プロバイオティクス菌株及びこれに由来する抗菌性ペプチド
本発明は、プロバイオティクス特性を有するエンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）の菌株に関する。Ｅ．ムンドティの菌株（ＳＴ４ＳＡ）は、広範囲の細菌に対して抗菌活性を示す抗菌性ペプチドを産生する。本発明はまた、前記抗菌性ペプチド（ペプチドＳＴ４ＳＡ）をコードする、単離されたヌクレオチド配列を提供する。本発明の別の態様は、本発明のペプチドを製造するための方法であって、エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株を、回収可能な量の前記ペプチドが産生されるまで、微好気条件下、１０〜４５℃の温度で、栄養培地中で培養すること、及び前記ペプチドを回収することを含む方法に関する。本発明の単離されたペプチドは、局所治療剤としての液剤又はゲル剤において抗菌剤として使用することができ、また、ポリマー中に封入して、抗菌剤として使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）の菌株から得られるペプチド、及びエンテロコッカス・ムンドティの菌株のプロバイオティクス組成物に関連する。より具体的には、本発明は、エンテロコッカス・ムンドティの菌株から得られるペプチド、このペプチドをコードする遺伝子、並びにこのペプチドを産生する菌株及びこのペプチド自体の様々な用途に関する。
【発明の背景】
【０００２】
乳酸菌は、胃腸の正常な微生物叢のバランスを維持することにおいて重要な役割を果たす。食餌、ストレス、微生物感染及び腸疾患は微生物のバランスを乱し、このことは、多くの場合、腸管における生存可能な乳酸菌（特に、ラクトバチルス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌）の数の低下を引き起こす。その場合、病原性細菌のその後の抑制されない増殖により、下痢及び他の臨床的障害（例えば、癌、炎症性疾患及び潰瘍性大腸炎など）が引き起こされる。
【０００３】
プロバイオティクス乳酸菌の重要な性質の１つが、上皮細胞又は腸粘膜への細胞の接着である。これには、上皮細胞表面の受容体分子と、細菌表面との間の強い相互作用が要求される。プロバイオティクス菌体の接着により、病原体の接着が妨げられ、また、免疫系が刺激される。後者は、粘膜と相互作用することによって達成され、そのような相互作用により、結果として、リンパ系細胞が感作される。プロバイオティクス菌体のもうひとつの重要な特徴が、低いｐＨ及び高量の胆汁酸塩での生存である。
【０００４】
ヒト及び動物の腸に関係するビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌及び腸球菌属細菌のある種の菌株は、様々なバクテリオシン（抗菌性ペプチド）を産生することが知られている。これらのペプチドの役割、及び腸管における病原性細菌の増殖を抑制することにおけるそれらの意味は不明である。しかしながら、グラム陰性細菌に対して活性であるバクテリオシンに関する近年の報告から結論されるように、これらのペプチド、及び腸内病原体とのそれらの相互作用が改めて注目され得る。後者のバクテリオシンの多くが、腸管に通常的に存在する乳酸菌によって、すなわち、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ）群、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・カセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ファーメンツム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ペントスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・パラカセイ亜種パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）によって産生される。
【０００５】
本発明は、腸のストレス状態（例えば、低いｐＨ、胆汁酸塩、塩、膵臓酵素）に耐え、広域抗菌性ペプチド（ペプチドＳＴ４ＳＡ）を産生するエンテロコッカス・ムンドティの菌株を記載する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の１つの態様によれば、
下記アミノ酸配列：
ＭＳＱＶＶＧＧＫＹＹＧＮＧＶＳＣＮＫＫＧＣＳＶＤＷＧＫＡＩＧＩＩＧＮＮＳＡＡＮＬＡＴＧＧＡＡＧＷＫＳ（配列番号１２）、
そのフラグメントであって、抗菌活性を有するフラグメント、
そのムテイン及び誘導体であって、抗菌活性を有するムテイン及び誘導体、
その共有結合架橋体であって、抗菌活性を有する共有結合架橋体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約９５％を超える相同性、好ましくは８５％を超える相同性、最も好ましくは約７５％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を有する、細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離されたペプチドが提供される。
【０００７】
本発明の別の態様によれば、細菌エンテロコッカス・ムンドティのペプチドＳＴ４ＳＡをコードする、単離されたヌクレオチド配列が提供される。
【０００８】
単離されたヌクレオチド配列は、
下記ヌクレオチド配列：
ＡＴＧＴＣＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＧＧＴＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＴＴＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＡＡＡＧＴ（配列番号１１）、
その相補体、
そのフラグメントであって、その発現後に、抗菌活性を有するペプチドを産生することができるフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことができる。
【０００９】
厳密なハイブリダイゼーション条件は、５０℃における、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄に相当する。
【００１０】
ヌクレオチド配列は、プラスミドの形態の発現ベクター又は移入ベクターなどのベクター中に含めることができる。ベクターは、抗生物質抵抗性などの選択属性をコードする核酸配列、又は他のマーカー遺伝子を含むことができる。従って、本発明は、微生物宿主細胞の形質転換に適した組換えプラスミドであって、本発明の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドベクターを含むプラスミドを包含する。
【００１１】
細胞は真核生物細胞又は原核生物細胞、例えば、細菌細胞又は酵母細胞であり得る。ヌクレオチド配列を細胞のゲノムに一過性又は構成的に組み入れることができる。従って、本発明は、本発明の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドベクターを含む組換えプラスミドを含む、形質転換された微生物細胞を包含する。
【００１２】
本発明のさらなる態様によれば、抗菌活性を有する細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離されたペプチドが提供される。
【００１３】
上記で特定される単離されたペプチドを産生する細菌エンテロコッカス・ムンドティはＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ−７２７８で寄託されている。上記で特定される単離されたペプチドを産生する、この特定の細菌エンテロコッカス・ムンドティ株はＳＴ４ＳＡ株と呼ばれている。従って、本発明は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ−７２７８で寄託されているエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株の実質的に純粋な培養物であって、資化可能な炭素源、窒素源及び無機物質を含有する栄養培地中で発酵すると、回収可能な量のペプチドＳＴ４ＳＡを産生することができる培養物を包含する。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明のペプチドを製造するための方法であって、エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株を、回収可能な量の上記ペプチドが産生されるまで、微好気条件下、１０〜４５℃の温度で、栄養培地中で培養するステップと、上記ペプチドを回収するステップと、を含む方法に関する。好ましくは、培養は、約３７℃の温度で行われる。
【００１５】
栄養培地は、コーンスティープリカー、チーズホエー粉末、ＭＲＳブロス、酵母抽出物及び廃糖蜜を含む群のいずれか１つ又は複数から選択することができる。好ましくは、栄養培地は、ｐＨ６〜６．５のＭＲＳブロスである。
【００１６】
本発明の単離されたペプチドは、例えば、中耳感染症などの耳感染症や、咽頭、眼又は皮膚の感染症のための局所治療剤としての液剤又はゲル剤において、抗菌剤として使用することができる。液剤はまた、食事への液体補助物として使用されるためのものであってもよい。本発明のペプチドはまた、例えば、副鼻腔感染症、副鼻腔炎、扁桃炎、咽頭感染症又は鼻炎を治療するためのスプレーにおいて、抗菌剤として使用することができる。本発明のペプチドはまた、凍結乾燥粉末の形態であってもよい。
【００１７】
本発明の単離されたペプチドはまた、ポリマー中に封入して、抗菌剤として使用することができる。本発明は、別の態様において、ペプチドＳＴ４ＳＡの抗菌有効量が組み入れられたポリマーを包含する。このポリマーは、その後、皮膚感染症などの感染症の局所治療用の製剤で使用することができ、或いは、インプラント又は医療デバイス、例えば、イヤーグロメット、カテーテル、オストミーチューブ、オストミーポーチ、ステント、縫合材、女性用衛生用品などの衛生用品、コンタクトレンズ、コンタクトレンズ洗浄液に組み入れるために、又は創傷被覆材に組み入れるために使用することができる。ポリマー中への抗菌性ペプチドの封入は、抗菌性ペプチドのゆっくりした放出及び微生物感染症の長期間の治療をもたらす。
【００１８】
本発明の単離されたペプチドは、１０００００〜３０００００ＡＵ（任意単位）／ｍｌポリマーの濃度で、好ましくは約２０００００ＡＵ／ｍｌポリマーの濃度で含まれ得る。
【００１９】
本発明のペプチドはさらに、軟膏剤、ローション剤又はクリーム剤に組み入れることによって抗菌剤として使用することができる。これらの軟膏剤、ローション剤又はクリーム剤は、感染症を治療するために使用することができる。本発明のペプチドはまた、コンタクトレンズ洗浄液などの液剤に組み入れることによって抗菌剤として使用することができ、又はコンタクトレンズそのものに組み入れることができる。従って、本発明は、本発明の別の態様として、本発明の抗菌性ペプチドを含有する抗菌性の軟膏、ローション又はクリームを提供する。
【００２０】
本発明の別の形態において、本発明のペプチドは、無菌包装の製造において使用される包装材（例えば、プラスチック）に組み入れることによって抗菌剤として使用することができる。
【００２１】
本発明のさらなる形態において、本発明のペプチドは、錠剤形態又はカプセル形態の細菌エンテロコッカス・ムンドティの広域プロバイオティクスの一部として使用することができ、或いは、食用形態、例えば、菓子（ｓｗｅｅｔ）又はチューインガムなどの形態であってもよい。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株の治療有効濃度を含む生物学的に純粋な培養物を含むプロバイオティクス組成物が提供される。この菌株を、プロバイオティクス組成物１ｍｌ当たり生細胞約１０６〜１０９個、好ましくは約１０８個（ｃｆｕ）の濃度で含むことができる。
【００２３】
本発明の１つの形態において、本発明のプロバイオティクス組成物は、動物又はヒトにおいて病原性細菌を減少させるために使用することができる。
【００２４】
本発明の別の形態において、本発明のプロバイオティクス組成物は、動物又はヒトにおいて病原性ウイルスを減少させるために使用することができる。
【００２５】
本発明のプロバイオティクス組成物は、粉末、液体、ゲル、錠剤の形態であり得るか、又は食品に組み入れることができる。液体形態のプロバイオティクス組成物は、食事への液体補助物として使用することができる。本発明の菌株を、液体補助物１ｍｌ当たり生細胞約１０６〜１０９個、好ましくは約１０８個（ｃｆｕ）の濃度で含むことができる。
【００２６】
本発明のプロバイオティクス組成物は、１０３〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度、好ましくは１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度、最も好ましくは約３×１０５の最終濃度で動物又はヒトに投与することができる。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、
動物又はヒトにおける細菌感染状態を治療する方法であって、動物又はヒトの感染領域を、
本発明のエンテロコッカス・ムンドティ株の薬学的有効量、及び
本発明の抗菌性ペプチドの薬学的有効量、
のいずれか１つ又は複数を含む群から選択される物質又は組成物に曝すステップを含む方法が提供される。
【００２８】
従って、本発明はまた、動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される医薬品の製造における、本発明のエンテロコッカス・ムンドティ株の治療有効量の使用を包含する。
【００２９】
この方法は、細菌種を、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌ、好ましくは約２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度の本発明の抗菌性ペプチドに曝すステップを含むことができる。
【００３０】
本発明はまた、動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される医薬品の製造における、本発明の抗菌性ペプチドの治療有効量の使用を包含する。
【００３１】
本発明はさらに、動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される物質又は組成物であって、本発明のエンテロコッカス・ムンドティ株を含み、上記方法が、そのような物質又は組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む、物質又は組成物を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される物質又は組成物であって、本発明の抗菌性ペプチドを含み、上記方法が、そのような物質又は組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む、物質又は組成物を提供する。
【００３３】
細菌感染症は、アシネトバクター・バウマニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・チロブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・カプリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス（エンテロコッカス）・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ） ｆａｅｃａｌｉｓ）又は肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、のいずれか１つ又は複数によって引き起こされる感染症であり得る。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、細菌種の成長を阻害する方法であって、細菌種を本発明の抗菌性ペプチドの有効量に曝すことを含む方法が提供される。細菌種は、アシネトバクター・バウマニイ、バチルス・セレウス、クロストリジウム・チロブチリクム、エンテロバクター・クロアカエ、大腸菌、肺炎桿菌、リステリア・イノクア、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・カルノサス、ストレプトコッカス・カプリヌス、糞便連鎖球菌及び肺炎連鎖球菌を含む群から選択され得る。
【００３５】
この方法は、細菌種を、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌ、好ましくは約２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度の本発明の抗菌性ペプチドに曝すステップを含むことができる。
【００３６】
本発明の１つの態様によれば、
細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離されたトランスポーターペプチドであって、
配列番号１４のアミノ酸配列、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約９０％を超える相同性、好ましくは８０％を超える相同性、最も好ましくは約７０％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を有するペプチドが提供される。
【００３７】
本発明の別の態様によれば、細菌エンテロコッカス・ムンドティのＳＴ４ＳＡトランスポーターペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列が提供される。単離されたヌクレオチド配列は、
配列番号１３のヌクレオチド配列、
その相補体、
そのフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことができる。
【００３８】
本発明の１つの態様によれば、
細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離された免疫ペプチドであって、
配列番号１６のアミノ酸配列、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約９０％を超える相同性、好ましくは８０％を超える相同性、最も好ましくは約７０％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を有するペプチドが提供される。
【００３９】
本発明の別の態様によれば、細菌エンテロコッカス・ムンドティのＳＴ４ＳＡ免疫／接着ペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列が提供される。単離されたヌクレオチド配列は、
配列番号１５のヌクレオチド配列、
その相補体、
そのフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことができる。
【００４０】
本発明は、別の態様において、配列番号１〜配列番号１０からなる群から選択されるプライマーを包含する。従って、本発明はまた、下記の群：
配列番号１及び配列番号２を含むプライマー対、
配列番号３及び配列番号４を含むプライマー対、
配列番号５及び配列番号６を含むプライマー対、
配列番号７及び配列番号８を含むプライマー対、並びに
配列番号９及び配列番号１０を含むプライマー対、
から選択されるプライマー対を包含する。
【００４１】
本発明はまた、エンテロコッカス・ムンドティの同定における、配列番号１及び配列番号２のプライマー対の使用を包含する。
【００４２】
本発明をよりよく理解するために、また、本発明がどのように実施され得るかを示すために、添付の図面及び表（これらは一例にすぎない。）を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡観察）によって観察されたときのエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株の細胞形態の画像である。
【図２】図２は、属特異的プライマーを使用することによって得られるＰＣＲ産物（ＤＮＡフラグメント）を示すアガロースゲルの写真である。エンテロコッカス属に特異的な１１２ｋｂの属特異的ＤＮＡバンドが得られた。
【図３】図３は、種特異的プライマーを使用することによって得られるＰＣＲ産物（ＤＮＡフラグメント）を示すアガロースゲルの写真である。エンテロコッカス・ムンドティに特異的な３０６ｂｂの種特異的ＤＮＡバンドが得られた。
【図４】図４は、ゲルろ過（ＡＫＴＡ−ｐｕｒｉｆｉｅｒ）によって分離されるペプチドＳＴ４ＳＡのグラフ表示である。
【図５】図５は、ペプチドＳＴ４ＳＡの位置を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡのプラスミドプロフィルを示すアガロースゲルの写真である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＳＴ４ＳＡ株の染色体（ゲノム）上の構造遺伝子の位置を示すサザンブロットである。
【図７】図７は、Ｅ．ムンドティのペプチドＳＴ４ＳＡのアミノ酸配列の概略図である。
【図８】図８は、ペプチドＳＴ４ＳＡの構造遺伝子のＤＮＡ配列（Ａ）、トランスポーター遺伝子のＤＮＡ配列（Ｂ）及び免疫遺伝子のＤＮＡ配列（Ｃ）である。
【図９Ａ】図９Ａは、ペプチドＳＴ４の産生に対する成長培地成分の影響を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ペプチドＳＴ４の産生に対する成長培地成分の影響を示す図である。
【図１０】図１０は、ＭＲＳブロスにおけるペプチドＳＴ４ＳＡの産生のグラフ表示である。
【図１１】図１１は、推定される接着遺伝子を含有し得るＤＮＡフラグメントを示すアガロースゲルの写真である。
【図１２】図１２は、異なる温度でのペプチドＳＴ４ＳＡ（無菌蒸留水に懸濁された粗抽出物）の安定性を示すグラフである。
【図１３】図１３は、寒天平板におけるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種に対して記録される阻害域の写真である。
【図１４】図１４は、ペプチドＳＴ４ＳＡ（４０９６００ＡＵ／ｍｌ）により処理された肺炎連鎖球菌の写真であり、細胞質の漏出が矢印によって示される。
【図１５】図１５は、肺炎連鎖球菌（病原体２７）の成長阻害を示すグラフである。
【図１６】図１６は、肺炎連鎖球菌（病原体２９）の成長阻害を示すグラフである。
【図１７】図１７は、肺炎桿菌（病原体３０）の成長阻害を示すグラフである。
【図１８】図１８は、中耳単離菌（病原体４０）の成長阻害を示すグラフである。
【図１９】図１９は、中耳単離菌（病原体ＢＷ）の成長阻害を示すグラフである。
【図２０】図２０は、中耳単離菌（病原体Ｅ）の成長阻害を示すグラフである。
【図２２】図２２は、中耳単離菌（病原体ＧＷ）の成長阻害を示すグラフである。
【図２３】図２３は、中耳単離菌（病原体ＨＷ）の成長阻害を示すグラフである。
【図２４】図２４は、リステリア・イノクアＬＭＧ１３５６８の存在下でのＳＴ４ＳＡ株の成長及びペプチドＳＴ４ＳＡの産生を示すグラフである。記号：黒色菱型＝Ｌ．イノクア ＬＭＧ１３５６８の存在下でのＳＴ４ＳＡ株の成長；黒色正方形＝Ｌ．イノクア ＬＭＧ１３５６８の成長阻害；黒色丸＝ｐＨにおける変化；黒色バー＝ペプチドＳＴ４ＳＡの産生。
【図２５】図２５は、プロバイオティクスＳＴ４ＳＡ株の評価のために開発された胃腸モデル（ＧＩＭ）の概略図である。
【図２６】図２６は、バンコマイシンによる脂質ＩＩ標的部位の阻止及びペプチドＳＴ４ＳＡの作用様式（抗菌活性）に対するその影響を示す概略図である。％漏出は、ＤＮＡ及びβ−ガラクトシダーゼ活性の増大したレベルによって記録されるときの細胞質漏出を示す。
【図２７】図２７は、アミノ酸９（システイン）及びアミノ酸１４（システイン）を共有結合により連結した、ペプチドに導入されたジスルフィド架橋の概略図である。
【図２８】図２８は、ＳＴ４ＳＡの疎水性プロットを示すグラフである。
【図２９】図２９は、ＳＴ４ＳＡによるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（モノサイトゲネス）攻撃の結果及びインビトロＧＩＴモデルにおける生存を示すグラフである。
【図３０】図３０は、ＭＲＳブロス及びＣＳＬ培地におけるＥ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡの成長曲線を示すグラフである。
【図３１】図３１は、（Ａ）コントロール結腸、（Ｂ）ＳＴ４ＳＡ株投与結腸、（Ｃ）コントロール回腸、（Ｄ）ＳＴ４ＳＡ株投与回腸、（Ｅ）コントロール肝臓、（Ｆ）ＳＴ４ＳＡ株投与肝臓、（Ｇ）コントロール脾臓、（Ｈ）ＳＴ４ＳＡ株投与脾臓の溶血素及びエオシン染色切片を６０Ｘの倍率で示す写真である。
【図３２】図３２は、ラットの各実験群の毎日の体重測定を表すグラフを示す。矢印はリステリア感染の時を示す。
【図３３】図３３は、ラットの餌摂取の毎日の測定を表すグラフを示す。
【図３４】図３４は、ラットの各実験群によって消費された水の毎日の測定を表すグラフを示す。
【図３５】図３５は、ＳＴ４株、４２３株及び水コントロールが投与されていたラットの各実験群の便水分含有量を表すグラフを示す。
【図３６】図３６は、ラットの各実験群から感染１日前及び感染２日後で集められた便サンプルにおけるリステリア数を示す。
【表の説明】
【００４４】
表１は、ＳＴ４ＳＡ株の表現型特徴（糖発酵反応）を示す。
表２は、ＳＴ４ＳＡ株の示差的特徴を示す。
表３は、ペプチドＳＴ４ＳＡに対する、酵素、温度、ｐＨ及び変性剤の影響を示す。
表４は、ペプチドＳＴ４ＳＡの活性スペクトルを示す。
表５は、ペーパーディスクにおけるペプチドＳＴ４ＳＡの活性を示す。
表６は、一般に使用される抗生物質とのペプチドＳＴ４ＳＡの活性の比較を示す。
表７は、病原体へのペプチドＳＴ４ＳＡの接着を示す。
表８は、病原体をペプチドＳＴ４ＳＡで処理した後に記録された細胞外ＤＮＡを示す。
表９は、病原体をペプチドＳＴ４ＳＡで処理した後に記録されたβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
表１０は、（コンピューター化された）ＧＩＭの操作を示す。
表１１は、ＧＩＭにおけるＳＴ４ＳＡ株の生存及びペプチドＳＴ４ＳＡの産生を示す。リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が標的生物（病原体）として使用された。値は３回の試験の平均値である。使用された栄養物は、それぞれ、ＮＡＮ Ｐｅｌａｒｇｏｎ（Ｎｅｓｔｌｅ）及びＭＲＳ（Ｄｅ Ｍａｎ Ｒｏｇｏｓａ培地、Ｂｉｏｌａｂ）であった。
表１２は、ＳＴ４ＳＡ株の抗生物質抵抗性を示す。
表１３は、異なる濃度のトリメトプリム−スルファメトキサゾール（ＴＭＰ−ＳＭＸ）及びメトロニダゾールの存在下におけるＳＴ４ＳＡ株の成長を示す。
表１４は、アッセイされた毒性因子を示す。
表１５は、平板計数によるＣａｃｏ−２細胞系へのＳＴ４ＳＡ株の接着を示す（コントロール）。
表１６は、ＳＴ４ＳＡ株及びＬ．モノサイトゲネスの競合的排除を示す。
表１７は、ＳＴ４ＳＡ株、Ｌａｃｔｏｖｉｔａ又は非補充の水が投与されたラットについての体重値を示す。
表１８は、（Ａ）１０７日のＬａｃｔｏｖｉｔａでの研究の期間中、及び（Ｂ）５０日のＳＴ４ＳＡ株での研究の期間中における雄性Ｗｉｓｔａｒラットの便サンプルにおけるβ−グルクロニダーゼ活性を示す。値は、２時間当たりの放出されたｍＭでのｐ−ニトロフェノールである。標準誤差値がかっこ内に示される。
表１９は、ＭＲＳｆ（ＭＲＳろ液）培地中のペプチドＳＴ４ＳＡの精製を示す。
表２０は、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生のための成長培地として試験された純粋なＣＳＬ、廃糖蜜及びＣＷｐについての結果を示す。
表２１は、どの培地がペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対して最も著しい影響が有ったかを明らかにするための成分としてのＣＳＬ及びＣＷｐに関する全要因設計（ＦＦＤ）を示す。
表２２は、ＳＴ４ＳＡ活性の最適化のためにＭＲＳ成分が補充されたＣＳＬの結果を示す。
表２３は、ＭＲＳ成分及びＣＳＬの高濃度及び低濃度を示す。
表２４は、２１０−５ＦｒＦＤ設計を示す。
表２５は、２１０−５ＦｒＦＤ設計についての分散分析表を示す。
表２６は、ＣＳＬ及びＹＥの濃度を決定するための３中心点による２２ＦＦＤを示す。
表２７は、発酵期間中の炭素取り込みを示す。
表２８は、抗菌剤及び抗炎症性薬物に対するＥ．ムンドティ ＳＴ４の抵抗性試験の結果を示す。
表２９は、Ｃａｃｏ−２細胞へのＳＴ４ＳＡの接着に対する抗菌剤及び抗炎症性医薬品の影響を示す。
【発明の詳細な説明】
【００４５】
本発明は、腸のストレス条件（例えば、低いｐＨ、胆汁酸塩、塩、膵臓酵素）に耐え、広域抗菌性ペプチド、すなわち、ペプチドＳＴ４ＳＡを産生する細菌エンテロコッカス・ムンドティの菌株を記載する。ペプチドＳＴ４ＳＡを産生するエンテロコッカス・ムンドティのこの菌株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されており、受託番号がＰＴＡ−７２７８である。活性が、非常に多数のグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して観察されており、これらのほとんどが中耳感染症及び腸から単離される。阻害される細菌の例は下記の通りである。アシネトバクター・バウマニイ、バチルス・セレウス、クロストリジウム・チロブチリクム、エンテロバクター・クロアカエ、大腸菌、肺炎桿菌、リステリア・イノクア、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・カルノサス、ストレプトコッカス・カプリヌス、糞便連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、並びに感染した中耳液サンプルから単離される未同定のグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の多くの臨床菌株。これは、広い活性スペクトルであり、具体的には、そのような様々なヒト病原体に対する広い活性スペクトルである。
【００４６】
グラム陰性細菌に対する活性を有する多くの広域抗菌性ペプチドが記載されている；例えば、ラクトバチルス・ペントススによって産生されるペントシン３５ｄ、ラクトバチルス・ペントススＳＴ１５１ＢＲによって産生されるバクテリオシンＳＴ１５１ＢＲ、ラクトバチルス・パラカセイ・サブエスピー・パラカセイによって産生されるバクテリオシン、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｒｍｏｐｈｙｌｕｓ）によって産生されるサーモフィリン（ｔｈｅｒｍｏｐｈｙｌｉｎ）、エンテロコッカス・フェカリスによって産生されるペプチドＡＳ−４８、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＫＣＡ２３８６によって産生されるバクテリオシン、及びエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）によって産生されるエンテロシンＣＲＬ３５。しかしながら、これらのペプチドの活性スペクトルは、上記で示されたペプチドＳＴ４ＳＡ感受性の種から理解され得るように、ペプチドＳＴ４ＳＡについて記録される活性スペクトルよりもはるかに狭い。広い活性スペクトル、特に、病原性細菌に対する広い活性スペクトルは、ペプチドＳＴ４ＳＡを、細菌感染症を抑制するために、特に、（このペプチドが非常に様々な中耳病原体に対して活性であるので）、中耳感染症を抑制するために理想的なものにし、同様にまた、二次的な創傷感染症に関与する病原体を抑制するために理想的なものにする（このペプチドはこれらの病原体の多くの成長を阻害する）。感染した中耳液から単離される病原体は、アシネトバクター・バウマニイ、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・カルノスス、肺炎連鎖球菌、並びに多くの未同定のグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌であった。
【００４７】
＜材料及び方法＞
〔ＳＴ４ＳＡ株の単離及び種レベルへの同定〕
無菌の蒸留水に４時間浸けたダイズから得られるダイズ抽出物を連続希釈し、真菌の成長を防止するために５０ｍｇ／ｌのナタマイシン（Ｄｅｌｖｏｃｉｄ（登録商標）、Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ，Ｂ．Ｖ．、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）が補充されたＭＲＳ寒天（Ｂｉｏｌａｂ、Ｂｉｏｌａｂ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｉｄｒａｎｄ、ＳＡ）に置床した。平板を３０℃及び３７℃で２日間インキュベーションした。
【００４８】
コロニーを、５０〜３００ｃｆｕ（コロニー形成単位）の平板から無作為に選択した。そして、Ｄｅｌｖｏｃｉｄ（登録商標）（５０ｍｇ／ｌ）が補充されたＭＲＳ寒天の第２の層でコロニーを覆うことによって、抗菌活性についてスクリーニングした。平板を、嫌気フラスコ（Ｏｘｏｉｄ、Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、英国）中、ガス発生キット（Ｏｘｏｉｄ）の存在下、３０℃及び３７℃で４８時間インキュベーションした。コロニーを、ラクトバチルス・カセイ、エンテロコッカス・フェカリス、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、肺炎桿菌、肺炎連鎖球菌及び黄色ブドウ球菌の１ｍｌの活発に成長している細胞（約１０６ｃｆｕ／ｍｌ）が補充された半固体（１．０％寒天、ｗ／ｖ）ＢＨＩ培地（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）の第３の層（約１０ｍｌ）によりそれぞれ覆った。平板を３７℃で２４時間インキュベーションした。
【００４９】
コロニーの１つが、試験パネルに含まれる多種類の病原体を阻害した（表４）。このコロニーをＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）に再接種し、その後、純粋な培養物を得るために再び画線培養した。単離菌はＳＴ４ＳＡ株と呼ばれた。抗菌活性が、寒天スポット試験方法を使用することによって確認された。
