スタウロスポリンを含む組み合わせ
本発明は骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病ならびにまた固形腫瘍をＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の医薬用組み合わせで処置する方法に関する。また前記した疾患または悪性腫瘍の処置のためのヒストンデアセチラーゼ阻害剤およびＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤の医薬用組み合わせの使用、ならびにこれらの疾患または悪性腫瘍の処置のための医薬品の製造のためのかかる医薬組成物の使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびｍｃｌ−１特異的核酸構築物のようなＭＣＬ−１阻害剤の医薬用組み合わせで骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症(ＳＭ)、ならびにまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を処置する方法に関する。ｍｃｌ−１特異的核酸構築物には、限定するものではないがアンチセンスｍｃｌ−１オリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物が含まれる。ｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物には、限定するものではないが低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)またはヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)構築物が含まれる。本発明はまた前記した疾患または悪性腫瘍の処置のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉおよびＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤の医薬用組み合わせの使用、ならびにこれらの疾患または悪性腫瘍の処置のための医薬品の製造のためのかかる医薬組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満細胞症は一つまたはそれより多い器官系における肥満細胞(ＭＣ)の異常蓄積を特徴とする障害の群に関して総称して使用される用語である。その疾患の皮膚および全身性異型が記載されている。皮膚肥満細胞症(ＣＭ)は典型的には幼児期に発症し、そして頻繁に自然退行を伴う良性の経過を示す。全身性肥満細胞症(ＳＭ)は任意の年齢で発症し得て、そして皮膚の合併症を伴うかまたは伴わない、一つまたはそれより多い内臓の合併症を特徴とする。ＣＭとは対照的に、ＳＭはＭＣの持続性のクローン性障害である。高比率の症例で形質転換ＫＩＴ変異Ｄ８１６Ｖが検出される。進行したＳＭでは、その他の骨髄細胞系列でも、Ｂリンパ球でさえも変異を検出できる。故にＳＭは多系列造血前駆細胞の疾患である。ＳＭが多系列前駆細胞から生じるという概念は、これらの患者が随伴性血液学的非肥満細胞系列疾患(ＡＨＮＭＤ)を発症し得るという考えによっても支持される。
【０００３】
ＷＨＯコンセンサス分類により、ＳＭの四つのカテゴリーが定義される：無痛性全身性肥満細胞症(ＩＳＭ)、ＡＨＮＭＤを伴う肥満細胞症(ＳＭ−ＡＨＮＭＤ)、侵襲性ＳＭ(ＡＳＭ)および肥満細胞白血病(ＭＣＬ)。ＳＭ異型はその臨床挙動および予後において互いに異なり、そして通常異なる治療を必要とする。ＩＳＭとは対照的に、とりわけＡＳＭまたはＭＣＬの患者は腫瘍縮小性または標的薬物での処置のための候補である。
【０００４】
これまでのところ、ＡＳＭまたはＭＣＬにおける腫瘍性ＭＣの成長を抑制するために、インターフェロン−アルファ(ＩＦＮα)またはクラドリビン(２ＣｄＡ)のようなわずかな薬物しか記載されておらず、そしてわずかな患者しか際だった、および永続的な応答を示さない。Ｎ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはニロチニブ(４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド)のようないくつかの新規チロシンキナーゼ(ＴＫ)阻害剤もまた腫瘍性ＭＣの成長に対抗し得る。しかしながらこの場合も、長く持続する応答は未だ記載されていない。その他の研究により、イマチニブはＳＭを有する患者の腫瘍性ＭＣの成長を阻止することが示唆される。しかしながらイマチニブの効果は、腫瘍性ＭＣが野生型ＫＩＴ、ＫＩＴ変異Ｆ５２２Ｃを宿す患者において、またはＦＩＰ１Ｌ１／ＰＤＧＦＲα融合遺伝子を随伴する共存性好酸球増加症を有する患者においてのみ認められている。それに反してイマチニブは、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈する腫瘍性ＭＣにはほとんど効果を示さなかった。実際に、ＳＭを有する大部分の患者において検出できるこのＫＩＴ変異はイマチニブに対する抵抗性を付与する。
【０００５】
最近はさらに有効な治療的研究法およびさらに有効な薬物組み合わせを開発するために、腫瘍性ＭＣの新しい標的を同定するための多くの試みが為されている。一つの有望な研究法は高悪性度のＭＣ腫瘍(ＡＳＭ、ＭＣＬ)でＭＣにおいて発現される生存性関連分子を調査することであるかもしれない。
【０００６】
Ｍｃｌ−１は種々の腫瘍細胞において抗アポトーシス的に作用すると考えられる、十分に特徴付けされたＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである。例えばMendelian Inheritance in Man、ＭＩＭアクセス番号１５９５５２を参照のこと。元来Ｍｃｌ−１は、白血病性ＭＬ−１細胞のＴＰＡ誘起の分化の間に発現される生存性強化分子として記載された。継続的な研究により、Ｍｃｌ−１は慢性骨髄性白血病の原発性腫瘍細胞において構成的に発現されることが示される。しかしながらこれまでのところ、その他の骨髄性腫瘍におけるＭｃｌ−１の発現および役割についてほとんど知られていない。
【０００７】
今では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物と組み合わされたＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤が治療的特性を保有することが見出されている。これらの知見によりＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびｍｃｌ−１阻害剤の組み合わせは骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、ならびにまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍の処置に特に有用であるとされる。
【０００８】
今ではとりわけＡＳＭおよびＭＣＬを含むＳＭの全ての異型における原発性腫瘍性ＭＣならびにＭＣＬ細胞系ＨＭＣ−１は構成的な様式でＭｃｌ−１を発現することが見出されている。加えてこれらの細胞におけるＭｃｌ−１のターゲティングは成長低下およびアポトーシスの誘導に、ならびにＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドおよびイマチニブを含むＴＫ阻害剤に対する感受性の増大に関連する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の組み合わせで使用するための特定の目的のＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤は４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドおよびイマチニブおよび式：
【化１】
または
【化２】
(ここで(II)は部分的に水素化された化合物(Ｉ)の誘導体である)または
【化３】
または
【化４】
または
【化５】
または
【化６】
(式中、
Ｒ１およびＲ２は互いに独立して非置換もしくは置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化もしくはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一もしくは二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルであり；
ｎおよびｍは互いに独立して０以上４以下の数字であり；
ｎ'およびｍ'は互いに独立して０以上４以下の数字であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８およびＲ１０は互いに独立して水素、−Ｏ−、３０個までの炭素原子を有するアシル、脂肪族、各々の場合に２９個までの炭素原子を有する炭素環式もしくは炭素環式脂肪族ラジカル、各々の場合に２０個までの炭素原子および各々の場合に９個までのヘテロ原子を有する複素環式もしくは複素環式脂肪族ラジカル、３０個までの炭素原子を有するアシルであり、ここでＲ４は不在でもよいか；
またはＲ３が３０個までの炭素原子を有するアシルである場合、Ｒ４はアシルではなく；
Ｒ４が不在である場合、ｐは０であるか、またはＲ３およびＲ４が双方共に存在し、そして各々の場合に前記のラジカルのうちの一つである場合１であり；
Ｒ５は水素、脂肪族、各々の場合に２９個までの炭素原子を有する炭素環式もしくは炭素環式脂肪族ラジカル、または各々の場合に２０個までの炭素原子および各々の場合に９個までのヘテロ原子を有する複素環式もしくは複素環式脂肪族ラジカル、または３０個までの炭素原子を有するアシルであり；
Ｒ７、Ｒ６およびＲ９はアシルもしくは−(低級アルキル)−アシル、非置換もしくは置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化もしくはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一もしくは二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ、カルボニル、カルボニルジオキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルであり；
Ｘは２個の水素原子；１個の水素原子およびヒドロキシ；Ｏ；または水素および低級アルコキシを意味し；
Ｚは水素または低級アルキルを表し；
そして波線で特徴付けられた２個の結合は環Ａで不在であり、４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ｂの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；
または波線で特徴付けられた２個の結合は環Ｂで不在であり、全部で４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ａの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；
または環Ａおよび環Ｂの双方で４個の波線の結合の全てが不在であり、全部で８個の水素原子により置き換えられるかのいずれかである)
のスタウロスポリン誘導体、または少なくとも一つの塩形成基が存在する場合はその塩である。
【００１０】
本明細書前記および後記で用いられる一般的な用語および定義は好ましくはスタウロスポリン誘導体に関する以下の意味を有する：
接頭辞「低級」とは関連するラジカルが好ましくは最大７個以下の炭素原子、特に最大４個以下の炭素原子を有することを示す。
低級アルキルは特にメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびまたペンチル、ヘキシルまたはヘプチルである。
【００１１】
非置換または置換アルキルは好ましくはＣ１−Ｃ２０アルキル、特に低級アルキル、典型的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり、それは特に非置換であるか、またはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素のようなハロゲン、フェニルもしくはナフチルのようなＣ６−Ｃ１４アリール、ヒドロキシ、低級アルコキシ、フェニル−低級アルコキシもしくはフェニルオキシのようなエーテル化ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシもしくはベンゾイルオキシのようなエステル化ヒドロキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、フェニル−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−(フェニル−低級アルキル)アミノのような一もしくは二置換アミノ、シアノ、メルカプト、低級アルキルチオのような置換メルカプト、カルボキシ、低級アルコキシカルボニルのようなエステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−低級アルキルカルバモイルもしくはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルカルバモイルのようなＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換カルバモイル、スルホ、低級アルカンスルホニルもしくは低級アルコキシスルホニルのような置換スルホ、アミノスルホニルまたはＮ−低級アルキルアミノスルホニルまたはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノスルホニルのようなＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルにより置換される。
【００１２】
ハロゲンは好ましくはフッ素、塩素、臭素またはヨウ素、特にフッ素または塩素である。
エーテル化ヒドロキシは特に低級アルコキシ、フェニルオキシのようなＣ６−Ｃ１４アリールオキシまたはベンジルオキシのようなＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルコキシである。
エステル化ヒドロキシは好ましくは低級アルカノイルオキシまたはベンゾイルオキシのようなＣ６−Ｃ１４アリールカルボニルオキシである。
一または二置換アミノは特に低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルキル、低級アルカノイルまたはＣ６−Ｃ１２アリールカルボニルにより一置換または二置換されたアミノである。
置換メルカプトは特に低級アルキルチオ、Ｃ６−Ｃ１４アリールチオ、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルチオ、低級アルカノイルチオまたはＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルカノイルチオである。
【００１３】
エステル化カルボキシは特に低級アルコキシカルボニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルコキシカルボニルまたはＣ６−Ｃ１４アリールオキシカルボニルである。
Ｎ−一またはＮ,Ｎ−二置換カルバモイルは特に低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリールまたはＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルによりＮ−一置換またはＮ,Ｎ−二置換されたカルバモイルである。
置換スルホニルは特にトルエンスルホニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルカンスルホニルまたは低級アルカンスルホニルのようなＣ６−Ｃ１４アリールスルホニルである。
Ｎ−一またはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルは特に低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリールまたはＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルによりＮ−一置換またはＮ,Ｎ−二置換されたアミノスルホニルである。
【００１４】
Ｃ６−Ｃ１４アリールは環系に６から１４個の炭素原子を有するフェニル、ナフチル、フルオレニルまたはインデニルのようなアリールラジカルであり、それは特に非置換であるか、またはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素のようなハロゲン、フェニルもしくはナフチル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、フェニル−低級アルコキシ、フェニルオキシ、低級アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、フェニル−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−(フェニル−低級アルキル)アミノ、シアノ、メルカプト、低級アルキルチオ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキルカルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルカルバモイル、スルホ、低級アルカンスルホニル、低級アルコキシスルホニル、アミノスルホニル、Ｎ−低級アルキルアミノスルホニルまたはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノスルホニルにより置換されている。
【００１５】
指数ｎおよびｍは各々の場合で好ましくは１、２または特に０である。一般的にｎおよびｍが各々の場合で０(ゼロ)である式Ｉの化合物が特に好ましい。
２９個までの炭素原子を有する脂肪族炭水化物ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は非環式置換基により置換されており、そして好ましくは最大１８個、特に最大１２個および通例せいぜい７個の炭素原子を有し、飽和または不飽和でよく、そして特に非置換または直鎖もしくは分岐した低級アルキル、低級アルケニル、低級アルカジエニル、または非環式置換基により置換された低級アルキニルラジカルである。低級アルキルは例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、およびまたｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルおよびｎ−ヘプチルであり；低級アルケニルは例えばアリル、プロペニル、イソプロペニル、２−または３−メタリルおよび２−または３−ブテニルであり；低級アルカジエニルは例えば１−ペンタ−２,４−ジエニルであり；低級アルキニルは例えばプロパルギルまたは２−ブチニルである。対応する不飽和ラジカルでは、二重結合は特に遊離原子価に関してα位よりも高位の位置にある。置換基は特に本明細書後記にてＲｏの置換基として定義されるアシルラジカル、好ましくはカルボキシもしくは低級アルコキシカルボニルのような遊離もしくはエステル化カルボキシ、シアノまたはジ−低級アルキルアミノである。
【００１６】
各々の場合で２９個までの炭素原子を有する炭素環式または炭素環式−脂肪族ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は特に芳香族、脂環式、脂環式−脂肪族、または芳香族−脂肪族ラジカルであり、それは非置換形態で存在するか、または本明細書後記でＲｏの置換基として言及されるラジカルにより置換されているかのいずれかである。芳香族ラジカル(アリールラジカル)Ｒ３またはＲ４は何よりも特にフェニル、また１−または２−ナフチルのようなナフチル、特に４−ビフェニリルのようなビフェニリル、およびまたアントリル、フルオレニルおよびアズレニル、ならびに１個またはそれより多い飽和環を有するその芳香族類似体であり、それは非置換形態で存在するか、または本明細書後記でＲｏの置換基として言及されるラジカルにより置換されているかのいずれかである。好ましい芳香族−脂肪族ラジカルはアリール−低級アルキル−およびアリール−低級アルケニルラジカル、例えばベンジル、フェネチル、１−、２−または３−フェニルプロピル、ジフェニルメチル(ベンズヒドリル)、トリチルおよびシンナミルのような末端フェニルラジカルを有するフェニル−低級アルキルまたはフェニル−低級アルケニル、ならびにまた１−または２−ナフチルメチルである。低級アルキルのような非環式ラジカルを担持するアリールラジカルのうち、種々の状態にあるメチルラジカルを有するｏ−、ｍ−およびｐ−トリルならびにキシリルラジカルが特記される。
【００１７】
２９個までの炭素原子を有する脂環式ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は特に置換または好ましくは非置換単環、二環または多環式シクロアルキル−、シクロアルケニル−、またはシクロアルカジエニルラジカルである。最大１４個、特に１２個の環炭素原子および３から８、好ましくは５から７、そして何より特に６員環を有するラジカルが好ましく、それはまた１個またはそれより多い、例えば２個の脂肪族炭化水素ラジカル、例えば前記にて挙げられたもの、特に低級アルキルラジカル、またはその他の脂環式ラジカルを置換基として担持することもできる。好ましい置換基は本明細書後記でＲｏに関して挙げられる非環式置換基である。
【００１８】
２９個までの炭素原子を有する脂環式−脂肪族ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は、非環式ラジカル、特にメチル、エチルおよびビニルのような特に最大７個、好ましくは最大４個の炭素原子を有するものが本明細書前記で定義されるような１個またはそれより多い脂環式ラジカルを担持するラジカルである。シクロアルキル−低級アルキルラジカルならびに環および／または鎖において不飽和であるが、非芳香族であり、そして鎖の末端炭素原子で環を担持するその類似体が特記される。好ましい置換基は本明細書後記でＲｏに関して挙げられる非環式置換基である。
【００１９】
各々２０個までの炭素原子および各々９個までのヘテロ原子を有する複素環式ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は特に単環式、しかしまた芳香族特性の二環または多環式、アザ−、チア−、オキサ−、チアザ−、オキサザ−、ジアザ−、トリアザ−またはテトラザ環式ラジカル、ならびに部分的または何より特に完全に飽和しているこの型の対応する複素環式ラジカルであり、これらのラジカルは、必要により、もしかするとさらに非環式、炭素環式もしくは複素環式ラジカルを担持し、および／またはもしかすると官能基により一、二もしくは三置換され、好ましくは脂肪族炭化水素ラジカルの置換基として本明細書前記にて挙げられたものである。何より特にそれらは２−アジリジニルのような窒素、酸素または硫黄原子を有する非置換または置換単環式ラジカル、および特にピリル(pyrryl)、例えば２−ピリルもしくは３−ピリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジルのようなこの型の芳香族ラジカル、およびまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリルであり；酸素、硫黄または窒素原子を有する類似の二環式ラジカル、例えばインドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、またはベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニルであり；いくつかのヘテロ原子を有する好ましい単環式および二環式ラジカルは、例えばイミダゾリル、典型的には２−もしくは４−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、またはチアゾリル、典型的には２−チアゾリル、およびベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、またはキナゾリル、典型的には２−キナゾリニルである。２−テトラヒドロフリル、２−または３−ピロリジニル、２−、３−または４−ピペリジル、およびまた２−または３−モルホリニル、２−または３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルおよびＮ−モノ−またはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニルラジカルのような適切な部分的または特に完全に飽和した類似ラジカルもまた考慮され得る。これらのラジカルはまた１個またはそれより多い非環式、炭素環式または複素環式ラジカル、特に本明細書にて前記されたものを担持することもできる。複素環式ラジカルＲ３またはＲ４の遊離原子価はその炭素原子の一つから生じたものでなければならない。ヘテロシクリルは非置換であるか、または本明細書前記にてＲｏに関して挙げられた１個またはそれより多い、好ましくは１または２個の置換基により置換されていてよい。
【００２０】
複素環式−脂肪族ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０、特に最大７個、好ましくは最大４個の炭素原子を有する、特に低級アルキルラジカル、例えば本明細書前記にて挙げられたものは、１個、２個またはそれより多い複素環式ラジカル、例えば前記のパラグラフで挙げられたものを担持し、複素環式環はもしかするとその窒素原子のうちの１個により脂肪族鎖に連結されている。好ましい複素環式−脂肪族ラジカルＲ１は、例えばイミダゾール−１−イルメチル、４−メチルピペラジン−１−イルメチル、ピペラジン−１−イルメチル、２−(モルホリン−４−イル)エチルおよびまたピリド−３−イルメチルである。ヘテロシクリルは非置換であるか、または本明細書後記にてＲｏに関して挙げられた１個またはそれより多い、好ましくは１個または２個の置換基により置換されていてよい。
【００２１】
各々２０個までの炭素原子および各々１０個までのヘテロ原子を有するヘテロ脂肪族ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は脂肪族ラジカルであり、それは１個、２個またはそれより多い炭素原子の代わりに同一のまたは異なる、特に酸素、硫黄および窒素のようなヘテロ原子を含有する。特に好ましいヘテロ脂肪族ラジカルＲ１の配列はオキサ−アルキルラジカルの形態を取り、ここで１個またはそれより多い炭素原子は好ましくは直鎖状アルキルで酸素原子により置き換えられ、好ましくはいくつかの(特に２個の)炭素原子により互いに分けられて、それらは反復基、必要により多反復基(Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−)ｑ(ここでｑ＝１から７)を形成する。
【００２２】
特に好ましいＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は、アシルは別として低級アルキル、特にメチルもしくはエチル；低級アルコキシカルボニル−低級アルキル、特にメトキシカルボニルメチルもしくは２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)エチル；カルボキシ−低級アルキル、特にカルボキシメチルもしくは２−カルボキシエチル；またはシアノ−低級アルキル、特に２−シアノエチルである。
【００２３】
３０個までの炭素原子を有するアシルラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０は、必要によりエステル化された、必要により機能的に修飾されたカルボン酸、有機スルホン酸またはピロ−もしくはオルトリン酸のようなリン酸から誘導される。
【００２４】
Ａｃ１と称され、そしてカルボン酸から誘導され、必要により機能的に修飾されたアシルは特に部分式Ｙ−Ｃ(＝Ｗ)−(式中、Ｗは酸素、硫黄またはイミノであり、そしてＹは水素、２９個までの炭素原子を有するヒドロカルビルＲｏ、ヒドロカルビルオキシＲｏ−Ｏ−、アミノ基または置換アミノ基、特に式ＲｏＨＮ−またはＲｏＲｏＮ−(式中、Ｒｏラジカルは同一または互いに異なってよい)の一つである)の一つである。
【００２５】
ヒドロカルビル(炭化水素ラジカル)Ｒｏは各々２９個までの炭素原子、特に１８個まで、および好ましくは１２個までの炭素原子を有する非環式(脂肪族)、炭素環式または炭素環式非環式炭化水素ラジカルであり、そして飽和または不飽和、非置換または置換されている。それは非環式および／または環式部分に１個、２個またはそれより多い炭素原子の代わりに同一のまたは異なる、特に酸素、硫黄および窒素のようなヘテロ原子を含有でき；後者の場合、それは複素環式ラジカル(ヘテロシクリルラジカル)または複素環式−非環式ラジカルとして記載される。
【００２６】
不飽和ラジカルは１個またはそれより多い、特に共役および／または単離された多重結合(二重または三重結合)を含有するものである。環式ラジカルなる用語にはまた共役二重結合を有する芳香族および非芳香族ラジカル、例えば少なくとも一つの６員炭素環式または５から８員複素環式環が最大数の非累積二重結合を含有するものが含まれる。少なくとも一つの環が６員芳香族環(すなわちベンゼン環)として存在する炭素環式ラジカルはアリールラジカルとして定義される。
【００２７】
非環式非置換炭化水素ラジカルＲｏは特に直鎖状または分岐した低級アルキル−、低級アルケニル−、低級アルカジエニル−、または低級アルキニルラジカルである。低級アルキルＲｏは例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、ならびにまたｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルおよびｎ−ヘプチルであり；低級アルケニルは例えばアリル、プロペニル、イソプロペニル、２−または３−メタリルおよび２−または３−ブテニルであり；低級アルカジエニルは、例えば１−ペンタ−２,４−ジエニルであり；低級アルキニルは、例えばプロパルギルまたは２−ブチニルである。対応する不飽和ラジカルでは、二重結合は特に遊離原子価に関してα位よりも高位の位置にある。
【００２８】
炭素環式炭化水素ラジカルＲｏは特に単環、二環または多環式シクロアルキル−、シクロアルケニル−もしくはシクロアルカジエニルラジカル、または対応するアリールラジカルである。好ましいのは最大１４個、特に１２個の環炭素原子、および３から８、好ましくは５から７、および何より特に６員環を有するラジカルであり、それはまた１個またはそれより多い、例えば２個の非環式ラジカル、例えば前記にて挙げられたもの、特に低級アルキルラジカルまたはその他の炭素環式ラジカルを担持できる。炭素環式−非環式ラジカルは、非環式ラジカル、特にメチル、エチルおよびビニルのような特に最大７個、好ましくは最大４個の炭素原子を有するものが１個またはそれより多い炭素環式、必要により前記の定義の芳香族ラジカルを担持するものである。シクロアルキル−低級およびアリール−低級アルキルラジカル、ならびに環および／または鎖で不飽和であるその類似体が特記され、そしてそれは鎖の末端炭素で環を担持する。
【００２９】
シクロアルキルＲｏは何より特に３個から１０個以下の炭素原子を有し、そして例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル、ならびにビシクロ[２,２,２]オクチル、２−ビシクロ[２,２,１]ヘプチルおよびアダマンチルであり、それはまた１個、２個またはそれより多い、例えば低級、アルキルラジカル、特にメチルラジカルにより置換されていてもよく；シクロアルケニルは例えば１、２または３位で二重結合を担持する、既に挙げられた単環式シクロアルキルラジカルの一つである。シクロアルキル−低級アルキルまたは−低級アルケニルは例えば前記で挙げられたシクロアルキルラジカルの一つにより置換された−メチル、−１−もしくは−２−エチル、−１−もしくは−２−ビニル、−１−、−２−もしくは−３−プロピルまたは−アリルであり、直鎖の末端で置換されたものが好ましい。
【００３０】
アリールラジカルＲ０は何より特にフェニル、また１−または２−ナフチルのようなナフチル、特に４−ビフェニリルのようなビフェニリル、およびまたアントリル、フルオレニルおよびアズレニル、ならびに１個またはそれより多い飽和環を有するその芳香族類似体である。好ましいアリール−低級アルキルおよび−低級アルケニルラジカルは、例えばベンジル、フェネチル、１−、２−または３−フェニルプロピル、ジフェニルメチル(ベンズヒドリル)、トリチルおよびシンナミルのような例えば末端フェニルラジカルを有するフェニル−低級アルキルまたはフェニル−低級アルケニル、ならびにまた１−または２−ナフチルメチルである。アリールは非置換または置換されていてよい。
【００３１】
複素環式−非環式ラジカルを含む複素環式ラジカルは特に単環式、しかしまた芳香族特性の二環または多環式、アザ−、チア−、オキサ−、チアザ−、オキサザ−、ジアザ−、トリアザ−またはテトラザ環式ラジカル、ならびに部分的または何より特に完全に飽和しているこの型の対応する複素環式ラジカルであり；必要により、例えば前記した炭素環式またはアリールラジカルの場合のように、これらのラジカルはさらに非環式、炭素環式もしくは複素環式ラジカルを担持でき、そして／または官能基により一、二もしくは三置換され得る。複素環式−非環式ラジカルの非環式部分は例えば対応する炭素環式−非環式ラジカルに関して示された意味を有する。何より特にそれらは２−アジリジニルのような窒素、酸素または硫黄原子を有する非置換または置換単環式ラジカル、および特にピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジルのようなこの型の芳香族ラジカル、およびまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリルであり；酸素、硫黄または窒素原子を有する類似の二環式ラジカルは、例えばインドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、またはベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニルであり；いくつかのヘテロ原子を有する好ましい単環式および二環式ラジカルは、例えばイミダゾリル、典型的には２−もしくは４−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、またはチアゾリル、典型的には２−チアゾリル、およびベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、またはキナゾリル、典型的には２−キナゾリニルである。２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、２−または３−ピロリジル、２−、３−または４−ピペリジル、およびまた２−または３−モルホリニル、２−または３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルおよびＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニルラジカルのような適切な部分的または特に完全に飽和した類似ラジカルもまた考慮され得る。これらのラジカルはまた１個またはそれより多い非環式、炭素環式または複素環式ラジカル、特に本明細書にて前記されたものを担持することもできる。複素環式−非環式ラジカルは特に最大７個、好ましくは最大４個の炭素原子、例えば本明細書前記にて挙げられたものを有する非環式ラジカルから誘導され、そして１個、２個またはそれより多い複素環式ラジカル、例えば本明細書前記にて挙げられたものを担持でき、その環はもしかするとその窒素原子のうちの１個により脂肪族鎖に連結されている。
【００３２】
既に記載したように、ヒドロカルビル(ヘテロシクリルを含む)は１個、２個またはそれより多い同一のまたは異なる置換基(官能基)により置換されていてよく；１個またはそれより多い以下の置換基を考慮できる：低級アルキル；遊離、エーテル化およびエステル化ヒドロキシル基；カルボキシ基およびエステル化カルボキシ基；メルカプト−および低級アルキルチオ−ならびに、必要により置換フェニルチオ基；ハロゲン原子、典型的には塩素およびフッ素、しかしまた臭素およびヨウ素；ハロゲン−低級アルキル基；ホルミルの形態で存在するオキソ基(すなわちアルデヒド)、およびケト基(また対応するアセタールまたはケタールとして)；アジド基；ニトロ基；シアノ基；第一級、第二級および好ましくは第三級アミノ基、アミノ−低級アルキル、一または二置換アミノ−低級アルキル、従来の保護基により保護された第一級または第二級アミノ基(特に低級アルコキシカルボニル、典型的にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)低級アルキレンジオキシ、およびまた遊離または機能的に修飾されたスルホ基、典型的には遊離形態または塩として存在するスルファモイルまたはスルホ基。ヒドロカルビルラジカルはまたカルバモイル、ウレイドまたはグアニジノ基を担持でき、それは遊離であるか、または１個もしくは２個の置換基およびシアノ基を担持する。前記の「(複数の)基」なる語の使用は個々の基をも意味すると見なされる。
【００３３】
ハロゲン−低級アルキルは好ましくは１から３個のハロゲン原子を含有し；好ましいのはトリフルオロメチルまたはクロロメチルである。
【００３４】
ヒドロカルビルに置換基として存在するエーテル化ヒドロキシル基は、例えば低級アルコキシ基、典型的にはメトキシ−、エトキシ−、プロポキシ−、イソプロポキシ−、ブトキシ−およびｔｅｒｔ−ブトキシ基であり、それはまた特に(ｉ)ヘテロシクリルにより置換されていてよく、それによりヘテロシクリルは好ましくは４から１２個の環原子を有することができ、不飽和または部分的もしくは完全に飽和されていてよく、単環または二環式であり、そして窒素、酸素および硫黄から選択される３個までのヘテロ原子を含有でき、そして何より特にピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジル、およびまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリル、インドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、ベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニル；イミダゾリル、典型的には１−もしくは２−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、チアゾリル、典型的には２−チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、キナゾリル、典型的には２−キナゾリニル、２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、２−もしくは４−テトラヒドロピラニル、１−、２−もしくは３−ピロリジル、１−、２−、３−もしくは４−ピペリジル、１−、２−もしくは３−モルホリニル、２−もしくは３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルまたはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニルであり；そしてまた(ii)ハロゲン原子により、２,２,２−トリクロロエトキシ、２−クロロエトキシもしくは２−ヨードエトキシラジカルのように特に２位で置換、例えば一、二もしくは多置換されていてよく、または(iii)ヒドロキシもしくは(iv)低級アルコキシラジカルにより、各々２−メトキシエトキシラジカルのように特に２位で置換、好ましくは一置換されていてよい。かかるエーテル化ヒドロキシル基はまた非置換または置換フェノキシラジカルおよび特にベンジルオキシ、ベンズヒドリルオキシおよびトリフェニルメトキシ(トリチルオキシ)のようなフェニル−低級アルコキシラジカル、ならびにヘテロシクリルオキシラジカルであり、ここでヘテロシクリルは好ましくは４から１２個の環原子を有することができ、不飽和または部分的もしくは完全に飽和されていてよく、単環または二環式であり、そして窒素、酸素および硫黄から選択される３個までのヘテロ原子を含有でき、そして何より特にピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジル、およびまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリル、インドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、ベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニル；イミダゾリル、典型的には１−もしくは２−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、チアゾリル、典型的には２−チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、キナゾリル、典型的には２−キナゾリニル、２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、２−もしくは４−テトラヒドロピラニル、１−、２−もしくは３−ピロリジル、１−、２−、３−もしくは４−ピペリジル、１−、２−もしくは３−モルホリニル、２−もしくは３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルまたはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニル；例えば特に２−または４−テトラヒドロピラニルオキシである。
【００３５】
この局面でエーテル化ヒドロキシル基はシリル化ヒドロキシル基、典型的には例えばトリ−低級アルキルシリルオキシ、典型的にはトリメチルシリルオキシおよびジメチル−ｔｅｒｔ−ブチルシリルオキシまたはフェニルジ−低級アルキルシリルオキシおよび低級アルキル−ジフェニルシリルオキシを含むと見なされる。
ヒドロカルビルに置換基として存在するエステル化ヒドロキシル基は、例えば低級アルカノイルオキシである。
【００３６】
ヒドロカルビルに置換基として存在するカルボキシル基は、水素原子が前記で特徴付けされたヒドロカルビルラジカルの一つ、好ましくは低級アルキル−またはフェニル−低級アルキルラジカルにより置き換えられたものであり；エステル化カルボキシル基の実例は低級アルコキシカルボニルまたは必要によりフェニル部分で置換されたフェニル−低級アルコキシカルボニル、特にメトキシ、エトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシおよびベンジルオキシカルボニル基、ならびにラクトン化カルボキシル基である。
【００３７】
ヒドロカルビルの置換基として第一級アミノ基−ＮＨ２はまた従来の保護基により保護された形態で存在し得る。第二級アミノ基は２個の水素原子のうちの１個の代わりにヒドロカルビルラジカル、好ましくは非置換のもの、典型的には前記で挙げられたものの一つ、特に低級アルキルを担持し、そして保護された形態でも存在し得る。
ヒドロカルビルに置換基として存在する第三級アミノ基は２個の異なる、または好ましくは同一の、前記で特徴付けされた非置換ヒドロカルビルラジカル、特に低級アルキルのようなヒドロカルビルラジカル(複素環式ラジカルを含む)を担持する。
【００３８】
好ましいアミノ基は式Ｒ１１(Ｒ１２)Ｎ−を有するものであり、式中、Ｒ１１およびＲ１２は各々の場合で独立して水素、非置換非環式Ｃ１−Ｃ７−ヒドロカルビル(例えば特にＣ１−Ｃ４アルキルまたはＣ２−Ｃ４アルケニル)または単環式アリール、アラルキルもしくはアラルケニルであり、必要によりＣ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、ハロゲンおよび／またはニトロにより置換され、そして最大１０個までの炭素原子を有し、ここで炭素含有ラジカルは必要によりヒドロカルビルにより置換された炭素−炭素結合または酸素原子、硫黄原子もしくは窒素原子を介して連結されていてよい。かかる場合に、それらはアミノ基の窒素原子を有する窒素含有複素環式環を形成する。以下は特に好ましい二置換アミノ基の実例である：ジ−低級アルキルアミノ、典型的にはジメチルアミノまたはジエチルアミノ、ピロリジノ、イミダゾール−１−イル、ピペリジノ、ピペラジノ、４−低級アルキルピペラジノ、モルホリノ、チオモルホリノおよびピペラジノまたは４−メチルピペラジノ、ならびに必要により、特にフェニル部分で例えば低級−アルキル、低級−アルコキシ、ハロゲンおよび／またはニトロにより置換されたジフェニルアミノおよびジベンジルアミノ；保護された基の実例、特に低級アルコキシカルボニルアミノ、典型的にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ、フェニル−低級アルコキシカルボニルアミノ、典型的には４−メトキシベンジルオキシカルボニルアミノおよび９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ。
【００３９】
アミノ−低級アルキルは何より特に低級アルキル鎖の１位でアミノにより置換され、そして特にアミノメチルである。
一もしくは二置換アミノ−低級アルキルは１個または２個のラジカルにより置換されたアミノ−低級アルキルであり、ここでアミノ−低級アルキルは何より特に低級アルキル鎖の１位でアミノにより置換され、そして特にアミノメチルであり；アミノ置換基はここでは好ましくは(２個の置換基が各々のアミノ基で互いに独立して存在する場合)特にメチル、エチルまたはｎ−プロピルのような低級アルキル、ヒドロキシ−低級アルキル、典型的には２−ヒドロキシエチル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、特にシクロヘキシル、アミノ−低級アルキル、典型的には３−アミノプロピルまたは４−アミノブチル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ(低級アルキル)−アミノ−低級アルキル、典型的には３−(Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ)プロピル、アミノ、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノおよびＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−(ヒドロキシ−低級アルキル)アミノを含む群からである。
【００４０】
二置換アミノ−低級アルキルはまた窒素原子を介して低級アルキルに結合した(好ましくは１位で)５または６員、飽和または不飽和ヘテロシクリルであり、そして０から２個、特に０または１個の、酸素、窒素および硫黄から選択されるその他のヘテロ原子を有し、それは非置換であるか、または特に低級アルキル、典型的にはメチルおよびまたオキソを含む群からの１個または２個のラジカルにより置換されている。ここで好ましいのはピロリジノ(１−ピロリジニル)、ピペリジノ(１−ピペリジニル)、ピペラジノ(１−ピペラジニル)、４−低級アルキルピペラジノ、典型的には４−メチルピペラジノ、イミダゾリノ(１−イミダゾリル)、モルホリノ(４−モルホリニル)、またはチオモルホリノ、Ｓ−オキソ−チオモルホリノ、もしくはＳ,Ｓ−ジオキソチオモルホリノでもある。
【００４１】
低級アルキレンジオキシは特にメチレンジオキシである。
１個または２個の置換基を担持するカルバモイル基は特にアミノカルボニル(カルバモイル)であり、それは窒素で１個または２個のラジカルにより置換されており；アミノ置換基はここで好ましくは(２個の置換基が各々のアミノ基で互いに独立して存在する場合)特にメチル、エチルまたはｎ−プロピルのような低級アルキル、ヒドロキシ−低級アルキル、典型的には２−ヒドロキシエチル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、特にシクロヘキシル、アミノ−低級アルキル、典型的には３−アミノプロピルまたは４−アミノブチル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ(低級アルキル)−アミノ−低級アルキル、典型的には３−(Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ)プロピル、アミノ、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノおよびＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−(ヒドロキシ−低級アルキル)アミノを含む群からであり；アミノカルバモイルの二置換アミノはまた結合窒素原子、ならびに０から２個、特に０または１個の、酸素、窒素および硫黄から選択されるその他のヘテロ原子を有する５または６員、飽和または不飽和ヘテロシクリルであり、それは非置換であるか、または特に低級アルキル、典型的にはメチルおよびまたオキソを含む群からの１個または２個のラジカルにより置換されている。ここで好ましいのはピロリジノ(１−ピロリジニル)、ピペリジノ(１−ピペリジニル)、ピペラジノ(１−ピペラジニル)、４−低級アルキルピペラジノ、典型的には４−メチルピペラジノ、イミダゾリノ(１−イミダゾリル)、モルホリノ(４−モルホリニル)、またはまたチオモルホリノ、Ｓ−オキソ−チオモルホリノ、もしくはＳ,Ｓ−ジオキソチオモルホリノである。
【００４２】
有機スルホン酸から誘導されるアシルはＡｃ２と称され、特に部分式Ｒｏ−ＳＯ２−を有するものであり、式中、Ｒｏは一般的および具体的な意味で前記で定義されたようなヒドロカルビルであり、ここでは後者がまた一般に好ましい。特に好ましいのは低級アルキルフェニルスルホニル、特に４−トルエンスルホニルである。
必要によりエステル化された、リン酸から誘導されるアシルはＡｃ３と称され、特に部分式ＲｏＯ(ＲｏＯ)Ｐ(＝Ｏ)−を有するものであり、式中、ラジカルＲｏは互いに独立して前記で示された一般的および具体的な意味で定義されるようなものである。
本明細書前記および後記で与えられる置換基に関するまびきデータ(reduced data)が好ましいと考えられる。
【００４３】
本発明による好ましい化合物は例えば、Ｒ０が以下の好ましい意味を有するものである：低級アルキル、特にメチルまたはエチル、アミノ−低級アルキル、ここでアミノ基は保護されていないか、または従来のアミノ保護基、特に低級アルコキシカルボニル、典型的にはｔｅｒｔ−低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルにより保護され、例えばアミノメチル、Ｒ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−アミノエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルまたはＲ,Ｓ−、Ｒ−、もしくは好ましくはＳ−１−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)エチルであり、カルボキシ−低級アルキル、典型的には２−カルボキシエチル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル、典型的には２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)エチル、シアノ−低級アルキル、典型的には２−シアノエチル、テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル、典型的には４−(テトラヒドロピラニル)−オキシメチル、モルホリノ−低級アルキル、典型的には２−(モルホリノ)エチル、フェニル、低級アルキルフェニル、典型的には４−メチルフェニル、低級アルコキシフェニル、典型的には４−メトキシフェニル、イミダゾリル−低級アルコキシフェニル、典型的には４−[２−(イミダゾール−１−イル)エチル)オキシフェニル、カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニル、低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−エトキシカルボニルフェニルもしくは４−メトキシフェニル、ハロゲン−低級アルキルフェニル、典型的には４−クロロメチルフェニル、ピロリジノフェニル、典型的には４−ピロリジノフェニル、イミダゾール−１−イルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イル)フェニル、ピペラジノフェニル、典型的には４−ピペラジノフェニル、(４−低級アルキルピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニル、モルホリノフェニル、典型的には４−モルホリノフェニル、ピロリジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピロリジノメチルフェニル、イミダゾール−１−イル−低級アルキルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イルメチル)フェニル、ピペラジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピペラジノメチルフェニル、(４−低級アルキルピペラジノメチル)−フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノメチル)フェニル、モルホリノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−モルホリノメチルフェニル、ピペラジノカルボニルフェニル、典型的には４−ピペラジノカルボニルフェニル、または(４−低級アルキル−ピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニルである。
【００４４】
好ましいアシルラジカルＡｃ１は部分式Ｒｏ−ＣＯ−を特徴とするカルボン酸のアシルラジカルであり、式中、ＲｏはヒドロカルビルラジカルＲｏの前記の一般的および好ましい意味の一つを有する。ここで特に好ましいラジカルＲｏは低級アルキル、特にメチルまたはエチル、アミノ−低級アルキルであり、ここでアミノ基は保護されていないか、または従来のアミノ保護基、特に低級アルコキシカルボニル、典型的にはｔｅｒｔ−低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルにより保護され、例えばアミノメチル、Ｒ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−アミノエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルまたはＲ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)エチルであり、カルボキシ−低級アルキル、典型的には２−カルボキシエチル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル、典型的には２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)エチル、テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル、典型的には４−(テトラヒドロピラニル)オキシメチル、フェニル、イミダゾリル−低級アルコキシフェニル、典型的には４−[２−(イミダゾール−１−イル)エチル]オキシフェニル、カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニル、低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−エトキシカルボニルフェニル、ハロゲン−低級アルキルフェニル、典型的には４−クロロメチルフェニル、イミダゾール−１−イルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イル)フェニル、ピロリジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピロリジノメチルフェニル、ピペラジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピペラジノメチルフェニル、(４−低級アルキルピペラジノメチル)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノメチル)フェニル、モルホリノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−モルホリノメチルフェニル、ピペラジノカルボニルフェニル、典型的には４−ピペラジノカルボニルフェニル、または(４−低級アルキルピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニルである。
