スーパーオキサイド発生剤およびその製造方法
【課題】取り扱いやすく、副産物を生じず、スーパーオキサイドだけを発生でき、しかも培地中においても、長時間スーパーオキサイドを発生できるスーパーオキサイド発生デバイスを提供する。
【解決手段】スーパーオキサイド発生剤の製造方法は特定の配列を有し、ヒト由来蛋白質Ｒａｃ変異体のアミノ酸配列よりなる第１のタンパク質と、特定の配列を有し、ヒト由来酵素ｐ６７ｐｈｏｘとｐ４７ｐｈｏｘの融合体蛋白質のアミノ酸配列よりなる第２のタンパク質と、シトクロムｂ558を含む溶液に１−メチル３−（３ジメチルラミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド（ＮＨＳ）を加えることを特徴とする。
【解決手段】スーパーオキサイド発生剤の製造方法は特定の配列を有し、ヒト由来蛋白質Ｒａｃ変異体のアミノ酸配列よりなる第１のタンパク質と、特定の配列を有し、ヒト由来酵素ｐ６７ｐｈｏｘとｐ４７ｐｈｏｘの融合体蛋白質のアミノ酸配列よりなる第２のタンパク質と、シトクロムｂ558を含む溶液に１−メチル３−（３ジメチルラミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド（ＮＨＳ）を加えることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーオキサイドの作用を調査する試験のための、スーパーオキサイドを発生させる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキサイド（Ｏ2-）が細胞に与える酸化ストレスは、様々な疾病の原因として近年注目されている。その疾病には、動脈硬化、高血圧、ガン、脳神経疾患などを始め、広く胃潰瘍、白内障なども含まれており、いずれも現代社会において大きな問題となっているものである。したがって、スーパーオキサイドの各々の細胞、組織におよぼす影響を調べることは、治療や診断の基礎として重要な課題である。しかし、これまでスーパーオキサイドを温和な条件下で発生させる適切な方法がなかったため、細胞ないしは組織レベルで調べることが困難であった。
【０００３】
従来スーパーオキサイド発生デバイスとして使用されていたのはキサンチンオキシダーゼであった（例えば非特許文献１）。一方、非特許文献２には、温和な条件で使用できるスーパーオキサイド発生デバイスが記載されている。
【非特許文献１】Barnes, K.A., Samson,S.E., and Grover, A.K. (2000) Molecular and Cellular Biochemistry, 203, 17-21
【非特許文献２】Minoru Tamura, etal. (2004)第７７回日本生化学会大会発表抄録集９８７頁、日本生化学会
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１に記載されたキサンチンオキシダーゼによる方法においては、１）基質のキサンチンが溶けにくい、２）スーパーオキサイド以外に過酸化水素も発生する、３）副産物として尿酸を生じる、４）冷凍保存により別の酵素に変換する、などの問題点がある。中でも、副産物として生じる尿酸はスーパーオキサイドから生じる活性酸素ＯＨラジカルと反応して無害化してしまうため、スーパーオキサイド発生デバイスとしては致命的である。
【０００５】
一方、白血球酵素ＮＡＤＰＨオキシダーゼにはこのような欠点がなく強力なスーパーオキサイド発生能をもつが、反面、そのままでは活性がなく、活性化するためには多くの因子が要ること、活性化の手順が煩雑であること、そして酵素が不安定であること、などの問題があり、スーパーオキサイド発生デバイスとして用いることは考えられなかった。非特許文献２に記載されたスーパーオキサイド発生デバイスは、冷凍保存が可能であり、しかもバッファー液中で長時間スーパーオキサイドを発生することができる。しかし、培地中においても、長時間スーパーオキサイドを発生できることが望まれる。
【０００６】
この発明は、取り扱いやすく、副産物を生じず、スーパーオキサイドだけを発生でき、しかも培地中においても、長時間スーパーオキサイドを発生できるスーパーオキサイド発生デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を解決するために、本発明のスーパーオキサイド発生剤の製造方法は配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列よりなる第１のタンパク質と、配列番号２に示すアミノ酸配列よりなる第２のタンパク質と、シトクロムｂ558を含む溶液に１−メチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド（ＮＨＳ）を加えることを特徴とする。
【０００８】
これに加えて、ＥＤＣとＮＨＳを加えた後、実質的に２５℃で２５分以上３５分以下保つ工程を有することにより、スーパーオキサイド発生剤の安定性はさらに向上する。
【０００９】
上述の製造方法によって製造されるスーパーオキサイド発生剤は、新規な物質である。使用時において、副産物を生じず、スーパーオキサイドだけを発生でき、しかも培地中でも長時間にわたってスーパーオキサイドを発生させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
この発明を実施するための最良の形態について説明する。図１はこの発明のスーパーオキサイド発生剤の構成と作用を示す概念図である。なお、図１においてタンパクの架橋は表示されていない。
【００１１】
スーパーオキサイド発生剤は、第１のタンパク質（図１の符号１、以下単に「タンパク質１」と表示する）、第２のタンパク質（図１の符号２、以下単に「タンパク質２」と表示する）と、シトクロムb558（図１の符号３）を含む。ここで、タンパク質１はヒトＲａｃの変異体であり、ＲａｃＱ６１Ｌと表示される。タンパク質２は、ヒトｐ６７phoxとｐ４７phoxの融合タンパク質であり、ｐ６７Ｎ−ｐ４７Ｎと表示される。タンパク質１（ヒトＲａｃ変異体）のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示される。また、タンパク質２のアミノ酸配列は配列番号１に示される。
【００１２】
タンパク質１とタンパク質２の製造方法の例を説明する。
【００１３】
