ファスジルと抗癌剤との組み合わせ医薬
【課題】抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制しつつ、がん細胞を有効に死滅させる効果を有する医薬を提供する。
【解決手段】１又は２以上の抗がん剤と、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬。
【解決手段】１又は２以上の抗がん剤と、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１種又は２種以上の抗がん剤と、該抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成抑制のためのファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物とを含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫はＢ細胞の最終分化段階であり、免疫グロブリンを産生する形質細胞の腫瘍性疾患である。６０歳以上の高齢者に発症しやすく、モノクローナルな免疫グロブリン（Ｍ蛋白）を大量に作る。
【０００３】
臨床的に損傷を受ける臓器としては主に骨、腎臓、神経が挙げられる。骨病変（溶骨）の存在は重要な予後因子であり、骨痛、病的骨折、骨折による神経圧迫症状は生存期間を縮める。溶骨性病変の病因に、ＴＮＦ、ＩＬ−１、Ｇ−ＣＳＦなど複数のサイトカインが破骨細胞の活性化にかかわりが考えられている。腎臓の病変は、Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ蛋白尿の排泄増加による円柱形成性尿細管障害が中心であり、腎アミロイドーシス、尿酸腎症、高カルシウム血症性腎症の像を呈する。高カルシウム血症をきたすとカルシウムが尿細管細胞、尿細管基底膜に沈着し変性壊死に陥り、間質性腎炎を引き起こす。急激に高カルシウム血症が進行すると腎血流量低下、脱水に続いて急性腎不全を招きやすく予後不良である。また、50％以上の症例で神経病変を呈するという報告が多い。その原因として、骨髄腫の直接侵襲障害、高カルシウム血症、出血等に続いて起こる神経障害、化学療法薬に伴うものが挙げられる。頻度的に高い疼痛の原因としては、神経根圧迫、脊髄神経圧迫などがあるが、骨障害による疼痛も含まれる。
【０００４】
治療開始後の平均生存期間は３年であり、１０年以上の生存率は約３〜５％と報告され、長期予後が望めない疾患であるのが現状である。治療は、６５歳以下であれば、自家骨髄移植が選択肢となるが、高齢であれば化学療法が選択される。化学療法ではこれまでＭＰ（メルファラン−プレドニゾロン）療法、ＶＡＤ（ビンクリスチン−ドキソルビシン−デキサメタゾン）療法が使われてきたが、最近サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブといった新しい薬が臨床で使われるようになってきた。多発性骨髄腫の患者の６０％は初期治療で改善するが、ほとんどの患者は再発し、抗がん剤に対し耐性を示し、死に至る。新しい薬が出たといっても多発性骨髄腫はいまだに治る病気ではない（非特許文献１〜４）。
【０００５】
血液悪性腫瘍における薬剤耐性のメカニズムの一つとして、腫瘍細胞が骨髄の中で細胞外マトリックスや間質細胞と接着することで薬剤耐性を示すＣＡＭ−ＤＲ（Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）が知られている。この接着には腫瘍細胞のＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＶＬＡ−６が関係していることが言われており（非特許文献５〜９）それらの分子が細胞外マトリックスに結合することによって抗アポトーシス分子であるｂｃｌ−２やＭＤＲ−１が腫瘍細胞内に誘導されると報告されている（非特許文献５、非特許文献７、非特許文献１０）。このＣＡＭ−ＤＲは、インテグリン抗体や薬剤耐性に関与する細胞内シグナル伝達分子の阻害剤で減弱され、抗がん剤との組み合わせでより抗がん効果が強まることが示されている（非特許文献７、非特許文献１１）。一方、ＣＡＭ−ＤＲは、一部の固形がんでも報告されている（非特許文献１２〜１６）。これらのことは、ＣＡＭ−ＤＲを減弱させる医薬と抗がん剤との組み合わせは血液の悪性腫瘍のみならず固形がんにも応用できることを意味している。
【０００６】
Ｋｏｂｕｎｅらは、調べた多発性骨髄腫細胞５種がＷｎｔ３を発現しており、間質細胞と強く接着していることを見出した（非特許文献９）。これらの細胞ではＣＡＭ−ＤＲが観察され、インテグリンβ１抗体、インテグリンα６抗体、ＦＲＬＰ−１（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２がＣＡＭ−ＤＲを阻害するが、Ｗｎｔのカノニカルパスウェイの特異的阻害剤Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１は阻害しないことより多発性骨髄腫細胞がインテグリンα６／β１（ＶＬＡ−６）を介して間質細胞に接着することによりＷｎｔ／ＲｈｏＡ／Ｒｈｏキナーゼシグナルパスウェイが活性化されＣＡＭ−ＤＲが起こること示した。しかし、ここで用いた抗体、ＦＲＬＰ−１、Ｙ−２７６３２はＣＡＭ−ＤＲを１／３〜１／５程度減弱させるに過ぎず、薬としての可能性を示しているものではない。
【０００７】
また、Ｓｃｈｍｉｄｍａｉｅｒらは、スタチンがＣＡＭ−ＤＲを抑制し、そのメカニズムとしてスタチンが阻害するＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの下流にあるＲｈｏのゲラニルゲラニル化が抑制されることを述べている（非特許文献１７）。即ち、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの下流にあるＲａｓをファルネシル化するファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤ＦＴＩ−２７７はＣＡＭ−ＤＲを阻害しないが、Ｒｈｏをゲラニルゲラニル化するゲラニルゲラニル化トランスフェラーゼ阻害剤ＧＧＴＩ−２９８やその下流にあるＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２はＣＡＭ−ＤＲを阻害するとした。ここで用いているＣＡＭ−ＤＲは、間質細胞と接着させた場合とそうでない場合のＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色細胞数の差をカウントすることにより定量しているがその差は２倍程度の細胞数でしかなく、ＧＧＴＩ−２９８、Ｙ−２７６３２についても薬としての可能性を示しているものではない。
【０００８】
一方、ファスジルは、Ｒｈｏキナーゼ、ミオシン軽鎖リン酸化酵素、プロテインキナーゼCなどに対するキナーゼ阻害活性を有しており、血管平滑筋弛緩作用、血流増加作用、血圧低下作用、脳機能改善作用、心臓保護作用等を示し、血管拡張剤（特に狭心症治療剤）、高血圧治療剤、脳機能改善作用、心臓保護剤、及び動脈硬化症治療剤等として有用な物質であることが知られている（例えば特許文献１〜９、又は非特許文献１８〜２５参照）。 しかしながら、ファスジルがＣＡＭ−ＤＲを阻害することも、多発性骨髄腫に有効であることも知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭６１−１５２６５８号公報
【特許文献２】特開昭６１−２２７５８１号公報
【特許文献３】特開平２−２５６６１７号公報
【特許文献４】特開平４−２６４０３０号公報
【特許文献５】特開平６−０５６６６８号公報
【特許文献６】特開平６−０８０５６９号公報
【特許文献７】特開平７−８０８５４号公報
【特許文献８】特開平９−２２７３８１号公報
【特許文献８】国際公開９８／０６４３３号パンフレット
【特許文献９】国際公開００／０３７４６号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】最新医学１２（２００９） 最新医学社
【非特許文献２】日本臨床１２（２００７） 日本臨床社
【非特許文献３】Ｌａｎｃｅｔ ３７４：３２４−３３９（２００９）
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ Ｒｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ６：１８１−１８２（２００７）
【非特許文献５】ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅら Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：２６６−２７４（１９９９））
【非特許文献６】ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅら Ｊ． Ｌｅｕｋ． Ｂｉｏｌ． ７１：４９５−５０２（２００２）
【非特許文献７】Ｍａｔｓｕｎａｇａら Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１１５８−１１６５（２００３）
【非特許文献８】Ｓｃｈｕｅｔｚら Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．４：３１−４０（１９９３）