【００４５】
さらに好ましいアシルＡｃ１は炭酸のモノエステルから誘導され、そして部分式Ｒｏ−Ｏ−ＣＯ−を特徴とする。低級アルキルラジカル、特にｔｅｒｔ−ブチルはこれらの誘導体で特に好ましいヒドロカルビルラジカルＲｏである。
別の好ましいアシルＡｃ１は炭酸(またはチオ炭酸もまた)のアミドから誘導され、そして式ＲｏＨＮ−Ｃ(＝Ｗ)−またはＲｏＲｏＮ−Ｃ(＝Ｗ)−を特徴とし、式中、ラジカルＲｏは互いに独立して前記で定義されるとおりであり、そしてＷは硫黄および特に酸素である。とりわけ、Ａｃ１が式ＲｏＨＮ−Ｃ(＝Ｗ)−のラジカルである化合物が好ましく、式中Ｗは酸素であり、そしてＲｏは以下の好ましい意味の一つを有する：モルホリノ−低級アルキル、典型的には２−モルホリノエチル、フェニル、低級アルコキシフェニル、典型的には４−メトキシフェニルもしくは４−エトキシフェニル、カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニル、または低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−エトキシカルボニルフェニル。
【００４６】
部分式Ｒｏ−ＳＯ２−(式中、Ｒｏは前記の一般的および具体的な意味で定義されるようなヒドロカルビルである)の好ましいアシルＡｃ２は低級アルキルフェニルスルホニル、典型的には４−トルエンスルホニルである。
ｐが０である場合、窒素原子結合Ｒ３は非荷電である。ｐが１である場合、次いでＲ４もまた存在しなければならず、そして窒素原子結合Ｒ３およびＲ４(第四級窒素)は次いで正に荷電する。
【００４７】
各々２９個までの炭素原子を有する脂肪族、炭素環式もしくは炭素環式脂肪族ラジカルに関する、または各々２０個までの炭素原子および各々９個までのヘテロ原子を有する複素環式もしくは複素環式−脂肪族ラジカル、または各々３０個までの炭素原子を有するアシルに関する定義は、好ましくは対応するラジカルＲ３およびＲ４に関して与えられた定義に合致する。特に好ましいのはＲ５低級アルキル、特にメチル、または何より特に水素である。
Ｚは特に低級アルキル、何より特にメチルまたは水素である。
【００４８】
波線により示される２個の結合が環Ａにおいて欠落している場合、次いで式Ｉで１、２、３および４の数字により特徴付けられる炭素原子間で二重結合は存在しない(四水素化誘導体)が、単結合のみ存在し、一方環Ｂは芳香族である(式Ｉの８および９により特徴付けられる炭素原子ならびに１０および１１により特徴付けられる炭素原子の間の二重結合)。波線により示される２個の結合が環Ｂにおいて欠落している場合、次いで式Ｉで８、９、１０および１１の数字により特徴付けられる炭素原子間で二重結合は存在しない(四水素化誘導体)が、単結合のみ存在し、一方環Ａは芳香族である(式Ｉの１および２により特徴付けられる炭素原子ならびに３および４により特徴付けられる炭素原子の間の二重結合)。波線により示される全部で４個の結合が環Ａおよび環Ｂにおいて欠落しており、そして全部で８個の水素原子により置き換えられている場合、次いで式Ｉの１、２、３、４、８、９、１０および１１の数字の炭素原子間で二重結合は存在しない(八水素化誘導体)が単結合のみ存在する。
【００４９】
その性質により、本発明の化合物は、塩形成基を含有する場合、薬学的、すなわち生理学的に許容される塩の形態でも存在し得る。単離および精製のためには薬学的に許容されない塩もまた使用できる。治療用途には薬学的に許容される塩のみが使用され、そしてこれらの塩が好ましい。
故に遊離酸基、例えば遊離スルホ、ホスホリルまたはカルボキシル基を有する式Ｉの化合物は塩形成塩基性構成成分との塩として、好ましく生理学的に許容される塩として存在し得る。これらは主としてアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属塩のような金属またはアンモニウム塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムもしくはカルシウム塩、またはアンモニアもしくは適当な有機アミン、特に第三級モノアミンおよび複素環式塩基、例えばトリエチルアミン、トリ−(２−ヒドロキシエチル)−アミン、Ｎ−エチルピペリジンもしくはＮ,Ｎ'−ジメチルピペラジンとのアンモニウム塩でよい。
【００５０】
塩基性特徴を有する本発明の化合物はまた付加塩、特に無機および有機酸との酸付加塩として、しかしまた第四級塩として存在し得る。故に例えば置換基としてアミノ基のような塩基性基を有する化合物は一般の酸と酸付加塩を形成し得る。適当な酸は、例えばハロゲン化水素酸、例えば塩酸および臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸もしくは過塩素酸、または脂肪族、非環式、芳香族もしくは複素環式カルボン酸もしくはスルホン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、シュウ酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、アントラニル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンジスルホン酸、ハロベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸またはスルファニル酸、およびまたメチオニン、トリプトファン、リジンまたはアルギニン、ならびにアスコルビン酸である。
【００５１】
遊離形態および、例えば新規化合物の精製または同定における中間物質として使用できるこれらの塩を含むその塩、およびその溶媒和物形態の化合物(特に式Ｉの)の間の密接な関係に鑑みて、本明細書前記および後記の遊離化合物に対する任意の言及は対応する塩、およびその溶媒和物、例えば水和物、必要に応じて賦形剤への言及として理解されるべきである。
式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｉ、II、III、IV、ＶまたはVIの化合物、特に式中、Ｒ５が水素であるものは貴重な薬理学的特性を保持する。
本明細書前記および後記で記載されたラジカルまたは化合物の基の場合、一般的な定義を適切でそして便宜的である限り、本明細書前記および後記で記載されたさらに具体的な定義により置き換えることができる。
【００５２】
好ましいのは；
Ｒ１およびＲ２は互いに独立して低級アルキル、ハロゲンにより置換された低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、ヒドロキシ、低級アルコキシ、フェニル−低級アルコキシ、フェニルオキシ、低級アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、フェニル−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−(フェニル−低級アルキル)アミノ、シアノ、メルカプト、低級アルキルチオ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキルカルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルカルバモイル、スルホ、低級アルカンスルホニル、低級アルコキシスルホニル、アミノスルホニル、Ｎ−低級アルキルアミノスルホニルもしくはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノスルホニル；ハロゲン；低級アルコキシ；Ｃ６−Ｃ１４アリールオキシ；Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルコキシ；低級アルカノイルオキシ；Ｃ６−Ｃ１４アリールカルボニルオキシ；低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルキル、低級アルカノイルもしくはＣ６−Ｃ１２アリールカルボニルにより一置換もしくは二置換されたアミノ；シアノ；ニトロ；メルカプト；低級アルキルチオ；Ｃ６−Ｃ１４アリールチオ；Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルチオ；低級アルカノイルチオ；Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルカノイルチオ；カルボキシ；低級アルコキシカルボニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルコキシカルボニル；Ｃ６−Ｃ１４アリールオキシカルボニル；カルバモイル；低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリールもしくはＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルによりＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換されたカルバモイル；スルホ；Ｃ６−Ｃ１４アリールスルホニル；Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルカンスルホニル；低級アルカンスルホニル；または低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリールもしくはＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルによりＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換されたアミノスルホニルであり、ここでＣ６−Ｃ１４アリールは環系に６個から１２個の炭素原子を有するアリールラジカルであり、それは非置換であるか、またはハロゲン、フェニルもしくはナフチル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、フェニル−低級アルコキシ、フェニルオキシ、低級アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、フェニル−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−(フェニル−低級アルキル)アミノ、シアノ、メルカプト、低級アルキルチオ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキルカルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルカルバモイル、スルホ、低級アルカンスルホニル、低級アルコキシスルホニル、アミノスルホニル、Ｎ−低級アルキルアミノスルホニルまたはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノスルホニルにより置換されていてよく；
【００５３】
ｎおよびｍは互いに独立して０または１または２、好ましくは０であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８、Ｒ１０は互いに独立して水素、低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルカジエニルであり、それは各々非置換であるか、または低級アルキル；ヒドロキシ；低級アルコキシ、それは(ｉ)４から１２個の環原子を有するヘテロシクリル(それは不飽和、完全飽和または部分的に飽和されていてよく、単環式または二環式であり、そして窒素、酸素および硫黄から選択される３個までのヘテロ原子を含有でき、そして何より特にピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジル、または広義ではまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリル、インドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、ベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニル；イミダゾリル、典型的には１−もしくは２−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、チアゾリル、典型的には２−チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、キナゾリル、典型的には２−キナゾリニル、２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロピラニル、１−、２−もしくは３−ピロリジル、１−、２−、３−もしくは４−ピペリジル、１−、２−もしくは３−モルホリニル、２−もしくは３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルまたはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニルである)により、(ii)ハロゲンにより、(iii)ヒドロキシにより、または(iv)低級アルコキシにより一、二もしくは三置換されていてよい；フェノキシ；フェニル−低級ルコキシ；ヘテロシクリルオキシ、ここでヘテロシクリルはピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジル、または広義ではまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリル、インドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、ベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニル；イミダゾリル、典型的には１−もしくは２−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、チアゾリル、典型的には２−チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、キナゾリル、典型的には２−キナゾリニル、２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、２−もしくは４−テトラヒドロピラニル、１−、２−もしくは３−ピロリジル、１−、２−、３−もしくは４−ピペリジル、１−、２−もしくは３−モルホリニル、２−もしくは３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルまたはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニル、例えば特に２−または４−テトラヒドロピラニルオキシである；低級アルカノイルオキシ；カルボキシ；低級アルコキシカルボニル；フェニル−低級アルコキシカルボニル；メルカプト；低級アルキルチオ；フェニルチオ；ハロゲン；ハロゲン−低級アルキル；オキソ(１位を除く、そうでないとアシルになるので)；アジド；ニトロ；シアノ；アミノ；モノ−低級アルキルアミノ；ジ−低級アルキルアミノ；ピロリジノ；イミダゾール−１−イル；ピペリジノ；ピペラジノ；４−低級アルキルピペラジノ；モルホリノ；チオモルホリノ；非置換であるか、またはフェニル部分で低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲンおよび／もしくはニトロにより置換されているジフェニルアミノまたはジベンジルアミノ；低級アルコキシカルボニルアミノ；非置換であるか、またはフェニル部分で低級アルキルもしくは低級アルコキシにより置換されているフェニル−低級アルコキシカルボニルアミノ；フルオレニルメトキシカルボニルアミノ；アミノ−低級アルキル；一置換または二置換アミノ−低級アルキル、ここでアミノ置換基は低級アルキル、ヒドロキシ−低級アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、アミノ−低級アルキル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ(−低級アルキル)アミノ−低級アルキル、アミノ、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノおよびＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−(ヒドロキシ−低級アルキル)アミノから選択される；ピロリジノ−低級アルキル；ピペリジノ−低級アルキル；ピペラジノ−低級アルキル；４−低級アルキルピペラジノ−低級アルキル；イミダゾール−１−イル−低級アルキル；モルホリノ−低級アルキル；チオモルホリノ−低級アルキル；Ｓ−オキソ−チオモルホリノ−低級アルキル；Ｓ,Ｓ−ジオキソチオモルホリノ−低級アルキル；低級アルキレンジオキシ；スルファモイル；スルホ；カルバモイル；ウレイド；グアニジノ；シアノ；アミノカルボニル(カルバモイル)およびアミノカルボニルオキシ、それは窒素で１個または２個のラジカルにより置換されており、ここでアミノ置換基は互いに独立して低級アルキル、ヒドロキシ−低級アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、アミノ−低級アルキル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ(−低級アルキル)アミノ−低級アルキル、アミノ、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノおよびＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−(ヒドロキシ−低級アルキル)アミノを含む群から選択される；ピロリジノカルボニル；ピペリジノカルボニル；ピペラジノカルボニル；４−低級アルキルピペラジノカルボニル；イミダゾリノカルボニル；モルホリノカルボニル；チオモルホリノカルボニル；Ｓ−オキソ−チオモルホリノカルボニル；ならびにＳ,Ｓ−ジオキソチオモルホリノ；
末端フェニルラジカルを有するフェニル、ナフチル、フェニル−低級アルキルまたはフェニル−低級アルケニル、それは非置換であるか、または低級アルキル、低級アルケニルもしくは低級アルカジエニルの置換基として前記で挙げられたラジカルにより一置換もしくは二置換されている；
【００５４】
またはヘテロシクリル−低級アルキル、ここでヘテロシクリルはピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジル、または広義ではまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリル、インドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、ベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニル；イミダゾリル、典型的には１−もしくは２−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、チアゾリル、典型的には２−チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、キナゾリル、典型的には２−キナゾリニル、２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、２−もしくは４−テトラヒドロピラニル、１−、２−もしくは３−ピロリジル、１−、２−、３−もしくは４−ピペリジル、１−、２−もしくは３−モルホリニル、２−もしくは３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルまたはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニルであり、それは各々の場合で非置換であるか、または低級アルキル、低級アルケニルもしくは低級アルカジエニルの置換基として前記で挙げられたラジカルにより一置換もしくは二置換されている；
または部分式Ｙ−Ｃ(＝Ｗ)−のアシル、ここでＷは酸素であり、そしてＹは水素、Ｒｏ、Ｒｏ−Ｏ−、ＲｏＨＮ−またはＲｏＲｏＮ−である(ここでラジカルＲｏは同一かまたは異なっていてよい)
または部分式Ｒｏ−ＳＯ２−のアシルから独立して選択される置換基により一置換または多置換、好ましくは一置換または二置換されており、
それによりＲ４はまた式IIの化合物に関して不在でもよいか；または
Ｒ４は式IIの化合物に関して不在、式Ｉの化合物に関して水素またはＣＨ３であり、そして
【００５５】
Ｒ３は部分式Ｙ−Ｃ(＝Ｗ)−のアシルであり、ここでＷは酸素であり、そしてＹは水素、Ｒｏ、Ｒｏ−Ｏ−、ＲｏＨＮ−またはＲｏＲｏＮ−である(ここでラジカルＲｏは同一かまたは異なっていてよい)、または部分式Ｒｏ−ＳＯ２−のアシルであり、
ここで該ラジカルのＲ０は以下の意味を有する：置換または非置換低級アルキル、特にメチルまたはエチル、アミノ−低級アルキルヒドロキシ−低級アルキル、ここでアミノ基は保護されていないかまたは従来のアミノ保護基、特に低級アルコキシカルボニル、典型的にはｔｅｒｔ−低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルにより保護され、例えばアミノメチル、Ｒ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−アミノエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルまたはＲ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)エチルであり、カルボキシ−低級アルキル、典型的には２−カルボキシエチル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル、典型的には２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)エチル、シアノ−低級アルキル、典型的には２−シアノエチル、テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル、典型的には４−(テトラヒドロピラニル)オキシメチル、モルホリノ−低級アルキル、典型的には２−(モルホリノ)エチル、フェニル、低級アルキルフェニル、典型的には４−メチルフェニル、低級アルコキシフェニル、典型的には４−メトキシフェニル、イミダゾリル−低級アルコキシフェニル、典型的には４−[２−(イミダゾール−１−イル)エチル)オキシフェニル、カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニル、低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−エトキシカルボニルフェニルもしくは４−メトキシフェニル、ハロゲン−低級アルキルフェニル、典型的には４−クロロメチルフェニル、ピロリジノフェニル、典型的には４−ピロリジノフェニル、イミダゾール−１−イルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イル)フェニル、ピペラジノフェニル、典型的には４−ピペラジノフェニル、(４−低級アルキルピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニル、モルホリノフェニル、典型的には４−モルホリノフェニル、ピロリジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピロリジノメチルフェニル、イミダゾール−１−イル−低級アルキルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イルメチル)フェニル、ピペラジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピペラジノメチルフェニル、(４−低級アルキルピペラジノメチル)−フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノメチル)フェニル、モルホリノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−モルホリノメチルフェニル、ピペラジノカルボニルフェニル、典型的には４−ピペラジノカルボニルフェニル、または(４−低級アルキルピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニル)。
【００５６】
Ｒ４が不在である場合、ｐは０であるか、またはＲ３およびＲ４が双方共に存在し、そして各々の場合に前記されたラジカルのうちの一つである場合１であり(式IIの化合物に関して)；
Ｒ５は水素または低級アルキル、特に水素であり；
Ｘは２個の水素原子、Ｏ、または１個の水素原子およびヒドロキシ水素；または１個の水素原子および低級アルコキシを意味し；
Ｚは水素または特に低級アルキル、何より特にメチルであり；
そして式IIの化合物に関して、波線で特徴付けられた２個の結合は好ましくは環Ａで不在であり、４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ｂの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；または
また波線で特徴付けられた２個の結合は環Ｂで不在であり、全部で４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ａの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；
または環Ａおよび環Ｂの双方で４個の波線の結合の全てが不在であり、全部で８個の水素原子により置き換えられているかのいずれかである；
式Ｉ、II、III、IV、Ｖ、VIの化合物、または少なくとも１個の塩形成基が存在する場合はその塩である。
【００５７】
特に好ましいのは：
ｍおよびｎは各々０であり；
Ｒ３およびＲ４は互いに独立して水素、非置換であるか、またはカルボキシ；低級アルコキシカルボニル；およびシアノから互いに独立して選択されるラジカルにより一もしくは二置換された、特に一置換された低級アルキルであるか；または
Ｒ４は水素もしくは−ＣＨ３であり、そして
Ｒ３は前記で定義されたとおりであるか、または好ましくはＲ３は部分式Ｒｏ−ＣＯのアシルであり、式中Ｒｏは低級アルキル；アミノ−低級アルキル、ここでアミノ基は非保護形態で存在するか、または低級アルコキシカルボニルにより保護されている；テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル；フェニル；イミダゾリル−低級アルコキシフェニル；カルボキシフェニル；低級アルコキシカルボニルフェニル；ハロゲン−低級アルキルフェニル；イミダゾール−１−イルフェニル；ピロリジノ−低級アルキルフェニル；ピペラジノ−低級アルキルフェニル；(４−低級アルキルピペラジノメチル)フェニル；モルホリノ−低級アルキルフェニル；ピペラジノカルボニルフェニル；または(４−低級アルキルピペラジノ)フェニルであるか；
または部分式Ｒｏ−Ｏ−ＣＯ−のアシルであり、式中、Ｒｏは低級アルキルであるか；
または部分式ＲｏＨＮ−Ｃ(＝Ｗ)−のアシルであり、式中、Ｗは酸素であり、そしてＲｏは以下の意味を有する：モルホリノ−低級アルキル、フェニル、低級アルコキシフェニル、カルボキシフェニルもしくは低級アルコキシカルボニルフェニル；または
Ｒ３は低級アルキルフェニルスルホニル、典型的には４−トルエンスルホニルであり；
好ましいＲ３基のさらに具体的な実例は好ましい式IIの化合物に関して以下に記載されるとおりであり、
Ｒ５は水素または低級アルキル、特に水素であり、
Ｘは２個の水素原子またはＯを意味し；
Ｚはメチルまたは水素である；
式Ｉであっての化合物または少なくとも１個の塩形成基が存在する場合、その塩である。
【００５８】
特に好ましいのは；
ｍおよびｎは各々０であり；
Ｒ３およびＲ４は互いに独立して水素、非置換であるか、またはカルボキシ；低級アルコキシカルボニル；およびシアノから互いに独立して選択されるラジカルにより非置換または一もしくは二置換された、特に一置換された低級アルキルであり；それによりＲ４は不在でもよいか；または
Ｒ４は不在であり、そして
Ｒ３は部分式Ｒｏ−ＣＯからのアシルであり、式中Ｒｏは低級アルキル、特にメチルまたはエチル；アミノ−低級アルキル、ここでアミノ基はここでアミノ基は保護されていないかまたは低級アルコキシカルボニル、典型的にはｔｅｒｔ−低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、例えばアミノメチル、Ｒ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−アミノエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルまたはＲ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)エチルにより保護される；テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル、典型的には４−(テトラヒドロピラニル)オキシメチル；フェニル；イミダゾリル−低級アルコキシフェニル、典型的には４−[２−(イミダゾール−１−イル)エチル)オキシフェニル；カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニル；低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−メトキシ−もしくは４−エトキシカルボニルフェニル；ハロゲン−低級アルキルフェニル、典型的には４−クロロメチルフェニル；イミダゾール−１−イルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イル)フェニル；ピロリジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピロリジノメチルフェニル；ピペラジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピペラジノメチルフェニル；(４−低級アルキルピペラジノメチル)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノメチル)フェニル；モルホリノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−モルホリノメチルフェニル；ピペラジノカルボニルフェニル、典型的には４−ピペラジノカルボニルフェニル；または(４−低級アルキルピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニルであるか；または
部分式Ｒｏ−Ｏ−ＣＯ−のアシルであり、ここでＲｏは低級アルキルであるか；または
部分式ＲｏＨＮ−Ｃ(＝Ｗ)−アシルであり、ここでＷは酸素であり、そしてＲｏは以下の好ましい意味を有する：モルホリノ−低級アルキル、典型的には２−モルホリノエチル、フェニル、低級アルコキシフェニル、典型的には４−メトキシフェニルもしくは４−エトキシフェニル、カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニルまたは低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−エトキシカルボニルフェニル；または
低級アルキルフェニルスルホニル、典型的には４−トルエンスルホニルであり；
Ｒ４が不在である場合、ｐは０であるか、またはＲ３およびＲ４が双方共に存在し、そして各々の場合で前記されたラジカルの一つである場合、１であり；
Ｒ５は水素または低級アルキル、特に水素であり
Ｘは２個の水素原子またはＯを意味し；
Ｚはメチルまたは水素であり；
そして波線で特徴付けられた２個の結合は好ましくは環Ａで不在であり、４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ｂの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；または
また波線で特徴付けられた２個の結合は環Ｂで不在であり、全部で４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ａの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；または
環Ａおよび環Ｂの双方で４個の波線の結合の全てが不在であり、全部で８個の水素原子により置き換えられているかのいずれかである)
式IIの化合物、または少なくとも１個の塩形成基が存在する場合はその塩である。
【００５９】
何より特に好ましい式IIの化合物は：
８,９,１０,１１−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−[４−(４−メチルピペラジン−１−イルメチル)ベンゾイル]−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−クロロメチルベンゾイル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−(ピロリジン−１−イルメチル)ベンゾイル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−(モルホリン−４−イルメチル)ベンゾイル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−(ピペラジン−１−イルメチル)ベンゾイル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−エチル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−トシル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−トリフルオロアセチル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−[４−(２−イミダゾール−１−イル−エトキシ)ベンゾイル]−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−メトキシカルボニルメチル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−カルボキシメチル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−テレフタロイルメチルエステル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−テレフタロイル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−エチルピペラジニルカルボニルベンゾイル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(２−シアノエチル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−ベンゾイル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
ヨウ化Ｎ,Ｎ−ジメチル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−ＢＯＣ−グリシル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−グリシル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(３−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)プロピル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(３−カルボキシプロピル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−イミダゾール−１−イル)ベンゾイル]−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−[(テトラヒドロ−２ｈ−ピラン−４−イルオキシ)アセチル]−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−ＢＯＣ−l−アラニル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
塩酸Ｎ−l−アラニル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−メチル−１,２,３,４−テトラヒドロ−６−メチルスタウロスポリン；
Ｎ−(４−カルボキシフェニルアミノカルボニル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−エチルフェニルアミノカルボニル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(Ｎ−フェニルアミノカルボニル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(Ｎ−[２−(１−モルホリノ)エチル]アミノカルボニル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(Ｎ−[４−メトキシフェニル]アミノカルボニル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
１,２,３,４−テトラヒドロ−６−メチルスタウロスポリン；
Ｎ−ＢＯＣ−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−ＢＯＣ−１,２,３,４−テトラヒドロ−６−メチルスタウロスポリン；
Ｎ−ＢＯＣ−１,２,３,４−テトラヒドロ−６−メチル−７−オキソ−スタウロスポリン；
１,２,３,４,８,９,１０,１１−オクタヒドロスタウロスポリン；
または少なくとも１個の塩形成基が存在する場合、その薬学的に許容される塩から選択される。
【００６０】
何より特に好ましいのは１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリンと称される式Ｉの化合物または(特に薬学的に許容される)その塩である(ここで式Ｉのｍおよびｎは０であり、Ｒ３は水素であり、Ｒ４は塩が存在しない場合(ｐ＝０)は不在であるか、または塩が存在する場合(ｐ＝１)は水素であり、Ｒ５は水素であり、波線で表される２個の結合は環Ａで不在であり、全部で４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ｂで波線で表される２個の結合は各々の場合で平行の結合と一緒に二重結合であり、Ｘは２個の水素原子を意味し、そしてＺはメチルである)。
【００６１】
何より特に好ましいのは式Ａの化合物であり、ここで；
Ａ)Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｑ＝−(ＣＨ２)２−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２)ＯＨ−(ＣＨ２)２−
Ｂ)Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｑ＝−(ＣＨ２)２−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)２)−(ＣＨ２)２−
Ｃ)Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｑ＝
【化７】
【００６２】
何より特に好ましいのは式Ｉの化合物であり、ここで；
Ａ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ４＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３(スタウロスポリン)
Ｂ) Ｘ＝(Ｒ)または(Ｓ)異性体の１個の水素および１個のヒドロキシ原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ４＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３(ＵＣＮ−０１およびＵＣＮ−０２)
Ｃ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ４＝ＣＨ３；Ｒ３＝ベンゾイル；Ｚ＝ＣＨ３(ＣＧＰ４１２５１またはＰＫＣ４１２またはミドスタウリン)
Ｄ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ３；Ｒ４＝エチルオキシカルボニル；Ｚ＝ＣＨ３(ＮＡ３８２；ＣＡＳ＝１４３０８６−３３−３)
Ｅ) Ｘ＝１個の水素および１個のヒドロキシ原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３；そしてＲ４は：−(ＣＨ２)２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＨ；−ＣＯ(ＣＨ２)２ＣＯ２Ｎａ；−(ＣＨ２)３ＣＯ２Ｈ；−ＣＯＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)２；
【化８】
から選択される；
Ｆ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３；そしてＲ４は：Ｎ−[０−(テトラヒドロピラン−４−イル)−Ｄ−ラクトイル]；Ｎ−[２−メチル−２−(テトラヒドロピラン−４−イルオキシ)−プロピオニル；Ｎ−[０−(テトラヒドロピラン−４−イル)−Ｌ−ラクトイル]；Ｎ−[０−(テトラヒドロピラン−４−イル)−Ｄ−ラクトイル]；Ｎ−[２−(テトラヒドロ−ピラン−４−イルオキシ)−アセチル)]から選択される；
Ｇ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３；そしてＲ４は：Ｎ−[０−(テトラヒドロピラン−４−イル)−Ｄ−ラクトイル]；Ｎ−[２−(テトラヒドロ−ピラン−４−イルオキシ)−アセチル)]から選択される；
Ｈ) Ｘ＝１個の水素および１個のヒドロキシ原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３；そしてＲ４は：Ｎ−[０−(テトラヒドロピラン−４−イル)−Ｄ−ラクトイル]；Ｎ−[２−(テトラヒドロ−ピラン−４−イルオキシ)−アセチル)]から選択される。
【００６３】
略語「ＣＡＳ」はケミカルアブストラクト登録番号を意味する。
最も好ましい式Ｉの化合物、例えばミドスタウリン[国際一般的名称]は１９８８年１２月２１日公開の特許文献１、ならびに１９９２年３月３日公開の特許文献２および特許文献３により適用され、そして具体的に記載されている。その他の好ましい化合物は共に１９９５年１２月７日公開の特許文献４および特許文献５に適用され、そして記載される。
【００６４】
何より特に好ましいのは式IIIの化合物であり、ここで；
Ａ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ６＝ＣＨ３；Ｒ７＝メチルオキシカルボニル；Ｚ＝Ｈ(２−メチルＫ２５２ａ)
Ｂ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６＝Ｈ；Ｒ７＝メチルオキシカルボニル；Ｚ＝Ｈ(Ｋ−２５２ａ)
Ｃ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６＝Ｈ；Ｒ７＝メチルオキシカルボニル；Ｚ＝ＣＨ３(ＫＴ−５７２０)。
【００６５】
何より特に好ましいのは式IVの化合物であり、ここで；
Ａ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ９＝ＣＨ２−ＮＭｅ２；Ｒ８＝ＣＨ３；ｍ'＝ｎ'＝２
Ｂ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ９＝ＣＨ２−ＮＨ２；Ｒ８＝ＣＨ３；ｍ'＝２；ｎ'＝１(Ｒｏ−３１−８４２５；ＣＡＳ＝１５１３４２−３５−７)。
【００６６】
何より特に好ましいのは式Ｖの化合物であり、ここで；
Ａ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ８＝ＣＨ３；Ｒ１０＝−(ＣＨ２)３−ＮＨ２；(Ｒｏ−３１−７５４９；ＣＡＳ＝１３８５１６−３１)
Ｂ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ８＝ＣＨ３；Ｒ１０＝−(ＣＨ２)３−Ｓ−(Ｃ＝ＮＨ)−ＮＨ２；(Ｒｏ−３１−８２２０；ＣＡＳ＝１２５３１４−６４−９))
Ｃ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ８＝ＣＨ３；Ｒ１０＝−ＣＨ３。
【００６７】
何より特に好ましいのは式VIの化合物であり、ここで；
Ａ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ４＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３；メチルまたは(Ｃ１−Ｃ１０)アルキル、アリールメチル、Ｃ６Ｈ２ＣＨ２−から選択されるＲ３。
【００６８】
スタウロスポリン誘導体およびその製造方法は多くの先行の文献に具体的に記載されており、当業者に周知である。
式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの化合物およびその製造方法は、例えば１９９５年６月１４日公開の特許文献６、１９９４年１１月１７日公開の特許文献７、１９９２年２月１２日公開の特許文献８、１９８９年８月１６日公開の特許文献９、１９９０年８月２９日公開の特許文献１０、および非特許文献１のような多くの出版物に記載されている。
【００６９】
式Ｉの化合物およびその製造方法は１９８８年１２月２１日公開の特許文献１ならびに１９９２年３月３日公開の特許文献２および特許文献３に具体的に記載されている。Ｒ４でテトラヒドロピラン−４−イル)−ラクトイル置換を有する式Ｉの化合物は１９９４年１１月１７日公開の特許文献１１に記載されている。その他の化合物は１９９３年１２月２９日公開の特許文献１２、１９８７年９月２３日に特許文献１３(ＵＣＮ−O１)、１９９８年７月３日公開の特許文献１４として公開された特許文献１５に記載されている。
【００７０】
式IIの化合物およびその製造方法は１９８８年１２月２１日公開の特許文献１ならびに１９９２年３月３日公開の特許文献２および特許文献３に具体的に記載されている。
式IIIの化合物およびその製造方法は１９９２年７月２４日出願の特許文献１６の優先権を主張する特許出願(すなわち１９９７年４月１６日公開の特許文献１７、２０００年５月２４日公開の特許文献１８、１９９５年５月１０日公開の特許文献１９)に具体的に記載されている。
【００７１】
式IVの化合物およびその製造方法は、各々１９９３年５月１０日および１９９４年２月２１日出願の特許文献２０および特許文献２１の優先権を主張する特許出願(すなわち１９９４年１１月１７日公開の特許文献７、２０００年５月２４日公開の特許文献１８、１９９５年５月１０日公開の特許文献１９)に具体的に記載されている。
【００７２】
式Ｖの化合物およびその製造方法は各々１９８８年２月１０日、１９８８年１１月２５日、１９８９年２月２３日、および１９８９年１２月１３日出願の特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４および特許文献２５の優先権を主張する特許出願(すなわち１９８９年８月１６日公開の特許文献９および１９９０年８月２９日公開の特許文献１０)に具体的に記載されている。
【００７３】
式VIの化合物およびその製造方法は１９９１年１０月１０日公開の特許文献２６(Ｃｏｎ)の優先権を主張する特許出願(すなわち１９９３年４月１５日公開の特許文献２７)に具体的に記載されている。
とりわけスタウロスポリン誘導体化合物に関する特許出願または科学的文献の引用が示される各々の場合の最終生成物の対象、医薬製剤および請求の範囲は出典明示により本明細書の一部とする。
コード番号により同定される活性薬剤の構造、一般名および商品名を最新版の標準概論「The Merck Index」またはデータベース、例えばPatents International(例えばIMS World Publications)から取ることができる。対応するその内容は出典明示により本明細書の一部とする。
【００７４】
本発明による好ましいスタウロスポリン誘導体は式(VII)：
【化９】
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩(本明細書後記では：「式VIIの化合物またはミドスタウリン」)である。
【００７５】
式VIIの化合物はミドスタウリン[国際一般的名称]またはＰＫＣ４１２としても公知である。
ミドスタウリンは天然発生アルカロイドスタウロスポリンの誘導体であり、そして１９８８年１２月２１日公開の特許文献１ならびに１９９２年３月３日公開の特許文献２および特許文献３に具体的に記載されている。
【００７６】
核酸
アポトーシスまたはプログラム細胞死を阻止する核酸分子には、限定するものではないが抗アポトーシスＭＣＬ１タンパク質をコードする遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡｉ構築物またはこの遺伝子の転写物が含まれる。本発明の組み合わせにおける使用のために最も好ましいのは、特にｍｃｌ−１特異的ｓｉＲＮＡを含むＭｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物である。本発明のｍｃｌ−１ＲＮＡｉ構築物の実例は実施例において記載される。
【００７７】
骨髄細胞白血病配列１(ＢＣＬ２関連)(「ｍｃｌ−１」)によりコードされるタンパク質はＢｃｌ−２ファミリーに属する。この遺伝子座で選択的スプライシングが生じ、結果的に異なるアイソフォームをコードする二つの転写バリアントに至る。より長い遺伝子生成物(アイソフォーム１)はアポトーシスを阻止することにより細胞生存性を強化する。選択的スプライシングされたより短い遺伝子生成物(アイソフォーム２)はアポトーシスを促進し、そして細胞死誘導する。ｍｃｌ−１遺伝子の別名には、限定するものではないがＥＡＴ、ＭＣＬ１Ｌ、ＭＣＬ１Ｓ、ＭＧＣ１０４２６４、ＭＧＣ１８３９およびＴＭが含まれる。ＭＣＬ１ポリペプチドの代替えの名称には、限定するものではないが誘導骨髄白血病細胞分化タンパク質Ｍｃｌ−１；骨髄細胞白血病配列１；および骨髄細胞白血病配列１、アイソフォーム１が含まれる。
【００７８】
本明細書で使用される際には、「核酸分子」なる用語にはＤＮＡ分子(例えばｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド)およびＲＮＡ分子(例えばｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡのようなＲＮＡｉ構築物)ならびにヌクレオシド類似体を用いて作成されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の類似体が含まれると意図される。核酸分子は一本鎖または二本鎖でよい。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖およびアンチセンス鎖でよい。その用語には合成(例えば化学的に合成された)ＤＮＡが含まれる。ヌクレオシド類似体または誘導体(例えばイノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド)を用いて核酸を合成することができる。かかるヌクレオシドを用いて例えば塩基対形成能が改変されているかまたは、ヌクレアーゼに対する抵抗性が増大されている核酸を調製することができる。
【００７９】
本発明は例えばｍｃｌ−１ ｃＤＮＡを含むｍｃｌ１ヌクレオチド配列に特異的なＲＮＡｉまたはアンチセンス核酸分子を包含する。より長いｍｃｌ−１アイソフォーム１のｃＤＮＡ配列(GenBank受け入れ番号 ＮＭ０２１９６０)を配列番号１で提供する。
【００８０】
GenBank受け入れ番号ＮＭ０２１９６０、４０２０ｂｐ 直鎖状ｍＲＮＡ、ＰＲＩ１２−ＪＵＮ−２００６[ホモサピエンス](配列番号１)
１ caccccgtag gactggccgc cctaaaaccg tgataaagga gctgctcgcc acttctcact
６１ tccgcttcct tccagtaagg agtcggggtc ttccccagtt ttctcagcca ggcggcggcg
１２１ gcgactggca atgtttggcc tcaaaagaaa cgcggtaatc ggactcaacc tctactgtgg
１８１ gggggccggc ttgggggccg gcagcggcgg cgccacccgc ccgggagggc gacttttggc
２４１ tacggagaag gaggcctcgg cccggcgaga gataggggga ggggaggccg gcgcggtgat
３０１ tggcggaagc gccggcgcaa gccccccgtc caccctcacg ccagactccc ggagggtcgc
３６１ gcggccgccg cccattggcg ccgaggtccc cgacgtcacc gcgacccccg cgaggctgct
４２１ tttcttcgcg cccacccgcc gcgcggcgcc gcttgaggag atggaagccc cggccgctga
４８１ cgccatcatg tcgcccgaag aggagctgga cgggtacgag ccggagcctc tcgggaagcg
５４１ gccggctgtc ctgccgctgc tggagttggt cggggaatct ggtaataaca ccagtacgga
６０１ cgggtcacta ccctcgacgc cgccgccagc agaggaggag gaggacgagt tgtaccggca
６６１ gtcgctggag attatctctc ggtaccttcg ggagcaggcc accggcgcca aggacacaaa
７２１ gccaatgggc aggtctgggg ccaccagcag gaaggcgctg gagaccttac gacgggttgg
７８１ ggatggcgtg cagcgcaacc acgagacggc cttccaaggc atgcttcgga aactggacat
８４１ caaaaacgaa gacgatgtga aatcgttgtc tcgagtgatg atccatgttt tcagcgacgg
