トランスフェクションマイクロアレイ
（ａ）疎水性エリアに囲まれた少なくとも１つの試料スポットエリアを含む基剤を用いること；
（ｂ）試料分子が前記少なくとも１つの試料スポットエリアに適用され、それによって前記試料分子を前記試料スポットエリアの不連続な位置に置くこと；
（ｃ）トランスフェクションすべき細胞を、基材に適用し、試料分子の前記細胞への進入に適する条件下でインキュベートすること；
（ｄ）それによって少なくとも一部の前記試料分子が前記細胞に導入されること
：を含む、試料分子を細胞へ導入するトランスフェクション法が提供される。
（ｂ）試料分子が前記少なくとも１つの試料スポットエリアに適用され、それによって前記試料分子を前記試料スポットエリアの不連続な位置に置くこと；
（ｃ）トランスフェクションすべき細胞を、基材に適用し、試料分子の前記細胞への進入に適する条件下でインキュベートすること；
（ｄ）それによって少なくとも一部の前記試料分子が前記細胞に導入されること
：を含む、試料分子を細胞へ導入するトランスフェクション法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
たとえばｓｉＲＮＡといった規定の試料分子の、細胞へのトランスフェクションを可能にする、疎水性光学細胞アレイの設計案が提示される。本発明は、細胞機能および特に遺伝子機能の高処理量分析に適する戦略を提供する。本発明の一態様は、目的の細胞表現型を生じるかまたは影響するものについて、試料分子の大きな組を迅速にスクリーニングするのに適する、トランスフェクションマイクロアレイを作製するための方法およびアレイを提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来の細胞アレイスクリーニング方法は、目的のｓｉＲＮＡといった試料分子を含む、ガラス表面上にスポットされたキャリヤーを利用するかまたは、マイクロタイタープレートを用いる。基本的に、細胞ＲＮＡｉスクリーニングに用いられる２つの従来のおよび一般的な「細胞アレイプレート」法がある：
【０００３】
１つの方法は、ウェルを基礎とする標準的なマイクロタイタープレート（たとえば９６または３８４ウェルマイクロタイタープレート）を用いる。この方法は、試料化合物の高処理量は実行可能でないという欠点がある。前記方法は、トランスフェクション試料の受容能力が相対的に低い（最大スポット数がウェル／プレートの量に限定される）。これらの方法はまた、相対的に多量の材料（たとえばｓｉＲＮＡおよび細胞）を必要とする。さらに、個々のウェルを多数のプレート上で取り扱う必要があるため、特に大規模スクリーニング中に、均一性が低下する。
【０００４】
たとえば、遺伝子２３０００個および１遺伝子当たり４個のｓｉＲＮＡを用いる全ゲノムスクリーニングを利用者が実施したい場合、９６ウェルプレート１枚当たり８２個のｓｉＲＮＡ（各プレート上の対照）はたった１つの実験について１１２２枚の９６ウェルプレートを結果として生じる。これは明らかに実施時間およびコストに関して短所である。また、保管室が提供されなければならない。
【０００５】
しかし、適当な代替物が無いため、この形式は現在用いられるＲＮＡｉスクリーニングで幅広く使用される形式である。１０００プレート以上を取り扱う作業負荷のため、ＲＮＡｉスクリーニングは適当なサイズおよび設備を有する少数の研究室に限定される。
【０００６】
別のトランスフェクション法は、（ガラス）スライド上の壁の無い標準アレイを用いる （たとえば非特許文献１および２、特許文献１）。この方法もまた、しかし、いくつかの短所を有する。懸濁細胞の使用が不可能であり、およびスポット上処理（たとえば以降の生化学試験のための細胞溶解）を実施する可能性はかなり限定される。さらに、側方拡散およびそのようにしての実験中の汚染を防ぐために核酸をスポット上に固定する必要がある（たとえばマトリクスまたはゼラチンを用いることによって）。たとえばｓｉＲＮＡといった試料核酸のスポッティングは、遺伝子発現プロファイリング研究用のＤＮＡマイクロアレイのために開発されたスポッティング装置を用いて実施される。そこで、ＤＮＡスポッティングは信頼性の高い実験のためにあまり頑健でないことが証明されている。いくつかの限定因子を挙げれば、たとえばスポットのサイズ、スポット形式およびガラススライドの純度が変動し、これらは限定のない因子として挙げられる。ＤＮＡスポッティングを基礎とするマイクロアレイの市場浸透は、これらの問題のために約５０％からおよそ５％へ減少している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ ０２／０７７７２６４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ジャウディン（Ｚｉａｕｄｄｉｎ）およびサバチニ（Ｓａｂａｔｉｎｉ），２００１
【非特許文献２】ムース（Ｍｏｕｓｓｅｓ）他，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
改良されたトランスフェクション法およびマイクロアレイトランスフェクションアレイ系を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、少なくとも下記の段階を含む、細胞へ試料分子を導入するトランスフェクション法によって解決される：
（ａ）疎水性エリアに囲まれた少なくとも１つの試料スポットエリアを含む基材を用いること；
（ｂ）試料分子を前記少なくとも１つの試料スポットエリアに適用し、それによって前記試料分子を前記試料スポットエリアの不連続な位置に置くこと；
（ｃ）トランスフェクションすべき細胞を基材に適用し、および試料分子の前記細胞への進入に適する条件下でインキュベートすること；
（ｄ）それによって少なくとも一部の前記試料分子が前記細胞へ導入される。
【００１１】
本発明の中核は、疎水性エリアに少なくとも一部が囲まれた試料スポットエリアを含む、トランスフェクションに適するマイクロアレイ基材の使用である。好ましくは、試料スポットエリアは、疎水性エリアによって完全に包含されおよびしたがって囲まれる。これは、たとえば試料スポットエリアの周りに疎水性の環を配置することによって達成されうる。しかし、好ましくは、濡らすことができおよびしたがって好ましくは親水性および／または親油性である試料スポットエリアを除いて、基本的に基材表面全体が疎水性である。
【００１２】
それによって、試料スポットエリアを囲む疎水性エリアの存在のために、試料スポットエリアが互いに安全に隔離されている、壁の無い疎水性トランスフェクションアレイが作製される。標準的なトランスフェクションアレイと比較した場合、本発明に記載のトランスフェクションアレイは、試料スポットエリアの周囲の疎水性エリアのために、交差汚染のリスクが相当に低い。これらの性質は、溶液および細胞培地が隣接するエリアへ拡散するのを防ぎ、それによって交差汚染を回避する。各試料スポットエリアは、周囲の疎水性エリアによって他の試料スポットエリアから隔離されている自身の液体区画によって接触される。試料スポットエリア上に置かれた試料分子を載せたトランスフェクションアレイ基材は、有利に供給者によって提供でき、およびしたがって必要に応じて製造前でありうる。前記トランスフェクションアレイは、したがって、利用者が基本的にトランスフェクションすべき細胞を適用するだけでよく、すぐ使える製品として利用者へ提供されうる。
【００１３】
試料スポットに置かれおよび通常その上で増殖するトランスフェクション細胞は、試料分子を取り込み、それによって試料スポットエリア上に局所化したトランスフェクション（トランスフェクションされた細胞のスポットを生じる。しかし、本発明に記載のトランスフェクションアレイによれば、細胞は、先行技術のトランスフェクションアレイについて知られるようには、基材表面全体に一面の細胞を生じない。代わりに、細胞は主に、試料スポットエリアの疎水性エリアの境界内に集中する。
【００１４】
試料スポットエリア間の交差汚染の回避に関する長所の他に、本発明に記載のアレイトランスフェクション系の長所は、不連続なおよび分離した試料スポットエリアのためにスポット数を顕著に増加させうる点である。これらの性質は、非常に多数の試料から成るアレイの構築を可能にする。一実施形態によると、基材は少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも７，５００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、または少なくとも２０，０００個の試料スポットエリアを含む。好ましくは、親水性および／または親油性エリアは特定のパターンにしたがって基材上に配列される。そのようにして、たとえば、親水性および／または親油性試料スポットエリアが次いでたとえば機械によって連続試験に向けて容易に移されうる、ラスター、いわゆるアレイが、製造されうる。本発明に記載のトランスフェクションアレイはたとえば自動的に読み取りされうる。マイクロタイタープレート形式でプレート当たり最小３８４スポットを有することが好ましい。アレイのサイズに応じて、最大数千のスポット数（２５，０００およびさらにそれ以上）が一般的に可能である。マイクロタイタープレート（面積約１２０ｘ８０ｍｍ2）当たり望ましい２５，０００（以上）スポットについて、たとえば試料ピッチ６２０μｍを与え、スポット直径約３００μｍを可能にする。
【００１５】
本発明に記載のトランスフェクションアレイ法は、たとえば、自動処理としての多数の異なる試料分子のスクリーニングおよび特にＨＴＳ（高処理量スクリーニング）に有用である。
【００１６】
はるかに少ない数の試料スポットについてさえ、本発明に記載のトランスフェクションアレイ設計は、調製処理を実施することができる試料位置の明瞭な空間的定義を可能にする。この機能は典型的には、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）コーティングといった従来の撥性表面とは異なる極度の撥液体性を必要とする。したがって、疎水性エリアはまた疎油性であることが、本発明によると好ましい。疎水性および疎油性を有する表面は、水によっても油性液体によっても濡らすことができない。
【００１７】
疎水性および疎油性を有する表面は、本発明によると「超疎」または超疎性と称する。
【００１８】
ウェルを基礎とするプレートと比較した本発明に記載の系の別の長所はまた、実験操作にピペット段階を使用する必要が低減されることである。これは、試料分子がアレイ基材の試料スポットエリアに予め固定または予め適用されて利用者へ提供されうるためである。利用者は、トランスフェクションすべき細胞を適用するだけでよく、ここで細胞は、疎水性および／または超疎性エリアの撥性のために、自動的に試料スポットエリア上に集中する。
【００１９】
本発明に記載のトランスフェクション法はまた、懸濁細胞をスクリーニングする可能性を開く。試料スポットの厳密な分離はまた、必要に応じて同一プラットホーム上での異なる実験条件の使用を可能にする（たとえば異なるトランスフェクション試薬、細胞型、ｓｉＲＮＡ濃度といった試料分子、トランスフェクション剤、細胞培地など）。多様性は、したがって、顕著に増大する。
【００２０】
好ましくは、前記試料スポットエリアだけが、アレイ上で濡らすことができる場所である。したがって、前記試料スポットエリアは親水性および／または親油性を有する。前記親水性および／または親油性エリアは、好ましくは水滴または油滴を置くことができるエリアである；すなわちたとえばピペットシステムによって親水性および／または親油性エリアと接触させられた水滴または油滴がそこに留まり、およびピペットシステムから離れるかまたは容易に離すことができる。好ましくは、親水性およびまたは親油性エリア上の体積１０μｌの水滴または油滴は接触角＜１２０°、好ましくは＜１１０°、特に好ましくは＜９０°を有し、および／またはこの滴の後退角は１０°を上回る。
【００２１】
試料スポットを囲むエリアは、試料調製中にアレイに適用される液体に対して極めて撥性である。これらのエリアはしたがって好ましくは超疎である。したがってアレイ全体がウェル無しマイクロアレイとして働き、試料区画は、その他の濡らすことができない環境における、濡らすことができるエリアとして定められる。
【００２２】
超疎性非湿潤性環境で囲まれた濡らすことができる試料スポットエリアに置かれた試料材料の分布は、従来の疎水性表面と比較してはるかに均一であることもまた示されている。後者の場合には、乾燥試料スポットの付着材料の不均一性は主に、溶媒が蒸発する際のスポットの周縁と中心との間で異なる蒸発条件により、より多くの材料が周縁の付着を生じる。したがって、超疎周囲エリアは本発明との関連（ｃｏｎｔｅｘｔ）で好ましい。
【００２３】
さらに、スポット外のエリア上の試料の非特異的結合を、液体試料が一時的にそれらのエリアと接触するとしても、試料スポットを囲むエリアの極端な撥性は、最小化する。したがって、試料スポットエリア外のエリア上の、細胞培養培地の成分および試料分子の非特異的結合は最小限だけである。三相界面を有する超疎性表面は、液体−固体界面に捕捉された気体から成り、それによって真の液体−固体接触面積を幾何学的接触面積のわずかな割合に低減する。たとえば、接触角１７８°にて固体−液体の割合は幾何学的接触面積のわずか０．１％である。
【００２４】
一実施形態によると、前記疎水性または超疎性エリアは、水に対して少なくとも１４０°、好ましくは少なくとも１５０°の接触角を示す。本発明の目的のための超疎性表面は、好ましくは表面上にある水滴および／または油滴の接触角が１５０°より大、好ましくは１６０°より大、および特に好ましい１７０°より大である。好ましくは、後退角は１０°を超えない。後退角とは、体積１０μｌの静止した水滴および／または油滴が表面の傾斜のための重力が原因で動く際の、基本的に平面のしかし構造化された表面の傾斜の水平からの角度を意味する。そのような超疎性表面は、たとえば、参照により本開示に含まれおよび本発明の開示の一部と見なされる、ＷＯ９８／２３５４９、ＷＯ９６／０４１２３、ＷＯ９６／２１５２３、ＷＯ９９／１０３２３、ＷＯ００／３９３６８、ＷＯ００／３９２３９、ＷＯ００／３９０５１、ＷＯ００／３８８４５およびＷＯ９６／３４６９７で開示される。
【００２５】
本発明に記載のトランスフェクションアレイを作製するために使用されうる前記疎水性および／または超疎性エリアは、好ましくはナノ構造を示す。好ましくは、前記疎水性または超疎性エリアは、各フーリエ成分の位相周波数ｆおよび積分範囲ｌｏｇ（ｆ1／μｍ-1）＝−３およびｌｏｇ（ｆ2／μｍ-1）＝３間で計算される積分Ｓ（ｌｏｇ（ｆ））＝ａ（ｆ）・ｆで表されるその振幅ａ（ｆ）が少なくとも０．３である表面構造を有し、および疎水性または特に疎油性材料製であるかまたは耐久性疎水性および／または特に耐久性疎油性材料でコーティングされている。そのような超疎性表面は、参照により本開示に含まれおよび本発明の開示の一部と見なされる、ＷＯ００／３９２４９に記載される。
【００２６】
親水性および／または親油性試料スポットエリアは、好ましくはレーザーによる前記撥性層の層厚みの少なくとも一部の化学的および／または機械的除去を通じて疎水性または超疎性表面上に作製されうる。それらはまた、疎水性または超疎性層上に沈着されうる。好ましくは、親水性および／または親油性エリアは、しかし、疎水性または超疎性表面の最上分子層のみの修飾によって形成される。好ましくは、この修飾は機械的および／または熱アブレ−ションであり、それによって好ましくは疎水性または超疎性の最大で１分子層が除去される。さらに、修飾は好ましくは超疎性表面の熱的または化学的変化を通じて進行し、しかし、その除去を含まず、たとえば、参照により本開示に含まれるＤＥ １９９ １０ ８０９に記載される通りである。この修飾によって、超疎性表面はその層厚みに関して著しく変化しないままである。別の好ましい一実施形態では、親水性および／または親油性エリアは超疎水性表面上の一部に可逆的に作製されうる。
【００２７】
超疎性材料を作製するために使用されうる好ましい超疎性材料は、たとえばナノ構造化ＺｒＯ2またはＡｌ2Ｏ3層である。それらはスパッタ成膜によって基材に適用することができる。ナノ構造層上部の表面化学として、ＳＡＭ分子が使用されうる。適当な例はたとえばフッ化シラン、フッ化リン酸およびホスホン酸塩、フッ化ヨウ化物およびフッ化脂肪酸である。好ましくは、表面化学は少なくとも、異なる長さを有する（分子スケールで混合された）鎖の２成分混合単層である。一実施形態によると、表面はＣ１０：Ｃ１２フッ化アルキル鎖の混合単層を構成する。別の一実施形態によると、Ｃ１０：Ｃ２０フッ化アルキル鎖の混合単層が用いられる。フッ化アルキル鎖はらせん状立体配座を含みおよび硬性である。フッ化単層の長所は、それらが相分離しないことである。
【００２８】
試料スポットエリアは好ましくは、ＳＡＭを含むかまたはＳＡＭから成り、ＳＡＭは単成分または多成分でありうる。それらはまた、フィブロネクチンといったペプチドでコーティングされうる。親水性表面化学は、好ましくは、３−アミノプロピル−トリエトキシシラン、３メルカプトプロピル−トリメトキシシラン、メタクリルオキシプロピル−トリエトキシシラン、ヘキサデシルトリメトキシシラン、２−[メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル]トリメトキシシラン、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈペルフルオロデシルトリエトキシ−シランおよび３−（フェニルアミノ）プロピルトリメチルジエトキシシランから成る群から選択される１つの化合物を含む。好ましくは、化合物は３−アミノプロピル−トリエトキシシラン、３メルカプトプロピル−トリメトキシシランおよび３−（フェニルアミノ）プロピルトリメチルジエトキシシランから選択され、なぜならこれらの化合物はＨｅＬａＳ３、ＭＣＦ−７、ＨＥＫ２９３、ＨＵＶＥＣ、ＣａＣＯ−２およびＨｅｐＧ２といった幅広い細胞の細胞増殖を可能にするために適することが証明されているためである。細胞は良好に接着した。
【００２９】
トランスフェクション反応のために試料スポットエリアに適用されうる試料分子の例は、下記を含むがそれらに限定されない：
−核酸、その下位にＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ここで核酸は１本鎖または２本鎖および直鎖または環状でありうる；
−ペプチド
−タンパク質
−糖
−脂質
−多糖
−有機分子、特に低分子。
【００３０】
試料分子は、たとえばピンツールを用いるスポッティング、分注ウェルプレートといった分注技術、またはインクジェット技術といった任意の適当な方法によってアレイに適用されうる。
【００３１】
