を有する分子をもたらすものとして、既に文献に記載されている（米国特許第５７３９１０３号、国際公開第０３／８４９９３号）。しかし、先行技術には、一部位置換（例えば、プロリンを含む）によって絶対的な単量体変異体となったケモカインの特異的な突然変異体、具体的にはＣＣＬ２の突然変異体が、ケモカインのアンタゴニストとして作用し得ることの記載はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
驚くべきことに、ＣＣＬ２のようなホモ二量体を形成するケモカインの変異体であって、二量体化界面において水素結合パターンを変更させる単一アミノ酸置換を有するために、インビトロにおいて、レセプターに結合し、かつアゴニストの性質を有する絶対的単量体を生じさせる変異体が、インビボにおいて、天然のケモカインに拮抗することができ、また、抗炎症作用をもつことが発見された。
【００１２】
本明細書に記載された変異体は、薬剤として有用である。配列番号２を含むポリペプチド、および、さらに配列番号２の第６４位のイソロイシンへの突然変異を有する配列番号２を含むポリペプチド（配列番号４）が薬剤として有用である。
【００１３】
本明細書に記載された変異体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症を治療するための薬剤として有用である。配列番号２を含むポリペプチド、および配列番号２の第６４位のイソロイシンにさらに突然変異を有する配列番号２を含むポリペプチド（配列番号４）が、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症を治療するための薬剤として有用である。一例において、配列番号２を含むポリペプチド、および配列番号２の第６４位のイソロイシンにさらに突然変異を有する配列番号２を含むポリペプチド（配列番号４）は、多発性硬化症を治療するための薬剤として有用である。
【００１４】
本明細書に記載された変異体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染症を治療する方法において、さらに有用である。そのような方法は、本発明の単量体変異体であって、該ケモカインの二量体化界面において水素結合パターンを変更させる、少なくとも１つのアミノ酸置換によって生じる変異体を有効量投与することを含む。このような方法において使用可能な単量体変異体の例は、ａ）配列番号２を含むポリペプチド、ｂ）配列番号４を含むポリペプチド、ｃ）ａ）またはｂ）の活性型突然変異体、ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）、および該ケモカイン以外のタンパク質に属するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに、これらの活性型の画分、前駆体、塩、誘導体、複合体または結合体という形態の対応分子である。
【００１５】
さらに、本発明は、本発明の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体を含むポリペプチドを含有する薬学的組成物を含む。
【００１６】
さらに、本発明は、非ケモカインタンパク質の配列に本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体を融合させたもの、例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域に配列番号２のアミノ酸配列を融合させたもの（配列番号５）を含む融合タンパク質を含む。本発明は、さらに、これらの融合タンパク質を産生する方法を含む。
【００１７】
さらに、本発明は、本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法
ａ）二量体化する能力を阻害する単一点突然変異をＣＣＬ２の中に作出すること、
ｂ）レセプターに結合し、インビトロにおいてアゴニスト特性を示す該変異体を同定すること、
ｃ）上記ｂ）で同定された群に由来する該変異体であって、さらに、腹膜細胞の動員を阻害する特徴をもつ変異体を同定すること。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
先行技術における上記の証拠を考慮しても、レセプターに結合し、インビトロにおいてアゴニストとしての性質を有する絶対的単量体となるように水素結合のパターンを変更する、二量化界面における少なくとも一つのアミノ酸置換によって生じたＣＣＬ２変異体が、インビボにおいてＣＣＬ２を拮抗することができ、また、一般的に細胞の動員および／または炎症反応を阻害することもできるということを示唆するものは存在しない。
【００２０】
単一のアミノ酸置換は、ヒトの成熟ＣＣＬ２の８位にあることが好ましく、具体的には、８位におけるプロリンをアラニンで置換することからなる。これらの変異体は、ヒト成熟ＣＣＬ２の９、１０または１３位に対応する位置にさらなる変異を含まない。
【００２１】
上記に説明した置換の例は、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａと呼ばれる成熟型のＣＣＬ２の単量体変異体であり、８位におけるプロリンのアラニンへの単一置換（配列番号２）を含むものとして、または、６４位のメチオニンのイソロイシン（配列番号４）へのさらなる置換（タンパク質発現を改善する）を含むものとして発現させることができる変異体である。８位プロリン−８がアラニン（水素結合を形成することが可能な、異なった配向性の化学基を有するアミノ酸）に置換されると、絶対的単量体として作用するＣＣＬ２変異体が生じる。ＣＣＬ２−Ｐ８ＡおよびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａは、同等の活性を有する分子とみなすことができる。
【００２２】
したがって、ＣＣＬ２−Ｐ８ＡおよびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａと呼ばれる、これらＣＣＬ２の特定の絶対的単量体変異体について想定し得る医薬的用途、方法および組成物は、ＣＣＬ２の、または二量体として天然活性を有する他のケモカインの任意の他の絶対的単量体変異体であって、同様な方法で作成されるものについても想定し得る。これらの変異体は、天然ケモカインに対して、ＣＣＬ２−Ｐ８ＡおよびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａと同様のアンタゴニストおよびインヒビターとしての性質を示すはずであるから、医学的に応用することができるはずである。
【００２３】
本発明の一つの態様は、例えば、自己免疫性、炎症性または感染症など、様々な病気の治療標的として知られているＣＣＬ２のような、ホモ二量体を形成するケモカインの絶対的単量体変異体を利用することである。このような変異体は、前述のケモカインの二量化界面における水素結合のパターンを変更して、レセプターに結合し、インビトロにおいては作用薬としての性質を、インビボにおいては拮抗薬としての性質を有する、薬学的組成物中の有効成分、具体的には、自己免疫性、炎症性または感染症を治療または予防するための有効成分としての絶対的単量体をもたらす、少なくとも１つのアミノ酸置換によって生じる。これらインビボにおける拮抗薬としての性質は、炎症性分子（ＣＣＬ２自体、チオグリコール酸またはオボアルブミンなどのケモカイン）で誘導した後に生じる、腹膜における作用細胞の動員のような性質を評価することができるアッセイにおいて明らかにすることができる。
【００２４】
絶対的単量体変異体は、水素結合のパターンを変更する、二量体化界面における単一アミノ酸置換から生じさせることも可能である。より好ましくは、プロリンが、ホモ二量体のようなタンパク質複合体の形成に関連する立体特異的な水素結合の形成に特に関係することが周知のアミノ酸であるため、単一アミノ酸置換は、プロリンをプロリン以外のアミノ酸と置換するものとなるはずである。あるいは、単一アミノ酸置換は、プロリン以外のアミノ酸をプロリンに置換して、水素結合の立体特異性を変えるものとなるはずである。
【００２５】
薬学的組成物の有効成分として用いることができる、上記に定義されたホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の代替的形態には、ａ）活性を有する突然変異体、またはｂ）前記の変異体または前記の活性を有する変異体を含むポリペプチド、および前記のケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列などがある。
【００２６】
「活性を有する」という用語は、このような代替的化合物が、本発明のＣＣＬ２突然変異体の機能的特徴を維持する必要がある、すなわち、インビボにおいてＣＣＬ２に拮抗し、細胞の動員および／または炎症反応を阻害する必要がある、ということを意味する。
【００２７】
本明細書において定義する絶対的単量体ケモカインアンタゴニストは、本発明に係る活性型化合物として、活性画分、先駆物質、塩、誘導体、複合体または結合体の形で存在することもできる。
【００２８】
これら代替的化合物は、本明細書中に開示される基本的な特徴に影響を及ぼさない、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の配列が変更された分子を包含することを意図する。例えば、ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａは、正常なＣＣＬ２活性を維持しているが、組換え発現に関して改良された性質を有するＣＣＬ２の突然変異体（ＣＣＬ２−Ｍ６４１またはＣＣＬ２＊）に基づいて作成されている。
【００２９】
上記したＣＣＬ２−Ｐ８ＡをＣＣＬ２のアンタゴニストとして用いて本明細書に例示されている、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体のアンタゴニストとしての性質を、活性を有する突然変異体中で維持することができ、さらに増強することも可能である。このカテゴリーの分子は、前記配列の天然型および合成型の類似体であって、当分野において既知であり、下記の実施例においても開示されている手段によって測定すると、本発明において特徴付けられた生化学的活性を、同等またはより高いレベルで示すという条件で、１個以上のアミノ酸残基が付加、欠失または置換されている類似体を含む。
【００３０】
天然の類似体は、マウスのＣＣＬ２（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ アクセッション番号 Ｐ１０１４８）のように、他の生物において同定されているヒトケモカインタンパク質に該当する配列であることを意図する。ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の人為的類似体とは、既知の化学合成法、および／または部位特異的突然変異導入技術、コードＤＮＡ配列のレベルにおけるコンビナトリアル技術（ＤＮＡシャッフリング、ファージディスプレイ／選抜など）、コンピュターによるデザイン研究、またはこれらに適切な任意の他の既知技術であって、先行技術および下記の実施例に示された教示内容を用いて当業者によって日常的に取得および試験することができる、実質的に対応する変異または短縮されたペプチドまたはポリペプチドの有限のセットを提供する技術によって調製されるポリペプチドを意図する。
【００３１】
例えば、具体的な人為的突然変異体は、ＣＣＬ２の別の位置で置換されていて、ＣＣＬ２アンタゴニストを作成するために関連があることが分かっている１個以上のアミノ酸を有する可能性がある（国際公開番号０３／８４９９３）。
【００３２】
本発明によれば、活性を有する突然変異体における好ましい変化は、一般に「保存的」置換または「安全な」置換として知られていて、非塩基性残基を含むものである。保存的アミノ酸置換は、分子の構造および生化学的機能を保存するために、十分に類似した化学的特性を有するアミノ酸をもつものである。特に挿入または欠失が、例えば１０個よりも少ない、好ましくは３個よりも少ない少数のアミノ酸を含むのみで、かつ、タンパク質またはペプチドの機能的立体構造にとって決定的に重要なアミノ酸を除去も置換もしない場合であれば、上記した配列において機能を変更することなしにアミノ酸の挿入および欠失を行うこともできるのは明らかある。
【００３３】
文献には、天然のタンパク質の配列および／または構造についての統計学的および物理化学的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の選択を行うことができる多くのモデルが提供されている（Ｒｏｇｏｖ ＳＩ ａｎｄ Ｎｅｋｒａｓｏｖ ＡＮ，２００１）。タンパク質の設計実験によって、アミノ酸の特定のサブセットを用いると、折りたたみ可能で活性を有するタンパク質が産生されることが明らかになっており、タンパク質構造の中により容易に取り込まれやすく、機能的・構造的なホモログおよびパラログを検出するために用いることができる、アミノ酸の「同義」置換を分類するのに役立っている（Ｍｕｒｐｈｙ ＬＲ ｅｔ ａｌ．，２０００）。同義アミノ酸基およびより好ましい同義の基は、表Ｉに記載されている基である。例えば、ＣＣＬ２＊およびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａに共通している、イソロイシンによる６４位のメチオニンの置換は、同一の基準を用いて選択されたものである。
【００３４】
上記したホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の活性を有する突然変異体のさらなるグループは、ペプチド模倣物（ペプチドミメティクスとも呼ばれる）であり、ペプチドまたはポリペプチドの本質は、アミノ酸側鎖、アミノ酸のキラリティー、および／またはペプチド骨格のレベルで化学的に改変されている。これらの改変は、調製、効能および／または薬物動態の特徴に関して同一または改善された性質を有するホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を提供することを目的としている。
【００３５】
例えば、対象者に注射した後ペプチドがペプチダーゼにより切断されやすくなる場合には、特に感度の高いペプチド結合を非分解性ペプチド模倣物で置換することにより、より安定し、そのため治療薬としてより有用なペプチドを提供することができる。同様に、Ｌアミノ酸残基の置換は、タンパク質分解に対するペプチドの感度を低くして、最終的にペプチド以外の有機化合物と同じようにする標準的な方法である。また、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、セイル（ｔｈｅｙｌ）、サクシニル、メトキシサクシニル、スベリル（ｓｕｂｅｒｙｌ）アジピル、アゼライル（ａｚｅｌａｙｌ）、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニル、メトキシカルボニル、メトキシアゼライル（ｍｅｔｈｏｘｙａｚｅｌａｙｌ）、メトキシアジピル、メトキシスベリル（ｍｅｔｈｏｘｙｓｕｂｅｒｙｌ）、および２，４−ジニトロフェニルなどのアミノ末端ブロッキング基も有用である。高い効力、長期にわたる活性、精製の容易さおよび／または半減期の増大を提供するその他の多くの改変が、当分野において知られている（国際公開番号０２／１０１９５；Ｖｉｌｌａｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００３６】
ペプチド模倣物に含まれる、アミノ酸に対する好ましい代替的「同義」基は、表ＩＩに記載したものである。アミノ酸誘導体の非網羅的なリストには、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ＣＯＯＨ、インドリン−２−カルボン酸、４−ジフルオロ−プロリン、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、Ｌ−ホモプロリン、３，４−デヒドロ−プロリン、３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン、シクロヘキシル−グリシン、およびフェニルグリシンが含まれる。
【００３７】
「アミノ酸誘導体」とは、２０種類の遺伝子をコードする天然アミノ酸の一つを除くアミノ酸またはアミノ酸様化学物質を意図する。具体的には、アミノ酸誘導体は、直鎖状、分枝状、または環状の置換アルキル部分または非置換アルキル部分を含み、１つ以上のヘテロ原子を含むことが可能である。該アミノ酸誘導体は、デノボで作成するか、または、商業的供給源から入手可能である（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｂａｃｈｅｍ，ＵＳＡ）。
【００３８】
ペプチド模倣物および非ペプチド模倣物の合成および開発の技術は、当分野において周知である（Ｈｒｕｂｙ ＶＪ ａｎｄ Ｂａｌｓｅ ＰＭ，２０００；Ｇｏｌｅｂｉｏｗｓｋｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。インビトロおよびインビボの翻訳系を用いて、タンパク質の構造および機能を探索および／または改良するための、非天然アミノ酸をタンパク質に取り込む様々な方法も、文献に開示されている（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ＤＡ，２０００）。
【００３９】
本発明は、薬学的組成物中における有効成分として、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体およびその活性を有する突然変異体を用いることを開示し、また、それらのアミノ酸配列、および前記ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列を含むタンパク質を用いることも開示する。この後者の非相同の配列は、医薬品への応用性を損なうことなしに、さらなる特性を提供するはずである。このような追加的特性の例は、精製処理法の簡略化、体液中における半減期の延長、または細胞外への局在化である。この後者の特徴は、上記の定義に含まれる融合タンパク質またはキメラタンパク質の具体的なグループを定義する上で特に重要である。なぜなら、それは、これらのペプチドの単離および精製が容易になるばかりでなく、ＣＣＬ２が他の分子と自然に相互作用を行う場所に、これらの単量体変異体を局在化することを可能にするからである。
【００４０】
部分、リガンドおよびリンカーの設計、また、融合タンパク質を構築、精製、検出および使用する方法および方策についても文献において広く議論されている（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９７；「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．３２６−３２８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０００；国際公開番号０１／７７１３７）。これら上記のホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体の代替形態を作成するために用いることができる付加的タンパク質配列は、膜結合性タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）、多量体形成ドメイン、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、輸出シグナル含有タンパク質の配列である。単量体変異体に融合させるためにこれらの配列を１つ以上選ぶことは、該因子の具体的な用途にとって有効である。この付加的タンパク質配列が、細胞外への輸出シグナルまたはシグナルペプチドを含有するタンパク質の配列のように、単量体変異体を細胞外の場所に分泌することができる場合には、該因子を、さらなる処理を考慮してより容易に培養細胞から採集して精製することができるか、または、代わりに細胞を直接用いるか、投与することができる。
【００４１】
上記したホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体は、他の好ましい形態、例えば活性画分、前駆体、塩類、誘導体、結合体または複合体として用いることもできる。
【００４２】
「画分」という用語は、化合物自体のポリペプチド鎖の任意の断片を単独で、または、それに結合した関連分子または残基、例えば糖類またはリン酸塩類の残基と結合して、または、元のポリペプチドまたはペプチドが凝集したものを意味する。このような分子は、通常は一次配列を変更しないその他の改変、例えばインビボまたはインビトロにおけるペプチドの化学的誘導体化（アセチル化またはカルボキシル化）、リン酸化パターンを改変してできるもの（ホスホチロシン残基、ホスホセリン残基またはホスホトレオニン残基の導入）、または、ペプチドの合成およびプロセッシングもしくはさらなる加工の工程におけるペプチドのグリコシル化（ペプチドを、例えば哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響する酵素に曝露して行われる）によって作成することも可能である。
【００４３】
「前駆体」は、細胞または身体に投与する前後に代謝上および酵素的な処理によって、本発明の化合物に変換することができる化合物である。
【００４４】
本明細書において「塩類」という用語は、カルボキシル基の塩、および本発明のペプチド、ポリペプチド、またはそれらの類似体のアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は、当分野において既知の手段により形成することができ、例えばナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩または亜鉛塩などの無機塩類、および、例えばトリエタノールアミン、アルギニンもしくはリジン、ピペリジン、プロケインなどのアミン類によって形成される塩など、有機塩基を有する塩を含む。酸付加塩は、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸を有する塩、および、例えば、酢酸、シュウ酸などの有機酸を有する塩を含む。このような塩のいずれも、本発明のペプチドおよびポリペプチド、またはそれらの類似体と、本質的に同様の活性を有する。
【００４５】
本明細書で用いる「誘導体」という用語は、アミノ酸部分の側鎖上、またはＮ末端基またはＣ末端基上に存在する官能基から、既知の方法に従って調製することができる誘導体を意味する。このような誘導体は、例えば、カルボキシル基のエステルまたは脂肪アミド、および遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、または遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含み、アシル基によって、例えばアルカノイル基またはアロイル基として形成される。
【００４６】
上記のホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体の有用な結合体または複合体は、受容タンパク質または他のタンパク質（放射性または蛍光性標識、ビオチン）、治療効力（細胞毒性薬）、または、ポリエチレングリコールおよび他の天然型または合成型のポリマーなど薬物送達効力に関わる因子の改良という当分野において既知の分子および方法を用いて作成することができる（Ｈａｒｒｉｓ ＪＭ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓ ＲＢ，２００３；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ＲＢ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｐｉｌｌａｉ Ｏ ａｎｄ Ｐａｎｃｈａｇｎｕｌａ Ｒ，２００１）。残基が、ポリマーに結合しやすい側鎖（すなわち、例えばリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジンのような、官能基を有するアミノ酸の側鎖）を有していれば、それらを結合に用いることができる。または、これらの部位にある残基は、ポリマーに結合しやすい側鎖を有する様々なアミノ酸で置換することができる。また、遺伝子にコードされたアミノ酸の側鎖を、ポリマーに結合するように化学的に改変するか、または適切な側鎖官能基を有する非天然アミノ酸を用いることができる。ポリマーの結合は、アンタゴニストの特定の位置に天然に存在するアミノ酸の側鎖、または、アンタゴニストの特定の位置に天然に存在するアミノ酸を置換する天然または非天然のアミノ酸の側鎖に対してだけでなく、標的位置においてアミノ酸の側鎖に結合している炭水化物部分または他の部分に対しても起こる可能性がある。
【００４７】
これらの目的に適するポリマーは、生体適合性を有する。すなわち、生体系に対して非毒性であり、このようなポリマーは多数知られている。このようなポリマーは、天然状態で疎水性もしく親水性、生物分解性もしくは非生物分解性、またはそれらの組み合わせであってもよい。これらのポリマーには、天然のポリマー（コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ヒアルロン酸など）、および合成ポリマー（ポリエステル、ポリオルトエステル、無水物など）が含まれる。疎水性の非分解性ポリマーの例は、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニルおよびポリメチルメタエリレートなどである。親水性の非分解性ポリマーの例は、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアルキレン、ポリアクリルアミドおよびこれらのコポリマーなどである。好適なポリマーは、順次反復単位として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなエチレンオキシドを含む。
【００４８】
好ましい結合方法は、ペプチドの合成および化学的ライゲーションを組み合わせて用いる。都合のよいことに、水溶性ポリマーの結合は、生物分解性のリンカーを介して、特にタンパク質のアミノ末端領域において行われる。このような修飾によって、前駆体（または「プロドラッグ」）型のタンパク質が提供され、それは、リンカーが分解されるとポリマー修飾をもたないタンパク質を放出する。
【００４９】
一般的な手順として、上記のホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体は、組換えＤＮＡ関連技術および化学合成技術など、当分野において既知の処理法によって作出し調製することが可能である。