９０１ cgtaacaaac tggggcagga ttgtgactct catttctttt ggtgcctttg tggctaaaca
９６１ cttgaagacc ataaaccaag aaagctgcat cgaaccatta gcagaaagta tcacagacgt
１０２１ tctcgtaagg acaaaacggg actggctagt taaacaaaga ggctgggatg ggtttgtgga
１０８１ gttcttccat gtagaggacc tagaaggtgg catcaggaat gtgctgctgg cttttgcagg
１１４１ tgttgctgga gtaggagctg gtttggcata tctaataaga tagccttact gtaagtgcaa
１２０１ tagttgactt ttaaccaacc accaccacca ccaaaaccag tttatgcagt tggactccaa
１２６１ gctgtaactt cctagagttg caccctagca acctagccag aaaagcaagt ggcaagagga
１３２１ ttatggctaa caagaataaa tacatgggaa gagtgctccc cattgattga agagtcactg
１３８１ tctgaaagaa gcaaagttca gtttcagcaa caaacaaact ttgtttggga agctatggag
１４４１ gaggactttt agatttagtg aagatggtag ggtggaaaga cttaatttcc ttgttgagaa
１５０１ caggaaagtg gccagtagcc aggcaagtca tagaattgat tacccgccga attcattaat
１５６１ ttactgtagt gttaagagaa gcactaagaa tgccagtgac ctgtgtaaaa gttacaagta
１６２１ atagaactat gactgtaagc ctcagtactg tacaagggaa gcttttcctc tctctaatta
１６８１ gctttcccag tatacttctt agaaagtcca agtgttcagg acttttatac ctgttatact
１７４１ ttggcttggt ttccatgatt cttactttat tagcctagtt tatcaccaat aatacttgac
１８０１ ggaaggctca gtaattagtt atgaatatgg atatcctcaa ttcttaagac agcttgtaaa
１８６１ tgtatttgta aaaattgtat atatttttac agaaagtcta tttctttgaa acgaaggaag
１９２１ tatcgaattt acattagttt ttttcatacc cttttgaact ttgcaacttc cgtaattagg
１９８１ aacctgtttc ttacagcttt tctatgctaa actttgttct gttcagttct agagtgtata
２０４１ cagaacgaat tgatgtgtaa ctgtatgcag actggttgta gtggaacaaa tctgataact
２１０１ atgcaggttt aaattttctt atctgatttt ggtaagtatt ccttagatag gtttttcttt
２１６１ gaaaacctgg gattgagagg ttgatgaatg gaaattcttt cacttcatta tatgcaagtt
２２２１ ttcaataatt aggtctaagt ggagttttaa ggttactgat gacttacaaa taatgggctc
２２８１ tgattgggca atactcattt gagttccttc catttgacct aatttaactg gtgaaattta
２３４１ aagtgaattc atgggctcat ctttaaagct tttactaaaa gattttcagc tgaatggaac
２４０１ tcattagctg tgtgcatata aaaagatcac atcaggtgga tggagagaca tttgatccct
２４６１ tgtttgctta ataaattata aaatgatggc ttggaaaagc aggctagtct aaccatggtg
２５２１ ctattattag gcttgcttgt tacacacaca ggtctaagcc tagtatgtca ataaagcaaa
２５８１ tacttactgt tttgtttcta ttaatgattc ccaaaccttg ttgcaagttt ttgcattggc
２６４１ atctttggat ttcagtcttg atgtttgttc tatcagactt aaccttttat ttcctgtcct
２７０１ tccttgaaat tgctgattgt tctgctccct ctacagatat ttatatcaat tcctacagct
２７６１ ttcccctgcc atccctgaac tctttctagc ccttttagat tttggcactg tgaaacccct
２８２１ gctggaaacc tgagtgaccc tccctcccca ccaagagtcc acagaccttt catctttcac
２８８１ gaacttgatc ctgttagcag gtggtaatac catgggtgct gtgacactaa cagtcattga
２９４１ gaggtgggag gaagtccctt ttccttggac tggtatcttt tcaactattg ttttatcctg
３００１ tctttggggg caatgtgtca aaagtcccct caggaatttt cagaggaaag aacattttat
３０６１ gaggctttct ctaaagtttc ctttgtatag gagtatgctc acttaaattt acagaaagag
３１２１ gtgagctgtg ttaaacctca gagtttaaaa gctactgata aactgaagaa agtgtctata
３１８１ ttggaactag ggtcatttga aagcttcagt ctcggaacat gacctttagt ctgtggactc
３２４１ catttaaaaa taggtatgaa taagatgact aagaatgtaa tggggaagaa ctgccctgcc
３３０１ tgcccatctc agagccataa ggtcatcttt gctagagcta tttttaccta tgtatttatc
３３６１ gttcttgatc ataagccgct tatttatatc atgtatctct aaggacctaa aagcacttta
３４２１ tgtagttttt aattaatctt aagatctggt tacggtaact aaaaaagcct gtctgccaaa
３４８１ tccagtggaa acaagtgcat agatgtgaat tggtttttag gggccccact tcccaattca
３５４１ ttaggtatga ctgtggaaat acagacaagg atcttagttg atattttggg cttggggcag
３６０１ tgagggctta ggacacccca agtggtttgg gaaaggagga ggggagtggt gggtttatag
３６６１ ggggaggagg aggcaggtgg tctaagtgct gactggctac gtagttcggg caaatcctcc
３７２１ aaaagggaaa gggaggattt gcttagaagg atggcgctcc cagtgactac tttttgactt
３７８１ ctgtttgtct tacgcttctc tcagggaaaa acatgcagtc ctctagtgtt tcatgtacat
３８４１ tctgtggggg gtgaacacct tggttctggt taaacagctg tacttttgat agctgtgcca
３９０１ ggaagggtta ggaccaacta caaattaatg ttggttgtca aatgtagtgt gtttccctaa
３９６１ ctttctgttt ttcctgagaa aaaaaaataa atcttttatt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa
【００８１】
本発明はさらに遺伝子コードの縮重ために配列番号１のヌクレオチド配列と異なるが、配列番号１によりコードされるものと同一のｍｃｌ−１タンパク質をコードする核酸分子を包含する。配列番号１のヌクレオチドによりコードされる３５０アミノ酸ＭＣＬ１ポリペプチド(GenPep受け入れ番号ＮＰ０６８７７９)を配列番号２として提供する。
【００８２】
GenPept受け入れ番号ＮＰ０６８７７９ ３５０アミノ酸骨髄細胞白血病配列１アイソフォーム１ ＰＲＩ１２−ＪＵＮ−２００６[ホモサピエンス](配列番号２)
１ mfglkrnavi glnlycggag lgagsggatr pggrllatek easarreigg geagaviggs
６１ agasppstlt pdsrrvarpp pigaevpdvt atparllffa ptrraaplee meapaadaim
１２１ speeeldgye peplgkrpav lpllelvges gnntstdgsl pstpppaeee edelyrqsle
１８１ iisrylreqa tgakdtkpmg rsgatsrkal etlrrvgdgv qrnhetafqg mlrkldikne
２４１ ddvkslsrvm ihvfsdgvtn wgrivtlisf gafvakhlkt inqesciepl aesitdvlvr
３０１ tkrdwlvkqr gwdgfveffh vedleggirn vllafagvag vgaglaylir
【００８３】
ｍｃｌ−１のアミノ酸配列に変化を導くＤＮＡ配列多型が所定の集団(例えばヒト集団)内に存在し得るということは当業者には理解されよう。かかる遺伝子多型は天然の対立遺伝子変種のために集団内で存在し得る。かかる天然の対立遺伝子変種は典型的にはｍｃｌ−１遺伝子のヌクレオチド配列で１５％変動に至り得る。任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変種は、「サイレント」、すなわち天然の対立遺伝子変種の結果であり、そしてｍｃｌ−１の機能的活性を改変しないアミノ酸多型に至ろうとも、本発明の範囲内であると意図される。故に例えばｍｃｌ−１のアミノ酸の１％、２％、３％、４％または５％を別のアミノ酸により、例えば保存置換により置き換えることができる。
【００８４】
集団において存在し得るｍｃｌ−１配列の天然発生対立遺伝子バリアントに加えて、配列番号１のヌクレオチド配列を変異させることにより変化を導入し、それによりタンパク質の機能的能力を改変することなくコードされたアミノ酸配列に変化を導くことができることは当業者には理解されよう。例えば「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基はｍｃｌ−１タンパク質の生物学的活性を改変することなく、ヒトｍｃｌ−１タンパク質の野生型配列から改変され得る残基であり、一方「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要である。例えば種々の種のｍｃｌ−１タンパク質間で保存されるアミノ酸残基は特に改変し難いと予測される。
【００８５】
したがって、活性に必須でないアミノ酸残基に変化を含有するｍｃｌ−１タンパク質をコードする核酸分子は本発明に含まれる。かかるｍｃｌ−１タンパク質はアミノ酸配列で配列番号２とは異なり、そしてなお野生型の生物学的活性の少なくとも一部を保持する。一つの実施態様では、例えば単離された核酸分子には、配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一、例えば８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする配列が含まれる。
【００８６】
一つまたはそれより多いアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、配列番号１に一つまたはそれより多いヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより、配列番号２とは異なる配列を有するｍｃｌ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子を創成することができる。標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発により変異を導入することができる。一つまたはそれより多い、予測される非必須アミノ酸残基で保存アミノ酸置換を行うことができる。故に例えば１％、２％、３％、５％または１０％までのアミノ酸を保存置換により置き換えることができる。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のもので置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野において公知である。それには塩基性側鎖(例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。故にｍｃｌ−１において予測される非必須アミノ酸残基を同一の側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えることができる。これに代えて、飽和変異誘発によるように変異をｍｃｌ−１コード化配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入することができ、そして得られた変異体をｍｃｌ−１生物学的活性に関してスクリーニングして活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発に続いて、タンパク質を発現させ、そしてその活性を決定することができる。
【００８７】
本発明はまたアンチセンス核酸分子、すなわちセンス鎖に相補的、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的、またはｍＲＮＡ配列に相補的である分子をも包含する。アンチセンス核酸は対応するセンス鎖に水素結合できる。アンチセンス核酸は全ｍｃｌ−１コード化配列に、またはその一部にのみ相補的でよい。アンチセンス核酸分子はセンス鎖の非コード化領域に対してアンチセンスでよい。非コード化領域(「５'および３'非翻訳領域」)は遺伝子またはｍＲＮＡのコード化領域をフランキングする５'および３'配列であり、そして翻訳されない。アンチセンス核酸分子はｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの全コード化領域に相補的でよく、またはｍｃｌ−１ ｍＲＮＡのコード化、または３'もしくは５'非コード化領域の一部にのみ相補的でよい場合もある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば約５、例えば約１０、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５または約５０ヌクレオチドの長さでよい。アンチセンス核酸に関係する一般的な手引き書に関しては、例えば非特許文献２を参照されたい。有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの実例には、限定するものではないが、配列番号１のヌクレオチド１３１と１１８３の間の領域に相補的な少なくとも１２ヌクレオチドの配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。実施例の配列番号７−９もまた参照されたい。
【００８８】
化学的合成、酵素ライゲーション反応およびその他の当分野において公知の手順を用いて本発明のアンチセンス核酸を構築することができる。例えば天然発生ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性および／もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された、種々に修飾されたヌクレオチドを用いてアンチセンス核酸(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)を合成することができる。例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸の作成に有用な、修飾されたヌクレオチドの実例には、５フルオロウラシル、５ブロモウラシル、５クロロウラシル、５ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４アセチルシトシン、５(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、１メチルグアニン、５カルボキシメチルアミノメチル２チオウリジン、２,２ジメチルグアニン、ジヒドロウラシル、ベータＤガラクトシルクエオシン、５カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６イソペンテニルアデニン、１メチルイノシン、２メチルアデニン、２メチルグアニン、４チオウラシル、３メチルシトシン、５メチルシトシン、Ｎ６アデニン、７メチルグアニン、５メトキシウラシル、５メチルアミノメチルウラシル、５メトキシアミノメチル２チオウラシル、シュードウラシル、クエオシン(queosine)、ベータＤマンノシルクエオシン、５'メトキシカルボキシメチルウラシル、５メチル２チオウラシル、２メチルチオＮ６イソペンテニルアデニン、ウラシル５オキシ酢酸(ｖ)、ウィブトキソシン(wybutoxosine)、２チオシトシン、２チオウラシル、５メチルウラシル、ウラシル５オキシ酢酸メチルエステル、５メチル２チオウラシル、３(３アミノ３Ｎ２カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗおよび２,６ジアミノプリンが含まれる。これに代えてアンチセンス配向で核酸がサブクローニングされている発現ベクターを用いてアンチセンス核酸を生成することができる(すなわち挿入された核酸から転写されるＲＮＡが、以下のサブセクションでさらに記載される目的の標的核酸に相補的である)。
【００８９】
本発明のアンチセンス核酸分子を対象に投与するか、またはそれがｍｃｌ−１タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズするかもしくは結合するように原位置で作成することができる。このように、アンチセンス核酸は例えば転写および／または翻訳を阻止することによりタンパク質の発現を阻止することができる。安定した二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性により、またはＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝での特異的相互作用を介してハイブリダイズすることができる。
【００９０】
アンチセンス核酸を当分野において公知の任意の方法により、例えば組織部位での直接注入により投与することができる。これに代えてまたは加えて、アンチセンス核酸分子を、全身投与できるように、標的選択細胞に適合させることができる。全身投与のために、例えばアンチセンス核酸分子をペプチドまたは細胞表面受容体もしくは抗原に結合する抗体に連結させることにより、アンチセンス分子を、選択された細胞表面上で発現される受容体または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。本明細書に記載される特定のベクターを用いてアンチセンス核酸分子を細胞に分配することもできる。転写されるべき配列が強力なｐｏｌ IIまたはｐｏｌ IIIプロモーターの制御下に置かれたベクター構築物を用いてアンチセンス転写物の十分な細胞内濃度を達成することができる。
【００９１】
本発明のアンチセンス核酸分子はαアノマー核酸分子でよい。αアノマー核酸分子形態特異的二本鎖は相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、ここでは、通常のβ単位と対照的に鎖は互いに平行に走る(非特許文献３)。アンチセンス核酸分子はまた２'ｏメチルリボヌクレオチド(非特許文献４)またはキメラＲＮＡ ＤＮＡ類似体(非特許文献５)を含むこともできる。
【００９２】
本発明はまたＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)によりｍｃｌ−１の発現を抑制できる核酸をも含む。ＲＮＡｉは、それにより二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)が動物および植物細胞における相同ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘起する方法である。(非特許文献６；非特許文献７)哺乳動物細胞では低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)とも称される、例えば２１−ヌクレオチド(ｎｔ)二重鎖ＲＮＡ(非特許文献８；非特許文献９)；またはマイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)、機能的短鎖ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)、またはＤＮＡ鋳型を用いてＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターを伴ってインビボで発現されるｄｓＲＮＡ(非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；また非特許文献１８参照)がＲＮＡｉの引き金となり得る。
【００９３】
「サイレンシング」としても公知の抑制は進化的に保存される主に細胞質性転写後事象である(非特許文献６参照)。現在のモデルにより、ｄｓＲＮＡがＲＮＡｓｅ III酵素、ダイサーによりｓｉＲＮＡにプロセシングされることが示唆される。次いでｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘起サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)と称される複合体を形成する。この複合体は標的ｍＲＮＡと相互作用し、それは次いで切断され、そして分解される(非特許文献２０；非特許文献２１)。ｓｈＲＮＡは哺乳動物細胞において研究されており(非特許文献２２)、そしてヒト細胞において効率的に発現され得る(非特許文献１３)。哺乳動物細胞において遺伝子発現を抑制するためのＤＮＡベクター基盤のＲＮＡｉ技術は非特許文献１７により記載される。哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現によるＲＮＡｉは(非特許文献１５)に記載されている。
【００９４】
本発明はｓｉＲＮＡ、その二重鎖(すなわちｄｓＲＮＡ)、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含み、それはｍｃｌ−１標的配列(例えばｍｃｌ−１ ｍＲＮＡ(例えば本明細書にて示されるもののようなヒトｍｃｌ−１配列に対応するｍＲＮＡ))と相互作用する(例えば結合する)。かかる核酸は、例えば化学的に合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチド(非特許文献９参照)でよい。本発明に包含され、そして有用であるＲＮＡｉ配列の実例には少なくとも一つの以下の配列またはその相補鎖配列が含まれる：
５' TTG GCT TTG TGT CCT TGG CG ３'(ｍｃｌ１、配列番号７)
５' AAG AAA CGC GGU AAU CGG ACU ３'(ｍｃｌ１、配列番号８)；
５' AGU CCG AUU ACC GCG UUU CUU ３'(ｍｃｌ１、配列番号９)；
５' CUU ACG CUG AGU ACU UCG A ３'(ルシフェラーゼ、配列番号１０)；
【００９５】
プラスミドを用いてｓｉＲＮＡとして機能できるｓｈＲＮＡを転写することができる(非特許文献１７；非特許文献２４参照)。かかるプラスミドは例えばＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーター、続いてセンス配列、ループ構造およびアンチセンス配列を含有するＲＮＡに転写される配列を含有できる。種々のループはいくつかのポリメラーゼIIIプロモーターを有するので、成功裏に用いられている(非特許文献２４；非特許文献２５)。ｍｃｌ−１「センス」配列、ループ構造および対応するｍｃｌ−１「アンチセンス」配列を含有するＲＮＡに転写される配列に作動可能なように連結されたプロモーター(例えばＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーター)を含有するベクター(例えばプラスミド)を当分野において日常的である手順を用いて作成することができる。四つのウリジン３'オーバーハングを有するＵ６−プロモーター駆動ｓｉＲＮＡは哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を抑制することが示されているので(非特許文献２６)、本発明のベクターはＵ６プロモーターおよびウリジンオーバーハング(例えば３'末端の１−６個のウリジン)を有するｓｉＲＮＡに転写される配列を含み得る。本発明に包含され、そして有用であるｓｈＲＮＡの実例は実施例のセクションにおいて記載され、それは各々配列番号９および１０として本明細書に示される配列から転写される(以下の表１を参照)。
【００９６】
典型的には、ｍｉＲＮＡはもしかするとダイサーとしても公知のＲＮａｓｅ III型酵素またはその相同体により、およそ７０ヌクレオチドの前駆体ＲＮＡステムループ(ｓｈＲＮＡ)から切り取られる。ｍｉＲＮＡ前駆体のステム配列を標的ｍＲＮＡ(ここではｍｃｌ−１ ｍＲＮＡ)に相補的なｍｉＲＮＡ配列で置換することにより、ｍｉＲＮＡを発現するベクター構築物を用いて、哺乳動物細胞において標的に対するＲＮＡｉを開始するｓｉＲＮＡを生成することができる(非特許文献１０)。
【００９７】
本発明の核酸はウイルスベクターに含まれる、そして発現され得る。したがって本発明はｓｉＲＮＡの発現によりｍｃｌ−１の特異的サイレンシングを誘起するウイルスベクターを特色とする。例えばＲＮＡ Ｐｏｌ IIプロモーター転写制御下でｓｉＲＮＡを発現する組換えアデノウイルスを作成することにより、ｍｃｌ−１特異的アデノウイルスベクターを構築することができる。
【００９８】
任意の当分野において公知の方法を用いてｓｉＲＮＡsまたはその他の核酸基盤の阻害剤を動物およびヒトに投与することができる。例えば動脈または静脈を介する動物への大容量のｓｉＲＮＡ含有溶液の急速注射(例えば数秒以内で完了する注射)のような「高圧」分配技術を用いることができる(例えば非特許文献２７参照)。マイクロ粒子、ナノ粒子およびリポソームを用いてｓｉＲＮＡを分配することもできる。ｍｃｌ−１ ｍＲＮＡを標的とし、そしてマイクロ粒子、ナノ粒子およびリポソームに随伴されるか、またはそうでなければ生物学的細胞への分配のために処方されるｓｉＲＮＡは本発明の範囲内である。
【００９９】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は約１５またはそれより多い(例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれより多い)ヌクレオチドを各々の鎖に含むことができる。ｄｓＲＮＡの鎖はｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの標的領域に実質的に相補的でよい。例えば１本の鎖はｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの標的領域に約９０％(例えば約９０％、９５％または１００％)相補的でよい。標的領域はｍｃｌ−１核酸配列の任意の領域、例えば配列番号２のアミノ酸１から７６のポリペプチドをコードする領域内の、例えば配列番号１のヌクレオチド１から２２８に対応する領域でよい。
【０１００】
例えば分子を化学的に合成すること、ＤＮＡ鋳型から分子をインビトロで転写すること、例えばｓｈＲＮＡから分子をインビボで作成すること(ｄｓＲＮＡおよびその他の阻止核酸の作成は前記でさらに論じられている)、または当分野において公知の任意のその他の方法を用いることにより本発明のｄｓＲＮＡ分子を生成することができる。例えば天然発生ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性増大させる、もしくはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖の間で形成された二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された、種々に修飾されたヌクレオチドを用いてｄｓＲＮＡの各鎖を化学的に合成することができる(例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオシドを使用することができる)。同一鎖にセンスおよびアンチセンス配列の双方を含む核酸がクローン化されている発現ベクターを用いてｄｓＲＮＡを生成することもできる(例えば挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、そのステムがｍｃｌ−１ＲＮＡに相補的であるアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡを形成するヘアピンを形成し得る)。したがって所定のｍｃｌ−１ ｍＲＮＡ配列の逆向でそして相補体である配列を含むｄｓＲＮＡを作成(または設計)することにより、ｍｃｌ−１発現を阻止するｄｓＲＮＡを作成することができる。
【０１０１】
ｄｓＲＮＡをｍｃｌ−１発現細胞において試験することができる。抗ｍｃｌ−１ ｄｓＲＮＡは細胞におけるｍｃｌ−１の発現を低下させる(すなわちｍｃｌ−１タンパク質およびｍｃｌ−１ ｍＲＮＡのレベルを低下させる)。当分野において公知の方法によりｍｃｌ−１発現を検定することができる。例えばｍｃｌ−１タンパク質のレベルをウェスタンブロット分析により、免疫沈降により、ＥＬＩＳＡにより、または機能的アッセイにより検定することができる。ｍｃｌ−１ ｍＲＮＡのレベルをノーザンブロット、インサイチュ分析またはポリメラーゼ連鎖反応と組み合わされた逆転写(ＲＴ−ＰＣＲ)により検定することができる。
【０１０２】
本発明はまたリボザイムをも包含する。リボザイムは一本鎖核酸(例えばｍＲＮＡ)に対する相補性領域を有し、それを切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。故にリボザイム(例えばハンマーヘッドリボザイム(非特許文献２８に記載される))を用いてｍｃｌ−１ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断して、それによりｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの翻訳を阻止することができる。ｍｃｌ−１コード化核酸に特異性を有するリボザイムを、本明細書に開示されるｍｃｌ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば活性部位のヌクレオチド配列が、ｍｃｌ−１コード化ｍＲＮＡで切断されるべきヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナＬ１９IVＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる。例えばCech et al., 特許文献２８；およびCech et al., 特許文献２９を参照されたい。これに代えて、ｍｃｌ−１ ｍＲＮＡを用いてＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。例えば非特許文献２９を参照されたい。
【０１０３】
本発明または三重らせん構造を形成する核酸分子をも包含する。例えばｍｃｌ−１遺伝子の調節領域(例えばｍｃｌ−１プロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列をターゲティングして、標的細胞におけるｍｃｌ−１遺伝子の転写を防御する三重らせん構造を形成することによりｍｃｌ−１遺伝子発現を阻止することができる。一般的には非特許文献３０；非特許文献３１；および非特許文献３２を参照されたい。
【０１０４】
特定の実施態様では、本発明の核酸分子を塩基部分、糖部分またはリン酸塩骨格で修飾して、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改善する。例えば核酸のデオキシリボースリン酸塩骨格を修飾してペプチド核酸を作成することができる(非特許文献３３参照)。本明細書で使用される際には「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」なる用語は、デオキシリボースリン酸塩骨格が擬ペプチド骨格により置き換えられ、そして四つの天然ヌクレオ塩基のみが保持される核酸擬似物質、例えばＤＮＡ擬似物質を指す。ＰＮＡの中性の骨格は低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。非特許文献３３；非特許文献３４に記載されるような標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いてＰＮＡオリゴマーの合成を実施することができる。
【０１０５】
本発明では、ｍｃｌ−１ ＰＮＡを治療および診断適用のために使用することができる。例えば遺伝子の転写もしくは翻訳停止を誘起するか、または複製を阻止することにより、例えば遺伝子発現の配列特異的調整のために、ＰＮＡをアンチセンスまたは抗遺伝子剤(antigene agent)として使用することができる。例えばｍｃｌ−１ ＰＮＡを例えばＰＮＡ指向ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において；その他の酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼと組み合わされて使用される場合の人工制限酵素として(非特許文献３３)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして(非特許文献３３；非特許文献３４)使用することもできる。
【０１０６】
別の実施態様では、例えば親油性またはその他のヘルパー基をＰＮＡに結合させることにより、ＰＮＡ ＤＮＡキメラの形成によりｍｃｌ−１ ＰＮＡを修飾して、またはリポソームもしくは当分野において公知のその他の薬物分配の技術の使用によりその安定性または細胞取り込みを強化することができる。例えばＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせることができるｍｃｌ−１ ＰＮＡ ＤＮＡキメラを作成することができる。かかるキメラにより、ＤＮＡ認識酵素、例えばＲＮＡｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ部分と相互作用することが可能になるが、ＰＮＡ部分は高い結合親和性および特異性を提供する。塩基スタッキング、ヌクレオ塩基間の結合の数および配向に関して選択された適切な長さのリンカーを用いてＰＮＡ ＤＮＡキメラを連結することができる(非特許文献３３)。ＰＮＡ ＤＮＡキメラの合成を非特許文献３３および非特許文献３５に記載されるように実施することができる。例えば標準的なホスホラミダイト結合化学を用いてＤＮＡ鎖を固体支持体上で合成することができ、そして修飾されたヌクレオシド類似体、例えば５'(４メトキシトリチル)アミノ５'デオキシチミジンホスホラミダイトを例えばＰＮＡとＤＮＡの５'末端の間でリンカーとして用いることができる(非特許文献３６)。次いでＰＮＡ単量体を段階的な様式で結合させて５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する(非特許文献３５)。これに代えて、５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントでキメラ分子を合成することができる(非特許文献３７)。
【０１０７】
その他の実施態様ではオリゴヌクレオチドは、ペプチド(例えばインビボで宿主細胞受容体をターゲティングするために)または細胞膜(例えば非特許文献３８；非特許文献３９；特許文献３０参照)もしくは脳血管関門(例えば特許文献３１参照)をわたる輸送を促進する薬剤のようなその他の追加の基を含み得る。加えてハイブリダイゼーションが引き金となる切断剤(例えば非特許文献４０参照)または挿入剤(例えば非特許文献４１参照)でオリゴヌクレオチドを修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションが引き金となる架橋剤、輸送剤またはハイブリダイゼーションが引き金となる切断剤に抱合させることができる。
【０１０８】
ベクター、宿主細胞およびトランスジェニック動物
ｍｃｌ−１核酸(またはその一部)を含有するベクター、例えば発現ベクターもまた本発明に含まれる。本明細書で使用される際には、「ベクター」なる用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一つの型のベクターはプラスミド、すなわちさらなるＤＮＡセグメントをライゲートできる環状二本鎖ＤＮＡループである。別の型はウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートできる。特定のベクターは導入された宿主細胞内で自己複製することが可能である。それ故に、ｍｃｌ−１核酸含有ベクターを含有する宿主細胞もまた本発明に含まれる。ベクターおよび宿主細胞の選択は当業者には日常的である。
【０１０９】
本発明は、治療上有効量のＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤および、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物のようなｍｃｌ−１阻害剤の組み合わせを各々遊離形態または薬学的に許容される塩もしくは各々のプロドラッグの形態で、かかる処置を必要とする哺乳動物に投与することを含む、骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、およびまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を処置する方法を提供する。
【０１１０】
好ましくは本発明は、治療上有効量の式(VII)のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその薬学的に許容される塩およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせをかかる処置を必要とする哺乳動物に投与することを含む、骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、およびまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を患う哺乳動物、特にヒトを処置する方法を提供する。
【０１１１】
別の実施態様では本発明は、骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、およびまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を処置するための、ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせの使用に関する。
【０１１２】
さらなる実施態様では本発明は骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、およびまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を処置するための医薬組成物の調製のためのＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせの使用に関する。
【０１１３】
本発明によれば、式(VII)のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその薬学的に許容される塩およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせは、ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の好ましい組み合わせである。
【０１１４】
略語：
ＡＳＯ (複数の)アンチセンスオリゴヌクレオチド
ＡＳＭ 侵襲性全身性肥満細胞症
ＢＭ 骨髄
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
クラドリビン ２−クロロデオキシアデノシン(＝２ＣｄＡ)
ＦＣＳ ウシ胎仔血清
ＩＳＭ 無痛性全身性肥満細胞症
ＭＣ (複数の)肥満細胞
ＭＣＬ 肥満細胞白血病
Ｍｃｌ−１ 骨髄細胞白血病−１
ＭＣＳ 肥満細胞肉腫
ｍｉＲＮＡ マイクロＲＮＡ
ＰＢ 末梢血
ＰＢＳ リン酸塩緩衝生理食塩水
ＲＮＡｉ ＲＮＡ干渉
ＲＴ−ＰＣＲ 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
ｓｈＲＮＡ 短鎖ヘアピンＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ 低分子干渉ＲＮＡ
ＳＭ 全身性肥満細胞症
ＳＳＭ 全身性くすぶり型肥満細胞症
ＴＫ チロシンキナーゼ
【０１１５】
骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、およびまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を処置するための、各々の遊離形態または薬学的に許容される塩もしくは各々のプロドラッグの形態のＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせは組み合わせパートナーの自由なまたは固定された組み合わせでよい。
【０１１６】
一つの態様では、本発明はまた(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤、特に具体的に前記されたＦＬＴ−３阻害剤、とりわけ好ましいとして記載されたもの；および(ｂ)アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物；を含む組み合わせ調製物または医薬組成物のような組み合わせにも関し、ここで活性成分(ａ)および(ｂ)は同時、併用的、個別または逐次的使用のために、各々の場合で遊離形態または薬学的に許容される塩もしくは適当な生物医薬処方の形態で存在する。適当な生物医薬処方は当業者に公知であり、ここでその処方は、治療的投与がＲＮＡｉ構築物のものであるか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド構築物のためのものであるかに依存して最適化される。
【０１１７】
「組み合わせ調製物」なる用語は、前記で定義されたような組み合わせパートナー(ａ)および(ｂ)を独立して、または区別された量の組み合わせパートナー(ａ)および(ｂ)での様々な固定された組み合わせの使用により、すなわち同時に、併用的に、個別にまたは逐次的に投与できるという意味で、特に「部品からなるキット」を定義する。次いで部品からなるキットの一部を例えば同時にまたは時間順に交互に、すなわち部品からなるキットの任意の部分に関して異なる時点で、および均等なまたは異なる時間間隔で投与できる。組み合わされた調製物で投与されるべき組み合わせパートナー(ａ)の組み合わせパートナー(ｂ)に対する全量の比率を、例えば処置されるべき患者の亜集団の必要性または単一の患者の必要性に対処するために変化させることができ、その異なる必要性は患者の特定の疾患、疾患の重篤度、年齢、性別、体重等のためでよい。
【０１１８】
前記されたような本明細書にて前記された疾患および症状を処置するために用いられるＦＬＴ−３阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の正確な投薬量は宿主、処置される症状の性質および重篤度、投与様式を含むいくつかの因子に依存する。しかしながら一般的に、ＦＬＴ−３阻害剤を非経口的、例えば腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、もしくは直腸内、または経腸的、例えば経口的、好ましくは静脈内、または好ましくは経口的、静脈内に、０.１から１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１から５ｍｇ／ｋｇ体重の１日投薬量で投与した場合に満足できる結果が達成される。ヒト試験では、２２５ｍｇ／日の全用量が何より恐らく最大耐量(ＭＴＤ)である。好ましい静脈内１日投薬量は０.１から１０ｍｇ／ｋｇ体重、またはたいていの大型霊長類に関しては、２００−３００ｍｇの１日投薬量である。典型的な静脈内投薬量は３から５ｍｇ／ｋｇ、週３から５回である。
【０１１９】
最も好ましくは、ＦＬＴ−３阻害剤、特にミドスタウリンは経口的に、マイクロエマルジョン、ソフトゲルまたは固体分散物のような投薬形態により、約２５０ｍｇ／日、とりわけ２２５ｍｇ／日までの投薬量で投与され、１日１、２または３回投与される。
通常、処置される宿主のための最適投薬量が決定されるまで、小用量を最初に投与し、そして投薬量を徐々に増加させる。投薬量の上限は副作用により強いられるものであり、そして処置されている宿主に関する試験により決定され得る。
【０１２０】
ＦＬＴ−３阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物を一つまたはそれより多い薬学的に許容される担体、および場合によっては一つまたはそれより多いその他の医薬用アジュバントと組み合わせることができ、そして錠剤、カプセル、キャプレット等の形態で経腸的、例えば経口的に、または例えば滅菌注射溶液もしくは懸濁液の形態で非経口的に、例えば腹腔内もしくは静脈内に投与できる。経腸用および非経口用組成物を従来の手段により調製することができる。
【０１２１】
本発明による注入溶液は好ましくは滅菌性である。例えば滅菌ろ過膜を通してろ過することにより、これを容易に達成することができる。液体形態の任意の組成物の無菌的形成、バイアルの無菌的充填および／または無菌条件下で本発明の医薬組成物を適当な希釈剤と組み合わせることは当業者に周知である。
ＦＬＴ−３阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物を本明細書にて前記にて挙げられた疾患および症状を処置するために有効である量の活性物質を含有する経腸用および非経口用医薬組成物に処方することができ、かかる組成物は単位投薬量形態であり、そしてかかる組成物は薬学的に許容される担体を含む。
【０１２２】
ＦＬＴ−３阻害剤の有用な組成物の実例は特許文献１、特許文献３２、特許文献１、特許文献３３、特許文献３４、特許文献３５に記載される。
ＦＬＴ−３阻害剤の好ましい組成物は、１９９５年６月１４日公開の特許文献３６に記載される。記載された医薬組成物は飽和ポリアルキレングリコールグリセリド中のミドスタウリンのような式Ｉの化合物の溶液または分散物を含み、ここでグリコールグリセリドは一つまたはそれより多いＣ８−Ｃ１８飽和脂肪酸のグリセリルおよびポリエチレングリコールエステルの混合物である。
【発明を実施するための形態】
【０１２３】
ＦＬＴ−３阻害剤のかかる組成物の二つの製造方法を本明細書後記に記載する。
組成物Ａ：
Gelucire４４／１４(８２部)を６０℃まで加熱することにより融解させる。粉末化されたミドスタウリン(１８部)を融解された材料に加える。得られた混合物をホモジナイズし、そして得られた分散物を様々な大きさの硬質ゼラチンカプセルに導入して、あるものはミドスタウリン２５ｍｇの投薬量を含有し、そしてあるものは７５ｍｇの投薬量を含有するようにする。得られたカプセルは経口投与に適当である。
【０１２４】
組成物Ｂ：
Gelucire４４／１４(８６部)を６０℃まで加熱することにより融解させる。粉末化されたミドスタウリン(１４部)を融解された材料に加える。混合物をホモジナイズし、そして得られた分散物を様々な大きさの硬質ゼラチンカプセルに導入して、あるものはミドスタウリン２５ｍｇの投薬量を含有し、そしてあるものは７５ｍｇの投薬量を含有するようにする。得られたカプセルは経口投与に適当である。
【０１２５】
Gelucire４４／１４はGattefosseより市販により入手可能であり；Ｃ８−Ｃ１８飽和脂肪酸のグリセロールとのエステルおよび分子量約１５００を有するポリエチレングリコールの混合物であり、脂肪酸構成成分の組成に関する明細は重量で４−１０％カプリル酸、３−９％カプリン酸、４０−５０％ラウリン酸、１４−２４％ミリスチン酸、４−１４％パルミチン酸および５−１５％ステアリン酸である。
【０１２６】
Gelucire処方の好ましい実例は：
Gelucire(４４／１４)：４７ｇ
ミドスタウリン：３.０ｇ、６０ｍｌねじ切り付きフラスコに充填
からなる。
ソフトゲルの好ましい実例は以下のマイクロエマルジョンを含有する：
コーン油グリセリド ８５.０ｍｇ
ポリエチレングリコール４００ １２８.２５ｍｇ
Cremophor ＲＨ４０ ２１３.７５ｍｇ
ミドスタウリン ２５.０ｍｇ
ＤＬアルファトコフェロール ０.５ｍｇ
無水エタノール ３３.９ｍｇ
全量 ４８６.４ｍｇ
しかしながら、それは説明目的のためだけであることを明確に理解すべきである。
【０１２７】
ＦＬＴ−３阻害剤およびｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせがそのいずれかの薬剤単独での処置よりもさらに有効であることを以下に記載される試験方法により示すことができる。確定されたこれらの研究では、全身性肥満細胞症(ＳＭ)に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物およびＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤、好ましくは４−ベンジルスタウロスポリンにより誘起される細胞周期効果およびアポトーシスが実証される。
【０１２８】
腫瘍性ヒトＭＣにおけるＭｃｌ−１の発現および機能的役割が試験される。ＡＳＭおよびＭＣＬを含むＳＭの全ての変種における原発性腫瘍性ＭＣならびにＭＣＬ細胞系ＨＭＣ−１がＭｃｌ−１を構成的な様式で発現することを示すことができる。加えてこれらの細胞におけるＭｃｌ−１のターゲティングが成長低下およびアポトーシスの誘導に、ならびにＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドおよびイマチニブを含むＴＫ阻害剤に対する感受性の増大に関連することが示される。
【０１２９】
抗ＦＬＴ−３またはホスホ(ｐ)−ＦＬＴ−３抗体を利用する新しく開発されたフローサイトメトリー(ＦＣＭ)アッセイを用いて、ＭＶ４−１１(ＭＶ)細胞はＦＬＴ−３およびｐ−ＦＬＴ−３の双方を発現するが、ＲＳ４−１１(ＲＳ)細胞はその細胞表面でＦＬＴ−３しか発現しないことが実証される。２０から２００ｎＭの好ましいＦＬＴ−３阻害剤への暴露は細胞周期Ｇ１相蓄積を用量依存的な様式で、およびＲＳ細胞よりも有意に多いＭＶのアポトーシスを誘起する。これはウェスタン分析により決定されるように、ｐ−ＦＬＴ−３、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫ１／２の著明な減衰に関連するが、ＦＬＴ−３、ＡＫＴまたはＥＲＫ１／２レベルには関連しない。好ましいＦＬＴ−３阻害剤はまたＭＶ細胞上のｐ−ＦＬＴ−３の細胞表面発現を阻止するが、ＦＬＴ−３の発現を阻止しない(ＦＣＭにより決定できるように)。好ましいＦＬＴ−３阻害剤とは対照的に、ウェスタンおよびＦＣＭ分析の双方により決定できるように、好ましいＨＤＡＩ化合物での処置はＭＶおよびＲＳ細胞におけるＦＬＴ−３およびｐ−ＦＬＴ−３双方のレベルを用量依存的な様式で減衰させる。好ましいＨＤＡＩ化合物(２０から１００ｎＭ)への暴露もまたｐ−ＦＬＴ−３、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫ１／２のレベルを下方調節する。驚くべきことに、好ましいＦＬＴ−３阻害剤および好ましいＨＤＡＩ化合物での同時処置はＭＶおよびＲＳ細胞のアポトーシスを有意に誘起する。これはＭＶ細胞におけるｐ−ＦＬＴ−３、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫ１／２のさらなる減衰に関連する。
【０１３０】
好ましくは、少なくとも一つの有益な効果、例えば第一および第二の活性成分の効果の相互増強、とりわけ相乗効果、例えば相加以上の効果、さらなる有利な効果、低副作用、第一および第二の活性成分の一つまたは双方の、組み合わせでなければ無効な投薬量で組み合わされた治療効果、ならびに特に活性成分の強力な相乗効果がある。
組み合わせ中のＦＬＴ−３阻害剤／アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物のモル比は一般的に１／１０から１０／１、好ましくは１／５から５／１、例えば１／２、１／１、２／１または３／１である。
【実施例１】
【０１３１】
材料および方法
試薬
イマチニブ(ＳＴＩ５７１)、ＰＫＣ４１２２８およびニロチニブ(４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド)２９はNovartis Pharma AG(Basel, Switzerland)により提供される。ＰＫＣ４１２および４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドのストック溶液はジメチル−スルホキシド(ＤＭＳＯ；Merck, Darmstadt, Germany)中に溶解することにより調製する。インターロイキン−４(ＩＬ−４)をPeprotech(Rocky Hill, NJ)から、ＲＰＭＩ１６４０培地およびウシ胎仔血清(ＦＣＳ)をPAA laboratories(Pasching, Austria)から、Ｌ−グルタミンおよびイスコフ改変ダルベッコ培地(ＩＭＤＭ)をGibco Life Technologies(Gaithersburg, MD)から、３Ｈ−チミジンをAmersham(Aylesbury, UK)から、そしてクラドリビン(２−クロロデオキシアデノシン、２ＣｄＡ)をJanssen−Cilag(Beerse, Belgium)から購入する。アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ；最近公開された配列にしたがって設計された)をVBC Genomics(Vienna, Austria)またはISIS Pharmaceuticals(Carlsbad, CA)から、そしてｓｉＲＮＡをDharmacon(Lafayette, CO)から入手する。
【０１３２】
患者の特徴および腫瘍性肥満細胞の精製
全身性肥満細胞症(無痛性全身性肥満細胞症、ＩＳＭ、ｎ＝１７；侵襲性全身性肥満細胞症、ＡＳＭ、ｎ＝３；肥満細胞白血病、ＭＣＬ、ｎ＝２；くすぶり型全身性肥満細胞症、ＳＳＭ、ｎ＝２；肥満細胞肉腫、ＭＣＳ、ｎ＝１)を有する全数２５人の患者を試験する。骨髄(ＢＭ)細胞を後腸骨稜細胞から入手し、そして保存剤不含ヘパリンが入ったシリンジに収集する。各々の場合で生検の前にインフォームドコンセントを得る。ＷＨＯ基準にしたがって診断を確立する。肥満細胞白血病(ＭＣＬ)を有する２人および肥満細胞肉腫(ＭＣＳ)を有する１人の患者の原発性腫瘍性ＭＣを、記載されるようにＰＥ標識ｍＡｂ ＹＢ５.Ｂ８(Pharmingen, San Diego, CA)およびＦＡＣＳ−Vantage セルソーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて均質になるまで精製する(純度＞９８％)。施設内診査委員会の承認を得て、そしてヘルシンキ宣言にしたがって、全ての実験を行う。
