ズダヤクシュ抽出物またはこれから分離された化合物を含む癌疾患の予防および治療用組成物
本発明は、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤であって、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞特異的であることを特徴とする、剤に関する。本発明のズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩は、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞株において、細胞接着を低下させて癌細胞の増殖を減少させ、また細胞死を誘導する効果を有するので、腫瘍関連抗原Ｌβまたはそのホモログを発現する癌細胞による癌疾患を予防および治療するために用いられうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含む、癌細胞特異的アノイキス誘導剤、ならびにこれを含む坑癌組成物または機能健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンと細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との相互作用は、細胞接着を仲介し、インテグリンを介した細胞接着は、多様なシグナル分子の活性と局在を制御し、結果的に細胞の機能あるいは動態までも制御する（Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２，ｐｐ．４４２−５４，２００２；Ｂｒａｋｅｂｕｓｃｈ，Ｃ．ａｎｄ Ｆａｓｓｌｅｒ，Ｒ．，Ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ａｃｔｉｎ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ，ａｎ ｅｔｅｒｎａｌ ｌｏｖｅ ａｆｆａｉｒ．，ＥＭＢＯ Ｊ，２２，ｐｐ．２３２４−３３，２００３）。インテグリンの細胞外部位が接着斑でＥＣＭと相互作用することによって、インテグリンサブユニットの細胞内、細胞質側末端に多様な細胞接着分子が集まることになる。これらの中には、パキシリンやｐ１３０Ｃａｓといったアダプター蛋白質や、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、ｃ−Ｓｒｃなどのシグナル分子が存在する（ＤｅＭａｌｉ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｋ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｃｔｉｎ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５，ｐｐ．５７２−８２，２００３；Ｃａｒｒａｇｈｅｒ，Ｎ．Ｏ．ａｎｄ Ｆｒａｍｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ：ａ ｐｌａｃｅ ｗｈｅｒｅ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｍｅｅｔ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１４，ｐｐ．２４１−９，２００４）。インテグリンに多様な細胞シグナル分子が集まることによって自身が活性化し、アクチン細胞骨格の再編成をもたらして、結果的に細胞の形態変化を引き起こす（Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，３２，ｐｐ．４４３−６，２００４）。接着斑のインテグリンは（特に細胞質側末端で）タンパク質複合体を介しアクチンフィラメントに連結されているため、接着斑分子が十分に集まることができない場合や、アクチンフィラメントが異常に再編成される場合は、付随して接着斑がなくなって細胞が丸くなり、細胞が基底膜から離脱する（Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ，Ｓ．ａｎｄ Ｋａｎａｉ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ，９４，ｐｐ．５７５−８１，２００３）。換言すれば、正常の上皮細胞はＥＣＭリッチな基底膜に単層を形成し、ＥＣＭからの細胞外シグナルを効果的に伝達することで生存することができるが、接着斑を失った細胞はアノイキスが誘導され、基底膜から細胞が剥がれることによって死ぬことになる。
【０００３】
多くの遺伝変異や遺伝的不安定さが生じることにより、細胞−ＥＣＭ相互作用や細胞−細胞間の接触が異常変化することによって、癌細胞は原発巣から転移できるようになる。転移性の癌細胞周囲の微細環境では、癌細胞自体または周囲の繊維芽細胞、白血球細胞、内皮細胞が分泌する成長因子や、サイトカインが細胞間の接触、接着、移動および浸潤などに重要な役割をはたす（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００，ｐｐ．４４８−６４，２００３）。転移性癌細胞は基底膜と間質領域を横断して循環系に入り（侵入）、その循環系で生き残る。ついで、管外遊出によって循環系から離脱する。この過程で、インテグリンを介した癌細胞とＥＣＭとの相互作用が、癌細胞の転移ポテンシャルを決定する重要な要素となりうる（Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５５，ｐｐ．１０３７−５７，１９８６）。播種性癌細胞の中で、アノイキスで生き残った細胞のみが血管やリンパ管を介して遠隔部位に移動し、最終的にその部位に定着して転位性腫瘍として増殖することになる（Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．，Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２，ｐｐ．４４２−５４，２００２）。
【０００４】
したがって抗発癌性または抗転位性の試薬をスクリーニングする場合、正常細胞には影響を与えずに発癌性細胞にアノイキスを引き起こす試薬を見つけることは有用であるだろう。
【０００５】
ＴＭ４ＳＦ５（またはＬ６Ｈ）は腫瘍関連抗原Ｌ６のホモログであり、Ｌ６、ＩＬ−ＴＭＰおよびＬ６Ｄとともに４回膜貫通型Ｌ６スーパーファミリーを形成する（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌ６ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａ ｎｅｗ ｆｏｕｒｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，９，ｐｐ．１５９４−６００，２０００）。ＴＭ４ＳＦ５は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、乳頭癌および軟部肉腫、ならびに非内分泌性肺腫瘍およびＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）ネガティブな気管支カルチノイド腫瘍において過剰発現する（Ｐａｓｃｕａｌ−Ｌｅ Ｔａｌｌｅｃ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｉｄ ｔｕｍｏｒｓ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，８７，ｐｐ．５０１５−２２，２００２）。最近我々は、ＴＭ４ＳＦ５が肝臓癌でも過剰発現していること、ＴＭ４ＳＦ５がアクチンの再配列と上皮間葉移行（ＥＭＴ）を引き起こし、コンタクト・インヒビションの低下と発癌性増殖を導くことを発見した（Ｌｅｅ Ｓ−Ａ ｅｔ ａｌ．，ＴＭ４ＳＦ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐ２７Ｋｉｐ１ ａｎｄ Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｃａｕｓｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｏｎｔａｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００７）。繊維芽細胞においてＴＭ４ＳＦ５を過剰発現させた場合、アクチン再編成と接着斑のターンオーバーが生じた（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）。ＴＭ４ＳＦ蛋白質（テトラスパニンまたはテトラスパンとして知られている）は、４つの膜貫通ドメインを有する約２５−５０ｋＤａの大きさの疎水性タンパク質のグループであり、二つの細胞外ループと二つの短い細胞質側末端を持っている（Ｓｔｉｐｐ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２８，ｐｐ．１０６−１２，２００３）。インテグリンのような細胞接着分子と複合体を形成することで、ＴＭ４ＳＦはテトラスパニン−ウェブ構造を形成する。この構造は、細胞の接着と運動において協調して役割を果たす（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ，Ｆ，Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｍｅｅｔｓ ｔｈｅ ｅｙｅ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１４，ｐｐ．４１４３−５１，２００１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の開示
技術的課題
本発明の目的は、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤を提供することである。当該剤は、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞に特異的である。
本発明の他の目的は、前記癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を含む癌疾患の治療および予防用医薬組成物および癌疾患の予防および改善用機能健康食品を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ＴＭ４ＳＦ５−ｎｕｌｌの親ＳＮＵ４４９細胞（以下‘Ｐ’という）、安定なコントロールのＳＮＵ４４９細胞（以下‘Ｃｐ’という）、安定なＴＭ４ＳＦ５過剰発現のＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞（以下‘Ｔｐ’という）およびＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞（以下‘Ｔ１６’という）のＴＭ４ＳＦ５発現を示す図である。
【図２】図２は、ティアレリック酸（ＴＡ）の処理がＰ、Ｃｐ、ＴｐおよびＴ１６細胞のＴＭ４ＳＦ５発現に及ぼす影響を示す図である。
【図３】図３は、ティアレリック酸（ＴＡ）の濃度によってＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞およびＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞の増殖が変化したことを示す顕微鏡写真である。
【図４】図４は、ティアレリック酸（ＴＡ）の濃度依存的および時間依存的ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞およびＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞数を示すグラフである。
【図５】図５は、様々な細胞株におけるＴＭ４ＳＦ５発現を確認した結果を示す図である。
【図６】図６は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＴＭ４ＳＦ５を発現するか、または発現しない様々な細胞株の細胞数を示すグラフである。
【図７】図７は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＴＭ４ＳＦ５−ｎｕｌｌ細胞（ＳＮＵ６３８およびＳＮＵ６６８）における接着斑分子の発現および活性化を示す顕微鏡写真である。
【図８】図８は、免疫ブロットアッセイの結果を示す。ここで接着斑分子の発現および活性化は、ティアレリック酸（ＴＡ）の濃度を変えて処理した細胞株において試験される。
【図９】図９は、免疫ブロットアッセイの結果を示す。ここで接着斑分子の発現および活性化は、ティアレリック酸（ＴＡ）で処理する時間を変えた細胞株において試験される。
【図１０】図１０は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ｐ１３０Ｃａｓのリン酸化レベルおよびｐ１３０Ｃａｓ、ＦＡＫおよびパキシリン間の物理的結合を示す図である。
【図１１】図１１は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＳＮＵ４４９細胞株における接着斑分子の発現および活性化を示す図である。
【図１２】図１２は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＴＭ４ＳＦ５を発現するか、または発現しない様々な細胞株における接着斑分子の発現および活性を示す図である。
【図１３】図１３は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ｐＹ３９７ＦＡＫ（接着斑キナーゼ）およびｐＹ１１８パキシリンの免疫染色によって、接着斑の形成を分析した結果である。
【図１４】図１４は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、インテグリンα５とｐＹ３９７ＦＡＫと間の解離を示す図である。
【図１５】図１５は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、アクチンストレスファイバー形成の消失を示す図である。
【図１６】図１６は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＳＮＵ４４９細胞株における接着の程度を示すグラフである。
【図１７】図１７は、時間を変えてティアレリック酸（ＴＡ）処理した後、浮遊しているＳＮＵ４４９ＣｐおよびＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞数を示すグラフである。
【図１８】図１８は、時間を変えてティアレリック酸（ＴＡ）処理した後、細胞生存および細胞死関連シグナル分子のウエスタンブロットを行った結果である。
【図１９】図１９は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、細胞ＤＮＡ量の分析結果である。
【図２０】図２０は、ＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞において、野生型ＦＡＫ、パキシリンまたはｐ１３０Ｃａｓを過剰発現させることによる、ＴＡ介在性効果に対する阻害の程度を示す図である。
【図２１】図２１は、ＤＮＡ量の分析結果である。接着斑分子の過剰発現により、ＴＡ介在性の細胞死が阻害される。
【図２２】図２２は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞株を注入されたマウスの体重および腫瘍体積の変化を示す図である。
【図２３】図２３は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＴＭ４ＳＦ５介在性腫瘍組職における細胞死の誘導を示す図である。
【図２４】図２４は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、マウスＴＭ４ＳＦ５介在性腫瘍組職におけるカスパーゼ−３の活性化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ベストモード
一態様において、本発明はズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含む、アノイキス誘導剤に関する。当該剤は、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞に特異的である。
【０００９】
本明細書中で使用するとき、ズダヤクシュ Ｄ．Ｄｏｎ（喘息薬種としても知られていう）は、ユキノシタ科の多年生草本のことをいう。これは大韓民国の鬱陵島の山頂のみで棲息する。本発明のズダヤクシュ抽出物は、ズダヤクシュから抽出した粗抽出物または極性溶媒可溶抽出物である。粗抽出物としては精製水を含む水、炭素数１〜４の低級アルコールおよびこれらの混合溶媒よりなる群から選ばれる溶媒、好ましくはメタノールに溶解される抽出物が挙げられる。また、極性溶媒可溶抽出物としては、水、メタノール、エタノール、ブタノールおよびこれらの混合溶媒よりなる群から選ばれる溶媒、好ましくはブタノールに溶解される抽出物が挙げられる。
【００１０】
