ベオミセス酸含有抽出物の製造方法
【課題】ベオミセス酸含有抽出物の製造方法及びベオミセス酸含有抽出物の提供。
【解決手段】ベオミセス酸を含有する原料からベオミセス酸含有抽出物を製造するにあたり、ローマカミツレを用いることを特徴とするベオミセス酸含有抽出物の製造方法、１，３−ブタンジオールを抽出溶媒として用い、ベオミセス酸を含有する原料としては、ムシゴケであるベオミセス酸含有抽出物の製造方法、当該方法により得られるベオミセス酸含有抽出物、及びベオミセス酸含有抽出物からなる美白剤。
【解決手段】ベオミセス酸を含有する原料からベオミセス酸含有抽出物を製造するにあたり、ローマカミツレを用いることを特徴とするベオミセス酸含有抽出物の製造方法、１，３−ブタンジオールを抽出溶媒として用い、ベオミセス酸を含有する原料としては、ムシゴケであるベオミセス酸含有抽出物の製造方法、当該方法により得られるベオミセス酸含有抽出物、及びベオミセス酸含有抽出物からなる美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベオミセス酸含有抽出物の製造方法に関する。また、本発明は当該方法により得られるベオミセス酸含有抽出物、並びに該抽出物を含有する美白剤及び美白用組成物に関する。さらに、本発明はベオミセス酸の溶解性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、紫外線による皮膚の黒化、シミ・ソバカス等の色素沈着は、メラノサイトが日光曝露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素により活性化され、その結果、メラノサイトで合成されたメラニン色素が皮膚内に異常沈着することにより発生する。これを防止又は改善するため、化粧料等にアスコルビン酸、ハイドロキノン誘導体、コウジ酸、胎盤抽出物等のメラニン生成抑制作用を有する美白成分を配合することが行われている。
しかしながら、これらの物質の奏する美白作用は、効果の点で未だ充分に満足のいくものとはいえず、より高い美白効果を持つ素材の探索が進められている。例えば、植物等の抽出物から美白作用を有するとされるエキスが種々報告されている。ローマカミツレの抽出物（特許文献１）及びムシゴケの抽出物（特許文献２）は、メラニン生成抑制作用を有するとの報告がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１１７６１３号公報
【特許文献２】特開２００６−１８２７３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規な美白成分であるベオミセス酸を含有する抽出物の製造方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該製造方法によって得られるベオミセス酸含有抽出物を提供することを課題とする。さらに本発明は、当該ベオミセス酸含有抽出物を含有する美白剤及び美白用組成物を提供することを課題とする。
また、本発明はベオミセス酸の溶解性を向上させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題に鑑み、植物等の抽出物からの新規美白成分の探求と、当該成分を高濃度に含有しうる抽出方法について鋭意検討を行った。その結果、ムシゴケ抽出物に含まれる成分の１つであるベオミセス酸が、メラニン生成を効果的に抑制しうることを見出し、新規の美白成分として有用であるとの知見を得た。さらに、ムシゴケをローマカミツレと共に抽出して得られた抽出物では、ムシゴケの単独抽出で得られる抽出物と比べてベオミセス酸の含有量が有意に増大していること、及び保存後においてもベオミセス酸の溶解性が高いことを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、ベオミセス酸を含有する原料からベオミセス酸含有抽出物を製造するにあたり、ローマカミツレを用いることを特徴とするベオミセス酸含有抽出物の製造方法に関する。
また、本発明は、当該方法により得られるベオミセス酸含有抽出物に関する。
また、本発明は、当該ベオミセス酸含有抽出物からなる美白剤及びそれを有効成分として含有する美白用組成物に関する。
さらに、本発明は、ローマカミツレを用いてベオミセス酸の溶媒への溶解性を向上させる方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の製造方法によれば、新規の美白成分であるベオミセス酸を高濃度に含有する抽出物を製造することができる。当該方法によって得られる本発明のベオミセス酸含有抽出物は、メラニン生成抑制作用を有し、美白剤又は美白用組成物の有効成分として有用である。したがって、本発明は当該ベオミセス酸含有抽出物を含有する美白剤及び美白用組成物を提供することができる。
また、本発明の方法によれば、ベオミセス酸の溶解性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】試験例２において、ベオミセス酸を添加し培養した皮膚シートの写真である。
【図２】試験例２において、ベオミセス酸を添加した皮膚シート中のメラニン量（相対値％）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のベオミセス酸含有抽出物の製造方法は、ベオミセス酸を含有する原料からベオミセス酸含有抽出物を製造するに際して、ローマカミツレを用いることを特徴とする。ベオミセス酸含有原料とともにローマカミツレを用いることで、当該原料を単独で用いた場合と比べて抽出物中のベオミセス酸含有量が増大する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
ベオミセス酸とは下記式（１）で表される化合物で、ムシゴケ抽出物等に含まれる成分の１つである。
【００１１】
【化１】
【００１２】
１．ベオミセス酸含有抽出物の製造方法
［原料］
本発明に使用する抽出原料はベオミセス酸を含有していればよく、ベオミセス酸を含有する植物、地衣類等を用いることができる。ベオミセス酸を含有する地衣類としては、例えば、ムシゴケ、センニンゴケが挙げられる。特に、本発明では抽出原料としてムシゴケを用いることが好ましい。ムシゴケとして、学名Thamnolia vermicularis（和名はセッチャ、別名はムシゴケ）であるムシゴケ科ムシゴケ属の地衣類、又は、学名Thamnolia Subuliformis（和名はトキワムシゴケ）であるムシゴケ科ムシゴケ属の地衣類を用いることができる。好ましくは、セッチャ（Thamnolia vermicularis）を用いる。
本発明においては、上記ベオミセス酸含有原料を二種以上混合して用いてもよく、単独で用いてもよい。
本発明では、上記ベオミセス酸含有原料とともにローマカミツレを用いる。本発明で用いるローマカミツレとは、キク科の植物で、学名はAnthemis nobilis L.である。
これらの植物や地衣類は市販品を使用することもできる。また、本発明では上記植物や地衣類の類縁種を用いることもできる。
【００１３】
ベオミセス酸含有原料としてムシゴケを使用する場合、ムシゴケの任意の部位（全体、全草、地衣体、枝状体、葉状体、子実体等）を用いることができ、各部位を複数組み合わせて用いてもよい。好ましくは、地衣体、枝状体を用いる。
ローマカミツレについても任意の部位（全木、全草、根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、果実、種子、果皮、莢、芽、花穂、心材等）を用いることができ、各部位を複数組み合わせて用いてもよい。好ましくは、花を用いる。
抽出に用いるムシゴケ等のベオミセス酸含有原料、ローマカミツレは生のままでもよく、抽出効率を高めるために、乾燥、細断、粉砕などの処理を施したものであってもよい。
【００１４】
ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとの使用比率は、ベオミセス酸高含有の抽出物が得られるのであればよく特に限定されない。好ましくは、ベオミセス酸含有原料：ローマカミツレが質量比で、１：０．５〜１：１００であり、より好ましくは１：１〜１：１０である。
【００１５】