【０１３３】
ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するかまたは欠如するＨＭＣ−１細胞の培養
ＭＣＬ４８を有する患者の白血病細胞から作成されたヒト肥満細胞系ＨＭＣ−１を入手する(Mayo Clinic, Rochester, MN)。ＨＭＣ−１の二つのサブクローン、すなわちＫＩＴ変異Ｇ５６０Ｖを宿すがＤ８１６Ｖを宿さないＨＭＣ−１.１、ならびにＫＩＴのＧ５６０Ｖ変異およびＤ８１６Ｖ変異の双方を呈するＨＭＣ−１.２細胞を使用する。１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補充したＩＭＤＭ培地中、３７℃および５％ＣＯ２で３２個のＨＭＣ−１細胞を成長させる。ＨＭＣ−１細胞を元来のストックから４から８週毎に再解凍し、そして毎週継代する。「表現型」の対照として、ＨＭＣ−１細胞をＫＩＴの発現およびＩＬ−４(１００Ｕ／ｍｌ、４８時間)の下方調整効果に関して定期的に確認する。
【０１３４】
阻害剤での処置
ＨＭＣ−１細胞を種々の濃度のＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ−ターゲティングＴＫ阻害剤ＰＫＣ４１２(１００ｐＭから１０μＭ)、種々の濃度の４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(１ｎＭから１００μＭ)、イマチニブ(３ｎＭから３００μＭ)、２ＣｄＡ(０.１−１００００ｎｇ／ｍｌ)または対照培地と共に３７℃および５％ＣＯ２で４８時間までインキュベートする。別の一連の実験では、ＨＭＣ−１細胞を阻害剤(以下を参照)に暴露される前にｍｃｌ−１特異的ＡＳＯでトランスフェクトする。その他の実験では、細胞を種々の濃度のＭｃｌ−１特異的ＡＳＯ(５０ｎＭ−２５０ｎＭ)で１２時間まで、またはｓｉＲＮＡ(２００ｎＭ)で１２時間トランスフェクトし、さらに標的薬物に暴露することはない。薬物または／およびＡＳＯに暴露した後、細胞を３Ｈ−チミジン取り込み実験、細胞生存能力およびアポトーシスの分析またはウェスタンブロッティングに供する。
【０１３５】
ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ
Trizol(Invitrogen, Ｃarlsbad, ＣA)を製造者の説明書にしたがって使用して全ＲＮＡをＨＭＣ−１細胞から単離する。ＲＮＡ調製物およびノーザンブロッティングを本質的に記載されるように実施する。簡単には記載されるように全ＲＮＡ１５μｇを１.０％ホルムアルデヒド−アガロースゲルでサイズ分画し、そしてナイロン膜(Hybond N, Amersham, Aylesbury, U.K.)に移す。ｍｃｌ−１またはβ−アクチンに特異的な３２Ｐ標識ｃＤＮＡを用いてrapid−hyb buffer(Amersham)中でハイブリダイゼーションを実施する。記載されるようにＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いてｐＢＳＫ−Ｍｃｌ−１(Stanley J. Korsmeyer, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MAから寄贈)から全長ｍｃｌ−１ ｃＤＮＡを切り出すことによりｍｃｌ−１プローブを作成する。Megaprimeキット(Amersham)を用いて標識を実施する。０.１％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を伴う０.２×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウム、pＨ７.０)で、１時間４２℃で、２×３０分間、および６２℃でさらに３０分間ブロットを洗浄する。−８０℃で増感スクリーン(Kodak)を用いてBiomax ＭＳフィルム(Kodak, Rochester, NY)に暴露することにより結合放射活性を可視化する。E.A.S.Y. Win３２ソフトウェア(Herolab, Wiesloch, Germany)を用いてオートラジオグラムのデンシトメトリーによりｍＲＮＡ発現レベルを定量する。Protoscript First Strand ｃＤＮＡ合成キット(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて、５０μｌ反応容量で１μｇ ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を実施する。ＰＣＲ条件は以下のとおりである：９４℃で６０秒間の初期変性、５５℃で６０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合(３５サイクル)および７２℃で１０分間の最終伸長。以下のプライマー対を使用する：ｍｃｌ−１：５'-TGC TGG AGT TGG TCG GGG AA−３'(順行)(配列番号３)および５'−TCG TAA GGT CTC CAG CGC CT−３'(逆行)(配列番号４)。βアクチン：５'−ATG GAT GAT GAT ATC GCC GCG−３'(順行)(配列番号５)および５'−CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG GCC−３'(逆行)(配列番号６)。ＰＣＲ生成物を０.５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム含有１％アガロースゲルに溶解させる。
【０１３６】
ウェスタンブロット分析
ＨＭＣ−１細胞のライゼートおよびポリクローナルウサギ抗ヒトＭｃｌ−１抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を用いて前記されたようにウェスタンブロット分析を実施する。簡単には、１％Triton−Ｘ−１００(Sigma, St. Louis, MO)を含有するリン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中で細胞を溶解する。還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、そしてトランスファーバッファー中でニトロセルロース膜(Protran, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)に移す。次いで膜を抗マウス／抗ウサギＩｇＧ(BM 化学発光ウェスタンブロッティングキット、Roche)に暴露する。均等の負荷を確認するために、膜を抗βアクチン抗体(Sigma)で再プロービングする。Biomax ＭＳフィルム(Kodak)への暴露により化学発光を検出する。
【０１３７】
免疫組織化学および免疫細胞化学
ＳＭを有する全ての患者で、腫瘍性ＢＭ ＭＣにおけるＭｃｌ−１の発現をパラフィン包埋、ホルマリン固定ＢＭ標本から調製された連続切片(２μｍ)で間接的免疫ペルオキシダーゼ染色技術を用いて試験する。内因性ペルオキシダーゼをＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ２により遮断する。ポリクローナル抗Ｍｃｌ−１抗体(Santa Cruz)(作業希釈：１：５０)で染色する前に、ＢＭ切片をマイクロ波オーブンにより前処理する。連続ＢＭ切片を抗Ｍｃｌ−１抗体(一晩)および抗トリプターゼ抗体Ｇ３(作業希釈：１：５０００、室温で１時間)(Chemicon, Temecula, CA)と共にインキュベートする。抗体を０.０５Ｍ Tris緩衝生理食塩水(ＴＢＳ、ｐＨ７.５)および１％ウシ血清アルブミンＢＳＡ(Sigma)で希釈する。洗浄後、スライドをビオチン化ヤギ抗ウサギまたはウマ抗マウスＩｇＧと共に３０分間インキュベートし、洗浄し、そしてストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体に３０分間暴露する。３−アミノ−９−エチル−カルバゾール(ＡＥＣ)を色素原として使用する。スライドをMayer's Hemalaunで対比染色する。抗Ｍｃｌ−１抗体(作業希釈１：２００)およびビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ(Biocarta, San Diego, CA)を用いて記載されるようにＨＭＣ−１細胞のサイトスピン調製物で免疫細胞化学を実施する。選択実験では、Ｍｃｌ−１遮断ペプチド(Santa Cruz)を適用する(作業希釈１：４０)。色素原としてアルカリ性ホスファターゼ複合体(Biocarta)を使用する。Neofuchsin(Nichirei, Tokyo, Japan)を用いて抗体反応性を可視化する。
【０１３８】
ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)およびｓｉＲＮＡでのトランスフェクション
ＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２細胞をｍｃｌ−１特異的２'−Ｏ−メトキシエチル／２'−デオキシヌクレオチドキメラホスホロチオエートＡＳＯ(５'−TTG GCT TTG TGT CCT TGG CG−３')(配列番号７)またはスクランブル対照オリゴヌクレオチドプールでトランスフェクトする。スクランブル対照はＡ(アデニン)、Ｇ(グアニン)、Ｔ(チミン)およびＣ(シトシン)塩基の混合物を表し、得られた調製物は等モル濃度のオリゴヌクレオチドの混合物を含有する。別の一連の実験では、アニーリングされた、精製された、そして脱塩された二本鎖ｍｃｌ−１ ｓｉＲＮＡ(AAG AAA CGC GGU AAU CGG ACU)(配列番号８)およびAGU CCG AUU ACC GCG UUU CUU ３'(ｍｃｌ１、配列番号９))ならびにルシフェラーゼに対する対照ｓｉＲＮＡ(CUU ACG CUG AGU ACU UCG A)(配列番号１０)(双方共にDharmacon(Lafayette, CO)より入手)を適用する。トランスフェクション用に８０００００セルを７５ｃｍ２培養プレートに３７℃で２４時間を播種する。本質的には記載されるようにＲＰＭＩ１６４０培地中Ｍｃｌ−１−ＡＳＯおよびＭｃｌ−１ ｓｉＲＮＡをリポフェクチン試薬(Invitrogen)と複合化する。簡単には、ＨＭＣ−１.１またはＨＭＣ−１.２細胞を種々の濃度のｍｃｌ−１ ＡＳＯ(５０−２５０ｎＭ)または２００ｎＭ ｍｃｌ−１特異的ｓｉＲＮＡと共に３７℃で４時間インキュベートする。ＡＳＯへの暴露の後、細胞を洗浄し、そして１０％ＦＣＳを伴うＲＰＭＩ１６４０培地中種々の濃度のＴＫ阻害剤の存在下または不在下でさらに１２時間培養した後に分析する。ｓｉＲＮＡ処置細胞を対照培地中１２時間(ＴＫ阻害剤不含)維持した後、アポトーシス細胞のパーセンテージおよびウェスタンブロッティングに関して試験する。
【０１３９】
３Ｈ−チミジン組み込みアッセイおよび細胞生存能力の決定
Ｍｃｌ−１ ＡＳＯ、ＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド、イマチニブおよび２ＣｄＡの抗増殖効果を調べるために、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞を用いて３Ｈ−チミジン組み込み実験を行う。ＴＫ阻害剤および２ＣｄＡを未処理細胞またはＡＳＯもしくは万能(universal)(スクランブル)対照でトランスフェクトされた細胞に適用する。とりわけＭｃｌ−１ ＡＳＯまたは対照オリゴヌクレオチドでのトランスフェクションの４時間後に、細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート(５×１０４セル／ウェル)中種々の濃度のＰＫＣ４１２(１００ｐＭから１０μＭ)、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(１ｎＭから１００μＭ)、イマチニブ(３ｎＭから３００μＭ)またはクラドリビン(２ＣｄＡ；ＨＭＣ−１.１：０.１−１００００ｎｇ／ｍｌ；ＨＭＣ−１.２：０.５−５００ｎｇ／ｍｌ)の不在下または存在下で２４時間培養する。その後、１μＣｉ ３Ｈ−チミジンを各ウェルに加える。１６時間後にFiltermate １９６ハーベスター(Packard Bioscience)のろ過膜(Packard Bioscience, Meriden, CT)上で細胞を収集する。次いでろ液を空気乾燥させ、そして結合放射活性をβカウンター(Top−Count NXT, Packard Bioscience)で測定する。全ての実験を３検体ずつで実施する。トリパンブルー排除試験により細胞生存能力を決定する。従来の細胞形態学基準を用いてWright−Giemsa染色サイトスピンスライド上でアポトーシス細胞のパーセンテージを決定する。
【０１４０】
統計分析
データの評価において見出される差異の有意性のレベルを決定するために、対応のあるスチューデントｔ検定を適用する。結果はｐ＜０.０５で有意に異なると考えられる。ｍｃｌ−１ ＡＳＯおよび標的薬物の相乗効果を決定するために、市販により入手可能であるソフトウェア(CalcuSyn；Biosoft, Ferguson, MO)を用いて公開されたガイドラインにしたがって組み合わせ指標の値を計算する。
【０１４１】
結果
腫瘍性肥満細胞におけるＭｃｌ−１タンパク質の検出
方法
免疫組織化学および連続切片染色により評価されるように、試験された全てＳＭ患者において腫瘍性ＭＣはＭｃｌ−１に対する抗体と反応することが見出される(ｎ＝２５)。腫瘍性ヒト肥満細胞におけるＭｃｌ−１の発現を、無痛性ＳＭ(ＩＳＭ)を有する患者の腫瘍性ＭＣにおけるトリプターゼおよびＭｃｌ−１の免疫組織化学的検出により分析する。隣接する骨髄切片をトリプターゼまたはＭｃｌ−１に対する抗体と共にインキュベートする。免疫組織化学を記載されるように実施する。
【０１４２】
Ｍｃｌ−１発現の免疫細胞化学的検出を、ＫＩＴ変異Ｄ８１６Ｖを呈するＨＭＣ−１.２細胞においてさらに分析する。ポリクローナル抗Ｍｃｌ−１抗体を用いて免疫細胞化学を実施する。抗体を特異的遮断ペプチドと共にプレインキュベートすると陰性染色に至った。同一の染色結果はＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１.１細胞で得られる。ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞のノーザンブロット分析はｍｃｌ−１特異的ｃＤＮＡプローブおよびβアクチン負荷対照を使用する。Ｋ５６２細胞、ＨＭＣ−１.１細胞、ＨＭＣ−１.２細胞、および精製された(純度＞９８％)腫瘍性ヒト肥満細胞におけるｍｃｌ−１ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析は肥満細胞肉腫(ＭＣＳ)を有する１人の患者(＃１)および肥満細胞白血病(ＭＣＬ)を有する２人の患者(＃２および＃３)から得られる。ＰＣＲ反応はＲＴ工程を省く(−ＲＴ)ことにより制御される。
【０１４３】
結果
ＩＳＭを有する患者の紡錘形腫瘍性ＢＭ ＭＣにおいてトリプターゼおよびＭｃｌ−１の同時発現が観察される。これらの浸潤物において事実上全ての腫瘍性ＭＣがＭｃｌ−１に関して陽性に染色されることが見出される。また、種々のカテゴリーのＳＭの患者を比較した場合、免疫組織化学によりＭＣにおけるＭｃｌ−１発現(浸潤物における染色されたＭＣのパーセンテージまたは染色の強度に関して)に差異はない。とりわけＭｃｌ−１はＩＳＭおよびＳＳＭを有する患者の腫瘍性ＭＣにおいて、ならびにＡＳＭおよびＭＣＬのような高悪性度の悪性腫瘍において発現されることが見出される。免疫細胞化学により決定されるようにヒトＭＣＬ由来の白血病細胞系ＨＭＣ−１(ＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２)もまたＭｃｌ−１タンパク質を発現することが見出される。対照培地またはＭｃｌ−１特異的遮断ペプチドとのプレインキュベーションの後の抗Ｍｃｌ−１抗体のＨＭＣ−１.１細胞との反応性を実施し、そしてＨＭＣ−１.２細胞と同一の結果が得られる。
【０１４４】
腫瘍性肥満細胞におけるｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの検出
次の工程では、原発性腫瘍性ＭＣおよびＨＭＣ−１細胞におけるｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの発現を試験する。ノーザンブロッティングにより評価されるように、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞の双方がｍｃｌ−１ ｍＲＮＡを発現することが見出される。ＨＭＣ−１細胞におけるｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ分析により確認する。さらにＭＣＬまたはＭＣＳを有する患者の高度に精製された原発性腫瘍性ＭＣにおけるｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ分析により実証することができる。
【０１４５】
Ｍｃｌ−１発現の下方調節が腫瘍性ＭＣの生存能力に対抗する
方法
ＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２細胞におけるＭｃｌ−１タンパク質発現ならびに細胞生存能力に及ぼすｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を分析する。ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを宿すＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞を２５０ｎＭ ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド、スクランブル対照でトランスフェクトするか、または１２時間トランスフェクトせずに放置した後に分析する。抗Ｍｃｌ−１抗体を用いてＭｃｌ−１発現のウェスタンブロット分析を実施する。βアクチンを負荷対照として提供する。非生存(トリパンブルー陽性)細胞の評価を全有核細胞のパーセンテージとして表現する。アポトーシス細胞の数(％)。結果は三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【０１４６】
腫瘍性肥満細胞に及ぼすｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの用量依存的および時間依存的効果を、種々の濃度のｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(５０−２５０ｎＭ)または対照培地に１２時間暴露した後のＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるＭｃｌ−１発現のウェスタンブロット分析により分析する。βアクチンを負荷対照として提供する。ＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるＭｃｌ−１タンパク質の発現に及ぼすｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(２５０ｎＭ)およびスクランブル対照(２５０ｎＭ)の時間依存的効果を観察する。負荷対照として提供されるβアクチンを用いてウェスタンブロッティングによりＭｃｌ−１発現を決定する。細胞生存能力に及ぼすｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(２５０ｎＭ)およびスクランブル対照(２５０ｎＭ)の時間依存的効果、すなわちアポトーシス性ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞のパーセンテージが得られる。結果は三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【０１４７】
結果
Ｍｃｌ−１の生存性分子としての役割およびＳＭにおける潜在的標的を調べるために、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)研究法によりＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞においてＭｃｌ−１をノックダウンする。ウェスタンブロッティングにより決定されるように、双方の細胞系のｍｃｌ−１ ＡＳＯ(２５０ｎＭ)でのトランスフェクションはスクランブル対照または非トランスフェクト細胞と比較した場合、Ｍｃｌ−１タンパク質の発現を事実上消失させた。予測されるように、ｍｃｌ−１ ＡＳＯでのトランスフェクションはトリパンブルー陽性細胞の実質的な増加(対照は約１−５％；スクランブル対照は約５−８％；ＡＳＯは約３５−５０％)および試験されたＨＭＣ−１サブクローンの双方、すなわちＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるアポトーシス細胞のパーセンテージの同様の実質的な増加を導く。腫瘍性ＭＣ(ＨＭＣ−１)の成長および生存性に及ぼすｍｃｌ−１ ＡＳＯの効果は用量依存的および時間依存的であることが見出される。これらのデータにより、ＡＳＯ研究法による腫瘍性ＭＣにおけるｍｃｌ−１のターゲティングは細胞生存能力の喪失およびアポトーシスの誘導に関連することが示される。
【０１４８】
腫瘍性肥満細胞に及ぼすｍｃｌ−１ ｓｉＲＮＡの効果
方法
腫瘍性肥満細胞におけるｍｃｌ−１−ｓｉＲＮＡの効果を、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるＭｃｌ−１タンパク質の発現および細胞生存能力に関して分析する。細胞をトランスフェクトせずに放置する(対照)か、または本明細書に記載されるようにｍｃｌ−１特異的ｓｉＲＮＡ(ｍｃｌ−１−ｓｉＲＮＡ；２００ｎＭ)もしくはルシフェラーゼ特異的(対照)−ｓｉＲＮＡ(ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ；２００ｎＭ)のいずれかでトランスフェクトする。ポリクローナル抗Ｍｃｌ−１抗体を用いるウェスタンブロッティングによりＭｃｌ−１タンパク質発現をを決定する。βアクチンに関してプロービングすることにより均等な負荷を確認する。アポトーシス細胞のパーセンテージ(％)を記録することにより細胞生存能力を分析する。結果は各一連の実験の三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【０１４９】
結果
次の工程では腫瘍性ＭＣにおける生存性関連分子および潜在的標的としてのｍｃｌ−１の役割をさらに実証するためにｍｃｌ−１特異的ｓｉＲＮＡを適用する。これらの実験では、ｍｃｌ−１ ｓｉＲＮＡはＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞においてＭｃｌ−１タンパク質の発現を下方調節することが見出される。Ｍｃｌ−１の下方調節を誘起するｓｉＲＮＡは、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるアポトーシス細胞の増加に関連することが見出される。これらのデータにより、ｍｃｌ−１が腫瘍性ＭＣにおける必須の生存性因子であるというさらなる証拠が提供された。
【０１５０】
腫瘍性肥満細胞におけるＭｃｌ−１の発現に及ぼす抗腫瘍薬および標的薬物の効果
方法
ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１.１細胞およびＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するＨＭＣ−１.２細胞におけるＭｃｌ−１タンパク質の発現および細胞生存能力に及ぼすＰＫＣ４１２、ニロチニブ(すなわち４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド)、イマチニブ(すなわちGLIVECまたはGLEEVEC)または２ＣｄＡの効果を観察する。ポリクローナル抗Ｍｃｌ−１抗体を用いるウェスタンブロッティングによりＭｃｌ−１タンパク質発現を決定する。βアクチンに関してプロービングすることにより均等な負荷を確認する。アポトーシス細胞のパーセンテージ(％)を記録することにより細胞生存能力を分析する。細胞生存能力に及ぼす薬物効果を立証する結果は三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【０１５１】
結果
次の工程ではＨＭＣ−１細胞におけるＭｃｌ−１の発現に及ぼす種々の標的薬物の効果を探索する。これらの実験では、ＰＫＣ４１２(０.３−１０μＭ)、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(１０−３００ｎＭ)およびイマチニブ(３０−３００ｎＭ)が、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１.１細胞においてＭｃｌ−１タンパク質の発現を下方調節するが、２ＣｄＡ(１０００ｎg/ｍｌまで)は下方調節しないことが見出される。ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するＨＭＣ−１.２細胞に同一の薬物(同一濃度で)を適用した場合、ＰＫＣ４１２(１−１０μＭ)および２ＣｄＡ(１０−１００ｎg/ｍｌ)が対照と比較した場合、Ｍｃｌ−１の発現を低下させることが見出されるが、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドまたはイマチニブのいずれでも、試験された用量範囲にわたって有意な効果が認められない。双方の細胞系で、薬物誘起のＭｃｌ−１タンパク質の発現の低下がアポトーシス細胞の増加を伴うことが見出される。
【０１５２】
Ｍｃｌ−１ ＡＳＯは腫瘍性ＭＣにおいて成長阻止を生じるのに、ＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(ニロチニブ)およびイマチニブと協同する。
標的薬物およびｍｃｌ−１特異的ＡＳＯの著しい効果に基づいて、薬物およびＡＳＯの組み合わせがＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞に相乗的な抗増殖(またはアポトーシス誘起)効果を招くかどうかを突き止めることは興味深い。第一工程では、各単一の薬物に関して薬物への暴露後の３Ｈ−チミジン取り込み実験およびアポトーシス細胞の数を決定する実験においてＩＣ５０値を決定する。各々の結果(ＩＣ５０値)を表１にまとめる。標的薬物に関して、データは概して以前の我々の観察に合致する。増殖を遮断するために必要とされる標的薬物の濃度は通常アポトーシスの誘起のために必要とされるものと比較して低い。以前の我々のデータと一致して、ＰＫＣ４１２および２ＣｄＡ、ならびにより低い程度で４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドは薬理学的に適当な濃度でＨＭＣ−１.２細胞における細胞成長に対抗することが見出される。対照的にＨＭＣ−１.１細胞では、ＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドおよびイマチニブは細胞成長を低下させ、そしてアポトーシスを誘起することが見出されるが、２ＣｄＡでは有意な効果が認められない。ｍｃｌ−１ ＡＳＯはＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２サブクローンの双方で増殖を阻止し、そしてアポトーシスを誘起することが見出され、ＨＭＣ−１.２細胞ではＩＣ５０値がわずかに高い。
【０１５３】
【表１】
*薬物とのインキュベーションまたはＡＳＯでのトランスフェクションの２４時間後に３Ｈ−チミジン取り込みを分析し、そして細胞を薬物と２４時間インキュベートした後にアポトーシス細胞のパーセンテージをサイトスピン調製物で決定する。アポトーシスの評価のために、ＡＳＯでのトランスフェクションの２４時間後にはアポトーシス細胞の数が全例で＞５０％になるので、１２時間後に細胞を試験する
**ニロチニブは４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドである。
【０１５４】
ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠く(ＨＭＣ−１.１)または呈する(ＨＭＣ−１.２)腫瘍性肥満細胞の成長および生存能力に及ぼすｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的薬物の効果を分析する。
【０１５５】
方法
スクランブル対照またはｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(５０ｎＭ)でトランスフェクトされたＨＭＣ−１.１細胞による３Ｈ−チミジン取り込みに及ぼす種々の濃度のＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(ニロチニブ)、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)または２ＣｄＡの効果を実施する。結果は、標的薬物を含まない対照(＝スクランブル対照)のパーセントとして表現され、そして分析された別個の三つの実験の平均±ＳＤを表す。ＰＫＣ４１２、ニロチニブ、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)もしくは２ＣｄＡを適用された、または各々の薬物を適用されないｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはスクランブル対照(各々１００ｎＭ)の細胞生存能力、すなわちアポトーシス細胞のパーセンテージ(％)に及ぼす効果を分析する。結果は三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。CalcuSynソフトウェアを用いてＨＭＣ−１.１におけるＰＫＣ４１２、ニロチニブ、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)または２ＣｄＡおよびｍｃｌ−１アンチセンス誘起のアポトーシスの用量−効果関係性の分析をChouおよびTalalayの半有効法(median effect method)にしたがって計算する。１未満の組み合わせ指標(ＣＩ)は相乗効果を示す。
【０１５６】
スクランブル対照またはｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(８０ｎＭ)でトランスフェクトされたＨＭＣ−１.２細胞による３Ｈ−チミジン取り込みに及ぼす種々の濃度のＰＫＣ４１２、ニロチニブ、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)または２ＣｄＡの効果を分析する。結果は、標的薬物を含まない対照、すなわちスクランブル対照のパーセントとして表現され、そして別個の三つの実験の平均±ＳＤを表す。ＰＫＣ４１２、ニロチニブ、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)もしくは２ＣｄＡを適用された、または各々の薬物を適用されないｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはスクランブル対照(各々１００ｎＭ)の細胞生存能力、すなわちアポトーシス細胞のパーセンテージ(％)に及ぼす効果を分析する。結果は三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。CalcuSynソフトウェアを用いてＨＭＣ−１.２におけるＰＫＣ４１２、ニロチニブ、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)または２ＣｄＡおよびｍｃｌ−１アンチセンス誘起のアポトーシスの用量−効果関係性の分析をChouおよびTalalayの半有効法(median effect method)にしたがって計算する。１未満の組み合わせ指標(ＣＩ)は相乗効果を示す。
【０１５７】
結果
ｍｃｌ−１−ＡＳＯ−トランスフェクトされたＨＭＣ−１細胞の薬物誘起の応答をスクランブル対照でトランスフェクトされたＨＭＣ−１細胞の応答と比較した場合、実質的な差異が見出される。実際に、たいていの場合でｍｃｌ−１ ＡＳＯでのトランスフェクションがＨＭＣ−１細胞をＴＫ阻害剤に対して、および２ＣｄＡに対して鋭敏にすることが見出される。興味深いことに、ＨＭＣ−１.１細胞では、たいていの組み合わせが実際に相乗的であることが見出される。それに反してＨＭＣ−１.２細胞では、相乗効果はＡＳＯおよびＰＫＣ４１２、ならびにＡＳＯおよび２ＣｄＡの組み合わせにおいてのみ認められるが、ＡＳＯおよび４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドまたはＡＳＯおよびイマチニブでは認められない。全般的に見て、これらのデータにより、Ｍｃｌ−１を腫瘍性ＭＣにおける新しい薬物標的として用いることができ、そしてｍｃｌ−１特異的ＡＳＯはＨＭＣ−１細胞を２ＣｄＡおよび新規ＴＫ阻害剤に対して鋭敏にできることが示される。
【０１５８】
考察
Ｍｃｌ−１は最近になって種々の骨髄性腫瘍の病因に関わると見なされている十分に特徴付けされたＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである。全身性肥満細胞症(ＳＭ)は内臓におけるＭＣの異常な成長および蓄積を特徴とする骨髄腫瘍である。ＳＭを有する患者の腫瘍性ＭＣおよびヒト肥満細胞白血病細胞系ＨＭＣ−１は構成的な様式でＭｃｌ−１を発現するという証拠を提供する。さらに我々のデータにより、Ｍｃｌ−１が腫瘍性ＭＣにおける非常に重要な生存性分子であり、そしてＡＳＯまたはｓｉＲＮＡによるＭｃｌ−１のターゲティングは腫瘍性ＭＣの生存性の低下およびＰＫＣ４１２または４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドを含むＫＩＴチロシンキナーゼ阻害剤に対する応答性の増大に関連することが示される。
【０１５９】
正常および腫瘍性ＭＣは好塩基球を含むたいていのその他の骨髄細胞系列と比較して極度に長寿命の細胞であるが、その長期間生存に寄与するメカニズムおよび生存性因子はほとんど未知のままである。Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーは顆粒単球細胞において必須の生存性因子として関わると見なされるが、ＭＣにおけるこれらの分子の発現および役割についてはほとんど分かっていない。これまでのところ、腫瘍性ＭＣおよびＨＭＣ−１細胞がＢｃｌ−２を発現することが報告されている。加えて、ＳＭにおける腫瘍性ＭＣはＢｃｌ−ｘＬを表示すると記載されている。この研究で、および特異的ＡＳＯおよびｓｉＲＮＡを用いる機能分析により、腫瘍性ＭＣにおけるｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでのＭｃｌ−１の発現を実証することができる。故に我々のデータに基づいて、Ｍｃｌ−１は腫瘍性ＭＣにおいて発現される重大な生存性因子として見なされなければならない。
【０１６０】
ＳＭの臨床経過は不定であり、そして低増殖能力のＭＣおよび正常な平均寿命を伴う無症候性から、腫瘍性ＭＣの急速な増殖および短い生存性を伴う高度に侵襲性の症例までにわたる。それ故にＭｃｌ−１のレベルがＳＭを有する患者の群の間で変動するかどうかを突き止めることは興味深い。しかしながら低悪性度および高悪性度のＭＣ悪性腫瘍を比較した場合、ＭＣにおけるＭｃｌ−１発現に見かけの差異はないことが検出される。Ｍｃｌ−１発現はＭＣの増殖能力よりもむしろその生存性に関係するという事実により、この観察を説明することができる。実際に、無痛性ＳＭにおいてさえ、ＭＣは極度に長い生存性を呈する。一方、Cerveroらは高度に鋭敏なフローサイトメトリー技術を用いて、ＩＳＭと比較してＭＣＬを有する患者のＢＭ ＭＣにおけるＢｃｌ−２の発現の増加を報告した。それ故に、我々の研究で適用された技術がフローサイトメトリーと比較して感受性が低いので、ＭＣＬのＭＣが、正常なＭＣまたはＩＳＭのＭＣと比較して、わずかに高レベルのＭｃｌ−１を発現するということを排除できない。
【０１６１】
腫瘍性骨髄細胞におけるＭｃｌ−１の発現の調節についてはほとんど分かっていない。慢性白血病(ＣＭＬ)では、疾患関連オンコプロテインＢＣＲ／ＡＢＬはＭｃｌ−１の発現を促すことが見出される。４６ＳＭでは、ＫＩＴのＤ８１６Ｖ変異バリアントはＣＭＬのＢＣＲ／ＡＢＬと比較されるように、類似の様式で疾患関連オンコプロテインとして提供される。オンコプロテインが腫瘍性ＭＣにおけるＭｃｌ−１の発現の調節に関与し得るかどうかを探索するために、ＫＩＴのＴＫ活性の阻害剤を利用した。これらの実験では、ＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドおよびイマチニブはＨＭＣ−１.１(ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くが、ＫＩＴ Ｇ５６０Ｖを発現する)におけるＭｃｌ−１の発現を下方調節することを見出されるが、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現するＨＭＣ−１.２細胞では、ＰＫＣ４１２のみ、ならびにより低い程度で４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドがＭｃｌ−１タンパク質の発現を低下させる。ＰＫＣ４１２はＫＩＴ Ｄ８１６ＶのＴＫ活性を強力に阻止するので、そしてこの変異はイマチニブに対する抵抗性を付与するので、これらの観察は、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖが腫瘍性ＭＣにおけるＭｃｌ−１の発現異常に寄与するという仮説を支持すると解釈することができる。一方、我々のデータにより、Ｍｃｌ−１発現が検出可能であり、そしてＫＩＴ ＴＫ阻害剤がＨＭＣ−１.１細胞においてＭｃｌ−１発現を下方調節したので、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１細胞においてＫＩＴ依存性であることも示唆される。高悪性度の悪性腫瘍(ＡＳＭまたはＭＣＬ)のＭＣがしばしばＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くか、またはＴＫ標的治療の間に再発を引き起こすために選択され得る、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ陰性サブクローンを有するので、この観察はとりわけ興味深い。
【０１６２】
Ｍｃｌ−１は骨髄細胞においてアポトーシスに対抗する、十分に確立された生存性分子である。腫瘍性ＭＣにおけるＭｃｌ−１発現の機能的有意性のための証拠を提供するために、ＨＭＣ−１細胞をｍｃｌ−１特異的ＡＳＯまたはｍｃｌ−１特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトする。双方のＨＭＣ−１サブクローンで、Ｍｃｌ−１タンパク質の特異的ＡＳＯおよびｓｉＲＮＡ誘起のノックダウンがウェスタンブロッティングにより実証され、そしてアポトーシス細胞における有意な増加を伴う。加えて、ＨＭＣ−１細胞の増殖はスクランブル対照でトランスフェクトされた細胞と比較して、Ｍｃｌ−１ ＡＳＯでのトランスフェクションの後に減少する。これらのデータにより、Ｍｃｌ−１がＨＭＣ−１細胞において重要な生存性因子であるという確固とした証拠が提供される。
【０１６３】
次にｍｃｌ−１ ＡＳＯならびに２ＣｄＡおよび新規ＫＩＴ ＴＫ阻害剤を含む種々の標的薬物の増殖阻止およびアポトーシス誘起効果を比較した。これらの実験における興味深い態様は、３Ｈ−チミジン取り込みにより測定される増殖が、アポトーシスの誘導と比較した場合、低濃度のＴＫ阻害剤で抑制されるという点である。この矛盾は種々の阻害剤の効果と比較する場合、重要な意味合いを有し、そして３Ｈ−チミジンの取り込みはより感受性の高い成長のパラメーターであり、そしてアポトーシス発生の徴候の前に影響され得るという事実によりもっともよく説明され得る。
【０１６４】
ＡＳＭおよびＭＣＬは深刻な予後および短い生存性を伴う高悪性度のＭＣ悪性腫瘍である。これらの患者では、多くの異なる因子がＭＣの異常な成長および生存性に寄与し得て、そしてこれらの患者における腫瘍性細胞の成長に対抗する薬物を同定することは困難である。しかしながら過去数年の間に、高悪性度のＭＣ腫瘍における薬物抵抗性を打破する多くの新規処置概念および標的薬物が同定されている。これらの薬物のうちの一つが、Ｆｌｔ３の変異体、野生型ＫＩＴおよびＫＩＴ Ｄ８１６ＶのＴＫ活性に対抗する新規ＴＫ阻害剤、ＰＫＣ４１２である。対応して、本研究ではＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現するＨＭＣ−１.２細胞において、ＰＫＣ４１２は成長およびＭｃｌ−１発現に対抗することが見出される。成長阻止に関して、これらのデータは我々のおよびその他の以前の観察を確認する。しかしながらＰＫＣ４１２では単一の薬物としてＡＳＭまたはＭＣＬを有する患者において永続的な完全な寛解を誘起することができないかもしれない。
【０１６５】
ＴＫ駆動性、薬物抵抗性骨髄腫瘍における最も魅力的な研究法は、標的薬物を互いに、または従来の薬物と組み合わせることである。ＡＳＭまたはＭＣＬの場合、故にＰＫＣ４１２、その他のＴＫ阻害剤およびその他の標的薬物を用いる薬物の組み合わせを考慮することは合理的であり得る。我々の研究の結果により、ｍｃｌ−１ ＡＳＯおよびＰＫＣ４１２ならびにｍｃｌ−１ ＡＳＯおよび４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドは、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞において成長阻止を生じるのに互いに協同する。加えて協同効果はまたＨＭＣ−１.１細胞においてイマチニブおよびｍｃｌ−１ ＡＳＯを適用する場合にも認められる。ｍｃｌ−１ ＡＳＯとＰＫＣ４１２との間の協同的な薬物効果は双方のＨＭＣ−１サブクローンにおいて相乗的であるが、ｍｃｌ−１ ＡＳＯと４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドとの間の相互作用はＨＭＣ−１.１細胞においてのみ相乗的であるが、ＨＣＭ−１.２細胞では相乗的でないというのは興味深い観察である。これらの差異はＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを表示するＨＭＣ−１.２細胞に及ぼすＰＫＣ４１２の効果と比較して、イマチニブおよび４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドのあまり顕著でない抗増殖効果により最もよく説明される。
【０１６６】
２ＣｄＡは最近進行型ＳＭの処置のための新規の有効な腫瘍縮小薬として紹介されている薬物である。現在の研究では、２ＣｄＡがＨＭＣ−１.１細胞と比較してＨＭＣ−１.２細胞においてなおさらに強力に成長およびＭｃｌ−１発現を阻止することが見出され、ＡＳＭおよびＭＣＬを有する患者を含むたいていのＳＭの患者がこのＫＩＴ変異を表示するので、これは臨床上非常に重要であり得る。故に２ＣｄＡはこのＫＩＴ変異体を欠くＭＣにおけるように、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現するＭＣにおいてより良好に作用すると記載された最初の薬物である。しかしながらこれらの効果に関わらず、２ＣｄＡは分析された二つのＨＭＣ−１サブクローンにおいてｍｃｌ−１ ＡＳＯと相乗的な抗増殖効果を生じなかった。
【０１６７】
多くの第Ｉ／II相臨床試験で、ＡＳＯ型薬物を用いる試みが為されている。しかしながら最初の有望な結果に関わらず、過去に癌患者においてかかる薬物の適用の可能性に関していくつがが保留されている。ｍｃｌ−１およびＳＭに関して、ｍｃｌ−１ターゲティング処置の概念をＡＳＭおよびＭＣＬの臨床試験に入るのに十分なまでに発展させることができるかどうかを明確にするためにさらなる前臨床および臨床研究が必要とされるであろう。
【０１６８】
要約すると、我々のデータにより、腫瘍性ＭＣはＭｃｌ−１を発現し、そしてＭｃｌ−１のターゲティングは生存性の低下およびＰＫＣ４１２のようなＴＫ阻害剤に対する応答性の増大に関連することが示される。これらのデータにより、Ｍｃｌ−１は腫瘍性ＭＣにおける新規の興味深い標的であり、ＴＫ阻害剤に対する抵抗性を打破する助けとなり得ることが示唆される。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびｍｃｌ−１特異的核酸構築物のようなＭＣＬ−１阻害剤の医薬用組み合わせで骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症(ＳＭ)、ならびにまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を処置する方法に関する。ｍｃｌ−１特異的核酸構築物には、限定するものではないがアンチセンスｍｃｌ−１オリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物が含まれる。ｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物には、限定するものではないが低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)またはヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)構築物が含まれる。本発明はまた前記した疾患または悪性腫瘍の処置のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉおよびＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤の医薬用組み合わせの使用、ならびにこれらの疾患または悪性腫瘍の処置のための医薬品の製造のためのかかる医薬組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満細胞症は一つまたはそれより多い器官系における肥満細胞(ＭＣ)の異常蓄積を特徴とする障害の群に関して総称して使用される用語である。その疾患の皮膚および全身性異型が記載されている。皮膚肥満細胞症(ＣＭ)は典型的には幼児期に発症し、そして頻繁に自然退行を伴う良性の経過を示す。全身性肥満細胞症(ＳＭ)は任意の年齢で発症し得て、そして皮膚の合併症を伴うかまたは伴わない、一つまたはそれより多い内臓の合併症を特徴とする。ＣＭとは対照的に、ＳＭはＭＣの持続性のクローン性障害である。高比率の症例で形質転換ＫＩＴ変異Ｄ８１６Ｖが検出される。進行したＳＭでは、その他の骨髄細胞系列でも、Ｂリンパ球でさえも変異を検出できる。故にＳＭは多系列造血前駆細胞の疾患である。ＳＭが多系列前駆細胞から生じるという概念は、これらの患者が随伴性血液学的非肥満細胞系列疾患(ＡＨＮＭＤ)を発症し得るという考えによっても支持される。
【０００３】
ＷＨＯコンセンサス分類により、ＳＭの四つのカテゴリーが定義される：無痛性全身性肥満細胞症(ＩＳＭ)、ＡＨＮＭＤを伴う肥満細胞症(ＳＭ−ＡＨＮＭＤ)、侵襲性ＳＭ(ＡＳＭ)および肥満細胞白血病(ＭＣＬ)。ＳＭ異型はその臨床挙動および予後において互いに異なり、そして通常異なる治療を必要とする。ＩＳＭとは対照的に、とりわけＡＳＭまたはＭＣＬの患者は腫瘍縮小性または標的薬物での処置のための候補である。
【０００４】
これまでのところ、ＡＳＭまたはＭＣＬにおける腫瘍性ＭＣの成長を抑制するために、インターフェロン−アルファ(ＩＦＮα)またはクラドリビン(２ＣｄＡ)のようなわずかな薬物しか記載されておらず、そしてわずかな患者しか際だった、および永続的な応答を示さない。Ｎ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはニロチニブ(４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド)のようないくつかの新規チロシンキナーゼ(ＴＫ)阻害剤もまた腫瘍性ＭＣの成長に対抗し得る。しかしながらこの場合も、長く持続する応答は未だ記載されていない。その他の研究により、イマチニブはＳＭを有する患者の腫瘍性ＭＣの成長を阻止することが示唆される。しかしながらイマチニブの効果は、腫瘍性ＭＣが野生型ＫＩＴ、ＫＩＴ変異Ｆ５２２Ｃを宿す患者において、またはＦＩＰ１Ｌ１／ＰＤＧＦＲα融合遺伝子を随伴する共存性好酸球増加症を有する患者においてのみ認められている。それに反してイマチニブは、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈する腫瘍性ＭＣにはほとんど効果を示さなかった。実際に、ＳＭを有する大部分の患者において検出できるこのＫＩＴ変異はイマチニブに対する抵抗性を付与する。
【０００５】
最近はさらに有効な治療的研究法およびさらに有効な薬物組み合わせを開発するために、腫瘍性ＭＣの新しい標的を同定するための多くの試みが為されている。一つの有望な研究法は高悪性度のＭＣ腫瘍(ＡＳＭ、ＭＣＬ)でＭＣにおいて発現される生存性関連分子を調査することであるかもしれない。
【０００６】
Ｍｃｌ−１は種々の腫瘍細胞において抗アポトーシス的に作用すると考えられる、十分に特徴付けされたＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである。例えばMendelian Inheritance in Man、ＭＩＭアクセス番号１５９５５２を参照のこと。元来Ｍｃｌ−１は、白血病性ＭＬ−１細胞のＴＰＡ誘起の分化の間に発現される生存性強化分子として記載された。継続的な研究により、Ｍｃｌ−１は慢性骨髄性白血病の原発性腫瘍細胞において構成的に発現されることが示される。しかしながらこれまでのところ、その他の骨髄性腫瘍におけるＭｃｌ−１の発現および役割についてほとんど知られていない。
【０００７】
今では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物と組み合わされたＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤が治療的特性を保有することが見出されている。これらの知見によりＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびｍｃｌ−１阻害剤の組み合わせは骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、ならびにまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍の処置に特に有用であるとされる。
【０００８】
今ではとりわけＡＳＭおよびＭＣＬを含むＳＭの全ての異型における原発性腫瘍性ＭＣならびにＭＣＬ細胞系ＨＭＣ−１は構成的な様式でＭｃｌ−１を発現することが見出されている。加えてこれらの細胞におけるＭｃｌ−１のターゲティングは成長低下およびアポトーシスの誘導に、ならびにＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドおよびイマチニブを含むＴＫ阻害剤に対する感受性の増大に関連する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の組み合わせで使用するための特定の目的のＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤は４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドおよびイマチニブおよび式：
【化１】
または
【化２】
(ここで(II)は部分的に水素化された化合物(Ｉ)の誘導体である)または
【化３】
または
【化４】
または
【化５】
または
【化６】
(式中、
Ｒ１およびＲ２は互いに独立して非置換もしくは置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化もしくはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一もしくは二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルであり；
ｎおよびｍは互いに独立して０以上４以下の数字であり；
ｎ'およびｍ'は互いに独立して０以上４以下の数字であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８およびＲ１０は互いに独立して水素、−Ｏ−、３０個までの炭素原子を有するアシル、脂肪族、各々の場合に２９個までの炭素原子を有する炭素環式もしくは炭素環式脂肪族ラジカル、各々の場合に２０個までの炭素原子および各々の場合に９個までのヘテロ原子を有する複素環式もしくは複素環式脂肪族ラジカル、３０個までの炭素原子を有するアシルであり、ここでＲ４は不在でもよいか；
またはＲ３が３０個までの炭素原子を有するアシルである場合、Ｒ４はアシルではなく；
Ｒ４が不在である場合、ｐは０であるか、またはＲ３およびＲ４が双方共に存在し、そして各々の場合に前記のラジカルのうちの一つである場合１であり；
Ｒ５は水素、脂肪族、各々の場合に２９個までの炭素原子を有する炭素環式もしくは炭素環式脂肪族ラジカル、または各々の場合に２０個までの炭素原子および各々の場合に９個までのヘテロ原子を有する複素環式もしくは複素環式脂肪族ラジカル、または３０個までの炭素原子を有するアシルであり；
Ｒ７、Ｒ６およびＲ９はアシルもしくは−(低級アルキル)−アシル、非置換もしくは置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化もしくはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一もしくは二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ、カルボニル、カルボニルジオキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルであり；
Ｘは２個の水素原子；１個の水素原子およびヒドロキシ；Ｏ；または水素および低級アルコキシを意味し；
Ｚは水素または低級アルキルを表し；
そして波線で特徴付けられた２個の結合は環Ａで不在であり、４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ｂの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；
または波線で特徴付けられた２個の結合は環Ｂで不在であり、全部で４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ａの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；
または環Ａおよび環Ｂの双方で４個の波線の結合の全てが不在であり、全部で８個の水素原子により置き換えられるかのいずれかである)
のスタウロスポリン誘導体、または少なくとも一つの塩形成基が存在する場合はその塩である。
【００１０】
本明細書前記および後記で用いられる一般的な用語および定義は好ましくはスタウロスポリン誘導体に関する以下の意味を有する：
接頭辞「低級」とは関連するラジカルが好ましくは最大７個以下の炭素原子、特に最大４個以下の炭素原子を有することを示す。
低級アルキルは特にメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびまたペンチル、ヘキシルまたはヘプチルである。
【００１１】