【００５０】
オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）発行の「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」シリーズ中の数巻（「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，１９９５；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４．Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，１９９６；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，１９９９；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，２００１など、多くの本や概説書に、ベクター、および原核生物（例えば大腸菌）または真核生物の宿主細胞を用いて組換タンパク質をクローニングして産生する方法についての教示が記載されている。
【００５１】
本発明による別の実施形態は、本明細書に記載の絶対的単量体ケモカイン変異体アンタゴニストをコードする核酸配列である。
【００５２】
ホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体をコードするＤＮＡ配列を、適当なエピソーム・ベクターまたは非相同的組込みベクターであって、任意の適当な手段（形質転換、形質移入、接合、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、直接的マイクロインジェクション法など）によって適切な宿主細胞に導入されて、それらを形質転換することができるベクターを挿入してライゲーションすることができる。具体的なプラスミドベクターまたはウイルスベクターを選択する上で重要な要素には、ベクターを含む受容細胞を、ベクターを含まないそれら受容細胞から識別して選択することの容易さ、具体的な宿主において望ましいベクターのコピー数、および異なる種の宿主細胞間でベクターを「往復する」ことを可能にすることが望ましいか否か、などが含まれる。
【００５３】
ベクターは、原核または真核宿主細胞中において、該細胞中において構成的に活性があるか、または誘導的に活性を有するかが選択されている転写開始／終結調節配列の制御下で、本発明のアンタゴニストを含む単離タンパク質または融合タンパク質を発現させるものでなければならない。そして、このような細胞の中で実質的に濃縮された細胞株を単離して安定した細胞株を生じることができる。
【００５４】
真核宿主（例えば、酵母菌、昆虫または哺乳動物の細胞）では、宿主の性質に応じて、様々な転写および翻訳の調節配列を用いることができる。それらは、アデノウイルス、ウシ・パピローマウイルス、シミアン・ウイルスなどのウイルス性由来源から派生させることができるが、この場合には、調節シグナルは、高レベルで発現する特定の遺伝子に結合している。具体例は、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、酵母菌のｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。抑制および活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択して、遺伝子の発現を調節することができる。発現ベクターを含む宿主細胞が選択できるようにする１つ以上のマーカーを導入しても、導入ＤＮＡにより安定的に形質転換されている細胞を選択することができる。該マーカーは、栄養要求性宿主（ａｕｘｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｓｔ）に対する光栄養（ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）、例えば抗生物質のような殺生物剤耐性、または銅などの重金属などを提供する。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結させるか、同時形質転換によって同一細胞に導入することができる。タンパク質の最適な合成を行うためには、さらに別の要素が必要とされる。
【００５５】
宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれでもよい。適正な部位における適正な折りたたみまたはグリコシル化など、タンパク質分子に対して翻訳後修飾を行うため、例えば、ヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞など、真核細胞宿主が好ましい。また、酵母菌細胞も、グリコシル化など、翻訳後ペプチド修飾を行うことができる。酵母菌中で所望のタンパク質を産生させるために利用することができる強力なプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを利用する組換えＤＮＡ法が多数ある。酵母菌は、クローニングされた哺乳動物遺伝子産物中のリーダー配列を認識して、リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレ−ペプチド）を分泌する。
【００５６】
組換えポリペプチドを長期間、高収率で産生させるためには、安定した発現が好ましい。例えば、目的とするポリペプチドを安定して発現する細胞株を、ウイルスの複製開始点および／または内因性発現要素および選択可能マーカー遺伝子を同一ベクター上または別々のベクター上に含むことができる発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクター導入後、細胞を１〜２日間富化培地で増殖させてから、選択培地に切り替えてもよい。選択可能マーカーの目的は、選抜に対する耐性を付与することであり、それが存在することによって、導入配列の発現に成功した細胞の増殖および回収が可能となる。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。そして、そのような細胞中で実質的に濃縮された細胞株を単離して、安定的な細胞株を生じることができる。
【００５７】
発現宿主として利用可能な哺乳動物の細胞株は当分野において既知であり、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞、サルの腎臓（ＣＯＳ）細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、バウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞、およびヒト肝細胞癌（例えばＨｅｐ Ｇ２）細胞、ならびにその他の多くの細胞株など、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。バキュロウイルス系では、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料が、特に、「ＭａｘＢａｃ」キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）として、キットの形で市販されている。
【００５８】
化学合成技術の例は、固相合成および液相合成である。固相合成としては、例えば、合成されるペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸を、有機溶媒中では不溶性の支持体に結合させ、適切な保護基で保護されたアミノ基および側鎖官能基を有するアミノ酸が、Ｃ末端からＮ末端まで一つ一つ順番に縮合される反応、および、樹脂またはペプチドのアミノ基の保護基に結合しているアミノ酸が放出される反応を交互に繰り返すことによって、このようにしてペプチド鎖が伸長する合成法がある。固相合成法は、用いる保護基の種類により、大きくは、ｔＢｏｃ法とＦｍｏｃ法に分けられる。一般的に用いられる保護基は、アミノ基に対してはｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル基）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル基）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル基）、Ｂｚｌ（ベンジル基）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル基）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル基）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基）、Ｔｒｔ（トリチル基）、Ｔｏｓ（トシル基）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル基）およびＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル基）などであり、グアニジノ基に対してはＮＯ２（ニトロ基）およびＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基）、およびヒドロキシル基に対してはｔＢｕ（ｔ−ブチル基）などである。所望のペプチドの合成後、保護基を脱保護反応にかけ、固体支持体から切り離す。このようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法ではフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸によって行うことができ、Ｆｍｏｃ法ではＴＦＡを用いて実施することができる。全合成ＣＣＬ２タンパク質は文献に開示されている（Ｂｒｏｗｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【００５９】
上記ホモ二量体形成ケモカインの合成または組換え単量体変異体の精製は、この目的にとって既知の方法のいずれか１つ、すなわち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを含む従来の処理法によって行うことが可能である。本発明のタンパク質を精製するために優先して用いることができる更なる精製処理法は、モノクローナル抗体またはアフィニティーグループを用いるアフィニティークロマトグラフィーであり、標的タンパク質を結合し、カラム内部に含まれるゲルマトリックス上で産生されて固定化される。タンパク質を含有する不純な調製物をカラム通過させる。タンパク質は、ヘパリンまたは特異的抗体によってカラムに結合するが、不純物は通過する。洗浄後、ｐＨまたはイオン強度を変えてタンパク質をゲルから溶出させる。あるいは、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いることもできる。タンパク質精製に広く用いられている水−アセトニトリル系溶媒を用いて溶出を行うこともできる。
【００６０】
ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症を治療または予防するための薬学的組成物に使用することができる。特に、多発性硬化症の動物モデルについての実施例で提供された結果は、これらの単量体変異体を、多発性硬化症を治療または予防するための薬学的組成物に使用できることを示している。
【００６１】
本発明の別の態様は、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体であって、該ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換によってできる変異体であり、薬物として使用される。このような変異体の例は、ＣＣＬ２−Ｐ８ＡおよびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａとして、本明細書中に開示されている。しかし、本明細書の教示により、他のケモカインの配列および活性に基づいて、類似分子を同定、産生および試験することが可能になる。
【００６２】
特に、これらの単量体変異体は、
ａ）ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（配列番号２）、
ｂ）ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（配列番号４）、
ｃ）（ａ）または（ｂ）の活性型突然変異体、または
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）を含むポリペプチド、および該ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列、
および、それらの活性画分、前駆体、塩類、誘導体、複合体または接合体の形になった、対応する単量体変異体から選択することができる。
【００６３】
本発明の別の態様は、有効成分としてホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を含む薬学的組成物であって、該変異体は、ＣＣＬ２−Ｐ８ＡまたはＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａなど、該ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から生じたものであり、選択的には、上記の形（活性型突然変異体、それらを含むポリペプチド、または結合体など）、およびそれらをコードするＤＮＡまたは発現する細胞の形になっている単量体である。
【００６４】
本発明の薬学的組成物は、動物への投与に適した、適切な薬学的に許容できる担体、生体適合的媒体および添加物（例えば生理食塩水）を含むことができ、最終的には、活性化合物を医薬上用いることができる調製物に加工しやすくする（賦形剤、安定剤または希釈剤のような）補助剤を含むことができる。薬学的組成物は、許容できる方法で調合して、投与方式の必要に適合させることができる。例えば、薬物送達のために生体材料およびその他のポリマーを用いること、また、特定の投与方式の有効性を確認するための様々な技術およびモデルも文献に開示されている（Ｌｕｏ Ｂ ａｎｄ Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ ＧＤ，２００１；Ｃｌｅｌａｎｄ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００６５】
「有効量」は、病気の経過および重度に影響を与えて、そのような病状を軽減または緩和するのに十分な有効成分の量を指す。有効量は投与経路および患者の状態に応じて決まる。
【００６６】
「薬学的に許容できる」は、有効成分の生物活性の効果を妨げず、投与される宿主に対して毒性を有さない担体を含むことを意味する。例えば、非経口投与するためには、上記活性成分を、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンゲル液のような媒体に入れて注射するための単位投与形態に処方することができる。また、担体は、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、ならびに、石油、動物、野菜または合成物に由来する油（ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油）などの様々な油から選択することもできる。
【００６７】
有効成分の所望の血中濃度を確立するために、当業者は、許容されているいかなる投与方法を用いることも、決定することもできる。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、経口、または口腔粘膜経路など、様々な非経口経路によることが可能である。非経口投与は、所定の速度で、好ましくは、正確な投薬量の単回投与に適した単位投与形態でポリペプチドを長時間にわたって投与するために、ボーラス注射によって、また、蓄積注射、浸透圧ポンプなど、時間をかけて次第に灌流するか、制御された放出投薬形態によって行うことができる。非経口投与のための調製物は、水性または非水性の無菌溶液、懸濁液、乳液などであり、当分野において既知の補助剤または賦形剤を含むことも可能であり、常法に従って調製することができる。また、活性化合物の懸濁液を適当な油性注射懸濁液として投与してもよい。適当な脂溶性溶媒または媒体には、例えばゴマ油などの脂肪油、または、例えばゴマ油のような合成脂肪酸エステル、または、例えばオイレン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルなどがある。懸濁液の粘度を増加させる物質を含むことができる水性注射用懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む。選択的には、該懸濁液は安定剤を含むことも可能である。薬学的組成物は、注射によって投与するのに適した溶液を含み、また、約０．０１〜９９％の、好ましくは２０〜７５％の活性化合物を、賦形剤とともに含む。直腸から投与することができる組成物は坐薬などである。
【００６８】
当然ながら、投与される用量は、被投与者の年齢、性別、健康状態、体重、もし受けているならば、同時に受けている治療の種類、治療頻度、および所望とする効果の性質に応じて異なると理解されるべきである。当業者に理解され、決定されているように、用量は、個々の被験体に応じて調整しなければならない。個々の治療に必要な総投薬量を複数回または単回で投与することができる。本発明の薬学的組成物は単独で、または当該症状に向けた別の治療薬、または該症状の別の病徴に向けられた他の治療薬とともに投与することができる。通常、有効成分の１日の用量は、体重１ｋｇあたり０．０１〜１００ｍｇである。分割投与または持続放出形態で投与されるときは、１日当たり１ｋｇにつき通常１〜４０ｍｇが、所望の結果を得るために有効である。２回目または後続の投与は、初回または前回各自に投与された用量と同一か、それよりも少ないか、または多い投薬量で実施することができる。
【００６９】
本発明の別の目的は、ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から得られた、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を有効量投与することを含む、自己免疫性または炎症性（多発性硬化症など）、または感染症を治療または予防する方法である。このような方法において用いることができる単量体変異体の例は以下のものである。
ａ）ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（配列番号２）、
ｂ）ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（配列番号４）、
ｃ）（ａ）または（ｂ）の活性型突然変異体、
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）を含むポリペプチド、および該ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列、
および、それらの活性画分、前駆体、塩類、誘導体、複合体または接合体の形になった、対応する単量体変異体。
【００７０】
本発明の使用、変異体および方法に関する、上記の自己免疫性、炎症性または感染症の非限定的なリストは以下の通りである。関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、骨関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、線維症、線維症、アレルギー性または過敏性の疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、癌、敗血症ショック、ウイルスまたはＨＩＶによる感染症、移植、気管支炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）およびアテローム性動脈硬化症。
【００７１】
本発明のポリペプチドおよび関連試薬の治療的用途は、動物の細胞、組織およびモデルを用いた、インビボまたはインビトロの測定法を用いて、（安全性、薬理動態および有効性について）評価することができる（Ｃｏｌｅｍａｎ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｉ ＡＰ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ｖｏｌ．１３８，「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ Ａ ｅｔ ａｌ．，編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，２０００；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．２８７ ａｎｄ ２８８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）。
【００７２】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法である。
ａ）ＣＣＬ２において、二量体化する能力を阻害する単一点突然変異を作出する工程、
ｂ）レセプターに結合して、インビトロでアゴニストの性質を示す該変異体を同定する工程、
ｃ）上記工程（ｂ）で同定された群から、さらに、腹膜細胞動員を阻害することを特徴とする該変異体を同定する工程。
【００７３】
これらの性質のこの評価法は、当分野において既知の伝統的な技術であり、実施例中において示されており、炎症および腹膜細胞動員を誘発することが知られている分子、例えば、ＣＣＬ２そのもの、チオグリコール酸またはオボアルブミンなどのケモカインを適用するものである。
【００７４】
特定の実施形態に関連して本発明を説明してきたが、その記載内容は、全ての改変および代用を含み、当業者は、請求の範囲の意味と目的を逸脱することなく実施することができる。
【００７５】
以下の実施例を用いて本発明を説明するが、それらを、本発明を限定するものとは決して解釈すべきではない。
【実施例】
【００７６】
実施例１：組換えタンパク質のクローニング、発現、および精製
成熟ＣＣＬ２（図１；配列番号１）およびＣＣＬ２−Ｐ８Ａ突然変異体タンパク質（図１；配列番号２）、成熟ＣＣＬ２＊（図１；配列番号３）、およびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ突然変異体タンパク質（図１；配列番号４）を、前駆体分子の２４〜９９位の分節に相当するヒトＣＣＬ２／ＭＣＰ−１の成熟型の配列に基づいて、文献（Ｐａａｖｏｌａ ＣＤ ｅｔ ａｌ，１９９８）に記載されたようにして、大腸菌において組換えタンパク質として作成および発現させた。ＣＣＬ２＊およびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａについては、６４位のメチオニンをイソロイシンで置換すると、６４位にメチオニン−スルホキシドを含む分子種が形成されるのを排除することによって、突然変異体の純度および均質性が向上する。
【００７７】
簡単に説明すると、大腸菌で発現させるのに最適なコドン使用と、成熟型のヒトＣＣＬ２またはＣＣＬ２＊をコードする配列の５’末端に付加されたメチオニンに対応するコドンを用いて、標準的な遺伝子合成技術によって、ＣＣＬ２＊に対するＣＣＬ２の遺伝子を構築した。８位にアラニンを含む突然変異体コンストラクトを、ＣＣＬ２またはＣＣＬ２＊を鋳型にポリメラーゼ連鎖反応による突然変異誘発法によって作出し、ｐＥＴ３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＸｈｏＩ部位とＮｄｅＩ部位の間にクローニングした。
【００７８】
ＣＣＬ２＊に基づくタンパク質をコードするプラスミドを用いてＴＡＰ３０２細胞を形質転換したが、この細胞は、細胞内酸化還元電位に、より確実にジスルフィド結合の形成をもたらせしめるよう、チオレドキシン還元酵素ノックアウトによって改造されているＢＬ２１ ｐＬｙｓ Ｓ細胞である。この系統を用いると、細胞でジスルフィド結合が形成されて、リフォールディング（再折り畳み）ステップの必要がなくなると考えられる。
【００７９】
コンストラクトは全て、標準的な分子生物学技術（ＰＣＲによる突然変異誘発および増幅、ＤＮＡ配列決定、制限酵素切断）によって取得および調節された。ＭＣＰ−１（Ｐ８Ａ）の正しい配列を含むクローンの１つを用いて、大腸菌の中でタンパク質を産生させた。また、このプラスミドを用いて、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号Ｃ−６０１０−０３）またはＢＬ２１ ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ社カタログ番号６９３８７−３）も形質転換した。
【００８０】
ＣＣＬ２、ＣＣＬ２＊、およびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａを、超音波破砕の工程、溶解工程、およびクロマトグラフィー工程（ＳＰ−セファロース・カラム；１０ｍＭ Ｋ２ＰＯ４，ｐＨ ７．５におけるＮａＣｌの勾配によって溶出）を用いて、原論文の記載通りに発現および精製する。ピーク画分をまとめ、逆相ＨＰＬＣ（５−μｍの粒子サイズおよび３００−Åの孔径をもつＣ１８カラム）によってさらに精製した。０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの勾配を次第に増加させてタンパク質を溶出したが、一般的には、タンパク質は、３４±５％アセトニトリルで溶出された。次に、それらを凍結乾燥させ、３５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８中で１ｍｇ／ｍｌに溶解し、１５μｇのアミノペプチダーゼ（ニュージャージー州、ロックヒル（Ｒｏｃｋ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）にあるＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社）／１ｍｇのタンパク質と室温にて３６時間反応させ、逆相ＨＰＬＣによって再精製した。アミノペプチダーゼ処理によって、Ｎ末端のメチオニンのみが取り除かれ、組換えタンパク質のＮ末端配列決定によって調べると、Ｎ末端グルタミンまたはＮ末端ピロ−グルタミン酸のいずれか（この違いによる生物活性への影響はない）が生じていた。
