ヒト造血幹細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖
造血幹細胞の数を増大させる方法およびキットを提供する。この方法は、単離されたＩＧＦＢＲ−２およびアンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）を含む培地中で細胞をインキュベートするステップを含む。増殖させたＨＳＣ、ならびに合成培地中でヒトＨＳＣを増殖させるための培地およびキットを提供する。増殖させたヒトＨＳＣを個体に投与する方法、ならびに特定の成長因子およびサイトカインを投与することによって個体を治療する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府資金
この技術は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された交付金番号Ｒ０１ ＤＫ０６７３５６−０１、１ Ｋ０１ ＣＡ１２００９９−０１および０７５／Ｐ−ＩＲＦＴの下で、米国政府からの補助を受けて作られたものであり、米国政府は、本技術における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、増殖および分化を通して、すべてのリンパ球様細胞、骨髄細胞および赤血球細胞を生じる。したがって、多分化能ＨＳＣは、骨髄移植の基礎であり、多くの臨床状態への造血遺伝子治療の魅力的な標的細胞と考えられている。しかし、これらの重要な臨床適用は、動物から取得できるＨＳＣの数が少ないこと、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＳＣの培養、および後で患者に投与するためのＨＳＣの増殖が難しいことによって厳しく妨げられてきた。
【０００３】
造血幹細胞など、幹細胞の培養および増殖は、通常、幹細胞の生存および数の増加を可能にする未知因子の補充を必要とする。それらの未知因子は、未特定な一団の因子を分泌する支持細胞と共に幹細胞を共培養することによって供給でき、または未特定な血清産物を増殖培地中に添加することによって供給できる。そのような補充培地は、多くの未知因子を含有しており、したがって、化学的に特定されていない。
【０００４】
ｉｎ ｖｉｖｏで使用するため、とりわけヒトで使用するために幹細胞が調製されている場合、未知因子の存在は問題である。多くの場合において、未知因子は非ヒト供給源由来である（ウシ血清産物など）。非ヒト成分は、被移植者体内で免疫反応を引き起こしうる。または、未特定な成分には、プリオンまたはウイルスなど、幹細胞の被移植者に有害となる未検出の病原体が含まれうる。増殖させる細胞の多分化能を維持しながら、既知組成培地中におけるヒトＨＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏ増殖を可能にする方法および組成物が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
造血幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させるための合成培地（definedculture ｍｅｉｕｍ）をここに提供する。この合成培地は、相互に協力してヒトＨＳＣの増殖を刺激する特定の複数の成長因子を含有する。驚いたことに、本明細書で明らかにするように、形質移入されていない２９３Ｔ細胞によって産生されたある因子がヒトＨＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を促進した。その因子がインスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）であることをここに示す。外因性ＩＧＦＢＰ−２が有する、様々なＩＧＦ依存性細胞培養系における細胞増殖への抑制作用（Hoeflichら、Canc.Res.、６１巻、８６０１〜８６１９頁（２００１年））を鑑みると、ＩＧＦＢＰ−２がヒト造血幹細胞の増殖を促進するという新知見は予想外である。
【０００６】
本明細書で明らかにするように、ＩＧＦＢＰ−２は、１または複数種のＡｎｇｐｔｌタンパク質との組合せで、合成培地中におけるヒトＨＳＣの増殖を促進する。一部の実施形態では、合成培地中で、ヒトＨＳＣが２５０倍以上に増殖する。
【０００７】
一部の実施形態では、ヒトＨＳＣを増殖させる方法は、合成培地中でヒト細胞をインキュベートするステップを含む。合成培地は、ＩＧＦＢＰ−２およびアンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）を含みうる。一部の実施形態では、合成培地は、ＩＧＦＢＰ−２、Ａｎｇｐｔｌ５、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含みうる。一部の実施形態では、この方法は、合成培地中で５日間ヒト細胞をインキュベートするステップを含む。
【０００８】
一部の実施形態では、ヒト細胞は初代ヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる細胞を少なくとも１つ含有している。一部の実施形態では、ヒト細胞は造血幹細胞を少なくとも１つ含有している。
【０００９】
一部の実施形態では、ヒト細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ３４からなる群から選択された表面マーカーを発現する細胞として、インキュベートされる前に選択されたものである。
【００１０】
造血幹細胞を個体に投与する方法も提供する。一部の実施形態では、その方法は、個体またはドナーからヒト細胞を得るステップを含む。一部の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも１つが、１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる。細胞は、ここで提示するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖する。一部の実施形態では、ＩＧＦＢＰ−２と、アンジオポエチン２またはＡｎｇｐｔｌからなる群から選択された成長因子とを含む合成培地中で細胞をインキュベートする。インキュベートされた細胞は、その後、個体に投与する。
【００１１】
患者を治療する方法であって、個体にＩＧＦＢＰ−２およびＡｎｇｐｔｌを投与するステップを含む方法を提供する。
【００１２】
ここに記載の通りに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた造血幹細胞も提供する。
【００１３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト造血幹細胞を増殖させるための培地およびキットも提供する。一部の実施形態では、キットは、造血幹細胞を培養するのに適した合成培地と、単離されたＩＧＦＢＰ−２と、アンジオポエチン２またはＡｎｇｐｔｌからなる群から選択された別の成長因子とを含む。成長因子は、別々の成分として提供することも、カクテルとして提供することも、既にＨＳＣ成長培地と混合された状態で提供することもできる。
【００１４】
加えて、造血幹細胞を含めた、培養中の幹細胞を、細胞を増殖させるのに十分な条件の下において、アンジオポエチン２などのアンジオポエチンを有効な量含有する培地中で、幹細胞を含有する細胞の集団を培養することによって増殖させる方法も提供する。アンジオポエチンに特異的に結合する単離された造血幹細胞も提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで造血幹細胞を増殖させるための培地およびキットも提供する。培地およびキットは、アンジオポエチン２などのアンジオポエチンと、造血幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させるための説明書とを含む。
【００１５】
ここに提供した方法および組成物の結果として、多分化能を維持しながら、ヒトＨＳＣを合成培地中で増殖させることができる。これらの細胞は、研究で使用するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることもでき、または、後で個体に投与するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させること（本明細書ではｅｘ ｖｉｖｏ増殖とも呼ばれる）もできる。
【００１６】
ここに記載した様々な実施形態は、相補的でありえ、ここに含まれている教示に鑑みて、当業者によって理解される方法で組み合わせるか、または併用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】Ａｎｇｐｔｌ５（四角）またはＡｎｇｐｔｌ３（菱形）の存在下における総ヒト臍帯血細胞の培養物の総細胞数対日数を示す図である。
【図１Ｂ】１×１０６の非培養ヒト単核臍帯血細胞（カラム１）、またはＡｎｇｐｔｌ５（カラム２）もしくはＡｎｇｐｔｌ３（カラム３）を足した無血清ＳＴＩＦ中で培養された１×１０６の初期ヒト臍帯血細胞の子孫を移植された、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄におけるヒトキメリズムの量を示す図である。各シンボルは、移植の２カ月後にアッセイされた単一の移植マウスにおける生着を表す（ｎ＝５〜１２）。（＊レーン１の値から有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．００１）。
【図２Ａ】１０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−２および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１を補充した無血清ＩＭＤＭ中（棒１）、または２９３Ｔ細胞から新たに収集した調整培地中（棒２）、または凍結／解凍した後の同じ調整培地中（棒３）で培養した後のマウスＨＳＣを用いたパーセント再増殖を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】上部パネルが、図２Ａの棒２によって代表された状態からの培養細胞を受け取った、マウスの骨髄系統およびリンパ系統における、移植５カ月後の再増殖の代表的なＦＡＣＳ分析および棒グラフを示し、下部パネルが、図２Ａの棒２によって代表される状態からの培養細胞を受け取った６匹のマウスから得られた、Ｔリンパ様細胞（棒１）、Ｂリンパ様細胞（棒２）および骨髄細胞（棒３）のパーセント再増殖データの概要を示す図である。
【図３】ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで分離し、抗ＩＧＦＢＰ−２抗体でプロービングした、ＩＧＦＢＰ−２（レーン１）、無血清３Ｔ３調整培地（レーン２）および無血清２９３Ｔ調整培地（レーン３）のウエスタンブロットを示す図である。
【図４Ａ】Ａｎｇｐｔｌ３を足したＳＴＩＦ培地中（カラム１および４）、Ａｎｇｐｔｌ３およびＩＧＦＢＰ−２を足したＳＴＩＦ培地中（カラム２および５）Ａｎｇｐｔｌ３およびＴｉｍｐ−１を足したＳＴＩＦ培地中（カラム３および６）で培養した後のマウスＨＳＣをマウスに生着させた１カ月後（左パネル）および４カ月後（右パネル）のパーセント再増殖を示す図である。
【図４Ｂ】Ａｎｇｐｔｌ３を足したＳＴＦ培地中（カラム１および４）、ＩＧＦＢＰ−２を足したＳＴＦ培地中（カラム２および５）、Ａｎｇｐｔｌ３およびＩＧＦＢＰ−２を足したＳＴＦ培地中（カラム３および６）で培養した後のマウスＨＳＣをマウスに生着させた１カ月後（左パネル）および４カ月後（右パネル）のパーセント再増殖を示す図である。
【図４Ｃ】１００ｎｇ／ｍｌの精製Ａｎｇｐｔｌ３および５００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−２を含有する調整ＳＴＦ培地中で２１日間培養する前（左）および後（右）における、成体ＢＭ ＳＰ ＣＤ４５＋Ｓｃａ−１＋細胞の再増殖能力の限界希釈分析を示す図である。
【図５Ａ】Ａｎｇｐｔｌ５を含有するＳＴＦ培地中（四角）、またはＳＴＦ培地中（菱形）で培養したヒトＨＳＣの、時間（日）経過における細胞数を示す図である。
【図５Ｂ】８０００の新たな細胞（カラム１）、１５０００の新たな細胞（カラム２）、ＳＴＦ培地中で培養した８０００の細胞（カラム３）、またはＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２ＳＴＦを含有する培地中で培養した８０００の細胞（カラム４）による％再増殖を示す図である。
【図５Ｃ】非培養（新鮮）または培養ヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞を移植された代表的なマウスにおける、２カ月目のヒト造血生着のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５Ｄ】非培養細胞を移植されたマウス（左パネル）およびＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養された細胞を移植されたマウス（右パネル）から得られた、ヒト骨髄細胞（ＣＤ１５／６６ｂ＋、カラム１、４）、Ｂリンパ様細胞（ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋、カラム２、５）および原始細胞（ＣＤ３４＋、カラム３、６）での％再増殖を示す多系列生着データの概要を示す図である。
【図５Ｅ】Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養され細胞（図５Ｂのレーン４）を移植され、亜致死放射線照射された二次被移植者体内に移植された、一次マウスからの骨髄を移植された二次被移植者の、ヒト総造血細胞（ＣＤ４５／７１＋、カラム１）、骨髄細胞（ＣＤ１５／６６ｂ＋、カラム２）、Ｂリンパ様細胞（ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋、カラム３）および原始細胞（ＣＤ３４＋、カラム５）での％再増殖を示す図である。
【図６Ａ】低レベルのＯ２（菱形）および正常レベルのＯ２（四角）内で培養された、Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中における、２×１０５のヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞の、時間経過における総細胞数を示す図である。
【図６Ｂ】低レベルのＯ２（菱形）および正常レベルのＯ２（四角）内で培養された、Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養されたヒトＨＳＣについての、時間経過における、ＣＤ３４＋原始細胞の数を示す図である。
【図６Ｃ】培養前の細胞の再増殖能力の限界希釈分析を示す図である。
【図６Ｄ】低レベルのＯ２（四角）および正常レベルのＯ２（菱形）内で、５００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇｐｔｌ５および１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で１０日間培養した後の細胞の再増殖能力の限界希釈分析を示す図である。
【図６Ｅ】２００００の非培養ＣＤ１３３＋細胞（左パネル、ｎ＝８）または正常Ｏ２における、５０００の初期ＣＤ１３３＋細胞からの培養子孫（右パネル、ｎ＝１０）を移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ被移植者における多系列生着を示す図である。
【図７】１×１０５のＣＤ４５．１骨髄細胞と共に、アンジオポエチン２含有ＳＴＩＦ培地中で培養された２０のＣＤ４５．２骨髄ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞でＣＤ４５．１被移植者（ｎ＝４〜５）に移植された４カ月後のパーセント再増殖を示す棒グラフである。
【図８】例示的アンジオポエチン様タンパク質のアミノ酸配列である配列番号３〜６を示す図である。
【図９】例示的アンジオポエチン２タンパク質のアミノ酸配列である配列番号１と、例示的ＩＧＦＢＰ−２タンパク質のアミノ酸配列である配列番号２とを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
造血幹細胞（ＨＳＣ）を増殖させる（propagating and/or expanding）方法と、これらの方法で産生したヒトＨＳＣとを提供する。一部の実施形態では、ヒトＨＳＣを合成培地中で増殖させる。ここに提供の方法の結果として、培養細胞内に通常存在している未知因子または夾雑物を含まないｅｘ ｖｉｖｏ増殖させたヒトＨＳＣが利用可能となっている。
【００１９】
培地
本明細書に記載の通り、適した細胞は、合成培地（本明細書では、既知組成培地とも呼ぶ）中でインキュベートされる。合成培地または既知組成培地は、培地中に存在するあらゆる構成成分およびそれらの量が既知である、細胞を培養するための栄養培地を指す。一部の実施形態では、培地は液体である。他の実施形態では、培地は、錠剤もしくは粉末などの固体物質、またはゲルなどの半固体物質でありうる。さらに他の実施形態では、培地は、メッシュおよび多孔性ビーズなどの固体構造を含有する液体でありうる。合成培地は、ダルベッコのＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５（Ｃａｍｂｒｅｘ社）、ＲＰＭＩ−１６４０およびＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）など、構成成分のベース混合物を含みうる。ヘパリン、血清アルブミン、インスリンおよびトランスフェリンなど、またはそれらの組合せなど、既知量の他の構成成分をベース混合物に補充することができる。一部の実施形態では、１０μｇ／ｍｌヘパリンを培地に補充する。添加される成分は、例えば、ヒト、ウシおよびマウス源を含めた、任意の適した動物源から得られたものでありうる。例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎは、ウシ血清アルブミン、ヒトインスリンおよびヒトトランスフェリンを補充したＩＭＤＭを含む。添加される構成成分および成長因子は、生物源（組織、血清または調整培地など）から単離することもでき、組換え産生させることもできる。組換え体成長因子および他の構成成分を産生するのに適した宿主には、例えば細菌、酵母または細胞培養が含まれる。細胞培養は、例えば、昆虫細胞培養または哺乳動物細胞培養でありうる。成長因子は、グリコシル化されたものでありうる。一部の実施形態では、成長因子は、天然に存在する成長因子と同じ様式、または実質的に同じ様式でグリコシル化されている。本明細書に記載の成長因子または他の添加構成成分は、例えば、マウス、非ヒト霊長類およびヒトを含めた任意の適した動物からのものでありうる。
【００２０】
「単離された」または「精製された」構成成分または成長因子は、産生されたとき（例えば、生物源によって、または形質移入細胞内での発現など、組換え法によって産生されたとき）にそれが共在している他の物質を実質的に含まない。一部の実施形態では、単離されたとは、構成成分または成長因子が、産生されたときに共在している他の物質の０．１％未満、０．０１％未満または０．００１％未満が存在していることを意味する。別の実施形態では、合成培地は無血清である。
【００２１】
本明細書に記載のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する、成長因子の例示的配列は、これによって参照により本明細書に組込まれているものとする。
【００２２】
ＩＧＦＢＰ−２
一部の実施形態では、合成培地は、単離されたインスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）を含有する。ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）は、ＩＧＦ受容体と同じかそれを超える親和性でＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に結合する循環タンパク質のファミリーである。ＩＧＦＢＰ−２は、様々なＩＧＦ依存細胞培養系における細胞増殖への阻害作用を有することでも知られている（Hoeflichら、Canc. Res.６１巻、８６０１〜８６１９頁（２００１年））。驚いたことに、本明細書に明らかにするように、ＩＧＦＢＰ−２は、ヒトＨＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に正の効果を有する。
【００２３】
例示的ＩＧＦＢＰ−２タンパク質配列は、例えば、受託番号ＡＡＡ３６０４８（ヒトインスリン様成長因子結合タンパク質２；配列番号２、図９）としてＧｅｎＢａｎｋで提示されている。ＩＧＦＢＰ−２に加えて、適したＩＧＦＢＰ−２には、天然に存在するアミノ酸配列内に変化を有するタンパク質および／またはポリペプチドが含まれ、改変配列が天然ＩＧＦＢＰ−２の少なくとも何らかの機能的能力を保持することを、当業者はさらに理解するであろう。適した改変には、保存性アミノ酸変化（例えば、あるアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換すること）と共に、非必須アミノ酸残基に加える変化またはそれらの除去が含まれる。
【００２４】
適したＩＧＦＢＰ−２は、配列番号９と少なくとも６０％の配列同一性を共有する。他の実施形態では、適したＩＧＦＢＰ−２は、配列番号９またはその生理活性部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を共有する。
【００２５】
ＩＧＦＢＰ−２の適した類似体には、望ましい活性を保持する断片および関連分子が含まれる。ＩＧＦＢＰ−２の対応する受容体に結合し、かつＩＧＦＢＰ−２受容体への結合に伴う１つまたは複数の生物学的作用を開始できる分子も、本明細書に提示の技術（例えば、方法、ＨＣＳ、培地およびキット）の範囲内にある。
【００２６】
アンジオポエチン様タンパク質
１または複数種のアンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）は、構造がアンジオポエチンに類似している分泌性糖タンパク質のファミリーの任意のメンバーでありうる（Oikeら、Int. J. Hematol.、８０巻、２１〜８頁（２００４年））。Ａｎｇｐｔｌタンパク質は、Ｎ末端コイルドコイルドメインと、Ｃ末端フィブリノゲン様ドメインとを含有している。アンジオポエチンとは異なり、Ａｎｇｐｔｌタンパク質は、チロシンキナーゼ受容体Ｔｉｅ２に結合しない。Ａｎｇｐｔｌタンパク質には、Ａｎｇｐｔｌ １、２、３、４、５、６および７が含まれる。Ａｎｇｐｔｌタンパク質には、ミクロフィブリル関連糖タンパク質４（Ｍｆａｐ４）ならびにその類似体および等価物が含まれる。Ａｎｇｐｔｌ２は、Kim,I.ら、J Biol Chem、２７４巻、２６５２３〜８頁（１９９９年）によって記載されている。加えて、Ａｎｇｐｔｌタンパク質は、商業的に取得可能である（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐ社）。一実施形態では、ＡｎｇｐｔｌはＡｎｇｐｔｌ３である。別の実施形態では、ＡｎｇｐｔｌはＡｎｇｐｔｌ５である。
【００２７】
例示的Ａｎｇｐｔｌタンパク質は、例えば、受託番号ＡＡＨ１２３６８（ヒトＡｎｇｐｔｌ１：配列番号３；ヒトＡｎｇｐｔｌ２前駆体；配列番号４）、受託番号ＡＡＨ５８２８７（ヒトＡｎｇｐｔｌ３前駆体；配列番号５）、受託番号ＡＡＨ２３６４７（ヒトＡｎｇｐｔｌ４；配列番号６）および受託番号ＡＡＨ４９１７０（ヒトＡｎｇｐｔｌ５；配列番号７）としてのＧｅｎＢａｎｋで提示されている。配列番号３〜７を図８に示す。他の適したＡｎｇｐｔｌタンパク質は、配列番号３〜７のうちのいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を共有するものである。他の実施形態では、適したＡｎｇｐｔｌタンパク質は、配列番号３、４、５、６または７などの例示的Ａｎｇｐｔｌ配列またはその生理活性部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を共有する。Ａｎｇｐｔｌ７の例示的配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＨ０１８８１に見出される。Ｍｆａｐ４の例示的配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２３９５に見出される。
【００２８】
Ａｎｇｐｔｌｓについて上記に提示した配列に加えて、当業者は、適したＡｎｇｐｔｌに、天然に存在するアミノ酸配列内に変化を有するタンパク質および／またはポリペプチドが含まれ、改変配列が天然Ａｎｇｐｔｌの少なくとも何らかの機能的能力を保持することをさらに理解するであろう。適した改変には、保存性アミノ酸変化（例えば、あるアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換すること）と共に、非必須アミノ酸残基に加える変化またはそれらの除去が含まれる。
【００２９】
Ａｎｇｐｔｌの適した類似体には、望ましい活性を保持する断片および関連分子が含まれる。例えば、Ａｎｇｐｔｌの適した類似体は、コイルドコイルドメインを含有するアンジオポエチン様タンパク質の断片である。例えば、アンジオポエチン様タンパク質のコイルドコイルドメイン。別の類似体は、フィブリノゲン様ドメインである。コイルドコイルドメインおよびフィブリノゲン様ドメインなどの、Ａｎｇｐｔｌの断片は、完全長タンパク質と比較して、発現および精製するのが、より容易でありうる。Ａｎｇｐｔｌの対応する受容体に結合し、かつＡｎｇｐｔｌ受容体への結合に伴う１つまたは複数の生物学的作用を開始できる分子も、本明細書に提示の技術の範囲内にある。
【００３０】
アンジオポエチン２