非置換または置換アルキルは好ましくはＣ１−Ｃ２０アルキル、特に低級アルキル、典型的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり、それは特に非置換であるか、またはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素のようなハロゲン、フェニルもしくはナフチルのようなＣ６−Ｃ１４アリール、ヒドロキシ、低級アルコキシ、フェニル−低級アルコキシもしくはフェニルオキシのようなエーテル化ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシもしくはベンゾイルオキシのようなエステル化ヒドロキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、フェニル−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−(フェニル−低級アルキル)アミノのような一もしくは二置換アミノ、シアノ、メルカプト、低級アルキルチオのような置換メルカプト、カルボキシ、低級アルコキシカルボニルのようなエステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−低級アルキルカルバモイルもしくはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルカルバモイルのようなＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換カルバモイル、スルホ、低級アルカンスルホニルもしくは低級アルコキシスルホニルのような置換スルホ、アミノスルホニルまたはＮ−低級アルキルアミノスルホニルまたはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノスルホニルのようなＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルにより置換される。
【００１２】
ハロゲンは好ましくはフッ素、塩素、臭素またはヨウ素、特にフッ素または塩素である。
エーテル化ヒドロキシは特に低級アルコキシ、フェニルオキシのようなＣ６−Ｃ１４アリールオキシまたはベンジルオキシのようなＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルコキシである。
エステル化ヒドロキシは好ましくは低級アルカノイルオキシまたはベンゾイルオキシのようなＣ６−Ｃ１４アリールカルボニルオキシである。
一または二置換アミノは特に低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルキル、低級アルカノイルまたはＣ６−Ｃ１２アリールカルボニルにより一置換または二置換されたアミノである。
置換メルカプトは特に低級アルキルチオ、Ｃ６−Ｃ１４アリールチオ、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルチオ、低級アルカノイルチオまたはＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルカノイルチオである。
【００１３】
エステル化カルボキシは特に低級アルコキシカルボニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルコキシカルボニルまたはＣ６−Ｃ１４アリールオキシカルボニルである。
Ｎ−一またはＮ,Ｎ−二置換カルバモイルは特に低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリールまたはＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルによりＮ−一置換またはＮ,Ｎ−二置換されたカルバモイルである。
置換スルホニルは特にトルエンスルホニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルカンスルホニルまたは低級アルカンスルホニルのようなＣ６−Ｃ１４アリールスルホニルである。
Ｎ−一またはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルは特に低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリールまたはＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルによりＮ−一置換またはＮ,Ｎ−二置換されたアミノスルホニルである。
【００１４】
Ｃ６−Ｃ１４アリールは環系に６から１４個の炭素原子を有するフェニル、ナフチル、フルオレニルまたはインデニルのようなアリールラジカルであり、それは特に非置換であるか、またはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素のようなハロゲン、フェニルもしくはナフチル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、フェニル−低級アルコキシ、フェニルオキシ、低級アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、フェニル−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−(フェニル−低級アルキル)アミノ、シアノ、メルカプト、低級アルキルチオ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキルカルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルカルバモイル、スルホ、低級アルカンスルホニル、低級アルコキシスルホニル、アミノスルホニル、Ｎ−低級アルキルアミノスルホニルまたはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノスルホニルにより置換されている。
【００１５】
指数ｎおよびｍは各々の場合で好ましくは１、２または特に０である。一般的にｎおよびｍが各々の場合で０(ゼロ)である式Ｉの化合物が特に好ましい。
２９個までの炭素原子を有する脂肪族炭水化物ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は非環式置換基により置換されており、そして好ましくは最大１８個、特に最大１２個および通例せいぜい７個の炭素原子を有し、飽和または不飽和でよく、そして特に非置換または直鎖もしくは分岐した低級アルキル、低級アルケニル、低級アルカジエニル、または非環式置換基により置換された低級アルキニルラジカルである。低級アルキルは例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、およびまたｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルおよびｎ−ヘプチルであり；低級アルケニルは例えばアリル、プロペニル、イソプロペニル、２−または３−メタリルおよび２−または３−ブテニルであり；低級アルカジエニルは例えば１−ペンタ−２,４−ジエニルであり；低級アルキニルは例えばプロパルギルまたは２−ブチニルである。対応する不飽和ラジカルでは、二重結合は特に遊離原子価に関してα位よりも高位の位置にある。置換基は特に本明細書後記にてＲｏの置換基として定義されるアシルラジカル、好ましくはカルボキシもしくは低級アルコキシカルボニルのような遊離もしくはエステル化カルボキシ、シアノまたはジ−低級アルキルアミノである。
【００１６】
各々の場合で２９個までの炭素原子を有する炭素環式または炭素環式−脂肪族ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は特に芳香族、脂環式、脂環式−脂肪族、または芳香族−脂肪族ラジカルであり、それは非置換形態で存在するか、または本明細書後記でＲｏの置換基として言及されるラジカルにより置換されているかのいずれかである。芳香族ラジカル(アリールラジカル)Ｒ３またはＲ４は何よりも特にフェニル、また１−または２−ナフチルのようなナフチル、特に４−ビフェニリルのようなビフェニリル、およびまたアントリル、フルオレニルおよびアズレニル、ならびに１個またはそれより多い飽和環を有するその芳香族類似体であり、それは非置換形態で存在するか、または本明細書後記でＲｏの置換基として言及されるラジカルにより置換されているかのいずれかである。好ましい芳香族−脂肪族ラジカルはアリール−低級アルキル−およびアリール−低級アルケニルラジカル、例えばベンジル、フェネチル、１−、２−または３−フェニルプロピル、ジフェニルメチル(ベンズヒドリル)、トリチルおよびシンナミルのような末端フェニルラジカルを有するフェニル−低級アルキルまたはフェニル−低級アルケニル、ならびにまた１−または２−ナフチルメチルである。低級アルキルのような非環式ラジカルを担持するアリールラジカルのうち、種々の状態にあるメチルラジカルを有するｏ−、ｍ−およびｐ−トリルならびにキシリルラジカルが特記される。
【００１７】
２９個までの炭素原子を有する脂環式ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は特に置換または好ましくは非置換単環、二環または多環式シクロアルキル−、シクロアルケニル−、またはシクロアルカジエニルラジカルである。最大１４個、特に１２個の環炭素原子および３から８、好ましくは５から７、そして何より特に６員環を有するラジカルが好ましく、それはまた１個またはそれより多い、例えば２個の脂肪族炭化水素ラジカル、例えば前記にて挙げられたもの、特に低級アルキルラジカル、またはその他の脂環式ラジカルを置換基として担持することもできる。好ましい置換基は本明細書後記でＲｏに関して挙げられる非環式置換基である。
【００１８】
２９個までの炭素原子を有する脂環式−脂肪族ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は、非環式ラジカル、特にメチル、エチルおよびビニルのような特に最大７個、好ましくは最大４個の炭素原子を有するものが本明細書前記で定義されるような１個またはそれより多い脂環式ラジカルを担持するラジカルである。シクロアルキル−低級アルキルラジカルならびに環および／または鎖において不飽和であるが、非芳香族であり、そして鎖の末端炭素原子で環を担持するその類似体が特記される。好ましい置換基は本明細書後記でＲｏに関して挙げられる非環式置換基である。
【００１９】
各々２０個までの炭素原子および各々９個までのヘテロ原子を有する複素環式ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は特に単環式、しかしまた芳香族特性の二環または多環式、アザ−、チア−、オキサ−、チアザ−、オキサザ−、ジアザ−、トリアザ−またはテトラザ環式ラジカル、ならびに部分的または何より特に完全に飽和しているこの型の対応する複素環式ラジカルであり、これらのラジカルは、必要により、もしかするとさらに非環式、炭素環式もしくは複素環式ラジカルを担持し、および／またはもしかすると官能基により一、二もしくは三置換され、好ましくは脂肪族炭化水素ラジカルの置換基として本明細書前記にて挙げられたものである。何より特にそれらは２−アジリジニルのような窒素、酸素または硫黄原子を有する非置換または置換単環式ラジカル、および特にピリル(pyrryl)、例えば２−ピリルもしくは３−ピリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジルのようなこの型の芳香族ラジカル、およびまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリルであり；酸素、硫黄または窒素原子を有する類似の二環式ラジカル、例えばインドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、またはベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニルであり；いくつかのヘテロ原子を有する好ましい単環式および二環式ラジカルは、例えばイミダゾリル、典型的には２−もしくは４−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、またはチアゾリル、典型的には２−チアゾリル、およびベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、またはキナゾリル、典型的には２−キナゾリニルである。２−テトラヒドロフリル、２−または３−ピロリジニル、２−、３−または４−ピペリジル、およびまた２−または３−モルホリニル、２−または３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルおよびＮ−モノ−またはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニルラジカルのような適切な部分的または特に完全に飽和した類似ラジカルもまた考慮され得る。これらのラジカルはまた１個またはそれより多い非環式、炭素環式または複素環式ラジカル、特に本明細書にて前記されたものを担持することもできる。複素環式ラジカルＲ３またはＲ４の遊離原子価はその炭素原子の一つから生じたものでなければならない。ヘテロシクリルは非置換であるか、または本明細書前記にてＲｏに関して挙げられた１個またはそれより多い、好ましくは１または２個の置換基により置換されていてよい。
【００２０】
複素環式−脂肪族ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０、特に最大７個、好ましくは最大４個の炭素原子を有する、特に低級アルキルラジカル、例えば本明細書前記にて挙げられたものは、１個、２個またはそれより多い複素環式ラジカル、例えば前記のパラグラフで挙げられたものを担持し、複素環式環はもしかするとその窒素原子のうちの１個により脂肪族鎖に連結されている。好ましい複素環式−脂肪族ラジカルＲ１は、例えばイミダゾール−１−イルメチル、４−メチルピペラジン−１−イルメチル、ピペラジン−１−イルメチル、２−(モルホリン−４−イル)エチルおよびまたピリド−３−イルメチルである。ヘテロシクリルは非置換であるか、または本明細書後記にてＲｏに関して挙げられた１個またはそれより多い、好ましくは１個または２個の置換基により置換されていてよい。
【００２１】
各々２０個までの炭素原子および各々１０個までのヘテロ原子を有するヘテロ脂肪族ラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は脂肪族ラジカルであり、それは１個、２個またはそれより多い炭素原子の代わりに同一のまたは異なる、特に酸素、硫黄および窒素のようなヘテロ原子を含有する。特に好ましいヘテロ脂肪族ラジカルＲ１の配列はオキサ−アルキルラジカルの形態を取り、ここで１個またはそれより多い炭素原子は好ましくは直鎖状アルキルで酸素原子により置き換えられ、好ましくはいくつかの(特に２個の)炭素原子により互いに分けられて、それらは反復基、必要により多反復基(Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−)ｑ(ここでｑ＝１から７)を形成する。
【００２２】
特に好ましいＲ３、Ｒ４、Ｒ８またはＲ１０は、アシルは別として低級アルキル、特にメチルもしくはエチル；低級アルコキシカルボニル−低級アルキル、特にメトキシカルボニルメチルもしくは２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)エチル；カルボキシ−低級アルキル、特にカルボキシメチルもしくは２−カルボキシエチル；またはシアノ−低級アルキル、特に２−シアノエチルである。
【００２３】
３０個までの炭素原子を有するアシルラジカルＲ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０は、必要によりエステル化された、必要により機能的に修飾されたカルボン酸、有機スルホン酸またはピロ−もしくはオルトリン酸のようなリン酸から誘導される。
【００２４】
Ａｃ１と称され、そしてカルボン酸から誘導され、必要により機能的に修飾されたアシルは特に部分式Ｙ−Ｃ(＝Ｗ)−(式中、Ｗは酸素、硫黄またはイミノであり、そしてＹは水素、２９個までの炭素原子を有するヒドロカルビルＲｏ、ヒドロカルビルオキシＲｏ−Ｏ−、アミノ基または置換アミノ基、特に式ＲｏＨＮ−またはＲｏＲｏＮ−(式中、Ｒｏラジカルは同一または互いに異なってよい)の一つである)の一つである。
【００２５】
ヒドロカルビル(炭化水素ラジカル)Ｒｏは各々２９個までの炭素原子、特に１８個まで、および好ましくは１２個までの炭素原子を有する非環式(脂肪族)、炭素環式または炭素環式非環式炭化水素ラジカルであり、そして飽和または不飽和、非置換または置換されている。それは非環式および／または環式部分に１個、２個またはそれより多い炭素原子の代わりに同一のまたは異なる、特に酸素、硫黄および窒素のようなヘテロ原子を含有でき；後者の場合、それは複素環式ラジカル(ヘテロシクリルラジカル)または複素環式−非環式ラジカルとして記載される。
【００２６】
不飽和ラジカルは１個またはそれより多い、特に共役および／または単離された多重結合(二重または三重結合)を含有するものである。環式ラジカルなる用語にはまた共役二重結合を有する芳香族および非芳香族ラジカル、例えば少なくとも一つの６員炭素環式または５から８員複素環式環が最大数の非累積二重結合を含有するものが含まれる。少なくとも一つの環が６員芳香族環(すなわちベンゼン環)として存在する炭素環式ラジカルはアリールラジカルとして定義される。
【００２７】
非環式非置換炭化水素ラジカルＲｏは特に直鎖状または分岐した低級アルキル−、低級アルケニル−、低級アルカジエニル−、または低級アルキニルラジカルである。低級アルキルＲｏは例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、ならびにまたｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルおよびｎ−ヘプチルであり；低級アルケニルは例えばアリル、プロペニル、イソプロペニル、２−または３−メタリルおよび２−または３−ブテニルであり；低級アルカジエニルは、例えば１−ペンタ−２,４−ジエニルであり；低級アルキニルは、例えばプロパルギルまたは２−ブチニルである。対応する不飽和ラジカルでは、二重結合は特に遊離原子価に関してα位よりも高位の位置にある。
【００２８】
炭素環式炭化水素ラジカルＲｏは特に単環、二環または多環式シクロアルキル−、シクロアルケニル−もしくはシクロアルカジエニルラジカル、または対応するアリールラジカルである。好ましいのは最大１４個、特に１２個の環炭素原子、および３から８、好ましくは５から７、および何より特に６員環を有するラジカルであり、それはまた１個またはそれより多い、例えば２個の非環式ラジカル、例えば前記にて挙げられたもの、特に低級アルキルラジカルまたはその他の炭素環式ラジカルを担持できる。炭素環式−非環式ラジカルは、非環式ラジカル、特にメチル、エチルおよびビニルのような特に最大７個、好ましくは最大４個の炭素原子を有するものが１個またはそれより多い炭素環式、必要により前記の定義の芳香族ラジカルを担持するものである。シクロアルキル−低級およびアリール−低級アルキルラジカル、ならびに環および／または鎖で不飽和であるその類似体が特記され、そしてそれは鎖の末端炭素で環を担持する。
【００２９】
シクロアルキルＲｏは何より特に３個から１０個以下の炭素原子を有し、そして例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル、ならびにビシクロ[２,２,２]オクチル、２−ビシクロ[２,２,１]ヘプチルおよびアダマンチルであり、それはまた１個、２個またはそれより多い、例えば低級、アルキルラジカル、特にメチルラジカルにより置換されていてもよく；シクロアルケニルは例えば１、２または３位で二重結合を担持する、既に挙げられた単環式シクロアルキルラジカルの一つである。シクロアルキル−低級アルキルまたは−低級アルケニルは例えば前記で挙げられたシクロアルキルラジカルの一つにより置換された−メチル、−１−もしくは−２−エチル、−１−もしくは−２−ビニル、−１−、−２−もしくは−３−プロピルまたは−アリルであり、直鎖の末端で置換されたものが好ましい。
【００３０】
アリールラジカルＲ０は何より特にフェニル、また１−または２−ナフチルのようなナフチル、特に４−ビフェニリルのようなビフェニリル、およびまたアントリル、フルオレニルおよびアズレニル、ならびに１個またはそれより多い飽和環を有するその芳香族類似体である。好ましいアリール−低級アルキルおよび−低級アルケニルラジカルは、例えばベンジル、フェネチル、１−、２−または３−フェニルプロピル、ジフェニルメチル(ベンズヒドリル)、トリチルおよびシンナミルのような例えば末端フェニルラジカルを有するフェニル−低級アルキルまたはフェニル−低級アルケニル、ならびにまた１−または２−ナフチルメチルである。アリールは非置換または置換されていてよい。
【００３１】
複素環式−非環式ラジカルを含む複素環式ラジカルは特に単環式、しかしまた芳香族特性の二環または多環式、アザ−、チア−、オキサ−、チアザ−、オキサザ−、ジアザ−、トリアザ−またはテトラザ環式ラジカル、ならびに部分的または何より特に完全に飽和しているこの型の対応する複素環式ラジカルであり；必要により、例えば前記した炭素環式またはアリールラジカルの場合のように、これらのラジカルはさらに非環式、炭素環式もしくは複素環式ラジカルを担持でき、そして／または官能基により一、二もしくは三置換され得る。複素環式−非環式ラジカルの非環式部分は例えば対応する炭素環式−非環式ラジカルに関して示された意味を有する。何より特にそれらは２−アジリジニルのような窒素、酸素または硫黄原子を有する非置換または置換単環式ラジカル、および特にピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジルのようなこの型の芳香族ラジカル、およびまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリルであり；酸素、硫黄または窒素原子を有する類似の二環式ラジカルは、例えばインドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、またはベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニルであり；いくつかのヘテロ原子を有する好ましい単環式および二環式ラジカルは、例えばイミダゾリル、典型的には２−もしくは４−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、またはチアゾリル、典型的には２−チアゾリル、およびベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、またはキナゾリル、典型的には２−キナゾリニルである。２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、２−または３−ピロリジル、２−、３−または４−ピペリジル、およびまた２−または３−モルホリニル、２−または３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルおよびＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニルラジカルのような適切な部分的または特に完全に飽和した類似ラジカルもまた考慮され得る。これらのラジカルはまた１個またはそれより多い非環式、炭素環式または複素環式ラジカル、特に本明細書にて前記されたものを担持することもできる。複素環式−非環式ラジカルは特に最大７個、好ましくは最大４個の炭素原子、例えば本明細書前記にて挙げられたものを有する非環式ラジカルから誘導され、そして１個、２個またはそれより多い複素環式ラジカル、例えば本明細書前記にて挙げられたものを担持でき、その環はもしかするとその窒素原子のうちの１個により脂肪族鎖に連結されている。
【００３２】
既に記載したように、ヒドロカルビル(ヘテロシクリルを含む)は１個、２個またはそれより多い同一のまたは異なる置換基(官能基)により置換されていてよく；１個またはそれより多い以下の置換基を考慮できる：低級アルキル；遊離、エーテル化およびエステル化ヒドロキシル基；カルボキシ基およびエステル化カルボキシ基；メルカプト−および低級アルキルチオ−ならびに、必要により置換フェニルチオ基；ハロゲン原子、典型的には塩素およびフッ素、しかしまた臭素およびヨウ素；ハロゲン−低級アルキル基；ホルミルの形態で存在するオキソ基(すなわちアルデヒド)、およびケト基(また対応するアセタールまたはケタールとして)；アジド基；ニトロ基；シアノ基；第一級、第二級および好ましくは第三級アミノ基、アミノ−低級アルキル、一または二置換アミノ−低級アルキル、従来の保護基により保護された第一級または第二級アミノ基(特に低級アルコキシカルボニル、典型的にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)低級アルキレンジオキシ、およびまた遊離または機能的に修飾されたスルホ基、典型的には遊離形態または塩として存在するスルファモイルまたはスルホ基。ヒドロカルビルラジカルはまたカルバモイル、ウレイドまたはグアニジノ基を担持でき、それは遊離であるか、または１個もしくは２個の置換基およびシアノ基を担持する。前記の「(複数の)基」なる語の使用は個々の基をも意味すると見なされる。
【００３３】
ハロゲン−低級アルキルは好ましくは１から３個のハロゲン原子を含有し；好ましいのはトリフルオロメチルまたはクロロメチルである。
【００３４】
ヒドロカルビルに置換基として存在するエーテル化ヒドロキシル基は、例えば低級アルコキシ基、典型的にはメトキシ−、エトキシ−、プロポキシ−、イソプロポキシ−、ブトキシ−およびｔｅｒｔ−ブトキシ基であり、それはまた特に(ｉ)ヘテロシクリルにより置換されていてよく、それによりヘテロシクリルは好ましくは４から１２個の環原子を有することができ、不飽和または部分的もしくは完全に飽和されていてよく、単環または二環式であり、そして窒素、酸素および硫黄から選択される３個までのヘテロ原子を含有でき、そして何より特にピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジル、およびまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリル、インドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、ベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニル；イミダゾリル、典型的には１−もしくは２−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、チアゾリル、典型的には２−チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、キナゾリル、典型的には２−キナゾリニル、２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、２−もしくは４−テトラヒドロピラニル、１−、２−もしくは３−ピロリジル、１−、２−、３−もしくは４−ピペリジル、１−、２−もしくは３−モルホリニル、２−もしくは３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルまたはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニルであり；そしてまた(ii)ハロゲン原子により、２,２,２−トリクロロエトキシ、２−クロロエトキシもしくは２−ヨードエトキシラジカルのように特に２位で置換、例えば一、二もしくは多置換されていてよく、または(iii)ヒドロキシもしくは(iv)低級アルコキシラジカルにより、各々２−メトキシエトキシラジカルのように特に２位で置換、好ましくは一置換されていてよい。かかるエーテル化ヒドロキシル基はまた非置換または置換フェノキシラジカルおよび特にベンジルオキシ、ベンズヒドリルオキシおよびトリフェニルメトキシ(トリチルオキシ)のようなフェニル−低級アルコキシラジカル、ならびにヘテロシクリルオキシラジカルであり、ここでヘテロシクリルは好ましくは４から１２個の環原子を有することができ、不飽和または部分的もしくは完全に飽和されていてよく、単環または二環式であり、そして窒素、酸素および硫黄から選択される３個までのヘテロ原子を含有でき、そして何より特にピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジル、およびまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリル、インドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、ベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニル；イミダゾリル、典型的には１−もしくは２−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、チアゾリル、典型的には２−チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、キナゾリル、典型的には２−キナゾリニル、２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、２−もしくは４−テトラヒドロピラニル、１−、２−もしくは３−ピロリジル、１−、２−、３−もしくは４−ピペリジル、１−、２−もしくは３−モルホリニル、２−もしくは３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルまたはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニル；例えば特に２−または４−テトラヒドロピラニルオキシである。
【００３５】
この局面でエーテル化ヒドロキシル基はシリル化ヒドロキシル基、典型的には例えばトリ−低級アルキルシリルオキシ、典型的にはトリメチルシリルオキシおよびジメチル−ｔｅｒｔ−ブチルシリルオキシまたはフェニルジ−低級アルキルシリルオキシおよび低級アルキル−ジフェニルシリルオキシを含むと見なされる。
ヒドロカルビルに置換基として存在するエステル化ヒドロキシル基は、例えば低級アルカノイルオキシである。
【００３６】
ヒドロカルビルに置換基として存在するカルボキシル基は、水素原子が前記で特徴付けされたヒドロカルビルラジカルの一つ、好ましくは低級アルキル−またはフェニル−低級アルキルラジカルにより置き換えられたものであり；エステル化カルボキシル基の実例は低級アルコキシカルボニルまたは必要によりフェニル部分で置換されたフェニル−低級アルコキシカルボニル、特にメトキシ、エトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシおよびベンジルオキシカルボニル基、ならびにラクトン化カルボキシル基である。
【００３７】
ヒドロカルビルの置換基として第一級アミノ基−ＮＨ２はまた従来の保護基により保護された形態で存在し得る。第二級アミノ基は２個の水素原子のうちの１個の代わりにヒドロカルビルラジカル、好ましくは非置換のもの、典型的には前記で挙げられたものの一つ、特に低級アルキルを担持し、そして保護された形態でも存在し得る。
ヒドロカルビルに置換基として存在する第三級アミノ基は２個の異なる、または好ましくは同一の、前記で特徴付けされた非置換ヒドロカルビルラジカル、特に低級アルキルのようなヒドロカルビルラジカル(複素環式ラジカルを含む)を担持する。
【００３８】
好ましいアミノ基は式Ｒ１１(Ｒ１２)Ｎ−を有するものであり、式中、Ｒ１１およびＲ１２は各々の場合で独立して水素、非置換非環式Ｃ１−Ｃ７−ヒドロカルビル(例えば特にＣ１−Ｃ４アルキルまたはＣ２−Ｃ４アルケニル)または単環式アリール、アラルキルもしくはアラルケニルであり、必要によりＣ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、ハロゲンおよび／またはニトロにより置換され、そして最大１０個までの炭素原子を有し、ここで炭素含有ラジカルは必要によりヒドロカルビルにより置換された炭素−炭素結合または酸素原子、硫黄原子もしくは窒素原子を介して連結されていてよい。かかる場合に、それらはアミノ基の窒素原子を有する窒素含有複素環式環を形成する。以下は特に好ましい二置換アミノ基の実例である：ジ−低級アルキルアミノ、典型的にはジメチルアミノまたはジエチルアミノ、ピロリジノ、イミダゾール−１−イル、ピペリジノ、ピペラジノ、４−低級アルキルピペラジノ、モルホリノ、チオモルホリノおよびピペラジノまたは４−メチルピペラジノ、ならびに必要により、特にフェニル部分で例えば低級−アルキル、低級−アルコキシ、ハロゲンおよび／またはニトロにより置換されたジフェニルアミノおよびジベンジルアミノ；保護された基の実例、特に低級アルコキシカルボニルアミノ、典型的にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ、フェニル−低級アルコキシカルボニルアミノ、典型的には４−メトキシベンジルオキシカルボニルアミノおよび９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ。
【００３９】
アミノ−低級アルキルは何より特に低級アルキル鎖の１位でアミノにより置換され、そして特にアミノメチルである。
一もしくは二置換アミノ−低級アルキルは１個または２個のラジカルにより置換されたアミノ−低級アルキルであり、ここでアミノ−低級アルキルは何より特に低級アルキル鎖の１位でアミノにより置換され、そして特にアミノメチルであり；アミノ置換基はここでは好ましくは(２個の置換基が各々のアミノ基で互いに独立して存在する場合)特にメチル、エチルまたはｎ−プロピルのような低級アルキル、ヒドロキシ−低級アルキル、典型的には２−ヒドロキシエチル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、特にシクロヘキシル、アミノ−低級アルキル、典型的には３−アミノプロピルまたは４−アミノブチル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ(低級アルキル)−アミノ−低級アルキル、典型的には３−(Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ)プロピル、アミノ、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノおよびＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−(ヒドロキシ−低級アルキル)アミノを含む群からである。
【００４０】
二置換アミノ−低級アルキルはまた窒素原子を介して低級アルキルに結合した(好ましくは１位で)５または６員、飽和または不飽和ヘテロシクリルであり、そして０から２個、特に０または１個の、酸素、窒素および硫黄から選択されるその他のヘテロ原子を有し、それは非置換であるか、または特に低級アルキル、典型的にはメチルおよびまたオキソを含む群からの１個または２個のラジカルにより置換されている。ここで好ましいのはピロリジノ(１−ピロリジニル)、ピペリジノ(１−ピペリジニル)、ピペラジノ(１−ピペラジニル)、４−低級アルキルピペラジノ、典型的には４−メチルピペラジノ、イミダゾリノ(１−イミダゾリル)、モルホリノ(４−モルホリニル)、またはチオモルホリノ、Ｓ−オキソ−チオモルホリノ、もしくはＳ,Ｓ−ジオキソチオモルホリノでもある。
【００４１】
低級アルキレンジオキシは特にメチレンジオキシである。
１個または２個の置換基を担持するカルバモイル基は特にアミノカルボニル(カルバモイル)であり、それは窒素で１個または２個のラジカルにより置換されており；アミノ置換基はここで好ましくは(２個の置換基が各々のアミノ基で互いに独立して存在する場合)特にメチル、エチルまたはｎ−プロピルのような低級アルキル、ヒドロキシ−低級アルキル、典型的には２−ヒドロキシエチル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、特にシクロヘキシル、アミノ−低級アルキル、典型的には３−アミノプロピルまたは４−アミノブチル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ(低級アルキル)−アミノ−低級アルキル、典型的には３−(Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ)プロピル、アミノ、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノおよびＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−(ヒドロキシ−低級アルキル)アミノを含む群からであり；アミノカルバモイルの二置換アミノはまた結合窒素原子、ならびに０から２個、特に０または１個の、酸素、窒素および硫黄から選択されるその他のヘテロ原子を有する５または６員、飽和または不飽和ヘテロシクリルであり、それは非置換であるか、または特に低級アルキル、典型的にはメチルおよびまたオキソを含む群からの１個または２個のラジカルにより置換されている。ここで好ましいのはピロリジノ(１−ピロリジニル)、ピペリジノ(１−ピペリジニル)、ピペラジノ(１−ピペラジニル)、４−低級アルキルピペラジノ、典型的には４−メチルピペラジノ、イミダゾリノ(１−イミダゾリル)、モルホリノ(４−モルホリニル)、またはまたチオモルホリノ、Ｓ−オキソ−チオモルホリノ、もしくはＳ,Ｓ−ジオキソチオモルホリノである。
【００４２】
有機スルホン酸から誘導されるアシルはＡｃ２と称され、特に部分式Ｒｏ−ＳＯ２−を有するものであり、式中、Ｒｏは一般的および具体的な意味で前記で定義されたようなヒドロカルビルであり、ここでは後者がまた一般に好ましい。特に好ましいのは低級アルキルフェニルスルホニル、特に４−トルエンスルホニルである。
必要によりエステル化された、リン酸から誘導されるアシルはＡｃ３と称され、特に部分式ＲｏＯ(ＲｏＯ)Ｐ(＝Ｏ)−を有するものであり、式中、ラジカルＲｏは互いに独立して前記で示された一般的および具体的な意味で定義されるようなものである。
本明細書前記および後記で与えられる置換基に関するまびきデータ(reduced data)が好ましいと考えられる。
【００４３】
本発明による好ましい化合物は例えば、Ｒ０が以下の好ましい意味を有するものである：低級アルキル、特にメチルまたはエチル、アミノ−低級アルキル、ここでアミノ基は保護されていないか、または従来のアミノ保護基、特に低級アルコキシカルボニル、典型的にはｔｅｒｔ−低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルにより保護され、例えばアミノメチル、Ｒ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−アミノエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルまたはＲ,Ｓ−、Ｒ−、もしくは好ましくはＳ−１−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)エチルであり、カルボキシ−低級アルキル、典型的には２−カルボキシエチル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル、典型的には２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)エチル、シアノ−低級アルキル、典型的には２−シアノエチル、テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル、典型的には４−(テトラヒドロピラニル)−オキシメチル、モルホリノ−低級アルキル、典型的には２−(モルホリノ)エチル、フェニル、低級アルキルフェニル、典型的には４−メチルフェニル、低級アルコキシフェニル、典型的には４−メトキシフェニル、イミダゾリル−低級アルコキシフェニル、典型的には４−[２−(イミダゾール−１−イル)エチル)オキシフェニル、カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニル、低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−エトキシカルボニルフェニルもしくは４−メトキシフェニル、ハロゲン−低級アルキルフェニル、典型的には４−クロロメチルフェニル、ピロリジノフェニル、典型的には４−ピロリジノフェニル、イミダゾール−１−イルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イル)フェニル、ピペラジノフェニル、典型的には４−ピペラジノフェニル、(４−低級アルキルピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニル、モルホリノフェニル、典型的には４−モルホリノフェニル、ピロリジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピロリジノメチルフェニル、イミダゾール−１−イル−低級アルキルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イルメチル)フェニル、ピペラジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピペラジノメチルフェニル、(４−低級アルキルピペラジノメチル)−フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノメチル)フェニル、モルホリノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−モルホリノメチルフェニル、ピペラジノカルボニルフェニル、典型的には４−ピペラジノカルボニルフェニル、または(４−低級アルキル−ピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニルである。
【００４４】
好ましいアシルラジカルＡｃ１は部分式Ｒｏ−ＣＯ−を特徴とするカルボン酸のアシルラジカルであり、式中、ＲｏはヒドロカルビルラジカルＲｏの前記の一般的および好ましい意味の一つを有する。ここで特に好ましいラジカルＲｏは低級アルキル、特にメチルまたはエチル、アミノ−低級アルキルであり、ここでアミノ基は保護されていないか、または従来のアミノ保護基、特に低級アルコキシカルボニル、典型的にはｔｅｒｔ−低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルにより保護され、例えばアミノメチル、Ｒ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−アミノエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルまたはＲ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)エチルであり、カルボキシ−低級アルキル、典型的には２−カルボキシエチル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル、典型的には２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)エチル、テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル、典型的には４−(テトラヒドロピラニル)オキシメチル、フェニル、イミダゾリル−低級アルコキシフェニル、典型的には４−[２−(イミダゾール−１−イル)エチル]オキシフェニル、カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニル、低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−エトキシカルボニルフェニル、ハロゲン−低級アルキルフェニル、典型的には４−クロロメチルフェニル、イミダゾール−１−イルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イル)フェニル、ピロリジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピロリジノメチルフェニル、ピペラジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピペラジノメチルフェニル、(４−低級アルキルピペラジノメチル)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノメチル)フェニル、モルホリノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−モルホリノメチルフェニル、ピペラジノカルボニルフェニル、典型的には４−ピペラジノカルボニルフェニル、または(４−低級アルキルピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニルである。
【００４５】
さらに好ましいアシルＡｃ１は炭酸のモノエステルから誘導され、そして部分式Ｒｏ−Ｏ−ＣＯ−を特徴とする。低級アルキルラジカル、特にｔｅｒｔ−ブチルはこれらの誘導体で特に好ましいヒドロカルビルラジカルＲｏである。
別の好ましいアシルＡｃ１は炭酸(またはチオ炭酸もまた)のアミドから誘導され、そして式ＲｏＨＮ−Ｃ(＝Ｗ)−またはＲｏＲｏＮ−Ｃ(＝Ｗ)−を特徴とし、式中、ラジカルＲｏは互いに独立して前記で定義されるとおりであり、そしてＷは硫黄および特に酸素である。とりわけ、Ａｃ１が式ＲｏＨＮ−Ｃ(＝Ｗ)−のラジカルである化合物が好ましく、式中Ｗは酸素であり、そしてＲｏは以下の好ましい意味の一つを有する：モルホリノ−低級アルキル、典型的には２−モルホリノエチル、フェニル、低級アルコキシフェニル、典型的には４−メトキシフェニルもしくは４−エトキシフェニル、カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニル、または低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−エトキシカルボニルフェニル。
【００４６】
部分式Ｒｏ−ＳＯ２−(式中、Ｒｏは前記の一般的および具体的な意味で定義されるようなヒドロカルビルである)の好ましいアシルＡｃ２は低級アルキルフェニルスルホニル、典型的には４−トルエンスルホニルである。
ｐが０である場合、窒素原子結合Ｒ３は非荷電である。ｐが１である場合、次いでＲ４もまた存在しなければならず、そして窒素原子結合Ｒ３およびＲ４(第四級窒素)は次いで正に荷電する。
【００４７】
各々２９個までの炭素原子を有する脂肪族、炭素環式もしくは炭素環式脂肪族ラジカルに関する、または各々２０個までの炭素原子および各々９個までのヘテロ原子を有する複素環式もしくは複素環式−脂肪族ラジカル、または各々３０個までの炭素原子を有するアシルに関する定義は、好ましくは対応するラジカルＲ３およびＲ４に関して与えられた定義に合致する。特に好ましいのはＲ５低級アルキル、特にメチル、または何より特に水素である。
Ｚは特に低級アルキル、何より特にメチルまたは水素である。
【００４８】
波線により示される２個の結合が環Ａにおいて欠落している場合、次いで式Ｉで１、２、３および４の数字により特徴付けられる炭素原子間で二重結合は存在しない(四水素化誘導体)が、単結合のみ存在し、一方環Ｂは芳香族である(式Ｉの８および９により特徴付けられる炭素原子ならびに１０および１１により特徴付けられる炭素原子の間の二重結合)。波線により示される２個の結合が環Ｂにおいて欠落している場合、次いで式Ｉで８、９、１０および１１の数字により特徴付けられる炭素原子間で二重結合は存在しない(四水素化誘導体)が、単結合のみ存在し、一方環Ａは芳香族である(式Ｉの１および２により特徴付けられる炭素原子ならびに３および４により特徴付けられる炭素原子の間の二重結合)。波線により示される全部で４個の結合が環Ａおよび環Ｂにおいて欠落しており、そして全部で８個の水素原子により置き換えられている場合、次いで式Ｉの１、２、３、４、８、９、１０および１１の数字の炭素原子間で二重結合は存在しない(八水素化誘導体)が単結合のみ存在する。
【００４９】
その性質により、本発明の化合物は、塩形成基を含有する場合、薬学的、すなわち生理学的に許容される塩の形態でも存在し得る。単離および精製のためには薬学的に許容されない塩もまた使用できる。治療用途には薬学的に許容される塩のみが使用され、そしてこれらの塩が好ましい。
故に遊離酸基、例えば遊離スルホ、ホスホリルまたはカルボキシル基を有する式Ｉの化合物は塩形成塩基性構成成分との塩として、好ましく生理学的に許容される塩として存在し得る。これらは主としてアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属塩のような金属またはアンモニウム塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムもしくはカルシウム塩、またはアンモニアもしくは適当な有機アミン、特に第三級モノアミンおよび複素環式塩基、例えばトリエチルアミン、トリ−(２−ヒドロキシエチル)−アミン、Ｎ−エチルピペリジンもしくはＮ,Ｎ'−ジメチルピペラジンとのアンモニウム塩でよい。
【００５０】
塩基性特徴を有する本発明の化合物はまた付加塩、特に無機および有機酸との酸付加塩として、しかしまた第四級塩として存在し得る。故に例えば置換基としてアミノ基のような塩基性基を有する化合物は一般の酸と酸付加塩を形成し得る。適当な酸は、例えばハロゲン化水素酸、例えば塩酸および臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸もしくは過塩素酸、または脂肪族、非環式、芳香族もしくは複素環式カルボン酸もしくはスルホン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、シュウ酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、アントラニル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンジスルホン酸、ハロベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸またはスルファニル酸、およびまたメチオニン、トリプトファン、リジンまたはアルギニン、ならびにアスコルビン酸である。
【００５１】
遊離形態および、例えば新規化合物の精製または同定における中間物質として使用できるこれらの塩を含むその塩、およびその溶媒和物形態の化合物(特に式Ｉの)の間の密接な関係に鑑みて、本明細書前記および後記の遊離化合物に対する任意の言及は対応する塩、およびその溶媒和物、例えば水和物、必要に応じて賦形剤への言及として理解されるべきである。
式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｉ、II、III、IV、ＶまたはVIの化合物、特に式中、Ｒ５が水素であるものは貴重な薬理学的特性を保持する。
本明細書前記および後記で記載されたラジカルまたは化合物の基の場合、一般的な定義を適切でそして便宜的である限り、本明細書前記および後記で記載されたさらに具体的な定義により置き換えることができる。
【００５２】
好ましいのは；
Ｒ１およびＲ２は互いに独立して低級アルキル、ハロゲンにより置換された低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、ヒドロキシ、低級アルコキシ、フェニル−低級アルコキシ、フェニルオキシ、低級アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、フェニル−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−(フェニル−低級アルキル)アミノ、シアノ、メルカプト、低級アルキルチオ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキルカルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルカルバモイル、スルホ、低級アルカンスルホニル、低級アルコキシスルホニル、アミノスルホニル、Ｎ−低級アルキルアミノスルホニルもしくはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノスルホニル；ハロゲン；低級アルコキシ；Ｃ６−Ｃ１４アリールオキシ；Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルコキシ；低級アルカノイルオキシ；Ｃ６−Ｃ１４アリールカルボニルオキシ；低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルキル、低級アルカノイルもしくはＣ６−Ｃ１２アリールカルボニルにより一置換もしくは二置換されたアミノ；シアノ；ニトロ；メルカプト；低級アルキルチオ；Ｃ６−Ｃ１４アリールチオ；Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルチオ；低級アルカノイルチオ；Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルカノイルチオ；カルボキシ；低級アルコキシカルボニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルコキシカルボニル；Ｃ６−Ｃ１４アリールオキシカルボニル；カルバモイル；低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリールもしくはＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルによりＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換されたカルバモイル；スルホ；Ｃ６−Ｃ１４アリールスルホニル；Ｃ６−Ｃ１４アリール−低級アルカンスルホニル；低級アルカンスルホニル；または低級アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリールもしくはＣ６−Ｃ１４アリール−低級アルキルによりＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換されたアミノスルホニルであり、ここでＣ６−Ｃ１４アリールは環系に６個から１２個の炭素原子を有するアリールラジカルであり、それは非置換であるか、またはハロゲン、フェニルもしくはナフチル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、フェニル−低級アルコキシ、フェニルオキシ、低級アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、フェニル−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−(フェニル−低級アルキル)アミノ、シアノ、メルカプト、低級アルキルチオ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキルカルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルカルバモイル、スルホ、低級アルカンスルホニル、低級アルコキシスルホニル、アミノスルホニル、Ｎ−低級アルキルアミノスルホニルまたはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノスルホニルにより置換されていてよく；
