バイオセンサー、及び、分子量分画方法
【課題】 簡易な構成で液体の分子量分画を行うことの可能なバイオセンサー、及び、分子量分画方法を提供する。
【解決手段】 金属膜５０の表面には、分子量分画層７０が形成されている。分子量分画層７０は、誘電体ブロック４２の長手方向に濃度勾配を有するゲルで構成されており、供給口４５Ａ側の濃度が高く、排出口４５Ｂ側の濃度が低い、６段階の濃度のゲルで分画領域Ｅ１〜Ｅ６が構成されている。供給口４５Ａ側では分子量の小さい物質のみを分子量分画層７０内へ進入させることができ、排出口４５Ｂ側へ向かうにつれて徐々に分子量の大きい物質を分子量分画層７０内へ進入させることができる。
【解決手段】 金属膜５０の表面には、分子量分画層７０が形成されている。分子量分画層７０は、誘電体ブロック４２の長手方向に濃度勾配を有するゲルで構成されており、供給口４５Ａ側の濃度が高く、排出口４５Ｂ側の濃度が低い、６段階の濃度のゲルで分画領域Ｅ１〜Ｅ６が構成されている。供給口４５Ａ側では分子量の小さい物質のみを分子量分画層７０内へ進入させることができ、排出口４５Ｂ側へ向かうにつれて徐々に分子量の大きい物質を分子量分画層７０内へ進入させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料に含まれる分子を分画すると共に、分画された分子を検出するバイオセンサー、及び、このバイオセンサーでの分子量分画方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性物質の分析として、異なる分子量の物質の分子量分画を行って、対象物質の特定を行う方法として、電気泳動法が知られている（特許文献１参照）。この電気泳動法では、濃度勾配を持つゲルの両端に電極を配置して電圧を印加することにより、供給した試料の分子量分画が行われる。
【特許文献１】特開平５−２０３６２１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、一般的な電気泳動法では、ゲルの両端に電極を配置する必要があり、装置構成が複雑になってしまう。
【０００４】
本発明は上記事実を考慮してなされたものであり、簡易な構成で液体の分子量分画を行うことの可能なバイオセンサー、及び、分子量分画方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、請求項１に記載のバイオセンサーは、液体試料の供給される供給口、及び前記液体試料の排出される排出口の形成された液体流路と、前記液体流路に表面が露出され、前記液体試料の進行方向に異なる部分で異なる分子量の分子を進入させる分子量分画層と、前記分子量分画層に進入した分子を検出する検出手段と、を含んで構成されている。
【０００６】
本発明のバイオセンサーでは、液体流路内に予め緩衝液を供給しておき、緩衝液で満たされている液体流路へ供給口から液体試料を供給することにより、液体試料中の分子は、排出口側へと拡散される。また、液体試料中の分子は、液体流路に露出された分子量分画層の表面から分子量分画層内へ進入し拡散される。したがって、供給口側で分子量分画層内へ進入する分子量の分子は、排出口側へ拡散されにくく、供給口側で分子量分画層内へ進入できない分子量の分子は、液体流路の排出口側へ拡散されやすくなる。
【０００７】
このように、液体試料中の分子の、供給口側から排出口側への拡散、及び、分子量分画層の表面から分子量分画層内への拡散を利用することにより、電極を用いることなく簡易な構成で分子量分画を行うことができる。
【０００８】
なお、本発明のバイオセンサーは、請求項２に記載のように、前記検出手段が、非電気化学的検出であること、を特徴とすることができる。
【０００９】
このように、非電気化学的検出を用いることにより、測定時に検出されるものと検出部との間に相互作用（電子移動など）が生じないため、検出物の回収などの操作を容易にすることができる。また、測定対象の荷電などをより現実に近いままで測定することができる。
【００１０】
請求項３記載のバイオセンサーは、前記分子量分画層が、前記液体試料の進行方向に濃度勾配を持つゲルで形成されていること、を特徴とする。
【００１１】
このように、分子量分画層を濃度勾配を持つゲルにより形成することで、異なる分子量の分子を分画することができる。
【００１２】
なお、前記ゲルの濃度勾配は、請求項４に記載のように、前記供給口側の濃度を前記排出口側の濃度よりも高くすることにより、供給口側のゲル内へ分子量の小さい分子を進入させることができ、分子量の大きい分子を液体流路内の排出口側へ拡散させることができる。
【００１３】
また、前記分子量分画層は、請求項５に記載のように、アガロース誘電体、または、アクリルアミド誘電体、を含んで構成することができる。
【００１４】
請求項６に記載のバイオセンサーは、液体クロマトグラフィと接続されていること、を特徴とする。
【００１５】
このように、液体クロマトグラフィと接続することにより、液体クロマトグラフィによって可能な液体試料の他の属性による分画と、分子量による分子量分画とを組み合わせて、実施することができる。
【００１６】
請求項７記載のバイオセンサーは、前記分子量分画層が金属膜上に構成され、前記検出手段は、前記金属膜の前記分子量分画層と逆側の面へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰を利用して、前記分子量分画層へ進入した分子を検出すること、を特徴とする。
【００１７】
このように、金属膜表面での全反射減衰を利用した検出として、表面プラズモン共鳴、漏洩モード検出を用いることができる。
【００１８】
なお、前記金属膜は、請求項８に記載のように、誘電体ブロックの光反射面に形成され、前記検出は、前記誘電体ブロックを介して前記金属膜へ光ビームを入射させると共に入射させた光ビームを反射させて行なわれること、を特徴とすることができる。
【００１９】
上記構成によれば、金属膜が誘電体ブロック上に直接形成されるので、金属膜と誘電体ブロックとが別体とされている場合と比較して、光学的なロスを少なくすることができる。また、金属膜と誘電体ブロックとが別体とされている場合には、誘電体ブロックと金属膜の形成された板との間に屈折率マッチングオイル等を注入する必要があるが、上記構成であれば屈折率マッチングオイル等を注入する必要はなく、回収装置の構成を簡単にすることができると共に、取り扱いも簡単になり、利便性が高まる。
【００２０】
請求項９に記載の分子量分画方法は、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載されたバイオセンサーを用いて液体試料の分子量分画を行う分子量分画方法であって、予め所定の緩衝液の供給されている前記液体流路へ、前記液体流路の容積よりも少ない量の液体試料を前記供給口から供給する液体試料供給ステップと、前記液体試料の供給後、前記検出手段で前記分子量分画層の前記進行方向の異なる複数箇所において前記進入した分子を検出する検出ステップと、を備えたものである。
【００２１】
本発明の分子量分画方法では、まず、前記液体流路の容積よりも少ない量の液体試料を前記供給口から供給する。これにより、予め供給されている緩衝液が排出口側へ押し出されるが、供給される液体試料は液体流路の容積よりも少ない量なので、液体流路内に緩衝液は残る。したがって、供給された液体試料の分子は、分子量分画層内へ進入すると共に、緩衝液側、すなわち、排出口側へも拡散される。
【００２２】
ところで、分子量分画層は、異なる分子量の分子を分画可能な層であるので、供給口側で分子量分画層内へ拡散される分子量の分子は、排出口側へ拡散されにくく、供給口側で分子量分画層内へ進入できない分子量の分子は、液体流路の排出口側へ拡散されやすくなる。したがって、供給口側の分子量分画層と排出口側の分子量分画層とで、異なる分子量の分子が進入し、分子量分画を行うことができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は上記構成としたので、流路部材に非特異的に吸着したアナライトが回収されてしまうことがなく、不要な物質が回収物質に混入するのを防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００２５】
本発明のバイオセンサーは、金属膜の表面に発生する表面プラズモン共鳴を利用して、液体中の物質が測定面に存在するかどうかを検出する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。
【００２６】
図１に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部1２、搬送部1４、容器載置台１６、液体吸排部２０、押さえ部２６、光学測定部５４、及び、制御部６０を備えている。