本発明のズダヤクシュ抽出物は当業者によく知られた方法によって製造できる。例えば、ズダヤクシュを丸ごと採集し、陰干しし、次いで粉末化する。そしてズダヤクシュ粉末を２〜２０倍体積の極性溶媒、たとえば水、メタノール、エタノールおよびブタノールといったＣ１〜Ｃ４の低級アルコールまたはこれらを約１：０．１〜１：１０の混合比で混合した混合溶媒といった極性溶媒、好ましくはメタノールと混合し、２０〜５０℃で約１０時間〜４８日、好ましくは２０時間〜３０時間、熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出または超音波抽出などの抽出方法で２〜５回、好ましくは２〜３回抽出する。そして結果物を通常の方法によって濾過、濃縮および乾燥して、粗抽出物を得ることができる。また本発明の極性溶媒可溶抽出物は、前記粗抽出物を蒸溜水に懸濁した後、１〜１００倍、好ましくは１〜５倍体積の、水、エタノール、メタノールおよびブタノールといった極性溶媒と混合し、１回〜１０回、好ましくは１回〜５回抽出、分離して収得することで得る。さらに追加で通常の分画工程を行うこともできる（Ｈａｒｂｏｒｎｅ Ｊ．Ｂ．，Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｏｄｅｒｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ．３，ｐｐ６−７，１９９８）。
【００１１】
本発明のズダヤクシュ抽出物から分離したティアレリック酸化合物［３，２３−ジヒドロキシ−２０（２９）−ルペン−２７−オイック アシッド］は下記化学式（Ｉ）
【００１２】
【化１】
【００１３】
で表される。
【００１４】
ティアレリック酸化合物は、当業者によく知られた方法によってズダヤクシュ抽出物から分離されうる。例えば本発明のズダヤクシュ抽出物を蒸溜水に懸濁し、次いでヘキサンで抽出してヘキサン可溶成分を分画する。ヘキサン可溶性画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサン−クロロホルム−メタノール混合溶媒で溶出して画分を得る。ティアレリック酸を含む画分を、繰返しカラムクロマトグラフィーに付す。ティアレリック酸を高純度で含む画分を溶媒再結晶に付して、本発明の純粋なティアレリック酸が得られる。
【００１５】
本明細書中で使用するとき、用語「薬学的に許容可能な塩」とは、薬学的または生理学的に許容される、無機酸および有機酸、ならびに塩基から誘導される塩を意味する。適切な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−硫酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸などが挙げられる。適切な塩基から誘導された塩としては、ナトリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、ならびにアンモニウムなどが挙げられる。
【００１６】
本発明のズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩は、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現している癌細胞に特異的に作用して、癌細胞のアノイキスを誘導する。
【００１７】
本明細書中で使用するとき、用語「腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログ」とは、膜貫通型Ｌ６スーパーファミリーを形成して非制御性の細胞増殖を誘導する蛋白質のことをいい、これは様々な腫瘍細胞で発現する。腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログとしては、Ｌ６、ＴＭ４ＳＦ５（またはＬ６Ｈ；４回膜貫通型Ｌ６ファミリーメンバー５）、ＩＬ−ＴＭＰおよびＬ６Ｄが挙げられ、好ましくはＴＭ４ＳＦ５である。
【００１８】
本明細書中で使用するとき、用語「アノイキス」とは、細胞外マトリックスへの細胞接着の失敗、または細胞外マトリックスへの不適切な細胞接着によって発生する、特殊なタイプのアポトーシスのことをいう。本発明では便宜上、細胞死またはアポトーシスをアノイキスということとする。
【００１９】
本発明の具体的な態様において、腫瘍関連抗原Ｌ６のホモログであるＴＭ４ＳＦ５による細胞増殖を抑制する化合物を捜す過程で、本発明者らは、ティアレリック酸（３，２３−ジヒドロキシ−２０（２９）−ルペン−２７−オイック アシッド）が、ＴＭ４ＳＦ５が発現する細胞株においてアノイキスを誘導することを発見した。ＴＭ４ＳＦ５発現細胞株をティアレリック酸（ＴＡ）で処理したとき、接着斑分子のリン酸化が阻害され、細胞接着が失われた。そして細胞増殖が阻害され、アノイキスが引き起こされた。またヌードマウスにおいて、ＴＡの投与はＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍発生を抑制した。これらの観察結果から、ティアレリック酸（ＴＡ）がＴＭ４ＳＦ５ポジティブな腫瘍発生に対する推定治療剤として開発されうることが示唆される。
【００２０】
前記腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞は、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳房癌、肺癌、非小細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、皮膚または眼黒色腫、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、悪性リンパ腫、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状線癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎細胞癌腫、腎臓骨盤癌、中枢神経系腫瘍、中枢神経系原発リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマまたは下垂体腺腫を引き起こすことが知られており、好ましくは肝臓癌、膵臓癌、胃癌、大腸癌、乳頭癌、軟部肉腫、非内分泌性肺腫瘍、ＡＣＴＨネガティブな気管支カルチノイド腫瘍を引き起こす癌細胞である。
【００２１】
他の見地では、本発明は、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤であって、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を有効成分として含む、癌疾患の予防および治療用医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明の癌疾患の予防および治療用組成物は、組成物の総重量に対して、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含む癌細胞特異的アノイキス誘導剤を０．１〜５０％重量含む。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、医薬組成物の製造に一般的に使用される適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含んでいてもよい。
【００２４】
従来の方法によれば、本発明の医薬組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、乳剤、シロップ、エアロゾールといった経口剤、外用剤、坐剤または滅菌注射液の形態に剤形化されうる。組成物に含まれる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が例示されうる。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製されうる。経口投与のための固形製剤の例としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤およびカプセル剤などが挙げられ、このような固形製剤は前記化合物と少なくとも１種以上の賦形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトースおよびゼラチンを混合して調製される。また賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクといった滑剤も使用されうる。経口投与のための液状製剤の例としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤およびシロップ剤が挙げられ、水や液体パラフィンといった一般的な希釈剤に加えて様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤および保存剤が含まれていてもよい。非経口投与のための製剤の例としては、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤が挙げられる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されうる。坐剤の基剤としては、ウィテプソール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオバター、ラウリンバター、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００２５】
本発明において、医薬組成物の効果的な投与量は、患者の健康状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および投与時間によって決定されうるが、当業者であれば適切に選択することができる。しかしながら、所望の効果を得るために、本発明の組成物は、１日あたり０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇで投与されうる。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量は本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトといった哺乳動物に多様な経路を通じて投与されうる。投与のすべての方式は予め定められており、例えば経口、直腸または静脈内、筋肉内、皮下、子宮内硬膜または脳室内注射によって投与されうる。
【００２７】
さらに他の見地では、本発明は、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞特異的に生じる癌疾患を治療および予防する方法であって、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤、あるいは当該剤を含む癌疾患の治療および予防用医薬組成物を、癌を持つ対象に投与する工程を含む、方法に関する。
【００２８】
本発明の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤または医薬組成物にしたがって、その効能、投与方法および投与量などに関する内容は前記したものと同じである。本発明の方法において、用語「対象」は、ヒト、サル、マウス、ブタ、ウシおよびウサギといった哺乳動物を包含するが、これらに限定されない。
【００２９】
さらに他の見地において、本発明は、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤であって、当該剤が腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞特異的であるアノイキス誘導剤を有効成分として含む、機能健康食品を提供する。癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を有効成分として含む食品としては各種の食品類、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康改善食品類などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含む、癌細胞特異的なアノイキス誘導剤は、総食品重量あたり０．０１〜１５重量％含んでいてもよく、健康飲料組成物の１００ｍｌあたり０．０２〜５ｇ、好ましくは０．３〜１ｇを加えてもよい。
【００３１】
本発明の機能健康食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤、液状製剤などの形態でありうる。
【００３２】
本発明の健康飲料組成物は、所定の割合で必須成分として前記化合物を含む液体である限りにおいて、他の成分には特に制限がなく、普通の飲料と同様にさまざまな香味剤または天然の炭水化物などを追加成分として含んでいてもよい。前述した天然炭水化物の例としては、葡萄糖、果糖といった単糖類；マルトース、スクロースといった二糖類；およびデキストリン、シクロデキストリンといった多糖類、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールといった糖アルコールが挙げられる。前述した以外の香味剤としては、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ）、グリシルリジン）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム）を有利に使用することができる。天然の炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり、通常約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００３３】
前記の外に、本発明の機能健康食品はさまざまな営養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。その他に、本発明の機能健康食品は、天然果物ジュースおよび果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は独立してまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合はあまり重要ではないが、本発明の化合物１００重量部当たり０〜約２０重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００３４】
以下、本発明を下記の実施例および実験例に基づいて詳細に説明する。ただし、下記の実施例および実験例は本発明を例示するものであるだけであり、本発明の内容が下記の実施例および実験例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
発明の実施形態
実施例１．ズダヤクシュの粗抽出物の製造
大韓民国の鬱陵島で採取したズダヤクシュの全草１．１ｋｇを乾燥、粉砕し、メタノール５Ｌを混合した。混合物を常温で２４時間撹拌し、真空濾過して上澄液を回収した。この工程を２回繰り返して上澄液を集めた。次いで上澄液を減圧濃縮して、ズダヤクシュのメタノール粗抽出物１００．５ｇを得た。
【００３６】
実施例２．ズダヤクシュ極性溶媒可溶抽出物の製造
実施例１で得たズダヤクシュ粗抽出物を蒸溜水１Ｌに懸濁した。ここに１Ｌのブタノールを加えて混合し、ブタノール可溶画分と水可溶性画分とに分離し、続けて濾過、減圧濃縮し、溶媒を除去した。最後にズダヤクシュのブタノール可溶抽出物８０．０ｇを得た。これは以下の実験例の試料として使用する。
【００３７】
実施例３．ズダヤクシュ抽出物からのティアレリック酸の分離
ズダヤクシュ３２．９ｋｇを６４Ｌのメタノールで７日間かけて室温で抽出し、次いで減圧下で濃縮して３．５２ｋｇのメタノール抽出物を得た。メタノール抽出物３．５２ｋｇを水１０Ｌに懸濁した後、ヘキサン３０Ｌで３回繰り返し抽出して、ヘキサン可溶画分６５１ｇを得た。濾液を酢酸エチル３０Ｌで３回繰り返し抽出して、酢酸エチル可溶抽出物を５１０ｇ得た。さらに酢酸エチルで抽出した後に残った懸濁液４０ＬをＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０に入れ、水８０Ｌで溶出した。水溶性画分を凍結乾燥して１．４ｋｇを得、次いで５０％メタノール８０Ｌで溶出した。５０％メタノール可溶画分を凍結乾燥して７９２ｇを得た。最後にメタノールでＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０カラムを溶出して、メタノール可溶画分１５８ｇを得た。ズダヤクシュ抽出物のそれぞれの画分を薄層クロマトグラフィーに付した。その結果、ヘキサン可溶画分にティアレリック酸が多量含有されていることが確認された。ヘキサン画分の半分量である３３０ｇをシリカゲル４ｋｇに加え、次いでヘキサン−酢酸エチル（１０：１，１３．２Ｌ；５：１，１６．８Ｌ；２：１，２４Ｌ）、クロロホルム−メタノール（９：１，３６Ｌ）、クロロホルムメタノール−水（７：３：０．１，２０Ｌ）およびメタノール１２Ｌで続けて溶出して九つの画分を得た。薄層クロマトグラフィーによって６および７番目の画分でティアレリック酸を確認した。ティアレリック酸を含む２つの画分を合わせ、これをシリカゲル２ｋｇに加えた後、クロロホルム−メタノール（２０：１，１８．９Ｌ；７：１，９Ｌ；３：１，４Ｌ）およびメタノール９Ｌで溶出して１１の画分を得た。この中で、４、５および６番目の画分にティアレリック酸が含有されていることを確認した。これらの画分をシリカゲルカラムにアプライし、溶媒再結晶に付してティアレリック酸２ｇを得た。加えて残りのヘキサン可溶画分３３０ｇを前記のような方法で分画してティアレリック酸２ｇを得た。下記の物性値を持つ全量４ｇのティアレリック酸（以下、ＴＡという）を分離精製した。