【非特許文献９】Ｋｏｂｕｎｅら Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．６：１７７４−１７８４（２００７）
【非特許文献１０】Ｌａｎｄｏｗｓｋｉら Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：４１７−４２１（２００３）
【非特許文献１１】Ｄａｍｉａｎｏら Ｂｌｏｏｄ ９３：１６５８−１６６７（１９９９）
【非特許文献１２】Ａｏｕｄｊｉｔら Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：４９９５−５００４ （２００１）
【非特許文献１３】Ｆｒｉｄｍａｎら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ８７：６６９８−６７０２（１９９０）
【非特許文献１４】Ｔｓｕｒｕｔａｎｉら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：８４２３−８４３２（２００５）
【非特許文献１５】Ｓｅｔｈｉら Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：６６２−６６８（１９９９）
【非特許文献１６】Ｕｈｍら Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１５８７−１５９４（１９９９）
【非特許文献１７】Ｓｃｈｍｉｄｍａｉｅｒら、Ｂｌｏｏｄ １０４：１８２５−１８３２（２００４）
【非特許文献１８】Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，９８，ｐ１０９１（１９８９）
【非特許文献１９】Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２５９，ｐ７３８（１９９１）
【非特許文献２０】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９６，ｐ４３５７（１９９７）
【非特許文献２１】Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，４３，ｐ１０２９（１９９９）
【非特許文献２２】Ｓｕｐｐｌｅ．Ｃｉｒｃ．１０４，Ｎｏ１７，１００１（２００１．１０．２３）
【非特許文献２３】日本臨床５９，Ｎｏ６，ｐ１０７６−１０８０、（２００１）
【非特許文献２４】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒａｍ．Ｂｕｌｌ．，４０，（３）ｐ７７０−７７３（１９９２）
【非特許文献２５】エリル(登録商標) 点滴静注液３０ｍｇ、添付文書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成抑制作用を有する有効成分と抗がん剤とを組み合わせて、がん細胞を効率的に死滅させることができる医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物が抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制する作用を有することを見出し、抗がん剤とファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬ががん細胞に対して極めて高い有効性を発揮することを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【００１３】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）１又は２以上の抗がん剤と、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬；
（２）ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物が、抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制するための有効成分である前記（１）に記載の医薬；
（３）多発性骨髄腫の治療のための前記（１）又は（２）に記載の医薬；
（４）抗がん剤がドキソルビシン、ビンクリスチン、メルファラン、デキサメサゾン、プレドニゾロン、ボルテゾミブ、サリドマイド、及びレナリドマイドからなる群から選ばれる１又は２以上の抗がん剤である前記（１）ないし（３）のいずれかに記載の医薬；
（５）抗がん剤がドキソルビシンである前記（４）に記載の医薬；
【００１４】
（６）抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制して抗がん剤によりがん細胞を死滅させる方法であって、１又は２以上の抗がん剤とファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせをがん細胞に接触させる工程を含む方法；
（７）抗がん剤がドキソルビシンである前記（６）に記載の方法；
（８）ドキソルビシンとファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬の適量を患者に投与する工程を含む、多発性骨髄腫の治療方法；
（９）多発性骨髄腫を治療するための前記（３）〜（５）のいずれかに記載の医薬の製造における１又は２以上の抗がん剤の使用、及び／又はファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用；
【００１５】
（１０）抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制するための医薬であって、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む医薬；及び
（１１）抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制する方法であって、がん細胞にファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を接触させる工程を含む方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の医薬は、多発性骨髄腫などの各種のがんの治療において、抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制しつつ、がん細胞を死滅させる効果を有することから、有効性の高いがん治療を可能にする医薬として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒト多発性骨髄腫に対するファスジルの細胞毒性を示した図である。
【図２】ヒト多発性骨髄腫のストローマ細胞への接着に対するファスジルの効果を示した図である。
【図３】ヒト多発性骨髄腫のＣＡＭ−ＤＲに対するファスジルの併用効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を示した図である。
【図４】ヒト多発性骨髄腫のＣＡＭ−ＤＲに対するファスジルの併用効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）を示した図である。
【図５】ヒト多発性骨髄腫のＣＡＭ−ＤＲに対するファスジルの併用効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）試験での骨髄中ヒトＣＤ３８発現を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ファスジルは、公知の方法、例えば、特許文献１（特開昭６１−１５２６５８号公報）、非特許文献２４（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒａｍ．Ｂｕｌｌ． ４０，（３）ｐ７７０−７７３（１９９２））等に記載されている方法に従って合成することができる。ファスジルの塩の形態は特に限定されないが、例えば酸付加塩としては薬学上許容される非毒性の塩が好ましく、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸等の無機酸、及び酢酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸等の有機酸の塩を挙げることができる。また、ファスジル又はその塩の水和物又は溶媒和物としては、例えば１／２水和物又は溶媒和物、１水和物又は溶媒和物、３水和物又は溶媒和物を挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１９】
抗がん剤の種類は特に限定されないが、例えば、ドキソルビシン、ビンクリスチン、メルファラン、デキサメサゾン、プレドニゾロン、ボルテゾミブ、サリドマイド、及びレナリドマイドからなる群から選ばれる１又は２以上の抗がん剤が好ましい例として挙げられ、ドキソルビシンが特に好ましい。
【００２０】