タンパク質１（Ｒａｃの変異体）は以下のように製造した。
配列表の配列番号３はヒトＲａｃのcＤＮＡ配列を示す。６１番目のアミノ酸残基グルタミンのコドン（ＣＡＡ）をロイシンのコドン（ＣＴＡ）に置換した。遺伝子変異はＲａｃのｃＤＮＡを含むｐＧＥＸ-２Ｔベクター（商品名、アマシャム社）上でＱｕｉｋ Ｃｈａｎｇｅ （商品名：ストラタジーン社）を用いて行った。変異導入には次の２本のプライマーを用いた。すなわち、
5' GGATACAGCTGGACTAGAAGATTATGACAG 3' とその相補的配列である
5' CTGTCATAATCTTCTAGTCCAGCTGTATCC 3'
（配列中の下線部が変異部分）
【００１４】
タンパク質２（ｐ６７Ｎとｐ４７Ｎの融合の融合タンパク）は以下のように製造した。
配列表の配列番号４はｐ６７のcＤＮＡ配列を、配列番号５はｐ４７のcＤＮＡ配列をそれぞれ示す。 pGEX-2Tに組み込まれていたp６７からp６７N (1-210) にあたる塩基配列を下記のプライマーを使って増幅した。
5'-プライマー 5'-CGTggatccATGTCCCTGGTGGAGGCC-3'
3'-プライマー 5'-GATgaattcACTATCCACCACAGATGC-3'
ここで下線部はそれぞれ開始コドンを示す。5'側にはBam HIサイト(小文字）をまた3'側にはEcoRIサイト（小文字）をリンカーとしてつけた。 増幅したp67NのcDNAをゲル電気泳動で分離したのち、EcoRIで両端のリンカーを刈り込んだのち、同じくEcoRIで切断したpGEX-2Tベクターと混ぜて対合させ、DNA ligaseで結合させた。
p47Nの遺伝子はpVL1393ベクターに組み込まれていたものを次のプライマーを使ってPCR増幅した。
5'-プライマー 5'-GATgaattcATGGGGGACACCTTCATCC-3'
3'-プライマー 5'-GATgaattcTCAGACGGCAGACGCCAGC-3'
ここで下線部はそれぞれ開始コドンおよび終止コドンである。両端には
EcoRIサイト(小文字）のリンカーをつけた。 増幅したcDNAをゲル電気泳動で分離したのち、EcoRIで処理して両端のリンカーを刈り込んだ。これを上述のp67N cDNAを組み込んだpGEX-2Tベクターと混ぜ、DNA-ligaseでつないだ。
【００１５】
目的タンパク質 を発現する組み換えベクターを含む大腸菌BL-21のグリセロールストックから、滅菌した楊枝で5本の試験管中のLB-Amp培地（各４ml）に植菌。37℃で一晩、振盪培養した。次に2リットルのLB-Amp培地へ移し、37℃でインキュベートしながら、エアーポンプで大量の空気を培養液に送った。この際、培養液の泡立ちを抑えるため、アンチフォーム（商品名、シグマ社） を少量加えた。菌体の培養を3.5時間行い、終濃度0.1 mM のIPTGを加え、さらに2.5時間培養して菌体内に目的タンパクを発現させた。なお、p67N-p47N融合タンパク質の場合、不溶化を防ぐためIPTGの終濃度を0.05 mMに下げ、誘導時の温度を25℃で行った。
【００１６】
培養終了後ただちに培養液を遠心ボトルに移し、氷冷する。完全に氷冷された培養液を6,200×g、４℃で10 分間遠心した。沈殿に適量のSTE Bufferを加え、よくほぐし、同様に遠心を行った。このSTE Bufferによる洗浄を２回行い、菌体を集菌した後、ひとまず80℃に凍結した。
【００１７】
凍結させた菌体に氷冷されたLysis Buffer 50 ml（使用直前に各種プロテアーゼインヒビターを添加）を加え，激しくシェイクして沈殿をほぐし、ミニディスクローターを用いて室温で３０分間穏やかに混ぜた。溶菌後、DNase I処理により、DNAを切断した。ライゼート50 mlに対し、10 mg/ml DNaseIを36μl、0.1M MgCl2 を2.64 ml、Brij を50 mg加え、激しくシェイクして、氷上で15 分間インキュベートした。その後、35,000×g、４℃で10 分間遠心し、上澄みを回収後、あらかじめ平衡化しておいたG-Sepharose （商品名、アマシャム社）2mlを回収した上澄み液に加え、ミニディスクローターにセットし4℃で一晩穏やかに混ぜ、目的タンパク質を吸着させた。
【００１８】
その後、500×g、4℃で5 分間遠心しG-Sepharose ビーズを沈殿させた。上澄みを除去しPBSを加え、ミニディスクローターで10 分間穏やかに撹拌後、500×g、4℃で5 分間遠心し、上澄みを除去した。この操作をPBSで2回、0.5% Triton X-100で2回、BufferIで2回行い、不純タンパクを除去した。その後、ペレット化したビーズにBufferIを等量加え、静かにほぐした。スラリー化したG-Sepharoseを4本のエッペンチューブに移した。
【００１９】
次に部位特異的プロテアーゼのスロンビンでG-Sepharose ビーズに結合したGST結合タンパク質間の切断を行った。室温で20 ユニットのスロンビンを加え、ディスクローターで穏やかに撹拌し、30 分間反応させ、さらにスロンビンを20 units追加し同様に室温で30 分間反応させた。
【００２０】
その後、500×g、4℃で10 分間遠心し、ビーズを沈殿させた。上澄みには目的タンパク質が溶出されており、回収後、BufferIでスラリーにし、15 ml培養チューブへ移したのちBufferIを入れ、ディスクローターで穏やかに10 分間撹拌後、500×g、4℃で5 分間遠心し、上澄みを回収した。この操作を2回繰り返しG-Sepharoseに残っている目的タンパク質を取り出した 。混入したビーズを除去するために溶出液をウルトラフリーMC（0.22μm, ミリポア社） にかけ、得られた目的タンパク質のスロンビンによる切断を防ぐためDIFP２μｌを加え、20 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0) で4℃、2 時間×2回、透析を行った後、アミコンウルトラ (ミリポア社) で濃縮した。
【００２１】
なお、上述の各成分について、以下に説明を示す。
IPTG: イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトース
・LB-Amp
LB培地を滅菌後、アンピシリンを５０μｌ／mlに加えたもの
・STE Buffer
10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