【００３８】
Ｎｅｅｄｌｅｓ（ＭｅＯＨ）；
ｍｐ ２５４−２５６℃；
［ａ］２３Ｄ ＋９４（ピリジン，ｃ ０．１４）；
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４９１（ＯＨ），１６８９（ＣＯ），１６４５（Ｃ＝Ｃ），１４５０，１３８８，１２６２，１２２２，１０４４；ＨＲＭＳ ｍ／ｚ ４７２．３５５２（Ｍ＋，Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ４８Ｏ４：４７２．３５５３）；
ＥＩＭＳ（ｒｅｌ．ｉｎｔ．）ｍ／ｚ：４７２［Ｍ］＋（６１），４５４［Ｍ−Ｈ２Ｏ］＋（３４），４３６［Ｍ−２Ｈ２Ｏ］＋（６２），４２４（４２），３９６（２６），２０５（７５），１８７（７１），１７５（８７），１７３（１００）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ピリジン−ｄ５）：１３．０（Ｃ−２４），１７．４（Ｃ−２５），１７．５（Ｃ−２６），１８．７（Ｃ−６），１８．８（Ｃ−２８），１９．４（Ｃ−３０），２１．３（Ｃ−１１），２５．８（Ｃ−１５），２６．７（Ｃ−１２），２７．９（Ｃ−２），３０．１（Ｃ−２１），３７．７（Ｃ−１０），３８．２（Ｃ−７），３８．３（Ｃ−１６），３９．２（Ｃ−１），３９．６（Ｃ−１３），４０．４（Ｃ−２２），４０．８（Ｃ−８），４２．９（Ｃ−４），４３．０（Ｃ−１７），４８．１（Ｃ−１９），４９．２（Ｃ−５），５１．４（Ｃ−１８），５１．６（Ｃ−９），６０．４（Ｃ−１４），６８．２（Ｃ−２３），７３．６（Ｃ−３），１１０．２（Ｃ−２９），１５０．９（Ｃ−２０），１７８．３（Ｃ−２７）；
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ピリジン−ｄ５）：１．０５，１．７１（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−１），１．８２，１．９１（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−２），４．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．７，１１．６Ｈｚ，Ｈ−３），１．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，１２．０Ｈｚ，Ｈ−５），１．４８，１．６５（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−６），１．８７，２．０６（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−７），２．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７，１２．７Ｈｚ，Ｈ−９），１．３２，１．６４（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−１１），１．８７，２．６０（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−１２），１．８８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１３），１．６７，２．２８（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−１５），１．７０，１．７８（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−１６），１．８１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１８），２．６０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１９），１．３６，１．９７（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−２１），１．１６，１．４０（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−２２），３．５７，４．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．４，ｅａｃｈ，Ｈ−２３），１．０４（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２４），１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２５），１．２１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２６），０．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２８）．４．７６，４．９６（２Ｈ，ｓ，ｅａｃｈ，Ｈ−２９），１．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｈ−３０）．
【００３９】
参考例１．細胞培養
ウイルス感染の後、空のｐＬＮＣＸまたはＴＭ４ＳＦ５を挿入したｐＬＮＣＸのレトロウイルスを、ＳＮＵ４４９肝臓癌細胞株（大韓民国細胞銀行（ＫｏｒｅａｎＣｅｌｌＢａｎｋ）、ソウル、大韓民国）に感染させることによって、プールした安定クローン（コントロールのＳＮＵ４４９ＣｐおよびＴＭ４ＳＦ発現ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞クローン）と単一細胞由来の細胞（ＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔ１６）とを製造した。親細胞およびコントロール細胞（Ｃｐ）は、それぞれ２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）無しまたはありの条件下、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／０．２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。内在性ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞または内在性ＴＭ４ＳＦ５を全く発現しない細胞（大韓民国細胞銀行）は、１０％ＦＢＳ（ＪＢＩ Ｉｎｃ．，大邱、大韓民国）入りのＤＭＥＭ−ＨあるいはＲＰＭＩ−１６４０培養液中でそれぞれ培養した。
【００４０】
参考例２．細胞溶解物の製造およびウエスタンブロット
全細胞溶解物は文献（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）記載のとおり、様々な実験条件で得た。例えば、コントロールＧＦＰ、野生型接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、パキシリン、ｐ１３０Ｃａｓ ｃＤＮＡと共の電気穿孔法（９５０μＦ、２５０Ｖ）を細胞に実施した。電気穿孔の１日後、細胞をティアレリック酸（２０μＭ）で所定の間処理した。通常の条件で培養した細胞、あるいは異なる濃度で所定の間ＴＡ処理した細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて回収した。ヌードマウスから得たコントロールまたは腫瘍組職は、手術後直ちに液体窒素を用いて氷らせた。すり鉢とすりこぎを用いて液体窒素中の組織をホモジナイズし、０．１％ＳＤＳ含有ＲＩＰＡ緩衝液を用いて抽出した。溶解物の標準的ウエスタンブロットは、リン酸化Ｙ３９７、Ｙ４０７、Ｙ５７７、Ｙ８６１、Ｙ９２５ＦＡＫ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、リン酸化Ｙ４１６Ｓｒｃ、ｃ−Ｓｒｃ、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＦＡＫ、ｐ１３０Ｃａｓ、パキシリン、ｐＹ１１８パキシリン、活性カスパーゼ−３（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｌａｂ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、α−チューブリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、リン酸化−Ｓ４７３またはＴ３０８Ａｋｔ、Ａｋｔ、リン酸化−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）およびＴＭ４ＳＦ５（自作）に対する抗体を用いて行った。
【００４１】
参考例３．免疫蛍光顕微鏡
細胞をＤＭＳＯまたは２０μＭのＴＡで２４時間処理した。次いで１０μｇ／ｍｌでフィブロネクチンをコートしたカバースリップ上に細胞を播種し、ＤＭＳＯまたは２０μＭのＴＡ存在下で２時間インキュベートした。続けてｐＹ３９７ＦＡＫ、ｐＹ１１８パキシリンおよびアクチンに対し、文献（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）記載のように免疫蛍光染色を実施した。マウントしたサンプルは、蛍光顕微鏡（ＢＸ５１，オリンパス，日本）で視覚化した。
【００４２】
参考例４．実験動物の準備
４〜５週齢の雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊＢｇｉ−ｎｕ）をＯｒｉｅｎｔ．Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｓｅｏｎｇｎａｍ，大韓民国）から購入した。マウスは制御された温度と湿度において、特別な無菌室に収容された。すべての動物への処置は、ソウル大学校実験動物管理マニュアルと臨床倫理委員会協定に従って実施された。５〜６週齢のマウス皮下に５×１０６個のＳＮＵ４４９Ｃｐ生細胞またはＳＮＵ４４９Ｔ１６生細胞を注射した。腫瘍の体積をキャリパーで測定し、下記の数式１で計算した。体積が２００ｍｍ３に達したときから、３ｍｇ／ｋｇあるいは３０ｍｇ／ｋｇ（体重）のティアレリック酸（ＴＡ）を１日おきに３０日間、腹腔内注射した。
【００４３】
【数１】
【００４４】
横長：短辺の長さ（ｍｍ）
縦長：長辺の長さ（ｍｍ）
【００４５】
実験例１．ＴＭ４ＳＦ５発現細胞の増殖抑制効果
実施例３で得たティアレリック酸（ＴＡ）の、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞への増殖抑制効果を測定するために、文献（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）に記載されているように、以下の実験を実施した。
【００４６】
参考例１の方法で培養した、ＴＭ４ＳＦ５−ｎｕｌｌの親ＳＮＵ４４９（以下‘Ｐ’という）、安定なコントロールＳＮＵ４４９（以下‘Ｃｐ’という）、ＴＭ４ＳＦ５過剰発現ＳＮＵ４４９Ｔｐ（以下、‘Ｔｐ’という）およびＳＮＵ４４９Ｔ１６（以下、‘Ｔ１６’という）を、濃度別（０、０．１、５、２０μＭ）のティアレリック酸（ＴＡ）で処理し、細胞増殖抑制効果を測定した。その結果を図１〜４にそれぞれ示す。
【００４７】
図１および図２に示すように、ティアレリック酸（ＴＡ）は、ＴＭ４ＳＦ５の発現量には影響を与えないが、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞の増殖抑制効果を示すことが分かった。
【００４８】
また図３および図４に示すように、ＴＭ４ＳＦ５−ｎｕｌｌのＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞をティアレリック酸（ＴＡ）２０μＭで３日間処理した場合、阻害効果は観察されなかった。一方、ＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞をティアレリック酸（ＴＡ）で３日間処理したとき、５μＭの低濃度でも増殖抑制効果が観察され、２０μＭの濃度では、細胞密度の低下や、丸い形の細胞が観察された（図３参照）。図４に示すように、ＴＡで処理するとＴＭ４ＳＦ５発現細胞数が減少するが、このことから、阻害効果がアポトーシスによるものであることが示唆された（図４参照）。
【００４９】
次に、ティアレリック酸（ＴＡ）がＴＭ４ＳＦ５特異的であることを確認するために、内在性ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞を用いてティアレリック酸（ＴＡ）の細胞毒性を試験した。９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクルする条件下、下記表１記載のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した（図５参照）。様々な細胞株を、５または２０μＭの濃度のティアレリック酸（ＴＡ）で処理した。
【００５０】
【表１】
【００５１】
その結果、繊維芽細胞であるＨｅｋ２９３、ＣＯＳ７、肝臓細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−４５３、胃細胞であるＳＮＵ６３８、ＳＮＵ６６８、肝臓上皮細胞であるＳＮＵ３９８細胞株といったＴＭ４ＳＦ５−ｎｕｌｌ細胞は、時間が経つにつれて増殖した。このように、これらの細胞はティアレリック酸（ＴＡ）による影響を受けなかったことを確認することができた。しかしながら、内在性ＴＭ４ＳＦ５発現細胞は、ＴＡ処理後の増殖抑制を示し、結果的に細胞数は減少した（図６および図７参照）。
結果として、上記結果はＴＭ４ＳＦ５を異所的に過剰発現するＳＮＵ４４９Ｔｐの結果と関連することが分かった。
【００５２】
実験例２．接着斑分子活性のティアレリック酸（ＴＡ）介在性阻害
シグナル伝達分子がティアレリック酸（ＴＡ）の影響を受けるかを調べるために、文献（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）に記載されているように、以下の実験を実施した。
【００５３】
用量（０、１、５、２０μＭ）および時間（０、８、１６、２４、３６時間）依存的に、ティアレリック酸（ＴＡ）でＳＮＵ４４９細胞株を処理した。
ＳＮＵ４４９ＣｐおよびＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞株を、種々の濃度（０、１、５、２０μＭ）で２４時間、ティアレリック酸（ＴＡ）処理し、免疫ブロットアッセイを実施した。
【００５４】
図８に示すように、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞は影響がなかったが、２０μＭ ＴＡで処理したＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞では、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）とパキシリンのリン酸化程度が減少し、そしてｐ１３０Ｃａｓのタンパク質レベルの減少が観察された（図８参照）。また２０μＭ ＴＡでＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞を処理した際には、時間依存的にＦＡＫとパキシリンのリン酸化やｐ１３０Ｃａｓのタンパク質レベルが著しく減少した（図９参照）。さらにティアレリック酸（ＴＡ）の処理により、ｐ１３０Ｃａｓのリン酸化が減少し、また接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、ｐ１３０Ｃａｓおよびパキシリン間の物理的な結合が弱められていることが分かった（図１０参照）。さらにＴＭ４ＳＦ５依存的なティアレリック酸（ＴＡ）の阻害効果がＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞株でも確認された（図１１参照）。これらの観察結果は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理がＴＭ４ＳＦ５細胞特異的に接着斑分子のリン酸化および複合体形成に影響することを示している。さらに、接着斑分子活性におけるティアレリック酸（ＴＡ）の効果を、内在性ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞株と発現しない細胞株で試験した。興味深いことに、内在性ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞株は、そうではない細胞株に比べ、ティアレリック酸（ＴＡ）処理による接着斑分子の活性の抑制効果を確認した（図１２参照）。しかしながら、前記結果で示されるように（図１１参照）、ティアレリック酸（ＴＡ）で処理することによってＳＮＵ４４９Ｃｐ、ＳＮＵ４４９ＴｐのいずれにおいてもｐＥｒｋ１／２を少しずつ増加させることが分かった。
【００５５】