本発明の好ましい態様としては、ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを溶媒で抽出し、ベオミセス酸含有抽出物を得る方法が挙げられる。抽出は、あらかじめベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを抽出槽に入れ、溶媒で抽出する方法、ローマカミツレエキスを用いてベオミセス酸含有原料を抽出処理する方法、ベオミセス酸含有抽出物を調製中にローマカミツレエキスを加える方法などが挙げられる。好ましくは、ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを同一溶媒（例えば後述の溶媒など）で抽出する方法であり、より好ましくは、ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを同じ抽出槽に入れ、同一溶媒中で抽出する方法である。
【００１６】
［抽出溶媒］
抽出溶媒としては、ベオミセス酸含有原料に含まれるベオミセス酸を抽出しうるものであればよく、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ブチレングリコール等の多価アルコール類等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
特に、ベオミセス酸は含水１，３−ブチレングリコール（１，３−ブタンジオール）への溶解性が低いため、抽出溶媒として１，３−ブチレングリコールを使用することで本発明の効果がより発揮され、好ましい。また、１，３−ブチレングリコールは、低刺激性であり、使用感もよいため化粧品等の皮膚外用剤用の溶媒として好ましく用いられるものである。本発明のベオミセス酸含有抽出物は、後述のように美白作用を有しており、化粧料等に美白剤として配合しうる。そのため、１，３−ブチレングリコールを抽出溶媒として得られたベオミセス酸含有抽出物は、化粧品等の用途に直接利用可能で、かつ少量で優れた美白作用を奏しうるものである。
【００１７】
抽出溶媒の濃度及び使用量は特に限定されず、抽出原料の使用量や乾燥状態等により適宜選択することができる。美白効果の点からは、抽出物中のベオミセス酸濃度が１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ程度であることが好ましく、これを満たすように溶媒の濃度及び使用量を選択することが好ましい。具体的には、ベオミセス酸含有原料に対し１〜４００倍量（質量比）の溶媒を使用することが好ましく、１０〜４００倍量がより好ましく、５０〜２００倍量がさらに好ましい。
ブチレングリコールを用いる場合、濃度が４０％〜６０％のものを用いることが好ましい。また、使用量はベオミセス酸含有原料１ｇに対して１０〜４００ｍＬ程度が好ましく、５０〜２００ｍＬ程度が好ましい。
なお、本発明においてｐｐｍは、特に限定がない限り質量基準である。また、本発明において溶媒濃度は特に限定がない限り容量（ｖ／ｖ）基準である。
【００１８】
［抽出方法］
上記抽出溶媒で、ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを抽出する。抽出条件としては、地衣類や植物の抽出に用いられる通常の条件を適応することができ、特に制限はない。具体的には、抽出温度０〜１００℃程度、好ましくは３〜１００℃、より好ましくは２０〜８０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃で、数分間〜数週間程度、好ましくは１時間〜数週間、より好ましくは１日〜３０日間程度で浸漬又は加熱還流することが挙げられる。また、抽出効率を上げる為、併せて攪拌を行ったり、溶媒中でホモジナイズ処理を行ってもよい。
上記抽出工程のあと、必要に応じて、さらに適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留等により活性の高い画分を分画してもよい。
本発明の製造方法により得られる抽出物には、このようにして得られた各種抽出物、その希釈液、その濃縮液、その精製物又はそれらの乾燥末等が包含される。
【００１９】
２．ベオミセス酸含有抽出物
上述の方法により得られる抽出物はベオミセス酸を含有する。ベオミセス酸はメラニン生成抑制作用を有し、これを含有する本発明の抽出物は優れた美白作用を奏する。本発明の抽出物に含まれるベオミセス酸は、ベオミセス酸含有原料由来の成分である。ベオミセス酸がメラニン生成抑制作用を奏することは従来知られておらず、本発明者らにより得られた新しい知見である。
さらに、本発明の抽出物は、ムシゴケ等のベオミセス酸含有原料を単独で抽出して得られる抽出物とは組成が異なり、抽出物中のベオミセス酸含有量が有意に増大している。本発明のベオミセス酸含有抽出物は、同じ抽出条件で同量のベオミセス酸含有原料を単独で抽出した場合と比べて、抽出物中のベオミセス酸濃度が高い抽出物である。ベオミセス酸含有量の高い本発明の抽出物は、ベオミセス酸含有原料の単独抽出物と比べて一段と高い美白効果を奏する。
また、本発明の抽出物は低温下での溶解性（保存性）にも優れる。ベオミセス酸含有原料を単独で抽出した場合、成分の変性等を防止するために低温保存すると、ベオミセス酸の溶解性が低下して析出が見られた。これに対し、本発明の抽出物は、抽出後に低温下で長期間保存しても、ベオミセス酸の溶解性が低下しにくく、高い含有量を保つことができる。実際的な化粧品用途等への使用を考慮すると、製造適性や効率面で利点となる。
なお、本発明において「美白（作用、効果）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【００２０】
本発明の抽出物中のベオミセス酸濃度は特に限定されないが、美白作用を効果的に得るためには、濃度が１ｐｐｍ以上であることが好ましく、１〜１０００ｐｐｍ程度であることがより好ましい。
【００２１】
３．美白剤・美白用組成物
本発明のベオミセス酸含有抽出物は、そのまま美白剤として用いることができる。或いは、該抽出物を有効成分として配合し美白用組成物とすることもできる。
組成物とする場合、当該抽出物に、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤などを添加することができる。また、他の薬効成分を加えてもよい。例えば、本発明の抽出物以外の美白剤、保湿剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、色材種等を加えることができる。組成物中に含有されるベオミセス酸含有抽出物の量は特に制限されないが、当該抽出物が０．０００１〜２０質量％含まれることが好ましく、０．００１〜１０質量％含まれることがより好ましく、０．０５〜５質量％含まれることが特に好ましい。
【００２２】
本発明の美白用組成物は、皮膚外用剤の形態で使用することが好ましい。「皮膚外用剤」とは、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品等として皮膚に適用されるものを意味し、その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、ファンデーション、軟膏、シート状製品等の形態が挙げられる。
皮膚外用剤の形態で使用する場合には、本発明のベオミセス酸含有抽出物の他、通常の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば界面活性剤、油性物質、高分子化合物、防腐剤、前記以外の薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等を適宜配合できる。ベオミセス酸含有抽出物を含有する皮膚外用剤の使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ２当たり
０．１〜５μｇ、液状製剤の場合、同じく０．１〜１０μｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下の試験例及び実施例等では、ベオミセス酸含有原料としてセッチャ（Thamnolia vermicularis）を用いた。
【００２４】
試験例１．セッチャ抽出物からの成分の単離
（１）ベオミセス酸
セッチャ（新和物産社製）４１．６ｇに９５％エタノール水溶液１Ｌを加え、３０℃で３０日間抽出後、ろ過し、ろ紙上のセッチャを９５％エタノール水溶液２００ｍＬで洗浄し、最初のろ液に加え、セッチャ抽出物１１００ｍＬ（固形分２．９８ｇ）を得た。この抽出物５６ｍＬ（固形分１５１．７ｍｇ）をＨＰＬＣで分画し、ベオミセス酸２８．００ｍｇ（収率１８．５％）を得た。