一部の実施形態では、合成培地はアンジオポエチン２を含有する。例示的アンジオポエチン２タンパク質配列は、例えば、受託番号ＮＰ＿００１１３８（ヒトアンジオポエチン２；配列番号１、図９）としてＧｅｎＢａｎｋに提示されている。加えて、当業者は、適したアンジオポエチン２に、天然に存在するアミノ酸配列内に変化を有するタンパク質および／またはポリペプチドが含まれ、改変配列が天然アンジオポエチン２の少なくとも何らかの機能的能力を保持することをさらに理解するであろう。適した改変には、保存性アミノ酸変化（例えば、あるアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換すること）と共に、非必須アミノ酸残基に加える変化またはそれらの除去が含まれる。
【００３１】
適したアンジオポエチン２は、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を共有する。他の実施形態では、適したアンジオポエチン２は、配列番号１またはその生理活性部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を共有する。
【００３２】
アンジオポエチン２の適した類似体には、望ましい活性を保持する断片および関連分子が含まれる。アンジオポエチン２の対応する受容体に結合し、かつアンジオポエチン２受容体への結合に伴う１つまたは複数の生物学的作用を開始できる分子も、本明細書に提示の技術の範囲内にある。
【００３３】
他の成長因子
ＩＧＦＢＰ−２、アンジオポエチン２、または１もしくは複数種のＡｎｇｐｔｌに加えて、本技術の方法で造血幹細胞の増殖を促進するのに有用な他の成長因子またはサイトカインには、１または複数種の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン成長因子、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）が含まれうる。したがって、別の実施形態では、培地は、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＴＰＯおよびＳＣＦ、またはそれらの類似体および等価物のうちの少なくとも２つを含有する。それらの等価物は、野生型または組換え産生されたサイトカインとしてのこれらの因子（すなわち、ＦＧＦ、ＴＰＯ、ＩＧＦおよびＳＣＦ）に類似の生物活性を有する分子が含まれる。類似体には、望ましい活性を保持する断片および関連分子が含まれる。例えば、ＴＰＯはｍｐｌ受容体のリガンドであり、したがって、ｍｐｌ受容体に結合し、ｍｐｌへのＴＰＯ結合に伴う１つまたは複数の生物学的作用を開始できる分子も、本技術の範囲内にある。ＴＰＯミメティックの一例は、Cwirlaら、Science、２７６巻、１６９６頁（１９９７年）に見出される。
【００３４】
サイトカインおよび成長因子は、例えば、Ａｍｇｅｎ社（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）およびＩｍｍｕｎｅｘ社（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）など、いくつかの供給業者から購入できる。
【００３５】
上述のように、サイトカインまたは成長因子の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍＬから約１．０μｇ／ｍＬまでの範囲にある。別の実施形態では、約１ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍＬまでの因子が使用される。別の実施形態では、約１０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌまでの因子が使用される。成長因子の他の有用な濃度は、本明細書に含まれている教示を用いて、当業者が容易に決定できる。
【００３６】
別の実施形態では、培地中に、ＦＧＦ−１、ＴＰＯおよびＳＣＦも含有されている。別の実施形態ではＳＣＦが１０ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯが２０ｎｇ／ｍｌ、ＦＧＦ−１が１０ｎｇ／ｍｌで存在している。別の実施形態では、培地中に、ＩＧＦ−２、ＦＧＦ−１、ＴＰＯおよびＳＣＦも含有されている。成長因子またはサイトカインの他の有用な濃度は、本明細書に含まれている教示を用いて、当業者が容易に決定できる。
【００３７】
本明細書に記載の通り、所与のアミノ酸配との同一性または相同性は、２つの配列間の同一性パーセントとして決定できる。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージ内で提供されているＧＡＰなどのコンピュータープログラムによるものなど、当技術分野で知られている方法を用いて決定できる（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ用プログラムマニュアル、バージョン８、１９９４年８月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ ５３７１１）（Needleman, S. B.およびWunsch, C. D.（１９７０年）、Journal of Molecular Biology、４８巻、４４３〜４５３頁）。
【００３８】
造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養
細胞
培養する１または複数の細胞には、１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる任意の細胞が含まれうる。例示的な血液細胞型には、貪食免疫細胞（例えば顆粒球）、単球（例えばマクロファージ前駆細胞）、マクロファージ、好酸球、赤血球、血小板形成細胞（例えば巨核球）、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。適した細胞には、個体またはドナーから得られた初代細胞が含まれる。適した細胞は、自己複製できるもの、すなわち、数を増やしまたは増大でき、かつ親細胞と同じ発生段階のままでいられるものでもありうる。
【００３９】
適した細胞は、例えば、限定されるものではないが、骨髄、末梢血、動員末梢血（ＭＰＢ）、胎児肝および臍帯血を含めた、造血幹細胞の任意の既知供給源から単離できる。臍帯血について、例えば、Issaragrishiら、N.Engl.J.Med.、３３２巻、３６７〜３６９頁（１９９５年）で論じられている。骨髄細胞は、限定されるものではないが、腸骨（例えば寛骨から腸骨稜を経て）、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨小腔を含めた、骨髄供給源から得ることができる。幹細胞の他の供給源には、ＥＳ細胞、胚卵黄嚢、胎児肝および胎児脾臓が含まれるが、これらに限定されない。個体またはドナーから細胞を得る方法は当技術分野でよく知られている。
【００４０】
骨髄を単離するには、許容できる緩衝剤と共に、限定されるものではないが、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）または他の天然に存在する因子を任意選択で補充した塩溶液を含めた、適切な溶液を用いて、骨を洗い流すことができる。一実施形態では、緩衝剤は低濃度であり、通常約５から約２５ｍＭまでである。好都合な緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝剤および乳酸緩衝剤が含まれるが、これらに限定されない。骨髄は、従来の技法に従って、骨から吸引することもできる。
【００４１】
本技術の適した細胞および造血細胞は、造血幹細胞が存在する任意の動物から得ることができる。適した動物には、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコおよびマウスなどが含まれる。一実施形態では、細胞はヒト細胞であり、さらに別の実施形態では、細胞はマウス細胞である。
【００４２】
候補ヒト造血幹細胞集団の長期生着能に関する動物モデルには、非肥満糖尿病／重症複合免疫不全症マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）モデル、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨モデル（Kyoizumiら（１９９２年）、Blood、７９巻、１７０４頁；Murrayら（１９９５年）、Blood、８５（２）巻、３６８〜３７８頁）および子宮内ヒツジモデル（Zanjaniら（１９９２年）、J.Clin. Invest.、８９巻、１１７９頁）が含まれる。ヒト造血の動物モデルに関する総説には、Srourら（１９９２年）、J. Hematother.、１巻、１４３〜１５３頁およびそれに引用されている参考文献を参照されたい。幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、５〜８週間後に間質共培養で産生されるコロニー形成性細胞の数の限界希釈分析に基づいた長期培養開始細胞（ＬＴＣＩＣ）アッセイである（Sutherlandら（１９９０年）、Proc.Nat'l Acad. Sci.、８７巻、３５８４〜３５８８頁）。ＬＴＣＩＣアッセイは、別の一般的に使用される幹細胞アッセイである敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）アッセイ、およびｉｎ ｖｉｖｏでの長期生着能と相関していることが示されている（Breemsら（１９９４年）、Leukemia、８巻、１０９５頁）。
【００４３】
本明細書で使用される場合、増殖（expansion or propagation）には、細胞数の任意の増大が含まれる。増殖には、例えば、培養を開始するのに使用される細胞集団内に存在するＨＳＣの数を超える、造血幹細胞の数の増大が含まれる。ここで提供する方法は、造血幹細胞などの既存細胞の生存の増大を提供する。生存という用語は、生きているまたは機能している状態を継続する能力を指す。
【００４４】
ここで提供する方法は、内皮前駆細胞（Shi、Q.ら（１９９８年）、Blood.、９２巻、３６２〜３６７頁）、骨髄間質幹細胞（Owen,M.（１９８８年）、J. Cell Science、補１０巻、６３〜７６頁）、間充織幹細胞（Pittenger, M.F.およびMarshak, D.R.（２００１年）、Marshak,D.R.、Gardner, D.K.およびGottlieb, D.編集、Cold Spring Harbor, New York、Cold SpringHarbor Laboratory Press社、３４９〜３７４頁）および骨格筋幹細胞（Gussoni, E.ら（１９９９年）、Nature、４０１巻、３９０〜３９４頁）、胚幹細胞および他のものなど、他のタイプ成体幹細胞を含めた、アンジオポエチン２および／またはアンジオポエチン様タンパク質および／またはＩＧＦＢＰの存在下で増殖する任意の幹細胞の増殖を刺激するのに使用できる。別の実施形態では、幹細胞は、ＨＳＣと同じ前駆体−血管芽細胞−を共有すると考えられている内皮前駆細胞である。
【００４５】
ここで提供する方法では、細胞の亜集団も使用できる。例えば、骨髄または他の供給源から得られた精製「サイドポピュレーション」（ＳＰ）細胞を使用できる。ＨＳＣの他の濃縮集団も使用できる。ＨＳＣの濃縮集団を単離する方法は、当技術分野で知られており、例えば、ＳＰ細胞を取得する方法は、Goodellら、J. Exp. Med.、１８３巻、１７９７〜８０６頁（１９９６年４月１日）に記載されている。
【００４６】
加えて、幹細胞が濃縮された細胞亜集団も、ここに記載の方法で使用できる。細胞集団からの幹細胞の分離は、細胞選別（例えば蛍光活性化細胞選別）、磁性ビーズおよび充填カラムを含めた、多数の方法によって行える。これらの方法は通常、幹細胞に特徴的な特定の細胞表面マーカーの存在および／または分化細胞に特徴的な特定な細胞表面マーカーの不在に依存している。これらの方法は、細胞集団の生着または分化能を測定する機能アッセイに依存するものでもありうる。そのようなマーカーおよび機能アッセイは当技術分野で知られている。
【００４７】
幹細胞の濃縮の例は、米国特許第５０６１６２０号に記載の通り、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋ＬＩＮ−表現型を有するものとして選択された細胞集団である。この表現型の集団は通常、約１／２０の平均ＣＡＦＣ頻度を有する（Murrayら（１９９５年）同上；Lansdorpら、J. Exp. Med.、１７７巻、１３３１頁（１９９３年））。造血幹細胞の高濃縮集団を単離する方法は、米国特許出願第５，６８１，５５９号に提供されている。
【００４８】
本明細書に記載の通り、造血幹細胞は、赤血球、ならびにリンパ様細胞および骨髄細胞を含めた白血球を含めた、いくつかのタイプの血液細胞のいずれにも分化する能力を有する。本明細書に記載の通り、ＨＳＣには、ｉｎ ｖｉｖｏにおける長期生着能を有する造血細胞が含まれる。長期生着能（例えば長期造血幹細胞）は、動物モデルまたはｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いて測定できる。
【００４９】
細胞は、ここで提供する方法に従って培養する前に、例えば血液細胞系統の幹細胞または未成熟細胞を濃縮したものでありうる。幹細胞が高度に濃縮されている細胞集団およびそれらを得る方法は、国際公開第９５／０５８４３号；国際公開第９５／０３６９３号および国際公開第９５／０８１０５号に記載されている。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は、造血幹細胞が実質的に濃縮されている細胞の集団を含む。他の実施形態では、ここで提供する方法による培養細胞は、間質細胞を実質的に含まない。
【００５０】
一部の実施形態では、ここで提供する方法で使用される細胞は、細胞表面における特定のマーカーが存在または不在であるものとして選択され、またはそれについて濃縮される。例えば、一部の実施形態では、細胞は、一次組織の動物源に特有な幹細胞マーカーが存在するものとして選択される。他の実施形態では、細胞は、系統特異的マーカーが不在であるものとして選択される。一部の実施形態では、細胞は、特定のマーカーが存在し、かつ他のマーカーが不在であるものとして選択される。特定のマーカーを有する細胞、または特定のマーカーを有しない細胞を単離する方法は当業者によく知られている。
【００５１】
系統特異的マーカーに関して、系統特異的マーカーの不在または低レベル発現は、系統特異的マーカーに特異的な抗体の結合の欠如によって特定できる。ここで提供する方法で使用するための細胞または細胞供給源は、ネガティブ選択技法にかけて、系統特異的マーカーであると発現する細胞を除去し、系統陰性（「Ｌｉｎ−」）である細胞を維持することができる。Ｌｉｎ−は通常、Ｔ細胞（ＣＤ２、３、４および８など）、Ｂ細胞（Ｂ２２０、ＣＤ４８、ＣＤ１０、１９および２０など）、骨髄細胞（Ｍａｃ−１、Ｇｒ−１、ＣＤ１４、１５、１６および３３など）、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞（ＣＤ２４４、ＣＤ２、１６および５６など）、ＲＢＣ（Ｔｅｒｉ１９およびグリコホリンＡなど）、巨核球（ＣＤ４１）、肥満細胞、好酸球または好塩基球に関連するものなどのマーカーが欠如している細胞を指す。ネガティブ選択の方法は当技術分野で知られている。系統特異的マーカーには、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ７１が含まれる。
【００５２】
最初に特定の系統の細胞または特定の表現型を有する細胞を除去することによって、細胞を分離する様々な技法を利用できる。分離の手順には、物理的分離と、磁力分離（抗体でコーティングされた磁性ビーズを用いる）と、アフィニティクロマトグラフィーと、モノクローナル抗体に連結されるか、またはモノクローナル抗体と共に併用される、限定されるものではないが、補体および細胞毒を含めた細胞毒性薬剤と、固体基質、例えばプレートに付着した抗体を用いる「パニング」と、エルトリエーションまたは任意の他の好都合な技法とが含まれうるが、これらに限定されない。正確かつ迅速な分離を提供する技法には、フローサイトメトリー（例えば蛍光活性化細胞選別）およびサイトスピンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
物理的分離技法の使用には、物理特性（密度勾配遠心および対流遠心エルトリエーション）、細胞表面特性（レクチンおよび抗体親和性）、および生体染色特性（ミトコンドリア結合色素ｒｈｏ１２３およびＤＮＡ結合色素ヘキスト３３３４２）の相違に基づくものが含まれるが、これらに限定されない。これらの手順は、この技術分野の当業者によく知られている。
【００５４】
上述の通り、造血幹細胞の濃縮を用いて、または用いずに得られた細胞は、直ちに使用することも、液体窒素温度で凍結および保存することもできる。凍結細胞は、解凍して、本明細書に記載の方法で使用することができる。
【００５５】
細胞培養
ＨＳＣ細胞増殖の一部の実施形態では、例えば一次組織源または適した動物から得られた細胞を適した培地でインキュベートする。適した条件には、３３℃から３９℃、好ましくは約３７℃におけるインキュベーションが含まれる。ＨＳＣは、１〜１０％の酸素濃度で培養できる。一部の実施形態では、ＨＳＣが低酸素条件下で培養される。一部の実施形態では、細胞は、標準酸素条件下でインキュベートされる。標準酸素条件は、例えば、５％ＣＯ２および１５％以上の酸素でありうる。一部の実施形態では、標準酸素条件が２１％Ｏ２である。低酸素条件は、例えば、５％ＣＯ２および５％Ｏ２でありうる。
【００５６】
培地は、培養時間中を通して置換できる。別の実施形態では、培地の半分を１週間に２回新たな培地で置換する。細胞が３から３０日間培養されうる。別の実施形態では、ＨＳＣを含有する細胞集団を少なくとも４週間培養する。別の実施形態では、ＨＳＣを含有する細胞集団を最長２週間まで培養する。別の実施形態では、ＨＳＣを含有する細胞集団を７から１４日間培養する。別の実施形態では、ＨＳＣを含有する細胞集団を１０日間培養する。
【００５７】
増殖容器内および適した培地容積で、１つまたは複数の細胞を培養またはインキュベートすることによって、ＨＳＣを増殖させることができる。細胞は、培養ウェルが１ウェルあたり約１〜１００の細胞を含有するように培養できる。細胞集団が骨髄である場合、培地１ｍＬあたり約１×１０２から約１×１０７細胞の密度で、細胞を培養できる。別の実施形態では、培地１ｍＬあたり約１×１０５から約１×１０６細胞の密度で、細胞を培養できる。別の実施形態では、細胞集団はサイドポピュレーション（ＳＰ）骨髄細胞を含む。ＳＰ骨髄細胞は、より低密度、例えば、約１×１０２から５×１０３細胞／ｍｌで培養できる。別々の態様では、細胞集団は動員末梢血から得ることができる。動員末梢血細胞は、約２００００細胞／ｍＬから約５００００細胞／ｍＬの密度で培養でき、別の実施形態では、動員末梢血細胞は、約５００００細胞／ｍＬの密度で培養される。
【００５８】
１２、２４もしくは９６ウェルプレート、１２．５ｃｍ２Ｔ型培養フラスコまたは気体透過バッグなど、任意の適した増殖容器、フラスコまたは適切な管が、ここで提供する方法で使用できる。そのような培養容器は、Ｆａｌｃｏｎ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社またはＣｏｓｔａｒ社から購入できる。本明細書で使用される場合、「増殖容器」は、自立的であるかないか、または増殖装置に組込まれているかないかに関わらず、細胞を増殖させるためのいかなるチャンバーまたは容器も含まれることが意図されている。
【００５９】
本明細書に記載の通りにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた造血幹細胞も提供する。培養で増殖した幹細胞の子孫は、親細胞と完全に同じ（遺伝学的に、形態学的に、または表現型的に）ではない可能性があると理解されている。しかし、ここで提示する通り、幹細胞の子孫は、上述した１つまたは複数の血液細胞型に分化する少なくとも何らかの能力を有する。１つまたは複数の血液細胞型に発生する能力などの機能的特性は、例えば、本明細書に記載の方法および系統マーカーを用いて測定できる。
【００６０】
ｅｘ ｖｉｖｏ増殖造血幹細胞の使用
本技術の増殖培養造血幹細胞は、移植、創薬、遺伝子クローニング、遺伝子送達および遺伝子発現を含めた様々な適用に使用できる。
【００６１】
移植
ここで提供する造血幹細胞は、対象または個体に投与できる。一部の実施形態では、ここで提供する方法で産生された造血幹細胞を、骨髄移植など、細胞ベースの療法に用いる。適した対象または個体は、上述の任意の動物が含まれる。対象または個体は、造血または細胞ベースの療法をｉｎ ｖｉｖｏで研究するのに適した任意の動物でありうる。脊椎動物。対象または個体は、細胞ベースの治療を必要とする任意の動物でありうる。一部の実施形態では、個体は哺乳動物である。哺乳動物には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ、イヌおよびネコなどが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００６２】
移植幹細胞は、自系（処置される個体に由来する）または同種（同じ種のドナーに由来する）であるか、組織適合性が一致しているドナーから得られたものでありうる。一部の実施形態では、移植幹細胞は異種（被移植者とは異なった種の動物に由来する）でありうる。ヒト自家骨髄移植および異系骨髄移植は、現在、白血病、リンパ腫、および生命に危険を及ぼす他の疾患などの疾患の療法として用いられている。
【００６３】
ここで提供する増殖細胞の、患者への投与に関しては、増殖細胞の有効な量が、わずか数百以下から、数百万以上までもの範囲でありうる。投与するべき増殖細胞の数は、医療専門家がよく知っている他の因子のなかでも、限定されるものではないが、処置するべきサイズまたは総容積を含めた、処置される障害の詳細、ならびに被移植者の必要性および条件に応じて異なることが理解されよう。一部の実施形態では、ヒト１００ｋｇあたり１０３〜１０１０の細胞を、対象または個体に投与または移植する。投与または移植の方法は、当技術分野でよく知られており、それらには、例えば注入が含まれる。ここで提供する増殖細胞は、例えば、静脈注入によって投与できる。
【００６４】
一部の実施形態では、細胞の単回投与を行う。他の実施形態では、多回投与を使用する。多回投与は、連続した３〜７日間の初期治療レジメを行い、その後、複数回繰り返すなど、周期的な期間にわたって行うことができる。
【００６５】
増殖細胞は、限定されるものではないが、放射線治療および化学療法などの処置の後、あらゆる範囲の造血細胞を個体で再構成するのに使用できる。そのような療法は、意図的に、または骨髄移植もしくはリンパ腫、白血病、および他の腫瘍状態、例えば乳癌の治療の副作用として、造血細胞を破壊する。
【００６６】
ここで提供する増殖細胞は、特定の造血系統のための細胞の供給源としても有用である。増殖造血細胞の成熟、増殖、および１つまたは複数の選択された系統への分化は、限定されるものではないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−１３などを含めた適切な因子と共に、または幹細胞の再生、拘束および分化の原因となる因子を分泌する、間質細胞もしくは他の細胞と共に細胞を培養することによって実現しうる。
【００６７】
創薬
本明細書に記載の方法によって得られる造血幹細胞は、創薬に有用である。例えば、幹細胞のそのような生物反応を促進または抑制する培養条件または成長因子は、試験される条件または因子に細胞を暴露することによって同定できる。このようにして、例えば、これらの因子の受容体またはその因子の生物活性を妨害する薬剤も同定できる。
【００６８】
ここで提供する方法で産生された造血幹細胞は、幹細胞を様々な造血系統に分化させるアッセイで使用できる。これらのアッセイは、例えば、幹細胞の自己再生、拘束または分化を促進または阻害する因子などの物質を同定するために、容易に適合させることができる。
【００６９】
遺伝子クローニング戦略
ここで提供する造血細胞は、例えば、サブトラクティブハイブリダイゼーションによって、またはこれらの生物学的イベントに関連しているか、または造血細胞型に特徴的な標的抗原に特異的なモノクローナル抗体を用いた発現クローニングによって、その発現が幹細胞または他の造血細胞の増殖、拘束、分化および成熟に関連する遺伝子を同定して、クローニングするのに使用できる。
【００７０】
遺伝子送達および発現
造血幹細胞は、対象における遺伝子送達または発現の重要な標的でもある。したがって、ここで提供する造血細胞は、細胞を個体に再導入する前に、遺伝子改変することができる。例えば、その発現が個体への治療効果を有すると予測されている遺伝子を、ここで提供する１または複数の造血細胞に導入することができる。細胞は、本明細書に記載の通りに、培養および／または増殖させる前または後に遺伝子改変できる。培養細胞に遺伝子を導入する方法は当技術分野でよく知られている。
【００７１】
本技術の一部の態様では、治療遺伝子を発現する細胞で、欠損および／または損傷している細胞を補充、増強および／または置換することによって個体を処置できる。細胞は、正常な適合ドナーの細胞に由来するものでも、処置すべき個体からの幹細胞（すなわち自系）に由来するものでもよい。発現可能形態の正常遺伝子を導入することによって、そのような欠損を患う個体に、遺伝的欠損を代償し、症状の一部またはすべてを除去、緩和または低減する手段を提供できる。
【００７２】