【００８１】
そして、このタンパク質を凍結乾燥し、水で１〜５ｍｇ／ｍｌに溶解して、小分けにして８０℃で保存した。
【００８２】
より大量の組換えタンパク質、また、特にはＣＣＬ２−Ｐ８Ａを、これらのタンパク質を産生する大腸菌菌株の大量発酵培養液から得られた細胞沈殿物から出発する精製を行うために設計された別プロトコールを用いても採取した。通常、５Ｌの発酵装置は、約２００ｇ湿重量の細胞沈殿物を産生し、５０Ｌの発酵装置は１．８ｋｇ湿重量の細胞沈殿物を産生する。ここに記載した精製処理では、２００ｇ湿重量の細胞沈殿物を処理する。
【００８３】
細胞沈殿物を融解して、グラム湿重量あたり３ｍｌの切断用バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ ８．０（カタログ番号２００９２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社））で、１０ｍＭのＭｇＣｌ２（カタログ番号６３０６５、Ｆｌｕｋａ社）、５ｍＭのベンズアミジン／ＨＣｌ（カタログ番号１２０７３、Ｆｌｕｋａ社）、１ｍＭの１，４ ＤＬジチオスレイトール（ＤＴＴ）（カタログ番号４３８１９、Ｆｌｕｋａ社）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（カタログ番号７８８３０、Ｆｌｕｋａ社）＊、２０ｍｇ／Ｌ ＤＮａｓｅ（Ｆｌｕｋａ社）（カタログ番号ＤＮ−２５、Ｓｉｇｍａ社）を含むものを加えた。この懸濁液をポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）でホモジナイズして、断片や塊を含まない良好なホモジネートを得た。全ての操作を４℃で行った。ホモジナイズした細菌懸濁液を、フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ）機械的細胞破砕装置（差圧）に移し入れた。パッセージの回数は、一般的には、１５００バールで２〜４時間であった。細胞の破砕を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをクマシー・ブルーで染色して測定した。
【００８４】
ライセートをＧＳＡ遠心分離管に分注して、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ５Ｃ（１６，３００×ｇ）により４℃で９０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上清中に目的の可溶性タンパク質が検出できないことをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した後上清を捨てた。沈殿物をスパチュラで遠心分離管から取り出して、予め重さを量っておいたビーカーの中に移して、沈殿物の重さを量った。ビーカー中で、この沈殿物１ｇあたり５ｍｌの脱イオン水を加え、マグネチック・スターラーを用いて４℃で３０分間撹拌して沈殿物を洗った。この懸濁液を、ＧＳＡ遠心分離管に入れ、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ５Ｃ（１６，３００×ｇ）を用いて４℃で６０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。この洗浄工程を３回繰り返した。各遠心分離の後、上清中に目的の可溶性タンパク質が検出できないことをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した後上清を捨てた。
【００８５】
この沈殿物を、１ｍＭの１，４ ＤＬジチオスレイトール（ＤＴＴ）（カタログ番号４３８１９、Ｆｌｕｋａ社）および６ Ｍのグアニジウム／ＨＣｌ（カタログ番号５０９５０、Ｆｌｕｋａ社）を含む、調製したばかりの封入体抽出用バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ ８．０（カタログ番号２００９２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社）に、細胞沈殿物２５ｇあたり１００ｍｌのバッファーという割合でポリトロンを用いて可溶化した。この溶液を６０℃で３０分間加熱してから撹拌して、確実に単量体化した後、室温まで冷却した。このホモジネートをＴｉ４５遠心分離管に分注して、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ−６０（１００，０００×ｇ）を用いて３５，０００ｒｐｍで超遠心分離した。上清を０．８〜０．２ｍｍフィルター（ＳｐｉｒａｌＣａｐ（カタログ番号１２０６９、ＰＡＬＬ社）で濾過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、クマシー蛋白質測定試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社）を、キットとともに配布されたプロトコールに従って用いて定量した。
【００８６】
目的とする組換えタンパク質を、供給業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の指示に従って充填されたＳｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣ樹脂を含むＦｉｎｅＬｉｎｅ ３５ Ｐｉｌｏｔカラム上に捕捉した。使用後、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）によって提供された洗浄処理法に従って、カラムを再生させる。細胞沈殿物１００ｇに対して、直径３．５ｍｍ×高さ２３ｃｍのカラムに全部で２２０ｍｌ（１カラム容量に等しい）のＳｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣを充填する。このカラムを、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に据える。流速を１０ｍｌ／分とし、最大圧力を１ ＭＰａにした。試料をロードする前に、脱イオン水で２カラム容量分（４４０ｍｌ）を洗浄した。洗浄後、発煙３７％ＨＣｌ（カタログ番号８４４２６、Ｆｌｕｋａ社）でｐＨ ７．５に調整された５ ＣＶ（カラム容量）の平衡化用バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（カタログ番号２００９２３９１：Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社）で平衡化した。
【００８７】
グアニジウム／ＨＣｌに溶解させたＩｂｓ（封入体）を、５ｍｌ／分というゆっくりとした速度でカラム上にロードした。そして、５カラム容量の平衡化用バッファーで洗浄した後、５ ＣＶのバッファーＡ（０．１％ ＴＦＡトリフルオロ酢酸（カタログ番号２８９０４、Ｐｉｅｒｃｅ社）および９９．９％の蒸留水）でカラムを洗浄した。バッファーＢ（０．１％ ＴＦＡトリフルオロ酢酸（カタログ番号２８９０４、Ｐｉｅｒｃｅ社）、９．９％の蒸留水、９０％アセトニトリル（ＵＮ１６４８、Ｂａｋｅｒ社））の０％から１００％までの直線的勾配を用いて、流速１０ｍｌ／分、および１ ＭＰＡ圧力限界で１０ ＣＶにわたってタンパク質を溶出する。１０ｍｌの画分を回収した。検出されたピークは全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣによって分析し、ＵＶ−分光法によって定量した。目的のタンパク質を含む画分を集めて、その量をＵＶ−分光法によって測定した。
【００８８】
タンパク質を、０．１ｍＭの還元型グルタチオン（カタログ番号Ｇ−４２５１、Ｓｉｇｍａ社）および０．０１ｍＭの酸化型グルタチオン（カタログ番号１２０ ０００ ２５０、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃ社）を含む復元用バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ ８．０（カタログ番号２００９２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社）に１０倍希釈することにより復元して、約０．１ｍｇ／ｍｌという最終濃度を得た。Ｓｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣを集めたものを一滴ずつ復元用バッファーに加えた。容量が大きい場合には、蠕動ポンプを用いてこれを行うことも可能である。溶液を４℃で一晩撹拌した。この溶液は、復元されていないタンパク質が沈殿するため、しばしば曇って見える。復元用バッファーにおける最終濃度０．１から０．４ｍｇ／分の範囲で、等量の復元されたタンパク質が得られた（４０〜５０％）。出発材料のｐＨおよびアセトニトリルは、復元工程に影響しない。復元の後、ＨＰＬＣによってリフォールディングを追跡することも可能である。
【００８９】
０．８ｍｍのプレフィルターの後に０．２２ｍｍのフィルターからなる二重フィルター付き高流量蠕動ポンプを用いて復元溶液を濾過した。次に、清澄になった溶液を、ＵＶ−スペクトルによって定量した後Ｈｉｌｏａｄ ＳＰセファロースＨＰ上のカチオン交換によって濃縮した。イオン交換カラムのサイズは、タンパク質の量に依存する。５００ミリグラムよりも少ないときは、１６／１０カラム（１ ＣＶ＝２０ｍｌ）、５００〜１０００ｍｇのときは２６／１０カラム（１ ＣＶ＝５０ｍｌ）、また、１〜２グラムのときは５０／５カラム（１ ＣＶ＝１００ｍｌ）を用いた。
【００９０】
カラムは、供給業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の指示に従って充填した。カラムを２ ＣＶの脱イオン水で洗浄してから、４ ＣＶのカチオン交換バッファーＡ（ＮａＯＨ（カタログ番号７１６９０（Ｆｌｕｋａ社））でｐＨを４．５に調整した５０ｍＭ酢酸（Ｆｌｕｋａ社））で平衡化した。溶液を、酢酸でｐＨ ４．５に調整し、伝導率を１０ ｍＳより小さくなるよう調整した。選択したカラム毎に供給業者の推奨する流速でタンパク質溶液をロードした後、５ ＣＶのバッファーＡでカラムを洗浄した。０％から１００％までのバッファーＢ（２ Ｍ ＮａＣｌ（カタログ番号７１３８０（Ｆｌｕｋａ社）を含むバッファーＡ）の直線勾配を用いて、２０ ＣＶにわたってタンパク質を溶出した。画分のサイズは、カラムのサイズに応じて決まった。検出されたピークは全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣによって分析し、ＵＶ−分光法によって定量した。解析後、ＡＳ９００６５２を含む画分を集めて、ＵＶ−スペクトルで定量し、ＨＰＬＣで分析した。
【００９１】
メチオニン・アミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を用いて酵素的にＮ末端メチオニンの除去を行った後、精製工程を行った。簡単に説明すると、試料は、まず、３．５ ｋＤのカットオフ値で膜チューブを用いて透析して、切断用バッファー（３５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ ７．５（カタログ番号２００９２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社）の中に入れた。透析用バッファーを２４時間の間に３回変えた。メチオニン・アミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を、１：１００００（Ｗ：Ｗ、酵素：タンパク質）の比率でタンパク質溶液に加えた。切断を室温で４８時間行った。次に、切断されたタンパク質を、上記したようにカチオン交換によって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価すると、タンパク質は純度９８％よりも高かった。
【００９２】
ＡＫＴＡ精製装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、所望のタンパク質をさらに精製した。この装置を１ Ｍ ＮａＯＨで１時間クリーニングし、滅菌水で洗浄し、０．２２ｍｍフィルターで濾過したバッファー（０．１％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（カタログ番号２８９０４、Ｐｉｅｒｃｅ社）および９９．９％の蒸留水）で平衡化した。Ｇ−２５ファイン・セファロースＸＫ５０／３０カラムを用いてタンパク質を脱塩した。カラムを、１ ＣＶの１ Ｍ ＮａＯＨその後４ ＣＶの滅菌水で洗浄してから、５ ＣＶの０．１％ ＴＦＡで平衡化した。最適な脱塩条件のために、４５０ｍｌのＧ−２５ファイン・セファロース上で、５０から１００ｍｌの試料を脱塩する。容量が１００ｍｌよりも大きくなるまで、この脱塩工程を繰り返す。試料は、ロードする前に０．２２ｍｍフィルターで濾過した。流速１０ｍｌ／分および最大圧力１ ＭＰａで、１．５ ＣＶの０．１％ ＴＦＡによってカラムを溶出する。１０ｍｌの画分を滅菌チューブの中に回収する。解析後、タンパク質を含む画分を集め、無菌条件下ＵＶ−スペクトルで定量し、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および質量分析法で解析する。
【００９３】
ＤｅｌｔａＰｒｅｐ ＨＰＬＣ（ＷＡＴＥＲＳ社）の予備的な逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）を用いて、残留した混入物を取り除く。試料を、０．１％ ＴＦＡに酸性化し、バッファーＡ（０．１％ ＴＦＡトリフルオロ酢酸（カタログ番号２８９０４、Ｐｉｅｒｃｅ社）および９９．９％の蒸留水）で平衡化したＶｙｄａｃ Ｃ８ ＲＰＣ（カタログ番号２０８ＴＢ１０１５２２、Ｖｙｄａｃ社）上にロードした。バッファーＢ（０．１％ ＴＦＡトリフルオロ酢酸（カタログ番号２８９０４、Ｐｉｅｒｃｅ社）、９９％アセトニトリル（ＵＮ１６４８、Ｂａｋｅｒ社））の０％から１００％までの直線的勾配を用いて、流速２５ｍｌ／分および７００バールの圧力限界で１０ ＣＶにわたってタンパク質を溶出した。検出されたピークは全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣによって分析し、ＵＶ−分光法によって定量した。解析後、ＡＳ９００６５２を含む画分を集めて、ＵＶ−スペクトルで定量し、必要に応じて小分けにしてから凍結乾燥させた。タンパク質は、−２０℃または−８０℃で保存する。
【００９４】
組換えタンパク質は、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｕｖｉｋｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ＫＯＮＴＲＯＮ社）を用い、ＵＶ分光分析法によって定量する。水晶製キュベット（ＱＳ １．０００，ＨＥＬＬＭＡ社）をバッファーの参照用に用い、もう一方のキュベットが試料を含む。３５０ ｎｍから２４０ ｎｍまでのスキャン結果を測定し、また、２８０ ｎｍにおける吸光度を用いて、ＰｒｏｔＰａｒａｍ，Ｅｘｐａｓｙを用いてアミノ酸組成物から得られた吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を基準として、定量を測定した。
【００９５】
ＮｕＰＡＧＥ １０％ゲル（カタログ番号ＮＰ０３０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。試料用バッファー（カタログ番号ＬＣ２６７６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で試料を２倍に希釈し、９５℃で５分間加熱した。標準用タンパク質ラダーを分子量の基準として用いた。１０μｌの分子量標準溶液と２０μｌのタンパク質試料を適当なウエルにロードした。電気泳動用バッファーはＭＥＳ（カタログ番号ＮＰ０００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）であった。泳動は、供給業者の指示に従って、２００Ｖ、１２ｍＡ、および２５Ｗで３５分間（ＰｏｗｅｒＥａｓｅ５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で行った。
【００９６】
ＮｕＰＡＧＥゲルを、蒸留水中１０％酢酸、３０％メタノールの中で０．１％ Ｒ２５０クマシー・ブルーによって３０分間染色し、蒸留水中１０％酢酸、３０％メタノールの中で、ゆっくりと揺らしながらバックグラウンド量が無色になるまで脱染した。そして、ゲルを水で何度か洗浄した後、２枚のセロファン紙（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の間に挟んで乾燥用溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の中に１０分間埋め込んでから、ミニチュアプレスに載せて、ゲルが薄いシートとして保存できるようにした。または、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ染色プロトコール（カタログ番号ＬＣ６０６５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて染色した。
【００９７】
ウォーターズ（ＷＡＴＥＲＳ）社から入手したＡｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ装置を、０．１％ ＴＦＡに平衡化した解析用Ｃ８ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００ ７ｍ（直径０．２ｃｍ×２２ｃｍ）とともに用いた。予め酸性化しておいた１０〜５０ｍｇの最終０．１％ＴＦＡを注入した。タンパク質は、２５〜５０％のアセトニトリルの勾配により２０ ＣＶにわたり溶出した。
【００９８】
質量スペクトル解析およびＮ末端配列解析によって、組換えタンパク質の同一性を確認した。精製された材料について、正しいＮ末端配列であるＱＰＤＡＩＮＡＡＶＴが得られた。
【００９９】
主な分子種については、２つのジスルフィド結合をもつタンパク質鎖の理論上の質量に対応する質量である８６５５ Ｄａが得られた。Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸に修飾されたものに対応する、１７ Ｄａの小さな質量をもつ別の分子種も観察された。この修飾が存在しても、タンパク質の活性には影響を与えない。
【０１００】
実施例２：細胞アッセイ法
材料および方法
ケモカイン誘導による腹膜細胞動員の測定法
８から１２週の雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を、通常の動物を閉じこめる条件の下で、標準的な１２時間の明／暗周期で飼育、食餌と水を自由に与えて飼育した。３〜６匹のマウスからなるグループに、２００μｌの食塩水（ＬＰＳを含まないＮａＣｌ ０．９％（ｗ／ｖ））、または２００μｌのこの溶液に、１回の注射あたり１０μｇのＣＣＬ２またはＣＣＬ２−Ｐ８Ａを含むものを腹腔内注射した。ＣＣＬ２誘導による腹膜細胞動員に対するＣＣＬ２−Ｐ８Ａの阻害効果を調べる研究では、これらの分子を、ＣＣＬ２を腹腔内注射する３０分前に腹腔内に投与した。全ての分子は、上記した濃度とバッファー（食塩水）で投与された。ＣＣＬ２またはＣＣＬ２−Ｐ８Ａを最後に注射してから４時間たったところでマウスを殺処理した。
【０１０１】
チオグリコール酸誘導による腹膜細胞動員の測定法が公開されている（Ｍｉｓｈｅｌｌ Ｂ，１９８０）。簡単に説明すると、３０ｇの無水チオグリコール酸培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を１リットルの冷たい蒸留水に懸濁し、次に、沸騰するまで加熱して粉末を完全に溶かしてチオグリコール酸培地を調製した。そして、この培地を、１００ｍｌボトルに分けてオートクレーブした。冷却した後、培地を室温暗黒下で少なくとも１ヶ月保存した。１日目にＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａを投与した３０分後に２００μｌの３％チオグルコール酸溶液を３匹のグループのマウスに腹腔内注射して細胞動員を誘導した。その後３日間ＣＣＬ２＊を投与した（２、３、および４日目）。デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社）は、陽性対照として使用され、１０ｍｇ／ｋｇで腹膜内から投与された。５日間たったところでマウスを殺処理した。
【０１０２】
前記アッセイにおける細胞動員を評価するために腹腔洗浄を以下のように行った。マウスをプレキシグラス製の箱の中でＣＯ２の濃度を上げて窒息させた。７０％エタノールで皮膚を消毒した。皮膚の外層を取り除いて、腹膜を露出させた。５ｍｌの氷冷ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で腹腔を３回洗浄して、液体を、氷上に置いた１５ｍｌのポリスチレン製のＦａｌｃｏｎチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に集めた。各洗浄をするときには、腹腔を軽くマッサージした。洗浄液を４２５×ｇで遠心分離し、上清を捨て、得られた細胞沈殿物を、１ｍｌのＰＢＳにやさしく何度もピペッティングして再懸濁した。１０μｌの細胞懸濁液を９０μｌのトリパンブルーで染色し、Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計算器を用いて、各１ｍｍ2の領域４つで計数して、全細胞数を数えた。血球計算器に添付されている使用説明書に従って、４つの計数結果の平均値を出して、希釈係数１０を掛け、再び１０を掛けて、１μｌあたりの細胞数を算出した。最後に、この総数を１０００倍（１ｍｌに等しい）して、回収した全細胞数を得た。
【０１０３】
結果
成熟した組換えヒトＣＣＬ２／ＭＣＰ−１およびＣＣＬ２＊と呼ばれる突然変異型、ならびに、これらに対応するＣＣＬ２−Ｐ８Ａ および ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（図１）と呼ばれる絶対的単量体突然変異体を大腸菌の中で発現させた。
【０１０４】
文献には、ＣＣＬ２におけるＰ８Ａ突然変異が、レセプターを発現する細胞や、ウイルスレセプター様タンパク質に対する結合に影響することなく、しかし、関連したアッセイ法において既知のＣＣＬ２アンタゴニストの活性を示すこともなく、ＣＣＬ２二量体の形成を阻害することが明確に示されている（Ｐａａａｖｏｌａ ＣＤ ｅｔ ａｌ．，１９９８の表１記載の（１＋９−７６）ＭＣＰ−１参照；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【０１０５】
ＣＣＬ２の絶対的単量体型は、細胞に基づいたアッセイ法で行われるアッセイにおいて、特異的かつ意外な性質を示す。腹膜細胞動員アッセイにおいて、ＣＣＬ２＊−Ｐ８ＡおよびＣＣＬ２−Ｐ８Ａは、天然のＣＣＬ２ほど細胞を動員することができない（図２）。さらに、これらの分子は、用量依存的な様式で、ＣＣＬ２誘導による（図３Ａ）、およびチオグリコール酸誘導によるマクロファージ動員を阻害することができる（図３Ｂ）。後者のアッセイにおいて、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａは、陽性対照（デキサメタゾン、既知の炎症性化合物）と同じくらい効果的に見える。
【０１０６】
実施例３：動物の疾患モデルにおけるＣＣＬ２−ｐ８Ａの性質
材料および方法
オボアルブミン誘導による肺炎症モデル
オボアルブミン誘導による肺炎症モデルは、公開されているように実施されていた（Ｂｌｙｔｈ ＤＩ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。２５μ１のオボアルブミン（２ｍｇ／ｍｌ）、２５０μｌの水酸化アルミニウムを、ＬＰＳを含まない０．９％ ＮａＣｌ（食塩水）７２５μｌの中で混合してから、４℃で３〜４時間沈殿させて調製したものである、２ｍｇの水酸化アルミニウム２％（Ｓｅｒｖａ）に沈殿させた１０μｇの鶏卵アルブミンを全容量２００μ１にしたものを腹腔内注射して、６匹のマウスのグループに感作した。感作してから１５日後、１５日目から１９日目まで毎日、吸入麻酔（イソフルレン）下で、５０μｌの食塩水に入れた１５μｇのオボアルブミンを鼻腔内投与して６匹のマウスのグループを処理および抗原投与した。各抗原投与の３０分前に、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（２００μｌ、腹腔内注射１回分あたり１０μｇ）を投与した。細胞動員および細胞計測数を評価するために、上記実施例２に記載されたように腹腔内洗浄を行った。
【０１０７】
ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）モデル
チャールズリバー・イタリー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｔａｌｙ：ＥＡＥに対する感受性が記録されている選抜系統；Ｓａｈｒｂａｃｈｅｒ ＵＣ ｅｔ ａｌ．，１９９８）に由来するＣ５７Ｂ１／６マウスを、０．５ｍｇのヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ，Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に入った２００μｇのＭＯＧ35-55ペプチド（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）からなる乳液０．２ ｍＬを左脇腹に皮下注射することにより免疫する（０日目）。その直後、４００μＬのバッファー（０．５ Ｍ ＮａＣｌ，０．０１７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０．０１５ Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ＝７．５）に溶解した５００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂ社、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）の静脈注射を受ける。２日目に、動物に５００ｎｇの百日咳毒素の２回目の静脈注射をする。７日目に、２回目の投薬である、ＣＦＡに入った２００μｇのＭＯＧ35-55ペプチドを右脇腹に皮下注射して、マウスに投与する。ほぼ８日から１０日目に始まって、この処理は、尻尾から前肢まで上ってくる少しずつ進行する麻痺をもたらす。７日目から、以下の臨床スコアを用いて、麻痺が存在するか、動物を個体ごとに試験した。；