単離成分の構造解析は、ＮＭＲにより行った。単離成分のＮＭＲスペクトルデータが文献で報告されているベオミセス酸（日本食品化学学会誌（日食化誌）Vol.14(2)，2007参照）のスペクトルデータとほぼ一致したことから、単離された成分はベオミセス酸であると同定した。ＮＭＲによる構造解析の結果を表１に示す。なお、表中のＭｅはメチル基を表す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
（２）スクァマト酸
上記（１）で得られたセッチャ抽出物２４ｍＬ（固形分６５．０４ｍｇ）をＨＰＬＣで分画したところ、スクァマト酸５．６ｍｇ（収率８．６１％）が得られた。単離成分の構造解析は、ＮＭＲにより行った。単離成分のＮＭＲスペクトルデータが文献で報告されているスクァマト酸（Yunnan Zhiwu Yanjiu，24(4)，525-530(2002)）のスペクトルデータとほぼ一致したことから、単離された成分はスクァマト酸であると同定した。ＮＭＲによる構造解析の結果を表２に示す。なお、表中のＭｅはメチル基を表す。
【００２７】
【表２】
【００２８】
試験例２．セッチャ由来成分のメラニン産生抑制作用の検証
試験例１で単離したベオミセス酸を用いて、皮膚におけるメラニン産生の抑制作用について検証した。
メラノサイトを含む３次元培養皮膚モデル（ＭＥＬ３００Ａ；クラボウ社）を、メラノサイト活性化因子であるエンドセリン−１（ＥＴ-１）とＳＣＦ（幹細胞増殖因子）とを終濃度１０ｎＭで添加したEPI-100-NMM113培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。培養初日より、ベオミセス酸を終濃度５０μＭで添加した（Ｎ＝２）。培地交換は３日に一度行った。１４日後に、皮膚モデルをＰＢＳにて洗浄し、写真撮影を行った。結果を図１に示す。その後、アラマーブルー試薬を用いて細胞呼吸活性を測定し、上記終濃度が細胞毒性を示さない濃度であることを確認した（結果は図示せず）。
続いて皮膚モデルカップをＰＢＳで洗浄し、ピンセットで皮膚シートを剥離してチューブに移し、ＰＢＳで３回洗浄した。５０％エタノールで３回、１００％エタノールで２回洗浄した後、室温で一晩放置し、完全に乾燥させた。２Ｍ ＮａＯＨを２００μＬ加えた後１００℃で溶解させ、遠心分離によって得られた上清について４０５ｎｍの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。結果を図２に示す。メラニン量は、コントロールのメラニン量を１００とした場合の相対値（％）で示した。なお、コントロールとして、エタノール又は１０〜９５ｖ／ｖ％の含水エタノール溶液を終濃度０．１〜０．５ｖ／ｖ％で添加したものを用いた。
【００２９】
図１から明らかなように、ベオミセス酸を添加した系では、コントロールの系に比べて皮膚の色が明るく、メラニン産生による皮膚の黒化が抑えられていた。また、図２に示すように、ベオミセス酸を添加した系では、細胞毒性を示さない添加濃度において、コントロールの系に比べて皮膚組織中のメラニン量が４５％以上も低下していた。
【００３０】
続いて、試験例１で単離したスクァマト酸を用いて、上記と同様にメラニン産生抑制作用について検証した。スクァマト酸を添加した系では、ベオミセス酸のような有意なメラニン量の低下は見られなかった。
【００３１】
実施例１．ベオミセス酸含有抽出物の製造
表３に示す比率でセッチャ（新和物産社製）とローマカミツレ（新和物産社製）とを混合した混合物に、６０％又は４０％１，３−ブタンジオール４００ｍＬをそれぞれ加えて、４０℃で４日間静置し、セッチャ‐ローマカミツレ混合抽出エキスを得た。
次いで、これらのエキス中のベオミセス酸含有量を、ＨＰＬＣを用いて下記の条件で分析した。結果を表３に示す。表中のベオミセス酸含有比は、６０％又は４０％１，３−ブタンジオールを用いた抽出それぞれにおいて、セッチャ単独抽出物のベオミセス酸濃度を１として各エキスのベオミセス酸含有量を相対値で示したものである。
［ベオミセス酸分析条件］
・使用カラム：Inertsil ODS-3（3＊150mm）
・移動相：A)0.1％TFA H2O
B)0.1％TFA MeOH
70％ B液isocratic
・検出波長：254nm
・流速：0.6mL/min
上記条件で、ベオミセス酸の保持時間１１分
【００３２】
【表３】
【００３３】
表３から明らかなように、セッチャを単独抽出して得られた抽出物（試料１及び６）と比較して、セッチャとローマカミツレとの混合抽出による抽出物（試料２〜５及び７）ではベオミセス酸濃度が大幅に高くなっていることがわかった。
【００３４】
実施例２．ベオミセス酸含有抽出物の低温保存後の溶解性の検証
表４に示す比率でセッチャ（新和物産社製）とローマカミツレ（新和物産社製）とを混合した混合物に、６０％１，３−ブタンジオール４００ｍＬを加えて、４０℃で４日間静置し、セッチャ‐ローマカミツレ混合抽出エキスを得た。
得られたエキス中のベオミセス酸含有量を、ＨＰＬＣを用いて上記実施例１と同様の条件にて分析した。次いで、得られたエキスを−５℃で２週間保存後、メンブランフィルターによりろ過を行った。得られたろ液中のベオミセス酸含有量を、ＨＰＬＣを用いて同様に分析した。
【００３５】
【表４】
【００３６】
表４から明らかなように、セッチャを単独抽出して得られた抽出物（試料１及び３）では、低温保存後のベオミセス酸濃度がほぼ１／２と大幅に低下していた。また、低温保存後の抽出物には白濁又は析出が見られた。このことから、単独抽出の抽出物では、低温下においてベオミセス酸の溶解性が大きく低下すると考えられる。これに対し、セッチャとローマカミツレとの混合抽出による抽出物（試料２及び４）では、低温保存後のベオミセス酸濃度が相対的に高かった。また、抽出物に白濁又は析出は見られなかった。
なお、試料５及び６では低温保存後のベオミセス酸濃度が同程度であるが、これはセッチャの量に対して溶媒量が多いため、単独抽出時と混合抽出時とのベオミセス酸の溶解性に差が出ないためと考えられる。
【００３７】
参考例１．ローマカミツレ由来成分の含有量分析
下記の表５に示す比率でセッチャ（新和物産社製）とローマカミツレ（新和物産社製）とを混合した生薬混合物に、６０％又は４０％１，３−ブタンジオール４００ｍＬをそれぞれ加えて４０℃で４日間静置し、セッチャ−ローマカミツレ混合抽出エキスを得た。次いで、抽出物中のアピゲニン含有量をHPLCを用いて下記の条件にて分析した。
なお、アピゲニンはローマカミツレに含まれるフラボノイド成分の１つである。
【００３８】
［アピゲニン分析条件］
・使用カラム：Inertsil ODS-3（3＊150mm）
・移動相：A)0.1％TFA H2O
B)0.1％TFA MeOH
50％ B液isocratic
・検出波長：340nm
・流速：0.5mL/min
上記条件で、アピゲニンの保持時間１４分
【００３９】
【表５】
【００４０】
表５から明らかなように、ローマカミツレを単独抽出して得られた抽出物（試料１，３，５，７及び９）と、セッチャとローマカミツレとの混合抽出による抽出物（試料２，４，６，８及び１０）との間でアピゲニン濃度に有意な差異は認められなかった。
【００４１】
実施例２．ベオミセス酸含有抽出物の美白作用（メラニン生成抑制作用）の検証
セッチャ‐ローマカミツレ混合抽出物の美白作用を、下記のドーパオキシダーゼ活性評価系によって検証した。ドーパオキシダーゼ活性は、チロシナーゼ酵素活性阻害作用をもつメラニン産生抑制素材を評価する際にその指標として用いられているものである（Wrathall JR．et al.，JCB 1973 57：406-423参照）。この手法によれば、メラノサイト内のドーパオキシダーゼ活性を抑制することで、最終的な生合成産物であるメラニンの産出を抑制する物質を評価することができる。
【００４２】
ドーパオキシダーゼ活性の測定
