スクシンイミジル基を持つポルフィリン化合物もしくはその金属錯体、ポルフィリン金属錯体結合アルブミンおよびそれを含有する酸素輸液
【課題】より長期にわたって安定な酸素錯体を形成し、酸素輸液として有効に作用し得るポルフィリン金属錯体またはその前駆体としてのポルフィリン化合物を提供する。
【解決手段】 式［Ｉ］：
【化１】
（ここで、Ｒ1は、置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ2は、アルキレン基、Ｒ3は第４〜５周期の遷移金属イオンＭを配位させたときに、イミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭへの配位を許容する基、Ｒは、メチレン基またはエチレン基）で示されるポルフィリン化合物、または、第４〜５周期の遷移金属イオンが配位したその金属錯体。
【解決手段】 式［Ｉ］：
【化１】
（ここで、Ｒ1は、置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ2は、アルキレン基、Ｒ3は第４〜５周期の遷移金属イオンＭを配位させたときに、イミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭへの配位を許容する基、Ｒは、メチレン基またはエチレン基）で示されるポルフィリン化合物、または、第４〜５周期の遷移金属イオンが配位したその金属錯体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可逆的に酸素を結合解離でき、しかも蛋白質に直接結合可能なスクシンイミジル基を有するポルフィリン化合物もしくはその金属錯体、それをアルブミンに共有結合して得たポルフィリン金属錯体結合アルブミン、およびそのポルフィリン金属錯体結合アルブミンを含有する酸素輸液（人工酸素運搬体）に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内で酸素運搬・貯蔵の役割を担うヘモグロビンやミオグロビンの補欠分子族であるヘム、すなわちポルフィリン鉄（II）錯体は、酸素分圧に応答して分子状酸素を可逆的に結合解離する。このような天然のヘムと同じ酸素吸脱着能を合成のポルフィリン鉄（II）錯体で再現しようとする研究は１９７０年代から報告されているが、初期の研究例としては、非特許文献１、非特許文献２等が代表的であり、また、最近の開発動向は非特許文献３、非特許文献４等に体系的に記載されている。
【０００３】
室温条件下で安定な酸素錯体を形成できるポルフィリン鉄（II）錯体としては、５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン鉄（II）錯体（以下、FeTpivPP錯体と呼ぶ）が知られている（非特許文献５）。FeTpivPP錯体は、軸塩基、例えば１−アルキルイミダゾール、１−アルキル−２−メチルイミダゾール等を過剰に共存させると、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の有機溶媒中、室温で分子状酸素を可逆的に結合解離できる。また、この錯体をリン脂質から成る二分子膜小胞体に包埋させれば、生理条件下（水相系、ｐＨ７．４、３７℃）でも同様の酸素吸脱着機能が発揮される（例えば、非特許文献６等）。FeTpivPP錯体が酸素を可逆的に結合解離するためには、上述したように過剰モル数の軸塩基分子を外部から添加することが不可欠である。しかし、軸塩基として広く用いられているイミダゾール誘導体には薬理作用を持つものがあり、体内毒性の高い場合が多い。また、リン脂質小胞体を利用する場合、過剰に共存させたイミダゾール誘導体がその形態を不安定化させる要因ともなり得る。この軸塩基の添加量を極限的に少なくする方法は、分子内に共有結合でイミダゾール誘導体を導入することに他ならない。
【０００４】
本発明者らのグループは、ポルフィリン鉄（II）錯体の分子内へ置換基として、例えばアルキルイミダゾール誘導体を共有結合すれば、軸塩基を外部添加することなく安定な酸素運搬体を供給できるものと考え、既にポルフィリン環の２位に置換基を有するFeTpivPP類縁体を合成し、これをリン脂質小胞体中やヒト血清アルブミンに包接させた系について、可逆的な酸素の吸脱着反応を明らかにしている（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【０００５】
しかしながら、一般的に水溶液中では中心鉄（II）の酸化反応が加速されるため、得られる酸素錯体の安定度は著しく低い。換言すると、可逆的な酸素配位活性を発現できるのは、ポルフィリン鉄錯体の中心鉄が２価の状態にある時のみで、中心鉄が酸化し、鉄（III）錯体になると、その酸素配位活性は完全に失われる。本発明者らのグループが開発したポルフィリン鉄（II）錯体を水中に分散させる上記のリン脂質小胞体中やヒト血清アルブミンに包接させる先行技術は、ポルフィリン鉄（II）錯体を均一に水中へ溶解させるだけでなく、酸素配位座近傍に微小な疎水空間を提供することにより、酸素錯体の安定度を延長させる効果もあった。
【０００６】
他方、これらの系ではポルフィリン鉄（II）錯体の包接駆動力は、いずれも疎水性相互作用、すなわち非共有結合であるため、酸素結合サイトであるポルフィリン金属錯体が、疎水場から解離してしまう可能性もある。上記ポルフィリン金属錯体水溶液や分散液を人工酸素運搬体として、例えば赤血球代替物として体内へ投与した場合、ある程度の期間、血流中に留まり、酸素輸送体の役割を担ってくれることが望ましい。実際、アルブミン−ポルフィリン金属錯体複合体を血中に投与すると、ポルフィリン金属錯体はアルブミンから解離する。つまり、より長い血中半減期を実現するためには、アルブミンに強固な結合様式で固定できるポルフィリン金属錯体の設計と合成が待たれていたのが現状であった。
【非特許文献１】J. P. Collman, Acc. Chem. Res., 10, 265 (1977)
【非特許文献２】F. Basolo, B. M. Hoffman, J. A. Ibers, Acc. Chem. Res., 8, 384 (1975)
【非特許文献３】Momentau et al., Chem. Rev., 110, 7690 (1994)
【非特許文献４】J. P. Collman, Chem. Rev., 104, 561 (2004)
【非特許文献５】J. P. Collman, et al., J. Am. Chem. Soc., 97, 1427 (1975)
【非特許文献６】E. Tsuchida et al., J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1984, 1147 (1984)
【特許文献１】特開昭５９−１６４７９１号公報
【特許文献２】特開昭５９−１６２９２４号公報
【特許文献３】特開平８−３０１８７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、上記従来技術の問題点を解消し、より長期にわたって安定な酸素錯体を形成し、酸素輸液として有効に作用し得るポルフィリン金属錯体またはその前駆体としてのポルフィリン化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、より強固な結合様式でアルブミンに固定できるポルフィリン金属錯体の分子設計と機能発現に鋭意研究を重ねた結果、２位置へ酸素吸着能を有効に発揮させるために必要な置換基、すなわち塩基性軸配位子であるイミダゾール誘導体を結合させた５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリン金属錯体の側鎖部分に、アルブミンのアミノ酸残基と特異的に共有結合を形成し得るスクシンイミドエステル基を導入し、その活性基とアルブミンを共有結合で連結すると、従来の非共有結合でアルブミンの疎水領域へ包接させていた系に比べ、ポルフィリン金属錯体が格段に強固な力で固定されたアルブミン（すなわち、ポルフィリン金属錯体結合アルブミン）の合成が可能となり、安定な酸素錯体を形成し得る新しい酸素輸液が提供できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の第１の側面によれば、式［Ｉ］：
【化２】
【００１０】
（ここで、Ｒ1は、置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ2は、アルキレン基、Ｒ3は周期律表第４〜５周期の遷移金属イオンＭを配位させたときに、イミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭへの配位を許容する基、Ｒは、メチレン基またはエチレン基）で示されるポルフィリン化合物、または周期律表第４〜５周期の遷移金属イオンが配位したその金属錯体が提供される。
【００１１】
また、本発明の第２の側面によれば、本発明のポルフィリン金属錯体のスクシンイミジル基をアルブミンと反応させることによって得られるポルフィリン金属錯体結合アルブミンが提供される。
【００１２】
さらに、本発明の第３の側面によれば、本発明のポルフィリン金属錯体結合アルブミンを含有する酸素輸液が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のポルフィリン金属錯体は、テトラフェニルポルフィリン金属錯体の２位置に塩基性軸配位子として機能するイミダゾリル基と、蛋白質に共有結合可能な活性側鎖置換基としてスクシンイミジル基を有するので、アルブミンのリジン残基とアミド結合を形成し、安定度高い酸素錯体を形成することができる。つまり、本発明のポルフィリン金属錯体は、酸素結合能を保持したまま、アルブミンに共有結合により強固に結合させることができる。これを含有する新規な酸素輸液は、血中に投与した後も、ポルフィリン金属錯体が解離することのない、実用に耐える、安定度高い製剤として提供できる。また、本発明のポルフィリン金属錯体は前記した酸素輸液のほか、ガス吸着剤、酸素吸脱着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒等としても有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のポルフィリン化合物は、上記式［Ｉ］で示される。
【００１５】
式［Ｉ］において、Ｒ1は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ1は、１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であることが好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ18アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’ＯＯＣ−）、アルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基等である。ここで、Ｒ’で表されるアルキル基としては、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基が好ましい。
【００１６】
式［Ｉ］において、Ｒ2はアルキレン基であり、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００１７】
式［Ｉ］において、Ｒ3は周期律表第４〜５周期の遷移金属イオンＭを配位させたときに、イミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭへの配位を許容する（配位を阻害しない）基である。かかるＲ4の例を挙げると、水素原子、メチル基、エチル基またはプロピル基である。
【００１８】
また、式［Ｉ］において、Ｒは、メチレン基またはエチレン基である。
【００１９】
本発明は、式［Ｉ］のポルフィリン化合物に周期律表第４〜第５周期の遷移金属イオンＭが配位したポルフィリン金属錯体をも提供する。遷移金属イオンＭとしては、ＦｅまたはＣｏが好ましい。Ｆｅの原子価は＋２または＋３であり得、またＣｏの原子価は＋２であり得る。このポルフィリン金属錯体は、式［II］で示すことができる。