０＝病気の徴候ない
０．５＝尾の部分的麻痺
１＝尾の麻痺
１．５＝尾の麻痺＋部分的な片側性の後肢の麻痺
２＝尾の麻痺＋後肢が弱る、または部分的な後肢の麻痺
２．５＝尾の麻痺＋部分的な後肢の麻痺（骨盤下部）
３＝尾の麻痺＝完全的な後肢の麻痺
３．５＝尾の麻痺＋完全的な後肢の麻痺＋失禁
４＝尾の麻痺＋後肢の麻痺＋前肢の弱りまたは部分的麻痺
５＝瀕死または死亡
【０１０８】
化合物または媒体による治療を、免疫後７日目に各動物に対して開始し、２１日間継続する（処理グループあたり動物１０〜１２頭）。インターフェロン−βとＣＣＬ２−Ｐ８Ａを、１日に１回、１０ｍｌ／ｋｇ ＰＢＳに可溶化させて、図に示した容量でそれぞれ皮下または静脈内に投与した。
【０１０９】
遅延型接触過敏症モデル
接触過敏症を測定するためにマウス耳介腫脹（ｅａｒ−ｓｗｅｌｌｉｎｇ）試験を、前述のように行った（Ｇａｒｒｉｇｕｅ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。簡単に説明すると、アセトン／オリーブ油（４：１）中０．５％の２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）溶液２５μ１を、毛を剃った腹に局所的に施用してマウスを感作した。５日後、同じ媒体中の０．２％ ＤＮＦＢを右耳に適用し、媒体だけを左耳に適用した。５日目にマウス（１グループあたりｎ＝６）を、０．０５、０．５または５ｍｇ／ｋｇ（それぞれ１、１０または１００マイクログラム／マウス）のＣＣＬ２−Ｐ８Ａ、デキサメタゾン（１ｍｇ／ｋｇ）、または対照グループではＰＢＳだけを腹腔内投与して処理した。この処理は、ＤＮＦＢを投与する３０分前に行われた。ダイアル式厚さ測定計（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社）で耳の厚さを測定した。投与後の値から投与前の値を引いて、また、さらに、媒体投与された反対側の耳で検出された膨張を全て引いて、耳の膨張を評価した。
【０１１０】
結果
ケモカインアンタゴニストとしてのＣＣＬ２−Ｐ８Ａの治療薬作用の可能性を、炎症および自己免疫疾患の動物モデルで試験した。
【０１１１】
ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａを疾患モデルである、オボアルブミン誘導による肺炎で試験した。アレルギー性肺炎のこの古典的なモデルでは、免疫反応を増強するために感作期間中水酸化アルミニウムのアジュバントとともにオボアルブミンでマウスを感作し、その後、５日間連続してオボアルブミンを鼻腔内投与して抗原投与するが、この期間中ずっとＣＣＬ２−Ｐ８Ａを腹腔内投与した。また、この場合、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａは、細胞動員を阻害することができた（図４）。
【０１１２】
第２のモデルでは、ヒトの中枢神経系の自己免疫性の炎症性脱髄疾患を治療するためのケモカイン（ＣＣＬ２を含む）のアンタゴニストを確認するために利用されてきた周知の多発性硬化症モデルであるＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）モデルでＣＣＬ２−Ｐ８を試験した（Ｍａｈａｄ ＤＪ ａｎｄ Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ ＲＭ，２００３；Ｉｚｉｋｓｏｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＣＣＬ−Ｐ８Ａは、ＥＡＥ誘発化合物で処理した後、臨床スコアで評価すると中程度または重度の病気を示す動物で試験した。これら２つの動物グループをそれぞれ５つのサブグループに分け、うち３つを異なった量のＣＣＬ２−Ｐ８Ａで処理し、残りの２つを陰性対照（媒体のみで処理した）または陽性対照（多発性硬化症を治療するための一般的な治療用産物であるインターフェロン−βで処理した）として用いた。動物の状態の変化を、処理期間（２１日間）中に測定した臨床スコアに基づいて比較した。両疾患モデルにおいて、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（０．１５ｍｇ／ｋｇまで低下させた投薬量で）は、統計学的に有意に動物の状態を改善する。ＣＣＬ−Ｐ８Ａを用いたときに観察される臨床スコアの減少は、少なくとも、インターフェロン−βを治療薬として用いたときに観察される臨床スコアの減少に匹敵する。（図５）。
【０１１３】
別の疾患モデルである接触過敏症モデルを用いて、Ｔ細胞によって仲介される皮膚炎に対するＣＣＬ２−Ｐ８Ａの治療効果の可能性を評価した。接触過敏症（ＣＨＳ）は、ランゲルハンス細胞（ＬＣ）依存性のＴ細胞介在型皮膚免疫反応で、インビボにおけるＬＣ活性（皮膚上抗原の取り込み、リンパ節への移動、および無処理Ｔ細胞への抗原提示）が最高になっていることを反映するものである。このモデルは、乾癬およびアレルギー性接触皮膚炎のような皮膚科学的適応症に対する化合物の特徴を調べるために十分に確立されている（Ｘｕ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９６）。それは、感作期間およびその後の抗原投与を含み、皮膚の浮腫および細胞浸潤物の形成を伴う皮膚炎をもたらす。浮腫は、抗原投与部位（マウスの耳）でノギスにより測定することができる。この過剰反応疾患の発症におけるケモカインの関与、特にＣＣＬ２の関与が示されていた（Ｍｉｔｓｕｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍｉｚｕｍｏｔｏ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。抗原（この場合ＤＮＦＢ）を投与する３０分前にＣＣＬ２−Ｐ８Ａを腹腔内投与すると、処理後１日で、既知の抗炎症性化合物（デキサメタゾン）を用いたときに観察される膨張の減少に匹敵し得る膨張の減少がもたらされる。対照用マウスは、抗原投与して得られたが、その前に感作させるか、させないで、Ｔ細胞依存性炎症および浮腫が形成されるか否かが決まる（図６）。
【０１１４】
したがって、ホモ二量体形成ＣＣ−ケモカインの単量体変異体であって、二量体化界面における水素結合パターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換によって生じた変異体は、インビボ細胞動員アッセイ法において、またヒト疾患の動物モデルにおいても、ケモカイン仲介型細胞動員のインヒビターであるが、このことは、これが、薬学的組成物を調製するために使用することができ、また治療法において使用することもできるケモカイン変異体を作成するための新しい方法であることを示唆している。
【０１１５】
実施例４：ＣＣＬ２−Ｐ８Ａの代替型
上記開示されたケモカイン変異体の代替型を、特定の特徴を改善するものとして当分野で既知の突然変異を導入することによって作成することができる。
【０１１６】
ＣＣＬ２−Ｐ８Ａの異なる位置に１つ以上の単一アミノ酸の置換および／または付加を導入することができる（図７Ａ）。ＣＣＬ２−Ｐ８Ａは、天然のグルタミンＮ末端残基を失った成熟タンパク質として、または、グルタミンの前のＮ末端に付加的な小型の残基（アラニンやグリシンなど）を付加して発現させることができ、その結果、この残基は露出した状態に置かれることなく、ピログルタミン酸型に自然に変換されることがなくなる（Ｇｏｎｇ Ｊ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−ＬｅｗｉｓＩ，１９９５）。また、ＣＣＬ−Ｐ８Ａは、５番目のシステインを利用して特異的ペグ化反応が可能になるよう突然変異させることもできる。これらのペグ化部位は、内部アミノ酸（例えば、１回の改変で単量体化とペグ化の両方をもたらすことができる１４位または１７位のアスパラギン、およびさらには８位）、またはＣ末端（天然のＣ末端スレオニンの後ろにシステインを直接付加することによる）のいずれかのレベルで取り込むことが可能である。
【０１１７】
この配列を、循環血液中における組換えタンパク質の安定性と有効性を向上させることが知られているタンパク質ドメインである、免疫グロブリンドメインの定常領域に融合させることによって、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａのさらなる変異体を得ることができる。得られた融合タンパク質は、融合タンパク質を培養培地に分泌させるのに適した発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞など）によって直接発現させることができる。好ましい構成において、成熟型ＣＣＬ２−Ｐ８Ａをコードする核酸配列は、５’末端においてヒトＣＣＬ２のシグナル配列をコードする核酸配列、および３’末端においてヒト免疫グロブリンのラムダ重鎖ＩｇＧ１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＡＡ７５３０２）の定常領域（セグメント２４６〜４６７）をコードする核酸配列に融合している発現ベクターの中にクローニングされる。得られたベクターを用いてＣＨＯ細胞株またはＨＥＫ２９３細胞株を形質転換することができ、Ｎ末端にＣＣＬ２−Ｐ８Ａ、Ｃ末端にＩｇＧ１配列を有する組換え融合タンパク質を安定して発現および分泌するクローン（図７Ｂ）を選択することができる。そして、生産規模を上げるため、および培養培地から組換え融合タンパク質を精製するためにこのクローンを用いることができる。あるいは、ヒト免疫グロブリンのラムダ重鎖ＩｇＧ１の定常領域（セグメント２４３〜４７４）とＣＣＬ２−Ｐ８Ａをコードする核酸の位置を逆にすることもでき、得られたタンパク質を、依然としてヒトＣＣＬ２のシグナル配列を用いるか、任意の別のシグナル配列を用いて発現および分泌させることができる。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ヒト成熟ＣＣＬ２（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ１３５００、配列番号１）、成熟ＣＣＬ２＋Ｐ８Ａ（配列番号２）、成熟ＣＣＬ２＊（配列番号３）、成熟ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（配列番号４）のアミノ酸配列。ＣＣＬ２＊およびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａの第６４位におけるイソロイシンへの突然変異（Ｍ６４Ｉ）が四角で囲まれており、関連突然変異Ｐ８Ａをボールド体と下線で示す。
【図２】腹膜細胞動員アッセイ法において、組換えヒトＣＣＬ２およびＣＣＬ２−Ｐ８Ａの細胞動員活性をベースラインと比較したグラフ。
【図３】２種類の異なる誘導物質であるＣＣＬ２（図Ａ）またはチオグリコール酸（図Ｂ）を用いた、腹膜細胞動員アッセイ法におけるＣＣＬ２−Ｐ８Ａの用量応答阻害活性を示すグラフ。結果を、ベースライン量、陰性対照（媒体のみ、食塩水）および陽性対照であるデキサメタゾン（Ｄｅｘ、図Ｂのみ）と比較する。
【図４】オボアルブミン誘導肺炎症アッセイ法におけるＣＣＬ２−Ｐ８Ａの阻害活性を示すグラフ。結果を、ベースライン量、および陰性対照（食塩水）と比較する。
【図５】ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）と呼ばれる多発性硬化症の動物モデルにおいて、動物が、臨床スコアの低い（２以下：Ａ）軽い病気か、または、臨床スコアの高い（少なくとも３：Ｂ）重い病気を示す場合に、臨床スコアの減少に対するＣＣＬ２−Ｐ８Ａの効力を示すグラフである。データを、媒体のみ（陰性対照）、または、ＥＡＥモデルに関する陽性対照（マウスのインターフェロンβ）を用いて観察されるデータと比較してある。各グラフの下にあるアステリスクの数は、各時点で陰性対照と比較した場合に見られた効果の統計的有意性の程度を示している（一元配置分散分析の後にフィッシャー検定して計算すると、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、および＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する）。
【図６】皮膚炎の動物モデル（感作されたマウスの耳にＤＮＦＢによって引き起こされる炎症）に様々な用量で投与された場合のＣＣＬ２−Ｐ８Ａの阻害活性、すなわち、処理後の耳の膨潤容積に対するＣＣＬ２−Ｐ８Ａの効果を示すグラフであって、以下の対照と比較したものである。感作されていないが、５日目にＤＮＦＢを抗原投与された動物（Ａ）、感作され、抗原を投与されたが、媒体のみで処理された動物（Ｂ）、およびデキサメタゾン（Ｄｅｘ、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａと同じ方法で投与された）で処理された動物。値は、６日目（処理および抗原投与後の日数）に測定された。
【図７】単一／複数のアミノ酸付加および／または置換によって（Ａ）、または、ヒト免疫グロブリンのλ重鎖ＩｇＧ１の第２４３〜４７４位の残基への融合（Ｂ、ＣＣＬ２シグナル配列を二重下線で、成熟型ＣＣＬ２−Ｐ８Ａを下線で示す）によって生成することができるＣＣＬ２−Ｐ８Ａの代替形態。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケモカイン変異体、および具体的にはヒトＣＣＬ２変異体の新規の治療への使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、小さな分泌性の炎症促進性タンパク質であり、白血球が指向的に血液から傷害部位へと移動するのを仲介する。ケモカインファミリーは、このタンパク質ファミリーの特徴である保存的システインの位置によって、一連の膜受容体に結合するＣケモカイン、Ｃ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、およびＣ−Ｘ3−Ｃケモカインに構造的に分けることができる（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＥＪ ａｎｄ Ｌｏｌｉｓ Ｅ，２００２）。
【０００３】
これらの膜受容体は、全て７へリックス（ｈｅｐｔａｈｅｌｉｃａｌ）Ｇ−タンパク質共役レセプターであり、ケモカインが標的細胞上でその生物学的活性を発揮するのを可能にし、それらの状態および／または種類によってレセプターの特異的な組み合わせを提示することができる。ケモカインの生理学的作用は、同時発生的な相互作用の複雑かつ集積的なシステムによるものであり、これらのレセプターは、しばしば、重複するリガンド特異性を有するため、単一のレセプターが異なったケモカインに結合し、また、単一のケモカインが異なったレセプターに結合することができる。
【０００４】
ケモカインは、通常、傷害部位で産生され、白血球の遊走および活性化をもたらし、炎症、免疫、ホメオスタシス、造血および血管形成のプロセスにおいて基本的な役割を果たしている。ケモカインを治療薬として使用することに短所となる点（具体的には、凝集しやすく、無差別に結合すること）があったとしても、これらの分子は、特異的なケモカインおよびそれらのレセプターを、白血球の過剰な動員および活性化を防止する目的で阻害することにより、上記プロセスに関連した病気への治療的介入を行うための優れた標的候補物質であると考えられている（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ Ｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ，２００１；Ｇｏｄｅｓｓａｒｔ Ｎ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ ＳＬ，２００１）。
【０００５】
構造と活性の関係について調べると、ケモカインには、それらのレセプターと相互作用する可動アミノ末端領域（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）、および２番目のシステインの後にある、立体配置的に固定したループ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｉｇｉｄ ｌｏｏｐ）という、２つの主な部位があることが示される。ケモカインは、ループ領域を用いてレセプター上にドッキングし、この接触によってアミノ末端領域の結合が促進され、レセプターの活性化をもたらす。このようにアミノ末端領域が重要なことは、このドメインを改変または短くした天然および合成のケモカインを試験することによっても明らかになっている。アミノ酸のタンパク質分解、突然変異誘発、または化学修飾の後にこのような処理を行うと、これらの分子を活性化または不活性化することができ、アゴニストおよび／またはアンタゴニストとしての活性を有する化合物を生成する。このように、アミノ末端領域を特異的に改変されたケモカインには、炎症性および自己免疫性の病気を治療する可能性がある（Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９９９）。
【０００６】
ＣＣＬ２は、単球遊走因子タンパク質−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ １：ＭＣＰ−１）または単球走化活性因子（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ：ＭＣＡＦ）としても知られているが、様々な炎症性疾患、様々なタイプの腫瘍、心臓同種移植片、ＡＩＤＳ、および結核における傷害および感染のシグナルに応答して、単球およびリンパ球の動員を促進することができるため、炎症において中心的役割を果たしていると見なされている（Ｙｏｓｈｕｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｇｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＣＣＬ２に関連する生理学的作用が、トランスジェニック動物を用いて広範に研究されており、このケモカインが、炎症モデルにおいて単球の動員を調節するだけでなく、ヘルパーＴの応答およびアテローム性動脈硬化症の開始に関係するサイトカインの発現も調節していることを明らかにすることができた。
【０００７】
構造上、ＣＣＬ２は、Ｃ末端にあるαへリックスで覆われたＮ末端ループおよびβシートからなり、特定の実験条件では単量体として検出されてはいるものの、ホモ二量体を形成する（Ｈａｎｄｅｌ Ｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋｉｍ ＫＳ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）。その他多くのケモカインについては、ＣＣＬ２に関連した結合活性およびその他の性質における欠失または置換されたアミノ酸の役割を評価するために、Ｎ末端切断型または単一部位置換型の変異体を発現させてＣＣＬ２の突然変異体が作成されている構造−活性研究の例が数多く文献に記載されている（Ｇｏｎｇ Ｊ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ，１９９５；Ｚｈａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｔｅｉｔｚ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｇｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈ Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｅｅｔ ＢＴ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【０００８】
特に、ＣＣＬ２レセプター結合および活性化における二量体化の役割が研究されて、二量体化を妨害する、末端領域における様々な変異が、レセプター結合親和性、走化性の促進、アデニル酸シクラーゼの阻害、およびカルシウム流出の促進など、ＣＣＬ２の作用のいくつかを変更し得ることが示された（Ｐａａｖｏｌａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。本明細書においてＰ８Ａ＊と呼ばれる、Ｐａａｖｏｌａによって記載された突然変異体は、二量体化はしないが、本来の能力と効力を維持しているのに対し、本明細書においてＹ１３Ａ＊と呼ばれる、Ｐａａｖｏｌａによって記載された別の絶対的な単量体突然変異体（ｏｂｌｉｇａｔｅ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｍｕｔａｎｔ）は、インビトロにおいて１００倍低い結合親和性を有し、インビトロにおいてアデニル酸シクラーゼのそれほど強力でないインヒビターであってカルシウム流出の刺激因子であり、また、細胞培養液中において走化性を促進することができないことが示された。Ｙ１３Ａ＊と同様、突然変異体である［１＋９−７６］ＭＣＰ−１（第２〜８位の残基がないＣＣＬ２変異体）は、インビトロにおいてＣＣＬ２の作用に拮抗する。
【０００９】
Ｐ８Ａ置換を含むＣＣＬ２突然変異体の結合特性も、実験モデルにおいて、ウイルスのケモカイン結合タンパク質Ｍ３の認識に基づいて調べられ、このウイルスタンパク質がＣＣＬ２の突然変異体に効率的に結合することが実証された（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，２００２）。さらに、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａなど、ケモカインの単量体変異体は、インビトロでは、完全な活性をもち、二量体型と区別することができないが、インビボでは活性をもたない（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００１０】
生じたタンパク質の二量体化特性に影響しない残基を含む、ＣＣＬ２の突然変異体の例が、ＣＣＬ２に対するアンタゴニストとしての性質を有する分子をもたらすものとして、既に文献に記載されている（米国特許第５７３９１０３号、国際公開第０３／８４９９３号）。しかし、先行技術には、一部位置換（例えば、プロリンを含む）によって絶対的な単量体変異体となったケモカインの特異的な突然変異体、具体的にはＣＣＬ２の突然変異体が、ケモカインのアンタゴニストとして作用し得ることの記載はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
驚くべきことに、ＣＣＬ２のようなホモ二量体を形成するケモカインの変異体であって、二量体化界面において水素結合パターンを変更させる単一アミノ酸置換を有するために、インビトロにおいて、レセプターに結合し、かつアゴニストの性質を有する絶対的単量体を生じさせる変異体が、インビボにおいて、天然のケモカインに拮抗することができ、また、抗炎症作用をもつことが発見された。
【００１２】
本明細書に記載された変異体は、薬剤として有用である。配列番号２を含むポリペプチド、および、さらに配列番号２の第６４位のイソロイシンへの突然変異を有する配列番号２を含むポリペプチド（配列番号４）が薬剤として有用である。
【００１３】
本明細書に記載された変異体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症を治療するための薬剤として有用である。配列番号２を含むポリペプチド、および配列番号２の第６４位のイソロイシンにさらに突然変異を有する配列番号２を含むポリペプチド（配列番号４）が、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症を治療するための薬剤として有用である。一例において、配列番号２を含むポリペプチド、および配列番号２の第６４位のイソロイシンにさらに突然変異を有する配列番号２を含むポリペプチド（配列番号４）は、多発性硬化症を治療するための薬剤として有用である。
【００１４】
本明細書に記載された変異体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染症を治療する方法において、さらに有用である。そのような方法は、本発明の単量体変異体であって、該ケモカインの二量体化界面において水素結合パターンを変更させる、少なくとも１つのアミノ酸置換によって生じる変異体を有効量投与することを含む。このような方法において使用可能な単量体変異体の例は、ａ）配列番号２を含むポリペプチド、ｂ）配列番号４を含むポリペプチド、ｃ）ａ）またはｂ）の活性型突然変異体、ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）、および該ケモカイン以外のタンパク質に属するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに、これらの活性型の画分、前駆体、塩、誘導体、複合体または結合体という形態の対応分子である。
【００１５】
さらに、本発明は、本発明の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体を含むポリペプチドを含有する薬学的組成物を含む。
【００１６】
さらに、本発明は、非ケモカインタンパク質の配列に本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体を融合させたもの、例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域に配列番号２のアミノ酸配列を融合させたもの（配列番号５）を含む融合タンパク質を含む。本発明は、さらに、これらの融合タンパク質を産生する方法を含む。
【００１７】
さらに、本発明は、本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法
ａ）二量体化する能力を阻害する単一点突然変異をＣＣＬ２の中に作出すること、
ｂ）レセプターに結合し、インビトロにおいてアゴニスト特性を示す該変異体を同定すること、
ｃ）上記ｂ）で同定された群に由来する該変異体であって、さらに、腹膜細胞の動員を阻害する特徴をもつ変異体を同定すること。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