【００２７】
トレイ保持部1２は、載置台1２Ａ、及び、ベルト1２Ｂを含んで構成されている。載置台1２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、トレイＴが２枚、位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が収納されている。センサースティック４０は、試料を流すための流路を備えたチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げる、押上機構１２Ｄが配置されている。
【００２８】
センサースティック４０は、図２及び図３に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、保持部材４６、接着部材４８、及び、蒸発防止部材４９、で構成されている。
【００２９】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａ、及び、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａと一体的に形成された被保持部４２Ｂを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、図４にも示すように金属膜５０が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５０との界面で全反射された光ビームが出射される。
【００３０】
金属膜５０の表面には、図４に示すように、分子量分画層７０が形成されている。分子量分画層７０は、誘電体ブロック４２の長手方向に濃度勾配を有するゲルで構成されている。ゲルとしては、アクリルアミド、アガロース、酢酸セルロース、デンプン、デキストランなどを用いることができる。濃度勾配は、流路部材４４の後述する供給口４５Ａ側の濃度が高く、排出口４５Ｂ側の濃度が低くなっている。これにより、供給口４５Ａ側では分子量の小さい物質のみを分子量分画層７０内へ進入させることができ、排出口４５Ｂ側へ向かうにつれて徐々に分子量の大きい物質を分子量分画層７０内へ進入させることができる。
【００３１】
なお、前述のゲルの濃度は、１％〜１５％（質量％）の範囲であることが好ましい。
【００３２】
分子量分画層７０は、次のようにして形成することができる。まず、図５（Ａ）に示すように、誘電体ブロック４２の金属膜５０部分の外側にスペーサー板７２を配置し、その上に蓋部材７４を積層して、金属膜５０と蓋部材７４との間に空間を構成する。そして、図５（Ｂ）に示すように、誘電体ブロック４２を鉛直方向に向けて、前記空間へ濃度の異なるゲルを順次充填する。所定時間おいてゲルを固め、スペーサー板７２及び蓋部材７４を除去することで、分子量分画層７０を形成することができる。
【００３３】
なお、架橋剤としては、「Electrophoresis」1989,2,220-228に記載されているが、アクリルアミドゲルでは、N,N'-メチレンビスアクリルアミドに代表される２価の重合架橋剤、水酸基含有のゲルであれば、ポリエポキシ化合物などが挙げられる。
【００３４】
本実施形態では、６段階の濃度のゲルを順に充填して、異なる分子量の分子を進入させることの可能な６つの領域（以下各領域を「分画領域Ｅ１〜Ｅ６」という、図６参照）で分子量分画層７０が形成されている。分画領域Ｅ１〜Ｅ６には、各々光ビームＬ１〜Ｌ６が入射される。
【００３５】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材５２と係合される係合凸部４２Ｃが、下側の端辺に沿ってプリズム部４２Ａの上面と垂直な仮想面の延長上に構成される垂直凸部４２Ｄが形成されている。また、誘電体ブロック４２の下面の長手方向に沿った中央部には、係合溝４２Ｅが形成されている。
【００３６】
流路部材４４は、誘電体ブロック４２よりもわずかに狭幅の直方体状とされ、図４に示すように、誘電体ブロック４２の分子量分画層７０上に配置されている。各々の流路部材４４の下面には流路溝４４Ａが形成されており、上面に形成された供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと連通されて、分子量分画層７０との間に、液体流路４５が構成される。流路部材４４の側壁には、保持部材４６の内側の図示しない凹部に圧入されて保持部材４６との密着性を確保するための凸部４４Ｂが形成されている。
【００３７】
保持部材４６は、長尺とされ、上面板４６Ａ及び２枚の側面板４６Ｂで構成されている。側面板４６Ｂには、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４６Ｃが形成されている。保持部材４６は、流路部材４４を間に挟んで係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。これにより、流路部材４４は、誘電体ブロック４２に取り付けられる。上面板４６Ａには、流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと対向する位置に、流路部材４４に向けて狭くなるテーパー状のピペット挿入孔４６Ｄが形成されている。また、隣り合うピペット挿入孔４６Ｄとピペット挿入孔４６Ｄとの間には、位置決め用のボス４６Ｅが形成されている。
【００３８】
保持部材４６の上面には、蒸発防止部材４９が接着部材４８を介して接着されている。接着部材４８のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置にはピペット挿入用の孔４８Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４８Ｅが形成されている。また、蒸発防止部材４９のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置には十字状の切り込みであるスリット４９Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４９Ｅが形成されている。ボス４６Ｅを孔４８Ｅ及び４９Ｅに挿通させて、蒸発防止部材４９を保持部材５２の上面に接着することにより、蒸発防止部材４９のスリット４９Ｄと流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂとが対向するように構成される。ピペットチップＣＰの非挿入時には、スリット４９Ｄ部分が供給口４５Ａを覆い、液体流路４５に供給されている液体の蒸発が防止される。
【００３９】
図１に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ、及び、スティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。また、測定部５６には、測定時にセンサースティック４０を押さえる押さえ部材５８が備えられている。押さえ部材５８は、図示しない駆動機構によりＺ方向に移動可能とされ、測定部５６に配置されたセンサースティック４０を上側から押圧する。
【００４０】
容器載置台１６には、試料プレート１７、廃液回収容器１８、バッファー液容器１９が載置されている。試料プレート１７には、各種の試料がストックされている。廃液回収容器１８は、回収容器１８Ａ〜１８Ｈで構成されており、回収容器１８Ａ〜１８Ｈには、後述するピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。バッファー液容器１９は、複数のストック容器１９Ａ〜１９ＥＨ構成されており、回収容器と同様にピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【００４１】
液体吸排部２０は、上部ガイドレール１４Ａ、及び、ガイドレール１６Ｂよりも上方で、矢印Ｙ方向に架け渡された横断レール２２、及び、ヘッド２４を含んで構成されている。横断レール２２は、図示しない駆動機構により、矢印Ｘ方向移動可能とされている。また、ヘッド２４は、横断レール２２に取り付けられ、矢印Ｙ方向に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。ヘッド２４は、図７に示すように、２本のピペット部２４Ａ、２４Ｂを備えている。ピペット部２４Ａ、２４Ｂには、先端部にピペットチップＣＰが取り付けられ、個々にＺ方向の長さを調整可能とされている。ピペットチップＣＰは、図示しないピペットチップストッカーに多数ストックされており、必要に応じて交換可能とされている。
【００４２】