９６穴プレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイト１００μｌを１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように各穴に播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human Melanocyte Growth Supplement）（いずれもCascade Biologics社製）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、メラノサイト活性化因子エンドセリン−１（ＥＴ−１）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を、それぞれ培地中終濃度で１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3になるように添加した。
また、実施例１の試料２で得られたベオミセス酸高含有抽出物（セッチャ‐ローマカミツレ混合抽出物）の２倍希釈品を終濃度０．５０質量％となるように添加した（ベオミセス酸濃度：０．３２ｐｐｍ）。最終的に培地量は２００μｌ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。
【００４３】
なお、培地には、以下の添加物も添加されている。
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子） ３ｎｇ／ｍｌ
ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液） ０．２体積％
ＦＢＳ（ウシ胎児血清） ０．５体積％
ハイドロコーチゾン ５×１０-4ｍｏｌ／ｍ3
インスリン ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン ５μｇ／ｍｌ
ヘパリン ５μｇ／ｍｌ
培養終了後、メラノサイトをＣａ2+およびＭｇ2+を除去したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を２０μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシターゼ活性の測定を行った。ドーパオキシダーゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（例えば、Winder A．J.，Harris H.，Eur．J．Biochem.，198，317-326，1991参照）を参考に、以下のように行った。
【００４４】
可溶化した細胞溶液の各ｗｅｌｌに、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μｌ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。
結果を表６に示す。なお、ドーパオキシダーゼ活性の値は、試料を添加しなかった場合の吸光度に対する相対値で示している。
【００４５】
【表６】
【００４６】
表６の結果から明らかなように、セッチャとローマカミツレとの混合抽出エキスを添加した系では、添加しなかった系と比べてドーパオキシダーゼ活性が大きく低下することがわかった。前述のように、ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生合成に関するチロシナーゼの酵素活性の指標として用いられろ。すなわち、本発明のベオミセス酸含有抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に阻害することでメラニン産生を抑制でき、美白成分として有用であることがわかる。
【００４７】
処方例
前記実施例１で得られたベオミセス酸含有抽出物を有効成分として、下記に示す組成のローション、乳液、美容液、クリーム、パックを常法により各々調製した。
【００４８】
１．ローションの調製
（組成） （配合：質量％）
１，３−ブチレングリコール ８．０
グリセリン ５．０
エタノール ３．０
ベオミセス酸含有抽出物（実施例１の試料２） ３．０
ローマカミツレエキス ３．０
キキョウエキス １．０
チョウジエキス １．０
キサンタンガム ０．１
ヒアルロン酸 ０．１
リン酸二ナトリウム ０．１
リン酸二水素ナトリウム ０．１
アスコルビン酸２−グルコシド ２．０
精製水 残部
香料 適量
防腐剤 適量
【００４９】
２．乳液の調製
（組成） （配合：質量％）
ベオミセス酸含有抽出物（実施例１の試料２） ５．０
ローマカミツレエキス １．０
キキョウエキス １．０
アルテアエキス ２．０
スクワラン ３．０
オリブ油 ３．０
グリセリン ５．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：40） １．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
水酸化カリウム ０．１
キサンタンガム ０．２
エデト酸二ナトリウム ０．０２
精製水 残部
防腐剤 適量
【００５０】
３．美容液の調製
（組成） （配合：質量％）
ベオミセス酸含有抽出物（実施例１の試料２） １．０
ローマカミツレエキス １．０
キキョウエキス １．０
チョウジエキス １．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．２
水酸化カリウム ０．２
キサンタンガム ０．１
ヒアルロン酸 ０．２
クエン酸ナトリウム ０．１５
クエン酸 ０．０３
グリセリン １０．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
エデト酸二ナトリム ０．０５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００５１】
４．クリームの調製
（組成） （配合：質量％）
ベオミセス酸含有抽出物（実施例１の試料２） ３．０
ローマカミツレエキス ２．０
キキョウエキス ２．０
チョウジエキス ２．０
メチルポリシロキサン ３．０
スクワラン ２．０
ジカプリン酸ネオペンチルグリコール ３．０
ステアリルアルコール １．５
セタノール １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：60） ０．５
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．３
水酸化カリウム ０．１５
キサンタンガム ０．１
エデト酸二ナトリウム ０．０５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００５２】
５．パックの調製
（組成） （配合：質量％）
ベオミセス酸含有抽出物（実施例１の試料２） ３．０
ローマカミツレエキス ２．０
キキョウエキス １．０
ジプロピレングリコール ３．０
ポリエチレングリコール（平均分子量１５００） ２．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
グリセリン ５．０
クエン酸ナトリウム ０．５
ポリビニルアルコール １０．０
乳酸 ０．３
ポリオキシエチレンデシルテトレデシルエーテル ０．５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベオミセス酸含有抽出物の製造方法に関する。また、本発明は当該方法により得られるベオミセス酸含有抽出物、並びに該抽出物を含有する美白剤及び美白用組成物に関する。さらに、本発明はベオミセス酸の溶解性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、紫外線による皮膚の黒化、シミ・ソバカス等の色素沈着は、メラノサイトが日光曝露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素により活性化され、その結果、メラノサイトで合成されたメラニン色素が皮膚内に異常沈着することにより発生する。これを防止又は改善するため、化粧料等にアスコルビン酸、ハイドロキノン誘導体、コウジ酸、胎盤抽出物等のメラニン生成抑制作用を有する美白成分を配合することが行われている。
しかしながら、これらの物質の奏する美白作用は、効果の点で未だ充分に満足のいくものとはいえず、より高い美白効果を持つ素材の探索が進められている。例えば、植物等の抽出物から美白作用を有するとされるエキスが種々報告されている。ローマカミツレの抽出物（特許文献１）及びムシゴケの抽出物（特許文献２）は、メラニン生成抑制作用を有するとの報告がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１１７６１３号公報