ＲＮＡ分子および特にｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子といったＲＮＡｉ媒介化合物は、本発明のトランスフェクションアレイのための特に好ましい試料分子である。ｓｉＲＮＡといったＲＮＡｉ媒介化合物のライブラリを本発明に記載のトランスフェクションアレイに適用することによって、前記ｓｉＲＮＡによって媒介される作用のスクリーニングおよびしたがって分析が顕著に改善される。本発明のアレイによればゲノムライブラリを与えることさえ可能である。
【００３２】
ｓｉＲＮＡ分子（２ヌクレオチドの末端３’オーバーハングを有する長さ２１〜３０ヌクレオチド（ｎｔ）を有する２本鎖（すなわち二重鎖）分子干渉短ＲＮＡ）を、哺乳類細胞において転写後に遺伝子発現をサイレンシングするために使用できることが知られている（エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）他，Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１１：４９４−４９８）。適当なトランスフェクション試薬とのｓｉＲＮＡの複合体化およびこれらの複合体の細胞への適用は、ｓｉＲＮＡ複合体のエンドサイトーシス取り込みを結果として生じる。ｓｉＲＮＡは最終的に細胞質へ放出され、およびｓｉＲＮＡ分子は認識されおよびＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と呼ばれる複合体に組み込まれる。ＲＩＳＣ関連ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ活性は二重鎖をほどき、および２本の鎖の両方が独立して標的ｍＲＮＡ認識を導くことを可能にする（ツシュル（Ｔｕｓｃｈｌ），ＭｏＩ．Ｉｎｔｅｒｖ．２００２，２：１５８−１６７）。
【００３３】
ＲＩＳＣ複合体は次いで、ｓｉＲＮＡ配列が相補的であるｍＲＮＡ内の領域を認識し、およびｍＲＮＡ中のこの領域と結合する。ｍＲＮＡは次いでヌクレオチド鎖切断によって、ＲＩＳＣ複合体が結合しているその位置で切断され、最後の段階では、ヌクレオチド鎖切断によって切断されたｍＲＮＡがエキソヌクレアーゼによって分解される。ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシング（ＲＮＡ干渉、ＲＮＡｉ）のこの機構は、真核細胞培養においてノックダウン実験を実施するために広く用いられている。
【００３４】
すべてのｓｉＲＮＡ二重鎖がｍＲＮＡレベルを同程度にノックダウンできるわけではないこともまた知られている。一部のｓｉＲＮＡは初期レベルを約１０〜２０％へ、別の一部は中程度のレベル（２０〜７０％）へノックダウンでき、およびさらに別のものはｍＲＮＡレベルを測定可能なレベルに全くノックダウンできない。ｓｉＲＮＡの設計については一定の設計規則（いわゆる「ツシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）則」）が存在するが、しかしこれらの規則にしたがって設計されたｓｉＲＮＡさえ上記の変動性を示す。この観察の理由は知られていない。二重鎖の熱力学的安定性もまた、ｓｉＲＮＡがサイレンシングを誘導する効率に関与しうると考えられている。この変動性、および「良い」ｓｉＲＮＡさえすべてのｍＲＮＡを完全にノックアウトできないという事実は、ｓｉＲＮＡ技術の重大な短所である（ゴング（Ｇｏｎｇ）Ｄ．，Ｔｒｅｎｓｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，２２：４５１−４５４；クホロバ（Ｋｈｖｏｒｏｖａ）Ａ，Ｃｅｌｌ ２００３，１１５：２０９−２１６； シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）Ｄ．Ｓ．，Ｃｅｌｌ ２００３，１１５：１９９−２０８；レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）Ａ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，２２：３２６−３３０）。細胞への取り込みの促進によるかまたはより強力な細胞内ｓｉＲＮＡ二重鎖による、より強力な遺伝子サイレンシングの検索は、したがってｓｉＲＮＡ研究の分野の中心である。
【００３５】
さらに、ｓｉＲＮＡ分子がサイレンシングを誘導する能力を高めるため、およびまたそれらの安定性を高めるために、いくつかの化学修飾が試験されていることが知られている。ｓｉＲＮＡ分子またはオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の化学修飾は、これらの分子のヌクレアーゼ安定性、または標的ｍＲＮＡとのそれらの親和性に影響する（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００４，８：５７０−５７９）。血清ヌクレアーゼに対する安定性を改善するためおよび／または標的との親和性を改善するための、さまざまな種類の修飾が記載されている。ａ．ハロゲン、アミン、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリル、アルキル基での２’−ＯＨ修飾；ｂ．オルトエステル、リン酸エステル、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホナート、ホスホノチオエート、ホスホロチオトリエステル、ホスホロアミデート、ホスホロチオアミデート、ホスフィナートおよびボロネート結合、エーテル、アリルエーテル、アリルスルフィド、ホルムアセタール／ケタールスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルファマート、スルホンアミド、シロキサン、アミド、陽イオン性アルキルポリアミン、グアニジル、モルホリノ、ヘキソース糖またはアミド含有結合、または２から４原子結合といったヌクレオチド間結合；ｃ．接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、たとえばアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、糖質、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびその組み合わせ、コレステロール接合体を用いる受動輸送が記載される。
【００３６】
通常の（非保護）ｓｉＲＮＡは、細胞培地中および血清といった体液中で、低い安定性を示しうる。これは、トランスフェクションまたは全身配送中のｓｉＲＮＡの分解の危険を結果として生じる。したがって、分解のために、効率的なサイレンシングのための細胞におけるより少ないｓｉＲＮＡが残り、および分解された（短縮された）ｓｉＲＮＡは非特異的塩基対形成のために、細胞中で標的効果を損なうことを導きうる。ｓｉＲＮＡの細胞へのトランスフェクションは、標的効果を損なうことを導きうることが示されている。具体的には、多量のｓｉＲＮＡはＰＫＲ活性化に繋がりうる（ＰＫＲ：プロテインキナーゼＲ；２本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ）。また、ＲＩＳＣ中のアンチセンス鎖でなくセンス鎖の認識および組み込みもまた、標的効果を損なうことを導きうる。
【００３７】
したがって、本発明によると、分解に対して保護されている改良されたｓｉＲＮＡ分子を試料分子として使用することが好ましく、そのためｓｉＲＮＡ分子の遺伝子サイレンシング活性、およびしたがってトランスフェクション効率が改善され、および効率的な遺伝子サイレンシングおよびしたがってトランスフェクションの成功に必要なｓｉＲＮＡ分子の量が減少する。
【００３８】
化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子は、培養培地中でのこれらの分子の安定性を高める。ｓｉＲＮＡの分解は効果的に抑制され、および完全長ｓｉＲＮＡはより活性でありおよび標的効果を損なうことを導きえない。さらに、ｓｉＲＮＡの感度が向上する。本発明に記載のトランスフェクション法において高レベルの遺伝子サイレンシングを達成するためには、より少ない量のｓｉＲＮＡが必要である。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣに正しい方向で組み込むことができ、そのためアンチセンス鎖だけがサイレンシングを誘導でき、それはより高い特異性に繋がる。加えて、センス鎖は修飾のために不活性化され、結果として標的効果が損なうことを消去する。本発明に記載のｓｉＲＮＡは、より効率的なｓｉＲＮＡ二重鎖の巻き戻し、および標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを可能にし、改善された標的結合親和性に繋がる。さらに、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション効率が向上する。
【００３９】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方のよく定義された位置に下記の基および結合の組み合わせを有する、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡの安定性、感度および特異性を改善する：
（ａ）２’−デオキシ修飾ヌクレオチド；
（ｂ）２’−メトキシ修飾ヌクレオチド；
（ｃ）３’→５’または２’→５’ホルムアセタール結合によって結合した２個のヌクレオシド；
（ｄ）−０−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＥｂ）２−ＯＨ基によって２’位で修飾されたヌクレオチド；および
（ｅ）３’位（[rho]osition）に−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）７−ＣＨ３基を含むヌクレオチド。
【００４０】
本発明に記載のトランスフェクション法において試料分子として使用されうるｓｉＲＮＡのさらなる有利な性質は、参照により本開示に含まれるＷＯ２００６／１０２９７０に記載される。
【００４１】
細胞にトランスフェクションすべき試料分子は、試料スポットエリアと共有結合によってまたは非共有結合的に結合／付着している。試料分子、たとえばｓｉＲＮＡ分子といった核酸は、試料スポットエリアへの適用の前に合成されうる。アレイ表面への適用は、優先的に試料分子含有溶液の単純なスポッティングによって実施され、任意に次いで乾燥過程が実施される。代替的に、スポッティングはさまざまな表面化学および／または化学キャリヤー材料またはマトリクスによって支持されうる。
【００４２】
試料スポットエリアへの試料分子の結合／付着を促進するために、試料分子はたとえば適当なマトリクスまたはポリマーと混合されうる。マトリクスのそれぞれのポリマーはまた、試料分子が添加される前に予め適用されうる。一実施形態によると、前記試料分子は試料スポットエリアにてマトリクスに埋め込まれている。これらのマトリクスは合成または天然でよく、および、試料スポットエリアへの試料分子の結合を促進するために、ゼラチン、アガーまたはアガロース、シラン、ポリＤリジン、（ポリ）アクリルアミド、抗体またはその断片、合成（ポリ）ペプチド、脂質、細胞タンパク質の粗調製物または精製調製物、糖または多糖、細胞外マトリクス成分、たとえばコラーゲン、フィブロネクチン、マトリゲル、無機イオン、他のポリマーから選択されうる。
【００４３】
また、別の試薬、たとえば細胞毒性低減試薬、細胞結合試薬、細胞増殖試薬、細胞刺激試薬または細胞阻害試薬、または特定の細胞を培養するための化合物／培地もまた、試料スポットエリアに適用または添加されうる。
【００４４】
試料スポットエリアは、細胞増殖を促進するためにトランスフェクション細胞がそこに接着するように設計されうる。一実施形態によると、試料スポットエリアへの細胞の接着を促進するために、少なくとも１つの前記試料スポットエリアの表面特性が修飾される。したがって、適用／トランスフェクションアッセイの具体的必要性に応じて、スポットエリアは細胞結合および増殖を増大させるように修飾されうる。これは、たとえば、ジルコニウムアルコキシド複合体を用いた（マレイミド）−アルコキシカルボキシレート中間体を介した細胞誘引性ペプチド誘導体ＲＧＤＣの結合を可能にするための、スポットの表面に曝露された少量のホスホン酸によって達成されうる。そのようなＲＧＤＣで修飾された表面は、骨芽細胞結合および増殖に有効であることが示されている（Ｍ．Ｐ．ダナヒー（Ｄａｎａｈｙ），Ｍ．Ｊ．アバルトロニ（Ａｖａｌｔｒｏｎｉ），Ｋ．Ｓ．ミドウッド（Ｍｉｄｗｏｏｄ），Ｊ．Ｅ．シュワルツバウエル（Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ），Ｊ．シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）；『α−ω−ジホスホン酸のＴｉ上の自己組織化単層は完全なまたは空間的に制御された表面誘導体化を可能にする』（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｏｍｅｇａ−Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄｓ ｏｎ Ｔｉ Ｅｎａｂｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｏｒ Ｓｐａｔｉａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）；Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０，５３３３ （２００４））。
【００４５】
特に試料分子としての核酸について使用されうるｉｎ ｓｉｔｕ合成プロトコルによると、ｓｉＲＮＡ核酸といった核酸は、たとえばフォトリソグラフィー法またはヌクレオチドのインクジェット印刷によって、スライドの表面上に直接合成されうる。これは別個のスポッティング段階を回避する。
【００４６】
試料分子取り込みを支持するために、いくつかのトランスフェクション法がｓｉＲＮＡ／ＮＡといった試料分子の細胞への進入または取り込みを円滑化するために使用されうる。優先的に、これはリポフェクション法、デンドリマー法、または細胞膜透過ペプチド法といった化学的方法によって達成される。しかし、それはまた、物理的方法、たとえばエレクトロポレーション法、ショットガン法、またはレーザー支援トランスフェクション法によって、または生物学的方法、たとえばウイルスベクターまたは細菌ベクターまたは孔形成毒素によって実施されうる。トランスフェクション試薬またはデリバリー試薬は、好ましくは核酸、タンパク質、ペプチド、糖、多糖、有機化合物、および他の分子といった試料分子を細胞へ導入できる陽イオン性化合物である。好ましい実施形態は、陽イオン性オリゴマー、たとえば低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、低分子量ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、低分子量キトサン、または低分子量デンドリマーを用いる。それらのモジュール組成によると、試薬は下記の通り分類されうる：脂質、ポリマー、脂質−ポリマーおよび／またはそれらの組み合わせおよび／またはそれらの誘導体であって、細胞−標的化または細胞内−標的化部および／または膜不安定化成分、およびデリバリーエンハンサーを含む。また、エレクトロポレーション、膜透過性ペプチドおよびナノ粒子が使用されうる。
【００４７】
好ましくは、スポットおよびスポット周囲エリアの表面化学は、ｐＨ７．５±１にて安定である。さらに、チップ／アレイ全体が水系細胞培養培地中で５日間３７℃にて安定であることが好ましい。さらに、試料と接触する材料は細胞毒性でない。
【００４８】
特に、試料スポットは、下記の化合物のうち少なくとも１つを含む水系トランスフェクション試薬の適用と互換性がある：脂質、たとえばＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）；ＤＯＴＭＡ（臭化１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウム）；ＤＭＲＩＥ（臭化１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム）；ＤＤＡＢ（臭化ジメチルジオクチルデシル（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔｙｌｄｅｙｌ）アンモニウム）；ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン）；ＤＣ−ＣＨＯＬ（（３β[Ｎ´，Ｎ´−ジメチルアミノエタン）カルバモイル]−コレステロール）；ＤＯＧＳ（５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド）；ＤＰＰＥＳ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−６−カルボキシスペルミルアミド）；ピリジニウム両親媒性物質、たとえば塩化Ｎ−メチル−４−（ジオレイル）メチルピリジニウム。好ましい試薬はキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）が販売するＲＮＡｉｆｅｃｔ（登録商標）およびＨｉＰｅｒｆｅｃｔ（登録商標）である。
【００４９】
一実施形態によると、トランスフェクション試薬は、細胞が基材に適用される前に、または細胞と一緒にトランスフェクション試薬／細胞混合物の形で、基材に適用される。この実施形態は、利用者が、トランスフェクションすべき細胞に最も良く作用する、自分で選択するトランスフェクション剤を使用しうるという長所を有する。別の一実施形態によると、トランスフェクション試薬は試料分子と一緒に試料スポットエリア上に適用され、およびしたがってまた試料スポットエリアにそれぞれ予め固定され予め適用される。この実施形態は、利用者は細胞をアレイに適用するだけでよいという長所がある。さらに、この実施形態によって、試料分子の安定化が達成されうる。
【００５０】
非常に好ましい一実施形態によると、少なくとも前記試料スポットエリアは光学的に透明または半透明である。しかし、また基材全体も光学的に透明または半透明でありうる。この性質は、試料スポットエリアが透過光顕微鏡法といった光学分析法に適するよう設計されるという特別の長所を有する。したがって、少なくとも１つ試料スポットエリア、または少なくとも２つまたは実質的にすべての試料スポットエリアさえも、光学的に透明または半透明であり、および光学顕微鏡および蛍光リーダーによる結果の分析を可能にするために従来の顕微鏡スライドと同様の光学特性を提供する。この点で、アレイ形式が透過光学顕微鏡および蛍光リーダーといった機器と適合するよう設計されることもまた有利である。これはまた自動処理を可能にする。
【００５１】