なお、本実施形態においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップＣＰにより行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【００４３】
光学測定部５４は、図８に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅ、を含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、６本の光ビームＬ１〜Ｌ６となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の分画領域Ｅ１〜Ｅ６に各々入射される。分画領域Ｅ１〜Ｅ６において、光ビームＬ１〜Ｌ６は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１〜Ｌ６は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１〜Ｌ６も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１〜Ｌ６は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、分画領域Ｅ１〜Ｅ６の全反射減衰角のデータ（以下「全反射減衰角データ」という）が求められる。この全反射減衰角データが制御部６０へ出力される。
【００４４】
制御部６０は、バイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図８に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ、及び、バイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０は、図９示すように、バスＢを介して互いに接続される、ＣＰＵ６０Ａ、ＲＯＭ６０Ｂ、ＲＡＭ６０Ｃ、メモリ６０Ｄ、及び、インターフェースＩ／Ｆ６０Ｅ、を有し、各種の情報を表示する表示部６２、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【００４５】
メモリ６０Ｄには、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データが記録されている。
【００４６】
次に、バイオセンサー１０での、分子量分画の手順について説明する。
【００４７】
バイオセンサー１０の載置台１２Ａには、液体流路４５にバッファー液Ｃが充填されたセンサースティック４０入りのトレイがセットされている。また、試料プレート１７には試料ＴＡが、バッファー液容器１９にはバッファー液が、各々セットされている。
【００４８】
まず、押上機構１２Ｄにより、１のセンサースティック４０がスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げられ、スティック保持部材１４Ｃにより保持される。そして、スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０を保持したまま下部ガイドレール１４Ｂに沿って移動して、センサースティック４０を測定部５６へ搬送する。測定部５６へ搬送されたセンサースティック４０は、所定の測定位置に位置決めされて押さえ部材５８により、上部から押圧され固定される。
【００４９】
入力部６４から測定開始の指示が入力されると、制御部６０では、図１０に示す測定処理が実行される。測定処理では、液体流路４５にバッファー液が充填されている状態での全反射データを補正用全反射データとして取得し、その後、試料ＴＡを供給して全反射データをプロファイルする。
【００５０】
まず、ステップＳ１２で、光源５４Ａへ光ビームＬの出射指示信号を出力する。これにより、光源５４Ａから光ビームＬが出射される。出射された光ビームＬは、第１光学系５４Ｂで６本の光ビームＬ１〜Ｌ６となり、液体流路４５の分画領域Ｅ１〜Ｅ６へ各々入射される。また、ステップＳ１４で、受光部５４Ｄ及び信号処理部５４Ｅへ、作動指示信号を出力する。これにより、分画領域Ｅ１〜Ｅ２で全反射され第２光学系５４Ｃを経た光ビームＬ１〜Ｌ６は、受光部５４Ｄで受光され、受光された光は、領域毎に光電変換されて光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、光検出信号に所定の処理が加えられ、補正用全反射減衰角データが生成され、制御部６０へ出力される。
【００５１】
制御部６０では、ステップＳ１６で、所定時間経過したかどうかを判断し、所定時間の経過後、ステップＳ１８で、入力された補正用全反射減衰角データをメモリ６０Ｄへ記憶する。
【００５２】
次に、ステップＳ２０で、試料ＴＡの供給指示信号を出力する。これにより、ヘッド２４で、液体流路４５へ試料ＴＡが供給される。試料ＴＡの供給は、具体的には以下のように行なわれる。まず、ヘッド２４が試料ＴＡのセットされた試料プレート１７の上部に移動し、ピペット部２４Ａが下側に長く、ピペット部２４Ｂが短くなるように段差がつけられる（図７（Ｃ）参照）。そして、ヘッド２４を下降させて、ピペット部２４Ａに取り付けられているピペットチップＣＰＡの先端のみを試料ＴＡが貯留されたセルへ挿入し、ピペットチップＣＰＡ内に試料ＴＡを吸引する。次に、ヘッド２４を上昇させて測定部５６の上部に移動させ、ピペット部２４Ａとピペット部２４Ｂとが同じ高さになるように長さを調整する（図７（Ａ）参照）。そして、ヘッド２４を下降させて、ピペット部２４Ａ側のピペットチップＣＰＡの先端を液体流路４５の供給口４５Ａへ挿入し、ピペット部２４Ｂ側のピペットチップＣＰＢの先端を液体流路４５の排出口４５Ｂへ挿入する（図１４（Ａ）参照）。そして、ピペットチップＣＰＡから液体流路４５へ試料ＴＡを注入する。
【００５３】
このとき、液体流路４５の供給口４５Ａから分画領域Ｅ１に至る間の容積と同程度の量の試料ＴＡを注入する（図１１（Ａ）、図１２（Ａ）、図１３（Ａ）参照）。これは、試料ＴＡを分画領域Ｅ１から分画領域Ｅ６側へと、液体流路４５内で徐々に拡散させるためである。
【００５４】
なお、試料ＴＡの供給により排出口４５Ｂから押し出されるバッファー液は、ピペットチップＣＰＢで吸引する（図１４(Ｂ)参照）。
【００５５】
次に、ステップＳ２２で、分画領域Ｅ１〜Ｅ６からの光検出信号により得られる全反射減衰角データを取得し、ステップＳ２４で、全反射減衰角データを補正用全反射減衰角データで補正して、試料ＴＡ中の物質Ｙが分画領域Ｅ１〜Ｅ６への進入状態を示す進入状態データを生成する。進入状態データは、物質Ｙが分子量分画層７０へ進入することにより、分子量分画層７０の屈折率の変化に対応する値として求めることができる。
【００５６】
そして、ステップＳ２６で、進入状態データを記憶し、ステップ２８で、進入状態データを表示部６２へ出力する。これにより、所定時間毎の進入状態データがメモリ６０Ｄへ記憶されると共に、表示部６２へ表示される。
【００５７】
次に、ステップＳ３０で、試料ＴＡから分子量分画に要する所定時間が経過したかどうかを判断し、この所定時間経過していれば、本処理を終了する。所定時間が経過していなければ、ステップＳ２２へ戻る。ここでの所要時間は、試料ＴＡが分画領域Ｅ６まで充分に拡散し、さらに、分画領域Ｅ１〜Ｅ６内への拡散も充分なされるために必要な時間である。
【００５８】
上記測定処理により、各分画領域Ｅ１〜Ｅ６への試料ＴＡに含まれる物質の進入状態をプロファイルすることができる。
【００５９】
例えば、試料ＴＡに含まれている物質Ｙ１が、分画領域Ｅ１へ進入可能な低分子量の物質である場合には、図１１（Ａ）に示すように、液体流路４５の供給口４５Ａから分画領域Ｅ１に至る間に試料ＴＡを供給すると、図１１（Ｂ）に示すように、物質Ｙ１は分画領域Ｅ１中へ進入する。また、物質Ｙ１は、徐々に液体流路４５中で拡散されて、分画領域Ｅ２、Ｅ３側へ移動し、分画領域Ｅ２、Ｅ３へも進入する。これにより、液体流路４５中の物質Ｙ１は、分画領域Ｅ６に近くなるにつれて少なくなる。したがって、分画領域Ｅ１〜Ｅ６の各々の進入状態データは、図１１（Ｃ）に示すように、分画領域Ｅ１への進入度が最も高く、分画領域Ｅ６で進入度が低いものが得られる。なお、進入データとしては、各分画領域への進入度が最も特徴的に認められる所定時間経過後のものを採用する。
【００６０】
