マーカー
本発明は、ロスコビチンとして知られる候補物質２，６，９−三置換プリンを含むＣＤＫＩに対する薬力学的マーカーに関する。これらのマーカーの同定によって、インビトロ 及びインビボの両方において、ロスコビチン様活性の簡便な検出が容易となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤用の薬力学的マーカー（pharmacodynamic markers）に関する。特に、本発明は、ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）として知られる候補物質２，６，９−三置換プリン用及びロスコビチン様化合物用の薬力学的マーカーに関する。これらのマーカーの同定によって、インビトロ 及びインビボの両方において、ロスコビチン様活性の簡便な検出が容易となる。
【背景技術】
【０００２】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ）のファミリーの増加が確認されている。これらの阻害剤は多様なＣＤＫファミリーメンバーに対して様々な活性を有する。通常、これらの阻害剤はＣＤＫのＡＴＰ結合ポケットに結合する。
【０００３】
２，６，９−三置換プリンは、癌、白血病及び糸球体腎炎などの増殖性疾患の治療に使用されるＣＤＫＩとして有望な化合物の、よく研究されたクラスとなりつつある。Fischer P & Lane D (Curr Med Chem (2000), vol 7, page 1213)は、ＣＤＫＩの起源及びその発見された活性の検討を詳細に示している。特に、ロスコビチンは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９を阻害し、Ｇ１後期／Ｓ期初期及びＭ期に細胞サイクルの進行を阻止することが証明されてきた。Ｒ−ロスコビチンとして知られる化合物（Ｒ）−２−［（１−エチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリンは、国際公開番号第ＷＯ９７／２０８４２号（Meijer L et al）に初めて記載されてから、有望な抗癌剤候補として開発されてきた。
【０００４】
このような薬剤の開発においては、投与における実際の作用機序を理解し、毒性及び投与に関する監督機関の要件を満たすために、薬物動態学的調査及び薬力学的調査を広範囲に実施しなくてはならない。これらの分析は、候補薬剤の活性の特定の機序を確認するために、細胞サイクル制御系に関する複雑な生化学や、薬剤の臨床開発期間前に実施される詳細な研究に基づいて行われる。
【０００５】
薬物動態学的及び薬力学的な調査における特に有利な点は、その候補薬剤に対する特異的な活性のマーカーの同定である。
【０００６】
本発明は、表１〜１２のいずれかに記載した多くの遺伝子が、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ロスコビチンの活性に対して、特異的薬力学的（ＰＤ）マーカー、又は「バイオマーカー」として作用するという知見に関する。特に、同定された遺伝子の発現は、ロスコビチン処理後に、アップレギュレート又はダウンレギュレートされる。
【０００７】
さらに、本発明は、多くの遺伝子はタンパク質として発現し、ロスコビチン活性に対する薬力学的マーカーであるタンパク質マーカーとして作用できるという知見に関する。よって、本発明は、ロスコビチン活性に対する特異的薬力学的マーカーとしてのタンパク質マーカーの同定、及び特に２８ｋＤａ及び１４ｋＤａマーカーの同定に関する。これらのマーカーは、各々アポリポタンパク質Ａ１及びトランスサイレチンが適当である。これらのタンパク質マーカーは、ロスコビチン処理後、アップレギュレート又はダウンレギュレートする発現を有するタンパク質となるか、或いは、ロスコビチン処理前の、翻訳後修飾された形、つまり、より広い範囲若しくはより狭い範囲で、検出不可能又は検出可能の形に変化する。
【特許文献１】国際公開番号第ＷＯ９７／２０８４２号
【非特許文献１】Fischer P & Lane D (Curr Med Chem (2000), vol 7, page 1213)
【発明の開示】
【０００８】
よって、最初の態様では、
ａ）細胞、細胞群、モデル動物又はヒトがＣＤＫＩで処理されている当該細胞、細胞群、モデル動物又はヒトからサンプルつまり、「処理サンプル」を単離するステップ、及び
ｂ）未処理コントロールサンプルと比較して、処理したサンプルにおけるｉ）表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子ii）２８ｋＤａのタンパク質、若しくはiii）１４ｋＤａのタンパク質のうち、少なくとも１つの発現の変化をＣＤＫＩ活性の指標として、決定するステップ
を含む、ＣＤＫＩ活性のモニタリング方法を示している。
【０００９】
遺伝子発現を含む発現の変化の検出は、当業界で公知の方法、特に本明細書に記載したようなマイクロアレイ分析、ウェスタンブロット法又はＱＰＣＲなどのＰＣＲ法により行なうことができる。発現の変化はまた、本明細書に記載したＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの方法を用いて、さらに二次元ゲル電気泳動法などの分析手法を用いて、サンプルのタンパク質含有量を分析することにより検出できる。これらの手法は、タンパク質の別の翻訳後修飾された形において発現の変化を検出するのに特に有用である。
【００１０】
ある実施態様では、「発現の変化（altered expression）」とは、表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子の遺伝子発現の増加又は減少のことである。表１〜１２に記載した遺伝子は、ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、２０５８５、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、１８７４７、２２１４７、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ及びｍｃｌ−１から選択するのが適当である。
【００１１】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の変化は、未処理サンプルと比較して発現の減少となることが適当である。或いは、発現の変化は、未処理サンプルと比較して増加している。
【００１２】
例えば発明がエキソビボで行われた場合、ロスコビチンなどのＣＤＫＩの薬力学的調査は、好ましくは細胞群さらに好ましくは細胞培養物で行われる。好ましい細胞の型を、ＨＴ２９などの結腸腫瘍細胞株、Ａ５４９などの肺腫瘍細胞株、Ａ４９８などの腎腫瘍細胞株、ＨＴ１３などの膀胱腫瘍細胞株、ＭＣＦ７などの乳房腫瘍細胞株、ＡＮ３ＣＡなどの子宮内膜腫瘍細胞株、ＭＥＳＳＡ ＤＨ６などの子宮腫瘍細胞株、子宮肉腫細胞、Ｈｅｐ２Ｇなどの肝腫瘍細胞株、ＤＵ１４５などの前立腺腫瘍細胞株、Ｃｅｍ Ｔ細胞などのＴ細胞腫瘍細胞株、ＭｉａＰａＣａ２などの膵腫瘍細胞株から選択する。或いは、細胞は、腫瘍生検の組織学的サンプルの形であってもよい。別にまた、細胞はＰＢＭＣなどの血液細胞培養物であってもよい。
【００１３】
遺伝子発現の変化を含む発現の変化を、哺乳動物又はヒトから得たサンプルにおいてモニタリングすることが適当である。適当なサンプルには、生検、血液、尿、口腔擦過などの組織サンプルが含まれる。ある実施態様では、遺伝子発現を腫瘍細胞、特に、乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜腺癌及び前立腺癌などの腫瘍由来の細胞、並びに白血病、又はリンパ球及び好ましくはＰＢＭＣのような末梢リンパ球などの血液細胞から検出することが好ましい。他の実施態様では、タンパク質発現の変化を、哺乳動物若しくはヒトの血清又は血漿サンプルで検出する。
【００１４】
これらの好ましい実施態様では、ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、２０５８５、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、１８７４７、２２１４７、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ及びｍｃｌ−１のいずれか１つの存在を、腫瘍細胞で、特に結腸若しくは肺腫瘍由来の細胞で、又はリンパ球及び好ましくはＰＢＭＣのような末梢リンパ球などの血液細胞から検出することが好ましい。
【００１５】
好ましい実施態様では、細胞群は細胞培養物であり、好ましくはＰＢＭＣ、ＨＴ２９及びＡ５４９の細胞から選択される。
【００１６】
他の実施態様では、細胞群は、腫瘍細胞、ＰＢＭＣ又はリンパ球である。
【００１７】
サンプルは血液であることが適当である。或いは、サンプルは、レーザー・キャプチャー・マイクロ手術で得られるサンプルなどの腫瘍生検であってもよい。
【００１８】
該方法には、前記サンプルからのＲＮＡの抽出、及びＱＰＣＲ法による遺伝子発現の検出がさらに含まれることが好ましい。
【００１９】
他の実施態様では、例えばウエスタンブロット法でタンパク質生成物を検出することにより遺伝子発現を検出する。
【００２０】
他の実施態様では、「発現の変化」とは、たんぱく質発現の変化パターンである。発現の変化とは、２８ｋＤａタンパク質の減少となることが適当である。また、タンパク質発現の変化は、未処理コントロールサンプルと比較して、処理したサンプルの２８ｋＤａタンパク質若しくは１４ｋＤａタンパク質の１以上の翻訳後修飾の存在又は不在であってもよい。２８ｋＤａタンパク質はアポリポタンパク質Ａ１であり、１４ｋＤａタンパク質はトランスサイレチンであることが好ましい。
【００２１】
タンパク質発現の変化を検出する場合、サンプルは血清、血漿又は組織培養上清であることが適当である。或いは、サンプルは、レーザー・キャプチャー・顕微鏡法で得られるサンプルなどの腫瘍生検であってもよい。
【００２２】
血清、特に患者の血漿サンプルにおけるタンパク質の検出では、サンプルを切り取り、本明細書に記載のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどのタンパク質分析法の対象とする。
【００２３】
上記に列挙したいずれかの実施態様に従った好ましい実施態様の方法では、ＣＤＫＩはロスコビチン活性を有する化合物であり、ロスコビチン又はロスコビチン類似体若しくは誘導体であることが好ましい。最も好ましいロスコビチンはＲ−ロスコビチンである。ロスコビチンを哺乳動物及び好ましくはヒトに投与することが適当である。
【００２４】
本発明の他の態様では、ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現変化をモニタリングすることを含む、ロスコビチンの適切な投与量を決定する方法を示している。
【００２５】
さらなる態様では、ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、２８ｋＤａ又は１４ｋＤａタンパク質の発現変化をモニタリングすることを含む、ロスコビチンの適切な投与量を決定する方法を示している。
【００２６】
他の態様では、候補薬剤を細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、及び未処理コントロールサンプルと比較して、処理したサンプルにおけるｉ）表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子、ii）２８ｋＤａのタンパク質、若しくはiii）１４ｋＤａのタンパク質のうち、少なくとも１つの発現の変化を、ＣＤＫＩ活性の指標として、検出するステップを含む、ＣＤＫＩ様活性を有する候補薬剤の同定方法を示す。この態様では、候補薬剤は、そのバイオマーカーの発現の変化において、周知のＣＤＫＩを使用して得られたパターンと類似のパターンを示すであろう。
【００２７】
ＣＤＫＩ好ましくはロスコビチンの活性のモニタリングにおける、表１〜１２に記載した少なくとも１つ遺伝子、又はアポリポタンパク質Ａ１若しくはトランスサイレチンをコードする遺伝子の使用。ロスコビチンなどのＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子、又は２８ｋＤａ若しくは１４ｋＤａのタンパク質の存在をモニタリングすることが適当である。
【００２８】
ロスコビチンなどのＣＤＫＩの活性を評価するキットには、核酸プライマー又は本明細書に記載した少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質に対する抗体が含まれて作製されることもある。該キットを、上述の、ロスコビチン活性のモニタリング方法、ロスコビチン投与量の決定方法又は候補薬剤のロスコビチン様活性の評価方法のいずれの方法に従って使用してもよい。
【００２９】
さらなる態様では、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子によりコードされたタンパク質、又は２８ｋＤａ若しくは１４ｋＤａのタンパク質に対する抗体を含む、ロスコビチンなどのＣＤＫＩ活性評価用キットを示している。そのようなキットには、本明細書に記載した遺伝子のタンパク質生成物を、単独で又は本明細書に記載した他の遺伝子に対する抗体と組み合わせて認識する抗体を含むことが適当である。
【００３０】
本明細書に記載した遺伝子又はタンパク質に対する抗体は、商業的供給源から、又は当業者にとって周知の手法により得ることができる。ある実施態様では、発現の変化をタンパク質バイオマーカーの翻訳後修飾された形の発現の変化によりそれ自体を明示する場合、それらの異なる形に対する特異的な抗体を使用することもある。
【００３１】
さらに他の態様では、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子に対する核酸プローブなどの遺伝子発現を検出するためのプローブを含む、ロスコビチンなどのＣＤＫＩ活性評価用キットを示している。例えば、適当なキットとは、本明細書に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現を検出するためのプライマーを含むＱＰＣＲ分析法のキットである。適当なプラーマーの例を、表１３及び１４に記載する。ＱＰＣＲ分析法のキットは、少なくとも１つの遺伝子を検出することもあり、また、本明細書に記載した他の遺伝子に対するプライマーを含むこともあるというのが適当である。タンパク質サンプルの分析により検出した発現の変化に対して、キットには、２８ｋＤａ又は１４ｋＤａのタンパク質検出のために、緩衝液、チップ及び品質管理用のコントロール（すなわち、周知のpositives又はnegatives）が含まれることもある。適当な緩衝液及びチップを本明細書に記載する。
【００３２】
他の態様では、
（ｉ）ＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、
（ii）処理した及び未処理の細胞、動物又はヒト由来のサンプルにおいて、遺伝子発現を測定するステップ、及び
（iii）未処理サンプルと比較して、処理したサンプルにおいて、表１〜１２のいずれかに記載した少なくとも１つの遺伝子、又は２８ｋＤａ若しくは１４ｋＤａタンパク質の遺伝子発現の増加又は減少を、ＣＤＫＩ活性の指標として、検出するステップ
を含む、ＣＤＫＩ活性のモニタリング方法を示している。
【００３３】
さらなる態様では、
（ｉ）ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、
（ii）処理した及び未処理の細胞、動物又はヒト由来のサンプルにおいて、遺伝子発現を測定するステップ、及び
（iii）未処理サンプルと比較して、処理したサンプルにおける表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の増加又は減少を、ロスコビチン活性の指標として、検出するステップ
を含む、ロスコビチン活性のモニタリング方法を示している。
【００３４】
他の態様では、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子のレベルが、ロスコビチン投与前に検出されたレベルよりも低いことを特徴とする上記クレームに記載の方法を示している。
【００３５】
さらなる態様では、ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の範囲や程度をモニタリングすることを含む、ロスコビチンの適切な投与量を決定する方法を示している。
【００３６】
その上さらなる態様では、候補薬剤を細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、及び表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の存在又は不在をモニタリングするステップを含む、ロスコビチン様活性を有する候補薬剤の同定方法を示している。
【００３７】
多くのロスコビチン活性のバイオマーカー（すなわち、表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子、又はアポリポタンパク質Ａ１若しくはトランスサイレチンを含むタンパク質マーカーとして発現した遺伝子）を、組み合わせて観察することが適当である。
【００３８】
ロスコビチンをヒトに投与する場合、細胞に投与するロスコビチンの有効濃度を、好ましくは５μＭより高濃度とし、より好ましくは１０μＭより高濃度とする。
【００３９】
ロスコビチンをヒトに投与する場合、遺伝子発現分析用の血液サンプルを採取する前の２、４又は８時間、薬剤で処理を行なうことが適当である。血清又は血漿サンプルをタンパク質発現変化の分析用に採取する場合は、ロスコビチンを一定期間にわたって投与する。
【００４０】
ある実施態様において、ロスコビチンを細胞に投与する場合、ロスコビチンの有効濃度を７５マイクロモルまでとすることが好ましい。
【００４１】
ある好ましい実施態様では、遺伝子発現を検出するための分析前に、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトを、７．５、１５又は３０μＭのロスコビチンで１．５時間処理する。この実施態様では、ロスコビチン活性の指標として、表３又は表７に記載した少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の減少を検出する。また、細胞での遺伝子発現を、ＰＢＭＣ、又はＨＴ２９に類似するフェノタイプを有する細胞で検出することが好ましい。
【００４２】
他の実施態様では、遺伝子発現を検出するための分析前に、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトを、７．５、１５又は３０μＭのロスコビチンで３時間処理する。この実施態様では、ロスコビチン活性の指標として、表４又は表８に記載した少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の減少を検出する。また、細胞での遺伝子発現を、ＰＢＭＣ、又はＨＴ２９に類似するフェノタイプを有する細胞で検出することが好ましい。
【００４３】
他の実施態様では、遺伝子発現を検出するための分析前に、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトを、１５、４５又は７５μＭのロスコビチンで２時間処理する。この実施態様では、ロスコビチン活性の指標として、表１１に記載した少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の減少を検出する。また、細胞での遺伝子発現を、Ａ５４９に類似するフェノタイプを有する細胞で検出することが好ましい。
【００４４】
他の実施態様では、遺伝子発現を検出するための分析前に、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトを、１５、４５又は７５μＭのロスコビチンで４時間処理する。この実施態様では、ロスコビチン活性の指標として、表１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の減少を検出する。また、細胞での遺伝子発現を、Ａ５４９に類似するフェノタイプを有する細胞で検出することが好ましい。
【００４５】
他の実施態様では、遺伝子発現を検出するための分析前に、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトを、５０μＭのロスコビチンで４、１２、２４又は４８時間処理する。
【００４６】
さらに他の実施態様では、ヒトを処理する場合、ロスコビチンを１日あたり０．８〜３．６ｇ、好ましくは１日あたり１．６〜２．４ｇを、１〜１０日間投与する。
【００４７】
本明細書で使用するように、「ＰＢＭＣ」なる用語は、末梢血単核細胞に言及しており、ＰＢＬ（末梢血液リンパ球）を含む。
【００４８】
ある実施態様では、遺伝子発現が検出される遺伝子を、ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、ＮＭ＿０１７６６５（本明細書ではＮＭ＿０１７６６５ヒト仮想的タンパク質（Homo sapiens hypothetical protein）ＦＬＪ２００９４に対する「２０５８５」として言及する）、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、ＮＭ＿０１８３１６（本明細書ではＮＭ＿０１８３１６ヒト仮想的タンパク質ＦＬＪ１１０７８に対する「１８７４７」として言及する）、ＮＭ＿０３３４１０（本明細書ではＮＭ＿０３３４１０ヒト仮想的タンパク質ＭＧＣ１３１３８に対する「２２１４７」として言及する）、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ及びｍｃｌ−１から選択する。
【００４９】
本明細書で使用するように、「ロスコビチン」及び「Ｒ−ロスコビチン」なる用語を使用して、化合物２−（Ｒ）−（１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリンに言及し、ＣＹＣ２０２としても言及する。特に条件のない場合では、「ロスコビチン」なる用語は、Ｒ−ロスコビチン、そのＳ鏡像異性体及びラセミ混合物を含んで使用される。該化合物及びその製造法は、米国特許第６，３１６，４５６号に記載されている。ロスコビチンの類似体は、例えば国際公開公報第０３／００２５６５号に記載されている。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様では、ロスコビチンを哺乳動物又はヒトに投与するが、より好ましくはヒトに投与する。モデル動物において実施する場合、本発明は、ＨＴ２９又はＡ５４９の異種移植マウスモデルなどの腫瘍モデルで実施することが好ましい。
【００５１】
本明細書に記載したいずれかの遺伝子の発現レベルをモニタリングする本発明の方法に、ロスコビチン投与前の、また好ましくは投与１．５、２、３、４、５、８、１２、２４又は４８時間後のレベルのモニタリングを含むことは好ましいであろう。好ましい実施態様では、そのレベルを、ロスコビチン投与後早ければ１．５時間で再度モニタリングする。さらなる実施態様では、タンパク質発現の変化を、投与後１〜１０日間測定する。
【００５２】
ある好ましい実施態様では、ロスコビチン投与後に検出される遺伝子のレベルは、ロスコビチン投与前に検出されたレベルよりも低いことが好ましい。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、遺伝子発現レベルのモニタリングを含む発現の変化のモニタリングによるロスコビチン活性の独立したモニタリングに関している。ある実施態様では、ロスコビチン投与後に検出される遺伝子発現のレベルは、ロスコビチン投与前に検出されたレベルよりも高いことが好ましい。他の実施態様では、ロスコビチン投与後に検出される遺伝子発現のレベルは、ロスコビチン投与前に検出されたレベルよりも低いことが好ましい。
【００５４】
本発明の方法は、
（ａ）ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、遺伝子発現の範囲や程度モニタリングするステップを含む、ロスコビチンの適切な投与量を決定する方法、
（ｂ）候補薬剤を細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、及び遺伝子の存在若しくは不在又はタンパク質の発現変化をモニタリングするステップを含む、ロスコビチン様活性を有する候補薬剤を同定する方法
に、さらに利用されることもある。
【００５５】
（ａ）に記載したような方法は、遺伝子発現の範囲や程度を、同じ期間で同じ投与量のロスコビチンによりその発現が調節される既知の遺伝子の既知の阻害率と関連付けるステップを、さらに含むこともある。ある実施態様では、ＲＢのリン酸化状態を、本明細書に記載したいずれかの遺伝子の発現パターンと比較することもある。ロスコビチン活性のマーカーとしてのＲＢは、国際公開公報第０２／０６１３８６号に記載されている。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、上記に記載したいずれかの方法を利用するロスコビチン活性のモニタリングにおける遺伝子又はタンパク質の使用に関する。
【００５７】
一般的に、細胞株の調査では、ロスコビチンのＣＤＫ２阻害（ＩＣ５０）投与量を投与し、例えば、投与から２、４、１２、２４、及び４８時間後に、サンプルを２４時間又は４８時間かけて抽出する。タンパク質サンプルを単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加して分離し、ブロットし、適当なマーカーを探す。モデル動物又はヒトで調査を実施する場合、ロスコビチン活性を評価するために、動物又はヒトから抽出可能な細胞源として、適当な増殖性組織を同定しなければならない。適当な組織にはあらゆる増殖性の組織が含まれる。特に腫瘍生検が含まれるが、循環リンパ球及び頬粘膜の細胞もまた使用できるということが今や確認されている。一旦抽出されると、これらの細胞は、細胞株について記載した方法と同一の方法で処理できる。ほとんどの場合、本明細書に記載した遺伝子を含むマーカーのプールを確認する。
【００５８】
生検サンプルにおける遺伝子発現検出用の適当な方法には、ＦＩＳＨ法、又はサンプルのタンパク質化合物を分析する方法と同様に、本明細書に記載した遺伝子を認識する抗体を使用する免疫組織化学法を使用することが含まれる。
【００５９】
本発明の実施態様をさらに開発して、用量漸増の手段として、遺伝子発現におけるロスコビチンの効果を使用することもある。すなわち、遺伝子発現の範囲及び割合をモニタリングすることによって、ロスコビチンの適切な投与量を決定する。そのような分析には、例えば、同じ投与量のロスコビチンによるＣＤＫ２活性又はＲＢリン酸化の既知の阻害率と遺伝子発現変化の関連がさらに含まれる。このように、遺伝子発現の範囲及び割合のある測定を、さらなるロスコビチン活性を示すとして用いてもよい。
【００６０】
さらなる本発明の実施態様では、候補薬剤によって遺伝子発現レベルの変化を含む発現の変化を、ロスコビチン様として分類される活性の機序の指標として用いることもある。
【００６１】
特定の治療単位の治療に対する癌患者の反応は、極めて多種多様である。例えば、特定の療法の治療に対して感受性を示し、腫瘍の苦しみの軽減や症状の改善を呈する患者もいれば、治療に対して耐性があり、特定の療法に対する改善を全く又はほとんど示さない患者もいる。ロスコビチンなどのＣＤＫＩによって修飾された発現を有する遺伝子を検出することは、ＣＤＫＩを用いた処理に対する反応を予測するためのマーカーの同定方法においても有用である。
【００６２】
したがって、別の態様では、腫瘍における遺伝子発現が、ロスコビチンなどのＣＤＫＩを用いた処理に対する反応を予測可能とする遺伝子の同定方法を示し、かかる方法は、
ａ）ロスコビチンなどのＣＤＫＩを用いた治療に感受性を示す患者からサンプルを採取し、本明細書に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現を検出するステップ、
ｂ）ロスコビチンなどのＣＤＫＩを用いた治療に耐性を示す患者からサンプルを採取し、本明細書に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現を検出するステップ、及び
ｃ）ａ）の遺伝子発現パターンとｂ）の遺伝子発現のパターンを比較し、その結果、感受性と関連する遺伝子及び耐性と関連する遺伝子を同定するステップ
を含む。
【００６３】
その後、腫瘍の遺伝子発現のパターンを決定し、上述の方法に従って同定されたマーカー遺伝子の発現に従って、特定の腫瘍を、処理に対して「感受性あり」又は「耐性あり」と分類する。
【発明の詳細な説明】
【００６４】
他に記載がない限り、本発明の実施には、通常の当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、細胞生物学、微生物学、ＤＮＡ組換え及び免疫学の従来の手法を用いる。これらの手法は、文献に記載されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition, Books 1-3、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.) 、B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons、J. M. Polak and James O’D. McGee, 1990, In Situ Hybridization、Principles and Practice; Oxford University Press、M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis、A Practical Approach, IRL Press; 及び D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照のこと。これらの全体の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
「ＣＤＫＩ」は、ＣＤＫ活性の阻害剤を意味する。ロスコビチンはＣＤＫ活性の阻害剤であるとして周知である多くの化合物の１つにすぎない。
【００６５】
「ロスコビチン活性」又は「ロスコビチン様活性」は、ロスコビチンによって発現する活性を意味する。例えば、ロスコビチン様とは、Ｇ１後期／Ｓ期初期又はＭ期において、細胞サイクルの進行を阻害可能であることを意味する。該細胞サイクルの進行の阻害は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９を含むＣＤＫを阻害することによって行われることが好ましい。ロスコビチン活性の研究結果は、McClue et al. Int. J. Cancer, 2002, 102, 463-468に報告されている。
【００６６】
ロスコビチン活性の「マーカー」又は「バイオマーカー」なる用語は、細胞又は哺乳動物に由来するサンプルにおける発現が、ロスコビチンを用いた処理に応じて変化するか或いは調節される、例えば、アップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子又はタンパク質を表わす。バイオマーカーがタンパク質の場合、発現の調節又は変化には、異なる翻訳後修飾による調節が含まれる。
【００６７】
また、本明細書で使用される「バイオマーカークラスター（biomarker cluster）」なる用語は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分離される場合、類似の質量を有するタンパク質の形を特徴とするグループを意味する。バイオマーカークラスターを、本明細書の実施例に記載する。
【００６８】
処理した及び未処理の細胞に由来するサンプルは、組織培養物又は動物若しくはヒトの細胞群に由来する溶菌液、抽出物或いは核酸のサンプルである。タンパク質分析のためには、サンプルは組織培養上清を用いる。細胞は、個体（例えば、血液、血清又は血漿のサンプル）から単離でき、生検などの組織サンプルの一部のこともある。
【００６９】
「発現の変化（altered expression）」とは、未処理のコントロールサンプルと比較した場合の、増加、減少又は他に、処理した細胞に由来するサンプルにおける、発現の修飾レベル若しくは発現パターンを意味する。
【００７０】
「発現（expression）」なる用語は、対応するｍＲＮＡを産生するための遺伝子のＤＮＡ鋳型の転写、及び対応する遺伝子産物（すなわち、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）を産生するためのｍＲＮＡの翻訳、さらに１以上の翻訳後修飾されたタンパク質の「発現」を表わす。
【００７１】
翻訳後修飾とは、タンパク質分解的切断により、又は１以上のアミノ酸への修飾基の付加により、タンパク質の特性を変化させる共有結合のプロセッシング現象である。通常の翻訳後修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、アシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー化、ユビキチン化などが含まれる。そのような修飾の概説及び検出の方法は、Mann et al. Nature Biotechnology March 2003, Vol. 21, pages 255-261で見出すことができる。
【００７２】
「ポリヌクレオチド」又は「ポリペプチド」は、ロスコビチンに応じてその発現が修飾される、本明細書に記載したＤＮＡ配列及びタンパク質配列を意味する。かかる用語には、これらの配列に近似の変異体も含まれ、かかる変異体はその参照配列と同じ生物活性を有する。該変異体が、本明細書に記載したかかる参照配列と同じ生物活性を保持する限り、これらの変異配列には、「対立遺伝子」（同一又は近似に関連した種において同じ遺伝子座に見られる変異配列）、「相同体」（共通の先祖ＤＮＡ配列から受け継がれた第二の遺伝子に関連し、種分化（「オルソログ」又は遺伝子複製（「パラログ」）のいずれかによって分離される遺伝子）が含まれる。