ティアレリック酸（ＴＡ）が接着斑分子の活性と複合体形成を阻害することから、ＴＡ処理によって接着斑形成が影響を受けることが予想される。従って本発明者らは、ＴＡ処理および無処理の細胞において、Ｔｙｒ３９７がリン酸化したＦＡＫ（ｐＹ３９７ＦＡＫ）とＴｙｒ１１８がリン酸化したパキシリン（ｐＹ１１８パキシリン）を免疫染色して接着斑の形成を分析した。ＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞では、ＴＡ処理によっても接着斑形成が影響を受けないが、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞ではＴＡ処理の後接着斑形成が失われていた。ｐＹ３９７ＦＡＫまたはｐＹ１１８パキシリンの染色結果から、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞における接着斑分子が解離していることを確認した（図１３参照）。インテグリンが、ｐＹ３９７ＦＡＫのような接着斑分子の動員を仲介していること（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）に合致するように、ＴＡによる接着斑の消失は、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞におけるインテグリンα５とｐＹ３９７ＦＡＫとの間の解離に関与するだろう（図１４参照）。さらに接着斑はストレスファイバーを介し互いに連結されている（Ｋａｖｅｒｉｎａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，３４，ｐｐ．７４６−６１，２００２）ので、本発明者らはＴＡ処理細胞および無処理細胞においてアクチンを染色した。図１５に示すように、ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞では、ＴＡ処理の後、わずかなストレスファイバーしか認められない異常なアクチン構築を認めたが、一方でＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞ではそうではないことを確認した（図１５参照）。ＴＡ処理したＴＭ４ＳＦ５発現細胞において、接着斑の減少とアクチンストレスファイバー形成の減少は、ＴＡ処理後の丸い形態の細胞数が増加したことと連関しうる。
【００５６】
実験例３．ＴＭ４ＳＦ５発現細胞におけるティアレリック酸（ＴＡ）介在性アノイキス誘導
ＴＡ処理により、接着斑分子の不活性化および解離が引き起こされ、これが細胞の丸い形態の原因となっている。このことから、ＴＡ処理によってＴＭ４ＳＦ５発現細胞のアノイキスが誘導されると考えられる。ＴＡ処理が細胞接着に影響を与えるか否かを調べるため、ＴＡ介在性の細胞死を分析する前に、文献（Ｙａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１６７，ｐｐ．１２３１−４０，２００４）に記載されているように、以下の実験を実施した。
細胞を２０μＭ ＴＡで２４時間処理し、次いで浮揚した細胞を回収し、フィブロネクチンでコートされたディッシュに１時間再播種して接着の程度を決定した。
【００５７】
図１６に示すように、ＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞（ＳＮＵ４４９Ｐ、ＳＮＵ４４９Ｃｐ）はＴＡ処理に影響されなかったが、一方、ＴＡで前処理したＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞（ＳＮＵ４４９Ｔｐ、ＳＮＵ４４９Ｔ１６）では、著しい接着の低下が認められた（図１６参照）。次に、ＴＡまたはＤＭＳＯ処理の後に浮遊細胞数を分析し、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞のＳＮＵ４４９Ｔｐでは浮遊細胞数が増加することが認められたが、ＴＡ処理はＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞に影響を与えないことを確認した（図１７参照）。この結果にしたがい、ＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞をＴＡ処理することによってもまた、Ａｋｔ不活性化およびカスパーゼ−３の活性化がもたらされた（図１８参照）。加えて、２０μＭ ＴＡで２４時間処理した後の細胞内ＤＮＡ量を分析した結果、ＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９ＴｐおよびＳＮＵ４４９Ｔ１６では、多くのｓｕｂ−Ｇ１細胞が存在したが、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９Ｔｐ（図１９参照）。したがってこれらの観察結果は、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞のみでＴＡはアノイキスを発生させることを示唆している。
【００５８】
実験例４．接着斑分子の過剰発現におけるティアレリック酸（ＴＡ）を介した影響
接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、パキシリン、ｐ１３０Ｃａｓといった接着斑分子の過剰発現が、ＴＡ処理による効果をブロックするか否かを評価するために、文献（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）に記載されているように以下の実験を実施した。
【００５９】
このために、それぞれのｃＤＮＡをＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞に電気穿孔法によって導入した。１日後、２０μＭ ＴＡで細胞を２４時間処理してライセートを得た。コントロールプラスミド（ＧＦＰ）を導入したＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞をＴＡ処理すると、時間依存的な接着斑分子の不活性化およびカスパーゼ−３の活性化が認められた。このことはＴＡ介在性のアポトーシスが起きることを支持している。しかしながら、野生型接着斑キナーゼ、パキシリンまたはｐ１３０Ｃａｓを導入したＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞は、ＴＡ介在性の効果をある程度防ぐ結果となった（図２０参照）。さらに接着斑分子を過剰発現させても、ＴＡ介在性のｓｕｂ−Ｇ１細胞数の増加を防止した（図２１参照）。したがってＴＭ４ＳＦ５細胞におけるＴＡ介在性の効果は、接着斑分子の過剰発現によってある程度解消しうる。一方、Ｅｒｋ１／２活性は、いずれの実験条件でも変化がないことから、この実験系におけるシグナル伝達へのＴＡ介在性の効果を理解することができる。
【００６０】
実験例５．ヌードマウスにおけるＴＭ４ＳＦ５介在性腫瘍へのティアレリック酸（ＴＡ）の効果
ティアレリック酸（ＴＡ）の投与がヌードマウスにおけるＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍形成に干渉しうるかを評価するために、文献（Ｌｅｅ Ｓ−Ａ ｅｔ ａｌ．，ＴＭ４ＳＦ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐ２７Ｋｉｐ１ ａｎｄ Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｃａｕｓｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｏｎｔａｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００７）に記載されているように、以下の実験を実施した。
【００６１】
先に報告したように、ＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞を注射したヌードマウスでは大きな腫瘍が形成されたが、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞を注射したヌードマウスでは腫瘍は形成されなかった。腫瘍（計算上の腫瘍体積が〜２００ｍｍ３である）を持つマウスに、１日おきに３０日間ティアレリック酸（ＴＡ）を腹腔投与した場合、ＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍形成が抑制された。図２２に示すように、ティアレリック酸（ＴＡ）を３または３０ｍｇ／ｋｇ体重で投与した場合、腫瘍体積は、それぞれ約４６．０％または２２．１％にまで抑制された。ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞を注射した部位周囲のコントロール組職とＳＮＵ４４９Ｔｐ注射したマウスの腫瘍組職とを用いたウエスタンブロット分析により、ＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍組織ではＡｋｔが活性化し、カスパーゼ−３が不活性化することが明らかとなった。このことは、腫瘍形成にはシグナル活性が必要であることを示している。しかしながらＴＡを注入することによって、Ａｋｔ活性が減少し、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂまたはｐ１６ＩＮＫ４Ａ ＣＫＩ（サイクリン依存的キナーゼインヒビター）レベルが増加し、カスパーゼ−３活性は増強する。このことは、ＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍において、ＴＡがその成長を阻害するとともにアポトーシスの原因となることを示している（図２３参照）。ＴＡ処理したマウスから得られるＴＭ４ＳＦ５介在性腫瘍における、カスパーゼ−３の免疫組職化学染色は、ポジティブであった（図２４参照）。したがってＴＡは、ヌードマウスにおけるＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍形成特異的に干渉するが、これはアポトーシスを促進するためであると推定される。これらの結果は、ＴＭ４ＳＦ５ポジティブな腫瘍に対する有望な治療剤としてティアレリック酸（ＴＡ）がさらに開発に資することを示唆している。
【００６２】
本発明の抽出物または化合物を含む医薬組成物の例を説明する。しかしながらこれらの例は、例示のみを目的とするものであり、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６３】
製剤例１．散剤の製造
ズダヤクシュ粗抽出物 ３００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
前記の成分を混合して気密性のある嚢に充填して散剤を製造した。
【００６４】
製剤例２．錠剤の製造
ティアレリック酸 ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記成分の混合物を用い、通常の錠剤の製造方法によって錠剤を製造した。
【００６５】
製剤例３．カプセル剤の製造
ズダヤクシュ粗抽出物 ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法にしたがい、前記成分の混合物をゼラチンカプセルに充電して、カプセル剤を製造した。
【００６６】
製剤例４．注射剤の製造
ティアレリック酸 ５０ｍｇ
注射用滅菌蒸溜水 適量
ｐＨ調節剤 適量
通常の注射剤の製造方法にしたがい、上記成分を含む注射剤を（２ｍｌ）アンプルで製造した。
【００６７】
製剤例５．液剤の製造
ズダヤクシュ粗抽出物 １００ｍｇ
異性化糖 １０ｇ
マンニトール ５ｇ
精製水 適量
通常の液剤の製造方法にしたがい、各成分を精製水に溶解させる。レモン香を適量加え、混合した。次いで精製水を加えて全体１００ｍｌに調節した後、茶色瓶に充填して液剤を製造した。
【００６８】
製剤例６．健康食品の製造
ティアレリック酸 １０００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０μｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミン ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２μｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０μｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０μｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
ミネラル混合物 適量
硫酸第１鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
リン酸二水素カリウム １５ｍｇ
リン酸一水素カリウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
前記ビタミンおよびミネラル混合物の組成は、それぞれの適切な成分の好ましい組合せに従うが、改変してもよい。上記成分は通常の健康食品の製造方法にしたがって混合され、健康食品組成物としてさらに用いるための顆粒剤となった。
【００６９】
製剤例７．健康飲料の製造
ズダヤクシュ粗抽出物 １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
梅濃縮液 ２ｇ
タウリン １ｇ
精製水 ９００ｍｌ
通常の健康飲料の製造方法にしたがって上記成分を混合し、混合物を８５℃で１時間撹拌しながら加熱した。溶液を濾過し、シールした滅菌済み２Ｌ容器に入れて滅菌した。冷蔵保管した後、本発明の健康飲料組成物の製造に使用した。
【００７０】
飲料の粗製は各成分の好ましい組合せに従うものであるが、それらに限定されるものではなく、また需要者層、国、使用目的、地域的、民族的な趣向を考慮して改変してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明のズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩は、癌細胞の増殖を減少させ、細胞死を誘導する効果を有するので、癌疾患の予防および治療用医薬組成物および機能健康食品として使用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含む、癌細胞特異的アノイキス誘導剤、ならびにこれを含む坑癌組成物または機能健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンと細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との相互作用は、細胞接着を仲介し、インテグリンを介した細胞接着は、多様なシグナル分子の活性と局在を制御し、結果的に細胞の機能あるいは動態までも制御する（Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２，ｐｐ．４４２−５４，２００２；Ｂｒａｋｅｂｕｓｃｈ，Ｃ．ａｎｄ Ｆａｓｓｌｅｒ，Ｒ．，Ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ａｃｔｉｎ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ，ａｎ ｅｔｅｒｎａｌ ｌｏｖｅ ａｆｆａｉｒ．，ＥＭＢＯ Ｊ，２２，ｐｐ．２３２４−３３，２００３）。インテグリンの細胞外部位が接着斑でＥＣＭと相互作用することによって、インテグリンサブユニットの細胞内、細胞質側末端に多様な細胞接着分子が集まることになる。これらの中には、パキシリンやｐ１３０Ｃａｓといったアダプター蛋白質や、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、ｃ−Ｓｒｃなどのシグナル分子が存在する（ＤｅＭａｌｉ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｋ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｃｔｉｎ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５，ｐｐ．５７２−８２，２００３；Ｃａｒｒａｇｈｅｒ，Ｎ．Ｏ．ａｎｄ Ｆｒａｍｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ：ａ ｐｌａｃｅ ｗｈｅｒｅ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｍｅｅｔ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１４，ｐｐ．２４１−９，２００４）。インテグリンに多様な細胞シグナル分子が集まることによって自身が活性化し、アクチン細胞骨格の再編成をもたらして、結果的に細胞の形態変化を引き起こす（Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，３２，ｐｐ．４４３−６，２００４）。接着斑のインテグリンは（特に細胞質側末端で）タンパク質複合体を介しアクチンフィラメントに連結されているため、接着斑分子が十分に集まることができない場合や、アクチンフィラメントが異常に再編成される場合は、付随して接着斑がなくなって細胞が丸くなり、細胞が基底膜から離脱する（Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ，Ｓ．ａｎｄ Ｋａｎａｉ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ，９４，ｐｐ．５７５−８１，２００３）。換言すれば、正常の上皮細胞はＥＣＭリッチな基底膜に単層を形成し、ＥＣＭからの細胞外シグナルを効果的に伝達することで生存することができるが、接着斑を失った細胞はアノイキスが誘導され、基底膜から細胞が剥がれることによって死ぬことになる。