発現ベクターを自家または同種増殖造血細胞に導入して発現させることも、当技術分野で知られている方法による相同組換えまたは非相同組換えによって、細胞のゲノムを改変することもできる。このようにして、個体における遺伝的欠損を修正することも、幹細胞で天然に欠失している遺伝能力を与えることもできる。例えば、限定されるものではないが、β−地中海貧血症、鎌状赤血球貧血、アデノシンデアミナーゼ欠損、リコンビナーゼ欠損およびリコンビナーゼ調節遺伝子欠損を含めた疾患をこの方法で修正できる。造血細胞に関連していない疾患、例えば、限定されるものではないが、ホルモン、酵素および成長因子を含めた分泌タンパク質の欠失に関連した疾患も処置できる。適切な調節開始領域の制御下における、対象とする遺伝子の誘導発現により、天然でそのタンパク質を正常に産生する細胞におけるものと同様な様式で、そのタンパク質を産生（および分泌）することが可能となる。
【００７３】
造血幹細胞培養の形質導入
ここで提供する造血幹細胞は、遺伝的に改変できる。造血幹細胞への遺伝子の導入は、標準的な技法、例えば、感染、形質移入、形質導入または形質転換によるものでありうる。治療遺伝子でＨＳＣ細胞に形質導入することができる。例えば、形質導入は、レトロウイルスベクター（例えば、実施例、国際公開第９４／２９４３８号、国際公開第９７／２１８２４号および国際公開第９７／２１８２５号に記載の通りに）、またはポックスウイルスベクターなどのウイルスベクターを介したものでありうる。形質導入がｅｘ ｖｉｖｏである場合には、それに続いて、形質導入細胞を被移植者に投与する。したがって、ここで提供する技術は、ここに開示する方法によって遺伝子をｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与することによって、ＨＳＣへの遺伝子導入が適用できる疾患の処置を包含する。例えば、限定されるものではないが、β−地中海貧血症、鎌状赤血球貧血、アデノシンデアミナーゼ欠損、リコンビナーゼ欠損、リコンビナーゼ調節遺伝子欠損などを含めた疾患を、治療遺伝子の導入によって修正できる。遺伝子治療に関する他の適応は、正常な幹細胞が利点を有し、化学療法中に選択圧を受けるのを可能にする薬剤耐性遺伝子の導入である。適した薬剤耐性遺伝子には、多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
遺伝子導入方法の例には、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞微量注入、ならびにウイルスベクター、アジュバント補助ＤＮＡ、遺伝子銃およびカテーテルなどが含まれる。別の実施形態では、ウイルスベクターが使用される。
【００７５】
対象とする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、当技術分野でよく知られている方法を用いてベクターに挿入できる。例えば、インサートおよびベクターＤＮＡを、相互に対形成し、かつリガーゼで連結できる相補的な末端を各分子上に生成する制限酵素と適した条件下で接触させることができる。代替として、制限ポリヌクレオチドの末端に、合成核酸リンカーを連結することができる。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ内の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有する。さらに、例えば、以下のもの、すなわち、哺乳動物細胞の安定的または一過性形質移入体を選択するためのネオマイシン遺伝子などの選択マーカー遺伝子；高レベル転写のための、ヒトＣＭＶ前初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のための、ＳＶ４０からの転写終結シグナルおよびＲＮＡプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；多目的多重クローニング部位；ならびにセンスおよびアンチセンスＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーターのうちの一部またはすべてを含有するベクターに挿入するために、終止コドンおよび適切な制限部位を含有するオリゴヌクレオチドを連結することもできる。他の手段も、当技術分野でよく知られており、利用可能である。
【００７６】
造血幹細胞の改変は、導入されるトランスジーンの構成的発現または誘導性発現のいずれかのために作製された発現カセットの使用を含みうる。そのような発現カセットは、プロモーター、開始コドン、終止コドンおよびポリアデニル化シグナルなどの調節エレメントを含有しうる。幹細胞内、または個体に注入した後に幹細胞から生じる細胞の中で作用可能である適したエレメントを使用できる。さらに、これらのエレメントがタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結し、それによってヌクレオチド配列が幹細胞内で発現でき、かつ、それゆえタンパク質が産生できることが必要である。開始コドンおよび終止コドンは通常、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられる。
【００７７】
導入された配列の発現を特定の細胞型で引き起こすのに使用できるプロモーターの例には、Ｔ細胞およびＮＫ細胞における発現用のグランザイムＡ、幹細胞および前駆細胞における発現用のＣＤ３４プロモーター、細胞傷害性Ｔ細胞における発現用のＣＤ８プロモーター、ならびに骨髄細胞における発現用のＣＤ１１ｂプロモーターが含まれる。加えて、調節可能プロモーターを使用できる。誘導性プロモーターなどの調節可能プロモーターは市販されている。
【００７８】
調節エレメントに作用可能に連結したトランスジーンを含有する外因性遺伝物質は、機能的な細胞質分子もしくは機能的なエピソーム分子として細胞内に残留することも、それが細胞の染色体ＤＮＡに組込まれることもある。外因性遺伝物質は、細胞内に導入されて、プラスミドの形態の別離した遺伝物質としてそこに残ることもある。代替として、直鎖状ＤＮＡを細胞に導入してもよく、直鎖状ＤＮＡは、染色体に組込まれうる。細胞内にＤＮＡを導入する場合、染色体へのＤＮＡ組込みを促進する試薬を添加してもよい。組込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列も、ＤＮＡ分子に含まれうる。代替として、細胞内にＲＮＡを導入してもよい。
【００７９】
選択マーカーは、本技術の造血幹細胞内への望ましい遺伝子の取込みをモニターするのに使用できる。これらのマーカー遺伝子は、任意のプロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下のものでありうる。これらは、当技術分野でよく知られており、それらには、栄養物、抗生物質などの刺激に対する細胞の感受性を変える遺伝子が含まれる。遺伝子には、ｎｅｏ、ｐｕｒｏおよびｔｋ、ならびに多剤耐性（ＭＤＲ）のものなどが含まれる。他の遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ルシフェラーゼおよびＬａｃＺなど、それらを求めて容易にスクリーニングできるタンパク質を発現する。
【００８０】
本明細書で使用される場合、治療遺伝子は、一遺伝子全体でも、欠損内因性遺伝子から生じる、患者における欠損を代償できる遺伝子の機能的に活性な断片のみでもありうる。治療遺伝子には、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス抑制に有用な遺伝子、およびリボザイム媒介治療用のリボザイムも包含される。優性な抑制オリゴヌクレオチドおよびペプチドをコードする治療遺伝子、ならびに調節タンパク質およびオリゴヌクレオチドをコードする遺伝子もこの技術に包含される。通常、遺伝子治療では、単一の治療遺伝子を導入するが、特定の疾患の治療には複数の遺伝子が必要となりうる。治療遺伝子は、欠損遺伝子の正常コピー、例えば野生型コピー、または機能相同体でありうる。別の実施形態では、治療遺伝子は、野生型の優性抑制変異体である。ベクターあたり複数の遺伝子を投与することができ、または代替として、いくつかの適合性ベクターを用いて複数の遺伝子を送達することもできる。遺伝的欠損に応じて、治療遺伝子は調節配列および非翻訳配列を含みうる。ヒト患者の遺伝子治療用には、治療遺伝子は通常、ヒト起源のものであろうが、高い相同性と、ヒトで生物学的に同一であるか同等な機能とを示す、他の近縁種からの遺伝子も、その遺伝子産物が受容者に有害な免疫反応を誘導しない場合には使用できる。例えば、その遺伝子産物がヒトでグルコースをグリコーゲンに変換できる霊長類インスリン遺伝子は、ヒト遺伝子の機能的等価物であると考えられるであろう。処置で使用するのに適した治療遺伝子は疾患に応じて異なるであろう。例えば、鎌状赤血球貧血を処置するのに適した治療遺伝子は、グロビン遺伝子の正常コピーである。ＳＣＩＤを処置するのに適した治療遺伝子は、正常ＡＤＡ遺伝子である。
【実施例】
【００８１】
結果
Ａｎｇｐｔｌ５またはＡｎｇｐｔｌ３の存在下における総ヒト臍帯血細胞の培養はヒトＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。
【００８２】
Ａｎｇｐｔｌ３またはＡｎｇｐｔｌ５を含有するＳＴＩＦ培地中で総ヒト臍帯血細胞を培養した（Conklin, Dら、Genomics、６２巻、４７７〜８２頁（１９９９年）；Zeng, L.ら、J Hum Genet、４８巻、１５９〜６２頁（２００３年））。
【００８３】
１００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇｐｔｌ３またはＡｎｇｐｔｌ５を含有する無血清ＳＴＩＦ培地に２．５×１０７の総臍帯血細胞を１×１０６細胞／ｍｌの密度で播種し、示された時間における総細胞数を計数した。２３日間の培養の後、Ａｎｇｐｔｌ３存在下における総細胞数は、２．６±０．３×１０８にまで１０倍に増加し（図１Ａ、菱形）、Ａｎｇｐｔｌ５と共に培養した細胞は２．２±０．３×１０８にまで増加した（四角）。培養細胞は、主に懸濁細胞を含有し、少数の付着亜集団を伴っていた。
【００８４】
ｅｘ ｖｉｖｏ増殖細胞が生着できるかどうか試験するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖アッセイを行った。図１Ｂは、１×１０６の非培養ヒト単核臍帯血細胞、または培養された１×１０６の初期ヒト臍帯血細胞の子孫を移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄におけるヒトキメリズムの量を示す。各シンボルは、移植の２カ月後にアッセイされた単一の移植マウスにおける生着を表す（ｎ＝５〜１２）。（＊レーン１の値から有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．００１）。したがって、１×１０６もしくは３×１０６の非培養細胞、または１×１０６の始原細胞の培養子孫を、亜致死照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ被移植者に注射した。Ａｎｇｐｔｌ５と共に１９日間培養した９．２×１０６の細胞を（１×１０６の最初にプレーティングされた総臍帯血細胞の子孫である）、移植した場合、移植の２カ月後に８．８％の平均ヒト造血キメリズムが観察された（図１Ｂ、レーン２）。これは、同等な１×１０６の非培養細胞によって示された０．６％生着よりはるかに大きい（図１Ｂ、レーン１；ｐ、＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。Ａｎｇｐｔｌ３の存在下で２３日間培養された細胞も、７．１％の平均キメリズムで被移植者に生着した（図１Ｂ、レーン３）。
【００８５】
非形質移入２９３Ｔ細胞はＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。
【００８６】
驚いたことに、ここで明らかにされるように、非形質移入２９３Ｔ細胞から収集された無血清調整培地がＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。
【００８７】
１０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−２および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１を補充した無血清ＩＭＤＭ中（ＳＴＩＦ培地；図２Ａ、棒１）、または２９３Ｔ細胞から新たに収集した調整ＳＴＩＦ培地中（棒２）、または凍結／解凍した後の同じ調整培地中（棒３）で新たに単離された２０のＣＤ４５．２骨髄ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞を１０日間培養した。培養細胞は、１×１０５のＣＤ４５．１総骨髄細胞と共にＣＤ４５．１被移植者（ｎ＝５〜６）に共移植した。
【００８８】
図２Ｂは、移植５カ月後（ｎ＝６）における、図２Ａの棒２によって代表される条件での培養細胞の多系統貢献を示す。上部パネルに示すデータは、移植５カ月後（図１Ａの棒２から）の１匹のマウスからの末梢血液単核細胞の代表的ＦＡＣＳプロットである。各四分画内の細胞のパーセントが示されている。図１Ａの棒２のマウスから得られた、Ｔリンパ様細胞、Ｂリンパ様細胞および骨髄細胞のパーセント再増殖データの概要が下部パネルにプロットされている。
【００８９】
ＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激した潜在的候補タンパク質を同定するために、無血清２９３Ｔ調整培地を質量分析で分析した。いくつかのタンパク質に由来するペプチドが同定された。７０ｋＤより小さいタンパク質を含有していた、２９３Ｔ細胞の無血清ＩＭＤＭベース調整培地の画分の質量分析で同定されたペプチドの部分的なリストを表１に示す。対照無血清ＩＭＤＭ試料と共通して見出されたタンパク質は示されていない。
【００９０】
【表１】
ここで明らかにするように、ＩＧＦＢＰ−２は無血清２９３Ｔ調整培地中に発現される。図３は、抗ヒトＩＧＦＢＰ−２ポリクロナール抗体で検出された、精製されたヒトＩＧＦＢＰ−２（陽性対照；レーン１）、無血清３Ｔ３調整培地（陰性対照；レーン２）および無血清２９３Ｔ調整培地（レーン３）のウエスタンブロット分析を示す。
【００９１】
精製されたＩＧＦＳＰ−２はＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。
【００９２】
ここで明らかにするように、ＩＧＦＢＰ−２はＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ３を含むＳＴＩＦ培地中（棒１および４）、５００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ−２を含む同じ培地中（棒２および５）、および２００ｎｇ／ｍｌ Ｔｉｍｐ−１を含む同じ培地中（棒３および６）で２０のＣＤ４５．２骨髄ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞を５日間培養した（図４Ａ参照）。その後、これらの細胞を１×１０５のＣＤ４５．１総骨髄細胞でＣＤ４５．１被移植者（ｎ＝５）に共移植した。移植の１カ月後または４カ月後における生着を図４Ａに示す。（＊棒４および６の値から有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【００９３】
１０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１（ＳＴＦ培地）、および１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ３を含む無血清培地中（棒１および４）、５００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ−２を含むＳＴＦ培地中（棒２および５）、ならびに５００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ−２および１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ３を含むＳＴＦ培地中（棒３および６）で、２０のＣＤ４５．２骨髄ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞を１０日間培養した（図４Ｂ参照）。その後、これらの細胞を１×１０５のＣＤ４５．１総骨髄細胞でＣＤ４５．１被移植者（ｎ＝６〜７）に共移植した。移植の１カ月後または４カ月後における生着を図４Ｂに示す。（＊および＊＊はそれぞれ棒４または棒５の値から有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【００９４】
図４Ｃは、１００ｎｇ／ｍｌの精製Ａｎｇｐｔｌ３および５００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−２を含有する無血清調整ＳＴＦ培地中で２１日間培養する前（左）および後（右）における、成体ＢＭ ＳＰ ＣＤ４５＋Ｓｃａ−１＋細胞の再増殖能力の限界希釈分析を示す。照射されたＣＤ４５．１近交系マウスに１×１０５のＣＤ４５．１ ＢＭ競合者細胞および１、５、２５もしくは１００の新たに単離されたＳＰ ＣＤ４５＋Ｓｃａ−１＋細胞（左；ｎ＝２４）または０．２、１、４もしくは１０のＳＰ ＣＤ４５＋Ｓｃａ−１＋細胞の培養子孫（右；ｎ＝２６）を注射した。１００の新たに単離されたＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞および４または１０の入力細胞の培養子孫はすべて、被移植者で再増殖した。これらのデータポイントはプロットされていない。注射された細胞の数に対する、移植４カ月後の有核末梢血細胞中に含有するＣＤ４５．２集団が１％未満である被移植者マウスのパーセントがプロットされている。
【００９５】
Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２の存在下におけるヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞の培養はＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を２５０倍超刺激する。
【００９６】
マウスＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を補助するのに、ＩＧＦＢＰ−２がＩＧＦ−２を置換できることは、驚くべき新知見であった。加えて、ＳＴＦ培地の存在下で、ＩＧＦＢＰ−２はヒト臍帯血ＨＳＣ ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増殖を２５０倍超促進した。
【００９７】
１×１０５のヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞の培養を無血清ＳＴＦ培地中、または５００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ５および５００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ−２を補充した無血清ＳＴＦ培地中で開始し、低Ｏ２環境（５％Ｏ２）で培養した。総細胞数を計数した。図５Ａに示す通り、総細胞数は、無血清ＳＴＦ培地またはＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有する無血清ＳＴＦ培地のいずれかにおいて、１１日間の培養の後に２００倍超増加した。
【００９８】
ＩＧＦＢＰ−２およびＡｎｇｐｔｌ５は、マウスモデルでヒト臍帯血細胞の生着およびキメリズムを促進する。
【００９９】
８０００または１５０００の非培養（新鮮）ヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞、またはＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含むか、もしくは含まない無血清ＳＴＦ培地中で１１日間培養された８０００の始原ＣＤ１３３＋細胞からの子孫を移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄におけるヒトキメリズムの量を測定した。８０００の非培養ＣＤ１３３＋細胞は、移植の２カ月後に、７匹の被移植者のうち１匹で生着でき、平均キメリズムは０．２％であった（図５Ｂ、レーン１）。１５０００の非培養ＣＤ１３３＋細胞は、増大したが、なお中程度の生着を示し、８匹のマウスのうち４匹の陽性生着があった（全細胞の平均キメリズム２．０％；図５Ｂ、レーン２）。著しく対照的に、Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含む無血清ＳＴＦ培地で培養した培養の後の２．１×１０６の細胞、すなわち、１１日間の培養の後の８０００の始原細胞の子孫はすべての被移植者マウスに生着し、８０００または１５０００の非培養細胞と比較して有意に増大したキメリズムを示した（平均３９．５％）（図５Ｂ、レーン４；ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含まないＳＴＦ培地中で培養された同じ数の始原細胞（８０００）の培養子孫（現在１．６×１０６細胞）は、それらの非培養対応物のものと同様に、乏しい生着しか示さなかった（図５Ｂ、レーン３）。したがって、Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２は、合成培地中のヒトＳＣＩＤ再増殖細胞（ＳＲＣ）のｅｘ ｖｉｖｏ増殖を補助する。各シンボルは、移植の２カ月後にアッセイされた単一の移植マウスにおける生着を表す（ｎ＝７〜８）。（＊レーン１〜３の値と有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【０１００】
図５Ｃは、非培養（新鮮）または培養ヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞を移植された代表的なマウスにおける、２カ月目のヒト造血生着を示す。（図５Ｂ）のレーン１によって代表される条件（新鮮）または（図５Ｂ）のレーン４によって代表される条件（培養）における、移植２カ月後の１匹のマウスからの骨髄細胞の代表的ＦＡＣＳプロット。各四分画内の細胞のパーセントが示されている。Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有する無血清ＳＴＦ培地中で培養された細胞での移植（図５Ｂのレーン４）は、非培養細胞を移植されたマウス（図５Ｂのレーン１）よりはるかに高い、ヒト総造血細胞（ＣＤ４５／７１＋）、骨髄細胞（ＣＤ１５／６６ｂ＋）、Ｂリンパ様細胞（ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋）および原始細胞（ＣＤ３４＋）の生着を示した。
【０１０１】
非培養細胞（図５Ｂレーン２）ならびにＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養された細胞（図５Ｂレーン４）を移植されたマウスの多系列生着の概要を図５Ｄに示す。８０００の細胞の子孫は、培養の後、移植の２カ月後に骨髄系統およびリンパ系統を再増殖させた。これは、ヒト幹細胞活性の増殖を実証するものである。非培養細胞を移植された一部のマウスは、ゼロパーセントのドナー再増殖を有していた。これらのデータポイントはプロットされていない。（＊値が非培養細胞の値と有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。図５Ｄは、非培養または培養ヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞を移植された代表的なマウスにおける、２カ月目のヒト造血生着を示す。８０００の細胞の子孫は、培養の後、移植の２カ月後に骨髄系統およびリンパ系統を再増殖させた。これは、ヒト幹細胞活性の増殖を実証するものである。
【０１０２】
培養ヒトＨＳＣの増殖
ＳＣＩＤ再増殖細胞（ＳＲＣ）の自己複製能を測定するために、非培養細胞（図５Ｂのレーン２）またはＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養された細胞（図５Ｂのレーン４）を移植された一次マウスから骨髄を収集し、それらを亜致死照射された二次被移植者に移植した。一次被移植者からの１本の後足からの骨髄液を２匹の二次被移植者に移植するのに用いた。移植の５〜８週間後に、二次ＮＯＤ／ＳＣＩＤ被移植者における多系列生着をアッセイした（ｎ＝１２のマウスが移植された）。非培養細胞は二次被移植者に生着できなかったが（示されていない）、培養細胞は、この場合も、二次移植の後に陽性生着を示した（図５Ｅ）。これらのデータは、最初の培養期間中におけるヒトＨＳＣの正味の増殖を示す。２つの独立した追加の実験によって、本明細書に記載の方法を用いて、ヒトＨＳＣが培養中に劇的に増殖したことが実証された。
【０１０３】
正常または低酸素濃度での培養の後に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞の限界希釈分析。
【０１０４】
ここに提供する培養系は、いくつかの独立した追加の実験で実証されたように、ヒトＳＲＣを劇的に増殖させる。１つの代表的実験では、２×１０５のヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞を、正常または低Ｏ２条件下に、５００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ５および１００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養した。総細胞数（図６Ａ）およびＣＤ３４＋細胞数（図６Ｂ）を計数した。１０日間の培養の後に、これら２通りの条件における総細胞数は有意に相違しておらず、両方とも２００倍超増加した（図６Ａ）。それにもかかわらず、５日間の培養の後には、より大きな数のＣＤ３４＋原始細胞が正常Ｏ２対低Ｏ２で観察された（図６Ｂ）。
【０１０５】
培養の前（図６Ｃ）および後（図６Ｄ）のＳＲＣ頻度を定量するために、限界希釈アッセイを行った。図６Ｂおよび６Ｃに実証されているように、１０日間の培養の後に、Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有する無血清ＳＴＦ培地中で、低Ｏ２または正常Ｏ２で培養されたＳＲＣの数は、それぞれ８倍または２０倍増加した。注射された入力細胞または入力等価物細胞の数に対する、移植の６〜８週間後に、被移植者マウス骨髄に含有されるヒト造血集団が１％未満である被移植者マウスのパーセントがプロットされている。正常Ｏ２または低Ｏ２で培養された１００００の入力細胞の子孫は、すべての被移植者で再増殖し、これらのデータポイント（ゼロパーセント陰性マウス）はプロットされていない。非培養ＣＤ１３３＋細胞のこの特定の試料の再増殖細胞の頻度（ＣＲＵ）は、６４０７５細胞あたり１である（平均の９５％信頼区間：１／２３９１９〜１／１７１６４３、ｎ＝２５）。すなわち、ポアソン統計から計算されるように、平均６４０７５の非培養ヒトＣＤ１３３＋細胞の注入が、移植マウスの６３％（＝１−１／ｅ）を再増殖させるのに十分である。Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で、低Ｏ２で細胞が培養された場合には、ＣＲＵ頻度は１／７８１４入力等価細胞であった（平均の９５％の信頼区間：１／３４３２〜１／１７７９１、ｎ＝２６）。これは、非培養細胞のものより約８倍大きい。驚いたことに、正常Ｏ２で細胞が培養された場合には、ＣＲＵ頻度が１／３２０９入力等価細胞にまで増大した（平均の９５％の信頼区間：１／１８８９〜１／５４５３、ｎ＝２７）。これは、機能的ＳＲＣの総数が約２０倍増加したことを示す。
【０１０６】
図６Ｅは、２００００の非培養ＣＤ１３３＋細胞（左パネル、ｎ＝８）または正常Ｏ２における、５０００の始原ＣＤ１３３＋細胞からの培養子孫（右パネル、ｎ＝１０）を移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ被移植者における多系列生着を示す。非培養細胞を移植されたいくつかのマウスはゼロパーセントドナー再増殖を有していた。これらのデータポイントはプロットされていない。全造血系統（カラム１および５、ＣＤ４５／７１＋）、骨髄系統（カラム２および６、ＣＤ１５／６６ｂ＋）、Ｂリンパ様系統（カラム３および７、ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋）および原始系統（カラム４および８、ＣＤ３４＋）が示されている。（＊値が非培養細胞の値と有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。図６Ｅに実証されているように、これらの培養細胞は、非培養細胞よりはるかに大きいレベルの多系列生着を有した。
【０１０７】
低酸素がヒトＳＲＣの増殖を改善することが示唆されている（Danetら、J ClinInvest、１１２巻、１２６〜３５頁（２００３年））。ここで明らかにするように、ＳＲＣの著しい増殖が低酸素条件で観察された。予想外に、ＳＲＣ増殖は、標準酸素圧下ではさらに大きかった。
【０１０８】
Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２の存在下で培養したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞も、ＳＲＣの増殖をもたらした（データは示されていない）。
【０１０９】
ヒトＨＳＣをｅｘ ｖｉｖｏ増殖させるためのＡｎｇｐｔｌｓおよびＩＧＦＢＰ−２の使用は、いまや合成培地中でヒトＨＳＣをｅｘ ｖｉｖｏ増殖できるので、骨髄移植用の臍帯血の臨床使用の増大を可能にする。ここに提供する技術は、ＨＳＣを用いた細胞および遺伝子治療の新規戦略の開発に有用であろう。
【０１１０】
アンジオポエチン２
競合的再構成分析
無血清調整ＳＴＩＦ培地中、または５００ｎｇ／ｍｌ精製ヒトアンジオポエチン１、ヒトアンジオポエチン２、マウスアンジオポエチン３もしくはヒトアンジオポエチン４を含有する同一培地中で、２０のＣＤ４５．２ドナー細胞を１０日間培養した。これらの細胞は、１×１０５の新たに単離したＣＤ４５．１競合者骨髄細胞と共に被移植者マウスに共移植した。その混合物を、事前に全量１０Ｇｙで照射されている６〜９週齢のＣＤ４５．１マウスの群のそれぞれに後眼窩経路で静脈内注射した。移植４カ月後の再構成を測定した。移植マウスの再構成を測定するために、移植後における、示された時間に末梢血を収集し、記載の通り（Zhang, C.C.およびLodish, H.F.、Blood、１０５巻、４３１４〜２０頁（２００５年））、リンパ様区画および骨髄区画内のＣＤ４５．１＋およびＣＤ４５．２＋細胞の存在を測定した。簡潔には、後眼窩出血によって末梢血細胞を収集し、それに続いて、赤血球を溶解し、抗ＣＤ４５．２−ＦＩＴＣと、抗ＣＤ４５．１−ＰＥ、抗Ｔｈｙ１．２−ＰＥ（Ｔリンパ様系統用）、抗Ｂ２２０−ＰＥ（Ｂリンパ様系統用）、抗Ｍａｃ−１−ＰＥ、抗Ｇｒ−１−ＰＥ（抗Ｍａｃ−１および抗Ｇｒ−１で共染色される細胞は骨髄系統であると考えられた）、 または抗Ｔｅｒ１１９−ＰＥ（赤血球系統用）モノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）とで染色した。図７に示す通り、アンジオポエチン２はＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。
【０１１１】
方法
マウス。Ｃ５７ ＢＬ／６ ＣＤ４５．２およびＣＤ４５．１マウスはＪａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙまたはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。ＮＯＤＩＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ １７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ動物設備で維持した。すべての動物実験は、Ｍ．Ｉ．Ｔ． 動物実験委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）の承認をもって行った。
【０１１２】
培地。無血清ＳＴＩＦ培地は、１０μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌマウスＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌマウスＩＧＦ−２（すべてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から）および１０ｎｇ／ｍｌヒトＦＧＦ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ無血清培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）である。無血清ＳＴＦ培地は、ＩＧＦ−２を含まない同一の培地である。示された量の精製Ａｎｇｐｔｌ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社からの贈与）、Ａｎｇｐｔｌ５（Ａｂｎｏｖａ社、台湾）またはＩＧＦＢＰ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加した。調整培地は、終夜培養の後に、集密的な２９３Ｔまたは３Ｔ３細胞から収集した。
【０１１３】
マウスＨＳＣ培養。８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．２マウスから単離された２０のＢＭ ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞を、示された培地１６０μｌと共に、Ｕ底９６ウェルプレート（３７９９；Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の１ウェルにプレーティングした。細胞は３７℃、５％ＣＯ２および正常Ｏ２で培養した。競合的移植の目的には、少なくとも６つの培養ウェルからの細胞をプールし、示された数の細胞を各マウスに移植する前に、競合者と混合した。
【０１１４】
ヒト細胞培養。ヒト総臍帯血単核細胞はＣａｍｂｒｅｘ社から購入した。細胞は、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ３またはＡｎｇｐｔｌ５を含むＳＴＩＦ培地１ｍｌあたり１×１０６細胞でプレーティングした。培地容積は、細胞密度を５×１０５〜１．５×１０６細胞／ｍｌに維持するために、５、８、１２、１５および１８日目に新たな培地を添加することによって増大した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２および正常Ｏ２で培養した。図５および６の実験で用いたヒト凍結保存臍帯血ＣＤ１３３＋細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ社およびＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。細胞は、示された培地２００μｌと共に、Ｕ底９６ウェルプレート（３７９９；Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の１つのウェルに１×１０４細胞／ウェルで２日間プレーティングした。３日目に、細胞を個々のウェルからプールして、５×１０４細胞／ｍｌで６ウェルプレートに移した。４および７日目に、細胞密度を２×１０５細胞／ｍｌ（４日目）または７×１０５／ｍｌ（７日目）に保つために、新たな培地を添加した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２、および正常Ｏ２または５％Ｏ２（低Ｏ２）レベルで培養した。
【０１１５】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ移植。ヒト総臍帯血単核細胞またはＣＤ１３３＋細胞の非培養または培養子孫を、示された日に収集し、亜致死照射された（３５０ラド）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに後眼窩経路で静脈内注射した。移植の６〜８週間後または示された時間に、移植された動物からの骨髄有核細胞を、フローサイトメトリーによって、ヒト細胞が存在するかどうか分析した。二次移植には、記載の通り（Hoganら、Proc Natl Acad Sci USA、９９巻、４１３〜８頁（２００２年））、一次被移植者の１本の後足からの骨髄液を用いて、２匹の二次被移植者に移植した。限界希釈実験におけるＣＲＵの計算は、Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて行った（Zhangら、ProcNatl Acad Sci USA、１０３巻、２１８４〜９頁（２００６年））。マウスは、マウス骨髄細胞の中に少なくとも１％（一次移植用）または０．１％（二次移植用）のＣＤ４５／７１＋ヒト細胞が検出された場合に、ヒトＨＳＣ移植において陽性であると考えられた。
【０１１６】
フローサイトメトリー。ドナー骨髄細胞は、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．２マウスから単離した。ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞は、Zhang, C.C.ら、Nat Med、１２巻、２４０〜５号（２００６年）に記載の通りに単離した。マウスＨＳＣの再増殖を分析するために、被移植者ＣＤ４５．１マウスの末梢血細胞を後眼窩出血によって収集し、それに続いて、赤血球を溶解し、抗ＣＤ４５．２−ＦＩＴＣと、抗ＣＤ４５．１−ＰＥ、抗Ｔｈｙ１．２−ＰＥ（Ｔリンパ様系統用）、抗Ｂ２２０−ＰＥ（Ｂリンパ様系統用）、抗Ｍａｃ−１−ＰＥ、抗Ｇｒ−１−ＰＥ（抗Ｍａｃ−１および抗Ｇｒ−１で共染色される細胞は骨髄系統であると考えられた）、または抗Ｔｅｒ１１９−ＰＥ（赤血球系統用）モノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）とで染色した。図１Ｂを除いたすべての図に示されている「パーセント再増殖」は、抗ＣＤ４５．２−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ４５．１−ＰＥの染色結果に基づいた。すべての場合で、多系列再構成を確認するために、上記に列挙した系統のＦＡＣＳ分析も行った。
【０１１７】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでヒト造血移植を分析するには、出版されているプロトコールに従った（Cashmanら、J. Exp Med、１９６巻、１１４１〜９頁（２００２年））。簡潔には、総ヒト造血（ＣＤ４５／７１＋）細胞集団、ならびにこの集団内における専ら顆粒球形成（ＣＤ１５／６６ｂ＋）細胞である部分集合を定量化するために、被移植者ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからの骨髄細胞を、抗ヒトＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ７１−ＰＥ、ＣＤ１５−ＦＩＴＣおよびＣＤ６６ｂ−ＦＩＴＣで染色した。ヒト前駆集団（ＣＤ３４＋）およびＢ系統集団（ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋）を定量化するために、細胞を抗ヒトＣＤ３４−ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ１９−ＰＥおよびＣＤ２０−ＰＥで染色した。図１の実験では、総ヒト造血（ＣＤ４５／７１＋）生着のみが測定された。抗ヒトＣＤ３４−ＦＩＴＣは、培養中のＣＤ３４＋細胞を定量化するのに用いた。すべての抗ヒト抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社から購入した。
【０１１８】
ＦＡＣＳ選別。ドナー骨髄細胞は、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．２マウスから単離した。ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞を選別するために、成体マウス骨髄ＳＰ細胞（以前の記載（Zhang, C.C.およびLodish, H.F.、Blood、１０３巻、２５１３〜２１頁（２００４年）；Zhang, C.C.およびLodish,H.F.、Blood、１０５巻、４３１４〜２０頁（２００５年）の通りに染色した）を、抗Ｓｃａ−１−ＰＥおよび抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣでさらに染色し、その後、ＭｏＦｌｏ（登録商標）ソーターで細胞選別を行った。
【０１１９】
競合的再構成分析。示された数のマウスＣＤ４５．２ドナー細胞を１×１０５の新たに単離されたＣＤ４５．１競合者骨髄細胞と混合し、その混合物を、事前に全量１０Ｇｙで照射されている６〜９週齢のＣＤ４５．１マウスの群のそれぞれに後眼窩経路で静脈内注射した。移植マウスの再構成を測定するために、移植後における、示された時間に末梢血を収集し、記載の通り（Zhang, C.C.およびLodish, H.F.、Blood、１０３巻、２５１３〜２１頁（２００４年）；Zhang, C.C.およびLodish,H.F.、Blood（２００５年））、リンパ様区画および骨髄区画内のＣＤ４５．１＋およびＣＤ４５．２＋細胞の存在を測定した。限界希釈実験におけるＣＲＵの計算は、Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア（ＳｔｅｘｎＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて行った。（Zhangら、ProcNatl Acad Sci USA、１０３巻、２１８４〜９頁（２００６年））。
【０１２０】
ウエスタンブロット。４〜１２％ＮｕＰａｇｅ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上での電気泳働によって、調整培地中の精製タンパク質または粗タンパク質を分析し、タンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングした。これらの膜を０．１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＧＦＢＰ−２ポリクロナール抗体（ＡＦ６７４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヤギ抗体でプロービングし、化学発光キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）によって検出した。
【０１２１】
本技術を特定の実施形態に関して詳細に示し、記述してきたが、当業者ならば、添付されている特許請求の範囲によって定義される本技術の趣旨および範囲から逸脱せずに、形態および詳細における様々な変化をそこに加えることができることが理解されるはずである。
【技術分野】
【０００１】
政府資金
この技術は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された交付金番号Ｒ０１ ＤＫ０６７３５６−０１、１ Ｋ０１ ＣＡ１２００９９−０１および０７５／Ｐ−ＩＲＦＴの下で、米国政府からの補助を受けて作られたものであり、米国政府は、本技術における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、増殖および分化を通して、すべてのリンパ球様細胞、骨髄細胞および赤血球細胞を生じる。したがって、多分化能ＨＳＣは、骨髄移植の基礎であり、多くの臨床状態への造血遺伝子治療の魅力的な標的細胞と考えられている。しかし、これらの重要な臨床適用は、動物から取得できるＨＳＣの数が少ないこと、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＳＣの培養、および後で患者に投与するためのＨＳＣの増殖が難しいことによって厳しく妨げられてきた。
【０００３】
造血幹細胞など、幹細胞の培養および増殖は、通常、幹細胞の生存および数の増加を可能にする未知因子の補充を必要とする。それらの未知因子は、未特定な一団の因子を分泌する支持細胞と共に幹細胞を共培養することによって供給でき、または未特定な血清産物を増殖培地中に添加することによって供給できる。そのような補充培地は、多くの未知因子を含有しており、したがって、化学的に特定されていない。
【０００４】
ｉｎ ｖｉｖｏで使用するため、とりわけヒトで使用するために幹細胞が調製されている場合、未知因子の存在は問題である。多くの場合において、未知因子は非ヒト供給源由来である（ウシ血清産物など）。非ヒト成分は、被移植者体内で免疫反応を引き起こしうる。または、未特定な成分には、プリオンまたはウイルスなど、幹細胞の被移植者に有害となる未検出の病原体が含まれうる。増殖させる細胞の多分化能を維持しながら、既知組成培地中におけるヒトＨＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏ増殖を可能にする方法および組成物が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
造血幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させるための合成培地（definedculture ｍｅｉｕｍ）をここに提供する。この合成培地は、相互に協力してヒトＨＳＣの増殖を刺激する特定の複数の成長因子を含有する。驚いたことに、本明細書で明らかにするように、形質移入されていない２９３Ｔ細胞によって産生されたある因子がヒトＨＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を促進した。その因子がインスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）であることをここに示す。外因性ＩＧＦＢＰ−２が有する、様々なＩＧＦ依存性細胞培養系における細胞増殖への抑制作用（Hoeflichら、Canc.Res.、６１巻、８６０１〜８６１９頁（２００１年））を鑑みると、ＩＧＦＢＰ−２がヒト造血幹細胞の増殖を促進するという新知見は予想外である。
【０００６】
本明細書で明らかにするように、ＩＧＦＢＰ−２は、１または複数種のＡｎｇｐｔｌタンパク質との組合せで、合成培地中におけるヒトＨＳＣの増殖を促進する。一部の実施形態では、合成培地中で、ヒトＨＳＣが２５０倍以上に増殖する。
【０００７】
一部の実施形態では、ヒトＨＳＣを増殖させる方法は、合成培地中でヒト細胞をインキュベートするステップを含む。合成培地は、ＩＧＦＢＰ−２およびアンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）を含みうる。一部の実施形態では、合成培地は、ＩＧＦＢＰ−２、Ａｎｇｐｔｌ５、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含みうる。一部の実施形態では、この方法は、合成培地中で５日間ヒト細胞をインキュベートするステップを含む。
【０００８】
一部の実施形態では、ヒト細胞は初代ヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる細胞を少なくとも１つ含有している。一部の実施形態では、ヒト細胞は造血幹細胞を少なくとも１つ含有している。
【０００９】
一部の実施形態では、ヒト細胞は、ＣＤ１３３およびＣＤ３４からなる群から選択された表面マーカーを発現する細胞として、インキュベートされる前に選択されたものである。
【００１０】
造血幹細胞を個体に投与する方法も提供する。一部の実施形態では、その方法は、個体またはドナーからヒト細胞を得るステップを含む。一部の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも１つが、１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる。細胞は、ここで提示するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖する。一部の実施形態では、ＩＧＦＢＰ−２と、アンジオポエチン２またはＡｎｇｐｔｌからなる群から選択された成長因子とを含む合成培地中で細胞をインキュベートする。インキュベートされた細胞は、その後、個体に投与する。
【００１１】
患者を治療する方法であって、個体にＩＧＦＢＰ−２およびＡｎｇｐｔｌを投与するステップを含む方法を提供する。
【００１２】
ここに記載の通りに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた造血幹細胞も提供する。
【００１３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト造血幹細胞を増殖させるための培地およびキットも提供する。一部の実施形態では、キットは、造血幹細胞を培養するのに適した合成培地と、単離されたＩＧＦＢＰ−２と、アンジオポエチン２またはＡｎｇｐｔｌからなる群から選択された別の成長因子とを含む。成長因子は、別々の成分として提供することも、カクテルとして提供することも、既にＨＳＣ成長培地と混合された状態で提供することもできる。
【００１４】
加えて、造血幹細胞を含めた、培養中の幹細胞を、細胞を増殖させるのに十分な条件の下において、アンジオポエチン２などのアンジオポエチンを有効な量含有する培地中で、幹細胞を含有する細胞の集団を培養することによって増殖させる方法も提供する。アンジオポエチンに特異的に結合する単離された造血幹細胞も提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで造血幹細胞を増殖させるための培地およびキットも提供する。培地およびキットは、アンジオポエチン２などのアンジオポエチンと、造血幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させるための説明書とを含む。
【００１５】
ここに提供した方法および組成物の結果として、多分化能を維持しながら、ヒトＨＳＣを合成培地中で増殖させることができる。これらの細胞は、研究で使用するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることもでき、または、後で個体に投与するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させること（本明細書ではｅｘ ｖｉｖｏ増殖とも呼ばれる）もできる。
【００１６】
ここに記載した様々な実施形態は、相補的でありえ、ここに含まれている教示に鑑みて、当業者によって理解される方法で組み合わせるか、または併用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】Ａｎｇｐｔｌ５（四角）またはＡｎｇｐｔｌ３（菱形）の存在下における総ヒト臍帯血細胞の培養物の総細胞数対日数を示す図である。
【図１Ｂ】１×１０６の非培養ヒト単核臍帯血細胞（カラム１）、またはＡｎｇｐｔｌ５（カラム２）もしくはＡｎｇｐｔｌ３（カラム３）を足した無血清ＳＴＩＦ中で培養された１×１０６の初期ヒト臍帯血細胞の子孫を移植された、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄におけるヒトキメリズムの量を示す図である。各シンボルは、移植の２カ月後にアッセイされた単一の移植マウスにおける生着を表す（ｎ＝５〜１２）。（＊レーン１の値から有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．００１）。