【００５０】
ＳＴ４ＳＡ株の細胞形態を走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）によって調べた（図１を参照のこと）。ＳＴ４ＳＡ株の初期指数期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．２）培養物の１０ｍｌを遠心分離によって集め、無菌の蒸留水により５回洗浄した（３０００×ｇ、１０分、４℃）。ペレットを５００μｌの無菌ＭｉｌｌｉＱ水（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁し、その後、顕微鏡観察に供した。
【００５１】
さらなる同定を生理学的特徴（表２）及び生化学的特徴によって達成した。色素形成をトリプシン消化ダイズブロス（Ｍｅｒｃｋ）で調べた。運動性についての試験もまた行った。糖発酵反応（表１）を、ＡＰＩ５０ＣＨＬ試験片及びＡＰＩ２０Ｓｔｒｅｐ試験片（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ−ｌ’Ｅｔｉｏｌｅ、フランス）を使用することによって記録し、腸球菌について列挙される反応と比較した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
【表２】
【００５４】
さらなる同定を、エンテロコッカス属に特異的なプライマーにより得られるＤＮＡバンドパターン（図２）、及びエンテロコッカス・ムンドティに特異的なプライマーにより得られるＤＮＡバンドパターン（図３）によって行った。５０ｂｐのＤＮＡフラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国）をマーカーとして使用した。３０６ｂｐのフラグメント（図３に示される）を生じさせるために使用されたプライマーを、１６ＳｒＤＮＡにおける好適に保存された領域から設計した。
配列番号１：フォワードプライマー：ＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ
配列番号２：リバースプライマー：ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ
【００５５】
ＤＮＡフラグメントの配列決定により、ＧｅｎＢａｎｋにおける保存された１６ＳｒＤＮＡフラグメントとの９８％の相同性が明らかにされた。
【００５６】
〔抗菌活性の発現〕
抗菌活性を無細胞上清１ｍｌ当たりの任意単位（ＡＵ）として表した。１ＡＵは、成長阻害の明瞭な領域を示す最大希釈の逆数として定義され、下記のように計算される。
ａｂ×１００
式中、「ａ」は希釈倍数を表し、「ｂ」は、直径が少なくとも２ｍｍである阻害域をもたらす最終希釈を表す。活性は、１００を乗じることによって１ｍｌ当たりで表される。ラクトバチルス・カセイＬＨＳを指示菌として使用した。
【００５７】
〔抗菌性物質の特徴づけ〕
ＳＴ４ＳＡ株をＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）において３０℃で２４時間及び４８時間培養した。細胞を集め（８０００×ｇ、４℃、１５分）、無細胞上清を６ＭのＮａＯＨによりｐＨ６．０に調節した。それぞれの上清の１ｍｌを、０．１ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）でのカタラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、並びに１ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）でのプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ、ＩＮ、米国）、プロナーゼ、パパイン、ペプシン及びトリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、ドイツ）によりそれぞれ処理した。インキュベーション後、酵素を熱不活化し（１００℃で３分）、前に記載したように抗菌活性について試験した。結果が表３に示される。
【００５８】
ペプチドＳＴ４ＳＡのアリコートを、３０℃、６０℃及び１００℃の熱処理に、１０分間、３０分間及び９０分間それぞれ曝し、また、１２１℃で２０分間曝した（表３）。その後、サンプルを、前に記載したように抗菌活性について試験した。
【００５９】
【表３】
【００６０】
別個の実験において、ペプチドＳＴ４ＳＡのサンプルを、２〜１２の範囲のｐＨ値に調節し、３７℃で３０分間インキュベーションし、ｐＨ７に中和し、その後、抗菌活性について試験した（表３）。
【００６１】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡの単離及び精製〕
ＳＴ４ＳＡ株の２４時間培養物をＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）に接種した（２％、ｖ／ｖ、ＯＤ６００ｎｍ＝８．０）。インキュベーションを、撹拌することなく、３７℃で２０時間行った。細胞を集め（８０００×ｇ、１０分、４℃）、ペプチドを８０％飽和の硫酸アンモニウムにより無細胞上清から沈殿させた。沈殿物を１／１０体積の２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）に再懸濁し、１０００Ｄａカットオフの透析メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国）を使用することによって蒸留水に対して脱塩し、ＳｅｐＰａｋ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、米国）にロードした。カラムを２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）中２０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールにより洗浄し、バクテリオシンを２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）中４０％のイソプロパノールにより溶出した。真空下で乾燥した後（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ；Ｓａｖａｎｔ）、フラクションをプールし、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した。活性のあるフラクションを、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に連結されたＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でのゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに分離した（図４）。カラムからのペプチドの溶出を５０ｍＭリン酸塩緩衝液及び４００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）により行った。ペプチドを２５４ｎｍ及び２８０ｎｍでそれぞれ検出した。活性のあるペプチドを含有するフラクションを集め、真空下で乾燥し、−２０℃で保存した。活性試験を、寒天スポット方法を使用することによって行った。
【００６２】
〔サイズ決定〕
ＳＴ４ＳＡ株をＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）において３０℃で２０時間成長させた。細胞を遠心分離（８０００×ｇ、１０分、４℃）によって集め、ペプチドＳＴ４ＳＡを８０％飽和の硫酸アンモニウムにより無細胞上清から沈殿させた。沈殿物を１／１０体積の２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）に再懸濁し、１０００Ｄａカットオフの透析メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国）を使用することによって蒸留水に対して脱塩し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した（図５Ａ）。２．３５ｋＤａから４６ｋＤａに及ぶサイズを有する低分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国）を使用した。活性なバクテリオシンの位置を明らかにするために、ゲルを固定し、一方の半分を、脳心臓浸出物（ＢＨＩ）寒天（Ｂｉｏｌａｂ）に埋め込まれたＬ．ｃａｓｅｉ ＬＨＳ（１０６ｃｆｕ／ｍｌ）により覆った（図５Ｂ）。
【００６３】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡに対する細胞毒性試験〕
ペプチドＳＴ４ＳＡが細胞毒性的性質を有するかどうかを明らかにするために、コンフルエントな単層のサル腎臓Ｖｅｒｏ細胞（１組３ウェル）を組織培養プレートで４８時間成長させ、その後、様々な濃度の抗菌性ペプチドに曝した。４８時間のインキュベーションの後、細胞の生存能を、細胞をテトラゾリウム塩ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−ガンマ−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］（Ｓｉｇｍａ）で処理することによって試験した。コハク酸デヒドロゲナーゼによるＭＴＴの切断の後で形成する青色生成物（ホルマザン）の生成を記録した。
【００６４】
５０％細胞毒性レベル（ＣＣ５０）を、細胞の生存能を５０％低下させるために要求されるペプチド濃度（μｇ／ｍｌ）として定義した。ＣＣ５０の結果（細胞毒性レベル）によれば、細胞毒性が何ら記録されなかった。すなわち、本発明のペプチドはゼロ（０）のＣＣ５０を有する。
【００６５】
〔プラスミド単離〕
総ＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡを単離し、その後、ＤＮＡをＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によってさらに精製した。ＤＮＡをアガロースゲルで分離した（図６）。ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたラムダＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）を分子量マーカーとして使用した。
【００６６】
〔プラスミドのキュアリング〕
キュアリング実験を行った。Ｅｎｔ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡの細胞をノボビオシン（１μｇｍｌ−１〜２５μｇｍｌ−１）の存在下において３７℃で７２時間インキュベーションした。最高濃度のノボビオシンにおいて成長した培養物を無菌の生理的食塩水により連続希釈し、ＭＲＳ寒天平板に置床した。３７℃での一晩のインキュベーションの後、コロニーをレプリカ置床し、元となった平板をエンテロコッカス・フェカリスＬＭＧ１３５６６の細胞により覆った。３７℃でさらに１６時間インキュベーションした後、コロニーを抗菌活性の喪失について調べた。
【００６７】
〔接合伝達実験〕
フィルターかけ合わせ実験を行った。Ｅｎｔ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ及びＥｎｔ．フェカリス ＦＡ２−２の一晩成長させた培養物（０．２５ｍｌ）を４．５ｍｌのＭＲＳに加え、混合し、０．４５μｍの細孔サイズの無菌メンブレンフィルター（ＨＡＷＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した。メンブレンをＭＲＳ寒天平板に置き、３７℃で一晩インキュベーションした。細胞をフィルターから１ｍｌのＭＲＳに洗い出し、連続希釈し、２５μｇｍｌ−１のフシジン酸、２５μｇｍｌ−１のリファンピシン及び２０００ＡＵｍｌ−１の粗ペプチドＳＴ４ＳＡを含有するＭＲＳ寒天平板に置床した。実験を、Ｅｎｔ．フェカリス ＯＧＸ１を受容菌として用いて繰り返した。この場合、選択を、１ｍｇｍｌ−１のストレプトマイシン及び２０００ＡＵｍｌ−１の粗ペプチドＳＴ４ＳＡを含有する平板で行った。コロニーを無作為に選択し、前に記載したように、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生について調べ、また、プラスミド含有量についてスクリーニングした。ｐＳＴ４ＳＡを含有した、Ｅｎｔ．フェカリス ＯＧＸ１の接合細胞のコロニーを培養し、無細胞上清を、前に記載したように活性試験に供した。
【００６８】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡをコードする遺伝子エレメントの検出及びＤＮＡ配列決定〕
総ＤＮＡを単離した。構造遺伝子、トランスポーター遺伝子及び免疫遺伝子（これらは下記に示される）をＰＣＲによって増幅するために使用されたＤＮＡプライマーを、他の抗菌性ペプチドについて発表された部分配列に基づいて設計した。配列決定をＡＢＩＰｒｉｓｍ（商標）３７７ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、米国）においてＡＢＩＰｒｉｓｍ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキットにより行った。データベース検索を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４、米国）のＢＬＡＳＴＮプログラム及びＢＬＡＳＴＸプログラムを使用することによって行った。
【００６９】
構造遺伝子プライマー：
配列番号３：ＳＧ−ａ：ＴＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡ（フォワード）
配列番号４：ＳＧ−ｂ：ＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡ（リバース）
【００７０】
ＡＢＣトランスポータープライマー：
配列番号５：ＡＢＣ１−ａ：ＴＧＡＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴ（フォワード）
配列番号６：ＡＳＣ１−ｂ：ＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＧＴＴＴＡＡＴＣＧ（リバース）
配列番号７：ＡＢＣ２−ａ：ＧＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＧＧＧＧＡＴＴＡＴ（フォワード）
配列番号８：ＡＢＣ２−ｂ：ＴＣＴＡＧＡＴＡＣＧＴＡＴＣＡＡＧＴＣＣ（リバース）
【００７１】
免疫プライマー：
配列番号９：Ｉｍｍｕｎ−ａ：ＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＣ（フォワード）
配列番号１０：Ｉｍｍｕｎ−ｂ：ＧＴＣＣＣＣＡＣＡＡＣＣＡＡＴＡＡＣＴＡ（リバース）
【００７２】
〔種々の成長培地及び種々の初期成長ｐＨ値におけるペプチドＳＴ４ＳＡの産生〕
ＳＴ４ＳＡ株の１８時間培養物を、ＭＲＳブロス、ＢＨＩブロス及びＭ１７ブロス（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）にそれぞれ接種した（２％、ｖ／ｖ）。インキュベーションを、撹拌することなく、２８時間、３０℃及び３７℃でそれぞれ行った。サンプルを１時間毎に採取し、細菌の成長（６００ｎｍでのＯＤ）、培養物ｐＨにおける変化、及びＬ．ｃａｓｅｉ ＬＨＳに対する抗菌活性（ＡＵ／ｍｌ）について調べた。寒天スポット試験方法を、前に記載したように使用した。
【００７３】
別個の実験において、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する初期培地ｐＨの影響を明らかにした。多数の３００ｍｌのＭＲＳブロスを、６ＭのＨＣｌ又は６ＭのＮａＯＨにより、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０及びｐＨ６．５にそれぞれ調節し、その後、オートクレーブ処理した（図９Ａ）。それぞれのフラスコにＳＴ４ＳＡ株の１８時間培養物を２％（ｖ／ｖ）接種し、フラスコを、撹拌することなく、３０℃で２０時間インキュベーションした。培養物ｐＨにおける変化及びペプチドＳＴ４ＳＡの産生（これはＡＵ／ｍｌとして表される）を、本明細書中、前で記載したように１時間毎に測定した。すべての実験を３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。
【００７４】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する培地組成の影響〕
ＳＴ４ＳＡ株を１０ｍｌのＭＲＳブロスにおいて３０℃で１８時間成長させ、細胞を遠心分離（８０００×ｇ、１０分、４℃）によって集め、ペレットを１０ｍｌの無菌のペプトン水に再懸濁した。この細胞懸濁物の４ｍｌを使用して、下記培地の２００ｍｌに接種した。（ａ）ＭＲＳブロス（Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ）で、有機栄養分を含まず、トリプトン（２０．０ｇ／ｌ）、肉抽出物（２０．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物（２０．０ｇ／ｌ）、トリプトン（１２．５ｇ／ｌ）＋肉抽出物（７．５ｇ／ｌ）、トリプトン（１２．５ｇ／ｌ）＋酵母抽出物（７．５ｇ／ｌ）、肉抽出物（１０．０ｇ／ｌ）＋酵母抽出物（１０．０ｇ／ｌ）、又はトリプトン（１０．０ｇ／ｌ）、肉抽出物（５．０ｇ／ｌ）及び酵母抽出物（５．０ｇ／ｌ）の組合せがそれぞれ補充されたもの；（ｂ）ＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）、すなわち、２０．０ｇ／ｌのグルコースを含むもの；（ｃ）ＭＲＳブロス（Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ）で、グルコースを含まず、２０．０ｇ／ｌのフルクトース、スクロース、ラクトース、マンノース及びマルトースがそれぞれ補充されたもの；（ｄ）ＭＲＳブロスで、０．１〜４０．０ｇ／ｌのフルクトースを唯一の炭素源として含むもの；（ｅ）ＭＲＳブロス（Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ）で、２．０〜５０．０ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４又は２．０〜５０．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４を含むもの；及び（ｆ）ＭＲＳブロス（Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ）で、０〜５０．０ｇ／ｌのグリセロールが補充されたもの。別個の実験において、シアノコバラミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）、Ｌ−アスコルビン酸（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ、Ｐｏｏｌｅ、英国）、チアミン（Ｓｉｇｍａ）、ＤＬ−６，８−チオクト酸（Ｓｉｇｍａ）及びビタミンＫ１（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、ＣＨ−９４７１ Ｂｕｃｈｓ、スイス）の各ビタミンをフィルター滅菌し、ＭＲＳブロスに１．０ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）で加えた。すべての試験のためのインキュベーションは３０℃で２０時間であった。ペプチドＳＴ４ＳＡの活性レベルを、前に記載したように測定した。すべての実験を３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。
【００７５】
ＳＴ４ＳＡ株は、図１に示されるような形態、非運動性、色素形成の非存在、並びに属特異的プライマーによるＰＣＲ（図２）及び種特異的プライマーによるＰＣＲ（図３）に基づいて、エンテロコッカス属の菌株として同定された。種レベルへのさらなる同定を、表１に示されるような糖発酵パターン、及び上記の表２に示されるような生理学特徴によって行った。
【００７６】
ペプチドＳＴ４ＳＡは、表３において認められ得るように、タンパク質分解酵素（プロテイナーゼＫ、ペプシン、プロナーゼ、パパイン及びトリプシン）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４による処理によって、また、１２１℃で２０分の後で不活性化された。ペプチドは、１００℃での９０分間の処理の後で、また、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、尿素、ＥＤＴＡ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００により処理されたとき、活性を有したままであった（表３）。活性が、２．０から１２．０に及ぶｐＨ値でのインキュベーションの後で全く失われなかった（表３）。
【００７７】
ペプチドＳＴ４ＳＡは、表４に示されるように、非常に多数のグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌を阻害した。
【００７８】
【表４】
【００７９】
ペプチドＳＴ４ＳＡを、図４に示されるゲルろ過によって精製した。ペプチドＳＴ４ＳＡは、図４及び図５から認められるように、３４００Ｄａの範囲である。このペプチドは、本明細書中、前で記載したように、Ｖｅｒｏ細胞に対して試験されたとき、細胞毒性を有しなかった。
【００８０】
ＳＴ４ＳＡ株は、図６Ａに示されるように、２つのプラスミドを有する。この菌株からこれらのプラスミドをキュアリング処理すると、抗菌活性の喪失が生じなかった。構造遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを用いた、染色体及びプラスミドＤＮＡのプローブ探査では、染色体（ゲノム）との明瞭なハイブリダイゼーションが示された（図６Ｂ）。このことは、ペプチドＳＴ４ＳＡをコードする構造遺伝子がゲノムに存在することを証明した。さらに、Ｅ．フェカリスへのこれらのプラスミドの接合（示されず）では、この菌株はペプチドＳＴ４ＳＡの産生菌に変換されなかった。このことから、ペプチドＳＴ４ＳＡ産生をコードする遺伝子がＳＴ４ＳＡ株のゲノムに存在することが確認された。
【００８１】
ペプチドＳＴ４ＳＡの配列が図７及び配列表に示され、本発明の目的のために配列番号１２として表示される。トランスポーターペプチド及び免疫ペプチドの配列が本発明の目的のために配列番号１４及び配列番号１６としてそれぞれ表示される。
【００８２】
構造遺伝子、トランスポーター遺伝子及び免疫遺伝子のＤＮＡ配列が図８及び配列表に示され、本明細書の目的のために、配列番号１１、配列番号１３及び配列番号１５としてそれぞれ表示される。
【００８３】
種々の成長培地におけるペプチドＳＴ４ＳＡの産生が図９Ａ及び図９Ｂに示される。ペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する初期成長ｐＨの影響が図９Ａに示される。これらの結果から、ペプチドＳＴ４ＳＡは、６．０及び６．５の初期ｐＨでのＭＲＳブロスにおいて最適に産生され、１０〜２０ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、１５．０〜２０．０ｇ／ｌのフルクトースの存在によって、又はビタミンＣ、ビタミンＢ１及びＤＬ−６，８−チオクト酸の存在によって刺激されることが明白である。
【００８４】
ペプチドＳＴ４ＳＡの産生が図１０に示される。最大の産生が１４時間の成長の後で記録された。
【００８５】
接着／免疫遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントが図１１に示され、本明細書の目的のために配列番号１５として表示される。
【００８６】
エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡは、多くの病原体に対する活性を有する広域抗菌性ペプチド（ペプチドＳＴ４ＳＡ）を産生する。リーダーペプチド及びプロペプチド（これらはまとめてプレペプチドとして知られている）をコードする構造遺伝子がＳＴ４ＳＡ株のゲノムに存在する（図６Ｂを参照のこと）。１つのそのような遺伝子構造のみが検出された。このことは、１つのペプチドのみが抗菌活性の広いスペクトルに関わっていることを示唆する。様々な努力が、ＳＴ４ＳＡ株を、その５０ｋｂプラスミド及び１００ｋｂプラスミドからキュアリングするために行われ（図１）、しかし、それらは失敗した。このことは、プラスミドが、免疫性をペプチドＳＴ４ＳＡに与えることにおいて大きな役割を果たし得ること、又は主要な代謝反応において重要な遺伝子を有することを示唆する。
【００８７】
ＳＴ４ＳＡがエンテロコッカス・ムンドティの菌株であるというさらなる証拠が、下記のプライマーを使用する、１６ＳｒＤＮＡにおける保存領域から設計されるプライマーによる種特異的ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって得られた。
配列番号１６：フォワードプライマー：ＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ
配列番号１７：リバースプライマー：ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ
【００８８】
３０６塩基対のフラグメントが増幅された（図３に示される）。このＤＮＡフラグメントの配列決定により、ＧｅｎＢａｎｋにおける保存された１６ＳｒＤＮＡフラグメントとの９８％の相同性がもたらされた。
【００８９】
構造遺伝子（これはプロペプチドＳＴ４ＳＡをコードする）、トランスポーター遺伝子及び免疫遺伝子が配列決定され、それらのそれぞれのアミノ酸配列がＤＮＡ配列から翻訳されている（図８）。
【００９０】
ペプチドＳＴ４ＳＡの安定性が、無菌の蒸留水に懸濁されたとき、−２０℃から６０℃に及ぶ温度で４２日間にわたって試験された（図１２）。このペプチドは、−２０℃では４２日間にわたって、また、４℃では３週間にわたって安定したままであった。安定性が３７℃で１週間の後で低下した。しかしながら、粉末形態のペプチドＳＴ４ＳＡは、室温（２５℃）では６ヶ月間にわたって安定したままであった。ペプチドＳＴ４ＳＡは粉末形態で製造され、そのようなものとして販売される。無菌の蒸留水に溶解されると、ペプチドＳＴ４ＳＡは４℃で３週間保つことができる（図１２を参照のこと）。
【００９１】
ペーパーディスクにおけるペプチドＳＴ４ＳＡの活性が表５に示される。抗生物質との活性の比較が表６に示される。活性が、感染した中耳液から単離されるＰｓｕｄｏｍｏｎａｓ種に対して試験された。阻害域の画像が図１３に示される。
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
ペプチドＳＴ４ＳＡが標的細胞に結合することが、ペプチドの浸透を確かなものにするために重要である。ペプチドＳＴ４ＳＡが病原体に接着する能力を調べた。結果が、病原体に結合する百分率として表された（表７）。これらの結果から結論すると、少なくとも７５％のペプチドＳＴ４ＳＡが、試験された病原体に結合する。ペプチドＳＴ４ＳＡが標的細胞に接着することにより、細胞膜への浸透及び細胞膜の破壊が引き起こされる（図１４）。
【００９５】
【表７】
【００９６】
細胞膜損傷及び細胞構成成分の漏出のさらなる証拠が、細胞外ＤＮＡ及び細胞外β−ガラクトシダーゼ活性について試験することによって得られた。これらの結果が表８及び表９にそれぞれ示される。これらの結果は、ＤＮＡ及びβ−ガラクトシダーゼが、ペプチドＳＴ４ＳＡによる損傷を受けた細胞から漏れたことを示している。β−ガラクトシダーゼの漏出は、すべての種がこの酵素の高い細胞内レベルを有するとは限らないという事実のために、すべての病原体について記録されなかった。
【００９７】
【表８】
【００９８】
【表９】
【００９９】
ペプチドＳＴ４ＳＡによる処理の後での種々の病原体の細胞溶解が図１５〜２３に示される。オーバーナイトの病原体の０．２％（ｖ／ｖ）接種物をＢＨＩブロスに接種した。ペプチドＳＴ４ＳＡを中期指数期でそれぞれの病原体に加えた。本明細書中に示される結果（図１５〜２３）から、ペプチドＳＴ４ＳＡがほとんどの病原体に対して殺菌的様式で作用したことが明らかである。
【０１００】
ペプチドＳＴ４ＳＡの産生をリステリア・イノクアの存在下で調べた（図２４）。これらの結果に基づいて、Ｌ．イノクアは、ペプチドＳＴ４ＳＡを産生するようにＳＴ４ＳＡ株を刺激し、しかし、その期間中、Ｌ．イノクアは阻害された。
【０１０１】
〔プロバイオティクス菌としてのエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ〕
エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡの生存を、コンピューター化された胃腸モデル（ＧＩＭ、これは図２５に示される）において評価した。
【０１０２】
ＧＩＭにおける第１の容器が胃を模擬し、第２の容器が十二指腸を模擬し、容器番号３が空腸及び回腸を模擬し、容器４が結腸を模擬する。栄養分の流れが専用のソフトウエアによって調節された。ＧＩＭの異なる区画におけるｐＨが無菌の１Ｎ ＨＣｌ又は１Ｎ ＮａＯＨの蠕動的添加によって調節された。それぞれの区画には、制御装置及びコンピューターにつながれる非常に高感度のｐＨプローブが取り付けられた。ＧＩＭを通過する栄養分の流速が乳児の腸管に従って調節された。短い消化管を模擬する条件が、より大きい変動、従って、プロバイオティクス菌に対する増大したストレスを可能にするために選ばれた。４つの乳児用調製粉乳（Ｌａｃｔｏｇｅｎ２、ＮＡＮ Ｐｅｌａｒｇｏｎ、ＡＬＬ１１０及びＡｌｆａｒｅ）を評価した。プロバイオティクス細菌（ＳＴ４ＳＡ）による投薬は処方に従った。すなわち、１ｍｌ当たり生細胞１０８個（ｃｆｕ）。プロバイオティクス菌体を唾液に懸濁した。ＮａＨＣＯ３、パンクレアチン及び雄牛の胆汁を含有する膵液−胆汁溶液を、蒸留水に溶解した。ＧＩＭで使用した条件は、表１０及び表１１に要約する通りであった。
【０１０３】
【表１０】
【０１０４】
【表１１】
【０１０５】
病原体に対するＳＴ４ＳＡ株の生存を、ＧＩＭにリステリア・モノサイトゲネスを感染させることによって試験した。ＧＩＭにおけるＳＴ４ＳＡ株の生存、及び抗菌性ペプチドＳＴ４ＳＡをＧＩＭにおいて産生するその能力をモニターした（結果が表１２に示される）。
【０１０６】
【表１２】
【０１０７】
表１２に示される結果から結論され得るように、ＳＴ４ＳＡ株が腸管のすべての区域で生存した。抗菌性ペプチドの産生は、腸管のすべての区域において、１ｍｌ当たり２５６００ＡＵ（任意単位）を超えていた。ＮＡＮ Ｐａｌａｒｇｏｎでの成長は、ＭＲＳの場合ほど最適でなく、わずかに低かった。しかしながら、両方の実験では、細胞数が、１対数単位を超えて低下しなかった（表１３を参照のこと）。
【０１０８】
【表１３】
【０１０９】
様々な抗生物質に対するＳＴ４ＳＡ株の抵抗性が標準的な手順（抗生物質ディスク、Ｏｘｏｉｄ）に従って試験されている。これらの結果から結論されるとき、ＳＴ４ＳＡ株は、スルホンアミド系、クロキサシリン、メトロニダゾール、メチシリン、ネオマイシン、ナイスタチン、オキサシリン及びストレプトマイシンに対して抵抗性である（表１３）。
【０１１０】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳの小児が、下痢を防止するためにトリメトプリム−スルファメトキサゾール（ＴＭＰ−ＳＭＸ）及び／又はメトロニダゾールにより処理される。ＮＡＮ Ｐａｌａｒｇｏｎには、異なる濃度の後者の抗生物質が補充され、ＳＴ４ＳＡに対する影響が最適な培養温度（３７℃）での１８時間の後で測定された。
【０１１１】
表４に示される結果から結論され得るように、ＴＭＰ−ＳＭＸ及びメトロニダゾールはＳＴ４ＳＡ株の細胞数を４対数単位で低下させた。しかしながら、増大した濃度は、生存性に対する劇的な影響を有しなかった。
【０１１２】
〔ＳＴ４ＳＡにおける毒性因子の発生〕
ＳＴ４ＳＡ株をプロバイオティクス菌として開発するためには、これに伴う何らかの毒性因子が存在するかを知ることが重要である。プライマーが、下記の毒性因子をコードする遺伝子について設計されている。バンコマイシン抵抗性（ＶａｎＡ／ＶａｎＢ）；ゼラチナーゼ（Ｇｅｌ）の産生；凝集物質（ＡＳ）；腸球菌由来のコラーゲンのアドヘシン（Ａｃｅ）；腸球菌表面タンパク質（Ｅｓｐ）；溶血素／バクテリオシン（Ｃｙｌ）及び非細胞溶解素β溶血素の遺伝子。ＳＴ４ＳＡ株のＤＮＡが後者のプライマーにより増幅されたことにより、この菌株は、バンコマイシン抵抗性、ゼラチナーゼ活性、凝集物質及びコラーゲン接着をコードする遺伝子を有しないことが示された。これらの結果に基づけば、ＳＴ４ＳＡ株は病原性でなく、また、アルルギー反応を、摂取されたときに引き起こさないはずである。
【０１１３】
ペプチドＳＴ４ＳＡは、多くのグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して作用する抗菌活性の広いスペクトルを有するので、ペプチドＳＴ４ＳＡの作用様式は、乳酸菌についてこれまでに記載の他の抗菌性ペプチドとは異なるようである。加えて、感受性細胞の細胞壁における認識部位が、本出願人が承知している他のペプチドによって使用される通常的な脂質ＩＩアンカー部位（図２６）とは異なり得る。
【０１１４】
この仮説を検証するために、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）ＤＳＭ２００１７（これはペプチドＳＴ４ＳＡに対して感受性である）の脂質ＩＩ標的部位をバンコマイシンにより阻止した（概略図を参照のこと、図２６）。バンコマイシンは脂質ＩＩ分子のアミノ酸側鎖に接着し、このことにより、理論的には、ペプチドＳＴ４ＳＡが同じ部位に結合することが妨げられると考えられる（すなわち、脂質ＩＩが受容体として作用するならば）。しかしながら、バンコマイシン及びペプチドＳＴ４ＳＡの組合せによる標的細胞（Ｌ．サケイ ＤＳＭ２００１７）の処理は成長阻害をもたらした（細胞質の漏出；図２６を参照のこと）。このことは、脂質ＩＩ以外の標的部位が、ペプチドＳＴ４ＳＡについての受容体として作用していることを示唆する。ペプチドＳＴ４ＳＡが感受性細胞表面の２つ以上のアンカー部位に結合するという事実により、ペプチドＳＴ４ＳＡがなぜ、（グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して阻害性の）抗菌活性のそのような広いスペクトルを有するかが説明され得る。本出願人は、バンコマイシンによるＬ．サケイ ＤＳＭ２００１７の処理が脂質ＩＩの標的部位へのナイシンの結合を妨げた図２６に示されるように、ナイシン（抗生物質）が脂質ＩＩに結合することを承知している。