【特許文献２】特開２００６−１８２７３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規な美白成分であるベオミセス酸を含有する抽出物の製造方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該製造方法によって得られるベオミセス酸含有抽出物を提供することを課題とする。さらに本発明は、当該ベオミセス酸含有抽出物を含有する美白剤及び美白用組成物を提供することを課題とする。
また、本発明はベオミセス酸の溶解性を向上させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題に鑑み、植物等の抽出物からの新規美白成分の探求と、当該成分を高濃度に含有しうる抽出方法について鋭意検討を行った。その結果、ムシゴケ抽出物に含まれる成分の１つであるベオミセス酸が、メラニン生成を効果的に抑制しうることを見出し、新規の美白成分として有用であるとの知見を得た。さらに、ムシゴケをローマカミツレと共に抽出して得られた抽出物では、ムシゴケの単独抽出で得られる抽出物と比べてベオミセス酸の含有量が有意に増大していること、及び保存後においてもベオミセス酸の溶解性が高いことを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、ベオミセス酸を含有する原料からベオミセス酸含有抽出物を製造するにあたり、ローマカミツレを用いることを特徴とするベオミセス酸含有抽出物の製造方法に関する。
また、本発明は、当該方法により得られるベオミセス酸含有抽出物に関する。
また、本発明は、当該ベオミセス酸含有抽出物からなる美白剤及びそれを有効成分として含有する美白用組成物に関する。
さらに、本発明は、ローマカミツレを用いてベオミセス酸の溶媒への溶解性を向上させる方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の製造方法によれば、新規の美白成分であるベオミセス酸を高濃度に含有する抽出物を製造することができる。当該方法によって得られる本発明のベオミセス酸含有抽出物は、メラニン生成抑制作用を有し、美白剤又は美白用組成物の有効成分として有用である。したがって、本発明は当該ベオミセス酸含有抽出物を含有する美白剤及び美白用組成物を提供することができる。
また、本発明の方法によれば、ベオミセス酸の溶解性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】試験例２において、ベオミセス酸を添加し培養した皮膚シートの写真である。
【図２】試験例２において、ベオミセス酸を添加した皮膚シート中のメラニン量（相対値％）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のベオミセス酸含有抽出物の製造方法は、ベオミセス酸を含有する原料からベオミセス酸含有抽出物を製造するに際して、ローマカミツレを用いることを特徴とする。ベオミセス酸含有原料とともにローマカミツレを用いることで、当該原料を単独で用いた場合と比べて抽出物中のベオミセス酸含有量が増大する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
ベオミセス酸とは下記式（１）で表される化合物で、ムシゴケ抽出物等に含まれる成分の１つである。
【００１１】
【化１】
【００１２】
１．ベオミセス酸含有抽出物の製造方法
［原料］
本発明に使用する抽出原料はベオミセス酸を含有していればよく、ベオミセス酸を含有する植物、地衣類等を用いることができる。ベオミセス酸を含有する地衣類としては、例えば、ムシゴケ、センニンゴケが挙げられる。特に、本発明では抽出原料としてムシゴケを用いることが好ましい。ムシゴケとして、学名Thamnolia vermicularis（和名はセッチャ、別名はムシゴケ）であるムシゴケ科ムシゴケ属の地衣類、又は、学名Thamnolia Subuliformis（和名はトキワムシゴケ）であるムシゴケ科ムシゴケ属の地衣類を用いることができる。好ましくは、セッチャ（Thamnolia vermicularis）を用いる。
本発明においては、上記ベオミセス酸含有原料を二種以上混合して用いてもよく、単独で用いてもよい。
本発明では、上記ベオミセス酸含有原料とともにローマカミツレを用いる。本発明で用いるローマカミツレとは、キク科の植物で、学名はAnthemis nobilis L.である。
これらの植物や地衣類は市販品を使用することもできる。また、本発明では上記植物や地衣類の類縁種を用いることもできる。
【００１３】
ベオミセス酸含有原料としてムシゴケを使用する場合、ムシゴケの任意の部位（全体、全草、地衣体、枝状体、葉状体、子実体等）を用いることができ、各部位を複数組み合わせて用いてもよい。好ましくは、地衣体、枝状体を用いる。
ローマカミツレについても任意の部位（全木、全草、根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、果実、種子、果皮、莢、芽、花穂、心材等）を用いることができ、各部位を複数組み合わせて用いてもよい。好ましくは、花を用いる。
抽出に用いるムシゴケ等のベオミセス酸含有原料、ローマカミツレは生のままでもよく、抽出効率を高めるために、乾燥、細断、粉砕などの処理を施したものであってもよい。
【００１４】
ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとの使用比率は、ベオミセス酸高含有の抽出物が得られるのであればよく特に限定されない。好ましくは、ベオミセス酸含有原料：ローマカミツレが質量比で、１：０．５〜１：１００であり、より好ましくは１：１〜１：１０である。
【００１５】
本発明の好ましい態様としては、ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを溶媒で抽出し、ベオミセス酸含有抽出物を得る方法が挙げられる。抽出は、あらかじめベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを抽出槽に入れ、溶媒で抽出する方法、ローマカミツレエキスを用いてベオミセス酸含有原料を抽出処理する方法、ベオミセス酸含有抽出物を調製中にローマカミツレエキスを加える方法などが挙げられる。好ましくは、ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを同一溶媒（例えば後述の溶媒など）で抽出する方法であり、より好ましくは、ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを同じ抽出槽に入れ、同一溶媒中で抽出する方法である。
【００１６】
［抽出溶媒］
抽出溶媒としては、ベオミセス酸含有原料に含まれるベオミセス酸を抽出しうるものであればよく、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ブチレングリコール等の多価アルコール類等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
特に、ベオミセス酸は含水１，３−ブチレングリコール（１，３−ブタンジオール）への溶解性が低いため、抽出溶媒として１，３−ブチレングリコールを使用することで本発明の効果がより発揮され、好ましい。また、１，３−ブチレングリコールは、低刺激性であり、使用感もよいため化粧品等の皮膚外用剤用の溶媒として好ましく用いられるものである。本発明のベオミセス酸含有抽出物は、後述のように美白作用を有しており、化粧料等に美白剤として配合しうる。そのため、１，３−ブチレングリコールを抽出溶媒として得られたベオミセス酸含有抽出物は、化粧品等の用途に直接利用可能で、かつ少量で優れた美白作用を奏しうるものである。
【００１７】
抽出溶媒の濃度及び使用量は特に限定されず、抽出原料の使用量や乾燥状態等により適宜選択することができる。美白効果の点からは、抽出物中のベオミセス酸濃度が１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ程度であることが好ましく、これを満たすように溶媒の濃度及び使用量を選択することが好ましい。具体的には、ベオミセス酸含有原料に対し１〜４００倍量（質量比）の溶媒を使用することが好ましく、１０〜４００倍量がより好ましく、５０〜２００倍量がさらに好ましい。
