プロテアーゼスクリーニング方法およびそれにより同定されるプロテアーゼ
【課題】
所望の基質特異性および活性をもつプロテアーゼまたは突然変異体プロテアーゼの選択方法を提供すること。
【解決手段】
候補および修飾プロテアーゼを、基質の開裂時に、安定した複合体を形成することによりプロテアーゼを捕捉する基質、例えばセルピン、アルファマクログロブリンまたはｐ３５ファミリータンパク質または修飾セルピンおよび修飾ｐ３５ファミリーメンバーまたは修飾アルファマクログロブリンと接触させることにより、それらをスクリーニングし、改変された機能を有する修飾プロテアーゼを同定することにより上記課題を解決する。
所望の基質特異性および活性をもつプロテアーゼまたは突然変異体プロテアーゼの選択方法を提供すること。
【解決手段】
候補および修飾プロテアーゼを、基質の開裂時に、安定した複合体を形成することによりプロテアーゼを捕捉する基質、例えばセルピン、アルファマクログロブリンまたはｐ３５ファミリータンパク質または修飾セルピンおよび修飾ｐ３５ファミリーメンバーまたは修飾アルファマクログロブリンと接触させることにより、それらをスクリーニングし、改変された機能を有する修飾プロテアーゼを同定することにより上記課題を解決する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質標的基質における開裂配列を開裂するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する方法であって、
ａ）プロテアーゼおよび／またはプロテアーゼの触媒活性部分のコレクションをプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させるが、ただし、
プロテアーゼトラップポリペプチドは、開裂配列を含む反応性部位を含み、それによりプロテアーゼまたはその触媒活性部分による反応性部位におけるアミノ酸の開裂時に、プロテアーゼトラップポリペプチドは、プロテアーゼまたはその触媒活性部分と共有結合を形成することにより複合体を形成し、また
接触は、コレクション中のプロテアーゼまたはその触媒活性部分によりプロテアーゼトラップポリペプチドの反応性部位におけるアミノ酸を開裂させることにより、プロテアーゼまたはその触媒活性部分と共有結合しているプロテアーゼトラップポリペプチドを含む複合体を形成させる条件下で実施されるものとし、
ｂ）コレクションの非複合体形成構成員から複合体形成プロテアーゼを分離し、次いで
ｃ）複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する、すなわちプロテアーゼトラップポリペプチドにおける開裂配列を開裂するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択することにより、タンパク質標的基質を開裂するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する
ことを含む方法。
【請求項２】
プロテアーゼトラップポリペプチドが、セルピン、アルファ−マクログロブリンファミリーの構成員、ｐ３５ファミリーの構成員、およびそれらの修飾形態から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プロテアーゼのコレクションが、それらの一次配列に修飾を含むプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションが、非修飾プロテアーゼとは異なり、標的基質に対して改変された活性および／または特異性を有するように修飾されている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
プロテアーゼトラップポリペプチドを検出または分離用に標識し、また
プロテアーゼまたはその触媒活性部分と共に検出可能なプロテアーゼトラップポリペプチドを含む複合体の捕獲により分離を行う、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
捕獲が、懸濁液、溶液または固体支持体において行われる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
プロテアーゼトラップポリペプチドをビオチンで標識する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
さらに分離された複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分を増幅することを含み、増幅が、宿主細胞におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分をコード化する核酸の増殖および発現を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複数の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドをコレクションと接触させ、
少なくとも２つのプロテアーゼトラップポリペプチドが同定可能な形で検出され得ることにより、複数のプロテアーゼが同定される、多重方式で実施される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分がディスプレーされ、同定または選択後にそれらを増幅させることにより、プロテアーゼおよび／またはその触媒活性部分の第２コレクションを作製し得る、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、第２コレクションを第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、安定した複合体の第２セットを製造することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第２プロテアーゼトラップポリペプチドが、第１プロテアーゼトラップポリペプチドと同一または異なる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらに、安定した複合体の第２セットにおいてプロテアーゼを同定または選択することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
コレクションが、少なくとも５、１０、５０、１００、５００、１０３、１０４、１０５、１０６またはそれ以上の異なる構成員を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分がセリンおよび／またはシステインプロテアーゼである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分がディスプレーされている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、固体支持体、細胞表面または微生物表面でディスプレーされる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、酵母、細菌、ウイルス、ファージ、核酸、ｍＲＮＡ分子の表面またはリボソームでディスプレーされる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、ファージディスプレーライブラリーでディスプレーされる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
プロテアーゼがプロテアーゼの触媒活性部分として提供される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも２つの異なるプロテアーゼトラップポリペプチドをコレクションと接触させ、さらに
プロテアーゼトラップポリペプチドの少なくとも一方を検出可能な形で標識することにより、検出可能なプロテアーゼトラップポリペプチドおよびプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む安定した複合体の捕獲が行われ、
他方または他の複数プロテアーゼトラップポリペプチドがそれぞれ検出可能な形で標識されたプロテアーゼトラップポリペプチドと比べて過剰に存在している、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