【００７３】
本発明はまた、前記変異体が、本明細書に記載したかかる参照配列と同じ生物活性を保持する限り、本明細書に記載したポリヌクレオチド及びポリペプチドにおいて、サイレント置換、多型性置換及び同類置換を有する遺伝子の検出を含むことを目的としている。
ＣＤＫＩ活性の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーの発現変化の測定
遺伝子及びタンパク質発現のレベルは、多くの異なる手法を用いて測定することができる。
ａ）ＲＮＡレベル
ＲＮＡレベルで遺伝子発現を検出することができる。例えば、フェノール酸／グアニジンイソチオシアン酸塩抽出法（acid phenol/guanidine isothiocyanate extraction）（RNAzolB：Biogenesis社製）、RNeasy RNA調製キット(Quiagen社製) 又はPAXgene （PreAnalytix社製, スイス）を含むＲＮＡ抽出法を用いて、ＲＮＡを細胞から抽出する。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用した典型的なアッセイの型式には、核Ｒｕｎ−Ｏｎアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、RNase Protection Assays (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035)、ノーザンブロット法及びインシツゥハイブリダイゼーションが含まれる。遺伝子発現はまた、以下に述べるように、マイクロアレイ分析により検出できる。
【００７４】
ノーザンブロット法を行なうためには、先ず、ＲＮＡサンプルを変性条件下アガロースゲルで電気泳動法によって大きさで分類する。次にＲＮＡを膜に転移させ、架橋し、標識プローブでハイブリダイズする。非同位体プローブ又は高比活性の放射標識プローブ（high specific activity radiolabeled probes）には、ランダムプライミングされたＤＮＡプローブ、ニックトランスレーションされたＤＮＡプローブ、又はＰＣＲ作製ＤＮＡプローブ、インビトロ転写ＲＮＡプローブ、及びオリゴヌクレオチドなどを用いることができる。さらに、一部にのみ相同性を有する配列（例えば、異なる種のｃＤＮＡ又はエキソンを含む可能性のあるゲノムＤＮＡフラグメント）をプローブとして用いてもよい。
【００７５】
NucleaseProtection Assays（ＮＰＡ）（リボヌクレアーゼタンパク質アッセイとＳ１ヌクレアーゼアッセイとの両方を含む）は、特定のｍＲＮＡの検出及び定量のための極めて高感度な方法を示している。ＮＰＡは、アンチセンスプローブ（放射標識された、又は非同位体の）のＲＮＡサンプルへの溶液ハイブリダイゼーションに基づいている。ハイブリダイゼーション後に、一本鎖のハイブリダイズされていないプローブ及びＲＮＡをヌクレアーゼによって分解する。残りの保護されているフラグメントをアクリルアミドゲル上で分離する。ＮＰＡによって、数種のＲＮＡを同時に検出することが可能となる。
【００７６】
インシツゥハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、細胞又は組織で、特定のｍＲＮＡを見つけ出すための強力で汎用な手段である。プローブのハイブリダイゼーションは、細胞又は組織で行われる。細胞の構造がかかる処理を通して維持されるため、ＩＳＨによって組織サンプルにおけるｍＲＮＡの位置に関する情報が示される。
【００７７】
処理は、サンプルを中性緩衝ホルマリン液に固定し、組織をパラフィンに埋め込むことから始める。次にサンプルを切片に薄切し、顕微鏡のスライドに載せる。（或いは、組織を凍らせて薄片に切り、パラホルムアルデヒドで後固定する）。かかる切片を何回か洗浄して、ワックスを除去し、加水して元の状態に戻した後、プローブの利便性を向上させるためにプロテインキナーゼＫの消化を行ない、次に標識プローブをサンプルの切片にハイブリダイズする。放射標識プローブを、スライド上で乾燥させたリキッドフィルムで可視化し、非同位体標識プローブは比色試薬又は蛍光試薬で簡便に検出する。この後者の検出方法は蛍光インシツゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の基礎である。
【００７８】
用いることのできる検出法には、放射標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識及び他の適する標識が含まれる。
【００７９】
一般的には、ＲＴ−ＰＣＲはターゲットＲＮＡを増幅するために用いられる。このプロセスにおいて、逆転写酵素を使用して、ＲＮＡを、その後増幅して検出を容易にすることができる相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。相対的定量ＲＴ−ＰＣＲには、対象とする遺伝子と同時に内部標準を増幅することが含まれる。内部標準は、サンプルをノーマライズするために用いられる。一度ノーマライズされれば、特定のｍＲＭＡの相対存在量をサンプル全体で直接比較することが可能となる。通常用いられる内部標準には、例えばＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ、アクチン及びサイクロフィリンが含まれる。
【００８０】
多くのＤＮＡ増幅方法が知られているが、そのほとんどは酵素連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応又は３ＳＲ法（self-sustained sequence replication）に基づくものであるか、或いはクローンされたベクターの全部又は一部の複製に由来するものである。
【００８１】
多くのターゲット増幅法及びシグナル増幅（ＴＡＳ）法については、例えば、Landegren, U. et al., Science 242:229-237 (1988) and Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990)の文献において、これらの方法の総論に記載されている。
【００８２】
ＰＣＲ法は核酸増幅法であり、とりわけ米国特許第４，６８３，１９５号及び４，６８３，２０２号に記載されている。診断に関しては、ＰＣＲ法を用いて、あらゆる既知の核酸を増幅することができる（Mok et al., 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252）。３ＳＲ法（３ＳＲ）はＴＡＳの変形であり、酵素カクテル及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーによってもたらされる逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼ及びヌクレアーゼ活性の一連の作用（via sequential round）による、核酸テンプレートの等温増幅を含む（Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）。連結増幅反応又は連結増幅システムでは、ＤＮＡリガーゼ及びターゲット鎖１本あたり２つ用いる４つのオリゴヌクレオチドを使用する。かかる手法は、Wu, D. Y. and Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:560に記載されている。Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197に記載されているように、Ｑβレプリカーゼ法において、一本鎖ＲＮＡを複製するバクテリオファージＱβのＲＮＡレプリカーゼを使用して、ターゲットＤＮＡを増幅する。
【００８３】
定量ＰＣＲ法（Ｑ−ＰＣＲ法）は、サンプル中のトランスクリプトの相対量を測定する手法である。Ｑ−ＰＣＲ法の適当な実施方法を本明細書に記載する。
【００８４】
本発明には、別の増幅手法を使用する。例えば、ローリングサークル増幅（Lizardi et al., 1998, Nat Genet 19:225）は、ＤＮＡポリメラーゼによって行われ、等温条件下で直線的又は幾何学的に運動する環状オリゴヌクレオチドプローブを複製することができる市販（ＲＣＡＴＴＭ）の増幅手法である。さらなる手法であるＳＤＡ法（strand displacement amplification） （SDA; Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:392） は、特定のターゲットに１つしかない特異的に限定された配列を用いて開始する。
【００８５】
本明細書に記載したロスコビチン活性のマーカーを検出する適当なプローブは、テストキットの形で適当な容器に都合良くに入れられている。それらのキットにおいて、かかるプローブは固体支持体（a solid support）に結合することもある。その固体支持体ではアッセイフォーマット用にキットが作成されており、そのアッセイフォーマットにはこの結合が必要である。キットには、サンプルを処理してプローブし、そのプローブをサンプルの核酸にハイブリダイズする適切な試薬、対照薬、説明書などが含まれることもある。適切なキットは、例えばＱＰＣＲ反応のためのプライマーやＦＩＳＨを実施するための標識プローブを含んでいることもある。
ａ）ポリペプチドレベル
遺伝子又はタンパク質の発現の変化は、ロスコビチン活性の遺伝子マーカーがコードするポリペプチドを測定することによっても検出できる。これは、ロスコビチン活性のマーカーとして、本明細書に記載したいずれかの遺伝子をコードするポリペプチドに結合する分子を使用することによって、達成される。タンパク質の存在を検出するために直接的に又は間接的にポリペプチドに結合する適当な分子／試薬には、ペプチドやタンパク質などの自然発生する分子、例えば抗体が含まれる。或いは、これらは合成分子であってもよい。
【００８６】
抗体の作製方法は当業者に公知である。ポリクローナル抗体が望ましい場合は、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、ポリペプチドのエピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫する。免疫下動物の血清を回収し、既知の手順で処理する。ポリペプチドのエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清に他の抗原に対する抗体が含まれる場合、ポリクローナル抗体を免疫親和性クロマトグラフィーで精製することができる。ポリクローナル抗血清を作製し加工する手法は、当業界で公知である。より大きな免疫原性反応を惹起させるには、動物又はヒトにおいて免疫源として使用するために、ポリペプチド又はそのフラグメントを他のポリペプチドにハプテン化してもよい。
【００８７】
当業者であれば、ポリペプチド中のエピトープに対するモノクローナル抗体も、容易に作製することができる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製する一般的な方法は公知である。細胞融合により、また、発癌性のＤＮＡを有するＢリンパ球の形質転換や、エブスタイン・バー（ＥＢ）ウイルスによる形質移入などの方法によっても、不死抗体産生細胞株を作製することができる。本発明のポリペプチド中のエピトープに対して生成されたモノクローナル抗体のパネルを、様々な特性、すなわちアイソタイプ及びエピトープ親和性についてスクリーニングすることができる。
【００８８】
別の手法には、例えば、ファージが様々な相補性決定領域（ＣＤＲ）と共にその被膜の表面でｓｃＦｖフラグメントを発現している、ファージディスプレイライブラリのスクリーニングが含まれる。かかる手法は当業界では公知である。
【００８９】
本発明の目的のためには、他に異なる記載のない限り、「抗体」なる用語は、ターゲット抗原に対する結合活性を保持する抗体全体のフラグメントを含む。これらのフラグメントには、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）だけでなく、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ'）フラグメント及びＦ（ａｂ'）２フラグメントが含まれる。さらに、例えば欧州特許第２３９４００号に記載されるように、抗体とそのフラグメントをヒト化抗体としてもよい。
【００９０】
上述のイムノブロットなどの標準的な実験の手法を用いて、同じ細胞集団中の未処理細胞と比較して、ロスコビチン活性のマーカーのレベル変化を検出することができる。
【００９１】
ポリペプチドの翻訳後の処理、又は核酸の転写後の修飾における変化を検出することによって、遺伝子発現を測定する。例えば、ポリペプチドのリン酸化の差異、ポリペプチドの切断又はＲＮＡの別のスプライシングなどを測定する。ポリペプチドなどの遺伝子産物の発現レベルや、それらの翻訳後の修飾を、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの市販のタンパク質アッセイ又は手法を用いて検出する。
【００９２】
（ａ）本発明の抗体を示すステップ、
（ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、前記抗体で生物サンプルを培養するステップ、及び
（ｃ）前記抗体を含む抗原抗体複合体が形成されたかどうかを判断するステップを備える方法
によって、本明細書に記載したロスコビチン活性のマーカーを生体サンプルにおいて検出する際には、抗体を使用する。
【００９３】
適当なサンプルには、脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉や骨組織などの抽出組織、又はこれらの組織に由来する腫瘍性成長が含まれる。適当な例には、他に血液及び尿のサンプルを含む。
【００９４】
ロスコビチン活性タンパク質のマーカーに特異的に結合する抗体を、体液中又は組織中のロスコビチン活性タンパク質のマーカーを検出又は定量するために、通常の技術を有する当業者には公知の診断方法やキットを使用することができる。これらのテストの結果を使用して、癌及び他の細胞サイクルの進行性疾患の発生又は再発を診断又は予測することができる。或いは、薬剤の投与量及び治療の有効性を査定することができる。
【００９５】
当業界で公知の方法により、免疫特異的な結合に対して、抗体をアッセイすることができる。使用可能なイムノアッセイには、ウエスタンブロット法、免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散法、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法及びプロティンＡイムノアッセイなどの手法を用いた競合アッセイ系及び非競合アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。これらのアッセイは当業界では決まりきった方法である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照のこと。これらの内容はそっくりそのまま、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００９６】
本発明で用いる抗体は、固体支持体に結合し、及び／又は適切な試薬、対照薬、説明書などと共にキットの形で適当な容器に入れられている。
【００９７】
他の方法には、大規模のスクリーニングには適当ではないが二次元ＰＡＧＥが含まれる。最新の手法にはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry）が含まれる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析法では、複合混合物のタンパク質を、固体金属マトリックスに添付し、パルスレーザービームで脱離し、フィールドフリーフライトチューブ（field-free flight tube）を横切る気相イオンを産生する。次に質量依存性の速度で分離する。個別のタンパク質及びペプチドは、タンパク質及びペプチドの配列データベースを検索するインフォマティックスツールを使用して同定される。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Surface-enhanced laser desorption/ionisation time of flight MS）は、タンパク質を化学的に修飾した固体表面に選択的に吸着する親和性に基づくＭＳ方法であり、不純物を洗浄して除去し、エネルギー吸収のマトリックスを使用し、該タンパク質をレーザー脱離質量分析（laser desorption mass analysis）により同定する。
【００９８】
タンパク質のバイオマーカーを同定するために、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用して、インタクトなタンパク質又は特定のタンパク質のフラグメントのどちらかの出現／喪失を検出する。さらにまたＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用して、化学基の付加／除去で引き起こされる質量の差異により、タンパク質の翻訳後修飾を検出する。よって、ある残基のリン酸化は、そのリン酸基により８０Ｄａの質量シフトを引き起こすであろう。翻訳後修飾に起因する分子量のデータベースは、インターネット上（http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home？avgmass=all）で自由にアクセスできる。さらに特異的なポリペプチドは、翻訳後修飾されたタンパク質の形を特異的に認識する、又はタンパク質のすべての形を一様に認識する抗体を用いてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用する親和性に基づくアプローチによって捕獲される。
アレイ（Array）
配列技術並びにそれに関連した様々な手法及び応用は、一般的に多くの教科書や文献に記載されている。これらには、Lemieux et al., 1998, Molecular Breeding 4:277-289、Schena and Davis. Parallel Analysis with Biological Chips. in PCR Methods Manual (eds. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky)、Schena and Davis, 1999, Genes, Genomes and Chips. In DNA Microarrays: A Practical Approach (ed. M. Schena), Oxford University Press, Oxford, UK, 1999)、The Chipping Forecast (Nature Genetics special issue; January 1999 Supplement)、Mark Schena (Ed.), Microarray Biochip Technology, (Eaton Publishing Company)、Cortes, 2000, The Scientist 14(17):25、Gwynne and Page, Microarray analysis: the next revolution in molecular biology, Science, 1999, August 6、Eakins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17:217-218、及び多くのワールドワイドウェブサイトで得られる文献が含まれる。
【００９９】
配列技術は、通常では「一実験一遺伝子（one gene in one experiment）」に基づき実施するために、処理量が少なく、遺伝子機能の「全体像」を理解することができないという、分子生物学における従来の方法の欠点を克服している。現在、配列技術の主な応用には、配列の同定（遺伝子／遺伝子変異）及び遺伝子の発現レベル（存在量）の測定が含まれる。遺伝子発現プロファイリングには、選択的にプロテオミクス技術と組み合わせて配列技術を用いる(Celis et al., 2000, FEBS Lett, 480(1):2-16; Lockhart and Winzeler, 2000, Nature 405(6788):827-836; Khan et al., 1999, 20(2):223-9)。 配列技術の他の応用も当業界で公知であり、遺伝子の発見、癌調査（Marx, 2000, Science 289: 1670-1672; Scherf et alet al., 2000, Nat Genet 24(3):236-44; Ross et al., 2000, Nat Genet 2000, 24(3):227-35）、ＳＮＰ分析（Wang et al., 1998, Science 280(5366):1077-82）、薬剤の発見、ファーマコジェノミックス、疾患の診断（例えばマイクロ流体工学装置を用いたChemical & Engineering News, February 22, 1999, 77(8):27-36、毒物学を用いたRockett and Dix (2000), Xenobiotica 30(2):155-77; Afshari et al., 1999, Cancer Res 59(19):4759-60、及びトキシコゲノミクス（toxicogenomics）を用いた（機能性ゲノムのハイブリッド及び分子毒物学）を例示することができる。トキシコゲノミクスの目的は、毒物の毒性反応と、毒物と接触した対象の遺伝子特性における変化との相互関係を見出すことである（Nuwaysir et al., 1999, Molecular Carcinogenesis 24:153-159）。
【０１００】
本発明においては、例えば、本明細書に記載した１以上のロスコビチン活性タンパク質マーカーの発現の分析において、配列技術を使用することができる。ある実施態様においては、配列技術を使用して、同時に本明細書に記載した多くのロスコビチン活性のマーカーに対する候補化合物の作用を評価する。したがって、本発明の別の態様では、表１〜１２のいずれかに記載した核酸の少なくとも１つ、少なくとも２つ、若しくは少なくとも複数、又はそのフラグメントを含むマイクロアレイ、或いはタンパク質アレイ又は抗体アレイを示している。
【０１０１】
一般的に、ライブラリ又は群の構成要素を空間的に隔てることによって、サンプルのライブラリ又は群を規則的にアレイに配置してよい。配列に適当なライブラリの例には、核酸ライブラリ（ＤＮＡライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、オリゴヌクレオチドライブラリなど）、ペプチドライブラリ、ポリペプチドライブラリ及びタンパク質ライブラリだけでなく、特にリガンドライブラリなどのあらゆる分子を含むライブラリが含まれる。したがって、本明細書中で「ライブラリ」に言及する場合は、他に記載がない限り、その言及はアレイの形のライブラリへの言及を含むものであると解釈される。本発明の内容において、「ライブラリ」には、本明細書に記載したロスコビチン活性のマーカーのサンプルが含まれる。
【０１０２】
通常、サンプル（例えばライブラリの構成要素）を固相、好ましくは固体基板に固定化又は不動化し、サンプルの拡散や混合を制限する。好ましい実施態様においては、ＤＮＡ結合リガンドのライブラリを作製する。特に、ライブラリを、プラスチックやガラスなどの膜基板及び非多孔性基板を含むほぼ平面状の固相に不動化する。さらに、好ましくはサンプルを、索引付け（すなわち、ある特定のサンプルへの参照やアクセス）が容易になるように配置する。典型的には、サンプルを升目の中の点（spots in a grid formation）として用いる。一般的なアッセイ系をこの目的に合うように使用する。例えば、ウェル中の様々なサンプル又は各ウェル中の１つのサンプルで、アレイをマイクロプレートの表面に不動化する。さらに、固体基板はニトロセルロース膜又はナイロン膜（例えばブロット法の実験で使用される膜）などの膜である。代替の基板にはガラス基板又はシリカ基板が含まれる。このように、例えば電荷相互作用により、或いはウェルの壁面若しくは底面、又は膜表面への化学的結合により、当業界で公知の適切な方法でサンプルを不動化する。例えば、ピペッティング、drop-touch、圧電手段、インクジェット技術及びバブルジェット技術、静電気の応用などの、他の配置手段及び固定手段を使用してもよい。シリコンチップの場合は、フォトリソグラフィを使用して、チップ上のサンプルを配置し、固定してもよい。
【０１０３】
固体基板上に「スポット」することによってサンプルを配置してもよい。これは手動で行ってもよいし、ロボットを用いてサンプルを配置してもよい。一般的に、アレイは、サンプルスポットの大きさの違いによりマクロアレイ又はマイクロアレイと表現される。マクロアレイは典型的には約３００マイクロン以上の大きさのサンプルスポットを含み、既存のゲルスキャナー及びブロットスキャナー（blot scanner）によって容易に画像化される。マイクロアレイのサンプルスポットの大きさは、典型的には直径２００マイクロン未満であり、これらのアレイは通常数千個のスポットを有する。したがって、マイクロアレイは専門のロボット技術や画像装置を必要とし、これらの技術や装置はオーダーメイドである必要がある。器具の使用については、Cortese, 2000, The Scientist 14(11):26に概ね記載されている。
【０１０４】
不動化したＤＮＡ分子のライブラリの作製手法は、当技術に記載されている。通常、ほとんどの先行技術の方法には、例えば、マスキング技術を用いて、固体基板上の様々な不連続な位置に、多様な配列の並べ替え（permutation of sequence）を構築する、一本鎖核酸分子ライブラリの合成方法が記載されていた。
米国特許第５，８３７，８３２号は、大規模集積回路技術に基づく、シリコン基板に不動化されたＤＮＡアレイの改良された作製法について記載している。かかる内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。特に、米国特許第５，８３７，８３２号には、本発明の不動化ＤＮＡライブラリを作製するために使用されることもある、基板上の空間的に画定された位置でプローブの特定の集合を合成する「タイリング」と称される方法を記載されている。米国特許第５，８３７，８３２号は、初期の技術に関する参照資料も示しており、これもまた使用されることがある。
【０１０５】
それぞれ個別のライブラリの構成要素（例えば、独特のペプチド配列）を、アレイ中の予め画定した不連続な位置に配列するように、ペプチド（又はペプチドミメティック）のアレイを表面に合成する。アレイでの空間的位置によって、各ライブラリの構成要素の同一性を判断する。所定の分子（例えばターゲット又はプローブ）と反応ライブラリ構成要素との結合相互作用が生じる場合、アレイにおける位置を判断し、それによって空間的な位置に基づき、反応ライブラリの構成要素の配列を同定する。これらの方法は米国特許第５，１４３，８５４号、国際公開公報第９０／１５０７０号及び国際公開公報第９２／１００９２号、Fodor et al., 1991, Science 251:767、Dower and Fodor, 1991, Ann. Rep. Med. Chem. 26:271に記載されている。
【０１０６】
検出を促進させるために、例えば蛍光レポーター、生物発光レポーター、リン光レポーター、放射性レポーターなどの容易に検出可能なレポーターでターゲット及びプローブを標識する。これらのレポーター、その検出、ターゲット／プローブへの結合などは本明細書全体に記載している。プローブ及びターゲットの標識化については、Shalon et al., 1996, Genome Res 6(7):639-45にも開示されている。
【０１０７】
ＤＮＡアレイの具体例には以下が含まれる。
【０１０８】
フォーマットＩ：プローブｃＤＮＡ（〜５００から〜５，０００塩基長）を、ガラスなどの固体表面にロボットスポッティング（robot spotting）を用いて不動化し、個別に又は混合してターゲットに接触させる。この方法はスタンフォード大学（Stanford University）で開発されたと広く考えられている(Ekins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17:217-218)。
【０１０９】
フォーマットII：オリゴヌクレオチドのアレイ（〜２０から〜２５merオリゴ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブをインシツゥ（チップ上）又は従来の合成によって合成し、その後チップ上に不動化する。かかるアレイを標識したサンプルＤＮＡに接触させ、ハイブリダイズし、相補配列の同一性／存在量を測定する。このようなＤＮＡチップはGeneChip(R)の商標が付され、Affymetrix, Inc.から販売されている。
【０１１０】
市販のマイクロアレイフォーマットの例は、例えばMarshall and Hodgson, 1998, Nature Biotechnology 16(1):27-31に示されている。
【０１１１】
データ分析もアレイに関する実験の重要な部分である。マイクロアレイ実験の生データは、一般的には画像であり、その画像は、行が例えば遺伝子を表し、列が例えば組織又は実験条件等の様々なサンプルを表し、各セルの数字が例えば特定のサンプルにおける特定の遺伝子の発現レベルを特徴付ける遺伝子発現行列−表に変換する必要がある。根本的な生物過程の知見を推論するのであれば、これらの行列をさらに分析しなくてはならない。データ分析の方法（バイオインフォマティクスアプローチだけでなく、スーパーバイズされた及びスーパーバイズされないデータ分析を含む）は、Brazma and Vilo J, 2000, FEBS Lett 480(1):17-24に記載されている。
【０１１２】
上述のように、タンパク質、ポリペプチドなどをアレイにおいて不動化してもよい。例えば、プロテインチップを用いたプロテオームのマイクロアレイ分析では、抗体が使用されている（Borrebaeck CA, 2000, Immunol Today 21(8):379-82）。ポリペプチドアレイは、例えばMacBeath and Schreiber, 2000, Science, 289(5485):1760-1763で概説されている。
診断及び予後診断
本発明はまた、ロスコビチン活性のマーカー、これらのタンパク質に対する抗体、及びこれらのタンパク質及び／又はその抗体を含む組成物の、特にロスコビチンで治療を施した個々人における、増殖活性によって特徴付けられる疾患の診断及び予後診断での使用を含む。本明細書に使用されるように、「予後診断方法」なる用語は、疾患、特に癌と診断されたヒト又は動物の該疾患の進行に関する予測を可能にする方法を意味する。特にロスコビチン治療の対象となる癌には、乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜腺癌、前立腺癌及び白血病が含まれる。
【０１１３】
本明細書に使用される「診断方法」なる用語は、ヒト若しくは動物に関して又はヒト若しくは動物において、癌の有無又は癌のタイプを判断可能にする方法を意味する。マーカーによってロスコビチン治療の成功を評価できることが適切である。上述の通り、適切な診断には、例えばＱＰＣＲプライマー、ＦＩＳＨプローブなどの本明細書に記載したいずれかの遺伝子に関するプローブが含まれる。
【０１１４】
次に本発明を以下の実施例を参考に説明する。
【実施例１】
【０１１５】
ＣＹＣ２０２処理細胞で発現した遺伝子の同定
方法
細胞培養
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、使用説明書に従いバキュテイナーＣＰＴチューブ（Becton Dickinson社製、N.J.、米国）の遠心分離により精製した。細胞を、１０％のウシ胎仔血清及びペニシリンストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地４０ｍｌ中に約２×１０７細胞の密度で播種した。
【０１１６】
ＨＴ２９及びＡ５４９の細胞は、それぞれヒトの大腸及び肺の腫瘍に由来しており、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭにおいて１０ｃｍプレートあたり１．５×１０６細胞と同等である約２０％の密集度で播種した。その結果、化合物で処理すると翌日には活発に増殖していた。
【０１１７】
ＣＹＣ２０２又は溶媒コントロールであるＤＭＳＯによる処理前、すべての細胞培養物を、５％ＣＯ２存在下、３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした。ＰＢＭＣ及びＨＴ２９の細胞を、７．５μＭ、１５μＭ又は３０μＭのＣＹＣ２０２で処理し、１．５時間、３時間、５時間、８時間及び２４時間後にサンプルを採取した。A５４９細胞は、１５μＭ、４５μＭ及び７５μＭのＣＹＣ２０２で処理し、２時間、４時間、８時間及び２４時間後にサンプルを採取した。
ＲＮＡ抽出
ＲＮＡを、使用説明書に従いＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロゲン社製）を用いて、マイクロアレイ実験で使用したA５４９細胞から抽出した。他のすべての細胞株に対しては、全ＲＮＡを、使用説明書に従いRneasy Midi Kit（Qiagen社製、Hilden、ドイツ）により培養物から抽出した。細胞をＲＬＴ緩衝液に溶解し、次にＲＮＡ抽出前に、Qiashredderカラムを通過させた。サンプルは、カラムに結合すると同時にRnase-free Dnase（Qiagen社製）により処理した。ＲＮＡをRnase-free水で溶出し、RiboGreen（Molecular Probes社製、Leiden、オランダ）を使用して定量した。サンプルのアリコートをアガロースゲルに流して、ＲＮＡの完全性及び品質をチェックした。