ブチレングリコールを用いる場合、濃度が４０％〜６０％のものを用いることが好ましい。また、使用量はベオミセス酸含有原料１ｇに対して１０〜４００ｍＬ程度が好ましく、５０〜２００ｍＬ程度が好ましい。
なお、本発明においてｐｐｍは、特に限定がない限り質量基準である。また、本発明において溶媒濃度は特に限定がない限り容量（ｖ／ｖ）基準である。
【００１８】
［抽出方法］
上記抽出溶媒で、ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを抽出する。抽出条件としては、地衣類や植物の抽出に用いられる通常の条件を適応することができ、特に制限はない。具体的には、抽出温度０〜１００℃程度、好ましくは３〜１００℃、より好ましくは２０〜８０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃で、数分間〜数週間程度、好ましくは１時間〜数週間、より好ましくは１日〜３０日間程度で浸漬又は加熱還流することが挙げられる。また、抽出効率を上げる為、併せて攪拌を行ったり、溶媒中でホモジナイズ処理を行ってもよい。
上記抽出工程のあと、必要に応じて、さらに適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留等により活性の高い画分を分画してもよい。
本発明の製造方法により得られる抽出物には、このようにして得られた各種抽出物、その希釈液、その濃縮液、その精製物又はそれらの乾燥末等が包含される。
【００１９】
２．ベオミセス酸含有抽出物
上述の方法により得られる抽出物はベオミセス酸を含有する。ベオミセス酸はメラニン生成抑制作用を有し、これを含有する本発明の抽出物は優れた美白作用を奏する。本発明の抽出物に含まれるベオミセス酸は、ベオミセス酸含有原料由来の成分である。ベオミセス酸がメラニン生成抑制作用を奏することは従来知られておらず、本発明者らにより得られた新しい知見である。
さらに、本発明の抽出物は、ムシゴケ等のベオミセス酸含有原料を単独で抽出して得られる抽出物とは組成が異なり、抽出物中のベオミセス酸含有量が有意に増大している。本発明のベオミセス酸含有抽出物は、同じ抽出条件で同量のベオミセス酸含有原料を単独で抽出した場合と比べて、抽出物中のベオミセス酸濃度が高い抽出物である。ベオミセス酸含有量の高い本発明の抽出物は、ベオミセス酸含有原料の単独抽出物と比べて一段と高い美白効果を奏する。
また、本発明の抽出物は低温下での溶解性（保存性）にも優れる。ベオミセス酸含有原料を単独で抽出した場合、成分の変性等を防止するために低温保存すると、ベオミセス酸の溶解性が低下して析出が見られた。これに対し、本発明の抽出物は、抽出後に低温下で長期間保存しても、ベオミセス酸の溶解性が低下しにくく、高い含有量を保つことができる。実際的な化粧品用途等への使用を考慮すると、製造適性や効率面で利点となる。
なお、本発明において「美白（作用、効果）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【００２０】
本発明の抽出物中のベオミセス酸濃度は特に限定されないが、美白作用を効果的に得るためには、濃度が１ｐｐｍ以上であることが好ましく、１〜１０００ｐｐｍ程度であることがより好ましい。
【００２１】
３．美白剤・美白用組成物
本発明のベオミセス酸含有抽出物は、そのまま美白剤として用いることができる。或いは、該抽出物を有効成分として配合し美白用組成物とすることもできる。
組成物とする場合、当該抽出物に、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤などを添加することができる。また、他の薬効成分を加えてもよい。例えば、本発明の抽出物以外の美白剤、保湿剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、色材種等を加えることができる。組成物中に含有されるベオミセス酸含有抽出物の量は特に制限されないが、当該抽出物が０．０００１〜２０質量％含まれることが好ましく、０．００１〜１０質量％含まれることがより好ましく、０．０５〜５質量％含まれることが特に好ましい。
【００２２】
本発明の美白用組成物は、皮膚外用剤の形態で使用することが好ましい。「皮膚外用剤」とは、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品等として皮膚に適用されるものを意味し、その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、ファンデーション、軟膏、シート状製品等の形態が挙げられる。
皮膚外用剤の形態で使用する場合には、本発明のベオミセス酸含有抽出物の他、通常の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば界面活性剤、油性物質、高分子化合物、防腐剤、前記以外の薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等を適宜配合できる。ベオミセス酸含有抽出物を含有する皮膚外用剤の使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ２当たり
０．１〜５μｇ、液状製剤の場合、同じく０．１〜１０μｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下の試験例及び実施例等では、ベオミセス酸含有原料としてセッチャ（Thamnolia vermicularis）を用いた。
【００２４】
試験例１．セッチャ抽出物からの成分の単離
（１）ベオミセス酸
セッチャ（新和物産社製）４１．６ｇに９５％エタノール水溶液１Ｌを加え、３０℃で３０日間抽出後、ろ過し、ろ紙上のセッチャを９５％エタノール水溶液２００ｍＬで洗浄し、最初のろ液に加え、セッチャ抽出物１１００ｍＬ（固形分２．９８ｇ）を得た。この抽出物５６ｍＬ（固形分１５１．７ｍｇ）をＨＰＬＣで分画し、ベオミセス酸２８．００ｍｇ（収率１８．５％）を得た。
単離成分の構造解析は、ＮＭＲにより行った。単離成分のＮＭＲスペクトルデータが文献で報告されているベオミセス酸（日本食品化学学会誌（日食化誌）Vol.14(2)，2007参照）のスペクトルデータとほぼ一致したことから、単離された成分はベオミセス酸であると同定した。ＮＭＲによる構造解析の結果を表１に示す。なお、表中のＭｅはメチル基を表す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
（２）スクァマト酸
上記（１）で得られたセッチャ抽出物２４ｍＬ（固形分６５．０４ｍｇ）をＨＰＬＣで分画したところ、スクァマト酸５．６ｍｇ（収率８．６１％）が得られた。単離成分の構造解析は、ＮＭＲにより行った。単離成分のＮＭＲスペクトルデータが文献で報告されているスクァマト酸（Yunnan Zhiwu Yanjiu，24(4)，525-530(2002)）のスペクトルデータとほぼ一致したことから、単離された成分はスクァマト酸であると同定した。ＮＭＲによる構造解析の結果を表２に示す。なお、表中のＭｅはメチル基を表す。
【００２７】
【表２】
【００２８】
試験例２．セッチャ由来成分のメラニン産生抑制作用の検証
試験例１で単離したベオミセス酸を用いて、皮膚におけるメラニン産生の抑制作用について検証した。
メラノサイトを含む３次元培養皮膚モデル（ＭＥＬ３００Ａ；クラボウ社）を、メラノサイト活性化因子であるエンドセリン−１（ＥＴ-１）とＳＣＦ（幹細胞増殖因子）とを終濃度１０ｎＭで添加したEPI-100-NMM113培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。培養初日より、ベオミセス酸を終濃度５０μＭで添加した（Ｎ＝２）。培地交換は３日に一度行った。１４日後に、皮膚モデルをＰＢＳにて洗浄し、写真撮影を行った。結果を図１に示す。その後、アラマーブルー試薬を用いて細胞呼吸活性を測定し、上記終濃度が細胞毒性を示さない濃度であることを確認した（結果は図示せず）。
続いて皮膚モデルカップをＰＢＳで洗浄し、ピンセットで皮膚シートを剥離してチューブに移し、ＰＢＳで３回洗浄した。５０％エタノールで３回、１００％エタノールで２回洗浄した後、室温で一晩放置し、完全に乾燥させた。２Ｍ ＮａＯＨを２００μＬ加えた後１００℃で溶解させ、遠心分離によって得られた上清について４０５ｎｍの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。結果を図２に示す。メラニン量は、コントロールのメラニン量を１００とした場合の相対値（％）で示した。なお、コントロールとして、エタノール又は１０〜９５ｖ／ｖ％の含水エタノール溶液を終濃度０．１〜０．５ｖ／ｖ％で添加したものを用いた。