検出可能な標識がビオチンである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、キモトリプシン、ズブチリシン、カスパーゼおよびパパインファミリーのプロテアーゼから選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼまたはその触媒活性部分であり、グランザイムＢ、テスチシン、トリプターゼベータ１、カリクレインｈｋ５、コリン、カリクレイン１２、ＤＥＳＣ１オリテサーゼ、トリプターゼガンマ１、カリクレインｈＫ１4，ヒアルロナン結合セリンプロテアーゼ、トリプターゼ、カリクレインｈＫ１５、トリプシン、好中球エラスターゼ、マンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ−３、カテプシンＧ、ミエロブラスチン、グランザイムＡ、グランザイムＭ、キマーゼ、グランザイムＫ、グランザイムＨ、キモトリプシンＢ、膵臓エラスターゼ、膵臓エンドペプチダーゼＥ、膵臓エラスターゼII、エンテロペプチダーゼ、キモトリプシンＣ、プロスタシン、カリクレイン１、カリクレインｈＫ２、カリクレイン３、ヒトカリクレイン８、メソトリプシン、因子ＸII、血漿カリクレインＫＬＫ３、因子ＸＩ、因子ＩＸ、因子ＶII、因子Ｘａ、トロンビン、プロテインＣ、アクロシン、ヘプシン、肝細胞増殖因子活性化因子（ｕＰＡ）、尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミン、ニューロシン、ニューロトリプシン、ニューロプシン、カリクレインｈＫ１０、エピセリアシン、プロスターゼ、キモパシン、カリクレイン１１、ＭＴ−ＳＰ１、スピネシン、カテプシンＬ、カテプシンＶ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カテプシンＦ、カテプシンＢ、パパイン、クルザイン、ズブチリシン、テルミターゼ、Ｃ５ａペプチダーゼ、フェルビドリシン、ラクトセピン、フリン、ケキシン、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−６、カスパーゼ−２、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１、カスパーゼ−１３およびカスパーゼ−１４から選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびＭＴ−ＳＰ１から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
プロテアーゼトラップポリペプチドが、標的基質についての予め定められた基質特異性および／または活性を有するプロテアーゼにより開裂されるように修飾されている、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
プロテアーゼトラップポリペプチドが、セルピンであり、セルピンまたはその修飾形態が、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）または抗トロンビンIII（ＡＴ３）またはそれらの修飾形態から選択される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
プロテアーゼトラップポリペプチドが、アルファ２−マクログロブリンまたはその修飾形態である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
修飾形態が、プロテアーゼトラップポリペプチドの反応性部位において１つまたはそれ以上のアミノ酸置き替え、欠失または置換を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
修飾が、標的基質の開裂配列に対応するいずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸置換である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
標的基質が疾患または障害の病因に関与するものである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
標的基質が、ＩＬ−５、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−４、ＩＬ−４受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ受容体、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ｇｐ１２０、ｇｐ１４１、ＣＤ４、ＲＳＶ融合タンパク質、血球凝集素、Ｂ７、ＣＤ２８、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４０、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＨＥＲ２、ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ３、Ｓｒｃ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２、ＢＣＲ−Ａｂ１、ＧＳＫ−３、Ｃｄｋ−２、Ｃｄｋ−４、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２および補体タンパク質から選択される、請求項３０または請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
開裂配列に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾が、配列番号４０６〜４３２および４８０〜４８９のいずれか１項に示されたアミノ酸の配列を有する、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
プロテアーゼの同定方法が複数回実施され、その過程が反復的である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
プロテアーゼが、対応する鋳型プロテアーゼの非標的基質の場合と比べて標的基質における開裂配列についての高い基質特異性および／または活性を呈するまで、本方法を実施する、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
複数の異なるプロテアーゼが少なくとも本方法の初回反復で同定される、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
さらに、同定されたプロテアーゼのアミノ酸配列を比較することにより、ホットスポットを同定することを含み、
ホットスポットが、同定されたプロテアーゼの少なくとも２、３、４、５またはそれ以上に存する修飾された遺伝子座であり、
修飾された遺伝子座が、コレクションが修飾プロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む場合には修飾されているものである、
請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
さらに、
第１の一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼを同定後、プロテアーゼの第２コレクションを製造するが、ただし、同定された第１プロテアーゼを鋳型として用いて、プロテアーゼ配列またはその触媒活性部分にさらなる突然変異を導入することにより、第２コレクションの構成員が、同定された第１プロテアーゼの突然変異および追加的突然変異を有するポリペプチドを含んでいるものとし、
次いで、第２コレクションを、第１の一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼを単離するのに使用した第１プロテアーゼトラップポリペプチドと同一または異なる第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させるが、ただし、第１および第２プロテアーゼトラップポリペプチドは、所望の標的基質特異性を有するプロテアーゼにより開裂されるように修飾されているものとし、
複合体におけるコレクションから第２プロテアーゼ（複数も可）またはプロテアーゼの触媒活性部分（複数も可）を同定するが、ただし、同定された第２プロテアーゼ（複数も可）は、同定された第１プロテアーゼよりも標的基質に対する高い活性または特異性を有するものとする、