本発明医薬は、抗がん剤の１種又は２種以上と、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬である。組み合わせとしては、単一の投与形態中に抗がん剤の１種又は２種以上とファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物とを含めたいわゆる合剤の形態であってもよく、あるいは単位投与形態の抗がん剤と、単位投与形態のファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む製剤とを組み合わせて投与してもよい。
【００２１】
合剤の形態の医薬は、有効成分である１又は２以上の抗がん剤と、有効成分であるファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物とを含む単一形態の医薬組成物として調製されることが好ましく、医薬組成物は製剤学上許容される１種又は２種以上の担体を用いて調製されることが好ましい。担体としては、例えば、ゼラチン；乳糖、グルコース等の糖類；小麦、米、とうもろこし澱粉等の澱粉類；ステアリン酸等の脂肪酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩；タルク；植物油；ステアリンアルコール、ベンジルアルコール等のアルコール；ガム；ポリアルキレングリコール等が挙げられる。
【００２２】
液状担体としては、一般に水、生理食塩液、デキストロース又は類似の糖溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグルコール類が挙げられる。カプセル剤となす場合には、ゼラチンを用いてカプセルを調整することが好ましい。
【００２３】
本発明の医薬の投与方法は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれの投与方法で投与してもよい。経口投与に適した剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤、又はエリキシル剤等が挙げられ、非経口投与に適した剤形としては、例えば注射剤又は点滴剤などの溶液剤が挙げられる。非経口的に、例えば筋肉内注射、静脈内注射、若しくは皮下注射、又は点滴により投与する場合、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物等張にするために、食塩又はグルコース等の他の溶質を添加した無菌溶液として投与することができる。
【００２４】
注射により投与する場合の溶解液としては、例えば、滅菌水、塩酸リドカイン溶液（筋肉内注射用）、生理食塩液、ブドウ糖、静脈内注射用溶液、電解質溶液（静脈内注射用）等が例示される。このようにして溶解した場合のファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の下限は、好ましくは０．０１重量％以上、さらに好ましくは０．１重量％以上、上限は好ましくは２０重量％以下、さらに好ましくは１０重量％以下程度である。抗がん剤の濃度は使用する抗がん剤の種類に応じて適宜選択することが望ましい。経口投与の液剤の場合、０．０１−２０重量％の有効成分を含む懸濁液又はシロップが好ましい例として挙げられる。この場合における担体としては、香料、シロップ、製剤的ミセル体等の水様賦形剤が挙げられる。
【００２５】
本発明の医薬の投与量は、被投与者の年齢、健康状態、体重、症状の程度、同時処置があるならばその種類、処置頻度、所望の効果の性質、あるいは投与経路や投与計画などによって異なるが、非経口投与の場合にファスジルの投与量が０．０１−２０ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは０．０５−１０ｍｇ／ｋｇ・日、より好ましくは０．１−１０ｍｇ／ｋｇ・日となるように、経口投与の場合にファスジルの投与量が０．０２−１００ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは０．０５−２０ｍｇ／ｋｇ・日、より好ましくは０．１−１０ｍｇ／ｋｇ・日となるように選択することができる。抗がん剤の投与量は使用する抗がん剤の種類に応じて適宜選択することが望ましい。
【００２６】
別々に調製されたファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む製剤及び抗がん剤を組み合わせて投与する場合には、両者を投与直前に混合して１つの投与単位として投与することもできるが、別々の投与形態のまま同時に、又は逐次に投与してもよい。一般的には抗がん剤の投与計画は厳密であり、数日ないし数週間の休薬期間を設けて投与することが多いが、抗がん剤については通常採用される投与計画をそのまま適用し、その投与計画における投与期間内においてファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む製剤を連日又は隔日など適宜の投与頻度で投与することができる。なお、組み合わせによる投与を採用する場合には、両者を経口投与又は非経口投与により投与するほか、一方を経口投与し、他方を非経口投与することも可能である。
【００２７】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の医薬は、がん細胞の抗がん剤に対する耐性形成を抑制しつつ抗がん作用を発揮することができる。ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物は、抗がん剤に対するがん細胞の耐性の獲得を軽減ないし防止することができる。また、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物は、抗がん剤の投与によりすでに形成されたがん細胞の抗がん剤に対する耐性を軽減ないし排除することができる。従って、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物と抗がん剤とを組み合わせて含む本発明の医薬を用いることにより、抗がん剤に対する耐性の獲得を軽減ないし排除しつつ、あるいはすでに形成された抗がん剤に対する耐性を軽減ないし排除しつつ、抗がん剤により有効ながん治療を行うことが可能になる。本明細書において用いられる「耐性形成の抑制」という用語は、耐性獲得の阻害のほか、すでに形成された耐性の軽減ないし排除を含む概念であり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例
に限定されることはない。
例１
まず、試験管内でファスジルのヒト多発性骨髄腫に対する細胞毒性の検討を行った。ヒト多発性骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−５、ＡＲＨ−７７、ＲＰＭＩ８２２６； 非特許文献９：Ｋｏｂｕｎｅら Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．６：１７７４−１７８４（２００７））は、２×１０4個／ウェルで９６穴カルチャープレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に播種して、異なる濃度（０、１、５、１０、５０及び１００μＭ）のファスジル（旭化成ファーマ、東京、日本）を含むＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いて、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2にて培養した。細胞生存率は、培養２４時間目に、Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ、東京、日本）を用いて、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）にて測定を行った。ファスジルは、ＫＭＳ−５、ＡＲＨ−７７、ＲＰＭＩ８２２６に対して各々１００μＭ、５０μＭ、５０μＭで毒性を示した。図１に結果を示す。
【００２９】
次にヒト多発性骨髄腫のストローマ細胞への接着に対するファスジルの効果を検討した。ヒトテロメラーゼ遺伝子導入ヒトストローマ細胞（Ｋｏｂｕｎｅら Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．３３：１５４４−１５５３（２００５）、Ｋａｗａｎｏら Ｂｌｏｏｄ １０１：５３２−５４０（２００３））は、セルカルチャーインサート（孔径０．４μm、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）の裏側に５×１０4個／ウェルの密度でまいて、４８時間、３７℃、５％ＣＯ2にてＭＥＭ-α培地＋１２．５％ウマ血清＋１２．５％ＦＢＳ＋１μｍｏｌ／Ｌハイドロコルチゾン＋１００μｍｏｌ／Ｌ β-メルカプトエタノール＋２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン培地を用いて培養した。培養２４時間目に、ヒトテロメラーゼ遺伝子導入ヒトストローマ細胞を播種したセルカルチャーインサートを１２穴カルチャープレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に移し、２×１０5個／ウェルの濃度で多発性骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−５、ＡＲＨ−７７、ＲＰＭＩ８２２６）をセルカルチャーインサート内に播種して、異なる濃度（０、１、５、１０及び５０μM）のファスジルを含むＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＢＳを用いて、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2にて培養した。細胞接着率は、培養２４時間目に、浮遊細胞及び接着細胞を回収して、細胞数を数えて、接着した細胞数を回収した全細胞数で割ることにより求めた。得られたデータは、Ｔ検定を用いて統計処理を行った。ＫＭＳ−５に対しては５０μＭ、ＡＲＨ−７７、ＲＰＭＩ８２２６に対しては１０μＭのファスジルがストローマ細胞への接着を抑制することが確認された。図２に結果を示す。