【００２９】
図１から明らかなように、ベオミセス酸を添加した系では、コントロールの系に比べて皮膚の色が明るく、メラニン産生による皮膚の黒化が抑えられていた。また、図２に示すように、ベオミセス酸を添加した系では、細胞毒性を示さない添加濃度において、コントロールの系に比べて皮膚組織中のメラニン量が４５％以上も低下していた。
【００３０】
続いて、試験例１で単離したスクァマト酸を用いて、上記と同様にメラニン産生抑制作用について検証した。スクァマト酸を添加した系では、ベオミセス酸のような有意なメラニン量の低下は見られなかった。
【００３１】
実施例１．ベオミセス酸含有抽出物の製造
表３に示す比率でセッチャ（新和物産社製）とローマカミツレ（新和物産社製）とを混合した混合物に、６０％又は４０％１，３−ブタンジオール４００ｍＬをそれぞれ加えて、４０℃で４日間静置し、セッチャ‐ローマカミツレ混合抽出エキスを得た。
次いで、これらのエキス中のベオミセス酸含有量を、ＨＰＬＣを用いて下記の条件で分析した。結果を表３に示す。表中のベオミセス酸含有比は、６０％又は４０％１，３−ブタンジオールを用いた抽出それぞれにおいて、セッチャ単独抽出物のベオミセス酸濃度を１として各エキスのベオミセス酸含有量を相対値で示したものである。
［ベオミセス酸分析条件］
・使用カラム：Inertsil ODS-3（3＊150mm）
・移動相：A)0.1％TFA H2O
B)0.1％TFA MeOH
70％ B液isocratic
・検出波長：254nm
・流速：0.6mL/min
上記条件で、ベオミセス酸の保持時間１１分
【００３２】
【表３】
【００３３】
表３から明らかなように、セッチャを単独抽出して得られた抽出物（試料１及び６）と比較して、セッチャとローマカミツレとの混合抽出による抽出物（試料２〜５及び７）ではベオミセス酸濃度が大幅に高くなっていることがわかった。
【００３４】
実施例２．ベオミセス酸含有抽出物の低温保存後の溶解性の検証
表４に示す比率でセッチャ（新和物産社製）とローマカミツレ（新和物産社製）とを混合した混合物に、６０％１，３−ブタンジオール４００ｍＬを加えて、４０℃で４日間静置し、セッチャ‐ローマカミツレ混合抽出エキスを得た。
得られたエキス中のベオミセス酸含有量を、ＨＰＬＣを用いて上記実施例１と同様の条件にて分析した。次いで、得られたエキスを−５℃で２週間保存後、メンブランフィルターによりろ過を行った。得られたろ液中のベオミセス酸含有量を、ＨＰＬＣを用いて同様に分析した。
【００３５】
【表４】
【００３６】
表４から明らかなように、セッチャを単独抽出して得られた抽出物（試料１及び３）では、低温保存後のベオミセス酸濃度がほぼ１／２と大幅に低下していた。また、低温保存後の抽出物には白濁又は析出が見られた。このことから、単独抽出の抽出物では、低温下においてベオミセス酸の溶解性が大きく低下すると考えられる。これに対し、セッチャとローマカミツレとの混合抽出による抽出物（試料２及び４）では、低温保存後のベオミセス酸濃度が相対的に高かった。また、抽出物に白濁又は析出は見られなかった。
なお、試料５及び６では低温保存後のベオミセス酸濃度が同程度であるが、これはセッチャの量に対して溶媒量が多いため、単独抽出時と混合抽出時とのベオミセス酸の溶解性に差が出ないためと考えられる。
【００３７】
参考例１．ローマカミツレ由来成分の含有量分析
下記の表５に示す比率でセッチャ（新和物産社製）とローマカミツレ（新和物産社製）とを混合した生薬混合物に、６０％又は４０％１，３−ブタンジオール４００ｍＬをそれぞれ加えて４０℃で４日間静置し、セッチャ−ローマカミツレ混合抽出エキスを得た。次いで、抽出物中のアピゲニン含有量をHPLCを用いて下記の条件にて分析した。
なお、アピゲニンはローマカミツレに含まれるフラボノイド成分の１つである。
【００３８】
［アピゲニン分析条件］
・使用カラム：Inertsil ODS-3（3＊150mm）
・移動相：A)0.1％TFA H2O
B)0.1％TFA MeOH
50％ B液isocratic
・検出波長：340nm
・流速：0.5mL/min
上記条件で、アピゲニンの保持時間１４分
【００３９】
【表５】
【００４０】
表５から明らかなように、ローマカミツレを単独抽出して得られた抽出物（試料１，３，５，７及び９）と、セッチャとローマカミツレとの混合抽出による抽出物（試料２，４，６，８及び１０）との間でアピゲニン濃度に有意な差異は認められなかった。
【００４１】
実施例２．ベオミセス酸含有抽出物の美白作用（メラニン生成抑制作用）の検証
セッチャ‐ローマカミツレ混合抽出物の美白作用を、下記のドーパオキシダーゼ活性評価系によって検証した。ドーパオキシダーゼ活性は、チロシナーゼ酵素活性阻害作用をもつメラニン産生抑制素材を評価する際にその指標として用いられているものである（Wrathall JR．et al.，JCB 1973 57：406-423参照）。この手法によれば、メラノサイト内のドーパオキシダーゼ活性を抑制することで、最終的な生合成産物であるメラニンの産出を抑制する物質を評価することができる。
【００４２】
ドーパオキシダーゼ活性の測定
９６穴プレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイト１００μｌを１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように各穴に播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human Melanocyte Growth Supplement）（いずれもCascade Biologics社製）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、メラノサイト活性化因子エンドセリン−１（ＥＴ−１）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を、それぞれ培地中終濃度で１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3になるように添加した。
また、実施例１の試料２で得られたベオミセス酸高含有抽出物（セッチャ‐ローマカミツレ混合抽出物）の２倍希釈品を終濃度０．５０質量％となるように添加した（ベオミセス酸濃度：０．３２ｐｐｍ）。最終的に培地量は２００μｌ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。
【００４３】
なお、培地には、以下の添加物も添加されている。
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子） ３ｎｇ／ｍｌ
ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液） ０．２体積％
ＦＢＳ（ウシ胎児血清） ０．５体積％
ハイドロコーチゾン ５×１０-4ｍｏｌ／ｍ3
インスリン ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン ５μｇ／ｍｌ
ヘパリン ５μｇ／ｍｌ
培養終了後、メラノサイトをＣａ2+およびＭｇ2+を除去したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を２０μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシターゼ活性の測定を行った。ドーパオキシダーゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（例えば、Winder A．J.，Harris H.，Eur．J．Biochem.，198，317-326，1991参照）を参考に、以下のように行った。
【００４４】
可溶化した細胞溶液の各ｗｅｌｌに、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μｌ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。