記載されたスクリーニング処理を実施できるために、明らかに、各試料スポットは異なる試料分子を含みうる。たとえば本発明に記載のトランスフェクションアレイ基材の各試料スポットエリアは、異なるｓｉＲＮＡの細胞に対する影響を分析するために、異なるｓｉＲＮＡを含みうる。別の一実施形態によると、少なくとも２つの異なる種類の試料分子が１つのトランスフェクション反応に用いられる。この一実施形態は、組み合わせトランスフェクションアッセイが実行可能であるという長所を有する。一実施形態によると、さまざまな種類の試料分子がすべて試料スポットエリアへ適用されおよびしたがってそれぞれ予め固定され予め沈着されている。たとえばｓｉＲＮＡといった核酸を、試料スポットエリア上に別のｓｉＲＮＡまたは医薬、たとえば低分子といった、別の試料分子と一緒に適用することができる。２つの異なる試料分子が１つの試料スポットエリアにしたがってそれぞれ予め固定され予め沈着されている。たとえば低分子といった医薬を用いる後者の実施形態は目的の遺伝子発現に対して、適用されるｓｉＲＮＡが完全なサイレンシング作用を提供しない場合に特に有利である。ｓｉＲＮＡを、同一経路に影響する別の試料分子と組み合わせることによって、改善されたかまたは完全な干渉およびしたがってサイレンシング作用が達成されうる（たとえば モーガン・ラッペ（Ｍｏｒｇａｎ−Ｌａｐｐｅ）他，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００６）２５，１３４０−１３４８；ギウリアノ（Ｇｉｕｌｉａｎｏ）他，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｅｎｇ ９（７）；２００４を参照）。また、異なる試料分子の交差相互作用もそれによって分析されうる。この実施形態はまた、より低濃度の前記ｓｉＲＮＡ（第１の試料分子の例として）および前記第２の試料分子を使用することを可能にする。この性質は、化合物のうち一方の阻害作用が、前記化合物の毒性濃度でしか達成されない場合に特に有利である。
【００５２】
前記第２の分子を予め試料スポットエリアへ適用する代替として、前記第２の試料分子はまた、細胞を基材へ適用する前または後に適用することができ、または細胞と予め混合されうる。この実施形態は、適当な第２の試料分子を利用者が自由に選択できるという長所を有する。
【００５３】
別の一実施形態によると、試料分子の細胞活性に対する影響は、本発明に記載のトランスフェクション方法を用いることによって観察されうる。一実施形態では、トランスフェクションスクリーニングを用いて、寄生虫またはたとえばウイルスといった感染病原体が目的細胞に適用された際の、増殖不能または生存不能について分析できる。この場合、選択は細胞が感染した際にだけ必須である、細胞内のウイルス機能または寄生虫機能の一部の側面に特異的に必須である遺伝子を標的とするノックアウトを対象とする。一部のウイルス感染は、生存因子（たとえばＣｒｍＡ、ｐ３５）の誘導を結果として生じるため、おそらく少なくとも一部の細胞機能はウイルス、寄生虫増殖中に異なりおよび潜在的に選択的に必要とされる。したがって、ウイルスサイクルをより詳細に研究することが可能である。一実施形態によると、ｓｉＲＮＡといった試料分子を試料スポットエリア上に含むトランスフェクション基材が用いられる。細胞は次いでトランスフェクション基材に置き、およびトランスフェクションが起こるようにインキュベートする。作用を与えるのに十分長く、試料分子が細胞にトランスフェクションされた後、ウイルスを細胞に適用する。この設定は、たとえばウイルスサイクル、およびウイルス増殖サイクルに対する特定のメッセンジャーの影響をより詳細に研究することを可能にする。
【００５４】
本発明の教示によるとトランスフェクションすべき細胞は任意の性質のものでよい。例は、真核細胞、たとえば哺乳類細胞（たとえば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、またはマウス細胞）、細菌、昆虫または植物細胞である。真核細胞は好ましくは哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、分裂細胞または非分裂細胞でよく、および細胞は形質転換細胞または初代細胞でよい。哺乳類細胞は体細胞または幹細胞でよい。試料分子が移送されている細胞の検出は、試料分子自体、その産物、その標的分子、触媒された産物、または試料分子によって調節される産物、または細胞の表現型に対する作用を検出することによって実施されうる。細胞は、試料分子を有する表面上へ、十分な密度で、および試料分子の細胞への導入／進入に適した条件下で、および作用を与えるのに必要な細胞成分との相互作用を可能にするように、平板播種（配置）される。
【００５５】
細胞は好ましくは試料分子が試料スポットエリアに既に配置された際に適用される。たとえば輸送台を用いる液体の並列移動、スタンプ技術およびスポッティング技術といった、任意の適用様式を用いることができる。
【００５６】
レシピエント細胞（トランスフェクションによって導入された前記試料分子を含む細胞）に対する作用の検出は、目的タンパク質（たとえば、トランスフェクションされたＤＮＡによってコードされると考えられるタンパク質、または導入された試料分子の作用を介して発現または機能が変化するタンパク質）と結合する蛍光標識された抗体を用いて細胞に対する作用を測定する免疫蛍光といった、さまざまな公知の方法を用いて実施されうる。試料分子取り込みの結果および多くの実施形態では、導入された分子の発現（少なくとも転写）、または試料分子によって媒介される作用（たとえばｓｉＲＮＡの場合には干渉）を検出するためにさまざまな方法が使用できる。一般的な意味で、アッセイは試料分子が、試料分子を欠く同一細胞と比較して細胞の表現型に変化を与えることができるかどうかを判定する手段を提供する。そのような変化は、細胞形態の変化（膜ラフリング、有糸分裂速度、細胞死の速度、細胞死の機構、色素取り込みなど）といった細胞全体レベルで検出されうる。別の実施形態では、細胞の表現型の変化があれば、２、３例を挙げると、特定タンパク質（たとえば選択可能なまたは検出可能なマーカー）のレベル、またはｍＲＮＡまたは二次メッセンジャーのレベルの検出といった、より集中した方法によって検出される。細胞の表現型の変化はまた、レポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を分析すること、イムノアッセイ、色素（たとえばＤＡＰＩ、カルコフロール）での染色を用いて酵素を分析すること、電気的変化を分析すること、細胞形状の変化を特徴づけること、タンパク質立体配座の変化を試験すること、および細胞数を計数することによっても測定されうる。他の目的変化は、化学アッセイ、光学顕微鏡法、走査型電子顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、画像再構成顕微鏡法、スキャナ、オートラジオグラフィー、光散乱、光吸収、ＮＭＲ、ＰＥＴ、パッチクランプ、カロリメトリー、質量分析法、表面プラズモン共鳴法、時間分解蛍光法といった方法によって検出されうる。データは単一または複数の時点で回収でき、および適当なソフトウェアによって分析されうる。
【００５７】
したがって、試料分子デリバリーの結果は、さまざまな方法によって分析されうる。さらに、トランスフェクションされた細胞は、特に標準的なアレイ形式（上記参照）が用いられる場合は、直接さらに処理されうる。たとえば配送された試料分子が遺伝子発現を調節できる場合、標的遺伝子発現レベルはまた、オートラジオグラフィー、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲといった方法によって測定されうる。同定／処理方法は、配送された試料分子、その発現産物、それによって調節される標的、および／または試料分子のデリバリーの結果として生じる最終産物の性質に依存する。
【００５８】
試料分子を加えそれぞれ接着するのに用いることができる任意の適当な表面が、本発明の目的に使用されうる。試料分子の結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。たとえば、表面は、ガラス、プラスチック（たとえばポリテトラフルオロエチレン、ポリ二フッ化ビニリデン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン）、シリコン、金属、（たとえば金）、膜（たとえばニトロセルロース、メチルセルロース、ＰＴＦＥまたはセルロース）、生物材料および無機物（たとえばヒドロキシアパタイト、グラファイト）でありうる。好ましい実施形態によると、表面はスライド（ガラスまたはポリ−Ｌリジン被覆スライド）である。上記で外接する通り、透明または半透明材料を使用するのが特に好ましく、ここで少なくとも１つ、それぞれすべての試料スポットが光学的に透明または半透明である。適当な透明または半透明材料は、たとえばホウケイ酸または半透明金属である。
【００５９】
一実施形態によると、総散乱損失≦７％、好ましくは≦３％、特に好ましくは≦１％である、光散乱の低減された、超疎性表面を有する透明または半透明基材が用いられる。前記基材は好ましくは水に関して接触角が少なくとも１４０°好ましくは少なくとも１５０°および転がり角（ｒｏｌｌ−ｏｆｆ ａｎｇｌｅ）≦２０°、好ましくは≦１０である。それぞれの低減された光散乱表面は、たとえば、参照により本開示に含まれるＵＳ２００６／０１５９９３４、特にパラグラフ２４から２６に記載される。この文書はまた、それぞれ超疎性表面を作製するのに適したナノ構造化された表面を得るための適当なコーティングを記載する。たとえばジルコニウム、チタン、アルミニウム、およびタンタルといった金属の、酸化物、フッ化物、炭化物、窒化物、セレン化物製のコーティング。酸化ジルコニウム層といった酸化物が特に好ましい。前記層を適用するための材料および可能な工程についての詳細はまた、参照により本開示に含まれるＵＳ２００６／０１５９９３４、パラグラフ８９から１５０に記載される。
【００６０】
試料スポットエリア周囲の前記エリアの疎水性および／または超疎性を改善するために、基材に疎水性または疎油性撥化剤の追加のコーティングを提供することが好ましい。
【００６１】
疎水性または疎油性撥化剤は通常は、任意の分子量の表面活性化合物である。これらの化合物は、たとえば辞典『表面活性剤ヨーロッパ、ヨーロッパで得られる表面活性剤要覧』（"Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ Ｅｕｒｏｐａ，Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅ），ゴードン・Ｌ・ホリス（Ｇｏｒｄｏｎ Ｌ．Ｈｏｌｌｉｓ）編，英国化学会（Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ），１９９５に挙げられるもののような、好ましくは陽イオン性、陰イオン性、両性または非イオン性表面活性化合物である。
【００６２】
陰イオン性撥化剤の例を挙げると：アルキル硫酸塩、エーテル硫酸塩、エーテルカルボン酸塩、リン酸エステル、スルホスクシネート、スルホスクシネートアミド、パラフィンスルホナート、オレフィンスルホナート、サルコシナート、イソチオナート、タウレートおよびリグニン化合物である。
【００６３】
陽イオン性撥化剤の例を挙げると、：四級アルキルアンモニウム化合物およびイミダゾールである。
【００６４】
両性撥化剤の例は、ベタイン、グリシナート、プロピオナートおよびイミダゾールである。
【００６５】
非イオン性撥化剤は、たとえば：アルコキシエート、アルキルアミド、エステル、アミンオキサイドおよびアルキルポリグリコシドである。たとえば脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪酸、フェノール、アルキルフェノール、スチレンフェノール縮合物のようなアリールアルキルフェノール、カルボン酸アミドおよび樹脂酸といった、アルキル化に適した化合物とのアルキレンオキサイドの転換産物もまた可能である。
【００６６】
特に好ましいのは、水素原子の１から１００％、特に好ましくは６０から９５％がフッ素原子で置換された撥化剤である。例を挙げると、パーフルオロアルキル硫酸塩、パーフルオロアルキルスルホン酸塩、パーフルオロアルキルリン酸塩、パーフルオロアルキルホスフィン酸塩、パーフルオロアルコキシシラン、パーフルオロクロロシラン、パーフルオロアルコキシクロロシラン、パーフルオロチオールおよびパーフルオロカルボン酸である。
【００６７】
適当な撥化剤のさらなる詳細は、参照により本開示に含まれるＵＳ２００６／０１５９９３４、パラグラフ１０８から１１２に開示される。
【００６８】
また本発明で提供されるのは、試料スポットエリアが疎水性エリアで囲まれておりおよび前記試料スポットエリアが試料分子を含み、それによって前記試料分子が前記試料スポットエリアの不連続な位置に配置されるアレイ形式に配列されたいくつかの試料スポットエリアを含む基材を含む、試料分子を細胞へ導入するためのトランスフェクションアレイ基材である。
【００６９】
各トランスフェクションアレイの好ましい性質および使用は、上記のトランスフェクション法に関連して詳細にすでに概説した。そこにまた、トランスフェクションアレイ基材の異なるエリアに適する表面性質も詳細に記載され、およびしたがってここで繰り返されない。我々は、トランスフェクションアレイにもまた適用される上記の考察を参照する。上記で概説する通り、ｓｉＲＮＡは、好ましくはアレイ基材に適用される試料分子として用いられる。スクリーニング法を可能にするために、好ましくは少なくとも一部の前記試料スポットエリアは、異なる種類の試料分子を含む。光学分析を可能にするために、透明または半透明基材が好ましい。しかし、一部の実施形態については、試料スポットエリアを透明または半透明にすれば十分でありうる。
【００７０】
利用者による容易な取扱を可能にするために、マイクロアレイおよびその機能規格は、１００℃まで安定であり、滅菌可能であり、および凍結可能（少なくとも−２０℃）であることが好ましい。
【００７１】
本発明の詳細を、単に例として提示する下記の図面に概説する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】好ましい一実施形態による本発明に記載の提案されるマイクロアレイの断面の模式図．
【図２】疎水性および／または超疎性エリアを作製するのに適したナノ構造化ＺｒＯ2層の走査型電子顕微鏡像。θは約１５５°である（水、ＳＡＭパーフルオロデカントリエトキシシラン）。
【図３】一実施形態に記載の表面化学の詳細。
【図４】本発明の好ましい一実施形態に記載の製造工程のフローチャート。
【図５】ｓｉＲＮＡといった試料分子を含む試料滴が適用される、本発明に記載のアレイの設計の略図を示す。見られる通り、試料滴は超疎性表面上を濡らすことができるスポットによって閉じ込められている。
【図６】本発明の好ましい一実施形態に記載のアレイの寸法の設計略図。
【図７】本発明の別の好ましい一実施形態に記載のアレイの寸法の設計略図。
【図８ａ】図６および７にも示される通りの、本発明の好ましい一実施形態に記載の試料スポットでの表面化学を示す。
【図８ｂ】図６および７にも示される通りの、本発明の好ましい一実施形態に記載の試料スポット外の表面化学を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
図１に示すマイクロアレイの異なる層は下記の番号で示される：
（１）基材、好ましくはガラス
（２）ｎ−ＺｒＯ2層、約１００ｎｍ
（３）切断可能フッ化化合物の自己組織化単層、好ましくは約１ｎｍ
（４）固定化試料分子、好ましくはＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のスポット
【００７４】
図１の実施形態に記載の基材（１）は、個別のパートとして使用および処理される最終寸法の従来のフロートガラス基材である。材料選択は、基材の望まれる厚み、およびバックグラウンド蛍光といった光学特性に応じて通常作製される。すべてのさまざまなガラス材料が同一の方法で以降の処理に使用されうる。ガラス材料は、トランスフェクション結果の光学的検査を可能にするため、光学特性および特に透明性のために、本発明に記載の好ましい基材材料である。
【００７５】
基材（１）の上に、ナノ構造化酸化ジルコニウム層（２）が適用される。この例でｎ−ＺｒＯ2層は、ボロフロートガラス基材（１）上に５９０Ｋにて反応性電子ビーム蒸着によって成膜された。同様の表面トポグラフィーがＤＣスパッタ成膜によって基材温度３００Ｋにて得られ、水接触角最大１５５°を与える。前記層（２）は、適当な単層（３）によって化学的に疎油化される際、超疎性を示すトポグラフィーを与える。
【００７６】
反応性電子ビーム蒸着によって、または反応性ＤＣスパッタ成膜によって、成膜されたｎ−ＺｒＯ2層（２）は、静止水接触角最大１５５°を与える。ＺｒＯ2は、特に長期曝露中の、酸性および塩基性環境の両方における安定性のため、ナノ構造化層に好ましい材料と見なされる。対照的に、一部の実施形態に適するにもかかわらず、スパッタ成膜Ａｌ2Ｏ3は光学品質において、両性のために、蛍光ＤＮＡアレイに十分でないという試験結果が得られている。
【００７７】
第２の層として、自己組織化フッ化物単層（３）がナノ構造化層（２）に適用される。それは２つの機能を有する。表面化学に密に充填したフッ化鎖を提供し、ｎ−ＺｒＯ2表面トポグラフィーと組み合わせて超疎水性表面特性を与える。さらに、単層のフッ化鎖はＵＶ切断可能であるため、空間的および化学的の両方で、定義された方法で表面化学を変化させることができ、必要なまたは望ましい機能（たとえば試料分子の結合、トランスフェクション細胞の接着）を有する試料スポットエリアを与える。
【００７８】
非スポットエリアＡの単層の構造を図３に示す。ここで、置換トリクロロシランといったシランが吸着されており、ポリシロキサン単層を与える。これらの化学吸着された部分は、試料スポットおよび非スポットエリアの両方に存在する示されている一実施形態に記載される。
【００７９】
酸化物表面上の高品質シロキサン単層は、再現可能な方法で作製するのが困難と一般的に考えられている。これは主に吸着溶液中の非常に少量の水の不完全な調節のためであると示唆されている（Ｂ．Ｍ．シルバーマン（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ），Ｋ．Ａ．ウィークハウス（Ｗｉｅｇｈａｕｓ），Ｊ．シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）；『重要なチタン合金上におけるシロキサンとホスホン酸塩の単層の性質の比較』（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｉｌｏｘａｎｅ ｖｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｎ Ａ Ｋｅｙ Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ａｌｌｏｙ）； Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２１，２２５ （２００５））。ここで工程安定性の大きな改善が、規定の水圧の存在下で二酸化ケイ素を基材として用いて、トリクロロシランおよびジメチルシランの共蒸着によって得られている（Ａ．ウルマン（Ｕｌｍａｎ）；『自己組織化単層の形成および構造』（Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）；Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６，１５３３ （１９９６））。