1 mM EDTA (pH 8.0)
150 mM NaCl
・Lysis Buffer
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
5 mM DTT
1 mM EDTA (pH 7.5)
0.25 mg/ml デオキシコール酸ナトリウム
400μｇ/ml Lysozyme
[インヒビター]
0.2 mM PMSF
10μｇ/ml Aprotinin (p67N-p47N では 1 mM DIFPを使用。)
・PBS Buffer
50 mM NaCl
50 mM KCl
8m M Na2HPO4
1.5 mM KH2PO4
・BufferI
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
50 mM NaCl
2.5 mM CaCl2
【００２２】
ついで、シトクロムb558の製造方法の例について説明する。
【００２３】
ブタの血液３リットルをガーゼでこしたのち、３％(w/v) ポリビニルピロリドン（K-９０）水溶液を670 ml加える。良く撹拌し室温で45分間静置して赤血球を沈ませた後、上層を採取し、750 x g、20分間遠心する。上清を捨てて遠心ボトルの底をたたいて沈澱をほぐし、低張液0.2%(w/v)NaCl溶液100 mlを加え30秒間手で震盪し、赤血球を破裂させる。素早く1.6%(w/v)NaCl溶液を100mlを加えて等張にもどす。750 x g、15 分間遠心して上清を捨て、沈澱を0.9 %(w/v)NaCl溶液200 mlに懸濁して750 x g、20 分間遠心する。沈澱を再び生理食塩水に懸濁したのち、50 ml培養チューブにリンパ球分離液を25 ml入れた上に乗せる。800 x g、30 分間遠心後、沈澱以外の層は除去する。沈澱をPBSに懸濁し、450 x g、10分間遠心して洗浄したのち、再懸濁する。DIFPを終濃度2 mMになるように加え、０℃で20 分置いたのち、400 x g20分間遠心し、沈澱をBuffer Aに5 x 108個/mlの濃度で懸濁する。-80 ℃に保存する。
【００２４】
好中球を1 X 108 個／mlの濃度になるようにBuffer Aで希釈し、細胞破砕器中で窒素圧34気圧を20分かけたのち、終濃度2.5 mMになるようにEGTAを加えたビーカー中にノズルより放出させる。800×g、4℃、10 分間遠心後、上澄みを回収する。その後、ショ糖密度勾配遠心分離により、サイトソルと形質膜を分離する。下から順に50 %(w/v) そして 30 %(w/v)スクロースを含むBuffer A (1mM EGTA入り)の上にサンプルを上層し、150,000×g、4℃、1時間で遠心後 50%と30%層の間にある部分(形質膜)を回収し、Buffer Sで倍量に希釈後、NaCl水溶液を終濃度1Mになるように加え懸濁したあと、150,000×g、4℃、1時間で再び遠心して、余分な膜タンパクを除くと共に形質膜を沈澱させる。沈澱にBuffer Kを加え超音波をかけて懸濁させる。
【００２５】
20 %(w/v) n-ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド(終濃度1.5%)で可溶化し、ただちに100,000×gで1時間遠心する。上澄みを回収し、16 %(v/v)グリセロールを含むBuffer Hで平衡化した3層カラム (DEAE-Sepharose、ω-aminooctyl-agarose、CM-Sepharose（いずれも商品名、アマシャム社))へ流す。素通り画分を回収し、8 %(v/v)グリセロールを含むBuffer Hで平衡化したHeparin-Sepharoseカラムに吸着させた後、NaCl勾配 (0.05−1.5M) により溶出させる。ピークを回収後、遠心濃縮器Amicon ultra (分画 50kD, ミリポア社)で濃縮したのち、再脂質化する。再脂質化は、リン脂質濃度1mg／ml buffer Aになるように調製されたリン脂質混合液 (PC : PE : PI : SM : cholesterol = 31 : 3 : 29 : 25 : 12 wt%)を精製シトクロムb558液に等量加え、かるく混ぜる。これを適当に小分けし−80℃で保存する。
【００２６】
以上、使用された各成分について以下に説明する。
DIFP: diisopropyl fluorophosphate
・Buffer A
200 mM PIPES (pH 7.4 )
180 mM NaCl
600 mM KCl
23m M MgCl2・6H2O
1 mM PMSF
1 μg/ml TLCK
1 mM ATP
6 %(w/v) スクロース
・Buffer S
50 mM PIPES (pH 7.4)
140 mM NaCl
1 mM EGTA
1 mM PMSF
・Buffer K
50 mM PIPES (pH 6.5 )
50 mM NaCl
1 mM EGTA
16 %(v/v) グリセロール 1 mM PMSF
0.5 mM DTT
・Buffer H
50 mM PIPES (pH 6.5)
50 mM NaCl
1 mM PMSF
0.2 mM DTT
１μｇ/ml TLCK
0.5 % (w/v) n-ヘプチル-・-D-チオグルコシド
【００２７】
本発明のスーパーオキサイド発生剤は、酵素成分である第２のタンパク質２を高濃度に含むことが好ましい。一般的には、酵素成分を使用する際に、ＥＣ50（最大反応速度の５０％の反応速度を達成する濃度）を基準に選択され、例えば、ＥＣ50の５倍もの濃度にすれば最大反応速度になると考えるのが通常である。しかし、本実施形態では、この通常選択される濃度よりも高い濃度で第２のタンパク質２を混入する。p67N-p47Nの酵素活性化におけるEC50 は０．１μＭである。しかし、本実施形態においてはＥＣ50の３０倍以上の濃度で調製した。このような濃度にすることによって、凍結保存後も活性が残るようになり、１２５倍以上にすることで殆ど失活なしに凍結保存できるようになる。本例においてＥＣ50の１２５倍以上とは、１２．５μＭ以上の濃度に対応する。また、第１のタンパク質もＥＣ50（０．０６μＭ）の５０倍以上の濃度で凍結保存後も活性が残るようになり、２００倍以上にすることで殆ど失活なしに凍結保存できるようになる。すなわち、第１のタンパク質の濃度は１２μＭ以上で調製することが好ましい。