【０１１５】
ペプチドＳＴ４ＳＡは、ペプチドＳＴ４ＳＡが細胞壁表面の受容体部位との反応を形成した後で、リン脂質が多い細胞膜とのインターカレーションが可能である２つの疎水性領域を有する（図２７）。これら２つの疎水性領域の間の領域、より具体的には、アミノ酸２９（セリン）と、アミノ酸３０（アラニン）との間（図２７）は、構造体の残り部分よりも柔軟であり、ペプチドのＣ末端側半分を曲げ、リン脂質が多い細胞膜の中に自身を取り込むことを可能にするヒンジ領域として作用し得る。この仮説を検証するために、ペプチドＳＴ４ＳＡのこれら２つの区域（図２７）を、構造遺伝子のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づいて合成した（これらは本明細書中下記ではフラグメント１及びフラグメント２として示される）。
【０１１６】
下記に示されるように、フラグメント１は、ヒンジ領域（すなわち、２９位におけるセリンと、３０位におけるアラニンとの間）の直前までの最初の２９アミノ酸（リシンからセリンまで）からなっていた。ジスルフィド架橋が導入され（連結線、下記に示される）、このジスルフィド架橋により、アミノ酸９（システイン）及びアミノ酸１４（システイン）（これらもまた、全長のペプチド配列において下記に示される）が共有結合により連結されていた。
【化１】
【０１１７】
このジスルフィド架橋は、ペプチドの構造を安定化するために役立った。フラグメント１は、囲まれた領域（２１位〜２６位の６アミノ酸、すなわち、ＡＩＧＩＩＧ）によって示される最初の疎水性領域を含有した。分子のこの部分は標的（感受性）生物の細胞壁における受容体を認識する。
【０１１８】
フラグメント２は、ヒンジ領域の下流側にある第２の疎水性ループにおける最後の１３個のＣ末端アミノ酸と、（セリンと、アラニンとの間の）ヒンジ領域の直前の先行する１１アミノ酸と、を含んでいた。
【化２】
【０１１９】
感受性細胞をペプチドＳＴ４ＳＡのこれらの２つのフラグメントで処理することにより、分子の両方のフラグメント（区域）が抗菌活性のために必要とされることが示された。従って、Ｎ末端が細胞表面の受容体に固定されると、細胞膜の破壊がやっと可能となるようである。
【０１２０】
〔ポリエチレン（ＰＥ）に対するペプチドＳＴ４ＳＡの結合〕
ポリエチレン（ＰＥ）に対するペプチドＳＴ４ＳＡの結合を試験した。ＰＥフィルムを５×５ｃｍの切片に切断し、６０％イソプロパノール及びペプチドＳＴ４ＳＡの溶液（活性レベル：１０２４００ＡＵ／ｍｌ）に１時間浸した。ＰＥ切片を風乾し（６０℃で２０分間）、標準的な寒天拡散方法を使用することによって抗菌活性についてアッセイした。平板にＬ．サケイ ＤＳＭ２００１７を播種した後、平板を３０℃で２４時間インキュベーションし、成長阻害域について調べた。
【０１２１】
ペプチドＳＴ４ＳＡは６０秒以内にＰＥに吸着して、高い抗菌活性（ＰＥ切片を取り囲む大きい阻害域）を有するフィルムをもたらした。結合の強さを、ペプチド被覆のＰＥフィルムをＳＤＳ緩衝液に浸し、その後、ペプチドＳＴ４ＳＡをフィルムから３０ｍＡの電流により２時間（室温、すなわち、約２５℃）電気溶出することによって求めた。サンプルを一定の時間間隔で採取し、抗菌活性について試験した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用することによって求めた。電気溶出されたフィルムを、寒天拡散方法を前のように使用することによって抗菌活性について試験した。
【０１２２】
ペプチドＳＴ４ＳＡはＰＥフィルムに強く接着した。ペプチドＳＴ４ＳＡはＰＥフィルムに対して不可逆的であるようである。ＰＥの表面からのペプチドＳＴ４ＳＡの遊離は３０ｍＡの電流により１時間後にやっと可能であった。赤身の肉をモデルとして用いる課題研究において、表面（ＰＥ）に結合したペプチドＳＴ４ＳＡは、病原性細菌（リステリア属、バチルス属及びスタフィロコッカス属）の成長を妨げた。このことは、ペプチドＳＴ４ＳＡは、微生物感染症を防止又は軽減するための創傷被覆材において使用可能であり、また、他の医療用途又は防腐用途における使用、例えば、インプラント、イヤーグロメット、カテーテル、オストミーチューブ、オストミーポーチ、ステント、縫合材、衛生用品（例えば、女性衛生用品など）、コンタクトレンズ、コンタクトレンズ洗浄液などにおける使用もまた見出されることを示唆する。抗菌性ペプチドをポリマー中に封入することにより、抗菌性ペプチドのゆっくりした放出及び微生物感染症の長期間の治療がもたらされる。さらには、ＰＥに対するペプチドＳＴ４ＳＡの強い接着性は、そのことが徐放性の抗菌剤として作用することを示す。
【０１２３】
ペプチドＳＴ４ＳＡは微生物細胞上の２つ以上の受容体に結合し、広域抗菌薬から予想される典型である。ペプチドＳＴ４ＳＡの第１の区域（ヒンジ領域の前方の区域）が受容体に結合する。第２の部分（ヒンジ領域の下流側の部分）はより大きい疎水性領域を有し、細胞膜の中にインターカレーションし、透過性を乱し、これにより、（ＤＮＡ及び酵素の漏出によって可視化される）細胞死を引き起こす。ペプチドＳＴ４ＳＡは、安定した徐放性様式でＰＥに結合し、従って、創傷被覆材に組み入れるために適する。
【０１２４】
〔プロバイオティクスへのエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡの開発〕
エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡの生存を、示されるようなコンピューター化された胃腸モデルにおいて評価した。この段階はプロバイオティクス菌としてのＳＴ４ＳＡ株のさらなるインビトロ評価及びインビボ評価を含んでいた。粘膜及び上皮細胞に対する接着を、ヒト細胞株を用いてインビトロで調べた。インビボ研究をラットにおいて行った。
【０１２５】
この研究で使用されたヒト腸細胞株はヒト結腸腺癌に由来し、Ｃａｃｏ−２細胞株、ＨＴ−２９及びＨＴ２９−ＭＴＸ（粘液分泌細胞）を含んでいた。これらの細胞株は、標準的な培養条件下で成長すると、形態学的及び機能的な分化を発現し、分極化、機能的な刷子縁及び先端の腸ヒドロラーゼをはじめとする成熟した腸細胞の特徴を示す。
【０１２６】
宿主細胞へのＳＴ４ＳＡ株の接着性が、細胞表面の炭水化物、ＥｆａＡタンパク質、Ａｃｅ（腸球菌由来のコラーゲンのアドヘシン）タンパク質及び凝集物質（ＡＳ）（これらは病原性に関係づけられる）によって影響される。ＡＳは、ＡＳがコードされる性フェロモンプラスミドの非常に効率的な伝達を可能にする細胞集塊の形成を媒介するアドヘシンである。
【０１２７】
本研究では、ＳＴ４ＳＡ株を、毒性形質、胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）の活性、及びヒト腸細胞様細胞株Ｃａｃｏ−２に対する接着能力、すなわち、Ｃａｃｏ−２細胞株に接着しながらでの競合的排除、また、インビトロ胃腸（ＧＩＴ）モデルにおける競合的排除についてスクリーニングした。加えて、ＳＴ４ＳＡの細胞表面の疎水性を求めた。
【０１２８】
〔毒性因子〕
毒性因子の存在、すなわち、バンコマイシン抵抗性（ＶａｎＡ／ＶａｎＢ／ＶａｎＣ１／ＶａｎＣ２／ＶａｎＣ３）の存在、ゼラチナーゼ（Ｇｅｌ）の産生、凝集物質（ＡＳ）、腸球菌由来のコラーゲンのアドヘシン（Ａｃｅ）、腸球菌表面タンパク質（Ｅｓｐ）、溶血素／バクテリオシン（Ｃｙｌ）及び非細胞溶解素β溶血素の遺伝子を、インビトロ検査及び／又はＰＣＲスクリーニングによって調べた。ＤＮＡを標準的な方法に従ってＥ．ムンドティＳＴ４から抽出した。後者の遺伝子を増幅するために設計されたプライマーは記載の通りであった。結果が表１４に示される。
【０１２９】
【表１４】
【０１３０】
〔凝集物質（ＡＳ）の産生〕
ＡＳの産生を性フェロモンの存在下での集塊形成アッセイで調べた。性フェロモンを、フェロモン産生菌（エンテロコッカス・フェカリスＪＨ２−２）をＭＲＳブロスにおいて３７℃で１８時間成長させることによって得た。フェロモン産生菌（Ｅ．フェカリス ＯＧ１Ｘ）の上清をマイクロタイタープレートでの集塊形成アッセイにおいて使用した。２００マイクロリットルをＳＴ４ＳＡ株とともに接種し（０．５％、ｖ／ｖ）、２時間後、４時間後、８時間後及び２４時間後に細胞の集塊形成について顕微鏡で調べた。細胞の集塊形成が全く認められなかった。
【０１３１】
〔ゼラチナーゼの産生〕
ゼラチナーゼの産生を、３０ｇ／ｌのゼラチンを含有するＭＲＳ寒天で調べた。３７℃で１８時間後においてコロニーを取り囲む透明域を、陽性の反応であると見なした。ゼラチナーゼの産生が全く検出されなかった。
【０１３２】
〔β−溶血素の産生〕
β−溶血素の産生が、血液寒天平板においてコロニーを取り囲む透明域の形成によって示された。血液寒天平板を、Ｃｏｌｕｍｂｉａ血液寒天基剤を５％のヒツジ血液とともに使用して調製した。β−溶血素の産生が全く認められなかった。
【０１３３】
本出願人が、ＳＴ４ＳＡ株は、バンコマイシン抵抗性、ゼラチナーゼ産生、心内膜炎抗原の産生、細胞凝集物の形成、コラーゲンに対する接着性、及び／又は表面タンパク質の産生をコードする遺伝子を有しないことを示していることは明白である。β−溶血素活性及び非細胞溶解素β溶血素ＩＩＩをコードする遺伝子が検出された。しかしながら、後者の２つの遺伝子は発現されない（溶血活性が血液寒天平板において認められなかった−下記参照）。
【０１３４】
〔胆汁酸塩加水分解（ＢＳＨ）活性の測定〕
ＳＴ４ＳＡ株を一晩培養した培養物を１０μｌ、０．５％（ｗ／ｖ）のタウロデオキシコール酸（ＴＣＤＡ）のナトリウム塩及び０．３７ｇ／ＬのＣａＣｌ２が補充されたＭＲＳ寒天平板にスポットすることによってＢＳＨ活性について試験した。平板を嫌気ジャーにおいて３７℃で７２時間インキュベーションした。沈殿域の形成を、ＢＳＨ陽性であると見なした。
【０１３５】
胆汁酸塩加水分解（ＢＳＨ）活性がＳＴ４ＳＡ株について認められなかった。ＢＳＨ活性は、十二指腸における抱合型胆汁酸塩の毒性に対する乳酸菌の抵抗性に寄与し得る。しかしながら、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性及び胆汁酸塩に対する抵抗性は無関係であると一般に受け入れられている。
【０１３６】
〔細胞表面疎水性の測定〕
Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡを一晩培養した培養物を１／４強度のリンゲル溶液（ＱＳＲＳ）により２回洗浄し、ＯＤ５８０ｎｍを測定した。等体積の懸濁物及びｎ−ヘキサデカンを一緒に加え、２分間混合した。相を室温で３０分間分離させ、その後、１ｍｌの水相を取り出し、ＯＤ５８０ｎｍを測定した。２回（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）の評価のＯＤ５８０ｎｍを平均化し、疎水性を計算するために使用した。
％疎水性＝［（ＯＤ５８０ｎｍ測定値１−ＯＤ５８０ｎｍ測定値２）／ＯＤ５８０ｎｍ測定値１］×１００。
【０１３７】
図２８に示される結果から、ＳＴ４ＳＡ株は疎水性の徴候を示さなかったことが明白である。従って、この細胞はＧＩＴにおいて表面に永続的に付着しない。この細胞は腸内を（プランクトン細胞のように）自由に移動し、従って、このことは、良好なプロバイオティクス菌としてのその有用性を高める。
【０１３８】
〔Ｃａｃｏ−２細胞株へのＥ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ及びリステリア・モノサイトゲネスの接着〕
Ｃａｃｏ−２細胞（Ｈｉｇｈｖｅｌｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、コンフルエンスを得るために５×１０５細胞／ウェルの濃度で播種した。接着性を、１００μｌの細菌懸濁物（１×１０５ｃｆｕ／ｍｌのＳＴ４ＳＡ株及び１×１０３ｃｆｕ／ｍｌのＬ．モノサイトゲネス）をウェルに加えることによって調べた。３７℃で２時間インキュベーションした後、細胞株をＰＢＳにより２回洗浄した。細菌細胞をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００により溶解し、ＭＲＳ寒天及びＢＨＩ寒天にそれぞれ置床した。接着を初期生菌数及び細胞溶解物から計算した。
【０１３９】
ＳＴ４ＳＡ株及びリステリア・モノサイトゲネスの競合的排除を、１００μｌの各菌株を細胞単層に接種することによって求めた。２時間のインキュベーション期間の後、細胞を溶解し、エンテロコッカス特異的培地及びリステリア特異的培地にそれぞれ置床した。
【０１４０】
Ｃａｃｏ−２細胞単層物を１２ウェル組織培養プレートでのガラス製カバースリップにおいて調製した。ＳＴ４ＳＡ細胞の懸濁物をウェルに加えた。２時間の接着期間の後、細胞株をＰＢＳにより２回洗浄し、１０％ホルマリンにより固定処理し、グラム染色した。接着性細胞を顕微鏡で調べた。結果が表１５及び表１６に示される。
【０１４１】
【表１５】
【０１４２】
【表１６】
【０１４３】
表１５及び表１６に示される結果から、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ細胞がＣａｃｏ−２細胞へのリステリアの接着を妨げたこと、及びこの細胞がヒト細胞株における認識部位についてリステリアに対して首尾良く競合したことが明らかである。従って、ＳＴ４ＳＡ株はリステリアに打ち勝つことができる。
【０１４４】
〔ＳＴ４ＳＡにより攻撃されたＬ．モノサイトゲネス及びインビトロ胃腸（ＧＩＴ）モデルにおける生存〕
インビトロ胃腸モデルにおけるＬ．モノサイトゲネスに対するＳＴ４ＳＡの抗菌活性を求めた。ＳＴ４ＳＡを本明細書中、前に記載したような胃容器に接種した。Ｌ．モノサイトゲネス（１×１０４個）をＧＩＴの十二指腸容器に接種した。サンプルをそれぞれの容器から採取し、エンテロコッカス特異的培地及びリステリア特異的培地にそれぞれ置床した。コントロールとして、Ｌ．モノサイトゲネスのみをＧＩＴモデルに接種した。
【０１４５】
インビトロＧＩＴモデルにおけるＳＴ４ＳＡによるＬ．モノサイトゲネス攻撃では、ＳＴ４が、Ｌ．モノサイトゲネスに対する抗菌活性を有したことが明らかにされた（次頁のグラフを参照のこと）。成長が十二指腸容器において８×１０４個から２×１０４個に低下し、Ｌ．モノサイトゲネスは、図２９に示すように、コントロールと比較したとき、回腸容器において１×１０１ｃｆｕ／ｍｌほど低かった。
【０１４６】
〔経口投与されたＥ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡの安全性、細菌転位、生存及び免疫調節能のインビボ評価：Ｌａｃｔｏｖｉｔａに対する比較〕
＜材料及び方法＞
〔動物〕
体重が３１８ｇ〜３３５ｇの間にある１０匹の雄性のＷｉｓｔａｒラットを、制御された大気（温度、２０℃±３℃）において、１２時間の明暗サイクルとともにプラスチックケージに５匹ずつの群で収容した。動物には、標準餌、並びにプロバイオティクス菌補充又は非補充のいずれかのオートクレーブ処理された逆浸透水が自由に与えられた。
【０１４７】
〔細菌菌株及びプロバイオティクス菌〕
ＳＴ４ＳＡ株をＭＲＳブロスにおいて３０℃で１８時間培養した。光学濃度を６００ｎｍにおいて１．８に調節した。細胞を遠心分離によって集め、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄された細胞を１００ｍＭスクロースに再懸濁し、液体窒素で凍結し、一晩凍結乾燥した。ｃｆｕ／ｍｌ値を、所与量の細胞を１ｍｌのリン酸塩緩衝液に懸濁し、希釈物をＭＲＳ固体培地に展開置床することによって求めた。ＳＴ４ＳＡ株を約２×１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で飲料水に加えた。
【０１４８】
Ｌａｃｔｏｖｉｔａの商品名で市販されているプロバイオティクス菌を含有する３個のカプセルを開け、飲料水のそれぞれのビンに加えた。これにより、約３×１０５ｃｆｕ／ｍｌが投与されることがもたらされた。
【０１４９】
〔実験設計〕
２つの別個の研究を行った。それぞれの研究では、１０匹のラットが、それぞれ５匹の２つの群に無作為に分けられた。一方の群はコントロールとして作用し、非補充の水が与えられた。第２の群には、Ｌａｃｔｏｖｉｔａカプセル又は凍結乾燥ＳＴ４ＳＡ株のいずれかが補充された水が与えられた。それぞれのラットは、研究期間を通して合計で９．８９×１０１１ｃｆｕのＳＴ４株又は３．１×１０９ｃｆｕのＬａｃｔｏｖｉｔａのいずれかが与えられた。ラットを毎日、波打った被毛、背中を丸めた姿勢、不安定な動き、震え又は身震い、咳又は呼吸困難、四肢の色を含めて、何らかの異常な活動、行動及び全体的な健康状態についてモニターした。活動を、３点スケール法を使用してモニターした。１＝緩慢、ゆっくり動く；２＝中程度；３＝活発な動き又は探索。生体重量及び消費された水の体積を毎日測定した。ＳＴ４ＳＡ株での研究を５０日にわたって行い、Ｌａｃｔｏｖｉｔａでの研究を１０８日にわたって行った。結果が表１７に示される。
【０１５０】
【表１７】
【０１５１】
〔β−グルクロニダーゼ活性〕
ラットを指定のサンプリング点で個別ケージに一晩入れ、２４時間の便サンプルを、細菌数及びβ−グルクロニダーゼ活性を求めるために集めた。便サンプルを１００ｍｇ便／ｍｌ緩衝液の濃度で２０ｍＭリン酸塩緩衝液においてホモジネートした。サンプルをアッセイまで−２０℃で保存した。便サンプルを遠心分離によってペレット化し、１ｍｌのＧＵＳ抽出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＰＯ４、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に再懸濁し、混合し、２２℃で１０分間インキュベーションした。サンプルを−２０℃で一晩凍結し、β−グルクロニダーゼ活性を測定する前に解凍した。β−グルクロニダーゼ活性を、１００μｌの処理された便懸濁物を９００μｌの反応緩衝液（１ｍＭのｐ−ニトロフェニルグルクロニドを含有する抽出緩衝液）と３７℃で２時間インキュベーションすることによってアッセイした。反応を、２．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０．４）を加えることによって停止させた。吸光度を４１５ｎｍで測定した。標準曲線を、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ及び１０ｍＭのｐ−ニトロフェノールを使用して構築した。
【０１５２】
〔細菌転位、毒性学的研究及び組織学〕
指定された期間にわたって試験菌株を与えた後、動物をペントバルビトンナトリウムの過剰用量によって安楽死させた。血液サンプルを右心室の心臓穿刺によって得た。それぞれのラットの内臓器官の全体的解剖学を調べ、記録した。肝臓組織、脾臓組織、回腸組織、盲腸組織及び結腸組織のサンプルを切除した。組織サンプルをカセットに集め、４％ホルムアルデヒド（ＰＢＳ）溶液に入れ、その後、組織学的分析及びＦＩＳＨ研究のためにパラフィンワックスに包埋した。回腸及び結腸の切片を液体窒素で凍結した。血液サンプルをＢＨＩ固体培地に展開置床し、３７℃で一晩インキュベーションした。
【０１５３】
〔免疫調節〕
総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して回腸及び結腸の凍結サンプルから抽出した。ＲＮＡの濃度を、ＤＮａｓｅ処理が完了した後、２６０ｎｍでの吸光度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して測定することによって求めた。それぞれのＲＮＡサンプルを４２ｎｇ／μｌの濃度に希釈した。合計で５μｇのそれぞれのサンプルを、スロットブロット装置を使用して３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）でナイロンメンブレンに移した。その後、メンブレンを、ラットのゲノムＤＮＡから増幅され、ＤＩＧにより標識された、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ）又はβ−アクチンのいずれかのＤＮＡプローブによりプローブ探査した。メンブレンをＸ線フィルムに一晩感光させ、現像した。
【０１５４】
＜結果＞
〔全体的な健康状態及び体重増加〕
研究期間を通して、顕著な行動変化又は活動変化がラットにおいて認められず、また、差を、実験群と、コントロール群との間で何ら認めることができなかった。処理に関連づけられる疾患又は死亡は生じなかった。
【０１５５】
〔β−グルクロニダーゼ活性〕
β−グルクロニダーゼを含めて、様々な細菌酵素が、変異原、発癌物質及び腫瘍促進因子を、ＧＩＴにおいて見出される前駆体から生じさせることに関与することが知られており、それらの存在が、細菌菌株の毒性を示す場合があり、従って、可能性のあるプロバイオティクス菌の安全性の目安として使用することができる。ＳＴ４ＳＡ株及びＬａｃｔｏｖｉｔａ懸濁物はともに、β−グルクロニダーゼ活性をインビトロで示さなかった（データは示さず）。しかしながら、Ｌａｃｔｏｖｉｔａ懸濁物が与えられたラットは、コントロールのラットと比較したとき、β−グルクロニダーゼ活性における増大を便サンプルにおいて示した（表１８Ａ）。コントロール動物はまた、５６日目での活性と比較したとき、活性における低下を研究の１０７日目に示し、実験動物は、５６日目と比較したとき、わずかに増大した値を１０７日目に示した。ＳＴ４補助物が与えられたラットは、コントロール群と比較したとき、より大きいβ−グルクロニダーゼ活性を示した（表１８Ｂ）。しかしながら、この活性は、研究の０日目での値と比較したとき、研究終了時においてより低いままであった。コントロール群もまた、０日目と比較したとき、研究終了時においてより低い活性を示した。
【０１５６】
【表１８】
【０１５７】
〔細菌転位、毒性学的研究及び組織学〕
菌血症が動物群のいずれにおいても検出されなかった。内臓器官の肉眼検査では、ＳＴ４ＳＡ株が与えられたラットが、コントロールのラットと比較したとき、著しくより顕著なＭＬＮを有したことが示された。ＭＬＮは、コントロールのラットにおいて特定することが極めて困難であった。実験群と比較したとき、コントロール群における脾臓はより狭小であり、筋肉量及び腹部脂肪がともにコントロール群ではより少なかった。Ｌａｃｔｏｖｉｔａが与えられた動物では、コントロール群と比較したとき、ＭＬＮがそれほど顕著ではなく、また、脾臓がより小さかった。
【０１５８】
リンパ球が脾臓に入り、血中の抗原に対する免疫応答を促進させる。肥大した脾臓は免疫系の増大した活性を示し得る。このことはまた、顕著なＭＬＮとも相関する。ＭＬＮはまた、免疫機能に関与しており、炎症又は感染の結果として大きくなる場合がある。この増大は、リンパ球がその機能を予想される通りに発揮していることの目安である。従って、ＳＴ４ＳＡ株は免疫刺激剤として作用し得る。Ｌａｃｔｏｖｉｔａ補助物を受けているラットは、コントロールのラットと比較したとき、より小さい脾臓及びそれほど顕著でないＭＬＮを示した。このことは、Ｌａｃｔｏｖｉｔａが免疫反応を誘導しないことを示している。しかしながら、コントロールラットのＭＬＮ及び脾臓が大きくなり、疾患の症状が、何らかの免疫刺激剤の非存在下では全く認められなかった。
【０１５９】
〔免疫調節〕
ノーザンハイブリダイゼーション研究では、何らかのサイトカイン（ＴＮＦ又はＩＦＮ）の発現が実験ＳＴ４ＳＡ群又はコントロール群のいずれにおいても示されなかった。ＲＮＡがβ−アクチンのＤＮＡプローブによりプローブ探査されたとき、陽性シグナルが検出され、相対的に同じ強度であった。このことはＲＮＡの存在を示している。
【０１６０】
サイトカインは、細胞成長、炎症、免疫性、分化及び修復を媒介する分泌タンパク質である。サイトカインは多くの場合、その要求される作用を生じさせるために、フェムトモル濃度を必要とするだけである。多くの場合、サイトカインは細胞表面の受容体との組合せで作用して、ＲＮＡ合成及びタンパク質合成のパターンにおける変化を生じさせる。サイトカインは通常、そのような低い濃度で存在するので、これらのタンパク質の影響下にあるさらなる遺伝子の発現を明らかにすることがより有益であり得る。
【０１６１】
本明細書中に示される結果は、試験されたプロバイオティク菌のいずれもが、雄性のＷｉｓｔａｒラットの全体的な健康状態に対する負の影響を何ら有していないことを示している。
【０１６２】
まとめると、ＳＴ４ＳＡ株は、バンコマイシン抵抗性をコードする遺伝子を有していない。β−溶血素活性及び非細胞溶解素β溶血素ＩＩＩをコードする遺伝子が検出されたが、しかし、遺伝子はサイレント（非発現）のままであった。ＳＴ４ＳＡ株は胆汁酸塩加水分解（ＢＳＨ）活性を有していない。このことは、この菌株がＧＩＴの下部区画（回腸及び結腸）においてより良好に機能することを示している。上記で示したように、データは、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ株がＧＩＴの中を自由に動き、Ｃａｃｏ−２細胞へのリステリアの接着を妨げ、同時にまた、ヒト細胞上の受容体に結合しないようにリステリアと首尾よく競合することを示している。ＳＴ４ＳＡ株は抗菌作用を胃腸モデル（ＧＩＭ）研究においてＬ．モノサイトゲネスに対して有した。ＳＴ４ＳＡ株は、ラット研究により示されるように、非毒性である。処理に関連づけられる疾患又は死亡は生じなかった。ＳＴ４ＳＡ株はまた、そのようなものとしてＬａｃｔｏｖｉｔａよりも良好に機能した。これは、ラットにＬａｃｔｏｖｉｔａが与えられた場合、ラットはβ−グルクロニダーゼ活性における増大を示したからである。従って、ＳＴ４ＳＡ株はラットにおいて免疫応答を刺激する。Ｌａｃｔｏｖｉｔａ補充物が与えられたラットは、コントロールのラットと比較したとき、より小さい脾臓及びそれほど顕著でないＭＬＮを示した。このことは、Ｌａｃｔｏｖｉｔａが免疫反応を誘導しないことを示唆する。
【０１６３】
上記で示したように、ペプチドＳＴ４ＳＡは様々な細菌の成長を阻害する。ペプチドＳＴ４ＳＡの最大産生（５１２００ＡＵ／ｍｌ）がＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）における２０時間の成長の後で記録され、これが発酵期間中を通して維持された。
【０１６４】
ＳＴ４ＳＡ株を１８時間培養した培養物がＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）及びろ過されたＭＲＳブロスにそれぞれ接種された（２％（ｖ／ｖ）、ＯＤ６００ｎｍ＝２．０）。ＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）を、細孔サイズが６０００Ｄａ〜８０００Ｄａのニトセルロースメンブレンを備えるＭｉｎｉｔａｎ（商標）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）でろ過した。８０００Ｄａよりも小さいタンパク質を含有するＭＲＳろ液（ＭＲＳｆ）を、その後、オートクレーブ処理し、前で記載したように接種した。ＭＲＳブロス及びＭＲＳｆにおけるインキュベーションは、撹拌を伴うことなく、３０℃及び３７℃で２９時間であった。ペプチドＳＴ４ＳＡの活性を２時間毎に求めた。
【０１６５】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡの精製〕
１リットルのＭＲＳｆにエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡを接種し（ＯＤ６００ｎｍ＝１．８）、これを３０℃で２４時間インキュベーションした。細胞を遠心分離（８０００×ｇ、４℃、１５分）によって集め、無細胞上清を８０℃で１０分間インキュベーションした。硫酸アンモニウムを４℃で無細胞上清に静かに加えて６０％の飽和レベルにした。４時間ゆっくり撹拌した後、沈殿物を遠心分離（２００００×ｇ、１時間、４℃）によって集めた。ペレットを１／１０体積の２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）に再懸濁し、１．０ｋＤａカットオフのＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国）を使用して無菌のＭｉｌｌｉＱ水に対して脱塩した。さらなる分離を、本明細書中、前で記載したように、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）による１ｍｌのＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるカチオン交換クロマトグラフィーによって行った。
【０１６６】
それぞれの精製段階の後で得られたペプチドＳＴ４ＳＡの活性レベルが表１９に示される。
【０１６７】
【表１９】
【０１６８】
ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒから集められた活性なフラクションはＳＴ４ＳＡピークに対応し、４２アミノ酸のペプチド（ペプチドＳＴ４ＳＡの予想サイズ）をもたらした。
【０１６９】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡの等電点フォーカシング〕
ペプチドＳＴ４ＳＡの等電点フォーカシングを、Ｒｏｔｏｆｏｒ（登録商標）エレクトロフォーカシングセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用することによって行った。ＭＲＳｆで培養されたＳＴ４ＳＡ株から得られ、前で記載したように調製された１リットルの無細胞上清を凍結乾燥し、製造者の説明書に従ってアンホライト（ｐＨ範囲：３〜１０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とともに５０ｍｌの無菌の蒸留水に再懸濁した。１２Ｗの定電流を８℃で５時間加えた。分離後、集められたフラクションのそれぞれからの小体積を３ＮのＮａＯＨ又は３ＮのＨＣｌによりｐＨ７．０に調節し、ラクトバチルス・カセイＬＨＳに対する抗菌活性について試験した。陽性と試験されたフラクションをプールし、５０ｍｌの総体積に脱イオン水で再懸濁し、エレクトロフォーカシングに再び供し、フラクションを集め、抗菌活性について試験した。サンプルを−２０℃で保存した。
【０１７０】
培養培地の費用削減は培地最適化の重要な部分となる。培地費用は、工業用培地を炭素源及び／又は窒素源として使用することによって下げることができる。コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、チーズホエー粉末（ＣＷｐ）及び廃糖蜜が通常、成長培地の一部として使用される。ＣＳＬは、トウモロコシの製粉時に形成される副産物である。ＣＳＬは主として窒素源であり、しかし、糖（主にスクロース）、ビタミン及びミネラルもまた含有する。チーズホエー（乳業における副産物）は乳酸（ＬＡ）製造のための最も一般的な発酵培地であり、ラクトース、タンパク質及び塩を主に含有する。廃糖蜜は、主としてスクロースを含有する副産物であり、微量の他のミネラルを含む。
【０１７１】
〔培養及び培地〕
ＳＴ４ＳＡ株をＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）で培養して、ＣＳＬ、ＣＷｐ及び廃糖蜜にそれぞれ接種した（２％ｖ／ｖ）。
【０１７２】
〔発酵〕
発酵を、１０ｍｌの培地を含有する試験管で行った。ｐＨを殺菌（１２１℃、１５分間）の前にＮａＯＨにより調節した。ＮａＯＨの濃度は培地の緩衝能に依存した。２４時間の培養物を接種（２％ｖ／ｖ）のために使用した。回分発酵を試験管において３０℃で１６時間行った（ｐＨ６．５〜７．０）。ｐＨは制御されなかった。光学濃度（ＯＤ）を６００ｎｍで測定した。
【０１７３】
１０ｇ．ｌ−１、２０ｇ．ｌ−１及び５０ｇ．ｌ−１での廃糖蜜及びＣＳＬを、ペプチドＳＴ４ＳＡ産生のための可能な培地として評価した（表２０）。廃糖蜜におけるｐＨが発酵期間中に低下した（従って、このことは細胞成長を示す）が、ペプチドＳＴ４ＳＡ活性が上清において記録されなかった。他方で、ＣＳＬは、２０ｇ．ｌ−１の最小濃度で、３２００ＡＵ．ｍｌ−１にまで達する活性を有する上清をもたらした。これらの結果から結論され得るように、窒素源（ＣＳＬ）が、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生を持続させるためには要求される。
【０１７４】
【表２０】
【０１７５】
追跡実験において、ＣＷｐを工業用培地のリストに加え、１０ｇＴＳ．ｌ−１、２０ｇＴＳ．ｌ−１及び５０ｇＴＳ．ｌ−１で発酵させた（表２０）。１６００ＡＵ．ｍｌ−１にまで達するペプチドＳＴ４ＳＡ活性がＣＷｐにおいて記録された（表２０）。
【０１７６】
成分としてのＣＳＬ及びＣＷｐに関する全要因設計（ＦＦＤ）を使用して、どの培地がペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する最も著しい影響を有したかを明らかにした（表２１）。ＦＦＤはまた、何らかの相互作用が栄養物の間に存在したかどうかに関する目安を与える。
【０１７７】
【表２１】
【０１７８】
糖の利用を、下記の方法を使用することによって明らかにした。
【０１７９】
〔全糖についてのフェノール硫酸アッセイ〕
フェノール（５％（ｖ／ｖ）溶液の５００μｌ）及び濃硫酸（２．５ｍｌ）を試験管における５００μｌの希釈サンプルに加えた。溶液を十分に撹拌混合し、吸光度の読み取りを４９０ｎｍで行った（室温）。糖濃度（ｇグルコース．ｌ−１）を、標準曲線グラフを使用して計算した。
【０１８０】
〔モノマー糖のＤｉｏｎｅｘ測定〕
ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１００カラムを備えるＤｉｏｎｅｘ ＤＸ５００分析装置を使用して、サンプルをモノマー糖について分析した。使用された溶出液は、１ｍｌ．ｍｉｎ−１の流速において、２５０ｍＭ ＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ及び１Ｍ ＮａＯＡｃであった。Ｄｉｏｎｅｘはオートサンプラーを備え、注入体積は１０μｌであった。
【０１８１】
全糖濃度を５ｇＴＳ．ｌ−１及び１０ｇＴＳ．ｌ−１（これらは「−１」及び「１」によってそれぞれ表される）の間で変化させた。結果（２連（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で行われた実験）は、ＣＳＬ及びＣＷｐの濃度はペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する影響を何ら有しなかったことを示唆した（表２１）。５ｇＴＳ．ｌ−１及び１０ｇＴＳ．ｌ−１でのＣＳＬは、ＣＳＬ及びＣＷｐの組合せで記録されたペプチドＳＴ４ＳＡ活性と類似するペプチドＳＴ４ＳＡ活性をもたらし（表２１）、５０ｇ．ｌ−１のＣＳＬにより記録されたよりも４倍高いペプチドＳＴ４ＳＡ活性をもたらした（表２０）。これらの結果から明白であるように、ＣＳＬはペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する最も著しい影響を有していた。