【００３０】
次にヒト多発性骨髄腫細胞のＣＡＭ−ＤＲによる細胞生存性に対するファスジルとドキソルビシン処理の効果を検討した。ヒトテロメラーゼ遺伝子導入ヒトストローマ細胞は、セルカルチャーインサート(孔径０．４μm、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）の裏側に５×１０4個／ウェルの密度でまいて、４８時間、３７℃、５％ＣＯ2にてＭＥＭ−α培地＋１２．５％ウマ血清＋１２．５％ＦＢＳ＋１μmol/Lハイドロコルチゾン＋１００μｍｏｌ／Ｌ β-メルカプトエタノール＋２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン培地を用いて培養した。培養２４時間目に、ヒトテロメラーゼ遺伝子導入ヒトストローマ細胞を播種したセルカルチャーインサートを１２穴カルチャープレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に移し、２×１０5個／ウェルの濃度で多発性骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−５、ＡＲＨ−７７、ＲＰＭＩ８２２６）をセルカルチャーインサート内に播種して、異なる濃度（０、１０及び５０μM）のファスジルを含むＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いて、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2にて培養した。ファスジルの濃度は、各々の細胞で毒性を示さない濃度を用いた。培養２４時間目に、異なる濃度のドキソルビシン（０、０．１、０．３、１、３及び１０μＭ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＢＳを用いて、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2にて培養した。培養２４時間後に、浮遊細胞及び接着細胞を回収して、９６穴カルチャープレートに移して、Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、細胞生存率をマイクロプレートリーダーにて測定した。
【００３１】
ヒトストローマ細胞がない場合には、ファスジル存在下、非存在下でドキソルビシンの多発性骨髄腫細胞感受性に差がないが、ヒトストローマ細胞がある場合には、ファスジル非存在下でストローマ細胞がない場合に比べてドキソルビシンに対する耐性度が上がることが観察された（ＣＡＭ−ＤＲ）。ところがファスジルを添加するとストローマ細胞がない場合と同程度にドキソルビシンに対する感受性が上昇した。図３に結果を示す。この結果は、ストローマ細胞がある場合には、ＣＡＭ−ＤＲが起こり、ファスジルがＣＡＭ−ＤＲを低下することを意味しており、ファスジルがＣＡＭ−ＤＲを抑制させドキソルビシンのような抗がん剤の作用を強めることが期待される。
【００３２】
例２
多発性骨髄腫細胞を移植したＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）へのファスジルとドキソルビシンの投与による生存率の検討を行った。ＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスに対して４５ｍｇ／ｋｇの濃度でブスルファン（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内注射した。ブスルファン投与２日目に、２×１０6個／１００μＬ ＰＢＳの濃度のＫＭＳ−５細胞を尾静脈注射した。細胞移植7及び１４日目に、ファスジルを１０mg／kgの濃度で、また、ドキソルビシンを４mg／ｋｇの濃度で尾静脈注射した。ＰＢＳ投与群、ファスジル投与群、ドキソルビシン投与群、ファスジル、ドキソルビシン併用投与群は、各々６匹のＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスを使用し、細胞移植から１２週間、マウスの生存を調べた（図４）。また、脛骨、腓骨及び大腿骨より骨髄細胞を採取し、ＲＮＡを抽出した後、ヒトＣＤ３８及びコントロールであるＧＡＰＤＨのプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲを行った（図５）。すなわち、ヒトＣＤ３８プライマー（フォワードプライマー： ５’−ＴＴＧＧＧＡＡＣＴＣＡＣＡＣＣＧＴＡＣＣ−３’、リバースプライマー：５’−ＧＴＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣ−３’）及びＧＡＰＤＨプライマー（フォワードプライマー：５’−ＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ−３’、リバースプライマー：５’−ＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ−３’）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃、５分、１サイクル、９５℃、３０秒、５５℃、１分、７２℃、３０秒、３０サイクル、７２℃、２分、１サイクルであった。ＰＣＲ終了後、ＰＣＲ産物は、１μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルを用いて、１００Vで３０分間、電気泳動を行った。電気泳動終了後、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲトランスイルミネーター(Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ)を用いてバンドの検出を行った。結果を図４及び図５に示す。
【００３３】
ＰＢＳ投与群、ファスジル投与群、ドキソルビシン投与群では６０日までにすべてのマウスが死んだが、ファスジル、ドキソルビシン併用投与群では２／３が９０日まで生き残った。また、骨髄におけるヒトＣＤ３８は、生き残ったマウスにおいてほとんど観察されず、がん細胞がなくなっていることがわかった。この効果は、例１から想定される効果を顕著に上回る効果ということができる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の医薬は、多発性骨髄腫などの各種がんの治療において、抗がん剤に対するがん細胞の耐性獲得を阻害し、及び／又はすでに耐性を獲得したがん細胞の耐性を減弱ないし排除しつつ、がん細胞を効率的に死滅させる効果を有することから、極めて有効な医薬として利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１種又は２種以上の抗がん剤と、該抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成抑制のためのファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物とを含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫はＢ細胞の最終分化段階であり、免疫グロブリンを産生する形質細胞の腫瘍性疾患である。６０歳以上の高齢者に発症しやすく、モノクローナルな免疫グロブリン（Ｍ蛋白）を大量に作る。
【０００３】
臨床的に損傷を受ける臓器としては主に骨、腎臓、神経が挙げられる。骨病変（溶骨）の存在は重要な予後因子であり、骨痛、病的骨折、骨折による神経圧迫症状は生存期間を縮める。溶骨性病変の病因に、ＴＮＦ、ＩＬ−１、Ｇ−ＣＳＦなど複数のサイトカインが破骨細胞の活性化にかかわりが考えられている。腎臓の病変は、Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ蛋白尿の排泄増加による円柱形成性尿細管障害が中心であり、腎アミロイドーシス、尿酸腎症、高カルシウム血症性腎症の像を呈する。高カルシウム血症をきたすとカルシウムが尿細管細胞、尿細管基底膜に沈着し変性壊死に陥り、間質性腎炎を引き起こす。急激に高カルシウム血症が進行すると腎血流量低下、脱水に続いて急性腎不全を招きやすく予後不良である。また、50％以上の症例で神経病変を呈するという報告が多い。その原因として、骨髄腫の直接侵襲障害、高カルシウム血症、出血等に続いて起こる神経障害、化学療法薬に伴うものが挙げられる。頻度的に高い疼痛の原因としては、神経根圧迫、脊髄神経圧迫などがあるが、骨障害による疼痛も含まれる。