【００２８】
このような高濃度は常識とは全く異なるものであるが、これによって全体のタンパク量を一定以上にして凍結に耐えうるようにできるということが判明した。
【００２９】
以上のようにして調製された混合物は、そのままでもバッファー液中でスーパーオキサイド発生剤として使用可能であるが、本発明においては、培地中での安定性を向上させるために、１−メチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド（ＮＨＳ）を加える処理を行う。この処理の例について、以下、詳細に説明する。
【００３０】
まず、００２７段落までに示した手順で調製した混合液を９０μｌ使用する。この混合液中には、第１のタンパク質が２５μＭ、第２のタンパク質が２５μＭ、シトクロムb558が１．０μＭの濃度でそれぞれ含まれている。これに、ｐＨ７．０のＰＩＰＥＳが５０ｍＭとＭｇＣｌ2が８ｍＭの溶液を８００μｌ、１ｍＭのＦＡＤを９μｌ加えて９００μｌの溶液とする。この溶液を５分間２５℃に保った。
【００３１】
この９００μｌの溶液を４５０μｌずつに分けて２つのサンプルとする。第１のサンプルに２００ｍＭのＥＤＣ２５μｌと１００ｍＭのＮＨＳ２５μｌを加えて、５００μｌの溶液とする。この溶液中で、ＥＤＣは１０ｍＭ、ＮＨＳは５ｍＭの濃度である。第２のサンプルにはＥＤＣのみを加え、ＮＨＳは加えない。
【００３２】
こうして得られたそれぞれのサンプルを実質的に２５℃で２５分以上３５分以下保った。このように、温度処理することによって、製造されるスーパーオキサイド発生剤の質が向上する。その中でも３０分保持するのが特に好ましい。
【００３３】
こうして得られた溶液中には、不要なＥＤＣが残存しているので、透析によってこれを除去する。外液として、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１０μｌのＦＡＤ、２０％のグリセロールを使用する。得られた第１のサンプルを透析チューブに入れ、外液５００ｍｌ中に２時間置く。この間、外液を５℃に保ちながら撹拌する。その後、外液を交換し、さらに２時間撹拌する。このようにして、過剰なＥＤＣは取り除かれる。外液中には内液と同程度の濃度のＦＡＤが含まれているので、内液からＦＡＤが消失することが防止される。以上で、この発明のスーパーオキサイド発生剤の一例が製造される。なお、第２のサンプルも同様に透析し、比較用のスーパーオキサイド発生剤とする。
【００３４】
このようにして製造されたスーパーオキサイド発生剤は、これまでにない新規な物質である。架橋剤であるＥＤＣによって、スーパーオキサイド発生剤内のタンパク質成分に架橋が形成されたと推定されるが、ＥＤＣとＮＨＳによる処理によって、スーパーオキサイド発生剤はより安定になる。バッファー液中はもとより、培地中でも安定であり、長時間にわたってスーパーオキサイドの発生が継続する。
【実施例１】
【００３５】
つぎに、この発明の実施例について説明する。サンプル１（ＥＤＣとＮＨＳによる処理）より得られたスーパーオキサイド発生剤を実施例として使用する。一方、サンプル２（ＥＤＣのみによる処理）より得られたスーパーオキサイド発生剤を第１の比較例として使用する。また、ＥＤＣやＮＨＳによる処理を全く行っていないものを第２の比較例として使用する。
【００３６】
２７６μｌの培地に実施例のスーパーオキサイド発生剤、第１の比較例、第２の比較例をそれぞれ１２．６μｌ加え、３７℃に保ちながら、スーパーオキサイドの発生量の時間変化を測定する。
【００３７】
スーパーオキサイドの発生量の測定方法について説明する。試験開始時点、および所定時間経過後に、一定量のサンプルを採取し、シトクロムＣを含む溶液中に加える。加えたサンプルがＯ2-を発生すると、シトクロムＣが発色する。この発色の度合いを測定し、スーパーオキサイドの発生能力を比較する。測定は、試験開始時点および１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分、３００分経過時に行った。
【００３８】
図２は、スーパーオキサイドの発生能力の時間変化を示すグラフである。ＥＤＣやＮＨＳによる処理を全く行っていない第２の比較例では、１５分後にはスーパーオキサイドの発生能力が著しく低下する。ＥＤＣのみによる処理を行った第１の比較例では、スーパーオキサイドの発生の持続力はやや向上し、半減期は約２０分であった。ＥＤＣとＮＨＳにより処理された実施例では、安定性が著しく向上しており、半減期は約２００分になった。５時間経過後でもなお４０％以上のスーパーオキサイドの発生能力が維持されていた。
【００３９】
以上、第１のタンパク質、第２のタンパク質およびシトクロムｂ558を含む溶液にＥＤＣとＮＨＳによる処理を行うことによって、培地中でも長時間スーパーオキサイドを発生できる安定なスーパーオキサイド発生剤が製造できる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、細胞や組織に対するスーパーオキサイドの作用を調べるためのスーパーオキサイドの発生剤として利用することができる。また、酸化ストレス実験ツール、スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）アッセイキット、さらにSODを共存させれば過酸化水素発生デバイスとしても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】スーパーオキサイド発生剤の構成と作用を示す概念図である。
【図２】スーパーオキサイドの発生能力の時間変化を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４２】
１．第１のタンパク質（タンパク質１）
２．第２のタンパク質（タンパク質２）
３．シトクロムb558
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーオキサイドの作用を調査する試験のための、スーパーオキサイドを発生させる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキサイド（Ｏ2-）が細胞に与える酸化ストレスは、様々な疾病の原因として近年注目されている。その疾病には、動脈硬化、高血圧、ガン、脳神経疾患などを始め、広く胃潰瘍、白内障なども含まれており、いずれも現代社会において大きな問題となっているものである。したがって、スーパーオキサイドの各々の細胞、組織におよぼす影響を調べることは、治療や診断の基礎として重要な課題である。しかし、これまでスーパーオキサイドを温和な条件下で発生させる適切な方法がなかったため、細胞ないしは組織レベルで調べることが困難であった。