【化３】
【００２０】
式［II］において、Ｘ-は、塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンを表し、Ｘ-の個数ｎは、遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００２１】
ＭがＦｅ（II）、Ｃｏ（II）等の＋２価の遷移金属イオンである場合に、このポルフィリン金属錯体は、下記式［III］に示すように、ポルフィリン分子内に結合されたイミダゾール基が遷移金属イオンＭに配位した状態になる。
【化４】
【００２２】
このようなポルフィリン金属錯体は、当該分子のみで酸素結合能を発揮できるものである。また、本発明のポルフィリン金属錯体では、側鎖置換基として、蛋白質と共有結合可能なスクシンイミジル基を有しているため、これをアルブミンと室温で混合するだけで、酸素結合サイトであるポルフィリン金属錯体が、アルブミンのリジンアミノ基と共有結合を形成し、アルブミン内部にアミド結合を介して固定される。つまり、体内へ投与した場合でも、血液循環系でポルフィリン金属錯体がアルブミンから解離することはなく、より長い血中滞留時間が期待される。
【００２３】
酸素輸液の適応は、出血ショックの蘇生液（輸血用血液の血液代替物）のほか、術前血液希釈液、人工心肺等体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全等）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、癌治療用増感剤、再生組織細胞の培養液、さらに、稀少血液型患者への利用、宗教上の理由による輸血拒否患者への対応、動物医療への応用が期待されている。酸素輸液は、本発明のポルフィリン金属錯体結合アルブミンを生理食塩水に分散させることによって得られる。ポルフィリン金属錯体結合アルブミンの濃度は、その用途によって異なるが、代用血液としてはヘム濃度で９．２ｍＭ／Ｌ程度、その他では、それ以上の濃度を用いることができる。
【００２４】
加えて、ポルフィリンが例えば第４〜５周期に属する金属イオンの錯体である場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての付加価値も高い。従って、本発明のポルフィリン金属錯体は、酸素輸液のほか、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としての特徴を持つ。
【００２５】
本発明のポルフィリン化合物の製造方法には特に制限はないが、例えば、次の式［IV］：
【化５】
【００２６】
で示される２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンを出発物質として合成することができる。式［IV］において、Ｒ1は、上に定義した通りである。このポルフィリンは、例えば、Tsuchida et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1995, 747 (1995)に記載の方法を用いて合成することができる。
【００２７】
具体的には、式［Ａ］：Ｒ”ＯＯＣＲＣ（ＮＨ−Ｆｍｏｃ）ＣＯＯＨ（ここで、Ｒは、上に定義した通り、Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、Ｒ”は、例えば、ｔ−ブチル）で示されるアスパラギン酸もしくはグルタミン酸誘導体を適当な乾燥溶媒（例えば、ジクロロメタン、ベンゼン、ジメチルホルムアミド等）に溶解し、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加え、室温で１〜１２時間撹拌する。反応の進行に伴い白色の沈殿が生成するので、反応溶液を２〜３０分間氷浴中で冷却した後、析出したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を濾過により除去する。濾液に、式［IV］の２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンを加え、遮光下で１〜１２時間攪拌する。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で反応の進行を追跡し、必要であれば適当な塩基（ピリジン、ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等）を加える。溶媒を減圧除去し、残渣をベンゼンに溶解し、析出したＤＣＵを再び濾過により除去する。溶媒を減圧除去後、冷ヘキサンを加え、ポルフィリンを析出させる。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製すると、２−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｔ−ブトキシカルボニル−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンが得られる。ここで、アミノアシルは、いうまでもなく、アスパラギルまたはグルタミルである（以下、同じ）。
【００２８】
得られたポルフィリンをジメチルホルムアミドに溶解し、ピペリジンを加え、遮光下、室温で６〜２４時間撹拌する。ジメチルホルムアミドとピペリジンを減圧除去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製すると、２−（ｔ−ブトキシカルボニル−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンが得られる。
【００２９】
次に、下記式［Ｂ］で示されるω−イミダゾリルアルカン酸（式［Ｂ］において、Ｒ2およびＲ3は、上に定義した通り）の塩酸塩を蒸留ジメチルホルムアミドに溶解し、ＤＣＣと適当な塩基（例えばピリジン、ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等）を加え、室温で３０分〜４時間撹拌する。
【化６】
【００３０】
反応の進行に伴い生成したＤＣＵを濾過により除去し、濾液に２−（ｔ−ブトキシカルボニル−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンを加え、遮光下で１５分〜２時間攪拌する。溶媒を減圧除去し、残渣をジクロロメタンとトリエチルアミンの混合溶媒に再溶解し、６〜２４時間、室温、遮光下にて攪拌する。ＤＣＵを濾過により除去した後、残渣をベンゼンに溶解し、析出物を濾別して、溶媒を減圧除去する。残渣をクロロホルムに溶解し、純水と炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、脱水後、クロロホルムを除去して、２−（Ｎ−（ω−イミダゾリルアルカノイル）−ｔ−ブトキシカルボニル−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンを得る。本化合物は、光、シリカゲルカラムによる分離操作で分解してしまうので、そのまま次の反応に用いる。
【００３１】
こうして得られたポルフィリンを適当な乾燥溶媒（ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン等）に溶解し、トリフルオロ酢酸を加え、室温、遮光下で１〜６時間撹拌する。ＴＬＣで反応の進行を追跡、溶媒を減圧除去し、残渣にベンゼンを加え、２−（Ｎ−（ω−イミダゾリルアルカノイル）−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンを得る。本化合物は、光、シリカゲルカラムによる分離操作で分解してしまうので、そのまま次の反応に用いる。
【００３２】
得られたポルフィリンへ中心金属Ｍを導入する。この中心金属Ｍの導入は、例えばD. Dolphin 編、The Porphyrin、1978年、アカデミック・プレス社等に記載の一般法により達成され、相当のポルフィリン金属錯体として得られる。一般に、鉄錯体の場合にはポルフィリン鉄（III）錯体が、コバルト錯体の場合にはポルフィリンコバルト（II）錯体が得られる。
【００３３】
具体的には、２−（Ｎ−（ω−イミダゾリルアルカノイル）−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンの蒸留ＴＨＦ溶液を電解鉄と臭化水素酸により調製した臭化鉄（II）へ、乾燥アルゴン雰囲気下ですばやく加え、６０〜８０℃で２〜２４時間反応させる。溶媒を減圧除去後、残渣をクロロホルムに溶解させ、純水で十分に洗浄する。脱水、溶媒除去後、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画精製すると、茶色固体の２−（Ｎ−（ω−イミダゾリルアルカノイル）−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィナト鉄（III）が得られる。
【００３４】
このポルフィリンを適当な乾燥溶媒（ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、ジエチルエーテル等）に溶解し、ＤＣＣを加え、室温で１０分〜２時間撹拌する。そこへＮ−ヒドロキシスクシンイミドのジクロロメタン溶液を添加し、室温、遮光下にて２〜２４時間反応させる。ＴＬＣで反応の進行を追跡し、析出物を０℃で濾別し、溶媒を減圧除去する。残渣をベンゼンに溶解し、ＤＣＵを再び濾過により除去した後、溶媒を減圧除去すると、目的化合物２−（Ｎ−（ω−イミダゾリルアルカノイル）−スクシンイミジル−アミノ酸エステル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィナト鉄（III）が得られる。ここで、アミノ酸エステルは、いうまでもなく、アルギネートまたはグルタメートである。
【００３５】
なお、上記ポルフィリン金属錯体のうち、鉄（III）錯体の形を有する場合は、適当な還元剤（亜二チオン酸ナトリウム、アスコルビン酸等）を用い、常法により中心金属を３価から２価へ還元すれば、酸素結合活性が付与できる。
【００３６】
これらのポルフィリン鉄（II）錯体をアルブミンと結合させるには、まずポルフィリン鉄（II）錯体のカルボニル錯体エタノール溶液を調製し、それを例えばヒト血清アルブミンのリン酸緩衝水溶液と混合し、ゆっくりと室温で３０分〜３時間攪拌する。得られた溶液をリン酸緩衝水溶液に対して、１０〜２４時間透析し、エタノールを除去する。こうして得られたポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミンは、下記式［Ｖ］で示されるように、ポルフィリンのスクシンイミジルオキシ基が離脱したアシル基がアルブミンのリシンアミノ基とアミド結合を形成しているものである。一酸化炭素錯体として遮光下にて冷蔵保存する。
【化７】
【００３７】
組換えヒト血清アルブミンに共有結合した系、アルブミン多量体に共有結合した系、いずれの場合も酸素と接触すると速やかに安定な酸素錯体を生成する。また、これらの錯体は酸素分圧に応じて酸素を吸脱着できる。この酸素結合解離は可逆的に繰り返し行うことができ、酸素吸脱着剤、酸素運搬体として作用する。
【００３８】
酸素以外にも金属に配位性である気体の場合、相当する配位錯体を形成できる（例えば、一酸化炭素、一酸化窒素、二酸化窒素等）。これらの理由から、本発明のポルフィリン金属錯体は、特に鉄（II）またはコバルト（II）錯体の場合、有効な酸素輸液として機能することはもちろん、均一系、不均一系での酸化還元反応触媒、およびガス吸着剤としての応用が可能となる。
【実施例】
【００３９】
以下、この発明をいくつかの例により詳細に説明するが、本発明はそれらの例により限定されるものではない。
【００４０】
例１
Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸（ｔ−ブチルエステル）（３１４ｍｇ，０．７４mmol）をジクロロメタン２ｍＬに溶解し、ＤＣＣ（１５２ｍｇ，０．７４mmol）を加え、室温で２時間撹拌した。反応の進行に伴い白色の沈殿が生成した。１０分間氷浴中で冷却し、析出したＤＣＵを濾過により除去した。濾液に２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン（７６ｍｇ，７３μmol）を加え、溶液を１ｍＬまで濃縮。遮光下で２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の進行を追跡し、必要であればジメチルアミノピリジン（３．０ｍｇ，２５μmol）のジクロロメタン溶液を加える。溶媒を減圧除去し、残渣をベンゼンに溶解し、析出したＤＣＵを再び濾過により除去した。溶媒を減圧除去後、冷ヘキサンを加え、紫色のポルフィリンを析出させた。得られた混合物をシリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム／酢酸エチル＝１０／１）で精製し、目的化合物２−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンを１９５ｍｇ得た（収率：９２％）。
【００４１】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ=０．７１（CHCl3:CH3OH = 20:1(v/v)）
赤外吸収スペクトル（ν/cm-1）: 3432(NH); 1726（C=O（エステル））, 1690（C=O(アミド））
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, CHCl3）: 640, 589, 545, 513, 420
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（500 MHz, CDCl3, d(ppm)）, -2.7（s, 2H, 内部H）, 0.0-0.3（m, 36H, But）, 1.5（d, 9H, O-But of Glu）, 1.9, 2.4（m, 4H, -CH2CH2-）, 4.0-4.5（m, 4H, >CHNHCOOCH2CH<）, 5.2-5.5（m, 2H, -CH2-Por）, 7.1-7.8（m, 24H, フェニルH）, 8.6-8.8（m, 11H, アミドH, ピロールH）
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）： 1448 [M]+; 1470 [M+Na]+。
【００４２】
例２
２−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン（２１５ｍｇ，０．１５mmol）をジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、ピペリジン（２０ｍＬ）を加え、遮光下、室温で１３時間撹拌した。ジメチルホルムアミドとピペリジンを減圧除去した後、残渣をシリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／酢酸：１００／５／１）で精製し、目的化合物２−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンを１３１ｍｇ得た（収率：７２％）。
【００４３】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．３１(CHCl3:CH3OH/20:1(v/v))
赤外吸収スペクトル（ν/cm-1)： 3432(NH); 1730（C=O（エステル））, 1689（C=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, CHCl3）: 646, 589, 545, 514, 420
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（500 MHz, CDCl3, d(ppm)）, -2.7（s, 2H, 内部H）, 0.0-0.2（m, 36H, But）, 1.4（d, 9H, GluのO-But）, 2.1, 2.4（m, 4H, -CH2CH2-）, 3.5（s, 1H, >CH）, 5.2, 5.4（d, 2H, -CH2-Por）, 7.0-7.8（m, 16H, フェニルH）, 8.6-8.8（11H, m, アミド H, pyrrole H）
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）： 1226 [M]+; 1248 [M+Na]+。
【００４４】
例３
８−（２−メチルイミダゾリル）オクタン酸・塩酸塩（１０６ｍｇ，０．４８mmol）を蒸留ジメチルホルムアミドに溶解し、ＤＣＣ（８４ｍｇ，０．４８mmol）、トリエチルアミン（８５ｍＬ，０．６１２mmol）を加え、室温で２時間撹拌した。反応の進行に伴い生成したＤＣＵを濾過により除去し、濾液に２−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン（５０ｍｇ，４０．８μmol）を加え、遮光下で３０分間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をジクロロメタン２ｍＬとトリエチルアミン３ｍＬに再溶解し、１８時間室温、遮光下にて攪拌した。ＤＣＵを濾過により除去した後、残渣をベンゼン２ｍＬに溶解、析出物を濾別して、溶媒を減圧除去した。残渣をクロロホルムに溶解し、純水と炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。脱水後、クロロホルムを除去して、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンを得た。本化合物は、光、シリカゲルカラムによる分離操作で分解してしまうので、そのまま次の反応に用いた。
【００４５】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．２２（CHCl3:CH3OH=20:1(v/v)）
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, CHCl3）: 643, 588, 544, 513, 421
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）： 1432 [M]+。
【００４６】
例４
例３で得られた２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンをジクロロメタン５ｍＬに溶解し、トリフルオロ酢酸５ｍＬを加え、室温、遮光下で３時間撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を追跡、溶媒を減圧除去し、残渣にベンゼン５ｍＬを加え、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンを得た。本化合物は、光、シリカゲルカラムによる分離操作で分解してしまうので、そのまま次の反応に用いた。
【００４７】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．１７（CHCl3:CH3OH=10:1(v/v)）
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, CHCl3）: 643, 589, 544, 513, 420
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）: 1376 [M]+。
【００４８】
例５
ポルフィリンへの鉄導入反応は、例えばD. Dolphin編、The Porphyrin、1978年、アカデミック・プレス社等に記載の一般法により達成できる。
【００４９】
三つ口フラスコに臭化水素酸水溶液（１．６２ｍＬ）を入れ、窒素を３０分間通気して、完全に脱酸素した。素早く電解鉄１０７．８ｍｇ（１．９３mmol）を加え、８０℃まで昇温し１時間攪拌した。電解鉄が溶解し、透明薄緑色の溶液となったら、１３０℃まで昇温し、臭化水素酸及び水を蒸発除去した。得られた薄白色固体のＦｅＢｒ2へ、例４で合成した２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン５０ｍｇと２，６−ルチジン５０ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン溶液（５ｍＬ）を窒素雰囲気下で滴下し、１７時間沸点還流を行った。反応が終了したら、溶媒を減圧除去し、これをクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧除去後、残渣をクロロホルムに溶解させ、純水で十分に洗浄した。脱水、溶媒除去後、得られた混合物をシリカゲルカラム（CHCl3／CH3OH＝10／1）で分画精製した。得られた成分を真空乾燥し、茶色固体の２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィナト鉄（III）を２２ｍｇ得た（２−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンからの収率３７％）。
【００５０】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．６４（CHCl3:CH3OH=1:1(v/v)）
赤外吸収スペクトル(ν/cm-1）: 3429(NH); 1740（C=O（エステル））, 1683（C=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, CHCl3): 574.5, 417.5
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）: 1430 [M-Br]+。
【００５１】
例６
２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィナト鉄（III）（１１ｍｇ，７．７μmol）をジクロロメタン１．５ｍＬに溶解し、ＤＣＣ（４．２ｍｇ，２０μmol）を加え、室温で３０分間撹拌した。そこへＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．１ｍｇ）のジクロロメタン溶液（１ｍＬ）を添加し、室温、遮光下にて１４時間反応させた。ＴＬＣで反応の進行を追跡し、析出物を０℃で濾別し、溶媒を減圧除去した。残渣をベンゼンに溶解、ＤＣＵを再び濾過により除去した。溶媒を減圧除去して、目的化合物２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−スクシンイミジル−Ｌ−グルタメート）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィナト鉄（III）錯体・臭化物を１２ｍｇ得た（収率：１００％）。このポルフィリンの分析結果は、以下の通りである。
【００５２】
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．３８（CHCl3:MeOH=10:1）
赤外吸収スペクトル（ν/cm-1）： 3428(NH); 1740（C=O(エステル））, 1685（C=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, EtOH）:421, 568 nm
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）: 1527 [M-Br]+。
【００５３】
例７