【０００４】
治療開始後の平均生存期間は３年であり、１０年以上の生存率は約３〜５％と報告され、長期予後が望めない疾患であるのが現状である。治療は、６５歳以下であれば、自家骨髄移植が選択肢となるが、高齢であれば化学療法が選択される。化学療法ではこれまでＭＰ（メルファラン−プレドニゾロン）療法、ＶＡＤ（ビンクリスチン−ドキソルビシン−デキサメタゾン）療法が使われてきたが、最近サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブといった新しい薬が臨床で使われるようになってきた。多発性骨髄腫の患者の６０％は初期治療で改善するが、ほとんどの患者は再発し、抗がん剤に対し耐性を示し、死に至る。新しい薬が出たといっても多発性骨髄腫はいまだに治る病気ではない（非特許文献１〜４）。
【０００５】
血液悪性腫瘍における薬剤耐性のメカニズムの一つとして、腫瘍細胞が骨髄の中で細胞外マトリックスや間質細胞と接着することで薬剤耐性を示すＣＡＭ−ＤＲ（Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）が知られている。この接着には腫瘍細胞のＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＶＬＡ−６が関係していることが言われており（非特許文献５〜９）それらの分子が細胞外マトリックスに結合することによって抗アポトーシス分子であるｂｃｌ−２やＭＤＲ−１が腫瘍細胞内に誘導されると報告されている（非特許文献５、非特許文献７、非特許文献１０）。このＣＡＭ−ＤＲは、インテグリン抗体や薬剤耐性に関与する細胞内シグナル伝達分子の阻害剤で減弱され、抗がん剤との組み合わせでより抗がん効果が強まることが示されている（非特許文献７、非特許文献１１）。一方、ＣＡＭ−ＤＲは、一部の固形がんでも報告されている（非特許文献１２〜１６）。これらのことは、ＣＡＭ−ＤＲを減弱させる医薬と抗がん剤との組み合わせは血液の悪性腫瘍のみならず固形がんにも応用できることを意味している。
【０００６】
Ｋｏｂｕｎｅらは、調べた多発性骨髄腫細胞５種がＷｎｔ３を発現しており、間質細胞と強く接着していることを見出した（非特許文献９）。これらの細胞ではＣＡＭ−ＤＲが観察され、インテグリンβ１抗体、インテグリンα６抗体、ＦＲＬＰ−１（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２がＣＡＭ−ＤＲを阻害するが、Ｗｎｔのカノニカルパスウェイの特異的阻害剤Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１は阻害しないことより多発性骨髄腫細胞がインテグリンα６／β１（ＶＬＡ−６）を介して間質細胞に接着することによりＷｎｔ／ＲｈｏＡ／Ｒｈｏキナーゼシグナルパスウェイが活性化されＣＡＭ−ＤＲが起こること示した。しかし、ここで用いた抗体、ＦＲＬＰ−１、Ｙ−２７６３２はＣＡＭ−ＤＲを１／３〜１／５程度減弱させるに過ぎず、薬としての可能性を示しているものではない。
【０００７】
また、Ｓｃｈｍｉｄｍａｉｅｒらは、スタチンがＣＡＭ−ＤＲを抑制し、そのメカニズムとしてスタチンが阻害するＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの下流にあるＲｈｏのゲラニルゲラニル化が抑制されることを述べている（非特許文献１７）。即ち、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの下流にあるＲａｓをファルネシル化するファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤ＦＴＩ−２７７はＣＡＭ−ＤＲを阻害しないが、Ｒｈｏをゲラニルゲラニル化するゲラニルゲラニル化トランスフェラーゼ阻害剤ＧＧＴＩ−２９８やその下流にあるＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２はＣＡＭ−ＤＲを阻害するとした。ここで用いているＣＡＭ−ＤＲは、間質細胞と接着させた場合とそうでない場合のＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色細胞数の差をカウントすることにより定量しているがその差は２倍程度の細胞数でしかなく、ＧＧＴＩ−２９８、Ｙ−２７６３２についても薬としての可能性を示しているものではない。
【０００８】
一方、ファスジルは、Ｒｈｏキナーゼ、ミオシン軽鎖リン酸化酵素、プロテインキナーゼCなどに対するキナーゼ阻害活性を有しており、血管平滑筋弛緩作用、血流増加作用、血圧低下作用、脳機能改善作用、心臓保護作用等を示し、血管拡張剤（特に狭心症治療剤）、高血圧治療剤、脳機能改善作用、心臓保護剤、及び動脈硬化症治療剤等として有用な物質であることが知られている（例えば特許文献１〜９、又は非特許文献１８〜２５参照）。 しかしながら、ファスジルがＣＡＭ−ＤＲを阻害することも、多発性骨髄腫に有効であることも知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭６１−１５２６５８号公報
【特許文献２】特開昭６１−２２７５８１号公報
【特許文献３】特開平２−２５６６１７号公報
【特許文献４】特開平４−２６４０３０号公報
【特許文献５】特開平６−０５６６６８号公報
【特許文献６】特開平６−０８０５６９号公報
【特許文献７】特開平７−８０８５４号公報
【特許文献８】特開平９−２２７３８１号公報
【特許文献８】国際公開９８／０６４３３号パンフレット
【特許文献９】国際公開００／０３７４６号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】最新医学１２（２００９） 最新医学社
【非特許文献２】日本臨床１２（２００７） 日本臨床社
【非特許文献３】Ｌａｎｃｅｔ ３７４：３２４−３３９（２００９）
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ Ｒｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ６：１８１−１８２（２００７）
【非特許文献５】ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅら Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：２６６−２７４（１９９９））
【非特許文献６】ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅら Ｊ． Ｌｅｕｋ． Ｂｉｏｌ． ７１：４９５−５０２（２００２）
【非特許文献７】Ｍａｔｓｕｎａｇａら Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１１５８−１１６５（２００３）
【非特許文献８】Ｓｃｈｕｅｔｚら Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．４：３１−４０（１９９３）
【非特許文献９】Ｋｏｂｕｎｅら Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．６：１７７４−１７８４（２００７）
【非特許文献１０】Ｌａｎｄｏｗｓｋｉら Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：４１７−４２１（２００３）
【非特許文献１１】Ｄａｍｉａｎｏら Ｂｌｏｏｄ ９３：１６５８−１６６７（１９９９）
【非特許文献１２】Ａｏｕｄｊｉｔら Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：４９９５−５００４ （２００１）
【非特許文献１３】Ｆｒｉｄｍａｎら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ８７：６６９８−６７０２（１９９０）
【非特許文献１４】Ｔｓｕｒｕｔａｎｉら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：８４２３−８４３２（２００５）
【非特許文献１５】Ｓｅｔｈｉら Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：６６２−６６８（１９９９）
【非特許文献１６】Ｕｈｍら Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１５８７−１５９４（１９９９）
【非特許文献１７】Ｓｃｈｍｉｄｍａｉｅｒら、Ｂｌｏｏｄ １０４：１８２５−１８３２（２００４）
【非特許文献１８】Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，９８，ｐ１０９１（１９８９）
【非特許文献１９】Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２５９，ｐ７３８（１９９１）
【非特許文献２０】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９６，ｐ４３５７（１９９７）
【非特許文献２１】Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，４３，ｐ１０２９（１９９９）