先行技術における上記の証拠を考慮しても、レセプターに結合し、インビトロにおいてアゴニストとしての性質を有する絶対的単量体となるように水素結合のパターンを変更する、二量化界面における少なくとも一つのアミノ酸置換によって生じたＣＣＬ２変異体が、インビボにおいてＣＣＬ２を拮抗することができ、また、一般的に細胞の動員および／または炎症反応を阻害することもできるということを示唆するものは存在しない。
【００２０】
単一のアミノ酸置換は、ヒトの成熟ＣＣＬ２の８位にあることが好ましく、具体的には、８位におけるプロリンをアラニンで置換することからなる。これらの変異体は、ヒト成熟ＣＣＬ２の９、１０または１３位に対応する位置にさらなる変異を含まない。
【００２１】
上記に説明した置換の例は、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａと呼ばれる成熟型のＣＣＬ２の単量体変異体であり、８位におけるプロリンのアラニンへの単一置換（配列番号２）を含むものとして、または、６４位のメチオニンのイソロイシン（配列番号４）へのさらなる置換（タンパク質発現を改善する）を含むものとして発現させることができる変異体である。８位プロリン−８がアラニン（水素結合を形成することが可能な、異なった配向性の化学基を有するアミノ酸）に置換されると、絶対的単量体として作用するＣＣＬ２変異体が生じる。ＣＣＬ２−Ｐ８ＡおよびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａは、同等の活性を有する分子とみなすことができる。
【００２２】
したがって、ＣＣＬ２−Ｐ８ＡおよびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａと呼ばれる、これらＣＣＬ２の特定の絶対的単量体変異体について想定し得る医薬的用途、方法および組成物は、ＣＣＬ２の、または二量体として天然活性を有する他のケモカインの任意の他の絶対的単量体変異体であって、同様な方法で作成されるものについても想定し得る。これらの変異体は、天然ケモカインに対して、ＣＣＬ２−Ｐ８ＡおよびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａと同様のアンタゴニストおよびインヒビターとしての性質を示すはずであるから、医学的に応用することができるはずである。
【００２３】
本発明の一つの態様は、例えば、自己免疫性、炎症性または感染症など、様々な病気の治療標的として知られているＣＣＬ２のような、ホモ二量体を形成するケモカインの絶対的単量体変異体を利用することである。このような変異体は、前述のケモカインの二量化界面における水素結合のパターンを変更して、レセプターに結合し、インビトロにおいては作用薬としての性質を、インビボにおいては拮抗薬としての性質を有する、薬学的組成物中の有効成分、具体的には、自己免疫性、炎症性または感染症を治療または予防するための有効成分としての絶対的単量体をもたらす、少なくとも１つのアミノ酸置換によって生じる。これらインビボにおける拮抗薬としての性質は、炎症性分子（ＣＣＬ２自体、チオグリコール酸またはオボアルブミンなどのケモカイン）で誘導した後に生じる、腹膜における作用細胞の動員のような性質を評価することができるアッセイにおいて明らかにすることができる。
【００２４】
絶対的単量体変異体は、水素結合のパターンを変更する、二量体化界面における単一アミノ酸置換から生じさせることも可能である。より好ましくは、プロリンが、ホモ二量体のようなタンパク質複合体の形成に関連する立体特異的な水素結合の形成に特に関係することが周知のアミノ酸であるため、単一アミノ酸置換は、プロリンをプロリン以外のアミノ酸と置換するものとなるはずである。あるいは、単一アミノ酸置換は、プロリン以外のアミノ酸をプロリンに置換して、水素結合の立体特異性を変えるものとなるはずである。
【００２５】
薬学的組成物の有効成分として用いることができる、上記に定義されたホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の代替的形態には、ａ）活性を有する突然変異体、またはｂ）前記の変異体または前記の活性を有する変異体を含むポリペプチド、および前記のケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列などがある。
【００２６】
「活性を有する」という用語は、このような代替的化合物が、本発明のＣＣＬ２突然変異体の機能的特徴を維持する必要がある、すなわち、インビボにおいてＣＣＬ２に拮抗し、細胞の動員および／または炎症反応を阻害する必要がある、ということを意味する。
【００２７】
本明細書において定義する絶対的単量体ケモカインアンタゴニストは、本発明に係る活性型化合物として、活性画分、先駆物質、塩、誘導体、複合体または結合体の形で存在することもできる。
【００２８】
これら代替的化合物は、本明細書中に開示される基本的な特徴に影響を及ぼさない、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の配列が変更された分子を包含することを意図する。例えば、ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａは、正常なＣＣＬ２活性を維持しているが、組換え発現に関して改良された性質を有するＣＣＬ２の突然変異体（ＣＣＬ２−Ｍ６４１またはＣＣＬ２＊）に基づいて作成されている。
【００２９】
上記したＣＣＬ２−Ｐ８ＡをＣＣＬ２のアンタゴニストとして用いて本明細書に例示されている、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体のアンタゴニストとしての性質を、活性を有する突然変異体中で維持することができ、さらに増強することも可能である。このカテゴリーの分子は、前記配列の天然型および合成型の類似体であって、当分野において既知であり、下記の実施例においても開示されている手段によって測定すると、本発明において特徴付けられた生化学的活性を、同等またはより高いレベルで示すという条件で、１個以上のアミノ酸残基が付加、欠失または置換されている類似体を含む。
【００３０】
天然の類似体は、マウスのＣＣＬ２（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ アクセッション番号 Ｐ１０１４８）のように、他の生物において同定されているヒトケモカインタンパク質に該当する配列であることを意図する。ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の人為的類似体とは、既知の化学合成法、および／または部位特異的突然変異導入技術、コードＤＮＡ配列のレベルにおけるコンビナトリアル技術（ＤＮＡシャッフリング、ファージディスプレイ／選抜など）、コンピュターによるデザイン研究、またはこれらに適切な任意の他の既知技術であって、先行技術および下記の実施例に示された教示内容を用いて当業者によって日常的に取得および試験することができる、実質的に対応する変異または短縮されたペプチドまたはポリペプチドの有限のセットを提供する技術によって調製されるポリペプチドを意図する。
【００３１】
例えば、具体的な人為的突然変異体は、ＣＣＬ２の別の位置で置換されていて、ＣＣＬ２アンタゴニストを作成するために関連があることが分かっている１個以上のアミノ酸を有する可能性がある（国際公開番号０３／８４９９３）。
【００３２】
本発明によれば、活性を有する突然変異体における好ましい変化は、一般に「保存的」置換または「安全な」置換として知られていて、非塩基性残基を含むものである。保存的アミノ酸置換は、分子の構造および生化学的機能を保存するために、十分に類似した化学的特性を有するアミノ酸をもつものである。特に挿入または欠失が、例えば１０個よりも少ない、好ましくは３個よりも少ない少数のアミノ酸を含むのみで、かつ、タンパク質またはペプチドの機能的立体構造にとって決定的に重要なアミノ酸を除去も置換もしない場合であれば、上記した配列において機能を変更することなしにアミノ酸の挿入および欠失を行うこともできるのは明らかある。
【００３３】
文献には、天然のタンパク質の配列および／または構造についての統計学的および物理化学的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の選択を行うことができる多くのモデルが提供されている（Ｒｏｇｏｖ ＳＩ ａｎｄ Ｎｅｋｒａｓｏｖ ＡＮ，２００１）。タンパク質の設計実験によって、アミノ酸の特定のサブセットを用いると、折りたたみ可能で活性を有するタンパク質が産生されることが明らかになっており、タンパク質構造の中により容易に取り込まれやすく、機能的・構造的なホモログおよびパラログを検出するために用いることができる、アミノ酸の「同義」置換を分類するのに役立っている（Ｍｕｒｐｈｙ ＬＲ ｅｔ ａｌ．，２０００）。同義アミノ酸基およびより好ましい同義の基は、表Ｉに記載されている基である。例えば、ＣＣＬ２＊およびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａに共通している、イソロイシンによる６４位のメチオニンの置換は、同一の基準を用いて選択されたものである。
【００３４】
上記したホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の活性を有する突然変異体のさらなるグループは、ペプチド模倣物（ペプチドミメティクスとも呼ばれる）であり、ペプチドまたはポリペプチドの本質は、アミノ酸側鎖、アミノ酸のキラリティー、および／またはペプチド骨格のレベルで化学的に改変されている。これらの改変は、調製、効能および／または薬物動態の特徴に関して同一または改善された性質を有するホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を提供することを目的としている。
【００３５】
例えば、対象者に注射した後ペプチドがペプチダーゼにより切断されやすくなる場合には、特に感度の高いペプチド結合を非分解性ペプチド模倣物で置換することにより、より安定し、そのため治療薬としてより有用なペプチドを提供することができる。同様に、Ｌアミノ酸残基の置換は、タンパク質分解に対するペプチドの感度を低くして、最終的にペプチド以外の有機化合物と同じようにする標準的な方法である。また、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、セイル（ｔｈｅｙｌ）、サクシニル、メトキシサクシニル、スベリル（ｓｕｂｅｒｙｌ）アジピル、アゼライル（ａｚｅｌａｙｌ）、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニル、メトキシカルボニル、メトキシアゼライル（ｍｅｔｈｏｘｙａｚｅｌａｙｌ）、メトキシアジピル、メトキシスベリル（ｍｅｔｈｏｘｙｓｕｂｅｒｙｌ）、および２，４−ジニトロフェニルなどのアミノ末端ブロッキング基も有用である。高い効力、長期にわたる活性、精製の容易さおよび／または半減期の増大を提供するその他の多くの改変が、当分野において知られている（国際公開番号０２／１０１９５；Ｖｉｌｌａｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００３６】
ペプチド模倣物に含まれる、アミノ酸に対する好ましい代替的「同義」基は、表ＩＩに記載したものである。アミノ酸誘導体の非網羅的なリストには、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ＣＯＯＨ、インドリン−２−カルボン酸、４−ジフルオロ−プロリン、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、Ｌ−ホモプロリン、３，４−デヒドロ−プロリン、３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン、シクロヘキシル−グリシン、およびフェニルグリシンが含まれる。
【００３７】
「アミノ酸誘導体」とは、２０種類の遺伝子をコードする天然アミノ酸の一つを除くアミノ酸またはアミノ酸様化学物質を意図する。具体的には、アミノ酸誘導体は、直鎖状、分枝状、または環状の置換アルキル部分または非置換アルキル部分を含み、１つ以上のヘテロ原子を含むことが可能である。該アミノ酸誘導体は、デノボで作成するか、または、商業的供給源から入手可能である（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｂａｃｈｅｍ，ＵＳＡ）。
【００３８】
ペプチド模倣物および非ペプチド模倣物の合成および開発の技術は、当分野において周知である（Ｈｒｕｂｙ ＶＪ ａｎｄ Ｂａｌｓｅ ＰＭ，２０００；Ｇｏｌｅｂｉｏｗｓｋｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。インビトロおよびインビボの翻訳系を用いて、タンパク質の構造および機能を探索および／または改良するための、非天然アミノ酸をタンパク質に取り込む様々な方法も、文献に開示されている（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ＤＡ，２０００）。
【００３９】
本発明は、薬学的組成物中における有効成分として、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体およびその活性を有する突然変異体を用いることを開示し、また、それらのアミノ酸配列、および前記ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列を含むタンパク質を用いることも開示する。この後者の非相同の配列は、医薬品への応用性を損なうことなしに、さらなる特性を提供するはずである。このような追加的特性の例は、精製処理法の簡略化、体液中における半減期の延長、または細胞外への局在化である。この後者の特徴は、上記の定義に含まれる融合タンパク質またはキメラタンパク質の具体的なグループを定義する上で特に重要である。なぜなら、それは、これらのペプチドの単離および精製が容易になるばかりでなく、ＣＣＬ２が他の分子と自然に相互作用を行う場所に、これらの単量体変異体を局在化することを可能にするからである。
【００４０】
部分、リガンドおよびリンカーの設計、また、融合タンパク質を構築、精製、検出および使用する方法および方策についても文献において広く議論されている（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９７；「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．３２６−３２８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０００；国際公開番号０１／７７１３７）。これら上記のホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体の代替形態を作成するために用いることができる付加的タンパク質配列は、膜結合性タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）、多量体形成ドメイン、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、輸出シグナル含有タンパク質の配列である。単量体変異体に融合させるためにこれらの配列を１つ以上選ぶことは、該因子の具体的な用途にとって有効である。この付加的タンパク質配列が、細胞外への輸出シグナルまたはシグナルペプチドを含有するタンパク質の配列のように、単量体変異体を細胞外の場所に分泌することができる場合には、該因子を、さらなる処理を考慮してより容易に培養細胞から採集して精製することができるか、または、代わりに細胞を直接用いるか、投与することができる。
【００４１】
上記したホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体は、他の好ましい形態、例えば活性画分、前駆体、塩類、誘導体、結合体または複合体として用いることもできる。
【００４２】
「画分」という用語は、化合物自体のポリペプチド鎖の任意の断片を単独で、または、それに結合した関連分子または残基、例えば糖類またはリン酸塩類の残基と結合して、または、元のポリペプチドまたはペプチドが凝集したものを意味する。このような分子は、通常は一次配列を変更しないその他の改変、例えばインビボまたはインビトロにおけるペプチドの化学的誘導体化（アセチル化またはカルボキシル化）、リン酸化パターンを改変してできるもの（ホスホチロシン残基、ホスホセリン残基またはホスホトレオニン残基の導入）、または、ペプチドの合成およびプロセッシングもしくはさらなる加工の工程におけるペプチドのグリコシル化（ペプチドを、例えば哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響する酵素に曝露して行われる）によって作成することも可能である。
【００４３】
「前駆体」は、細胞または身体に投与する前後に代謝上および酵素的な処理によって、本発明の化合物に変換することができる化合物である。
【００４４】
本明細書において「塩類」という用語は、カルボキシル基の塩、および本発明のペプチド、ポリペプチド、またはそれらの類似体のアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は、当分野において既知の手段により形成することができ、例えばナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩または亜鉛塩などの無機塩類、および、例えばトリエタノールアミン、アルギニンもしくはリジン、ピペリジン、プロケインなどのアミン類によって形成される塩など、有機塩基を有する塩を含む。酸付加塩は、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸を有する塩、および、例えば、酢酸、シュウ酸などの有機酸を有する塩を含む。このような塩のいずれも、本発明のペプチドおよびポリペプチド、またはそれらの類似体と、本質的に同様の活性を有する。
【００４５】
本明細書で用いる「誘導体」という用語は、アミノ酸部分の側鎖上、またはＮ末端基またはＣ末端基上に存在する官能基から、既知の方法に従って調製することができる誘導体を意味する。このような誘導体は、例えば、カルボキシル基のエステルまたは脂肪アミド、および遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、または遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含み、アシル基によって、例えばアルカノイル基またはアロイル基として形成される。
【００４６】
上記のホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体の有用な結合体または複合体は、受容タンパク質または他のタンパク質（放射性または蛍光性標識、ビオチン）、治療効力（細胞毒性薬）、または、ポリエチレングリコールおよび他の天然型または合成型のポリマーなど薬物送達効力に関わる因子の改良という当分野において既知の分子および方法を用いて作成することができる（Ｈａｒｒｉｓ ＪＭ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓ ＲＢ，２００３；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ＲＢ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｐｉｌｌａｉ Ｏ ａｎｄ Ｐａｎｃｈａｇｎｕｌａ Ｒ，２００１）。残基が、ポリマーに結合しやすい側鎖（すなわち、例えばリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジンのような、官能基を有するアミノ酸の側鎖）を有していれば、それらを結合に用いることができる。または、これらの部位にある残基は、ポリマーに結合しやすい側鎖を有する様々なアミノ酸で置換することができる。また、遺伝子にコードされたアミノ酸の側鎖を、ポリマーに結合するように化学的に改変するか、または適切な側鎖官能基を有する非天然アミノ酸を用いることができる。ポリマーの結合は、アンタゴニストの特定の位置に天然に存在するアミノ酸の側鎖、または、アンタゴニストの特定の位置に天然に存在するアミノ酸を置換する天然または非天然のアミノ酸の側鎖に対してだけでなく、標的位置においてアミノ酸の側鎖に結合している炭水化物部分または他の部分に対しても起こる可能性がある。
【００４７】
これらの目的に適するポリマーは、生体適合性を有する。すなわち、生体系に対して非毒性であり、このようなポリマーは多数知られている。このようなポリマーは、天然状態で疎水性もしく親水性、生物分解性もしくは非生物分解性、またはそれらの組み合わせであってもよい。これらのポリマーには、天然のポリマー（コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ヒアルロン酸など）、および合成ポリマー（ポリエステル、ポリオルトエステル、無水物など）が含まれる。疎水性の非分解性ポリマーの例は、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニルおよびポリメチルメタエリレートなどである。親水性の非分解性ポリマーの例は、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアルキレン、ポリアクリルアミドおよびこれらのコポリマーなどである。好適なポリマーは、順次反復単位として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなエチレンオキシドを含む。
【００４８】
好ましい結合方法は、ペプチドの合成および化学的ライゲーションを組み合わせて用いる。都合のよいことに、水溶性ポリマーの結合は、生物分解性のリンカーを介して、特にタンパク質のアミノ末端領域において行われる。このような修飾によって、前駆体（または「プロドラッグ」）型のタンパク質が提供され、それは、リンカーが分解されるとポリマー修飾をもたないタンパク質を放出する。
【００４９】
一般的な手順として、上記のホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体は、組換えＤＮＡ関連技術および化学合成技術など、当分野において既知の処理法によって作出し調製することが可能である。
【００５０】
オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）発行の「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」シリーズ中の数巻（「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，１９９５；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４．Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，１９９６；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，１９９９；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，２００１など、多くの本や概説書に、ベクター、および原核生物（例えば大腸菌）または真核生物の宿主細胞を用いて組換タンパク質をクローニングして産生する方法についての教示が記載されている。
【００５１】
本発明による別の実施形態は、本明細書に記載の絶対的単量体ケモカイン変異体アンタゴニストをコードする核酸配列である。
【００５２】
ホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体をコードするＤＮＡ配列を、適当なエピソーム・ベクターまたは非相同的組込みベクターであって、任意の適当な手段（形質転換、形質移入、接合、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、直接的マイクロインジェクション法など）によって適切な宿主細胞に導入されて、それらを形質転換することができるベクターを挿入してライゲーションすることができる。具体的なプラスミドベクターまたはウイルスベクターを選択する上で重要な要素には、ベクターを含む受容細胞を、ベクターを含まないそれら受容細胞から識別して選択することの容易さ、具体的な宿主において望ましいベクターのコピー数、および異なる種の宿主細胞間でベクターを「往復する」ことを可能にすることが望ましいか否か、などが含まれる。
【００５３】
ベクターは、原核または真核宿主細胞中において、該細胞中において構成的に活性があるか、または誘導的に活性を有するかが選択されている転写開始／終結調節配列の制御下で、本発明のアンタゴニストを含む単離タンパク質または融合タンパク質を発現させるものでなければならない。そして、このような細胞の中で実質的に濃縮された細胞株を単離して安定した細胞株を生じることができる。
【００５４】
真核宿主（例えば、酵母菌、昆虫または哺乳動物の細胞）では、宿主の性質に応じて、様々な転写および翻訳の調節配列を用いることができる。それらは、アデノウイルス、ウシ・パピローマウイルス、シミアン・ウイルスなどのウイルス性由来源から派生させることができるが、この場合には、調節シグナルは、高レベルで発現する特定の遺伝子に結合している。具体例は、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、酵母菌のｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。抑制および活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択して、遺伝子の発現を調節することができる。発現ベクターを含む宿主細胞が選択できるようにする１つ以上のマーカーを導入しても、導入ＤＮＡにより安定的に形質転換されている細胞を選択することができる。該マーカーは、栄養要求性宿主（ａｕｘｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｓｔ）に対する光栄養（ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）、例えば抗生物質のような殺生物剤耐性、または銅などの重金属などを提供する。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結させるか、同時形質転換によって同一細胞に導入することができる。タンパク質の最適な合成を行うためには、さらに別の要素が必要とされる。