【０１８２】
〔ＣＳＬの最適化〕
１２８００ＡＵｍｌ−１にまで達するペプチドＳＴ４ＳＡ活性が、１０ｇＴＳ．ｌ−１の濃度で、純粋なＣＳＬにおいて記録された。しかしながら、ＭＲＳにおいて記録されたペプチドＳＴ４ＳＡ活性（５１２００ＡＵ．ｍｌ−１）と比較したとき、これは低かった。予備実験において、ＭＲＳ成分（グルコースを除く）を１０ｇＴＳ．ｌ−１及び４０ｇＴＳ．ｌ−１のＣＳＬ及びＣＷｐにそれぞれ加えた（表２２）。活性における２倍の増大が、純粋なＣＳＬと比較したとき、補充物を有する１０ｇＴＳ．ｌ−１のＣＳＬについて認められた。対照的に、補充物を有する４０ｇＴＳ．ｌ−１でのＣＳＬは低い活性をもたらした。高濃度のＣＳＬは成長を阻害し（ｐＨにおける小さい低下）、その後に、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生もまた阻害した。これはＣＳＬにおける阻害性成分のためであり得る。同じ実験をＣＷｐに関して行った（表２２）。ＣＷｐ濃度を（１０ｇＴＳ．ｌ−１から４０ｇＴＳ．ｌ−１に）増大させた場合、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する影響は何ら記録されなかった。
【０１８３】
【表２２】
【０１８４】
１０ｇＴＳ．ｌ−１において、ＣＳＬは、ＣＷｐと比較したとき、２倍の活性でペプチドＳＴ４ＳＡを産生した（２５６００ＡＵ．ｍｌ−１）。従って、ＣＳＬをさらなる実験のための培地として選んだ。
【０１８５】
ＭＲＳ成分のすべてが、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生を改善することにおいて役割を果たしたわけではないので、スクリーニング実験を行って、有意な成分を特定した。このスクリーニング実験は２１０−５の一部実施要因設計（ＦｒＦＤ）により行われた。この設計は、通常の１０２４回の実験の代わりに、ほんの３２回の実験で１０の要因を試験することを可能にした（表２３及び表２４）。何らかの相互作用が成分の間で存在したかを明らかにすることもまた可能であった。結果をＡＮＯＶＡにより分析した（表２５）。
【０１８６】
【表２３】
【０１８７】
〔コード化された値に関する線形モデル〕
活性＝−１４３１．２＊Ｂ＋９５６．２＊Ｃ＋３８３１．２＊Ｄ−２７８１．３＊Ｅ−２２４３．８＊Ｇ−２００６．２＊Ｋ＋７６６８．８［式２］
Ｒ２＝０．７３
【０１８８】
ペプチドＳＴ４ＳＡの産生が、線形モデルを使用して表された。この線形モデルは活性を正確に予測することができない（Ｒ２＝０．７３）が、それでも、成分の影響（正又は負）を評価するために使用することができる。牛肉抽出物（Ｂ）、リン酸カリウム（Ｅ）、クエン酸三アンモニウム（Ｇ）及び酢酸ナトリウム（Ｋ）は、応答変数における低下を引き起こす、線形モデル（式２）における負の係数を有した。このことは、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対するそれらの負の影響を反映した。このことは、酵母抽出物（ＹＥ）（Ｃ）及びＣＳＬ（Ｄ）のみがペプチドＳＴ４ＳＡの産生を増大させたことを意味した。
【０１８９】
【表２４】
【０１９０】
【表２５】
【０１９１】
ＣＳＬ及びＹＥの濃度を２２ＦＦＤにより設定した（表２６）。ペプチドＳＴ４ＳＡの活性を求めるために使用された臨界希釈法は正確な結果を与えなかった。このことは、ＣＳＬ及びＹＥの濃度を活性に関連づけるモデルを近似することを不可能にした。実験結果を使用して、成分濃度を決定した。表２６から、ＣＳＬ及びＹＥの低濃度又は高濃度を使用すると、明瞭な影響がなかったことが理解され得る。平均値を、７．５ｇＴＳ．ｌ−１のＣＳＬ及び６．５ｇ．ｌ−１のＹＥの組成に関して、最良であるとして選択した。
【０１９２】
【表２６】
【０１９３】
最適な培地による成長曲線が図３０に示される。ＣＳＬ系培地及びＭＲＳは類似した成長速度論をもたらした。
【０１９４】
〔バッチ間の変動〕
ＣＳＬは老廃物であるので、ＣＳＬの組成が日毎に変化し得る。組成における差は、結果に著しい影響を及ぼす可能性がある。このことを、同じ実験をＣＳＬの第２のバッチで行うことによって調べた。今回のＡＮＯＶＡ分析では、ＹＥ、ＣＳＬ、Ｔｗｅｅｎ８０、ＭｎＳＯ４及び酢酸ナトリウムが、バクテリオシンの産生に対する最も著しい影響を有する成分として特定された（Ｐ＜０．１）。継続した最適化により、ＭｎＳＯ４は重要でなく、一方、酢酸ナトリウムは活性における低下を引き起こしたことが示された。
【０１９５】
最終的な培地は下記の３つの成分からなっていた。ＹＥ（Ｃ）、ＣＳＬ（Ｄ）及びＴｗｅｅｎ８０（Ｆ）。酵母抽出物が、またしても、有意な成分の１つであったことを見出すことは驚くべきことではなかった。Ｔｗｅｅｎ８０は乳化特性を有する。最終濃度は、２３ＦＦＤ設計で設定されるとき、ＹＥが７．５ｇ．ｌ−１であり、ＣＳＬが１０ｇ．ｌ−１であり、Ｔｗｅｅｎ８０が２ｇ．ｌ−１であった。
【０１９６】
〔成長制限〕
ＣＳＬ培地の糖含有量を発酵の前後で測定した。発酵開始時において、ＣＳＬは７．５ｇＴＳ．ｌ−１の濃度にされた。存在する主なモノマー糖はグルコース及びフルクトースであり、総濃度が３．８８３ｇ．ｌ−１であった。従って、全糖の約５１．８％のみが発酵可能な形態であり、すべての糖が発酵期間中に代謝されるわけではなかった。発酵終了時（一定のＯＤ）において、ｐＨが４．６であり、残っている残存糖が８．８％であった。成長制限は、低いｐＨのためであって、窒素、ミネラル、ビタミン又は任意の他の栄養分の不足のためではなかった。表２７は発酵期間中の炭素の取り込みを示す。
【０１９７】
【表２７】
【０１９８】
従って、ＹＥが補充されたＣＳＬは、市販のＭＲＳブロスで得られる高いペプチドＳＴ４ＳＡレベルに匹敵し得ることが明白である。好都合なことに、このことは、培養培地に関連する費用を著しく削減するという可能性を有する。ＣＳＬをペプチドＳＴ４ＳＡの工業的製造のための成長培地として選択した。
【０１９９】
〔プロバイオティクスへのエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡの開発〕
プロバイオティクス菌株を選択するための１つの重要な基準が、上皮細胞への接着である。プロバイオティクス細菌はまた、接着部位について病原性細菌と競合し得る。Ｃａｃｏ−２細胞（これはヒト結腸腺癌に由来する）をインビトロモデルとして使用して、上皮細胞に対するＥ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡの接着能及び競合的排除能を調べた。
【０２００】
結果が、接種物に対して比較される接着百分率として表される。Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ及びＬ．モノサイトゲネス ＳｃｏｔｔＡは接着することができ、ともに、Ｃａｃｏ−２細胞に対する５％の接着を示した。Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡの接着は、インキュベーション時間がほんの１時間であったとき、１％に低下した。食物は小腸に２時間留まり、従って、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４が上皮細胞に接着するための十分な時間を可能にする。しかしながら、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡは、この菌株が、病原体とのインキュベーションの前に、又は病原体とのインキュベーションの期間中に、又は病原体とのインキュベーションの後で加えられたかどうかにかかわらず、Ｌ．モノサイトゲネス ＳｃｏｔｔＡの接着に対する影響を有しなかった。排除及び追い出し試験において、Ｌ．モノサイトゲネス ＳｃｏｔｔＡは５％の接着を示した。競合試験では、パーセント接着がコントロールの場合と同じに留まったので、接着についての競合が何ら示されなかった。このことは、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ及びＬ．モノサイトゲネス ＳｃｏｔｔＡが上皮細胞上の異なる受容体に結合するかもしれないことによって説明することができる。従って、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ及びＬ．モノサイトゲネス ＳｃｏｔｔＡは、類似する受容体について競合しない。
【０２０１】
〔抗生物質及び抗炎症性薬物に対するＥ．ムンドティ ＳＴ４の抵抗性〕
Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡは、２つの抗生物質（Ｃｅｆａｓｙｎ及びＵｔｉｎ）及び炎症性医薬品（Ｒｈｅｕｇｅｓｉｃ、Ｃｏｘｆｌａｍ及びＰｙｎｍｅｄ）に対する抵抗性を示した。結果が表２８に示される。Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡに対する最大の成長阻害を有する抗生物質が、Ｐｒｏｍｏｘｉｌ、Ｃｉｐａｄｕｒ、Ｒｏｘｉｂｉｄｄ及びＤｏｘｉｍａｌである。
【０２０２】
Ｐｒｏｍｏｘｉｌ、Ｄｏｘｉｍａｌ、Ｃｅｆａｓｙｎ及びＵｔｉｎは、コントロールと比較したとき、Ｃａｃｏ−２細胞へのＳＴ４ＳＡ細胞の接着に対する影響を有しなかった。接着が、表２９において同様に認められ得るように、Ｃｉｐａｄｕｒ、Ｒｏｘｉｂｕｄｄ及びＩｂｕｇｅｓｔｉｃシロップの存在下では１０％低下し、より高濃度のＣｅｆａｓｙｎにより１４％低下した。
【０２０３】
【表２８】
【０２０４】
【表２９】
【０２０５】
〔経口投与されたＥ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ細胞の安全性、毒性、細菌転位及び生存、免疫調節能及び効力のインビボ評価−Ｌａｃｔｏｖｉｔａとの比較〕
〔動物〕
体重が１５０ｇ〜１８０ｇの間にある３６匹の雄性のＷｉｓｔａｒラットを、制御された大気（温度、２０℃±３℃）において、１２時間の明暗サイクルとともにプラスチックケージに６匹ずつの群で収容した。動物には、標準餌が自由に与えられた。
【０２０６】
＜細菌菌株及びプロバイオティクス菌＞
Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ株をＭＲＳブロスにおいて３０℃で１８時間培養した。光学濃度を６００ｎｍにおいて１．８に調節した。細胞を遠心分離によって集め、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄された細胞を１００ｍＭスクロースに再懸濁し、−８０℃で凍結し、一晩凍結乾燥した。ｃｆｕ／ｍｌ値を、所与量の細胞を１ｍｌのリン酸塩緩衝液に懸濁し、希釈物をＭＲＳ固体培地に展開置床することによって求めた。凍結乾燥された細胞を無菌スキムミルク（１０％）に再懸濁し、２×１０８ｃｆｕのＳＴ４ＳＡ株を胃内胃管栄養法により投与した。
【０２０７】
Ｌａｃｔｏｖｉｔａカプセルの中味を取り出してバイアルに入れ、無菌スキムミルク（１０％）に再懸濁し、２×１０８ｃｆｕを胃内胃管栄養法により投与した。
【０２０８】
リステリア・モノサイトゲネスＳｃｏｔｔＡをＢＨＩブロスにおいて３７℃で１８時間培養した。細胞を遠心分離によって集め、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄された細胞を１００ｍＭスクロースに再懸濁し、−８０℃で凍結し、一晩凍結乾燥した。ｃｆｕ／バイアルの数字を、上記で記載したように求めた。凍結乾燥された細胞を無菌スキムミルク（１０％）に再懸濁し、１０４ｃｆｕを胃内胃管栄養法により投与した。
【０２０９】
〔実験設計〕
７日間連続して、２つ動物群がＳＴ４株を胃内胃管栄養法により受け、２つの群がＬａｃｔｏｖｉｔａを受け、残る２つのコントロール群が水を受けた。８日目に、両方のコントロール群はリステリア・モノサイトゲネスに胃内胃管栄養法により感染させられ、ＳＴ４ＳＡ株群からの１つの群及びＬａｃｔｏｖｉｔａ群からの１つの群もそれぞれまた、Ｌ．モノサイトゲネスに感染させられた。このとき、動物はまた、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ株、Ｌａｃｔｏｖｉｔａ又は水を受けた。プロバイオティクス又は水が９日目及び１０日目に再び投与された。コントロール群が症状を示し始めたとき、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ株がコントロール群の一方に胃内胃管栄養法により投与された。その後、この群を症状の緩和についてモニターした。
【０２１０】
動物をリステリア症の症状について毎日２回モニターした。動物を（Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ株をそのときに受けているコントロール群を除いて）１１日目に屠殺した。血液を右心室からサンプリングした。総血球数が病理学者の研究室によって求められ、血液のサンプルをＢＨＩ固体培地及びリステリア選択的寒天基剤に接種し、ｃｆｕ／ｍｌを求めた。血漿を集め、エンドトキシンレベル、並びにサイトカイン（ＩＬ−６及びＩＦＮ−α）レベルを求めた。肝臓、脾臓、及び胃腸管の様々な区画を切除し、ホルムアルデヒドで固定し、その後、パラフィン包埋した。
【０２１１】
様々な区画を組織化学的分析のために溶血素及びエオシンにより染色した。溶血素及びエオシンによる分析では、ＳＴ４ＳＡ株の経口投与は、肝臓、脾臓又はＧＩＴに対する構造的損傷を何らもたらさないことが示された（図３１を参照のこと）。違いが、ＳＴ４ＳＡ株が投与されていた動物と、非補充の水のみを受けている動物との間において何ら認められなかった。
【０２１２】
本明細書中に記載のように、ダイズ抽出物から単離されたエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株は、多くの病原性生物（例えば、ヒトの中耳感染症及びヒトの腸から単離された病原性生物など）に対して活性である有用な抗菌性ペプチド（ペプチドＳＴ４ＳＡ）を産生することが本出願人によって見出されている。好都合なことに、ペプチドＳＴ４ＳＡは細胞毒性を有しない。エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株は、本出願人によって、糖発酵反応、多くの生化学的試験、２つのプラスミド（ｐＳＴ４ＳＡ１及びｐＳＴ４ＳＡ２）の存在、並びに腸上皮細胞及び粘膜への接着をコードする特異な遺伝子（ＡｄｈＳＴ４ＳＡ）によりＥ．ムンドティの他の菌株とは区別されている。ペプチドＳＴ４ＳＡが精製及び配列決定されており、ペプチドＳＴ４ＳＡは２つの大きな疎水性領域を含有する。本出願人は、ペプチドＳＴ４ＳＡをコードする核酸配列、並びに免疫性をそれ自身のペプチドの産生細胞に与えるように働く、細胞膜を横断するペプチドＳＴ４ＳＡの輸送をコードする核酸配列を単離し、配列決定している。この菌株からのそのプラスミドのキュアリング処理は抗菌活性の喪失を引き起こさなかったので、後者の遺伝子のすべてがゲノムに存在する。さらには、エンテロコッカス・フェカリスの菌株へのプラスミドの形質転換は受容菌をペプチドＳＴ４ＳＡの産生菌に変換しなかった。このことは、そのような遺伝子がプラスミドに存在しないというさらなる証拠である。ペプチドをタンパク質分解酵素で処理した後の抗菌活性の喪失により、この活性がペプチド構造に起因し、分子に連結される脂質又は炭水化物に起因しないことが確認された。驚くべきことに、このペプチドは、ｐＨ２．０〜ｐＨ１２．０の間での緩衝液における３０分のインキュベーションの後、及び１００℃で９０分の後で、活性を有したままであった。より一層驚くべきことに、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００による処理は、抗菌活性の喪失をもたらさなかった。ＳＴ４ＳＡ株は、低いｐＨ条件（ｐＨ２．５）をも生存し、６．５％のＮａＣｌの存在下、ｐＨ４．０からｐＨ９．６まで調節された培地で成長し、また、１．０％（ｗ／ｖ）胆汁酸塩及び膵液に対して抵抗性である。ＳＴ４ＳＡ株の成長が、（ゆっくりではあるが）１０℃で、また、４５℃でも生じ、最適な成長が３７℃においてである。Ｌ（＋）−乳酸のみがグルコースから産生される。これらの菌株特徴、ペプチドＳＴ４ＳＡの迅速及び安定した産生（菌株が環境ストレスに曝されるときでさえも）、ペプチドが細胞非毒性であるという事実、並びにペプチドがＧＲＡＳ（一般に安全であると見なされる）状態の生物によって産生されるという事実は、この菌株を有用なプロバイオティクスにする。
【０２１３】
本発明のペプチドはまた、（例えば、中耳感染症のための）局所治療剤としての液剤における抗菌剤として使用することができる。この液剤は、点耳剤アプリケーターを使用して耳に適用することができる。液剤はまた、食事への液体補助物として使用される液体形態のエンテロコッカス・ムンドティのプロバイオティクスに含まれる。本発明のペプチドはさらに、（例えば、副鼻腔感染症又は副鼻腔炎を治療するための）鼻腔スプレーにおいて、液体形態又は吸引形態のいずれかで、抗菌剤として使用することができる。本発明のペプチドはまた、ポリマー中に封入された抗菌剤として使用される。このポリマーは、その後、感染症（例えば、皮膚感染症など）の局所治療用の製剤において使用され、或いは、インプラント（例えば、イヤーグロメットなど）に組み入れるために、又は創傷被覆材に組み入れるために使用することができる。ポリマーへの抗菌性ペプチドのカプセル化は抗菌性ペプチドのゆっくりした放出及び微生物感染症の長期間の治療をもたらす。本発明のペプチドはまた、軟膏剤、ローション剤又はクリーム剤に組み入れられ、感染症を治療するために使用されることによって抗菌剤としての使用が見出される。本発明のペプチドはまた、液剤（例えば、コンタクトレンズ洗浄液など）に組み入れることによって抗菌剤として使用することができ、又はコンタクトレンズ自体に組み入れることができる。本発明のペプチドはまた、無菌性包装の製造において使用される包装材（例えば、プラスチックなど）に組み入れることによって抗菌剤として使用することができる。本発明のさらなる形態において、本発明のペプチドは、錠剤形態又はカプセル形態でエンテロコッカス・ムンドティの広域プロバイオティクスの一部として使用することができ、或いは、食用形態（例えば、菓子又はチューインガムなど）で使用することができる。
【０２１４】
【表３０−１】
【０２１５】
【表３０−２】
【０２１６】
【表３０−３】
【受託番号】
【０２１７】
ＰＴＡ−７２７８
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）の菌株から得られるペプチド、及びエンテロコッカス・ムンドティの菌株のプロバイオティクス組成物に関連する。より具体的には、本発明は、エンテロコッカス・ムンドティの菌株から得られるペプチド、このペプチドをコードする遺伝子、並びにこのペプチドを産生する菌株及びこのペプチド自体の様々な用途に関する。
【発明の背景】
【０００２】
乳酸菌は、胃腸の正常な微生物叢のバランスを維持することにおいて重要な役割を果たす。食餌、ストレス、微生物感染及び腸疾患は微生物のバランスを乱し、このことは、多くの場合、腸管における生存可能な乳酸菌（特に、ラクトバチルス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌）の数の低下を引き起こす。その場合、病原性細菌のその後の抑制されない増殖により、下痢及び他の臨床的障害（例えば、癌、炎症性疾患及び潰瘍性大腸炎など）が引き起こされる。
【０００３】
プロバイオティクス乳酸菌の重要な性質の１つが、上皮細胞又は腸粘膜への細胞の接着である。これには、上皮細胞表面の受容体分子と、細菌表面との間の強い相互作用が要求される。プロバイオティクス菌体の接着により、病原体の接着が妨げられ、また、免疫系が刺激される。後者は、粘膜と相互作用することによって達成され、そのような相互作用により、結果として、リンパ系細胞が感作される。プロバイオティクス菌体のもうひとつの重要な特徴が、低いｐＨ及び高量の胆汁酸塩での生存である。
【０００４】
ヒト及び動物の腸に関係するビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌及び腸球菌属細菌のある種の菌株は、様々なバクテリオシン（抗菌性ペプチド）を産生することが知られている。これらのペプチドの役割、及び腸管における病原性細菌の増殖を抑制することにおけるそれらの意味は不明である。しかしながら、グラム陰性細菌に対して活性であるバクテリオシンに関する近年の報告から結論されるように、これらのペプチド、及び腸内病原体とのそれらの相互作用が改めて注目され得る。後者のバクテリオシンの多くが、腸管に通常的に存在する乳酸菌によって、すなわち、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ）群、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・カセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ファーメンツム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ペントスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・パラカセイ亜種パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）によって産生される。
【０００５】
本発明は、腸のストレス状態（例えば、低いｐＨ、胆汁酸塩、塩、膵臓酵素）に耐え、広域抗菌性ペプチド（ペプチドＳＴ４ＳＡ）を産生するエンテロコッカス・ムンドティの菌株を記載する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の１つの態様によれば、
下記アミノ酸配列：
ＭＳＱＶＶＧＧＫＹＹＧＮＧＶＳＣＮＫＫＧＣＳＶＤＷＧＫＡＩＧＩＩＧＮＮＳＡＡＮＬＡＴＧＧＡＡＧＷＫＳ（配列番号１２）、
そのフラグメントであって、抗菌活性を有するフラグメント、
そのムテイン及び誘導体であって、抗菌活性を有するムテイン及び誘導体、
その共有結合架橋体であって、抗菌活性を有する共有結合架橋体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約９５％を超える相同性、好ましくは８５％を超える相同性、最も好ましくは約７５％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を有する、細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離されたペプチドが提供される。
【０００７】
本発明の別の態様によれば、細菌エンテロコッカス・ムンドティのペプチドＳＴ４ＳＡをコードする、単離されたヌクレオチド配列が提供される。
【０００８】
単離されたヌクレオチド配列は、
下記ヌクレオチド配列：
ＡＴＧＴＣＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＧＧＴＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＴＴＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＡＡＡＧＴ（配列番号１１）、
その相補体、
そのフラグメントであって、その発現後に、抗菌活性を有するペプチドを産生することができるフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことができる。
【０００９】
厳密なハイブリダイゼーション条件は、５０℃における、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄に相当する。
【００１０】
ヌクレオチド配列は、プラスミドの形態の発現ベクター又は移入ベクターなどのベクター中に含めることができる。ベクターは、抗生物質抵抗性などの選択属性をコードする核酸配列、又は他のマーカー遺伝子を含むことができる。従って、本発明は、微生物宿主細胞の形質転換に適した組換えプラスミドであって、本発明の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドベクターを含むプラスミドを包含する。
【００１１】
細胞は真核生物細胞又は原核生物細胞、例えば、細菌細胞又は酵母細胞であり得る。ヌクレオチド配列を細胞のゲノムに一過性又は構成的に組み入れることができる。従って、本発明は、本発明の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドベクターを含む組換えプラスミドを含む、形質転換された微生物細胞を包含する。
【００１２】
本発明のさらなる態様によれば、抗菌活性を有する細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離されたペプチドが提供される。
【００１３】
上記で特定される単離されたペプチドを産生する細菌エンテロコッカス・ムンドティはＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ−７２７８で寄託されている。上記で特定される単離されたペプチドを産生する、この特定の細菌エンテロコッカス・ムンドティ株はＳＴ４ＳＡ株と呼ばれている。従って、本発明は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ−７２７８で寄託されているエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株の実質的に純粋な培養物であって、資化可能な炭素源、窒素源及び無機物質を含有する栄養培地中で発酵すると、回収可能な量のペプチドＳＴ４ＳＡを産生することができる培養物を包含する。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明のペプチドを製造するための方法であって、エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株を、回収可能な量の上記ペプチドが産生されるまで、微好気条件下、１０〜４５℃の温度で、栄養培地中で培養するステップと、上記ペプチドを回収するステップと、を含む方法に関する。好ましくは、培養は、約３７℃の温度で行われる。
【００１５】
栄養培地は、コーンスティープリカー、チーズホエー粉末、ＭＲＳブロス、酵母抽出物及び廃糖蜜を含む群のいずれか１つ又は複数から選択することができる。好ましくは、栄養培地は、ｐＨ６〜６．５のＭＲＳブロスである。
【００１６】
本発明の単離されたペプチドは、例えば、中耳感染症などの耳感染症や、咽頭、眼又は皮膚の感染症のための局所治療剤としての液剤又はゲル剤において、抗菌剤として使用することができる。液剤はまた、食事への液体補助物として使用されるためのものであってもよい。本発明のペプチドはまた、例えば、副鼻腔感染症、副鼻腔炎、扁桃炎、咽頭感染症又は鼻炎を治療するためのスプレーにおいて、抗菌剤として使用することができる。本発明のペプチドはまた、凍結乾燥粉末の形態であってもよい。
【００１７】
本発明の単離されたペプチドはまた、ポリマー中に封入して、抗菌剤として使用することができる。本発明は、別の態様において、ペプチドＳＴ４ＳＡの抗菌有効量が組み入れられたポリマーを包含する。このポリマーは、その後、皮膚感染症などの感染症の局所治療用の製剤で使用することができ、或いは、インプラント又は医療デバイス、例えば、イヤーグロメット、カテーテル、オストミーチューブ、オストミーポーチ、ステント、縫合材、女性用衛生用品などの衛生用品、コンタクトレンズ、コンタクトレンズ洗浄液に組み入れるために、又は創傷被覆材に組み入れるために使用することができる。ポリマー中への抗菌性ペプチドの封入は、抗菌性ペプチドのゆっくりした放出及び微生物感染症の長期間の治療をもたらす。
【００１８】
本発明の単離されたペプチドは、１０００００〜３０００００ＡＵ（任意単位）／ｍｌポリマーの濃度で、好ましくは約２０００００ＡＵ／ｍｌポリマーの濃度で含まれ得る。
【００１９】
本発明のペプチドはさらに、軟膏剤、ローション剤又はクリーム剤に組み入れることによって抗菌剤として使用することができる。これらの軟膏剤、ローション剤又はクリーム剤は、感染症を治療するために使用することができる。本発明のペプチドはまた、コンタクトレンズ洗浄液などの液剤に組み入れることによって抗菌剤として使用することができ、又はコンタクトレンズそのものに組み入れることができる。従って、本発明は、本発明の別の態様として、本発明の抗菌性ペプチドを含有する抗菌性の軟膏、ローション又はクリームを提供する。
【００２０】
本発明の別の形態において、本発明のペプチドは、無菌包装の製造において使用される包装材（例えば、プラスチック）に組み入れることによって抗菌剤として使用することができる。
【００２１】
本発明のさらなる形態において、本発明のペプチドは、錠剤形態又はカプセル形態の細菌エンテロコッカス・ムンドティの広域プロバイオティクスの一部として使用することができ、或いは、食用形態、例えば、菓子（ｓｗｅｅｔ）又はチューインガムなどの形態であってもよい。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株の治療有効濃度を含む生物学的に純粋な培養物を含むプロバイオティクス組成物が提供される。この菌株を、プロバイオティクス組成物１ｍｌ当たり生細胞約１０６〜１０９個、好ましくは約１０８個（ｃｆｕ）の濃度で含むことができる。
【００２３】
本発明の１つの形態において、本発明のプロバイオティクス組成物は、動物又はヒトにおいて病原性細菌を減少させるために使用することができる。
【００２４】
本発明の別の形態において、本発明のプロバイオティクス組成物は、動物又はヒトにおいて病原性ウイルスを減少させるために使用することができる。
【００２５】
本発明のプロバイオティクス組成物は、粉末、液体、ゲル、錠剤の形態であり得るか、又は食品に組み入れることができる。液体形態のプロバイオティクス組成物は、食事への液体補助物として使用することができる。本発明の菌株を、液体補助物１ｍｌ当たり生細胞約１０６〜１０９個、好ましくは約１０８個（ｃｆｕ）の濃度で含むことができる。
【００２６】
本発明のプロバイオティクス組成物は、１０３〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度、好ましくは１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度、最も好ましくは約３×１０５の最終濃度で動物又はヒトに投与することができる。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、
動物又はヒトにおける細菌感染状態を治療する方法であって、動物又はヒトの感染領域を、
本発明のエンテロコッカス・ムンドティ株の薬学的有効量、及び
本発明の抗菌性ペプチドの薬学的有効量、
のいずれか１つ又は複数を含む群から選択される物質又は組成物に曝すステップを含む方法が提供される。
【００２８】
従って、本発明はまた、動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される医薬品の製造における、本発明のエンテロコッカス・ムンドティ株の治療有効量の使用を包含する。
【００２９】
この方法は、細菌種を、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌ、好ましくは約２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度の本発明の抗菌性ペプチドに曝すステップを含むことができる。
【００３０】
本発明はまた、動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される医薬品の製造における、本発明の抗菌性ペプチドの治療有効量の使用を包含する。
【００３１】
本発明はさらに、動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される物質又は組成物であって、本発明のエンテロコッカス・ムンドティ株を含み、上記方法が、そのような物質又は組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む、物質又は組成物を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される物質又は組成物であって、本発明の抗菌性ペプチドを含み、上記方法が、そのような物質又は組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む、物質又は組成物を提供する。
【００３３】
細菌感染症は、アシネトバクター・バウマニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・チロブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・カプリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス（エンテロコッカス）・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ） ｆａｅｃａｌｉｓ）又は肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、のいずれか１つ又は複数によって引き起こされる感染症であり得る。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、細菌種の成長を阻害する方法であって、細菌種を本発明の抗菌性ペプチドの有効量に曝すことを含む方法が提供される。細菌種は、アシネトバクター・バウマニイ、バチルス・セレウス、クロストリジウム・チロブチリクム、エンテロバクター・クロアカエ、大腸菌、肺炎桿菌、リステリア・イノクア、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・カルノサス、ストレプトコッカス・カプリヌス、糞便連鎖球菌及び肺炎連鎖球菌を含む群から選択され得る。
【００３５】
この方法は、細菌種を、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌ、好ましくは約２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度の本発明の抗菌性ペプチドに曝すステップを含むことができる。
【００３６】
本発明の１つの態様によれば、
細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離されたトランスポーターペプチドであって、