また、試料ＴＡに含まれている物質Ｙ２が、分画領域Ｅ１、Ｅ２へは進入できず、分画領域Ｅ３〜Ｅ６へは進入可能な中分子量の物質である場合には、図１２（Ａ）に示すように、液体流路４５の供給口４５Ａから分画領域Ｅ１に至る間に試料ＴＡを供給すると、図１２（Ｂ）に示すように、物質Ｙ２は分画領域Ｅ１、Ｅ２へは進入せず、液体流路４５中を分画領域Ｅ１側から分画領域Ｅ３側へ拡散され、分画領域Ｅ３中へ進入する。さらに、物質Ｙ２は、液体流路４５中で拡散されて、分画領域Ｅ４、Ｅ５側へ移動し、分画領域Ｅ４、Ｅ５へも進入する。これにより、液体流路４５中の物質Ｙ２は、分画領域Ｅ６に近くなるにつれて少なくなる。したがって、分画領域Ｅ１〜Ｅ６の各々の進入状態データは、図１２（Ｃ）に示すように、分画領域Ｅ１、Ｅ２への進入度は低く、分画領域Ｅ３への進入度が最も高く、分画領域Ｅ４、Ｅ５と徐々に進入度が低くなるものが得られる。
【００６１】
また、試料ＴＡに含まれている物質Ｙ３が、分画領域Ｅ１〜Ｅ４へは進入できず、分画領域Ｅ５、Ｅ６へは進入可能な高分子量の物質である場合には、図１３（Ａ）に示すように、液体流路４５の供給口４５Ａから分画領域Ｅ１に至る間に試料ＴＡを供給すると、図１３（Ｂ）に示すように、物質Ｙ３は分画領域Ｅ１〜Ｅ４へは進入せず、液体流路４５中を分画領域Ｅ１側から分画領域Ｅ５側へ拡散され、分画領域Ｅ５中へ進入する。さらに、物質Ｙ３は、液体流路４５中で拡散されて、分画領域Ｅ６側へ移動し、分画領域Ｅ６へも進入する。したがって、分画領域Ｅ１〜Ｅ６の各々の進入状態データは、図１３（Ｃ）に示すように、分画領域Ｅ１〜Ｅ４への進入度は低く、分画領域Ｅ５、Ｅ６への進入度が高いものが得られる。
【００６２】
以上説明したように、本実施形態のバイオセンサーによれば、液体流路４５内での物質Ｙの拡散、及び、分子量分画層７０内への物質Ｙの拡散を利用するので、電圧印加のための電極等が必要なく、簡易な構成で分子量分画を行うことができる、これにより、試料ＴＡ中の物質の分子量分布を解析することができる。
【００６３】
なお、本実施形態での分子量分画のみを行ったが、液体クロマトグラフィにより試料ＴＡの他の属性、例えば親水性により分離した後、分子量分画を行うことにより、図１５に示すように、二次元的な情報を得ることができる。
【００６４】
また、本実施形態では、金属膜５０が、プリズムとして機能する誘電体ブロック４２上に形成されているセンサースティック４０を用いたが、図１６に示すように、金属膜８０Ａが透明な平板８２の一面に形成され、この金属膜８０Ａ上に分子量分画層７０が積層されているセンサーチップ８４を用いてもよい。この場合には、光学プリズムＰを平版８２の金属膜８０Ａが形成されていない面と密着させ、この光学プリズムＰを介して金属膜８０Ａへ光ビームＬを入射させると共に入射させた光ビームＬを反射させる。この構成によれば、金属膜８０Ａの形成される平板８２を、光学プリズムＰと別体にして、センサーチップ８４を簡易な構成とすることができる。
【００６５】
一方、本実施形態のように、金属膜５０が誘電体ブロック４２上に形成された構成とすることにより、光学的なロスを少なくすることができる。また、金属膜と誘電体ブロックとが別体とされている場合には、プリズムと金属膜の形成された板との間に屈折率マッチングオイル等を注入する必要があるが、本実施形態のように、金属膜５０が誘電体ブロック４２上に形成された構成であれば、屈折率マッチングオイル等を注入する必要はなく、バイオセンサーの構成を簡単にすることができると共に、取り扱いも簡単になり、利便性が高まる。
【００６６】
なお、本実施形態では、バイオセンサーとして、表面プラズモンセンサーを一例として説明したが、バイオセンサーとしては、表面プラズモンセンサーに限定されるものではない。その他の例えば、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した光学的測定技術など、あらゆるバイオセンサーを用いてのアナライトの回収に本発明は適用することができる。
【００６７】
また、全反射減衰を利用する他のバイオセンサーとしては、漏洩モード検出器をあげることができる。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を透過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において、導波モードが励起されると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。導波モードが励起される入射角は、表面プラズモン共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本実施形態のバイオセンサーの全体斜視図である。
【図２】本実施形態のセンサースティックの斜視図である。
【図３】本実施形態のセンサースティックの分解斜視図である。
【図４】本実施形態のセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図５】本実施形態の分子量分画層の製造方法の説明図である。
【図６】本実施形態のセンサースティックの分画領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図７】本実施形態の液体供給部を構成するピペット部の側面図である。
【図８】本実施形態のバイオセンサーの光学測定部付近の概略図である。
【図９】本実施形態の制御部とその周辺の概略ブロック図である。
【図１０】本実施形態の測定処理のフローチャートである。
【図１１】本実施形態の低分子物質の（Ａ）（Ｂ）は分子量分画層への物質の進入状態を示す図であり、（Ｃ）は各分画層の進入データの一例を示すグラフである。
【図１２】本実施形態の中子物質の（Ａ）（Ｂ）は分子量分画層への物質の進入状態を示す図であり、（Ｃ）は各分画層の進入データの一例を示すグラフである。
【図１３】本実施形態の高子物質の（Ａ）（Ｂ）は分子量分画層への物質の進入状態を示す図であり、（Ｃ）は各分画層の進入データの一例を示すグラフである。
【図１４】本実施形態の液体流路への試料供給動作を説明する図である。
【図１５】本実施形態での分子量分画と液体クロマトグラフィによる親水性特性を組み合わせた二次元マップ上に測定結果をプロットした例である。
【図１６】本発明が実施される他の形態のセンサーチップの概略断面図である。
【符号の説明】
【００６９】
１０ バイオセンサー
２０ 液体吸排部
４０ センサースティック
４２ 誘電体ブロック
４４ 流路部材
４５ 液体流路
４５Ａ 供給口
４５Ｂ 排出口
５０ 金属膜
５４ 光学測定部
７０ 分子量分画層
８４ センサーチップ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料に含まれる分子を分画すると共に、分画された分子を検出するバイオセンサー、及び、このバイオセンサーでの分子量分画方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性物質の分析として、異なる分子量の物質の分子量分画を行って、対象物質の特定を行う方法として、電気泳動法が知られている（特許文献１参照）。この電気泳動法では、濃度勾配を持つゲルの両端に電極を配置して電圧を印加することにより、供給した試料の分子量分画が行われる。
【特許文献１】特開平５−２０３６２１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、一般的な電気泳動法では、ゲルの両端に電極を配置する必要があり、装置構成が複雑になってしまう。
【０００４】
本発明は上記事実を考慮してなされたものであり、簡易な構成で液体の分子量分画を行うことの可能なバイオセンサー、及び、分子量分画方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、請求項１に記載のバイオセンサーは、液体試料の供給される供給口、及び前記液体試料の排出される排出口の形成された液体流路と、前記液体流路に表面が露出され、前記液体試料の進行方向に異なる部分で異なる分子量の分子を進入させる分子量分画層と、前記分子量分画層に進入した分子を検出する検出手段と、を含んで構成されている。
【０００６】
本発明のバイオセンサーでは、液体流路内に予め緩衝液を供給しておき、緩衝液で満たされている液体流路へ供給口から液体試料を供給することにより、液体試料中の分子は、排出口側へと拡散される。また、液体試料中の分子は、液体流路に露出された分子量分画層の表面から分子量分画層内へ進入し拡散される。したがって、供給口側で分子量分画層内へ進入する分子量の分子は、排出口側へ拡散されにくく、供給口側で分子量分画層内へ進入できない分子量の分子は、液体流路の排出口側へ拡散されやすくなる。
【０００７】
このように、液体試料中の分子の、供給口側から排出口側への拡散、及び、分子量分画層の表面から分子量分画層内への拡散を利用することにより、電極を用いることなく簡易な構成で分子量分画を行うことができる。
【０００８】
なお、本発明のバイオセンサーは、請求項２に記載のように、前記検出手段が、非電気化学的検出であること、を特徴とすることができる。
【０００９】