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、プロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼまたはその触媒活性部分の間の反応に競合物質を加えることにより、同定されたプロテアーゼ（複数も可）またはその触媒活性部分（複数も可）の選択性を高めることを含む方法である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
さらに、
ａ）第１開裂配列を含む第１プロテアーゼトラップポリペプチドと安定した複合体を形成する第１の一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定後、同定されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分を、第２開裂配列を含む第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させ、ただし接触については競合物質の存在下で実施するものとし、
ｂ）第２プロテアーゼトラップポリペプチドと複合体を形成するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する
ことを含み、
同定、進化または選択されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分が、少なくとも２つの開裂配列についての基質特異性および／または開裂活性を有するものである、
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも２つの開裂配列が一標的基質に存する、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも２つの開裂配列が２つの異なる標的基質に存する、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
第１および第２プロテアーゼトラップポリペプチドが異なり、それぞれ、異なる標的基質についての所望の基質特異性を有するプロテアーゼにより開裂されるように修飾されている、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
さらに、少なくとも２つの開裂配列に対し所望の、または予め定められた基質特異性および開裂活性をもつ同定または選択されたプロテアーゼが単離されるまで、段階ａ）およびｂ）を少なくとも再度反復することを含む、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
さらに、標的基質の開裂配列に対する基質特異性について同定されたプロテアーゼをスクリーニングすることを含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
プロテアーゼおよび／またはその触媒活性部分のコレクション、および
セルピン、アルファマクログロブリンファミリーの構成員、またはｐ３５ファミリーの構成員またはそれらの修飾形態である少なくとも１つのプロテアーゼトラップポリペプチド
を含む組合わせ。
【請求項４７】
プロテアーゼおよび／またはその触媒活性部分のコレクションがディスプレーライブラリーで呈示される、請求項４６記載の組合わせ。
【請求項４８】
ディスプレーライブラリーがファージディスプレーライブラリーであり、構成員が少なくともプロテアーゼの触媒活性部分をディスプレーする、請求項４７記載の組合わせ。
【請求項４９】
プロテアーゼまたはその触媒活性フラグメントが、セリンプロテアーゼのキモトリプシンファミリーのものであり、キモトリプシンのナンバリングに基づき３０、７３、８９および１５５位に対応する位置のいずれか１項に１つまたはそれ以上の突然変異を含み、基質特異性が改変されている、修飾プロテアーゼ。
【請求項５０】
プロテアーゼが、修飾尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメントである、請求項４９記載の修飾プロテアーゼ。
【請求項５１】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、キモトリプシンのナンバリングに基づき、２１、２４、３０、３９、６１（Ａ）、８０、８２、８４、８９、９２、１５６、１５８、１５９および１８７位から選択された位置に対応する位置に１つまたはそれ以上の修飾を含む、修飾尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）ポリペプチド。
【請求項５２】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Ｆ２１Ｖ、Ｉ２４Ｌ、Ｆ３０Ｖ、Ｆ３０Ｌ、Ｔ３９Ａ、Ｙ６１（Ａ）Ｈ、Ｅ８０Ｇ、Ｋ８２Ｅ、Ｅ８４Ｋ、Ｉ８９Ｖ、Ｋ９２Ｅ、Ｋ１５６Ｔ、Ｔ１５８Ａ、Ｖ１５９ＡおよびＫ１８７Ｅから選択される１つまたはそれ以上の修飾を含む、請求項５１記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５３】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Ｆ２１Ｖ；Ｉ２４Ｌ；Ｆ３０Ｖ；Ｆ３０Ｌ；Ｆ３０Ｖ／Ｙ６１（ａ）Ｈ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ１５６Ｔ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｔ３９Ａ／Ｖ１５９Ａ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｔ１５８Ａ／Ｖ１５９Ａ；Ｆ３０Ｖ／Ｙ６１（ａ）Ｈ／Ｋ９２Ｅ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ／Ｅ８０Ｇ／Ｉ８９Ｖ／Ｋ１８７Ｅ；およびＦ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ／Ｅ８０Ｇ／Ｅ８４Ｋ／Ｉ８９Ｖ／Ｋ１８７Ｅから選択される修飾を含む、請求項５２記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５４】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、キモトリプシンのナンバリングに基づき、３８、７２、７３、７５、１３２、１３３、１３７、１３８、１５５、１６０および２１７位から選択された位置に対応する位置に１つまたはそれ以上の修飾を含む、修飾尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）ポリペプチド。
【請求項５５】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Ｖ３８Ｄ、Ｒ７２Ｇ、Ｌ７３Ａ、Ｌ７３Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｆ１３２Ｌ、Ｇ１３３Ｄ、Ｅ１３７Ｇ、Ｉ１３８Ｔ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｍ、Ｖ１６０ＡおよびＲ２１７Ｃから選択される１つまたはそれ以上の修飾を含む、請求項５４記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５６】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、さらにキモトリプシンのナンバリングに基づく３０位および／または８９位に修飾を含む、請求項５４記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５７】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分におけるさらなる修飾が、Ｆ３０Ｉ、Ｆ３０Ｔ、Ｆ３０Ｌ、Ｆ３０Ｖ、Ｆ３０Ｇ、Ｆ３０ＭおよびＩ８９Ｖから選択される、請求項５６記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５８】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ；Ｌ７３Ｐ；Ｒ２１７Ｃ；Ｌ１５５Ｐ；Ｓ７５Ｐ／Ｉ８９Ｖ／Ｉ１３８Ｔ；Ｅ１３７Ｇ；Ｒ７２Ｇ／Ｌ１５５Ｐ；Ｇ１３３Ｄ；Ｖ１６０Ａ；Ｖ３８Ｄ；Ｆ１３２Ｌ／Ｖ１６０Ａ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｔ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｌ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｖ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｇ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｖ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｍ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｍ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｌ／Ｌ１５５Ｍ；およびＬ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｇ／Ｌ１５５Ｍから選択される修飾を含む、請求項５７記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５９】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、キモトリプシンのナンバリングに基づき、Ｆ３０Ｉ、Ｆ３０Ｔ、Ｆ３０ＧおよびＦ３０Ｍから選択される突然変異に対応する１つまたはそれ以上の修飾を含む、修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項６０】
ｕ−ＰＡポリペプチドが、配列番号４３３に示された野生型ｕ−ＰＡポリペプチドと８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し、ポリペプチドが１つまたはそれ以上の修飾を含む、請求項５１〜５９のいずれか１項に記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項６１】
配列番号２５３に示されたＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドにおいて、キモトリプシンのナンバリングに基づき、Ｄ２３Ｅ、Ｉ４１Ｆ、Ｉ４１Ｔ、Ｌ５２Ｍ、Ｙ６０（ｇ）ｓ、Ｔ５６Ｋ、 Ｈ７１Ｒ、Ｆ９３Ｌ、Ｎ９５Ｋ、Ｆ９７Ｙ、Ｆ９７Ｌ、Ｔ９８Ｐ、Ｆ９９Ｌ、Ａ１２６Ｔ、Ｖ１２９Ｄ、Ｐ１３１Ｓ、Ｉ１３６Ｔ、Ｉ１３６Ｖ、Ｈ１４３Ｒ、Ｔ１４４Ｉ、Ｉ１５４Ｖ、Ｎ１６４Ｄ、Ｔ１６６Ａ、Ｌ１７１Ｆ、Ｐ１７３Ｓ、Ｆ１８４（ａ）Ｌ、Ｑ１９２Ｈ、Ｓ２０１Ｉ、Ｑ２０９Ｌ、Ｑ２２１（ａ）Ｌ、Ｒ２３０Ｗ、Ｆ２３４ＬおよびＶ２４４Ｇから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項６２】
さらに、配列番号２５３に示されたＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドにおける修飾Ｑ１７５ＲまたはＤ２１７Ｖに対応する１つまたはそれ以上の修飾を含む、請求項６１記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド。
【請求項６３】
アミノ酸修飾が、Ｉ１３６Ｔ／Ｎ１６４Ｄ／Ｔ１６６Ａ／Ｆ１８４（Ａ）Ｌ／Ｄ２１７Ｖ；Ｉ４１Ｆ；Ｉ４１Ｆ／Ａ１２６Ｔ／Ｖ２４４Ｇ；Ｄ２３Ｅ／Ｉ４１Ｆ／Ｔ９８Ｐ／Ｔ１４４Ｉ；Ｉ４１Ｆ／Ｌ１７１Ｆ／Ｖ２４４Ｇ；Ｈ１４３Ｒ／Ｑ１７５Ｒ；Ｉ４１Ｆ／Ｌ１７１Ｆ；Ｒ２３０Ｗ；Ｉ４１Ｆ／Ｉ１５４Ｖ／Ｖ２４４Ｇ；Ｉ１４１Ｆ／Ｌ５２Ｍ／Ｖ１２９Ｄ／Ｑ２２１（Ａ）Ｌ；Ｆ９９Ｌ；Ｆ９７Ｙ／Ｉ１３６Ｖ／Ｑ１９２Ｈ／Ｓ２０１Ｉ；Ｈ７１Ｒ／Ｐ１３１Ｓ／Ｄ２１７Ｖ；Ｄ２１７Ｖ；Ｔ６５Ｋ／Ｆ９３Ｌ／Ｆ９７Ｙ／ Ｄ２１７Ｖ；Ｉ４１Ｔ／Ｐ１７３Ｓ／Ｑ２０９Ｌ；Ｆ９７Ｌ／Ｆ２３４Ｌ；Ｑ１７５Ｒ；Ｎ９５Ｋ；およびＹ６０（Ｇ）Ｓから選択される、請求項６２記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド。
【請求項６４】
修飾により、Ｃ２補体タンパク質についての特異性またはＣ２補体タンパク質に対する活性の一方または両方が高められる、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド。
【請求項６５】
ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが、配列番号２５３に示された野生型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド、または配列番号５０５に示されたその触媒活性部分と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し、ポリペプチドが１つまたはそれ以上の修飾を含む、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド。
【請求項６６】
請求項５１〜５３および６０のいずれか１項に記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６７】
請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６８】
請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６９】
請求項５１〜６０記載の修飾ｕ−ＰＡプロテアーゼのいずれか１つまたは求項６１〜６５記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのいずれか１つをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項７０】
請求項６９記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７１】
請求項７０記載のベクターを含む細胞。
【請求項７２】
ｔ−ＰＡの投与により処置される疾患または状態の処置における使用のための請求項６６記載の医薬組成物。
【請求項７３】
ｔ−ＰＡにより処置される疾患または状態を処置する医薬の製造における請求項６６記載の医薬組成物の使用。
【請求項７４】
ＶＥＧＦＲ−２が介在する疾患または状態の処置における使用のための請求項６７記載の医薬組成物。
【請求項７５】
ＶＥＧＦＲ−２が介在する疾患または状態を処置する医薬の製造における、請求項６７記載の医薬組成物の使用。
【請求項７６】
補体タンパク質Ｃ２が介在する疾患または状態の処置における使用のための請求項６８記載の医薬組成物。
【請求項７７】
補体タンパク質Ｃ２が介在する疾患または状態を処置する医薬の処方を目的とする、請求項６８記載の医薬組成物の使用。
【請求項７８】
疾患または障害の病因に関与している標的基質についての開裂配列を伴うＰ４〜Ｐ２´位のいずれか１つまたはそれ以上に対応するその反応性部位ループに修飾を含む、修飾セルピンポリペプチド。
【請求項７９】
標的基質が、ＶＥＧＦＲ、補体タンパク質またはｔ−ＰＡ基質から選択される、請求項７８記載の修飾セルピンポリペプチド。
【請求項８０】
標的基質がＶＥＧＦＲ２またはＣ２である、請求項７９記載の修飾セルピンポリペプチド。
【請求項８１】
セルピンが、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）または抗トロンビン−３（ＡＴ３）である、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の修飾セルピンポリペプチド。
【請求項８２】
配列番号４９７、４９９、６１０および６１１のいずれかに示されたアミノ酸の配列を有する請求項７８〜８１のいずれか１項に記載の修飾セルピンポリペプチド。
【請求項１】
タンパク質標的基質における開裂配列を開裂するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する方法であって、
ａ）プロテアーゼおよび／またはプロテアーゼの触媒活性部分のコレクションをプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させるが、ただし、