【００５３】
ｎおよびｍは互いに独立して０または１または２、好ましくは０であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８、Ｒ１０は互いに独立して水素、低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルカジエニルであり、それは各々非置換であるか、または低級アルキル；ヒドロキシ；低級アルコキシ、それは(ｉ)４から１２個の環原子を有するヘテロシクリル(それは不飽和、完全飽和または部分的に飽和されていてよく、単環式または二環式であり、そして窒素、酸素および硫黄から選択される３個までのヘテロ原子を含有でき、そして何より特にピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジル、または広義ではまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリル、インドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、ベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニル；イミダゾリル、典型的には１−もしくは２−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、チアゾリル、典型的には２−チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、キナゾリル、典型的には２−キナゾリニル、２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロピラニル、１−、２−もしくは３−ピロリジル、１−、２−、３−もしくは４−ピペリジル、１−、２−もしくは３−モルホリニル、２−もしくは３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルまたはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニルである)により、(ii)ハロゲンにより、(iii)ヒドロキシにより、または(iv)低級アルコキシにより一、二もしくは三置換されていてよい；フェノキシ；フェニル−低級ルコキシ；ヘテロシクリルオキシ、ここでヘテロシクリルはピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジル、または広義ではまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリル、インドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、ベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニル；イミダゾリル、典型的には１−もしくは２−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、チアゾリル、典型的には２−チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、キナゾリル、典型的には２−キナゾリニル、２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、２−もしくは４−テトラヒドロピラニル、１−、２−もしくは３−ピロリジル、１−、２−、３−もしくは４−ピペリジル、１−、２−もしくは３−モルホリニル、２−もしくは３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルまたはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニル、例えば特に２−または４−テトラヒドロピラニルオキシである；低級アルカノイルオキシ；カルボキシ；低級アルコキシカルボニル；フェニル−低級アルコキシカルボニル；メルカプト；低級アルキルチオ；フェニルチオ；ハロゲン；ハロゲン−低級アルキル；オキソ(１位を除く、そうでないとアシルになるので)；アジド；ニトロ；シアノ；アミノ；モノ−低級アルキルアミノ；ジ−低級アルキルアミノ；ピロリジノ；イミダゾール−１−イル；ピペリジノ；ピペラジノ；４−低級アルキルピペラジノ；モルホリノ；チオモルホリノ；非置換であるか、またはフェニル部分で低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲンおよび／もしくはニトロにより置換されているジフェニルアミノまたはジベンジルアミノ；低級アルコキシカルボニルアミノ；非置換であるか、またはフェニル部分で低級アルキルもしくは低級アルコキシにより置換されているフェニル−低級アルコキシカルボニルアミノ；フルオレニルメトキシカルボニルアミノ；アミノ−低級アルキル；一置換または二置換アミノ−低級アルキル、ここでアミノ置換基は低級アルキル、ヒドロキシ−低級アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、アミノ−低級アルキル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ(−低級アルキル)アミノ−低級アルキル、アミノ、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノおよびＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−(ヒドロキシ−低級アルキル)アミノから選択される；ピロリジノ−低級アルキル；ピペリジノ−低級アルキル；ピペラジノ−低級アルキル；４−低級アルキルピペラジノ−低級アルキル；イミダゾール−１−イル−低級アルキル；モルホリノ−低級アルキル；チオモルホリノ−低級アルキル；Ｓ−オキソ−チオモルホリノ−低級アルキル；Ｓ,Ｓ−ジオキソチオモルホリノ−低級アルキル；低級アルキレンジオキシ；スルファモイル；スルホ；カルバモイル；ウレイド；グアニジノ；シアノ；アミノカルボニル(カルバモイル)およびアミノカルボニルオキシ、それは窒素で１個または２個のラジカルにより置換されており、ここでアミノ置換基は互いに独立して低級アルキル、ヒドロキシ−低級アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、アミノ−低級アルキル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ(−低級アルキル)アミノ−低級アルキル、アミノ、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノおよびＮ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−(ヒドロキシ−低級アルキル)アミノを含む群から選択される；ピロリジノカルボニル；ピペリジノカルボニル；ピペラジノカルボニル；４−低級アルキルピペラジノカルボニル；イミダゾリノカルボニル；モルホリノカルボニル；チオモルホリノカルボニル；Ｓ−オキソ−チオモルホリノカルボニル；ならびにＳ,Ｓ−ジオキソチオモルホリノ；
末端フェニルラジカルを有するフェニル、ナフチル、フェニル−低級アルキルまたはフェニル−低級アルケニル、それは非置換であるか、または低級アルキル、低級アルケニルもしくは低級アルカジエニルの置換基として前記で挙げられたラジカルにより一置換もしくは二置換されている；
【００５４】
またはヘテロシクリル−低級アルキル、ここでヘテロシクリルはピロリル、例えば２−ピロリルもしくは３−ピロリル、ピリジル、例えば２−、３−もしくは４−ピリジル、または広義ではまたチエニル、例えば２−もしくは３−チエニル、またはフリル、例えば２−フリル、インドリル、典型的には２−もしくは３−インドリル、キノリル、典型的には２−もしくは４−キノリル、イソキノリル、典型的には３−もしくは５−イソキノリル、ベンゾフラニル、典型的には２−ベンゾフラニル、クロメニル、典型的には３−クロメニル、ベンゾチエニル、典型的には２−もしくは３−ベンゾチエニル；イミダゾリル、典型的には１−もしくは２−イミダゾリル、ピリミジニル、典型的には２−もしくは４−ピリミジニル、オキサゾリル、典型的には２−オキサゾリル、イソオキサゾリル、典型的には３−イソオキサゾリル、チアゾリル、典型的には２−チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、典型的には２−ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、典型的には２−ベンゾオキサゾリル、キナゾリル、典型的には２−キナゾリニル、２−テトラヒドロフリル、４−テトラヒドロフリル、２−もしくは４−テトラヒドロピラニル、１−、２−もしくは３−ピロリジル、１−、２−、３−もしくは４−ピペリジル、１−、２−もしくは３−モルホリニル、２−もしくは３−チオモルホリニル、２−ピペラジニルまたはＮ,Ｎ'−ビス−低級アルキル−２−ピペラジニルであり、それは各々の場合で非置換であるか、または低級アルキル、低級アルケニルもしくは低級アルカジエニルの置換基として前記で挙げられたラジカルにより一置換もしくは二置換されている；
または部分式Ｙ−Ｃ(＝Ｗ)−のアシル、ここでＷは酸素であり、そしてＹは水素、Ｒｏ、Ｒｏ−Ｏ−、ＲｏＨＮ−またはＲｏＲｏＮ−である(ここでラジカルＲｏは同一かまたは異なっていてよい)
または部分式Ｒｏ−ＳＯ２−のアシルから独立して選択される置換基により一置換または多置換、好ましくは一置換または二置換されており、
それによりＲ４はまた式IIの化合物に関して不在でもよいか；または
Ｒ４は式IIの化合物に関して不在、式Ｉの化合物に関して水素またはＣＨ３であり、そして
【００５５】
Ｒ３は部分式Ｙ−Ｃ(＝Ｗ)−のアシルであり、ここでＷは酸素であり、そしてＹは水素、Ｒｏ、Ｒｏ−Ｏ−、ＲｏＨＮ−またはＲｏＲｏＮ−である(ここでラジカルＲｏは同一かまたは異なっていてよい)、または部分式Ｒｏ−ＳＯ２−のアシルであり、
ここで該ラジカルのＲ０は以下の意味を有する：置換または非置換低級アルキル、特にメチルまたはエチル、アミノ−低級アルキルヒドロキシ−低級アルキル、ここでアミノ基は保護されていないかまたは従来のアミノ保護基、特に低級アルコキシカルボニル、典型的にはｔｅｒｔ−低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルにより保護され、例えばアミノメチル、Ｒ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−アミノエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルまたはＲ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)エチルであり、カルボキシ−低級アルキル、典型的には２−カルボキシエチル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル、典型的には２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)エチル、シアノ−低級アルキル、典型的には２−シアノエチル、テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル、典型的には４−(テトラヒドロピラニル)オキシメチル、モルホリノ−低級アルキル、典型的には２−(モルホリノ)エチル、フェニル、低級アルキルフェニル、典型的には４−メチルフェニル、低級アルコキシフェニル、典型的には４−メトキシフェニル、イミダゾリル−低級アルコキシフェニル、典型的には４−[２−(イミダゾール−１−イル)エチル)オキシフェニル、カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニル、低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−エトキシカルボニルフェニルもしくは４−メトキシフェニル、ハロゲン−低級アルキルフェニル、典型的には４−クロロメチルフェニル、ピロリジノフェニル、典型的には４−ピロリジノフェニル、イミダゾール−１−イルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イル)フェニル、ピペラジノフェニル、典型的には４−ピペラジノフェニル、(４−低級アルキルピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニル、モルホリノフェニル、典型的には４−モルホリノフェニル、ピロリジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピロリジノメチルフェニル、イミダゾール−１−イル−低級アルキルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イルメチル)フェニル、ピペラジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピペラジノメチルフェニル、(４−低級アルキルピペラジノメチル)−フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノメチル)フェニル、モルホリノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−モルホリノメチルフェニル、ピペラジノカルボニルフェニル、典型的には４−ピペラジノカルボニルフェニル、または(４−低級アルキルピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニル)。
【００５６】
Ｒ４が不在である場合、ｐは０であるか、またはＲ３およびＲ４が双方共に存在し、そして各々の場合に前記されたラジカルのうちの一つである場合１であり(式IIの化合物に関して)；
Ｒ５は水素または低級アルキル、特に水素であり；
Ｘは２個の水素原子、Ｏ、または１個の水素原子およびヒドロキシ水素；または１個の水素原子および低級アルコキシを意味し；
Ｚは水素または特に低級アルキル、何より特にメチルであり；
そして式IIの化合物に関して、波線で特徴付けられた２個の結合は好ましくは環Ａで不在であり、４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ｂの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；または
また波線で特徴付けられた２個の結合は環Ｂで不在であり、全部で４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ａの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；
または環Ａおよび環Ｂの双方で４個の波線の結合の全てが不在であり、全部で８個の水素原子により置き換えられているかのいずれかである；
式Ｉ、II、III、IV、Ｖ、VIの化合物、または少なくとも１個の塩形成基が存在する場合はその塩である。
【００５７】
特に好ましいのは：
ｍおよびｎは各々０であり；
Ｒ３およびＲ４は互いに独立して水素、非置換であるか、またはカルボキシ；低級アルコキシカルボニル；およびシアノから互いに独立して選択されるラジカルにより一もしくは二置換された、特に一置換された低級アルキルであるか；または
Ｒ４は水素もしくは−ＣＨ３であり、そして
Ｒ３は前記で定義されたとおりであるか、または好ましくはＲ３は部分式Ｒｏ−ＣＯのアシルであり、式中Ｒｏは低級アルキル；アミノ−低級アルキル、ここでアミノ基は非保護形態で存在するか、または低級アルコキシカルボニルにより保護されている；テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル；フェニル；イミダゾリル−低級アルコキシフェニル；カルボキシフェニル；低級アルコキシカルボニルフェニル；ハロゲン−低級アルキルフェニル；イミダゾール−１−イルフェニル；ピロリジノ−低級アルキルフェニル；ピペラジノ−低級アルキルフェニル；(４−低級アルキルピペラジノメチル)フェニル；モルホリノ−低級アルキルフェニル；ピペラジノカルボニルフェニル；または(４−低級アルキルピペラジノ)フェニルであるか；
または部分式Ｒｏ−Ｏ−ＣＯ−のアシルであり、式中、Ｒｏは低級アルキルであるか；
または部分式ＲｏＨＮ−Ｃ(＝Ｗ)−のアシルであり、式中、Ｗは酸素であり、そしてＲｏは以下の意味を有する：モルホリノ−低級アルキル、フェニル、低級アルコキシフェニル、カルボキシフェニルもしくは低級アルコキシカルボニルフェニル；または
Ｒ３は低級アルキルフェニルスルホニル、典型的には４−トルエンスルホニルであり；
好ましいＲ３基のさらに具体的な実例は好ましい式IIの化合物に関して以下に記載されるとおりであり、
Ｒ５は水素または低級アルキル、特に水素であり、
Ｘは２個の水素原子またはＯを意味し；
Ｚはメチルまたは水素である；
式Ｉであっての化合物または少なくとも１個の塩形成基が存在する場合、その塩である。
【００５８】
特に好ましいのは；
ｍおよびｎは各々０であり；
Ｒ３およびＲ４は互いに独立して水素、非置換であるか、またはカルボキシ；低級アルコキシカルボニル；およびシアノから互いに独立して選択されるラジカルにより非置換または一もしくは二置換された、特に一置換された低級アルキルであり；それによりＲ４は不在でもよいか；または
Ｒ４は不在であり、そして
Ｒ３は部分式Ｒｏ−ＣＯからのアシルであり、式中Ｒｏは低級アルキル、特にメチルまたはエチル；アミノ−低級アルキル、ここでアミノ基はここでアミノ基は保護されていないかまたは低級アルコキシカルボニル、典型的にはｔｅｒｔ−低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、例えばアミノメチル、Ｒ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−アミノエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチルまたはＲ,Ｓ−、Ｒ−もしくは好ましくはＳ−１−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)エチルにより保護される；テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル、典型的には４−(テトラヒドロピラニル)オキシメチル；フェニル；イミダゾリル−低級アルコキシフェニル、典型的には４−[２−(イミダゾール−１−イル)エチル)オキシフェニル；カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニル；低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−メトキシ−もしくは４−エトキシカルボニルフェニル；ハロゲン−低級アルキルフェニル、典型的には４−クロロメチルフェニル；イミダゾール−１−イルフェニル、典型的には４−(イミダゾリル−１−イル)フェニル；ピロリジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピロリジノメチルフェニル；ピペラジノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−ピペラジノメチルフェニル；(４−低級アルキルピペラジノメチル)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノメチル)フェニル；モルホリノ−低級アルキルフェニル、典型的には４−モルホリノメチルフェニル；ピペラジノカルボニルフェニル、典型的には４−ピペラジノカルボニルフェニル；または(４−低級アルキルピペラジノ)フェニル、典型的には４−(４−メチルピペラジノ)フェニルであるか；または
部分式Ｒｏ−Ｏ−ＣＯ−のアシルであり、ここでＲｏは低級アルキルであるか；または
部分式ＲｏＨＮ−Ｃ(＝Ｗ)−アシルであり、ここでＷは酸素であり、そしてＲｏは以下の好ましい意味を有する：モルホリノ−低級アルキル、典型的には２−モルホリノエチル、フェニル、低級アルコキシフェニル、典型的には４−メトキシフェニルもしくは４−エトキシフェニル、カルボキシフェニル、典型的には４−カルボキシフェニルまたは低級アルコキシカルボニルフェニル、典型的には４−エトキシカルボニルフェニル；または
低級アルキルフェニルスルホニル、典型的には４−トルエンスルホニルであり；
Ｒ４が不在である場合、ｐは０であるか、またはＲ３およびＲ４が双方共に存在し、そして各々の場合で前記されたラジカルの一つである場合、１であり；
Ｒ５は水素または低級アルキル、特に水素であり
Ｘは２個の水素原子またはＯを意味し；
Ｚはメチルまたは水素であり；
そして波線で特徴付けられた２個の結合は好ましくは環Ａで不在であり、４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ｂの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；または
また波線で特徴付けられた２個の結合は環Ｂで不在であり、全部で４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ａの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；または
環Ａおよび環Ｂの双方で４個の波線の結合の全てが不在であり、全部で８個の水素原子により置き換えられているかのいずれかである)
式IIの化合物、または少なくとも１個の塩形成基が存在する場合はその塩である。
【００５９】
何より特に好ましい式IIの化合物は：
８,９,１０,１１−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−[４−(４−メチルピペラジン−１−イルメチル)ベンゾイル]−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−クロロメチルベンゾイル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−(ピロリジン−１−イルメチル)ベンゾイル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−(モルホリン−４−イルメチル)ベンゾイル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−(ピペラジン−１−イルメチル)ベンゾイル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−エチル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−トシル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−トリフルオロアセチル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−[４−(２−イミダゾール−１−イル−エトキシ)ベンゾイル]−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−メトキシカルボニルメチル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−カルボキシメチル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−テレフタロイルメチルエステル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−テレフタロイル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−エチルピペラジニルカルボニルベンゾイル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(２−シアノエチル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−ベンゾイル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
ヨウ化Ｎ,Ｎ−ジメチル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−ＢＯＣ−グリシル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−グリシル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(３−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)プロピル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(３−カルボキシプロピル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−イミダゾール−１−イル)ベンゾイル]−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−[(テトラヒドロ−２ｈ−ピラン−４−イルオキシ)アセチル]−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−ＢＯＣ−l−アラニル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
塩酸Ｎ−l−アラニル−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−メチル−１,２,３,４−テトラヒドロ−６−メチルスタウロスポリン；
Ｎ−(４−カルボキシフェニルアミノカルボニル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(４−エチルフェニルアミノカルボニル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(Ｎ−フェニルアミノカルボニル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(Ｎ−[２−(１−モルホリノ)エチル]アミノカルボニル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−(Ｎ−[４−メトキシフェニル]アミノカルボニル)−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
１,２,３,４−テトラヒドロ−６−メチルスタウロスポリン；
Ｎ−ＢＯＣ−１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリン；
Ｎ−ＢＯＣ−１,２,３,４−テトラヒドロ−６−メチルスタウロスポリン；
Ｎ−ＢＯＣ−１,２,３,４−テトラヒドロ−６−メチル−７−オキソ−スタウロスポリン；
１,２,３,４,８,９,１０,１１−オクタヒドロスタウロスポリン；
または少なくとも１個の塩形成基が存在する場合、その薬学的に許容される塩から選択される。
【００６０】
何より特に好ましいのは１,２,３,４−テトラヒドロスタウロスポリンと称される式Ｉの化合物または(特に薬学的に許容される)その塩である(ここで式Ｉのｍおよびｎは０であり、Ｒ３は水素であり、Ｒ４は塩が存在しない場合(ｐ＝０)は不在であるか、または塩が存在する場合(ｐ＝１)は水素であり、Ｒ５は水素であり、波線で表される２個の結合は環Ａで不在であり、全部で４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ｂで波線で表される２個の結合は各々の場合で平行の結合と一緒に二重結合であり、Ｘは２個の水素原子を意味し、そしてＺはメチルである)。
【００６１】
何より特に好ましいのは式Ａの化合物であり、ここで；
Ａ)Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｑ＝−(ＣＨ２)２−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２)ＯＨ−(ＣＨ２)２−
Ｂ)Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｑ＝−(ＣＨ２)２−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)２)−(ＣＨ２)２−
Ｃ)Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｑ＝
【化７】
【００６２】
何より特に好ましいのは式Ｉの化合物であり、ここで；
Ａ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ４＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３(スタウロスポリン)
Ｂ) Ｘ＝(Ｒ)または(Ｓ)異性体の１個の水素および１個のヒドロキシ原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ４＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３(ＵＣＮ−０１およびＵＣＮ−０２)
Ｃ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ４＝ＣＨ３；Ｒ３＝ベンゾイル；Ｚ＝ＣＨ３(ＣＧＰ４１２５１またはＰＫＣ４１２またはミドスタウリン)
Ｄ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ３；Ｒ４＝エチルオキシカルボニル；Ｚ＝ＣＨ３(ＮＡ３８２；ＣＡＳ＝１４３０８６−３３−３)
Ｅ) Ｘ＝１個の水素および１個のヒドロキシ原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３；そしてＲ４は：−(ＣＨ２)２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＨ；−ＣＯ(ＣＨ２)２ＣＯ２Ｎａ；−(ＣＨ２)３ＣＯ２Ｈ；−ＣＯＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)２；
【化８】
から選択される；
Ｆ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３；そしてＲ４は：Ｎ−[０−(テトラヒドロピラン−４−イル)−Ｄ−ラクトイル]；Ｎ−[２−メチル−２−(テトラヒドロピラン−４−イルオキシ)−プロピオニル；Ｎ−[０−(テトラヒドロピラン−４−イル)−Ｌ−ラクトイル]；Ｎ−[０−(テトラヒドロピラン−４−イル)−Ｄ−ラクトイル]；Ｎ−[２−(テトラヒドロ−ピラン−４−イルオキシ)−アセチル)]から選択される；
Ｇ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３；そしてＲ４は：Ｎ−[０−(テトラヒドロピラン−４−イル)−Ｄ−ラクトイル]；Ｎ−[２−(テトラヒドロ−ピラン−４−イルオキシ)−アセチル)]から選択される；
Ｈ) Ｘ＝１個の水素および１個のヒドロキシ原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３；そしてＲ４は：Ｎ−[０−(テトラヒドロピラン−４−イル)−Ｄ−ラクトイル]；Ｎ−[２−(テトラヒドロ−ピラン−４−イルオキシ)−アセチル)]から選択される。
【００６３】
略語「ＣＡＳ」はケミカルアブストラクト登録番号を意味する。
最も好ましい式Ｉの化合物、例えばミドスタウリン[国際一般的名称]は１９８８年１２月２１日公開の特許文献１、ならびに１９９２年３月３日公開の特許文献２および特許文献３により適用され、そして具体的に記載されている。その他の好ましい化合物は共に１９９５年１２月７日公開の特許文献４および特許文献５に適用され、そして記載される。
【００６４】
何より特に好ましいのは式IIIの化合物であり、ここで；
Ａ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ６＝ＣＨ３；Ｒ７＝メチルオキシカルボニル；Ｚ＝Ｈ(２−メチルＫ２５２ａ)
Ｂ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６＝Ｈ；Ｒ７＝メチルオキシカルボニル；Ｚ＝Ｈ(Ｋ−２５２ａ)
Ｃ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６＝Ｈ；Ｒ７＝メチルオキシカルボニル；Ｚ＝ＣＨ３(ＫＴ−５７２０)。
【００６５】
何より特に好ましいのは式IVの化合物であり、ここで；
Ａ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ９＝ＣＨ２−ＮＭｅ２；Ｒ８＝ＣＨ３；ｍ'＝ｎ'＝２
Ｂ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ９＝ＣＨ２−ＮＨ２；Ｒ８＝ＣＨ３；ｍ'＝２；ｎ'＝１(Ｒｏ−３１−８４２５；ＣＡＳ＝１５１３４２−３５−７)。
【００６６】
何より特に好ましいのは式Ｖの化合物であり、ここで；
Ａ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ８＝ＣＨ３；Ｒ１０＝−(ＣＨ２)３−ＮＨ２；(Ｒｏ−３１−７５４９；ＣＡＳ＝１３８５１６−３１)
Ｂ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ８＝ＣＨ３；Ｒ１０＝−(ＣＨ２)３−Ｓ−(Ｃ＝ＮＨ)−ＮＨ２；(Ｒｏ−３１−８２２０；ＣＡＳ＝１２５３１４−６４−９))
Ｃ) Ｘ＝Ｏ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ８＝ＣＨ３；Ｒ１０＝−ＣＨ３。
【００６７】
何より特に好ましいのは式VIの化合物であり、ここで；
Ａ) Ｘ＝２個の水素原子；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５＝Ｈ；Ｒ４＝ＣＨ３；Ｚ＝ＣＨ３；メチルまたは(Ｃ１−Ｃ１０)アルキル、アリールメチル、Ｃ６Ｈ２ＣＨ２−から選択されるＲ３。
【００６８】
スタウロスポリン誘導体およびその製造方法は多くの先行の文献に具体的に記載されており、当業者に周知である。
式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの化合物およびその製造方法は、例えば１９９５年６月１４日公開の特許文献６、１９９４年１１月１７日公開の特許文献７、１９９２年２月１２日公開の特許文献８、１９８９年８月１６日公開の特許文献９、１９９０年８月２９日公開の特許文献１０、および非特許文献１のような多くの出版物に記載されている。
【００６９】
式Ｉの化合物およびその製造方法は１９８８年１２月２１日公開の特許文献１ならびに１９９２年３月３日公開の特許文献２および特許文献３に具体的に記載されている。Ｒ４でテトラヒドロピラン−４−イル)−ラクトイル置換を有する式Ｉの化合物は１９９４年１１月１７日公開の特許文献１１に記載されている。その他の化合物は１９９３年１２月２９日公開の特許文献１２、１９８７年９月２３日に特許文献１３(ＵＣＮ−O１)、１９９８年７月３日公開の特許文献１４として公開された特許文献１５に記載されている。
【００７０】
式IIの化合物およびその製造方法は１９８８年１２月２１日公開の特許文献１ならびに１９９２年３月３日公開の特許文献２および特許文献３に具体的に記載されている。
式IIIの化合物およびその製造方法は１９９２年７月２４日出願の特許文献１６の優先権を主張する特許出願(すなわち１９９７年４月１６日公開の特許文献１７、２０００年５月２４日公開の特許文献１８、１９９５年５月１０日公開の特許文献１９)に具体的に記載されている。
【００７１】
式IVの化合物およびその製造方法は、各々１９９３年５月１０日および１９９４年２月２１日出願の特許文献２０および特許文献２１の優先権を主張する特許出願(すなわち１９９４年１１月１７日公開の特許文献７、２０００年５月２４日公開の特許文献１８、１９９５年５月１０日公開の特許文献１９)に具体的に記載されている。
【００７２】
式Ｖの化合物およびその製造方法は各々１９８８年２月１０日、１９８８年１１月２５日、１９８９年２月２３日、および１９８９年１２月１３日出願の特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４および特許文献２５の優先権を主張する特許出願(すなわち１９８９年８月１６日公開の特許文献９および１９９０年８月２９日公開の特許文献１０)に具体的に記載されている。
【００７３】
式VIの化合物およびその製造方法は１９９１年１０月１０日公開の特許文献２６(Ｃｏｎ)の優先権を主張する特許出願(すなわち１９９３年４月１５日公開の特許文献２７)に具体的に記載されている。
とりわけスタウロスポリン誘導体化合物に関する特許出願または科学的文献の引用が示される各々の場合の最終生成物の対象、医薬製剤および請求の範囲は出典明示により本明細書の一部とする。
コード番号により同定される活性薬剤の構造、一般名および商品名を最新版の標準概論「The Merck Index」またはデータベース、例えばPatents International(例えばIMS World Publications)から取ることができる。対応するその内容は出典明示により本明細書の一部とする。
【００７４】
本発明による好ましいスタウロスポリン誘導体は式(VII)：
【化９】
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩(本明細書後記では：「式VIIの化合物またはミドスタウリン」)である。
【００７５】
式VIIの化合物はミドスタウリン[国際一般的名称]またはＰＫＣ４１２としても公知である。
ミドスタウリンは天然発生アルカロイドスタウロスポリンの誘導体であり、そして１９８８年１２月２１日公開の特許文献１ならびに１９９２年３月３日公開の特許文献２および特許文献３に具体的に記載されている。
【００７６】
核酸
アポトーシスまたはプログラム細胞死を阻止する核酸分子には、限定するものではないが抗アポトーシスＭＣＬ１タンパク質をコードする遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡｉ構築物またはこの遺伝子の転写物が含まれる。本発明の組み合わせにおける使用のために最も好ましいのは、特にｍｃｌ−１特異的ｓｉＲＮＡを含むＭｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物である。本発明のｍｃｌ−１ＲＮＡｉ構築物の実例は実施例において記載される。
【００７７】
骨髄細胞白血病配列１(ＢＣＬ２関連)(「ｍｃｌ−１」)によりコードされるタンパク質はＢｃｌ−２ファミリーに属する。この遺伝子座で選択的スプライシングが生じ、結果的に異なるアイソフォームをコードする二つの転写バリアントに至る。より長い遺伝子生成物(アイソフォーム１)はアポトーシスを阻止することにより細胞生存性を強化する。選択的スプライシングされたより短い遺伝子生成物(アイソフォーム２)はアポトーシスを促進し、そして細胞死誘導する。ｍｃｌ−１遺伝子の別名には、限定するものではないがＥＡＴ、ＭＣＬ１Ｌ、ＭＣＬ１Ｓ、ＭＧＣ１０４２６４、ＭＧＣ１８３９およびＴＭが含まれる。ＭＣＬ１ポリペプチドの代替えの名称には、限定するものではないが誘導骨髄白血病細胞分化タンパク質Ｍｃｌ−１；骨髄細胞白血病配列１；および骨髄細胞白血病配列１、アイソフォーム１が含まれる。
【００７８】
本明細書で使用される際には、「核酸分子」なる用語にはＤＮＡ分子(例えばｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド)およびＲＮＡ分子(例えばｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡのようなＲＮＡｉ構築物)ならびにヌクレオシド類似体を用いて作成されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の類似体が含まれると意図される。核酸分子は一本鎖または二本鎖でよい。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖およびアンチセンス鎖でよい。その用語には合成(例えば化学的に合成された)ＤＮＡが含まれる。ヌクレオシド類似体または誘導体(例えばイノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド)を用いて核酸を合成することができる。かかるヌクレオシドを用いて例えば塩基対形成能が改変されているかまたは、ヌクレアーゼに対する抵抗性が増大されている核酸を調製することができる。
【００７９】
本発明は例えばｍｃｌ−１ ｃＤＮＡを含むｍｃｌ１ヌクレオチド配列に特異的なＲＮＡｉまたはアンチセンス核酸分子を包含する。より長いｍｃｌ−１アイソフォーム１のｃＤＮＡ配列(GenBank受け入れ番号 ＮＭ０２１９６０)を配列番号１で提供する。
【００８０】
GenBank受け入れ番号ＮＭ０２１９６０、４０２０ｂｐ 直鎖状ｍＲＮＡ、ＰＲＩ１２−ＪＵＮ−２００６[ホモサピエンス](配列番号１)
１ caccccgtag gactggccgc cctaaaaccg tgataaagga gctgctcgcc acttctcact
６１ tccgcttcct tccagtaagg agtcggggtc ttccccagtt ttctcagcca ggcggcggcg
１２１ gcgactggca atgtttggcc tcaaaagaaa cgcggtaatc ggactcaacc tctactgtgg
１８１ gggggccggc ttgggggccg gcagcggcgg cgccacccgc ccgggagggc gacttttggc
２４１ tacggagaag gaggcctcgg cccggcgaga gataggggga ggggaggccg gcgcggtgat
３０１ tggcggaagc gccggcgcaa gccccccgtc caccctcacg ccagactccc ggagggtcgc
３６１ gcggccgccg cccattggcg ccgaggtccc cgacgtcacc gcgacccccg cgaggctgct
４２１ tttcttcgcg cccacccgcc gcgcggcgcc gcttgaggag atggaagccc cggccgctga
４８１ cgccatcatg tcgcccgaag aggagctgga cgggtacgag ccggagcctc tcgggaagcg
５４１ gccggctgtc ctgccgctgc tggagttggt cggggaatct ggtaataaca ccagtacgga
６０１ cgggtcacta ccctcgacgc cgccgccagc agaggaggag gaggacgagt tgtaccggca
６６１ gtcgctggag attatctctc ggtaccttcg ggagcaggcc accggcgcca aggacacaaa
７２１ gccaatgggc aggtctgggg ccaccagcag gaaggcgctg gagaccttac gacgggttgg
７８１ ggatggcgtg cagcgcaacc acgagacggc cttccaaggc atgcttcgga aactggacat
８４１ caaaaacgaa gacgatgtga aatcgttgtc tcgagtgatg atccatgttt tcagcgacgg
９０１ cgtaacaaac tggggcagga ttgtgactct catttctttt ggtgcctttg tggctaaaca
９６１ cttgaagacc ataaaccaag aaagctgcat cgaaccatta gcagaaagta tcacagacgt
１０２１ tctcgtaagg acaaaacggg actggctagt taaacaaaga ggctgggatg ggtttgtgga
１０８１ gttcttccat gtagaggacc tagaaggtgg catcaggaat gtgctgctgg cttttgcagg
１１４１ tgttgctgga gtaggagctg gtttggcata tctaataaga tagccttact gtaagtgcaa
１２０１ tagttgactt ttaaccaacc accaccacca ccaaaaccag tttatgcagt tggactccaa
１２６１ gctgtaactt cctagagttg caccctagca acctagccag aaaagcaagt ggcaagagga
１３２１ ttatggctaa caagaataaa tacatgggaa gagtgctccc cattgattga agagtcactg
１３８１ tctgaaagaa gcaaagttca gtttcagcaa caaacaaact ttgtttggga agctatggag
１４４１ gaggactttt agatttagtg aagatggtag ggtggaaaga cttaatttcc ttgttgagaa
１５０１ caggaaagtg gccagtagcc aggcaagtca tagaattgat tacccgccga attcattaat
１５６１ ttactgtagt gttaagagaa gcactaagaa tgccagtgac ctgtgtaaaa gttacaagta
１６２１ atagaactat gactgtaagc ctcagtactg tacaagggaa gcttttcctc tctctaatta
１６８１ gctttcccag tatacttctt agaaagtcca agtgttcagg acttttatac ctgttatact
１７４１ ttggcttggt ttccatgatt cttactttat tagcctagtt tatcaccaat aatacttgac
１８０１ ggaaggctca gtaattagtt atgaatatgg atatcctcaa ttcttaagac agcttgtaaa
１８６１ tgtatttgta aaaattgtat atatttttac agaaagtcta tttctttgaa acgaaggaag
１９２１ tatcgaattt acattagttt ttttcatacc cttttgaact ttgcaacttc cgtaattagg
１９８１ aacctgtttc ttacagcttt tctatgctaa actttgttct gttcagttct agagtgtata
２０４１ cagaacgaat tgatgtgtaa ctgtatgcag actggttgta gtggaacaaa tctgataact
２１０１ atgcaggttt aaattttctt atctgatttt ggtaagtatt ccttagatag gtttttcttt
２１６１ gaaaacctgg gattgagagg ttgatgaatg gaaattcttt cacttcatta tatgcaagtt
２２２１ ttcaataatt aggtctaagt ggagttttaa ggttactgat gacttacaaa taatgggctc
２２８１ tgattgggca atactcattt gagttccttc catttgacct aatttaactg gtgaaattta
２３４１ aagtgaattc atgggctcat ctttaaagct tttactaaaa gattttcagc tgaatggaac
２４０１ tcattagctg tgtgcatata aaaagatcac atcaggtgga tggagagaca tttgatccct
２４６１ tgtttgctta ataaattata aaatgatggc ttggaaaagc aggctagtct aaccatggtg
２５２１ ctattattag gcttgcttgt tacacacaca ggtctaagcc tagtatgtca ataaagcaaa
２５８１ tacttactgt tttgtttcta ttaatgattc ccaaaccttg ttgcaagttt ttgcattggc
２６４１ atctttggat ttcagtcttg atgtttgttc tatcagactt aaccttttat ttcctgtcct
２７０１ tccttgaaat tgctgattgt tctgctccct ctacagatat ttatatcaat tcctacagct
２７６１ ttcccctgcc atccctgaac tctttctagc ccttttagat tttggcactg tgaaacccct
２８２１ gctggaaacc tgagtgaccc tccctcccca ccaagagtcc acagaccttt catctttcac
２８８１ gaacttgatc ctgttagcag gtggtaatac catgggtgct gtgacactaa cagtcattga
２９４１ gaggtgggag gaagtccctt ttccttggac tggtatcttt tcaactattg ttttatcctg
３００１ tctttggggg caatgtgtca aaagtcccct caggaatttt cagaggaaag aacattttat
３０６１ gaggctttct ctaaagtttc ctttgtatag gagtatgctc acttaaattt acagaaagag
３１２１ gtgagctgtg ttaaacctca gagtttaaaa gctactgata aactgaagaa agtgtctata
３１８１ ttggaactag ggtcatttga aagcttcagt ctcggaacat gacctttagt ctgtggactc
３２４１ catttaaaaa taggtatgaa taagatgact aagaatgtaa tggggaagaa ctgccctgcc
３３０１ tgcccatctc agagccataa ggtcatcttt gctagagcta tttttaccta tgtatttatc
３３６１ gttcttgatc ataagccgct tatttatatc atgtatctct aaggacctaa aagcacttta
３４２１ tgtagttttt aattaatctt aagatctggt tacggtaact aaaaaagcct gtctgccaaa
３４８１ tccagtggaa acaagtgcat agatgtgaat tggtttttag gggccccact tcccaattca
３５４１ ttaggtatga ctgtggaaat acagacaagg atcttagttg atattttggg cttggggcag
３６０１ tgagggctta ggacacccca agtggtttgg gaaaggagga ggggagtggt gggtttatag
３６６１ ggggaggagg aggcaggtgg tctaagtgct gactggctac gtagttcggg caaatcctcc
３７２１ aaaagggaaa gggaggattt gcttagaagg atggcgctcc cagtgactac tttttgactt
３７８１ ctgtttgtct tacgcttctc tcagggaaaa acatgcagtc ctctagtgtt tcatgtacat
３８４１ tctgtggggg gtgaacacct tggttctggt taaacagctg tacttttgat agctgtgcca
３９０１ ggaagggtta ggaccaacta caaattaatg ttggttgtca aatgtagtgt gtttccctaa
３９６１ ctttctgttt ttcctgagaa aaaaaaataa atcttttatt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa
【００８１】
本発明はさらに遺伝子コードの縮重ために配列番号１のヌクレオチド配列と異なるが、配列番号１によりコードされるものと同一のｍｃｌ−１タンパク質をコードする核酸分子を包含する。配列番号１のヌクレオチドによりコードされる３５０アミノ酸ＭＣＬ１ポリペプチド(GenPep受け入れ番号ＮＰ０６８７７９)を配列番号２として提供する。
【００８２】
GenPept受け入れ番号ＮＰ０６８７７９ ３５０アミノ酸骨髄細胞白血病配列１アイソフォーム１ ＰＲＩ１２−ＪＵＮ−２００６[ホモサピエンス](配列番号２)
１ mfglkrnavi glnlycggag lgagsggatr pggrllatek easarreigg geagaviggs
６１ agasppstlt pdsrrvarpp pigaevpdvt atparllffa ptrraaplee meapaadaim
１２１ speeeldgye peplgkrpav lpllelvges gnntstdgsl pstpppaeee edelyrqsle
１８１ iisrylreqa tgakdtkpmg rsgatsrkal etlrrvgdgv qrnhetafqg mlrkldikne
２４１ ddvkslsrvm ihvfsdgvtn wgrivtlisf gafvakhlkt inqesciepl aesitdvlvr
３０１ tkrdwlvkqr gwdgfveffh vedleggirn vllafagvag vgaglaylir
【００８３】
ｍｃｌ−１のアミノ酸配列に変化を導くＤＮＡ配列多型が所定の集団(例えばヒト集団)内に存在し得るということは当業者には理解されよう。かかる遺伝子多型は天然の対立遺伝子変種のために集団内で存在し得る。かかる天然の対立遺伝子変種は典型的にはｍｃｌ−１遺伝子のヌクレオチド配列で１５％変動に至り得る。任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変種は、「サイレント」、すなわち天然の対立遺伝子変種の結果であり、そしてｍｃｌ−１の機能的活性を改変しないアミノ酸多型に至ろうとも、本発明の範囲内であると意図される。故に例えばｍｃｌ−１のアミノ酸の１％、２％、３％、４％または５％を別のアミノ酸により、例えば保存置換により置き換えることができる。
【００８４】
集団において存在し得るｍｃｌ−１配列の天然発生対立遺伝子バリアントに加えて、配列番号１のヌクレオチド配列を変異させることにより変化を導入し、それによりタンパク質の機能的能力を改変することなくコードされたアミノ酸配列に変化を導くことができることは当業者には理解されよう。例えば「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基はｍｃｌ−１タンパク質の生物学的活性を改変することなく、ヒトｍｃｌ−１タンパク質の野生型配列から改変され得る残基であり、一方「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要である。例えば種々の種のｍｃｌ−１タンパク質間で保存されるアミノ酸残基は特に改変し難いと予測される。
【００８５】
したがって、活性に必須でないアミノ酸残基に変化を含有するｍｃｌ−１タンパク質をコードする核酸分子は本発明に含まれる。かかるｍｃｌ−１タンパク質はアミノ酸配列で配列番号２とは異なり、そしてなお野生型の生物学的活性の少なくとも一部を保持する。一つの実施態様では、例えば単離された核酸分子には、配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一、例えば８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする配列が含まれる。
【００８６】