二本鎖ｃＤＮＡの合成
１０μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡ作製用の出発物質として使用した。第１鎖及び第２鎖のｃＤＮＡ合成を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ部位を含むoligo-dTプライマーを使用することを除いては、使用説明書に従いSuperScript II System（インビトロゲン社製、Carlsbad、カリフォルニア州）を使用して行なった。標識ｃＲＮＡをBioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit（Enzo社製）を使用して作製した。ビオチン標識したＣＴＰ及びＵＴＰ（Enzo社製）を、未標識のNTP´sと一緒に反応中で使用した。ＩＶＴ反応に続き、非取り込み型のヌクレオチドを、RNeasyカラム（Qiagen社製、Hilden、ドイツ）を使用して除去した。
マイクロアレイ・ハイブリダイゼイション及びスキャンニング
ｃＲＮＡを、Affymetrix Technical Manualに従い、metal-induced加水分解により断片化し、３５〜２００塩基のフラグメントを得た。１５μｇのｃＲＮＡを、９４℃で３５分間、ｐＨ８．１のTris-acetate４０ｍＭ、KOAc１００ｍＭ及びMgOAc３０ｍＭを含むフラグメンテーション緩衝液中で断片化した。ハイブリダイゼイションに先立って、アフィメトリクスプローブアレイカートリッジに載せる前に、６ｘＳＳＰＥ-Ｔハイブリダイゼーション緩衝液（１ＭのNaCl、ｐＨ ７．６のトリス１０ｍＭ、０．００５％ のトリトン）中の断片化したｃＲＮＡを、９５℃で５分間、続いて４５℃で５分間加熱した。
【０１１８】
ＨＴ−２９細胞及びＰＢＭＣからのＲＮＡをHu Gene U133A Cartridgesに載せる一方で、Ａ５４９細胞から抽出したＲＮＡを、Hu Gene FL Cartridgeと一緒に使用した。次に、プローブアレイを、４５℃で１６時間、一定の回転数（６０ｒｐｍ）でインキュベートした。洗浄及び染色の処置はAffymetrix Fluidics Stationを用いて行った。プローブアレイを接触して、２５℃で６ｘＳＳＰＥ−Ｔにおいて１０回洗浄後、５０℃で０．５ｘＳＳＰＥ−Ｔにおいて４回洗浄した。ビオチン標識したｃＲＮＡを、阻害剤として正常なヤギのＩｇＧを最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ（Sigma社製）で、及びビオチン標識した抗ストレプトアビジン抗体（ヤギ）を最終濃度３ｍｇ／ｍｌ（Vector Laboratories社製）で使用する抗体増幅ステップ（antibody amplification step）により検出した。この後、ストレプトアビジン・フィコエリトリン複合物、最終濃度２ｍｇ／ｍｌ（Molecular Probes社製、Eugene、OR）で、２５℃で６ｘＳＳＰＥ−Ｔにおいて３０分間染色を行なって、２５℃で６ｘＳＳＰＥ−Ｔにおいて１０回洗浄した。プローブアレイを、共焦点レーザー顕微鏡（Hewlett Packard社製、 GeneArray Scanner G2500A）を使用して５６０ｎｍでスキャンした。定量的スキャニングからの測定値は、Affymetrix Gene Expression Analysis Softwareを使用して分析した。
マイクロアレイ・データの分析
データの分析は、Affymetrix Software PackagesのMAS ver. 5.0、MicroDB ver. 3.0及びDMT ver. 3.0を使用して行った。すべての未加工の分析は150 unitsへの Global Scaledであり、その後Pairwise Comparison分析により比較した。
対象の遺伝子の選択
Affymetrix Chipsのデータを、ＣＹＣ２０２処理後に個々の時点で分析した。ＣＹＣ２０２処理のマーカーとして同定された遺伝子は、ＤＭＳＯで処理した細胞から単離されたＲＮＡに存在していた遺伝子であるが、その発現は、ＣＹＣ２０２の全濃度で処理した細胞から単離されたＲＮＡにおいてはダウン・レギュレートすると判断した。
【０１１９】
７．５、１５及び３０μＭで１．５、３、５、８及び２４時間、ＣＹＣ２０２で処理したＰＢＭＣ由来のサンプルを使用してマイクロアレイから得た発現データにより、以下の表を得た。
【０１２０】
表１は、ＰＢＭＣのＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、１．５時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１２１】
表２は、ＰＢＭＣのＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、３時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１２２】
表３は、１．５時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表１に記載したプローブ）。
【０１２３】
表４は、３時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表２に記載したプローブ）。
【０１２４】
７．５、１５及び３０μＭで１．５、３、５、８及び２４時間、ＣＹＣ２０２で処理したＨＴ２９細胞由来のサンプルを使用してマイクロアレイから得た発現データにより、以下の表を得た。
【０１２５】
表５は、ＨＴ２９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、１．５時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１２６】
表６は、ＨＴ２９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、３時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１２７】
表７は、１．５時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表５に記載したプローブ）。
【０１２８】
表８は、３時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表６に記載したプローブ）。
【０１２９】
１５、４５及び７５μＭで２、４、８及び２４時間、ＣＹＣ２０２で処理したＡ５４９細胞由来のサンプルを使用してマイクロアレイから得た発現データにより、以下の表を得た。
【０１３０】
表９は、Ａ５４９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、２時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１３１】
表１０は、Ａ５４９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、４時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１３２】
表１１は、２時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表９に記載したプローブ）。
【０１３３】
表１２は、４時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表１０に記載したプローブ）。
【実施例２】
【０１３４】
リアルタイム定量ＰＣＲ（Real time quantitative PCR）を使用するマイクロアレイ・データの確認
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
同じ３つの細胞株から得られた全ＲＮＡサンプルを、マイクロアレイで観察した遺伝子発現レベルの検証のために使用した。リアルタイム定量ＰＣＲをRoche LightCycler machine（ロシュ社製、英国）で行った。プライマーを選択して、ゲノムＤＮＡで微量汚染されたＲＮＡサンプル生成物を得ることのないように、その可能性を排除した。
【０１３５】
さらに、全血液サンプルのＲＮＡをＱＰＣＲ法により分析した。ボランティアの血液をVacutainer Heparin CPT tubeに採取した。次に血液を、様々な濃度のＣＹＣ２０２又はＤＭＳＯで処理し、３０分毎にチューブを反転して、５％ＣＯ２の存在下３７℃で１．５時間、インキュベーターでインキュベートした。血液をその後、PAXgene tube（PreAnalytiX社製）に移動し、数回反転し、室温で２時間の最初のインキュベーションにより細胞を溶解させた後、−２０℃の場所に置いた。分析用に準備する場合には、血液を室温で約２時間放置して解凍し、使用説明書にしたがって処理した。デオキシリボヌクレアーゼ分解ステップを任意で含んだ。ＲＮＡサンプルは、定量後にＱＰＣＲアッセイで直接に使用した。
【０１３６】
プライマーを表１３に記載する。
【０１３７】
ワンステップ逆転写では、RNA Master SYBR Green I kit （ロシュ社製、英国）を使用した。２０μｌ反応体積において、１００ｎｇ又は１μｇの全ＲＮＡを、７．５μｌのRNA Master SYBR Green I、３．２５ｍＭ のMn(OAc)2、及び０．３μＭの各プライマーに添加した。反応条件は以下のようであった。ＲＴステップを６１℃で２０分間、次に変性ステップを９５℃で２分間、４５サイクルからなる増幅ステップを９５℃で５秒間、５５℃で５秒間、及び７２℃で１３秒間、次に、融解曲線分析ステップをプライマーダイマーと生成物を識別するために９５℃で５秒間、６５℃で１５秒間、及び０．１℃／秒で９５℃に上昇して行なった。最後に冷却ステップを４０℃で３０秒間行なって終了した。
ＱＰＣＲデータの分析
全サンプルを１μｇ／μｌにノーマライズし、等価なＲＮＡ全量をアッセイで使用した（対象のターゲット遺伝子により、１００ｎｇ又は１μｇ）。サンプルを複製し、ＰＣＲ反応を繰り返した。ＤＭＳＯ溶媒コントロールと比較した化合物の存在下、発現レベルにおけるfold changeを算出するための式を、以下のように計算した。
２ΔＣｔ
ここで２は、各ＰＣＲ反応の最大の効率であり、ΔＣｔはcrossing point valuesにおける変化である（サンプルCt - DMSOコントロールCt）。
【０１３８】
さらに、ハウスキーパー遺伝子の発現レベルをこれらのサンプルで測定し、データを次式の導関数を使用してノーマライズした。
【０１３９】
２ΔＣｔ target / ２ΔＣｔ housekeeper
結果
図１〜１７は、表１〜１２のマイクロアレイ・データで示される遺伝子発現データを有する１６遺伝子（ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、２０５８５、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、１８７４７、２２１４７、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ 及び ｍｃｌ−１）のグラフ表示を示す。ＰＢＭＣ並びに／又は、ＨＴ２９及び／若しくはＡ５４９の細胞における１６遺伝子の各々に対して得られたマイクロアレイ・データを、ＱＰＣＲ分析の結果と比較する。
【０１４０】
これらの結果をマイクロアレイ・データで確認する。
【実施例３】
【０１４１】
ＣＹＣ２０２で治療した患者における遺伝子発現の分析
患者サンプルの分析では、採血中及び採血直後におけるＲＮＡの発現特性を保存する方法は、ＱＰＣＲ法などの手法によりヒト全血の遺伝子発現の正確な分析をするためには重要である。室温での保存又は移動の間に、全血液中における個々のｍＲＮＡ種のコピー数は、１０００倍よりも大きく変化するということを、PreAnalytixは示している。これは、採血後、ある遺伝子の誘導性発現だけではなく、ＲＮＡの急速な分解により引き起こされる。
【０１４２】
よって、PAXgene（PreAnalytix社製、スイス）法を、細胞性ＲＮＡの単離のための迅速で効率的なプロトコルと一緒に使用して、全血検体を採取し、安定化及び運搬手段とした。このシステムの使用では、遺伝子発現における誤変動に関る問題に対して効果があり、わずか２．５ｍｌの全血から高品質のＲＮＡを数マイクログラム産生する。
方法論
ボランティアからの血液を、英国DundeeにあるHawkhill Medical CentreでVacutainer Heparin CPT tubeに採取し、実施例２に記載したように処理した。PAXgene tubeへ移動後、室温で２時間、最初のインキュベーションで細胞を溶解させた後、そのチューブを室温、４℃又は−２０℃の場所に置いた。
【０１４３】
様々な長さの時間、様々な保存条件で保存されている血液を、室温で約２時間放置してから、使用説明書にしたがって処理した。デオキシリボヌクレアーゼ（DNase）分解ステップを任意で含んだ。ＲＮＡサンプルは定量化して、ＱＰＣＲアッセイで直接使用した。
結果
ＲＮＡは、その収率は血液２．５ｍｌあたり３〜５μｇの間で様々であるが、許容できる品質を有している。ターゲット遺伝子（ＰＮＵＴＳ）及びハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）の発現をこれらの全サンプルにおいて測定した。
【０１４４】
図１８は、ＰＮＵＴＳの発現におけるＣＹＣ２０２の効果（下部パネル）、及びあるドナーの遺伝子発現のＣＹＣ２０２性変化における保存の効果（上部パネル）を示す。ＰＮＵＴＳの発現をハウスキーパーの発現にノーマライズし、グラフのデータを、インビトロの血液を３０μＭのＣＹＣ２０２に１．５時間接触後、ＰＮＵＴＳの発現におけるノーマライズしたfold decreaseとして表わした。
【０１４５】
これらの遺伝子発現は、すべてのサンプル中で検出され、ＣＹＣ２０２に血液を接触ことにより再現性よくダウンレギュレートされた（図１８の下部パネル）。最適条件は、−２０℃で保存することであるとされ、発現は、最初の１ヶ月間は−２０℃で安定しているように思われる（図１８の上部パネル）。これは４℃又は室温での保存よりも好ましく、製造者の勧告と一致する。
ＱＰＣＲアッセイの最適化
ＱＰＣＲアッセイの最適化を行なって、ポジティブシグナルとネガティブシグナルの相違を最大化し、遺伝子発現におけるfold changeについての的確な予測を可能にした。
【０１４６】
最適化はＲＮＡ増幅キットを使用して行なった。プライマー濃度、アニーリング温度及びＭｇＣｌ２濃度をすべて変更して、シグナルとノイズの最良の分離を得た。
【０１４７】
プライマーを最適化し、最終プライマーセットリストを表１４に示す。
【０１４８】
さらに、すべてのＰＣＲ産物をクローン化し、ＲＮＡが正確に増幅されたことを検証するために配列決定した。
ＣＹＣ２０２で治療した乳癌患者における遺伝子発現の分析
患者02-2-01 (08)を、１日目から５日目までは６００ｍｇのＣＹＣ２０２を１日２回、２日目から１５日目まではカペシタビン投与を経口で１日２回、併用して治療した。この患者に対して薬物動態解析を行なった。その結果、患者は有効なＣＹＣ２０２の値を数時間にわたり維持していたことが明らかになった。
【０１４９】
図１９は、患者02-2-01 (08)の薬物動態学的なデータを示し、１日目の完全な経時的データ及び５日目の投与前のある時点におけるデータを示す。ＣＹＣ２０２の血漿濃度をμＭで得る。インビトロのＰＮＵＴＳ及び他のターゲット遺伝子の影響を、ここで表わされる範囲内である、７．５〜１５μＭの濃度で１．５〜３時間観察した。
【０１５０】
この理由のため、治療１日目の複数の時点で、かかる患者の全血から抽出したＲＮＡの遺伝子発現に対する化合物の影響を分析することは有益であると思われた。ＰＮＵＴＳの発現をすべてのサンプルで検査し、このデータを安定的である２８ＳｒＲＮＡの発現レベルに対してノーマライズした。
【０１５１】
図２０は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＰＮＵＴＳの発現におけるfold decreaseを示すグラフである。ＰＮＵＴＳ発現は、最初のＣＹＣ２０２投薬後には約２〜３倍の減少となり、その後、５日目の投薬前に測定したときには正常のレベルに戻った。
【０１５２】
図２１は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のC/EBPαの発現におけるfold decreaseを示すグラフである。C/EBPα発現における減少は、最初のＣＹＣ２０２投薬から８時間後には約４．５倍となって、頂点に達し、その後、５日目の投薬前に測定したときには正常のレベルに戻った。
【０１５３】
図２２は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＦＵＴ４の発現におけるfold decreaseを示すグラフである。ＦＵＴ４発現における減少は、最初のＣＹＣ２０２投薬から３時間後には約２倍となって、頂点に達し、その後、最初の投薬後８時間までには、５日目の投薬前に測定したときには正常のレベルに戻った。
【０１５４】
図２３は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＮＭ＿０３３４１０の発現におけるfold decreaseを示すグラフである。ＮＭ ０３３４１０発現における減少は、最初のＣＹＣ２０２投薬から２時間後には約２倍となって、頂点に達し、その後、５日目の投薬前に測定したときには正常のレベルに戻った。
結論
遺伝子発現への影響の動態（kinetics）は、異なる遺伝子に対してＣＹＣ２０２を投薬後、異なる時間に起こる遺伝子発現の最大の影響をともなって、相当に変化する。ＰＮＵＴＳの場合、遺伝子発現の変化は、ＰＫデータに酷似する。すべてのＲＮＡサンプルを、１ｍｇ／ｍｌにノーマライズして希釈し、濃度を再度測定し、すべてのサンプルが同じ濃度であったことを確認した。さらにまた、２８ＳｒＲＮＡの発現を分析することで確認した。すべての遺伝子発現を２８ＳｒＲＮＡにノーマライズしたので、２８ＳｒＲＮＡにおけるあらゆる小さな変動には、サンプル間のＲＮＡ濃度のあらゆる小さな変化が取り入れることであろう。
【０１５５】
かかるデータでは次のことを確認する。本発明に見られる遺伝子発現の差動効果は、ＲＮＡ濃度の差異によるものではなく、末梢血単核細胞及び腫瘍細胞のインビトロのマクロアレイ実験及びＱＰＣＲ実験により浮き彫りにされたいくつかの遺伝子発現における、ＣＹＣ２０２で治療した患者に起こる本当の変化である。
【実施例４】
【０１５６】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用した血漿プロテオミクス特性の分析及びバイオマーカーの同定
ＳＥＬＤＩ
ＣＹＣ２０２治療の初日及び最終日に、患者から血漿サンプルを得た。異なる腫瘍タイプを有し、異なる投薬を受け、ＣＹＣ２０２の投与計画を予定している患者からなる全１６名の患者を、本調査において分析した。１０名の患者には、３週間毎に１日あたり１．６ｇ〜３．２ｇのＣＹＣ２０２を５日間続けて投与し、４名の患者には、３週間毎に１日あたり１．６ｇ〜２ｇのＣＹＣ２０２を１０日間続けて投与した、２名の患者には、３週間毎に１日あたり２．４ｇのＣＹＣ２０２を３日間投与した。全サンプルをアリコートで、−８０℃で保存した。
【０１５７】
サンプルを、４つの異なるProteinChip(R) Array表面で、Q Ceramic HyperD(R)F96 well plate（Ciphergen社製）におけるNeat又は分画のどちらかを分析した。かかる手法は、複雑な生物源からタンパク質を分離し、電荷に基づいて分画する。陰イオン交換吸着剤を、タンパク質の分画用にデザインし、イオン交換体と同様のｐＩ又は結合親和力を有するタンパク質を一緒に溶出する。これはまた、サンプルにおける極めて大量のタンパク質を、限定した数の画分に分離するという便益を提供し、ProteinChip(R) Array表面の容量を超えてはいないということを確実にするだけでなく、低存在量のタンパク質におけるシグナル抑制効果を減少させる。
【０１５８】
分画のために、２０μｌの各血漿サンプルを３０μｌのＵ９緩衝液（尿素９Ｍ、２％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ９のＴｒｉｓ−ＨＣｌを５０ｍＭ）で、３０分間室温で混合した。その後、Q HyperD(R) F plateに添加する前に、同量のＵ１緩衝液（尿素１Ｍ、０．２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのｐＨ９Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）で希釈した。分画は、ｐＨを連続的に低下させることによる溶離を基本的に含むExpression Difference MappingTM kitの使用説明書にしたがって完成させ、６画分を調製した。
【０１５９】
すべてのチップ表面を、以下に記載するような適当な結合緩衝液と平衡にした。分画したサンプルをその後、適当な結合緩衝液と１：１０の割合で希釈して様々な表面に使用した。NeatサンプルをＵ９緩衝液で１：６の割合に希釈し、室温で３０分間混合し、その後にまた、適当な緩衝液で１：１０の割合で希釈し、ProteinChip(R) Array表面に結合した。ＳＡＸ−２ 又は Ｑ１０ ProteinChip(R) Arraysは強陰イオン交換表面であり、サンプルを、ｐＨ９緩衝液（１００ｍＭのｐＨ９Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中でこれらのProteinChip(R) Arraysに使用した。ＷＣＸ２及びＣＭ１０チップは弱陽イオン交換表面であり、使用した緩衝液は１００ｍＭのｐＨ３．５ＮａＯＡｃ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００であった。１０％ ＡＣＮ + ０．１％ ＴＦＡ 及びＩＭＡＣ チップを利用した疎水性のチップ表面（Ｈ５０）を、使用説明書にしたがって０．１Ｍの硫酸銅で活性化した。全サンプルを、プラットフォームシェーカーを用いて室温で１時間結合させた。アレイを結合緩衝液で１回洗浄し、続いて界面活性剤非存在下において結合緩衝液で２回洗浄した。各々を、プラットフォームシェーカーを用いて５分間行なった。その後１０ｍＭのｐＨ７Ｈｅｐｅｓで簡単にすすぎ、空気乾燥させた。０．８μｌの５０％飽和シナピン酸（５０％のアセトニトリル、０．０５％ＴＦＡで調製）を、各スポットに対して２回使用した。次にタンパク質をProteinChip(R) Readerで検出した。データは、０〜５０，０００（低）、０〜１００，０００（中）、及び０〜２００，０００（高）、の３つの異なる質量範囲を使用して、１９０〜２１０の強度を有する平均値が約１５０のレーザーショットにより、収集した。
【０１６０】
Biomarker Wizard Softwareを使用して、全スペクトルを集め、２０００〜２００，０００の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有する適格な質量ピーク（信号対雑音比＞５）を、自動検出した。ピーククラスターは、second-passのピーク選択（信号対雑音比＞２、０．３％未満のmass window）を使用して完成し、推定のピークを加えた。ピーク強度を、該データが、質量範囲の低、中又は高のいずれから得られたかにより、２０００〜５０，０００、２０００〜１００，０００又は２０００〜２００，０００のｍ／ｚの全イオン電流にノーマライズした。これらのすべてを、ProteinChip(R) Software 3.1（Ciphergen社製）を使用して行なった。付加的な前処理段階では、ピーク強度データの対数変換のみを行なった。Biomarker Wizardにより、スペクトルの全サンプル群から類似の分子量のピークを分類し、サンプル群間の発現レベルの差異を統計的に及び視覚的に表示した。各サンプルの平均及び標準偏差を記録し、適当な統計学を使用した。非常に大きなデータセットに対してはパラメトリック検定を使用するが、この調査に対しては、データが小さすぎるので正規分布を有していないと判断し、ノンパラメトリック検定を行なった。ここでは、Mann-Whitney U testを使用してデータを分析し、０．０５未満のｐ値を、処理前又は処理後を表示し、２群の間において統計的に有意な差異と思われる各クラスター群に指定した。
二次元ゲル（2D gels）
一次元の等電点電気泳動に対しては、二次元ゲル電気泳動を、IPGPhor（Amersham Pharmacia Biotech社製）システムを使用して行ない、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対しては、Novex MiniCell（Invitrogen社製）システムを使用して行なった。
【０１６１】
使用説明書にしたがい、IPGphorにおいて、再水和緩衝液（８Ｍの尿素、２％ＣＨＡＰＳ、ブロモフェノール・ブルー、及びｐＨに対して適当な０．５％ ＩＰＧ 緩衝液）と、５μｌの血漿サンプルと、２０ｍＭのＤＴＴを、２０℃で１６時間使用してｉｎ−ｇｅｌ再水和により、等電点電気泳動に対するサンプルを、Immobiline DryStrips（７ｃｍ、ｐＨ３〜１０（linear）又はｐＨ４〜７）に添加した。１ストリップ当り５０ｍＡの定電流で８時間を超えて総量約４００００Ｖを使用して、タンパク質を一次元に集束させた。等電点電気泳動後、Immobiline DryStripsを、５０ｍＭのｐＨ８．８Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍの尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノール・ブルー及び１０ｍｇ／ｍｌのＤＴＴを含む平衡緩衝液で、３０分間室温で平衡化した。さらに１５分間、ＤＴＴを含まないが、２５ｍｇ／ｍｌのヨードアセトアミドを含む平衡緩衝液で平衡化した。
【０１６２】
二次元電気泳動を、４〜１２％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して行なった。集束した／平衡したImmobiline DryStripsをＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅゲルと直接に接触して置き、タンパク質を１５０Ｖの定電圧でブロモフェノール・ブルーがゲルの底部に達するまで電気泳動を使用して分離した。
【０１６３】
Colloidal Blue staining （Invitrogen社製）を、使用説明書にしたがって行ない、対象のスポットを複製ゲルから切り取って、受動溶出（passive elution）によりタンパク質の同定及びタンパク質の抽出のために平行して処理した。
タンパク質の同定
タンパク質同定のために、ゲル片を１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム／５０％アセトニトリル中で連続してインキュベートし、１０分間の洗浄を３回行ない、過剰の染色及びＳＤＳを除去し、その後１００％アセトニトリルで５分間行なった。この溶液を除去し、ゲル片をヒートブロックで簡単にインキュベートし、ゲル片を脱水した。トリプシン（２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム中に１０ｎｇ／ｕｌのPromega porcine trypsin）を添加して、ゲル片を３７℃で一晩インキュベートしてタンパク質を消化した。トリプシン消化が成功したかどうかを確認するために、サンプルをＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。この分析を行なうために、０．５μｌのトリプシン消化物を０．５μｌの２０％α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）基質溶液と、５０％のＡＣＮ、０．５％のＴＦＡ中で混合し、ＮＰ２０チップに添加した。タンパク質を同定するために、ペプチド消化物をUniversity of Dundee 'FingerPrints' Proteomics Facilityに提出した。消化物はABI 4700 Proteomics Analyzer with Tof/Tof OpticsのＭＳ及びＭＳ−ＭＳによって分析された。消化した各ゲルスポットのペプチド質量指紋で組み合わせたＭＳ及びＭＳ−ＭＳデータを、Matrix Science社製のMascot検索エンジンを用いてＣＤＳデータベースを検索するために使用した。
受動溶出（Passive elution）
受動溶出手法を使用して、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦで再分析が可能となるように、ゲル片からタンパク質の抽出を行なう。ゲル片を、シェーカーを用いて１００％アセトニトリルで５分間インキュベートし、溶液を除去し、ゲル片をヒートブロックにしばらく置いて乾燥させた。その後、ＦＡＰＨ溶液（５０％ギ酸、２５％アセトニトリル、１５％イソプロパノール、１０％水）をゲル片及び室温で３０分間超音波処理したサンプルに添加した。さらに２〜３時間ボルテックスし、ＮＰ２０チップに添加して、その受動溶出液の特性を、バイオマーカーを明らかにするオリジナルのサンプルスペクトルの特性と比較した。
４．１ １４ｋＤａバイオマーカーの同定及びトランスサイレチン（Transthyretin）であることの証拠
処理により増加した１４ｋＤａバイオマーカーを、ＩＭＡＣ−Ｃｕ２＋及びＳＡＸチップの両方で同定した。ｐＨ９におけるＳＡＸチップの分画４の分析から得られた Biomarker Wizardデータを、患者の代表的な特性と同様に示す。
【０１６４】
図２４：上部半分：ｐＨ９のＳＡＸチップにおける１ｂ期の患者１６名の分画４の分析のBiomarker Wizardプロット。１３．５ｋＤａ〜１４．６ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを青（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを赤（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準の強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらずサンプル群間の差異を表現する。
【０１６５】
下部半分：処理後の付加的ピークの出現を示している患者２名の代表的なスペクトル。統計的に有意に、より高度にノーマライズした強度を、Ｍ／Ｚ１４２５５（49.7+/-8.4 vs 20.4+/-3.9; p=0.0000031, Mann-Whitney U test）に対して、「処理後」グループを「処理前」グループと比較して観察した。
【０１６６】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析後、患者４名のサンプルをｐＨ４〜７に固定したｐＨ勾配ストリップに添加して、等電点（電荷）にしたがってタンパク質を分離した。等電点電気泳動後、大きさにより二次元分離を行なった。処理の初日と最終日の差異を観察するために、ゲルをColloidal blue染色で染色した。その変化を四角で囲んで強調する。
【０１６７】
図２５は患者の血漿の二次元ゲルを示す。Neat血漿サンプルをｐＨ４〜７のＩＰＧストリップに添加し、電荷により一次元においてタンパク質を分離し、次に、二次元においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさで分離した。分子量サイズマーカーは各ゲルの左にある。対象のスポットは、各ゲルの左に示される１４ｋＤａ〜１７ｋＤａマーカーにちょうど存在する。下部のゲルは、変化が再現可能ということを示し、さらに２名の患者の拡大図を表わす。
【０１６８】
各サンプルの上部２つのゲルスポットを、トリプシン消化物及び受動溶出のために平行して切り取り処理し、ゲルからタンパク質を溶出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦにおける再分析を可能にした。受動溶出サンプルを、ＮＰ２０チップに添加して、タンパク質ピークの大きさ及び特性を検査し、それらがバイオメーカーピークそのものに類似しているかどうかを判断した（図２５）。平行サンプルを、トリプシン消化及びペプチド・マッピングのために処理し、これらのスポットは、University of Dundee Proteomics facilityで、ＭＳ及びＭＳ−ＭＳの両方により、トランスサイレチンとして同定された。
【０１６９】
図２６は、オリジナルＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ特性と二次元ゲルから抽出した受動溶出サンプルとの比較を示す。ゲルを複製し、各サンプル（１日目又は１０日目）における約１４ｋＤａの２つのスポットを、受動溶出又はトリプシン消化のために平行して切り取り処理した。受動溶出により、ゲルスライスからタンパク質の抽出が可能となり、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析を行なうことができる。これは上部４つの特性に示し、サンプルのオリジナルＳＥＬＤＩ特性と比較する（最下部の２つのスペクトルで示す）。１日目のスポット２の受動溶出では、このスポットは処理前にColloidal染色で極めて弱く染色されるという知見と一致して、いかなる特性も生じなかった。受動溶出特性はあまり分離されない傾向にあるが、それにもかかわらず、点線で示されるように、オリジナルＳＥＬＤＩ特性の２つのピークで完璧に整列するように思われ、余分のスポットは、１０日目に存在し、Biomarker Wizardにより同定された１４２５５バイオマーカーで完璧に整列する。トリプシン消化物をUniversity of Dundeeで分析した。