プロテアーゼトラップポリペプチドは、開裂配列を含む反応性部位を含み、それによりプロテアーゼまたはその触媒活性部分による反応性部位におけるアミノ酸の開裂時に、プロテアーゼトラップポリペプチドは、プロテアーゼまたはその触媒活性部分と共有結合を形成することにより複合体を形成し、また
接触は、コレクション中のプロテアーゼまたはその触媒活性部分によりプロテアーゼトラップポリペプチドの反応性部位におけるアミノ酸を開裂させることにより、プロテアーゼまたはその触媒活性部分と共有結合しているプロテアーゼトラップポリペプチドを含む複合体を形成させる条件下で実施されるものとし、
ｂ）コレクションの非複合体形成構成員から複合体形成プロテアーゼを分離し、次いで
ｃ）複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する、すなわちプロテアーゼトラップポリペプチドにおける開裂配列を開裂するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択することにより、タンパク質標的基質を開裂するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する
ことを含む方法。
【請求項２】
プロテアーゼトラップポリペプチドが、セルピン、アルファ−マクログロブリンファミリーの構成員、ｐ３５ファミリーの構成員、およびそれらの修飾形態から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プロテアーゼのコレクションが、それらの一次配列に修飾を含むプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションが、非修飾プロテアーゼとは異なり、標的基質に対して改変された活性および／または特異性を有するように修飾されている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
プロテアーゼトラップポリペプチドを検出または分離用に標識し、また
プロテアーゼまたはその触媒活性部分と共に検出可能なプロテアーゼトラップポリペプチドを含む複合体の捕獲により分離を行う、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
捕獲が、懸濁液、溶液または固体支持体において行われる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
プロテアーゼトラップポリペプチドをビオチンで標識する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
さらに分離された複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分を増幅することを含み、増幅が、宿主細胞におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分をコード化する核酸の増殖および発現を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複数の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドをコレクションと接触させ、
少なくとも２つのプロテアーゼトラップポリペプチドが同定可能な形で検出され得ることにより、複数のプロテアーゼが同定される、多重方式で実施される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分がディスプレーされ、同定または選択後にそれらを増幅させることにより、プロテアーゼおよび／またはその触媒活性部分の第２コレクションを作製し得る、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、第２コレクションを第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、安定した複合体の第２セットを製造することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第２プロテアーゼトラップポリペプチドが、第１プロテアーゼトラップポリペプチドと同一または異なる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらに、安定した複合体の第２セットにおいてプロテアーゼを同定または選択することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
コレクションが、少なくとも５、１０、５０、１００、５００、１０３、１０４、１０５、１０６またはそれ以上の異なる構成員を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分がセリンおよび／またはシステインプロテアーゼである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分がディスプレーされている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、固体支持体、細胞表面または微生物表面でディスプレーされる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、酵母、細菌、ウイルス、ファージ、核酸、ｍＲＮＡ分子の表面またはリボソームでディスプレーされる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、ファージディスプレーライブラリーでディスプレーされる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
プロテアーゼがプロテアーゼの触媒活性部分として提供される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも２つの異なるプロテアーゼトラップポリペプチドをコレクションと接触させ、さらに
プロテアーゼトラップポリペプチドの少なくとも一方を検出可能な形で標識することにより、検出可能なプロテアーゼトラップポリペプチドおよびプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む安定した複合体の捕獲が行われ、
他方または他の複数プロテアーゼトラップポリペプチドがそれぞれ検出可能な形で標識されたプロテアーゼトラップポリペプチドと比べて過剰に存在している、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
検出可能な標識がビオチンである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、キモトリプシン、ズブチリシン、カスパーゼおよびパパインファミリーのプロテアーゼから選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼまたはその触媒活性部分であり、グランザイムＢ、テスチシン、トリプターゼベータ１、カリクレインｈｋ５、コリン、カリクレイン１２、ＤＥＳＣ１オリテサーゼ、トリプターゼガンマ１、カリクレインｈＫ１4，ヒアルロナン結合セリンプロテアーゼ、トリプターゼ、カリクレインｈＫ１５、トリプシン、好中球エラスターゼ、マンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ−３、カテプシンＧ、ミエロブラスチン、グランザイムＡ、グランザイムＭ、キマーゼ、グランザイムＫ、グランザイムＨ、キモトリプシンＢ、膵臓エラスターゼ、膵臓エンドペプチダーゼＥ、膵臓エラスターゼII、エンテロペプチダーゼ、キモトリプシンＣ、プロスタシン、カリクレイン１、カリクレインｈＫ２、カリクレイン３、ヒトカリクレイン８、メソトリプシン、因子ＸII、血漿カリクレインＫＬＫ３、因子ＸＩ、因子ＩＸ、因子ＶII、因子Ｘａ、トロンビン、プロテインＣ、アクロシン、ヘプシン、肝細胞増殖因子活性化因子（ｕＰＡ）、尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミン、ニューロシン、ニューロトリプシン、ニューロプシン、カリクレインｈＫ１０、エピセリアシン、プロスターゼ、キモパシン、カリクレイン１１、ＭＴ−ＳＰ１、スピネシン、カテプシンＬ、カテプシンＶ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カテプシンＦ、カテプシンＢ、パパイン、クルザイン、ズブチリシン、テルミターゼ、Ｃ５ａペプチダーゼ、フェルビドリシン、ラクトセピン、フリン、ケキシン、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−６、カスパーゼ−２、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１、カスパーゼ−１３およびカスパーゼ−１４から選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびＭＴ−ＳＰ１から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