このように、非電気化学的検出を用いることにより、測定時に検出されるものと検出部との間に相互作用（電子移動など）が生じないため、検出物の回収などの操作を容易にすることができる。また、測定対象の荷電などをより現実に近いままで測定することができる。
【００１０】
請求項３記載のバイオセンサーは、前記分子量分画層が、前記液体試料の進行方向に濃度勾配を持つゲルで形成されていること、を特徴とする。
【００１１】
このように、分子量分画層を濃度勾配を持つゲルにより形成することで、異なる分子量の分子を分画することができる。
【００１２】
なお、前記ゲルの濃度勾配は、請求項４に記載のように、前記供給口側の濃度を前記排出口側の濃度よりも高くすることにより、供給口側のゲル内へ分子量の小さい分子を進入させることができ、分子量の大きい分子を液体流路内の排出口側へ拡散させることができる。
【００１３】
また、前記分子量分画層は、請求項５に記載のように、アガロース誘電体、または、アクリルアミド誘電体、を含んで構成することができる。
【００１４】
請求項６に記載のバイオセンサーは、液体クロマトグラフィと接続されていること、を特徴とする。
【００１５】
このように、液体クロマトグラフィと接続することにより、液体クロマトグラフィによって可能な液体試料の他の属性による分画と、分子量による分子量分画とを組み合わせて、実施することができる。
【００１６】
請求項７記載のバイオセンサーは、前記分子量分画層が金属膜上に構成され、前記検出手段は、前記金属膜の前記分子量分画層と逆側の面へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰を利用して、前記分子量分画層へ進入した分子を検出すること、を特徴とする。
【００１７】
このように、金属膜表面での全反射減衰を利用した検出として、表面プラズモン共鳴、漏洩モード検出を用いることができる。
【００１８】
なお、前記金属膜は、請求項８に記載のように、誘電体ブロックの光反射面に形成され、前記検出は、前記誘電体ブロックを介して前記金属膜へ光ビームを入射させると共に入射させた光ビームを反射させて行なわれること、を特徴とすることができる。
【００１９】
上記構成によれば、金属膜が誘電体ブロック上に直接形成されるので、金属膜と誘電体ブロックとが別体とされている場合と比較して、光学的なロスを少なくすることができる。また、金属膜と誘電体ブロックとが別体とされている場合には、誘電体ブロックと金属膜の形成された板との間に屈折率マッチングオイル等を注入する必要があるが、上記構成であれば屈折率マッチングオイル等を注入する必要はなく、回収装置の構成を簡単にすることができると共に、取り扱いも簡単になり、利便性が高まる。
【００２０】
請求項９に記載の分子量分画方法は、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載されたバイオセンサーを用いて液体試料の分子量分画を行う分子量分画方法であって、予め所定の緩衝液の供給されている前記液体流路へ、前記液体流路の容積よりも少ない量の液体試料を前記供給口から供給する液体試料供給ステップと、前記液体試料の供給後、前記検出手段で前記分子量分画層の前記進行方向の異なる複数箇所において前記進入した分子を検出する検出ステップと、を備えたものである。
【００２１】
本発明の分子量分画方法では、まず、前記液体流路の容積よりも少ない量の液体試料を前記供給口から供給する。これにより、予め供給されている緩衝液が排出口側へ押し出されるが、供給される液体試料は液体流路の容積よりも少ない量なので、液体流路内に緩衝液は残る。したがって、供給された液体試料の分子は、分子量分画層内へ進入すると共に、緩衝液側、すなわち、排出口側へも拡散される。
【００２２】
ところで、分子量分画層は、異なる分子量の分子を分画可能な層であるので、供給口側で分子量分画層内へ拡散される分子量の分子は、排出口側へ拡散されにくく、供給口側で分子量分画層内へ進入できない分子量の分子は、液体流路の排出口側へ拡散されやすくなる。したがって、供給口側の分子量分画層と排出口側の分子量分画層とで、異なる分子量の分子が進入し、分子量分画を行うことができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は上記構成としたので、流路部材に非特異的に吸着したアナライトが回収されてしまうことがなく、不要な物質が回収物質に混入するのを防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００２５】
本発明のバイオセンサーは、金属膜の表面に発生する表面プラズモン共鳴を利用して、液体中の物質が測定面に存在するかどうかを検出する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。
【００２６】
図１に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部1２、搬送部1４、容器載置台１６、液体吸排部２０、押さえ部２６、光学測定部５４、及び、制御部６０を備えている。
【００２７】
トレイ保持部1２は、載置台1２Ａ、及び、ベルト1２Ｂを含んで構成されている。載置台1２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、トレイＴが２枚、位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が収納されている。センサースティック４０は、試料を流すための流路を備えたチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げる、押上機構１２Ｄが配置されている。
【００２８】
センサースティック４０は、図２及び図３に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、保持部材４６、接着部材４８、及び、蒸発防止部材４９、で構成されている。
【００２９】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａ、及び、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａと一体的に形成された被保持部４２Ｂを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、図４にも示すように金属膜５０が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５０との界面で全反射された光ビームが出射される。
【００３０】
金属膜５０の表面には、図４に示すように、分子量分画層７０が形成されている。分子量分画層７０は、誘電体ブロック４２の長手方向に濃度勾配を有するゲルで構成されている。ゲルとしては、アクリルアミド、アガロース、酢酸セルロース、デンプン、デキストランなどを用いることができる。濃度勾配は、流路部材４４の後述する供給口４５Ａ側の濃度が高く、排出口４５Ｂ側の濃度が低くなっている。これにより、供給口４５Ａ側では分子量の小さい物質のみを分子量分画層７０内へ進入させることができ、排出口４５Ｂ側へ向かうにつれて徐々に分子量の大きい物質を分子量分画層７０内へ進入させることができる。
【００３１】
なお、前述のゲルの濃度は、１％〜１５％（質量％）の範囲であることが好ましい。
【００３２】
分子量分画層７０は、次のようにして形成することができる。まず、図５（Ａ）に示すように、誘電体ブロック４２の金属膜５０部分の外側にスペーサー板７２を配置し、その上に蓋部材７４を積層して、金属膜５０と蓋部材７４との間に空間を構成する。そして、図５（Ｂ）に示すように、誘電体ブロック４２を鉛直方向に向けて、前記空間へ濃度の異なるゲルを順次充填する。所定時間おいてゲルを固め、スペーサー板７２及び蓋部材７４を除去することで、分子量分画層７０を形成することができる。
【００３３】
なお、架橋剤としては、「Electrophoresis」1989,2,220-228に記載されているが、アクリルアミドゲルでは、N,N'-メチレンビスアクリルアミドに代表される２価の重合架橋剤、水酸基含有のゲルであれば、ポリエポキシ化合物などが挙げられる。
【００３４】
本実施形態では、６段階の濃度のゲルを順に充填して、異なる分子量の分子を進入させることの可能な６つの領域（以下各領域を「分画領域Ｅ１〜Ｅ６」という、図６参照）で分子量分画層７０が形成されている。分画領域Ｅ１〜Ｅ６には、各々光ビームＬ１〜Ｌ６が入射される。
【００３５】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材５２と係合される係合凸部４２Ｃが、下側の端辺に沿ってプリズム部４２Ａの上面と垂直な仮想面の延長上に構成される垂直凸部４２Ｄが形成されている。また、誘電体ブロック４２の下面の長手方向に沿った中央部には、係合溝４２Ｅが形成されている。