【０１７０】
２つの下部スポットは、処理により変化するようには思えなかったが、トリプシン消化によっても分析され、ハプトグロビンとして同定された。
【０１７１】
そのサンプル前後における２つの上部スポットは、すべてトランスサイレチンとして同定された。これは、新規で異なったタンパク質の出現というよりも、タンパク質のさらなる酸性型をもたらす、処理後のユニークなスポットはトランスサイレチンの翻訳後修飾によるということを示唆した。受動溶出後のサンプルにおけるタンパク質の同定及び分析の平行判定では、Biomarker Wizardにより同定された１４ｋＤａバイオマーカーは事実上トランスサイレチンであるという明解な証拠を示す。
【０１７２】
二次元ゲルのスポットに対する２つのピークは、約３３２〜３４１Ｄａ隔てられていた。大きさの違いは、Delta Mass Reference Database for Protein Translational Modifications (http://www.abrf.org)で判断されたように、タンパク質のＳ−パルミトイルシステイニル修飾を示し、ＣＹＣ２０２の処理後に認められたＴＴＲの付加的な酸性型は、Ｓ−パルミトイルシステイニルが原因であるかもしれないということを示唆している。
４．２ ２８ｋDａバイオマーカークラスター、アポリポタンパク質Ａ１の同定
統計的に有意な２つの２８ｋＤａバイオマーカーは、処理により減少した４チップすべての表面に存在していたということが同定された。これら２つのピークに隣接して付加的な２つのピークが認められたが、統計的に有意な程度ではなかった。それにもかかわらず、処理に対して再現性よく変化するように思われた。ｐＨ９のＳＡＸチップにおける分画４の分析から得られたBiomarker Wizardデータを、患者の代表的な特性と同様に図２６に示す。
【０１７３】
ＣＹＣ２０２による処理は、２７９２３及び２８１２６における２つのピークで減少をもたらす。一方、統計的に有意な程度ではない２８２９２及び２８７９９におけるピークでは、それにもかかわらず、処理後に劇的に増加するように思われる。
【０１７４】
図２７：上部半分：ｐＨ９のＳＡＸチップにおける１ｂ期の患者１６名の分画４の分析のBiomarker Wizardプロット。２６．５ｋＤａ〜３０．５ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを青（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを赤（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。
【０１７５】
下部半分：処理後の最初の２つのバイオマーカーに対する最初の２つのピークの減少、及び第３バイオマーカーに対する第３ピークにおける出現又は増加を示す患者２名の代表的なスペクトル。統計的に有意に、より低度にノーマライズした強度を、Ｍ／Ｚ２７９２３（31.8+/-13.7 vs 50.6+/-11.8; p = 0.00097, Mann-Whitney U test）及びＭ／Ｚ２８１２６（20.4+/-9.9 vs 32.0+/-9.6; p = 0.0058, Mann-Whitney U test）に対して、「処理後」グループを「処理前」グループと比較して観察した。Ｍ／Ｚ２８２９２及びＭ／Ｚ２８７９９における２つのマーカーは、統計的に有意（各々p = 0.95及び0.19）であるとは思えず、２名の患者の処理後における明らかな増加であると思われる程度である。
【０１７６】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析後、患者４名のサンプルをｐＨ４〜７に固定したｐＨ勾配ストリップに添加して、等電点（電荷）にしたがってタンパク質を分離した。等電点電気泳動後、大きさにより二次元分離を行なった。処理の初日と最終日の差異を観察するために、ゲルをColloidal blue染色で染色した。その変化を四角で囲んで強調する。
【０１７７】
図２８は患者の血漿の二次元ゲルを示す。Neat血漿サンプルをｐＨ４〜７のＩＰＧストリップに添加し、電荷により一次元においてタンパク質を分離し、次に、二次元においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさで分離した。分子量サイズマーカーは各ゲルの左にある。対象スポットは、２８ｋＤａマーカーの下にちょうど存在する。
【０１７８】
図２８の画像は、さらに２名の患者の二次元ゲルの拡大図を表わし、処理後の付加的なさらなる酸性スポットの出現を示す。
【０１７９】
図２９：処理後の第３のさらなる酸性スポットの出現、及びBiomarker Wizard プロットに一致する最初のスポットでの中程度の減少を示している２０９患者及び１１６患者に対する二次元ゲルの拡大図。
【０１８０】
その後、２０９患者１日目のサンプルを、広域範囲のｐＨ（ｐＨ３〜１０）のＩＰＧストリップに添加して、ひとつの未分解スポットを得た。この物質を含むゲルスポットをゲルから切り取り、受動溶出を行なってゲル片からタンパク質を抽出した。その後、ＮＰ２０チップに添加して、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによりタンパク質の大きさ及び特性を検査した（図３０）。
【０１８１】
平行サンプルを、トリプシン消化及びペプチド・マッピングのために処理し、University of Dundee Proteomics facilityで、ＭＳ及びＭＳ−ＭＳの両方により、アポリポタンパク質Ａ１であると同定した。
【０１８２】
同じ処理を、上記で示した分離したアポＡ１スポットにおいて行なった。すべてのスポットを、処理後のユニークスポットは新規で異なるタンパク質の出現というよりもアポＡ１の翻訳後修飾によるということを示唆するアポＡ１であると同定した。これは、全１６名の患者にとっては統計的に有意な程度には達しない２８．２９２における第３のバイオマーカーに最も応答したようであった。
【０１８３】
図３０：ｐＨ３〜１０のＩＰＧストリップを用いた患者の血漿の二次元ゲル分析。ゲルを複製し、２８ｋＤａにおけるスポットを、受動溶出又はトリプシン消化のために平行して切り取り処理した。受動溶出により、ゲルスライスからタンパク質の抽出が可能となり、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析を行うことができる。これは下部の特性に示し、オリジナル２０９の１日目のサンプルと有利に比較する―上部特性。トリプシン消化物をUniversity of Dundeeで分析した。
【０１８４】
受動溶出後のサンプルのタンパク質同定及び分析の平行判定では、ＳＥＬＤＩにより同定された２８ｋＤａバイオマーカーは事実上アポリポタンパク質Ａ１であるという明確な証拠を示している。従って、ＣＹＣ２０２処理によって変化しているとしてBiomarker Wizardにより同定された２８ｋＤａピークは、アポリポタンパク質Ａ１（アポＡ１）である。アポＡ１は、グリコシル化、アシル化及びリン酸化などの翻訳後修飾の対象となる。アポＡ１の脱アミド化した型もまた同定されている。
４．３ ７ｋＤａバイオマーカー・クラスターの同定
処理後においてのみ現れる７ｋＤａバイオマーカーのクラスターを、いくつかのチップ表面で同定した。ｐＨ９のＨ５０チップにおける分画６、及びＣＭ１０チップにおけるNeat血漿の分析のBiomarker Wizardデータを、数名の患者の典型的な特性と同様に示す。
図３１：上部半分：Ｈ５０チップにおける１ｂ期の患者１６名の分画６の分析のBiomarker Wizardプロット。５ｋＤａ〜８．５ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。
【０１８５】
下部半分：処理後の付加的な２つのピークの出現を示す患者３名の代表的なスペクトル。統計的に有意に、より高度にノーマライズした強度を、Ｍ／Ｚ６７９９（2.9+/-1.2 vs 29.1+/-8.1; p=0.0000031, Mann-Whitney U test）及び Ｍ／Ｚ６９９８（2.1+/-0.7 vs 42.0+/-9.1; p=0.0000031, Mann-Whitney Utest）に対して、「処理後」グループを「処理前」グループと比較して観察した。
【０１８６】
図３２：上部半分：ＣＭ１０チップにおける１ｂ期の患者１６名のNeat 血漿の分析のBiomarker Wizardプロット。６ｋＤａ〜８ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを青（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを赤（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。
【０１８７】
下部半分：処理後の付加的な２つのピークの出現を示す患者３名の代表的なスペクトル。統計的に有意に、より高度にノーマライズした強度を、Ｍ／Ｚ６７８７（5.6+/-1.9 vs 27.5+/-10.4; p=0.0000014, Mann-Whitney U test）及び Ｍ／Ｚ６９８４（3.1+/-1.2 vs 42.2+/-11.8; p=0.0000014, Mann-Whitney Utest）に対して、「処理後」グループを「処理前」グループと比較して観察した。
【０１８８】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析後、患者（２０９）のサンプルをＣＭ１０チップに添加して、タンパク質の結合特性を検査した。結合はｐＨ３．５の８スポットすべてにおいて行なわれており、チップスポットをｐＨを上げながら、ｐＨ３．５、４．５、５．５、及び７で洗浄した。バイオマーカーは、ｐＨ４．５以下で洗浄した場合に、チップに存在するのみであり、タンパク質のｐＩは約４．５〜５であることを示唆している。
【０１８９】
本明細書の上述部分に例挙された出版物、それらの出版物に引用された文献は、参照することによって本明細書に組み込まれる。記載した本発明の方法やシステムの様々な改良や変形は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、当業者に明らかとなるであろう。本発明は、具体的な好ましい実施例に関して説明してきたが、本発明が請求するように、これらの具体的な実施例に不当に限定されるべきではないことは、理解されるであろう。実際には、分子生物学及び関連する分野の当業者には自明であるところの、前述の態様についての本発明を実施する上での様々な改良も、本発明の範囲に含まれるものとする。
【０１９０】
（表の簡単な説明）
表１は、ＰＢＭＣのＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、１．５時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表１】
【０１９１】
表２は、ＰＢＭＣのＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、３時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表２】
【０１９２】
表３は、１．５時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表１に記載したプローブ）。
【表３】
【０１９３】
表４は、３時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表２に記載したプローブ）。
【表４】
【０１９４】
表５は、ＨＴ２９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、１．５時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表５】
【０１９５】
表６は、ＨＴ２９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、３時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表６】
【０１９６】
表７は、１．５時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表５に記載したプローブ）。
【表７】
【０１９７】
表８は、３時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表６に記載したプローブ）。
【表８】
【０１９８】
表９は、Ａ５４９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、２時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表９】
【０１９９】
表１０は、Ａ５４９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、４時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表１０】
【０２００】
表１１は、２時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表９に記載したプローブ）。
【表１１】
【０２０１】
表１２は、４時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表１０に記載したプローブ）。
【表１２】
【０２０２】
表１３は、ＱＰＣＲ分析で使用したプライマーの配列を示す。
【表１３】
【０２０３】
表１４は、ＱＰＣＲ分析で使用した最適化されたプライマーの配列を示す。
【表１４】
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、ＡＤＭに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図２】図２は、ＦＡＤＤに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図３】図３は、ＰＡＩ１に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図４】図４は、ＰＬＡＵに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図５】図５は、ＰＮＵＴＳに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図６】図６は、ＴＮＦＳＦ１４に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図７】図７は、Ｃ／ＥＢＰαに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図８】図８は、２０５８５に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図９】図９は、ＦＵＴ４に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１０】図１０は、Ｅ２Ｆ６に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１１】図１１は、１８７４７に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１２】図１２は、２２１４７に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１３】図１３は、ＺＫ１に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１４】図１４は、ＫＩＡＡ１６９８に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１５】図１５は、ＣＣＲＬ２に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１６】図１６は、ｍｙｃに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１７】図１７は、Ｍｃｌ １に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較示す。
【図１８】図１８は、ＰＡＸ遺伝子システムを使用して数人のドナーから調製した血液中でのＰＮＵＴＳの発現におけるＣＹＣ２０２の効果（下部パネル）、及びあるドナーの遺伝子発現のＣＹＣ２０２性変化における保存の効果（上部パネル）を示す。
【図１９】図１９は、患者02-2-01(08)の薬物動態学的なデータを示し、１日目の完全な経時的データ及び５日目の投与前のある時点におけるデータを示す。ＣＹＣ２０２の血漿濃度をμＭで得る。
【図２０】図２０は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＰＮＵＴＳの発現におけるfold decreaseを示すグラフである。
【図２１】図２１は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＣＥＢＰの発現におけるfold decreaseを示すグラフである。
【図２２】図２２は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＦＵＴ４の発現におけるfold decreaseを示すグラフである。
【図２３】図２３は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＮＭ＿０３３４１０の発現におけるfold decreaseを示すグラフである。
【図２４】図２４：上部半分：ｐＨ９のＳＡＸチップにおける１ｂ期の患者１６名の分画４の分析のBiomarker Wizardプロット。１３．５ｋＤａ〜１４．６ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを（ｔ）で示す。下部半分：処理後の付加的ピークの出現を示す患者２名の代表的なスペクトル。
【図２５】図２５は患者の血漿の二次元ゲルを示す。Neat血漿サンプルをｐＨ４〜７のＩＰＧストリップに添加し、電荷により一次元においてタンパク質を分離し、次に、二次元においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさで分離した。分子量サイズマーカーは各ゲルの左にある。対象のスポットは、各ゲルの左に示される１４ｋＤａ〜１７ｋＤａマーカーにちょうど存在する。下部のゲルは、変化が再現可能ということを示し、さらに２名の患者の拡大図を表わす。
【図２６】図２６は、オリジナルＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ特性と二次元ゲルから抽出した受動溶出サンプルとの比較を示す。ゲルを複製し、各サンプル（１日目又は１０日目）における約１４ｋＤａの２つのスポットを、受動溶出又はトリプシン消化のために平行して切り取り処理した。受動溶出により、ゲルスライスからタンパク質の抽出が可能となり、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析を行なうことができる。これは上部４つの特性に示し、サンプルのオリジナルＳＥＬＤＩ特性と比較する（最下部の２つのスペクトルで示す）。
【図２７】図２７：上部半分：ｐＨ９のＳＡＸチップにおける１ｂ期の患者１６名の分画４の分析のBiomarker Wizard プロット。２６．５ｋＤａ〜３０．５ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。下部半分：処理後の最初の２つのバイオマーカーに対する最初の２つのピークの減少、及び第３バイオマーカーに対する第３ピークにおける出現又は増加を示す患者２名の代表的なスペクトル。
【図２８】図２８は患者の血漿の二次元ゲルを示す。Neat血漿サンプルをｐＨ４〜７のＩＰＧストリップに添加し、電荷により一次元においてタンパク質を分離し、次に、二次元においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさで分離した。分子量サイズマーカーは各ゲルの左にある。対象スポットは、２８ｋＤａマーカーの下にちょうど存在する。
【図２９】図２９は２０９患者及び１１６患者に対する二次元ゲルの拡大図を示す。
【図３０】図３０は、ｐＨ３〜１０のＩＰＧストリップを用いた患者の血漿の二次元ゲル分析を示す。ゲルを複製し、２８ｋＤａにおけるスポットを、受動溶出又はトリプシン消化のために平行して切り取り処理した。
【図３１】図３１：上部半分：Ｈ５０チップにおける１ｂ期の患者１６名の分画６の分析のBiomarker Wizardプロット。５ｋＤａ〜８．５ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。下部半分：処理後の付加的な２つのピークの出現を示す患者３名の代表的なスペクトル。
【図３２】図３２：上部半分：ＣＭ１０チップにおける１ｂ期の患者１６名のNeat 血漿の分析のBiomarker Wizardプロット。６ｋＤａ〜８ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。下部半分：処理後の付加的な２つのピークの出現を示す患者３名の代表的なスペクトル。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤用の薬力学的マーカー（pharmacodynamic markers）に関する。特に、本発明は、ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）として知られる候補物質２，６，９−三置換プリン用及びロスコビチン様化合物用の薬力学的マーカーに関する。これらのマーカーの同定によって、インビトロ 及びインビボの両方において、ロスコビチン様活性の簡便な検出が容易となる。
【背景技術】
【０００２】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ）のファミリーの増加が確認されている。これらの阻害剤は多様なＣＤＫファミリーメンバーに対して様々な活性を有する。通常、これらの阻害剤はＣＤＫのＡＴＰ結合ポケットに結合する。
【０００３】
２，６，９−三置換プリンは、癌、白血病及び糸球体腎炎などの増殖性疾患の治療に使用されるＣＤＫＩとして有望な化合物の、よく研究されたクラスとなりつつある。Fischer P & Lane D (Curr Med Chem (2000), vol 7, page 1213)は、ＣＤＫＩの起源及びその発見された活性の検討を詳細に示している。特に、ロスコビチンは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９を阻害し、Ｇ１後期／Ｓ期初期及びＭ期に細胞サイクルの進行を阻止することが証明されてきた。Ｒ−ロスコビチンとして知られる化合物（Ｒ）−２−［（１−エチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリンは、国際公開番号第ＷＯ９７／２０８４２号（Meijer L et al）に初めて記載されてから、有望な抗癌剤候補として開発されてきた。
【０００４】
このような薬剤の開発においては、投与における実際の作用機序を理解し、毒性及び投与に関する監督機関の要件を満たすために、薬物動態学的調査及び薬力学的調査を広範囲に実施しなくてはならない。これらの分析は、候補薬剤の活性の特定の機序を確認するために、細胞サイクル制御系に関する複雑な生化学や、薬剤の臨床開発期間前に実施される詳細な研究に基づいて行われる。
【０００５】
薬物動態学的及び薬力学的な調査における特に有利な点は、その候補薬剤に対する特異的な活性のマーカーの同定である。
【０００６】
本発明は、表１〜１２のいずれかに記載した多くの遺伝子が、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ロスコビチンの活性に対して、特異的薬力学的（ＰＤ）マーカー、又は「バイオマーカー」として作用するという知見に関する。特に、同定された遺伝子の発現は、ロスコビチン処理後に、アップレギュレート又はダウンレギュレートされる。
【０００７】
さらに、本発明は、多くの遺伝子はタンパク質として発現し、ロスコビチン活性に対する薬力学的マーカーであるタンパク質マーカーとして作用できるという知見に関する。よって、本発明は、ロスコビチン活性に対する特異的薬力学的マーカーとしてのタンパク質マーカーの同定、及び特に２８ｋＤａ及び１４ｋＤａマーカーの同定に関する。これらのマーカーは、各々アポリポタンパク質Ａ１及びトランスサイレチンが適当である。これらのタンパク質マーカーは、ロスコビチン処理後、アップレギュレート又はダウンレギュレートする発現を有するタンパク質となるか、或いは、ロスコビチン処理前の、翻訳後修飾された形、つまり、より広い範囲若しくはより狭い範囲で、検出不可能又は検出可能の形に変化する。
【特許文献１】国際公開番号第ＷＯ９７／２０８４２号
【非特許文献１】Fischer P & Lane D (Curr Med Chem (2000), vol 7, page 1213)
【発明の開示】
【０００８】
よって、最初の態様では、
ａ）細胞、細胞群、モデル動物又はヒトがＣＤＫＩで処理されている当該細胞、細胞群、モデル動物又はヒトからサンプルつまり、「処理サンプル」を単離するステップ、及び
ｂ）未処理コントロールサンプルと比較して、処理したサンプルにおけるｉ）表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子ii）２８ｋＤａのタンパク質、若しくはiii）１４ｋＤａのタンパク質のうち、少なくとも１つの発現の変化をＣＤＫＩ活性の指標として、決定するステップ
を含む、ＣＤＫＩ活性のモニタリング方法を示している。
【０００９】
遺伝子発現を含む発現の変化の検出は、当業界で公知の方法、特に本明細書に記載したようなマイクロアレイ分析、ウェスタンブロット法又はＱＰＣＲなどのＰＣＲ法により行なうことができる。発現の変化はまた、本明細書に記載したＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの方法を用いて、さらに二次元ゲル電気泳動法などの分析手法を用いて、サンプルのタンパク質含有量を分析することにより検出できる。これらの手法は、タンパク質の別の翻訳後修飾された形において発現の変化を検出するのに特に有用である。
【００１０】
ある実施態様では、「発現の変化（altered expression）」とは、表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子の遺伝子発現の増加又は減少のことである。表１〜１２に記載した遺伝子は、ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、２０５８５、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、１８７４７、２２１４７、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ及びｍｃｌ−１から選択するのが適当である。
【００１１】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の変化は、未処理サンプルと比較して発現の減少となることが適当である。或いは、発現の変化は、未処理サンプルと比較して増加している。
【００１２】
例えば発明がエキソビボで行われた場合、ロスコビチンなどのＣＤＫＩの薬力学的調査は、好ましくは細胞群さらに好ましくは細胞培養物で行われる。好ましい細胞の型を、ＨＴ２９などの結腸腫瘍細胞株、Ａ５４９などの肺腫瘍細胞株、Ａ４９８などの腎腫瘍細胞株、ＨＴ１３などの膀胱腫瘍細胞株、ＭＣＦ７などの乳房腫瘍細胞株、ＡＮ３ＣＡなどの子宮内膜腫瘍細胞株、ＭＥＳＳＡ ＤＨ６などの子宮腫瘍細胞株、子宮肉腫細胞、Ｈｅｐ２Ｇなどの肝腫瘍細胞株、ＤＵ１４５などの前立腺腫瘍細胞株、Ｃｅｍ Ｔ細胞などのＴ細胞腫瘍細胞株、ＭｉａＰａＣａ２などの膵腫瘍細胞株から選択する。或いは、細胞は、腫瘍生検の組織学的サンプルの形であってもよい。別にまた、細胞はＰＢＭＣなどの血液細胞培養物であってもよい。
【００１３】
遺伝子発現の変化を含む発現の変化を、哺乳動物又はヒトから得たサンプルにおいてモニタリングすることが適当である。適当なサンプルには、生検、血液、尿、口腔擦過などの組織サンプルが含まれる。ある実施態様では、遺伝子発現を腫瘍細胞、特に、乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜腺癌及び前立腺癌などの腫瘍由来の細胞、並びに白血病、又はリンパ球及び好ましくはＰＢＭＣのような末梢リンパ球などの血液細胞から検出することが好ましい。他の実施態様では、タンパク質発現の変化を、哺乳動物若しくはヒトの血清又は血漿サンプルで検出する。
【００１４】
これらの好ましい実施態様では、ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、２０５８５、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、１８７４７、２２１４７、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ及びｍｃｌ−１のいずれか１つの存在を、腫瘍細胞で、特に結腸若しくは肺腫瘍由来の細胞で、又はリンパ球及び好ましくはＰＢＭＣのような末梢リンパ球などの血液細胞から検出することが好ましい。
【００１５】
好ましい実施態様では、細胞群は細胞培養物であり、好ましくはＰＢＭＣ、ＨＴ２９及びＡ５４９の細胞から選択される。
【００１６】
他の実施態様では、細胞群は、腫瘍細胞、ＰＢＭＣ又はリンパ球である。
【００１７】
サンプルは血液であることが適当である。或いは、サンプルは、レーザー・キャプチャー・マイクロ手術で得られるサンプルなどの腫瘍生検であってもよい。
【００１８】
該方法には、前記サンプルからのＲＮＡの抽出、及びＱＰＣＲ法による遺伝子発現の検出がさらに含まれることが好ましい。
【００１９】
他の実施態様では、例えばウエスタンブロット法でタンパク質生成物を検出することにより遺伝子発現を検出する。
【００２０】
他の実施態様では、「発現の変化」とは、たんぱく質発現の変化パターンである。発現の変化とは、２８ｋＤａタンパク質の減少となることが適当である。また、タンパク質発現の変化は、未処理コントロールサンプルと比較して、処理したサンプルの２８ｋＤａタンパク質若しくは１４ｋＤａタンパク質の１以上の翻訳後修飾の存在又は不在であってもよい。２８ｋＤａタンパク質はアポリポタンパク質Ａ１であり、１４ｋＤａタンパク質はトランスサイレチンであることが好ましい。
【００２１】
タンパク質発現の変化を検出する場合、サンプルは血清、血漿又は組織培養上清であることが適当である。或いは、サンプルは、レーザー・キャプチャー・顕微鏡法で得られるサンプルなどの腫瘍生検であってもよい。
【００２２】
血清、特に患者の血漿サンプルにおけるタンパク質の検出では、サンプルを切り取り、本明細書に記載のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどのタンパク質分析法の対象とする。
【００２３】
上記に列挙したいずれかの実施態様に従った好ましい実施態様の方法では、ＣＤＫＩはロスコビチン活性を有する化合物であり、ロスコビチン又はロスコビチン類似体若しくは誘導体であることが好ましい。最も好ましいロスコビチンはＲ−ロスコビチンである。ロスコビチンを哺乳動物及び好ましくはヒトに投与することが適当である。
【００２４】
本発明の他の態様では、ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現変化をモニタリングすることを含む、ロスコビチンの適切な投与量を決定する方法を示している。
【００２５】
さらなる態様では、ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、２８ｋＤａ又は１４ｋＤａタンパク質の発現変化をモニタリングすることを含む、ロスコビチンの適切な投与量を決定する方法を示している。
【００２６】
他の態様では、候補薬剤を細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、及び未処理コントロールサンプルと比較して、処理したサンプルにおけるｉ）表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子、ii）２８ｋＤａのタンパク質、若しくはiii）１４ｋＤａのタンパク質のうち、少なくとも１つの発現の変化を、ＣＤＫＩ活性の指標として、検出するステップを含む、ＣＤＫＩ様活性を有する候補薬剤の同定方法を示す。この態様では、候補薬剤は、そのバイオマーカーの発現の変化において、周知のＣＤＫＩを使用して得られたパターンと類似のパターンを示すであろう。
【００２７】
ＣＤＫＩ好ましくはロスコビチンの活性のモニタリングにおける、表１〜１２に記載した少なくとも１つ遺伝子、又はアポリポタンパク質Ａ１若しくはトランスサイレチンをコードする遺伝子の使用。ロスコビチンなどのＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子、又は２８ｋＤａ若しくは１４ｋＤａのタンパク質の存在をモニタリングすることが適当である。
【００２８】
ロスコビチンなどのＣＤＫＩの活性を評価するキットには、核酸プライマー又は本明細書に記載した少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質に対する抗体が含まれて作製されることもある。該キットを、上述の、ロスコビチン活性のモニタリング方法、ロスコビチン投与量の決定方法又は候補薬剤のロスコビチン様活性の評価方法のいずれの方法に従って使用してもよい。