配列番号１４のアミノ酸配列、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約９０％を超える相同性、好ましくは８０％を超える相同性、最も好ましくは約７０％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を有するペプチドが提供される。
【００３７】
本発明の別の態様によれば、細菌エンテロコッカス・ムンドティのＳＴ４ＳＡトランスポーターペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列が提供される。単離されたヌクレオチド配列は、
配列番号１３のヌクレオチド配列、
その相補体、
そのフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことができる。
【００３８】
本発明の１つの態様によれば、
細菌エンテロコッカス・ムンドティ由来の単離された免疫ペプチドであって、
配列番号１６のアミノ酸配列、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約９０％を超える相同性、好ましくは８０％を超える相同性、最も好ましくは約７０％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を有するペプチドが提供される。
【００３９】
本発明の別の態様によれば、細菌エンテロコッカス・ムンドティのＳＴ４ＳＡ免疫／接着ペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列が提供される。単離されたヌクレオチド配列は、
配列番号１５のヌクレオチド配列、
その相補体、
そのフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことができる。
【００４０】
本発明は、別の態様において、配列番号１〜配列番号１０からなる群から選択されるプライマーを包含する。従って、本発明はまた、下記の群：
配列番号１及び配列番号２を含むプライマー対、
配列番号３及び配列番号４を含むプライマー対、
配列番号５及び配列番号６を含むプライマー対、
配列番号７及び配列番号８を含むプライマー対、並びに
配列番号９及び配列番号１０を含むプライマー対、
から選択されるプライマー対を包含する。
【００４１】
本発明はまた、エンテロコッカス・ムンドティの同定における、配列番号１及び配列番号２のプライマー対の使用を包含する。
【００４２】
本発明をよりよく理解するために、また、本発明がどのように実施され得るかを示すために、添付の図面及び表（これらは一例にすぎない。）を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡観察）によって観察されたときのエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株の細胞形態の画像である。
【図２】図２は、属特異的プライマーを使用することによって得られるＰＣＲ産物（ＤＮＡフラグメント）を示すアガロースゲルの写真である。エンテロコッカス属に特異的な１１２ｋｂの属特異的ＤＮＡバンドが得られた。
【図３】図３は、種特異的プライマーを使用することによって得られるＰＣＲ産物（ＤＮＡフラグメント）を示すアガロースゲルの写真である。エンテロコッカス・ムンドティに特異的な３０６ｂｂの種特異的ＤＮＡバンドが得られた。
【図４】図４は、ゲルろ過（ＡＫＴＡ−ｐｕｒｉｆｉｅｒ）によって分離されるペプチドＳＴ４ＳＡのグラフ表示である。
【図５】図５は、ペプチドＳＴ４ＳＡの位置を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡのプラスミドプロフィルを示すアガロースゲルの写真である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＳＴ４ＳＡ株の染色体（ゲノム）上の構造遺伝子の位置を示すサザンブロットである。
【図７】図７は、Ｅ．ムンドティのペプチドＳＴ４ＳＡのアミノ酸配列の概略図である。
【図８】図８は、ペプチドＳＴ４ＳＡの構造遺伝子のＤＮＡ配列（Ａ）、トランスポーター遺伝子のＤＮＡ配列（Ｂ）及び免疫遺伝子のＤＮＡ配列（Ｃ）である。
【図９Ａ】図９Ａは、ペプチドＳＴ４の産生に対する成長培地成分の影響を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ペプチドＳＴ４の産生に対する成長培地成分の影響を示す図である。
【図１０】図１０は、ＭＲＳブロスにおけるペプチドＳＴ４ＳＡの産生のグラフ表示である。
【図１１】図１１は、推定される接着遺伝子を含有し得るＤＮＡフラグメントを示すアガロースゲルの写真である。
【図１２】図１２は、異なる温度でのペプチドＳＴ４ＳＡ（無菌蒸留水に懸濁された粗抽出物）の安定性を示すグラフである。
【図１３】図１３は、寒天平板におけるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種に対して記録される阻害域の写真である。
【図１４】図１４は、ペプチドＳＴ４ＳＡ（４０９６００ＡＵ／ｍｌ）により処理された肺炎連鎖球菌の写真であり、細胞質の漏出が矢印によって示される。
【図１５】図１５は、肺炎連鎖球菌（病原体２７）の成長阻害を示すグラフである。
【図１６】図１６は、肺炎連鎖球菌（病原体２９）の成長阻害を示すグラフである。
【図１７】図１７は、肺炎桿菌（病原体３０）の成長阻害を示すグラフである。
【図１８】図１８は、中耳単離菌（病原体４０）の成長阻害を示すグラフである。
【図１９】図１９は、中耳単離菌（病原体ＢＷ）の成長阻害を示すグラフである。
【図２０】図２０は、中耳単離菌（病原体Ｅ）の成長阻害を示すグラフである。
【図２２】図２２は、中耳単離菌（病原体ＧＷ）の成長阻害を示すグラフである。
【図２３】図２３は、中耳単離菌（病原体ＨＷ）の成長阻害を示すグラフである。
【図２４】図２４は、リステリア・イノクアＬＭＧ１３５６８の存在下でのＳＴ４ＳＡ株の成長及びペプチドＳＴ４ＳＡの産生を示すグラフである。記号：黒色菱型＝Ｌ．イノクア ＬＭＧ１３５６８の存在下でのＳＴ４ＳＡ株の成長；黒色正方形＝Ｌ．イノクア ＬＭＧ１３５６８の成長阻害；黒色丸＝ｐＨにおける変化；黒色バー＝ペプチドＳＴ４ＳＡの産生。
【図２５】図２５は、プロバイオティクスＳＴ４ＳＡ株の評価のために開発された胃腸モデル（ＧＩＭ）の概略図である。
【図２６】図２６は、バンコマイシンによる脂質ＩＩ標的部位の阻止及びペプチドＳＴ４ＳＡの作用様式（抗菌活性）に対するその影響を示す概略図である。％漏出は、ＤＮＡ及びβ−ガラクトシダーゼ活性の増大したレベルによって記録されるときの細胞質漏出を示す。
【図２７】図２７は、アミノ酸９（システイン）及びアミノ酸１４（システイン）を共有結合により連結した、ペプチドに導入されたジスルフィド架橋の概略図である。
【図２８】図２８は、ＳＴ４ＳＡの疎水性プロットを示すグラフである。
【図２９】図２９は、ＳＴ４ＳＡによるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（モノサイトゲネス）攻撃の結果及びインビトロＧＩＴモデルにおける生存を示すグラフである。
【図３０】図３０は、ＭＲＳブロス及びＣＳＬ培地におけるＥ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡの成長曲線を示すグラフである。
【図３１】図３１は、（Ａ）コントロール結腸、（Ｂ）ＳＴ４ＳＡ株投与結腸、（Ｃ）コントロール回腸、（Ｄ）ＳＴ４ＳＡ株投与回腸、（Ｅ）コントロール肝臓、（Ｆ）ＳＴ４ＳＡ株投与肝臓、（Ｇ）コントロール脾臓、（Ｈ）ＳＴ４ＳＡ株投与脾臓の溶血素及びエオシン染色切片を６０Ｘの倍率で示す写真である。
【図３２】図３２は、ラットの各実験群の毎日の体重測定を表すグラフを示す。矢印はリステリア感染の時を示す。
【図３３】図３３は、ラットの餌摂取の毎日の測定を表すグラフを示す。
【図３４】図３４は、ラットの各実験群によって消費された水の毎日の測定を表すグラフを示す。
【図３５】図３５は、ＳＴ４株、４２３株及び水コントロールが投与されていたラットの各実験群の便水分含有量を表すグラフを示す。
【図３６】図３６は、ラットの各実験群から感染１日前及び感染２日後で集められた便サンプルにおけるリステリア数を示す。
【表の説明】
【００４４】
表１は、ＳＴ４ＳＡ株の表現型特徴（糖発酵反応）を示す。
表２は、ＳＴ４ＳＡ株の示差的特徴を示す。
表３は、ペプチドＳＴ４ＳＡに対する、酵素、温度、ｐＨ及び変性剤の影響を示す。
表４は、ペプチドＳＴ４ＳＡの活性スペクトルを示す。
表５は、ペーパーディスクにおけるペプチドＳＴ４ＳＡの活性を示す。
表６は、一般に使用される抗生物質とのペプチドＳＴ４ＳＡの活性の比較を示す。
表７は、病原体へのペプチドＳＴ４ＳＡの接着を示す。
表８は、病原体をペプチドＳＴ４ＳＡで処理した後に記録された細胞外ＤＮＡを示す。
表９は、病原体をペプチドＳＴ４ＳＡで処理した後に記録されたβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
表１０は、（コンピューター化された）ＧＩＭの操作を示す。
表１１は、ＧＩＭにおけるＳＴ４ＳＡ株の生存及びペプチドＳＴ４ＳＡの産生を示す。リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が標的生物（病原体）として使用された。値は３回の試験の平均値である。使用された栄養物は、それぞれ、ＮＡＮ Ｐｅｌａｒｇｏｎ（Ｎｅｓｔｌｅ）及びＭＲＳ（Ｄｅ Ｍａｎ Ｒｏｇｏｓａ培地、Ｂｉｏｌａｂ）であった。
表１２は、ＳＴ４ＳＡ株の抗生物質抵抗性を示す。
表１３は、異なる濃度のトリメトプリム−スルファメトキサゾール（ＴＭＰ−ＳＭＸ）及びメトロニダゾールの存在下におけるＳＴ４ＳＡ株の成長を示す。
表１４は、アッセイされた毒性因子を示す。
表１５は、平板計数によるＣａｃｏ−２細胞系へのＳＴ４ＳＡ株の接着を示す（コントロール）。
表１６は、ＳＴ４ＳＡ株及びＬ．モノサイトゲネスの競合的排除を示す。
表１７は、ＳＴ４ＳＡ株、Ｌａｃｔｏｖｉｔａ又は非補充の水が投与されたラットについての体重値を示す。
表１８は、（Ａ）１０７日のＬａｃｔｏｖｉｔａでの研究の期間中、及び（Ｂ）５０日のＳＴ４ＳＡ株での研究の期間中における雄性Ｗｉｓｔａｒラットの便サンプルにおけるβ−グルクロニダーゼ活性を示す。値は、２時間当たりの放出されたｍＭでのｐ−ニトロフェノールである。標準誤差値がかっこ内に示される。
表１９は、ＭＲＳｆ（ＭＲＳろ液）培地中のペプチドＳＴ４ＳＡの精製を示す。
表２０は、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生のための成長培地として試験された純粋なＣＳＬ、廃糖蜜及びＣＷｐについての結果を示す。
表２１は、どの培地がペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対して最も著しい影響が有ったかを明らかにするための成分としてのＣＳＬ及びＣＷｐに関する全要因設計（ＦＦＤ）を示す。
表２２は、ＳＴ４ＳＡ活性の最適化のためにＭＲＳ成分が補充されたＣＳＬの結果を示す。
表２３は、ＭＲＳ成分及びＣＳＬの高濃度及び低濃度を示す。
表２４は、２１０−５ＦｒＦＤ設計を示す。
表２５は、２１０−５ＦｒＦＤ設計についての分散分析表を示す。
表２６は、ＣＳＬ及びＹＥの濃度を決定するための３中心点による２２ＦＦＤを示す。
表２７は、発酵期間中の炭素取り込みを示す。
表２８は、抗菌剤及び抗炎症性薬物に対するＥ．ムンドティ ＳＴ４の抵抗性試験の結果を示す。
表２９は、Ｃａｃｏ−２細胞へのＳＴ４ＳＡの接着に対する抗菌剤及び抗炎症性医薬品の影響を示す。
【発明の詳細な説明】
【００４５】
本発明は、腸のストレス条件（例えば、低いｐＨ、胆汁酸塩、塩、膵臓酵素）に耐え、広域抗菌性ペプチド、すなわち、ペプチドＳＴ４ＳＡを産生する細菌エンテロコッカス・ムンドティの菌株を記載する。ペプチドＳＴ４ＳＡを産生するエンテロコッカス・ムンドティのこの菌株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されており、受託番号がＰＴＡ−７２７８である。活性が、非常に多数のグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して観察されており、これらのほとんどが中耳感染症及び腸から単離される。阻害される細菌の例は下記の通りである。アシネトバクター・バウマニイ、バチルス・セレウス、クロストリジウム・チロブチリクム、エンテロバクター・クロアカエ、大腸菌、肺炎桿菌、リステリア・イノクア、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・カルノサス、ストレプトコッカス・カプリヌス、糞便連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、並びに感染した中耳液サンプルから単離される未同定のグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の多くの臨床菌株。これは、広い活性スペクトルであり、具体的には、そのような様々なヒト病原体に対する広い活性スペクトルである。
【００４６】
グラム陰性細菌に対する活性を有する多くの広域抗菌性ペプチドが記載されている；例えば、ラクトバチルス・ペントススによって産生されるペントシン３５ｄ、ラクトバチルス・ペントススＳＴ１５１ＢＲによって産生されるバクテリオシンＳＴ１５１ＢＲ、ラクトバチルス・パラカセイ・サブエスピー・パラカセイによって産生されるバクテリオシン、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｒｍｏｐｈｙｌｕｓ）によって産生されるサーモフィリン（ｔｈｅｒｍｏｐｈｙｌｉｎ）、エンテロコッカス・フェカリスによって産生されるペプチドＡＳ−４８、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＫＣＡ２３８６によって産生されるバクテリオシン、及びエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）によって産生されるエンテロシンＣＲＬ３５。しかしながら、これらのペプチドの活性スペクトルは、上記で示されたペプチドＳＴ４ＳＡ感受性の種から理解され得るように、ペプチドＳＴ４ＳＡについて記録される活性スペクトルよりもはるかに狭い。広い活性スペクトル、特に、病原性細菌に対する広い活性スペクトルは、ペプチドＳＴ４ＳＡを、細菌感染症を抑制するために、特に、（このペプチドが非常に様々な中耳病原体に対して活性であるので）、中耳感染症を抑制するために理想的なものにし、同様にまた、二次的な創傷感染症に関与する病原体を抑制するために理想的なものにする（このペプチドはこれらの病原体の多くの成長を阻害する）。感染した中耳液から単離される病原体は、アシネトバクター・バウマニイ、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・カルノスス、肺炎連鎖球菌、並びに多くの未同定のグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌であった。
【００４７】
＜材料及び方法＞
〔ＳＴ４ＳＡ株の単離及び種レベルへの同定〕
無菌の蒸留水に４時間浸けたダイズから得られるダイズ抽出物を連続希釈し、真菌の成長を防止するために５０ｍｇ／ｌのナタマイシン（Ｄｅｌｖｏｃｉｄ（登録商標）、Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ，Ｂ．Ｖ．、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）が補充されたＭＲＳ寒天（Ｂｉｏｌａｂ、Ｂｉｏｌａｂ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｉｄｒａｎｄ、ＳＡ）に置床した。平板を３０℃及び３７℃で２日間インキュベーションした。
【００４８】
コロニーを、５０〜３００ｃｆｕ（コロニー形成単位）の平板から無作為に選択した。そして、Ｄｅｌｖｏｃｉｄ（登録商標）（５０ｍｇ／ｌ）が補充されたＭＲＳ寒天の第２の層でコロニーを覆うことによって、抗菌活性についてスクリーニングした。平板を、嫌気フラスコ（Ｏｘｏｉｄ、Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、英国）中、ガス発生キット（Ｏｘｏｉｄ）の存在下、３０℃及び３７℃で４８時間インキュベーションした。コロニーを、ラクトバチルス・カセイ、エンテロコッカス・フェカリス、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、肺炎桿菌、肺炎連鎖球菌及び黄色ブドウ球菌の１ｍｌの活発に成長している細胞（約１０６ｃｆｕ／ｍｌ）が補充された半固体（１．０％寒天、ｗ／ｖ）ＢＨＩ培地（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）の第３の層（約１０ｍｌ）によりそれぞれ覆った。平板を３７℃で２４時間インキュベーションした。
【００４９】
コロニーの１つが、試験パネルに含まれる多種類の病原体を阻害した（表４）。このコロニーをＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）に再接種し、その後、純粋な培養物を得るために再び画線培養した。単離菌はＳＴ４ＳＡ株と呼ばれた。抗菌活性が、寒天スポット試験方法を使用することによって確認された。
【００５０】
ＳＴ４ＳＡ株の細胞形態を走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）によって調べた（図１を参照のこと）。ＳＴ４ＳＡ株の初期指数期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．２）培養物の１０ｍｌを遠心分離によって集め、無菌の蒸留水により５回洗浄した（３０００×ｇ、１０分、４℃）。ペレットを５００μｌの無菌ＭｉｌｌｉＱ水（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁し、その後、顕微鏡観察に供した。
【００５１】
さらなる同定を生理学的特徴（表２）及び生化学的特徴によって達成した。色素形成をトリプシン消化ダイズブロス（Ｍｅｒｃｋ）で調べた。運動性についての試験もまた行った。糖発酵反応（表１）を、ＡＰＩ５０ＣＨＬ試験片及びＡＰＩ２０Ｓｔｒｅｐ試験片（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ−ｌ’Ｅｔｉｏｌｅ、フランス）を使用することによって記録し、腸球菌について列挙される反応と比較した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
【表２】
【００５４】
さらなる同定を、エンテロコッカス属に特異的なプライマーにより得られるＤＮＡバンドパターン（図２）、及びエンテロコッカス・ムンドティに特異的なプライマーにより得られるＤＮＡバンドパターン（図３）によって行った。５０ｂｐのＤＮＡフラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国）をマーカーとして使用した。３０６ｂｐのフラグメント（図３に示される）を生じさせるために使用されたプライマーを、１６ＳｒＤＮＡにおける好適に保存された領域から設計した。
配列番号１：フォワードプライマー：ＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ
配列番号２：リバースプライマー：ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ
【００５５】
ＤＮＡフラグメントの配列決定により、ＧｅｎＢａｎｋにおける保存された１６ＳｒＤＮＡフラグメントとの９８％の相同性が明らかにされた。
【００５６】
〔抗菌活性の発現〕
抗菌活性を無細胞上清１ｍｌ当たりの任意単位（ＡＵ）として表した。１ＡＵは、成長阻害の明瞭な領域を示す最大希釈の逆数として定義され、下記のように計算される。
ａｂ×１００
式中、「ａ」は希釈倍数を表し、「ｂ」は、直径が少なくとも２ｍｍである阻害域をもたらす最終希釈を表す。活性は、１００を乗じることによって１ｍｌ当たりで表される。ラクトバチルス・カセイＬＨＳを指示菌として使用した。
【００５７】
〔抗菌性物質の特徴づけ〕
ＳＴ４ＳＡ株をＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）において３０℃で２４時間及び４８時間培養した。細胞を集め（８０００×ｇ、４℃、１５分）、無細胞上清を６ＭのＮａＯＨによりｐＨ６．０に調節した。それぞれの上清の１ｍｌを、０．１ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）でのカタラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、並びに１ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）でのプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ、ＩＮ、米国）、プロナーゼ、パパイン、ペプシン及びトリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、ドイツ）によりそれぞれ処理した。インキュベーション後、酵素を熱不活化し（１００℃で３分）、前に記載したように抗菌活性について試験した。結果が表３に示される。
【００５８】
ペプチドＳＴ４ＳＡのアリコートを、３０℃、６０℃及び１００℃の熱処理に、１０分間、３０分間及び９０分間それぞれ曝し、また、１２１℃で２０分間曝した（表３）。その後、サンプルを、前に記載したように抗菌活性について試験した。
【００５９】
【表３】
【００６０】
別個の実験において、ペプチドＳＴ４ＳＡのサンプルを、２〜１２の範囲のｐＨ値に調節し、３７℃で３０分間インキュベーションし、ｐＨ７に中和し、その後、抗菌活性について試験した（表３）。
【００６１】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡの単離及び精製〕
ＳＴ４ＳＡ株の２４時間培養物をＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）に接種した（２％、ｖ／ｖ、ＯＤ６００ｎｍ＝８．０）。インキュベーションを、撹拌することなく、３７℃で２０時間行った。細胞を集め（８０００×ｇ、１０分、４℃）、ペプチドを８０％飽和の硫酸アンモニウムにより無細胞上清から沈殿させた。沈殿物を１／１０体積の２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）に再懸濁し、１０００Ｄａカットオフの透析メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国）を使用することによって蒸留水に対して脱塩し、ＳｅｐＰａｋ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、米国）にロードした。カラムを２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）中２０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールにより洗浄し、バクテリオシンを２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）中４０％のイソプロパノールにより溶出した。真空下で乾燥した後（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ；Ｓａｖａｎｔ）、フラクションをプールし、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した。活性のあるフラクションを、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に連結されたＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でのゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに分離した（図４）。カラムからのペプチドの溶出を５０ｍＭリン酸塩緩衝液及び４００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）により行った。ペプチドを２５４ｎｍ及び２８０ｎｍでそれぞれ検出した。活性のあるペプチドを含有するフラクションを集め、真空下で乾燥し、−２０℃で保存した。活性試験を、寒天スポット方法を使用することによって行った。
【００６２】
〔サイズ決定〕
ＳＴ４ＳＡ株をＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）において３０℃で２０時間成長させた。細胞を遠心分離（８０００×ｇ、１０分、４℃）によって集め、ペプチドＳＴ４ＳＡを８０％飽和の硫酸アンモニウムにより無細胞上清から沈殿させた。沈殿物を１／１０体積の２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）に再懸濁し、１０００Ｄａカットオフの透析メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国）を使用することによって蒸留水に対して脱塩し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した（図５Ａ）。２．３５ｋＤａから４６ｋＤａに及ぶサイズを有する低分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国）を使用した。活性なバクテリオシンの位置を明らかにするために、ゲルを固定し、一方の半分を、脳心臓浸出物（ＢＨＩ）寒天（Ｂｉｏｌａｂ）に埋め込まれたＬ．ｃａｓｅｉ ＬＨＳ（１０６ｃｆｕ／ｍｌ）により覆った（図５Ｂ）。
【００６３】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡに対する細胞毒性試験〕
ペプチドＳＴ４ＳＡが細胞毒性的性質を有するかどうかを明らかにするために、コンフルエントな単層のサル腎臓Ｖｅｒｏ細胞（１組３ウェル）を組織培養プレートで４８時間成長させ、その後、様々な濃度の抗菌性ペプチドに曝した。４８時間のインキュベーションの後、細胞の生存能を、細胞をテトラゾリウム塩ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−ガンマ−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］（Ｓｉｇｍａ）で処理することによって試験した。コハク酸デヒドロゲナーゼによるＭＴＴの切断の後で形成する青色生成物（ホルマザン）の生成を記録した。
【００６４】
５０％細胞毒性レベル（ＣＣ５０）を、細胞の生存能を５０％低下させるために要求されるペプチド濃度（μｇ／ｍｌ）として定義した。ＣＣ５０の結果（細胞毒性レベル）によれば、細胞毒性が何ら記録されなかった。すなわち、本発明のペプチドはゼロ（０）のＣＣ５０を有する。
【００６５】
〔プラスミド単離〕
総ＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡを単離し、その後、ＤＮＡをＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によってさらに精製した。ＤＮＡをアガロースゲルで分離した（図６）。ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたラムダＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）を分子量マーカーとして使用した。
【００６６】
〔プラスミドのキュアリング〕
キュアリング実験を行った。Ｅｎｔ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡの細胞をノボビオシン（１μｇｍｌ−１〜２５μｇｍｌ−１）の存在下において３７℃で７２時間インキュベーションした。最高濃度のノボビオシンにおいて成長した培養物を無菌の生理的食塩水により連続希釈し、ＭＲＳ寒天平板に置床した。３７℃での一晩のインキュベーションの後、コロニーをレプリカ置床し、元となった平板をエンテロコッカス・フェカリスＬＭＧ１３５６６の細胞により覆った。３７℃でさらに１６時間インキュベーションした後、コロニーを抗菌活性の喪失について調べた。
【００６７】
〔接合伝達実験〕
フィルターかけ合わせ実験を行った。Ｅｎｔ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ及びＥｎｔ．フェカリス ＦＡ２−２の一晩成長させた培養物（０．２５ｍｌ）を４．５ｍｌのＭＲＳに加え、混合し、０．４５μｍの細孔サイズの無菌メンブレンフィルター（ＨＡＷＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した。メンブレンをＭＲＳ寒天平板に置き、３７℃で一晩インキュベーションした。細胞をフィルターから１ｍｌのＭＲＳに洗い出し、連続希釈し、２５μｇｍｌ−１のフシジン酸、２５μｇｍｌ−１のリファンピシン及び２０００ＡＵｍｌ−１の粗ペプチドＳＴ４ＳＡを含有するＭＲＳ寒天平板に置床した。実験を、Ｅｎｔ．フェカリス ＯＧＸ１を受容菌として用いて繰り返した。この場合、選択を、１ｍｇｍｌ−１のストレプトマイシン及び２０００ＡＵｍｌ−１の粗ペプチドＳＴ４ＳＡを含有する平板で行った。コロニーを無作為に選択し、前に記載したように、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生について調べ、また、プラスミド含有量についてスクリーニングした。ｐＳＴ４ＳＡを含有した、Ｅｎｔ．フェカリス ＯＧＸ１の接合細胞のコロニーを培養し、無細胞上清を、前に記載したように活性試験に供した。
【００６８】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡをコードする遺伝子エレメントの検出及びＤＮＡ配列決定〕
総ＤＮＡを単離した。構造遺伝子、トランスポーター遺伝子及び免疫遺伝子（これらは下記に示される）をＰＣＲによって増幅するために使用されたＤＮＡプライマーを、他の抗菌性ペプチドについて発表された部分配列に基づいて設計した。配列決定をＡＢＩＰｒｉｓｍ（商標）３７７ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、米国）においてＡＢＩＰｒｉｓｍ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキットにより行った。データベース検索を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４、米国）のＢＬＡＳＴＮプログラム及びＢＬＡＳＴＸプログラムを使用することによって行った。
【００６９】
構造遺伝子プライマー：
配列番号３：ＳＧ−ａ：ＴＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡ（フォワード）
配列番号４：ＳＧ−ｂ：ＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡ（リバース）
【００７０】
ＡＢＣトランスポータープライマー：
配列番号５：ＡＢＣ１−ａ：ＴＧＡＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴ（フォワード）
配列番号６：ＡＳＣ１−ｂ：ＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＧＴＴＴＡＡＴＣＧ（リバース）
配列番号７：ＡＢＣ２−ａ：ＧＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＧＧＧＧＡＴＴＡＴ（フォワード）
配列番号８：ＡＢＣ２−ｂ：ＴＣＴＡＧＡＴＡＣＧＴＡＴＣＡＡＧＴＣＣ（リバース）
【００７１】
免疫プライマー：
配列番号９：Ｉｍｍｕｎ−ａ：ＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＣ（フォワード）
配列番号１０：Ｉｍｍｕｎ−ｂ：ＧＴＣＣＣＣＡＣＡＡＣＣＡＡＴＡＡＣＴＡ（リバース）
【００７２】
〔種々の成長培地及び種々の初期成長ｐＨ値におけるペプチドＳＴ４ＳＡの産生〕
ＳＴ４ＳＡ株の１８時間培養物を、ＭＲＳブロス、ＢＨＩブロス及びＭ１７ブロス（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）にそれぞれ接種した（２％、ｖ／ｖ）。インキュベーションを、撹拌することなく、２８時間、３０℃及び３７℃でそれぞれ行った。サンプルを１時間毎に採取し、細菌の成長（６００ｎｍでのＯＤ）、培養物ｐＨにおける変化、及びＬ．ｃａｓｅｉ ＬＨＳに対する抗菌活性（ＡＵ／ｍｌ）について調べた。寒天スポット試験方法を、前に記載したように使用した。
【００７３】
別個の実験において、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する初期培地ｐＨの影響を明らかにした。多数の３００ｍｌのＭＲＳブロスを、６ＭのＨＣｌ又は６ＭのＮａＯＨにより、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０及びｐＨ６．５にそれぞれ調節し、その後、オートクレーブ処理した（図９Ａ）。それぞれのフラスコにＳＴ４ＳＡ株の１８時間培養物を２％（ｖ／ｖ）接種し、フラスコを、撹拌することなく、３０℃で２０時間インキュベーションした。培養物ｐＨにおける変化及びペプチドＳＴ４ＳＡの産生（これはＡＵ／ｍｌとして表される）を、本明細書中、前で記載したように１時間毎に測定した。すべての実験を３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。
【００７４】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する培地組成の影響〕