【００３６】
流路部材４４は、誘電体ブロック４２よりもわずかに狭幅の直方体状とされ、図４に示すように、誘電体ブロック４２の分子量分画層７０上に配置されている。各々の流路部材４４の下面には流路溝４４Ａが形成されており、上面に形成された供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと連通されて、分子量分画層７０との間に、液体流路４５が構成される。流路部材４４の側壁には、保持部材４６の内側の図示しない凹部に圧入されて保持部材４６との密着性を確保するための凸部４４Ｂが形成されている。
【００３７】
保持部材４６は、長尺とされ、上面板４６Ａ及び２枚の側面板４６Ｂで構成されている。側面板４６Ｂには、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４６Ｃが形成されている。保持部材４６は、流路部材４４を間に挟んで係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。これにより、流路部材４４は、誘電体ブロック４２に取り付けられる。上面板４６Ａには、流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと対向する位置に、流路部材４４に向けて狭くなるテーパー状のピペット挿入孔４６Ｄが形成されている。また、隣り合うピペット挿入孔４６Ｄとピペット挿入孔４６Ｄとの間には、位置決め用のボス４６Ｅが形成されている。
【００３８】
保持部材４６の上面には、蒸発防止部材４９が接着部材４８を介して接着されている。接着部材４８のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置にはピペット挿入用の孔４８Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４８Ｅが形成されている。また、蒸発防止部材４９のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置には十字状の切り込みであるスリット４９Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４９Ｅが形成されている。ボス４６Ｅを孔４８Ｅ及び４９Ｅに挿通させて、蒸発防止部材４９を保持部材５２の上面に接着することにより、蒸発防止部材４９のスリット４９Ｄと流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂとが対向するように構成される。ピペットチップＣＰの非挿入時には、スリット４９Ｄ部分が供給口４５Ａを覆い、液体流路４５に供給されている液体の蒸発が防止される。
【００３９】
図１に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ、及び、スティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。また、測定部５６には、測定時にセンサースティック４０を押さえる押さえ部材５８が備えられている。押さえ部材５８は、図示しない駆動機構によりＺ方向に移動可能とされ、測定部５６に配置されたセンサースティック４０を上側から押圧する。
【００４０】
容器載置台１６には、試料プレート１７、廃液回収容器１８、バッファー液容器１９が載置されている。試料プレート１７には、各種の試料がストックされている。廃液回収容器１８は、回収容器１８Ａ〜１８Ｈで構成されており、回収容器１８Ａ〜１８Ｈには、後述するピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。バッファー液容器１９は、複数のストック容器１９Ａ〜１９ＥＨ構成されており、回収容器と同様にピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【００４１】
液体吸排部２０は、上部ガイドレール１４Ａ、及び、ガイドレール１６Ｂよりも上方で、矢印Ｙ方向に架け渡された横断レール２２、及び、ヘッド２４を含んで構成されている。横断レール２２は、図示しない駆動機構により、矢印Ｘ方向移動可能とされている。また、ヘッド２４は、横断レール２２に取り付けられ、矢印Ｙ方向に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。ヘッド２４は、図７に示すように、２本のピペット部２４Ａ、２４Ｂを備えている。ピペット部２４Ａ、２４Ｂには、先端部にピペットチップＣＰが取り付けられ、個々にＺ方向の長さを調整可能とされている。ピペットチップＣＰは、図示しないピペットチップストッカーに多数ストックされており、必要に応じて交換可能とされている。
【００４２】
なお、本実施形態においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップＣＰにより行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【００４３】
光学測定部５４は、図８に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅ、を含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、６本の光ビームＬ１〜Ｌ６となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の分画領域Ｅ１〜Ｅ６に各々入射される。分画領域Ｅ１〜Ｅ６において、光ビームＬ１〜Ｌ６は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１〜Ｌ６は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１〜Ｌ６も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１〜Ｌ６は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、分画領域Ｅ１〜Ｅ６の全反射減衰角のデータ（以下「全反射減衰角データ」という）が求められる。この全反射減衰角データが制御部６０へ出力される。
【００４４】
制御部６０は、バイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図８に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ、及び、バイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０は、図９示すように、バスＢを介して互いに接続される、ＣＰＵ６０Ａ、ＲＯＭ６０Ｂ、ＲＡＭ６０Ｃ、メモリ６０Ｄ、及び、インターフェースＩ／Ｆ６０Ｅ、を有し、各種の情報を表示する表示部６２、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【００４５】
メモリ６０Ｄには、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データが記録されている。
【００４６】
次に、バイオセンサー１０での、分子量分画の手順について説明する。
【００４７】
バイオセンサー１０の載置台１２Ａには、液体流路４５にバッファー液Ｃが充填されたセンサースティック４０入りのトレイがセットされている。また、試料プレート１７には試料ＴＡが、バッファー液容器１９にはバッファー液が、各々セットされている。
【００４８】
まず、押上機構１２Ｄにより、１のセンサースティック４０がスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げられ、スティック保持部材１４Ｃにより保持される。そして、スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０を保持したまま下部ガイドレール１４Ｂに沿って移動して、センサースティック４０を測定部５６へ搬送する。測定部５６へ搬送されたセンサースティック４０は、所定の測定位置に位置決めされて押さえ部材５８により、上部から押圧され固定される。
【００４９】
入力部６４から測定開始の指示が入力されると、制御部６０では、図１０に示す測定処理が実行される。測定処理では、液体流路４５にバッファー液が充填されている状態での全反射データを補正用全反射データとして取得し、その後、試料ＴＡを供給して全反射データをプロファイルする。
【００５０】