【００２９】
さらなる態様では、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子によりコードされたタンパク質、又は２８ｋＤａ若しくは１４ｋＤａのタンパク質に対する抗体を含む、ロスコビチンなどのＣＤＫＩ活性評価用キットを示している。そのようなキットには、本明細書に記載した遺伝子のタンパク質生成物を、単独で又は本明細書に記載した他の遺伝子に対する抗体と組み合わせて認識する抗体を含むことが適当である。
【００３０】
本明細書に記載した遺伝子又はタンパク質に対する抗体は、商業的供給源から、又は当業者にとって周知の手法により得ることができる。ある実施態様では、発現の変化をタンパク質バイオマーカーの翻訳後修飾された形の発現の変化によりそれ自体を明示する場合、それらの異なる形に対する特異的な抗体を使用することもある。
【００３１】
さらに他の態様では、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子に対する核酸プローブなどの遺伝子発現を検出するためのプローブを含む、ロスコビチンなどのＣＤＫＩ活性評価用キットを示している。例えば、適当なキットとは、本明細書に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現を検出するためのプライマーを含むＱＰＣＲ分析法のキットである。適当なプラーマーの例を、表１３及び１４に記載する。ＱＰＣＲ分析法のキットは、少なくとも１つの遺伝子を検出することもあり、また、本明細書に記載した他の遺伝子に対するプライマーを含むこともあるというのが適当である。タンパク質サンプルの分析により検出した発現の変化に対して、キットには、２８ｋＤａ又は１４ｋＤａのタンパク質検出のために、緩衝液、チップ及び品質管理用のコントロール（すなわち、周知のpositives又はnegatives）が含まれることもある。適当な緩衝液及びチップを本明細書に記載する。
【００３２】
他の態様では、
（ｉ）ＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、
（ii）処理した及び未処理の細胞、動物又はヒト由来のサンプルにおいて、遺伝子発現を測定するステップ、及び
（iii）未処理サンプルと比較して、処理したサンプルにおいて、表１〜１２のいずれかに記載した少なくとも１つの遺伝子、又は２８ｋＤａ若しくは１４ｋＤａタンパク質の遺伝子発現の増加又は減少を、ＣＤＫＩ活性の指標として、検出するステップ
を含む、ＣＤＫＩ活性のモニタリング方法を示している。
【００３３】
さらなる態様では、
（ｉ）ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、
（ii）処理した及び未処理の細胞、動物又はヒト由来のサンプルにおいて、遺伝子発現を測定するステップ、及び
（iii）未処理サンプルと比較して、処理したサンプルにおける表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の増加又は減少を、ロスコビチン活性の指標として、検出するステップ
を含む、ロスコビチン活性のモニタリング方法を示している。
【００３４】
他の態様では、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子のレベルが、ロスコビチン投与前に検出されたレベルよりも低いことを特徴とする上記クレームに記載の方法を示している。
【００３５】
さらなる態様では、ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の範囲や程度をモニタリングすることを含む、ロスコビチンの適切な投与量を決定する方法を示している。
【００３６】
その上さらなる態様では、候補薬剤を細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、及び表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の存在又は不在をモニタリングするステップを含む、ロスコビチン様活性を有する候補薬剤の同定方法を示している。
【００３７】
多くのロスコビチン活性のバイオマーカー（すなわち、表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子、又はアポリポタンパク質Ａ１若しくはトランスサイレチンを含むタンパク質マーカーとして発現した遺伝子）を、組み合わせて観察することが適当である。
【００３８】
ロスコビチンをヒトに投与する場合、細胞に投与するロスコビチンの有効濃度を、好ましくは５μＭより高濃度とし、より好ましくは１０μＭより高濃度とする。
【００３９】
ロスコビチンをヒトに投与する場合、遺伝子発現分析用の血液サンプルを採取する前の２、４又は８時間、薬剤で処理を行なうことが適当である。血清又は血漿サンプルをタンパク質発現変化の分析用に採取する場合は、ロスコビチンを一定期間にわたって投与する。
【００４０】
ある実施態様において、ロスコビチンを細胞に投与する場合、ロスコビチンの有効濃度を７５マイクロモルまでとすることが好ましい。
【００４１】
ある好ましい実施態様では、遺伝子発現を検出するための分析前に、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトを、７．５、１５又は３０μＭのロスコビチンで１．５時間処理する。この実施態様では、ロスコビチン活性の指標として、表３又は表７に記載した少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の減少を検出する。また、細胞での遺伝子発現を、ＰＢＭＣ、又はＨＴ２９に類似するフェノタイプを有する細胞で検出することが好ましい。
【００４２】
他の実施態様では、遺伝子発現を検出するための分析前に、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトを、７．５、１５又は３０μＭのロスコビチンで３時間処理する。この実施態様では、ロスコビチン活性の指標として、表４又は表８に記載した少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の減少を検出する。また、細胞での遺伝子発現を、ＰＢＭＣ、又はＨＴ２９に類似するフェノタイプを有する細胞で検出することが好ましい。
【００４３】
他の実施態様では、遺伝子発現を検出するための分析前に、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトを、１５、４５又は７５μＭのロスコビチンで２時間処理する。この実施態様では、ロスコビチン活性の指標として、表１１に記載した少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の減少を検出する。また、細胞での遺伝子発現を、Ａ５４９に類似するフェノタイプを有する細胞で検出することが好ましい。
【００４４】
他の実施態様では、遺伝子発現を検出するための分析前に、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトを、１５、４５又は７５μＭのロスコビチンで４時間処理する。この実施態様では、ロスコビチン活性の指標として、表１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の減少を検出する。また、細胞での遺伝子発現を、Ａ５４９に類似するフェノタイプを有する細胞で検出することが好ましい。
【００４５】
他の実施態様では、遺伝子発現を検出するための分析前に、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトを、５０μＭのロスコビチンで４、１２、２４又は４８時間処理する。
【００４６】
さらに他の実施態様では、ヒトを処理する場合、ロスコビチンを１日あたり０．８〜３．６ｇ、好ましくは１日あたり１．６〜２．４ｇを、１〜１０日間投与する。
【００４７】
本明細書で使用するように、「ＰＢＭＣ」なる用語は、末梢血単核細胞に言及しており、ＰＢＬ（末梢血液リンパ球）を含む。
【００４８】
ある実施態様では、遺伝子発現が検出される遺伝子を、ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、ＮＭ＿０１７６６５（本明細書ではＮＭ＿０１７６６５ヒト仮想的タンパク質（Homo sapiens hypothetical protein）ＦＬＪ２００９４に対する「２０５８５」として言及する）、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、ＮＭ＿０１８３１６（本明細書ではＮＭ＿０１８３１６ヒト仮想的タンパク質ＦＬＪ１１０７８に対する「１８７４７」として言及する）、ＮＭ＿０３３４１０（本明細書ではＮＭ＿０３３４１０ヒト仮想的タンパク質ＭＧＣ１３１３８に対する「２２１４７」として言及する）、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ及びｍｃｌ−１から選択する。
【００４９】
本明細書で使用するように、「ロスコビチン」及び「Ｒ−ロスコビチン」なる用語を使用して、化合物２−（Ｒ）−（１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリンに言及し、ＣＹＣ２０２としても言及する。特に条件のない場合では、「ロスコビチン」なる用語は、Ｒ−ロスコビチン、そのＳ鏡像異性体及びラセミ混合物を含んで使用される。該化合物及びその製造法は、米国特許第６，３１６，４５６号に記載されている。ロスコビチンの類似体は、例えば国際公開公報第０３／００２５６５号に記載されている。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様では、ロスコビチンを哺乳動物又はヒトに投与するが、より好ましくはヒトに投与する。モデル動物において実施する場合、本発明は、ＨＴ２９又はＡ５４９の異種移植マウスモデルなどの腫瘍モデルで実施することが好ましい。
【００５１】
本明細書に記載したいずれかの遺伝子の発現レベルをモニタリングする本発明の方法に、ロスコビチン投与前の、また好ましくは投与１．５、２、３、４、５、８、１２、２４又は４８時間後のレベルのモニタリングを含むことは好ましいであろう。好ましい実施態様では、そのレベルを、ロスコビチン投与後早ければ１．５時間で再度モニタリングする。さらなる実施態様では、タンパク質発現の変化を、投与後１〜１０日間測定する。
【００５２】
ある好ましい実施態様では、ロスコビチン投与後に検出される遺伝子のレベルは、ロスコビチン投与前に検出されたレベルよりも低いことが好ましい。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、遺伝子発現レベルのモニタリングを含む発現の変化のモニタリングによるロスコビチン活性の独立したモニタリングに関している。ある実施態様では、ロスコビチン投与後に検出される遺伝子発現のレベルは、ロスコビチン投与前に検出されたレベルよりも高いことが好ましい。他の実施態様では、ロスコビチン投与後に検出される遺伝子発現のレベルは、ロスコビチン投与前に検出されたレベルよりも低いことが好ましい。
【００５４】
本発明の方法は、
（ａ）ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、遺伝子発現の範囲や程度モニタリングするステップを含む、ロスコビチンの適切な投与量を決定する方法、
（ｂ）候補薬剤を細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、及び遺伝子の存在若しくは不在又はタンパク質の発現変化をモニタリングするステップを含む、ロスコビチン様活性を有する候補薬剤を同定する方法
に、さらに利用されることもある。
【００５５】
（ａ）に記載したような方法は、遺伝子発現の範囲や程度を、同じ期間で同じ投与量のロスコビチンによりその発現が調節される既知の遺伝子の既知の阻害率と関連付けるステップを、さらに含むこともある。ある実施態様では、ＲＢのリン酸化状態を、本明細書に記載したいずれかの遺伝子の発現パターンと比較することもある。ロスコビチン活性のマーカーとしてのＲＢは、国際公開公報第０２／０６１３８６号に記載されている。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、上記に記載したいずれかの方法を利用するロスコビチン活性のモニタリングにおける遺伝子又はタンパク質の使用に関する。
【００５７】
一般的に、細胞株の調査では、ロスコビチンのＣＤＫ２阻害（ＩＣ５０）投与量を投与し、例えば、投与から２、４、１２、２４、及び４８時間後に、サンプルを２４時間又は４８時間かけて抽出する。タンパク質サンプルを単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加して分離し、ブロットし、適当なマーカーを探す。モデル動物又はヒトで調査を実施する場合、ロスコビチン活性を評価するために、動物又はヒトから抽出可能な細胞源として、適当な増殖性組織を同定しなければならない。適当な組織にはあらゆる増殖性の組織が含まれる。特に腫瘍生検が含まれるが、循環リンパ球及び頬粘膜の細胞もまた使用できるということが今や確認されている。一旦抽出されると、これらの細胞は、細胞株について記載した方法と同一の方法で処理できる。ほとんどの場合、本明細書に記載した遺伝子を含むマーカーのプールを確認する。
【００５８】
生検サンプルにおける遺伝子発現検出用の適当な方法には、ＦＩＳＨ法、又はサンプルのタンパク質化合物を分析する方法と同様に、本明細書に記載した遺伝子を認識する抗体を使用する免疫組織化学法を使用することが含まれる。
【００５９】
本発明の実施態様をさらに開発して、用量漸増の手段として、遺伝子発現におけるロスコビチンの効果を使用することもある。すなわち、遺伝子発現の範囲及び割合をモニタリングすることによって、ロスコビチンの適切な投与量を決定する。そのような分析には、例えば、同じ投与量のロスコビチンによるＣＤＫ２活性又はＲＢリン酸化の既知の阻害率と遺伝子発現変化の関連がさらに含まれる。このように、遺伝子発現の範囲及び割合のある測定を、さらなるロスコビチン活性を示すとして用いてもよい。
【００６０】
さらなる本発明の実施態様では、候補薬剤によって遺伝子発現レベルの変化を含む発現の変化を、ロスコビチン様として分類される活性の機序の指標として用いることもある。
【００６１】
特定の治療単位の治療に対する癌患者の反応は、極めて多種多様である。例えば、特定の療法の治療に対して感受性を示し、腫瘍の苦しみの軽減や症状の改善を呈する患者もいれば、治療に対して耐性があり、特定の療法に対する改善を全く又はほとんど示さない患者もいる。ロスコビチンなどのＣＤＫＩによって修飾された発現を有する遺伝子を検出することは、ＣＤＫＩを用いた処理に対する反応を予測するためのマーカーの同定方法においても有用である。
【００６２】
したがって、別の態様では、腫瘍における遺伝子発現が、ロスコビチンなどのＣＤＫＩを用いた処理に対する反応を予測可能とする遺伝子の同定方法を示し、かかる方法は、
ａ）ロスコビチンなどのＣＤＫＩを用いた治療に感受性を示す患者からサンプルを採取し、本明細書に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現を検出するステップ、
ｂ）ロスコビチンなどのＣＤＫＩを用いた治療に耐性を示す患者からサンプルを採取し、本明細書に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現を検出するステップ、及び
ｃ）ａ）の遺伝子発現パターンとｂ）の遺伝子発現のパターンを比較し、その結果、感受性と関連する遺伝子及び耐性と関連する遺伝子を同定するステップ
を含む。
【００６３】
その後、腫瘍の遺伝子発現のパターンを決定し、上述の方法に従って同定されたマーカー遺伝子の発現に従って、特定の腫瘍を、処理に対して「感受性あり」又は「耐性あり」と分類する。
【発明の詳細な説明】
【００６４】
他に記載がない限り、本発明の実施には、通常の当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、細胞生物学、微生物学、ＤＮＡ組換え及び免疫学の従来の手法を用いる。これらの手法は、文献に記載されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition, Books 1-3、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.) 、B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons、J. M. Polak and James O’D. McGee, 1990, In Situ Hybridization、Principles and Practice; Oxford University Press、M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis、A Practical Approach, IRL Press; 及び D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照のこと。これらの全体の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
「ＣＤＫＩ」は、ＣＤＫ活性の阻害剤を意味する。ロスコビチンはＣＤＫ活性の阻害剤であるとして周知である多くの化合物の１つにすぎない。
【００６５】
「ロスコビチン活性」又は「ロスコビチン様活性」は、ロスコビチンによって発現する活性を意味する。例えば、ロスコビチン様とは、Ｇ１後期／Ｓ期初期又はＭ期において、細胞サイクルの進行を阻害可能であることを意味する。該細胞サイクルの進行の阻害は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９を含むＣＤＫを阻害することによって行われることが好ましい。ロスコビチン活性の研究結果は、McClue et al. Int. J. Cancer, 2002, 102, 463-468に報告されている。
【００６６】
ロスコビチン活性の「マーカー」又は「バイオマーカー」なる用語は、細胞又は哺乳動物に由来するサンプルにおける発現が、ロスコビチンを用いた処理に応じて変化するか或いは調節される、例えば、アップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子又はタンパク質を表わす。バイオマーカーがタンパク質の場合、発現の調節又は変化には、異なる翻訳後修飾による調節が含まれる。
【００６７】
また、本明細書で使用される「バイオマーカークラスター（biomarker cluster）」なる用語は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分離される場合、類似の質量を有するタンパク質の形を特徴とするグループを意味する。バイオマーカークラスターを、本明細書の実施例に記載する。
【００６８】
処理した及び未処理の細胞に由来するサンプルは、組織培養物又は動物若しくはヒトの細胞群に由来する溶菌液、抽出物或いは核酸のサンプルである。タンパク質分析のためには、サンプルは組織培養上清を用いる。細胞は、個体（例えば、血液、血清又は血漿のサンプル）から単離でき、生検などの組織サンプルの一部のこともある。
【００６９】
「発現の変化（altered expression）」とは、未処理のコントロールサンプルと比較した場合の、増加、減少又は他に、処理した細胞に由来するサンプルにおける、発現の修飾レベル若しくは発現パターンを意味する。
【００７０】
「発現（expression）」なる用語は、対応するｍＲＮＡを産生するための遺伝子のＤＮＡ鋳型の転写、及び対応する遺伝子産物（すなわち、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）を産生するためのｍＲＮＡの翻訳、さらに１以上の翻訳後修飾されたタンパク質の「発現」を表わす。
【００７１】
翻訳後修飾とは、タンパク質分解的切断により、又は１以上のアミノ酸への修飾基の付加により、タンパク質の特性を変化させる共有結合のプロセッシング現象である。通常の翻訳後修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、アシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー化、ユビキチン化などが含まれる。そのような修飾の概説及び検出の方法は、Mann et al. Nature Biotechnology March 2003, Vol. 21, pages 255-261で見出すことができる。
【００７２】
「ポリヌクレオチド」又は「ポリペプチド」は、ロスコビチンに応じてその発現が修飾される、本明細書に記載したＤＮＡ配列及びタンパク質配列を意味する。かかる用語には、これらの配列に近似の変異体も含まれ、かかる変異体はその参照配列と同じ生物活性を有する。該変異体が、本明細書に記載したかかる参照配列と同じ生物活性を保持する限り、これらの変異配列には、「対立遺伝子」（同一又は近似に関連した種において同じ遺伝子座に見られる変異配列）、「相同体」（共通の先祖ＤＮＡ配列から受け継がれた第二の遺伝子に関連し、種分化（「オルソログ」又は遺伝子複製（「パラログ」）のいずれかによって分離される遺伝子）が含まれる。
【００７３】
本発明はまた、前記変異体が、本明細書に記載したかかる参照配列と同じ生物活性を保持する限り、本明細書に記載したポリヌクレオチド及びポリペプチドにおいて、サイレント置換、多型性置換及び同類置換を有する遺伝子の検出を含むことを目的としている。
ＣＤＫＩ活性の遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーの発現変化の測定
遺伝子及びタンパク質発現のレベルは、多くの異なる手法を用いて測定することができる。
ａ）ＲＮＡレベル
ＲＮＡレベルで遺伝子発現を検出することができる。例えば、フェノール酸／グアニジンイソチオシアン酸塩抽出法（acid phenol/guanidine isothiocyanate extraction）（RNAzolB：Biogenesis社製）、RNeasy RNA調製キット(Quiagen社製) 又はPAXgene （PreAnalytix社製, スイス）を含むＲＮＡ抽出法を用いて、ＲＮＡを細胞から抽出する。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用した典型的なアッセイの型式には、核Ｒｕｎ−Ｏｎアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、RNase Protection Assays (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035)、ノーザンブロット法及びインシツゥハイブリダイゼーションが含まれる。遺伝子発現はまた、以下に述べるように、マイクロアレイ分析により検出できる。
【００７４】
ノーザンブロット法を行なうためには、先ず、ＲＮＡサンプルを変性条件下アガロースゲルで電気泳動法によって大きさで分類する。次にＲＮＡを膜に転移させ、架橋し、標識プローブでハイブリダイズする。非同位体プローブ又は高比活性の放射標識プローブ（high specific activity radiolabeled probes）には、ランダムプライミングされたＤＮＡプローブ、ニックトランスレーションされたＤＮＡプローブ、又はＰＣＲ作製ＤＮＡプローブ、インビトロ転写ＲＮＡプローブ、及びオリゴヌクレオチドなどを用いることができる。さらに、一部にのみ相同性を有する配列（例えば、異なる種のｃＤＮＡ又はエキソンを含む可能性のあるゲノムＤＮＡフラグメント）をプローブとして用いてもよい。
【００７５】
NucleaseProtection Assays（ＮＰＡ）（リボヌクレアーゼタンパク質アッセイとＳ１ヌクレアーゼアッセイとの両方を含む）は、特定のｍＲＮＡの検出及び定量のための極めて高感度な方法を示している。ＮＰＡは、アンチセンスプローブ（放射標識された、又は非同位体の）のＲＮＡサンプルへの溶液ハイブリダイゼーションに基づいている。ハイブリダイゼーション後に、一本鎖のハイブリダイズされていないプローブ及びＲＮＡをヌクレアーゼによって分解する。残りの保護されているフラグメントをアクリルアミドゲル上で分離する。ＮＰＡによって、数種のＲＮＡを同時に検出することが可能となる。
【００７６】
インシツゥハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、細胞又は組織で、特定のｍＲＮＡを見つけ出すための強力で汎用な手段である。プローブのハイブリダイゼーションは、細胞又は組織で行われる。細胞の構造がかかる処理を通して維持されるため、ＩＳＨによって組織サンプルにおけるｍＲＮＡの位置に関する情報が示される。
【００７７】
処理は、サンプルを中性緩衝ホルマリン液に固定し、組織をパラフィンに埋め込むことから始める。次にサンプルを切片に薄切し、顕微鏡のスライドに載せる。（或いは、組織を凍らせて薄片に切り、パラホルムアルデヒドで後固定する）。かかる切片を何回か洗浄して、ワックスを除去し、加水して元の状態に戻した後、プローブの利便性を向上させるためにプロテインキナーゼＫの消化を行ない、次に標識プローブをサンプルの切片にハイブリダイズする。放射標識プローブを、スライド上で乾燥させたリキッドフィルムで可視化し、非同位体標識プローブは比色試薬又は蛍光試薬で簡便に検出する。この後者の検出方法は蛍光インシツゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の基礎である。
【００７８】
用いることのできる検出法には、放射標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識及び他の適する標識が含まれる。
【００７９】
一般的には、ＲＴ−ＰＣＲはターゲットＲＮＡを増幅するために用いられる。このプロセスにおいて、逆転写酵素を使用して、ＲＮＡを、その後増幅して検出を容易にすることができる相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。相対的定量ＲＴ−ＰＣＲには、対象とする遺伝子と同時に内部標準を増幅することが含まれる。内部標準は、サンプルをノーマライズするために用いられる。一度ノーマライズされれば、特定のｍＲＭＡの相対存在量をサンプル全体で直接比較することが可能となる。通常用いられる内部標準には、例えばＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ、アクチン及びサイクロフィリンが含まれる。
【００８０】
多くのＤＮＡ増幅方法が知られているが、そのほとんどは酵素連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応又は３ＳＲ法（self-sustained sequence replication）に基づくものであるか、或いはクローンされたベクターの全部又は一部の複製に由来するものである。
【００８１】
多くのターゲット増幅法及びシグナル増幅（ＴＡＳ）法については、例えば、Landegren, U. et al., Science 242:229-237 (1988) and Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990)の文献において、これらの方法の総論に記載されている。
【００８２】
ＰＣＲ法は核酸増幅法であり、とりわけ米国特許第４，６８３，１９５号及び４，６８３，２０２号に記載されている。診断に関しては、ＰＣＲ法を用いて、あらゆる既知の核酸を増幅することができる（Mok et al., 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252）。３ＳＲ法（３ＳＲ）はＴＡＳの変形であり、酵素カクテル及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーによってもたらされる逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼ及びヌクレアーゼ活性の一連の作用（via sequential round）による、核酸テンプレートの等温増幅を含む（Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）。連結増幅反応又は連結増幅システムでは、ＤＮＡリガーゼ及びターゲット鎖１本あたり２つ用いる４つのオリゴヌクレオチドを使用する。かかる手法は、Wu, D. Y. and Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:560に記載されている。Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197に記載されているように、Ｑβレプリカーゼ法において、一本鎖ＲＮＡを複製するバクテリオファージＱβのＲＮＡレプリカーゼを使用して、ターゲットＤＮＡを増幅する。
【００８３】
定量ＰＣＲ法（Ｑ−ＰＣＲ法）は、サンプル中のトランスクリプトの相対量を測定する手法である。Ｑ−ＰＣＲ法の適当な実施方法を本明細書に記載する。
【００８４】
本発明には、別の増幅手法を使用する。例えば、ローリングサークル増幅（Lizardi et al., 1998, Nat Genet 19:225）は、ＤＮＡポリメラーゼによって行われ、等温条件下で直線的又は幾何学的に運動する環状オリゴヌクレオチドプローブを複製することができる市販（ＲＣＡＴＴＭ）の増幅手法である。さらなる手法であるＳＤＡ法（strand displacement amplification） （SDA; Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:392） は、特定のターゲットに１つしかない特異的に限定された配列を用いて開始する。
【００８５】
本明細書に記載したロスコビチン活性のマーカーを検出する適当なプローブは、テストキットの形で適当な容器に都合良くに入れられている。それらのキットにおいて、かかるプローブは固体支持体（a solid support）に結合することもある。その固体支持体ではアッセイフォーマット用にキットが作成されており、そのアッセイフォーマットにはこの結合が必要である。キットには、サンプルを処理してプローブし、そのプローブをサンプルの核酸にハイブリダイズする適切な試薬、対照薬、説明書などが含まれることもある。適切なキットは、例えばＱＰＣＲ反応のためのプライマーやＦＩＳＨを実施するための標識プローブを含んでいることもある。
ａ）ポリペプチドレベル
遺伝子又はタンパク質の発現の変化は、ロスコビチン活性の遺伝子マーカーがコードするポリペプチドを測定することによっても検出できる。これは、ロスコビチン活性のマーカーとして、本明細書に記載したいずれかの遺伝子をコードするポリペプチドに結合する分子を使用することによって、達成される。タンパク質の存在を検出するために直接的に又は間接的にポリペプチドに結合する適当な分子／試薬には、ペプチドやタンパク質などの自然発生する分子、例えば抗体が含まれる。或いは、これらは合成分子であってもよい。
【００８６】
抗体の作製方法は当業者に公知である。ポリクローナル抗体が望ましい場合は、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、ポリペプチドのエピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫する。免疫下動物の血清を回収し、既知の手順で処理する。ポリペプチドのエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清に他の抗原に対する抗体が含まれる場合、ポリクローナル抗体を免疫親和性クロマトグラフィーで精製することができる。ポリクローナル抗血清を作製し加工する手法は、当業界で公知である。より大きな免疫原性反応を惹起させるには、動物又はヒトにおいて免疫源として使用するために、ポリペプチド又はそのフラグメントを他のポリペプチドにハプテン化してもよい。
【００８７】
当業者であれば、ポリペプチド中のエピトープに対するモノクローナル抗体も、容易に作製することができる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製する一般的な方法は公知である。細胞融合により、また、発癌性のＤＮＡを有するＢリンパ球の形質転換や、エブスタイン・バー（ＥＢ）ウイルスによる形質移入などの方法によっても、不死抗体産生細胞株を作製することができる。本発明のポリペプチド中のエピトープに対して生成されたモノクローナル抗体のパネルを、様々な特性、すなわちアイソタイプ及びエピトープ親和性についてスクリーニングすることができる。
【００８８】
別の手法には、例えば、ファージが様々な相補性決定領域（ＣＤＲ）と共にその被膜の表面でｓｃＦｖフラグメントを発現している、ファージディスプレイライブラリのスクリーニングが含まれる。かかる手法は当業界では公知である。
【００８９】
本発明の目的のためには、他に異なる記載のない限り、「抗体」なる用語は、ターゲット抗原に対する結合活性を保持する抗体全体のフラグメントを含む。これらのフラグメントには、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）だけでなく、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ'）フラグメント及びＦ（ａｂ'）２フラグメントが含まれる。さらに、例えば欧州特許第２３９４００号に記載されるように、抗体とそのフラグメントをヒト化抗体としてもよい。
【００９０】