ＳＴ４ＳＡ株を１０ｍｌのＭＲＳブロスにおいて３０℃で１８時間成長させ、細胞を遠心分離（８０００×ｇ、１０分、４℃）によって集め、ペレットを１０ｍｌの無菌のペプトン水に再懸濁した。この細胞懸濁物の４ｍｌを使用して、下記培地の２００ｍｌに接種した。（ａ）ＭＲＳブロス（Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ）で、有機栄養分を含まず、トリプトン（２０．０ｇ／ｌ）、肉抽出物（２０．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物（２０．０ｇ／ｌ）、トリプトン（１２．５ｇ／ｌ）＋肉抽出物（７．５ｇ／ｌ）、トリプトン（１２．５ｇ／ｌ）＋酵母抽出物（７．５ｇ／ｌ）、肉抽出物（１０．０ｇ／ｌ）＋酵母抽出物（１０．０ｇ／ｌ）、又はトリプトン（１０．０ｇ／ｌ）、肉抽出物（５．０ｇ／ｌ）及び酵母抽出物（５．０ｇ／ｌ）の組合せがそれぞれ補充されたもの；（ｂ）ＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）、すなわち、２０．０ｇ／ｌのグルコースを含むもの；（ｃ）ＭＲＳブロス（Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ）で、グルコースを含まず、２０．０ｇ／ｌのフルクトース、スクロース、ラクトース、マンノース及びマルトースがそれぞれ補充されたもの；（ｄ）ＭＲＳブロスで、０．１〜４０．０ｇ／ｌのフルクトースを唯一の炭素源として含むもの；（ｅ）ＭＲＳブロス（Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ）で、２．０〜５０．０ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４又は２．０〜５０．０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４を含むもの；及び（ｆ）ＭＲＳブロス（Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ）で、０〜５０．０ｇ／ｌのグリセロールが補充されたもの。別個の実験において、シアノコバラミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）、Ｌ−アスコルビン酸（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ、Ｐｏｏｌｅ、英国）、チアミン（Ｓｉｇｍａ）、ＤＬ−６，８−チオクト酸（Ｓｉｇｍａ）及びビタミンＫ１（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、ＣＨ−９４７１ Ｂｕｃｈｓ、スイス）の各ビタミンをフィルター滅菌し、ＭＲＳブロスに１．０ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）で加えた。すべての試験のためのインキュベーションは３０℃で２０時間であった。ペプチドＳＴ４ＳＡの活性レベルを、前に記載したように測定した。すべての実験を３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。
【００７５】
ＳＴ４ＳＡ株は、図１に示されるような形態、非運動性、色素形成の非存在、並びに属特異的プライマーによるＰＣＲ（図２）及び種特異的プライマーによるＰＣＲ（図３）に基づいて、エンテロコッカス属の菌株として同定された。種レベルへのさらなる同定を、表１に示されるような糖発酵パターン、及び上記の表２に示されるような生理学特徴によって行った。
【００７６】
ペプチドＳＴ４ＳＡは、表３において認められ得るように、タンパク質分解酵素（プロテイナーゼＫ、ペプシン、プロナーゼ、パパイン及びトリプシン）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４による処理によって、また、１２１℃で２０分の後で不活性化された。ペプチドは、１００℃での９０分間の処理の後で、また、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、尿素、ＥＤＴＡ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００により処理されたとき、活性を有したままであった（表３）。活性が、２．０から１２．０に及ぶｐＨ値でのインキュベーションの後で全く失われなかった（表３）。
【００７７】
ペプチドＳＴ４ＳＡは、表４に示されるように、非常に多数のグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌を阻害した。
【００７８】
【表４】
【００７９】
ペプチドＳＴ４ＳＡを、図４に示されるゲルろ過によって精製した。ペプチドＳＴ４ＳＡは、図４及び図５から認められるように、３４００Ｄａの範囲である。このペプチドは、本明細書中、前で記載したように、Ｖｅｒｏ細胞に対して試験されたとき、細胞毒性を有しなかった。
【００８０】
ＳＴ４ＳＡ株は、図６Ａに示されるように、２つのプラスミドを有する。この菌株からこれらのプラスミドをキュアリング処理すると、抗菌活性の喪失が生じなかった。構造遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを用いた、染色体及びプラスミドＤＮＡのプローブ探査では、染色体（ゲノム）との明瞭なハイブリダイゼーションが示された（図６Ｂ）。このことは、ペプチドＳＴ４ＳＡをコードする構造遺伝子がゲノムに存在することを証明した。さらに、Ｅ．フェカリスへのこれらのプラスミドの接合（示されず）では、この菌株はペプチドＳＴ４ＳＡの産生菌に変換されなかった。このことから、ペプチドＳＴ４ＳＡ産生をコードする遺伝子がＳＴ４ＳＡ株のゲノムに存在することが確認された。
【００８１】
ペプチドＳＴ４ＳＡの配列が図７及び配列表に示され、本発明の目的のために配列番号１２として表示される。トランスポーターペプチド及び免疫ペプチドの配列が本発明の目的のために配列番号１４及び配列番号１６としてそれぞれ表示される。
【００８２】
構造遺伝子、トランスポーター遺伝子及び免疫遺伝子のＤＮＡ配列が図８及び配列表に示され、本明細書の目的のために、配列番号１１、配列番号１３及び配列番号１５としてそれぞれ表示される。
【００８３】
種々の成長培地におけるペプチドＳＴ４ＳＡの産生が図９Ａ及び図９Ｂに示される。ペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する初期成長ｐＨの影響が図９Ａに示される。これらの結果から、ペプチドＳＴ４ＳＡは、６．０及び６．５の初期ｐＨでのＭＲＳブロスにおいて最適に産生され、１０〜２０ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、１５．０〜２０．０ｇ／ｌのフルクトースの存在によって、又はビタミンＣ、ビタミンＢ１及びＤＬ−６，８−チオクト酸の存在によって刺激されることが明白である。
【００８４】
ペプチドＳＴ４ＳＡの産生が図１０に示される。最大の産生が１４時間の成長の後で記録された。
【００８５】
接着／免疫遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントが図１１に示され、本明細書の目的のために配列番号１５として表示される。
【００８６】
エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡは、多くの病原体に対する活性を有する広域抗菌性ペプチド（ペプチドＳＴ４ＳＡ）を産生する。リーダーペプチド及びプロペプチド（これらはまとめてプレペプチドとして知られている）をコードする構造遺伝子がＳＴ４ＳＡ株のゲノムに存在する（図６Ｂを参照のこと）。１つのそのような遺伝子構造のみが検出された。このことは、１つのペプチドのみが抗菌活性の広いスペクトルに関わっていることを示唆する。様々な努力が、ＳＴ４ＳＡ株を、その５０ｋｂプラスミド及び１００ｋｂプラスミドからキュアリングするために行われ（図１）、しかし、それらは失敗した。このことは、プラスミドが、免疫性をペプチドＳＴ４ＳＡに与えることにおいて大きな役割を果たし得ること、又は主要な代謝反応において重要な遺伝子を有することを示唆する。
【００８７】
ＳＴ４ＳＡがエンテロコッカス・ムンドティの菌株であるというさらなる証拠が、下記のプライマーを使用する、１６ＳｒＤＮＡにおける保存領域から設計されるプライマーによる種特異的ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって得られた。
配列番号１６：フォワードプライマー：ＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ
配列番号１７：リバースプライマー：ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ
【００８８】
３０６塩基対のフラグメントが増幅された（図３に示される）。このＤＮＡフラグメントの配列決定により、ＧｅｎＢａｎｋにおける保存された１６ＳｒＤＮＡフラグメントとの９８％の相同性がもたらされた。
【００８９】
構造遺伝子（これはプロペプチドＳＴ４ＳＡをコードする）、トランスポーター遺伝子及び免疫遺伝子が配列決定され、それらのそれぞれのアミノ酸配列がＤＮＡ配列から翻訳されている（図８）。
【００９０】
ペプチドＳＴ４ＳＡの安定性が、無菌の蒸留水に懸濁されたとき、−２０℃から６０℃に及ぶ温度で４２日間にわたって試験された（図１２）。このペプチドは、−２０℃では４２日間にわたって、また、４℃では３週間にわたって安定したままであった。安定性が３７℃で１週間の後で低下した。しかしながら、粉末形態のペプチドＳＴ４ＳＡは、室温（２５℃）では６ヶ月間にわたって安定したままであった。ペプチドＳＴ４ＳＡは粉末形態で製造され、そのようなものとして販売される。無菌の蒸留水に溶解されると、ペプチドＳＴ４ＳＡは４℃で３週間保つことができる（図１２を参照のこと）。
【００９１】
ペーパーディスクにおけるペプチドＳＴ４ＳＡの活性が表５に示される。抗生物質との活性の比較が表６に示される。活性が、感染した中耳液から単離されるＰｓｕｄｏｍｏｎａｓ種に対して試験された。阻害域の画像が図１３に示される。
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
ペプチドＳＴ４ＳＡが標的細胞に結合することが、ペプチドの浸透を確かなものにするために重要である。ペプチドＳＴ４ＳＡが病原体に接着する能力を調べた。結果が、病原体に結合する百分率として表された（表７）。これらの結果から結論すると、少なくとも７５％のペプチドＳＴ４ＳＡが、試験された病原体に結合する。ペプチドＳＴ４ＳＡが標的細胞に接着することにより、細胞膜への浸透及び細胞膜の破壊が引き起こされる（図１４）。
【００９５】
【表７】
【００９６】
細胞膜損傷及び細胞構成成分の漏出のさらなる証拠が、細胞外ＤＮＡ及び細胞外β−ガラクトシダーゼ活性について試験することによって得られた。これらの結果が表８及び表９にそれぞれ示される。これらの結果は、ＤＮＡ及びβ−ガラクトシダーゼが、ペプチドＳＴ４ＳＡによる損傷を受けた細胞から漏れたことを示している。β−ガラクトシダーゼの漏出は、すべての種がこの酵素の高い細胞内レベルを有するとは限らないという事実のために、すべての病原体について記録されなかった。
【００９７】
【表８】
【００９８】
【表９】
【００９９】
ペプチドＳＴ４ＳＡによる処理の後での種々の病原体の細胞溶解が図１５〜２３に示される。オーバーナイトの病原体の０．２％（ｖ／ｖ）接種物をＢＨＩブロスに接種した。ペプチドＳＴ４ＳＡを中期指数期でそれぞれの病原体に加えた。本明細書中に示される結果（図１５〜２３）から、ペプチドＳＴ４ＳＡがほとんどの病原体に対して殺菌的様式で作用したことが明らかである。
【０１００】
ペプチドＳＴ４ＳＡの産生をリステリア・イノクアの存在下で調べた（図２４）。これらの結果に基づいて、Ｌ．イノクアは、ペプチドＳＴ４ＳＡを産生するようにＳＴ４ＳＡ株を刺激し、しかし、その期間中、Ｌ．イノクアは阻害された。
【０１０１】
〔プロバイオティクス菌としてのエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ〕
エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡの生存を、コンピューター化された胃腸モデル（ＧＩＭ、これは図２５に示される）において評価した。
【０１０２】
ＧＩＭにおける第１の容器が胃を模擬し、第２の容器が十二指腸を模擬し、容器番号３が空腸及び回腸を模擬し、容器４が結腸を模擬する。栄養分の流れが専用のソフトウエアによって調節された。ＧＩＭの異なる区画におけるｐＨが無菌の１Ｎ ＨＣｌ又は１Ｎ ＮａＯＨの蠕動的添加によって調節された。それぞれの区画には、制御装置及びコンピューターにつながれる非常に高感度のｐＨプローブが取り付けられた。ＧＩＭを通過する栄養分の流速が乳児の腸管に従って調節された。短い消化管を模擬する条件が、より大きい変動、従って、プロバイオティクス菌に対する増大したストレスを可能にするために選ばれた。４つの乳児用調製粉乳（Ｌａｃｔｏｇｅｎ２、ＮＡＮ Ｐｅｌａｒｇｏｎ、ＡＬＬ１１０及びＡｌｆａｒｅ）を評価した。プロバイオティクス細菌（ＳＴ４ＳＡ）による投薬は処方に従った。すなわち、１ｍｌ当たり生細胞１０８個（ｃｆｕ）。プロバイオティクス菌体を唾液に懸濁した。ＮａＨＣＯ３、パンクレアチン及び雄牛の胆汁を含有する膵液−胆汁溶液を、蒸留水に溶解した。ＧＩＭで使用した条件は、表１０及び表１１に要約する通りであった。
【０１０３】
【表１０】
【０１０４】
【表１１】
【０１０５】
病原体に対するＳＴ４ＳＡ株の生存を、ＧＩＭにリステリア・モノサイトゲネスを感染させることによって試験した。ＧＩＭにおけるＳＴ４ＳＡ株の生存、及び抗菌性ペプチドＳＴ４ＳＡをＧＩＭにおいて産生するその能力をモニターした（結果が表１２に示される）。
【０１０６】
【表１２】
【０１０７】
表１２に示される結果から結論され得るように、ＳＴ４ＳＡ株が腸管のすべての区域で生存した。抗菌性ペプチドの産生は、腸管のすべての区域において、１ｍｌ当たり２５６００ＡＵ（任意単位）を超えていた。ＮＡＮ Ｐａｌａｒｇｏｎでの成長は、ＭＲＳの場合ほど最適でなく、わずかに低かった。しかしながら、両方の実験では、細胞数が、１対数単位を超えて低下しなかった（表１３を参照のこと）。
【０１０８】
【表１３】
【０１０９】
様々な抗生物質に対するＳＴ４ＳＡ株の抵抗性が標準的な手順（抗生物質ディスク、Ｏｘｏｉｄ）に従って試験されている。これらの結果から結論されるとき、ＳＴ４ＳＡ株は、スルホンアミド系、クロキサシリン、メトロニダゾール、メチシリン、ネオマイシン、ナイスタチン、オキサシリン及びストレプトマイシンに対して抵抗性である（表１３）。
【０１１０】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳの小児が、下痢を防止するためにトリメトプリム−スルファメトキサゾール（ＴＭＰ−ＳＭＸ）及び／又はメトロニダゾールにより処理される。ＮＡＮ Ｐａｌａｒｇｏｎには、異なる濃度の後者の抗生物質が補充され、ＳＴ４ＳＡに対する影響が最適な培養温度（３７℃）での１８時間の後で測定された。
【０１１１】
表４に示される結果から結論され得るように、ＴＭＰ−ＳＭＸ及びメトロニダゾールはＳＴ４ＳＡ株の細胞数を４対数単位で低下させた。しかしながら、増大した濃度は、生存性に対する劇的な影響を有しなかった。
【０１１２】
〔ＳＴ４ＳＡにおける毒性因子の発生〕
ＳＴ４ＳＡ株をプロバイオティクス菌として開発するためには、これに伴う何らかの毒性因子が存在するかを知ることが重要である。プライマーが、下記の毒性因子をコードする遺伝子について設計されている。バンコマイシン抵抗性（ＶａｎＡ／ＶａｎＢ）；ゼラチナーゼ（Ｇｅｌ）の産生；凝集物質（ＡＳ）；腸球菌由来のコラーゲンのアドヘシン（Ａｃｅ）；腸球菌表面タンパク質（Ｅｓｐ）；溶血素／バクテリオシン（Ｃｙｌ）及び非細胞溶解素β溶血素の遺伝子。ＳＴ４ＳＡ株のＤＮＡが後者のプライマーにより増幅されたことにより、この菌株は、バンコマイシン抵抗性、ゼラチナーゼ活性、凝集物質及びコラーゲン接着をコードする遺伝子を有しないことが示された。これらの結果に基づけば、ＳＴ４ＳＡ株は病原性でなく、また、アルルギー反応を、摂取されたときに引き起こさないはずである。
【０１１３】
ペプチドＳＴ４ＳＡは、多くのグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して作用する抗菌活性の広いスペクトルを有するので、ペプチドＳＴ４ＳＡの作用様式は、乳酸菌についてこれまでに記載の他の抗菌性ペプチドとは異なるようである。加えて、感受性細胞の細胞壁における認識部位が、本出願人が承知している他のペプチドによって使用される通常的な脂質ＩＩアンカー部位（図２６）とは異なり得る。
【０１１４】
この仮説を検証するために、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）ＤＳＭ２００１７（これはペプチドＳＴ４ＳＡに対して感受性である）の脂質ＩＩ標的部位をバンコマイシンにより阻止した（概略図を参照のこと、図２６）。バンコマイシンは脂質ＩＩ分子のアミノ酸側鎖に接着し、このことにより、理論的には、ペプチドＳＴ４ＳＡが同じ部位に結合することが妨げられると考えられる（すなわち、脂質ＩＩが受容体として作用するならば）。しかしながら、バンコマイシン及びペプチドＳＴ４ＳＡの組合せによる標的細胞（Ｌ．サケイ ＤＳＭ２００１７）の処理は成長阻害をもたらした（細胞質の漏出；図２６を参照のこと）。このことは、脂質ＩＩ以外の標的部位が、ペプチドＳＴ４ＳＡについての受容体として作用していることを示唆する。ペプチドＳＴ４ＳＡが感受性細胞表面の２つ以上のアンカー部位に結合するという事実により、ペプチドＳＴ４ＳＡがなぜ、（グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して阻害性の）抗菌活性のそのような広いスペクトルを有するかが説明され得る。本出願人は、バンコマイシンによるＬ．サケイ ＤＳＭ２００１７の処理が脂質ＩＩの標的部位へのナイシンの結合を妨げた図２６に示されるように、ナイシン（抗生物質）が脂質ＩＩに結合することを承知している。
【０１１５】
ペプチドＳＴ４ＳＡは、ペプチドＳＴ４ＳＡが細胞壁表面の受容体部位との反応を形成した後で、リン脂質が多い細胞膜とのインターカレーションが可能である２つの疎水性領域を有する（図２７）。これら２つの疎水性領域の間の領域、より具体的には、アミノ酸２９（セリン）と、アミノ酸３０（アラニン）との間（図２７）は、構造体の残り部分よりも柔軟であり、ペプチドのＣ末端側半分を曲げ、リン脂質が多い細胞膜の中に自身を取り込むことを可能にするヒンジ領域として作用し得る。この仮説を検証するために、ペプチドＳＴ４ＳＡのこれら２つの区域（図２７）を、構造遺伝子のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づいて合成した（これらは本明細書中下記ではフラグメント１及びフラグメント２として示される）。
【０１１６】
下記に示されるように、フラグメント１は、ヒンジ領域（すなわち、２９位におけるセリンと、３０位におけるアラニンとの間）の直前までの最初の２９アミノ酸（リシンからセリンまで）からなっていた。ジスルフィド架橋が導入され（連結線、下記に示される）、このジスルフィド架橋により、アミノ酸９（システイン）及びアミノ酸１４（システイン）（これらもまた、全長のペプチド配列において下記に示される）が共有結合により連結されていた。
【化１】
【０１１７】
このジスルフィド架橋は、ペプチドの構造を安定化するために役立った。フラグメント１は、囲まれた領域（２１位〜２６位の６アミノ酸、すなわち、ＡＩＧＩＩＧ）によって示される最初の疎水性領域を含有した。分子のこの部分は標的（感受性）生物の細胞壁における受容体を認識する。
【０１１８】
フラグメント２は、ヒンジ領域の下流側にある第２の疎水性ループにおける最後の１３個のＣ末端アミノ酸と、（セリンと、アラニンとの間の）ヒンジ領域の直前の先行する１１アミノ酸と、を含んでいた。
【化２】
【０１１９】
感受性細胞をペプチドＳＴ４ＳＡのこれらの２つのフラグメントで処理することにより、分子の両方のフラグメント（区域）が抗菌活性のために必要とされることが示された。従って、Ｎ末端が細胞表面の受容体に固定されると、細胞膜の破壊がやっと可能となるようである。
【０１２０】
〔ポリエチレン（ＰＥ）に対するペプチドＳＴ４ＳＡの結合〕
ポリエチレン（ＰＥ）に対するペプチドＳＴ４ＳＡの結合を試験した。ＰＥフィルムを５×５ｃｍの切片に切断し、６０％イソプロパノール及びペプチドＳＴ４ＳＡの溶液（活性レベル：１０２４００ＡＵ／ｍｌ）に１時間浸した。ＰＥ切片を風乾し（６０℃で２０分間）、標準的な寒天拡散方法を使用することによって抗菌活性についてアッセイした。平板にＬ．サケイ ＤＳＭ２００１７を播種した後、平板を３０℃で２４時間インキュベーションし、成長阻害域について調べた。
【０１２１】
ペプチドＳＴ４ＳＡは６０秒以内にＰＥに吸着して、高い抗菌活性（ＰＥ切片を取り囲む大きい阻害域）を有するフィルムをもたらした。結合の強さを、ペプチド被覆のＰＥフィルムをＳＤＳ緩衝液に浸し、その後、ペプチドＳＴ４ＳＡをフィルムから３０ｍＡの電流により２時間（室温、すなわち、約２５℃）電気溶出することによって求めた。サンプルを一定の時間間隔で採取し、抗菌活性について試験した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用することによって求めた。電気溶出されたフィルムを、寒天拡散方法を前のように使用することによって抗菌活性について試験した。
【０１２２】
ペプチドＳＴ４ＳＡはＰＥフィルムに強く接着した。ペプチドＳＴ４ＳＡはＰＥフィルムに対して不可逆的であるようである。ＰＥの表面からのペプチドＳＴ４ＳＡの遊離は３０ｍＡの電流により１時間後にやっと可能であった。赤身の肉をモデルとして用いる課題研究において、表面（ＰＥ）に結合したペプチドＳＴ４ＳＡは、病原性細菌（リステリア属、バチルス属及びスタフィロコッカス属）の成長を妨げた。このことは、ペプチドＳＴ４ＳＡは、微生物感染症を防止又は軽減するための創傷被覆材において使用可能であり、また、他の医療用途又は防腐用途における使用、例えば、インプラント、イヤーグロメット、カテーテル、オストミーチューブ、オストミーポーチ、ステント、縫合材、衛生用品（例えば、女性衛生用品など）、コンタクトレンズ、コンタクトレンズ洗浄液などにおける使用もまた見出されることを示唆する。抗菌性ペプチドをポリマー中に封入することにより、抗菌性ペプチドのゆっくりした放出及び微生物感染症の長期間の治療がもたらされる。さらには、ＰＥに対するペプチドＳＴ４ＳＡの強い接着性は、そのことが徐放性の抗菌剤として作用することを示す。
【０１２３】
ペプチドＳＴ４ＳＡは微生物細胞上の２つ以上の受容体に結合し、広域抗菌薬から予想される典型である。ペプチドＳＴ４ＳＡの第１の区域（ヒンジ領域の前方の区域）が受容体に結合する。第２の部分（ヒンジ領域の下流側の部分）はより大きい疎水性領域を有し、細胞膜の中にインターカレーションし、透過性を乱し、これにより、（ＤＮＡ及び酵素の漏出によって可視化される）細胞死を引き起こす。ペプチドＳＴ４ＳＡは、安定した徐放性様式でＰＥに結合し、従って、創傷被覆材に組み入れるために適する。
【０１２４】
〔プロバイオティクスへのエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡの開発〕
エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡの生存を、示されるようなコンピューター化された胃腸モデルにおいて評価した。この段階はプロバイオティクス菌としてのＳＴ４ＳＡ株のさらなるインビトロ評価及びインビボ評価を含んでいた。粘膜及び上皮細胞に対する接着を、ヒト細胞株を用いてインビトロで調べた。インビボ研究をラットにおいて行った。
【０１２５】
この研究で使用されたヒト腸細胞株はヒト結腸腺癌に由来し、Ｃａｃｏ−２細胞株、ＨＴ−２９及びＨＴ２９−ＭＴＸ（粘液分泌細胞）を含んでいた。これらの細胞株は、標準的な培養条件下で成長すると、形態学的及び機能的な分化を発現し、分極化、機能的な刷子縁及び先端の腸ヒドロラーゼをはじめとする成熟した腸細胞の特徴を示す。
【０１２６】
宿主細胞へのＳＴ４ＳＡ株の接着性が、細胞表面の炭水化物、ＥｆａＡタンパク質、Ａｃｅ（腸球菌由来のコラーゲンのアドヘシン）タンパク質及び凝集物質（ＡＳ）（これらは病原性に関係づけられる）によって影響される。ＡＳは、ＡＳがコードされる性フェロモンプラスミドの非常に効率的な伝達を可能にする細胞集塊の形成を媒介するアドヘシンである。
【０１２７】
本研究では、ＳＴ４ＳＡ株を、毒性形質、胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）の活性、及びヒト腸細胞様細胞株Ｃａｃｏ−２に対する接着能力、すなわち、Ｃａｃｏ−２細胞株に接着しながらでの競合的排除、また、インビトロ胃腸（ＧＩＴ）モデルにおける競合的排除についてスクリーニングした。加えて、ＳＴ４ＳＡの細胞表面の疎水性を求めた。
【０１２８】
〔毒性因子〕
毒性因子の存在、すなわち、バンコマイシン抵抗性（ＶａｎＡ／ＶａｎＢ／ＶａｎＣ１／ＶａｎＣ２／ＶａｎＣ３）の存在、ゼラチナーゼ（Ｇｅｌ）の産生、凝集物質（ＡＳ）、腸球菌由来のコラーゲンのアドヘシン（Ａｃｅ）、腸球菌表面タンパク質（Ｅｓｐ）、溶血素／バクテリオシン（Ｃｙｌ）及び非細胞溶解素β溶血素の遺伝子を、インビトロ検査及び／又はＰＣＲスクリーニングによって調べた。ＤＮＡを標準的な方法に従ってＥ．ムンドティＳＴ４から抽出した。後者の遺伝子を増幅するために設計されたプライマーは記載の通りであった。結果が表１４に示される。
【０１２９】
【表１４】
【０１３０】
〔凝集物質（ＡＳ）の産生〕
ＡＳの産生を性フェロモンの存在下での集塊形成アッセイで調べた。性フェロモンを、フェロモン産生菌（エンテロコッカス・フェカリスＪＨ２−２）をＭＲＳブロスにおいて３７℃で１８時間成長させることによって得た。フェロモン産生菌（Ｅ．フェカリス ＯＧ１Ｘ）の上清をマイクロタイタープレートでの集塊形成アッセイにおいて使用した。２００マイクロリットルをＳＴ４ＳＡ株とともに接種し（０．５％、ｖ／ｖ）、２時間後、４時間後、８時間後及び２４時間後に細胞の集塊形成について顕微鏡で調べた。細胞の集塊形成が全く認められなかった。
【０１３１】
〔ゼラチナーゼの産生〕
ゼラチナーゼの産生を、３０ｇ／ｌのゼラチンを含有するＭＲＳ寒天で調べた。３７℃で１８時間後においてコロニーを取り囲む透明域を、陽性の反応であると見なした。ゼラチナーゼの産生が全く検出されなかった。
【０１３２】
〔β−溶血素の産生〕
β−溶血素の産生が、血液寒天平板においてコロニーを取り囲む透明域の形成によって示された。血液寒天平板を、Ｃｏｌｕｍｂｉａ血液寒天基剤を５％のヒツジ血液とともに使用して調製した。β−溶血素の産生が全く認められなかった。
【０１３３】
本出願人が、ＳＴ４ＳＡ株は、バンコマイシン抵抗性、ゼラチナーゼ産生、心内膜炎抗原の産生、細胞凝集物の形成、コラーゲンに対する接着性、及び／又は表面タンパク質の産生をコードする遺伝子を有しないことを示していることは明白である。β−溶血素活性及び非細胞溶解素β溶血素ＩＩＩをコードする遺伝子が検出された。しかしながら、後者の２つの遺伝子は発現されない（溶血活性が血液寒天平板において認められなかった−下記参照）。
【０１３４】
〔胆汁酸塩加水分解（ＢＳＨ）活性の測定〕
ＳＴ４ＳＡ株を一晩培養した培養物を１０μｌ、０．５％（ｗ／ｖ）のタウロデオキシコール酸（ＴＣＤＡ）のナトリウム塩及び０．３７ｇ／ＬのＣａＣｌ２が補充されたＭＲＳ寒天平板にスポットすることによってＢＳＨ活性について試験した。平板を嫌気ジャーにおいて３７℃で７２時間インキュベーションした。沈殿域の形成を、ＢＳＨ陽性であると見なした。
【０１３５】
胆汁酸塩加水分解（ＢＳＨ）活性がＳＴ４ＳＡ株について認められなかった。ＢＳＨ活性は、十二指腸における抱合型胆汁酸塩の毒性に対する乳酸菌の抵抗性に寄与し得る。しかしながら、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性及び胆汁酸塩に対する抵抗性は無関係であると一般に受け入れられている。
【０１３６】
〔細胞表面疎水性の測定〕
Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡを一晩培養した培養物を１／４強度のリンゲル溶液（ＱＳＲＳ）により２回洗浄し、ＯＤ５８０ｎｍを測定した。等体積の懸濁物及びｎ−ヘキサデカンを一緒に加え、２分間混合した。相を室温で３０分間分離させ、その後、１ｍｌの水相を取り出し、ＯＤ５８０ｎｍを測定した。２回（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）の評価のＯＤ５８０ｎｍを平均化し、疎水性を計算するために使用した。
％疎水性＝［（ＯＤ５８０ｎｍ測定値１−ＯＤ５８０ｎｍ測定値２）／ＯＤ５８０ｎｍ測定値１］×１００。
【０１３７】
図２８に示される結果から、ＳＴ４ＳＡ株は疎水性の徴候を示さなかったことが明白である。従って、この細胞はＧＩＴにおいて表面に永続的に付着しない。この細胞は腸内を（プランクトン細胞のように）自由に移動し、従って、このことは、良好なプロバイオティクス菌としてのその有用性を高める。
【０１３８】
〔Ｃａｃｏ−２細胞株へのＥ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ及びリステリア・モノサイトゲネスの接着〕
Ｃａｃｏ−２細胞（Ｈｉｇｈｖｅｌｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、コンフルエンスを得るために５×１０５細胞／ウェルの濃度で播種した。接着性を、１００μｌの細菌懸濁物（１×１０５ｃｆｕ／ｍｌのＳＴ４ＳＡ株及び１×１０３ｃｆｕ／ｍｌのＬ．モノサイトゲネス）をウェルに加えることによって調べた。３７℃で２時間インキュベーションした後、細胞株をＰＢＳにより２回洗浄した。細菌細胞をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００により溶解し、ＭＲＳ寒天及びＢＨＩ寒天にそれぞれ置床した。接着を初期生菌数及び細胞溶解物から計算した。
【０１３９】
ＳＴ４ＳＡ株及びリステリア・モノサイトゲネスの競合的排除を、１００μｌの各菌株を細胞単層に接種することによって求めた。２時間のインキュベーション期間の後、細胞を溶解し、エンテロコッカス特異的培地及びリステリア特異的培地にそれぞれ置床した。
【０１４０】
Ｃａｃｏ−２細胞単層物を１２ウェル組織培養プレートでのガラス製カバースリップにおいて調製した。ＳＴ４ＳＡ細胞の懸濁物をウェルに加えた。２時間の接着期間の後、細胞株をＰＢＳにより２回洗浄し、１０％ホルマリンにより固定処理し、グラム染色した。接着性細胞を顕微鏡で調べた。結果が表１５及び表１６に示される。
【０１４１】
【表１５】
【０１４２】
【表１６】
【０１４３】
表１５及び表１６に示される結果から、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ細胞がＣａｃｏ−２細胞へのリステリアの接着を妨げたこと、及びこの細胞がヒト細胞株における認識部位についてリステリアに対して首尾良く競合したことが明らかである。従って、ＳＴ４ＳＡ株はリステリアに打ち勝つことができる。
【０１４４】
〔ＳＴ４ＳＡにより攻撃されたＬ．モノサイトゲネス及びインビトロ胃腸（ＧＩＴ）モデルにおける生存〕
インビトロ胃腸モデルにおけるＬ．モノサイトゲネスに対するＳＴ４ＳＡの抗菌活性を求めた。ＳＴ４ＳＡを本明細書中、前に記載したような胃容器に接種した。Ｌ．モノサイトゲネス（１×１０４個）をＧＩＴの十二指腸容器に接種した。サンプルをそれぞれの容器から採取し、エンテロコッカス特異的培地及びリステリア特異的培地にそれぞれ置床した。コントロールとして、Ｌ．モノサイトゲネスのみをＧＩＴモデルに接種した。
【０１４５】
インビトロＧＩＴモデルにおけるＳＴ４ＳＡによるＬ．モノサイトゲネス攻撃では、ＳＴ４が、Ｌ．モノサイトゲネスに対する抗菌活性を有したことが明らかにされた（次頁のグラフを参照のこと）。成長が十二指腸容器において８×１０４個から２×１０４個に低下し、Ｌ．モノサイトゲネスは、図２９に示すように、コントロールと比較したとき、回腸容器において１×１０１ｃｆｕ／ｍｌほど低かった。
【０１４６】
〔経口投与されたＥ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡの安全性、細菌転位、生存及び免疫調節能のインビボ評価：Ｌａｃｔｏｖｉｔａに対する比較〕
＜材料及び方法＞
〔動物〕
体重が３１８ｇ〜３３５ｇの間にある１０匹の雄性のＷｉｓｔａｒラットを、制御された大気（温度、２０℃±３℃）において、１２時間の明暗サイクルとともにプラスチックケージに５匹ずつの群で収容した。動物には、標準餌、並びにプロバイオティクス菌補充又は非補充のいずれかのオートクレーブ処理された逆浸透水が自由に与えられた。
【０１４７】
〔細菌菌株及びプロバイオティクス菌〕
ＳＴ４ＳＡ株をＭＲＳブロスにおいて３０℃で１８時間培養した。光学濃度を６００ｎｍにおいて１．８に調節した。細胞を遠心分離によって集め、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄された細胞を１００ｍＭスクロースに再懸濁し、液体窒素で凍結し、一晩凍結乾燥した。ｃｆｕ／ｍｌ値を、所与量の細胞を１ｍｌのリン酸塩緩衝液に懸濁し、希釈物をＭＲＳ固体培地に展開置床することによって求めた。ＳＴ４ＳＡ株を約２×１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で飲料水に加えた。
【０１４８】
Ｌａｃｔｏｖｉｔａの商品名で市販されているプロバイオティクス菌を含有する３個のカプセルを開け、飲料水のそれぞれのビンに加えた。これにより、約３×１０５ｃｆｕ／ｍｌが投与されることがもたらされた。
【０１４９】
〔実験設計〕
２つの別個の研究を行った。それぞれの研究では、１０匹のラットが、それぞれ５匹の２つの群に無作為に分けられた。一方の群はコントロールとして作用し、非補充の水が与えられた。第２の群には、Ｌａｃｔｏｖｉｔａカプセル又は凍結乾燥ＳＴ４ＳＡ株のいずれかが補充された水が与えられた。それぞれのラットは、研究期間を通して合計で９．８９×１０１１ｃｆｕのＳＴ４株又は３．１×１０９ｃｆｕのＬａｃｔｏｖｉｔａのいずれかが与えられた。ラットを毎日、波打った被毛、背中を丸めた姿勢、不安定な動き、震え又は身震い、咳又は呼吸困難、四肢の色を含めて、何らかの異常な活動、行動及び全体的な健康状態についてモニターした。活動を、３点スケール法を使用してモニターした。１＝緩慢、ゆっくり動く；２＝中程度；３＝活発な動き又は探索。生体重量及び消費された水の体積を毎日測定した。ＳＴ４ＳＡ株での研究を５０日にわたって行い、Ｌａｃｔｏｖｉｔａでの研究を１０８日にわたって行った。結果が表１７に示される。
【０１５０】
【表１７】
【０１５１】
〔β−グルクロニダーゼ活性〕