【００８０】
しかし、有機シリコン誘導体をホスホン酸塩で置き換えることが、その優れた加水分解安定性（Ｈ．シフト（Ｓｃｈｉｆｔ），Ｓ．ザクサー（Ｓａｘｅｒ），Ａ．パーク（Ｐａｒｋ），Ｃ．パデステ（Ｐａｄｅｓｔｅ），Ｕ．ピーレス（Ｐｉｅｌｅｓ），Ｊ．ゴブレヒト（Ｇｏｂｒｅｃｈｔ）；『ナノインプリントスタンプのためのシランの調節共蒸着』（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌａｎｅｓ ｆｏｒ ｎａｎｏｉｍｐｒｉｎｔ ｓｔａｍｐｓ）；Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，１７１ （２００５）），および有望なより良好な工程安定性のために有利でありうる。
【００８１】
疎水性または超疎性エリアの脱濡れ性質は、自己組織化フッ化単層（３）から得られる分子の粗さによってさらに最適化されうる。たとえば１．８Åしか高さ差のない、無作為に混合されたパーフルオロカーボン鎖は、すでに極めて粗い表面を示す場合、表面張力の低い液体について表面上の撥性を顕著に低下させる。非常に高い空間的頻度を有するそのような「追加の」粗さは、ナノスケールのトポグラフィー上に組み立てることができ、それによって脱濡れ性質を高める。
【００８２】
そのような最適化は、パーフルオロアルキル鎖（図３ＡでＲｆで示す）を用いて実施されうる。ここで、異なる長さの鎖が分子スケールで混合される際に脱濡れを顕著に増大させうる。それらは、異なる長さのパーフルオロ酸塩化物として導入されうる。必要な中間体はさまざまな鎖長（Ｃ４−Ｃ１８）で市販されている。
【００８３】
試料スポットエリア（４）は、紫外光によって開始されるフッ化単層の調節された化学修飾によって、示される通り形成されうる。フォトリソグラフィー・マイクロパターン化のための異なる化学構造を用いるさまざまなそのような化合物が公知であり、たとえば（Ｊ．Ｄ．ジェヤプラカシュ（Ｊｅｙａｐｒａｋａｓｈ），Ｓ．サムエル（Ｓａｍｕｅｌ），Ｊ．リューエ（Ｒｕｅｈｅ）；『マイクロ構造化フッ化表面の作製のための容易な光化学表面修飾』（Ａ Ｆａｃｉｌｅ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒｔ ｈｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）； Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０，１００８０ （２００４）；Ｋ．リー（Ｌｅｅ），Ｆ．パン（Ｐａｎ），Ｇ．Ｔ．キャロル（Ｃａｒｏｌｌ），Ｎ，Ｊ．ツロ（Ｔｕｒｒｏ），Ｊ．Ｔ．コバースタイン（Ｋｏｂｅｒｓｔｅｉｎ）；『表面の直接光化学修飾および化学マイクロパターン化のためのフォトリソグラフィー法』（Ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）；Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０，１８１２（２００４））を参照のこと。記載の例では、パーフルオロエステルがこの目的のために提案される。イソプレン−スチレン・ブロック共重合体にパーフルオロ側鎖として存在するそのようなエステル部は、約３４０℃にて選択的に熱によって切断でき、熱的に可能であるペリ環状レトロ・エン反応によって、対応するオレフィンを与えることが示されている（Ａ．ベーカー（Ｂｏｅｋｅｒ），Ｋ．ライス（Ｒｅｉｈｓ），Ｊ．ワング（Ｗａｎｇ），Ｒ．ステッドラー（Ｓｔａｄｌｅｒ），Ｃ．オベル（Ｏｂｅｒ）；『選択的に熱的切断可能なフッ化側鎖ブロック共重合体：表面化学および表面特性』（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｔｈｅｒｍａｌｌｙ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ Ｓｉｄｅ Ｃｈａｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ： Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）； Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３３，１３１０ （２０００））。カルボン酸およびアルファン酸部分といった他の構造が、同様の温度で切断可能である（Ａ．ベーカー（Ｂｏｅｋｅｒ），Ｔ．ヘルウェク（Ｈｅｒｗｅｇ），Ｋ．ライス（Ｒｅｉｈｓ）；『フッ化側鎖の熱切断によるポリマー表面の選択的変化』（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｂｙ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ Ｓｉｄｅ Ｃｈａｉｎｓ）；Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３５，４９２９（２００２））。この熱処理はＵＶ照射によって同様に開始されうる。
【００８４】
試料スポットエリアの限定的化学官能化に使用されうる選択的分解の結果として、オレフィンＢが生じる（図３参照）。
【００８５】
シロキサン単層は、ＣＨ3（ＣＨ2）n鎖から成るアルキルシロキサン自己組織化単層が真空で約７４０Ｋまで鎖長（ｎ＝４、８、１８）にかかわらず安定であるため、そのような条件下で安定である可能性が高い（Ｇ．Ｊ．クルト（Ｋｌｕｔｈ），Ｍ．Ｍ．スン（Ｓｕｎｇ），Ｒ．マボージアン（Ｍａｂｏｕｄｉａｎ）；『アルキルシロキサン自己組織化単層の酸化 Ｓｉ（１００） 表面上での熱挙動』（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ａｌｋｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｏｘｉｄｉｚｅｄ Ｓｉ（１００）Ｓｕｒｆａｃｅ）；Ｌａｎｇｍｕｉｒ １３，３７７５（１９９７））。
【００８６】
オレフィンＢ（図３参照）をエポキシド化して、共有結合によってだけでなく、たとえばｓｉＲＮＡ含有溶液といった試料分子をスポット上で乾燥することによってまたは代替的に試料分子をポリマーまたはマトリクス化合物内に埋め込むことによって非共有結合によっても、ＲＮＡ Ｃの固定化に用いられる表面を与えることができる。試料分子を表面上に固定するためのこれらの工程についてはさまざまな手順が存在する。
【００８７】
用途の特異的な必要事項に応じて、試料スポットエリアは、細胞結合および増殖を高めるように修飾されうる。これは、たとえば、Ｚｒアルコキシド複合体を用いた（マレイミド）−アルコキシカルボキシレート中間体を介した細胞誘引性ペプチド誘導体ＲＧＤＣの結合を可能にするための、スポットの表面に曝露された少量のホスホン酸によって達成されうる。そのようなＲＧＤＣで修飾された表面は、骨芽細胞結合および増殖に有効であることが示されている（上記参照）。
【００８８】
マイクロアレイ設計について概説される製造工程の概観を図４に示す。
【００８９】
図６は好ましい一実施形態に記載のアレイの寸法の模式図を示す。アレイ面積は１２７．７６ｍｍｘ８５．４８ｍｍである。アレイの厚さは約１．１ｍｍ（標準）であるが、しかし近い距離を必要とする浸漬対物レンズに用いる場合は０．１４５ｍｍである。スポットの総数は２００ｘ１３６＝２７，２００スポットである。各行および列の最外側のスポットは好ましくは試料に使用されない。試料スポットの数は１９２ｘ１２８＝２４，５７６スポットである。スポット直径は０．３００ｍｍであり；スポット間距離（中心から中心）は０．５６２５ｍｍである。スポットの密度は、２７，２００スポットが１１２．２３８ｍｍｘ７６．２３８ｍｍ＝３１８スポット／ｃｍ2上にある。試料体積は液体適用の方法に依存する。通常は、使用される体積は７ｎＬ未満である（半球）。典型的な体積は約４ｎＬ（高さ約１００μｍ）であり、スポット直径は約３００μｍである。
【００９０】
図７は別の好ましい一実施形態に記載のアレイの寸法の模式図を示す。アレイ面積は１２７．７６ｍｍｘ８５．４８ｍｍである。アレイの厚さは約１．１ｍｍ（標準）であるが、しかし近い距離を必要とする浸漬対物レンズに用いる場合は０．１４５ｍｍである。スポットの総数は１００ｘ６８＝６，８００スポットである。各行および列の最外側の２スポットは、エッジ効果を回避するために、試料には使用されない。試料スポットの数は９６ｘ６４＝６，１４４スポットである。スポット直径は０．６００ｍｍであり；スポット間距離（中心から中心）は１．１２５ｍｍである。スポットの密度は、６，８００スポットが１１１．９７５ｍｍｘ７５．９７５ｍｍ＝８０スポット／ｃｍ2上にある。試料体積は液体添加の方法に依存する。通常は、使用される体積は５５ｎＬ未満である（半球）。典型的な体積は約３５ｎＬ（高さ約２００μｍ）であり、スポット直径は約６００μｍである。
【００９１】
図８ａは試料スポットでの表面化学を示す。最も好ましい構造は、３−アミノプロピル−トリエトキシルシラン（１）または３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン（２）から成り、（２）が非常に好ましい。単層はＣＶＤ処理によって１００℃〜１５０℃にて調製される。
【００９２】
図８ｂは試料スポット外の表面化学を示す。構造は１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデシルジメチルクロロシラン（ｎ＝７）の化学吸着由来の単層から成ることができる。好ましくは、構造は、ｎ＝７およびｎ＝１９の等モル組成物の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロアルキルジメチルクロロシランの二元混合単層から成る。単層はＣＶＤ処理によって１００℃〜１５０℃にて調製されうる。
【００９３】
図面および好ましい実施形態の上記の説明によって示される通り、アレイは次の機能規格を有する。試料分子は試料スポットに固定化され、好ましくは試料スポットに化学的に結合している。細胞が試料スポットに適用および接着される。試料スポットの周囲の疎水性または超疎性エリアのために、試料スポットの外側のエリアで核酸および細胞培養培地成分の非特異的結合が最小限起こる。技術的規格に関して、アレイの試料スポットは、透過光顕微鏡法での使用のために設計され、すなわち、スポットは光学的に透明または半透明であり、および従来の顕微鏡スライドと同様の光学特性を提供する。試料プレートは好ましくは、透過光学顕微鏡および蛍光リーダーといった機器に適合している。
【技術分野】
【０００１】
たとえばｓｉＲＮＡといった規定の試料分子の、細胞へのトランスフェクションを可能にする、疎水性光学細胞アレイの設計案が提示される。本発明は、細胞機能および特に遺伝子機能の高処理量分析に適する戦略を提供する。本発明の一態様は、目的の細胞表現型を生じるかまたは影響するものについて、試料分子の大きな組を迅速にスクリーニングするのに適する、トランスフェクションマイクロアレイを作製するための方法およびアレイを提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来の細胞アレイスクリーニング方法は、目的のｓｉＲＮＡといった試料分子を含む、ガラス表面上にスポットされたキャリヤーを利用するかまたは、マイクロタイタープレートを用いる。基本的に、細胞ＲＮＡｉスクリーニングに用いられる２つの従来のおよび一般的な「細胞アレイプレート」法がある：
【０００３】
１つの方法は、ウェルを基礎とする標準的なマイクロタイタープレート（たとえば９６または３８４ウェルマイクロタイタープレート）を用いる。この方法は、試料化合物の高処理量は実行可能でないという欠点がある。前記方法は、トランスフェクション試料の受容能力が相対的に低い（最大スポット数がウェル／プレートの量に限定される）。これらの方法はまた、相対的に多量の材料（たとえばｓｉＲＮＡおよび細胞）を必要とする。さらに、個々のウェルを多数のプレート上で取り扱う必要があるため、特に大規模スクリーニング中に、均一性が低下する。
【０００４】
たとえば、遺伝子２３０００個および１遺伝子当たり４個のｓｉＲＮＡを用いる全ゲノムスクリーニングを利用者が実施したい場合、９６ウェルプレート１枚当たり８２個のｓｉＲＮＡ（各プレート上の対照）はたった１つの実験について１１２２枚の９６ウェルプレートを結果として生じる。これは明らかに実施時間およびコストに関して短所である。また、保管室が提供されなければならない。
【０００５】
しかし、適当な代替物が無いため、この形式は現在用いられるＲＮＡｉスクリーニングで幅広く使用される形式である。１０００プレート以上を取り扱う作業負荷のため、ＲＮＡｉスクリーニングは適当なサイズおよび設備を有する少数の研究室に限定される。
【０００６】
別のトランスフェクション法は、（ガラス）スライド上の壁の無い標準アレイを用いる （たとえば非特許文献１および２、特許文献１）。この方法もまた、しかし、いくつかの短所を有する。懸濁細胞の使用が不可能であり、およびスポット上処理（たとえば以降の生化学試験のための細胞溶解）を実施する可能性はかなり限定される。さらに、側方拡散およびそのようにしての実験中の汚染を防ぐために核酸をスポット上に固定する必要がある（たとえばマトリクスまたはゼラチンを用いることによって）。たとえばｓｉＲＮＡといった試料核酸のスポッティングは、遺伝子発現プロファイリング研究用のＤＮＡマイクロアレイのために開発されたスポッティング装置を用いて実施される。そこで、ＤＮＡスポッティングは信頼性の高い実験のためにあまり頑健でないことが証明されている。いくつかの限定因子を挙げれば、たとえばスポットのサイズ、スポット形式およびガラススライドの純度が変動し、これらは限定のない因子として挙げられる。ＤＮＡスポッティングを基礎とするマイクロアレイの市場浸透は、これらの問題のために約５０％からおよそ５％へ減少している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ ０２／０７７７２６４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ジャウディン（Ｚｉａｕｄｄｉｎ）およびサバチニ（Ｓａｂａｔｉｎｉ），２００１
【非特許文献２】ムース（Ｍｏｕｓｓｅｓ）他，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
改良されたトランスフェクション法およびマイクロアレイトランスフェクションアレイ系を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、少なくとも下記の段階を含む、細胞へ試料分子を導入するトランスフェクション法によって解決される：
（ａ）疎水性エリアに囲まれた少なくとも１つの試料スポットエリアを含む基材を用いること；
（ｂ）試料分子を前記少なくとも１つの試料スポットエリアに適用し、それによって前記試料分子を前記試料スポットエリアの不連続な位置に置くこと；
（ｃ）トランスフェクションすべき細胞を基材に適用し、および試料分子の前記細胞への進入に適する条件下でインキュベートすること；
（ｄ）それによって少なくとも一部の前記試料分子が前記細胞へ導入される。
【００１１】
本発明の中核は、疎水性エリアに少なくとも一部が囲まれた試料スポットエリアを含む、トランスフェクションに適するマイクロアレイ基材の使用である。好ましくは、試料スポットエリアは、疎水性エリアによって完全に包含されおよびしたがって囲まれる。これは、たとえば試料スポットエリアの周りに疎水性の環を配置することによって達成されうる。しかし、好ましくは、濡らすことができおよびしたがって好ましくは親水性および／または親油性である試料スポットエリアを除いて、基本的に基材表面全体が疎水性である。
【００１２】
それによって、試料スポットエリアを囲む疎水性エリアの存在のために、試料スポットエリアが互いに安全に隔離されている、壁の無い疎水性トランスフェクションアレイが作製される。標準的なトランスフェクションアレイと比較した場合、本発明に記載のトランスフェクションアレイは、試料スポットエリアの周囲の疎水性エリアのために、交差汚染のリスクが相当に低い。これらの性質は、溶液および細胞培地が隣接するエリアへ拡散するのを防ぎ、それによって交差汚染を回避する。各試料スポットエリアは、周囲の疎水性エリアによって他の試料スポットエリアから隔離されている自身の液体区画によって接触される。試料スポットエリア上に置かれた試料分子を載せたトランスフェクションアレイ基材は、有利に供給者によって提供でき、およびしたがって必要に応じて製造前でありうる。前記トランスフェクションアレイは、したがって、利用者が基本的にトランスフェクションすべき細胞を適用するだけでよく、すぐ使える製品として利用者へ提供されうる。
【００１３】
試料スポットに置かれおよび通常その上で増殖するトランスフェクション細胞は、試料分子を取り込み、それによって試料スポットエリア上に局所化したトランスフェクション（トランスフェクションされた細胞のスポットを生じる。しかし、本発明に記載のトランスフェクションアレイによれば、細胞は、先行技術のトランスフェクションアレイについて知られるようには、基材表面全体に一面の細胞を生じない。代わりに、細胞は主に、試料スポットエリアの疎水性エリアの境界内に集中する。
【００１４】
試料スポットエリア間の交差汚染の回避に関する長所の他に、本発明に記載のアレイトランスフェクション系の長所は、不連続なおよび分離した試料スポットエリアのためにスポット数を顕著に増加させうる点である。これらの性質は、非常に多数の試料から成るアレイの構築を可能にする。一実施形態によると、基材は少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも７，５００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、または少なくとも２０，０００個の試料スポットエリアを含む。好ましくは、親水性および／または親油性エリアは特定のパターンにしたがって基材上に配列される。そのようにして、たとえば、親水性および／または親油性試料スポットエリアが次いでたとえば機械によって連続試験に向けて容易に移されうる、ラスター、いわゆるアレイが、製造されうる。本発明に記載のトランスフェクションアレイはたとえば自動的に読み取りされうる。マイクロタイタープレート形式でプレート当たり最小３８４スポットを有することが好ましい。アレイのサイズに応じて、最大数千のスポット数（２５，０００およびさらにそれ以上）が一般的に可能である。マイクロタイタープレート（面積約１２０ｘ８０ｍｍ2）当たり望ましい２５，０００（以上）スポットについて、たとえば試料ピッチ６２０μｍを与え、スポット直径約３００μｍを可能にする。