【非特許文献２２】Ｓｕｐｐｌｅ．Ｃｉｒｃ．１０４，Ｎｏ１７，１００１（２００１．１０．２３）
【非特許文献２３】日本臨床５９，Ｎｏ６，ｐ１０７６−１０８０、（２００１）
【非特許文献２４】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒａｍ．Ｂｕｌｌ．，４０，（３）ｐ７７０−７７３（１９９２）
【非特許文献２５】エリル(登録商標) 点滴静注液３０ｍｇ、添付文書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成抑制作用を有する有効成分と抗がん剤とを組み合わせて、がん細胞を効率的に死滅させることができる医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物が抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制する作用を有することを見出し、抗がん剤とファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬ががん細胞に対して極めて高い有効性を発揮することを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【００１３】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）１又は２以上の抗がん剤と、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬；
（２）ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物が、抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制するための有効成分である前記（１）に記載の医薬；
（３）多発性骨髄腫の治療のための前記（１）又は（２）に記載の医薬；
（４）抗がん剤がドキソルビシン、ビンクリスチン、メルファラン、デキサメサゾン、プレドニゾロン、ボルテゾミブ、サリドマイド、及びレナリドマイドからなる群から選ばれる１又は２以上の抗がん剤である前記（１）ないし（３）のいずれかに記載の医薬；
（５）抗がん剤がドキソルビシンである前記（４）に記載の医薬；
【００１４】
（６）抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制して抗がん剤によりがん細胞を死滅させる方法であって、１又は２以上の抗がん剤とファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせをがん細胞に接触させる工程を含む方法；
（７）抗がん剤がドキソルビシンである前記（６）に記載の方法；
（８）ドキソルビシンとファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬の適量を患者に投与する工程を含む、多発性骨髄腫の治療方法；
（９）多発性骨髄腫を治療するための前記（３）〜（５）のいずれかに記載の医薬の製造における１又は２以上の抗がん剤の使用、及び／又はファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用；
【００１５】
（１０）抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制するための医薬であって、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む医薬；及び
（１１）抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制する方法であって、がん細胞にファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を接触させる工程を含む方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の医薬は、多発性骨髄腫などの各種のがんの治療において、抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制しつつ、がん細胞を死滅させる効果を有することから、有効性の高いがん治療を可能にする医薬として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒト多発性骨髄腫に対するファスジルの細胞毒性を示した図である。
【図２】ヒト多発性骨髄腫のストローマ細胞への接着に対するファスジルの効果を示した図である。
【図３】ヒト多発性骨髄腫のＣＡＭ−ＤＲに対するファスジルの併用効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を示した図である。
【図４】ヒト多発性骨髄腫のＣＡＭ−ＤＲに対するファスジルの併用効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）を示した図である。
【図５】ヒト多発性骨髄腫のＣＡＭ−ＤＲに対するファスジルの併用効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）試験での骨髄中ヒトＣＤ３８発現を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ファスジルは、公知の方法、例えば、特許文献１（特開昭６１−１５２６５８号公報）、非特許文献２４（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒａｍ．Ｂｕｌｌ． ４０，（３）ｐ７７０−７７３（１９９２））等に記載されている方法に従って合成することができる。ファスジルの塩の形態は特に限定されないが、例えば酸付加塩としては薬学上許容される非毒性の塩が好ましく、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸等の無機酸、及び酢酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸等の有機酸の塩を挙げることができる。また、ファスジル又はその塩の水和物又は溶媒和物としては、例えば１／２水和物又は溶媒和物、１水和物又は溶媒和物、３水和物又は溶媒和物を挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１９】
抗がん剤の種類は特に限定されないが、例えば、ドキソルビシン、ビンクリスチン、メルファラン、デキサメサゾン、プレドニゾロン、ボルテゾミブ、サリドマイド、及びレナリドマイドからなる群から選ばれる１又は２以上の抗がん剤が好ましい例として挙げられ、ドキソルビシンが特に好ましい。
【００２０】
本発明医薬は、抗がん剤の１種又は２種以上と、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬である。組み合わせとしては、単一の投与形態中に抗がん剤の１種又は２種以上とファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物とを含めたいわゆる合剤の形態であってもよく、あるいは単位投与形態の抗がん剤と、単位投与形態のファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む製剤とを組み合わせて投与してもよい。
【００２１】
合剤の形態の医薬は、有効成分である１又は２以上の抗がん剤と、有効成分であるファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物とを含む単一形態の医薬組成物として調製されることが好ましく、医薬組成物は製剤学上許容される１種又は２種以上の担体を用いて調製されることが好ましい。担体としては、例えば、ゼラチン；乳糖、グルコース等の糖類；小麦、米、とうもろこし澱粉等の澱粉類；ステアリン酸等の脂肪酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩；タルク；植物油；ステアリンアルコール、ベンジルアルコール等のアルコール；ガム；ポリアルキレングリコール等が挙げられる。
【００２２】
液状担体としては、一般に水、生理食塩液、デキストロース又は類似の糖溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグルコール類が挙げられる。カプセル剤となす場合には、ゼラチンを用いてカプセルを調整することが好ましい。
【００２３】
本発明の医薬の投与方法は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれの投与方法で投与してもよい。経口投与に適した剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤、又はエリキシル剤等が挙げられ、非経口投与に適した剤形としては、例えば注射剤又は点滴剤などの溶液剤が挙げられる。非経口的に、例えば筋肉内注射、静脈内注射、若しくは皮下注射、又は点滴により投与する場合、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物等張にするために、食塩又はグルコース等の他の溶質を添加した無菌溶液として投与することができる。