まず、ステップＳ１２で、光源５４Ａへ光ビームＬの出射指示信号を出力する。これにより、光源５４Ａから光ビームＬが出射される。出射された光ビームＬは、第１光学系５４Ｂで６本の光ビームＬ１〜Ｌ６となり、液体流路４５の分画領域Ｅ１〜Ｅ６へ各々入射される。また、ステップＳ１４で、受光部５４Ｄ及び信号処理部５４Ｅへ、作動指示信号を出力する。これにより、分画領域Ｅ１〜Ｅ２で全反射され第２光学系５４Ｃを経た光ビームＬ１〜Ｌ６は、受光部５４Ｄで受光され、受光された光は、領域毎に光電変換されて光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、光検出信号に所定の処理が加えられ、補正用全反射減衰角データが生成され、制御部６０へ出力される。
【００５１】
制御部６０では、ステップＳ１６で、所定時間経過したかどうかを判断し、所定時間の経過後、ステップＳ１８で、入力された補正用全反射減衰角データをメモリ６０Ｄへ記憶する。
【００５２】
次に、ステップＳ２０で、試料ＴＡの供給指示信号を出力する。これにより、ヘッド２４で、液体流路４５へ試料ＴＡが供給される。試料ＴＡの供給は、具体的には以下のように行なわれる。まず、ヘッド２４が試料ＴＡのセットされた試料プレート１７の上部に移動し、ピペット部２４Ａが下側に長く、ピペット部２４Ｂが短くなるように段差がつけられる（図７（Ｃ）参照）。そして、ヘッド２４を下降させて、ピペット部２４Ａに取り付けられているピペットチップＣＰＡの先端のみを試料ＴＡが貯留されたセルへ挿入し、ピペットチップＣＰＡ内に試料ＴＡを吸引する。次に、ヘッド２４を上昇させて測定部５６の上部に移動させ、ピペット部２４Ａとピペット部２４Ｂとが同じ高さになるように長さを調整する（図７（Ａ）参照）。そして、ヘッド２４を下降させて、ピペット部２４Ａ側のピペットチップＣＰＡの先端を液体流路４５の供給口４５Ａへ挿入し、ピペット部２４Ｂ側のピペットチップＣＰＢの先端を液体流路４５の排出口４５Ｂへ挿入する（図１４（Ａ）参照）。そして、ピペットチップＣＰＡから液体流路４５へ試料ＴＡを注入する。
【００５３】
このとき、液体流路４５の供給口４５Ａから分画領域Ｅ１に至る間の容積と同程度の量の試料ＴＡを注入する（図１１（Ａ）、図１２（Ａ）、図１３（Ａ）参照）。これは、試料ＴＡを分画領域Ｅ１から分画領域Ｅ６側へと、液体流路４５内で徐々に拡散させるためである。
【００５４】
なお、試料ＴＡの供給により排出口４５Ｂから押し出されるバッファー液は、ピペットチップＣＰＢで吸引する（図１４(Ｂ)参照）。
【００５５】
次に、ステップＳ２２で、分画領域Ｅ１〜Ｅ６からの光検出信号により得られる全反射減衰角データを取得し、ステップＳ２４で、全反射減衰角データを補正用全反射減衰角データで補正して、試料ＴＡ中の物質Ｙが分画領域Ｅ１〜Ｅ６への進入状態を示す進入状態データを生成する。進入状態データは、物質Ｙが分子量分画層７０へ進入することにより、分子量分画層７０の屈折率の変化に対応する値として求めることができる。
【００５６】
そして、ステップＳ２６で、進入状態データを記憶し、ステップ２８で、進入状態データを表示部６２へ出力する。これにより、所定時間毎の進入状態データがメモリ６０Ｄへ記憶されると共に、表示部６２へ表示される。
【００５７】
次に、ステップＳ３０で、試料ＴＡから分子量分画に要する所定時間が経過したかどうかを判断し、この所定時間経過していれば、本処理を終了する。所定時間が経過していなければ、ステップＳ２２へ戻る。ここでの所要時間は、試料ＴＡが分画領域Ｅ６まで充分に拡散し、さらに、分画領域Ｅ１〜Ｅ６内への拡散も充分なされるために必要な時間である。
【００５８】
上記測定処理により、各分画領域Ｅ１〜Ｅ６への試料ＴＡに含まれる物質の進入状態をプロファイルすることができる。
【００５９】
例えば、試料ＴＡに含まれている物質Ｙ１が、分画領域Ｅ１へ進入可能な低分子量の物質である場合には、図１１（Ａ）に示すように、液体流路４５の供給口４５Ａから分画領域Ｅ１に至る間に試料ＴＡを供給すると、図１１（Ｂ）に示すように、物質Ｙ１は分画領域Ｅ１中へ進入する。また、物質Ｙ１は、徐々に液体流路４５中で拡散されて、分画領域Ｅ２、Ｅ３側へ移動し、分画領域Ｅ２、Ｅ３へも進入する。これにより、液体流路４５中の物質Ｙ１は、分画領域Ｅ６に近くなるにつれて少なくなる。したがって、分画領域Ｅ１〜Ｅ６の各々の進入状態データは、図１１（Ｃ）に示すように、分画領域Ｅ１への進入度が最も高く、分画領域Ｅ６で進入度が低いものが得られる。なお、進入データとしては、各分画領域への進入度が最も特徴的に認められる所定時間経過後のものを採用する。
【００６０】
また、試料ＴＡに含まれている物質Ｙ２が、分画領域Ｅ１、Ｅ２へは進入できず、分画領域Ｅ３〜Ｅ６へは進入可能な中分子量の物質である場合には、図１２（Ａ）に示すように、液体流路４５の供給口４５Ａから分画領域Ｅ１に至る間に試料ＴＡを供給すると、図１２（Ｂ）に示すように、物質Ｙ２は分画領域Ｅ１、Ｅ２へは進入せず、液体流路４５中を分画領域Ｅ１側から分画領域Ｅ３側へ拡散され、分画領域Ｅ３中へ進入する。さらに、物質Ｙ２は、液体流路４５中で拡散されて、分画領域Ｅ４、Ｅ５側へ移動し、分画領域Ｅ４、Ｅ５へも進入する。これにより、液体流路４５中の物質Ｙ２は、分画領域Ｅ６に近くなるにつれて少なくなる。したがって、分画領域Ｅ１〜Ｅ６の各々の進入状態データは、図１２（Ｃ）に示すように、分画領域Ｅ１、Ｅ２への進入度は低く、分画領域Ｅ３への進入度が最も高く、分画領域Ｅ４、Ｅ５と徐々に進入度が低くなるものが得られる。
【００６１】
また、試料ＴＡに含まれている物質Ｙ３が、分画領域Ｅ１〜Ｅ４へは進入できず、分画領域Ｅ５、Ｅ６へは進入可能な高分子量の物質である場合には、図１３（Ａ）に示すように、液体流路４５の供給口４５Ａから分画領域Ｅ１に至る間に試料ＴＡを供給すると、図１３（Ｂ）に示すように、物質Ｙ３は分画領域Ｅ１〜Ｅ４へは進入せず、液体流路４５中を分画領域Ｅ１側から分画領域Ｅ５側へ拡散され、分画領域Ｅ５中へ進入する。さらに、物質Ｙ３は、液体流路４５中で拡散されて、分画領域Ｅ６側へ移動し、分画領域Ｅ６へも進入する。したがって、分画領域Ｅ１〜Ｅ６の各々の進入状態データは、図１３（Ｃ）に示すように、分画領域Ｅ１〜Ｅ４への進入度は低く、分画領域Ｅ５、Ｅ６への進入度が高いものが得られる。
【００６２】
以上説明したように、本実施形態のバイオセンサーによれば、液体流路４５内での物質Ｙの拡散、及び、分子量分画層７０内への物質Ｙの拡散を利用するので、電圧印加のための電極等が必要なく、簡易な構成で分子量分画を行うことができる、これにより、試料ＴＡ中の物質の分子量分布を解析することができる。
【００６３】
なお、本実施形態での分子量分画のみを行ったが、液体クロマトグラフィにより試料ＴＡの他の属性、例えば親水性により分離した後、分子量分画を行うことにより、図１５に示すように、二次元的な情報を得ることができる。
【００６４】
また、本実施形態では、金属膜５０が、プリズムとして機能する誘電体ブロック４２上に形成されているセンサースティック４０を用いたが、図１６に示すように、金属膜８０Ａが透明な平板８２の一面に形成され、この金属膜８０Ａ上に分子量分画層７０が積層されているセンサーチップ８４を用いてもよい。この場合には、光学プリズムＰを平版８２の金属膜８０Ａが形成されていない面と密着させ、この光学プリズムＰを介して金属膜８０Ａへ光ビームＬを入射させると共に入射させた光ビームＬを反射させる。この構成によれば、金属膜８０Ａの形成される平板８２を、光学プリズムＰと別体にして、センサーチップ８４を簡易な構成とすることができる。
【００６５】
一方、本実施形態のように、金属膜５０が誘電体ブロック４２上に形成された構成とすることにより、光学的なロスを少なくすることができる。また、金属膜と誘電体ブロックとが別体とされている場合には、プリズムと金属膜の形成された板との間に屈折率マッチングオイル等を注入する必要があるが、本実施形態のように、金属膜５０が誘電体ブロック４２上に形成された構成であれば、屈折率マッチングオイル等を注入する必要はなく、バイオセンサーの構成を簡単にすることができると共に、取り扱いも簡単になり、利便性が高まる。
【００６６】
なお、本実施形態では、バイオセンサーとして、表面プラズモンセンサーを一例として説明したが、バイオセンサーとしては、表面プラズモンセンサーに限定されるものではない。その他の例えば、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した光学的測定技術など、あらゆるバイオセンサーを用いてのアナライトの回収に本発明は適用することができる。
【００６７】