【図２Ａ】１０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−２および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１を補充した無血清ＩＭＤＭ中（棒１）、または２９３Ｔ細胞から新たに収集した調整培地中（棒２）、または凍結／解凍した後の同じ調整培地中（棒３）で培養した後のマウスＨＳＣを用いたパーセント再増殖を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】上部パネルが、図２Ａの棒２によって代表された状態からの培養細胞を受け取った、マウスの骨髄系統およびリンパ系統における、移植５カ月後の再増殖の代表的なＦＡＣＳ分析および棒グラフを示し、下部パネルが、図２Ａの棒２によって代表される状態からの培養細胞を受け取った６匹のマウスから得られた、Ｔリンパ様細胞（棒１）、Ｂリンパ様細胞（棒２）および骨髄細胞（棒３）のパーセント再増殖データの概要を示す図である。
【図３】ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで分離し、抗ＩＧＦＢＰ−２抗体でプロービングした、ＩＧＦＢＰ−２（レーン１）、無血清３Ｔ３調整培地（レーン２）および無血清２９３Ｔ調整培地（レーン３）のウエスタンブロットを示す図である。
【図４Ａ】Ａｎｇｐｔｌ３を足したＳＴＩＦ培地中（カラム１および４）、Ａｎｇｐｔｌ３およびＩＧＦＢＰ−２を足したＳＴＩＦ培地中（カラム２および５）Ａｎｇｐｔｌ３およびＴｉｍｐ−１を足したＳＴＩＦ培地中（カラム３および６）で培養した後のマウスＨＳＣをマウスに生着させた１カ月後（左パネル）および４カ月後（右パネル）のパーセント再増殖を示す図である。
【図４Ｂ】Ａｎｇｐｔｌ３を足したＳＴＦ培地中（カラム１および４）、ＩＧＦＢＰ−２を足したＳＴＦ培地中（カラム２および５）、Ａｎｇｐｔｌ３およびＩＧＦＢＰ−２を足したＳＴＦ培地中（カラム３および６）で培養した後のマウスＨＳＣをマウスに生着させた１カ月後（左パネル）および４カ月後（右パネル）のパーセント再増殖を示す図である。
【図４Ｃ】１００ｎｇ／ｍｌの精製Ａｎｇｐｔｌ３および５００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−２を含有する調整ＳＴＦ培地中で２１日間培養する前（左）および後（右）における、成体ＢＭ ＳＰ ＣＤ４５＋Ｓｃａ−１＋細胞の再増殖能力の限界希釈分析を示す図である。
【図５Ａ】Ａｎｇｐｔｌ５を含有するＳＴＦ培地中（四角）、またはＳＴＦ培地中（菱形）で培養したヒトＨＳＣの、時間（日）経過における細胞数を示す図である。
【図５Ｂ】８０００の新たな細胞（カラム１）、１５０００の新たな細胞（カラム２）、ＳＴＦ培地中で培養した８０００の細胞（カラム３）、またはＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２ＳＴＦを含有する培地中で培養した８０００の細胞（カラム４）による％再増殖を示す図である。
【図５Ｃ】非培養（新鮮）または培養ヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞を移植された代表的なマウスにおける、２カ月目のヒト造血生着のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５Ｄ】非培養細胞を移植されたマウス（左パネル）およびＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養された細胞を移植されたマウス（右パネル）から得られた、ヒト骨髄細胞（ＣＤ１５／６６ｂ＋、カラム１、４）、Ｂリンパ様細胞（ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋、カラム２、５）および原始細胞（ＣＤ３４＋、カラム３、６）での％再増殖を示す多系列生着データの概要を示す図である。
【図５Ｅ】Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養され細胞（図５Ｂのレーン４）を移植され、亜致死放射線照射された二次被移植者体内に移植された、一次マウスからの骨髄を移植された二次被移植者の、ヒト総造血細胞（ＣＤ４５／７１＋、カラム１）、骨髄細胞（ＣＤ１５／６６ｂ＋、カラム２）、Ｂリンパ様細胞（ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋、カラム３）および原始細胞（ＣＤ３４＋、カラム５）での％再増殖を示す図である。
【図６Ａ】低レベルのＯ２（菱形）および正常レベルのＯ２（四角）内で培養された、Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中における、２×１０５のヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞の、時間経過における総細胞数を示す図である。
【図６Ｂ】低レベルのＯ２（菱形）および正常レベルのＯ２（四角）内で培養された、Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養されたヒトＨＳＣについての、時間経過における、ＣＤ３４＋原始細胞の数を示す図である。
【図６Ｃ】培養前の細胞の再増殖能力の限界希釈分析を示す図である。
【図６Ｄ】低レベルのＯ２（四角）および正常レベルのＯ２（菱形）内で、５００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇｐｔｌ５および１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で１０日間培養した後の細胞の再増殖能力の限界希釈分析を示す図である。
【図６Ｅ】２００００の非培養ＣＤ１３３＋細胞（左パネル、ｎ＝８）または正常Ｏ２における、５０００の初期ＣＤ１３３＋細胞からの培養子孫（右パネル、ｎ＝１０）を移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ被移植者における多系列生着を示す図である。
【図７】１×１０５のＣＤ４５．１骨髄細胞と共に、アンジオポエチン２含有ＳＴＩＦ培地中で培養された２０のＣＤ４５．２骨髄ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞でＣＤ４５．１被移植者（ｎ＝４〜５）に移植された４カ月後のパーセント再増殖を示す棒グラフである。
【図８】例示的アンジオポエチン様タンパク質のアミノ酸配列である配列番号３〜６を示す図である。
【図９】例示的アンジオポエチン２タンパク質のアミノ酸配列である配列番号１と、例示的ＩＧＦＢＰ−２タンパク質のアミノ酸配列である配列番号２とを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
造血幹細胞（ＨＳＣ）を増殖させる（propagating and/or expanding）方法と、これらの方法で産生したヒトＨＳＣとを提供する。一部の実施形態では、ヒトＨＳＣを合成培地中で増殖させる。ここに提供の方法の結果として、培養細胞内に通常存在している未知因子または夾雑物を含まないｅｘ ｖｉｖｏ増殖させたヒトＨＳＣが利用可能となっている。
【００１９】
培地
本明細書に記載の通り、適した細胞は、合成培地（本明細書では、既知組成培地とも呼ぶ）中でインキュベートされる。合成培地または既知組成培地は、培地中に存在するあらゆる構成成分およびそれらの量が既知である、細胞を培養するための栄養培地を指す。一部の実施形態では、培地は液体である。他の実施形態では、培地は、錠剤もしくは粉末などの固体物質、またはゲルなどの半固体物質でありうる。さらに他の実施形態では、培地は、メッシュおよび多孔性ビーズなどの固体構造を含有する液体でありうる。合成培地は、ダルベッコのＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５（Ｃａｍｂｒｅｘ社）、ＲＰＭＩ−１６４０およびＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）など、構成成分のベース混合物を含みうる。ヘパリン、血清アルブミン、インスリンおよびトランスフェリンなど、またはそれらの組合せなど、既知量の他の構成成分をベース混合物に補充することができる。一部の実施形態では、１０μｇ／ｍｌヘパリンを培地に補充する。添加される成分は、例えば、ヒト、ウシおよびマウス源を含めた、任意の適した動物源から得られたものでありうる。例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎは、ウシ血清アルブミン、ヒトインスリンおよびヒトトランスフェリンを補充したＩＭＤＭを含む。添加される構成成分および成長因子は、生物源（組織、血清または調整培地など）から単離することもでき、組換え産生させることもできる。組換え体成長因子および他の構成成分を産生するのに適した宿主には、例えば細菌、酵母または細胞培養が含まれる。細胞培養は、例えば、昆虫細胞培養または哺乳動物細胞培養でありうる。成長因子は、グリコシル化されたものでありうる。一部の実施形態では、成長因子は、天然に存在する成長因子と同じ様式、または実質的に同じ様式でグリコシル化されている。本明細書に記載の成長因子または他の添加構成成分は、例えば、マウス、非ヒト霊長類およびヒトを含めた任意の適した動物からのものでありうる。
【００２０】
「単離された」または「精製された」構成成分または成長因子は、産生されたとき（例えば、生物源によって、または形質移入細胞内での発現など、組換え法によって産生されたとき）にそれが共在している他の物質を実質的に含まない。一部の実施形態では、単離されたとは、構成成分または成長因子が、産生されたときに共在している他の物質の０．１％未満、０．０１％未満または０．００１％未満が存在していることを意味する。別の実施形態では、合成培地は無血清である。
【００２１】
本明細書に記載のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する、成長因子の例示的配列は、これによって参照により本明細書に組込まれているものとする。
【００２２】
ＩＧＦＢＰ−２
一部の実施形態では、合成培地は、単離されたインスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）を含有する。ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）は、ＩＧＦ受容体と同じかそれを超える親和性でＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に結合する循環タンパク質のファミリーである。ＩＧＦＢＰ−２は、様々なＩＧＦ依存細胞培養系における細胞増殖への阻害作用を有することでも知られている（Hoeflichら、Canc. Res.６１巻、８６０１〜８６１９頁（２００１年））。驚いたことに、本明細書に明らかにするように、ＩＧＦＢＰ−２は、ヒトＨＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に正の効果を有する。
【００２３】
例示的ＩＧＦＢＰ−２タンパク質配列は、例えば、受託番号ＡＡＡ３６０４８（ヒトインスリン様成長因子結合タンパク質２；配列番号２、図９）としてＧｅｎＢａｎｋで提示されている。ＩＧＦＢＰ−２に加えて、適したＩＧＦＢＰ−２には、天然に存在するアミノ酸配列内に変化を有するタンパク質および／またはポリペプチドが含まれ、改変配列が天然ＩＧＦＢＰ−２の少なくとも何らかの機能的能力を保持することを、当業者はさらに理解するであろう。適した改変には、保存性アミノ酸変化（例えば、あるアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換すること）と共に、非必須アミノ酸残基に加える変化またはそれらの除去が含まれる。
【００２４】
適したＩＧＦＢＰ−２は、配列番号９と少なくとも６０％の配列同一性を共有する。他の実施形態では、適したＩＧＦＢＰ−２は、配列番号９またはその生理活性部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を共有する。
【００２５】
ＩＧＦＢＰ−２の適した類似体には、望ましい活性を保持する断片および関連分子が含まれる。ＩＧＦＢＰ−２の対応する受容体に結合し、かつＩＧＦＢＰ−２受容体への結合に伴う１つまたは複数の生物学的作用を開始できる分子も、本明細書に提示の技術（例えば、方法、ＨＣＳ、培地およびキット）の範囲内にある。
【００２６】
アンジオポエチン様タンパク質
１または複数種のアンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）は、構造がアンジオポエチンに類似している分泌性糖タンパク質のファミリーの任意のメンバーでありうる（Oikeら、Int. J. Hematol.、８０巻、２１〜８頁（２００４年））。Ａｎｇｐｔｌタンパク質は、Ｎ末端コイルドコイルドメインと、Ｃ末端フィブリノゲン様ドメインとを含有している。アンジオポエチンとは異なり、Ａｎｇｐｔｌタンパク質は、チロシンキナーゼ受容体Ｔｉｅ２に結合しない。Ａｎｇｐｔｌタンパク質には、Ａｎｇｐｔｌ １、２、３、４、５、６および７が含まれる。Ａｎｇｐｔｌタンパク質には、ミクロフィブリル関連糖タンパク質４（Ｍｆａｐ４）ならびにその類似体および等価物が含まれる。Ａｎｇｐｔｌ２は、Kim,I.ら、J Biol Chem、２７４巻、２６５２３〜８頁（１９９９年）によって記載されている。加えて、Ａｎｇｐｔｌタンパク質は、商業的に取得可能である（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐ社）。一実施形態では、ＡｎｇｐｔｌはＡｎｇｐｔｌ３である。別の実施形態では、ＡｎｇｐｔｌはＡｎｇｐｔｌ５である。
【００２７】
例示的Ａｎｇｐｔｌタンパク質は、例えば、受託番号ＡＡＨ１２３６８（ヒトＡｎｇｐｔｌ１：配列番号３；ヒトＡｎｇｐｔｌ２前駆体；配列番号４）、受託番号ＡＡＨ５８２８７（ヒトＡｎｇｐｔｌ３前駆体；配列番号５）、受託番号ＡＡＨ２３６４７（ヒトＡｎｇｐｔｌ４；配列番号６）および受託番号ＡＡＨ４９１７０（ヒトＡｎｇｐｔｌ５；配列番号７）としてのＧｅｎＢａｎｋで提示されている。配列番号３〜７を図８に示す。他の適したＡｎｇｐｔｌタンパク質は、配列番号３〜７のうちのいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を共有するものである。他の実施形態では、適したＡｎｇｐｔｌタンパク質は、配列番号３、４、５、６または７などの例示的Ａｎｇｐｔｌ配列またはその生理活性部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を共有する。Ａｎｇｐｔｌ７の例示的配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＨ０１８８１に見出される。Ｍｆａｐ４の例示的配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２３９５に見出される。
【００２８】
Ａｎｇｐｔｌｓについて上記に提示した配列に加えて、当業者は、適したＡｎｇｐｔｌに、天然に存在するアミノ酸配列内に変化を有するタンパク質および／またはポリペプチドが含まれ、改変配列が天然Ａｎｇｐｔｌの少なくとも何らかの機能的能力を保持することをさらに理解するであろう。適した改変には、保存性アミノ酸変化（例えば、あるアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換すること）と共に、非必須アミノ酸残基に加える変化またはそれらの除去が含まれる。
【００２９】
Ａｎｇｐｔｌの適した類似体には、望ましい活性を保持する断片および関連分子が含まれる。例えば、Ａｎｇｐｔｌの適した類似体は、コイルドコイルドメインを含有するアンジオポエチン様タンパク質の断片である。例えば、アンジオポエチン様タンパク質のコイルドコイルドメイン。別の類似体は、フィブリノゲン様ドメインである。コイルドコイルドメインおよびフィブリノゲン様ドメインなどの、Ａｎｇｐｔｌの断片は、完全長タンパク質と比較して、発現および精製するのが、より容易でありうる。Ａｎｇｐｔｌの対応する受容体に結合し、かつＡｎｇｐｔｌ受容体への結合に伴う１つまたは複数の生物学的作用を開始できる分子も、本明細書に提示の技術の範囲内にある。
【００３０】
アンジオポエチン２
一部の実施形態では、合成培地はアンジオポエチン２を含有する。例示的アンジオポエチン２タンパク質配列は、例えば、受託番号ＮＰ＿００１１３８（ヒトアンジオポエチン２；配列番号１、図９）としてＧｅｎＢａｎｋに提示されている。加えて、当業者は、適したアンジオポエチン２に、天然に存在するアミノ酸配列内に変化を有するタンパク質および／またはポリペプチドが含まれ、改変配列が天然アンジオポエチン２の少なくとも何らかの機能的能力を保持することをさらに理解するであろう。適した改変には、保存性アミノ酸変化（例えば、あるアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換すること）と共に、非必須アミノ酸残基に加える変化またはそれらの除去が含まれる。
【００３１】
適したアンジオポエチン２は、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を共有する。他の実施形態では、適したアンジオポエチン２は、配列番号１またはその生理活性部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を共有する。
【００３２】
アンジオポエチン２の適した類似体には、望ましい活性を保持する断片および関連分子が含まれる。アンジオポエチン２の対応する受容体に結合し、かつアンジオポエチン２受容体への結合に伴う１つまたは複数の生物学的作用を開始できる分子も、本明細書に提示の技術の範囲内にある。
【００３３】
他の成長因子
ＩＧＦＢＰ−２、アンジオポエチン２、または１もしくは複数種のＡｎｇｐｔｌに加えて、本技術の方法で造血幹細胞の増殖を促進するのに有用な他の成長因子またはサイトカインには、１または複数種の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン成長因子、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）が含まれうる。したがって、別の実施形態では、培地は、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＴＰＯおよびＳＣＦ、またはそれらの類似体および等価物のうちの少なくとも２つを含有する。それらの等価物は、野生型または組換え産生されたサイトカインとしてのこれらの因子（すなわち、ＦＧＦ、ＴＰＯ、ＩＧＦおよびＳＣＦ）に類似の生物活性を有する分子が含まれる。類似体には、望ましい活性を保持する断片および関連分子が含まれる。例えば、ＴＰＯはｍｐｌ受容体のリガンドであり、したがって、ｍｐｌ受容体に結合し、ｍｐｌへのＴＰＯ結合に伴う１つまたは複数の生物学的作用を開始できる分子も、本技術の範囲内にある。ＴＰＯミメティックの一例は、Cwirlaら、Science、２７６巻、１６９６頁（１９９７年）に見出される。
【００３４】
サイトカインおよび成長因子は、例えば、Ａｍｇｅｎ社（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）およびＩｍｍｕｎｅｘ社（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）など、いくつかの供給業者から購入できる。
【００３５】
上述のように、サイトカインまたは成長因子の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍＬから約１．０μｇ／ｍＬまでの範囲にある。別の実施形態では、約１ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍＬまでの因子が使用される。別の実施形態では、約１０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌまでの因子が使用される。成長因子の他の有用な濃度は、本明細書に含まれている教示を用いて、当業者が容易に決定できる。
【００３６】
別の実施形態では、培地中に、ＦＧＦ−１、ＴＰＯおよびＳＣＦも含有されている。別の実施形態ではＳＣＦが１０ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯが２０ｎｇ／ｍｌ、ＦＧＦ−１が１０ｎｇ／ｍｌで存在している。別の実施形態では、培地中に、ＩＧＦ−２、ＦＧＦ−１、ＴＰＯおよびＳＣＦも含有されている。成長因子またはサイトカインの他の有用な濃度は、本明細書に含まれている教示を用いて、当業者が容易に決定できる。
【００３７】
本明細書に記載の通り、所与のアミノ酸配との同一性または相同性は、２つの配列間の同一性パーセントとして決定できる。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージ内で提供されているＧＡＰなどのコンピュータープログラムによるものなど、当技術分野で知られている方法を用いて決定できる（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ用プログラムマニュアル、バージョン８、１９９４年８月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ ５３７１１）（Needleman, S. B.およびWunsch, C. D.（１９７０年）、Journal of Molecular Biology、４８巻、４４３〜４５３頁）。
【００３８】
造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養
細胞
培養する１または複数の細胞には、１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる任意の細胞が含まれうる。例示的な血液細胞型には、貪食免疫細胞（例えば顆粒球）、単球（例えばマクロファージ前駆細胞）、マクロファージ、好酸球、赤血球、血小板形成細胞（例えば巨核球）、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。適した細胞には、個体またはドナーから得られた初代細胞が含まれる。適した細胞は、自己複製できるもの、すなわち、数を増やしまたは増大でき、かつ親細胞と同じ発生段階のままでいられるものでもありうる。
【００３９】
適した細胞は、例えば、限定されるものではないが、骨髄、末梢血、動員末梢血（ＭＰＢ）、胎児肝および臍帯血を含めた、造血幹細胞の任意の既知供給源から単離できる。臍帯血について、例えば、Issaragrishiら、N.Engl.J.Med.、３３２巻、３６７〜３６９頁（１９９５年）で論じられている。骨髄細胞は、限定されるものではないが、腸骨（例えば寛骨から腸骨稜を経て）、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨小腔を含めた、骨髄供給源から得ることができる。幹細胞の他の供給源には、ＥＳ細胞、胚卵黄嚢、胎児肝および胎児脾臓が含まれるが、これらに限定されない。個体またはドナーから細胞を得る方法は当技術分野でよく知られている。
【００４０】
骨髄を単離するには、許容できる緩衝剤と共に、限定されるものではないが、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）または他の天然に存在する因子を任意選択で補充した塩溶液を含めた、適切な溶液を用いて、骨を洗い流すことができる。一実施形態では、緩衝剤は低濃度であり、通常約５から約２５ｍＭまでである。好都合な緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝剤および乳酸緩衝剤が含まれるが、これらに限定されない。骨髄は、従来の技法に従って、骨から吸引することもできる。
【００４１】
本技術の適した細胞および造血細胞は、造血幹細胞が存在する任意の動物から得ることができる。適した動物には、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコおよびマウスなどが含まれる。一実施形態では、細胞はヒト細胞であり、さらに別の実施形態では、細胞はマウス細胞である。
【００４２】
候補ヒト造血幹細胞集団の長期生着能に関する動物モデルには、非肥満糖尿病／重症複合免疫不全症マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）モデル、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨モデル（Kyoizumiら（１９９２年）、Blood、７９巻、１７０４頁；Murrayら（１９９５年）、Blood、８５（２）巻、３６８〜３７８頁）および子宮内ヒツジモデル（Zanjaniら（１９９２年）、J.Clin. Invest.、８９巻、１１７９頁）が含まれる。ヒト造血の動物モデルに関する総説には、Srourら（１９９２年）、J. Hematother.、１巻、１４３〜１５３頁およびそれに引用されている参考文献を参照されたい。幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、５〜８週間後に間質共培養で産生されるコロニー形成性細胞の数の限界希釈分析に基づいた長期培養開始細胞（ＬＴＣＩＣ）アッセイである（Sutherlandら（１９９０年）、Proc.Nat'l Acad. Sci.、８７巻、３５８４〜３５８８頁）。ＬＴＣＩＣアッセイは、別の一般的に使用される幹細胞アッセイである敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）アッセイ、およびｉｎ ｖｉｖｏでの長期生着能と相関していることが示されている（Breemsら（１９９４年）、Leukemia、８巻、１０９５頁）。