【００５５】
宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれでもよい。適正な部位における適正な折りたたみまたはグリコシル化など、タンパク質分子に対して翻訳後修飾を行うため、例えば、ヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞など、真核細胞宿主が好ましい。また、酵母菌細胞も、グリコシル化など、翻訳後ペプチド修飾を行うことができる。酵母菌中で所望のタンパク質を産生させるために利用することができる強力なプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを利用する組換えＤＮＡ法が多数ある。酵母菌は、クローニングされた哺乳動物遺伝子産物中のリーダー配列を認識して、リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレ−ペプチド）を分泌する。
【００５６】
組換えポリペプチドを長期間、高収率で産生させるためには、安定した発現が好ましい。例えば、目的とするポリペプチドを安定して発現する細胞株を、ウイルスの複製開始点および／または内因性発現要素および選択可能マーカー遺伝子を同一ベクター上または別々のベクター上に含むことができる発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクター導入後、細胞を１〜２日間富化培地で増殖させてから、選択培地に切り替えてもよい。選択可能マーカーの目的は、選抜に対する耐性を付与することであり、それが存在することによって、導入配列の発現に成功した細胞の増殖および回収が可能となる。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。そして、そのような細胞中で実質的に濃縮された細胞株を単離して、安定的な細胞株を生じることができる。
【００５７】
発現宿主として利用可能な哺乳動物の細胞株は当分野において既知であり、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞、サルの腎臓（ＣＯＳ）細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、バウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞、およびヒト肝細胞癌（例えばＨｅｐ Ｇ２）細胞、ならびにその他の多くの細胞株など、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。バキュロウイルス系では、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料が、特に、「ＭａｘＢａｃ」キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）として、キットの形で市販されている。
【００５８】
化学合成技術の例は、固相合成および液相合成である。固相合成としては、例えば、合成されるペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸を、有機溶媒中では不溶性の支持体に結合させ、適切な保護基で保護されたアミノ基および側鎖官能基を有するアミノ酸が、Ｃ末端からＮ末端まで一つ一つ順番に縮合される反応、および、樹脂またはペプチドのアミノ基の保護基に結合しているアミノ酸が放出される反応を交互に繰り返すことによって、このようにしてペプチド鎖が伸長する合成法がある。固相合成法は、用いる保護基の種類により、大きくは、ｔＢｏｃ法とＦｍｏｃ法に分けられる。一般的に用いられる保護基は、アミノ基に対してはｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル基）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル基）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル基）、Ｂｚｌ（ベンジル基）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル基）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル基）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基）、Ｔｒｔ（トリチル基）、Ｔｏｓ（トシル基）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル基）およびＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル基）などであり、グアニジノ基に対してはＮＯ２（ニトロ基）およびＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基）、およびヒドロキシル基に対してはｔＢｕ（ｔ−ブチル基）などである。所望のペプチドの合成後、保護基を脱保護反応にかけ、固体支持体から切り離す。このようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法ではフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸によって行うことができ、Ｆｍｏｃ法ではＴＦＡを用いて実施することができる。全合成ＣＣＬ２タンパク質は文献に開示されている（Ｂｒｏｗｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【００５９】
上記ホモ二量体形成ケモカインの合成または組換え単量体変異体の精製は、この目的にとって既知の方法のいずれか１つ、すなわち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを含む従来の処理法によって行うことが可能である。本発明のタンパク質を精製するために優先して用いることができる更なる精製処理法は、モノクローナル抗体またはアフィニティーグループを用いるアフィニティークロマトグラフィーであり、標的タンパク質を結合し、カラム内部に含まれるゲルマトリックス上で産生されて固定化される。タンパク質を含有する不純な調製物をカラム通過させる。タンパク質は、ヘパリンまたは特異的抗体によってカラムに結合するが、不純物は通過する。洗浄後、ｐＨまたはイオン強度を変えてタンパク質をゲルから溶出させる。あるいは、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いることもできる。タンパク質精製に広く用いられている水−アセトニトリル系溶媒を用いて溶出を行うこともできる。
【００６０】
ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症を治療または予防するための薬学的組成物に使用することができる。特に、多発性硬化症の動物モデルについての実施例で提供された結果は、これらの単量体変異体を、多発性硬化症を治療または予防するための薬学的組成物に使用できることを示している。
【００６１】
本発明の別の態様は、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体であって、該ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換によってできる変異体であり、薬物として使用される。このような変異体の例は、ＣＣＬ２−Ｐ８ＡおよびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａとして、本明細書中に開示されている。しかし、本明細書の教示により、他のケモカインの配列および活性に基づいて、類似分子を同定、産生および試験することが可能になる。
【００６２】
特に、これらの単量体変異体は、
ａ）ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（配列番号２）、
ｂ）ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（配列番号４）、
ｃ）（ａ）または（ｂ）の活性型突然変異体、または
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）を含むポリペプチド、および該ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列、
および、それらの活性画分、前駆体、塩類、誘導体、複合体または接合体の形になった、対応する単量体変異体から選択することができる。
【００６３】
本発明の別の態様は、有効成分としてホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を含む薬学的組成物であって、該変異体は、ＣＣＬ２−Ｐ８ＡまたはＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａなど、該ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から生じたものであり、選択的には、上記の形（活性型突然変異体、それらを含むポリペプチド、または結合体など）、およびそれらをコードするＤＮＡまたは発現する細胞の形になっている単量体である。
【００６４】
本発明の薬学的組成物は、動物への投与に適した、適切な薬学的に許容できる担体、生体適合的媒体および添加物（例えば生理食塩水）を含むことができ、最終的には、活性化合物を医薬上用いることができる調製物に加工しやすくする（賦形剤、安定剤または希釈剤のような）補助剤を含むことができる。薬学的組成物は、許容できる方法で調合して、投与方式の必要に適合させることができる。例えば、薬物送達のために生体材料およびその他のポリマーを用いること、また、特定の投与方式の有効性を確認するための様々な技術およびモデルも文献に開示されている（Ｌｕｏ Ｂ ａｎｄ Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ ＧＤ，２００１；Ｃｌｅｌａｎｄ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００６５】
「有効量」は、病気の経過および重度に影響を与えて、そのような病状を軽減または緩和するのに十分な有効成分の量を指す。有効量は投与経路および患者の状態に応じて決まる。
【００６６】
「薬学的に許容できる」は、有効成分の生物活性の効果を妨げず、投与される宿主に対して毒性を有さない担体を含むことを意味する。例えば、非経口投与するためには、上記活性成分を、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンゲル液のような媒体に入れて注射するための単位投与形態に処方することができる。また、担体は、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、ならびに、石油、動物、野菜または合成物に由来する油（ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油）などの様々な油から選択することもできる。
【００６７】
有効成分の所望の血中濃度を確立するために、当業者は、許容されているいかなる投与方法を用いることも、決定することもできる。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、経口、または口腔粘膜経路など、様々な非経口経路によることが可能である。非経口投与は、所定の速度で、好ましくは、正確な投薬量の単回投与に適した単位投与形態でポリペプチドを長時間にわたって投与するために、ボーラス注射によって、また、蓄積注射、浸透圧ポンプなど、時間をかけて次第に灌流するか、制御された放出投薬形態によって行うことができる。非経口投与のための調製物は、水性または非水性の無菌溶液、懸濁液、乳液などであり、当分野において既知の補助剤または賦形剤を含むことも可能であり、常法に従って調製することができる。また、活性化合物の懸濁液を適当な油性注射懸濁液として投与してもよい。適当な脂溶性溶媒または媒体には、例えばゴマ油などの脂肪油、または、例えばゴマ油のような合成脂肪酸エステル、または、例えばオイレン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルなどがある。懸濁液の粘度を増加させる物質を含むことができる水性注射用懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む。選択的には、該懸濁液は安定剤を含むことも可能である。薬学的組成物は、注射によって投与するのに適した溶液を含み、また、約０．０１〜９９％の、好ましくは２０〜７５％の活性化合物を、賦形剤とともに含む。直腸から投与することができる組成物は坐薬などである。
【００６８】
当然ながら、投与される用量は、被投与者の年齢、性別、健康状態、体重、もし受けているならば、同時に受けている治療の種類、治療頻度、および所望とする効果の性質に応じて異なると理解されるべきである。当業者に理解され、決定されているように、用量は、個々の被験体に応じて調整しなければならない。個々の治療に必要な総投薬量を複数回または単回で投与することができる。本発明の薬学的組成物は単独で、または当該症状に向けた別の治療薬、または該症状の別の病徴に向けられた他の治療薬とともに投与することができる。通常、有効成分の１日の用量は、体重１ｋｇあたり０．０１〜１００ｍｇである。分割投与または持続放出形態で投与されるときは、１日当たり１ｋｇにつき通常１〜４０ｍｇが、所望の結果を得るために有効である。２回目または後続の投与は、初回または前回各自に投与された用量と同一か、それよりも少ないか、または多い投薬量で実施することができる。
【００６９】
本発明の別の目的は、ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から得られた、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を有効量投与することを含む、自己免疫性または炎症性（多発性硬化症など）、または感染症を治療または予防する方法である。このような方法において用いることができる単量体変異体の例は以下のものである。
ａ）ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（配列番号２）、
ｂ）ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（配列番号４）、
ｃ）（ａ）または（ｂ）の活性型突然変異体、
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）を含むポリペプチド、および該ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列、
および、それらの活性画分、前駆体、塩類、誘導体、複合体または接合体の形になった、対応する単量体変異体。
【００７０】
本発明の使用、変異体および方法に関する、上記の自己免疫性、炎症性または感染症の非限定的なリストは以下の通りである。関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、骨関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、線維症、線維症、アレルギー性または過敏性の疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、癌、敗血症ショック、ウイルスまたはＨＩＶによる感染症、移植、気管支炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）およびアテローム性動脈硬化症。
【００７１】
本発明のポリペプチドおよび関連試薬の治療的用途は、動物の細胞、組織およびモデルを用いた、インビボまたはインビトロの測定法を用いて、（安全性、薬理動態および有効性について）評価することができる（Ｃｏｌｅｍａｎ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｉ ＡＰ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ｖｏｌ．１３８，「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ Ａ ｅｔ ａｌ．，編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，２０００；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．２８７ ａｎｄ ２８８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）。
【００７２】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法である。
ａ）ＣＣＬ２において、二量体化する能力を阻害する単一点突然変異を作出する工程、
ｂ）レセプターに結合して、インビトロでアゴニストの性質を示す該変異体を同定する工程、
ｃ）上記工程（ｂ）で同定された群から、さらに、腹膜細胞動員を阻害することを特徴とする該変異体を同定する工程。
【００７３】
これらの性質のこの評価法は、当分野において既知の伝統的な技術であり、実施例中において示されており、炎症および腹膜細胞動員を誘発することが知られている分子、例えば、ＣＣＬ２そのもの、チオグリコール酸またはオボアルブミンなどのケモカインを適用するものである。
【００７４】
特定の実施形態に関連して本発明を説明してきたが、その記載内容は、全ての改変および代用を含み、当業者は、請求の範囲の意味と目的を逸脱することなく実施することができる。
【００７５】
以下の実施例を用いて本発明を説明するが、それらを、本発明を限定するものとは決して解釈すべきではない。
【実施例】
【００７６】
実施例１：組換えタンパク質のクローニング、発現、および精製
成熟ＣＣＬ２（図１；配列番号１）およびＣＣＬ２−Ｐ８Ａ突然変異体タンパク質（図１；配列番号２）、成熟ＣＣＬ２＊（図１；配列番号３）、およびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ突然変異体タンパク質（図１；配列番号４）を、前駆体分子の２４〜９９位の分節に相当するヒトＣＣＬ２／ＭＣＰ−１の成熟型の配列に基づいて、文献（Ｐａａｖｏｌａ ＣＤ ｅｔ ａｌ，１９９８）に記載されたようにして、大腸菌において組換えタンパク質として作成および発現させた。ＣＣＬ２＊およびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａについては、６４位のメチオニンをイソロイシンで置換すると、６４位にメチオニン−スルホキシドを含む分子種が形成されるのを排除することによって、突然変異体の純度および均質性が向上する。
【００７７】
簡単に説明すると、大腸菌で発現させるのに最適なコドン使用と、成熟型のヒトＣＣＬ２またはＣＣＬ２＊をコードする配列の５’末端に付加されたメチオニンに対応するコドンを用いて、標準的な遺伝子合成技術によって、ＣＣＬ２＊に対するＣＣＬ２の遺伝子を構築した。８位にアラニンを含む突然変異体コンストラクトを、ＣＣＬ２またはＣＣＬ２＊を鋳型にポリメラーゼ連鎖反応による突然変異誘発法によって作出し、ｐＥＴ３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＸｈｏＩ部位とＮｄｅＩ部位の間にクローニングした。
【００７８】
ＣＣＬ２＊に基づくタンパク質をコードするプラスミドを用いてＴＡＰ３０２細胞を形質転換したが、この細胞は、細胞内酸化還元電位に、より確実にジスルフィド結合の形成をもたらせしめるよう、チオレドキシン還元酵素ノックアウトによって改造されているＢＬ２１ ｐＬｙｓ Ｓ細胞である。この系統を用いると、細胞でジスルフィド結合が形成されて、リフォールディング（再折り畳み）ステップの必要がなくなると考えられる。
【００７９】
コンストラクトは全て、標準的な分子生物学技術（ＰＣＲによる突然変異誘発および増幅、ＤＮＡ配列決定、制限酵素切断）によって取得および調節された。ＭＣＰ−１（Ｐ８Ａ）の正しい配列を含むクローンの１つを用いて、大腸菌の中でタンパク質を産生させた。また、このプラスミドを用いて、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号Ｃ−６０１０−０３）またはＢＬ２１ ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ社カタログ番号６９３８７−３）も形質転換した。
【００８０】
ＣＣＬ２、ＣＣＬ２＊、およびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａを、超音波破砕の工程、溶解工程、およびクロマトグラフィー工程（ＳＰ−セファロース・カラム；１０ｍＭ Ｋ２ＰＯ４，ｐＨ ７．５におけるＮａＣｌの勾配によって溶出）を用いて、原論文の記載通りに発現および精製する。ピーク画分をまとめ、逆相ＨＰＬＣ（５−μｍの粒子サイズおよび３００−Åの孔径をもつＣ１８カラム）によってさらに精製した。０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの勾配を次第に増加させてタンパク質を溶出したが、一般的には、タンパク質は、３４±５％アセトニトリルで溶出された。次に、それらを凍結乾燥させ、３５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８中で１ｍｇ／ｍｌに溶解し、１５μｇのアミノペプチダーゼ（ニュージャージー州、ロックヒル（Ｒｏｃｋ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）にあるＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社）／１ｍｇのタンパク質と室温にて３６時間反応させ、逆相ＨＰＬＣによって再精製した。アミノペプチダーゼ処理によって、Ｎ末端のメチオニンのみが取り除かれ、組換えタンパク質のＮ末端配列決定によって調べると、Ｎ末端グルタミンまたはＮ末端ピロ−グルタミン酸のいずれか（この違いによる生物活性への影響はない）が生じていた。
【００８１】
そして、このタンパク質を凍結乾燥し、水で１〜５ｍｇ／ｍｌに溶解して、小分けにして８０℃で保存した。
【００８２】
より大量の組換えタンパク質、また、特にはＣＣＬ２−Ｐ８Ａを、これらのタンパク質を産生する大腸菌菌株の大量発酵培養液から得られた細胞沈殿物から出発する精製を行うために設計された別プロトコールを用いても採取した。通常、５Ｌの発酵装置は、約２００ｇ湿重量の細胞沈殿物を産生し、５０Ｌの発酵装置は１．８ｋｇ湿重量の細胞沈殿物を産生する。ここに記載した精製処理では、２００ｇ湿重量の細胞沈殿物を処理する。
【００８３】
細胞沈殿物を融解して、グラム湿重量あたり３ｍｌの切断用バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ ８．０（カタログ番号２００９２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社））で、１０ｍＭのＭｇＣｌ２（カタログ番号６３０６５、Ｆｌｕｋａ社）、５ｍＭのベンズアミジン／ＨＣｌ（カタログ番号１２０７３、Ｆｌｕｋａ社）、１ｍＭの１，４ ＤＬジチオスレイトール（ＤＴＴ）（カタログ番号４３８１９、Ｆｌｕｋａ社）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（カタログ番号７８８３０、Ｆｌｕｋａ社）＊、２０ｍｇ／Ｌ ＤＮａｓｅ（Ｆｌｕｋａ社）（カタログ番号ＤＮ−２５、Ｓｉｇｍａ社）を含むものを加えた。この懸濁液をポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）でホモジナイズして、断片や塊を含まない良好なホモジネートを得た。全ての操作を４℃で行った。ホモジナイズした細菌懸濁液を、フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ）機械的細胞破砕装置（差圧）に移し入れた。パッセージの回数は、一般的には、１５００バールで２〜４時間であった。細胞の破砕を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをクマシー・ブルーで染色して測定した。
【００８４】
ライセートをＧＳＡ遠心分離管に分注して、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ５Ｃ（１６，３００×ｇ）により４℃で９０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上清中に目的の可溶性タンパク質が検出できないことをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した後上清を捨てた。沈殿物をスパチュラで遠心分離管から取り出して、予め重さを量っておいたビーカーの中に移して、沈殿物の重さを量った。ビーカー中で、この沈殿物１ｇあたり５ｍｌの脱イオン水を加え、マグネチック・スターラーを用いて４℃で３０分間撹拌して沈殿物を洗った。この懸濁液を、ＧＳＡ遠心分離管に入れ、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ５Ｃ（１６，３００×ｇ）を用いて４℃で６０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。この洗浄工程を３回繰り返した。各遠心分離の後、上清中に目的の可溶性タンパク質が検出できないことをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した後上清を捨てた。
【００８５】