【０００３】
従来スーパーオキサイド発生デバイスとして使用されていたのはキサンチンオキシダーゼであった（例えば非特許文献１）。一方、非特許文献２には、温和な条件で使用できるスーパーオキサイド発生デバイスが記載されている。
【非特許文献１】Barnes, K.A., Samson,S.E., and Grover, A.K. (2000) Molecular and Cellular Biochemistry, 203, 17-21
【非特許文献２】Minoru Tamura, etal. (2004)第７７回日本生化学会大会発表抄録集９８７頁、日本生化学会
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１に記載されたキサンチンオキシダーゼによる方法においては、１）基質のキサンチンが溶けにくい、２）スーパーオキサイド以外に過酸化水素も発生する、３）副産物として尿酸を生じる、４）冷凍保存により別の酵素に変換する、などの問題点がある。中でも、副産物として生じる尿酸はスーパーオキサイドから生じる活性酸素ＯＨラジカルと反応して無害化してしまうため、スーパーオキサイド発生デバイスとしては致命的である。
【０００５】
一方、白血球酵素ＮＡＤＰＨオキシダーゼにはこのような欠点がなく強力なスーパーオキサイド発生能をもつが、反面、そのままでは活性がなく、活性化するためには多くの因子が要ること、活性化の手順が煩雑であること、そして酵素が不安定であること、などの問題があり、スーパーオキサイド発生デバイスとして用いることは考えられなかった。非特許文献２に記載されたスーパーオキサイド発生デバイスは、冷凍保存が可能であり、しかもバッファー液中で長時間スーパーオキサイドを発生することができる。しかし、培地中においても、長時間スーパーオキサイドを発生できることが望まれる。
【０００６】
この発明は、取り扱いやすく、副産物を生じず、スーパーオキサイドだけを発生でき、しかも培地中においても、長時間スーパーオキサイドを発生できるスーパーオキサイド発生デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を解決するために、本発明のスーパーオキサイド発生剤の製造方法は配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列よりなる第１のタンパク質と、配列番号２に示すアミノ酸配列よりなる第２のタンパク質と、シトクロムｂ558を含む溶液に１−メチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド（ＮＨＳ）を加えることを特徴とする。
【０００８】
これに加えて、ＥＤＣとＮＨＳを加えた後、実質的に２５℃で２５分以上３５分以下保つ工程を有することにより、スーパーオキサイド発生剤の安定性はさらに向上する。
【０００９】
上述の製造方法によって製造されるスーパーオキサイド発生剤は、新規な物質である。使用時において、副産物を生じず、スーパーオキサイドだけを発生でき、しかも培地中でも長時間にわたってスーパーオキサイドを発生させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
この発明を実施するための最良の形態について説明する。図１はこの発明のスーパーオキサイド発生剤の構成と作用を示す概念図である。なお、図１においてタンパクの架橋は表示されていない。
【００１１】
スーパーオキサイド発生剤は、第１のタンパク質（図１の符号１、以下単に「タンパク質１」と表示する）、第２のタンパク質（図１の符号２、以下単に「タンパク質２」と表示する）と、シトクロムb558（図１の符号３）を含む。ここで、タンパク質１はヒトＲａｃの変異体であり、ＲａｃＱ６１Ｌと表示される。タンパク質２は、ヒトｐ６７phoxとｐ４７phoxの融合タンパク質であり、ｐ６７Ｎ−ｐ４７Ｎと表示される。タンパク質１（ヒトＲａｃ変異体）のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示される。また、タンパク質２のアミノ酸配列は配列番号１に示される。
【００１２】
タンパク質１とタンパク質２の製造方法の例を説明する。
【００１３】
タンパク質１（Ｒａｃの変異体）は以下のように製造した。
配列表の配列番号３はヒトＲａｃのcＤＮＡ配列を示す。６１番目のアミノ酸残基グルタミンのコドン（ＣＡＡ）をロイシンのコドン（ＣＴＡ）に置換した。遺伝子変異はＲａｃのｃＤＮＡを含むｐＧＥＸ-２Ｔベクター（商品名、アマシャム社）上でＱｕｉｋ Ｃｈａｎｇｅ （商品名：ストラタジーン社）を用いて行った。変異導入には次の２本のプライマーを用いた。すなわち、
5' GGATACAGCTGGACTAGAAGATTATGACAG 3' とその相補的配列である
5' CTGTCATAATCTTCTAGTCCAGCTGTATCC 3'
（配列中の下線部が変異部分）
【００１４】
タンパク質２（ｐ６７Ｎとｐ４７Ｎの融合の融合タンパク）は以下のように製造した。
配列表の配列番号４はｐ６７のcＤＮＡ配列を、配列番号５はｐ４７のcＤＮＡ配列をそれぞれ示す。 pGEX-2Tに組み込まれていたp６７からp６７N (1-210) にあたる塩基配列を下記のプライマーを使って増幅した。
5'-プライマー 5'-CGTggatccATGTCCCTGGTGGAGGCC-3'
3'-プライマー 5'-GATgaattcACTATCCACCACAGATGC-3'
ここで下線部はそれぞれ開始コドンを示す。5'側にはBam HIサイト(小文字）をまた3'側にはEcoRIサイト（小文字）をリンカーとしてつけた。 増幅したp67NのcDNAをゲル電気泳動で分離したのち、EcoRIで両端のリンカーを刈り込んだのち、同じくEcoRIで切断したpGEX-2Tベクターと混ぜて対合させ、DNA ligaseで結合させた。
p47Nの遺伝子はpVL1393ベクターに組み込まれていたものを次のプライマーを使ってPCR増幅した。
5'-プライマー 5'-GATgaattcATGGGGGACACCTTCATCC-3'