例１において２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンの代わりに２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサノイル）アミノフェニル）ポルフィリンを用い、例３において８−（２−メチルイミダゾリル）オクタン酸・塩酸塩の代わりに８−イミダゾリルオクタン酸・塩酸塩を用いた以外は例１〜６と全く同様な方法に従って、２−（Ｎ−（８−（イミダゾリルオクタノイル）)−スクシンイミジル−Ｌ−グルタメート）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサノイル）アミノフェニル）ポルフィリン鉄（III）錯体・臭化物を定量的に合成した。
【００５４】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール：１０／１（容量／容量）：Ｒｆ：０．４５（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（cm-1）: 1741（νC=O（エステル））、1686（νC=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（CHCl3、λmax: 421, 505, 581, 647, 682 nm）
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）:1688 [M-Br]+。
【００５５】
例８
例１において２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンの代わりに２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルペンタノイル）アミノフェニル）ポルフィリンを用い、例３において８−（２−メチルイミダゾリル）オクタン酸・塩酸塩の代わりに１２−イミダゾリルドデカン酸・塩酸塩を用いた以外は例１〜６と全く同様な方法に従って、２−（Ｎ−（８−（イミダゾリルドデカノイル））スクシンイミジル−Ｌ−グルタメート）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロペンタノイル）アミノフェニル）ポルフィリン鉄（III）錯体・臭化物を定量的に合成した。
【００５６】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール：１０／１（容量／容量）：Ｒｆ：０．３７（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（cm-1）: 1739（νC=O（エステル））、1683（νC=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（CHCl3、λmax:420, 503, 578, 647, 685 nm）
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）: 1674 [M-Br]+。
【００５７】
例９
例１において２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンの代わりに２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（アダマンタノイル）アミノフェニル）ポルフィリンを、Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸（ｔ−ブチルエステル）の代わりにＦｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸（ｔ−ブチルエステル）を用いた以外は例１〜６と全く同様な方法に従って、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））スクシンイミジル−Ｌ−グルタメート）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（アダマンタノイル）アミノフェニル）ポルフィリン鉄（III）錯体・臭化物を定量的に合成した。
【００５８】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール：１０／１（容量／容量）：Ｒｆ：０．５４（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（cm-1）: 1740（νC=O（エステル））、1685（νC=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（CHCl3、λmax:420, 503, 582, 649, 679 nm）
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）: 1826 [M-Br]+。
【００５９】
例１０
例６で合成したポルフィリン鉄（III）錯体・臭化物４８．２μｇ（０．０３μmol）を１０ｍＬの無水トルエン溶液とし、窒素置換後、亜二チオン酸水溶液と不均一系で約２時間混合攪拌し、鉄（II）へ還元した。窒素雰囲気下、トルエン層だけを抽出、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥後、濾別し、得られたトルエン溶液を測定セルに移し密閉した。こうしてポルフィリン鉄（II）錯体のトルエン溶液を得た。この溶液の可視吸収スペクトルはλｍａｘ：４４０、５３８、５５７ｎｍで、当該錯体はイミダゾールが１つ配位した５配位デオキシ型に相当するものである。
【００６０】
この溶液に、酸素ガスを吹き込むと直ちにスペクトルが変化し、λｍａｘ：４２５、５５１ｎｍのスペクトルが得られた。これは明らかに酸素化錯体になっていることを示す。この酸素化錯体溶液に窒素ガスを１分間吹き込むことにより、可視吸収スペクトルは酸素化型スペクトルからデオキシ型スペクトルへ可逆的に変化し、酸素の吸脱着が可逆的に生起することを確認した。なお、酸素を吹き込み、次に窒素を吹き込む操作を繰り返し、酸素吸脱着を連続して行うことができた。
【００６１】
例１１
例６で合成したポルフィリン鉄（III）錯体・臭化物４８２μｇ（０．３μmol）のエタノール溶液（２．０ｍＬ）に、一酸化炭素雰囲気下、亜二チオン酸水溶液を加え、５分間撹拌、ヘムが直ちに還元されて一酸化炭素錯体を形成し、溶液の色はオレンジ色に変化した。吸収スペクトル測定から、カルボニル錯体が形成されていることを確認後、テフロンチューブを介して、一酸化炭素圧により、ゆっくりと組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ，０．０７５μmol，４．９８ｍｇ）のリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．３，３０ｍＭ）中へ滴下した（ＦｅｐｉｖＰ−ＳＩ／ｒＨＳＡ＝４／１（mol／mol））。ゆっくりと室温で１時間攪拌、得られた溶液をリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．３，３０ｍＭ）に対して、１５時間透析を行い、エタノールを除去した。得られたポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミンは、一酸化炭素錯体として遮光下にて冷蔵（４℃）保存した。
【００６２】
例１２
例１１で得られたポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミンの分子量測定は、Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectra(MALDI-TOFMS)AXIMA-CFR(KRATOS)により行った。分子イオンピークがｍ／ｚ：７０，６４３に現れ、ポルフィリン鉄（II）錯体がアミド結合でアルブミンに共有結合していることが示唆された。通常、アルブミンにポルフィリン金属錯体を包接させた複合体についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳやＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ測定で分子量測定すると、イオン化の途中でポルフィリン金属錯体が脱離してしまうため、アルブミン自身の質量（ｍ／ｚ：６６，５００）のみが観測される。今回の結果は、ポルフィリン金属錯体がアルブミンに共有結合して強固に固定された結果、分子イオンピークが明確に観測されたことを示している。アルブミン１分子当りにはポルフィリン鉄（II）錯体が約３分子結合していることが明らかとなった。
【００６３】
例１３
例１１で調製したポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミン（一酸化炭素錯体）溶液（４ｍＬ）を１ｃｍ石英製分光用セルに入れ、氷水浴で冷やしながら、酸素を通気（フロー）しながら、ハロゲンランプ（５００Ｗ）を用いてポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミン水溶液に光照射した（１０分間）。その後、得られた水溶液の紫外可視吸収スペクトル測定を行った。酸素錯体の形成を確認後、窒素を通気して、脱酸素を行いデオキシ体を調製した。ポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミンの窒素雰囲気下における吸収スペクトルは、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体型を示し、トルエン溶液中と同様に、軸塩基が中心鉄に分子内配位したデオキシ体であることが明らかとなった。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行し、その酸素結合は酸素分圧に応答して可逆的に変化した。酸素錯体の半減期は３７℃において、５時間であった。また、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体が得られた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可逆的に酸素を結合解離でき、しかも蛋白質に直接結合可能なスクシンイミジル基を有するポルフィリン化合物もしくはその金属錯体、それをアルブミンに共有結合して得たポルフィリン金属錯体結合アルブミン、およびそのポルフィリン金属錯体結合アルブミンを含有する酸素輸液（人工酸素運搬体）に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内で酸素運搬・貯蔵の役割を担うヘモグロビンやミオグロビンの補欠分子族であるヘム、すなわちポルフィリン鉄（II）錯体は、酸素分圧に応答して分子状酸素を可逆的に結合解離する。このような天然のヘムと同じ酸素吸脱着能を合成のポルフィリン鉄（II）錯体で再現しようとする研究は１９７０年代から報告されているが、初期の研究例としては、非特許文献１、非特許文献２等が代表的であり、また、最近の開発動向は非特許文献３、非特許文献４等に体系的に記載されている。
【０００３】
室温条件下で安定な酸素錯体を形成できるポルフィリン鉄（II）錯体としては、５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン鉄（II）錯体（以下、FeTpivPP錯体と呼ぶ）が知られている（非特許文献５）。FeTpivPP錯体は、軸塩基、例えば１−アルキルイミダゾール、１−アルキル−２−メチルイミダゾール等を過剰に共存させると、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の有機溶媒中、室温で分子状酸素を可逆的に結合解離できる。また、この錯体をリン脂質から成る二分子膜小胞体に包埋させれば、生理条件下（水相系、ｐＨ７．４、３７℃）でも同様の酸素吸脱着機能が発揮される（例えば、非特許文献６等）。FeTpivPP錯体が酸素を可逆的に結合解離するためには、上述したように過剰モル数の軸塩基分子を外部から添加することが不可欠である。しかし、軸塩基として広く用いられているイミダゾール誘導体には薬理作用を持つものがあり、体内毒性の高い場合が多い。また、リン脂質小胞体を利用する場合、過剰に共存させたイミダゾール誘導体がその形態を不安定化させる要因ともなり得る。この軸塩基の添加量を極限的に少なくする方法は、分子内に共有結合でイミダゾール誘導体を導入することに他ならない。