この沈殿物を、１ｍＭの１，４ ＤＬジチオスレイトール（ＤＴＴ）（カタログ番号４３８１９、Ｆｌｕｋａ社）および６ Ｍのグアニジウム／ＨＣｌ（カタログ番号５０９５０、Ｆｌｕｋａ社）を含む、調製したばかりの封入体抽出用バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ ８．０（カタログ番号２００９２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社）に、細胞沈殿物２５ｇあたり１００ｍｌのバッファーという割合でポリトロンを用いて可溶化した。この溶液を６０℃で３０分間加熱してから撹拌して、確実に単量体化した後、室温まで冷却した。このホモジネートをＴｉ４５遠心分離管に分注して、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ−６０（１００，０００×ｇ）を用いて３５，０００ｒｐｍで超遠心分離した。上清を０．８〜０．２ｍｍフィルター（ＳｐｉｒａｌＣａｐ（カタログ番号１２０６９、ＰＡＬＬ社）で濾過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、クマシー蛋白質測定試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社）を、キットとともに配布されたプロトコールに従って用いて定量した。
【００８６】
目的とする組換えタンパク質を、供給業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の指示に従って充填されたＳｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣ樹脂を含むＦｉｎｅＬｉｎｅ ３５ Ｐｉｌｏｔカラム上に捕捉した。使用後、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）によって提供された洗浄処理法に従って、カラムを再生させる。細胞沈殿物１００ｇに対して、直径３．５ｍｍ×高さ２３ｃｍのカラムに全部で２２０ｍｌ（１カラム容量に等しい）のＳｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣを充填する。このカラムを、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に据える。流速を１０ｍｌ／分とし、最大圧力を１ ＭＰａにした。試料をロードする前に、脱イオン水で２カラム容量分（４４０ｍｌ）を洗浄した。洗浄後、発煙３７％ＨＣｌ（カタログ番号８４４２６、Ｆｌｕｋａ社）でｐＨ ７．５に調整された５ ＣＶ（カラム容量）の平衡化用バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（カタログ番号２００９２３９１：Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社）で平衡化した。
【００８７】
グアニジウム／ＨＣｌに溶解させたＩｂｓ（封入体）を、５ｍｌ／分というゆっくりとした速度でカラム上にロードした。そして、５カラム容量の平衡化用バッファーで洗浄した後、５ ＣＶのバッファーＡ（０．１％ ＴＦＡトリフルオロ酢酸（カタログ番号２８９０４、Ｐｉｅｒｃｅ社）および９９．９％の蒸留水）でカラムを洗浄した。バッファーＢ（０．１％ ＴＦＡトリフルオロ酢酸（カタログ番号２８９０４、Ｐｉｅｒｃｅ社）、９．９％の蒸留水、９０％アセトニトリル（ＵＮ１６４８、Ｂａｋｅｒ社））の０％から１００％までの直線的勾配を用いて、流速１０ｍｌ／分、および１ ＭＰＡ圧力限界で１０ ＣＶにわたってタンパク質を溶出する。１０ｍｌの画分を回収した。検出されたピークは全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣによって分析し、ＵＶ−分光法によって定量した。目的のタンパク質を含む画分を集めて、その量をＵＶ−分光法によって測定した。
【００８８】
タンパク質を、０．１ｍＭの還元型グルタチオン（カタログ番号Ｇ−４２５１、Ｓｉｇｍａ社）および０．０１ｍＭの酸化型グルタチオン（カタログ番号１２０ ０００ ２５０、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃ社）を含む復元用バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ ８．０（カタログ番号２００９２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社）に１０倍希釈することにより復元して、約０．１ｍｇ／ｍｌという最終濃度を得た。Ｓｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣを集めたものを一滴ずつ復元用バッファーに加えた。容量が大きい場合には、蠕動ポンプを用いてこれを行うことも可能である。溶液を４℃で一晩撹拌した。この溶液は、復元されていないタンパク質が沈殿するため、しばしば曇って見える。復元用バッファーにおける最終濃度０．１から０．４ｍｇ／分の範囲で、等量の復元されたタンパク質が得られた（４０〜５０％）。出発材料のｐＨおよびアセトニトリルは、復元工程に影響しない。復元の後、ＨＰＬＣによってリフォールディングを追跡することも可能である。
【００８９】
０．８ｍｍのプレフィルターの後に０．２２ｍｍのフィルターからなる二重フィルター付き高流量蠕動ポンプを用いて復元溶液を濾過した。次に、清澄になった溶液を、ＵＶ−スペクトルによって定量した後Ｈｉｌｏａｄ ＳＰセファロースＨＰ上のカチオン交換によって濃縮した。イオン交換カラムのサイズは、タンパク質の量に依存する。５００ミリグラムよりも少ないときは、１６／１０カラム（１ ＣＶ＝２０ｍｌ）、５００〜１０００ｍｇのときは２６／１０カラム（１ ＣＶ＝５０ｍｌ）、また、１〜２グラムのときは５０／５カラム（１ ＣＶ＝１００ｍｌ）を用いた。
【００９０】
カラムは、供給業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の指示に従って充填した。カラムを２ ＣＶの脱イオン水で洗浄してから、４ ＣＶのカチオン交換バッファーＡ（ＮａＯＨ（カタログ番号７１６９０（Ｆｌｕｋａ社））でｐＨを４．５に調整した５０ｍＭ酢酸（Ｆｌｕｋａ社））で平衡化した。溶液を、酢酸でｐＨ ４．５に調整し、伝導率を１０ ｍＳより小さくなるよう調整した。選択したカラム毎に供給業者の推奨する流速でタンパク質溶液をロードした後、５ ＣＶのバッファーＡでカラムを洗浄した。０％から１００％までのバッファーＢ（２ Ｍ ＮａＣｌ（カタログ番号７１３８０（Ｆｌｕｋａ社）を含むバッファーＡ）の直線勾配を用いて、２０ ＣＶにわたってタンパク質を溶出した。画分のサイズは、カラムのサイズに応じて決まった。検出されたピークは全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣによって分析し、ＵＶ−分光法によって定量した。解析後、ＡＳ９００６５２を含む画分を集めて、ＵＶ−スペクトルで定量し、ＨＰＬＣで分析した。
【００９１】
メチオニン・アミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を用いて酵素的にＮ末端メチオニンの除去を行った後、精製工程を行った。簡単に説明すると、試料は、まず、３．５ ｋＤのカットオフ値で膜チューブを用いて透析して、切断用バッファー（３５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ ７．５（カタログ番号２００９２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社）の中に入れた。透析用バッファーを２４時間の間に３回変えた。メチオニン・アミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を、１：１００００（Ｗ：Ｗ、酵素：タンパク質）の比率でタンパク質溶液に加えた。切断を室温で４８時間行った。次に、切断されたタンパク質を、上記したようにカチオン交換によって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価すると、タンパク質は純度９８％よりも高かった。
【００９２】
ＡＫＴＡ精製装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、所望のタンパク質をさらに精製した。この装置を１ Ｍ ＮａＯＨで１時間クリーニングし、滅菌水で洗浄し、０．２２ｍｍフィルターで濾過したバッファー（０．１％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（カタログ番号２８９０４、Ｐｉｅｒｃｅ社）および９９．９％の蒸留水）で平衡化した。Ｇ−２５ファイン・セファロースＸＫ５０／３０カラムを用いてタンパク質を脱塩した。カラムを、１ ＣＶの１ Ｍ ＮａＯＨその後４ ＣＶの滅菌水で洗浄してから、５ ＣＶの０．１％ ＴＦＡで平衡化した。最適な脱塩条件のために、４５０ｍｌのＧ−２５ファイン・セファロース上で、５０から１００ｍｌの試料を脱塩する。容量が１００ｍｌよりも大きくなるまで、この脱塩工程を繰り返す。試料は、ロードする前に０．２２ｍｍフィルターで濾過した。流速１０ｍｌ／分および最大圧力１ ＭＰａで、１．５ ＣＶの０．１％ ＴＦＡによってカラムを溶出する。１０ｍｌの画分を滅菌チューブの中に回収する。解析後、タンパク質を含む画分を集め、無菌条件下ＵＶ−スペクトルで定量し、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および質量分析法で解析する。
【００９３】
ＤｅｌｔａＰｒｅｐ ＨＰＬＣ（ＷＡＴＥＲＳ社）の予備的な逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）を用いて、残留した混入物を取り除く。試料を、０．１％ ＴＦＡに酸性化し、バッファーＡ（０．１％ ＴＦＡトリフルオロ酢酸（カタログ番号２８９０４、Ｐｉｅｒｃｅ社）および９９．９％の蒸留水）で平衡化したＶｙｄａｃ Ｃ８ ＲＰＣ（カタログ番号２０８ＴＢ１０１５２２、Ｖｙｄａｃ社）上にロードした。バッファーＢ（０．１％ ＴＦＡトリフルオロ酢酸（カタログ番号２８９０４、Ｐｉｅｒｃｅ社）、９９％アセトニトリル（ＵＮ１６４８、Ｂａｋｅｒ社））の０％から１００％までの直線的勾配を用いて、流速２５ｍｌ／分および７００バールの圧力限界で１０ ＣＶにわたってタンパク質を溶出した。検出されたピークは全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣによって分析し、ＵＶ−分光法によって定量した。解析後、ＡＳ９００６５２を含む画分を集めて、ＵＶ−スペクトルで定量し、必要に応じて小分けにしてから凍結乾燥させた。タンパク質は、−２０℃または−８０℃で保存する。
【００９４】
組換えタンパク質は、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｕｖｉｋｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ＫＯＮＴＲＯＮ社）を用い、ＵＶ分光分析法によって定量する。水晶製キュベット（ＱＳ １．０００，ＨＥＬＬＭＡ社）をバッファーの参照用に用い、もう一方のキュベットが試料を含む。３５０ ｎｍから２４０ ｎｍまでのスキャン結果を測定し、また、２８０ ｎｍにおける吸光度を用いて、ＰｒｏｔＰａｒａｍ，Ｅｘｐａｓｙを用いてアミノ酸組成物から得られた吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を基準として、定量を測定した。
【００９５】
ＮｕＰＡＧＥ １０％ゲル（カタログ番号ＮＰ０３０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。試料用バッファー（カタログ番号ＬＣ２６７６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で試料を２倍に希釈し、９５℃で５分間加熱した。標準用タンパク質ラダーを分子量の基準として用いた。１０μｌの分子量標準溶液と２０μｌのタンパク質試料を適当なウエルにロードした。電気泳動用バッファーはＭＥＳ（カタログ番号ＮＰ０００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）であった。泳動は、供給業者の指示に従って、２００Ｖ、１２ｍＡ、および２５Ｗで３５分間（ＰｏｗｅｒＥａｓｅ５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で行った。
【００９６】
ＮｕＰＡＧＥゲルを、蒸留水中１０％酢酸、３０％メタノールの中で０．１％ Ｒ２５０クマシー・ブルーによって３０分間染色し、蒸留水中１０％酢酸、３０％メタノールの中で、ゆっくりと揺らしながらバックグラウンド量が無色になるまで脱染した。そして、ゲルを水で何度か洗浄した後、２枚のセロファン紙（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の間に挟んで乾燥用溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の中に１０分間埋め込んでから、ミニチュアプレスに載せて、ゲルが薄いシートとして保存できるようにした。または、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ染色プロトコール（カタログ番号ＬＣ６０６５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて染色した。
【００９７】
ウォーターズ（ＷＡＴＥＲＳ）社から入手したＡｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ装置を、０．１％ ＴＦＡに平衡化した解析用Ｃ８ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００ ７ｍ（直径０．２ｃｍ×２２ｃｍ）とともに用いた。予め酸性化しておいた１０〜５０ｍｇの最終０．１％ＴＦＡを注入した。タンパク質は、２５〜５０％のアセトニトリルの勾配により２０ ＣＶにわたり溶出した。
【００９８】
質量スペクトル解析およびＮ末端配列解析によって、組換えタンパク質の同一性を確認した。精製された材料について、正しいＮ末端配列であるＱＰＤＡＩＮＡＡＶＴが得られた。
【００９９】
主な分子種については、２つのジスルフィド結合をもつタンパク質鎖の理論上の質量に対応する質量である８６５５ Ｄａが得られた。Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸に修飾されたものに対応する、１７ Ｄａの小さな質量をもつ別の分子種も観察された。この修飾が存在しても、タンパク質の活性には影響を与えない。
【０１００】
実施例２：細胞アッセイ法
材料および方法
ケモカイン誘導による腹膜細胞動員の測定法
８から１２週の雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を、通常の動物を閉じこめる条件の下で、標準的な１２時間の明／暗周期で飼育、食餌と水を自由に与えて飼育した。３〜６匹のマウスからなるグループに、２００μｌの食塩水（ＬＰＳを含まないＮａＣｌ ０．９％（ｗ／ｖ））、または２００μｌのこの溶液に、１回の注射あたり１０μｇのＣＣＬ２またはＣＣＬ２−Ｐ８Ａを含むものを腹腔内注射した。ＣＣＬ２誘導による腹膜細胞動員に対するＣＣＬ２−Ｐ８Ａの阻害効果を調べる研究では、これらの分子を、ＣＣＬ２を腹腔内注射する３０分前に腹腔内に投与した。全ての分子は、上記した濃度とバッファー（食塩水）で投与された。ＣＣＬ２またはＣＣＬ２−Ｐ８Ａを最後に注射してから４時間たったところでマウスを殺処理した。
【０１０１】
チオグリコール酸誘導による腹膜細胞動員の測定法が公開されている（Ｍｉｓｈｅｌｌ Ｂ，１９８０）。簡単に説明すると、３０ｇの無水チオグリコール酸培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を１リットルの冷たい蒸留水に懸濁し、次に、沸騰するまで加熱して粉末を完全に溶かしてチオグリコール酸培地を調製した。そして、この培地を、１００ｍｌボトルに分けてオートクレーブした。冷却した後、培地を室温暗黒下で少なくとも１ヶ月保存した。１日目にＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａを投与した３０分後に２００μｌの３％チオグルコール酸溶液を３匹のグループのマウスに腹腔内注射して細胞動員を誘導した。その後３日間ＣＣＬ２＊を投与した（２、３、および４日目）。デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社）は、陽性対照として使用され、１０ｍｇ／ｋｇで腹膜内から投与された。５日間たったところでマウスを殺処理した。
【０１０２】
前記アッセイにおける細胞動員を評価するために腹腔洗浄を以下のように行った。マウスをプレキシグラス製の箱の中でＣＯ２の濃度を上げて窒息させた。７０％エタノールで皮膚を消毒した。皮膚の外層を取り除いて、腹膜を露出させた。５ｍｌの氷冷ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で腹腔を３回洗浄して、液体を、氷上に置いた１５ｍｌのポリスチレン製のＦａｌｃｏｎチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に集めた。各洗浄をするときには、腹腔を軽くマッサージした。洗浄液を４２５×ｇで遠心分離し、上清を捨て、得られた細胞沈殿物を、１ｍｌのＰＢＳにやさしく何度もピペッティングして再懸濁した。１０μｌの細胞懸濁液を９０μｌのトリパンブルーで染色し、Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計算器を用いて、各１ｍｍ2の領域４つで計数して、全細胞数を数えた。血球計算器に添付されている使用説明書に従って、４つの計数結果の平均値を出して、希釈係数１０を掛け、再び１０を掛けて、１μｌあたりの細胞数を算出した。最後に、この総数を１０００倍（１ｍｌに等しい）して、回収した全細胞数を得た。
【０１０３】
結果
成熟した組換えヒトＣＣＬ２／ＭＣＰ−１およびＣＣＬ２＊と呼ばれる突然変異型、ならびに、これらに対応するＣＣＬ２−Ｐ８Ａ および ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（図１）と呼ばれる絶対的単量体突然変異体を大腸菌の中で発現させた。
【０１０４】
文献には、ＣＣＬ２におけるＰ８Ａ突然変異が、レセプターを発現する細胞や、ウイルスレセプター様タンパク質に対する結合に影響することなく、しかし、関連したアッセイ法において既知のＣＣＬ２アンタゴニストの活性を示すこともなく、ＣＣＬ２二量体の形成を阻害することが明確に示されている（Ｐａａａｖｏｌａ ＣＤ ｅｔ ａｌ．，１９９８の表１記載の（１＋９−７６）ＭＣＰ−１参照；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【０１０５】
ＣＣＬ２の絶対的単量体型は、細胞に基づいたアッセイ法で行われるアッセイにおいて、特異的かつ意外な性質を示す。腹膜細胞動員アッセイにおいて、ＣＣＬ２＊−Ｐ８ＡおよびＣＣＬ２−Ｐ８Ａは、天然のＣＣＬ２ほど細胞を動員することができない（図２）。さらに、これらの分子は、用量依存的な様式で、ＣＣＬ２誘導による（図３Ａ）、およびチオグリコール酸誘導によるマクロファージ動員を阻害することができる（図３Ｂ）。後者のアッセイにおいて、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａは、陽性対照（デキサメタゾン、既知の炎症性化合物）と同じくらい効果的に見える。
【０１０６】
実施例３：動物の疾患モデルにおけるＣＣＬ２−ｐ８Ａの性質
材料および方法
オボアルブミン誘導による肺炎症モデル
オボアルブミン誘導による肺炎症モデルは、公開されているように実施されていた（Ｂｌｙｔｈ ＤＩ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。２５μ１のオボアルブミン（２ｍｇ／ｍｌ）、２５０μｌの水酸化アルミニウムを、ＬＰＳを含まない０．９％ ＮａＣｌ（食塩水）７２５μｌの中で混合してから、４℃で３〜４時間沈殿させて調製したものである、２ｍｇの水酸化アルミニウム２％（Ｓｅｒｖａ）に沈殿させた１０μｇの鶏卵アルブミンを全容量２００μ１にしたものを腹腔内注射して、６匹のマウスのグループに感作した。感作してから１５日後、１５日目から１９日目まで毎日、吸入麻酔（イソフルレン）下で、５０μｌの食塩水に入れた１５μｇのオボアルブミンを鼻腔内投与して６匹のマウスのグループを処理および抗原投与した。各抗原投与の３０分前に、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（２００μｌ、腹腔内注射１回分あたり１０μｇ）を投与した。細胞動員および細胞計測数を評価するために、上記実施例２に記載されたように腹腔内洗浄を行った。
【０１０７】
ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）モデル
チャールズリバー・イタリー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｔａｌｙ：ＥＡＥに対する感受性が記録されている選抜系統；Ｓａｈｒｂａｃｈｅｒ ＵＣ ｅｔ ａｌ．，１９９８）に由来するＣ５７Ｂ１／６マウスを、０．５ｍｇのヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ，Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に入った２００μｇのＭＯＧ35-55ペプチド（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）からなる乳液０．２ ｍＬを左脇腹に皮下注射することにより免疫する（０日目）。その直後、４００μＬのバッファー（０．５ Ｍ ＮａＣｌ，０．０１７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０．０１５ Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ＝７．５）に溶解した５００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂ社、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）の静脈注射を受ける。２日目に、動物に５００ｎｇの百日咳毒素の２回目の静脈注射をする。７日目に、２回目の投薬である、ＣＦＡに入った２００μｇのＭＯＧ35-55ペプチドを右脇腹に皮下注射して、マウスに投与する。ほぼ８日から１０日目に始まって、この処理は、尻尾から前肢まで上ってくる少しずつ進行する麻痺をもたらす。７日目から、以下の臨床スコアを用いて、麻痺が存在するか、動物を個体ごとに試験した。；
０＝病気の徴候ない
０．５＝尾の部分的麻痺
１＝尾の麻痺
１．５＝尾の麻痺＋部分的な片側性の後肢の麻痺
２＝尾の麻痺＋後肢が弱る、または部分的な後肢の麻痺
２．５＝尾の麻痺＋部分的な後肢の麻痺（骨盤下部）
３＝尾の麻痺＝完全的な後肢の麻痺
３．５＝尾の麻痺＋完全的な後肢の麻痺＋失禁
４＝尾の麻痺＋後肢の麻痺＋前肢の弱りまたは部分的麻痺
５＝瀕死または死亡
【０１０８】
化合物または媒体による治療を、免疫後７日目に各動物に対して開始し、２１日間継続する（処理グループあたり動物１０〜１２頭）。インターフェロン−βとＣＣＬ２−Ｐ８Ａを、１日に１回、１０ｍｌ／ｋｇ ＰＢＳに可溶化させて、図に示した容量でそれぞれ皮下または静脈内に投与した。
【０１０９】
遅延型接触過敏症モデル
接触過敏症を測定するためにマウス耳介腫脹（ｅａｒ−ｓｗｅｌｌｉｎｇ）試験を、前述のように行った（Ｇａｒｒｉｇｕｅ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。簡単に説明すると、アセトン／オリーブ油（４：１）中０．５％の２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）溶液２５μ１を、毛を剃った腹に局所的に施用してマウスを感作した。５日後、同じ媒体中の０．２％ ＤＮＦＢを右耳に適用し、媒体だけを左耳に適用した。５日目にマウス（１グループあたりｎ＝６）を、０．０５、０．５または５ｍｇ／ｋｇ（それぞれ１、１０または１００マイクログラム／マウス）のＣＣＬ２−Ｐ８Ａ、デキサメタゾン（１ｍｇ／ｋｇ）、または対照グループではＰＢＳだけを腹腔内投与して処理した。この処理は、ＤＮＦＢを投与する３０分前に行われた。ダイアル式厚さ測定計（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社）で耳の厚さを測定した。投与後の値から投与前の値を引いて、また、さらに、媒体投与された反対側の耳で検出された膨張を全て引いて、耳の膨張を評価した。
【０１１０】
結果
ケモカインアンタゴニストとしてのＣＣＬ２−Ｐ８Ａの治療薬作用の可能性を、炎症および自己免疫疾患の動物モデルで試験した。
【０１１１】
ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａを疾患モデルである、オボアルブミン誘導による肺炎で試験した。アレルギー性肺炎のこの古典的なモデルでは、免疫反応を増強するために感作期間中水酸化アルミニウムのアジュバントとともにオボアルブミンでマウスを感作し、その後、５日間連続してオボアルブミンを鼻腔内投与して抗原投与するが、この期間中ずっとＣＣＬ２−Ｐ８Ａを腹腔内投与した。また、この場合、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａは、細胞動員を阻害することができた（図４）。
【０１１２】
第２のモデルでは、ヒトの中枢神経系の自己免疫性の炎症性脱髄疾患を治療するためのケモカイン（ＣＣＬ２を含む）のアンタゴニストを確認するために利用されてきた周知の多発性硬化症モデルであるＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）モデルでＣＣＬ２−Ｐ８を試験した（Ｍａｈａｄ ＤＪ ａｎｄ Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ ＲＭ，２００３；Ｉｚｉｋｓｏｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＣＣＬ−Ｐ８Ａは、ＥＡＥ誘発化合物で処理した後、臨床スコアで評価すると中程度または重度の病気を示す動物で試験した。これら２つの動物グループをそれぞれ５つのサブグループに分け、うち３つを異なった量のＣＣＬ２−Ｐ８Ａで処理し、残りの２つを陰性対照（媒体のみで処理した）または陽性対照（多発性硬化症を治療するための一般的な治療用産物であるインターフェロン−βで処理した）として用いた。動物の状態の変化を、処理期間（２１日間）中に測定した臨床スコアに基づいて比較した。両疾患モデルにおいて、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（０．１５ｍｇ／ｋｇまで低下させた投薬量で）は、統計学的に有意に動物の状態を改善する。ＣＣＬ−Ｐ８Ａを用いたときに観察される臨床スコアの減少は、少なくとも、インターフェロン−βを治療薬として用いたときに観察される臨床スコアの減少に匹敵する。（図５）。