結果を表６に示す。なお、ドーパオキシダーゼ活性の値は、試料を添加しなかった場合の吸光度に対する相対値で示している。
【００４５】
【表６】
【００４６】
表６の結果から明らかなように、セッチャとローマカミツレとの混合抽出エキスを添加した系では、添加しなかった系と比べてドーパオキシダーゼ活性が大きく低下することがわかった。前述のように、ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生合成に関するチロシナーゼの酵素活性の指標として用いられろ。すなわち、本発明のベオミセス酸含有抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に阻害することでメラニン産生を抑制でき、美白成分として有用であることがわかる。
【００４７】
処方例
前記実施例１で得られたベオミセス酸含有抽出物を有効成分として、下記に示す組成のローション、乳液、美容液、クリーム、パックを常法により各々調製した。
【００４８】
１．ローションの調製
（組成） （配合：質量％）
１，３−ブチレングリコール ８．０
グリセリン ５．０
エタノール ３．０
ベオミセス酸含有抽出物（実施例１の試料２） ３．０
ローマカミツレエキス ３．０
キキョウエキス １．０
チョウジエキス １．０
キサンタンガム ０．１
ヒアルロン酸 ０．１
リン酸二ナトリウム ０．１
リン酸二水素ナトリウム ０．１
アスコルビン酸２−グルコシド ２．０
精製水 残部
香料 適量
防腐剤 適量
【００４９】
２．乳液の調製
（組成） （配合：質量％）
ベオミセス酸含有抽出物（実施例１の試料２） ５．０
ローマカミツレエキス １．０
キキョウエキス １．０
アルテアエキス ２．０
スクワラン ３．０
オリブ油 ３．０
グリセリン ５．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：40） １．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
水酸化カリウム ０．１
キサンタンガム ０．２
エデト酸二ナトリウム ０．０２
精製水 残部
防腐剤 適量
【００５０】
３．美容液の調製
（組成） （配合：質量％）
ベオミセス酸含有抽出物（実施例１の試料２） １．０
ローマカミツレエキス １．０
キキョウエキス １．０
チョウジエキス １．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．２
水酸化カリウム ０．２
キサンタンガム ０．１
ヒアルロン酸 ０．２
クエン酸ナトリウム ０．１５
クエン酸 ０．０３
グリセリン １０．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
エデト酸二ナトリム ０．０５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００５１】
４．クリームの調製
（組成） （配合：質量％）
ベオミセス酸含有抽出物（実施例１の試料２） ３．０
ローマカミツレエキス ２．０
キキョウエキス ２．０
チョウジエキス ２．０
メチルポリシロキサン ３．０
スクワラン ２．０
ジカプリン酸ネオペンチルグリコール ３．０
ステアリルアルコール １．５
セタノール １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：60） ０．５
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．３
水酸化カリウム ０．１５
キサンタンガム ０．１
エデト酸二ナトリウム ０．０５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【００５２】
５．パックの調製
（組成） （配合：質量％）
ベオミセス酸含有抽出物（実施例１の試料２） ３．０
ローマカミツレエキス ２．０
キキョウエキス １．０
ジプロピレングリコール ３．０
ポリエチレングリコール（平均分子量１５００） ２．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
グリセリン ５．０
クエン酸ナトリウム ０．５
ポリビニルアルコール １０．０
乳酸 ０．３
ポリオキシエチレンデシルテトレデシルエーテル ０．５
精製水 残部
防腐剤 適量
香料 適量
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベオミセス酸を含有する原料からベオミセス酸含有抽出物を製造するにあたり、ローマカミツレを用いることを特徴とするベオミセス酸含有抽出物の製造方法。
【請求項２】
前記ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを同一溶媒で抽出することを特徴とする、請求項１記載のベオミセス酸含有抽出物の製造方法。
【請求項３】
１，３−ブタンジオールを抽出溶媒として用いることを特徴とする、請求項１又は２記載のベオミセス酸含有抽出物の製造方法。
【請求項４】
前記ベオミセス酸含有原料がムシゴケであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のベオミセス酸含有抽出物の製造方法。
【請求項５】
前記ムシゴケがセッチャ（Thamnolia vermicularis）であることを特徴とする、請求項４記載のベオミセス酸含有抽出物の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法により得られるベオミセス酸含有抽出物。
【請求項７】
請求項６記載のベオミセス酸含有抽出物からなる美白剤。
【請求項８】
請求項７記載の美白剤を有効成分として含有する美白用組成物。
【請求項９】
ローマカミツレを用いてベオミセス酸の溶媒への溶解性を向上させる方法。
【請求項１０】
前記溶媒が１，３−ブタンジオールであることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１】
ベオミセス酸を含有する原料からベオミセス酸含有抽出物を製造するにあたり、ローマカミツレを用いることを特徴とするベオミセス酸含有抽出物の製造方法。
【請求項２】
前記ベオミセス酸含有原料とローマカミツレとを同一溶媒で抽出することを特徴とする、請求項１記載のベオミセス酸含有抽出物の製造方法。
【請求項３】
１，３−ブタンジオールを抽出溶媒として用いることを特徴とする、請求項１又は２記載のベオミセス酸含有抽出物の製造方法。
【請求項４】
前記ベオミセス酸含有原料がムシゴケであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のベオミセス酸含有抽出物の製造方法。
【請求項５】
前記ムシゴケがセッチャ（Thamnolia vermicularis）であることを特徴とする、請求項４記載のベオミセス酸含有抽出物の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法により得られるベオミセス酸含有抽出物。
【請求項７】
請求項６記載のベオミセス酸含有抽出物からなる美白剤。
【請求項８】
請求項７記載の美白剤を有効成分として含有する美白用組成物。
【請求項９】
ローマカミツレを用いてベオミセス酸の溶媒への溶解性を向上させる方法。
【請求項１０】
前記溶媒が１，３−ブタンジオールであることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【図２】
【図１】
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１２６６５４（Ｐ２０１２−１２６６５４Ａ）
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７７００３（Ｐ２０１０−２７７００３）
【出願日】平成２２年１２月１３日（２０１０．１２．１３）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１３日（２０１０．１２．１３）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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