【０００４】
本発明者らのグループは、ポルフィリン鉄（II）錯体の分子内へ置換基として、例えばアルキルイミダゾール誘導体を共有結合すれば、軸塩基を外部添加することなく安定な酸素運搬体を供給できるものと考え、既にポルフィリン環の２位に置換基を有するFeTpivPP類縁体を合成し、これをリン脂質小胞体中やヒト血清アルブミンに包接させた系について、可逆的な酸素の吸脱着反応を明らかにしている（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【０００５】
しかしながら、一般的に水溶液中では中心鉄（II）の酸化反応が加速されるため、得られる酸素錯体の安定度は著しく低い。換言すると、可逆的な酸素配位活性を発現できるのは、ポルフィリン鉄錯体の中心鉄が２価の状態にある時のみで、中心鉄が酸化し、鉄（III）錯体になると、その酸素配位活性は完全に失われる。本発明者らのグループが開発したポルフィリン鉄（II）錯体を水中に分散させる上記のリン脂質小胞体中やヒト血清アルブミンに包接させる先行技術は、ポルフィリン鉄（II）錯体を均一に水中へ溶解させるだけでなく、酸素配位座近傍に微小な疎水空間を提供することにより、酸素錯体の安定度を延長させる効果もあった。
【０００６】
他方、これらの系ではポルフィリン鉄（II）錯体の包接駆動力は、いずれも疎水性相互作用、すなわち非共有結合であるため、酸素結合サイトであるポルフィリン金属錯体が、疎水場から解離してしまう可能性もある。上記ポルフィリン金属錯体水溶液や分散液を人工酸素運搬体として、例えば赤血球代替物として体内へ投与した場合、ある程度の期間、血流中に留まり、酸素輸送体の役割を担ってくれることが望ましい。実際、アルブミン−ポルフィリン金属錯体複合体を血中に投与すると、ポルフィリン金属錯体はアルブミンから解離する。つまり、より長い血中半減期を実現するためには、アルブミンに強固な結合様式で固定できるポルフィリン金属錯体の設計と合成が待たれていたのが現状であった。
【非特許文献１】J. P. Collman, Acc. Chem. Res., 10, 265 (1977)
【非特許文献２】F. Basolo, B. M. Hoffman, J. A. Ibers, Acc. Chem. Res., 8, 384 (1975)
【非特許文献３】Momentau et al., Chem. Rev., 110, 7690 (1994)
【非特許文献４】J. P. Collman, Chem. Rev., 104, 561 (2004)
【非特許文献５】J. P. Collman, et al., J. Am. Chem. Soc., 97, 1427 (1975)
【非特許文献６】E. Tsuchida et al., J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1984, 1147 (1984)
【特許文献１】特開昭５９−１６４７９１号公報
【特許文献２】特開昭５９−１６２９２４号公報
【特許文献３】特開平８−３０１８７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、上記従来技術の問題点を解消し、より長期にわたって安定な酸素錯体を形成し、酸素輸液として有効に作用し得るポルフィリン金属錯体またはその前駆体としてのポルフィリン化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、より強固な結合様式でアルブミンに固定できるポルフィリン金属錯体の分子設計と機能発現に鋭意研究を重ねた結果、２位置へ酸素吸着能を有効に発揮させるために必要な置換基、すなわち塩基性軸配位子であるイミダゾール誘導体を結合させた５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリン金属錯体の側鎖部分に、アルブミンのアミノ酸残基と特異的に共有結合を形成し得るスクシンイミドエステル基を導入し、その活性基とアルブミンを共有結合で連結すると、従来の非共有結合でアルブミンの疎水領域へ包接させていた系に比べ、ポルフィリン金属錯体が格段に強固な力で固定されたアルブミン（すなわち、ポルフィリン金属錯体結合アルブミン）の合成が可能となり、安定な酸素錯体を形成し得る新しい酸素輸液が提供できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の第１の側面によれば、式［Ｉ］：
【化２】
【００１０】
（ここで、Ｒ1は、置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ2は、アルキレン基、Ｒ3は周期律表第４〜５周期の遷移金属イオンＭを配位させたときに、イミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭへの配位を許容する基、Ｒは、メチレン基またはエチレン基）で示されるポルフィリン化合物、または周期律表第４〜５周期の遷移金属イオンが配位したその金属錯体が提供される。
【００１１】
また、本発明の第２の側面によれば、本発明のポルフィリン金属錯体のスクシンイミジル基をアルブミンと反応させることによって得られるポルフィリン金属錯体結合アルブミンが提供される。
【００１２】
さらに、本発明の第３の側面によれば、本発明のポルフィリン金属錯体結合アルブミンを含有する酸素輸液が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のポルフィリン金属錯体は、テトラフェニルポルフィリン金属錯体の２位置に塩基性軸配位子として機能するイミダゾリル基と、蛋白質に共有結合可能な活性側鎖置換基としてスクシンイミジル基を有するので、アルブミンのリジン残基とアミド結合を形成し、安定度高い酸素錯体を形成することができる。つまり、本発明のポルフィリン金属錯体は、酸素結合能を保持したまま、アルブミンに共有結合により強固に結合させることができる。これを含有する新規な酸素輸液は、血中に投与した後も、ポルフィリン金属錯体が解離することのない、実用に耐える、安定度高い製剤として提供できる。また、本発明のポルフィリン金属錯体は前記した酸素輸液のほか、ガス吸着剤、酸素吸脱着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒等としても有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のポルフィリン化合物は、上記式［Ｉ］で示される。
【００１５】
式［Ｉ］において、Ｒ1は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ1は、１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であることが好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ18アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’ＯＯＣ−）、アルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基等である。ここで、Ｒ’で表されるアルキル基としては、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基が好ましい。
【００１６】
式［Ｉ］において、Ｒ2はアルキレン基であり、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００１７】
式［Ｉ］において、Ｒ3は周期律表第４〜５周期の遷移金属イオンＭを配位させたときに、イミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭへの配位を許容する（配位を阻害しない）基である。かかるＲ4の例を挙げると、水素原子、メチル基、エチル基またはプロピル基である。
【００１８】
また、式［Ｉ］において、Ｒは、メチレン基またはエチレン基である。
【００１９】
本発明は、式［Ｉ］のポルフィリン化合物に周期律表第４〜第５周期の遷移金属イオンＭが配位したポルフィリン金属錯体をも提供する。遷移金属イオンＭとしては、ＦｅまたはＣｏが好ましい。Ｆｅの原子価は＋２または＋３であり得、またＣｏの原子価は＋２であり得る。このポルフィリン金属錯体は、式［II］で示すことができる。
【化３】
【００２０】
式［II］において、Ｘ-は、塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンを表し、Ｘ-の個数ｎは、遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００２１】
ＭがＦｅ（II）、Ｃｏ（II）等の＋２価の遷移金属イオンである場合に、このポルフィリン金属錯体は、下記式［III］に示すように、ポルフィリン分子内に結合されたイミダゾール基が遷移金属イオンＭに配位した状態になる。
【化４】
【００２２】
このようなポルフィリン金属錯体は、当該分子のみで酸素結合能を発揮できるものである。また、本発明のポルフィリン金属錯体では、側鎖置換基として、蛋白質と共有結合可能なスクシンイミジル基を有しているため、これをアルブミンと室温で混合するだけで、酸素結合サイトであるポルフィリン金属錯体が、アルブミンのリジンアミノ基と共有結合を形成し、アルブミン内部にアミド結合を介して固定される。つまり、体内へ投与した場合でも、血液循環系でポルフィリン金属錯体がアルブミンから解離することはなく、より長い血中滞留時間が期待される。
【００２３】
酸素輸液の適応は、出血ショックの蘇生液（輸血用血液の血液代替物）のほか、術前血液希釈液、人工心肺等体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全等）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、癌治療用増感剤、再生組織細胞の培養液、さらに、稀少血液型患者への利用、宗教上の理由による輸血拒否患者への対応、動物医療への応用が期待されている。酸素輸液は、本発明のポルフィリン金属錯体結合アルブミンを生理食塩水に分散させることによって得られる。ポルフィリン金属錯体結合アルブミンの濃度は、その用途によって異なるが、代用血液としてはヘム濃度で９．２ｍＭ／Ｌ程度、その他では、それ以上の濃度を用いることができる。
【００２４】
加えて、ポルフィリンが例えば第４〜５周期に属する金属イオンの錯体である場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての付加価値も高い。従って、本発明のポルフィリン金属錯体は、酸素輸液のほか、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としての特徴を持つ。
【００２５】
本発明のポルフィリン化合物の製造方法には特に制限はないが、例えば、次の式［IV］：
【化５】
【００２６】
で示される２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンを出発物質として合成することができる。式［IV］において、Ｒ1は、上に定義した通りである。このポルフィリンは、例えば、Tsuchida et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1995, 747 (1995)に記載の方法を用いて合成することができる。
【００２７】