【００１５】
本発明に記載のトランスフェクションアレイ法は、たとえば、自動処理としての多数の異なる試料分子のスクリーニングおよび特にＨＴＳ（高処理量スクリーニング）に有用である。
【００１６】
はるかに少ない数の試料スポットについてさえ、本発明に記載のトランスフェクションアレイ設計は、調製処理を実施することができる試料位置の明瞭な空間的定義を可能にする。この機能は典型的には、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）コーティングといった従来の撥性表面とは異なる極度の撥液体性を必要とする。したがって、疎水性エリアはまた疎油性であることが、本発明によると好ましい。疎水性および疎油性を有する表面は、水によっても油性液体によっても濡らすことができない。
【００１７】
疎水性および疎油性を有する表面は、本発明によると「超疎」または超疎性と称する。
【００１８】
ウェルを基礎とするプレートと比較した本発明に記載の系の別の長所はまた、実験操作にピペット段階を使用する必要が低減されることである。これは、試料分子がアレイ基材の試料スポットエリアに予め固定または予め適用されて利用者へ提供されうるためである。利用者は、トランスフェクションすべき細胞を適用するだけでよく、ここで細胞は、疎水性および／または超疎性エリアの撥性のために、自動的に試料スポットエリア上に集中する。
【００１９】
本発明に記載のトランスフェクション法はまた、懸濁細胞をスクリーニングする可能性を開く。試料スポットの厳密な分離はまた、必要に応じて同一プラットホーム上での異なる実験条件の使用を可能にする（たとえば異なるトランスフェクション試薬、細胞型、ｓｉＲＮＡ濃度といった試料分子、トランスフェクション剤、細胞培地など）。多様性は、したがって、顕著に増大する。
【００２０】
好ましくは、前記試料スポットエリアだけが、アレイ上で濡らすことができる場所である。したがって、前記試料スポットエリアは親水性および／または親油性を有する。前記親水性および／または親油性エリアは、好ましくは水滴または油滴を置くことができるエリアである；すなわちたとえばピペットシステムによって親水性および／または親油性エリアと接触させられた水滴または油滴がそこに留まり、およびピペットシステムから離れるかまたは容易に離すことができる。好ましくは、親水性およびまたは親油性エリア上の体積１０μｌの水滴または油滴は接触角＜１２０°、好ましくは＜１１０°、特に好ましくは＜９０°を有し、および／またはこの滴の後退角は１０°を上回る。
【００２１】
試料スポットを囲むエリアは、試料調製中にアレイに適用される液体に対して極めて撥性である。これらのエリアはしたがって好ましくは超疎である。したがってアレイ全体がウェル無しマイクロアレイとして働き、試料区画は、その他の濡らすことができない環境における、濡らすことができるエリアとして定められる。
【００２２】
超疎性非湿潤性環境で囲まれた濡らすことができる試料スポットエリアに置かれた試料材料の分布は、従来の疎水性表面と比較してはるかに均一であることもまた示されている。後者の場合には、乾燥試料スポットの付着材料の不均一性は主に、溶媒が蒸発する際のスポットの周縁と中心との間で異なる蒸発条件により、より多くの材料が周縁の付着を生じる。したがって、超疎周囲エリアは本発明との関連（ｃｏｎｔｅｘｔ）で好ましい。
【００２３】
さらに、スポット外のエリア上の試料の非特異的結合を、液体試料が一時的にそれらのエリアと接触するとしても、試料スポットを囲むエリアの極端な撥性は、最小化する。したがって、試料スポットエリア外のエリア上の、細胞培養培地の成分および試料分子の非特異的結合は最小限だけである。三相界面を有する超疎性表面は、液体−固体界面に捕捉された気体から成り、それによって真の液体−固体接触面積を幾何学的接触面積のわずかな割合に低減する。たとえば、接触角１７８°にて固体−液体の割合は幾何学的接触面積のわずか０．１％である。
【００２４】
一実施形態によると、前記疎水性または超疎性エリアは、水に対して少なくとも１４０°、好ましくは少なくとも１５０°の接触角を示す。本発明の目的のための超疎性表面は、好ましくは表面上にある水滴および／または油滴の接触角が１５０°より大、好ましくは１６０°より大、および特に好ましい１７０°より大である。好ましくは、後退角は１０°を超えない。後退角とは、体積１０μｌの静止した水滴および／または油滴が表面の傾斜のための重力が原因で動く際の、基本的に平面のしかし構造化された表面の傾斜の水平からの角度を意味する。そのような超疎性表面は、たとえば、参照により本開示に含まれおよび本発明の開示の一部と見なされる、ＷＯ９８／２３５４９、ＷＯ９６／０４１２３、ＷＯ９６／２１５２３、ＷＯ９９／１０３２３、ＷＯ００／３９３６８、ＷＯ００／３９２３９、ＷＯ００／３９０５１、ＷＯ００／３８８４５およびＷＯ９６／３４６９７で開示される。
【００２５】
本発明に記載のトランスフェクションアレイを作製するために使用されうる前記疎水性および／または超疎性エリアは、好ましくはナノ構造を示す。好ましくは、前記疎水性または超疎性エリアは、各フーリエ成分の位相周波数ｆおよび積分範囲ｌｏｇ（ｆ1／μｍ-1）＝−３およびｌｏｇ（ｆ2／μｍ-1）＝３間で計算される積分Ｓ（ｌｏｇ（ｆ））＝ａ（ｆ）・ｆで表されるその振幅ａ（ｆ）が少なくとも０．３である表面構造を有し、および疎水性または特に疎油性材料製であるかまたは耐久性疎水性および／または特に耐久性疎油性材料でコーティングされている。そのような超疎性表面は、参照により本開示に含まれおよび本発明の開示の一部と見なされる、ＷＯ００／３９２４９に記載される。
【００２６】
親水性および／または親油性試料スポットエリアは、好ましくはレーザーによる前記撥性層の層厚みの少なくとも一部の化学的および／または機械的除去を通じて疎水性または超疎性表面上に作製されうる。それらはまた、疎水性または超疎性層上に沈着されうる。好ましくは、親水性および／または親油性エリアは、しかし、疎水性または超疎性表面の最上分子層のみの修飾によって形成される。好ましくは、この修飾は機械的および／または熱アブレ−ションであり、それによって好ましくは疎水性または超疎性の最大で１分子層が除去される。さらに、修飾は好ましくは超疎性表面の熱的または化学的変化を通じて進行し、しかし、その除去を含まず、たとえば、参照により本開示に含まれるＤＥ １９９ １０ ８０９に記載される通りである。この修飾によって、超疎性表面はその層厚みに関して著しく変化しないままである。別の好ましい一実施形態では、親水性および／または親油性エリアは超疎水性表面上の一部に可逆的に作製されうる。
【００２７】
超疎性材料を作製するために使用されうる好ましい超疎性材料は、たとえばナノ構造化ＺｒＯ2またはＡｌ2Ｏ3層である。それらはスパッタ成膜によって基材に適用することができる。ナノ構造層上部の表面化学として、ＳＡＭ分子が使用されうる。適当な例はたとえばフッ化シラン、フッ化リン酸およびホスホン酸塩、フッ化ヨウ化物およびフッ化脂肪酸である。好ましくは、表面化学は少なくとも、異なる長さを有する（分子スケールで混合された）鎖の２成分混合単層である。一実施形態によると、表面はＣ１０：Ｃ１２フッ化アルキル鎖の混合単層を構成する。別の一実施形態によると、Ｃ１０：Ｃ２０フッ化アルキル鎖の混合単層が用いられる。フッ化アルキル鎖はらせん状立体配座を含みおよび硬性である。フッ化単層の長所は、それらが相分離しないことである。
【００２８】
試料スポットエリアは好ましくは、ＳＡＭを含むかまたはＳＡＭから成り、ＳＡＭは単成分または多成分でありうる。それらはまた、フィブロネクチンといったペプチドでコーティングされうる。親水性表面化学は、好ましくは、３−アミノプロピル−トリエトキシシラン、３メルカプトプロピル−トリメトキシシラン、メタクリルオキシプロピル−トリエトキシシラン、ヘキサデシルトリメトキシシラン、２−[メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル]トリメトキシシラン、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈペルフルオロデシルトリエトキシ−シランおよび３−（フェニルアミノ）プロピルトリメチルジエトキシシランから成る群から選択される１つの化合物を含む。好ましくは、化合物は３−アミノプロピル−トリエトキシシラン、３メルカプトプロピル−トリメトキシシランおよび３−（フェニルアミノ）プロピルトリメチルジエトキシシランから選択され、なぜならこれらの化合物はＨｅＬａＳ３、ＭＣＦ−７、ＨＥＫ２９３、ＨＵＶＥＣ、ＣａＣＯ−２およびＨｅｐＧ２といった幅広い細胞の細胞増殖を可能にするために適することが証明されているためである。細胞は良好に接着した。
【００２９】
トランスフェクション反応のために試料スポットエリアに適用されうる試料分子の例は、下記を含むがそれらに限定されない：
−核酸、その下位にＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ここで核酸は１本鎖または２本鎖および直鎖または環状でありうる；
−ペプチド
−タンパク質
−糖
−脂質
−多糖
−有機分子、特に低分子。
【００３０】
試料分子は、たとえばピンツールを用いるスポッティング、分注ウェルプレートといった分注技術、またはインクジェット技術といった任意の適当な方法によってアレイに適用されうる。
【００３１】
ＲＮＡ分子および特にｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子といったＲＮＡｉ媒介化合物は、本発明のトランスフェクションアレイのための特に好ましい試料分子である。ｓｉＲＮＡといったＲＮＡｉ媒介化合物のライブラリを本発明に記載のトランスフェクションアレイに適用することによって、前記ｓｉＲＮＡによって媒介される作用のスクリーニングおよびしたがって分析が顕著に改善される。本発明のアレイによればゲノムライブラリを与えることさえ可能である。
【００３２】
ｓｉＲＮＡ分子（２ヌクレオチドの末端３’オーバーハングを有する長さ２１〜３０ヌクレオチド（ｎｔ）を有する２本鎖（すなわち二重鎖）分子干渉短ＲＮＡ）を、哺乳類細胞において転写後に遺伝子発現をサイレンシングするために使用できることが知られている（エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）他，Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１１：４９４−４９８）。適当なトランスフェクション試薬とのｓｉＲＮＡの複合体化およびこれらの複合体の細胞への適用は、ｓｉＲＮＡ複合体のエンドサイトーシス取り込みを結果として生じる。ｓｉＲＮＡは最終的に細胞質へ放出され、およびｓｉＲＮＡ分子は認識されおよびＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と呼ばれる複合体に組み込まれる。ＲＩＳＣ関連ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ活性は二重鎖をほどき、および２本の鎖の両方が独立して標的ｍＲＮＡ認識を導くことを可能にする（ツシュル（Ｔｕｓｃｈｌ），ＭｏＩ．Ｉｎｔｅｒｖ．２００２，２：１５８−１６７）。
【００３３】
ＲＩＳＣ複合体は次いで、ｓｉＲＮＡ配列が相補的であるｍＲＮＡ内の領域を認識し、およびｍＲＮＡ中のこの領域と結合する。ｍＲＮＡは次いでヌクレオチド鎖切断によって、ＲＩＳＣ複合体が結合しているその位置で切断され、最後の段階では、ヌクレオチド鎖切断によって切断されたｍＲＮＡがエキソヌクレアーゼによって分解される。ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシング（ＲＮＡ干渉、ＲＮＡｉ）のこの機構は、真核細胞培養においてノックダウン実験を実施するために広く用いられている。
【００３４】
すべてのｓｉＲＮＡ二重鎖がｍＲＮＡレベルを同程度にノックダウンできるわけではないこともまた知られている。一部のｓｉＲＮＡは初期レベルを約１０〜２０％へ、別の一部は中程度のレベル（２０〜７０％）へノックダウンでき、およびさらに別のものはｍＲＮＡレベルを測定可能なレベルに全くノックダウンできない。ｓｉＲＮＡの設計については一定の設計規則（いわゆる「ツシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）則」）が存在するが、しかしこれらの規則にしたがって設計されたｓｉＲＮＡさえ上記の変動性を示す。この観察の理由は知られていない。二重鎖の熱力学的安定性もまた、ｓｉＲＮＡがサイレンシングを誘導する効率に関与しうると考えられている。この変動性、および「良い」ｓｉＲＮＡさえすべてのｍＲＮＡを完全にノックアウトできないという事実は、ｓｉＲＮＡ技術の重大な短所である（ゴング（Ｇｏｎｇ）Ｄ．，Ｔｒｅｎｓｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，２２：４５１−４５４；クホロバ（Ｋｈｖｏｒｏｖａ）Ａ，Ｃｅｌｌ ２００３，１１５：２０９−２１６； シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）Ｄ．Ｓ．，Ｃｅｌｌ ２００３，１１５：１９９−２０８；レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）Ａ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，２２：３２６−３３０）。細胞への取り込みの促進によるかまたはより強力な細胞内ｓｉＲＮＡ二重鎖による、より強力な遺伝子サイレンシングの検索は、したがってｓｉＲＮＡ研究の分野の中心である。
【００３５】
さらに、ｓｉＲＮＡ分子がサイレンシングを誘導する能力を高めるため、およびまたそれらの安定性を高めるために、いくつかの化学修飾が試験されていることが知られている。ｓｉＲＮＡ分子またはオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の化学修飾は、これらの分子のヌクレアーゼ安定性、または標的ｍＲＮＡとのそれらの親和性に影響する（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００４，８：５７０−５７９）。血清ヌクレアーゼに対する安定性を改善するためおよび／または標的との親和性を改善するための、さまざまな種類の修飾が記載されている。ａ．ハロゲン、アミン、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリル、アルキル基での２’−ＯＨ修飾；ｂ．オルトエステル、リン酸エステル、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホナート、ホスホノチオエート、ホスホロチオトリエステル、ホスホロアミデート、ホスホロチオアミデート、ホスフィナートおよびボロネート結合、エーテル、アリルエーテル、アリルスルフィド、ホルムアセタール／ケタールスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルファマート、スルホンアミド、シロキサン、アミド、陽イオン性アルキルポリアミン、グアニジル、モルホリノ、ヘキソース糖またはアミド含有結合、または２から４原子結合といったヌクレオチド間結合；ｃ．接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、たとえばアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、糖質、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびその組み合わせ、コレステロール接合体を用いる受動輸送が記載される。
【００３６】
通常の（非保護）ｓｉＲＮＡは、細胞培地中および血清といった体液中で、低い安定性を示しうる。これは、トランスフェクションまたは全身配送中のｓｉＲＮＡの分解の危険を結果として生じる。したがって、分解のために、効率的なサイレンシングのための細胞におけるより少ないｓｉＲＮＡが残り、および分解された（短縮された）ｓｉＲＮＡは非特異的塩基対形成のために、細胞中で標的効果を損なうことを導きうる。ｓｉＲＮＡの細胞へのトランスフェクションは、標的効果を損なうことを導きうることが示されている。具体的には、多量のｓｉＲＮＡはＰＫＲ活性化に繋がりうる（ＰＫＲ：プロテインキナーゼＲ；２本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ）。また、ＲＩＳＣ中のアンチセンス鎖でなくセンス鎖の認識および組み込みもまた、標的効果を損なうことを導きうる。
【００３７】
したがって、本発明によると、分解に対して保護されている改良されたｓｉＲＮＡ分子を試料分子として使用することが好ましく、そのためｓｉＲＮＡ分子の遺伝子サイレンシング活性、およびしたがってトランスフェクション効率が改善され、および効率的な遺伝子サイレンシングおよびしたがってトランスフェクションの成功に必要なｓｉＲＮＡ分子の量が減少する。
【００３８】
化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子は、培養培地中でのこれらの分子の安定性を高める。ｓｉＲＮＡの分解は効果的に抑制され、および完全長ｓｉＲＮＡはより活性でありおよび標的効果を損なうことを導きえない。さらに、ｓｉＲＮＡの感度が向上する。本発明に記載のトランスフェクション法において高レベルの遺伝子サイレンシングを達成するためには、より少ない量のｓｉＲＮＡが必要である。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣに正しい方向で組み込むことができ、そのためアンチセンス鎖だけがサイレンシングを誘導でき、それはより高い特異性に繋がる。加えて、センス鎖は修飾のために不活性化され、結果として標的効果が損なうことを消去する。本発明に記載のｓｉＲＮＡは、より効率的なｓｉＲＮＡ二重鎖の巻き戻し、および標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを可能にし、改善された標的結合親和性に繋がる。さらに、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション効率が向上する。