【００４３】
本明細書で使用される場合、増殖（expansion or propagation）には、細胞数の任意の増大が含まれる。増殖には、例えば、培養を開始するのに使用される細胞集団内に存在するＨＳＣの数を超える、造血幹細胞の数の増大が含まれる。ここで提供する方法は、造血幹細胞などの既存細胞の生存の増大を提供する。生存という用語は、生きているまたは機能している状態を継続する能力を指す。
【００４４】
ここで提供する方法は、内皮前駆細胞（Shi、Q.ら（１９９８年）、Blood.、９２巻、３６２〜３６７頁）、骨髄間質幹細胞（Owen,M.（１９８８年）、J. Cell Science、補１０巻、６３〜７６頁）、間充織幹細胞（Pittenger, M.F.およびMarshak, D.R.（２００１年）、Marshak,D.R.、Gardner, D.K.およびGottlieb, D.編集、Cold Spring Harbor, New York、Cold SpringHarbor Laboratory Press社、３４９〜３７４頁）および骨格筋幹細胞（Gussoni, E.ら（１９９９年）、Nature、４０１巻、３９０〜３９４頁）、胚幹細胞および他のものなど、他のタイプ成体幹細胞を含めた、アンジオポエチン２および／またはアンジオポエチン様タンパク質および／またはＩＧＦＢＰの存在下で増殖する任意の幹細胞の増殖を刺激するのに使用できる。別の実施形態では、幹細胞は、ＨＳＣと同じ前駆体−血管芽細胞−を共有すると考えられている内皮前駆細胞である。
【００４５】
ここで提供する方法では、細胞の亜集団も使用できる。例えば、骨髄または他の供給源から得られた精製「サイドポピュレーション」（ＳＰ）細胞を使用できる。ＨＳＣの他の濃縮集団も使用できる。ＨＳＣの濃縮集団を単離する方法は、当技術分野で知られており、例えば、ＳＰ細胞を取得する方法は、Goodellら、J. Exp. Med.、１８３巻、１７９７〜８０６頁（１９９６年４月１日）に記載されている。
【００４６】
加えて、幹細胞が濃縮された細胞亜集団も、ここに記載の方法で使用できる。細胞集団からの幹細胞の分離は、細胞選別（例えば蛍光活性化細胞選別）、磁性ビーズおよび充填カラムを含めた、多数の方法によって行える。これらの方法は通常、幹細胞に特徴的な特定の細胞表面マーカーの存在および／または分化細胞に特徴的な特定な細胞表面マーカーの不在に依存している。これらの方法は、細胞集団の生着または分化能を測定する機能アッセイに依存するものでもありうる。そのようなマーカーおよび機能アッセイは当技術分野で知られている。
【００４７】
幹細胞の濃縮の例は、米国特許第５０６１６２０号に記載の通り、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋ＬＩＮ−表現型を有するものとして選択された細胞集団である。この表現型の集団は通常、約１／２０の平均ＣＡＦＣ頻度を有する（Murrayら（１９９５年）同上；Lansdorpら、J. Exp. Med.、１７７巻、１３３１頁（１９９３年））。造血幹細胞の高濃縮集団を単離する方法は、米国特許出願第５，６８１，５５９号に提供されている。
【００４８】
本明細書に記載の通り、造血幹細胞は、赤血球、ならびにリンパ様細胞および骨髄細胞を含めた白血球を含めた、いくつかのタイプの血液細胞のいずれにも分化する能力を有する。本明細書に記載の通り、ＨＳＣには、ｉｎ ｖｉｖｏにおける長期生着能を有する造血細胞が含まれる。長期生着能（例えば長期造血幹細胞）は、動物モデルまたはｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いて測定できる。
【００４９】
細胞は、ここで提供する方法に従って培養する前に、例えば血液細胞系統の幹細胞または未成熟細胞を濃縮したものでありうる。幹細胞が高度に濃縮されている細胞集団およびそれらを得る方法は、国際公開第９５／０５８４３号；国際公開第９５／０３６９３号および国際公開第９５／０８１０５号に記載されている。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は、造血幹細胞が実質的に濃縮されている細胞の集団を含む。他の実施形態では、ここで提供する方法による培養細胞は、間質細胞を実質的に含まない。
【００５０】
一部の実施形態では、ここで提供する方法で使用される細胞は、細胞表面における特定のマーカーが存在または不在であるものとして選択され、またはそれについて濃縮される。例えば、一部の実施形態では、細胞は、一次組織の動物源に特有な幹細胞マーカーが存在するものとして選択される。他の実施形態では、細胞は、系統特異的マーカーが不在であるものとして選択される。一部の実施形態では、細胞は、特定のマーカーが存在し、かつ他のマーカーが不在であるものとして選択される。特定のマーカーを有する細胞、または特定のマーカーを有しない細胞を単離する方法は当業者によく知られている。
【００５１】
系統特異的マーカーに関して、系統特異的マーカーの不在または低レベル発現は、系統特異的マーカーに特異的な抗体の結合の欠如によって特定できる。ここで提供する方法で使用するための細胞または細胞供給源は、ネガティブ選択技法にかけて、系統特異的マーカーであると発現する細胞を除去し、系統陰性（「Ｌｉｎ−」）である細胞を維持することができる。Ｌｉｎ−は通常、Ｔ細胞（ＣＤ２、３、４および８など）、Ｂ細胞（Ｂ２２０、ＣＤ４８、ＣＤ１０、１９および２０など）、骨髄細胞（Ｍａｃ−１、Ｇｒ−１、ＣＤ１４、１５、１６および３３など）、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞（ＣＤ２４４、ＣＤ２、１６および５６など）、ＲＢＣ（Ｔｅｒｉ１９およびグリコホリンＡなど）、巨核球（ＣＤ４１）、肥満細胞、好酸球または好塩基球に関連するものなどのマーカーが欠如している細胞を指す。ネガティブ選択の方法は当技術分野で知られている。系統特異的マーカーには、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ７１が含まれる。
【００５２】
最初に特定の系統の細胞または特定の表現型を有する細胞を除去することによって、細胞を分離する様々な技法を利用できる。分離の手順には、物理的分離と、磁力分離（抗体でコーティングされた磁性ビーズを用いる）と、アフィニティクロマトグラフィーと、モノクローナル抗体に連結されるか、またはモノクローナル抗体と共に併用される、限定されるものではないが、補体および細胞毒を含めた細胞毒性薬剤と、固体基質、例えばプレートに付着した抗体を用いる「パニング」と、エルトリエーションまたは任意の他の好都合な技法とが含まれうるが、これらに限定されない。正確かつ迅速な分離を提供する技法には、フローサイトメトリー（例えば蛍光活性化細胞選別）およびサイトスピンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
物理的分離技法の使用には、物理特性（密度勾配遠心および対流遠心エルトリエーション）、細胞表面特性（レクチンおよび抗体親和性）、および生体染色特性（ミトコンドリア結合色素ｒｈｏ１２３およびＤＮＡ結合色素ヘキスト３３３４２）の相違に基づくものが含まれるが、これらに限定されない。これらの手順は、この技術分野の当業者によく知られている。
【００５４】
上述の通り、造血幹細胞の濃縮を用いて、または用いずに得られた細胞は、直ちに使用することも、液体窒素温度で凍結および保存することもできる。凍結細胞は、解凍して、本明細書に記載の方法で使用することができる。
【００５５】
細胞培養
ＨＳＣ細胞増殖の一部の実施形態では、例えば一次組織源または適した動物から得られた細胞を適した培地でインキュベートする。適した条件には、３３℃から３９℃、好ましくは約３７℃におけるインキュベーションが含まれる。ＨＳＣは、１〜１０％の酸素濃度で培養できる。一部の実施形態では、ＨＳＣが低酸素条件下で培養される。一部の実施形態では、細胞は、標準酸素条件下でインキュベートされる。標準酸素条件は、例えば、５％ＣＯ２および１５％以上の酸素でありうる。一部の実施形態では、標準酸素条件が２１％Ｏ２である。低酸素条件は、例えば、５％ＣＯ２および５％Ｏ２でありうる。
【００５６】
培地は、培養時間中を通して置換できる。別の実施形態では、培地の半分を１週間に２回新たな培地で置換する。細胞が３から３０日間培養されうる。別の実施形態では、ＨＳＣを含有する細胞集団を少なくとも４週間培養する。別の実施形態では、ＨＳＣを含有する細胞集団を最長２週間まで培養する。別の実施形態では、ＨＳＣを含有する細胞集団を７から１４日間培養する。別の実施形態では、ＨＳＣを含有する細胞集団を１０日間培養する。
【００５７】
増殖容器内および適した培地容積で、１つまたは複数の細胞を培養またはインキュベートすることによって、ＨＳＣを増殖させることができる。細胞は、培養ウェルが１ウェルあたり約１〜１００の細胞を含有するように培養できる。細胞集団が骨髄である場合、培地１ｍＬあたり約１×１０２から約１×１０７細胞の密度で、細胞を培養できる。別の実施形態では、培地１ｍＬあたり約１×１０５から約１×１０６細胞の密度で、細胞を培養できる。別の実施形態では、細胞集団はサイドポピュレーション（ＳＰ）骨髄細胞を含む。ＳＰ骨髄細胞は、より低密度、例えば、約１×１０２から５×１０３細胞／ｍｌで培養できる。別々の態様では、細胞集団は動員末梢血から得ることができる。動員末梢血細胞は、約２００００細胞／ｍＬから約５００００細胞／ｍＬの密度で培養でき、別の実施形態では、動員末梢血細胞は、約５００００細胞／ｍＬの密度で培養される。
【００５８】
１２、２４もしくは９６ウェルプレート、１２．５ｃｍ２Ｔ型培養フラスコまたは気体透過バッグなど、任意の適した増殖容器、フラスコまたは適切な管が、ここで提供する方法で使用できる。そのような培養容器は、Ｆａｌｃｏｎ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社またはＣｏｓｔａｒ社から購入できる。本明細書で使用される場合、「増殖容器」は、自立的であるかないか、または増殖装置に組込まれているかないかに関わらず、細胞を増殖させるためのいかなるチャンバーまたは容器も含まれることが意図されている。
【００５９】
本明細書に記載の通りにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた造血幹細胞も提供する。培養で増殖した幹細胞の子孫は、親細胞と完全に同じ（遺伝学的に、形態学的に、または表現型的に）ではない可能性があると理解されている。しかし、ここで提示する通り、幹細胞の子孫は、上述した１つまたは複数の血液細胞型に分化する少なくとも何らかの能力を有する。１つまたは複数の血液細胞型に発生する能力などの機能的特性は、例えば、本明細書に記載の方法および系統マーカーを用いて測定できる。
【００６０】
ｅｘ ｖｉｖｏ増殖造血幹細胞の使用
本技術の増殖培養造血幹細胞は、移植、創薬、遺伝子クローニング、遺伝子送達および遺伝子発現を含めた様々な適用に使用できる。
【００６１】
移植
ここで提供する造血幹細胞は、対象または個体に投与できる。一部の実施形態では、ここで提供する方法で産生された造血幹細胞を、骨髄移植など、細胞ベースの療法に用いる。適した対象または個体は、上述の任意の動物が含まれる。対象または個体は、造血または細胞ベースの療法をｉｎ ｖｉｖｏで研究するのに適した任意の動物でありうる。脊椎動物。対象または個体は、細胞ベースの治療を必要とする任意の動物でありうる。一部の実施形態では、個体は哺乳動物である。哺乳動物には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ、イヌおよびネコなどが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００６２】
移植幹細胞は、自系（処置される個体に由来する）または同種（同じ種のドナーに由来する）であるか、組織適合性が一致しているドナーから得られたものでありうる。一部の実施形態では、移植幹細胞は異種（被移植者とは異なった種の動物に由来する）でありうる。ヒト自家骨髄移植および異系骨髄移植は、現在、白血病、リンパ腫、および生命に危険を及ぼす他の疾患などの疾患の療法として用いられている。
【００６３】
ここで提供する増殖細胞の、患者への投与に関しては、増殖細胞の有効な量が、わずか数百以下から、数百万以上までもの範囲でありうる。投与するべき増殖細胞の数は、医療専門家がよく知っている他の因子のなかでも、限定されるものではないが、処置するべきサイズまたは総容積を含めた、処置される障害の詳細、ならびに被移植者の必要性および条件に応じて異なることが理解されよう。一部の実施形態では、ヒト１００ｋｇあたり１０３〜１０１０の細胞を、対象または個体に投与または移植する。投与または移植の方法は、当技術分野でよく知られており、それらには、例えば注入が含まれる。ここで提供する増殖細胞は、例えば、静脈注入によって投与できる。
【００６４】
一部の実施形態では、細胞の単回投与を行う。他の実施形態では、多回投与を使用する。多回投与は、連続した３〜７日間の初期治療レジメを行い、その後、複数回繰り返すなど、周期的な期間にわたって行うことができる。
【００６５】
増殖細胞は、限定されるものではないが、放射線治療および化学療法などの処置の後、あらゆる範囲の造血細胞を個体で再構成するのに使用できる。そのような療法は、意図的に、または骨髄移植もしくはリンパ腫、白血病、および他の腫瘍状態、例えば乳癌の治療の副作用として、造血細胞を破壊する。
【００６６】
ここで提供する増殖細胞は、特定の造血系統のための細胞の供給源としても有用である。増殖造血細胞の成熟、増殖、および１つまたは複数の選択された系統への分化は、限定されるものではないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−１３などを含めた適切な因子と共に、または幹細胞の再生、拘束および分化の原因となる因子を分泌する、間質細胞もしくは他の細胞と共に細胞を培養することによって実現しうる。
【００６７】
創薬
本明細書に記載の方法によって得られる造血幹細胞は、創薬に有用である。例えば、幹細胞のそのような生物反応を促進または抑制する培養条件または成長因子は、試験される条件または因子に細胞を暴露することによって同定できる。このようにして、例えば、これらの因子の受容体またはその因子の生物活性を妨害する薬剤も同定できる。
【００６８】
ここで提供する方法で産生された造血幹細胞は、幹細胞を様々な造血系統に分化させるアッセイで使用できる。これらのアッセイは、例えば、幹細胞の自己再生、拘束または分化を促進または阻害する因子などの物質を同定するために、容易に適合させることができる。
【００６９】
遺伝子クローニング戦略
ここで提供する造血細胞は、例えば、サブトラクティブハイブリダイゼーションによって、またはこれらの生物学的イベントに関連しているか、または造血細胞型に特徴的な標的抗原に特異的なモノクローナル抗体を用いた発現クローニングによって、その発現が幹細胞または他の造血細胞の増殖、拘束、分化および成熟に関連する遺伝子を同定して、クローニングするのに使用できる。
【００７０】
遺伝子送達および発現
造血幹細胞は、対象における遺伝子送達または発現の重要な標的でもある。したがって、ここで提供する造血細胞は、細胞を個体に再導入する前に、遺伝子改変することができる。例えば、その発現が個体への治療効果を有すると予測されている遺伝子を、ここで提供する１または複数の造血細胞に導入することができる。細胞は、本明細書に記載の通りに、培養および／または増殖させる前または後に遺伝子改変できる。培養細胞に遺伝子を導入する方法は当技術分野でよく知られている。
【００７１】
本技術の一部の態様では、治療遺伝子を発現する細胞で、欠損および／または損傷している細胞を補充、増強および／または置換することによって個体を処置できる。細胞は、正常な適合ドナーの細胞に由来するものでも、処置すべき個体からの幹細胞（すなわち自系）に由来するものでもよい。発現可能形態の正常遺伝子を導入することによって、そのような欠損を患う個体に、遺伝的欠損を代償し、症状の一部またはすべてを除去、緩和または低減する手段を提供できる。
【００７２】
発現ベクターを自家または同種増殖造血細胞に導入して発現させることも、当技術分野で知られている方法による相同組換えまたは非相同組換えによって、細胞のゲノムを改変することもできる。このようにして、個体における遺伝的欠損を修正することも、幹細胞で天然に欠失している遺伝能力を与えることもできる。例えば、限定されるものではないが、β−地中海貧血症、鎌状赤血球貧血、アデノシンデアミナーゼ欠損、リコンビナーゼ欠損およびリコンビナーゼ調節遺伝子欠損を含めた疾患をこの方法で修正できる。造血細胞に関連していない疾患、例えば、限定されるものではないが、ホルモン、酵素および成長因子を含めた分泌タンパク質の欠失に関連した疾患も処置できる。適切な調節開始領域の制御下における、対象とする遺伝子の誘導発現により、天然でそのタンパク質を正常に産生する細胞におけるものと同様な様式で、そのタンパク質を産生（および分泌）することが可能となる。
【００７３】
造血幹細胞培養の形質導入
ここで提供する造血幹細胞は、遺伝的に改変できる。造血幹細胞への遺伝子の導入は、標準的な技法、例えば、感染、形質移入、形質導入または形質転換によるものでありうる。治療遺伝子でＨＳＣ細胞に形質導入することができる。例えば、形質導入は、レトロウイルスベクター（例えば、実施例、国際公開第９４／２９４３８号、国際公開第９７／２１８２４号および国際公開第９７／２１８２５号に記載の通りに）、またはポックスウイルスベクターなどのウイルスベクターを介したものでありうる。形質導入がｅｘ ｖｉｖｏである場合には、それに続いて、形質導入細胞を被移植者に投与する。したがって、ここで提供する技術は、ここに開示する方法によって遺伝子をｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与することによって、ＨＳＣへの遺伝子導入が適用できる疾患の処置を包含する。例えば、限定されるものではないが、β−地中海貧血症、鎌状赤血球貧血、アデノシンデアミナーゼ欠損、リコンビナーゼ欠損、リコンビナーゼ調節遺伝子欠損などを含めた疾患を、治療遺伝子の導入によって修正できる。遺伝子治療に関する他の適応は、正常な幹細胞が利点を有し、化学療法中に選択圧を受けるのを可能にする薬剤耐性遺伝子の導入である。適した薬剤耐性遺伝子には、多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
遺伝子導入方法の例には、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞微量注入、ならびにウイルスベクター、アジュバント補助ＤＮＡ、遺伝子銃およびカテーテルなどが含まれる。別の実施形態では、ウイルスベクターが使用される。
【００７５】
対象とする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、当技術分野でよく知られている方法を用いてベクターに挿入できる。例えば、インサートおよびベクターＤＮＡを、相互に対形成し、かつリガーゼで連結できる相補的な末端を各分子上に生成する制限酵素と適した条件下で接触させることができる。代替として、制限ポリヌクレオチドの末端に、合成核酸リンカーを連結することができる。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ内の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有する。さらに、例えば、以下のもの、すなわち、哺乳動物細胞の安定的または一過性形質移入体を選択するためのネオマイシン遺伝子などの選択マーカー遺伝子；高レベル転写のための、ヒトＣＭＶ前初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のための、ＳＶ４０からの転写終結シグナルおよびＲＮＡプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；多目的多重クローニング部位；ならびにセンスおよびアンチセンスＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーターのうちの一部またはすべてを含有するベクターに挿入するために、終止コドンおよび適切な制限部位を含有するオリゴヌクレオチドを連結することもできる。他の手段も、当技術分野でよく知られており、利用可能である。
【００７６】
造血幹細胞の改変は、導入されるトランスジーンの構成的発現または誘導性発現のいずれかのために作製された発現カセットの使用を含みうる。そのような発現カセットは、プロモーター、開始コドン、終止コドンおよびポリアデニル化シグナルなどの調節エレメントを含有しうる。幹細胞内、または個体に注入した後に幹細胞から生じる細胞の中で作用可能である適したエレメントを使用できる。さらに、これらのエレメントがタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結し、それによってヌクレオチド配列が幹細胞内で発現でき、かつ、それゆえタンパク質が産生できることが必要である。開始コドンおよび終止コドンは通常、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられる。
【００７７】
導入された配列の発現を特定の細胞型で引き起こすのに使用できるプロモーターの例には、Ｔ細胞およびＮＫ細胞における発現用のグランザイムＡ、幹細胞および前駆細胞における発現用のＣＤ３４プロモーター、細胞傷害性Ｔ細胞における発現用のＣＤ８プロモーター、ならびに骨髄細胞における発現用のＣＤ１１ｂプロモーターが含まれる。加えて、調節可能プロモーターを使用できる。誘導性プロモーターなどの調節可能プロモーターは市販されている。
【００７８】
調節エレメントに作用可能に連結したトランスジーンを含有する外因性遺伝物質は、機能的な細胞質分子もしくは機能的なエピソーム分子として細胞内に残留することも、それが細胞の染色体ＤＮＡに組込まれることもある。外因性遺伝物質は、細胞内に導入されて、プラスミドの形態の別離した遺伝物質としてそこに残ることもある。代替として、直鎖状ＤＮＡを細胞に導入してもよく、直鎖状ＤＮＡは、染色体に組込まれうる。細胞内にＤＮＡを導入する場合、染色体へのＤＮＡ組込みを促進する試薬を添加してもよい。組込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列も、ＤＮＡ分子に含まれうる。代替として、細胞内にＲＮＡを導入してもよい。
【００７９】
選択マーカーは、本技術の造血幹細胞内への望ましい遺伝子の取込みをモニターするのに使用できる。これらのマーカー遺伝子は、任意のプロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下のものでありうる。これらは、当技術分野でよく知られており、それらには、栄養物、抗生物質などの刺激に対する細胞の感受性を変える遺伝子が含まれる。遺伝子には、ｎｅｏ、ｐｕｒｏおよびｔｋ、ならびに多剤耐性（ＭＤＲ）のものなどが含まれる。他の遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ルシフェラーゼおよびＬａｃＺなど、それらを求めて容易にスクリーニングできるタンパク質を発現する。
【００８０】
本明細書で使用される場合、治療遺伝子は、一遺伝子全体でも、欠損内因性遺伝子から生じる、患者における欠損を代償できる遺伝子の機能的に活性な断片のみでもありうる。治療遺伝子には、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス抑制に有用な遺伝子、およびリボザイム媒介治療用のリボザイムも包含される。優性な抑制オリゴヌクレオチドおよびペプチドをコードする治療遺伝子、ならびに調節タンパク質およびオリゴヌクレオチドをコードする遺伝子もこの技術に包含される。通常、遺伝子治療では、単一の治療遺伝子を導入するが、特定の疾患の治療には複数の遺伝子が必要となりうる。治療遺伝子は、欠損遺伝子の正常コピー、例えば野生型コピー、または機能相同体でありうる。別の実施形態では、治療遺伝子は、野生型の優性抑制変異体である。ベクターあたり複数の遺伝子を投与することができ、または代替として、いくつかの適合性ベクターを用いて複数の遺伝子を送達することもできる。遺伝的欠損に応じて、治療遺伝子は調節配列および非翻訳配列を含みうる。ヒト患者の遺伝子治療用には、治療遺伝子は通常、ヒト起源のものであろうが、高い相同性と、ヒトで生物学的に同一であるか同等な機能とを示す、他の近縁種からの遺伝子も、その遺伝子産物が受容者に有害な免疫反応を誘導しない場合には使用できる。例えば、その遺伝子産物がヒトでグルコースをグリコーゲンに変換できる霊長類インスリン遺伝子は、ヒト遺伝子の機能的等価物であると考えられるであろう。処置で使用するのに適した治療遺伝子は疾患に応じて異なるであろう。例えば、鎌状赤血球貧血を処置するのに適した治療遺伝子は、グロビン遺伝子の正常コピーである。ＳＣＩＤを処置するのに適した治療遺伝子は、正常ＡＤＡ遺伝子である。
【実施例】
【００８１】
結果
Ａｎｇｐｔｌ５またはＡｎｇｐｔｌ３の存在下における総ヒト臍帯血細胞の培養はヒトＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。
【００８２】
Ａｎｇｐｔｌ３またはＡｎｇｐｔｌ５を含有するＳＴＩＦ培地中で総ヒト臍帯血細胞を培養した（Conklin, Dら、Genomics、６２巻、４７７〜８２頁（１９９９年）；Zeng, L.ら、J Hum Genet、４８巻、１５９〜６２頁（２００３年））。
【００８３】
１００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇｐｔｌ３またはＡｎｇｐｔｌ５を含有する無血清ＳＴＩＦ培地に２．５×１０７の総臍帯血細胞を１×１０６細胞／ｍｌの密度で播種し、示された時間における総細胞数を計数した。２３日間の培養の後、Ａｎｇｐｔｌ３存在下における総細胞数は、２．６±０．３×１０８にまで１０倍に増加し（図１Ａ、菱形）、Ａｎｇｐｔｌ５と共に培養した細胞は２．２±０．３×１０８にまで増加した（四角）。培養細胞は、主に懸濁細胞を含有し、少数の付着亜集団を伴っていた。