プロテアーゼトラップポリペプチドが、標的基質についての予め定められた基質特異性および／または活性を有するプロテアーゼにより開裂されるように修飾されている、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
プロテアーゼトラップポリペプチドが、セルピンであり、セルピンまたはその修飾形態が、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）または抗トロンビンIII（ＡＴ３）またはそれらの修飾形態から選択される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
プロテアーゼトラップポリペプチドが、アルファ２−マクログロブリンまたはその修飾形態である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
修飾形態が、プロテアーゼトラップポリペプチドの反応性部位において１つまたはそれ以上のアミノ酸置き替え、欠失または置換を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
修飾が、標的基質の開裂配列に対応するいずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸置換である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
標的基質が疾患または障害の病因に関与するものである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
標的基質が、ＩＬ−５、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−４、ＩＬ−４受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ受容体、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ｇｐ１２０、ｇｐ１４１、ＣＤ４、ＲＳＶ融合タンパク質、血球凝集素、Ｂ７、ＣＤ２８、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４０、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＨＥＲ２、ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ３、Ｓｒｃ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２、ＢＣＲ−Ａｂ１、ＧＳＫ−３、Ｃｄｋ−２、Ｃｄｋ−４、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２および補体タンパク質から選択される、請求項３０または請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
開裂配列に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾が、配列番号４０６〜４３２および４８０〜４８９のいずれか１項に示されたアミノ酸の配列を有する、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
プロテアーゼの同定方法が複数回実施され、その過程が反復的である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
プロテアーゼが、対応する鋳型プロテアーゼの非標的基質の場合と比べて標的基質における開裂配列についての高い基質特異性および／または活性を呈するまで、本方法を実施する、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
複数の異なるプロテアーゼが少なくとも本方法の初回反復で同定される、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
さらに、同定されたプロテアーゼのアミノ酸配列を比較することにより、ホットスポットを同定することを含み、
ホットスポットが、同定されたプロテアーゼの少なくとも２、３、４、５またはそれ以上に存する修飾された遺伝子座であり、
修飾された遺伝子座が、コレクションが修飾プロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む場合には修飾されているものである、
請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
さらに、
第１の一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼを同定後、プロテアーゼの第２コレクションを製造するが、ただし、同定された第１プロテアーゼを鋳型として用いて、プロテアーゼ配列またはその触媒活性部分にさらなる突然変異を導入することにより、第２コレクションの構成員が、同定された第１プロテアーゼの突然変異および追加的突然変異を有するポリペプチドを含んでいるものとし、
次いで、第２コレクションを、第１の一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼを単離するのに使用した第１プロテアーゼトラップポリペプチドと同一または異なる第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させるが、ただし、第１および第２プロテアーゼトラップポリペプチドは、所望の標的基質特異性を有するプロテアーゼにより開裂されるように修飾されているものとし、
複合体におけるコレクションから第２プロテアーゼ（複数も可）またはプロテアーゼの触媒活性部分（複数も可）を同定するが、ただし、同定された第２プロテアーゼ（複数も可）は、同定された第１プロテアーゼよりも標的基質に対する高い活性または特異性を有するものとする、
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、プロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼまたはその触媒活性部分の間の反応に競合物質を加えることにより、同定されたプロテアーゼ（複数も可）またはその触媒活性部分（複数も可）の選択性を高めることを含む方法である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
さらに、
ａ）第１開裂配列を含む第１プロテアーゼトラップポリペプチドと安定した複合体を形成する第１の一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定後、同定されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分を、第２開裂配列を含む第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させ、ただし接触については競合物質の存在下で実施するものとし、
ｂ）第２プロテアーゼトラップポリペプチドと複合体を形成するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する
ことを含み、
同定、進化または選択されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分が、少なくとも２つの開裂配列についての基質特異性および／または開裂活性を有するものである、