【０１１３】
別の疾患モデルである接触過敏症モデルを用いて、Ｔ細胞によって仲介される皮膚炎に対するＣＣＬ２−Ｐ８Ａの治療効果の可能性を評価した。接触過敏症（ＣＨＳ）は、ランゲルハンス細胞（ＬＣ）依存性のＴ細胞介在型皮膚免疫反応で、インビボにおけるＬＣ活性（皮膚上抗原の取り込み、リンパ節への移動、および無処理Ｔ細胞への抗原提示）が最高になっていることを反映するものである。このモデルは、乾癬およびアレルギー性接触皮膚炎のような皮膚科学的適応症に対する化合物の特徴を調べるために十分に確立されている（Ｘｕ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９６）。それは、感作期間およびその後の抗原投与を含み、皮膚の浮腫および細胞浸潤物の形成を伴う皮膚炎をもたらす。浮腫は、抗原投与部位（マウスの耳）でノギスにより測定することができる。この過剰反応疾患の発症におけるケモカインの関与、特にＣＣＬ２の関与が示されていた（Ｍｉｔｓｕｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍｉｚｕｍｏｔｏ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。抗原（この場合ＤＮＦＢ）を投与する３０分前にＣＣＬ２−Ｐ８Ａを腹腔内投与すると、処理後１日で、既知の抗炎症性化合物（デキサメタゾン）を用いたときに観察される膨張の減少に匹敵し得る膨張の減少がもたらされる。対照用マウスは、抗原投与して得られたが、その前に感作させるか、させないで、Ｔ細胞依存性炎症および浮腫が形成されるか否かが決まる（図６）。
【０１１４】
したがって、ホモ二量体形成ＣＣ−ケモカインの単量体変異体であって、二量体化界面における水素結合パターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換によって生じた変異体は、インビボ細胞動員アッセイ法において、またヒト疾患の動物モデルにおいても、ケモカイン仲介型細胞動員のインヒビターであるが、このことは、これが、薬学的組成物を調製するために使用することができ、また治療法において使用することもできるケモカイン変異体を作成するための新しい方法であることを示唆している。
【０１１５】
実施例４：ＣＣＬ２−Ｐ８Ａの代替型
上記開示されたケモカイン変異体の代替型を、特定の特徴を改善するものとして当分野で既知の突然変異を導入することによって作成することができる。
【０１１６】
ＣＣＬ２−Ｐ８Ａの異なる位置に１つ以上の単一アミノ酸の置換および／または付加を導入することができる（図７Ａ）。ＣＣＬ２−Ｐ８Ａは、天然のグルタミンＮ末端残基を失った成熟タンパク質として、または、グルタミンの前のＮ末端に付加的な小型の残基（アラニンやグリシンなど）を付加して発現させることができ、その結果、この残基は露出した状態に置かれることなく、ピログルタミン酸型に自然に変換されることがなくなる（Ｇｏｎｇ Ｊ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−ＬｅｗｉｓＩ，１９９５）。また、ＣＣＬ−Ｐ８Ａは、５番目のシステインを利用して特異的ペグ化反応が可能になるよう突然変異させることもできる。これらのペグ化部位は、内部アミノ酸（例えば、１回の改変で単量体化とペグ化の両方をもたらすことができる１４位または１７位のアスパラギン、およびさらには８位）、またはＣ末端（天然のＣ末端スレオニンの後ろにシステインを直接付加することによる）のいずれかのレベルで取り込むことが可能である。
【０１１７】
この配列を、循環血液中における組換えタンパク質の安定性と有効性を向上させることが知られているタンパク質ドメインである、免疫グロブリンドメインの定常領域に融合させることによって、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａのさらなる変異体を得ることができる。得られた融合タンパク質は、融合タンパク質を培養培地に分泌させるのに適した発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞など）によって直接発現させることができる。好ましい構成において、成熟型ＣＣＬ２−Ｐ８Ａをコードする核酸配列は、５’末端においてヒトＣＣＬ２のシグナル配列をコードする核酸配列、および３’末端においてヒト免疫グロブリンのラムダ重鎖ＩｇＧ１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＡＡ７５３０２）の定常領域（セグメント２４６〜４６７）をコードする核酸配列に融合している発現ベクターの中にクローニングされる。得られたベクターを用いてＣＨＯ細胞株またはＨＥＫ２９３細胞株を形質転換することができ、Ｎ末端にＣＣＬ２−Ｐ８Ａ、Ｃ末端にＩｇＧ１配列を有する組換え融合タンパク質を安定して発現および分泌するクローン（図７Ｂ）を選択することができる。そして、生産規模を上げるため、および培養培地から組換え融合タンパク質を精製するためにこのクローンを用いることができる。あるいは、ヒト免疫グロブリンのラムダ重鎖ＩｇＧ１の定常領域（セグメント２４３〜４７４）とＣＣＬ２−Ｐ８Ａをコードする核酸の位置を逆にすることもでき、得られたタンパク質を、依然としてヒトＣＣＬ２のシグナル配列を用いるか、任意の別のシグナル配列を用いて発現および分泌させることができる。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ヒト成熟ＣＣＬ２（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ１３５００、配列番号１）、成熟ＣＣＬ２＋Ｐ８Ａ（配列番号２）、成熟ＣＣＬ２＊（配列番号３）、成熟ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（配列番号４）のアミノ酸配列。ＣＣＬ２＊およびＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａの第６４位におけるイソロイシンへの突然変異（Ｍ６４Ｉ）が四角で囲まれており、関連突然変異Ｐ８Ａをボールド体と下線で示す。
【図２】腹膜細胞動員アッセイ法において、組換えヒトＣＣＬ２およびＣＣＬ２−Ｐ８Ａの細胞動員活性をベースラインと比較したグラフ。
【図３】２種類の異なる誘導物質であるＣＣＬ２（図Ａ）またはチオグリコール酸（図Ｂ）を用いた、腹膜細胞動員アッセイ法におけるＣＣＬ２−Ｐ８Ａの用量応答阻害活性を示すグラフ。結果を、ベースライン量、陰性対照（媒体のみ、食塩水）および陽性対照であるデキサメタゾン（Ｄｅｘ、図Ｂのみ）と比較する。
【図４】オボアルブミン誘導肺炎症アッセイ法におけるＣＣＬ２−Ｐ８Ａの阻害活性を示すグラフ。結果を、ベースライン量、および陰性対照（食塩水）と比較する。
【図５】ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）と呼ばれる多発性硬化症の動物モデルにおいて、動物が、臨床スコアの低い（２以下：Ａ）軽い病気か、または、臨床スコアの高い（少なくとも３：Ｂ）重い病気を示す場合に、臨床スコアの減少に対するＣＣＬ２−Ｐ８Ａの効力を示すグラフである。データを、媒体のみ（陰性対照）、または、ＥＡＥモデルに関する陽性対照（マウスのインターフェロンβ）を用いて観察されるデータと比較してある。各グラフの下にあるアステリスクの数は、各時点で陰性対照と比較した場合に見られた効果の統計的有意性の程度を示している（一元配置分散分析の後にフィッシャー検定して計算すると、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、および＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する）。
【図６】皮膚炎の動物モデル（感作されたマウスの耳にＤＮＦＢによって引き起こされる炎症）に様々な用量で投与された場合のＣＣＬ２−Ｐ８Ａの阻害活性、すなわち、処理後の耳の膨潤容積に対するＣＣＬ２−Ｐ８Ａの効果を示すグラフであって、以下の対照と比較したものである。感作されていないが、５日目にＤＮＦＢを抗原投与された動物（Ａ）、感作され、抗原を投与されたが、媒体のみで処理された動物（Ｂ）、およびデキサメタゾン（Ｄｅｘ、ＣＣＬ２−Ｐ８Ａと同じ方法で投与された）で処理された動物。値は、６日目（処理および抗原投与後の日数）に測定された。
【図７】単一／複数のアミノ酸付加および／または置換によって（Ａ）、または、ヒト免疫グロブリンのλ重鎖ＩｇＧ１の第２４３〜４７４位の残基への融合（Ｂ、ＣＣＬ２シグナル配列を二重下線で、成熟型ＣＣＬ２−Ｐ８Ａを下線で示す）によって生成することができるＣＣＬ２−Ｐ８Ａの代替形態。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２を含むポリペプチドの薬物としての使用。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、さらに、配列番号２の６４位にイソロイシンを含むものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
さらに、前記ポリペプチドが、配列番号２および配列番号４の対応する配列の９位、１０位、または１３位に突然変異を含まないことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
さらに、前記ポリペプチドが、配列番号２および配列番号４の対応する配列において、
ａ）８位、１４位、１７位、または７７位にシステイン、または、
ｂ）１位においてアラニンまたはグリシン
を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域を含む、請求項１から４いずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
自己免疫性、炎症性、または感染性疾患を治療するための薬物を製造するための、配列番号２を含むポリペプチドの使用。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、さらに、配列番号２の６４位にイソロイシンを含む、請求項６５に記載の使用。
【請求項８】
さらに、前記ポリペプチドが、配列番号２および配列番号４の対応する配列の９位、１０位、または１３位に突然変異を含まないことを特徴とする、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
さらに、前記ポリペプチドが、配列番号２および配列番号４の対応する配列において、
ａ）８位、１４位、１７位、または７７位にシステイン、または、
ｂ）１位においてアラニンまたはグリシン
を含むことを特徴とする、請求項６または７に記載の使用。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域を含む、請求項６から９いずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記疾患が、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、骨関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、線維症、アレルギー性または過敏性の疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、癌、敗血症ショック、ウイルスまたはＨＩＶによる感染症、移植、気管支炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項１２】
前記疾患が、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、骨関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、線維症、アレルギー性または過敏性の疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、癌、敗血症ショック、ウイルスまたはＨＩＶによる感染症、移植、気管支炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項１３】
前記疾患が多発性硬化症である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記疾患が多発性硬化症である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
配列番号５のヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域に融合した配列番号２の融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
【請求項１６】
配列番号５の融合ポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項１７】
請求項１５に記載の融合ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）成熟型ＣＣＬ２−Ｐ８Ａをコードする核酸配列を、５’末端においてヒトＣＣＬ２のシグナル配列をコードする核酸配列、および３’末端においてヒト免疫グロブリンのラムダ重鎖ＩｇＧ１の定常領域（セグメント２４３〜４７４）をコードする核酸配列に融合している発現ベクターの中にクローニングする工程、
ｂ）得られたベクターによってＣＨＯ細胞株またはＨＥＫ２９３細胞株を形質転換する工程、
ｃ）Ｎ末端にＣＣＬ２−Ｐ８Ａ、Ｃ末端にＩｇＧ１配列を有する組換え融合タンパク質を安定して発現および分泌するクローンを選択する工程、
ｄ）培養培地から融合タンパク質を精製する工程
を含む方法。
【請求項１８】
本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＣＣＬ２において、二量体化する能力を遮断する単一点突然変異を作出する工程、
ｂ）レセプターに結合して、インビトロでアゴニストの性質を示す前記変異体を同定する工程、
ｃ）上記工程（ｂ）で同定された群から、さらに、腹膜細胞動員を阻害することを特徴とする前記変異体を同定する工程
を含む方法。
【請求項１９】
ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を活性成分として含む医薬組成物であって、前記変異体が、前記ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から得られる組成物。
【請求項２０】
前記単量体変異体が、
ａ）ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（配列番号２）、
ｂ）ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（配列番号４）、
ｃ）（ａ）または（ｂ）の活性型突然変異体、または
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を含むポリペプチド、および前記ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列
から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記単量体変異体が、活性画分、先駆物質、塩、誘導体、複合体または結合体の形態である、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
有効量のホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を投与することを含む、自己免疫性、炎症性、または感染性疾患を治療または予防するための方法であって、前記変異体が、前記ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から得られる方法。
【請求項２３】
前記単量体変異体が、
ａ）ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（配列番号２）、
ｂ）ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（配列番号４）、
ｃ）（ａ）または（ｂ）の活性型変異体、または
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を含むポリペプチド、および前記ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列
から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項１】
配列番号２を含むポリペプチドの薬物としての使用。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、さらに、配列番号２の６４位にイソロイシンを含むものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
さらに、前記ポリペプチドが、配列番号２および配列番号４の対応する配列の９位、１０位、または１３位に突然変異を含まないことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
さらに、前記ポリペプチドが、配列番号２および配列番号４の対応する配列において、
ａ）８位、１４位、１７位、または７７位にシステイン、または、
ｂ）１位においてアラニンまたはグリシン
を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域を含む、請求項１から４いずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
自己免疫性、炎症性、または感染性疾患を治療するための薬物を製造するための、配列番号２を含むポリペプチドの使用。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、さらに、配列番号２の６４位にイソロイシンを含む、請求項６５に記載の使用。
【請求項８】
さらに、前記ポリペプチドが、配列番号２および配列番号４の対応する配列の９位、１０位、または１３位に突然変異を含まないことを特徴とする、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
さらに、前記ポリペプチドが、配列番号２および配列番号４の対応する配列において、
ａ）８位、１４位、１７位、または７７位にシステイン、または、
ｂ）１位においてアラニンまたはグリシン
を含むことを特徴とする、請求項６または７に記載の使用。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域を含む、請求項６から９いずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記疾患が、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、骨関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、線維症、アレルギー性または過敏性の疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、癌、敗血症ショック、ウイルスまたはＨＩＶによる感染症、移植、気管支炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項１２】
前記疾患が、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、骨関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、線維症、アレルギー性または過敏性の疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、癌、敗血症ショック、ウイルスまたはＨＩＶによる感染症、移植、気管支炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項１３】
前記疾患が多発性硬化症である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記疾患が多発性硬化症である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
配列番号５のヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域に融合した配列番号２の融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
【請求項１６】
配列番号５の融合ポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項１７】
請求項１５に記載の融合ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）成熟型ＣＣＬ２−Ｐ８Ａをコードする核酸配列を、５’末端においてヒトＣＣＬ２のシグナル配列をコードする核酸配列、および３’末端においてヒト免疫グロブリンのラムダ重鎖ＩｇＧ１の定常領域（セグメント２４３〜４７４）をコードする核酸配列に融合している発現ベクターの中にクローニングする工程、
ｂ）得られたベクターによってＣＨＯ細胞株またはＨＥＫ２９３細胞株を形質転換する工程、
ｃ）Ｎ末端にＣＣＬ２−Ｐ８Ａ、Ｃ末端にＩｇＧ１配列を有する組換え融合タンパク質を安定して発現および分泌するクローンを選択する工程、
ｄ）培養培地から融合タンパク質を精製する工程
を含む方法。
【請求項１８】
本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＣＣＬ２において、二量体化する能力を遮断する単一点突然変異を作出する工程、
ｂ）レセプターに結合して、インビトロでアゴニストの性質を示す前記変異体を同定する工程、
ｃ）上記工程（ｂ）で同定された群から、さらに、腹膜細胞動員を阻害することを特徴とする前記変異体を同定する工程
を含む方法。
【請求項１９】
ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を活性成分として含む医薬組成物であって、前記変異体が、前記ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から得られる組成物。
【請求項２０】
前記単量体変異体が、
ａ）ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（配列番号２）、
ｂ）ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（配列番号４）、
ｃ）（ａ）または（ｂ）の活性型突然変異体、または
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を含むポリペプチド、および前記ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列
から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記単量体変異体が、活性画分、先駆物質、塩、誘導体、複合体または結合体の形態である、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
有効量のホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を投与することを含む、自己免疫性、炎症性、または感染性疾患を治療または予防するための方法であって、前記変異体が、前記ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から得られる方法。
【請求項２３】
前記単量体変異体が、
ａ）ＣＣＬ２−Ｐ８Ａ（配列番号２）、
ｂ）ＣＣＬ２＊−Ｐ８Ａ（配列番号４）、
ｃ）（ａ）または（ｂ）の活性型変異体、または
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を含むポリペプチド、および前記ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列
から選択される、請求項２１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５１０４０３（Ｐ２００７−５１０４０３Ａ）
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３４７６８（Ｐ２００６−５３４７６８）
【出願日】平成１６年１０月１８日（２００４．１０．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５２５７２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３７３０５
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（５９９１７７３９６）アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ (70)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月１８日（２００４．１０．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５２５７２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３７３０５
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（５９９１７７３９６）アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ (70)
【Ｆターム（参考）】
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