【００２４】
注射により投与する場合の溶解液としては、例えば、滅菌水、塩酸リドカイン溶液（筋肉内注射用）、生理食塩液、ブドウ糖、静脈内注射用溶液、電解質溶液（静脈内注射用）等が例示される。このようにして溶解した場合のファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の下限は、好ましくは０．０１重量％以上、さらに好ましくは０．１重量％以上、上限は好ましくは２０重量％以下、さらに好ましくは１０重量％以下程度である。抗がん剤の濃度は使用する抗がん剤の種類に応じて適宜選択することが望ましい。経口投与の液剤の場合、０．０１−２０重量％の有効成分を含む懸濁液又はシロップが好ましい例として挙げられる。この場合における担体としては、香料、シロップ、製剤的ミセル体等の水様賦形剤が挙げられる。
【００２５】
本発明の医薬の投与量は、被投与者の年齢、健康状態、体重、症状の程度、同時処置があるならばその種類、処置頻度、所望の効果の性質、あるいは投与経路や投与計画などによって異なるが、非経口投与の場合にファスジルの投与量が０．０１−２０ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは０．０５−１０ｍｇ／ｋｇ・日、より好ましくは０．１−１０ｍｇ／ｋｇ・日となるように、経口投与の場合にファスジルの投与量が０．０２−１００ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは０．０５−２０ｍｇ／ｋｇ・日、より好ましくは０．１−１０ｍｇ／ｋｇ・日となるように選択することができる。抗がん剤の投与量は使用する抗がん剤の種類に応じて適宜選択することが望ましい。
【００２６】
別々に調製されたファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む製剤及び抗がん剤を組み合わせて投与する場合には、両者を投与直前に混合して１つの投与単位として投与することもできるが、別々の投与形態のまま同時に、又は逐次に投与してもよい。一般的には抗がん剤の投与計画は厳密であり、数日ないし数週間の休薬期間を設けて投与することが多いが、抗がん剤については通常採用される投与計画をそのまま適用し、その投与計画における投与期間内においてファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む製剤を連日又は隔日など適宜の投与頻度で投与することができる。なお、組み合わせによる投与を採用する場合には、両者を経口投与又は非経口投与により投与するほか、一方を経口投与し、他方を非経口投与することも可能である。
【００２７】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の医薬は、がん細胞の抗がん剤に対する耐性形成を抑制しつつ抗がん作用を発揮することができる。ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物は、抗がん剤に対するがん細胞の耐性の獲得を軽減ないし防止することができる。また、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物は、抗がん剤の投与によりすでに形成されたがん細胞の抗がん剤に対する耐性を軽減ないし排除することができる。従って、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物と抗がん剤とを組み合わせて含む本発明の医薬を用いることにより、抗がん剤に対する耐性の獲得を軽減ないし排除しつつ、あるいはすでに形成された抗がん剤に対する耐性を軽減ないし排除しつつ、抗がん剤により有効ながん治療を行うことが可能になる。本明細書において用いられる「耐性形成の抑制」という用語は、耐性獲得の阻害のほか、すでに形成された耐性の軽減ないし排除を含む概念であり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例
に限定されることはない。
例１
まず、試験管内でファスジルのヒト多発性骨髄腫に対する細胞毒性の検討を行った。ヒト多発性骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−５、ＡＲＨ−７７、ＲＰＭＩ８２２６； 非特許文献９：Ｋｏｂｕｎｅら Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．６：１７７４−１７８４（２００７））は、２×１０4個／ウェルで９６穴カルチャープレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に播種して、異なる濃度（０、１、５、１０、５０及び１００μＭ）のファスジル（旭化成ファーマ、東京、日本）を含むＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いて、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2にて培養した。細胞生存率は、培養２４時間目に、Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ、東京、日本）を用いて、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）にて測定を行った。ファスジルは、ＫＭＳ−５、ＡＲＨ−７７、ＲＰＭＩ８２２６に対して各々１００μＭ、５０μＭ、５０μＭで毒性を示した。図１に結果を示す。
【００２９】
次にヒト多発性骨髄腫のストローマ細胞への接着に対するファスジルの効果を検討した。ヒトテロメラーゼ遺伝子導入ヒトストローマ細胞（Ｋｏｂｕｎｅら Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．３３：１５４４−１５５３（２００５）、Ｋａｗａｎｏら Ｂｌｏｏｄ １０１：５３２−５４０（２００３））は、セルカルチャーインサート（孔径０．４μm、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）の裏側に５×１０4個／ウェルの密度でまいて、４８時間、３７℃、５％ＣＯ2にてＭＥＭ-α培地＋１２．５％ウマ血清＋１２．５％ＦＢＳ＋１μｍｏｌ／Ｌハイドロコルチゾン＋１００μｍｏｌ／Ｌ β-メルカプトエタノール＋２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン培地を用いて培養した。培養２４時間目に、ヒトテロメラーゼ遺伝子導入ヒトストローマ細胞を播種したセルカルチャーインサートを１２穴カルチャープレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に移し、２×１０5個／ウェルの濃度で多発性骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−５、ＡＲＨ−７７、ＲＰＭＩ８２２６）をセルカルチャーインサート内に播種して、異なる濃度（０、１、５、１０及び５０μM）のファスジルを含むＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＢＳを用いて、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2にて培養した。細胞接着率は、培養２４時間目に、浮遊細胞及び接着細胞を回収して、細胞数を数えて、接着した細胞数を回収した全細胞数で割ることにより求めた。得られたデータは、Ｔ検定を用いて統計処理を行った。ＫＭＳ−５に対しては５０μＭ、ＡＲＨ−７７、ＲＰＭＩ８２２６に対しては１０μＭのファスジルがストローマ細胞への接着を抑制することが確認された。図２に結果を示す。
【００３０】
次にヒト多発性骨髄腫細胞のＣＡＭ−ＤＲによる細胞生存性に対するファスジルとドキソルビシン処理の効果を検討した。ヒトテロメラーゼ遺伝子導入ヒトストローマ細胞は、セルカルチャーインサート(孔径０．４μm、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）の裏側に５×１０4個／ウェルの密度でまいて、４８時間、３７℃、５％ＣＯ2にてＭＥＭ−α培地＋１２．５％ウマ血清＋１２．５％ＦＢＳ＋１μmol/Lハイドロコルチゾン＋１００μｍｏｌ／Ｌ β-メルカプトエタノール＋２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン培地を用いて培養した。培養２４時間目に、ヒトテロメラーゼ遺伝子導入ヒトストローマ細胞を播種したセルカルチャーインサートを１２穴カルチャープレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に移し、２×１０5個／ウェルの濃度で多発性骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−５、ＡＲＨ−７７、ＲＰＭＩ８２２６）をセルカルチャーインサート内に播種して、異なる濃度（０、１０及び５０μM）のファスジルを含むＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いて、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2にて培養した。ファスジルの濃度は、各々の細胞で毒性を示さない濃度を用いた。培養２４時間目に、異なる濃度のドキソルビシン（０、０．１、０．３、１、３及び１０μＭ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＢＳを用いて、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2にて培養した。培養２４時間後に、浮遊細胞及び接着細胞を回収して、９６穴カルチャープレートに移して、Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、細胞生存率をマイクロプレートリーダーにて測定した。