上述のイムノブロットなどの標準的な実験の手法を用いて、同じ細胞集団中の未処理細胞と比較して、ロスコビチン活性のマーカーのレベル変化を検出することができる。
【００９１】
ポリペプチドの翻訳後の処理、又は核酸の転写後の修飾における変化を検出することによって、遺伝子発現を測定する。例えば、ポリペプチドのリン酸化の差異、ポリペプチドの切断又はＲＮＡの別のスプライシングなどを測定する。ポリペプチドなどの遺伝子産物の発現レベルや、それらの翻訳後の修飾を、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの市販のタンパク質アッセイ又は手法を用いて検出する。
【００９２】
（ａ）本発明の抗体を示すステップ、
（ｂ）抗原抗体複合体の形成を可能にする条件下で、前記抗体で生物サンプルを培養するステップ、及び
（ｃ）前記抗体を含む抗原抗体複合体が形成されたかどうかを判断するステップを備える方法
によって、本明細書に記載したロスコビチン活性のマーカーを生体サンプルにおいて検出する際には、抗体を使用する。
【００９３】
適当なサンプルには、脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉や骨組織などの抽出組織、又はこれらの組織に由来する腫瘍性成長が含まれる。適当な例には、他に血液及び尿のサンプルを含む。
【００９４】
ロスコビチン活性タンパク質のマーカーに特異的に結合する抗体を、体液中又は組織中のロスコビチン活性タンパク質のマーカーを検出又は定量するために、通常の技術を有する当業者には公知の診断方法やキットを使用することができる。これらのテストの結果を使用して、癌及び他の細胞サイクルの進行性疾患の発生又は再発を診断又は予測することができる。或いは、薬剤の投与量及び治療の有効性を査定することができる。
【００９５】
当業界で公知の方法により、免疫特異的な結合に対して、抗体をアッセイすることができる。使用可能なイムノアッセイには、ウエスタンブロット法、免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散法、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法及びプロティンＡイムノアッセイなどの手法を用いた競合アッセイ系及び非競合アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。これらのアッセイは当業界では決まりきった方法である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照のこと。これらの内容はそっくりそのまま、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００９６】
本発明で用いる抗体は、固体支持体に結合し、及び／又は適切な試薬、対照薬、説明書などと共にキットの形で適当な容器に入れられている。
【００９７】
他の方法には、大規模のスクリーニングには適当ではないが二次元ＰＡＧＥが含まれる。最新の手法にはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry）が含まれる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析法では、複合混合物のタンパク質を、固体金属マトリックスに添付し、パルスレーザービームで脱離し、フィールドフリーフライトチューブ（field-free flight tube）を横切る気相イオンを産生する。次に質量依存性の速度で分離する。個別のタンパク質及びペプチドは、タンパク質及びペプチドの配列データベースを検索するインフォマティックスツールを使用して同定される。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Surface-enhanced laser desorption/ionisation time of flight MS）は、タンパク質を化学的に修飾した固体表面に選択的に吸着する親和性に基づくＭＳ方法であり、不純物を洗浄して除去し、エネルギー吸収のマトリックスを使用し、該タンパク質をレーザー脱離質量分析（laser desorption mass analysis）により同定する。
【００９８】
タンパク質のバイオマーカーを同定するために、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用して、インタクトなタンパク質又は特定のタンパク質のフラグメントのどちらかの出現／喪失を検出する。さらにまたＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用して、化学基の付加／除去で引き起こされる質量の差異により、タンパク質の翻訳後修飾を検出する。よって、ある残基のリン酸化は、そのリン酸基により８０Ｄａの質量シフトを引き起こすであろう。翻訳後修飾に起因する分子量のデータベースは、インターネット上（http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home？avgmass=all）で自由にアクセスできる。さらに特異的なポリペプチドは、翻訳後修飾されたタンパク質の形を特異的に認識する、又はタンパク質のすべての形を一様に認識する抗体を用いてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用する親和性に基づくアプローチによって捕獲される。
アレイ（Array）
配列技術並びにそれに関連した様々な手法及び応用は、一般的に多くの教科書や文献に記載されている。これらには、Lemieux et al., 1998, Molecular Breeding 4:277-289、Schena and Davis. Parallel Analysis with Biological Chips. in PCR Methods Manual (eds. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky)、Schena and Davis, 1999, Genes, Genomes and Chips. In DNA Microarrays: A Practical Approach (ed. M. Schena), Oxford University Press, Oxford, UK, 1999)、The Chipping Forecast (Nature Genetics special issue; January 1999 Supplement)、Mark Schena (Ed.), Microarray Biochip Technology, (Eaton Publishing Company)、Cortes, 2000, The Scientist 14(17):25、Gwynne and Page, Microarray analysis: the next revolution in molecular biology, Science, 1999, August 6、Eakins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17:217-218、及び多くのワールドワイドウェブサイトで得られる文献が含まれる。
【００９９】
配列技術は、通常では「一実験一遺伝子（one gene in one experiment）」に基づき実施するために、処理量が少なく、遺伝子機能の「全体像」を理解することができないという、分子生物学における従来の方法の欠点を克服している。現在、配列技術の主な応用には、配列の同定（遺伝子／遺伝子変異）及び遺伝子の発現レベル（存在量）の測定が含まれる。遺伝子発現プロファイリングには、選択的にプロテオミクス技術と組み合わせて配列技術を用いる(Celis et al., 2000, FEBS Lett, 480(1):2-16; Lockhart and Winzeler, 2000, Nature 405(6788):827-836; Khan et al., 1999, 20(2):223-9)。 配列技術の他の応用も当業界で公知であり、遺伝子の発見、癌調査（Marx, 2000, Science 289: 1670-1672; Scherf et alet al., 2000, Nat Genet 24(3):236-44; Ross et al., 2000, Nat Genet 2000, 24(3):227-35）、ＳＮＰ分析（Wang et al., 1998, Science 280(5366):1077-82）、薬剤の発見、ファーマコジェノミックス、疾患の診断（例えばマイクロ流体工学装置を用いたChemical & Engineering News, February 22, 1999, 77(8):27-36、毒物学を用いたRockett and Dix (2000), Xenobiotica 30(2):155-77; Afshari et al., 1999, Cancer Res 59(19):4759-60、及びトキシコゲノミクス（toxicogenomics）を用いた（機能性ゲノムのハイブリッド及び分子毒物学）を例示することができる。トキシコゲノミクスの目的は、毒物の毒性反応と、毒物と接触した対象の遺伝子特性における変化との相互関係を見出すことである（Nuwaysir et al., 1999, Molecular Carcinogenesis 24:153-159）。
【０１００】
本発明においては、例えば、本明細書に記載した１以上のロスコビチン活性タンパク質マーカーの発現の分析において、配列技術を使用することができる。ある実施態様においては、配列技術を使用して、同時に本明細書に記載した多くのロスコビチン活性のマーカーに対する候補化合物の作用を評価する。したがって、本発明の別の態様では、表１〜１２のいずれかに記載した核酸の少なくとも１つ、少なくとも２つ、若しくは少なくとも複数、又はそのフラグメントを含むマイクロアレイ、或いはタンパク質アレイ又は抗体アレイを示している。
【０１０１】
一般的に、ライブラリ又は群の構成要素を空間的に隔てることによって、サンプルのライブラリ又は群を規則的にアレイに配置してよい。配列に適当なライブラリの例には、核酸ライブラリ（ＤＮＡライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、オリゴヌクレオチドライブラリなど）、ペプチドライブラリ、ポリペプチドライブラリ及びタンパク質ライブラリだけでなく、特にリガンドライブラリなどのあらゆる分子を含むライブラリが含まれる。したがって、本明細書中で「ライブラリ」に言及する場合は、他に記載がない限り、その言及はアレイの形のライブラリへの言及を含むものであると解釈される。本発明の内容において、「ライブラリ」には、本明細書に記載したロスコビチン活性のマーカーのサンプルが含まれる。
【０１０２】
通常、サンプル（例えばライブラリの構成要素）を固相、好ましくは固体基板に固定化又は不動化し、サンプルの拡散や混合を制限する。好ましい実施態様においては、ＤＮＡ結合リガンドのライブラリを作製する。特に、ライブラリを、プラスチックやガラスなどの膜基板及び非多孔性基板を含むほぼ平面状の固相に不動化する。さらに、好ましくはサンプルを、索引付け（すなわち、ある特定のサンプルへの参照やアクセス）が容易になるように配置する。典型的には、サンプルを升目の中の点（spots in a grid formation）として用いる。一般的なアッセイ系をこの目的に合うように使用する。例えば、ウェル中の様々なサンプル又は各ウェル中の１つのサンプルで、アレイをマイクロプレートの表面に不動化する。さらに、固体基板はニトロセルロース膜又はナイロン膜（例えばブロット法の実験で使用される膜）などの膜である。代替の基板にはガラス基板又はシリカ基板が含まれる。このように、例えば電荷相互作用により、或いはウェルの壁面若しくは底面、又は膜表面への化学的結合により、当業界で公知の適切な方法でサンプルを不動化する。例えば、ピペッティング、drop-touch、圧電手段、インクジェット技術及びバブルジェット技術、静電気の応用などの、他の配置手段及び固定手段を使用してもよい。シリコンチップの場合は、フォトリソグラフィを使用して、チップ上のサンプルを配置し、固定してもよい。
【０１０３】
固体基板上に「スポット」することによってサンプルを配置してもよい。これは手動で行ってもよいし、ロボットを用いてサンプルを配置してもよい。一般的に、アレイは、サンプルスポットの大きさの違いによりマクロアレイ又はマイクロアレイと表現される。マクロアレイは典型的には約３００マイクロン以上の大きさのサンプルスポットを含み、既存のゲルスキャナー及びブロットスキャナー（blot scanner）によって容易に画像化される。マイクロアレイのサンプルスポットの大きさは、典型的には直径２００マイクロン未満であり、これらのアレイは通常数千個のスポットを有する。したがって、マイクロアレイは専門のロボット技術や画像装置を必要とし、これらの技術や装置はオーダーメイドである必要がある。器具の使用については、Cortese, 2000, The Scientist 14(11):26に概ね記載されている。
【０１０４】
不動化したＤＮＡ分子のライブラリの作製手法は、当技術に記載されている。通常、ほとんどの先行技術の方法には、例えば、マスキング技術を用いて、固体基板上の様々な不連続な位置に、多様な配列の並べ替え（permutation of sequence）を構築する、一本鎖核酸分子ライブラリの合成方法が記載されていた。
米国特許第５，８３７，８３２号は、大規模集積回路技術に基づく、シリコン基板に不動化されたＤＮＡアレイの改良された作製法について記載している。かかる内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。特に、米国特許第５，８３７，８３２号には、本発明の不動化ＤＮＡライブラリを作製するために使用されることもある、基板上の空間的に画定された位置でプローブの特定の集合を合成する「タイリング」と称される方法を記載されている。米国特許第５，８３７，８３２号は、初期の技術に関する参照資料も示しており、これもまた使用されることがある。
【０１０５】
それぞれ個別のライブラリの構成要素（例えば、独特のペプチド配列）を、アレイ中の予め画定した不連続な位置に配列するように、ペプチド（又はペプチドミメティック）のアレイを表面に合成する。アレイでの空間的位置によって、各ライブラリの構成要素の同一性を判断する。所定の分子（例えばターゲット又はプローブ）と反応ライブラリ構成要素との結合相互作用が生じる場合、アレイにおける位置を判断し、それによって空間的な位置に基づき、反応ライブラリの構成要素の配列を同定する。これらの方法は米国特許第５，１４３，８５４号、国際公開公報第９０／１５０７０号及び国際公開公報第９２／１００９２号、Fodor et al., 1991, Science 251:767、Dower and Fodor, 1991, Ann. Rep. Med. Chem. 26:271に記載されている。
【０１０６】
検出を促進させるために、例えば蛍光レポーター、生物発光レポーター、リン光レポーター、放射性レポーターなどの容易に検出可能なレポーターでターゲット及びプローブを標識する。これらのレポーター、その検出、ターゲット／プローブへの結合などは本明細書全体に記載している。プローブ及びターゲットの標識化については、Shalon et al., 1996, Genome Res 6(7):639-45にも開示されている。
【０１０７】
ＤＮＡアレイの具体例には以下が含まれる。
【０１０８】
フォーマットＩ：プローブｃＤＮＡ（〜５００から〜５，０００塩基長）を、ガラスなどの固体表面にロボットスポッティング（robot spotting）を用いて不動化し、個別に又は混合してターゲットに接触させる。この方法はスタンフォード大学（Stanford University）で開発されたと広く考えられている(Ekins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17:217-218)。
【０１０９】
フォーマットII：オリゴヌクレオチドのアレイ（〜２０から〜２５merオリゴ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブをインシツゥ（チップ上）又は従来の合成によって合成し、その後チップ上に不動化する。かかるアレイを標識したサンプルＤＮＡに接触させ、ハイブリダイズし、相補配列の同一性／存在量を測定する。このようなＤＮＡチップはGeneChip(R)の商標が付され、Affymetrix, Inc.から販売されている。
【０１１０】
市販のマイクロアレイフォーマットの例は、例えばMarshall and Hodgson, 1998, Nature Biotechnology 16(1):27-31に示されている。
【０１１１】
データ分析もアレイに関する実験の重要な部分である。マイクロアレイ実験の生データは、一般的には画像であり、その画像は、行が例えば遺伝子を表し、列が例えば組織又は実験条件等の様々なサンプルを表し、各セルの数字が例えば特定のサンプルにおける特定の遺伝子の発現レベルを特徴付ける遺伝子発現行列−表に変換する必要がある。根本的な生物過程の知見を推論するのであれば、これらの行列をさらに分析しなくてはならない。データ分析の方法（バイオインフォマティクスアプローチだけでなく、スーパーバイズされた及びスーパーバイズされないデータ分析を含む）は、Brazma and Vilo J, 2000, FEBS Lett 480(1):17-24に記載されている。
【０１１２】
上述のように、タンパク質、ポリペプチドなどをアレイにおいて不動化してもよい。例えば、プロテインチップを用いたプロテオームのマイクロアレイ分析では、抗体が使用されている（Borrebaeck CA, 2000, Immunol Today 21(8):379-82）。ポリペプチドアレイは、例えばMacBeath and Schreiber, 2000, Science, 289(5485):1760-1763で概説されている。
診断及び予後診断
本発明はまた、ロスコビチン活性のマーカー、これらのタンパク質に対する抗体、及びこれらのタンパク質及び／又はその抗体を含む組成物の、特にロスコビチンで治療を施した個々人における、増殖活性によって特徴付けられる疾患の診断及び予後診断での使用を含む。本明細書に使用されるように、「予後診断方法」なる用語は、疾患、特に癌と診断されたヒト又は動物の該疾患の進行に関する予測を可能にする方法を意味する。特にロスコビチン治療の対象となる癌には、乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜腺癌、前立腺癌及び白血病が含まれる。
【０１１３】
本明細書に使用される「診断方法」なる用語は、ヒト若しくは動物に関して又はヒト若しくは動物において、癌の有無又は癌のタイプを判断可能にする方法を意味する。マーカーによってロスコビチン治療の成功を評価できることが適切である。上述の通り、適切な診断には、例えばＱＰＣＲプライマー、ＦＩＳＨプローブなどの本明細書に記載したいずれかの遺伝子に関するプローブが含まれる。
【０１１４】
次に本発明を以下の実施例を参考に説明する。
【実施例１】
【０１１５】
ＣＹＣ２０２処理細胞で発現した遺伝子の同定
方法
細胞培養
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、使用説明書に従いバキュテイナーＣＰＴチューブ（Becton Dickinson社製、N.J.、米国）の遠心分離により精製した。細胞を、１０％のウシ胎仔血清及びペニシリンストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地４０ｍｌ中に約２×１０７細胞の密度で播種した。
【０１１６】
ＨＴ２９及びＡ５４９の細胞は、それぞれヒトの大腸及び肺の腫瘍に由来しており、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭにおいて１０ｃｍプレートあたり１．５×１０６細胞と同等である約２０％の密集度で播種した。その結果、化合物で処理すると翌日には活発に増殖していた。
【０１１７】
ＣＹＣ２０２又は溶媒コントロールであるＤＭＳＯによる処理前、すべての細胞培養物を、５％ＣＯ２存在下、３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした。ＰＢＭＣ及びＨＴ２９の細胞を、７．５μＭ、１５μＭ又は３０μＭのＣＹＣ２０２で処理し、１．５時間、３時間、５時間、８時間及び２４時間後にサンプルを採取した。A５４９細胞は、１５μＭ、４５μＭ及び７５μＭのＣＹＣ２０２で処理し、２時間、４時間、８時間及び２４時間後にサンプルを採取した。
ＲＮＡ抽出
ＲＮＡを、使用説明書に従いＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロゲン社製）を用いて、マイクロアレイ実験で使用したA５４９細胞から抽出した。他のすべての細胞株に対しては、全ＲＮＡを、使用説明書に従いRneasy Midi Kit（Qiagen社製、Hilden、ドイツ）により培養物から抽出した。細胞をＲＬＴ緩衝液に溶解し、次にＲＮＡ抽出前に、Qiashredderカラムを通過させた。サンプルは、カラムに結合すると同時にRnase-free Dnase（Qiagen社製）により処理した。ＲＮＡをRnase-free水で溶出し、RiboGreen（Molecular Probes社製、Leiden、オランダ）を使用して定量した。サンプルのアリコートをアガロースゲルに流して、ＲＮＡの完全性及び品質をチェックした。
二本鎖ｃＤＮＡの合成
１０μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡ作製用の出発物質として使用した。第１鎖及び第２鎖のｃＤＮＡ合成を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ部位を含むoligo-dTプライマーを使用することを除いては、使用説明書に従いSuperScript II System（インビトロゲン社製、Carlsbad、カリフォルニア州）を使用して行なった。標識ｃＲＮＡをBioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit（Enzo社製）を使用して作製した。ビオチン標識したＣＴＰ及びＵＴＰ（Enzo社製）を、未標識のNTP´sと一緒に反応中で使用した。ＩＶＴ反応に続き、非取り込み型のヌクレオチドを、RNeasyカラム（Qiagen社製、Hilden、ドイツ）を使用して除去した。
マイクロアレイ・ハイブリダイゼイション及びスキャンニング
ｃＲＮＡを、Affymetrix Technical Manualに従い、metal-induced加水分解により断片化し、３５〜２００塩基のフラグメントを得た。１５μｇのｃＲＮＡを、９４℃で３５分間、ｐＨ８．１のTris-acetate４０ｍＭ、KOAc１００ｍＭ及びMgOAc３０ｍＭを含むフラグメンテーション緩衝液中で断片化した。ハイブリダイゼイションに先立って、アフィメトリクスプローブアレイカートリッジに載せる前に、６ｘＳＳＰＥ-Ｔハイブリダイゼーション緩衝液（１ＭのNaCl、ｐＨ ７．６のトリス１０ｍＭ、０．００５％ のトリトン）中の断片化したｃＲＮＡを、９５℃で５分間、続いて４５℃で５分間加熱した。
【０１１８】
ＨＴ−２９細胞及びＰＢＭＣからのＲＮＡをHu Gene U133A Cartridgesに載せる一方で、Ａ５４９細胞から抽出したＲＮＡを、Hu Gene FL Cartridgeと一緒に使用した。次に、プローブアレイを、４５℃で１６時間、一定の回転数（６０ｒｐｍ）でインキュベートした。洗浄及び染色の処置はAffymetrix Fluidics Stationを用いて行った。プローブアレイを接触して、２５℃で６ｘＳＳＰＥ−Ｔにおいて１０回洗浄後、５０℃で０．５ｘＳＳＰＥ−Ｔにおいて４回洗浄した。ビオチン標識したｃＲＮＡを、阻害剤として正常なヤギのＩｇＧを最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ（Sigma社製）で、及びビオチン標識した抗ストレプトアビジン抗体（ヤギ）を最終濃度３ｍｇ／ｍｌ（Vector Laboratories社製）で使用する抗体増幅ステップ（antibody amplification step）により検出した。この後、ストレプトアビジン・フィコエリトリン複合物、最終濃度２ｍｇ／ｍｌ（Molecular Probes社製、Eugene、OR）で、２５℃で６ｘＳＳＰＥ−Ｔにおいて３０分間染色を行なって、２５℃で６ｘＳＳＰＥ−Ｔにおいて１０回洗浄した。プローブアレイを、共焦点レーザー顕微鏡（Hewlett Packard社製、 GeneArray Scanner G2500A）を使用して５６０ｎｍでスキャンした。定量的スキャニングからの測定値は、Affymetrix Gene Expression Analysis Softwareを使用して分析した。
マイクロアレイ・データの分析
データの分析は、Affymetrix Software PackagesのMAS ver. 5.0、MicroDB ver. 3.0及びDMT ver. 3.0を使用して行った。すべての未加工の分析は150 unitsへの Global Scaledであり、その後Pairwise Comparison分析により比較した。
対象の遺伝子の選択
Affymetrix Chipsのデータを、ＣＹＣ２０２処理後に個々の時点で分析した。ＣＹＣ２０２処理のマーカーとして同定された遺伝子は、ＤＭＳＯで処理した細胞から単離されたＲＮＡに存在していた遺伝子であるが、その発現は、ＣＹＣ２０２の全濃度で処理した細胞から単離されたＲＮＡにおいてはダウン・レギュレートすると判断した。
【０１１９】
７．５、１５及び３０μＭで１．５、３、５、８及び２４時間、ＣＹＣ２０２で処理したＰＢＭＣ由来のサンプルを使用してマイクロアレイから得た発現データにより、以下の表を得た。
【０１２０】
表１は、ＰＢＭＣのＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、１．５時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１２１】
表２は、ＰＢＭＣのＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、３時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１２２】
表３は、１．５時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表１に記載したプローブ）。
【０１２３】
表４は、３時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表２に記載したプローブ）。
【０１２４】
７．５、１５及び３０μＭで１．５、３、５、８及び２４時間、ＣＹＣ２０２で処理したＨＴ２９細胞由来のサンプルを使用してマイクロアレイから得た発現データにより、以下の表を得た。
【０１２５】
表５は、ＨＴ２９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、１．５時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１２６】
表６は、ＨＴ２９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、３時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１２７】
表７は、１．５時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表５に記載したプローブ）。
【０１２８】
表８は、３時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表６に記載したプローブ）。
【０１２９】
１５、４５及び７５μＭで２、４、８及び２４時間、ＣＹＣ２０２で処理したＡ５４９細胞由来のサンプルを使用してマイクロアレイから得た発現データにより、以下の表を得た。
【０１３０】
表９は、Ａ５４９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、２時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１３１】
表１０は、Ａ５４９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、４時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【０１３２】
表１１は、２時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表９に記載したプローブ）。
【０１３３】
表１２は、４時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表１０に記載したプローブ）。
【実施例２】
【０１３４】
リアルタイム定量ＰＣＲ（Real time quantitative PCR）を使用するマイクロアレイ・データの確認
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
同じ３つの細胞株から得られた全ＲＮＡサンプルを、マイクロアレイで観察した遺伝子発現レベルの検証のために使用した。リアルタイム定量ＰＣＲをRoche LightCycler machine（ロシュ社製、英国）で行った。プライマーを選択して、ゲノムＤＮＡで微量汚染されたＲＮＡサンプル生成物を得ることのないように、その可能性を排除した。
【０１３５】
さらに、全血液サンプルのＲＮＡをＱＰＣＲ法により分析した。ボランティアの血液をVacutainer Heparin CPT tubeに採取した。次に血液を、様々な濃度のＣＹＣ２０２又はＤＭＳＯで処理し、３０分毎にチューブを反転して、５％ＣＯ２の存在下３７℃で１．５時間、インキュベーターでインキュベートした。血液をその後、PAXgene tube（PreAnalytiX社製）に移動し、数回反転し、室温で２時間の最初のインキュベーションにより細胞を溶解させた後、−２０℃の場所に置いた。分析用に準備する場合には、血液を室温で約２時間放置して解凍し、使用説明書にしたがって処理した。デオキシリボヌクレアーゼ分解ステップを任意で含んだ。ＲＮＡサンプルは、定量後にＱＰＣＲアッセイで直接に使用した。
【０１３６】
プライマーを表１３に記載する。
【０１３７】
ワンステップ逆転写では、RNA Master SYBR Green I kit （ロシュ社製、英国）を使用した。２０μｌ反応体積において、１００ｎｇ又は１μｇの全ＲＮＡを、７．５μｌのRNA Master SYBR Green I、３．２５ｍＭ のMn(OAc)2、及び０．３μＭの各プライマーに添加した。反応条件は以下のようであった。ＲＴステップを６１℃で２０分間、次に変性ステップを９５℃で２分間、４５サイクルからなる増幅ステップを９５℃で５秒間、５５℃で５秒間、及び７２℃で１３秒間、次に、融解曲線分析ステップをプライマーダイマーと生成物を識別するために９５℃で５秒間、６５℃で１５秒間、及び０．１℃／秒で９５℃に上昇して行なった。最後に冷却ステップを４０℃で３０秒間行なって終了した。
ＱＰＣＲデータの分析
全サンプルを１μｇ／μｌにノーマライズし、等価なＲＮＡ全量をアッセイで使用した（対象のターゲット遺伝子により、１００ｎｇ又は１μｇ）。サンプルを複製し、ＰＣＲ反応を繰り返した。ＤＭＳＯ溶媒コントロールと比較した化合物の存在下、発現レベルにおけるfold changeを算出するための式を、以下のように計算した。
２ΔＣｔ
ここで２は、各ＰＣＲ反応の最大の効率であり、ΔＣｔはcrossing point valuesにおける変化である（サンプルCt - DMSOコントロールCt）。
【０１３８】
さらに、ハウスキーパー遺伝子の発現レベルをこれらのサンプルで測定し、データを次式の導関数を使用してノーマライズした。
【０１３９】
２ΔＣｔ target / ２ΔＣｔ housekeeper
結果
図１〜１７は、表１〜１２のマイクロアレイ・データで示される遺伝子発現データを有する１６遺伝子（ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、２０５８５、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、１８７４７、２２１４７、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ 及び ｍｃｌ−１）のグラフ表示を示す。ＰＢＭＣ並びに／又は、ＨＴ２９及び／若しくはＡ５４９の細胞における１６遺伝子の各々に対して得られたマイクロアレイ・データを、ＱＰＣＲ分析の結果と比較する。
【０１４０】
これらの結果をマイクロアレイ・データで確認する。
【実施例３】
【０１４１】
ＣＹＣ２０２で治療した患者における遺伝子発現の分析
患者サンプルの分析では、採血中及び採血直後におけるＲＮＡの発現特性を保存する方法は、ＱＰＣＲ法などの手法によりヒト全血の遺伝子発現の正確な分析をするためには重要である。室温での保存又は移動の間に、全血液中における個々のｍＲＮＡ種のコピー数は、１０００倍よりも大きく変化するということを、PreAnalytixは示している。これは、採血後、ある遺伝子の誘導性発現だけではなく、ＲＮＡの急速な分解により引き起こされる。
【０１４２】
よって、PAXgene（PreAnalytix社製、スイス）法を、細胞性ＲＮＡの単離のための迅速で効率的なプロトコルと一緒に使用して、全血検体を採取し、安定化及び運搬手段とした。このシステムの使用では、遺伝子発現における誤変動に関る問題に対して効果があり、わずか２．５ｍｌの全血から高品質のＲＮＡを数マイクログラム産生する。
方法論