3'-プライマー 5'-GATgaattcTCAGACGGCAGACGCCAGC-3'
ここで下線部はそれぞれ開始コドンおよび終止コドンである。両端には
EcoRIサイト(小文字）のリンカーをつけた。 増幅したcDNAをゲル電気泳動で分離したのち、EcoRIで処理して両端のリンカーを刈り込んだ。これを上述のp67N cDNAを組み込んだpGEX-2Tベクターと混ぜ、DNA-ligaseでつないだ。
【００１５】
目的タンパク質 を発現する組み換えベクターを含む大腸菌BL-21のグリセロールストックから、滅菌した楊枝で5本の試験管中のLB-Amp培地（各４ml）に植菌。37℃で一晩、振盪培養した。次に2リットルのLB-Amp培地へ移し、37℃でインキュベートしながら、エアーポンプで大量の空気を培養液に送った。この際、培養液の泡立ちを抑えるため、アンチフォーム（商品名、シグマ社） を少量加えた。菌体の培養を3.5時間行い、終濃度0.1 mM のIPTGを加え、さらに2.5時間培養して菌体内に目的タンパクを発現させた。なお、p67N-p47N融合タンパク質の場合、不溶化を防ぐためIPTGの終濃度を0.05 mMに下げ、誘導時の温度を25℃で行った。
【００１６】
培養終了後ただちに培養液を遠心ボトルに移し、氷冷する。完全に氷冷された培養液を6,200×g、４℃で10 分間遠心した。沈殿に適量のSTE Bufferを加え、よくほぐし、同様に遠心を行った。このSTE Bufferによる洗浄を２回行い、菌体を集菌した後、ひとまず80℃に凍結した。
【００１７】
凍結させた菌体に氷冷されたLysis Buffer 50 ml（使用直前に各種プロテアーゼインヒビターを添加）を加え，激しくシェイクして沈殿をほぐし、ミニディスクローターを用いて室温で３０分間穏やかに混ぜた。溶菌後、DNase I処理により、DNAを切断した。ライゼート50 mlに対し、10 mg/ml DNaseIを36μl、0.1M MgCl2 を2.64 ml、Brij を50 mg加え、激しくシェイクして、氷上で15 分間インキュベートした。その後、35,000×g、４℃で10 分間遠心し、上澄みを回収後、あらかじめ平衡化しておいたG-Sepharose （商品名、アマシャム社）2mlを回収した上澄み液に加え、ミニディスクローターにセットし4℃で一晩穏やかに混ぜ、目的タンパク質を吸着させた。
【００１８】
その後、500×g、4℃で5 分間遠心しG-Sepharose ビーズを沈殿させた。上澄みを除去しPBSを加え、ミニディスクローターで10 分間穏やかに撹拌後、500×g、4℃で5 分間遠心し、上澄みを除去した。この操作をPBSで2回、0.5% Triton X-100で2回、BufferIで2回行い、不純タンパクを除去した。その後、ペレット化したビーズにBufferIを等量加え、静かにほぐした。スラリー化したG-Sepharoseを4本のエッペンチューブに移した。
【００１９】
次に部位特異的プロテアーゼのスロンビンでG-Sepharose ビーズに結合したGST結合タンパク質間の切断を行った。室温で20 ユニットのスロンビンを加え、ディスクローターで穏やかに撹拌し、30 分間反応させ、さらにスロンビンを20 units追加し同様に室温で30 分間反応させた。
【００２０】
その後、500×g、4℃で10 分間遠心し、ビーズを沈殿させた。上澄みには目的タンパク質が溶出されており、回収後、BufferIでスラリーにし、15 ml培養チューブへ移したのちBufferIを入れ、ディスクローターで穏やかに10 分間撹拌後、500×g、4℃で5 分間遠心し、上澄みを回収した。この操作を2回繰り返しG-Sepharoseに残っている目的タンパク質を取り出した 。混入したビーズを除去するために溶出液をウルトラフリーMC（0.22μm, ミリポア社） にかけ、得られた目的タンパク質のスロンビンによる切断を防ぐためDIFP２μｌを加え、20 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0) で4℃、2 時間×2回、透析を行った後、アミコンウルトラ (ミリポア社) で濃縮した。
【００２１】
なお、上述の各成分について、以下に説明を示す。
IPTG: イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトース
・LB-Amp
LB培地を滅菌後、アンピシリンを５０μｌ／mlに加えたもの
・STE Buffer
10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
1 mM EDTA (pH 8.0)
150 mM NaCl
・Lysis Buffer
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
5 mM DTT
1 mM EDTA (pH 7.5)
0.25 mg/ml デオキシコール酸ナトリウム
400μｇ/ml Lysozyme
[インヒビター]
0.2 mM PMSF
10μｇ/ml Aprotinin (p67N-p47N では 1 mM DIFPを使用。)
・PBS Buffer
50 mM NaCl
50 mM KCl
8m M Na2HPO4
1.5 mM KH2PO4
・BufferI
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
50 mM NaCl
2.5 mM CaCl2
【００２２】
ついで、シトクロムb558の製造方法の例について説明する。
【００２３】
ブタの血液３リットルをガーゼでこしたのち、３％(w/v) ポリビニルピロリドン（K-９０）水溶液を670 ml加える。良く撹拌し室温で45分間静置して赤血球を沈ませた後、上層を採取し、750 x g、20分間遠心する。上清を捨てて遠心ボトルの底をたたいて沈澱をほぐし、低張液0.2%(w/v)NaCl溶液100 mlを加え30秒間手で震盪し、赤血球を破裂させる。素早く1.6%(w/v)NaCl溶液を100mlを加えて等張にもどす。750 x g、15 分間遠心して上清を捨て、沈澱を0.9 %(w/v)NaCl溶液200 mlに懸濁して750 x g、20 分間遠心する。沈澱を再び生理食塩水に懸濁したのち、50 ml培養チューブにリンパ球分離液を25 ml入れた上に乗せる。800 x g、30 分間遠心後、沈澱以外の層は除去する。沈澱をPBSに懸濁し、450 x g、10分間遠心して洗浄したのち、再懸濁する。DIFPを終濃度2 mMになるように加え、０℃で20 分置いたのち、400 x g20分間遠心し、沈澱をBuffer Aに5 x 108個/mlの濃度で懸濁する。-80 ℃に保存する。