ラットを指定のサンプリング点で個別ケージに一晩入れ、２４時間の便サンプルを、細菌数及びβ−グルクロニダーゼ活性を求めるために集めた。便サンプルを１００ｍｇ便／ｍｌ緩衝液の濃度で２０ｍＭリン酸塩緩衝液においてホモジネートした。サンプルをアッセイまで−２０℃で保存した。便サンプルを遠心分離によってペレット化し、１ｍｌのＧＵＳ抽出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＰＯ４、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に再懸濁し、混合し、２２℃で１０分間インキュベーションした。サンプルを−２０℃で一晩凍結し、β−グルクロニダーゼ活性を測定する前に解凍した。β−グルクロニダーゼ活性を、１００μｌの処理された便懸濁物を９００μｌの反応緩衝液（１ｍＭのｐ−ニトロフェニルグルクロニドを含有する抽出緩衝液）と３７℃で２時間インキュベーションすることによってアッセイした。反応を、２．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０．４）を加えることによって停止させた。吸光度を４１５ｎｍで測定した。標準曲線を、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ及び１０ｍＭのｐ−ニトロフェノールを使用して構築した。
【０１５２】
〔細菌転位、毒性学的研究及び組織学〕
指定された期間にわたって試験菌株を与えた後、動物をペントバルビトンナトリウムの過剰用量によって安楽死させた。血液サンプルを右心室の心臓穿刺によって得た。それぞれのラットの内臓器官の全体的解剖学を調べ、記録した。肝臓組織、脾臓組織、回腸組織、盲腸組織及び結腸組織のサンプルを切除した。組織サンプルをカセットに集め、４％ホルムアルデヒド（ＰＢＳ）溶液に入れ、その後、組織学的分析及びＦＩＳＨ研究のためにパラフィンワックスに包埋した。回腸及び結腸の切片を液体窒素で凍結した。血液サンプルをＢＨＩ固体培地に展開置床し、３７℃で一晩インキュベーションした。
【０１５３】
〔免疫調節〕
総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して回腸及び結腸の凍結サンプルから抽出した。ＲＮＡの濃度を、ＤＮａｓｅ処理が完了した後、２６０ｎｍでの吸光度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して測定することによって求めた。それぞれのＲＮＡサンプルを４２ｎｇ／μｌの濃度に希釈した。合計で５μｇのそれぞれのサンプルを、スロットブロット装置を使用して３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）でナイロンメンブレンに移した。その後、メンブレンを、ラットのゲノムＤＮＡから増幅され、ＤＩＧにより標識された、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ）又はβ−アクチンのいずれかのＤＮＡプローブによりプローブ探査した。メンブレンをＸ線フィルムに一晩感光させ、現像した。
【０１５４】
＜結果＞
〔全体的な健康状態及び体重増加〕
研究期間を通して、顕著な行動変化又は活動変化がラットにおいて認められず、また、差を、実験群と、コントロール群との間で何ら認めることができなかった。処理に関連づけられる疾患又は死亡は生じなかった。
【０１５５】
〔β−グルクロニダーゼ活性〕
β−グルクロニダーゼを含めて、様々な細菌酵素が、変異原、発癌物質及び腫瘍促進因子を、ＧＩＴにおいて見出される前駆体から生じさせることに関与することが知られており、それらの存在が、細菌菌株の毒性を示す場合があり、従って、可能性のあるプロバイオティクス菌の安全性の目安として使用することができる。ＳＴ４ＳＡ株及びＬａｃｔｏｖｉｔａ懸濁物はともに、β−グルクロニダーゼ活性をインビトロで示さなかった（データは示さず）。しかしながら、Ｌａｃｔｏｖｉｔａ懸濁物が与えられたラットは、コントロールのラットと比較したとき、β−グルクロニダーゼ活性における増大を便サンプルにおいて示した（表１８Ａ）。コントロール動物はまた、５６日目での活性と比較したとき、活性における低下を研究の１０７日目に示し、実験動物は、５６日目と比較したとき、わずかに増大した値を１０７日目に示した。ＳＴ４補助物が与えられたラットは、コントロール群と比較したとき、より大きいβ−グルクロニダーゼ活性を示した（表１８Ｂ）。しかしながら、この活性は、研究の０日目での値と比較したとき、研究終了時においてより低いままであった。コントロール群もまた、０日目と比較したとき、研究終了時においてより低い活性を示した。
【０１５６】
【表１８】
【０１５７】
〔細菌転位、毒性学的研究及び組織学〕
菌血症が動物群のいずれにおいても検出されなかった。内臓器官の肉眼検査では、ＳＴ４ＳＡ株が与えられたラットが、コントロールのラットと比較したとき、著しくより顕著なＭＬＮを有したことが示された。ＭＬＮは、コントロールのラットにおいて特定することが極めて困難であった。実験群と比較したとき、コントロール群における脾臓はより狭小であり、筋肉量及び腹部脂肪がともにコントロール群ではより少なかった。Ｌａｃｔｏｖｉｔａが与えられた動物では、コントロール群と比較したとき、ＭＬＮがそれほど顕著ではなく、また、脾臓がより小さかった。
【０１５８】
リンパ球が脾臓に入り、血中の抗原に対する免疫応答を促進させる。肥大した脾臓は免疫系の増大した活性を示し得る。このことはまた、顕著なＭＬＮとも相関する。ＭＬＮはまた、免疫機能に関与しており、炎症又は感染の結果として大きくなる場合がある。この増大は、リンパ球がその機能を予想される通りに発揮していることの目安である。従って、ＳＴ４ＳＡ株は免疫刺激剤として作用し得る。Ｌａｃｔｏｖｉｔａ補助物を受けているラットは、コントロールのラットと比較したとき、より小さい脾臓及びそれほど顕著でないＭＬＮを示した。このことは、Ｌａｃｔｏｖｉｔａが免疫反応を誘導しないことを示している。しかしながら、コントロールラットのＭＬＮ及び脾臓が大きくなり、疾患の症状が、何らかの免疫刺激剤の非存在下では全く認められなかった。
【０１５９】
〔免疫調節〕
ノーザンハイブリダイゼーション研究では、何らかのサイトカイン（ＴＮＦ又はＩＦＮ）の発現が実験ＳＴ４ＳＡ群又はコントロール群のいずれにおいても示されなかった。ＲＮＡがβ−アクチンのＤＮＡプローブによりプローブ探査されたとき、陽性シグナルが検出され、相対的に同じ強度であった。このことはＲＮＡの存在を示している。
【０１６０】
サイトカインは、細胞成長、炎症、免疫性、分化及び修復を媒介する分泌タンパク質である。サイトカインは多くの場合、その要求される作用を生じさせるために、フェムトモル濃度を必要とするだけである。多くの場合、サイトカインは細胞表面の受容体との組合せで作用して、ＲＮＡ合成及びタンパク質合成のパターンにおける変化を生じさせる。サイトカインは通常、そのような低い濃度で存在するので、これらのタンパク質の影響下にあるさらなる遺伝子の発現を明らかにすることがより有益であり得る。
【０１６１】
本明細書中に示される結果は、試験されたプロバイオティク菌のいずれもが、雄性のＷｉｓｔａｒラットの全体的な健康状態に対する負の影響を何ら有していないことを示している。
【０１６２】
まとめると、ＳＴ４ＳＡ株は、バンコマイシン抵抗性をコードする遺伝子を有していない。β−溶血素活性及び非細胞溶解素β溶血素ＩＩＩをコードする遺伝子が検出されたが、しかし、遺伝子はサイレント（非発現）のままであった。ＳＴ４ＳＡ株は胆汁酸塩加水分解（ＢＳＨ）活性を有していない。このことは、この菌株がＧＩＴの下部区画（回腸及び結腸）においてより良好に機能することを示している。上記で示したように、データは、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ株がＧＩＴの中を自由に動き、Ｃａｃｏ−２細胞へのリステリアの接着を妨げ、同時にまた、ヒト細胞上の受容体に結合しないようにリステリアと首尾よく競合することを示している。ＳＴ４ＳＡ株は抗菌作用を胃腸モデル（ＧＩＭ）研究においてＬ．モノサイトゲネスに対して有した。ＳＴ４ＳＡ株は、ラット研究により示されるように、非毒性である。処理に関連づけられる疾患又は死亡は生じなかった。ＳＴ４ＳＡ株はまた、そのようなものとしてＬａｃｔｏｖｉｔａよりも良好に機能した。これは、ラットにＬａｃｔｏｖｉｔａが与えられた場合、ラットはβ−グルクロニダーゼ活性における増大を示したからである。従って、ＳＴ４ＳＡ株はラットにおいて免疫応答を刺激する。Ｌａｃｔｏｖｉｔａ補充物が与えられたラットは、コントロールのラットと比較したとき、より小さい脾臓及びそれほど顕著でないＭＬＮを示した。このことは、Ｌａｃｔｏｖｉｔａが免疫反応を誘導しないことを示唆する。
【０１６３】
上記で示したように、ペプチドＳＴ４ＳＡは様々な細菌の成長を阻害する。ペプチドＳＴ４ＳＡの最大産生（５１２００ＡＵ／ｍｌ）がＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）における２０時間の成長の後で記録され、これが発酵期間中を通して維持された。
【０１６４】
ＳＴ４ＳＡ株を１８時間培養した培養物がＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）及びろ過されたＭＲＳブロスにそれぞれ接種された（２％（ｖ／ｖ）、ＯＤ６００ｎｍ＝２．０）。ＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）を、細孔サイズが６０００Ｄａ〜８０００Ｄａのニトセルロースメンブレンを備えるＭｉｎｉｔａｎ（商標）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）でろ過した。８０００Ｄａよりも小さいタンパク質を含有するＭＲＳろ液（ＭＲＳｆ）を、その後、オートクレーブ処理し、前で記載したように接種した。ＭＲＳブロス及びＭＲＳｆにおけるインキュベーションは、撹拌を伴うことなく、３０℃及び３７℃で２９時間であった。ペプチドＳＴ４ＳＡの活性を２時間毎に求めた。
【０１６５】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡの精製〕
１リットルのＭＲＳｆにエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡを接種し（ＯＤ６００ｎｍ＝１．８）、これを３０℃で２４時間インキュベーションした。細胞を遠心分離（８０００×ｇ、４℃、１５分）によって集め、無細胞上清を８０℃で１０分間インキュベーションした。硫酸アンモニウムを４℃で無細胞上清に静かに加えて６０％の飽和レベルにした。４時間ゆっくり撹拌した後、沈殿物を遠心分離（２００００×ｇ、１時間、４℃）によって集めた。ペレットを１／１０体積の２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）に再懸濁し、１．０ｋＤａカットオフのＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国）を使用して無菌のＭｉｌｌｉＱ水に対して脱塩した。さらなる分離を、本明細書中、前で記載したように、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）による１ｍｌのＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるカチオン交換クロマトグラフィーによって行った。
【０１６６】
それぞれの精製段階の後で得られたペプチドＳＴ４ＳＡの活性レベルが表１９に示される。
【０１６７】
【表１９】
【０１６８】
ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒから集められた活性なフラクションはＳＴ４ＳＡピークに対応し、４２アミノ酸のペプチド（ペプチドＳＴ４ＳＡの予想サイズ）をもたらした。
【０１６９】
〔ペプチドＳＴ４ＳＡの等電点フォーカシング〕
ペプチドＳＴ４ＳＡの等電点フォーカシングを、Ｒｏｔｏｆｏｒ（登録商標）エレクトロフォーカシングセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用することによって行った。ＭＲＳｆで培養されたＳＴ４ＳＡ株から得られ、前で記載したように調製された１リットルの無細胞上清を凍結乾燥し、製造者の説明書に従ってアンホライト（ｐＨ範囲：３〜１０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とともに５０ｍｌの無菌の蒸留水に再懸濁した。１２Ｗの定電流を８℃で５時間加えた。分離後、集められたフラクションのそれぞれからの小体積を３ＮのＮａＯＨ又は３ＮのＨＣｌによりｐＨ７．０に調節し、ラクトバチルス・カセイＬＨＳに対する抗菌活性について試験した。陽性と試験されたフラクションをプールし、５０ｍｌの総体積に脱イオン水で再懸濁し、エレクトロフォーカシングに再び供し、フラクションを集め、抗菌活性について試験した。サンプルを−２０℃で保存した。
【０１７０】
培養培地の費用削減は培地最適化の重要な部分となる。培地費用は、工業用培地を炭素源及び／又は窒素源として使用することによって下げることができる。コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、チーズホエー粉末（ＣＷｐ）及び廃糖蜜が通常、成長培地の一部として使用される。ＣＳＬは、トウモロコシの製粉時に形成される副産物である。ＣＳＬは主として窒素源であり、しかし、糖（主にスクロース）、ビタミン及びミネラルもまた含有する。チーズホエー（乳業における副産物）は乳酸（ＬＡ）製造のための最も一般的な発酵培地であり、ラクトース、タンパク質及び塩を主に含有する。廃糖蜜は、主としてスクロースを含有する副産物であり、微量の他のミネラルを含む。
【０１７１】
〔培養及び培地〕
ＳＴ４ＳＡ株をＭＲＳブロス（Ｂｉｏｌａｂ）で培養して、ＣＳＬ、ＣＷｐ及び廃糖蜜にそれぞれ接種した（２％ｖ／ｖ）。
【０１７２】
〔発酵〕
発酵を、１０ｍｌの培地を含有する試験管で行った。ｐＨを殺菌（１２１℃、１５分間）の前にＮａＯＨにより調節した。ＮａＯＨの濃度は培地の緩衝能に依存した。２４時間の培養物を接種（２％ｖ／ｖ）のために使用した。回分発酵を試験管において３０℃で１６時間行った（ｐＨ６．５〜７．０）。ｐＨは制御されなかった。光学濃度（ＯＤ）を６００ｎｍで測定した。
【０１７３】
１０ｇ．ｌ−１、２０ｇ．ｌ−１及び５０ｇ．ｌ−１での廃糖蜜及びＣＳＬを、ペプチドＳＴ４ＳＡ産生のための可能な培地として評価した（表２０）。廃糖蜜におけるｐＨが発酵期間中に低下した（従って、このことは細胞成長を示す）が、ペプチドＳＴ４ＳＡ活性が上清において記録されなかった。他方で、ＣＳＬは、２０ｇ．ｌ−１の最小濃度で、３２００ＡＵ．ｍｌ−１にまで達する活性を有する上清をもたらした。これらの結果から結論され得るように、窒素源（ＣＳＬ）が、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生を持続させるためには要求される。
【０１７４】
【表２０】
【０１７５】
追跡実験において、ＣＷｐを工業用培地のリストに加え、１０ｇＴＳ．ｌ−１、２０ｇＴＳ．ｌ−１及び５０ｇＴＳ．ｌ−１で発酵させた（表２０）。１６００ＡＵ．ｍｌ−１にまで達するペプチドＳＴ４ＳＡ活性がＣＷｐにおいて記録された（表２０）。
【０１７６】
成分としてのＣＳＬ及びＣＷｐに関する全要因設計（ＦＦＤ）を使用して、どの培地がペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する最も著しい影響を有したかを明らかにした（表２１）。ＦＦＤはまた、何らかの相互作用が栄養物の間に存在したかどうかに関する目安を与える。
【０１７７】
【表２１】
【０１７８】
糖の利用を、下記の方法を使用することによって明らかにした。
【０１７９】
〔全糖についてのフェノール硫酸アッセイ〕
フェノール（５％（ｖ／ｖ）溶液の５００μｌ）及び濃硫酸（２．５ｍｌ）を試験管における５００μｌの希釈サンプルに加えた。溶液を十分に撹拌混合し、吸光度の読み取りを４９０ｎｍで行った（室温）。糖濃度（ｇグルコース．ｌ−１）を、標準曲線グラフを使用して計算した。
【０１８０】
〔モノマー糖のＤｉｏｎｅｘ測定〕
ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１００カラムを備えるＤｉｏｎｅｘ ＤＸ５００分析装置を使用して、サンプルをモノマー糖について分析した。使用された溶出液は、１ｍｌ．ｍｉｎ−１の流速において、２５０ｍＭ ＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ及び１Ｍ ＮａＯＡｃであった。Ｄｉｏｎｅｘはオートサンプラーを備え、注入体積は１０μｌであった。
【０１８１】
全糖濃度を５ｇＴＳ．ｌ−１及び１０ｇＴＳ．ｌ−１（これらは「−１」及び「１」によってそれぞれ表される）の間で変化させた。結果（２連（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で行われた実験）は、ＣＳＬ及びＣＷｐの濃度はペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する影響を何ら有しなかったことを示唆した（表２１）。５ｇＴＳ．ｌ−１及び１０ｇＴＳ．ｌ−１でのＣＳＬは、ＣＳＬ及びＣＷｐの組合せで記録されたペプチドＳＴ４ＳＡ活性と類似するペプチドＳＴ４ＳＡ活性をもたらし（表２１）、５０ｇ．ｌ−１のＣＳＬにより記録されたよりも４倍高いペプチドＳＴ４ＳＡ活性をもたらした（表２０）。これらの結果から明白であるように、ＣＳＬはペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する最も著しい影響を有していた。
【０１８２】
〔ＣＳＬの最適化〕
１２８００ＡＵｍｌ−１にまで達するペプチドＳＴ４ＳＡ活性が、１０ｇＴＳ．ｌ−１の濃度で、純粋なＣＳＬにおいて記録された。しかしながら、ＭＲＳにおいて記録されたペプチドＳＴ４ＳＡ活性（５１２００ＡＵ．ｍｌ−１）と比較したとき、これは低かった。予備実験において、ＭＲＳ成分（グルコースを除く）を１０ｇＴＳ．ｌ−１及び４０ｇＴＳ．ｌ−１のＣＳＬ及びＣＷｐにそれぞれ加えた（表２２）。活性における２倍の増大が、純粋なＣＳＬと比較したとき、補充物を有する１０ｇＴＳ．ｌ−１のＣＳＬについて認められた。対照的に、補充物を有する４０ｇＴＳ．ｌ−１でのＣＳＬは低い活性をもたらした。高濃度のＣＳＬは成長を阻害し（ｐＨにおける小さい低下）、その後に、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生もまた阻害した。これはＣＳＬにおける阻害性成分のためであり得る。同じ実験をＣＷｐに関して行った（表２２）。ＣＷｐ濃度を（１０ｇＴＳ．ｌ−１から４０ｇＴＳ．ｌ−１に）増大させた場合、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対する影響は何ら記録されなかった。
【０１８３】
【表２２】
【０１８４】
１０ｇＴＳ．ｌ−１において、ＣＳＬは、ＣＷｐと比較したとき、２倍の活性でペプチドＳＴ４ＳＡを産生した（２５６００ＡＵ．ｍｌ−１）。従って、ＣＳＬをさらなる実験のための培地として選んだ。
【０１８５】
ＭＲＳ成分のすべてが、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生を改善することにおいて役割を果たしたわけではないので、スクリーニング実験を行って、有意な成分を特定した。このスクリーニング実験は２１０−５の一部実施要因設計（ＦｒＦＤ）により行われた。この設計は、通常の１０２４回の実験の代わりに、ほんの３２回の実験で１０の要因を試験することを可能にした（表２３及び表２４）。何らかの相互作用が成分の間で存在したかを明らかにすることもまた可能であった。結果をＡＮＯＶＡにより分析した（表２５）。
【０１８６】
【表２３】
【０１８７】
〔コード化された値に関する線形モデル〕
活性＝−１４３１．２＊Ｂ＋９５６．２＊Ｃ＋３８３１．２＊Ｄ−２７８１．３＊Ｅ−２２４３．８＊Ｇ−２００６．２＊Ｋ＋７６６８．８［式２］
Ｒ２＝０．７３
【０１８８】
ペプチドＳＴ４ＳＡの産生が、線形モデルを使用して表された。この線形モデルは活性を正確に予測することができない（Ｒ２＝０．７３）が、それでも、成分の影響（正又は負）を評価するために使用することができる。牛肉抽出物（Ｂ）、リン酸カリウム（Ｅ）、クエン酸三アンモニウム（Ｇ）及び酢酸ナトリウム（Ｋ）は、応答変数における低下を引き起こす、線形モデル（式２）における負の係数を有した。このことは、ペプチドＳＴ４ＳＡの産生に対するそれらの負の影響を反映した。このことは、酵母抽出物（ＹＥ）（Ｃ）及びＣＳＬ（Ｄ）のみがペプチドＳＴ４ＳＡの産生を増大させたことを意味した。
【０１８９】
【表２４】
【０１９０】
【表２５】
【０１９１】
ＣＳＬ及びＹＥの濃度を２２ＦＦＤにより設定した（表２６）。ペプチドＳＴ４ＳＡの活性を求めるために使用された臨界希釈法は正確な結果を与えなかった。このことは、ＣＳＬ及びＹＥの濃度を活性に関連づけるモデルを近似することを不可能にした。実験結果を使用して、成分濃度を決定した。表２６から、ＣＳＬ及びＹＥの低濃度又は高濃度を使用すると、明瞭な影響がなかったことが理解され得る。平均値を、７．５ｇＴＳ．ｌ−１のＣＳＬ及び６．５ｇ．ｌ−１のＹＥの組成に関して、最良であるとして選択した。
【０１９２】
【表２６】
【０１９３】
最適な培地による成長曲線が図３０に示される。ＣＳＬ系培地及びＭＲＳは類似した成長速度論をもたらした。
【０１９４】
〔バッチ間の変動〕
ＣＳＬは老廃物であるので、ＣＳＬの組成が日毎に変化し得る。組成における差は、結果に著しい影響を及ぼす可能性がある。このことを、同じ実験をＣＳＬの第２のバッチで行うことによって調べた。今回のＡＮＯＶＡ分析では、ＹＥ、ＣＳＬ、Ｔｗｅｅｎ８０、ＭｎＳＯ４及び酢酸ナトリウムが、バクテリオシンの産生に対する最も著しい影響を有する成分として特定された（Ｐ＜０．１）。継続した最適化により、ＭｎＳＯ４は重要でなく、一方、酢酸ナトリウムは活性における低下を引き起こしたことが示された。
【０１９５】
最終的な培地は下記の３つの成分からなっていた。ＹＥ（Ｃ）、ＣＳＬ（Ｄ）及びＴｗｅｅｎ８０（Ｆ）。酵母抽出物が、またしても、有意な成分の１つであったことを見出すことは驚くべきことではなかった。Ｔｗｅｅｎ８０は乳化特性を有する。最終濃度は、２３ＦＦＤ設計で設定されるとき、ＹＥが７．５ｇ．ｌ−１であり、ＣＳＬが１０ｇ．ｌ−１であり、Ｔｗｅｅｎ８０が２ｇ．ｌ−１であった。
【０１９６】
〔成長制限〕
ＣＳＬ培地の糖含有量を発酵の前後で測定した。発酵開始時において、ＣＳＬは７．５ｇＴＳ．ｌ−１の濃度にされた。存在する主なモノマー糖はグルコース及びフルクトースであり、総濃度が３．８８３ｇ．ｌ−１であった。従って、全糖の約５１．８％のみが発酵可能な形態であり、すべての糖が発酵期間中に代謝されるわけではなかった。発酵終了時（一定のＯＤ）において、ｐＨが４．６であり、残っている残存糖が８．８％であった。成長制限は、低いｐＨのためであって、窒素、ミネラル、ビタミン又は任意の他の栄養分の不足のためではなかった。表２７は発酵期間中の炭素の取り込みを示す。
【０１９７】
【表２７】
【０１９８】
従って、ＹＥが補充されたＣＳＬは、市販のＭＲＳブロスで得られる高いペプチドＳＴ４ＳＡレベルに匹敵し得ることが明白である。好都合なことに、このことは、培養培地に関連する費用を著しく削減するという可能性を有する。ＣＳＬをペプチドＳＴ４ＳＡの工業的製造のための成長培地として選択した。
【０１９９】
〔プロバイオティクスへのエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡの開発〕
プロバイオティクス菌株を選択するための１つの重要な基準が、上皮細胞への接着である。プロバイオティクス細菌はまた、接着部位について病原性細菌と競合し得る。Ｃａｃｏ−２細胞（これはヒト結腸腺癌に由来する）をインビトロモデルとして使用して、上皮細胞に対するＥ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡの接着能及び競合的排除能を調べた。
【０２００】
結果が、接種物に対して比較される接着百分率として表される。Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ及びＬ．モノサイトゲネス ＳｃｏｔｔＡは接着することができ、ともに、Ｃａｃｏ−２細胞に対する５％の接着を示した。Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡの接着は、インキュベーション時間がほんの１時間であったとき、１％に低下した。食物は小腸に２時間留まり、従って、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４が上皮細胞に接着するための十分な時間を可能にする。しかしながら、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡは、この菌株が、病原体とのインキュベーションの前に、又は病原体とのインキュベーションの期間中に、又は病原体とのインキュベーションの後で加えられたかどうかにかかわらず、Ｌ．モノサイトゲネス ＳｃｏｔｔＡの接着に対する影響を有しなかった。排除及び追い出し試験において、Ｌ．モノサイトゲネス ＳｃｏｔｔＡは５％の接着を示した。競合試験では、パーセント接着がコントロールの場合と同じに留まったので、接着についての競合が何ら示されなかった。このことは、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ及びＬ．モノサイトゲネス ＳｃｏｔｔＡが上皮細胞上の異なる受容体に結合するかもしれないことによって説明することができる。従って、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ及びＬ．モノサイトゲネス ＳｃｏｔｔＡは、類似する受容体について競合しない。
【０２０１】
〔抗生物質及び抗炎症性薬物に対するＥ．ムンドティ ＳＴ４の抵抗性〕
Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡは、２つの抗生物質（Ｃｅｆａｓｙｎ及びＵｔｉｎ）及び炎症性医薬品（Ｒｈｅｕｇｅｓｉｃ、Ｃｏｘｆｌａｍ及びＰｙｎｍｅｄ）に対する抵抗性を示した。結果が表２８に示される。Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡに対する最大の成長阻害を有する抗生物質が、Ｐｒｏｍｏｘｉｌ、Ｃｉｐａｄｕｒ、Ｒｏｘｉｂｉｄｄ及びＤｏｘｉｍａｌである。
【０２０２】
Ｐｒｏｍｏｘｉｌ、Ｄｏｘｉｍａｌ、Ｃｅｆａｓｙｎ及びＵｔｉｎは、コントロールと比較したとき、Ｃａｃｏ−２細胞へのＳＴ４ＳＡ細胞の接着に対する影響を有しなかった。接着が、表２９において同様に認められ得るように、Ｃｉｐａｄｕｒ、Ｒｏｘｉｂｕｄｄ及びＩｂｕｇｅｓｔｉｃシロップの存在下では１０％低下し、より高濃度のＣｅｆａｓｙｎにより１４％低下した。
【０２０３】
【表２８】
【０２０４】
【表２９】
【０２０５】
〔経口投与されたＥ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ細胞の安全性、毒性、細菌転位及び生存、免疫調節能及び効力のインビボ評価−Ｌａｃｔｏｖｉｔａとの比較〕
〔動物〕
体重が１５０ｇ〜１８０ｇの間にある３６匹の雄性のＷｉｓｔａｒラットを、制御された大気（温度、２０℃±３℃）において、１２時間の明暗サイクルとともにプラスチックケージに６匹ずつの群で収容した。動物には、標準餌が自由に与えられた。
【０２０６】
＜細菌菌株及びプロバイオティクス菌＞
Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ株をＭＲＳブロスにおいて３０℃で１８時間培養した。光学濃度を６００ｎｍにおいて１．８に調節した。細胞を遠心分離によって集め、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄された細胞を１００ｍＭスクロースに再懸濁し、−８０℃で凍結し、一晩凍結乾燥した。ｃｆｕ／ｍｌ値を、所与量の細胞を１ｍｌのリン酸塩緩衝液に懸濁し、希釈物をＭＲＳ固体培地に展開置床することによって求めた。凍結乾燥された細胞を無菌スキムミルク（１０％）に再懸濁し、２×１０８ｃｆｕのＳＴ４ＳＡ株を胃内胃管栄養法により投与した。
【０２０７】
Ｌａｃｔｏｖｉｔａカプセルの中味を取り出してバイアルに入れ、無菌スキムミルク（１０％）に再懸濁し、２×１０８ｃｆｕを胃内胃管栄養法により投与した。
【０２０８】
リステリア・モノサイトゲネスＳｃｏｔｔＡをＢＨＩブロスにおいて３７℃で１８時間培養した。細胞を遠心分離によって集め、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄された細胞を１００ｍＭスクロースに再懸濁し、−８０℃で凍結し、一晩凍結乾燥した。ｃｆｕ／バイアルの数字を、上記で記載したように求めた。凍結乾燥された細胞を無菌スキムミルク（１０％）に再懸濁し、１０４ｃｆｕを胃内胃管栄養法により投与した。
【０２０９】
〔実験設計〕
７日間連続して、２つ動物群がＳＴ４株を胃内胃管栄養法により受け、２つの群がＬａｃｔｏｖｉｔａを受け、残る２つのコントロール群が水を受けた。８日目に、両方のコントロール群はリステリア・モノサイトゲネスに胃内胃管栄養法により感染させられ、ＳＴ４ＳＡ株群からの１つの群及びＬａｃｔｏｖｉｔａ群からの１つの群もそれぞれまた、Ｌ．モノサイトゲネスに感染させられた。このとき、動物はまた、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ株、Ｌａｃｔｏｖｉｔａ又は水を受けた。プロバイオティクス又は水が９日目及び１０日目に再び投与された。コントロール群が症状を示し始めたとき、Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ株がコントロール群の一方に胃内胃管栄養法により投与された。その後、この群を症状の緩和についてモニターした。
【０２１０】
動物をリステリア症の症状について毎日２回モニターした。動物を（Ｅ．ムンドティ ＳＴ４ＳＡ株をそのときに受けているコントロール群を除いて）１１日目に屠殺した。血液を右心室からサンプリングした。総血球数が病理学者の研究室によって求められ、血液のサンプルをＢＨＩ固体培地及びリステリア選択的寒天基剤に接種し、ｃｆｕ／ｍｌを求めた。血漿を集め、エンドトキシンレベル、並びにサイトカイン（ＩＬ−６及びＩＦＮ−α）レベルを求めた。肝臓、脾臓、及び胃腸管の様々な区画を切除し、ホルムアルデヒドで固定し、その後、パラフィン包埋した。
【０２１１】
様々な区画を組織化学的分析のために溶血素及びエオシンにより染色した。溶血素及びエオシンによる分析では、ＳＴ４ＳＡ株の経口投与は、肝臓、脾臓又はＧＩＴに対する構造的損傷を何らもたらさないことが示された（図３１を参照のこと）。違いが、ＳＴ４ＳＡ株が投与されていた動物と、非補充の水のみを受けている動物との間において何ら認められなかった。
【０２１２】
本明細書中に記載のように、ダイズ抽出物から単離されたエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株は、多くの病原性生物（例えば、ヒトの中耳感染症及びヒトの腸から単離された病原性生物など）に対して活性である有用な抗菌性ペプチド（ペプチドＳＴ４ＳＡ）を産生することが本出願人によって見出されている。好都合なことに、ペプチドＳＴ４ＳＡは細胞毒性を有しない。エンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株は、本出願人によって、糖発酵反応、多くの生化学的試験、２つのプラスミド（ｐＳＴ４ＳＡ１及びｐＳＴ４ＳＡ２）の存在、並びに腸上皮細胞及び粘膜への接着をコードする特異な遺伝子（ＡｄｈＳＴ４ＳＡ）によりＥ．ムンドティの他の菌株とは区別されている。ペプチドＳＴ４ＳＡが精製及び配列決定されており、ペプチドＳＴ４ＳＡは２つの大きな疎水性領域を含有する。本出願人は、ペプチドＳＴ４ＳＡをコードする核酸配列、並びに免疫性をそれ自身のペプチドの産生細胞に与えるように働く、細胞膜を横断するペプチドＳＴ４ＳＡの輸送をコードする核酸配列を単離し、配列決定している。この菌株からのそのプラスミドのキュアリング処理は抗菌活性の喪失を引き起こさなかったので、後者の遺伝子のすべてがゲノムに存在する。さらには、エンテロコッカス・フェカリスの菌株へのプラスミドの形質転換は受容菌をペプチドＳＴ４ＳＡの産生菌に変換しなかった。このことは、そのような遺伝子がプラスミドに存在しないというさらなる証拠である。ペプチドをタンパク質分解酵素で処理した後の抗菌活性の喪失により、この活性がペプチド構造に起因し、分子に連結される脂質又は炭水化物に起因しないことが確認された。驚くべきことに、このペプチドは、ｐＨ２．０〜ｐＨ１２．０の間での緩衝液における３０分のインキュベーションの後、及び１００℃で９０分の後で、活性を有したままであった。より一層驚くべきことに、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００による処理は、抗菌活性の喪失をもたらさなかった。ＳＴ４ＳＡ株は、低いｐＨ条件（ｐＨ２．５）をも生存し、６．５％のＮａＣｌの存在下、ｐＨ４．０からｐＨ９．６まで調節された培地で成長し、また、１．０％（ｗ／ｖ）胆汁酸塩及び膵液に対して抵抗性である。ＳＴ４ＳＡ株の成長が、（ゆっくりではあるが）１０℃で、また、４５℃でも生じ、最適な成長が３７℃においてである。Ｌ（＋）−乳酸のみがグルコースから産生される。これらの菌株特徴、ペプチドＳＴ４ＳＡの迅速及び安定した産生（菌株が環境ストレスに曝されるときでさえも）、ペプチドが細胞非毒性であるという事実、並びにペプチドがＧＲＡＳ（一般に安全であると見なされる）状態の生物によって産生されるという事実は、この菌株を有用なプロバイオティクスにする。
【０２１３】
本発明のペプチドはまた、（例えば、中耳感染症のための）局所治療剤としての液剤における抗菌剤として使用することができる。この液剤は、点耳剤アプリケーターを使用して耳に適用することができる。液剤はまた、食事への液体補助物として使用される液体形態のエンテロコッカス・ムンドティのプロバイオティクスに含まれる。本発明のペプチドはさらに、（例えば、副鼻腔感染症又は副鼻腔炎を治療するための）鼻腔スプレーにおいて、液体形態又は吸引形態のいずれかで、抗菌剤として使用することができる。本発明のペプチドはまた、ポリマー中に封入された抗菌剤として使用される。このポリマーは、その後、感染症（例えば、皮膚感染症など）の局所治療用の製剤において使用され、或いは、インプラント（例えば、イヤーグロメットなど）に組み入れるために、又は創傷被覆材に組み入れるために使用することができる。ポリマーへの抗菌性ペプチドのカプセル化は抗菌性ペプチドのゆっくりした放出及び微生物感染症の長期間の治療をもたらす。本発明のペプチドはまた、軟膏剤、ローション剤又はクリーム剤に組み入れられ、感染症を治療するために使用されることによって抗菌剤としての使用が見出される。本発明のペプチドはまた、液剤（例えば、コンタクトレンズ洗浄液など）に組み入れることによって抗菌剤として使用することができ、又はコンタクトレンズ自体に組み入れることができる。本発明のペプチドはまた、無菌性包装の製造において使用される包装材（例えば、プラスチックなど）に組み入れることによって抗菌剤として使用することができる。本発明のさらなる形態において、本発明のペプチドは、錠剤形態又はカプセル形態でエンテロコッカス・ムンドティの広域プロバイオティクスの一部として使用することができ、或いは、食用形態（例えば、菓子又はチューインガムなど）で使用することができる。