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも２つの開裂配列が一標的基質に存する、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも２つの開裂配列が２つの異なる標的基質に存する、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
第１および第２プロテアーゼトラップポリペプチドが異なり、それぞれ、異なる標的基質についての所望の基質特異性を有するプロテアーゼにより開裂されるように修飾されている、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
さらに、少なくとも２つの開裂配列に対し所望の、または予め定められた基質特異性および開裂活性をもつ同定または選択されたプロテアーゼが単離されるまで、段階ａ）およびｂ）を少なくとも再度反復することを含む、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
さらに、標的基質の開裂配列に対する基質特異性について同定されたプロテアーゼをスクリーニングすることを含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
プロテアーゼおよび／またはその触媒活性部分のコレクション、および
セルピン、アルファマクログロブリンファミリーの構成員、またはｐ３５ファミリーの構成員またはそれらの修飾形態である少なくとも１つのプロテアーゼトラップポリペプチド
を含む組合わせ。
【請求項４７】
プロテアーゼおよび／またはその触媒活性部分のコレクションがディスプレーライブラリーで呈示される、請求項４６記載の組合わせ。
【請求項４８】
ディスプレーライブラリーがファージディスプレーライブラリーであり、構成員が少なくともプロテアーゼの触媒活性部分をディスプレーする、請求項４７記載の組合わせ。
【請求項４９】
プロテアーゼまたはその触媒活性フラグメントが、セリンプロテアーゼのキモトリプシンファミリーのものであり、キモトリプシンのナンバリングに基づき３０、７３、８９および１５５位に対応する位置のいずれか１項に１つまたはそれ以上の突然変異を含み、基質特異性が改変されている、修飾プロテアーゼ。
【請求項５０】
プロテアーゼが、修飾尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメントである、請求項４９記載の修飾プロテアーゼ。
【請求項５１】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、キモトリプシンのナンバリングに基づき、２１、２４、３０、３９、６１（Ａ）、８０、８２、８４、８９、９２、１５６、１５８、１５９および１８７位から選択された位置に対応する位置に１つまたはそれ以上の修飾を含む、修飾尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）ポリペプチド。
【請求項５２】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Ｆ２１Ｖ、Ｉ２４Ｌ、Ｆ３０Ｖ、Ｆ３０Ｌ、Ｔ３９Ａ、Ｙ６１（Ａ）Ｈ、Ｅ８０Ｇ、Ｋ８２Ｅ、Ｅ８４Ｋ、Ｉ８９Ｖ、Ｋ９２Ｅ、Ｋ１５６Ｔ、Ｔ１５８Ａ、Ｖ１５９ＡおよびＫ１８７Ｅから選択される１つまたはそれ以上の修飾を含む、請求項５１記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５３】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Ｆ２１Ｖ；Ｉ２４Ｌ；Ｆ３０Ｖ；Ｆ３０Ｌ；Ｆ３０Ｖ／Ｙ６１（ａ）Ｈ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ１５６Ｔ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｔ３９Ａ／Ｖ１５９Ａ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｔ１５８Ａ／Ｖ１５９Ａ；Ｆ３０Ｖ／Ｙ６１（ａ）Ｈ／Ｋ９２Ｅ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ／Ｅ８０Ｇ／Ｉ８９Ｖ／Ｋ１８７Ｅ；およびＦ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ／Ｅ８０Ｇ／Ｅ８４Ｋ／Ｉ８９Ｖ／Ｋ１８７Ｅから選択される修飾を含む、請求項５２記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５４】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、キモトリプシンのナンバリングに基づき、３８、７２、７３、７５、１３２、１３３、１３７、１３８、１５５、１６０および２１７位から選択された位置に対応する位置に１つまたはそれ以上の修飾を含む、修飾尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）ポリペプチド。
【請求項５５】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Ｖ３８Ｄ、Ｒ７２Ｇ、Ｌ７３Ａ、Ｌ７３Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｆ１３２Ｌ、Ｇ１３３Ｄ、Ｅ１３７Ｇ、Ｉ１３８Ｔ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｍ、Ｖ１６０ＡおよびＲ２１７Ｃから選択される１つまたはそれ以上の修飾を含む、請求項５４記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５６】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、さらにキモトリプシンのナンバリングに基づく３０位および／または８９位に修飾を含む、請求項５４記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５７】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分におけるさらなる修飾が、Ｆ３０Ｉ、Ｆ３０Ｔ、Ｆ３０Ｌ、Ｆ３０Ｖ、Ｆ３０Ｇ、Ｆ３０ＭおよびＩ８９Ｖから選択される、請求項５６記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５８】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ；Ｌ７３Ｐ；Ｒ２１７Ｃ；Ｌ１５５Ｐ；Ｓ７５Ｐ／Ｉ８９Ｖ／Ｉ１３８Ｔ；Ｅ１３７Ｇ；Ｒ７２Ｇ／Ｌ１５５Ｐ；Ｇ１３３Ｄ；Ｖ１６０Ａ；Ｖ３８Ｄ；Ｆ１３２Ｌ／Ｖ１６０Ａ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｔ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｌ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｖ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｇ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｖ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｍ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｍ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｌ／Ｌ１５５Ｍ；およびＬ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｇ／Ｌ１５５Ｍから選択される修飾を含む、請求項５７記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項５９】
ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、キモトリプシンのナンバリングに基づき、Ｆ３０Ｉ、Ｆ３０Ｔ、Ｆ３０ＧおよびＦ３０Ｍから選択される突然変異に対応する１つまたはそれ以上の修飾を含む、修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項６０】