【００３１】
ヒトストローマ細胞がない場合には、ファスジル存在下、非存在下でドキソルビシンの多発性骨髄腫細胞感受性に差がないが、ヒトストローマ細胞がある場合には、ファスジル非存在下でストローマ細胞がない場合に比べてドキソルビシンに対する耐性度が上がることが観察された（ＣＡＭ−ＤＲ）。ところがファスジルを添加するとストローマ細胞がない場合と同程度にドキソルビシンに対する感受性が上昇した。図３に結果を示す。この結果は、ストローマ細胞がある場合には、ＣＡＭ−ＤＲが起こり、ファスジルがＣＡＭ−ＤＲを低下することを意味しており、ファスジルがＣＡＭ−ＤＲを抑制させドキソルビシンのような抗がん剤の作用を強めることが期待される。
【００３２】
例２
多発性骨髄腫細胞を移植したＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）へのファスジルとドキソルビシンの投与による生存率の検討を行った。ＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスに対して４５ｍｇ／ｋｇの濃度でブスルファン（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内注射した。ブスルファン投与２日目に、２×１０6個／１００μＬ ＰＢＳの濃度のＫＭＳ−５細胞を尾静脈注射した。細胞移植7及び１４日目に、ファスジルを１０mg／kgの濃度で、また、ドキソルビシンを４mg／ｋｇの濃度で尾静脈注射した。ＰＢＳ投与群、ファスジル投与群、ドキソルビシン投与群、ファスジル、ドキソルビシン併用投与群は、各々６匹のＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスを使用し、細胞移植から１２週間、マウスの生存を調べた（図４）。また、脛骨、腓骨及び大腿骨より骨髄細胞を採取し、ＲＮＡを抽出した後、ヒトＣＤ３８及びコントロールであるＧＡＰＤＨのプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲを行った（図５）。すなわち、ヒトＣＤ３８プライマー（フォワードプライマー： ５’−ＴＴＧＧＧＡＡＣＴＣＡＣＡＣＣＧＴＡＣＣ−３’、リバースプライマー：５’−ＧＴＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣ−３’）及びＧＡＰＤＨプライマー（フォワードプライマー：５’−ＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ−３’、リバースプライマー：５’−ＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ−３’）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃、５分、１サイクル、９５℃、３０秒、５５℃、１分、７２℃、３０秒、３０サイクル、７２℃、２分、１サイクルであった。ＰＣＲ終了後、ＰＣＲ産物は、１μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルを用いて、１００Vで３０分間、電気泳動を行った。電気泳動終了後、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲトランスイルミネーター(Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ)を用いてバンドの検出を行った。結果を図４及び図５に示す。
【００３３】
ＰＢＳ投与群、ファスジル投与群、ドキソルビシン投与群では６０日までにすべてのマウスが死んだが、ファスジル、ドキソルビシン併用投与群では２／３が９０日まで生き残った。また、骨髄におけるヒトＣＤ３８は、生き残ったマウスにおいてほとんど観察されず、がん細胞がなくなっていることがわかった。この効果は、例１から想定される効果を顕著に上回る効果ということができる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の医薬は、多発性骨髄腫などの各種がんの治療において、抗がん剤に対するがん細胞の耐性獲得を阻害し、及び／又はすでに耐性を獲得したがん細胞の耐性を減弱ないし排除しつつ、がん細胞を効率的に死滅させる効果を有することから、極めて有効な医薬として利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は２以上の抗がん剤と、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬。
【請求項２】
ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物が、抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制するための有効成分である請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
多発性骨髄腫の治療のための請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
抗がん剤がドキソルビシン、ビンクリスチン、メルファラン、デキサメサゾン、プレドニゾロン、ボルテゾミブ、サリドマイド、及びレナリドマイドからなる群から選ばれる１又は２以上の抗がん剤である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項５】
抗がん剤がドキソルビシンである請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
請求項３ないし５のいずれか１項に記載の医薬の製造における１又は２以上の抗がん剤の使用、及び／又はファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用。
【請求項７】
抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制するための医薬であって、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む医薬。
【請求項１】
１又は２以上の抗がん剤と、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物との組み合わせを含む医薬。
【請求項２】
ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物が、抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制するための有効成分である請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
多発性骨髄腫の治療のための請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
抗がん剤がドキソルビシン、ビンクリスチン、メルファラン、デキサメサゾン、プレドニゾロン、ボルテゾミブ、サリドマイド、及びレナリドマイドからなる群から選ばれる１又は２以上の抗がん剤である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項５】
抗がん剤がドキソルビシンである請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
請求項３ないし５のいずれか１項に記載の医薬の製造における１又は２以上の抗がん剤の使用、及び／又はファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用。
【請求項７】
抗がん剤に対するがん細胞の耐性形成を抑制するための医薬であって、ファスジル若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む医薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１０６９４６（Ｐ２０１２−１０６９４６Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５６５１８（Ｐ２０１０−２５６５１８）
【出願日】平成２２年１１月１７日（２０１０．１１．１７）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１７日（２０１０．１１．１７）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]