具体的には、式［Ａ］：Ｒ”ＯＯＣＲＣ（ＮＨ−Ｆｍｏｃ）ＣＯＯＨ（ここで、Ｒは、上に定義した通り、Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、Ｒ”は、例えば、ｔ−ブチル）で示されるアスパラギン酸もしくはグルタミン酸誘導体を適当な乾燥溶媒（例えば、ジクロロメタン、ベンゼン、ジメチルホルムアミド等）に溶解し、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加え、室温で１〜１２時間撹拌する。反応の進行に伴い白色の沈殿が生成するので、反応溶液を２〜３０分間氷浴中で冷却した後、析出したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を濾過により除去する。濾液に、式［IV］の２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンを加え、遮光下で１〜１２時間攪拌する。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で反応の進行を追跡し、必要であれば適当な塩基（ピリジン、ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等）を加える。溶媒を減圧除去し、残渣をベンゼンに溶解し、析出したＤＣＵを再び濾過により除去する。溶媒を減圧除去後、冷ヘキサンを加え、ポルフィリンを析出させる。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製すると、２−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｔ−ブトキシカルボニル−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンが得られる。ここで、アミノアシルは、いうまでもなく、アスパラギルまたはグルタミルである（以下、同じ）。
【００２８】
得られたポルフィリンをジメチルホルムアミドに溶解し、ピペリジンを加え、遮光下、室温で６〜２４時間撹拌する。ジメチルホルムアミドとピペリジンを減圧除去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製すると、２−（ｔ−ブトキシカルボニル−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンが得られる。
【００２９】
次に、下記式［Ｂ］で示されるω−イミダゾリルアルカン酸（式［Ｂ］において、Ｒ2およびＲ3は、上に定義した通り）の塩酸塩を蒸留ジメチルホルムアミドに溶解し、ＤＣＣと適当な塩基（例えばピリジン、ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等）を加え、室温で３０分〜４時間撹拌する。
【化６】
【００３０】
反応の進行に伴い生成したＤＣＵを濾過により除去し、濾液に２−（ｔ−ブトキシカルボニル−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンを加え、遮光下で１５分〜２時間攪拌する。溶媒を減圧除去し、残渣をジクロロメタンとトリエチルアミンの混合溶媒に再溶解し、６〜２４時間、室温、遮光下にて攪拌する。ＤＣＵを濾過により除去した後、残渣をベンゼンに溶解し、析出物を濾別して、溶媒を減圧除去する。残渣をクロロホルムに溶解し、純水と炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、脱水後、クロロホルムを除去して、２−（Ｎ−（ω−イミダゾリルアルカノイル）−ｔ−ブトキシカルボニル−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンを得る。本化合物は、光、シリカゲルカラムによる分離操作で分解してしまうので、そのまま次の反応に用いる。
【００３１】
こうして得られたポルフィリンを適当な乾燥溶媒（ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン等）に溶解し、トリフルオロ酢酸を加え、室温、遮光下で１〜６時間撹拌する。ＴＬＣで反応の進行を追跡、溶媒を減圧除去し、残渣にベンゼンを加え、２−（Ｎ−（ω−イミダゾリルアルカノイル）−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンを得る。本化合物は、光、シリカゲルカラムによる分離操作で分解してしまうので、そのまま次の反応に用いる。
【００３２】
得られたポルフィリンへ中心金属Ｍを導入する。この中心金属Ｍの導入は、例えばD. Dolphin 編、The Porphyrin、1978年、アカデミック・プレス社等に記載の一般法により達成され、相当のポルフィリン金属錯体として得られる。一般に、鉄錯体の場合にはポルフィリン鉄（III）錯体が、コバルト錯体の場合にはポルフィリンコバルト（II）錯体が得られる。
【００３３】
具体的には、２−（Ｎ−（ω−イミダゾリルアルカノイル）−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィリンの蒸留ＴＨＦ溶液を電解鉄と臭化水素酸により調製した臭化鉄（II）へ、乾燥アルゴン雰囲気下ですばやく加え、６０〜８０℃で２〜２４時間反応させる。溶媒を減圧除去後、残渣をクロロホルムに溶解させ、純水で十分に洗浄する。脱水、溶媒除去後、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画精製すると、茶色固体の２−（Ｎ−（ω−イミダゾリルアルカノイル）−アミノアシル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−置換アミドフェニル）ポルフィナト鉄（III）が得られる。
【００３４】
このポルフィリンを適当な乾燥溶媒（ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、ジエチルエーテル等）に溶解し、ＤＣＣを加え、室温で１０分〜２時間撹拌する。そこへＮ−ヒドロキシスクシンイミドのジクロロメタン溶液を添加し、室温、遮光下にて２〜２４時間反応させる。ＴＬＣで反応の進行を追跡し、析出物を０℃で濾別し、溶媒を減圧除去する。残渣をベンゼンに溶解し、ＤＣＵを再び濾過により除去した後、溶媒を減圧除去すると、目的化合物２−（Ｎ−（ω−イミダゾリルアルカノイル）−スクシンイミジル−アミノ酸エステル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィナト鉄（III）が得られる。ここで、アミノ酸エステルは、いうまでもなく、アルギネートまたはグルタメートである。
【００３５】
なお、上記ポルフィリン金属錯体のうち、鉄（III）錯体の形を有する場合は、適当な還元剤（亜二チオン酸ナトリウム、アスコルビン酸等）を用い、常法により中心金属を３価から２価へ還元すれば、酸素結合活性が付与できる。
【００３６】
これらのポルフィリン鉄（II）錯体をアルブミンと結合させるには、まずポルフィリン鉄（II）錯体のカルボニル錯体エタノール溶液を調製し、それを例えばヒト血清アルブミンのリン酸緩衝水溶液と混合し、ゆっくりと室温で３０分〜３時間攪拌する。得られた溶液をリン酸緩衝水溶液に対して、１０〜２４時間透析し、エタノールを除去する。こうして得られたポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミンは、下記式［Ｖ］で示されるように、ポルフィリンのスクシンイミジルオキシ基が離脱したアシル基がアルブミンのリシンアミノ基とアミド結合を形成しているものである。一酸化炭素錯体として遮光下にて冷蔵保存する。
【化７】
【００３７】
組換えヒト血清アルブミンに共有結合した系、アルブミン多量体に共有結合した系、いずれの場合も酸素と接触すると速やかに安定な酸素錯体を生成する。また、これらの錯体は酸素分圧に応じて酸素を吸脱着できる。この酸素結合解離は可逆的に繰り返し行うことができ、酸素吸脱着剤、酸素運搬体として作用する。
【００３８】
酸素以外にも金属に配位性である気体の場合、相当する配位錯体を形成できる（例えば、一酸化炭素、一酸化窒素、二酸化窒素等）。これらの理由から、本発明のポルフィリン金属錯体は、特に鉄（II）またはコバルト（II）錯体の場合、有効な酸素輸液として機能することはもちろん、均一系、不均一系での酸化還元反応触媒、およびガス吸着剤としての応用が可能となる。
【実施例】
【００３９】
以下、この発明をいくつかの例により詳細に説明するが、本発明はそれらの例により限定されるものではない。
【００４０】
例１
Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸（ｔ−ブチルエステル）（３１４ｍｇ，０．７４mmol）をジクロロメタン２ｍＬに溶解し、ＤＣＣ（１５２ｍｇ，０．７４mmol）を加え、室温で２時間撹拌した。反応の進行に伴い白色の沈殿が生成した。１０分間氷浴中で冷却し、析出したＤＣＵを濾過により除去した。濾液に２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン（７６ｍｇ，７３μmol）を加え、溶液を１ｍＬまで濃縮。遮光下で２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の進行を追跡し、必要であればジメチルアミノピリジン（３．０ｍｇ，２５μmol）のジクロロメタン溶液を加える。溶媒を減圧除去し、残渣をベンゼンに溶解し、析出したＤＣＵを再び濾過により除去した。溶媒を減圧除去後、冷ヘキサンを加え、紫色のポルフィリンを析出させた。得られた混合物をシリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム／酢酸エチル＝１０／１）で精製し、目的化合物２−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンを１９５ｍｇ得た（収率：９２％）。
【００４１】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ=０．７１（CHCl3:CH3OH = 20:1(v/v)）
赤外吸収スペクトル（ν/cm-1）: 3432(NH); 1726（C=O（エステル））, 1690（C=O(アミド））
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, CHCl3）: 640, 589, 545, 513, 420
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（500 MHz, CDCl3, d(ppm)）, -2.7（s, 2H, 内部H）, 0.0-0.3（m, 36H, But）, 1.5（d, 9H, O-But of Glu）, 1.9, 2.4（m, 4H, -CH2CH2-）, 4.0-4.5（m, 4H, >CHNHCOOCH2CH<）, 5.2-5.5（m, 2H, -CH2-Por）, 7.1-7.8（m, 24H, フェニルH）, 8.6-8.8（m, 11H, アミドH, ピロールH）
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）： 1448 [M]+; 1470 [M+Na]+。
【００４２】
例２
２−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン（２１５ｍｇ，０．１５mmol）をジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、ピペリジン（２０ｍＬ）を加え、遮光下、室温で１３時間撹拌した。ジメチルホルムアミドとピペリジンを減圧除去した後、残渣をシリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／酢酸：１００／５／１）で精製し、目的化合物２−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンを１３１ｍｇ得た（収率：７２％）。
【００４３】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．３１(CHCl3:CH3OH/20:1(v/v))
