ムコ多糖症の診断方法
【課題】生体試料中のグリコサミノグリカンを高感度かつ簡便に測定し、ムコ多糖症を正確に診断するための方法の提供。
【解決手段】下記（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ）の診断方法。
（１）（ａ）生体試料を限外濾過フィルターで濾過し、フィルター上でグリコサミノグリカン特異的酵素による消化を行なうか、又は（ｂ）生体試料をグリコサミノグリカン特異的酵素による消化を行ない、得られた消化物を限外濾過フィルターで濾過した後、
得られた消化物を遠心分離して得られた濾過液又は得られた濾過液を液体クロマトグラフィー／質量分析計へ注入し、グリコサミノグリカン由来の二糖について分析するステップ。
（２）（１）の測定結果である定量濃度及び二糖組成を用いて、ムコ多糖症の診断、ムコ多糖症の治療効果の化学診断、又はムコ多糖症の各疾患の判別鑑定を行なうステップ。
【解決手段】下記（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ）の診断方法。
（１）（ａ）生体試料を限外濾過フィルターで濾過し、フィルター上でグリコサミノグリカン特異的酵素による消化を行なうか、又は（ｂ）生体試料をグリコサミノグリカン特異的酵素による消化を行ない、得られた消化物を限外濾過フィルターで濾過した後、
得られた消化物を遠心分離して得られた濾過液又は得られた濾過液を液体クロマトグラフィー／質量分析計へ注入し、グリコサミノグリカン由来の二糖について分析するステップ。
（２）（１）の測定結果である定量濃度及び二糖組成を用いて、ムコ多糖症の診断、ムコ多糖症の治療効果の化学診断、又はムコ多糖症の各疾患の判別鑑定を行なうステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ）の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムコ多糖症は、正式にはムコ多糖代謝異常症といい、先天的にムコ多糖分解酵素が欠損していることにより全身にムコ多糖の分解物が蓄積し、種々の臓器や組織が次第に損なわれる進行性の疾患である。ムコ多糖症は、欠損酵素によって大きく７つの型に分類されている。ムコ多糖症の多くは知的障害を伴い、進行性で、成人に達するまでに死亡する型もある。主な症状は、著しい骨の変化、短い首、関節が固くなる、粗い顔つき等であり、その他、角膜混濁、難聴、肝肥腫、心臓疾患、低身長等である。
【０００３】
ムコ多糖症の診断は、血液等の生体試料中のムコ多糖を測定することにより行なわれる。グリコサミノグリカンの測定法としては、以下の方法が知られている。
【０００４】
特許文献１には、グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧという）特異的分解酵素によってＧＡＧを二糖に分解し、当該二糖の組成を高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという）で分析することでＧＡＧを分析する方法が記載されている。非特許文献１には、尿中のケラタン硫酸（以下、ＫＳという）を特異的分解酵素であるケラタナーゼによってＫＳを二糖に分解し、当該二糖をＨＰＬＣで分析することでＫＳを分析する方法が記載されている。非特許文献２には、血漿及び血清中のＧＡＧを加水分解し、生成するガラクトースとアミノ糖をＨＰＬＣで分析することでＧＡＧを分析する方法が記載されている。非特許文献３には、血漿及び尿中のコンドロイチン硫酸（以下、ＣＳという）を、限外濾過フィルターで濾過した後に、フィルター上でコンドロイチナーゼＡＢＣによってＣＳを二糖に分解し、濾過液中の当該二糖をＨＰＬＣで分析することでＣＳを分析する方法が記載されている。非特許文献４には、組織中のＫＳを、エタノール沈殿法により前処理した後に、ケラタナーゼＩＩにより二糖に分解し、当該二糖を液体クロマトグラフィー／タンデムマス質量分析計（以下、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳという）へ注入し、ＫＳ由来の二糖組成について分析する方法が記載されている。非特許文献５には、組織中のヘパラン硫酸（以下、ＨＳという）を、エタノール沈殿法により前処理した後に、特異的分解酵素で二糖に分解し、当該二糖をＬＣ／ＭＳ／ＭＳへ注入し、ＨＳ由来の二糖組成について分析する方法が記載されている。特許文献２及び非特許文献６には、尿中のＧＡＧを１，９−ジメチルメチレンブルーを用いて測定し、ムコ多糖症の診断を行なう方法が記載されている。
また、特許文献３には、ＫＳ及びヒアルロン酸（以下、ＨＡという）をリガンドとする固相プレートを用いたアッセイ方法が記載されている。
【特許文献１】特開平４−１３５４９６号公報
【特許文献２】特開２００３−２６５１９６号公報
【特許文献３】特開平１０−１５３６００号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４６（１），９７−１０１（１９９８）
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７６５，１５１−１６０（２００１）
【非特許文献３】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０２，１６９−１７４（２００２）
【非特許文献４】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９０，６８−７３（２００１）
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７５４，１５３−１５９（２００１）
【非特許文献６】Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２６４，２４５−２５０（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来の分析方法は、測定濃度がばらつく、測定感度が低い、前処理操作が煩雑である、一種類のＧＡＧしか測定できない等の問題があり、ムコ多糖症の診断方法として満足できるものではなかった。
従って、本発明の目的は、生体試料中のグリコサミノグリカンを高感度かつ簡便に測定し、ムコ多糖症を正確に診断するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は生体試料中の複数のグリコサミノグリカンを同時に高感度で測定する方法を見出すべく種々検討した結果、限外濾過フィルターの使用及びＧＡＧ特異的酵素消化に加えてＬＣ／ＭＳ／ＭＳを組み合せることにより、生体試料中の複数のグリコサミノグリカンが高感度で同時に定量できることから、ムコ多糖症の診断が正確にできることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｅ）を提供するものである。