ｕ−ＰＡポリペプチドが、配列番号４３３に示された野生型ｕ−ＰＡポリペプチドと８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し、ポリペプチドが１つまたはそれ以上の修飾を含む、請求項５１〜５９のいずれか１項に記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチド。
【請求項６１】
配列番号２５３に示されたＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドにおいて、キモトリプシンのナンバリングに基づき、Ｄ２３Ｅ、Ｉ４１Ｆ、Ｉ４１Ｔ、Ｌ５２Ｍ、Ｙ６０（ｇ）ｓ、Ｔ５６Ｋ、 Ｈ７１Ｒ、Ｆ９３Ｌ、Ｎ９５Ｋ、Ｆ９７Ｙ、Ｆ９７Ｌ、Ｔ９８Ｐ、Ｆ９９Ｌ、Ａ１２６Ｔ、Ｖ１２９Ｄ、Ｐ１３１Ｓ、Ｉ１３６Ｔ、Ｉ１３６Ｖ、Ｈ１４３Ｒ、Ｔ１４４Ｉ、Ｉ１５４Ｖ、Ｎ１６４Ｄ、Ｔ１６６Ａ、Ｌ１７１Ｆ、Ｐ１７３Ｓ、Ｆ１８４（ａ）Ｌ、Ｑ１９２Ｈ、Ｓ２０１Ｉ、Ｑ２０９Ｌ、Ｑ２２１（ａ）Ｌ、Ｒ２３０Ｗ、Ｆ２３４ＬおよびＶ２４４Ｇから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項６２】
さらに、配列番号２５３に示されたＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドにおける修飾Ｑ１７５ＲまたはＤ２１７Ｖに対応する１つまたはそれ以上の修飾を含む、請求項６１記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド。
【請求項６３】
アミノ酸修飾が、Ｉ１３６Ｔ／Ｎ１６４Ｄ／Ｔ１６６Ａ／Ｆ１８４（Ａ）Ｌ／Ｄ２１７Ｖ；Ｉ４１Ｆ；Ｉ４１Ｆ／Ａ１２６Ｔ／Ｖ２４４Ｇ；Ｄ２３Ｅ／Ｉ４１Ｆ／Ｔ９８Ｐ／Ｔ１４４Ｉ；Ｉ４１Ｆ／Ｌ１７１Ｆ／Ｖ２４４Ｇ；Ｈ１４３Ｒ／Ｑ１７５Ｒ；Ｉ４１Ｆ／Ｌ１７１Ｆ；Ｒ２３０Ｗ；Ｉ４１Ｆ／Ｉ１５４Ｖ／Ｖ２４４Ｇ；Ｉ１４１Ｆ／Ｌ５２Ｍ／Ｖ１２９Ｄ／Ｑ２２１（Ａ）Ｌ；Ｆ９９Ｌ；Ｆ９７Ｙ／Ｉ１３６Ｖ／Ｑ１９２Ｈ／Ｓ２０１Ｉ；Ｈ７１Ｒ／Ｐ１３１Ｓ／Ｄ２１７Ｖ；Ｄ２１７Ｖ；Ｔ６５Ｋ／Ｆ９３Ｌ／Ｆ９７Ｙ／ Ｄ２１７Ｖ；Ｉ４１Ｔ／Ｐ１７３Ｓ／Ｑ２０９Ｌ；Ｆ９７Ｌ／Ｆ２３４Ｌ；Ｑ１７５Ｒ；Ｎ９５Ｋ；およびＹ６０（Ｇ）Ｓから選択される、請求項６２記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド。
【請求項６４】
修飾により、Ｃ２補体タンパク質についての特異性またはＣ２補体タンパク質に対する活性の一方または両方が高められる、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド。
【請求項６５】
ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが、配列番号２５３に示された野生型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド、または配列番号５０５に示されたその触媒活性部分と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し、ポリペプチドが１つまたはそれ以上の修飾を含む、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド。
【請求項６６】
請求項５１〜５３および６０のいずれか１項に記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６７】
請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の修飾ｕ−ＰＡポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６８】
請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６９】
請求項５１〜６０記載の修飾ｕ−ＰＡプロテアーゼのいずれか１つまたは求項６１〜６５記載の修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのいずれか１つをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項７０】
請求項６９記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７１】
請求項７０記載のベクターを含む細胞。
【請求項７２】
ｔ−ＰＡの投与により処置される疾患または状態の処置における使用のための請求項６６記載の医薬組成物。
【請求項７３】
ｔ−ＰＡにより処置される疾患または状態を処置する医薬の製造における請求項６６記載の医薬組成物の使用。
【請求項７４】
ＶＥＧＦＲ−２が介在する疾患または状態の処置における使用のための請求項６７記載の医薬組成物。
【請求項７５】
ＶＥＧＦＲ−２が介在する疾患または状態を処置する医薬の製造における、請求項６７記載の医薬組成物の使用。
【請求項７６】
補体タンパク質Ｃ２が介在する疾患または状態の処置における使用のための請求項６８記載の医薬組成物。
【請求項７７】
補体タンパク質Ｃ２が介在する疾患または状態を処置する医薬の処方を目的とする、請求項６８記載の医薬組成物の使用。
【請求項７８】
疾患または障害の病因に関与している標的基質についての開裂配列を伴うＰ４〜Ｐ２´位のいずれか１つまたはそれ以上に対応するその反応性部位ループに修飾を含む、修飾セルピンポリペプチド。
【請求項７９】
標的基質が、ＶＥＧＦＲ、補体タンパク質またはｔ−ＰＡ基質から選択される、請求項７８記載の修飾セルピンポリペプチド。
【請求項８０】
標的基質がＶＥＧＦＲ２またはＣ２である、請求項７９記載の修飾セルピンポリペプチド。
【請求項８１】
セルピンが、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）または抗トロンビン−３（ＡＴ３）である、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の修飾セルピンポリペプチド。
【請求項８２】
配列番号４９７、４９９、６１０および６１１のいずれかに示されたアミノ酸の配列を有する請求項７８〜８１のいずれか１項に記載の修飾セルピンポリペプチド。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−７５２０９（Ｐ２０１０−７５２０９Ａ）
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９２８４１（Ｐ２００９−２９２８４１）
【出願日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【分割の表示】特願２００９−５１８３８６（Ｐ２００９−５１８３８６）の分割
【原出願日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０８１２１５９９）カタリスト・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ， ＩＮＣ．
【出願人】（５０９００４６８６）トーリー・パインズ・インスティテュート・フォー・モレキュラー・スタディーズ (3)
【氏名又は名称原語表記】ＴＯＲＲＥＹ ＰＩＮＥＳ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＳＴＵＤＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【分割の表示】特願２００９−５１８３８６（Ｐ２００９−５１８３８６）の分割
【原出願日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０８１２１５９９）カタリスト・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ， ＩＮＣ．
【出願人】（５０９００４６８６）トーリー・パインズ・インスティテュート・フォー・モレキュラー・スタディーズ (3)
【氏名又は名称原語表記】ＴＯＲＲＥＹ ＰＩＮＥＳ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＳＴＵＤＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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