赤外吸収スペクトル（ν/cm-1)： 3432(NH); 1730（C=O（エステル））, 1689（C=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, CHCl3）: 646, 589, 545, 514, 420
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（500 MHz, CDCl3, d(ppm)）, -2.7（s, 2H, 内部H）, 0.0-0.2（m, 36H, But）, 1.4（d, 9H, GluのO-But）, 2.1, 2.4（m, 4H, -CH2CH2-）, 3.5（s, 1H, >CH）, 5.2, 5.4（d, 2H, -CH2-Por）, 7.0-7.8（m, 16H, フェニルH）, 8.6-8.8（11H, m, アミド H, pyrrole H）
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）： 1226 [M]+; 1248 [M+Na]+。
【００４４】
例３
８−（２−メチルイミダゾリル）オクタン酸・塩酸塩（１０６ｍｇ，０．４８mmol）を蒸留ジメチルホルムアミドに溶解し、ＤＣＣ（８４ｍｇ，０．４８mmol）、トリエチルアミン（８５ｍＬ，０．６１２mmol）を加え、室温で２時間撹拌した。反応の進行に伴い生成したＤＣＵを濾過により除去し、濾液に２−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン（５０ｍｇ，４０．８μmol）を加え、遮光下で３０分間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をジクロロメタン２ｍＬとトリエチルアミン３ｍＬに再溶解し、１８時間室温、遮光下にて攪拌した。ＤＣＵを濾過により除去した後、残渣をベンゼン２ｍＬに溶解、析出物を濾別して、溶媒を減圧除去した。残渣をクロロホルムに溶解し、純水と炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。脱水後、クロロホルムを除去して、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンを得た。本化合物は、光、シリカゲルカラムによる分離操作で分解してしまうので、そのまま次の反応に用いた。
【００４５】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．２２（CHCl3:CH3OH=20:1(v/v)）
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, CHCl3）: 643, 588, 544, 513, 421
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）： 1432 [M]+。
【００４６】
例４
例３で得られた２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンをジクロロメタン５ｍＬに溶解し、トリフルオロ酢酸５ｍＬを加え、室温、遮光下で３時間撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を追跡、溶媒を減圧除去し、残渣にベンゼン５ｍＬを加え、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンを得た。本化合物は、光、シリカゲルカラムによる分離操作で分解してしまうので、そのまま次の反応に用いた。
【００４７】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．１７（CHCl3:CH3OH=10:1(v/v)）
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, CHCl3）: 643, 589, 544, 513, 420
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）: 1376 [M]+。
【００４８】
例５
ポルフィリンへの鉄導入反応は、例えばD. Dolphin編、The Porphyrin、1978年、アカデミック・プレス社等に記載の一般法により達成できる。
【００４９】
三つ口フラスコに臭化水素酸水溶液（１．６２ｍＬ）を入れ、窒素を３０分間通気して、完全に脱酸素した。素早く電解鉄１０７．８ｍｇ（１．９３mmol）を加え、８０℃まで昇温し１時間攪拌した。電解鉄が溶解し、透明薄緑色の溶液となったら、１３０℃まで昇温し、臭化水素酸及び水を蒸発除去した。得られた薄白色固体のＦｅＢｒ2へ、例４で合成した２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン５０ｍｇと２，６−ルチジン５０ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン溶液（５ｍＬ）を窒素雰囲気下で滴下し、１７時間沸点還流を行った。反応が終了したら、溶媒を減圧除去し、これをクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧除去後、残渣をクロロホルムに溶解させ、純水で十分に洗浄した。脱水、溶媒除去後、得られた混合物をシリカゲルカラム（CHCl3／CH3OH＝10／1）で分画精製した。得られた成分を真空乾燥し、茶色固体の２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィナト鉄（III）を２２ｍｇ得た（２−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンからの収率３７％）。
【００５０】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．６４（CHCl3:CH3OH=1:1(v/v)）
赤外吸収スペクトル(ν/cm-1）: 3429(NH); 1740（C=O（エステル））, 1683（C=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, CHCl3): 574.5, 417.5
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）: 1430 [M-Br]+。
【００５１】
例６
２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィナト鉄（III）（１１ｍｇ，７．７μmol）をジクロロメタン１．５ｍＬに溶解し、ＤＣＣ（４．２ｍｇ，２０μmol）を加え、室温で３０分間撹拌した。そこへＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．１ｍｇ）のジクロロメタン溶液（１ｍＬ）を添加し、室温、遮光下にて１４時間反応させた。ＴＬＣで反応の進行を追跡し、析出物を０℃で濾別し、溶媒を減圧除去した。残渣をベンゼンに溶解、ＤＣＵを再び濾過により除去した。溶媒を減圧除去して、目的化合物２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））−スクシンイミジル−Ｌ−グルタメート）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィナト鉄（III）錯体・臭化物を１２ｍｇ得た（収率：１００％）。このポルフィリンの分析結果は、以下の通りである。
【００５２】
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．３８（CHCl3:MeOH=10:1）
赤外吸収スペクトル（ν/cm-1）： 3428(NH); 1740（C=O(エステル））, 1685（C=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（λmax/nm, EtOH）:421, 568 nm
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）: 1527 [M-Br]+。
【００５３】
例７
例１において２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンの代わりに２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサノイル）アミノフェニル）ポルフィリンを用い、例３において８−（２−メチルイミダゾリル）オクタン酸・塩酸塩の代わりに８−イミダゾリルオクタン酸・塩酸塩を用いた以外は例１〜６と全く同様な方法に従って、２−（Ｎ−（８−（イミダゾリルオクタノイル）)−スクシンイミジル−Ｌ−グルタメート）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサノイル）アミノフェニル）ポルフィリン鉄（III）錯体・臭化物を定量的に合成した。
【００５４】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール：１０／１（容量／容量）：Ｒｆ：０．４５（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（cm-1）: 1741（νC=O（エステル））、1686（νC=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（CHCl3、λmax: 421, 505, 581, 647, 682 nm）
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）:1688 [M-Br]+。
【００５５】
例８
例１において２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンの代わりに２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルペンタノイル）アミノフェニル）ポルフィリンを用い、例３において８−（２−メチルイミダゾリル）オクタン酸・塩酸塩の代わりに１２−イミダゾリルドデカン酸・塩酸塩を用いた以外は例１〜６と全く同様な方法に従って、２−（Ｎ−（８−（イミダゾリルドデカノイル））スクシンイミジル−Ｌ−グルタメート）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロペンタノイル）アミノフェニル）ポルフィリン鉄（III）錯体・臭化物を定量的に合成した。
【００５６】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール：１０／１（容量／容量）：Ｒｆ：０．３７（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（cm-1）: 1739（νC=O（エステル））、1683（νC=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（CHCl3、λmax:420, 503, 578, 647, 685 nm）
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）: 1674 [M-Br]+。
【００５７】
例９
例１において２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリンの代わりに２−ヒドロキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（アダマンタノイル）アミノフェニル）ポルフィリンを、Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸（ｔ−ブチルエステル）の代わりにＦｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸（ｔ−ブチルエステル）を用いた以外は例１〜６と全く同様な方法に従って、２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリルオクタノイル））スクシンイミジル−Ｌ−グルタメート）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（アダマンタノイル）アミノフェニル）ポルフィリン鉄（III）錯体・臭化物を定量的に合成した。