【０２１４】
【表３０−１】
【０２１５】
【表３０−２】
【０２１６】
【表３０−３】
【受託番号】
【０２１７】
ＰＴＡ−７２７８
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２、
そのフラグメントであって、抗菌活性を有するフラグメント、
そのムテイン及び誘導体であって、抗菌活性を有するムテイン及び誘導体、
その共有結合架橋体であって、抗菌活性を有する共有結合架橋体、及び、
前記アミノ酸配列に対して約７５％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を含む群から選択される、単離されたペプチド。
【請求項２】
前記単離されたペプチドに対して約８５％を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記単離されたペプチドに対して約９５％を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
配列番号１１、
その相補体、
そのフラグメントであって、その発現後に、抗菌活性を有するペプチドを産生することができるフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含む、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項５】
微生物宿主細胞の形質転換に適した組換えプラスミドであって、請求項１に記載の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドベクターを含むプラスミド。
【請求項６】
請求項１に記載の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドベクターを含む組換えプラスミドを含む、形質転換された微生物細胞。
【請求項７】
ＡＴＣＣに寄託され、受託番号がＰＴＡ−７２７８であるエンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）ＳＴ４ＳＡ株の実質的に純粋な培養物であって、資化可能な炭素源、窒素源及び無機物質を含有する栄養培地中で発酵すると、回収可能な量のペプチドＳＴ４ＳＡを産生することができる培養物。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドを製造するための方法であって、エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）ＳＴ４ＳＡ株を、回収可能な量の前記ペプチドが産生されるまで、微好気条件下、１０〜４５℃の温度で、栄養培地中で培養するステップと、前記ペプチドを回収するステップと、を含む方法。
【請求項９】
培養が約３７℃の温度で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
栄養培地が、コーンスティープリカー、チーズホエー粉末、ＭＲＳブロス、酵母抽出物及び廃糖蜜を含む群のいずれか１つ又は複数から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
栄養培地が、１０〜２０ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４及び／又は１５．０〜２０．０ｇ／ｌのフルクトースを含有するＭＲＳブロスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法であって、動物又はヒトの感染領域を、
請求項７に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株培養物、及び／又は
請求項１に記載の抗菌性ペプチド、
の治療有効量を含む物質又は組成物に曝すステップを含む方法。
【請求項１３】
前記菌株培養物が、約１０６〜１０９ｃｆｕ（コロニー形成単位）／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記菌株培養物が、約１０８ｃｆｕ（コロニー形成単位）／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、約１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される医薬品の製造における、請求項７に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株培養物の治療有効量の使用。
【請求項１８】
前記菌株培養物が、１０６〜１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記菌株培養物が、１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される医薬品の製造における、請求項１に記載の抗菌性ペプチドの治療有効量の使用。
【請求項２１】
前記ペプチドが、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ペプチドが、２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される物質又は組成物であって、請求項７に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株培養物を含み、前記方法が、当該物質又は組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む、物質又は組成物。
【請求項２４】
前記菌株培養物が、１０６〜１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２３に記載の物質又は組成物。
【請求項２５】
前記菌株培養物が、１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２４に記載の物質又は組成物。
【請求項２６】
動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される物質又は組成物であって、請求項１に記載の抗菌性ペプチドを含み、前記方法が、当該物質又は組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む、物質又は組成物。
【請求項２７】
前記単離されたペプチドが、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２６に記載の物質又は組成物。
【請求項２８】
前記単離されたペプチドが、２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２７に記載の物質又は組成物。
【請求項２９】
液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、液体スプレー、凍結乾燥粉末、凍結乾燥スプレー、口腔洗浄剤又は含嗽剤の形態である、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の物質又は組成物。
【請求項３０】
細菌感染症が、アシネトバクター・バウマニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・チロブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・カプリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス（エンテロコッカス）・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ） ｆａｅｃａｌｉｓ）又は肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、のいずれか１つ又は複数によって引き起こされる感染症である、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の物質又は組成物。
【請求項３１】
細菌種の成長を阻害する方法であって、細菌種を、請求項１に記載の抗菌性ペプチドの有効量に曝すステップを含む方法。
【請求項３２】
前記細菌種が、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌの濃度の前記抗菌性ペプチドに曝される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細菌種が、２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度の前記抗菌性ペプチドに曝される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細菌種が、アシネトバクター・バウマニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・チロブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・カプリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス（エンテロコッカス）・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ） ｆａｅｃａｌｉｓ）及び肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、を含む群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、液体スプレー、凍結乾燥スプレー、口腔洗浄剤又は含嗽剤の形態の抗菌剤の製造における、請求項１に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項３６】
副鼻腔感染症、副鼻腔炎、鼻炎、扁桃炎又は咽頭感染症を治療するための抗菌スプレーの製造における、請求項１に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項３７】
請求項１に記載の単離されたペプチドの抗菌有効量が組み入れられたポリマー。
【請求項３８】
請求項１に記載の単離されたペプチドが、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項３７に記載のポリマー。
【請求項３９】
請求項１に記載の単離されたペプチドが、２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項３８に記載のポリマー。
【請求項４０】
包装材、インプラント、医療デバイス、イヤーグロメット、カテーテル、オストミーチューブ、オストミーポーチ、ステント、縫合材、衛生用品、コンタクトレンズ、コンタクトレンズ洗浄液及び創傷被覆材に組み入れられる、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項４１】
請求項７に記載のエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株の生物学的に純粋な培養物の治療有効濃度を含むプロバイオティクス組成物。
【請求項４２】
前記菌株が、プロバイオティクス組成物１ｍｌ当たり生細胞約１０５〜１０９個（ｃｆｕ）の濃度で含まれる、請求項４１に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項４３】
前記菌株が、プロバイオティクス組成物１ｍｌ当たり生細胞約２×１０８個（ｃｆｕ）の濃度で含まれる、請求項４２に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項４４】
液体、錠剤、カプセル、菓子、チューインガム又は他の食品の形態である、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項４５】
動物又はヒトにおける病原性細菌又は病原性ウイルスのレベルを低減させる方法であって、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載のプロバイオティクス組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む方法。
【請求項４６】
前記プロバイオティクス組成物が、１０３〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度で動物又はヒトに投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記プロバイオティクス組成物が、１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度で動物又はヒトに投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記プロバイオティクス組成物が、約３×１０５の最終濃度で動物又はヒトに投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
動物又はヒトにおける病原性細菌又は病原性ウイルスのレベルを低減させる方法において使用されるプロバイオティクスの製造における、請求項７に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株の生物学的に純粋な培養物の使用。
【請求項５０】
前記菌株培養物が、１０６〜１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記菌株培養物が、１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
配列番号１〜配列番号１０からなる群から選択されるプライマー。
【請求項５３】
配列番号１及び配列番号２を含むプライマー対。
【請求項５４】
エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）の同定における、配列番号１及び配列番号２のプライマー対の使用。
【請求項５５】
配列番号３及び配列番号４を含むプライマー対。
【請求項５６】
配列番号５及び配列番号６を含むプライマー対。
【請求項５７】
配列番号７及び配列番号８を含むプライマー対。
【請求項５８】
配列番号９及び配列番号１０を含むプライマー対。
【請求項５９】
細菌エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）由来の単離されたトランスポーターペプチドであって、
配列番号１４、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約９０％を超える相同性、好ましくは８０％を超える相同性、最も好ましくは約７０％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を含むペプチド。
【請求項６０】
細菌エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）のＳＴ４ＳＡトランスポーターペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列であって、
配列番号１３、
その相補体、
そのフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含む配列。
【請求項６１】
細菌エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）由来の単離された免疫ペプチドであって、
配列番号１６、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約９０％を超える相同性、好ましくは８０％を超える相同性、最も好ましくは約７０％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を含むペプチド。
【請求項６２】
細菌エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）のＳＴ４ＳＡ免疫ペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列であって、
配列番号１５、
その相補体、
そのフラグメント、又は
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含む配列。
【請求項１】
配列番号１２、
そのフラグメントであって、抗菌活性を有するフラグメント、
そのムテイン及び誘導体であって、抗菌活性を有するムテイン及び誘導体、
その共有結合架橋体であって、抗菌活性を有する共有結合架橋体、及び、
前記アミノ酸配列に対して約７５％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を含む群から選択される、単離されたペプチド。
【請求項２】
前記単離されたペプチドに対して約８５％を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記単離されたペプチドに対して約９５％を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
配列番号１１、
その相補体、
そのフラグメントであって、その発現後に、抗菌活性を有するペプチドを産生することができるフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含む、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項５】
微生物宿主細胞の形質転換に適した組換えプラスミドであって、請求項１に記載の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドベクターを含むプラスミド。
【請求項６】
請求項１に記載の抗菌性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドベクターを含む組換えプラスミドを含む、形質転換された微生物細胞。
【請求項７】
ＡＴＣＣに寄託され、受託番号がＰＴＡ−７２７８であるエンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）ＳＴ４ＳＡ株の実質的に純粋な培養物であって、資化可能な炭素源、窒素源及び無機物質を含有する栄養培地中で発酵すると、回収可能な量のペプチドＳＴ４ＳＡを産生することができる培養物。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドを製造するための方法であって、エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）ＳＴ４ＳＡ株を、回収可能な量の前記ペプチドが産生されるまで、微好気条件下、１０〜４５℃の温度で、栄養培地中で培養するステップと、前記ペプチドを回収するステップと、を含む方法。
【請求項９】
培養が約３７℃の温度で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
栄養培地が、コーンスティープリカー、チーズホエー粉末、ＭＲＳブロス、酵母抽出物及び廃糖蜜を含む群のいずれか１つ又は複数から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
栄養培地が、１０〜２０ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４及び／又は１５．０〜２０．０ｇ／ｌのフルクトースを含有するＭＲＳブロスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法であって、動物又はヒトの感染領域を、
請求項７に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株培養物、及び／又は
請求項１に記載の抗菌性ペプチド、
の治療有効量を含む物質又は組成物に曝すステップを含む方法。
【請求項１３】
前記菌株培養物が、約１０６〜１０９ｃｆｕ（コロニー形成単位）／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記菌株培養物が、約１０８ｃｆｕ（コロニー形成単位）／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、約１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される医薬品の製造における、請求項７に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株培養物の治療有効量の使用。
【請求項１８】
前記菌株培養物が、１０６〜１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記菌株培養物が、１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される医薬品の製造における、請求項１に記載の抗菌性ペプチドの治療有効量の使用。
【請求項２１】
前記ペプチドが、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ペプチドが、２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される物質又は組成物であって、請求項７に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株培養物を含み、前記方法が、当該物質又は組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む、物質又は組成物。
【請求項２４】
前記菌株培養物が、１０６〜１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２３に記載の物質又は組成物。
【請求項２５】
前記菌株培養物が、１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２４に記載の物質又は組成物。
【請求項２６】
動物又はヒトの細菌感染症を治療する方法において使用される物質又は組成物であって、請求項１に記載の抗菌性ペプチドを含み、前記方法が、当該物質又は組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む、物質又は組成物。
【請求項２７】
前記単離されたペプチドが、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２６に記載の物質又は組成物。
【請求項２８】
前記単離されたペプチドが、２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２７に記載の物質又は組成物。
【請求項２９】
液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、液体スプレー、凍結乾燥粉末、凍結乾燥スプレー、口腔洗浄剤又は含嗽剤の形態である、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の物質又は組成物。
【請求項３０】
細菌感染症が、アシネトバクター・バウマニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・チロブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・カプリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス（エンテロコッカス）・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ） ｆａｅｃａｌｉｓ）又は肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、のいずれか１つ又は複数によって引き起こされる感染症である、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の物質又は組成物。
【請求項３１】
細菌種の成長を阻害する方法であって、細菌種を、請求項１に記載の抗菌性ペプチドの有効量に曝すステップを含む方法。
【請求項３２】
前記細菌種が、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌの濃度の前記抗菌性ペプチドに曝される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細菌種が、２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度の前記抗菌性ペプチドに曝される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細菌種が、アシネトバクター・バウマニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・チロブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・カプリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス（エンテロコッカス）・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ） ｆａｅｃａｌｉｓ）及び肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、を含む群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、液体スプレー、凍結乾燥スプレー、口腔洗浄剤又は含嗽剤の形態の抗菌剤の製造における、請求項１に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項３６】
副鼻腔感染症、副鼻腔炎、鼻炎、扁桃炎又は咽頭感染症を治療するための抗菌スプレーの製造における、請求項１に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項３７】
請求項１に記載の単離されたペプチドの抗菌有効量が組み入れられたポリマー。
【請求項３８】
請求項１に記載の単離されたペプチドが、１０００００〜３０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項３７に記載のポリマー。
【請求項３９】
請求項１に記載の単離されたペプチドが、２０００００ＡＵ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項３８に記載のポリマー。
【請求項４０】
包装材、インプラント、医療デバイス、イヤーグロメット、カテーテル、オストミーチューブ、オストミーポーチ、ステント、縫合材、衛生用品、コンタクトレンズ、コンタクトレンズ洗浄液及び創傷被覆材に組み入れられる、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項４１】
請求項７に記載のエンテロコッカス・ムンドティＳＴ４ＳＡ株の生物学的に純粋な培養物の治療有効濃度を含むプロバイオティクス組成物。
【請求項４２】
前記菌株が、プロバイオティクス組成物１ｍｌ当たり生細胞約１０５〜１０９個（ｃｆｕ）の濃度で含まれる、請求項４１に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項４３】
前記菌株が、プロバイオティクス組成物１ｍｌ当たり生細胞約２×１０８個（ｃｆｕ）の濃度で含まれる、請求項４２に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項４４】
液体、錠剤、カプセル、菓子、チューインガム又は他の食品の形態である、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項４５】
動物又はヒトにおける病原性細菌又は病原性ウイルスのレベルを低減させる方法であって、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載のプロバイオティクス組成物の治療有効量を動物又はヒトに投与するステップを含む方法。
【請求項４６】
前記プロバイオティクス組成物が、１０３〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度で動物又はヒトに投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記プロバイオティクス組成物が、１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度で動物又はヒトに投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記プロバイオティクス組成物が、約３×１０５の最終濃度で動物又はヒトに投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
動物又はヒトにおける病原性細菌又は病原性ウイルスのレベルを低減させる方法において使用されるプロバイオティクスの製造における、請求項７に記載のエンテロコッカス・ムンドティ株の生物学的に純粋な培養物の使用。
【請求項５０】
前記菌株培養物が、１０６〜１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記菌株培養物が、１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で投与される、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
配列番号１〜配列番号１０からなる群から選択されるプライマー。
【請求項５３】
配列番号１及び配列番号２を含むプライマー対。
【請求項５４】
エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）の同定における、配列番号１及び配列番号２のプライマー対の使用。
【請求項５５】
配列番号３及び配列番号４を含むプライマー対。
【請求項５６】
配列番号５及び配列番号６を含むプライマー対。
【請求項５７】
配列番号７及び配列番号８を含むプライマー対。
【請求項５８】
配列番号９及び配列番号１０を含むプライマー対。
【請求項５９】
細菌エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）由来の単離されたトランスポーターペプチドであって、
配列番号１４、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約９０％を超える相同性、好ましくは８０％を超える相同性、最も好ましくは約７０％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を含むペプチド。
【請求項６０】
細菌エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）のＳＴ４ＳＡトランスポーターペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列であって、
配列番号１３、
その相補体、
そのフラグメント、又は、
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含む配列。
【請求項６１】
細菌エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）由来の単離された免疫ペプチドであって、
配列番号１６、
そのフラグメント、
そのムテイン及び誘導体、又は、
前記アミノ酸配列に対して約９０％を超える相同性、好ましくは８０％を超える相同性、最も好ましくは約７０％を超える相同性を有する配列であって、抗菌活性を有する配列、
を含むペプチド。
【請求項６２】
細菌エンテロコッカス・ムンドティ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ）のＳＴ４ＳＡ免疫ペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列であって、
配列番号１５、
その相補体、
そのフラグメント、又は
厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含む配列。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【公表番号】特表２００９−５３８６１４（Ｐ２００９−５３８６１４Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１２７３９（Ｐ２００９−５１２７３９）
【出願日】平成１９年５月２５日（２００７．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０５１９８２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３８５３８
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３５３７８７）シプラ メドプロ リサーチ アンド デヴェロップメント （プロプライエタリー） リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２５日（２００７．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０５１９８２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３８５３８
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３５３７８７）シプラ メドプロ リサーチ アンド デヴェロップメント （プロプライエタリー） リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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