一つまたはそれより多いアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、配列番号１に一つまたはそれより多いヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより、配列番号２とは異なる配列を有するｍｃｌ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子を創成することができる。標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発により変異を導入することができる。一つまたはそれより多い、予測される非必須アミノ酸残基で保存アミノ酸置換を行うことができる。故に例えば１％、２％、３％、５％または１０％までのアミノ酸を保存置換により置き換えることができる。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のもので置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野において公知である。それには塩基性側鎖(例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。故にｍｃｌ−１において予測される非必須アミノ酸残基を同一の側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えることができる。これに代えて、飽和変異誘発によるように変異をｍｃｌ−１コード化配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入することができ、そして得られた変異体をｍｃｌ−１生物学的活性に関してスクリーニングして活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発に続いて、タンパク質を発現させ、そしてその活性を決定することができる。
【００８７】
本発明はまたアンチセンス核酸分子、すなわちセンス鎖に相補的、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的、またはｍＲＮＡ配列に相補的である分子をも包含する。アンチセンス核酸は対応するセンス鎖に水素結合できる。アンチセンス核酸は全ｍｃｌ−１コード化配列に、またはその一部にのみ相補的でよい。アンチセンス核酸分子はセンス鎖の非コード化領域に対してアンチセンスでよい。非コード化領域(「５'および３'非翻訳領域」)は遺伝子またはｍＲＮＡのコード化領域をフランキングする５'および３'配列であり、そして翻訳されない。アンチセンス核酸分子はｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの全コード化領域に相補的でよく、またはｍｃｌ−１ ｍＲＮＡのコード化、または３'もしくは５'非コード化領域の一部にのみ相補的でよい場合もある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば約５、例えば約１０、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５または約５０ヌクレオチドの長さでよい。アンチセンス核酸に関係する一般的な手引き書に関しては、例えば非特許文献２を参照されたい。有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの実例には、限定するものではないが、配列番号１のヌクレオチド１３１と１１８３の間の領域に相補的な少なくとも１２ヌクレオチドの配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。実施例の配列番号７−９もまた参照されたい。
【００８８】
化学的合成、酵素ライゲーション反応およびその他の当分野において公知の手順を用いて本発明のアンチセンス核酸を構築することができる。例えば天然発生ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性および／もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された、種々に修飾されたヌクレオチドを用いてアンチセンス核酸(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)を合成することができる。例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸の作成に有用な、修飾されたヌクレオチドの実例には、５フルオロウラシル、５ブロモウラシル、５クロロウラシル、５ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４アセチルシトシン、５(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、１メチルグアニン、５カルボキシメチルアミノメチル２チオウリジン、２,２ジメチルグアニン、ジヒドロウラシル、ベータＤガラクトシルクエオシン、５カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６イソペンテニルアデニン、１メチルイノシン、２メチルアデニン、２メチルグアニン、４チオウラシル、３メチルシトシン、５メチルシトシン、Ｎ６アデニン、７メチルグアニン、５メトキシウラシル、５メチルアミノメチルウラシル、５メトキシアミノメチル２チオウラシル、シュードウラシル、クエオシン(queosine)、ベータＤマンノシルクエオシン、５'メトキシカルボキシメチルウラシル、５メチル２チオウラシル、２メチルチオＮ６イソペンテニルアデニン、ウラシル５オキシ酢酸(ｖ)、ウィブトキソシン(wybutoxosine)、２チオシトシン、２チオウラシル、５メチルウラシル、ウラシル５オキシ酢酸メチルエステル、５メチル２チオウラシル、３(３アミノ３Ｎ２カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗおよび２,６ジアミノプリンが含まれる。これに代えてアンチセンス配向で核酸がサブクローニングされている発現ベクターを用いてアンチセンス核酸を生成することができる(すなわち挿入された核酸から転写されるＲＮＡが、以下のサブセクションでさらに記載される目的の標的核酸に相補的である)。
【００８９】
本発明のアンチセンス核酸分子を対象に投与するか、またはそれがｍｃｌ−１タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズするかもしくは結合するように原位置で作成することができる。このように、アンチセンス核酸は例えば転写および／または翻訳を阻止することによりタンパク質の発現を阻止することができる。安定した二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性により、またはＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝での特異的相互作用を介してハイブリダイズすることができる。
【００９０】
アンチセンス核酸を当分野において公知の任意の方法により、例えば組織部位での直接注入により投与することができる。これに代えてまたは加えて、アンチセンス核酸分子を、全身投与できるように、標的選択細胞に適合させることができる。全身投与のために、例えばアンチセンス核酸分子をペプチドまたは細胞表面受容体もしくは抗原に結合する抗体に連結させることにより、アンチセンス分子を、選択された細胞表面上で発現される受容体または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。本明細書に記載される特定のベクターを用いてアンチセンス核酸分子を細胞に分配することもできる。転写されるべき配列が強力なｐｏｌ IIまたはｐｏｌ IIIプロモーターの制御下に置かれたベクター構築物を用いてアンチセンス転写物の十分な細胞内濃度を達成することができる。
【００９１】
本発明のアンチセンス核酸分子はαアノマー核酸分子でよい。αアノマー核酸分子形態特異的二本鎖は相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、ここでは、通常のβ単位と対照的に鎖は互いに平行に走る(非特許文献３)。アンチセンス核酸分子はまた２'ｏメチルリボヌクレオチド(非特許文献４)またはキメラＲＮＡ ＤＮＡ類似体(非特許文献５)を含むこともできる。
【００９２】
本発明はまたＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)によりｍｃｌ−１の発現を抑制できる核酸をも含む。ＲＮＡｉは、それにより二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)が動物および植物細胞における相同ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘起する方法である。(非特許文献６；非特許文献７)哺乳動物細胞では低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)とも称される、例えば２１−ヌクレオチド(ｎｔ)二重鎖ＲＮＡ(非特許文献８；非特許文献９)；またはマイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)、機能的短鎖ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)、またはＤＮＡ鋳型を用いてＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターを伴ってインビボで発現されるｄｓＲＮＡ(非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；また非特許文献１８参照)がＲＮＡｉの引き金となり得る。
【００９３】
「サイレンシング」としても公知の抑制は進化的に保存される主に細胞質性転写後事象である(非特許文献６参照)。現在のモデルにより、ｄｓＲＮＡがＲＮＡｓｅ III酵素、ダイサーによりｓｉＲＮＡにプロセシングされることが示唆される。次いでｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘起サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)と称される複合体を形成する。この複合体は標的ｍＲＮＡと相互作用し、それは次いで切断され、そして分解される(非特許文献２０；非特許文献２１)。ｓｈＲＮＡは哺乳動物細胞において研究されており(非特許文献２２)、そしてヒト細胞において効率的に発現され得る(非特許文献１３)。哺乳動物細胞において遺伝子発現を抑制するためのＤＮＡベクター基盤のＲＮＡｉ技術は非特許文献１７により記載される。哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現によるＲＮＡｉは(非特許文献１５)に記載されている。
【００９４】
本発明はｓｉＲＮＡ、その二重鎖(すなわちｄｓＲＮＡ)、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含み、それはｍｃｌ−１標的配列(例えばｍｃｌ−１ ｍＲＮＡ(例えば本明細書にて示されるもののようなヒトｍｃｌ−１配列に対応するｍＲＮＡ))と相互作用する(例えば結合する)。かかる核酸は、例えば化学的に合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチド(非特許文献９参照)でよい。本発明に包含され、そして有用であるＲＮＡｉ配列の実例には少なくとも一つの以下の配列またはその相補鎖配列が含まれる：
５' TTG GCT TTG TGT CCT TGG CG ３'(ｍｃｌ１、配列番号７)
５' AAG AAA CGC GGU AAU CGG ACU ３'(ｍｃｌ１、配列番号８)；
５' AGU CCG AUU ACC GCG UUU CUU ３'(ｍｃｌ１、配列番号９)；
５' CUU ACG CUG AGU ACU UCG A ３'(ルシフェラーゼ、配列番号１０)；
【００９５】
プラスミドを用いてｓｉＲＮＡとして機能できるｓｈＲＮＡを転写することができる(非特許文献１７；非特許文献２４参照)。かかるプラスミドは例えばＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーター、続いてセンス配列、ループ構造およびアンチセンス配列を含有するＲＮＡに転写される配列を含有できる。種々のループはいくつかのポリメラーゼIIIプロモーターを有するので、成功裏に用いられている(非特許文献２４；非特許文献２５)。ｍｃｌ−１「センス」配列、ループ構造および対応するｍｃｌ−１「アンチセンス」配列を含有するＲＮＡに転写される配列に作動可能なように連結されたプロモーター(例えばＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーター)を含有するベクター(例えばプラスミド)を当分野において日常的である手順を用いて作成することができる。四つのウリジン３'オーバーハングを有するＵ６−プロモーター駆動ｓｉＲＮＡは哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を抑制することが示されているので(非特許文献２６)、本発明のベクターはＵ６プロモーターおよびウリジンオーバーハング(例えば３'末端の１−６個のウリジン)を有するｓｉＲＮＡに転写される配列を含み得る。本発明に包含され、そして有用であるｓｈＲＮＡの実例は実施例のセクションにおいて記載され、それは各々配列番号９および１０として本明細書に示される配列から転写される(以下の表１を参照)。
【００９６】
典型的には、ｍｉＲＮＡはもしかするとダイサーとしても公知のＲＮａｓｅ III型酵素またはその相同体により、およそ７０ヌクレオチドの前駆体ＲＮＡステムループ(ｓｈＲＮＡ)から切り取られる。ｍｉＲＮＡ前駆体のステム配列を標的ｍＲＮＡ(ここではｍｃｌ−１ ｍＲＮＡ)に相補的なｍｉＲＮＡ配列で置換することにより、ｍｉＲＮＡを発現するベクター構築物を用いて、哺乳動物細胞において標的に対するＲＮＡｉを開始するｓｉＲＮＡを生成することができる(非特許文献１０)。
【００９７】
本発明の核酸はウイルスベクターに含まれる、そして発現され得る。したがって本発明はｓｉＲＮＡの発現によりｍｃｌ−１の特異的サイレンシングを誘起するウイルスベクターを特色とする。例えばＲＮＡ Ｐｏｌ IIプロモーター転写制御下でｓｉＲＮＡを発現する組換えアデノウイルスを作成することにより、ｍｃｌ−１特異的アデノウイルスベクターを構築することができる。
【００９８】
任意の当分野において公知の方法を用いてｓｉＲＮＡsまたはその他の核酸基盤の阻害剤を動物およびヒトに投与することができる。例えば動脈または静脈を介する動物への大容量のｓｉＲＮＡ含有溶液の急速注射(例えば数秒以内で完了する注射)のような「高圧」分配技術を用いることができる(例えば非特許文献２７参照)。マイクロ粒子、ナノ粒子およびリポソームを用いてｓｉＲＮＡを分配することもできる。ｍｃｌ−１ ｍＲＮＡを標的とし、そしてマイクロ粒子、ナノ粒子およびリポソームに随伴されるか、またはそうでなければ生物学的細胞への分配のために処方されるｓｉＲＮＡは本発明の範囲内である。
【００９９】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は約１５またはそれより多い(例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれより多い)ヌクレオチドを各々の鎖に含むことができる。ｄｓＲＮＡの鎖はｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの標的領域に実質的に相補的でよい。例えば１本の鎖はｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの標的領域に約９０％(例えば約９０％、９５％または１００％)相補的でよい。標的領域はｍｃｌ−１核酸配列の任意の領域、例えば配列番号２のアミノ酸１から７６のポリペプチドをコードする領域内の、例えば配列番号１のヌクレオチド１から２２８に対応する領域でよい。
【０１００】
例えば分子を化学的に合成すること、ＤＮＡ鋳型から分子をインビトロで転写すること、例えばｓｈＲＮＡから分子をインビボで作成すること(ｄｓＲＮＡおよびその他の阻止核酸の作成は前記でさらに論じられている)、または当分野において公知の任意のその他の方法を用いることにより本発明のｄｓＲＮＡ分子を生成することができる。例えば天然発生ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性増大させる、もしくはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖の間で形成された二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された、種々に修飾されたヌクレオチドを用いてｄｓＲＮＡの各鎖を化学的に合成することができる(例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオシドを使用することができる)。同一鎖にセンスおよびアンチセンス配列の双方を含む核酸がクローン化されている発現ベクターを用いてｄｓＲＮＡを生成することもできる(例えば挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、そのステムがｍｃｌ−１ＲＮＡに相補的であるアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡを形成するヘアピンを形成し得る)。したがって所定のｍｃｌ−１ ｍＲＮＡ配列の逆向でそして相補体である配列を含むｄｓＲＮＡを作成(または設計)することにより、ｍｃｌ−１発現を阻止するｄｓＲＮＡを作成することができる。
【０１０１】
ｄｓＲＮＡをｍｃｌ−１発現細胞において試験することができる。抗ｍｃｌ−１ ｄｓＲＮＡは細胞におけるｍｃｌ−１の発現を低下させる(すなわちｍｃｌ−１タンパク質およびｍｃｌ−１ ｍＲＮＡのレベルを低下させる)。当分野において公知の方法によりｍｃｌ−１発現を検定することができる。例えばｍｃｌ−１タンパク質のレベルをウェスタンブロット分析により、免疫沈降により、ＥＬＩＳＡにより、または機能的アッセイにより検定することができる。ｍｃｌ−１ ｍＲＮＡのレベルをノーザンブロット、インサイチュ分析またはポリメラーゼ連鎖反応と組み合わされた逆転写(ＲＴ−ＰＣＲ)により検定することができる。
【０１０２】
本発明はまたリボザイムをも包含する。リボザイムは一本鎖核酸(例えばｍＲＮＡ)に対する相補性領域を有し、それを切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。故にリボザイム(例えばハンマーヘッドリボザイム(非特許文献２８に記載される))を用いてｍｃｌ−１ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断して、それによりｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの翻訳を阻止することができる。ｍｃｌ−１コード化核酸に特異性を有するリボザイムを、本明細書に開示されるｍｃｌ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば活性部位のヌクレオチド配列が、ｍｃｌ−１コード化ｍＲＮＡで切断されるべきヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナＬ１９IVＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる。例えばCech et al., 特許文献２８；およびCech et al., 特許文献２９を参照されたい。これに代えて、ｍｃｌ−１ ｍＲＮＡを用いてＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。例えば非特許文献２９を参照されたい。
【０１０３】
本発明または三重らせん構造を形成する核酸分子をも包含する。例えばｍｃｌ−１遺伝子の調節領域(例えばｍｃｌ−１プロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列をターゲティングして、標的細胞におけるｍｃｌ−１遺伝子の転写を防御する三重らせん構造を形成することによりｍｃｌ−１遺伝子発現を阻止することができる。一般的には非特許文献３０；非特許文献３１；および非特許文献３２を参照されたい。
【０１０４】
特定の実施態様では、本発明の核酸分子を塩基部分、糖部分またはリン酸塩骨格で修飾して、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改善する。例えば核酸のデオキシリボースリン酸塩骨格を修飾してペプチド核酸を作成することができる(非特許文献３３参照)。本明細書で使用される際には「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」なる用語は、デオキシリボースリン酸塩骨格が擬ペプチド骨格により置き換えられ、そして四つの天然ヌクレオ塩基のみが保持される核酸擬似物質、例えばＤＮＡ擬似物質を指す。ＰＮＡの中性の骨格は低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。非特許文献３３；非特許文献３４に記載されるような標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いてＰＮＡオリゴマーの合成を実施することができる。
【０１０５】
本発明では、ｍｃｌ−１ ＰＮＡを治療および診断適用のために使用することができる。例えば遺伝子の転写もしくは翻訳停止を誘起するか、または複製を阻止することにより、例えば遺伝子発現の配列特異的調整のために、ＰＮＡをアンチセンスまたは抗遺伝子剤(antigene agent)として使用することができる。例えばｍｃｌ−１ ＰＮＡを例えばＰＮＡ指向ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において；その他の酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼと組み合わされて使用される場合の人工制限酵素として(非特許文献３３)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして(非特許文献３３；非特許文献３４)使用することもできる。
【０１０６】
別の実施態様では、例えば親油性またはその他のヘルパー基をＰＮＡに結合させることにより、ＰＮＡ ＤＮＡキメラの形成によりｍｃｌ−１ ＰＮＡを修飾して、またはリポソームもしくは当分野において公知のその他の薬物分配の技術の使用によりその安定性または細胞取り込みを強化することができる。例えばＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせることができるｍｃｌ−１ ＰＮＡ ＤＮＡキメラを作成することができる。かかるキメラにより、ＤＮＡ認識酵素、例えばＲＮＡｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ部分と相互作用することが可能になるが、ＰＮＡ部分は高い結合親和性および特異性を提供する。塩基スタッキング、ヌクレオ塩基間の結合の数および配向に関して選択された適切な長さのリンカーを用いてＰＮＡ ＤＮＡキメラを連結することができる(非特許文献３３)。ＰＮＡ ＤＮＡキメラの合成を非特許文献３３および非特許文献３５に記載されるように実施することができる。例えば標準的なホスホラミダイト結合化学を用いてＤＮＡ鎖を固体支持体上で合成することができ、そして修飾されたヌクレオシド類似体、例えば５'(４メトキシトリチル)アミノ５'デオキシチミジンホスホラミダイトを例えばＰＮＡとＤＮＡの５'末端の間でリンカーとして用いることができる(非特許文献３６)。次いでＰＮＡ単量体を段階的な様式で結合させて５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する(非特許文献３５)。これに代えて、５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントでキメラ分子を合成することができる(非特許文献３７)。
【０１０７】
その他の実施態様ではオリゴヌクレオチドは、ペプチド(例えばインビボで宿主細胞受容体をターゲティングするために)または細胞膜(例えば非特許文献３８；非特許文献３９；特許文献３０参照)もしくは脳血管関門(例えば特許文献３１参照)をわたる輸送を促進する薬剤のようなその他の追加の基を含み得る。加えてハイブリダイゼーションが引き金となる切断剤(例えば非特許文献４０参照)または挿入剤(例えば非特許文献４１参照)でオリゴヌクレオチドを修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションが引き金となる架橋剤、輸送剤またはハイブリダイゼーションが引き金となる切断剤に抱合させることができる。
【０１０８】
ベクター、宿主細胞およびトランスジェニック動物
ｍｃｌ−１核酸(またはその一部)を含有するベクター、例えば発現ベクターもまた本発明に含まれる。本明細書で使用される際には、「ベクター」なる用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一つの型のベクターはプラスミド、すなわちさらなるＤＮＡセグメントをライゲートできる環状二本鎖ＤＮＡループである。別の型はウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートできる。特定のベクターは導入された宿主細胞内で自己複製することが可能である。それ故に、ｍｃｌ−１核酸含有ベクターを含有する宿主細胞もまた本発明に含まれる。ベクターおよび宿主細胞の選択は当業者には日常的である。
【０１０９】
本発明は、治療上有効量のＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤および、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物のようなｍｃｌ−１阻害剤の組み合わせを各々遊離形態または薬学的に許容される塩もしくは各々のプロドラッグの形態で、かかる処置を必要とする哺乳動物に投与することを含む、骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、およびまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を処置する方法を提供する。
【０１１０】
好ましくは本発明は、治療上有効量の式(VII)のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその薬学的に許容される塩およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせをかかる処置を必要とする哺乳動物に投与することを含む、骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、およびまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を患う哺乳動物、特にヒトを処置する方法を提供する。
【０１１１】
別の実施態様では本発明は、骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、およびまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を処置するための、ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせの使用に関する。
【０１１２】
さらなる実施態様では本発明は骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、およびまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を処置するための医薬組成物の調製のためのＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせの使用に関する。
【０１１３】
本発明によれば、式(VII)のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその薬学的に許容される塩およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせは、ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の好ましい組み合わせである。
【０１１４】
略語：
ＡＳＯ (複数の)アンチセンスオリゴヌクレオチド
ＡＳＭ 侵襲性全身性肥満細胞症
ＢＭ 骨髄
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
クラドリビン ２−クロロデオキシアデノシン(＝２ＣｄＡ)
ＦＣＳ ウシ胎仔血清
ＩＳＭ 無痛性全身性肥満細胞症
ＭＣ (複数の)肥満細胞
ＭＣＬ 肥満細胞白血病
Ｍｃｌ−１ 骨髄細胞白血病−１
ＭＣＳ 肥満細胞肉腫
ｍｉＲＮＡ マイクロＲＮＡ
ＰＢ 末梢血
ＰＢＳ リン酸塩緩衝生理食塩水
ＲＮＡｉ ＲＮＡ干渉
ＲＴ−ＰＣＲ 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
ｓｈＲＮＡ 短鎖ヘアピンＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ 低分子干渉ＲＮＡ
ＳＭ 全身性肥満細胞症
ＳＳＭ 全身性くすぶり型肥満細胞症
ＴＫ チロシンキナーゼ
【０１１５】
骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病、とりわけ全身性肥満細胞症、およびまた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ならびにまた例えば結腸直腸癌(ＣＲＣ)および非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)のような固形腫瘍を処置するための、各々の遊離形態または薬学的に許容される塩もしくは各々のプロドラッグの形態のＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせは組み合わせパートナーの自由なまたは固定された組み合わせでよい。
【０１１６】
一つの態様では、本発明はまた(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤、特に具体的に前記されたＦＬＴ−３阻害剤、とりわけ好ましいとして記載されたもの；および(ｂ)アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物；を含む組み合わせ調製物または医薬組成物のような組み合わせにも関し、ここで活性成分(ａ)および(ｂ)は同時、併用的、個別または逐次的使用のために、各々の場合で遊離形態または薬学的に許容される塩もしくは適当な生物医薬処方の形態で存在する。適当な生物医薬処方は当業者に公知であり、ここでその処方は、治療的投与がＲＮＡｉ構築物のものであるか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド構築物のためのものであるかに依存して最適化される。
【０１１７】
「組み合わせ調製物」なる用語は、前記で定義されたような組み合わせパートナー(ａ)および(ｂ)を独立して、または区別された量の組み合わせパートナー(ａ)および(ｂ)での様々な固定された組み合わせの使用により、すなわち同時に、併用的に、個別にまたは逐次的に投与できるという意味で、特に「部品からなるキット」を定義する。次いで部品からなるキットの一部を例えば同時にまたは時間順に交互に、すなわち部品からなるキットの任意の部分に関して異なる時点で、および均等なまたは異なる時間間隔で投与できる。組み合わされた調製物で投与されるべき組み合わせパートナー(ａ)の組み合わせパートナー(ｂ)に対する全量の比率を、例えば処置されるべき患者の亜集団の必要性または単一の患者の必要性に対処するために変化させることができ、その異なる必要性は患者の特定の疾患、疾患の重篤度、年齢、性別、体重等のためでよい。
【０１１８】
前記されたような本明細書にて前記された疾患および症状を処置するために用いられるＦＬＴ−３阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の正確な投薬量は宿主、処置される症状の性質および重篤度、投与様式を含むいくつかの因子に依存する。しかしながら一般的に、ＦＬＴ−３阻害剤を非経口的、例えば腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、もしくは直腸内、または経腸的、例えば経口的、好ましくは静脈内、または好ましくは経口的、静脈内に、０.１から１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１から５ｍｇ／ｋｇ体重の１日投薬量で投与した場合に満足できる結果が達成される。ヒト試験では、２２５ｍｇ／日の全用量が何より恐らく最大耐量(ＭＴＤ)である。好ましい静脈内１日投薬量は０.１から１０ｍｇ／ｋｇ体重、またはたいていの大型霊長類に関しては、２００−３００ｍｇの１日投薬量である。典型的な静脈内投薬量は３から５ｍｇ／ｋｇ、週３から５回である。
【０１１９】
最も好ましくは、ＦＬＴ−３阻害剤、特にミドスタウリンは経口的に、マイクロエマルジョン、ソフトゲルまたは固体分散物のような投薬形態により、約２５０ｍｇ／日、とりわけ２２５ｍｇ／日までの投薬量で投与され、１日１、２または３回投与される。
通常、処置される宿主のための最適投薬量が決定されるまで、小用量を最初に投与し、そして投薬量を徐々に増加させる。投薬量の上限は副作用により強いられるものであり、そして処置されている宿主に関する試験により決定され得る。
【０１２０】
ＦＬＴ−３阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物を一つまたはそれより多い薬学的に許容される担体、および場合によっては一つまたはそれより多いその他の医薬用アジュバントと組み合わせることができ、そして錠剤、カプセル、キャプレット等の形態で経腸的、例えば経口的に、または例えば滅菌注射溶液もしくは懸濁液の形態で非経口的に、例えば腹腔内もしくは静脈内に投与できる。経腸用および非経口用組成物を従来の手段により調製することができる。
【０１２１】
本発明による注入溶液は好ましくは滅菌性である。例えば滅菌ろ過膜を通してろ過することにより、これを容易に達成することができる。液体形態の任意の組成物の無菌的形成、バイアルの無菌的充填および／または無菌条件下で本発明の医薬組成物を適当な希釈剤と組み合わせることは当業者に周知である。
ＦＬＴ−３阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物を本明細書にて前記にて挙げられた疾患および症状を処置するために有効である量の活性物質を含有する経腸用および非経口用医薬組成物に処方することができ、かかる組成物は単位投薬量形態であり、そしてかかる組成物は薬学的に許容される担体を含む。
【０１２２】
ＦＬＴ−３阻害剤の有用な組成物の実例は特許文献１、特許文献３２、特許文献１、特許文献３３、特許文献３４、特許文献３５に記載される。
ＦＬＴ−３阻害剤の好ましい組成物は、１９９５年６月１４日公開の特許文献３６に記載される。記載された医薬組成物は飽和ポリアルキレングリコールグリセリド中のミドスタウリンのような式Ｉの化合物の溶液または分散物を含み、ここでグリコールグリセリドは一つまたはそれより多いＣ８−Ｃ１８飽和脂肪酸のグリセリルおよびポリエチレングリコールエステルの混合物である。
【発明を実施するための形態】
【０１２３】
ＦＬＴ−３阻害剤のかかる組成物の二つの製造方法を本明細書後記に記載する。
組成物Ａ：
Gelucire４４／１４(８２部)を６０℃まで加熱することにより融解させる。粉末化されたミドスタウリン(１８部)を融解された材料に加える。得られた混合物をホモジナイズし、そして得られた分散物を様々な大きさの硬質ゼラチンカプセルに導入して、あるものはミドスタウリン２５ｍｇの投薬量を含有し、そしてあるものは７５ｍｇの投薬量を含有するようにする。得られたカプセルは経口投与に適当である。
【０１２４】
組成物Ｂ：
Gelucire４４／１４(８６部)を６０℃まで加熱することにより融解させる。粉末化されたミドスタウリン(１４部)を融解された材料に加える。混合物をホモジナイズし、そして得られた分散物を様々な大きさの硬質ゼラチンカプセルに導入して、あるものはミドスタウリン２５ｍｇの投薬量を含有し、そしてあるものは７５ｍｇの投薬量を含有するようにする。得られたカプセルは経口投与に適当である。
【０１２５】
Gelucire４４／１４はGattefosseより市販により入手可能であり；Ｃ８−Ｃ１８飽和脂肪酸のグリセロールとのエステルおよび分子量約１５００を有するポリエチレングリコールの混合物であり、脂肪酸構成成分の組成に関する明細は重量で４−１０％カプリル酸、３−９％カプリン酸、４０−５０％ラウリン酸、１４−２４％ミリスチン酸、４−１４％パルミチン酸および５−１５％ステアリン酸である。
【０１２６】
Gelucire処方の好ましい実例は：
Gelucire(４４／１４)：４７ｇ
ミドスタウリン：３.０ｇ、６０ｍｌねじ切り付きフラスコに充填
からなる。
ソフトゲルの好ましい実例は以下のマイクロエマルジョンを含有する：
コーン油グリセリド ８５.０ｍｇ
ポリエチレングリコール４００ １２８.２５ｍｇ
Cremophor ＲＨ４０ ２１３.７５ｍｇ
ミドスタウリン ２５.０ｍｇ
ＤＬアルファトコフェロール ０.５ｍｇ
無水エタノール ３３.９ｍｇ
全量 ４８６.４ｍｇ
しかしながら、それは説明目的のためだけであることを明確に理解すべきである。
【０１２７】
ＦＬＴ−３阻害剤およびｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせがそのいずれかの薬剤単独での処置よりもさらに有効であることを以下に記載される試験方法により示すことができる。確定されたこれらの研究では、全身性肥満細胞症(ＳＭ)に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物およびＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤、好ましくは４−ベンジルスタウロスポリンにより誘起される細胞周期効果およびアポトーシスが実証される。
【０１２８】
腫瘍性ヒトＭＣにおけるＭｃｌ−１の発現および機能的役割が試験される。ＡＳＭおよびＭＣＬを含むＳＭの全ての変種における原発性腫瘍性ＭＣならびにＭＣＬ細胞系ＨＭＣ−１がＭｃｌ−１を構成的な様式で発現することを示すことができる。加えてこれらの細胞におけるＭｃｌ−１のターゲティングが成長低下およびアポトーシスの誘導に、ならびにＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドおよびイマチニブを含むＴＫ阻害剤に対する感受性の増大に関連することが示される。
【０１２９】
抗ＦＬＴ−３またはホスホ(ｐ)−ＦＬＴ−３抗体を利用する新しく開発されたフローサイトメトリー(ＦＣＭ)アッセイを用いて、ＭＶ４−１１(ＭＶ)細胞はＦＬＴ−３およびｐ−ＦＬＴ−３の双方を発現するが、ＲＳ４−１１(ＲＳ)細胞はその細胞表面でＦＬＴ−３しか発現しないことが実証される。２０から２００ｎＭの好ましいＦＬＴ−３阻害剤への暴露は細胞周期Ｇ１相蓄積を用量依存的な様式で、およびＲＳ細胞よりも有意に多いＭＶのアポトーシスを誘起する。これはウェスタン分析により決定されるように、ｐ−ＦＬＴ−３、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫ１／２の著明な減衰に関連するが、ＦＬＴ−３、ＡＫＴまたはＥＲＫ１／２レベルには関連しない。好ましいＦＬＴ−３阻害剤はまたＭＶ細胞上のｐ−ＦＬＴ−３の細胞表面発現を阻止するが、ＦＬＴ−３の発現を阻止しない(ＦＣＭにより決定できるように)。好ましいＦＬＴ−３阻害剤とは対照的に、ウェスタンおよびＦＣＭ分析の双方により決定できるように、好ましいＨＤＡＩ化合物での処置はＭＶおよびＲＳ細胞におけるＦＬＴ−３およびｐ−ＦＬＴ−３双方のレベルを用量依存的な様式で減衰させる。好ましいＨＤＡＩ化合物(２０から１００ｎＭ)への暴露もまたｐ−ＦＬＴ−３、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫ１／２のレベルを下方調節する。驚くべきことに、好ましいＦＬＴ−３阻害剤および好ましいＨＤＡＩ化合物での同時処置はＭＶおよびＲＳ細胞のアポトーシスを有意に誘起する。これはＭＶ細胞におけるｐ−ＦＬＴ−３、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫ１／２のさらなる減衰に関連する。
【０１３０】
好ましくは、少なくとも一つの有益な効果、例えば第一および第二の活性成分の効果の相互増強、とりわけ相乗効果、例えば相加以上の効果、さらなる有利な効果、低副作用、第一および第二の活性成分の一つまたは双方の、組み合わせでなければ無効な投薬量で組み合わされた治療効果、ならびに特に活性成分の強力な相乗効果がある。
組み合わせ中のＦＬＴ−３阻害剤／アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物のモル比は一般的に１／１０から１０／１、好ましくは１／５から５／１、例えば１／２、１／１、２／１または３／１である。
【実施例１】
【０１３１】
材料および方法
試薬
イマチニブ(ＳＴＩ５７１)、ＰＫＣ４１２２８およびニロチニブ(４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド)２９はNovartis Pharma AG(Basel, Switzerland)により提供される。ＰＫＣ４１２および４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドのストック溶液はジメチル−スルホキシド(ＤＭＳＯ；Merck, Darmstadt, Germany)中に溶解することにより調製する。インターロイキン−４(ＩＬ−４)をPeprotech(Rocky Hill, NJ)から、ＲＰＭＩ１６４０培地およびウシ胎仔血清(ＦＣＳ)をPAA laboratories(Pasching, Austria)から、Ｌ−グルタミンおよびイスコフ改変ダルベッコ培地(ＩＭＤＭ)をGibco Life Technologies(Gaithersburg, MD)から、３Ｈ−チミジンをAmersham(Aylesbury, UK)から、そしてクラドリビン(２−クロロデオキシアデノシン、２ＣｄＡ)をJanssen−Cilag(Beerse, Belgium)から購入する。アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ；最近公開された配列にしたがって設計された)をVBC Genomics(Vienna, Austria)またはISIS Pharmaceuticals(Carlsbad, CA)から、そしてｓｉＲＮＡをDharmacon(Lafayette, CO)から入手する。
【０１３２】
患者の特徴および腫瘍性肥満細胞の精製
全身性肥満細胞症(無痛性全身性肥満細胞症、ＩＳＭ、ｎ＝１７；侵襲性全身性肥満細胞症、ＡＳＭ、ｎ＝３；肥満細胞白血病、ＭＣＬ、ｎ＝２；くすぶり型全身性肥満細胞症、ＳＳＭ、ｎ＝２；肥満細胞肉腫、ＭＣＳ、ｎ＝１)を有する全数２５人の患者を試験する。骨髄(ＢＭ)細胞を後腸骨稜細胞から入手し、そして保存剤不含ヘパリンが入ったシリンジに収集する。各々の場合で生検の前にインフォームドコンセントを得る。ＷＨＯ基準にしたがって診断を確立する。肥満細胞白血病(ＭＣＬ)を有する２人および肥満細胞肉腫(ＭＣＳ)を有する１人の患者の原発性腫瘍性ＭＣを、記載されるようにＰＥ標識ｍＡｂ ＹＢ５.Ｂ８(Pharmingen, San Diego, CA)およびＦＡＣＳ−Vantage セルソーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて均質になるまで精製する(純度＞９８％)。施設内診査委員会の承認を得て、そしてヘルシンキ宣言にしたがって、全ての実験を行う。
【０１３３】
ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するかまたは欠如するＨＭＣ−１細胞の培養
ＭＣＬ４８を有する患者の白血病細胞から作成されたヒト肥満細胞系ＨＭＣ−１を入手する(Mayo Clinic, Rochester, MN)。ＨＭＣ−１の二つのサブクローン、すなわちＫＩＴ変異Ｇ５６０Ｖを宿すがＤ８１６Ｖを宿さないＨＭＣ−１.１、ならびにＫＩＴのＧ５６０Ｖ変異およびＤ８１６Ｖ変異の双方を呈するＨＭＣ−１.２細胞を使用する。１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補充したＩＭＤＭ培地中、３７℃および５％ＣＯ２で３２個のＨＭＣ−１細胞を成長させる。ＨＭＣ−１細胞を元来のストックから４から８週毎に再解凍し、そして毎週継代する。「表現型」の対照として、ＨＭＣ−１細胞をＫＩＴの発現およびＩＬ−４(１００Ｕ／ｍｌ、４８時間)の下方調整効果に関して定期的に確認する。
【０１３４】
阻害剤での処置
ＨＭＣ−１細胞を種々の濃度のＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ−ターゲティングＴＫ阻害剤ＰＫＣ４１２(１００ｐＭから１０μＭ)、種々の濃度の４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(１ｎＭから１００μＭ)、イマチニブ(３ｎＭから３００μＭ)、２ＣｄＡ(０.１−１００００ｎｇ／ｍｌ)または対照培地と共に３７℃および５％ＣＯ２で４８時間までインキュベートする。別の一連の実験では、ＨＭＣ−１細胞を阻害剤(以下を参照)に暴露される前にｍｃｌ−１特異的ＡＳＯでトランスフェクトする。その他の実験では、細胞を種々の濃度のＭｃｌ−１特異的ＡＳＯ(５０ｎＭ−２５０ｎＭ)で１２時間まで、またはｓｉＲＮＡ(２００ｎＭ)で１２時間トランスフェクトし、さらに標的薬物に暴露することはない。薬物または／およびＡＳＯに暴露した後、細胞を３Ｈ−チミジン取り込み実験、細胞生存能力およびアポトーシスの分析またはウェスタンブロッティングに供する。
【０１３５】
ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ
Trizol(Invitrogen, Ｃarlsbad, ＣA)を製造者の説明書にしたがって使用して全ＲＮＡをＨＭＣ−１細胞から単離する。ＲＮＡ調製物およびノーザンブロッティングを本質的に記載されるように実施する。簡単には記載されるように全ＲＮＡ１５μｇを１.０％ホルムアルデヒド−アガロースゲルでサイズ分画し、そしてナイロン膜(Hybond N, Amersham, Aylesbury, U.K.)に移す。ｍｃｌ−１またはβ−アクチンに特異的な３２Ｐ標識ｃＤＮＡを用いてrapid−hyb buffer(Amersham)中でハイブリダイゼーションを実施する。記載されるようにＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いてｐＢＳＫ−Ｍｃｌ−１(Stanley J. Korsmeyer, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MAから寄贈)から全長ｍｃｌ−１ ｃＤＮＡを切り出すことによりｍｃｌ−１プローブを作成する。Megaprimeキット(Amersham)を用いて標識を実施する。０.１％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を伴う０.２×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウム、pＨ７.０)で、１時間４２℃で、２×３０分間、および６２℃でさらに３０分間ブロットを洗浄する。−８０℃で増感スクリーン(Kodak)を用いてBiomax ＭＳフィルム(Kodak, Rochester, NY)に暴露することにより結合放射活性を可視化する。E.A.S.Y. Win３２ソフトウェア(Herolab, Wiesloch, Germany)を用いてオートラジオグラムのデンシトメトリーによりｍＲＮＡ発現レベルを定量する。Protoscript First Strand ｃＤＮＡ合成キット(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて、５０μｌ反応容量で１μｇ ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を実施する。ＰＣＲ条件は以下のとおりである：９４℃で６０秒間の初期変性、５５℃で６０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合(３５サイクル)および７２℃で１０分間の最終伸長。以下のプライマー対を使用する：ｍｃｌ−１：５'-TGC TGG AGT TGG TCG GGG AA−３'(順行)(配列番号３)および５'−TCG TAA GGT CTC CAG CGC CT−３'(逆行)(配列番号４)。βアクチン：５'−ATG GAT GAT GAT ATC GCC GCG−３'(順行)(配列番号５)および５'−CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG GCC−３'(逆行)(配列番号６)。ＰＣＲ生成物を０.５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム含有１％アガロースゲルに溶解させる。
【０１３６】
ウェスタンブロット分析
ＨＭＣ−１細胞のライゼートおよびポリクローナルウサギ抗ヒトＭｃｌ−１抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を用いて前記されたようにウェスタンブロット分析を実施する。簡単には、１％Triton−Ｘ−１００(Sigma, St. Louis, MO)を含有するリン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中で細胞を溶解する。還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、そしてトランスファーバッファー中でニトロセルロース膜(Protran, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)に移す。次いで膜を抗マウス／抗ウサギＩｇＧ(BM 化学発光ウェスタンブロッティングキット、Roche)に暴露する。均等の負荷を確認するために、膜を抗βアクチン抗体(Sigma)で再プロービングする。Biomax ＭＳフィルム(Kodak)への暴露により化学発光を検出する。
【０１３７】
免疫組織化学および免疫細胞化学
ＳＭを有する全ての患者で、腫瘍性ＢＭ ＭＣにおけるＭｃｌ−１の発現をパラフィン包埋、ホルマリン固定ＢＭ標本から調製された連続切片(２μｍ)で間接的免疫ペルオキシダーゼ染色技術を用いて試験する。内因性ペルオキシダーゼをＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ２により遮断する。ポリクローナル抗Ｍｃｌ−１抗体(Santa Cruz)(作業希釈：１：５０)で染色する前に、ＢＭ切片をマイクロ波オーブンにより前処理する。連続ＢＭ切片を抗Ｍｃｌ−１抗体(一晩)および抗トリプターゼ抗体Ｇ３(作業希釈：１：５０００、室温で１時間)(Chemicon, Temecula, CA)と共にインキュベートする。抗体を０.０５Ｍ Tris緩衝生理食塩水(ＴＢＳ、ｐＨ７.５)および１％ウシ血清アルブミンＢＳＡ(Sigma)で希釈する。洗浄後、スライドをビオチン化ヤギ抗ウサギまたはウマ抗マウスＩｇＧと共に３０分間インキュベートし、洗浄し、そしてストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体に３０分間暴露する。３−アミノ−９−エチル−カルバゾール(ＡＥＣ)を色素原として使用する。スライドをMayer's Hemalaunで対比染色する。抗Ｍｃｌ−１抗体(作業希釈１：２００)およびビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ(Biocarta, San Diego, CA)を用いて記載されるようにＨＭＣ−１細胞のサイトスピン調製物で免疫細胞化学を実施する。選択実験では、Ｍｃｌ−１遮断ペプチド(Santa Cruz)を適用する(作業希釈１：４０)。色素原としてアルカリ性ホスファターゼ複合体(Biocarta)を使用する。Neofuchsin(Nichirei, Tokyo, Japan)を用いて抗体反応性を可視化する。
【０１３８】
ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)およびｓｉＲＮＡでのトランスフェクション
ＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２細胞をｍｃｌ−１特異的２'−Ｏ−メトキシエチル／２'−デオキシヌクレオチドキメラホスホロチオエートＡＳＯ(５'−TTG GCT TTG TGT CCT TGG CG−３')(配列番号７)またはスクランブル対照オリゴヌクレオチドプールでトランスフェクトする。スクランブル対照はＡ(アデニン)、Ｇ(グアニン)、Ｔ(チミン)およびＣ(シトシン)塩基の混合物を表し、得られた調製物は等モル濃度のオリゴヌクレオチドの混合物を含有する。別の一連の実験では、アニーリングされた、精製された、そして脱塩された二本鎖ｍｃｌ−１ ｓｉＲＮＡ(AAG AAA CGC GGU AAU CGG ACU)(配列番号８)およびAGU CCG AUU ACC GCG UUU CUU ３'(ｍｃｌ１、配列番号９))ならびにルシフェラーゼに対する対照ｓｉＲＮＡ(CUU ACG CUG AGU ACU UCG A)(配列番号１０)(双方共にDharmacon(Lafayette, CO)より入手)を適用する。トランスフェクション用に８０００００セルを７５ｃｍ２培養プレートに３７℃で２４時間を播種する。本質的には記載されるようにＲＰＭＩ１６４０培地中Ｍｃｌ−１−ＡＳＯおよびＭｃｌ−１ ｓｉＲＮＡをリポフェクチン試薬(Invitrogen)と複合化する。簡単には、ＨＭＣ−１.１またはＨＭＣ−１.２細胞を種々の濃度のｍｃｌ−１ ＡＳＯ(５０−２５０ｎＭ)または２００ｎＭ ｍｃｌ−１特異的ｓｉＲＮＡと共に３７℃で４時間インキュベートする。ＡＳＯへの暴露の後、細胞を洗浄し、そして１０％ＦＣＳを伴うＲＰＭＩ１６４０培地中種々の濃度のＴＫ阻害剤の存在下または不在下でさらに１２時間培養した後に分析する。ｓｉＲＮＡ処置細胞を対照培地中１２時間(ＴＫ阻害剤不含)維持した後、アポトーシス細胞のパーセンテージおよびウェスタンブロッティングに関して試験する。
【０１３９】
３Ｈ−チミジン組み込みアッセイおよび細胞生存能力の決定
Ｍｃｌ−１ ＡＳＯ、ＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド、イマチニブおよび２ＣｄＡの抗増殖効果を調べるために、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞を用いて３Ｈ−チミジン組み込み実験を行う。ＴＫ阻害剤および２ＣｄＡを未処理細胞またはＡＳＯもしくは万能(universal)(スクランブル)対照でトランスフェクトされた細胞に適用する。とりわけＭｃｌ−１ ＡＳＯまたは対照オリゴヌクレオチドでのトランスフェクションの４時間後に、細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート(５×１０４セル／ウェル)中種々の濃度のＰＫＣ４１２(１００ｐＭから１０μＭ)、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(１ｎＭから１００μＭ)、イマチニブ(３ｎＭから３００μＭ)またはクラドリビン(２ＣｄＡ；ＨＭＣ−１.１：０.１−１００００ｎｇ／ｍｌ；ＨＭＣ−１.２：０.５−５００ｎｇ／ｍｌ)の不在下または存在下で２４時間培養する。その後、１μＣｉ ３Ｈ−チミジンを各ウェルに加える。１６時間後にFiltermate １９６ハーベスター(Packard Bioscience)のろ過膜(Packard Bioscience, Meriden, CT)上で細胞を収集する。次いでろ液を空気乾燥させ、そして結合放射活性をβカウンター(Top−Count NXT, Packard Bioscience)で測定する。全ての実験を３検体ずつで実施する。トリパンブルー排除試験により細胞生存能力を決定する。従来の細胞形態学基準を用いてWright−Giemsa染色サイトスピンスライド上でアポトーシス細胞のパーセンテージを決定する。