【００８４】
ｅｘ ｖｉｖｏ増殖細胞が生着できるかどうか試験するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖アッセイを行った。図１Ｂは、１×１０６の非培養ヒト単核臍帯血細胞、または培養された１×１０６の初期ヒト臍帯血細胞の子孫を移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄におけるヒトキメリズムの量を示す。各シンボルは、移植の２カ月後にアッセイされた単一の移植マウスにおける生着を表す（ｎ＝５〜１２）。（＊レーン１の値から有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．００１）。したがって、１×１０６もしくは３×１０６の非培養細胞、または１×１０６の始原細胞の培養子孫を、亜致死照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ被移植者に注射した。Ａｎｇｐｔｌ５と共に１９日間培養した９．２×１０６の細胞を（１×１０６の最初にプレーティングされた総臍帯血細胞の子孫である）、移植した場合、移植の２カ月後に８．８％の平均ヒト造血キメリズムが観察された（図１Ｂ、レーン２）。これは、同等な１×１０６の非培養細胞によって示された０．６％生着よりはるかに大きい（図１Ｂ、レーン１；ｐ、＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。Ａｎｇｐｔｌ３の存在下で２３日間培養された細胞も、７．１％の平均キメリズムで被移植者に生着した（図１Ｂ、レーン３）。
【００８５】
非形質移入２９３Ｔ細胞はＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。
【００８６】
驚いたことに、ここで明らかにされるように、非形質移入２９３Ｔ細胞から収集された無血清調整培地がＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。
【００８７】
１０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−２および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１を補充した無血清ＩＭＤＭ中（ＳＴＩＦ培地；図２Ａ、棒１）、または２９３Ｔ細胞から新たに収集した調整ＳＴＩＦ培地中（棒２）、または凍結／解凍した後の同じ調整培地中（棒３）で新たに単離された２０のＣＤ４５．２骨髄ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞を１０日間培養した。培養細胞は、１×１０５のＣＤ４５．１総骨髄細胞と共にＣＤ４５．１被移植者（ｎ＝５〜６）に共移植した。
【００８８】
図２Ｂは、移植５カ月後（ｎ＝６）における、図２Ａの棒２によって代表される条件での培養細胞の多系統貢献を示す。上部パネルに示すデータは、移植５カ月後（図１Ａの棒２から）の１匹のマウスからの末梢血液単核細胞の代表的ＦＡＣＳプロットである。各四分画内の細胞のパーセントが示されている。図１Ａの棒２のマウスから得られた、Ｔリンパ様細胞、Ｂリンパ様細胞および骨髄細胞のパーセント再増殖データの概要が下部パネルにプロットされている。
【００８９】
ＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激した潜在的候補タンパク質を同定するために、無血清２９３Ｔ調整培地を質量分析で分析した。いくつかのタンパク質に由来するペプチドが同定された。７０ｋＤより小さいタンパク質を含有していた、２９３Ｔ細胞の無血清ＩＭＤＭベース調整培地の画分の質量分析で同定されたペプチドの部分的なリストを表１に示す。対照無血清ＩＭＤＭ試料と共通して見出されたタンパク質は示されていない。
【００９０】
【表１】
ここで明らかにするように、ＩＧＦＢＰ−２は無血清２９３Ｔ調整培地中に発現される。図３は、抗ヒトＩＧＦＢＰ−２ポリクロナール抗体で検出された、精製されたヒトＩＧＦＢＰ−２（陽性対照；レーン１）、無血清３Ｔ３調整培地（陰性対照；レーン２）および無血清２９３Ｔ調整培地（レーン３）のウエスタンブロット分析を示す。
【００９１】
精製されたＩＧＦＳＰ−２はＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。
【００９２】
ここで明らかにするように、ＩＧＦＢＰ−２はＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ３を含むＳＴＩＦ培地中（棒１および４）、５００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ−２を含む同じ培地中（棒２および５）、および２００ｎｇ／ｍｌ Ｔｉｍｐ−１を含む同じ培地中（棒３および６）で２０のＣＤ４５．２骨髄ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞を５日間培養した（図４Ａ参照）。その後、これらの細胞を１×１０５のＣＤ４５．１総骨髄細胞でＣＤ４５．１被移植者（ｎ＝５）に共移植した。移植の１カ月後または４カ月後における生着を図４Ａに示す。（＊棒４および６の値から有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【００９３】
１０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１（ＳＴＦ培地）、および１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ３を含む無血清培地中（棒１および４）、５００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ−２を含むＳＴＦ培地中（棒２および５）、ならびに５００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ−２および１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ３を含むＳＴＦ培地中（棒３および６）で、２０のＣＤ４５．２骨髄ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞を１０日間培養した（図４Ｂ参照）。その後、これらの細胞を１×１０５のＣＤ４５．１総骨髄細胞でＣＤ４５．１被移植者（ｎ＝６〜７）に共移植した。移植の１カ月後または４カ月後における生着を図４Ｂに示す。（＊および＊＊はそれぞれ棒４または棒５の値から有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【００９４】
図４Ｃは、１００ｎｇ／ｍｌの精製Ａｎｇｐｔｌ３および５００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−２を含有する無血清調整ＳＴＦ培地中で２１日間培養する前（左）および後（右）における、成体ＢＭ ＳＰ ＣＤ４５＋Ｓｃａ−１＋細胞の再増殖能力の限界希釈分析を示す。照射されたＣＤ４５．１近交系マウスに１×１０５のＣＤ４５．１ ＢＭ競合者細胞および１、５、２５もしくは１００の新たに単離されたＳＰ ＣＤ４５＋Ｓｃａ−１＋細胞（左；ｎ＝２４）または０．２、１、４もしくは１０のＳＰ ＣＤ４５＋Ｓｃａ−１＋細胞の培養子孫（右；ｎ＝２６）を注射した。１００の新たに単離されたＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞および４または１０の入力細胞の培養子孫はすべて、被移植者で再増殖した。これらのデータポイントはプロットされていない。注射された細胞の数に対する、移植４カ月後の有核末梢血細胞中に含有するＣＤ４５．２集団が１％未満である被移植者マウスのパーセントがプロットされている。
【００９５】
Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２の存在下におけるヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞の培養はＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を２５０倍超刺激する。
【００９６】
マウスＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を補助するのに、ＩＧＦＢＰ−２がＩＧＦ−２を置換できることは、驚くべき新知見であった。加えて、ＳＴＦ培地の存在下で、ＩＧＦＢＰ−２はヒト臍帯血ＨＳＣ ＣＤ１３３＋細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増殖を２５０倍超促進した。
【００９７】
１×１０５のヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞の培養を無血清ＳＴＦ培地中、または５００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ５および５００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ−２を補充した無血清ＳＴＦ培地中で開始し、低Ｏ２環境（５％Ｏ２）で培養した。総細胞数を計数した。図５Ａに示す通り、総細胞数は、無血清ＳＴＦ培地またはＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有する無血清ＳＴＦ培地のいずれかにおいて、１１日間の培養の後に２００倍超増加した。
【００９８】
ＩＧＦＢＰ−２およびＡｎｇｐｔｌ５は、マウスモデルでヒト臍帯血細胞の生着およびキメリズムを促進する。
【００９９】
８０００または１５０００の非培養（新鮮）ヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞、またはＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含むか、もしくは含まない無血清ＳＴＦ培地中で１１日間培養された８０００の始原ＣＤ１３３＋細胞からの子孫を移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄におけるヒトキメリズムの量を測定した。８０００の非培養ＣＤ１３３＋細胞は、移植の２カ月後に、７匹の被移植者のうち１匹で生着でき、平均キメリズムは０．２％であった（図５Ｂ、レーン１）。１５０００の非培養ＣＤ１３３＋細胞は、増大したが、なお中程度の生着を示し、８匹のマウスのうち４匹の陽性生着があった（全細胞の平均キメリズム２．０％；図５Ｂ、レーン２）。著しく対照的に、Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含む無血清ＳＴＦ培地で培養した培養の後の２．１×１０６の細胞、すなわち、１１日間の培養の後の８０００の始原細胞の子孫はすべての被移植者マウスに生着し、８０００または１５０００の非培養細胞と比較して有意に増大したキメリズムを示した（平均３９．５％）（図５Ｂ、レーン４；ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含まないＳＴＦ培地中で培養された同じ数の始原細胞（８０００）の培養子孫（現在１．６×１０６細胞）は、それらの非培養対応物のものと同様に、乏しい生着しか示さなかった（図５Ｂ、レーン３）。したがって、Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２は、合成培地中のヒトＳＣＩＤ再増殖細胞（ＳＲＣ）のｅｘ ｖｉｖｏ増殖を補助する。各シンボルは、移植の２カ月後にアッセイされた単一の移植マウスにおける生着を表す（ｎ＝７〜８）。（＊レーン１〜３の値と有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【０１００】
図５Ｃは、非培養（新鮮）または培養ヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞を移植された代表的なマウスにおける、２カ月目のヒト造血生着を示す。（図５Ｂ）のレーン１によって代表される条件（新鮮）または（図５Ｂ）のレーン４によって代表される条件（培養）における、移植２カ月後の１匹のマウスからの骨髄細胞の代表的ＦＡＣＳプロット。各四分画内の細胞のパーセントが示されている。Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有する無血清ＳＴＦ培地中で培養された細胞での移植（図５Ｂのレーン４）は、非培養細胞を移植されたマウス（図５Ｂのレーン１）よりはるかに高い、ヒト総造血細胞（ＣＤ４５／７１＋）、骨髄細胞（ＣＤ１５／６６ｂ＋）、Ｂリンパ様細胞（ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋）および原始細胞（ＣＤ３４＋）の生着を示した。
【０１０１】
非培養細胞（図５Ｂレーン２）ならびにＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養された細胞（図５Ｂレーン４）を移植されたマウスの多系列生着の概要を図５Ｄに示す。８０００の細胞の子孫は、培養の後、移植の２カ月後に骨髄系統およびリンパ系統を再増殖させた。これは、ヒト幹細胞活性の増殖を実証するものである。非培養細胞を移植された一部のマウスは、ゼロパーセントのドナー再増殖を有していた。これらのデータポイントはプロットされていない。（＊値が非培養細胞の値と有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。図５Ｄは、非培養または培養ヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞を移植された代表的なマウスにおける、２カ月目のヒト造血生着を示す。８０００の細胞の子孫は、培養の後、移植の２カ月後に骨髄系統およびリンパ系統を再増殖させた。これは、ヒト幹細胞活性の増殖を実証するものである。
【０１０２】
培養ヒトＨＳＣの増殖
ＳＣＩＤ再増殖細胞（ＳＲＣ）の自己複製能を測定するために、非培養細胞（図５Ｂのレーン２）またはＡｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養された細胞（図５Ｂのレーン４）を移植された一次マウスから骨髄を収集し、それらを亜致死照射された二次被移植者に移植した。一次被移植者からの１本の後足からの骨髄液を２匹の二次被移植者に移植するのに用いた。移植の５〜８週間後に、二次ＮＯＤ／ＳＣＩＤ被移植者における多系列生着をアッセイした（ｎ＝１２のマウスが移植された）。非培養細胞は二次被移植者に生着できなかったが（示されていない）、培養細胞は、この場合も、二次移植の後に陽性生着を示した（図５Ｅ）。これらのデータは、最初の培養期間中におけるヒトＨＳＣの正味の増殖を示す。２つの独立した追加の実験によって、本明細書に記載の方法を用いて、ヒトＨＳＣが培養中に劇的に増殖したことが実証された。
【０１０３】
正常または低酸素濃度での培養の後に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞の限界希釈分析。
【０１０４】
ここに提供する培養系は、いくつかの独立した追加の実験で実証されたように、ヒトＳＲＣを劇的に増殖させる。１つの代表的実験では、２×１０５のヒト臍帯血ＣＤ１３３＋細胞を、正常または低Ｏ２条件下に、５００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ５および１００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で培養した。総細胞数（図６Ａ）およびＣＤ３４＋細胞数（図６Ｂ）を計数した。１０日間の培養の後に、これら２通りの条件における総細胞数は有意に相違しておらず、両方とも２００倍超増加した（図６Ａ）。それにもかかわらず、５日間の培養の後には、より大きな数のＣＤ３４＋原始細胞が正常Ｏ２対低Ｏ２で観察された（図６Ｂ）。
【０１０５】
培養の前（図６Ｃ）および後（図６Ｄ）のＳＲＣ頻度を定量するために、限界希釈アッセイを行った。図６Ｂおよび６Ｃに実証されているように、１０日間の培養の後に、Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有する無血清ＳＴＦ培地中で、低Ｏ２または正常Ｏ２で培養されたＳＲＣの数は、それぞれ８倍または２０倍増加した。注射された入力細胞または入力等価物細胞の数に対する、移植の６〜８週間後に、被移植者マウス骨髄に含有されるヒト造血集団が１％未満である被移植者マウスのパーセントがプロットされている。正常Ｏ２または低Ｏ２で培養された１００００の入力細胞の子孫は、すべての被移植者で再増殖し、これらのデータポイント（ゼロパーセント陰性マウス）はプロットされていない。非培養ＣＤ１３３＋細胞のこの特定の試料の再増殖細胞の頻度（ＣＲＵ）は、６４０７５細胞あたり１である（平均の９５％信頼区間：１／２３９１９〜１／１７１６４３、ｎ＝２５）。すなわち、ポアソン統計から計算されるように、平均６４０７５の非培養ヒトＣＤ１３３＋細胞の注入が、移植マウスの６３％（＝１−１／ｅ）を再増殖させるのに十分である。Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２を含有するＳＴＦ培地中で、低Ｏ２で細胞が培養された場合には、ＣＲＵ頻度は１／７８１４入力等価細胞であった（平均の９５％の信頼区間：１／３４３２〜１／１７７９１、ｎ＝２６）。これは、非培養細胞のものより約８倍大きい。驚いたことに、正常Ｏ２で細胞が培養された場合には、ＣＲＵ頻度が１／３２０９入力等価細胞にまで増大した（平均の９５％の信頼区間：１／１８８９〜１／５４５３、ｎ＝２７）。これは、機能的ＳＲＣの総数が約２０倍増加したことを示す。
【０１０６】
図６Ｅは、２００００の非培養ＣＤ１３３＋細胞（左パネル、ｎ＝８）または正常Ｏ２における、５０００の始原ＣＤ１３３＋細胞からの培養子孫（右パネル、ｎ＝１０）を移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ被移植者における多系列生着を示す。非培養細胞を移植されたいくつかのマウスはゼロパーセントドナー再増殖を有していた。これらのデータポイントはプロットされていない。全造血系統（カラム１および５、ＣＤ４５／７１＋）、骨髄系統（カラム２および６、ＣＤ１５／６６ｂ＋）、Ｂリンパ様系統（カラム３および７、ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋）および原始系統（カラム４および８、ＣＤ３４＋）が示されている。（＊値が非培養細胞の値と有意に異なる。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。図６Ｅに実証されているように、これらの培養細胞は、非培養細胞よりはるかに大きいレベルの多系列生着を有した。
【０１０７】
低酸素がヒトＳＲＣの増殖を改善することが示唆されている（Danetら、J ClinInvest、１１２巻、１２６〜３５頁（２００３年））。ここで明らかにするように、ＳＲＣの著しい増殖が低酸素条件で観察された。予想外に、ＳＲＣ増殖は、標準酸素圧下ではさらに大きかった。
【０１０８】
Ａｎｇｐｔｌ５およびＩＧＦＢＰ−２の存在下で培養したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞も、ＳＲＣの増殖をもたらした（データは示されていない）。
【０１０９】
ヒトＨＳＣをｅｘ ｖｉｖｏ増殖させるためのＡｎｇｐｔｌｓおよびＩＧＦＢＰ−２の使用は、いまや合成培地中でヒトＨＳＣをｅｘ ｖｉｖｏ増殖できるので、骨髄移植用の臍帯血の臨床使用の増大を可能にする。ここに提供する技術は、ＨＳＣを用いた細胞および遺伝子治療の新規戦略の開発に有用であろう。
【０１１０】
アンジオポエチン２
競合的再構成分析
無血清調整ＳＴＩＦ培地中、または５００ｎｇ／ｍｌ精製ヒトアンジオポエチン１、ヒトアンジオポエチン２、マウスアンジオポエチン３もしくはヒトアンジオポエチン４を含有する同一培地中で、２０のＣＤ４５．２ドナー細胞を１０日間培養した。これらの細胞は、１×１０５の新たに単離したＣＤ４５．１競合者骨髄細胞と共に被移植者マウスに共移植した。その混合物を、事前に全量１０Ｇｙで照射されている６〜９週齢のＣＤ４５．１マウスの群のそれぞれに後眼窩経路で静脈内注射した。移植４カ月後の再構成を測定した。移植マウスの再構成を測定するために、移植後における、示された時間に末梢血を収集し、記載の通り（Zhang, C.C.およびLodish, H.F.、Blood、１０５巻、４３１４〜２０頁（２００５年））、リンパ様区画および骨髄区画内のＣＤ４５．１＋およびＣＤ４５．２＋細胞の存在を測定した。簡潔には、後眼窩出血によって末梢血細胞を収集し、それに続いて、赤血球を溶解し、抗ＣＤ４５．２−ＦＩＴＣと、抗ＣＤ４５．１−ＰＥ、抗Ｔｈｙ１．２−ＰＥ（Ｔリンパ様系統用）、抗Ｂ２２０−ＰＥ（Ｂリンパ様系統用）、抗Ｍａｃ−１−ＰＥ、抗Ｇｒ−１−ＰＥ（抗Ｍａｃ−１および抗Ｇｒ−１で共染色される細胞は骨髄系統であると考えられた）、 または抗Ｔｅｒ１１９−ＰＥ（赤血球系統用）モノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）とで染色した。図７に示す通り、アンジオポエチン２はＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖を刺激する。
【０１１１】
方法
マウス。Ｃ５７ ＢＬ／６ ＣＤ４５．２およびＣＤ４５．１マウスはＪａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙまたはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。ＮＯＤＩＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ １７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ動物設備で維持した。すべての動物実験は、Ｍ．Ｉ．Ｔ． 動物実験委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）の承認をもって行った。
【０１１２】
培地。無血清ＳＴＩＦ培地は、１０μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌマウスＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌマウスＩＧＦ−２（すべてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から）および１０ｎｇ／ｍｌヒトＦＧＦ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ無血清培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）である。無血清ＳＴＦ培地は、ＩＧＦ−２を含まない同一の培地である。示された量の精製Ａｎｇｐｔｌ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社からの贈与）、Ａｎｇｐｔｌ５（Ａｂｎｏｖａ社、台湾）またはＩＧＦＢＰ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加した。調整培地は、終夜培養の後に、集密的な２９３Ｔまたは３Ｔ３細胞から収集した。
【０１１３】
マウスＨＳＣ培養。８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．２マウスから単離された２０のＢＭ ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞を、示された培地１６０μｌと共に、Ｕ底９６ウェルプレート（３７９９；Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の１ウェルにプレーティングした。細胞は３７℃、５％ＣＯ２および正常Ｏ２で培養した。競合的移植の目的には、少なくとも６つの培養ウェルからの細胞をプールし、示された数の細胞を各マウスに移植する前に、競合者と混合した。
【０１１４】
ヒト細胞培養。ヒト総臍帯血単核細胞はＣａｍｂｒｅｘ社から購入した。細胞は、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ３またはＡｎｇｐｔｌ５を含むＳＴＩＦ培地１ｍｌあたり１×１０６細胞でプレーティングした。培地容積は、細胞密度を５×１０５〜１．５×１０６細胞／ｍｌに維持するために、５、８、１２、１５および１８日目に新たな培地を添加することによって増大した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２および正常Ｏ２で培養した。図５および６の実験で用いたヒト凍結保存臍帯血ＣＤ１３３＋細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ社およびＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。細胞は、示された培地２００μｌと共に、Ｕ底９６ウェルプレート（３７９９；Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の１つのウェルに１×１０４細胞／ウェルで２日間プレーティングした。３日目に、細胞を個々のウェルからプールして、５×１０４細胞／ｍｌで６ウェルプレートに移した。４および７日目に、細胞密度を２×１０５細胞／ｍｌ（４日目）または７×１０５／ｍｌ（７日目）に保つために、新たな培地を添加した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２、および正常Ｏ２または５％Ｏ２（低Ｏ２）レベルで培養した。