【０００３】
多くの遺伝変異や遺伝的不安定さが生じることにより、細胞−ＥＣＭ相互作用や細胞−細胞間の接触が異常変化することによって、癌細胞は原発巣から転移できるようになる。転移性の癌細胞周囲の微細環境では、癌細胞自体または周囲の繊維芽細胞、白血球細胞、内皮細胞が分泌する成長因子や、サイトカインが細胞間の接触、接着、移動および浸潤などに重要な役割をはたす（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００，ｐｐ．４４８−６４，２００３）。転移性癌細胞は基底膜と間質領域を横断して循環系に入り（侵入）、その循環系で生き残る。ついで、管外遊出によって循環系から離脱する。この過程で、インテグリンを介した癌細胞とＥＣＭとの相互作用が、癌細胞の転移ポテンシャルを決定する重要な要素となりうる（Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５５，ｐｐ．１０３７−５７，１９８６）。播種性癌細胞の中で、アノイキスで生き残った細胞のみが血管やリンパ管を介して遠隔部位に移動し、最終的にその部位に定着して転位性腫瘍として増殖することになる（Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．，Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２，ｐｐ．４４２−５４，２００２）。
【０００４】
したがって抗発癌性または抗転位性の試薬をスクリーニングする場合、正常細胞には影響を与えずに発癌性細胞にアノイキスを引き起こす試薬を見つけることは有用であるだろう。
【０００５】
ＴＭ４ＳＦ５（またはＬ６Ｈ）は腫瘍関連抗原Ｌ６のホモログであり、Ｌ６、ＩＬ−ＴＭＰおよびＬ６Ｄとともに４回膜貫通型Ｌ６スーパーファミリーを形成する（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌ６ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａ ｎｅｗ ｆｏｕｒｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，９，ｐｐ．１５９４−６００，２０００）。ＴＭ４ＳＦ５は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、乳頭癌および軟部肉腫、ならびに非内分泌性肺腫瘍およびＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）ネガティブな気管支カルチノイド腫瘍において過剰発現する（Ｐａｓｃｕａｌ−Ｌｅ Ｔａｌｌｅｃ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｉｄ ｔｕｍｏｒｓ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，８７，ｐｐ．５０１５−２２，２００２）。最近我々は、ＴＭ４ＳＦ５が肝臓癌でも過剰発現していること、ＴＭ４ＳＦ５がアクチンの再配列と上皮間葉移行（ＥＭＴ）を引き起こし、コンタクト・インヒビションの低下と発癌性増殖を導くことを発見した（Ｌｅｅ Ｓ−Ａ ｅｔ ａｌ．，ＴＭ４ＳＦ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐ２７Ｋｉｐ１ ａｎｄ Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｃａｕｓｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｏｎｔａｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００７）。繊維芽細胞においてＴＭ４ＳＦ５を過剰発現させた場合、アクチン再編成と接着斑のターンオーバーが生じた（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）。ＴＭ４ＳＦ蛋白質（テトラスパニンまたはテトラスパンとして知られている）は、４つの膜貫通ドメインを有する約２５−５０ｋＤａの大きさの疎水性タンパク質のグループであり、二つの細胞外ループと二つの短い細胞質側末端を持っている（Ｓｔｉｐｐ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２８，ｐｐ．１０６−１２，２００３）。インテグリンのような細胞接着分子と複合体を形成することで、ＴＭ４ＳＦはテトラスパニン−ウェブ構造を形成する。この構造は、細胞の接着と運動において協調して役割を果たす（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ，Ｆ，Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｍｅｅｔｓ ｔｈｅ ｅｙｅ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１４，ｐｐ．４１４３−５１，２００１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の開示
技術的課題
本発明の目的は、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤を提供することである。当該剤は、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞に特異的である。
本発明の他の目的は、前記癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を含む癌疾患の治療および予防用医薬組成物および癌疾患の予防および改善用機能健康食品を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ＴＭ４ＳＦ５−ｎｕｌｌの親ＳＮＵ４４９細胞（以下‘Ｐ’という）、安定なコントロールのＳＮＵ４４９細胞（以下‘Ｃｐ’という）、安定なＴＭ４ＳＦ５過剰発現のＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞（以下‘Ｔｐ’という）およびＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞（以下‘Ｔ１６’という）のＴＭ４ＳＦ５発現を示す図である。
【図２】図２は、ティアレリック酸（ＴＡ）の処理がＰ、Ｃｐ、ＴｐおよびＴ１６細胞のＴＭ４ＳＦ５発現に及ぼす影響を示す図である。
【図３】図３は、ティアレリック酸（ＴＡ）の濃度によってＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞およびＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞の増殖が変化したことを示す顕微鏡写真である。
【図４】図４は、ティアレリック酸（ＴＡ）の濃度依存的および時間依存的ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞およびＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞数を示すグラフである。
【図５】図５は、様々な細胞株におけるＴＭ４ＳＦ５発現を確認した結果を示す図である。
【図６】図６は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＴＭ４ＳＦ５を発現するか、または発現しない様々な細胞株の細胞数を示すグラフである。
【図７】図７は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＴＭ４ＳＦ５−ｎｕｌｌ細胞（ＳＮＵ６３８およびＳＮＵ６６８）における接着斑分子の発現および活性化を示す顕微鏡写真である。
【図８】図８は、免疫ブロットアッセイの結果を示す。ここで接着斑分子の発現および活性化は、ティアレリック酸（ＴＡ）の濃度を変えて処理した細胞株において試験される。
【図９】図９は、免疫ブロットアッセイの結果を示す。ここで接着斑分子の発現および活性化は、ティアレリック酸（ＴＡ）で処理する時間を変えた細胞株において試験される。
【図１０】図１０は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ｐ１３０Ｃａｓのリン酸化レベルおよびｐ１３０Ｃａｓ、ＦＡＫおよびパキシリン間の物理的結合を示す図である。
【図１１】図１１は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＳＮＵ４４９細胞株における接着斑分子の発現および活性化を示す図である。
【図１２】図１２は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＴＭ４ＳＦ５を発現するか、または発現しない様々な細胞株における接着斑分子の発現および活性を示す図である。
【図１３】図１３は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ｐＹ３９７ＦＡＫ（接着斑キナーゼ）およびｐＹ１１８パキシリンの免疫染色によって、接着斑の形成を分析した結果である。
【図１４】図１４は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、インテグリンα５とｐＹ３９７ＦＡＫと間の解離を示す図である。
【図１５】図１５は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、アクチンストレスファイバー形成の消失を示す図である。
【図１６】図１６は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＳＮＵ４４９細胞株における接着の程度を示すグラフである。
【図１７】図１７は、時間を変えてティアレリック酸（ＴＡ）処理した後、浮遊しているＳＮＵ４４９ＣｐおよびＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞数を示すグラフである。
【図１８】図１８は、時間を変えてティアレリック酸（ＴＡ）処理した後、細胞生存および細胞死関連シグナル分子のウエスタンブロットを行った結果である。
【図１９】図１９は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、細胞ＤＮＡ量の分析結果である。
【図２０】図２０は、ＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞において、野生型ＦＡＫ、パキシリンまたはｐ１３０Ｃａｓを過剰発現させることによる、ＴＡ介在性効果に対する阻害の程度を示す図である。
【図２１】図２１は、ＤＮＡ量の分析結果である。接着斑分子の過剰発現により、ＴＡ介在性の細胞死が阻害される。
【図２２】図２２は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞株を注入されたマウスの体重および腫瘍体積の変化を示す図である。
【図２３】図２３は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、ＴＭ４ＳＦ５介在性腫瘍組職における細胞死の誘導を示す図である。
【図２４】図２４は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理後の、マウスＴＭ４ＳＦ５介在性腫瘍組職におけるカスパーゼ−３の活性化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ベストモード
一態様において、本発明はズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含む、アノイキス誘導剤に関する。当該剤は、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞に特異的である。
【０００９】
本明細書中で使用するとき、ズダヤクシュ Ｄ．Ｄｏｎ（喘息薬種としても知られていう）は、ユキノシタ科の多年生草本のことをいう。これは大韓民国の鬱陵島の山頂のみで棲息する。本発明のズダヤクシュ抽出物は、ズダヤクシュから抽出した粗抽出物または極性溶媒可溶抽出物である。粗抽出物としては精製水を含む水、炭素数１〜４の低級アルコールおよびこれらの混合溶媒よりなる群から選ばれる溶媒、好ましくはメタノールに溶解される抽出物が挙げられる。また、極性溶媒可溶抽出物としては、水、メタノール、エタノール、ブタノールおよびこれらの混合溶媒よりなる群から選ばれる溶媒、好ましくはブタノールに溶解される抽出物が挙げられる。
【００１０】
本発明のズダヤクシュ抽出物は当業者によく知られた方法によって製造できる。例えば、ズダヤクシュを丸ごと採集し、陰干しし、次いで粉末化する。そしてズダヤクシュ粉末を２〜２０倍体積の極性溶媒、たとえば水、メタノール、エタノールおよびブタノールといったＣ１〜Ｃ４の低級アルコールまたはこれらを約１：０．１〜１：１０の混合比で混合した混合溶媒といった極性溶媒、好ましくはメタノールと混合し、２０〜５０℃で約１０時間〜４８日、好ましくは２０時間〜３０時間、熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出または超音波抽出などの抽出方法で２〜５回、好ましくは２〜３回抽出する。そして結果物を通常の方法によって濾過、濃縮および乾燥して、粗抽出物を得ることができる。また本発明の極性溶媒可溶抽出物は、前記粗抽出物を蒸溜水に懸濁した後、１〜１００倍、好ましくは１〜５倍体積の、水、エタノール、メタノールおよびブタノールといった極性溶媒と混合し、１回〜１０回、好ましくは１回〜５回抽出、分離して収得することで得る。さらに追加で通常の分画工程を行うこともできる（Ｈａｒｂｏｒｎｅ Ｊ．Ｂ．，Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｏｄｅｒｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ．３，ｐｐ６−７，１９９８）。
【００１１】
本発明のズダヤクシュ抽出物から分離したティアレリック酸化合物［３，２３−ジヒドロキシ−２０（２９）−ルペン−２７−オイック アシッド］は下記化学式（Ｉ）
【００１２】
【化１】
【００１３】
で表される。
【００１４】
ティアレリック酸化合物は、当業者によく知られた方法によってズダヤクシュ抽出物から分離されうる。例えば本発明のズダヤクシュ抽出物を蒸溜水に懸濁し、次いでヘキサンで抽出してヘキサン可溶成分を分画する。ヘキサン可溶性画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサン−クロロホルム−メタノール混合溶媒で溶出して画分を得る。ティアレリック酸を含む画分を、繰返しカラムクロマトグラフィーに付す。ティアレリック酸を高純度で含む画分を溶媒再結晶に付して、本発明の純粋なティアレリック酸が得られる。
【００１５】
本明細書中で使用するとき、用語「薬学的に許容可能な塩」とは、薬学的または生理学的に許容される、無機酸および有機酸、ならびに塩基から誘導される塩を意味する。適切な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−硫酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸などが挙げられる。適切な塩基から誘導された塩としては、ナトリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、ならびにアンモニウムなどが挙げられる。
【００１６】
本発明のズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩は、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現している癌細胞に特異的に作用して、癌細胞のアノイキスを誘導する。
【００１７】
本明細書中で使用するとき、用語「腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログ」とは、膜貫通型Ｌ６スーパーファミリーを形成して非制御性の細胞増殖を誘導する蛋白質のことをいい、これは様々な腫瘍細胞で発現する。腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログとしては、Ｌ６、ＴＭ４ＳＦ５（またはＬ６Ｈ；４回膜貫通型Ｌ６ファミリーメンバー５）、ＩＬ−ＴＭＰおよびＬ６Ｄが挙げられ、好ましくはＴＭ４ＳＦ５である。
【００１８】
本明細書中で使用するとき、用語「アノイキス」とは、細胞外マトリックスへの細胞接着の失敗、または細胞外マトリックスへの不適切な細胞接着によって発生する、特殊なタイプのアポトーシスのことをいう。本発明では便宜上、細胞死またはアポトーシスをアノイキスということとする。
【００１９】
本発明の具体的な態様において、腫瘍関連抗原Ｌ６のホモログであるＴＭ４ＳＦ５による細胞増殖を抑制する化合物を捜す過程で、本発明者らは、ティアレリック酸（３，２３−ジヒドロキシ−２０（２９）−ルペン−２７−オイック アシッド）が、ＴＭ４ＳＦ５が発現する細胞株においてアノイキスを誘導することを発見した。ＴＭ４ＳＦ５発現細胞株をティアレリック酸（ＴＡ）で処理したとき、接着斑分子のリン酸化が阻害され、細胞接着が失われた。そして細胞増殖が阻害され、アノイキスが引き起こされた。またヌードマウスにおいて、ＴＡの投与はＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍発生を抑制した。これらの観察結果から、ティアレリック酸（ＴＡ）がＴＭ４ＳＦ５ポジティブな腫瘍発生に対する推定治療剤として開発されうることが示唆される。