【００３９】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方のよく定義された位置に下記の基および結合の組み合わせを有する、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡの安定性、感度および特異性を改善する：
（ａ）２’−デオキシ修飾ヌクレオチド；
（ｂ）２’−メトキシ修飾ヌクレオチド；
（ｃ）３’→５’または２’→５’ホルムアセタール結合によって結合した２個のヌクレオシド；
（ｄ）−０−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＥｂ）２−ＯＨ基によって２’位で修飾されたヌクレオチド；および
（ｅ）３’位（[rho]osition）に−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）７−ＣＨ３基を含むヌクレオチド。
【００４０】
本発明に記載のトランスフェクション法において試料分子として使用されうるｓｉＲＮＡのさらなる有利な性質は、参照により本開示に含まれるＷＯ２００６／１０２９７０に記載される。
【００４１】
細胞にトランスフェクションすべき試料分子は、試料スポットエリアと共有結合によってまたは非共有結合的に結合／付着している。試料分子、たとえばｓｉＲＮＡ分子といった核酸は、試料スポットエリアへの適用の前に合成されうる。アレイ表面への適用は、優先的に試料分子含有溶液の単純なスポッティングによって実施され、任意に次いで乾燥過程が実施される。代替的に、スポッティングはさまざまな表面化学および／または化学キャリヤー材料またはマトリクスによって支持されうる。
【００４２】
試料スポットエリアへの試料分子の結合／付着を促進するために、試料分子はたとえば適当なマトリクスまたはポリマーと混合されうる。マトリクスのそれぞれのポリマーはまた、試料分子が添加される前に予め適用されうる。一実施形態によると、前記試料分子は試料スポットエリアにてマトリクスに埋め込まれている。これらのマトリクスは合成または天然でよく、および、試料スポットエリアへの試料分子の結合を促進するために、ゼラチン、アガーまたはアガロース、シラン、ポリＤリジン、（ポリ）アクリルアミド、抗体またはその断片、合成（ポリ）ペプチド、脂質、細胞タンパク質の粗調製物または精製調製物、糖または多糖、細胞外マトリクス成分、たとえばコラーゲン、フィブロネクチン、マトリゲル、無機イオン、他のポリマーから選択されうる。
【００４３】
また、別の試薬、たとえば細胞毒性低減試薬、細胞結合試薬、細胞増殖試薬、細胞刺激試薬または細胞阻害試薬、または特定の細胞を培養するための化合物／培地もまた、試料スポットエリアに適用または添加されうる。
【００４４】
試料スポットエリアは、細胞増殖を促進するためにトランスフェクション細胞がそこに接着するように設計されうる。一実施形態によると、試料スポットエリアへの細胞の接着を促進するために、少なくとも１つの前記試料スポットエリアの表面特性が修飾される。したがって、適用／トランスフェクションアッセイの具体的必要性に応じて、スポットエリアは細胞結合および増殖を増大させるように修飾されうる。これは、たとえば、ジルコニウムアルコキシド複合体を用いた（マレイミド）−アルコキシカルボキシレート中間体を介した細胞誘引性ペプチド誘導体ＲＧＤＣの結合を可能にするための、スポットの表面に曝露された少量のホスホン酸によって達成されうる。そのようなＲＧＤＣで修飾された表面は、骨芽細胞結合および増殖に有効であることが示されている（Ｍ．Ｐ．ダナヒー（Ｄａｎａｈｙ），Ｍ．Ｊ．アバルトロニ（Ａｖａｌｔｒｏｎｉ），Ｋ．Ｓ．ミドウッド（Ｍｉｄｗｏｏｄ），Ｊ．Ｅ．シュワルツバウエル（Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ），Ｊ．シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）；『α−ω−ジホスホン酸のＴｉ上の自己組織化単層は完全なまたは空間的に制御された表面誘導体化を可能にする』（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｏｍｅｇａ−Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄｓ ｏｎ Ｔｉ Ｅｎａｂｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｏｒ Ｓｐａｔｉａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）；Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０，５３３３ （２００４））。
【００４５】
特に試料分子としての核酸について使用されうるｉｎ ｓｉｔｕ合成プロトコルによると、ｓｉＲＮＡ核酸といった核酸は、たとえばフォトリソグラフィー法またはヌクレオチドのインクジェット印刷によって、スライドの表面上に直接合成されうる。これは別個のスポッティング段階を回避する。
【００４６】
試料分子取り込みを支持するために、いくつかのトランスフェクション法がｓｉＲＮＡ／ＮＡといった試料分子の細胞への進入または取り込みを円滑化するために使用されうる。優先的に、これはリポフェクション法、デンドリマー法、または細胞膜透過ペプチド法といった化学的方法によって達成される。しかし、それはまた、物理的方法、たとえばエレクトロポレーション法、ショットガン法、またはレーザー支援トランスフェクション法によって、または生物学的方法、たとえばウイルスベクターまたは細菌ベクターまたは孔形成毒素によって実施されうる。トランスフェクション試薬またはデリバリー試薬は、好ましくは核酸、タンパク質、ペプチド、糖、多糖、有機化合物、および他の分子といった試料分子を細胞へ導入できる陽イオン性化合物である。好ましい実施形態は、陽イオン性オリゴマー、たとえば低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、低分子量ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、低分子量キトサン、または低分子量デンドリマーを用いる。それらのモジュール組成によると、試薬は下記の通り分類されうる：脂質、ポリマー、脂質−ポリマーおよび／またはそれらの組み合わせおよび／またはそれらの誘導体であって、細胞−標的化または細胞内−標的化部および／または膜不安定化成分、およびデリバリーエンハンサーを含む。また、エレクトロポレーション、膜透過性ペプチドおよびナノ粒子が使用されうる。
【００４７】
好ましくは、スポットおよびスポット周囲エリアの表面化学は、ｐＨ７．５±１にて安定である。さらに、チップ／アレイ全体が水系細胞培養培地中で５日間３７℃にて安定であることが好ましい。さらに、試料と接触する材料は細胞毒性でない。
【００４８】
特に、試料スポットは、下記の化合物のうち少なくとも１つを含む水系トランスフェクション試薬の適用と互換性がある：脂質、たとえばＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）；ＤＯＴＭＡ（臭化１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウム）；ＤＭＲＩＥ（臭化１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム）；ＤＤＡＢ（臭化ジメチルジオクチルデシル（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔｙｌｄｅｙｌ）アンモニウム）；ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン）；ＤＣ−ＣＨＯＬ（（３β[Ｎ´，Ｎ´−ジメチルアミノエタン）カルバモイル]−コレステロール）；ＤＯＧＳ（５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド）；ＤＰＰＥＳ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−６−カルボキシスペルミルアミド）；ピリジニウム両親媒性物質、たとえば塩化Ｎ−メチル−４−（ジオレイル）メチルピリジニウム。好ましい試薬はキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）が販売するＲＮＡｉｆｅｃｔ（登録商標）およびＨｉＰｅｒｆｅｃｔ（登録商標）である。
【００４９】
一実施形態によると、トランスフェクション試薬は、細胞が基材に適用される前に、または細胞と一緒にトランスフェクション試薬／細胞混合物の形で、基材に適用される。この実施形態は、利用者が、トランスフェクションすべき細胞に最も良く作用する、自分で選択するトランスフェクション剤を使用しうるという長所を有する。別の一実施形態によると、トランスフェクション試薬は試料分子と一緒に試料スポットエリア上に適用され、およびしたがってまた試料スポットエリアにそれぞれ予め固定され予め適用される。この実施形態は、利用者は細胞をアレイに適用するだけでよいという長所がある。さらに、この実施形態によって、試料分子の安定化が達成されうる。
【００５０】
非常に好ましい一実施形態によると、少なくとも前記試料スポットエリアは光学的に透明または半透明である。しかし、また基材全体も光学的に透明または半透明でありうる。この性質は、試料スポットエリアが透過光顕微鏡法といった光学分析法に適するよう設計されるという特別の長所を有する。したがって、少なくとも１つ試料スポットエリア、または少なくとも２つまたは実質的にすべての試料スポットエリアさえも、光学的に透明または半透明であり、および光学顕微鏡および蛍光リーダーによる結果の分析を可能にするために従来の顕微鏡スライドと同様の光学特性を提供する。この点で、アレイ形式が透過光学顕微鏡および蛍光リーダーといった機器と適合するよう設計されることもまた有利である。これはまた自動処理を可能にする。
【００５１】
記載されたスクリーニング処理を実施できるために、明らかに、各試料スポットは異なる試料分子を含みうる。たとえば本発明に記載のトランスフェクションアレイ基材の各試料スポットエリアは、異なるｓｉＲＮＡの細胞に対する影響を分析するために、異なるｓｉＲＮＡを含みうる。別の一実施形態によると、少なくとも２つの異なる種類の試料分子が１つのトランスフェクション反応に用いられる。この一実施形態は、組み合わせトランスフェクションアッセイが実行可能であるという長所を有する。一実施形態によると、さまざまな種類の試料分子がすべて試料スポットエリアへ適用されおよびしたがってそれぞれ予め固定され予め沈着されている。たとえばｓｉＲＮＡといった核酸を、試料スポットエリア上に別のｓｉＲＮＡまたは医薬、たとえば低分子といった、別の試料分子と一緒に適用することができる。２つの異なる試料分子が１つの試料スポットエリアにしたがってそれぞれ予め固定され予め沈着されている。たとえば低分子といった医薬を用いる後者の実施形態は目的の遺伝子発現に対して、適用されるｓｉＲＮＡが完全なサイレンシング作用を提供しない場合に特に有利である。ｓｉＲＮＡを、同一経路に影響する別の試料分子と組み合わせることによって、改善されたかまたは完全な干渉およびしたがってサイレンシング作用が達成されうる（たとえば モーガン・ラッペ（Ｍｏｒｇａｎ−Ｌａｐｐｅ）他，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００６）２５，１３４０−１３４８；ギウリアノ（Ｇｉｕｌｉａｎｏ）他，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｅｎｇ ９（７）；２００４を参照）。また、異なる試料分子の交差相互作用もそれによって分析されうる。この実施形態はまた、より低濃度の前記ｓｉＲＮＡ（第１の試料分子の例として）および前記第２の試料分子を使用することを可能にする。この性質は、化合物のうち一方の阻害作用が、前記化合物の毒性濃度でしか達成されない場合に特に有利である。
【００５２】
前記第２の分子を予め試料スポットエリアへ適用する代替として、前記第２の試料分子はまた、細胞を基材へ適用する前または後に適用することができ、または細胞と予め混合されうる。この実施形態は、適当な第２の試料分子を利用者が自由に選択できるという長所を有する。
【００５３】
別の一実施形態によると、試料分子の細胞活性に対する影響は、本発明に記載のトランスフェクション方法を用いることによって観察されうる。一実施形態では、トランスフェクションスクリーニングを用いて、寄生虫またはたとえばウイルスといった感染病原体が目的細胞に適用された際の、増殖不能または生存不能について分析できる。この場合、選択は細胞が感染した際にだけ必須である、細胞内のウイルス機能または寄生虫機能の一部の側面に特異的に必須である遺伝子を標的とするノックアウトを対象とする。一部のウイルス感染は、生存因子（たとえばＣｒｍＡ、ｐ３５）の誘導を結果として生じるため、おそらく少なくとも一部の細胞機能はウイルス、寄生虫増殖中に異なりおよび潜在的に選択的に必要とされる。したがって、ウイルスサイクルをより詳細に研究することが可能である。一実施形態によると、ｓｉＲＮＡといった試料分子を試料スポットエリア上に含むトランスフェクション基材が用いられる。細胞は次いでトランスフェクション基材に置き、およびトランスフェクションが起こるようにインキュベートする。作用を与えるのに十分長く、試料分子が細胞にトランスフェクションされた後、ウイルスを細胞に適用する。この設定は、たとえばウイルスサイクル、およびウイルス増殖サイクルに対する特定のメッセンジャーの影響をより詳細に研究することを可能にする。
【００５４】
本発明の教示によるとトランスフェクションすべき細胞は任意の性質のものでよい。例は、真核細胞、たとえば哺乳類細胞（たとえば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、またはマウス細胞）、細菌、昆虫または植物細胞である。真核細胞は好ましくは哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、分裂細胞または非分裂細胞でよく、および細胞は形質転換細胞または初代細胞でよい。哺乳類細胞は体細胞または幹細胞でよい。試料分子が移送されている細胞の検出は、試料分子自体、その産物、その標的分子、触媒された産物、または試料分子によって調節される産物、または細胞の表現型に対する作用を検出することによって実施されうる。細胞は、試料分子を有する表面上へ、十分な密度で、および試料分子の細胞への導入／進入に適した条件下で、および作用を与えるのに必要な細胞成分との相互作用を可能にするように、平板播種（配置）される。
【００５５】
細胞は好ましくは試料分子が試料スポットエリアに既に配置された際に適用される。たとえば輸送台を用いる液体の並列移動、スタンプ技術およびスポッティング技術といった、任意の適用様式を用いることができる。
【００５６】
レシピエント細胞（トランスフェクションによって導入された前記試料分子を含む細胞）に対する作用の検出は、目的タンパク質（たとえば、トランスフェクションされたＤＮＡによってコードされると考えられるタンパク質、または導入された試料分子の作用を介して発現または機能が変化するタンパク質）と結合する蛍光標識された抗体を用いて細胞に対する作用を測定する免疫蛍光といった、さまざまな公知の方法を用いて実施されうる。試料分子取り込みの結果および多くの実施形態では、導入された分子の発現（少なくとも転写）、または試料分子によって媒介される作用（たとえばｓｉＲＮＡの場合には干渉）を検出するためにさまざまな方法が使用できる。一般的な意味で、アッセイは試料分子が、試料分子を欠く同一細胞と比較して細胞の表現型に変化を与えることができるかどうかを判定する手段を提供する。そのような変化は、細胞形態の変化（膜ラフリング、有糸分裂速度、細胞死の速度、細胞死の機構、色素取り込みなど）といった細胞全体レベルで検出されうる。別の実施形態では、細胞の表現型の変化があれば、２、３例を挙げると、特定タンパク質（たとえば選択可能なまたは検出可能なマーカー）のレベル、またはｍＲＮＡまたは二次メッセンジャーのレベルの検出といった、より集中した方法によって検出される。細胞の表現型の変化はまた、レポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を分析すること、イムノアッセイ、色素（たとえばＤＡＰＩ、カルコフロール）での染色を用いて酵素を分析すること、電気的変化を分析すること、細胞形状の変化を特徴づけること、タンパク質立体配座の変化を試験すること、および細胞数を計数することによっても測定されうる。他の目的変化は、化学アッセイ、光学顕微鏡法、走査型電子顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、画像再構成顕微鏡法、スキャナ、オートラジオグラフィー、光散乱、光吸収、ＮＭＲ、ＰＥＴ、パッチクランプ、カロリメトリー、質量分析法、表面プラズモン共鳴法、時間分解蛍光法といった方法によって検出されうる。データは単一または複数の時点で回収でき、および適当なソフトウェアによって分析されうる。
【００５７】
したがって、試料分子デリバリーの結果は、さまざまな方法によって分析されうる。さらに、トランスフェクションされた細胞は、特に標準的なアレイ形式（上記参照）が用いられる場合は、直接さらに処理されうる。たとえば配送された試料分子が遺伝子発現を調節できる場合、標的遺伝子発現レベルはまた、オートラジオグラフィー、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲといった方法によって測定されうる。同定／処理方法は、配送された試料分子、その発現産物、それによって調節される標的、および／または試料分子のデリバリーの結果として生じる最終産物の性質に依存する。
【００５８】
試料分子を加えそれぞれ接着するのに用いることができる任意の適当な表面が、本発明の目的に使用されうる。試料分子の結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。たとえば、表面は、ガラス、プラスチック（たとえばポリテトラフルオロエチレン、ポリ二フッ化ビニリデン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン）、シリコン、金属、（たとえば金）、膜（たとえばニトロセルロース、メチルセルロース、ＰＴＦＥまたはセルロース）、生物材料および無機物（たとえばヒドロキシアパタイト、グラファイト）でありうる。好ましい実施形態によると、表面はスライド（ガラスまたはポリ−Ｌリジン被覆スライド）である。上記で外接する通り、透明または半透明材料を使用するのが特に好ましく、ここで少なくとも１つ、それぞれすべての試料スポットが光学的に透明または半透明である。適当な透明または半透明材料は、たとえばホウケイ酸または半透明金属である。