ボランティアからの血液を、英国DundeeにあるHawkhill Medical CentreでVacutainer Heparin CPT tubeに採取し、実施例２に記載したように処理した。PAXgene tubeへ移動後、室温で２時間、最初のインキュベーションで細胞を溶解させた後、そのチューブを室温、４℃又は−２０℃の場所に置いた。
【０１４３】
様々な長さの時間、様々な保存条件で保存されている血液を、室温で約２時間放置してから、使用説明書にしたがって処理した。デオキシリボヌクレアーゼ（DNase）分解ステップを任意で含んだ。ＲＮＡサンプルは定量化して、ＱＰＣＲアッセイで直接使用した。
結果
ＲＮＡは、その収率は血液２．５ｍｌあたり３〜５μｇの間で様々であるが、許容できる品質を有している。ターゲット遺伝子（ＰＮＵＴＳ）及びハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）の発現をこれらの全サンプルにおいて測定した。
【０１４４】
図１８は、ＰＮＵＴＳの発現におけるＣＹＣ２０２の効果（下部パネル）、及びあるドナーの遺伝子発現のＣＹＣ２０２性変化における保存の効果（上部パネル）を示す。ＰＮＵＴＳの発現をハウスキーパーの発現にノーマライズし、グラフのデータを、インビトロの血液を３０μＭのＣＹＣ２０２に１．５時間接触後、ＰＮＵＴＳの発現におけるノーマライズしたfold decreaseとして表わした。
【０１４５】
これらの遺伝子発現は、すべてのサンプル中で検出され、ＣＹＣ２０２に血液を接触ことにより再現性よくダウンレギュレートされた（図１８の下部パネル）。最適条件は、−２０℃で保存することであるとされ、発現は、最初の１ヶ月間は−２０℃で安定しているように思われる（図１８の上部パネル）。これは４℃又は室温での保存よりも好ましく、製造者の勧告と一致する。
ＱＰＣＲアッセイの最適化
ＱＰＣＲアッセイの最適化を行なって、ポジティブシグナルとネガティブシグナルの相違を最大化し、遺伝子発現におけるfold changeについての的確な予測を可能にした。
【０１４６】
最適化はＲＮＡ増幅キットを使用して行なった。プライマー濃度、アニーリング温度及びＭｇＣｌ２濃度をすべて変更して、シグナルとノイズの最良の分離を得た。
【０１４７】
プライマーを最適化し、最終プライマーセットリストを表１４に示す。
【０１４８】
さらに、すべてのＰＣＲ産物をクローン化し、ＲＮＡが正確に増幅されたことを検証するために配列決定した。
ＣＹＣ２０２で治療した乳癌患者における遺伝子発現の分析
患者02-2-01 (08)を、１日目から５日目までは６００ｍｇのＣＹＣ２０２を１日２回、２日目から１５日目まではカペシタビン投与を経口で１日２回、併用して治療した。この患者に対して薬物動態解析を行なった。その結果、患者は有効なＣＹＣ２０２の値を数時間にわたり維持していたことが明らかになった。
【０１４９】
図１９は、患者02-2-01 (08)の薬物動態学的なデータを示し、１日目の完全な経時的データ及び５日目の投与前のある時点におけるデータを示す。ＣＹＣ２０２の血漿濃度をμＭで得る。インビトロのＰＮＵＴＳ及び他のターゲット遺伝子の影響を、ここで表わされる範囲内である、７．５〜１５μＭの濃度で１．５〜３時間観察した。
【０１５０】
この理由のため、治療１日目の複数の時点で、かかる患者の全血から抽出したＲＮＡの遺伝子発現に対する化合物の影響を分析することは有益であると思われた。ＰＮＵＴＳの発現をすべてのサンプルで検査し、このデータを安定的である２８ＳｒＲＮＡの発現レベルに対してノーマライズした。
【０１５１】
図２０は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＰＮＵＴＳの発現におけるfold decreaseを示すグラフである。ＰＮＵＴＳ発現は、最初のＣＹＣ２０２投薬後には約２〜３倍の減少となり、その後、５日目の投薬前に測定したときには正常のレベルに戻った。
【０１５２】
図２１は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のC/EBPαの発現におけるfold decreaseを示すグラフである。C/EBPα発現における減少は、最初のＣＹＣ２０２投薬から８時間後には約４．５倍となって、頂点に達し、その後、５日目の投薬前に測定したときには正常のレベルに戻った。
【０１５３】
図２２は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＦＵＴ４の発現におけるfold decreaseを示すグラフである。ＦＵＴ４発現における減少は、最初のＣＹＣ２０２投薬から３時間後には約２倍となって、頂点に達し、その後、最初の投薬後８時間までには、５日目の投薬前に測定したときには正常のレベルに戻った。
【０１５４】
図２３は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＮＭ＿０３３４１０の発現におけるfold decreaseを示すグラフである。ＮＭ ０３３４１０発現における減少は、最初のＣＹＣ２０２投薬から２時間後には約２倍となって、頂点に達し、その後、５日目の投薬前に測定したときには正常のレベルに戻った。
結論
遺伝子発現への影響の動態（kinetics）は、異なる遺伝子に対してＣＹＣ２０２を投薬後、異なる時間に起こる遺伝子発現の最大の影響をともなって、相当に変化する。ＰＮＵＴＳの場合、遺伝子発現の変化は、ＰＫデータに酷似する。すべてのＲＮＡサンプルを、１ｍｇ／ｍｌにノーマライズして希釈し、濃度を再度測定し、すべてのサンプルが同じ濃度であったことを確認した。さらにまた、２８ＳｒＲＮＡの発現を分析することで確認した。すべての遺伝子発現を２８ＳｒＲＮＡにノーマライズしたので、２８ＳｒＲＮＡにおけるあらゆる小さな変動には、サンプル間のＲＮＡ濃度のあらゆる小さな変化が取り入れることであろう。
【０１５５】
かかるデータでは次のことを確認する。本発明に見られる遺伝子発現の差動効果は、ＲＮＡ濃度の差異によるものではなく、末梢血単核細胞及び腫瘍細胞のインビトロのマクロアレイ実験及びＱＰＣＲ実験により浮き彫りにされたいくつかの遺伝子発現における、ＣＹＣ２０２で治療した患者に起こる本当の変化である。
【実施例４】
【０１５６】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用した血漿プロテオミクス特性の分析及びバイオマーカーの同定
ＳＥＬＤＩ
ＣＹＣ２０２治療の初日及び最終日に、患者から血漿サンプルを得た。異なる腫瘍タイプを有し、異なる投薬を受け、ＣＹＣ２０２の投与計画を予定している患者からなる全１６名の患者を、本調査において分析した。１０名の患者には、３週間毎に１日あたり１．６ｇ〜３．２ｇのＣＹＣ２０２を５日間続けて投与し、４名の患者には、３週間毎に１日あたり１．６ｇ〜２ｇのＣＹＣ２０２を１０日間続けて投与した、２名の患者には、３週間毎に１日あたり２．４ｇのＣＹＣ２０２を３日間投与した。全サンプルをアリコートで、−８０℃で保存した。
【０１５７】
サンプルを、４つの異なるProteinChip(R) Array表面で、Q Ceramic HyperD(R)F96 well plate（Ciphergen社製）におけるNeat又は分画のどちらかを分析した。かかる手法は、複雑な生物源からタンパク質を分離し、電荷に基づいて分画する。陰イオン交換吸着剤を、タンパク質の分画用にデザインし、イオン交換体と同様のｐＩ又は結合親和力を有するタンパク質を一緒に溶出する。これはまた、サンプルにおける極めて大量のタンパク質を、限定した数の画分に分離するという便益を提供し、ProteinChip(R) Array表面の容量を超えてはいないということを確実にするだけでなく、低存在量のタンパク質におけるシグナル抑制効果を減少させる。
【０１５８】
分画のために、２０μｌの各血漿サンプルを３０μｌのＵ９緩衝液（尿素９Ｍ、２％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ９のＴｒｉｓ−ＨＣｌを５０ｍＭ）で、３０分間室温で混合した。その後、Q HyperD(R) F plateに添加する前に、同量のＵ１緩衝液（尿素１Ｍ、０．２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのｐＨ９Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）で希釈した。分画は、ｐＨを連続的に低下させることによる溶離を基本的に含むExpression Difference MappingTM kitの使用説明書にしたがって完成させ、６画分を調製した。
【０１５９】
すべてのチップ表面を、以下に記載するような適当な結合緩衝液と平衡にした。分画したサンプルをその後、適当な結合緩衝液と１：１０の割合で希釈して様々な表面に使用した。NeatサンプルをＵ９緩衝液で１：６の割合に希釈し、室温で３０分間混合し、その後にまた、適当な緩衝液で１：１０の割合で希釈し、ProteinChip(R) Array表面に結合した。ＳＡＸ−２ 又は Ｑ１０ ProteinChip(R) Arraysは強陰イオン交換表面であり、サンプルを、ｐＨ９緩衝液（１００ｍＭのｐＨ９Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中でこれらのProteinChip(R) Arraysに使用した。ＷＣＸ２及びＣＭ１０チップは弱陽イオン交換表面であり、使用した緩衝液は１００ｍＭのｐＨ３．５ＮａＯＡｃ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００であった。１０％ ＡＣＮ + ０．１％ ＴＦＡ 及びＩＭＡＣ チップを利用した疎水性のチップ表面（Ｈ５０）を、使用説明書にしたがって０．１Ｍの硫酸銅で活性化した。全サンプルを、プラットフォームシェーカーを用いて室温で１時間結合させた。アレイを結合緩衝液で１回洗浄し、続いて界面活性剤非存在下において結合緩衝液で２回洗浄した。各々を、プラットフォームシェーカーを用いて５分間行なった。その後１０ｍＭのｐＨ７Ｈｅｐｅｓで簡単にすすぎ、空気乾燥させた。０．８μｌの５０％飽和シナピン酸（５０％のアセトニトリル、０．０５％ＴＦＡで調製）を、各スポットに対して２回使用した。次にタンパク質をProteinChip(R) Readerで検出した。データは、０〜５０，０００（低）、０〜１００，０００（中）、及び０〜２００，０００（高）、の３つの異なる質量範囲を使用して、１９０〜２１０の強度を有する平均値が約１５０のレーザーショットにより、収集した。
【０１６０】
Biomarker Wizard Softwareを使用して、全スペクトルを集め、２０００〜２００，０００の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有する適格な質量ピーク（信号対雑音比＞５）を、自動検出した。ピーククラスターは、second-passのピーク選択（信号対雑音比＞２、０．３％未満のmass window）を使用して完成し、推定のピークを加えた。ピーク強度を、該データが、質量範囲の低、中又は高のいずれから得られたかにより、２０００〜５０，０００、２０００〜１００，０００又は２０００〜２００，０００のｍ／ｚの全イオン電流にノーマライズした。これらのすべてを、ProteinChip(R) Software 3.1（Ciphergen社製）を使用して行なった。付加的な前処理段階では、ピーク強度データの対数変換のみを行なった。Biomarker Wizardにより、スペクトルの全サンプル群から類似の分子量のピークを分類し、サンプル群間の発現レベルの差異を統計的に及び視覚的に表示した。各サンプルの平均及び標準偏差を記録し、適当な統計学を使用した。非常に大きなデータセットに対してはパラメトリック検定を使用するが、この調査に対しては、データが小さすぎるので正規分布を有していないと判断し、ノンパラメトリック検定を行なった。ここでは、Mann-Whitney U testを使用してデータを分析し、０．０５未満のｐ値を、処理前又は処理後を表示し、２群の間において統計的に有意な差異と思われる各クラスター群に指定した。
二次元ゲル（2D gels）
一次元の等電点電気泳動に対しては、二次元ゲル電気泳動を、IPGPhor（Amersham Pharmacia Biotech社製）システムを使用して行ない、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対しては、Novex MiniCell（Invitrogen社製）システムを使用して行なった。
【０１６１】
使用説明書にしたがい、IPGphorにおいて、再水和緩衝液（８Ｍの尿素、２％ＣＨＡＰＳ、ブロモフェノール・ブルー、及びｐＨに対して適当な０．５％ ＩＰＧ 緩衝液）と、５μｌの血漿サンプルと、２０ｍＭのＤＴＴを、２０℃で１６時間使用してｉｎ−ｇｅｌ再水和により、等電点電気泳動に対するサンプルを、Immobiline DryStrips（７ｃｍ、ｐＨ３〜１０（linear）又はｐＨ４〜７）に添加した。１ストリップ当り５０ｍＡの定電流で８時間を超えて総量約４００００Ｖを使用して、タンパク質を一次元に集束させた。等電点電気泳動後、Immobiline DryStripsを、５０ｍＭのｐＨ８．８Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍの尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノール・ブルー及び１０ｍｇ／ｍｌのＤＴＴを含む平衡緩衝液で、３０分間室温で平衡化した。さらに１５分間、ＤＴＴを含まないが、２５ｍｇ／ｍｌのヨードアセトアミドを含む平衡緩衝液で平衡化した。
【０１６２】
二次元電気泳動を、４〜１２％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して行なった。集束した／平衡したImmobiline DryStripsをＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅゲルと直接に接触して置き、タンパク質を１５０Ｖの定電圧でブロモフェノール・ブルーがゲルの底部に達するまで電気泳動を使用して分離した。
【０１６３】
Colloidal Blue staining （Invitrogen社製）を、使用説明書にしたがって行ない、対象のスポットを複製ゲルから切り取って、受動溶出（passive elution）によりタンパク質の同定及びタンパク質の抽出のために平行して処理した。
タンパク質の同定
タンパク質同定のために、ゲル片を１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム／５０％アセトニトリル中で連続してインキュベートし、１０分間の洗浄を３回行ない、過剰の染色及びＳＤＳを除去し、その後１００％アセトニトリルで５分間行なった。この溶液を除去し、ゲル片をヒートブロックで簡単にインキュベートし、ゲル片を脱水した。トリプシン（２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム中に１０ｎｇ／ｕｌのPromega porcine trypsin）を添加して、ゲル片を３７℃で一晩インキュベートしてタンパク質を消化した。トリプシン消化が成功したかどうかを確認するために、サンプルをＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。この分析を行なうために、０．５μｌのトリプシン消化物を０．５μｌの２０％α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）基質溶液と、５０％のＡＣＮ、０．５％のＴＦＡ中で混合し、ＮＰ２０チップに添加した。タンパク質を同定するために、ペプチド消化物をUniversity of Dundee 'FingerPrints' Proteomics Facilityに提出した。消化物はABI 4700 Proteomics Analyzer with Tof/Tof OpticsのＭＳ及びＭＳ−ＭＳによって分析された。消化した各ゲルスポットのペプチド質量指紋で組み合わせたＭＳ及びＭＳ−ＭＳデータを、Matrix Science社製のMascot検索エンジンを用いてＣＤＳデータベースを検索するために使用した。
受動溶出（Passive elution）
受動溶出手法を使用して、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦで再分析が可能となるように、ゲル片からタンパク質の抽出を行なう。ゲル片を、シェーカーを用いて１００％アセトニトリルで５分間インキュベートし、溶液を除去し、ゲル片をヒートブロックにしばらく置いて乾燥させた。その後、ＦＡＰＨ溶液（５０％ギ酸、２５％アセトニトリル、１５％イソプロパノール、１０％水）をゲル片及び室温で３０分間超音波処理したサンプルに添加した。さらに２〜３時間ボルテックスし、ＮＰ２０チップに添加して、その受動溶出液の特性を、バイオマーカーを明らかにするオリジナルのサンプルスペクトルの特性と比較した。
４．１ １４ｋＤａバイオマーカーの同定及びトランスサイレチン（Transthyretin）であることの証拠
処理により増加した１４ｋＤａバイオマーカーを、ＩＭＡＣ−Ｃｕ２＋及びＳＡＸチップの両方で同定した。ｐＨ９におけるＳＡＸチップの分画４の分析から得られた Biomarker Wizardデータを、患者の代表的な特性と同様に示す。
【０１６４】
図２４：上部半分：ｐＨ９のＳＡＸチップにおける１ｂ期の患者１６名の分画４の分析のBiomarker Wizardプロット。１３．５ｋＤａ〜１４．６ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを青（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを赤（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準の強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらずサンプル群間の差異を表現する。
【０１６５】
下部半分：処理後の付加的ピークの出現を示している患者２名の代表的なスペクトル。統計的に有意に、より高度にノーマライズした強度を、Ｍ／Ｚ１４２５５（49.7+/-8.4 vs 20.4+/-3.9; p=0.0000031, Mann-Whitney U test）に対して、「処理後」グループを「処理前」グループと比較して観察した。
【０１６６】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析後、患者４名のサンプルをｐＨ４〜７に固定したｐＨ勾配ストリップに添加して、等電点（電荷）にしたがってタンパク質を分離した。等電点電気泳動後、大きさにより二次元分離を行なった。処理の初日と最終日の差異を観察するために、ゲルをColloidal blue染色で染色した。その変化を四角で囲んで強調する。
【０１６７】
図２５は患者の血漿の二次元ゲルを示す。Neat血漿サンプルをｐＨ４〜７のＩＰＧストリップに添加し、電荷により一次元においてタンパク質を分離し、次に、二次元においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさで分離した。分子量サイズマーカーは各ゲルの左にある。対象のスポットは、各ゲルの左に示される１４ｋＤａ〜１７ｋＤａマーカーにちょうど存在する。下部のゲルは、変化が再現可能ということを示し、さらに２名の患者の拡大図を表わす。
【０１６８】
各サンプルの上部２つのゲルスポットを、トリプシン消化物及び受動溶出のために平行して切り取り処理し、ゲルからタンパク質を溶出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦにおける再分析を可能にした。受動溶出サンプルを、ＮＰ２０チップに添加して、タンパク質ピークの大きさ及び特性を検査し、それらがバイオメーカーピークそのものに類似しているかどうかを判断した（図２５）。平行サンプルを、トリプシン消化及びペプチド・マッピングのために処理し、これらのスポットは、University of Dundee Proteomics facilityで、ＭＳ及びＭＳ−ＭＳの両方により、トランスサイレチンとして同定された。
【０１６９】
図２６は、オリジナルＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ特性と二次元ゲルから抽出した受動溶出サンプルとの比較を示す。ゲルを複製し、各サンプル（１日目又は１０日目）における約１４ｋＤａの２つのスポットを、受動溶出又はトリプシン消化のために平行して切り取り処理した。受動溶出により、ゲルスライスからタンパク質の抽出が可能となり、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析を行なうことができる。これは上部４つの特性に示し、サンプルのオリジナルＳＥＬＤＩ特性と比較する（最下部の２つのスペクトルで示す）。１日目のスポット２の受動溶出では、このスポットは処理前にColloidal染色で極めて弱く染色されるという知見と一致して、いかなる特性も生じなかった。受動溶出特性はあまり分離されない傾向にあるが、それにもかかわらず、点線で示されるように、オリジナルＳＥＬＤＩ特性の２つのピークで完璧に整列するように思われ、余分のスポットは、１０日目に存在し、Biomarker Wizardにより同定された１４２５５バイオマーカーで完璧に整列する。トリプシン消化物をUniversity of Dundeeで分析した。
【０１７０】
２つの下部スポットは、処理により変化するようには思えなかったが、トリプシン消化によっても分析され、ハプトグロビンとして同定された。
【０１７１】
そのサンプル前後における２つの上部スポットは、すべてトランスサイレチンとして同定された。これは、新規で異なったタンパク質の出現というよりも、タンパク質のさらなる酸性型をもたらす、処理後のユニークなスポットはトランスサイレチンの翻訳後修飾によるということを示唆した。受動溶出後のサンプルにおけるタンパク質の同定及び分析の平行判定では、Biomarker Wizardにより同定された１４ｋＤａバイオマーカーは事実上トランスサイレチンであるという明解な証拠を示す。
【０１７２】
二次元ゲルのスポットに対する２つのピークは、約３３２〜３４１Ｄａ隔てられていた。大きさの違いは、Delta Mass Reference Database for Protein Translational Modifications (http://www.abrf.org)で判断されたように、タンパク質のＳ−パルミトイルシステイニル修飾を示し、ＣＹＣ２０２の処理後に認められたＴＴＲの付加的な酸性型は、Ｓ−パルミトイルシステイニルが原因であるかもしれないということを示唆している。
４．２ ２８ｋDａバイオマーカークラスター、アポリポタンパク質Ａ１の同定
統計的に有意な２つの２８ｋＤａバイオマーカーは、処理により減少した４チップすべての表面に存在していたということが同定された。これら２つのピークに隣接して付加的な２つのピークが認められたが、統計的に有意な程度ではなかった。それにもかかわらず、処理に対して再現性よく変化するように思われた。ｐＨ９のＳＡＸチップにおける分画４の分析から得られたBiomarker Wizardデータを、患者の代表的な特性と同様に図２６に示す。
【０１７３】
ＣＹＣ２０２による処理は、２７９２３及び２８１２６における２つのピークで減少をもたらす。一方、統計的に有意な程度ではない２８２９２及び２８７９９におけるピークでは、それにもかかわらず、処理後に劇的に増加するように思われる。
【０１７４】
図２７：上部半分：ｐＨ９のＳＡＸチップにおける１ｂ期の患者１６名の分画４の分析のBiomarker Wizardプロット。２６．５ｋＤａ〜３０．５ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを青（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを赤（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。
【０１７５】
下部半分：処理後の最初の２つのバイオマーカーに対する最初の２つのピークの減少、及び第３バイオマーカーに対する第３ピークにおける出現又は増加を示す患者２名の代表的なスペクトル。統計的に有意に、より低度にノーマライズした強度を、Ｍ／Ｚ２７９２３（31.8+/-13.7 vs 50.6+/-11.8; p = 0.00097, Mann-Whitney U test）及びＭ／Ｚ２８１２６（20.4+/-9.9 vs 32.0+/-9.6; p = 0.0058, Mann-Whitney U test）に対して、「処理後」グループを「処理前」グループと比較して観察した。Ｍ／Ｚ２８２９２及びＭ／Ｚ２８７９９における２つのマーカーは、統計的に有意（各々p = 0.95及び0.19）であるとは思えず、２名の患者の処理後における明らかな増加であると思われる程度である。
【０１７６】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析後、患者４名のサンプルをｐＨ４〜７に固定したｐＨ勾配ストリップに添加して、等電点（電荷）にしたがってタンパク質を分離した。等電点電気泳動後、大きさにより二次元分離を行なった。処理の初日と最終日の差異を観察するために、ゲルをColloidal blue染色で染色した。その変化を四角で囲んで強調する。
【０１７７】
図２８は患者の血漿の二次元ゲルを示す。Neat血漿サンプルをｐＨ４〜７のＩＰＧストリップに添加し、電荷により一次元においてタンパク質を分離し、次に、二次元においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさで分離した。分子量サイズマーカーは各ゲルの左にある。対象スポットは、２８ｋＤａマーカーの下にちょうど存在する。
【０１７８】
図２８の画像は、さらに２名の患者の二次元ゲルの拡大図を表わし、処理後の付加的なさらなる酸性スポットの出現を示す。
【０１７９】
図２９：処理後の第３のさらなる酸性スポットの出現、及びBiomarker Wizard プロットに一致する最初のスポットでの中程度の減少を示している２０９患者及び１１６患者に対する二次元ゲルの拡大図。
【０１８０】
その後、２０９患者１日目のサンプルを、広域範囲のｐＨ（ｐＨ３〜１０）のＩＰＧストリップに添加して、ひとつの未分解スポットを得た。この物質を含むゲルスポットをゲルから切り取り、受動溶出を行なってゲル片からタンパク質を抽出した。その後、ＮＰ２０チップに添加して、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによりタンパク質の大きさ及び特性を検査した（図３０）。
【０１８１】
平行サンプルを、トリプシン消化及びペプチド・マッピングのために処理し、University of Dundee Proteomics facilityで、ＭＳ及びＭＳ−ＭＳの両方により、アポリポタンパク質Ａ１であると同定した。
【０１８２】
同じ処理を、上記で示した分離したアポＡ１スポットにおいて行なった。すべてのスポットを、処理後のユニークスポットは新規で異なるタンパク質の出現というよりもアポＡ１の翻訳後修飾によるということを示唆するアポＡ１であると同定した。これは、全１６名の患者にとっては統計的に有意な程度には達しない２８．２９２における第３のバイオマーカーに最も応答したようであった。
【０１８３】
図３０：ｐＨ３〜１０のＩＰＧストリップを用いた患者の血漿の二次元ゲル分析。ゲルを複製し、２８ｋＤａにおけるスポットを、受動溶出又はトリプシン消化のために平行して切り取り処理した。受動溶出により、ゲルスライスからタンパク質の抽出が可能となり、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析を行うことができる。これは下部の特性に示し、オリジナル２０９の１日目のサンプルと有利に比較する―上部特性。トリプシン消化物をUniversity of Dundeeで分析した。
【０１８４】
受動溶出後のサンプルのタンパク質同定及び分析の平行判定では、ＳＥＬＤＩにより同定された２８ｋＤａバイオマーカーは事実上アポリポタンパク質Ａ１であるという明確な証拠を示している。従って、ＣＹＣ２０２処理によって変化しているとしてBiomarker Wizardにより同定された２８ｋＤａピークは、アポリポタンパク質Ａ１（アポＡ１）である。アポＡ１は、グリコシル化、アシル化及びリン酸化などの翻訳後修飾の対象となる。アポＡ１の脱アミド化した型もまた同定されている。
４．３ ７ｋＤａバイオマーカー・クラスターの同定
処理後においてのみ現れる７ｋＤａバイオマーカーのクラスターを、いくつかのチップ表面で同定した。ｐＨ９のＨ５０チップにおける分画６、及びＣＭ１０チップにおけるNeat血漿の分析のBiomarker Wizardデータを、数名の患者の典型的な特性と同様に示す。
図３１：上部半分：Ｈ５０チップにおける１ｂ期の患者１６名の分画６の分析のBiomarker Wizardプロット。５ｋＤａ〜８．５ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。
【０１８５】
下部半分：処理後の付加的な２つのピークの出現を示す患者３名の代表的なスペクトル。統計的に有意に、より高度にノーマライズした強度を、Ｍ／Ｚ６７９９（2.9+/-1.2 vs 29.1+/-8.1; p=0.0000031, Mann-Whitney U test）及び Ｍ／Ｚ６９９８（2.1+/-0.7 vs 42.0+/-9.1; p=0.0000031, Mann-Whitney Utest）に対して、「処理後」グループを「処理前」グループと比較して観察した。
【０１８６】
図３２：上部半分：ＣＭ１０チップにおける１ｂ期の患者１６名のNeat 血漿の分析のBiomarker Wizardプロット。６ｋＤａ〜８ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを青（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを赤（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。
【０１８７】
下部半分：処理後の付加的な２つのピークの出現を示す患者３名の代表的なスペクトル。統計的に有意に、より高度にノーマライズした強度を、Ｍ／Ｚ６７８７（5.6+/-1.9 vs 27.5+/-10.4; p=0.0000014, Mann-Whitney U test）及び Ｍ／Ｚ６９８４（3.1+/-1.2 vs 42.2+/-11.8; p=0.0000014, Mann-Whitney Utest）に対して、「処理後」グループを「処理前」グループと比較して観察した。
【０１８８】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析後、患者（２０９）のサンプルをＣＭ１０チップに添加して、タンパク質の結合特性を検査した。結合はｐＨ３．５の８スポットすべてにおいて行なわれており、チップスポットをｐＨを上げながら、ｐＨ３．５、４．５、５．５、及び７で洗浄した。バイオマーカーは、ｐＨ４．５以下で洗浄した場合に、チップに存在するのみであり、タンパク質のｐＩは約４．５〜５であることを示唆している。
【０１８９】
本明細書の上述部分に例挙された出版物、それらの出版物に引用された文献は、参照することによって本明細書に組み込まれる。記載した本発明の方法やシステムの様々な改良や変形は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、当業者に明らかとなるであろう。本発明は、具体的な好ましい実施例に関して説明してきたが、本発明が請求するように、これらの具体的な実施例に不当に限定されるべきではないことは、理解されるであろう。実際には、分子生物学及び関連する分野の当業者には自明であるところの、前述の態様についての本発明を実施する上での様々な改良も、本発明の範囲に含まれるものとする。
【０１９０】
（表の簡単な説明）
表１は、ＰＢＭＣのＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、１．５時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表１】
【０１９１】
表２は、ＰＢＭＣのＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、３時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表２】
【０１９２】
表３は、１．５時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表１に記載したプローブ）。
【表３】
【０１９３】
表４は、３時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表２に記載したプローブ）。
【表４】
【０１９４】
表５は、ＨＴ２９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、１．５時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表５】
【０１９５】
表６は、ＨＴ２９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、３時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表６】
【０１９６】
表７は、１．５時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表５に記載したプローブ）。
【表７】
【０１９７】
表８は、３時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表６に記載したプローブ）。