【００２０】
前記腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞は、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳房癌、肺癌、非小細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、皮膚または眼黒色腫、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、悪性リンパ腫、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状線癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎細胞癌腫、腎臓骨盤癌、中枢神経系腫瘍、中枢神経系原発リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマまたは下垂体腺腫を引き起こすことが知られており、好ましくは肝臓癌、膵臓癌、胃癌、大腸癌、乳頭癌、軟部肉腫、非内分泌性肺腫瘍、ＡＣＴＨネガティブな気管支カルチノイド腫瘍を引き起こす癌細胞である。
【００２１】
他の見地では、本発明は、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤であって、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を有効成分として含む、癌疾患の予防および治療用医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明の癌疾患の予防および治療用組成物は、組成物の総重量に対して、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含む癌細胞特異的アノイキス誘導剤を０．１〜５０％重量含む。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、医薬組成物の製造に一般的に使用される適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含んでいてもよい。
【００２４】
従来の方法によれば、本発明の医薬組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、乳剤、シロップ、エアロゾールといった経口剤、外用剤、坐剤または滅菌注射液の形態に剤形化されうる。組成物に含まれる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が例示されうる。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製されうる。経口投与のための固形製剤の例としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤およびカプセル剤などが挙げられ、このような固形製剤は前記化合物と少なくとも１種以上の賦形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトースおよびゼラチンを混合して調製される。また賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクといった滑剤も使用されうる。経口投与のための液状製剤の例としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤およびシロップ剤が挙げられ、水や液体パラフィンといった一般的な希釈剤に加えて様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤および保存剤が含まれていてもよい。非経口投与のための製剤の例としては、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤が挙げられる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されうる。坐剤の基剤としては、ウィテプソール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオバター、ラウリンバター、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００２５】
本発明において、医薬組成物の効果的な投与量は、患者の健康状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および投与時間によって決定されうるが、当業者であれば適切に選択することができる。しかしながら、所望の効果を得るために、本発明の組成物は、１日あたり０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇで投与されうる。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量は本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトといった哺乳動物に多様な経路を通じて投与されうる。投与のすべての方式は予め定められており、例えば経口、直腸または静脈内、筋肉内、皮下、子宮内硬膜または脳室内注射によって投与されうる。
【００２７】
さらに他の見地では、本発明は、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞特異的に生じる癌疾患を治療および予防する方法であって、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤、あるいは当該剤を含む癌疾患の治療および予防用医薬組成物を、癌を持つ対象に投与する工程を含む、方法に関する。
【００２８】
本発明の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤または医薬組成物にしたがって、その効能、投与方法および投与量などに関する内容は前記したものと同じである。本発明の方法において、用語「対象」は、ヒト、サル、マウス、ブタ、ウシおよびウサギといった哺乳動物を包含するが、これらに限定されない。
【００２９】
さらに他の見地において、本発明は、ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤であって、当該剤が腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞特異的であるアノイキス誘導剤を有効成分として含む、機能健康食品を提供する。癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を有効成分として含む食品としては各種の食品類、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康改善食品類などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含む、癌細胞特異的なアノイキス誘導剤は、総食品重量あたり０．０１〜１５重量％含んでいてもよく、健康飲料組成物の１００ｍｌあたり０．０２〜５ｇ、好ましくは０．３〜１ｇを加えてもよい。
【００３１】
本発明の機能健康食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤、液状製剤などの形態でありうる。
【００３２】
本発明の健康飲料組成物は、所定の割合で必須成分として前記化合物を含む液体である限りにおいて、他の成分には特に制限がなく、普通の飲料と同様にさまざまな香味剤または天然の炭水化物などを追加成分として含んでいてもよい。前述した天然炭水化物の例としては、葡萄糖、果糖といった単糖類；マルトース、スクロースといった二糖類；およびデキストリン、シクロデキストリンといった多糖類、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールといった糖アルコールが挙げられる。前述した以外の香味剤としては、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ）、グリシルリジン）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム）を有利に使用することができる。天然の炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり、通常約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００３３】
前記の外に、本発明の機能健康食品はさまざまな営養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。その他に、本発明の機能健康食品は、天然果物ジュースおよび果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は独立してまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合はあまり重要ではないが、本発明の化合物１００重量部当たり０〜約２０重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００３４】
以下、本発明を下記の実施例および実験例に基づいて詳細に説明する。ただし、下記の実施例および実験例は本発明を例示するものであるだけであり、本発明の内容が下記の実施例および実験例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
発明の実施形態
実施例１．ズダヤクシュの粗抽出物の製造
大韓民国の鬱陵島で採取したズダヤクシュの全草１．１ｋｇを乾燥、粉砕し、メタノール５Ｌを混合した。混合物を常温で２４時間撹拌し、真空濾過して上澄液を回収した。この工程を２回繰り返して上澄液を集めた。次いで上澄液を減圧濃縮して、ズダヤクシュのメタノール粗抽出物１００．５ｇを得た。
【００３６】
実施例２．ズダヤクシュ極性溶媒可溶抽出物の製造
実施例１で得たズダヤクシュ粗抽出物を蒸溜水１Ｌに懸濁した。ここに１Ｌのブタノールを加えて混合し、ブタノール可溶画分と水可溶性画分とに分離し、続けて濾過、減圧濃縮し、溶媒を除去した。最後にズダヤクシュのブタノール可溶抽出物８０．０ｇを得た。これは以下の実験例の試料として使用する。
【００３７】
実施例３．ズダヤクシュ抽出物からのティアレリック酸の分離
ズダヤクシュ３２．９ｋｇを６４Ｌのメタノールで７日間かけて室温で抽出し、次いで減圧下で濃縮して３．５２ｋｇのメタノール抽出物を得た。メタノール抽出物３．５２ｋｇを水１０Ｌに懸濁した後、ヘキサン３０Ｌで３回繰り返し抽出して、ヘキサン可溶画分６５１ｇを得た。濾液を酢酸エチル３０Ｌで３回繰り返し抽出して、酢酸エチル可溶抽出物を５１０ｇ得た。さらに酢酸エチルで抽出した後に残った懸濁液４０ＬをＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０に入れ、水８０Ｌで溶出した。水溶性画分を凍結乾燥して１．４ｋｇを得、次いで５０％メタノール８０Ｌで溶出した。５０％メタノール可溶画分を凍結乾燥して７９２ｇを得た。最後にメタノールでＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０カラムを溶出して、メタノール可溶画分１５８ｇを得た。ズダヤクシュ抽出物のそれぞれの画分を薄層クロマトグラフィーに付した。その結果、ヘキサン可溶画分にティアレリック酸が多量含有されていることが確認された。ヘキサン画分の半分量である３３０ｇをシリカゲル４ｋｇに加え、次いでヘキサン−酢酸エチル（１０：１，１３．２Ｌ；５：１，１６．８Ｌ；２：１，２４Ｌ）、クロロホルム−メタノール（９：１，３６Ｌ）、クロロホルムメタノール−水（７：３：０．１，２０Ｌ）およびメタノール１２Ｌで続けて溶出して九つの画分を得た。薄層クロマトグラフィーによって６および７番目の画分でティアレリック酸を確認した。ティアレリック酸を含む２つの画分を合わせ、これをシリカゲル２ｋｇに加えた後、クロロホルム−メタノール（２０：１，１８．９Ｌ；７：１，９Ｌ；３：１，４Ｌ）およびメタノール９Ｌで溶出して１１の画分を得た。この中で、４、５および６番目の画分にティアレリック酸が含有されていることを確認した。これらの画分をシリカゲルカラムにアプライし、溶媒再結晶に付してティアレリック酸２ｇを得た。加えて残りのヘキサン可溶画分３３０ｇを前記のような方法で分画してティアレリック酸２ｇを得た。下記の物性値を持つ全量４ｇのティアレリック酸（以下、ＴＡという）を分離精製した。
【００３８】
Ｎｅｅｄｌｅｓ（ＭｅＯＨ）；
ｍｐ ２５４−２５６℃；
［ａ］２３Ｄ ＋９４（ピリジン，ｃ ０．１４）；
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４９１（ＯＨ），１６８９（ＣＯ），１６４５（Ｃ＝Ｃ），１４５０，１３８８，１２６２，１２２２，１０４４；ＨＲＭＳ ｍ／ｚ ４７２．３５５２（Ｍ＋，Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ４８Ｏ４：４７２．３５５３）；
ＥＩＭＳ（ｒｅｌ．ｉｎｔ．）ｍ／ｚ：４７２［Ｍ］＋（６１），４５４［Ｍ−Ｈ２Ｏ］＋（３４），４３６［Ｍ−２Ｈ２Ｏ］＋（６２），４２４（４２），３９６（２６），２０５（７５），１８７（７１），１７５（８７），１７３（１００）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ピリジン−ｄ５）：１３．０（Ｃ−２４），１７．４（Ｃ−２５），１７．５（Ｃ−２６），１８．７（Ｃ−６），１８．８（Ｃ−２８），１９．４（Ｃ−３０），２１．３（Ｃ−１１），２５．８（Ｃ−１５），２６．７（Ｃ−１２），２７．９（Ｃ−２），３０．１（Ｃ−２１），３７．７（Ｃ−１０），３８．２（Ｃ−７），３８．３（Ｃ−１６），３９．２（Ｃ−１），３９．６（Ｃ−１３），４０．４（Ｃ−２２），４０．８（Ｃ−８），４２．９（Ｃ−４），４３．０（Ｃ−１７），４８．１（Ｃ−１９），４９．２（Ｃ−５），５１．４（Ｃ−１８），５１．６（Ｃ−９），６０．４（Ｃ−１４），６８．２（Ｃ−２３），７３．６（Ｃ−３），１１０．２（Ｃ−２９），１５０．９（Ｃ−２０），１７８．３（Ｃ−２７）；
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ピリジン−ｄ５）：１．０５，１．７１（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−１），１．８２，１．９１（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−２），４．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．７，１１．６Ｈｚ，Ｈ−３），１．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，１２．０Ｈｚ，Ｈ−５），１．４８，１．６５（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−６），１．８７，２．０６（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−７），２．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７，１２．７Ｈｚ，Ｈ−９），１．３２，１．６４（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−１１），１．８７，２．６０（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−１２），１．８８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１３），１．６７，２．２８（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−１５），１．７０，１．７８（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−１６），１．８１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１８），２．６０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１９），１．３６，１．９７（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−２１），１．１６，１．４０（２Ｈ，ｍ，ｅａｃｈ，Ｈ−２２），３．５７，４．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．４，ｅａｃｈ，Ｈ−２３），１．０４（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２４），１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２５），１．２１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２６），０．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２８）．４．７６，４．９６（２Ｈ，ｓ，ｅａｃｈ，Ｈ−２９），１．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｈ−３０）．