【００５９】
一実施形態によると、総散乱損失≦７％、好ましくは≦３％、特に好ましくは≦１％である、光散乱の低減された、超疎性表面を有する透明または半透明基材が用いられる。前記基材は好ましくは水に関して接触角が少なくとも１４０°好ましくは少なくとも１５０°および転がり角（ｒｏｌｌ−ｏｆｆ ａｎｇｌｅ）≦２０°、好ましくは≦１０である。それぞれの低減された光散乱表面は、たとえば、参照により本開示に含まれるＵＳ２００６／０１５９９３４、特にパラグラフ２４から２６に記載される。この文書はまた、それぞれ超疎性表面を作製するのに適したナノ構造化された表面を得るための適当なコーティングを記載する。たとえばジルコニウム、チタン、アルミニウム、およびタンタルといった金属の、酸化物、フッ化物、炭化物、窒化物、セレン化物製のコーティング。酸化ジルコニウム層といった酸化物が特に好ましい。前記層を適用するための材料および可能な工程についての詳細はまた、参照により本開示に含まれるＵＳ２００６／０１５９９３４、パラグラフ８９から１５０に記載される。
【００６０】
試料スポットエリア周囲の前記エリアの疎水性および／または超疎性を改善するために、基材に疎水性または疎油性撥化剤の追加のコーティングを提供することが好ましい。
【００６１】
疎水性または疎油性撥化剤は通常は、任意の分子量の表面活性化合物である。これらの化合物は、たとえば辞典『表面活性剤ヨーロッパ、ヨーロッパで得られる表面活性剤要覧』（"Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ Ｅｕｒｏｐａ，Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅ），ゴードン・Ｌ・ホリス（Ｇｏｒｄｏｎ Ｌ．Ｈｏｌｌｉｓ）編，英国化学会（Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ），１９９５に挙げられるもののような、好ましくは陽イオン性、陰イオン性、両性または非イオン性表面活性化合物である。
【００６２】
陰イオン性撥化剤の例を挙げると：アルキル硫酸塩、エーテル硫酸塩、エーテルカルボン酸塩、リン酸エステル、スルホスクシネート、スルホスクシネートアミド、パラフィンスルホナート、オレフィンスルホナート、サルコシナート、イソチオナート、タウレートおよびリグニン化合物である。
【００６３】
陽イオン性撥化剤の例を挙げると、：四級アルキルアンモニウム化合物およびイミダゾールである。
【００６４】
両性撥化剤の例は、ベタイン、グリシナート、プロピオナートおよびイミダゾールである。
【００６５】
非イオン性撥化剤は、たとえば：アルコキシエート、アルキルアミド、エステル、アミンオキサイドおよびアルキルポリグリコシドである。たとえば脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪酸、フェノール、アルキルフェノール、スチレンフェノール縮合物のようなアリールアルキルフェノール、カルボン酸アミドおよび樹脂酸といった、アルキル化に適した化合物とのアルキレンオキサイドの転換産物もまた可能である。
【００６６】
特に好ましいのは、水素原子の１から１００％、特に好ましくは６０から９５％がフッ素原子で置換された撥化剤である。例を挙げると、パーフルオロアルキル硫酸塩、パーフルオロアルキルスルホン酸塩、パーフルオロアルキルリン酸塩、パーフルオロアルキルホスフィン酸塩、パーフルオロアルコキシシラン、パーフルオロクロロシラン、パーフルオロアルコキシクロロシラン、パーフルオロチオールおよびパーフルオロカルボン酸である。
【００６７】
適当な撥化剤のさらなる詳細は、参照により本開示に含まれるＵＳ２００６／０１５９９３４、パラグラフ１０８から１１２に開示される。
【００６８】
また本発明で提供されるのは、試料スポットエリアが疎水性エリアで囲まれておりおよび前記試料スポットエリアが試料分子を含み、それによって前記試料分子が前記試料スポットエリアの不連続な位置に配置されるアレイ形式に配列されたいくつかの試料スポットエリアを含む基材を含む、試料分子を細胞へ導入するためのトランスフェクションアレイ基材である。
【００６９】
各トランスフェクションアレイの好ましい性質および使用は、上記のトランスフェクション法に関連して詳細にすでに概説した。そこにまた、トランスフェクションアレイ基材の異なるエリアに適する表面性質も詳細に記載され、およびしたがってここで繰り返されない。我々は、トランスフェクションアレイにもまた適用される上記の考察を参照する。上記で概説する通り、ｓｉＲＮＡは、好ましくはアレイ基材に適用される試料分子として用いられる。スクリーニング法を可能にするために、好ましくは少なくとも一部の前記試料スポットエリアは、異なる種類の試料分子を含む。光学分析を可能にするために、透明または半透明基材が好ましい。しかし、一部の実施形態については、試料スポットエリアを透明または半透明にすれば十分でありうる。
【００７０】
利用者による容易な取扱を可能にするために、マイクロアレイおよびその機能規格は、１００℃まで安定であり、滅菌可能であり、および凍結可能（少なくとも−２０℃）であることが好ましい。
【００７１】
本発明の詳細を、単に例として提示する下記の図面に概説する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】好ましい一実施形態による本発明に記載の提案されるマイクロアレイの断面の模式図．
【図２】疎水性および／または超疎性エリアを作製するのに適したナノ構造化ＺｒＯ2層の走査型電子顕微鏡像。θは約１５５°である（水、ＳＡＭパーフルオロデカントリエトキシシラン）。
【図３】一実施形態に記載の表面化学の詳細。
【図４】本発明の好ましい一実施形態に記載の製造工程のフローチャート。
【図５】ｓｉＲＮＡといった試料分子を含む試料滴が適用される、本発明に記載のアレイの設計の略図を示す。見られる通り、試料滴は超疎性表面上を濡らすことができるスポットによって閉じ込められている。
【図６】本発明の好ましい一実施形態に記載のアレイの寸法の設計略図。
【図７】本発明の別の好ましい一実施形態に記載のアレイの寸法の設計略図。
【図８ａ】図６および７にも示される通りの、本発明の好ましい一実施形態に記載の試料スポットでの表面化学を示す。
【図８ｂ】図６および７にも示される通りの、本発明の好ましい一実施形態に記載の試料スポット外の表面化学を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
図１に示すマイクロアレイの異なる層は下記の番号で示される：
（１）基材、好ましくはガラス
（２）ｎ−ＺｒＯ2層、約１００ｎｍ
（３）切断可能フッ化化合物の自己組織化単層、好ましくは約１ｎｍ
（４）固定化試料分子、好ましくはＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のスポット
【００７４】
図１の実施形態に記載の基材（１）は、個別のパートとして使用および処理される最終寸法の従来のフロートガラス基材である。材料選択は、基材の望まれる厚み、およびバックグラウンド蛍光といった光学特性に応じて通常作製される。すべてのさまざまなガラス材料が同一の方法で以降の処理に使用されうる。ガラス材料は、トランスフェクション結果の光学的検査を可能にするため、光学特性および特に透明性のために、本発明に記載の好ましい基材材料である。
【００７５】
基材（１）の上に、ナノ構造化酸化ジルコニウム層（２）が適用される。この例でｎ−ＺｒＯ2層は、ボロフロートガラス基材（１）上に５９０Ｋにて反応性電子ビーム蒸着によって成膜された。同様の表面トポグラフィーがＤＣスパッタ成膜によって基材温度３００Ｋにて得られ、水接触角最大１５５°を与える。前記層（２）は、適当な単層（３）によって化学的に疎油化される際、超疎性を示すトポグラフィーを与える。
【００７６】
反応性電子ビーム蒸着によって、または反応性ＤＣスパッタ成膜によって、成膜されたｎ−ＺｒＯ2層（２）は、静止水接触角最大１５５°を与える。ＺｒＯ2は、特に長期曝露中の、酸性および塩基性環境の両方における安定性のため、ナノ構造化層に好ましい材料と見なされる。対照的に、一部の実施形態に適するにもかかわらず、スパッタ成膜Ａｌ2Ｏ3は光学品質において、両性のために、蛍光ＤＮＡアレイに十分でないという試験結果が得られている。
【００７７】
第２の層として、自己組織化フッ化物単層（３）がナノ構造化層（２）に適用される。それは２つの機能を有する。表面化学に密に充填したフッ化鎖を提供し、ｎ−ＺｒＯ2表面トポグラフィーと組み合わせて超疎水性表面特性を与える。さらに、単層のフッ化鎖はＵＶ切断可能であるため、空間的および化学的の両方で、定義された方法で表面化学を変化させることができ、必要なまたは望ましい機能（たとえば試料分子の結合、トランスフェクション細胞の接着）を有する試料スポットエリアを与える。
【００７８】
非スポットエリアＡの単層の構造を図３に示す。ここで、置換トリクロロシランといったシランが吸着されており、ポリシロキサン単層を与える。これらの化学吸着された部分は、試料スポットおよび非スポットエリアの両方に存在する示されている一実施形態に記載される。
【００７９】
酸化物表面上の高品質シロキサン単層は、再現可能な方法で作製するのが困難と一般的に考えられている。これは主に吸着溶液中の非常に少量の水の不完全な調節のためであると示唆されている（Ｂ．Ｍ．シルバーマン（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ），Ｋ．Ａ．ウィークハウス（Ｗｉｅｇｈａｕｓ），Ｊ．シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）；『重要なチタン合金上におけるシロキサンとホスホン酸塩の単層の性質の比較』（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｉｌｏｘａｎｅ ｖｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｎ Ａ Ｋｅｙ Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ａｌｌｏｙ）； Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２１，２２５ （２００５））。ここで工程安定性の大きな改善が、規定の水圧の存在下で二酸化ケイ素を基材として用いて、トリクロロシランおよびジメチルシランの共蒸着によって得られている（Ａ．ウルマン（Ｕｌｍａｎ）；『自己組織化単層の形成および構造』（Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）；Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６，１５３３ （１９９６））。
【００８０】
しかし、有機シリコン誘導体をホスホン酸塩で置き換えることが、その優れた加水分解安定性（Ｈ．シフト（Ｓｃｈｉｆｔ），Ｓ．ザクサー（Ｓａｘｅｒ），Ａ．パーク（Ｐａｒｋ），Ｃ．パデステ（Ｐａｄｅｓｔｅ），Ｕ．ピーレス（Ｐｉｅｌｅｓ），Ｊ．ゴブレヒト（Ｇｏｂｒｅｃｈｔ）；『ナノインプリントスタンプのためのシランの調節共蒸着』（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌａｎｅｓ ｆｏｒ ｎａｎｏｉｍｐｒｉｎｔ ｓｔａｍｐｓ）；Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，１７１ （２００５）），および有望なより良好な工程安定性のために有利でありうる。
【００８１】
疎水性または超疎性エリアの脱濡れ性質は、自己組織化フッ化単層（３）から得られる分子の粗さによってさらに最適化されうる。たとえば１．８Åしか高さ差のない、無作為に混合されたパーフルオロカーボン鎖は、すでに極めて粗い表面を示す場合、表面張力の低い液体について表面上の撥性を顕著に低下させる。非常に高い空間的頻度を有するそのような「追加の」粗さは、ナノスケールのトポグラフィー上に組み立てることができ、それによって脱濡れ性質を高める。
【００８２】
そのような最適化は、パーフルオロアルキル鎖（図３ＡでＲｆで示す）を用いて実施されうる。ここで、異なる長さの鎖が分子スケールで混合される際に脱濡れを顕著に増大させうる。それらは、異なる長さのパーフルオロ酸塩化物として導入されうる。必要な中間体はさまざまな鎖長（Ｃ４−Ｃ１８）で市販されている。
【００８３】
試料スポットエリア（４）は、紫外光によって開始されるフッ化単層の調節された化学修飾によって、示される通り形成されうる。フォトリソグラフィー・マイクロパターン化のための異なる化学構造を用いるさまざまなそのような化合物が公知であり、たとえば（Ｊ．Ｄ．ジェヤプラカシュ（Ｊｅｙａｐｒａｋａｓｈ），Ｓ．サムエル（Ｓａｍｕｅｌ），Ｊ．リューエ（Ｒｕｅｈｅ）；『マイクロ構造化フッ化表面の作製のための容易な光化学表面修飾』（Ａ Ｆａｃｉｌｅ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒｔ ｈｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）； Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０，１００８０ （２００４）；Ｋ．リー（Ｌｅｅ），Ｆ．パン（Ｐａｎ），Ｇ．Ｔ．キャロル（Ｃａｒｏｌｌ），Ｎ，Ｊ．ツロ（Ｔｕｒｒｏ），Ｊ．Ｔ．コバースタイン（Ｋｏｂｅｒｓｔｅｉｎ）；『表面の直接光化学修飾および化学マイクロパターン化のためのフォトリソグラフィー法』（Ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）；Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０，１８１２（２００４））を参照のこと。記載の例では、パーフルオロエステルがこの目的のために提案される。イソプレン−スチレン・ブロック共重合体にパーフルオロ側鎖として存在するそのようなエステル部は、約３４０℃にて選択的に熱によって切断でき、熱的に可能であるペリ環状レトロ・エン反応によって、対応するオレフィンを与えることが示されている（Ａ．ベーカー（Ｂｏｅｋｅｒ），Ｋ．ライス（Ｒｅｉｈｓ），Ｊ．ワング（Ｗａｎｇ），Ｒ．ステッドラー（Ｓｔａｄｌｅｒ），Ｃ．オベル（Ｏｂｅｒ）；『選択的に熱的切断可能なフッ化側鎖ブロック共重合体：表面化学および表面特性』（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｔｈｅｒｍａｌｌｙ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ Ｓｉｄｅ Ｃｈａｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ： Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）； Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３３，１３１０ （２０００））。カルボン酸およびアルファン酸部分といった他の構造が、同様の温度で切断可能である（Ａ．ベーカー（Ｂｏｅｋｅｒ），Ｔ．ヘルウェク（Ｈｅｒｗｅｇ），Ｋ．ライス（Ｒｅｉｈｓ）；『フッ化側鎖の熱切断によるポリマー表面の選択的変化』（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｂｙ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ Ｓｉｄｅ Ｃｈａｉｎｓ）；Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３５，４９２９（２００２））。この熱処理はＵＶ照射によって同様に開始されうる。
【００８４】
試料スポットエリアの限定的化学官能化に使用されうる選択的分解の結果として、オレフィンＢが生じる（図３参照）。
【００８５】
シロキサン単層は、ＣＨ3（ＣＨ2）n鎖から成るアルキルシロキサン自己組織化単層が真空で約７４０Ｋまで鎖長（ｎ＝４、８、１８）にかかわらず安定であるため、そのような条件下で安定である可能性が高い（Ｇ．Ｊ．クルト（Ｋｌｕｔｈ），Ｍ．Ｍ．スン（Ｓｕｎｇ），Ｒ．マボージアン（Ｍａｂｏｕｄｉａｎ）；『アルキルシロキサン自己組織化単層の酸化 Ｓｉ（１００） 表面上での熱挙動』（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ａｌｋｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｏｘｉｄｉｚｅｄ Ｓｉ（１００）Ｓｕｒｆａｃｅ）；Ｌａｎｇｍｕｉｒ １３，３７７５（１９９７））。
【００８６】
オレフィンＢ（図３参照）をエポキシド化して、共有結合によってだけでなく、たとえばｓｉＲＮＡ含有溶液といった試料分子をスポット上で乾燥することによってまたは代替的に試料分子をポリマーまたはマトリクス化合物内に埋め込むことによって非共有結合によっても、ＲＮＡ Ｃの固定化に用いられる表面を与えることができる。試料分子を表面上に固定するためのこれらの工程についてはさまざまな手順が存在する。
【００８７】
用途の特異的な必要事項に応じて、試料スポットエリアは、細胞結合および増殖を高めるように修飾されうる。これは、たとえば、Ｚｒアルコキシド複合体を用いた（マレイミド）−アルコキシカルボキシレート中間体を介した細胞誘引性ペプチド誘導体ＲＧＤＣの結合を可能にするための、スポットの表面に曝露された少量のホスホン酸によって達成されうる。そのようなＲＧＤＣで修飾された表面は、骨芽細胞結合および増殖に有効であることが示されている（上記参照）。
【００８８】
マイクロアレイ設計について概説される製造工程の概観を図４に示す。
【００８９】
図６は好ましい一実施形態に記載のアレイの寸法の模式図を示す。アレイ面積は１２７．７６ｍｍｘ８５．４８ｍｍである。アレイの厚さは約１．１ｍｍ（標準）であるが、しかし近い距離を必要とする浸漬対物レンズに用いる場合は０．１４５ｍｍである。スポットの総数は２００ｘ１３６＝２７，２００スポットである。各行および列の最外側のスポットは好ましくは試料に使用されない。試料スポットの数は１９２ｘ１２８＝２４，５７６スポットである。スポット直径は０．３００ｍｍであり；スポット間距離（中心から中心）は０．５６２５ｍｍである。スポットの密度は、２７，２００スポットが１１２．２３８ｍｍｘ７６．２３８ｍｍ＝３１８スポット／ｃｍ2上にある。試料体積は液体適用の方法に依存する。通常は、使用される体積は７ｎＬ未満である（半球）。典型的な体積は約４ｎＬ（高さ約１００μｍ）であり、スポット直径は約３００μｍである。
【００９０】