【０１４０】
統計分析
データの評価において見出される差異の有意性のレベルを決定するために、対応のあるスチューデントｔ検定を適用する。結果はｐ＜０.０５で有意に異なると考えられる。ｍｃｌ−１ ＡＳＯおよび標的薬物の相乗効果を決定するために、市販により入手可能であるソフトウェア(CalcuSyn；Biosoft, Ferguson, MO)を用いて公開されたガイドラインにしたがって組み合わせ指標の値を計算する。
【０１４１】
結果
腫瘍性肥満細胞におけるＭｃｌ−１タンパク質の検出
方法
免疫組織化学および連続切片染色により評価されるように、試験された全てＳＭ患者において腫瘍性ＭＣはＭｃｌ−１に対する抗体と反応することが見出される(ｎ＝２５)。腫瘍性ヒト肥満細胞におけるＭｃｌ−１の発現を、無痛性ＳＭ(ＩＳＭ)を有する患者の腫瘍性ＭＣにおけるトリプターゼおよびＭｃｌ−１の免疫組織化学的検出により分析する。隣接する骨髄切片をトリプターゼまたはＭｃｌ−１に対する抗体と共にインキュベートする。免疫組織化学を記載されるように実施する。
【０１４２】
Ｍｃｌ−１発現の免疫細胞化学的検出を、ＫＩＴ変異Ｄ８１６Ｖを呈するＨＭＣ−１.２細胞においてさらに分析する。ポリクローナル抗Ｍｃｌ−１抗体を用いて免疫細胞化学を実施する。抗体を特異的遮断ペプチドと共にプレインキュベートすると陰性染色に至った。同一の染色結果はＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１.１細胞で得られる。ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞のノーザンブロット分析はｍｃｌ−１特異的ｃＤＮＡプローブおよびβアクチン負荷対照を使用する。Ｋ５６２細胞、ＨＭＣ−１.１細胞、ＨＭＣ−１.２細胞、および精製された(純度＞９８％)腫瘍性ヒト肥満細胞におけるｍｃｌ−１ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析は肥満細胞肉腫(ＭＣＳ)を有する１人の患者(＃１)および肥満細胞白血病(ＭＣＬ)を有する２人の患者(＃２および＃３)から得られる。ＰＣＲ反応はＲＴ工程を省く(−ＲＴ)ことにより制御される。
【０１４３】
結果
ＩＳＭを有する患者の紡錘形腫瘍性ＢＭ ＭＣにおいてトリプターゼおよびＭｃｌ−１の同時発現が観察される。これらの浸潤物において事実上全ての腫瘍性ＭＣがＭｃｌ−１に関して陽性に染色されることが見出される。また、種々のカテゴリーのＳＭの患者を比較した場合、免疫組織化学によりＭＣにおけるＭｃｌ−１発現(浸潤物における染色されたＭＣのパーセンテージまたは染色の強度に関して)に差異はない。とりわけＭｃｌ−１はＩＳＭおよびＳＳＭを有する患者の腫瘍性ＭＣにおいて、ならびにＡＳＭおよびＭＣＬのような高悪性度の悪性腫瘍において発現されることが見出される。免疫細胞化学により決定されるようにヒトＭＣＬ由来の白血病細胞系ＨＭＣ−１(ＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２)もまたＭｃｌ−１タンパク質を発現することが見出される。対照培地またはＭｃｌ−１特異的遮断ペプチドとのプレインキュベーションの後の抗Ｍｃｌ−１抗体のＨＭＣ−１.１細胞との反応性を実施し、そしてＨＭＣ−１.２細胞と同一の結果が得られる。
【０１４４】
腫瘍性肥満細胞におけるｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの検出
次の工程では、原発性腫瘍性ＭＣおよびＨＭＣ−１細胞におけるｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの発現を試験する。ノーザンブロッティングにより評価されるように、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞の双方がｍｃｌ−１ ｍＲＮＡを発現することが見出される。ＨＭＣ−１細胞におけるｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ分析により確認する。さらにＭＣＬまたはＭＣＳを有する患者の高度に精製された原発性腫瘍性ＭＣにおけるｍｃｌ−１ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ分析により実証することができる。
【０１４５】
Ｍｃｌ−１発現の下方調節が腫瘍性ＭＣの生存能力に対抗する
方法
ＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２細胞におけるＭｃｌ−１タンパク質発現ならびに細胞生存能力に及ぼすｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を分析する。ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを宿すＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞を２５０ｎＭ ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド、スクランブル対照でトランスフェクトするか、または１２時間トランスフェクトせずに放置した後に分析する。抗Ｍｃｌ−１抗体を用いてＭｃｌ−１発現のウェスタンブロット分析を実施する。βアクチンを負荷対照として提供する。非生存(トリパンブルー陽性)細胞の評価を全有核細胞のパーセンテージとして表現する。アポトーシス細胞の数(％)。結果は三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【０１４６】
腫瘍性肥満細胞に及ぼすｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの用量依存的および時間依存的効果を、種々の濃度のｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(５０−２５０ｎＭ)または対照培地に１２時間暴露した後のＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるＭｃｌ−１発現のウェスタンブロット分析により分析する。βアクチンを負荷対照として提供する。ＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるＭｃｌ−１タンパク質の発現に及ぼすｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(２５０ｎＭ)およびスクランブル対照(２５０ｎＭ)の時間依存的効果を観察する。負荷対照として提供されるβアクチンを用いてウェスタンブロッティングによりＭｃｌ−１発現を決定する。細胞生存能力に及ぼすｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(２５０ｎＭ)およびスクランブル対照(２５０ｎＭ)の時間依存的効果、すなわちアポトーシス性ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞のパーセンテージが得られる。結果は三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【０１４７】
結果
Ｍｃｌ−１の生存性分子としての役割およびＳＭにおける潜在的標的を調べるために、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)研究法によりＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞においてＭｃｌ−１をノックダウンする。ウェスタンブロッティングにより決定されるように、双方の細胞系のｍｃｌ−１ ＡＳＯ(２５０ｎＭ)でのトランスフェクションはスクランブル対照または非トランスフェクト細胞と比較した場合、Ｍｃｌ−１タンパク質の発現を事実上消失させた。予測されるように、ｍｃｌ−１ ＡＳＯでのトランスフェクションはトリパンブルー陽性細胞の実質的な増加(対照は約１−５％；スクランブル対照は約５−８％；ＡＳＯは約３５−５０％)および試験されたＨＭＣ−１サブクローンの双方、すなわちＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるアポトーシス細胞のパーセンテージの同様の実質的な増加を導く。腫瘍性ＭＣ(ＨＭＣ−１)の成長および生存性に及ぼすｍｃｌ−１ ＡＳＯの効果は用量依存的および時間依存的であることが見出される。これらのデータにより、ＡＳＯ研究法による腫瘍性ＭＣにおけるｍｃｌ−１のターゲティングは細胞生存能力の喪失およびアポトーシスの誘導に関連することが示される。
【０１４８】
腫瘍性肥満細胞に及ぼすｍｃｌ−１ ｓｉＲＮＡの効果
方法
腫瘍性肥満細胞におけるｍｃｌ−１−ｓｉＲＮＡの効果を、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるＭｃｌ−１タンパク質の発現および細胞生存能力に関して分析する。細胞をトランスフェクトせずに放置する(対照)か、または本明細書に記載されるようにｍｃｌ−１特異的ｓｉＲＮＡ(ｍｃｌ−１−ｓｉＲＮＡ；２００ｎＭ)もしくはルシフェラーゼ特異的(対照)−ｓｉＲＮＡ(ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ；２００ｎＭ)のいずれかでトランスフェクトする。ポリクローナル抗Ｍｃｌ−１抗体を用いるウェスタンブロッティングによりＭｃｌ−１タンパク質発現をを決定する。βアクチンに関してプロービングすることにより均等な負荷を確認する。アポトーシス細胞のパーセンテージ(％)を記録することにより細胞生存能力を分析する。結果は各一連の実験の三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【０１４９】
結果
次の工程では腫瘍性ＭＣにおける生存性関連分子および潜在的標的としてのｍｃｌ−１の役割をさらに実証するためにｍｃｌ−１特異的ｓｉＲＮＡを適用する。これらの実験では、ｍｃｌ−１ ｓｉＲＮＡはＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞においてＭｃｌ−１タンパク質の発現を下方調節することが見出される。Ｍｃｌ−１の下方調節を誘起するｓｉＲＮＡは、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるアポトーシス細胞の増加に関連することが見出される。これらのデータにより、ｍｃｌ−１が腫瘍性ＭＣにおける必須の生存性因子であるというさらなる証拠が提供された。
【０１５０】
腫瘍性肥満細胞におけるＭｃｌ−１の発現に及ぼす抗腫瘍薬および標的薬物の効果
方法
ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１.１細胞およびＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するＨＭＣ−１.２細胞におけるＭｃｌ−１タンパク質の発現および細胞生存能力に及ぼすＰＫＣ４１２、ニロチニブ(すなわち４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド)、イマチニブ(すなわちGLIVECまたはGLEEVEC)または２ＣｄＡの効果を観察する。ポリクローナル抗Ｍｃｌ−１抗体を用いるウェスタンブロッティングによりＭｃｌ−１タンパク質発現を決定する。βアクチンに関してプロービングすることにより均等な負荷を確認する。アポトーシス細胞のパーセンテージ(％)を記録することにより細胞生存能力を分析する。細胞生存能力に及ぼす薬物効果を立証する結果は三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【０１５１】
結果
次の工程ではＨＭＣ−１細胞におけるＭｃｌ−１の発現に及ぼす種々の標的薬物の効果を探索する。これらの実験では、ＰＫＣ４１２(０.３−１０μＭ)、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(１０−３００ｎＭ)およびイマチニブ(３０−３００ｎＭ)が、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１.１細胞においてＭｃｌ−１タンパク質の発現を下方調節するが、２ＣｄＡ(１０００ｎg/ｍｌまで)は下方調節しないことが見出される。ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するＨＭＣ−１.２細胞に同一の薬物(同一濃度で)を適用した場合、ＰＫＣ４１２(１−１０μＭ)および２ＣｄＡ(１０−１００ｎg/ｍｌ)が対照と比較した場合、Ｍｃｌ−１の発現を低下させることが見出されるが、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドまたはイマチニブのいずれでも、試験された用量範囲にわたって有意な効果が認められない。双方の細胞系で、薬物誘起のＭｃｌ−１タンパク質の発現の低下がアポトーシス細胞の増加を伴うことが見出される。
【０１５２】
Ｍｃｌ−１ ＡＳＯは腫瘍性ＭＣにおいて成長阻止を生じるのに、ＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(ニロチニブ)およびイマチニブと協同する。
標的薬物およびｍｃｌ−１特異的ＡＳＯの著しい効果に基づいて、薬物およびＡＳＯの組み合わせがＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞に相乗的な抗増殖(またはアポトーシス誘起)効果を招くかどうかを突き止めることは興味深い。第一工程では、各単一の薬物に関して薬物への暴露後の３Ｈ−チミジン取り込み実験およびアポトーシス細胞の数を決定する実験においてＩＣ５０値を決定する。各々の結果(ＩＣ５０値)を表１にまとめる。標的薬物に関して、データは概して以前の我々の観察に合致する。増殖を遮断するために必要とされる標的薬物の濃度は通常アポトーシスの誘起のために必要とされるものと比較して低い。以前の我々のデータと一致して、ＰＫＣ４１２および２ＣｄＡ、ならびにより低い程度で４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドは薬理学的に適当な濃度でＨＭＣ−１.２細胞における細胞成長に対抗することが見出される。対照的にＨＭＣ−１.１細胞では、ＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドおよびイマチニブは細胞成長を低下させ、そしてアポトーシスを誘起することが見出されるが、２ＣｄＡでは有意な効果が認められない。ｍｃｌ−１ ＡＳＯはＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２サブクローンの双方で増殖を阻止し、そしてアポトーシスを誘起することが見出され、ＨＭＣ−１.２細胞ではＩＣ５０値がわずかに高い。
【０１５３】
【表１】
*薬物とのインキュベーションまたはＡＳＯでのトランスフェクションの２４時間後に３Ｈ−チミジン取り込みを分析し、そして細胞を薬物と２４時間インキュベートした後にアポトーシス細胞のパーセンテージをサイトスピン調製物で決定する。アポトーシスの評価のために、ＡＳＯでのトランスフェクションの２４時間後にはアポトーシス細胞の数が全例で＞５０％になるので、１２時間後に細胞を試験する
**ニロチニブは４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドである。
【０１５４】
ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠く(ＨＭＣ−１.１)または呈する(ＨＭＣ−１.２)腫瘍性肥満細胞の成長および生存能力に及ぼすｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的薬物の効果を分析する。
【０１５５】
方法
スクランブル対照またはｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(５０ｎＭ)でトランスフェクトされたＨＭＣ−１.１細胞による３Ｈ−チミジン取り込みに及ぼす種々の濃度のＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(ニロチニブ)、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)または２ＣｄＡの効果を実施する。結果は、標的薬物を含まない対照(＝スクランブル対照)のパーセントとして表現され、そして分析された別個の三つの実験の平均±ＳＤを表す。ＰＫＣ４１２、ニロチニブ、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)もしくは２ＣｄＡを適用された、または各々の薬物を適用されないｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはスクランブル対照(各々１００ｎＭ)の細胞生存能力、すなわちアポトーシス細胞のパーセンテージ(％)に及ぼす効果を分析する。結果は三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。CalcuSynソフトウェアを用いてＨＭＣ−１.１におけるＰＫＣ４１２、ニロチニブ、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)または２ＣｄＡおよびｍｃｌ−１アンチセンス誘起のアポトーシスの用量−効果関係性の分析をChouおよびTalalayの半有効法(median effect method)にしたがって計算する。１未満の組み合わせ指標(ＣＩ)は相乗効果を示す。
【０１５６】
スクランブル対照またはｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド(８０ｎＭ)でトランスフェクトされたＨＭＣ−１.２細胞による３Ｈ−チミジン取り込みに及ぼす種々の濃度のＰＫＣ４１２、ニロチニブ、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)または２ＣｄＡの効果を分析する。結果は、標的薬物を含まない対照、すなわちスクランブル対照のパーセントとして表現され、そして別個の三つの実験の平均±ＳＤを表す。ＰＫＣ４１２、ニロチニブ、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)もしくは２ＣｄＡを適用された、または各々の薬物を適用されないｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはスクランブル対照(各々１００ｎＭ)の細胞生存能力、すなわちアポトーシス細胞のパーセンテージ(％)に及ぼす効果を分析する。結果は三つの別個の実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。CalcuSynソフトウェアを用いてＨＭＣ−１.２におけるＰＫＣ４１２、ニロチニブ、ＳＴＩ５７１(イマチニブ)または２ＣｄＡおよびｍｃｌ−１アンチセンス誘起のアポトーシスの用量−効果関係性の分析をChouおよびTalalayの半有効法(median effect method)にしたがって計算する。１未満の組み合わせ指標(ＣＩ)は相乗効果を示す。
【０１５７】
結果
ｍｃｌ−１−ＡＳＯ−トランスフェクトされたＨＭＣ−１細胞の薬物誘起の応答をスクランブル対照でトランスフェクトされたＨＭＣ−１細胞の応答と比較した場合、実質的な差異が見出される。実際に、たいていの場合でｍｃｌ−１ ＡＳＯでのトランスフェクションがＨＭＣ−１細胞をＴＫ阻害剤に対して、および２ＣｄＡに対して鋭敏にすることが見出される。興味深いことに、ＨＭＣ−１.１細胞では、たいていの組み合わせが実際に相乗的であることが見出される。それに反してＨＭＣ−１.２細胞では、相乗効果はＡＳＯおよびＰＫＣ４１２、ならびにＡＳＯおよび２ＣｄＡの組み合わせにおいてのみ認められるが、ＡＳＯおよび４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドまたはＡＳＯおよびイマチニブでは認められない。全般的に見て、これらのデータにより、Ｍｃｌ−１を腫瘍性ＭＣにおける新しい薬物標的として用いることができ、そしてｍｃｌ−１特異的ＡＳＯはＨＭＣ−１細胞を２ＣｄＡおよび新規ＴＫ阻害剤に対して鋭敏にできることが示される。
【０１５８】
考察
Ｍｃｌ−１は最近になって種々の骨髄性腫瘍の病因に関わると見なされている十分に特徴付けされたＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである。全身性肥満細胞症(ＳＭ)は内臓におけるＭＣの異常な成長および蓄積を特徴とする骨髄腫瘍である。ＳＭを有する患者の腫瘍性ＭＣおよびヒト肥満細胞白血病細胞系ＨＭＣ−１は構成的な様式でＭｃｌ−１を発現するという証拠を提供する。さらに我々のデータにより、Ｍｃｌ−１が腫瘍性ＭＣにおける非常に重要な生存性分子であり、そしてＡＳＯまたはｓｉＲＮＡによるＭｃｌ−１のターゲティングは腫瘍性ＭＣの生存性の低下およびＰＫＣ４１２または４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドを含むＫＩＴチロシンキナーゼ阻害剤に対する応答性の増大に関連することが示される。
【０１５９】
正常および腫瘍性ＭＣは好塩基球を含むたいていのその他の骨髄細胞系列と比較して極度に長寿命の細胞であるが、その長期間生存に寄与するメカニズムおよび生存性因子はほとんど未知のままである。Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーは顆粒単球細胞において必須の生存性因子として関わると見なされるが、ＭＣにおけるこれらの分子の発現および役割についてはほとんど分かっていない。これまでのところ、腫瘍性ＭＣおよびＨＭＣ−１細胞がＢｃｌ−２を発現することが報告されている。加えて、ＳＭにおける腫瘍性ＭＣはＢｃｌ−ｘＬを表示すると記載されている。この研究で、および特異的ＡＳＯおよびｓｉＲＮＡを用いる機能分析により、腫瘍性ＭＣにおけるｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでのＭｃｌ−１の発現を実証することができる。故に我々のデータに基づいて、Ｍｃｌ−１は腫瘍性ＭＣにおいて発現される重大な生存性因子として見なされなければならない。
【０１６０】
ＳＭの臨床経過は不定であり、そして低増殖能力のＭＣおよび正常な平均寿命を伴う無症候性から、腫瘍性ＭＣの急速な増殖および短い生存性を伴う高度に侵襲性の症例までにわたる。それ故にＭｃｌ−１のレベルがＳＭを有する患者の群の間で変動するかどうかを突き止めることは興味深い。しかしながら低悪性度および高悪性度のＭＣ悪性腫瘍を比較した場合、ＭＣにおけるＭｃｌ−１発現に見かけの差異はないことが検出される。Ｍｃｌ−１発現はＭＣの増殖能力よりもむしろその生存性に関係するという事実により、この観察を説明することができる。実際に、無痛性ＳＭにおいてさえ、ＭＣは極度に長い生存性を呈する。一方、Cerveroらは高度に鋭敏なフローサイトメトリー技術を用いて、ＩＳＭと比較してＭＣＬを有する患者のＢＭ ＭＣにおけるＢｃｌ−２の発現の増加を報告した。それ故に、我々の研究で適用された技術がフローサイトメトリーと比較して感受性が低いので、ＭＣＬのＭＣが、正常なＭＣまたはＩＳＭのＭＣと比較して、わずかに高レベルのＭｃｌ−１を発現するということを排除できない。
【０１６１】
腫瘍性骨髄細胞におけるＭｃｌ−１の発現の調節についてはほとんど分かっていない。慢性白血病(ＣＭＬ)では、疾患関連オンコプロテインＢＣＲ／ＡＢＬはＭｃｌ−１の発現を促すことが見出される。４６ＳＭでは、ＫＩＴのＤ８１６Ｖ変異バリアントはＣＭＬのＢＣＲ／ＡＢＬと比較されるように、類似の様式で疾患関連オンコプロテインとして提供される。オンコプロテインが腫瘍性ＭＣにおけるＭｃｌ−１の発現の調節に関与し得るかどうかを探索するために、ＫＩＴのＴＫ活性の阻害剤を利用した。これらの実験では、ＰＫＣ４１２、４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドおよびイマチニブはＨＭＣ−１.１(ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くが、ＫＩＴ Ｇ５６０Ｖを発現する)におけるＭｃｌ−１の発現を下方調節することを見出されるが、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現するＨＭＣ−１.２細胞では、ＰＫＣ４１２のみ、ならびにより低い程度で４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドがＭｃｌ−１タンパク質の発現を低下させる。ＰＫＣ４１２はＫＩＴ Ｄ８１６ＶのＴＫ活性を強力に阻止するので、そしてこの変異はイマチニブに対する抵抗性を付与するので、これらの観察は、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖが腫瘍性ＭＣにおけるＭｃｌ−１の発現異常に寄与するという仮説を支持すると解釈することができる。一方、我々のデータにより、Ｍｃｌ−１発現が検出可能であり、そしてＫＩＴ ＴＫ阻害剤がＨＭＣ−１.１細胞においてＭｃｌ−１発現を下方調節したので、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１細胞においてＫＩＴ依存性であることも示唆される。高悪性度の悪性腫瘍(ＡＳＭまたはＭＣＬ)のＭＣがしばしばＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くか、またはＴＫ標的治療の間に再発を引き起こすために選択され得る、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ陰性サブクローンを有するので、この観察はとりわけ興味深い。
【０１６２】
Ｍｃｌ−１は骨髄細胞においてアポトーシスに対抗する、十分に確立された生存性分子である。腫瘍性ＭＣにおけるＭｃｌ−１発現の機能的有意性のための証拠を提供するために、ＨＭＣ−１細胞をｍｃｌ−１特異的ＡＳＯまたはｍｃｌ−１特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトする。双方のＨＭＣ−１サブクローンで、Ｍｃｌ−１タンパク質の特異的ＡＳＯおよびｓｉＲＮＡ誘起のノックダウンがウェスタンブロッティングにより実証され、そしてアポトーシス細胞における有意な増加を伴う。加えて、ＨＭＣ−１細胞の増殖はスクランブル対照でトランスフェクトされた細胞と比較して、Ｍｃｌ−１ ＡＳＯでのトランスフェクションの後に減少する。これらのデータにより、Ｍｃｌ−１がＨＭＣ−１細胞において重要な生存性因子であるという確固とした証拠が提供される。
【０１６３】
次にｍｃｌ−１ ＡＳＯならびに２ＣｄＡおよび新規ＫＩＴ ＴＫ阻害剤を含む種々の標的薬物の増殖阻止およびアポトーシス誘起効果を比較した。これらの実験における興味深い態様は、３Ｈ−チミジン取り込みにより測定される増殖が、アポトーシスの誘導と比較した場合、低濃度のＴＫ阻害剤で抑制されるという点である。この矛盾は種々の阻害剤の効果と比較する場合、重要な意味合いを有し、そして３Ｈ−チミジンの取り込みはより感受性の高い成長のパラメーターであり、そしてアポトーシス発生の徴候の前に影響され得るという事実によりもっともよく説明され得る。
【０１６４】
ＡＳＭおよびＭＣＬは深刻な予後および短い生存性を伴う高悪性度のＭＣ悪性腫瘍である。これらの患者では、多くの異なる因子がＭＣの異常な成長および生存性に寄与し得て、そしてこれらの患者における腫瘍性細胞の成長に対抗する薬物を同定することは困難である。しかしながら過去数年の間に、高悪性度のＭＣ腫瘍における薬物抵抗性を打破する多くの新規処置概念および標的薬物が同定されている。これらの薬物のうちの一つが、Ｆｌｔ３の変異体、野生型ＫＩＴおよびＫＩＴ Ｄ８１６ＶのＴＫ活性に対抗する新規ＴＫ阻害剤、ＰＫＣ４１２である。対応して、本研究ではＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現するＨＭＣ−１.２細胞において、ＰＫＣ４１２は成長およびＭｃｌ−１発現に対抗することが見出される。成長阻止に関して、これらのデータは我々のおよびその他の以前の観察を確認する。しかしながらＰＫＣ４１２では単一の薬物としてＡＳＭまたはＭＣＬを有する患者において永続的な完全な寛解を誘起することができないかもしれない。
【０１６５】
ＴＫ駆動性、薬物抵抗性骨髄腫瘍における最も魅力的な研究法は、標的薬物を互いに、または従来の薬物と組み合わせることである。ＡＳＭまたはＭＣＬの場合、故にＰＫＣ４１２、その他のＴＫ阻害剤およびその他の標的薬物を用いる薬物の組み合わせを考慮することは合理的であり得る。我々の研究の結果により、ｍｃｌ−１ ＡＳＯおよびＰＫＣ４１２ならびにｍｃｌ−１ ＡＳＯおよび４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドは、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞において成長阻止を生じるのに互いに協同する。加えて協同効果はまたＨＭＣ−１.１細胞においてイマチニブおよびｍｃｌ−１ ＡＳＯを適用する場合にも認められる。ｍｃｌ−１ ＡＳＯとＰＫＣ４１２との間の協同的な薬物効果は双方のＨＭＣ−１サブクローンにおいて相乗的であるが、ｍｃｌ−１ ＡＳＯと４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドとの間の相互作用はＨＭＣ−１.１細胞においてのみ相乗的であるが、ＨＣＭ−１.２細胞では相乗的でないというのは興味深い観察である。これらの差異はＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを表示するＨＭＣ−１.２細胞に及ぼすＰＫＣ４１２の効果と比較して、イマチニブおよび４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドのあまり顕著でない抗増殖効果により最もよく説明される。
【０１６６】
２ＣｄＡは最近進行型ＳＭの処置のための新規の有効な腫瘍縮小薬として紹介されている薬物である。現在の研究では、２ＣｄＡがＨＭＣ−１.１細胞と比較してＨＭＣ−１.２細胞においてなおさらに強力に成長およびＭｃｌ−１発現を阻止することが見出され、ＡＳＭおよびＭＣＬを有する患者を含むたいていのＳＭの患者がこのＫＩＴ変異を表示するので、これは臨床上非常に重要であり得る。故に２ＣｄＡはこのＫＩＴ変異体を欠くＭＣにおけるように、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現するＭＣにおいてより良好に作用すると記載された最初の薬物である。しかしながらこれらの効果に関わらず、２ＣｄＡは分析された二つのＨＭＣ−１サブクローンにおいてｍｃｌ−１ ＡＳＯと相乗的な抗増殖効果を生じなかった。
【０１６７】
多くの第Ｉ／II相臨床試験で、ＡＳＯ型薬物を用いる試みが為されている。しかしながら最初の有望な結果に関わらず、過去に癌患者においてかかる薬物の適用の可能性に関していくつがが保留されている。ｍｃｌ−１およびＳＭに関して、ｍｃｌ−１ターゲティング処置の概念をＡＳＭおよびＭＣＬの臨床試験に入るのに十分なまでに発展させることができるかどうかを明確にするためにさらなる前臨床および臨床研究が必要とされるであろう。
【０１６８】
要約すると、我々のデータにより、腫瘍性ＭＣはＭｃｌ−１を発現し、そしてＭｃｌ−１のターゲティングは生存性の低下およびＰＫＣ４１２のようなＴＫ阻害剤に対する応答性の増大に関連することが示される。これらのデータにより、Ｍｃｌ−１は腫瘍性ＭＣにおける新規の興味深い標的であり、ＴＫ阻害剤に対する抵抗性を打破する助けとなり得ることが示唆される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に有効な量の(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、および(ｂ)ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物で同時に、併用的に、個別にまたは逐次的にかかる処置を必要とする哺乳動物を処置することを含む哺乳動物における骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍を処置する方法。
【請求項２】
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)を処置するための請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＬＴ−３阻害剤がスタウロスポリン誘導体または４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドまたはイマチニブである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
スタウロスポリン誘導体が式：
【化１】
または
【化２】
【化３】
または
【化４】
または
【化５】
または
【化６】
(式中、
Ｒ１およびＲ２は互いに独立して非置換もしくは置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化もしくはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一もしくは二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルであり；
ｎおよびｍは互いに独立して１以上４以下の数字であり；
ｎ'およびｍ'は互いに独立して０以上４以下の数字であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８およびＲ１０は互いに独立して水素、脂肪族、各々の場合に２９個までの炭素原子を有する炭素環式もしくは炭素環式脂肪族ラジカル、各々の場合に２０個までの炭素原子および各々の場合に９個までのヘテロ原子を有する複素環式もしくは複素環式脂肪族ラジカル、３０個までの炭素原子を有するアシルであり、ここでＲ４は不在でもよいか；
またはＲ３は３０個までの炭素原子を有するアシルであり、そしてＲ４はアシルではなく；
Ｒ４が不在である場合、ｐは０であるか、またはＲ３およびＲ４が双方共に存在し、そして各々の場合に前記のラジカルのうちの一つである場合は１であり；
Ｒ５は水素、脂肪族、各々の場合に２９個までの炭素原子を有する炭素環式もしくは炭素環式脂肪族ラジカル、または各々の場合に２０個までの炭素原子および各々の場合に９個までのヘテロ原子を有する複素環式もしくは複素環式脂肪族ラジカル、または３０個までの炭素原子を有するアシルであり；
Ｒ７、Ｒ６およびＲ９はアシルもしくは−(低級アルキル)−アシル、非置換もしくは置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化もしくはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一もしくは二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ、カルボニル、カルボニルジオキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルであり；
Ｘは２個の水素原子；１個の水素原子およびヒドロキシ；Ｏ；または水素および低級アルコキシを意味し；
Ｚは水素または低級アルキルを表し；
そして波線で特徴付けられた２個の結合は環Ａで不在であり、４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ｂの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；
または波線で特徴付けられた２個の結合は環Ｂで不在であり、全部で４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ａの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；
または環Ａおよび環Ｂの双方で４個の波線の結合の全てが不在であり、全部で８個の水素原子により置き換えられているかのいずれかである)
の化合物または少なくとも一つの塩形成基が存在する場合はその塩から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
スタウロスポリン誘導体が式Ｉ：
【化７】
(式中、
ｍおよびｎは各々０であり；
Ｒ３およびＲ４は互いに独立して水素、
カルボキシ；低級アルコキシカルボニル；およびシアノから互いに独立して選択されるラジカルにより非置換または一もしくは二置換された、特に一置換された低級アルキルであるか；または
Ｒ４は水素もしくは−ＣＨ３であり、そして
Ｒ３は部分式Ｒｏ−ＣＯのアシルであり、式中Ｒｏは低級アルキルである；アミノ−低級アルキル、ここでアミノ基は非保護形態で存在するか、または低級アルコキシカルボニルにより保護されている；テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル；フェニル；イミダゾリル−低級アルコキシフェニル；カルボキシフェニル；低級アルコキシカルボニルフェニル；ハロゲン−低級アルキルフェニル；イミダゾール−１−イルフェニル；ピロリジノ−低級アルキルフェニル；ピペラジノ−低級アルキルフェニル；(４−低級アルキルピペラジノメチル)フェニル；モルホリノ−低級アルキルフェニル；ピペラジノカルボニルフェニル；もしくは(４−低級アルキルピペラジノ)フェニルであるか；
または部分式Ｒｏ−Ｏ−ＣＯ−のアシルであり、式中、Ｒｏは低級アルキルであるか；
または部分式ＲｏＨＮ−Ｃ(＝Ｗ)−のアシルであり、式中、Ｗは酸素であり、そしてＲｏは以下の意味を有する：モルホリノ−低級アルキル、フェニル、低級アルコキシフェニル、カルボキシフェニルもしくは低級アルコキシカルボニルフェニル；
またはＲ３は低級アルキルフェニルスルホニル、典型的には４−トルエンスルホニルであり；
Ｒ５は水素または低級アルキルであり、
Ｘは２個の水素原子またはＯを意味し；
Ｚはメチルまたは水素である)
のスタウロスポリン誘導体または少なくとも一つの塩形成基が存在する場合、その塩である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
スタウロスポリン誘導体が式(VII)：
【化８】
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍を処置するための(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤および(ｂ)ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせの使用。
【請求項８】
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、結腸直腸癌(ＣＲＣ)または非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)を処置するための請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＦＬＴ−３阻害剤が式(VII)：
【化９】
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩およびｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物である請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍の処置のための医薬品の調製のための(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤および(ｂ)ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせの使用。
【請求項１１】
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、結腸直腸癌(ＣＲＣ)または非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)を処置するための請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ＦＬＴ−３阻害剤が式(VII)：
【化１０】
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩およびｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物である請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍の処置のための(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤および(ｂ)ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物を含む医薬組成物。
【請求項１４】
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、結腸直腸癌(ＣＲＣ)または非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)を処置するための請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＦＬＴ−３阻害剤が式(VII)：
【化１１】
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩およびｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物である請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号９またはその相補鎖配列から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１８】
ベクターが発現ベクターである請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１６に記載の単離された核酸を含む宿主細胞。
【請求項２０】
配列番号７、配列番号８および配列番号９またはその相補鎖配列から選択される配列を含む短鎖ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)。
【請求項２１】
配列番号３および配列番号４またはその相補鎖配列から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１】
医薬的に有効な量の(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、および(ｂ)ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物で同時に、併用的に、個別にまたは逐次的にかかる処置を必要とする哺乳動物を処置することを含む哺乳動物における骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍を処置する方法。
【請求項２】
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)を処置するための請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＬＴ−３阻害剤がスタウロスポリン誘導体または４−メチル−３−[[４−(３−ピリジニル)−２−ピリミジニル]アミノ]−Ｎ−[５−(４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミドまたはイマチニブである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
スタウロスポリン誘導体が式：
【化１】
または
【化２】
【化３】
または
【化４】
または
【化５】
または
【化６】
(式中、
Ｒ１およびＲ２は互いに独立して非置換もしくは置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化もしくはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一もしくは二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルであり；
ｎおよびｍは互いに独立して１以上４以下の数字であり；
ｎ'およびｍ'は互いに独立して０以上４以下の数字であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８およびＲ１０は互いに独立して水素、脂肪族、各々の場合に２９個までの炭素原子を有する炭素環式もしくは炭素環式脂肪族ラジカル、各々の場合に２０個までの炭素原子および各々の場合に９個までのヘテロ原子を有する複素環式もしくは複素環式脂肪族ラジカル、３０個までの炭素原子を有するアシルであり、ここでＲ４は不在でもよいか；
またはＲ３は３０個までの炭素原子を有するアシルであり、そしてＲ４はアシルではなく；
Ｒ４が不在である場合、ｐは０であるか、またはＲ３およびＲ４が双方共に存在し、そして各々の場合に前記のラジカルのうちの一つである場合は１であり；
Ｒ５は水素、脂肪族、各々の場合に２９個までの炭素原子を有する炭素環式もしくは炭素環式脂肪族ラジカル、または各々の場合に２０個までの炭素原子および各々の場合に９個までのヘテロ原子を有する複素環式もしくは複素環式脂肪族ラジカル、または３０個までの炭素原子を有するアシルであり；
Ｒ７、Ｒ６およびＲ９はアシルもしくは−(低級アルキル)−アシル、非置換もしくは置換アルキル、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル化もしくはエステル化ヒドロキシ、アミノ、一もしくは二置換アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、置換メルカプト、カルボキシ、カルボニル、カルボニルジオキシ、エステル化カルボキシ、カルバモイル、Ｎ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換カルバモイル、スルホ、置換スルホニル、アミノスルホニルまたはＮ−一もしくはＮ,Ｎ−二置換アミノスルホニルであり；
Ｘは２個の水素原子；１個の水素原子およびヒドロキシ；Ｏ；または水素および低級アルコキシを意味し；
Ｚは水素または低級アルキルを表し；
そして波線で特徴付けられた２個の結合は環Ａで不在であり、４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ｂの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；
または波線で特徴付けられた２個の結合は環Ｂで不在であり、全部で４個の水素原子により置き換えられ、ならびに環Ａの２本の波線の各々は各平行の結合と一緒に二重結合を示すか；
または環Ａおよび環Ｂの双方で４個の波線の結合の全てが不在であり、全部で８個の水素原子により置き換えられているかのいずれかである)
の化合物または少なくとも一つの塩形成基が存在する場合はその塩から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
スタウロスポリン誘導体が式Ｉ：
【化７】
(式中、
ｍおよびｎは各々０であり；
Ｒ３およびＲ４は互いに独立して水素、
カルボキシ；低級アルコキシカルボニル；およびシアノから互いに独立して選択されるラジカルにより非置換または一もしくは二置換された、特に一置換された低級アルキルであるか；または
Ｒ４は水素もしくは−ＣＨ３であり、そして
Ｒ３は部分式Ｒｏ−ＣＯのアシルであり、式中Ｒｏは低級アルキルである；アミノ−低級アルキル、ここでアミノ基は非保護形態で存在するか、または低級アルコキシカルボニルにより保護されている；テトラヒドロピラニルオキシ−低級アルキル；フェニル；イミダゾリル−低級アルコキシフェニル；カルボキシフェニル；低級アルコキシカルボニルフェニル；ハロゲン−低級アルキルフェニル；イミダゾール−１−イルフェニル；ピロリジノ−低級アルキルフェニル；ピペラジノ−低級アルキルフェニル；(４−低級アルキルピペラジノメチル)フェニル；モルホリノ−低級アルキルフェニル；ピペラジノカルボニルフェニル；もしくは(４−低級アルキルピペラジノ)フェニルであるか；
または部分式Ｒｏ−Ｏ−ＣＯ−のアシルであり、式中、Ｒｏは低級アルキルであるか；
または部分式ＲｏＨＮ−Ｃ(＝Ｗ)−のアシルであり、式中、Ｗは酸素であり、そしてＲｏは以下の意味を有する：モルホリノ−低級アルキル、フェニル、低級アルコキシフェニル、カルボキシフェニルもしくは低級アルコキシカルボニルフェニル；
またはＲ３は低級アルキルフェニルスルホニル、典型的には４−トルエンスルホニルであり；
Ｒ５は水素または低級アルキルであり、
Ｘは２個の水素原子またはＯを意味し；
Ｚはメチルまたは水素である)
のスタウロスポリン誘導体または少なくとも一つの塩形成基が存在する場合、その塩である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
スタウロスポリン誘導体が式(VII)：
【化８】
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍を処置するための(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤および(ｂ)ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせの使用。
【請求項８】
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、結腸直腸癌(ＣＲＣ)または非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)を処置するための請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＦＬＴ−３阻害剤が式(VII)：
【化９】
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩およびｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物である請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍の処置のための医薬品の調製のための(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤および(ｂ)ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物の組み合わせの使用。
【請求項１１】
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、結腸直腸癌(ＣＲＣ)または非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)を処置するための請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ＦＬＴ−３阻害剤が式(VII)：
【化１０】
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩およびｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物である請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
骨髄異形成症候群、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍の処置のための(ａ)ＦＬＴ−３阻害剤および(ｂ)ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物を含む医薬組成物。
【請求項１４】
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、結腸直腸癌(ＣＲＣ)または非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)を処置するための請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＦＬＴ−３阻害剤が式(VII)：
【化１１】
のＮ−[(９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３',２',１'−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアゾニン−１１−イル]−Ｎ−メチルベンズアミドまたはその塩およびｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｃｌ−１特異的ＲＮＡｉ構築物である請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号９またはその相補鎖配列から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１８】
ベクターが発現ベクターである請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１６に記載の単離された核酸を含む宿主細胞。
【請求項２０】
配列番号７、配列番号８および配列番号９またはその相補鎖配列から選択される配列を含む短鎖ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)。
【請求項２１】
配列番号３および配列番号４またはその相補鎖配列から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【公表番号】特表２００９−５４１２４０（Ｐ２００９−５４１２４０Ａ）
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１５７７４（Ｐ２００９−５１５７７４）
【出願日】平成１９年６月２２日（２００７．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００５５１７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４７６１３
【国際公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２２日（２００７．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００５５１７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４７６１３
【国際公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
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