【００２４】
好中球を1 X 108 個／mlの濃度になるようにBuffer Aで希釈し、細胞破砕器中で窒素圧34気圧を20分かけたのち、終濃度2.5 mMになるようにEGTAを加えたビーカー中にノズルより放出させる。800×g、4℃、10 分間遠心後、上澄みを回収する。その後、ショ糖密度勾配遠心分離により、サイトソルと形質膜を分離する。下から順に50 %(w/v) そして 30 %(w/v)スクロースを含むBuffer A (1mM EGTA入り)の上にサンプルを上層し、150,000×g、4℃、1時間で遠心後 50%と30%層の間にある部分(形質膜)を回収し、Buffer Sで倍量に希釈後、NaCl水溶液を終濃度1Mになるように加え懸濁したあと、150,000×g、4℃、1時間で再び遠心して、余分な膜タンパクを除くと共に形質膜を沈澱させる。沈澱にBuffer Kを加え超音波をかけて懸濁させる。
【００２５】
20 %(w/v) n-ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド(終濃度1.5%)で可溶化し、ただちに100,000×gで1時間遠心する。上澄みを回収し、16 %(v/v)グリセロールを含むBuffer Hで平衡化した3層カラム (DEAE-Sepharose、ω-aminooctyl-agarose、CM-Sepharose（いずれも商品名、アマシャム社))へ流す。素通り画分を回収し、8 %(v/v)グリセロールを含むBuffer Hで平衡化したHeparin-Sepharoseカラムに吸着させた後、NaCl勾配 (0.05−1.5M) により溶出させる。ピークを回収後、遠心濃縮器Amicon ultra (分画 50kD, ミリポア社)で濃縮したのち、再脂質化する。再脂質化は、リン脂質濃度1mg／ml buffer Aになるように調製されたリン脂質混合液 (PC : PE : PI : SM : cholesterol = 31 : 3 : 29 : 25 : 12 wt%)を精製シトクロムb558液に等量加え、かるく混ぜる。これを適当に小分けし−80℃で保存する。
【００２６】
以上、使用された各成分について以下に説明する。
DIFP: diisopropyl fluorophosphate
・Buffer A
200 mM PIPES (pH 7.4 )
180 mM NaCl
600 mM KCl
23m M MgCl2・6H2O
1 mM PMSF
1 μg/ml TLCK
1 mM ATP
6 %(w/v) スクロース
・Buffer S
50 mM PIPES (pH 7.4)
140 mM NaCl
1 mM EGTA
1 mM PMSF
・Buffer K
50 mM PIPES (pH 6.5 )
50 mM NaCl
1 mM EGTA
16 %(v/v) グリセロール 1 mM PMSF
0.5 mM DTT
・Buffer H
50 mM PIPES (pH 6.5)
50 mM NaCl
1 mM PMSF
0.2 mM DTT
１μｇ/ml TLCK
0.5 % (w/v) n-ヘプチル-・-D-チオグルコシド
【００２７】
本発明のスーパーオキサイド発生剤は、酵素成分である第２のタンパク質２を高濃度に含むことが好ましい。一般的には、酵素成分を使用する際に、ＥＣ50（最大反応速度の５０％の反応速度を達成する濃度）を基準に選択され、例えば、ＥＣ50の５倍もの濃度にすれば最大反応速度になると考えるのが通常である。しかし、本実施形態では、この通常選択される濃度よりも高い濃度で第２のタンパク質２を混入する。p67N-p47Nの酵素活性化におけるEC50 は０．１μＭである。しかし、本実施形態においてはＥＣ50の３０倍以上の濃度で調製した。このような濃度にすることによって、凍結保存後も活性が残るようになり、１２５倍以上にすることで殆ど失活なしに凍結保存できるようになる。本例においてＥＣ50の１２５倍以上とは、１２．５μＭ以上の濃度に対応する。また、第１のタンパク質もＥＣ50（０．０６μＭ）の５０倍以上の濃度で凍結保存後も活性が残るようになり、２００倍以上にすることで殆ど失活なしに凍結保存できるようになる。すなわち、第１のタンパク質の濃度は１２μＭ以上で調製することが好ましい。
【００２８】
このような高濃度は常識とは全く異なるものであるが、これによって全体のタンパク量を一定以上にして凍結に耐えうるようにできるということが判明した。
【００２９】
以上のようにして調製された混合物は、そのままでもバッファー液中でスーパーオキサイド発生剤として使用可能であるが、本発明においては、培地中での安定性を向上させるために、１−メチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド（ＮＨＳ）を加える処理を行う。この処理の例について、以下、詳細に説明する。
【００３０】
まず、００２７段落までに示した手順で調製した混合液を９０μｌ使用する。この混合液中には、第１のタンパク質が２５μＭ、第２のタンパク質が２５μＭ、シトクロムb558が１．０μＭの濃度でそれぞれ含まれている。これに、ｐＨ７．０のＰＩＰＥＳが５０ｍＭとＭｇＣｌ2が８ｍＭの溶液を８００μｌ、１ｍＭのＦＡＤを９μｌ加えて９００μｌの溶液とする。この溶液を５分間２５℃に保った。
【００３１】
この９００μｌの溶液を４５０μｌずつに分けて２つのサンプルとする。第１のサンプルに２００ｍＭのＥＤＣ２５μｌと１００ｍＭのＮＨＳ２５μｌを加えて、５００μｌの溶液とする。この溶液中で、ＥＤＣは１０ｍＭ、ＮＨＳは５ｍＭの濃度である。第２のサンプルにはＥＤＣのみを加え、ＮＨＳは加えない。
【００３２】
こうして得られたそれぞれのサンプルを実質的に２５℃で２５分以上３５分以下保った。このように、温度処理することによって、製造されるスーパーオキサイド発生剤の質が向上する。その中でも３０分保持するのが特に好ましい。
【００３３】