【００３９】
参考例１．細胞培養
ウイルス感染の後、空のｐＬＮＣＸまたはＴＭ４ＳＦ５を挿入したｐＬＮＣＸのレトロウイルスを、ＳＮＵ４４９肝臓癌細胞株（大韓民国細胞銀行（ＫｏｒｅａｎＣｅｌｌＢａｎｋ）、ソウル、大韓民国）に感染させることによって、プールした安定クローン（コントロールのＳＮＵ４４９ＣｐおよびＴＭ４ＳＦ発現ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞クローン）と単一細胞由来の細胞（ＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔ１６）とを製造した。親細胞およびコントロール細胞（Ｃｐ）は、それぞれ２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）無しまたはありの条件下、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／０．２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。内在性ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞または内在性ＴＭ４ＳＦ５を全く発現しない細胞（大韓民国細胞銀行）は、１０％ＦＢＳ（ＪＢＩ Ｉｎｃ．，大邱、大韓民国）入りのＤＭＥＭ−ＨあるいはＲＰＭＩ−１６４０培養液中でそれぞれ培養した。
【００４０】
参考例２．細胞溶解物の製造およびウエスタンブロット
全細胞溶解物は文献（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）記載のとおり、様々な実験条件で得た。例えば、コントロールＧＦＰ、野生型接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、パキシリン、ｐ１３０Ｃａｓ ｃＤＮＡと共の電気穿孔法（９５０μＦ、２５０Ｖ）を細胞に実施した。電気穿孔の１日後、細胞をティアレリック酸（２０μＭ）で所定の間処理した。通常の条件で培養した細胞、あるいは異なる濃度で所定の間ＴＡ処理した細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて回収した。ヌードマウスから得たコントロールまたは腫瘍組職は、手術後直ちに液体窒素を用いて氷らせた。すり鉢とすりこぎを用いて液体窒素中の組織をホモジナイズし、０．１％ＳＤＳ含有ＲＩＰＡ緩衝液を用いて抽出した。溶解物の標準的ウエスタンブロットは、リン酸化Ｙ３９７、Ｙ４０７、Ｙ５７７、Ｙ８６１、Ｙ９２５ＦＡＫ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、リン酸化Ｙ４１６Ｓｒｃ、ｃ−Ｓｒｃ、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＦＡＫ、ｐ１３０Ｃａｓ、パキシリン、ｐＹ１１８パキシリン、活性カスパーゼ−３（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｌａｂ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、α−チューブリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、リン酸化−Ｓ４７３またはＴ３０８Ａｋｔ、Ａｋｔ、リン酸化−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）およびＴＭ４ＳＦ５（自作）に対する抗体を用いて行った。
【００４１】
参考例３．免疫蛍光顕微鏡
細胞をＤＭＳＯまたは２０μＭのＴＡで２４時間処理した。次いで１０μｇ／ｍｌでフィブロネクチンをコートしたカバースリップ上に細胞を播種し、ＤＭＳＯまたは２０μＭのＴＡ存在下で２時間インキュベートした。続けてｐＹ３９７ＦＡＫ、ｐＹ１１８パキシリンおよびアクチンに対し、文献（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）記載のように免疫蛍光染色を実施した。マウントしたサンプルは、蛍光顕微鏡（ＢＸ５１，オリンパス，日本）で視覚化した。
【００４２】
参考例４．実験動物の準備
４〜５週齢の雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊＢｇｉ−ｎｕ）をＯｒｉｅｎｔ．Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｓｅｏｎｇｎａｍ，大韓民国）から購入した。マウスは制御された温度と湿度において、特別な無菌室に収容された。すべての動物への処置は、ソウル大学校実験動物管理マニュアルと臨床倫理委員会協定に従って実施された。５〜６週齢のマウス皮下に５×１０６個のＳＮＵ４４９Ｃｐ生細胞またはＳＮＵ４４９Ｔ１６生細胞を注射した。腫瘍の体積をキャリパーで測定し、下記の数式１で計算した。体積が２００ｍｍ３に達したときから、３ｍｇ／ｋｇあるいは３０ｍｇ／ｋｇ（体重）のティアレリック酸（ＴＡ）を１日おきに３０日間、腹腔内注射した。
【００４３】
【数１】
【００４４】
横長：短辺の長さ（ｍｍ）
縦長：長辺の長さ（ｍｍ）
【００４５】
実験例１．ＴＭ４ＳＦ５発現細胞の増殖抑制効果
実施例３で得たティアレリック酸（ＴＡ）の、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞への増殖抑制効果を測定するために、文献（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）に記載されているように、以下の実験を実施した。
【００４６】
参考例１の方法で培養した、ＴＭ４ＳＦ５−ｎｕｌｌの親ＳＮＵ４４９（以下‘Ｐ’という）、安定なコントロールＳＮＵ４４９（以下‘Ｃｐ’という）、ＴＭ４ＳＦ５過剰発現ＳＮＵ４４９Ｔｐ（以下、‘Ｔｐ’という）およびＳＮＵ４４９Ｔ１６（以下、‘Ｔ１６’という）を、濃度別（０、０．１、５、２０μＭ）のティアレリック酸（ＴＡ）で処理し、細胞増殖抑制効果を測定した。その結果を図１〜４にそれぞれ示す。
【００４７】
図１および図２に示すように、ティアレリック酸（ＴＡ）は、ＴＭ４ＳＦ５の発現量には影響を与えないが、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞の増殖抑制効果を示すことが分かった。
【００４８】
また図３および図４に示すように、ＴＭ４ＳＦ５−ｎｕｌｌのＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞をティアレリック酸（ＴＡ）２０μＭで３日間処理した場合、阻害効果は観察されなかった。一方、ＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞をティアレリック酸（ＴＡ）で３日間処理したとき、５μＭの低濃度でも増殖抑制効果が観察され、２０μＭの濃度では、細胞密度の低下や、丸い形の細胞が観察された（図３参照）。図４に示すように、ＴＡで処理するとＴＭ４ＳＦ５発現細胞数が減少するが、このことから、阻害効果がアポトーシスによるものであることが示唆された（図４参照）。
【００４９】
次に、ティアレリック酸（ＴＡ）がＴＭ４ＳＦ５特異的であることを確認するために、内在性ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞を用いてティアレリック酸（ＴＡ）の細胞毒性を試験した。９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクルする条件下、下記表１記載のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した（図５参照）。様々な細胞株を、５または２０μＭの濃度のティアレリック酸（ＴＡ）で処理した。
【００５０】
【表１】
【００５１】
その結果、繊維芽細胞であるＨｅｋ２９３、ＣＯＳ７、肝臓細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−４５３、胃細胞であるＳＮＵ６３８、ＳＮＵ６６８、肝臓上皮細胞であるＳＮＵ３９８細胞株といったＴＭ４ＳＦ５−ｎｕｌｌ細胞は、時間が経つにつれて増殖した。このように、これらの細胞はティアレリック酸（ＴＡ）による影響を受けなかったことを確認することができた。しかしながら、内在性ＴＭ４ＳＦ５発現細胞は、ＴＡ処理後の増殖抑制を示し、結果的に細胞数は減少した（図６および図７参照）。
結果として、上記結果はＴＭ４ＳＦ５を異所的に過剰発現するＳＮＵ４４９Ｔｐの結果と関連することが分かった。
【００５２】
実験例２．接着斑分子活性のティアレリック酸（ＴＡ）介在性阻害
シグナル伝達分子がティアレリック酸（ＴＡ）の影響を受けるかを調べるために、文献（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）に記載されているように、以下の実験を実施した。
【００５３】
用量（０、１、５、２０μＭ）および時間（０、８、１６、２４、３６時間）依存的に、ティアレリック酸（ＴＡ）でＳＮＵ４４９細胞株を処理した。
ＳＮＵ４４９ＣｐおよびＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞株を、種々の濃度（０、１、５、２０μＭ）で２４時間、ティアレリック酸（ＴＡ）処理し、免疫ブロットアッセイを実施した。
【００５４】
図８に示すように、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞は影響がなかったが、２０μＭ ＴＡで処理したＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞では、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）とパキシリンのリン酸化程度が減少し、そしてｐ１３０Ｃａｓのタンパク質レベルの減少が観察された（図８参照）。また２０μＭ ＴＡでＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞を処理した際には、時間依存的にＦＡＫとパキシリンのリン酸化やｐ１３０Ｃａｓのタンパク質レベルが著しく減少した（図９参照）。さらにティアレリック酸（ＴＡ）の処理により、ｐ１３０Ｃａｓのリン酸化が減少し、また接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、ｐ１３０Ｃａｓおよびパキシリン間の物理的な結合が弱められていることが分かった（図１０参照）。さらにＴＭ４ＳＦ５依存的なティアレリック酸（ＴＡ）の阻害効果がＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞株でも確認された（図１１参照）。これらの観察結果は、ティアレリック酸（ＴＡ）処理がＴＭ４ＳＦ５細胞特異的に接着斑分子のリン酸化および複合体形成に影響することを示している。さらに、接着斑分子活性におけるティアレリック酸（ＴＡ）の効果を、内在性ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞株と発現しない細胞株で試験した。興味深いことに、内在性ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞株は、そうではない細胞株に比べ、ティアレリック酸（ＴＡ）処理による接着斑分子の活性の抑制効果を確認した（図１２参照）。しかしながら、前記結果で示されるように（図１１参照）、ティアレリック酸（ＴＡ）で処理することによってＳＮＵ４４９Ｃｐ、ＳＮＵ４４９ＴｐのいずれにおいてもｐＥｒｋ１／２を少しずつ増加させることが分かった。
【００５５】
ティアレリック酸（ＴＡ）が接着斑分子の活性と複合体形成を阻害することから、ＴＡ処理によって接着斑形成が影響を受けることが予想される。従って本発明者らは、ＴＡ処理および無処理の細胞において、Ｔｙｒ３９７がリン酸化したＦＡＫ（ｐＹ３９７ＦＡＫ）とＴｙｒ１１８がリン酸化したパキシリン（ｐＹ１１８パキシリン）を免疫染色して接着斑の形成を分析した。ＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞では、ＴＡ処理によっても接着斑形成が影響を受けないが、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞ではＴＡ処理の後接着斑形成が失われていた。ｐＹ３９７ＦＡＫまたはｐＹ１１８パキシリンの染色結果から、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞における接着斑分子が解離していることを確認した（図１３参照）。インテグリンが、ｐＹ３９７ＦＡＫのような接着斑分子の動員を仲介していること（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）に合致するように、ＴＡによる接着斑の消失は、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞におけるインテグリンα５とｐＹ３９７ＦＡＫとの間の解離に関与するだろう（図１４参照）。さらに接着斑はストレスファイバーを介し互いに連結されている（Ｋａｖｅｒｉｎａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，３４，ｐｐ．７４６−６１，２００２）ので、本発明者らはＴＡ処理細胞および無処理細胞においてアクチンを染色した。図１５に示すように、ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞では、ＴＡ処理の後、わずかなストレスファイバーしか認められない異常なアクチン構築を認めたが、一方でＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞ではそうではないことを確認した（図１５参照）。ＴＡ処理したＴＭ４ＳＦ５発現細胞において、接着斑の減少とアクチンストレスファイバー形成の減少は、ＴＡ処理後の丸い形態の細胞数が増加したことと連関しうる。
【００５６】
実験例３．ＴＭ４ＳＦ５発現細胞におけるティアレリック酸（ＴＡ）介在性アノイキス誘導
ＴＡ処理により、接着斑分子の不活性化および解離が引き起こされ、これが細胞の丸い形態の原因となっている。このことから、ＴＡ処理によってＴＭ４ＳＦ５発現細胞のアノイキスが誘導されると考えられる。ＴＡ処理が細胞接着に影響を与えるか否かを調べるため、ＴＡ介在性の細胞死を分析する前に、文献（Ｙａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１６７，ｐｐ．１２３１−４０，２００４）に記載されているように、以下の実験を実施した。
細胞を２０μＭ ＴＡで２４時間処理し、次いで浮揚した細胞を回収し、フィブロネクチンでコートされたディッシュに１時間再播種して接着の程度を決定した。
【００５７】
図１６に示すように、ＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞（ＳＮＵ４４９Ｐ、ＳＮＵ４４９Ｃｐ）はＴＡ処理に影響されなかったが、一方、ＴＡで前処理したＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞（ＳＮＵ４４９Ｔｐ、ＳＮＵ４４９Ｔ１６）では、著しい接着の低下が認められた（図１６参照）。次に、ＴＡまたはＤＭＳＯ処理の後に浮遊細胞数を分析し、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞のＳＮＵ４４９Ｔｐでは浮遊細胞数が増加することが認められたが、ＴＡ処理はＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞に影響を与えないことを確認した（図１７参照）。この結果にしたがい、ＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞をＴＡ処理することによってもまた、Ａｋｔ不活性化およびカスパーゼ−３の活性化がもたらされた（図１８参照）。加えて、２０μＭ ＴＡで２４時間処理した後の細胞内ＤＮＡ量を分析した結果、ＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９ＴｐおよびＳＮＵ４４９Ｔ１６では、多くのｓｕｂ−Ｇ１細胞が存在したが、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９Ｔｐ（図１９参照）。したがってこれらの観察結果は、ＴＭ４ＳＦ５発現細胞のみでＴＡはアノイキスを発生させることを示唆している。
【００５８】
実験例４．接着斑分子の過剰発現におけるティアレリック酸（ＴＡ）を介した影響
接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、パキシリン、ｐ１３０Ｃａｓといった接着斑分子の過剰発現が、ＴＡ処理による効果をブロックするか否かを評価するために、文献（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１２，ｐｐ．２９８３−９９，２００６）に記載されているように以下の実験を実施した。