【００５８】
＜分析結果＞
薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール：１０／１（容量／容量）：Ｒｆ：０．５４（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（cm-1）: 1740（νC=O（エステル））、1685（νC=O（アミド））
紫外可視吸収スペクトル（CHCl3、λmax:420, 503, 582, 649, 679 nm）
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（m/z）: 1826 [M-Br]+。
【００５９】
例１０
例６で合成したポルフィリン鉄（III）錯体・臭化物４８．２μｇ（０．０３μmol）を１０ｍＬの無水トルエン溶液とし、窒素置換後、亜二チオン酸水溶液と不均一系で約２時間混合攪拌し、鉄（II）へ還元した。窒素雰囲気下、トルエン層だけを抽出、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥後、濾別し、得られたトルエン溶液を測定セルに移し密閉した。こうしてポルフィリン鉄（II）錯体のトルエン溶液を得た。この溶液の可視吸収スペクトルはλｍａｘ：４４０、５３８、５５７ｎｍで、当該錯体はイミダゾールが１つ配位した５配位デオキシ型に相当するものである。
【００６０】
この溶液に、酸素ガスを吹き込むと直ちにスペクトルが変化し、λｍａｘ：４２５、５５１ｎｍのスペクトルが得られた。これは明らかに酸素化錯体になっていることを示す。この酸素化錯体溶液に窒素ガスを１分間吹き込むことにより、可視吸収スペクトルは酸素化型スペクトルからデオキシ型スペクトルへ可逆的に変化し、酸素の吸脱着が可逆的に生起することを確認した。なお、酸素を吹き込み、次に窒素を吹き込む操作を繰り返し、酸素吸脱着を連続して行うことができた。
【００６１】
例１１
例６で合成したポルフィリン鉄（III）錯体・臭化物４８２μｇ（０．３μmol）のエタノール溶液（２．０ｍＬ）に、一酸化炭素雰囲気下、亜二チオン酸水溶液を加え、５分間撹拌、ヘムが直ちに還元されて一酸化炭素錯体を形成し、溶液の色はオレンジ色に変化した。吸収スペクトル測定から、カルボニル錯体が形成されていることを確認後、テフロンチューブを介して、一酸化炭素圧により、ゆっくりと組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ，０．０７５μmol，４．９８ｍｇ）のリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．３，３０ｍＭ）中へ滴下した（ＦｅｐｉｖＰ−ＳＩ／ｒＨＳＡ＝４／１（mol／mol））。ゆっくりと室温で１時間攪拌、得られた溶液をリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．３，３０ｍＭ）に対して、１５時間透析を行い、エタノールを除去した。得られたポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミンは、一酸化炭素錯体として遮光下にて冷蔵（４℃）保存した。
【００６２】
例１２
例１１で得られたポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミンの分子量測定は、Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectra(MALDI-TOFMS)AXIMA-CFR(KRATOS)により行った。分子イオンピークがｍ／ｚ：７０，６４３に現れ、ポルフィリン鉄（II）錯体がアミド結合でアルブミンに共有結合していることが示唆された。通常、アルブミンにポルフィリン金属錯体を包接させた複合体についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳやＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ測定で分子量測定すると、イオン化の途中でポルフィリン金属錯体が脱離してしまうため、アルブミン自身の質量（ｍ／ｚ：６６，５００）のみが観測される。今回の結果は、ポルフィリン金属錯体がアルブミンに共有結合して強固に固定された結果、分子イオンピークが明確に観測されたことを示している。アルブミン１分子当りにはポルフィリン鉄（II）錯体が約３分子結合していることが明らかとなった。
【００６３】
例１３
例１１で調製したポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミン（一酸化炭素錯体）溶液（４ｍＬ）を１ｃｍ石英製分光用セルに入れ、氷水浴で冷やしながら、酸素を通気（フロー）しながら、ハロゲンランプ（５００Ｗ）を用いてポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミン水溶液に光照射した（１０分間）。その後、得られた水溶液の紫外可視吸収スペクトル測定を行った。酸素錯体の形成を確認後、窒素を通気して、脱酸素を行いデオキシ体を調製した。ポルフィリン鉄（II）錯体結合アルブミンの窒素雰囲気下における吸収スペクトルは、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体型を示し、トルエン溶液中と同様に、軸塩基が中心鉄に分子内配位したデオキシ体であることが明らかとなった。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行し、その酸素結合は酸素分圧に応答して可逆的に変化した。酸素錯体の半減期は３７℃において、５時間であった。また、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体が得られた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［Ｉ］：
【化１】
（ここで、Ｒ1は、置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ2は、アルキレン基、Ｒ3は周期律表第４〜５周期の遷移金属イオンＭを配位させたときに、イミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭへの配位を許容する基、Ｒは、メチレン基またはエチレン基）で示されるポルフィリン化合物、または周期律表第４〜５周期の遷移金属イオンＭが配位したその金属錯体。
【請求項２】
Ｒ1が、１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ2が、Ｃ1〜Ｃ10アルキレン基であり、Ｒ3が、水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である請求項１に記載のポルフィリン化合物またはその金属錯体。
【請求項３】
Ｒ1が、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ18アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基である請求項２に記載のポルフィリン化合物またはその金属錯体。
【請求項４】
Ｍが、ＦｅまたはＣｏである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の金属錯体。
【請求項５】
Ｆｅの価数が＋２価または＋３価である請求項４に記載の金属錯体。
【請求項６】
Ｃｏの価数が＋２価である請求項４に記載の金属錯体。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の金属錯体のスクシンイミジル基をアルブミンと反応させることによって得られるポルフィリン金属錯体結合アルブミン。
【請求項８】
前記スクシンイミジル基が前記アルブミンのリジンアミノ基と反応し、アミド結合を形成した請求項７記載のポルフィリン金属錯体結合アルブミン。
【請求項９】
アルブミンがヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、アルブミン多量体である請求項８記載のポルフィリン金属錯体結合アルブミン。
【請求項１０】
請求項９記載のポルフィリン金属錯体結合アルブミンを含有する酸素輸液。
【請求項１】
式［Ｉ］：
【化１】
（ここで、Ｒ1は、置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ2は、アルキレン基、Ｒ3は周期律表第４〜５周期の遷移金属イオンＭを配位させたときに、イミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭへの配位を許容する基、Ｒは、メチレン基またはエチレン基）で示されるポルフィリン化合物、または周期律表第４〜５周期の遷移金属イオンＭが配位したその金属錯体。
【請求項２】
Ｒ1が、１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ2が、Ｃ1〜Ｃ10アルキレン基であり、Ｒ3が、水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である請求項１に記載のポルフィリン化合物またはその金属錯体。
【請求項３】
Ｒ1が、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ18アルカン基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基である請求項２に記載のポルフィリン化合物またはその金属錯体。
【請求項４】
Ｍが、ＦｅまたはＣｏである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の金属錯体。
【請求項５】
Ｆｅの価数が＋２価または＋３価である請求項４に記載の金属錯体。
【請求項６】
Ｃｏの価数が＋２価である請求項４に記載の金属錯体。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の金属錯体のスクシンイミジル基をアルブミンと反応させることによって得られるポルフィリン金属錯体結合アルブミン。
【請求項８】
前記スクシンイミジル基が前記アルブミンのリジンアミノ基と反応し、アミド結合を形成した請求項７記載のポルフィリン金属錯体結合アルブミン。
【請求項９】
アルブミンがヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、アルブミン多量体である請求項８記載のポルフィリン金属錯体結合アルブミン。
【請求項１０】
請求項９記載のポルフィリン金属錯体結合アルブミンを含有する酸素輸液。
【公開番号】特開２００６−８６２３（Ｐ２００６−８６２３Ａ）
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１９０１９０（Ｐ２００４−１９０１９０）
【出願日】平成１６年６月２８日（２００４．６．２８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（０００２１８７１９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２８日（２００４．６．２８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（０００２１８７１９）
【Ｆターム（参考）】
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