図７は別の好ましい一実施形態に記載のアレイの寸法の模式図を示す。アレイ面積は１２７．７６ｍｍｘ８５．４８ｍｍである。アレイの厚さは約１．１ｍｍ（標準）であるが、しかし近い距離を必要とする浸漬対物レンズに用いる場合は０．１４５ｍｍである。スポットの総数は１００ｘ６８＝６，８００スポットである。各行および列の最外側の２スポットは、エッジ効果を回避するために、試料には使用されない。試料スポットの数は９６ｘ６４＝６，１４４スポットである。スポット直径は０．６００ｍｍであり；スポット間距離（中心から中心）は１．１２５ｍｍである。スポットの密度は、６，８００スポットが１１１．９７５ｍｍｘ７５．９７５ｍｍ＝８０スポット／ｃｍ2上にある。試料体積は液体添加の方法に依存する。通常は、使用される体積は５５ｎＬ未満である（半球）。典型的な体積は約３５ｎＬ（高さ約２００μｍ）であり、スポット直径は約６００μｍである。
【００９１】
図８ａは試料スポットでの表面化学を示す。最も好ましい構造は、３−アミノプロピル−トリエトキシルシラン（１）または３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン（２）から成り、（２）が非常に好ましい。単層はＣＶＤ処理によって１００℃〜１５０℃にて調製される。
【００９２】
図８ｂは試料スポット外の表面化学を示す。構造は１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデシルジメチルクロロシラン（ｎ＝７）の化学吸着由来の単層から成ることができる。好ましくは、構造は、ｎ＝７およびｎ＝１９の等モル組成物の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロアルキルジメチルクロロシランの二元混合単層から成る。単層はＣＶＤ処理によって１００℃〜１５０℃にて調製されうる。
【００９３】
図面および好ましい実施形態の上記の説明によって示される通り、アレイは次の機能規格を有する。試料分子は試料スポットに固定化され、好ましくは試料スポットに化学的に結合している。細胞が試料スポットに適用および接着される。試料スポットの周囲の疎水性または超疎性エリアのために、試料スポットの外側のエリアで核酸および細胞培養培地成分の非特異的結合が最小限起こる。技術的規格に関して、アレイの試料スポットは、透過光顕微鏡法での使用のために設計され、すなわち、スポットは光学的に透明または半透明であり、および従来の顕微鏡スライドと同様の光学特性を提供する。試料プレートは好ましくは、透過光学顕微鏡および蛍光リーダーといった機器に適合している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）疎水性エリアに囲まれた少なくとも１つの試料スポットエリアを含む基剤を用いること；
（ｂ）試料分子が前記少なくとも１つの試料スポットエリアに適用され、それによって前記試料分子を前記試料スポットエリアの不連続な位置に置くこと；
（ｃ）トランスフェクションすべき細胞を、試料分子の前記細胞への進入に適する条件下で基材に適用すること；
（ｄ）それによって少なくとも一部の前記試料分子が前記細胞に導入されること
：を含む、試料分子を細胞へ導入するトランスフェクション法。
【請求項２】
前記試料スポットエリアが試料分子によって濡らされうる、請求項１に記載のトランスフェクション法。
【請求項３】
前記試料スポットエリアが親水性および／または親油性を有する、請求項２に記載のトランスフェクション法。
【請求項４】
前記疎水性エリアが疎水性および／または疎油性、好ましくは超疎性である、請求項１から３のうち１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項５】
前記超疎性エリアが水に対して接触角が少なくとも１４０°、好ましくは少なくとも１５０°を示す、請求項４に記載のトランスフェクション法。
【請求項６】
前記超疎性エリアがナノ構造化されている、請求項４または５に記載のトランスフェクション法。
【請求項７】
前記超疎性エリアが、各フーリエ成分の位相周波数ｆおよび積分範囲ｌｏｇ（ｆ1／μｍ-1）＝−３およびｌｏｇ（ｆ2／μｍ-1）＝３間で計算される積分Ｓ（ｌｏｇ（ｆ））＝ａ（ｆ）・ｆで表されるその振幅ａ（ｆ）が少なくとも０．３である表面構造を有し、および疎水性または特に疎油性材料製であるかまたは耐久性疎水性および／または特に耐久性疎油性材料でコーティングされている、請求項４から６のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項８】
前記試料分子が前記試料スポットエリアと共有結合によってまたは非共有結合によって結合している、請求項１から７のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項９】
前記試料分子がマトリクスに埋め込まれている、請求項１から８のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１０】
トランスフェクション試薬が基材に適用されるかまたはトランスフェクションすべき細胞と混合される、請求項１から９のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１１】
少なくとも前記試料スポットエリアが光学的に透明または半透明である、請求項１から１０のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの試料スポットエリアの表面特性が、トランスフェクション細胞の試料スポットエリアへの接着を促進するように修飾されている、請求項１から１１のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１３】
前記基材が、アレイ形式に配列されているいくつかの試料スポットエリアを含む、請求項１から１２のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１４】
少なくとも２つの異なる種類の試料分子が、少なくとも１つの試料スポットエリアに適用される、請求項１から１３のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１５】
前記試料分子が核酸、ペプチド、低分子から成る群から選択され、および好ましくはＲＮＡ分子、より好ましくはＲＮＡｉ媒介化合物またはｓｉＲＮＡ分子である、請求項１から１４のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１６】
試料スポットエリアが疎水性エリアで囲まれ、および試料スポットエリアがトランスフェクションアッセイに有用な試料分子を含み、それによって該試料分子が試料スポットエリアの不連続な位置に配置される、アレイ形式に配置されているいくつかの試料スポットエリアを含む基材を含む、試料分子を細胞へ導入するためのトランスフェクションアレイ。
【請求項１７】
ｓｉＲＮＡが試料分子として用いられる、請求項１６に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項１８】
試料スポットエリアが親水性および／または親油性を有する、請求項１６または１７に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項１９】
試料スポットエリアの表面化学が、３−アミノプロピル−トリエトキシシラン、３メルカプトプロピル−トリメトキシシラン、メタクリルオキシプロピル−トリエトキシシラン、ヘキサデシルトリメトキシシラン、２−[メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル]トリメトキシシラン、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルトリエトキシ−シランおよび３−（フェニルアミノ）プロピルトリメチルジエトキシシランから成る群から選択される化合物を含み、好ましくは該化合物が３−アミノプロピル−トリエトキシシラン、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシランおよび３−（フェニルアミノ）プロピルトリメチルジエトキシシランから選択される、請求項１６から１８のうちの１項に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２０】
前記疎水性エリアが疎水性および／または疎油性，好ましくは超疎性である、請求項１６から１９のうちの１項に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２１】
前記超疎性エリアがナノ構造化されており、および水に関して接触角が少なくとも１４０°、好ましくは少なくとも１５０°を示す、請求項２０に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２２】
前記超疎性エリアが、各フーリエ成分の位相周波数ｆおよび積分範囲ｌｏｇ（ｆ1／μｍ-1）＝−３およびｌｏｇ（ｆ2／μｍ-1）＝３間で計算される積分Ｓ（ｌｏｇ（ｆ））＝ａ（ｆ）・ｆで表されるその振幅ａ（ｆ）が少なくとも０．３である表面構造を有し、および疎水性または特に疎油性材料製であるかまたは耐久性疎水性および／または特に耐久性疎油性材料でコーティングされている、請求項２０または２１に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２３】
少なくとも前記試料スポットエリアが光学的に透明または半透明である、請求項１６から２２のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２４】
少なくとも一部の試料スポットエリアが細胞接着促進剤を含む、請求項１６から２２のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２５】
請求項１から１５に記載のトランスフェクション法における、請求項１６から２４のうちの１項に記載のトランスフェクションアレイの使用。
【請求項２６】
ゲノムスクリーニングアッセイを実施するための、請求項２５に記載のトランスフェクションアレイの使用。
【請求項１】
（ａ）疎水性エリアに囲まれた少なくとも１つの試料スポットエリアを含む基剤を用いること；
（ｂ）試料分子が前記少なくとも１つの試料スポットエリアに適用され、それによって前記試料分子を前記試料スポットエリアの不連続な位置に置くこと；
（ｃ）トランスフェクションすべき細胞を、試料分子の前記細胞への進入に適する条件下で基材に適用すること；
（ｄ）それによって少なくとも一部の前記試料分子が前記細胞に導入されること
：を含む、試料分子を細胞へ導入するトランスフェクション法。
【請求項２】
前記試料スポットエリアが試料分子によって濡らされうる、請求項１に記載のトランスフェクション法。
【請求項３】
前記試料スポットエリアが親水性および／または親油性を有する、請求項２に記載のトランスフェクション法。
【請求項４】
前記疎水性エリアが疎水性および／または疎油性、好ましくは超疎性である、請求項１から３のうち１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項５】
前記超疎性エリアが水に対して接触角が少なくとも１４０°、好ましくは少なくとも１５０°を示す、請求項４に記載のトランスフェクション法。
【請求項６】
前記超疎性エリアがナノ構造化されている、請求項４または５に記載のトランスフェクション法。
【請求項７】
前記超疎性エリアが、各フーリエ成分の位相周波数ｆおよび積分範囲ｌｏｇ（ｆ1／μｍ-1）＝−３およびｌｏｇ（ｆ2／μｍ-1）＝３間で計算される積分Ｓ（ｌｏｇ（ｆ））＝ａ（ｆ）・ｆで表されるその振幅ａ（ｆ）が少なくとも０．３である表面構造を有し、および疎水性または特に疎油性材料製であるかまたは耐久性疎水性および／または特に耐久性疎油性材料でコーティングされている、請求項４から６のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項８】
前記試料分子が前記試料スポットエリアと共有結合によってまたは非共有結合によって結合している、請求項１から７のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項９】
前記試料分子がマトリクスに埋め込まれている、請求項１から８のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１０】
トランスフェクション試薬が基材に適用されるかまたはトランスフェクションすべき細胞と混合される、請求項１から９のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１１】
少なくとも前記試料スポットエリアが光学的に透明または半透明である、請求項１から１０のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの試料スポットエリアの表面特性が、トランスフェクション細胞の試料スポットエリアへの接着を促進するように修飾されている、請求項１から１１のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１３】
前記基材が、アレイ形式に配列されているいくつかの試料スポットエリアを含む、請求項１から１２のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１４】
少なくとも２つの異なる種類の試料分子が、少なくとも１つの試料スポットエリアに適用される、請求項１から１３のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１５】
前記試料分子が核酸、ペプチド、低分子から成る群から選択され、および好ましくはＲＮＡ分子、より好ましくはＲＮＡｉ媒介化合物またはｓｉＲＮＡ分子である、請求項１から１４のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクション法。
【請求項１６】
試料スポットエリアが疎水性エリアで囲まれ、および試料スポットエリアがトランスフェクションアッセイに有用な試料分子を含み、それによって該試料分子が試料スポットエリアの不連続な位置に配置される、アレイ形式に配置されているいくつかの試料スポットエリアを含む基材を含む、試料分子を細胞へ導入するためのトランスフェクションアレイ。
【請求項１７】
ｓｉＲＮＡが試料分子として用いられる、請求項１６に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項１８】
試料スポットエリアが親水性および／または親油性を有する、請求項１６または１７に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項１９】
試料スポットエリアの表面化学が、３−アミノプロピル−トリエトキシシラン、３メルカプトプロピル−トリメトキシシラン、メタクリルオキシプロピル−トリエトキシシラン、ヘキサデシルトリメトキシシラン、２−[メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル]トリメトキシシラン、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルトリエトキシ−シランおよび３−（フェニルアミノ）プロピルトリメチルジエトキシシランから成る群から選択される化合物を含み、好ましくは該化合物が３−アミノプロピル−トリエトキシシラン、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシランおよび３−（フェニルアミノ）プロピルトリメチルジエトキシシランから選択される、請求項１６から１８のうちの１項に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２０】
前記疎水性エリアが疎水性および／または疎油性，好ましくは超疎性である、請求項１６から１９のうちの１項に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２１】
前記超疎性エリアがナノ構造化されており、および水に関して接触角が少なくとも１４０°、好ましくは少なくとも１５０°を示す、請求項２０に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２２】
前記超疎性エリアが、各フーリエ成分の位相周波数ｆおよび積分範囲ｌｏｇ（ｆ1／μｍ-1）＝−３およびｌｏｇ（ｆ2／μｍ-1）＝３間で計算される積分Ｓ（ｌｏｇ（ｆ））＝ａ（ｆ）・ｆで表されるその振幅ａ（ｆ）が少なくとも０．３である表面構造を有し、および疎水性または特に疎油性材料製であるかまたは耐久性疎水性および／または特に耐久性疎油性材料でコーティングされている、請求項２０または２１に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２３】
少なくとも前記試料スポットエリアが光学的に透明または半透明である、請求項１６から２２のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２４】
少なくとも一部の試料スポットエリアが細胞接着促進剤を含む、請求項１６から２２のうち少なくとも１項に記載のトランスフェクションアレイ。
【請求項２５】
請求項１から１５に記載のトランスフェクション法における、請求項１６から２４のうちの１項に記載のトランスフェクションアレイの使用。
【請求項２６】
ゲノムスクリーニングアッセイを実施するための、請求項２５に記載のトランスフェクションアレイの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５１２１５５（Ｐ２０１０−５１２１５５Ａ）
【公表日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４０６６１（Ｐ２００９−５４０６６１）
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０１０９６１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７１４３０
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
２．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０１０９６１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７１４３０
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
２．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
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