【００５９】
このために、それぞれのｃＤＮＡをＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞に電気穿孔法によって導入した。１日後、２０μＭ ＴＡで細胞を２４時間処理してライセートを得た。コントロールプラスミド（ＧＦＰ）を導入したＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞をＴＡ処理すると、時間依存的な接着斑分子の不活性化およびカスパーゼ−３の活性化が認められた。このことはＴＡ介在性のアポトーシスが起きることを支持している。しかしながら、野生型接着斑キナーゼ、パキシリンまたはｐ１３０Ｃａｓを導入したＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞は、ＴＡ介在性の効果をある程度防ぐ結果となった（図２０参照）。さらに接着斑分子を過剰発現させても、ＴＡ介在性のｓｕｂ−Ｇ１細胞数の増加を防止した（図２１参照）。したがってＴＭ４ＳＦ５細胞におけるＴＡ介在性の効果は、接着斑分子の過剰発現によってある程度解消しうる。一方、Ｅｒｋ１／２活性は、いずれの実験条件でも変化がないことから、この実験系におけるシグナル伝達へのＴＡ介在性の効果を理解することができる。
【００６０】
実験例５．ヌードマウスにおけるＴＭ４ＳＦ５介在性腫瘍へのティアレリック酸（ＴＡ）の効果
ティアレリック酸（ＴＡ）の投与がヌードマウスにおけるＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍形成に干渉しうるかを評価するために、文献（Ｌｅｅ Ｓ−Ａ ｅｔ ａｌ．，ＴＭ４ＳＦ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐ２７Ｋｉｐ１ ａｎｄ Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｃａｕｓｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｏｎｔａｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００７）に記載されているように、以下の実験を実施した。
【００６１】
先に報告したように、ＴＭ４ＳＦ５発現ＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞を注射したヌードマウスでは大きな腫瘍が形成されたが、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞を注射したヌードマウスでは腫瘍は形成されなかった。腫瘍（計算上の腫瘍体積が〜２００ｍｍ３である）を持つマウスに、１日おきに３０日間ティアレリック酸（ＴＡ）を腹腔投与した場合、ＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍形成が抑制された。図２２に示すように、ティアレリック酸（ＴＡ）を３または３０ｍｇ／ｋｇ体重で投与した場合、腫瘍体積は、それぞれ約４６．０％または２２．１％にまで抑制された。ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞を注射した部位周囲のコントロール組職とＳＮＵ４４９Ｔｐ注射したマウスの腫瘍組職とを用いたウエスタンブロット分析により、ＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍組織ではＡｋｔが活性化し、カスパーゼ−３が不活性化することが明らかとなった。このことは、腫瘍形成にはシグナル活性が必要であることを示している。しかしながらＴＡを注入することによって、Ａｋｔ活性が減少し、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂまたはｐ１６ＩＮＫ４Ａ ＣＫＩ（サイクリン依存的キナーゼインヒビター）レベルが増加し、カスパーゼ−３活性は増強する。このことは、ＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍において、ＴＡがその成長を阻害するとともにアポトーシスの原因となることを示している（図２３参照）。ＴＡ処理したマウスから得られるＴＭ４ＳＦ５介在性腫瘍における、カスパーゼ−３の免疫組職化学染色は、ポジティブであった（図２４参照）。したがってＴＡは、ヌードマウスにおけるＴＭ４ＳＦ５介在性の腫瘍形成特異的に干渉するが、これはアポトーシスを促進するためであると推定される。これらの結果は、ＴＭ４ＳＦ５ポジティブな腫瘍に対する有望な治療剤としてティアレリック酸（ＴＡ）がさらに開発に資することを示唆している。
【００６２】
本発明の抽出物または化合物を含む医薬組成物の例を説明する。しかしながらこれらの例は、例示のみを目的とするものであり、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６３】
製剤例１．散剤の製造
ズダヤクシュ粗抽出物 ３００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
前記の成分を混合して気密性のある嚢に充填して散剤を製造した。
【００６４】
製剤例２．錠剤の製造
ティアレリック酸 ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記成分の混合物を用い、通常の錠剤の製造方法によって錠剤を製造した。
【００６５】
製剤例３．カプセル剤の製造
ズダヤクシュ粗抽出物 ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法にしたがい、前記成分の混合物をゼラチンカプセルに充電して、カプセル剤を製造した。
【００６６】
製剤例４．注射剤の製造
ティアレリック酸 ５０ｍｇ
注射用滅菌蒸溜水 適量
ｐＨ調節剤 適量
通常の注射剤の製造方法にしたがい、上記成分を含む注射剤を（２ｍｌ）アンプルで製造した。
【００６７】
製剤例５．液剤の製造
ズダヤクシュ粗抽出物 １００ｍｇ
異性化糖 １０ｇ
マンニトール ５ｇ
精製水 適量
通常の液剤の製造方法にしたがい、各成分を精製水に溶解させる。レモン香を適量加え、混合した。次いで精製水を加えて全体１００ｍｌに調節した後、茶色瓶に充填して液剤を製造した。
【００６８】
製剤例６．健康食品の製造
ティアレリック酸 １０００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０μｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミン ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２μｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０μｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０μｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
ミネラル混合物 適量
硫酸第１鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
リン酸二水素カリウム １５ｍｇ
リン酸一水素カリウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
前記ビタミンおよびミネラル混合物の組成は、それぞれの適切な成分の好ましい組合せに従うが、改変してもよい。上記成分は通常の健康食品の製造方法にしたがって混合され、健康食品組成物としてさらに用いるための顆粒剤となった。
【００６９】
製剤例７．健康飲料の製造
ズダヤクシュ粗抽出物 １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
梅濃縮液 ２ｇ
タウリン １ｇ
精製水 ９００ｍｌ
通常の健康飲料の製造方法にしたがって上記成分を混合し、混合物を８５℃で１時間撹拌しながら加熱した。溶液を濾過し、シールした滅菌済み２Ｌ容器に入れて滅菌した。冷蔵保管した後、本発明の健康飲料組成物の製造に使用した。
【００７０】
飲料の粗製は各成分の好ましい組合せに従うものであるが、それらに限定されるものではなく、また需要者層、国、使用目的、地域的、民族的な趣向を考慮して改変してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明のズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩は、癌細胞の増殖を減少させ、細胞死を誘導する効果を有するので、癌疾患の予防および治療用医薬組成物および機能健康食品として使用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤であって、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞特異的であることを特徴とする、剤。
【請求項２】
抽出物が、粗抽出物または極性溶媒可溶抽出物である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
粗抽出物が、精製水を含む水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合溶媒に溶解される抽出物である、請求項２に記載の剤。
【請求項４】
極性溶媒可溶抽出物が、水、メタノール、エタノール、ブタノールおよびこれらの混合溶媒から選択される溶媒に溶解される抽出物である、請求項２に記載の剤。
【請求項５】
腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログが、Ｌ６、ＴＭ４ＳＦ５、ＩＬ−ＴＭＰまたはＬ６Ｄである、請求項１に記載の剤。
【請求項６】
癌細胞が、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳房癌、肺癌、非小細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、皮膚または眼黒色腫、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、悪性リンパ腫、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状線癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系腫瘍、中枢神経系原発リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマおよび脳下垂体腺腫よりなる群から選ばれるいずれか一の癌細胞である、請求項１に記載の剤。
【請求項７】
請求項１の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を含む、癌疾患の治療および予防用医薬組成物。
【請求項８】
癌細胞特異的なアノイキス誘導剤が、組成物の総重量に対して０．１〜５０重量％で含まれる、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を有効成分として含む、癌疾患の予防および改善用機能健康食品。
【請求項１０】
機能健康食品が、錠剤、カプセル剤、丸剤または液剤である、請求項９に記載の機能健康食品。
【請求項１１】
請求項１の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を癌の哺乳動物に投与することを特徴とする、癌疾患を治療する方法。
【請求項１２】
癌疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤の使用。
【請求項１３】
癌疾患の治療における、請求項１の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤の使用。
【請求項１】
ズダヤクシュ抽出物、これから分離されたティアレリック酸化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩を含むアノイキス誘導剤であって、腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログを発現する癌細胞特異的であることを特徴とする、剤。
【請求項２】
抽出物が、粗抽出物または極性溶媒可溶抽出物である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
粗抽出物が、精製水を含む水、炭素数１〜４の低級アルコールまたはこれらの混合溶媒に溶解される抽出物である、請求項２に記載の剤。
【請求項４】
極性溶媒可溶抽出物が、水、メタノール、エタノール、ブタノールおよびこれらの混合溶媒から選択される溶媒に溶解される抽出物である、請求項２に記載の剤。
【請求項５】
腫瘍関連抗原Ｌ６またはそのホモログが、Ｌ６、ＴＭ４ＳＦ５、ＩＬ−ＴＭＰまたはＬ６Ｄである、請求項１に記載の剤。
【請求項６】
癌細胞が、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳房癌、肺癌、非小細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、皮膚または眼黒色腫、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、悪性リンパ腫、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状線癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系腫瘍、中枢神経系原発リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマおよび脳下垂体腺腫よりなる群から選ばれるいずれか一の癌細胞である、請求項１に記載の剤。
【請求項７】
請求項１の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を含む、癌疾患の治療および予防用医薬組成物。
【請求項８】
癌細胞特異的なアノイキス誘導剤が、組成物の総重量に対して０．１〜５０重量％で含まれる、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を有効成分として含む、癌疾患の予防および改善用機能健康食品。
【請求項１０】
機能健康食品が、錠剤、カプセル剤、丸剤または液剤である、請求項９に記載の機能健康食品。
【請求項１１】
請求項１の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤を癌の哺乳動物に投与することを特徴とする、癌疾患を治療する方法。
【請求項１２】
癌疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤の使用。
【請求項１３】
癌疾患の治療における、請求項１の癌細胞特異的なアノイキス誘導剤の使用。
【図４】
【図６】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２１】
【図２２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１８】
【図２０】
【図２３】
【図２４】
【図６】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２１】
【図２２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１８】
【図２０】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２０１０−５２８１０６（Ｐ２０１０−５２８１０６Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０１８９（Ｐ２０１０−５１０１８９）
【出願日】平成１９年１１月３０日（２００７．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００６１６９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４７００５
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５０１２４５９９７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月３０日（２００７．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００６１６９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４７００５
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５０１２４５９９７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (15)
【Ｆターム（参考）】
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