また、全反射減衰を利用する他のバイオセンサーとしては、漏洩モード検出器をあげることができる。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を透過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において、導波モードが励起されると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。導波モードが励起される入射角は、表面プラズモン共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本実施形態のバイオセンサーの全体斜視図である。
【図２】本実施形態のセンサースティックの斜視図である。
【図３】本実施形態のセンサースティックの分解斜視図である。
【図４】本実施形態のセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図５】本実施形態の分子量分画層の製造方法の説明図である。
【図６】本実施形態のセンサースティックの分画領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図７】本実施形態の液体供給部を構成するピペット部の側面図である。
【図８】本実施形態のバイオセンサーの光学測定部付近の概略図である。
【図９】本実施形態の制御部とその周辺の概略ブロック図である。
【図１０】本実施形態の測定処理のフローチャートである。
【図１１】本実施形態の低分子物質の（Ａ）（Ｂ）は分子量分画層への物質の進入状態を示す図であり、（Ｃ）は各分画層の進入データの一例を示すグラフである。
【図１２】本実施形態の中子物質の（Ａ）（Ｂ）は分子量分画層への物質の進入状態を示す図であり、（Ｃ）は各分画層の進入データの一例を示すグラフである。
【図１３】本実施形態の高子物質の（Ａ）（Ｂ）は分子量分画層への物質の進入状態を示す図であり、（Ｃ）は各分画層の進入データの一例を示すグラフである。
【図１４】本実施形態の液体流路への試料供給動作を説明する図である。
【図１５】本実施形態での分子量分画と液体クロマトグラフィによる親水性特性を組み合わせた二次元マップ上に測定結果をプロットした例である。
【図１６】本発明が実施される他の形態のセンサーチップの概略断面図である。
【符号の説明】
【００６９】
１０ バイオセンサー
２０ 液体吸排部
４０ センサースティック
４２ 誘電体ブロック
４４ 流路部材
４５ 液体流路
４５Ａ 供給口
４５Ｂ 排出口
５０ 金属膜
５４ 光学測定部
７０ 分子量分画層
８４ センサーチップ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料の供給される供給口、及び前記液体試料の排出される排出口の形成された液体流路と、
前記液体流路に表面が露出され、前記液体試料の進行方向に異なる部分で異なる分子量の分子を進入させる分子量分画層と、
前記分子量分画層に進入した分子を検出する検出手段と、
を備えたバイオセンサー。
【請求項２】
前記検出手段が、非電気化学的検出であること、を特徴とする請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記分子量分画層は、前記液体試料の進行方向に濃度勾配を持つゲルで形成されていること、を特徴とする請求項１または請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記ゲルの前記濃度勾配は、前記供給口側の濃度が前記排出口側の濃度よりも高いこと、を特徴とする請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記分子量分画層が、アガロース誘電体、または、アクリルアミド誘電体、を含んで構成されていること、を特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記液体流路は、液体クロマトグラフィと接続されていること、を特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記分子量分画層は金属膜上に構成され、
前記検出手段は、前記金属膜の前記分子量分画層と逆側の面へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰を利用して、前記分子量分画層へ進入した分子を検出すること、
を特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記金属膜は、誘電体ブロックの光反射面に形成され、
前記検出は、前記誘電体ブロックを介して前記金属膜へ光ビームを入射させると共に入射させた光ビームを反射させて行なわれること、を特徴とする請求項７に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載されたバイオセンサーを用いて液体試料の分子量分画を行う分子量分画方法であって、
予め所定の緩衝液の供給されている前記液体流路へ、前記液体流路の容積よりも少ない量の液体試料を前記供給口から供給する液体試料供給ステップと、
前記液体試料の供給後、前記検出手段で前記分子量分画層の前記進行方向の異なる複数箇所において前記進入した分子を検出する検出ステップと、
を備えた分子量分画方法。
【請求項１】
液体試料の供給される供給口、及び前記液体試料の排出される排出口の形成された液体流路と、
前記液体流路に表面が露出され、前記液体試料の進行方向に異なる部分で異なる分子量の分子を進入させる分子量分画層と、
前記分子量分画層に進入した分子を検出する検出手段と、
を備えたバイオセンサー。
【請求項２】
前記検出手段が、非電気化学的検出であること、を特徴とする請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記分子量分画層は、前記液体試料の進行方向に濃度勾配を持つゲルで形成されていること、を特徴とする請求項１または請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記ゲルの前記濃度勾配は、前記供給口側の濃度が前記排出口側の濃度よりも高いこと、を特徴とする請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記分子量分画層が、アガロース誘電体、または、アクリルアミド誘電体、を含んで構成されていること、を特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記液体流路は、液体クロマトグラフィと接続されていること、を特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記分子量分画層は金属膜上に構成され、
前記検出手段は、前記金属膜の前記分子量分画層と逆側の面へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰を利用して、前記分子量分画層へ進入した分子を検出すること、
を特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記金属膜は、誘電体ブロックの光反射面に形成され、
前記検出は、前記誘電体ブロックを介して前記金属膜へ光ビームを入射させると共に入射させた光ビームを反射させて行なわれること、を特徴とする請求項７に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載されたバイオセンサーを用いて液体試料の分子量分画を行う分子量分画方法であって、
予め所定の緩衝液の供給されている前記液体流路へ、前記液体流路の容積よりも少ない量の液体試料を前記供給口から供給する液体試料供給ステップと、
前記液体試料の供給後、前記検出手段で前記分子量分画層の前記進行方向の異なる複数箇所において前記進入した分子を検出する検出ステップと、
を備えた分子量分画方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００７−４７１０５（Ｐ２００７−４７１０５Ａ）
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３４１２８（Ｐ２００５−２３４１２８）
【出願日】平成１７年８月１２日（２００５．８．１２）
【出願人】（０００００５２０１）富士フイルムホールディングス株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１２日（２００５．８．１２）
【出願人】（０００００５２０１）富士フイルムホールディングス株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
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