こうして得られた溶液中には、不要なＥＤＣが残存しているので、透析によってこれを除去する。外液として、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１０μｌのＦＡＤ、２０％のグリセロールを使用する。得られた第１のサンプルを透析チューブに入れ、外液５００ｍｌ中に２時間置く。この間、外液を５℃に保ちながら撹拌する。その後、外液を交換し、さらに２時間撹拌する。このようにして、過剰なＥＤＣは取り除かれる。外液中には内液と同程度の濃度のＦＡＤが含まれているので、内液からＦＡＤが消失することが防止される。以上で、この発明のスーパーオキサイド発生剤の一例が製造される。なお、第２のサンプルも同様に透析し、比較用のスーパーオキサイド発生剤とする。
【００３４】
このようにして製造されたスーパーオキサイド発生剤は、これまでにない新規な物質である。架橋剤であるＥＤＣによって、スーパーオキサイド発生剤内のタンパク質成分に架橋が形成されたと推定されるが、ＥＤＣとＮＨＳによる処理によって、スーパーオキサイド発生剤はより安定になる。バッファー液中はもとより、培地中でも安定であり、長時間にわたってスーパーオキサイドの発生が継続する。
【実施例１】
【００３５】
つぎに、この発明の実施例について説明する。サンプル１（ＥＤＣとＮＨＳによる処理）より得られたスーパーオキサイド発生剤を実施例として使用する。一方、サンプル２（ＥＤＣのみによる処理）より得られたスーパーオキサイド発生剤を第１の比較例として使用する。また、ＥＤＣやＮＨＳによる処理を全く行っていないものを第２の比較例として使用する。
【００３６】
２７６μｌの培地に実施例のスーパーオキサイド発生剤、第１の比較例、第２の比較例をそれぞれ１２．６μｌ加え、３７℃に保ちながら、スーパーオキサイドの発生量の時間変化を測定する。
【００３７】
スーパーオキサイドの発生量の測定方法について説明する。試験開始時点、および所定時間経過後に、一定量のサンプルを採取し、シトクロムＣを含む溶液中に加える。加えたサンプルがＯ2-を発生すると、シトクロムＣが発色する。この発色の度合いを測定し、スーパーオキサイドの発生能力を比較する。測定は、試験開始時点および１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分、３００分経過時に行った。
【００３８】
図２は、スーパーオキサイドの発生能力の時間変化を示すグラフである。ＥＤＣやＮＨＳによる処理を全く行っていない第２の比較例では、１５分後にはスーパーオキサイドの発生能力が著しく低下する。ＥＤＣのみによる処理を行った第１の比較例では、スーパーオキサイドの発生の持続力はやや向上し、半減期は約２０分であった。ＥＤＣとＮＨＳにより処理された実施例では、安定性が著しく向上しており、半減期は約２００分になった。５時間経過後でもなお４０％以上のスーパーオキサイドの発生能力が維持されていた。
【００３９】
以上、第１のタンパク質、第２のタンパク質およびシトクロムｂ558を含む溶液にＥＤＣとＮＨＳによる処理を行うことによって、培地中でも長時間スーパーオキサイドを発生できる安定なスーパーオキサイド発生剤が製造できる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、細胞や組織に対するスーパーオキサイドの作用を調べるためのスーパーオキサイドの発生剤として利用することができる。また、酸化ストレス実験ツール、スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）アッセイキット、さらにSODを共存させれば過酸化水素発生デバイスとしても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】スーパーオキサイド発生剤の構成と作用を示す概念図である。
【図２】スーパーオキサイドの発生能力の時間変化を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４２】
１．第１のタンパク質（タンパク質１）
２．第２のタンパク質（タンパク質２）
３．シトクロムb558
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列よりなる第１のタンパク質と、配列番号２に示すアミノ酸配列よりなる第２のタンパク質と、シトクロムｂ558を含む溶液に１−メチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド（ＮＨＳ）を加えることを特徴とするスーパーオキサイド発生剤の製造方法。
【請求項２】
１−メチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド（ＮＨＳ）を加えた後、実質的に２５℃で２５分以上３５分以下保つ工程を有する請求項１に記載のスーパーオキサイド発生剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の製造方法により製造されるスーパーオキサイド発生剤。
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列よりなる第１のタンパク質と、配列番号２に示すアミノ酸配列よりなる第２のタンパク質と、シトクロムｂ558を含む溶液に１−メチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド（ＮＨＳ）を加えることを特徴とするスーパーオキサイド発生剤の製造方法。
【請求項２】
１−メチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド（ＮＨＳ）を加えた後、実質的に２５℃で２５分以上３５分以下保つ工程を有する請求項１に記載のスーパーオキサイド発生剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の製造方法により製造されるスーパーオキサイド発生剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−２２２０６２（Ｐ２００７−２２２０６２Ａ）
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−４６２３７（Ｐ２００６−４６２３７）
【出願日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
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