【表８】
【０１９８】
表９は、Ａ５４９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、２時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表９】
【０１９９】
表１０は、Ａ５４９細胞のＣＹＣ２０２処理の結果を示し、後の時点でのこれら遺伝子発現に対するデータとともに、４時間で有意にダウン・レギュレートする遺伝子発現を有する遺伝子を記載する。
【表１０】
【０２００】
表１１は、２時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表９に記載したプローブ）。
【表１１】
【０２０１】
表１２は、４時間でダウン・レギュレートする発現を有するAffymetrix Chipsのプローブに対する遺伝子の同定を示す（すなわち、表１０に記載したプローブ）。
【表１２】
【０２０２】
表１３は、ＱＰＣＲ分析で使用したプライマーの配列を示す。
【表１３】
【０２０３】
表１４は、ＱＰＣＲ分析で使用した最適化されたプライマーの配列を示す。
【表１４】
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、ＡＤＭに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図２】図２は、ＦＡＤＤに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図３】図３は、ＰＡＩ１に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図４】図４は、ＰＬＡＵに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図５】図５は、ＰＮＵＴＳに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図６】図６は、ＴＮＦＳＦ１４に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図７】図７は、Ｃ／ＥＢＰαに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図８】図８は、２０５８５に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図９】図９は、ＦＵＴ４に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１０】図１０は、Ｅ２Ｆ６に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１１】図１１は、１８７４７に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１２】図１２は、２２１４７に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１３】図１３は、ＺＫ１に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１４】図１４は、ＫＩＡＡ１６９８に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１５】図１５は、ＣＣＲＬ２に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１６】図１６は、ｍｙｃに対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較を示す。
【図１７】図１７は、Ｍｃｌ １に対するマイクロアレイ・データ及びＱＰＣＲデータの比較示す。
【図１８】図１８は、ＰＡＸ遺伝子システムを使用して数人のドナーから調製した血液中でのＰＮＵＴＳの発現におけるＣＹＣ２０２の効果（下部パネル）、及びあるドナーの遺伝子発現のＣＹＣ２０２性変化における保存の効果（上部パネル）を示す。
【図１９】図１９は、患者02-2-01(08)の薬物動態学的なデータを示し、１日目の完全な経時的データ及び５日目の投与前のある時点におけるデータを示す。ＣＹＣ２０２の血漿濃度をμＭで得る。
【図２０】図２０は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＰＮＵＴＳの発現におけるfold decreaseを示すグラフである。
【図２１】図２１は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＣＥＢＰの発現におけるfold decreaseを示すグラフである。
【図２２】図２２は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＦＵＴ４の発現におけるfold decreaseを示すグラフである。
【図２３】図２３は、２８ＳｒＲＮＡレベルでノーマライズ後のＮＭ＿０３３４１０の発現におけるfold decreaseを示すグラフである。
【図２４】図２４：上部半分：ｐＨ９のＳＡＸチップにおける１ｂ期の患者１６名の分画４の分析のBiomarker Wizardプロット。１３．５ｋＤａ〜１４．６ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを（ｔ）で示す。下部半分：処理後の付加的ピークの出現を示す患者２名の代表的なスペクトル。
【図２５】図２５は患者の血漿の二次元ゲルを示す。Neat血漿サンプルをｐＨ４〜７のＩＰＧストリップに添加し、電荷により一次元においてタンパク質を分離し、次に、二次元においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさで分離した。分子量サイズマーカーは各ゲルの左にある。対象のスポットは、各ゲルの左に示される１４ｋＤａ〜１７ｋＤａマーカーにちょうど存在する。下部のゲルは、変化が再現可能ということを示し、さらに２名の患者の拡大図を表わす。
【図２６】図２６は、オリジナルＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ特性と二次元ゲルから抽出した受動溶出サンプルとの比較を示す。ゲルを複製し、各サンプル（１日目又は１０日目）における約１４ｋＤａの２つのスポットを、受動溶出又はトリプシン消化のために平行して切り取り処理した。受動溶出により、ゲルスライスからタンパク質の抽出が可能となり、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析を行なうことができる。これは上部４つの特性に示し、サンプルのオリジナルＳＥＬＤＩ特性と比較する（最下部の２つのスペクトルで示す）。
【図２７】図２７：上部半分：ｐＨ９のＳＡＸチップにおける１ｂ期の患者１６名の分画４の分析のBiomarker Wizard プロット。２６．５ｋＤａ〜３０．５ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。下部半分：処理後の最初の２つのバイオマーカーに対する最初の２つのピークの減少、及び第３バイオマーカーに対する第３ピークにおける出現又は増加を示す患者２名の代表的なスペクトル。
【図２８】図２８は患者の血漿の二次元ゲルを示す。Neat血漿サンプルをｐＨ４〜７のＩＰＧストリップに添加し、電荷により一次元においてタンパク質を分離し、次に、二次元においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさで分離した。分子量サイズマーカーは各ゲルの左にある。対象スポットは、２８ｋＤａマーカーの下にちょうど存在する。
【図２９】図２９は２０９患者及び１１６患者に対する二次元ゲルの拡大図を示す。
【図３０】図３０は、ｐＨ３〜１０のＩＰＧストリップを用いた患者の血漿の二次元ゲル分析を示す。ゲルを複製し、２８ｋＤａにおけるスポットを、受動溶出又はトリプシン消化のために平行して切り取り処理した。
【図３１】図３１：上部半分：Ｈ５０チップにおける１ｂ期の患者１６名の分画６の分析のBiomarker Wizardプロット。５ｋＤａ〜８．５ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。下部半分：処理後の付加的な２つのピークの出現を示す患者３名の代表的なスペクトル。
【図３２】図３２：上部半分：ＣＭ１０チップにおける１ｂ期の患者１６名のNeat 血漿の分析のBiomarker Wizardプロット。６ｋＤａ〜８ｋＤａの質量範囲のみをここに示す。処理開始前の１日目のサンプルを（ｕ）で示し、処理最終日のサンプルを（ｔ）で示す。強度をノーマライズしたログはピーク強度のログをプロットし、標準強度を０にノーマライズし、よって、絶対強度にもかかわらず、サンプル群間の差異を表現する。下部半分：処理後の付加的な２つのピークの出現を示す患者３名の代表的なスペクトル。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞、細胞群、モデル動物又はヒトがＣＤＫＩで処理されていることを特徴とする細胞、細胞群、モデル動物又はヒトからサンプルを分離するステップ、及び
ｂ）未処理のコントロールサンプルと比較して、ｉ）表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子、又は処理したサンプルにおけるii）２８ｋＤａのタンパク質、若しくはiii）１４ｋＤａのタンパク質のうち、少なくとも１つの発現の変化を、ＣＤＫＩ活性の指標として、決定するステップ
を含む、ＣＤＫＩ活性のモニタリング方法。
【請求項２】
発現の変化が、表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子の遺伝子発現の増加又は減少であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
表１〜１２に記載した遺伝子が、ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、２０５８５、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、１８７４７、２２１４７、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ 及び ｍｃｌ−１から選択されることを特徴とする請求項２で請求した方法。
【請求項４】
細胞群が細胞培養物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
細胞をＰＢＭＣ、ＨＴ２９、及びＡ５４９の細胞から選択することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
細胞群が、腫瘍細胞、ＰＢＭＣ又はリンパ球であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
サンプルが、血液であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項８】
サンプルからＲＮＡを抽出するステップ、及びＱＰＣＲ法により遺伝子発現を検出するステップ、をさらに含む請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の変化が、未処理サンプルと比較して、発現の減少であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
発現の変化が、２８ｋＤａのタンパク質の減少であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
発現の変化が、未処理コントロールサンプルと比較して処理したサンプルにおいて、２８ｋＤａのタンパク質又は１４ｋＤａのタンパク質の１以上の翻訳後修飾の存在又は不在であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
２８ｋＤａのタンパク質がアポリポタンパク質Ａ１であることを特徴とする請求項１、１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
１４ｋＤａのタンパク質がトランスサイレチンであることを特徴とする請求項１又は１１記載の方法。
【請求項１４】
サンプルが血清、血漿若しくは組織培養上清であることを特徴とする請求項１又は１０〜１３記載の方法。
【請求項１５】
サンプルを、タンパク質分析法により分析することを特徴とする請求項１又は１０〜１４記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質分析法が、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ又は二次元ＰＡＧＥによることを特徴とする請求項１又は１０〜１５記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤＫＩを哺乳動物に投与することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤＫＩをヒトに投与することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の変化をモニタリングすることを含む、ＣＤＫＩの適切な投与量を決定する方法。
【請求項２０】
ＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、２８ｋＤａ又は１４ｋＤａのタンパク質の発現の変化をモニタリングすることを含む、ＣＤＫＩの適切な投与量を決定する方法。
【請求項２１】
２８ｋＤａ又は１４ｋＤａのタンパク質が、翻訳後修飾された形であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
候補薬剤を、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、及び未処理のコントロールサンプルと比較してｉ）表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子、又は処理したサンプルにおけるii）２８ｋＤａのタンパク質、若しくはiii）１４ｋＤａのタンパク質のうち、少なくとも１つの発現の変化を、ＣＤＫＩ活性の指標として、検出するステップを含む、ＣＤＫＩ様活性を有する候補薬剤の同定方法。
【請求項２３】
ＣＤＫＩがロスコビチンであることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
ロスコビチンがＲ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤＫＩ活性のモニタリングにおける、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子、又はアポリポタンパク質Ａ１若しくはトランスサイレチンをコードする遺伝子の使用。
【請求項２６】
ＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子又は２８ｋＤａ若しくは１４ｋＤａのタンパク質の存在をモニタリングすることを特徴とする請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
ＣＤＫＩがロスコビチンであることを特徴とする請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
ロスコビチンがＲ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子によりコードされたタンパク質、又は２８ｋＤａ若しくは１４ｋＤａのタンパク質に対する抗体を含む、ロスコビチン活性評価用キット。
【請求項３０】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子に対する核酸プローブを含む、ロスコビチン活性評価用キット。
【請求項３１】
表１３又は１４に記載した配列を有するＱＰＣＲプライマーを含む、ロスコビチン活性評価用キット。
【請求項３２】
請求項１〜２４のいずれかで定義した方法における、請求項２９〜３１のいずれかで定義したキットの使用。
【請求項３３】
（ｉ）ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、
（ii）処理した又は未処理の細胞、動物又はヒト由来のサンプルにおいて、遺伝子発現を測定するステップ、及び
（iii）未処理サンプルと比較して、処理したサンプルにおいて、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の増加又は減少を、ロスコビチン活性の指標として、検出するステップ
を含む、ロスコビチン活性のモニタリング方法。
【請求項３４】
表１〜１２に記載した遺伝子が、ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、２０５８５、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、１８７４７、２２１４７、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ 及び ｍｃｌ−１から選択されることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ロスコビチンを哺乳動物に投与することを特徴とする請求項３３又は３４記載の方法。
【請求項３６】
ロスコビチンをヒトに投与することを特徴とする請求項３３〜３５のいずれか記載の方法。
【請求項３７】
細胞群が細胞培養物であることを特徴とする請求項３３又は３４記載の方法。
【請求項３８】
細胞をＰＢＭＣ、ＨＴ２９及びＡ５４９の細胞から選択することを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の存在が、腫瘍細胞又はリンパ球で検出されることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか記載の方法。
【請求項４０】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子のレベルが、ロスコビチンの投与前に検出されたレベルよりも低いことを特徴とする請求項１〜３９のいずれか記載の方法。
【請求項４１】
ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の範囲や程度をモニタリングすることを含む、ロスコビチンの適切な投与量を決定する方法。
【請求項４２】
候補薬剤を細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、及び表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の存在又は不在をモニタリングするステップを含む、ロスコビチン様活性を有する候補薬剤の同定方法。
【請求項４３】
ロスコビチンがＲ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項１〜４２のいずれか記載の方法。
【請求項４４】
ロスコビチン活性のモニタリングにおける、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の使用。
【請求項４５】
ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の存在をモニタリングすることを特徴とする請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
ロスコビチンがＲ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項４４又は４５記載の使用。
【請求項４７】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子に対する抗体を含むロスコビチン活性評価用キット。
【請求項４８】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子に対する核酸プローブを含むロスコビチン活性評価用キット。
【請求項４９】
請求項１〜１２のいずれかで定義した方法における、請求項４７又は４８で定義したキットの使用。
【請求項５０】
（ｉ）ＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、
（ii）処理した又は未処理の細胞、動物又はヒト由来のサンプルにおいて、遺伝子発現を測定するステップ、及び
（iii）未処理サンプルと比較して、処理したサンプルにおいて、表１〜１２のいずれかに記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の増加又は減少を、ＣＤＫＩ活性の指標として、検出するステップ、
を含む、ＣＤＫＩ活性のモニタリング方法。
【請求項１】
ａ）細胞、細胞群、モデル動物又はヒトがＣＤＫＩで処理されていることを特徴とする細胞、細胞群、モデル動物又はヒトからサンプルを分離するステップ、及び
ｂ）未処理のコントロールサンプルと比較して、ｉ）表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子、又は処理したサンプルにおけるii）２８ｋＤａのタンパク質、若しくはiii）１４ｋＤａのタンパク質のうち、少なくとも１つの発現の変化を、ＣＤＫＩ活性の指標として、決定するステップ
を含む、ＣＤＫＩ活性のモニタリング方法。
【請求項２】
発現の変化が、表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子の遺伝子発現の増加又は減少であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
表１〜１２に記載した遺伝子が、ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、２０５８５、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、１８７４７、２２１４７、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ 及び ｍｃｌ−１から選択されることを特徴とする請求項２で請求した方法。
【請求項４】
細胞群が細胞培養物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
細胞をＰＢＭＣ、ＨＴ２９、及びＡ５４９の細胞から選択することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
細胞群が、腫瘍細胞、ＰＢＭＣ又はリンパ球であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
サンプルが、血液であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項８】
サンプルからＲＮＡを抽出するステップ、及びＱＰＣＲ法により遺伝子発現を検出するステップ、をさらに含む請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の変化が、未処理サンプルと比較して、発現の減少であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
発現の変化が、２８ｋＤａのタンパク質の減少であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
発現の変化が、未処理コントロールサンプルと比較して処理したサンプルにおいて、２８ｋＤａのタンパク質又は１４ｋＤａのタンパク質の１以上の翻訳後修飾の存在又は不在であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
２８ｋＤａのタンパク質がアポリポタンパク質Ａ１であることを特徴とする請求項１、１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
１４ｋＤａのタンパク質がトランスサイレチンであることを特徴とする請求項１又は１１記載の方法。
【請求項１４】
サンプルが血清、血漿若しくは組織培養上清であることを特徴とする請求項１又は１０〜１３記載の方法。
【請求項１５】
サンプルを、タンパク質分析法により分析することを特徴とする請求項１又は１０〜１４記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質分析法が、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ又は二次元ＰＡＧＥによることを特徴とする請求項１又は１０〜１５記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤＫＩを哺乳動物に投与することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤＫＩをヒトに投与することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の変化をモニタリングすることを含む、ＣＤＫＩの適切な投与量を決定する方法。
【請求項２０】
ＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、２８ｋＤａ又は１４ｋＤａのタンパク質の発現の変化をモニタリングすることを含む、ＣＤＫＩの適切な投与量を決定する方法。
【請求項２１】
２８ｋＤａ又は１４ｋＤａのタンパク質が、翻訳後修飾された形であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
候補薬剤を、細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、及び未処理のコントロールサンプルと比較してｉ）表１〜１２のいずれかに記載した遺伝子、又は処理したサンプルにおけるii）２８ｋＤａのタンパク質、若しくはiii）１４ｋＤａのタンパク質のうち、少なくとも１つの発現の変化を、ＣＤＫＩ活性の指標として、検出するステップを含む、ＣＤＫＩ様活性を有する候補薬剤の同定方法。
【請求項２３】
ＣＤＫＩがロスコビチンであることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
ロスコビチンがＲ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤＫＩ活性のモニタリングにおける、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子、又はアポリポタンパク質Ａ１若しくはトランスサイレチンをコードする遺伝子の使用。
【請求項２６】
ＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子又は２８ｋＤａ若しくは１４ｋＤａのタンパク質の存在をモニタリングすることを特徴とする請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
ＣＤＫＩがロスコビチンであることを特徴とする請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
ロスコビチンがＲ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子によりコードされたタンパク質、又は２８ｋＤａ若しくは１４ｋＤａのタンパク質に対する抗体を含む、ロスコビチン活性評価用キット。
【請求項３０】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子に対する核酸プローブを含む、ロスコビチン活性評価用キット。
【請求項３１】
表１３又は１４に記載した配列を有するＱＰＣＲプライマーを含む、ロスコビチン活性評価用キット。
【請求項３２】
請求項１〜２４のいずれかで定義した方法における、請求項２９〜３１のいずれかで定義したキットの使用。
【請求項３３】
（ｉ）ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、
（ii）処理した又は未処理の細胞、動物又はヒト由来のサンプルにおいて、遺伝子発現を測定するステップ、及び
（iii）未処理サンプルと比較して、処理したサンプルにおいて、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の増加又は減少を、ロスコビチン活性の指標として、検出するステップ
を含む、ロスコビチン活性のモニタリング方法。
【請求項３４】
表１〜１２に記載した遺伝子が、ＡＤＭ、ＦＡＤＤ、ＰＡＩ１、ＰＬＡＵ、ＰＮＵＴＳ、ＴＮＦＳＦ１４、Ｃ／ＥＢＰα、２０５８５、ＦＵＴ４、Ｅ２Ｆ６、１８７４７、２２１４７、ＺＫ１、ＫＩＡＡ１６９８、ＣＣＲＬ２、ｍｙｃ 及び ｍｃｌ−１から選択されることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ロスコビチンを哺乳動物に投与することを特徴とする請求項３３又は３４記載の方法。
【請求項３６】
ロスコビチンをヒトに投与することを特徴とする請求項３３〜３５のいずれか記載の方法。
【請求項３７】
細胞群が細胞培養物であることを特徴とする請求項３３又は３４記載の方法。
【請求項３８】
細胞をＰＢＭＣ、ＨＴ２９及びＡ５４９の細胞から選択することを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の存在が、腫瘍細胞又はリンパ球で検出されることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか記載の方法。
【請求項４０】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子のレベルが、ロスコビチンの投与前に検出されたレベルよりも低いことを特徴とする請求項１〜３９のいずれか記載の方法。
【請求項４１】
ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の範囲や程度をモニタリングすることを含む、ロスコビチンの適切な投与量を決定する方法。
【請求項４２】
候補薬剤を細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、及び表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の存在又は不在をモニタリングするステップを含む、ロスコビチン様活性を有する候補薬剤の同定方法。
【請求項４３】
ロスコビチンがＲ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項１〜４２のいずれか記載の方法。
【請求項４４】
ロスコビチン活性のモニタリングにおける、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の使用。
【請求項４５】
ロスコビチンを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与後、表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子の存在をモニタリングすることを特徴とする請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
ロスコビチンがＲ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項４４又は４５記載の使用。
【請求項４７】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子に対する抗体を含むロスコビチン活性評価用キット。
【請求項４８】
表１〜１２に記載した少なくとも１つの遺伝子に対する核酸プローブを含むロスコビチン活性評価用キット。
【請求項４９】
請求項１〜１２のいずれかで定義した方法における、請求項４７又は４８で定義したキットの使用。
【請求項５０】
（ｉ）ＣＤＫＩを細胞、細胞群、モデル動物又はヒトに投与するステップ、
（ii）処理した又は未処理の細胞、動物又はヒト由来のサンプルにおいて、遺伝子発現を測定するステップ、及び
（iii）未処理サンプルと比較して、処理したサンプルにおいて、表１〜１２のいずれかに記載した少なくとも１つの遺伝子の発現の増加又は減少を、ＣＤＫＩ活性の指標として、検出するステップ、
を含む、ＣＤＫＩ活性のモニタリング方法。
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【公表番号】特表２００６−５２１８０５（Ｐ２００６−５２１８０５Ａ）
【公表日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０６０３６（Ｐ２００６−５０６０３６）
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００１３３４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７９５４
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
バブルジェット
【出願人】（５０５２６１３８０）サイクラセル リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００１３３４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７９５４
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
バブルジェット
【出願人】（５０５２６１３８０）サイクラセル リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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