【０１１５】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ移植。ヒト総臍帯血単核細胞またはＣＤ１３３＋細胞の非培養または培養子孫を、示された日に収集し、亜致死照射された（３５０ラド）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに後眼窩経路で静脈内注射した。移植の６〜８週間後または示された時間に、移植された動物からの骨髄有核細胞を、フローサイトメトリーによって、ヒト細胞が存在するかどうか分析した。二次移植には、記載の通り（Hoganら、Proc Natl Acad Sci USA、９９巻、４１３〜８頁（２００２年））、一次被移植者の１本の後足からの骨髄液を用いて、２匹の二次被移植者に移植した。限界希釈実験におけるＣＲＵの計算は、Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて行った（Zhangら、ProcNatl Acad Sci USA、１０３巻、２１８４〜９頁（２００６年））。マウスは、マウス骨髄細胞の中に少なくとも１％（一次移植用）または０．１％（二次移植用）のＣＤ４５／７１＋ヒト細胞が検出された場合に、ヒトＨＳＣ移植において陽性であると考えられた。
【０１１６】
フローサイトメトリー。ドナー骨髄細胞は、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．２マウスから単離した。ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞は、Zhang, C.C.ら、Nat Med、１２巻、２４０〜５号（２００６年）に記載の通りに単離した。マウスＨＳＣの再増殖を分析するために、被移植者ＣＤ４５．１マウスの末梢血細胞を後眼窩出血によって収集し、それに続いて、赤血球を溶解し、抗ＣＤ４５．２−ＦＩＴＣと、抗ＣＤ４５．１−ＰＥ、抗Ｔｈｙ１．２−ＰＥ（Ｔリンパ様系統用）、抗Ｂ２２０−ＰＥ（Ｂリンパ様系統用）、抗Ｍａｃ−１−ＰＥ、抗Ｇｒ−１−ＰＥ（抗Ｍａｃ−１および抗Ｇｒ−１で共染色される細胞は骨髄系統であると考えられた）、または抗Ｔｅｒ１１９−ＰＥ（赤血球系統用）モノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）とで染色した。図１Ｂを除いたすべての図に示されている「パーセント再増殖」は、抗ＣＤ４５．２−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ４５．１−ＰＥの染色結果に基づいた。すべての場合で、多系列再構成を確認するために、上記に列挙した系統のＦＡＣＳ分析も行った。
【０１１７】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでヒト造血移植を分析するには、出版されているプロトコールに従った（Cashmanら、J. Exp Med、１９６巻、１１４１〜９頁（２００２年））。簡潔には、総ヒト造血（ＣＤ４５／７１＋）細胞集団、ならびにこの集団内における専ら顆粒球形成（ＣＤ１５／６６ｂ＋）細胞である部分集合を定量化するために、被移植者ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからの骨髄細胞を、抗ヒトＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ７１−ＰＥ、ＣＤ１５−ＦＩＴＣおよびＣＤ６６ｂ−ＦＩＴＣで染色した。ヒト前駆集団（ＣＤ３４＋）およびＢ系統集団（ＣＤ３４−ＣＤ１９／２０＋）を定量化するために、細胞を抗ヒトＣＤ３４−ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ１９−ＰＥおよびＣＤ２０−ＰＥで染色した。図１の実験では、総ヒト造血（ＣＤ４５／７１＋）生着のみが測定された。抗ヒトＣＤ３４−ＦＩＴＣは、培養中のＣＤ３４＋細胞を定量化するのに用いた。すべての抗ヒト抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社から購入した。
【０１１８】
ＦＡＣＳ選別。ドナー骨髄細胞は、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．２マウスから単離した。ＳＰ Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５＋細胞を選別するために、成体マウス骨髄ＳＰ細胞（以前の記載（Zhang, C.C.およびLodish, H.F.、Blood、１０３巻、２５１３〜２１頁（２００４年）；Zhang, C.C.およびLodish,H.F.、Blood、１０５巻、４３１４〜２０頁（２００５年）の通りに染色した）を、抗Ｓｃａ−１−ＰＥおよび抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣでさらに染色し、その後、ＭｏＦｌｏ（登録商標）ソーターで細胞選別を行った。
【０１１９】
競合的再構成分析。示された数のマウスＣＤ４５．２ドナー細胞を１×１０５の新たに単離されたＣＤ４５．１競合者骨髄細胞と混合し、その混合物を、事前に全量１０Ｇｙで照射されている６〜９週齢のＣＤ４５．１マウスの群のそれぞれに後眼窩経路で静脈内注射した。移植マウスの再構成を測定するために、移植後における、示された時間に末梢血を収集し、記載の通り（Zhang, C.C.およびLodish, H.F.、Blood、１０３巻、２５１３〜２１頁（２００４年）；Zhang, C.C.およびLodish,H.F.、Blood（２００５年））、リンパ様区画および骨髄区画内のＣＤ４５．１＋およびＣＤ４５．２＋細胞の存在を測定した。限界希釈実験におけるＣＲＵの計算は、Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア（ＳｔｅｘｎＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて行った。（Zhangら、ProcNatl Acad Sci USA、１０３巻、２１８４〜９頁（２００６年））。
【０１２０】
ウエスタンブロット。４〜１２％ＮｕＰａｇｅ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上での電気泳働によって、調整培地中の精製タンパク質または粗タンパク質を分析し、タンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングした。これらの膜を０．１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＧＦＢＰ−２ポリクロナール抗体（ＡＦ６７４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヤギ抗体でプロービングし、化学発光キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）によって検出した。
【０１２１】
本技術を特定の実施形態に関して詳細に示し、記述してきたが、当業者ならば、添付されている特許請求の範囲によって定義される本技術の趣旨および範囲から逸脱せずに、形態および詳細における様々な変化をそこに加えることができることが理解されるはずである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞数を増大させる方法であって、単離されたインスリン成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）およびアンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）を含む合成培地中でヒト細胞をインキュベートするステップを含み、該ヒト細胞の少なくとも１つが１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる、方法。
【請求項２】
前記単離されたＩＧＦＢＰ−２が約１．０ｎｇ／ｍＬから約５μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離されたＩＧＦＢＰ−２が組換え産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト細胞が少なくとも５日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト細胞が少なくとも１０日間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ａｎｇｐｔｌが、Ａｎｇｐｔｌ３およびＡｎｇｐｔｌ５からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培地が、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の成長因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記追加の成長因子が約０．５ｎｇ／ｍＬから約５μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト細胞が、骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞および胎児肝細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ１３３を発現する１つまたは複数の初代ヒト細胞を、該ヒト細胞を培養する前に選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ３４を発現する１つまたは複数の初代ヒト細胞を、該ヒト細胞をインキュベートする前に選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法で産生された造血幹細胞。
【請求項１３】
ヒト造血幹細胞数をｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させる方法であって、単離されたインスリン成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）、アンジオポエチン様タンパク質５（Ａｎｇｐｔｌ５）、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む合成培地中で少なくとも５日間ヒト細胞をインキュベートするステップを含み、該ヒト細胞のうちの少なくとも１つが、ＣＤ１３３およびＣＤ３４からなる群から選択される表面マーカーの発現に関して選択されたものであり、該ヒト細胞の少なくとも１つが１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる、方法。
【請求項１４】
造血幹細胞を個体に投与する方法であって、
ａ）該個体またはドナーからヒト細胞を得るステップであって、該ヒト細胞の少なくとも１つが１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる、ステップと、
ｂ）単離されたＩＧＦＢＰ−２およびアンジオポエチン様成長因子（Ａｎｇｐｔｌ）を含む合成培地中で該ヒト細胞をインキュベートするステップと、
ｃ）該培養された細胞を該個体に移植するステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
前記単離されたＩＧＦＢＰ−２が約１．０ｎｇ／ｍＬから約５μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離されたＩＧＦＢＰ−２が組換え産生される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ａｎｇｐｔｌが、Ａｎｇｐｔｌ３およびＡｎｇｐｔｌ５からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ａｎｇｐｔｌが組換え産生される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒト細胞が、骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞および胎児肝細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤ１３３を発現する１つまたは複数の初代ヒト細胞を、該初代ヒト細胞をインキュベートする前に選択するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤ３４を発現する１つまたは複数の初代ヒト細胞を、該ヒト細胞をインキュベートする前に選択するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
個体を治療する方法であって、該個体にＩＧＦＢＰ−２およびＡｎｇｐｔｌを投与するステップを含む方法。
【請求項２３】
前記Ａｎｇｐｔｌが、Ａｎｇｐｔｌ３およびＡｎｇｐｔｌ５からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト造血幹細胞数を増大させるための培地であって、
ａ）合成造血幹細胞基本培地と、
ｂ）単離されたＩＧＦＢＰ−２と、
ｃ）Ａｎｇｐｔｌと
を含む培地。
【請求項２５】
前記Ａｎｇｐｔｌが、Ａｎｇｐｔｌ３およびＡｎｇｐｔｌ５からなる群から選択される、請求項２４の培地。
【請求項２６】
培養中の造血幹細胞の増殖を促進する方法であって、細胞の集団を、アンジオポエチン２を含む培地中で、該細胞の増殖に十分な条件下で培養するステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記アンジオポエチン２がヒトアンジオポエチン２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が１０日間培養される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記培地が無血清培地である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記培地が、インスリン成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の因子をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞がＣＤ４５＋、Ｓｃａ−１＋骨髄細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞がサイドポピュレーション細胞（side population ｃｅｌｌ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
造血幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させるのに適した培地であって、無血清培地およびアンジオポエチン２を含む、培地。
【請求項３４】
前記アンジオポエチン２がヒトアンジオポエチン２である、請求項３３に記載の培地。
【請求項３５】
前記培地が、インスリン成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の因子をさらに含む、請求項３３に記載の培地。
【請求項３６】
インスリン成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも２つの追加の因子を含む、請求項３３に記載の培地。
【請求項３７】
前記ＩＧＦが１ＧＦ−２である、請求項３５に記載の培地。
【請求項３８】
前記ＦＧＦがＦＧＦ−１である、請求項３５に記載の培地。
【請求項３９】
ＩＧＦ−２、ＦＧＦ−１、ＳＣＦおよびＴＰＯをさらに含む、請求項３５に記載の培地。
【請求項１】
造血幹細胞数を増大させる方法であって、単離されたインスリン成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）およびアンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ）を含む合成培地中でヒト細胞をインキュベートするステップを含み、該ヒト細胞の少なくとも１つが１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる、方法。
【請求項２】
前記単離されたＩＧＦＢＰ−２が約１．０ｎｇ／ｍＬから約５μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離されたＩＧＦＢＰ−２が組換え産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト細胞が少なくとも５日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト細胞が少なくとも１０日間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ａｎｇｐｔｌが、Ａｎｇｐｔｌ３およびＡｎｇｐｔｌ５からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培地が、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の成長因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記追加の成長因子が約０．５ｎｇ／ｍＬから約５μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト細胞が、骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞および胎児肝細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ１３３を発現する１つまたは複数の初代ヒト細胞を、該ヒト細胞を培養する前に選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ３４を発現する１つまたは複数の初代ヒト細胞を、該ヒト細胞をインキュベートする前に選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法で産生された造血幹細胞。
【請求項１３】
ヒト造血幹細胞数をｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させる方法であって、単離されたインスリン成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）、アンジオポエチン様タンパク質５（Ａｎｇｐｔｌ５）、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む合成培地中で少なくとも５日間ヒト細胞をインキュベートするステップを含み、該ヒト細胞のうちの少なくとも１つが、ＣＤ１３３およびＣＤ３４からなる群から選択される表面マーカーの発現に関して選択されたものであり、該ヒト細胞の少なくとも１つが１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる、方法。
【請求項１４】
造血幹細胞を個体に投与する方法であって、
ａ）該個体またはドナーからヒト細胞を得るステップであって、該ヒト細胞の少なくとも１つが１つまたは複数の血液細胞型に分化することができる、ステップと、
ｂ）単離されたＩＧＦＢＰ−２およびアンジオポエチン様成長因子（Ａｎｇｐｔｌ）を含む合成培地中で該ヒト細胞をインキュベートするステップと、
ｃ）該培養された細胞を該個体に移植するステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
前記単離されたＩＧＦＢＰ−２が約１．０ｎｇ／ｍＬから約５μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離されたＩＧＦＢＰ−２が組換え産生される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ａｎｇｐｔｌが、Ａｎｇｐｔｌ３およびＡｎｇｐｔｌ５からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ａｎｇｐｔｌが組換え産生される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒト細胞が、骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞および胎児肝細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤ１３３を発現する１つまたは複数の初代ヒト細胞を、該初代ヒト細胞をインキュベートする前に選択するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤ３４を発現する１つまたは複数の初代ヒト細胞を、該ヒト細胞をインキュベートする前に選択するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
個体を治療する方法であって、該個体にＩＧＦＢＰ−２およびＡｎｇｐｔｌを投与するステップを含む方法。
【請求項２３】
前記Ａｎｇｐｔｌが、Ａｎｇｐｔｌ３およびＡｎｇｐｔｌ５からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト造血幹細胞数を増大させるための培地であって、
ａ）合成造血幹細胞基本培地と、
ｂ）単離されたＩＧＦＢＰ−２と、
ｃ）Ａｎｇｐｔｌと
を含む培地。
【請求項２５】
前記Ａｎｇｐｔｌが、Ａｎｇｐｔｌ３およびＡｎｇｐｔｌ５からなる群から選択される、請求項２４の培地。
【請求項２６】
培養中の造血幹細胞の増殖を促進する方法であって、細胞の集団を、アンジオポエチン２を含む培地中で、該細胞の増殖に十分な条件下で培養するステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記アンジオポエチン２がヒトアンジオポエチン２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が１０日間培養される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記培地が無血清培地である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記培地が、インスリン成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の因子をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞がＣＤ４５＋、Ｓｃａ−１＋骨髄細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞がサイドポピュレーション細胞（side population ｃｅｌｌ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
造血幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させるのに適した培地であって、無血清培地およびアンジオポエチン２を含む、培地。
【請求項３４】
前記アンジオポエチン２がヒトアンジオポエチン２である、請求項３３に記載の培地。
【請求項３５】
前記培地が、インスリン成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の因子をさらに含む、請求項３３に記載の培地。
【請求項３６】
インスリン成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも２つの追加の因子を含む、請求項３３に記載の培地。
【請求項３７】
前記ＩＧＦが１ＧＦ−２である、請求項３５に記載の培地。
【請求項３８】
前記ＦＧＦがＦＧＦ−１である、請求項３５に記載の培地。
【請求項３９】
ＩＧＦ−２、ＦＧＦ−１、ＳＣＦおよびＴＰＯをさらに含む、請求項３５に記載の培地。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５２５８３６（Ｐ２０１０−５２５８３６Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０７５４９（Ｐ２０１０−５０７５４９）
【出願日】平成２０年５月２日（２００８．５．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６２３６５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３７６４１
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５００４８２８１０）ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２日（２００８．５．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６２３６５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３７６４１
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５００４８２８１０）ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (7)
【Ｆターム（参考）】
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