（Ａ）下記ステップ（１）及び（２）を含む、ムコ多糖症の診断方法。
（１）（ａ）生体試料を限外濾過フィルターで濾過し、フィルター上でＧＡＧ特異的酵素による消化を行なうか、又は（ｂ）生体試料をＧＡＧ特異的酵素による消化を行ない、得られた消化物を限外濾過フィルターで濾過した後、
得られた消化物を遠心分離して得られた濾過液を又は得られた濾過液ＬＣ／ＭＳ／ＭＳへ注入し、ＧＡＧ由来の二糖について分析するステップ。
（２）（１）の測定結果である定量濃度及び二糖組成を用いて、ムコ多糖症の診断、又はムコ多糖症の各疾患の判別鑑定を行なうステップ。
【０００８】
（Ｂ）（１）のステップにおいて、ＨＰＬＣの分析条件として、分析カラムにカーボングラファイトカラムを用い、移動相にアルカリ性条件の溶液を用いることで、ＭＳ分析する上で最適な溶出位置にＧＡＧ由来の二糖を溶出するものである上記（Ａ）記載の方法。
【０００９】
（Ｃ）（１）のステップにおいて、ＧＡＧを特異的に分解する酵素として、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼＢを同時に含む溶液により二糖を生成させ、ＫＳ、ＨＳ及びＤＳを一斉に分析するものである上記（Ａ）又は（Ｂ）記載の方法。
【００１０】
（Ｄ）（１）のステップにおいて、ＧＡＧを特異的に分解する酵素として、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼＢのいずれか１種を用いて二糖を生成させ、ＫＳ、ＨＳ、ＤＳのいずれか一種類又は二種類を分析するものである上記（Ａ）又は（Ｂ）記載の方法。
【００１１】
（Ｅ）（１）のステップにおいて、生体試料が血漿、血清、血液、尿、体液のいずれかである上記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法は、ムコ多糖症を、精度良く、高感度かつ簡便に診断できる方法である。これにより、全新生児についてムコ多糖症の検査を行なうことで、出世後の早期段階でムコ多糖症の発見が可能となる。早期段階で適切な酵素補充療法や遺伝子治療等を行なうことで、患者の病状を最小限に食い止めることが可能となる。
また、本発明の方法はムコ多糖症の診断の他、前述した治療時における治療効果の把握と治療方針の決定、さらには医薬品開発の薬効評価へも使用することが可能である。
さらに本発明の方法は、ＧＡＧに関連する疾患である変形性関節症、慢性関節リウマチ、角膜組織異常を伴う疾患、リウマチなどの炎症、癌、肝疾患におけるバイオマーカー測定法としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明方法のステップ（１）で使用する生体試料としては、ムコ多糖を含むものであれば制限されないが、血漿、血清、血液、尿、体液などが挙げられる。このうち、血漿又は血清が特に好ましい。
【００１４】
本発明で使用する限外濾過フィルターとしては、ムコ多糖を通過させず、ムコ多糖よりも分子量の小さい分子を通過させるフィルターであれば制限されないが、分子量５０００程度の分子を分離できるフィルターが好ましい。このような限外濾過フィルターの市販品としては、例えばＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いることができる。例えばＡｃｒｏＰｒｅｐ ９６ ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ（１０Ｋ）（ＰＡＬＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を使用した場合は多検体同時処理が可能である。
【００１５】
本発明で使用するＧＡＧ特異的酵素としては、グリコサミノグリカンを分解する酵素であればよいが、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸をそれぞれ特異的に分解する酵素が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合せて用いることができる。ケラタン硫酸分解酵素、ヘパラン硫酸分解酵素及びデルマタン硫酸分解酵素の３種を組み合せて用いた場合には、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の３種を一斉に分解できる。一方、これらの酵素のいずれか１種を用いれば、これらのグリコサミノグリカンの１種又は２種が分析できる。これらのＧＡＧ分解酵素としては、ケラタナーゼ、ヘパチリナーゼ及びコンドロイチナーゼが好ましい。これらのＧＡＧ特異的酵素の市販品としては、例えばケラタナーゼ、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、ヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼＩＩ、へパリナーゼ、コンドロイチナーゼＢ（生化学工業(株)製造、販売）などが挙げられる。またＨＳ分解酵素についてはＳｉｇｍａ社より同様の酵素が市販されており、使用することは可能である。これらのうち、ケラタナーゼＩＩ、ヘパチリナーゼ及びコンドロイチナーゼＢの３種を組み合せるか、これらのいずれか１種を用いるのが特に好ましい。
【００１６】
本発明で実施するＧＡＧ特異的酵素による酵素消化としては、例えば３０〜４０℃で１〜３０時間行なうことで完了する。特に３７℃で１５時間、インキュベーターにて加温するのが好ましい。
【００１７】
本発明の応用として、ＣＳあるいはＨＡを測定対象とする場合は、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、ヒアルロニダーゼＳＤによりＣＳあるいはＨＡを特異的に分解することでＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析することも可能である。
【００１８】
上記のＧＡＧ特異的酵素による酵素消化によって、グリコサミノグリカンが二糖類に分解される。ここで、二糖類の略号を以下に示す。
ΔＤｉＨＳ−０Ｓ：ΔＨｅｘＡ α１→４ＧｌｃＮＡｃ：
２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−４−Ｏ−（４−ｄｅｏｘｙ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−ｅｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ：ΔＨｅｘＡ α１→４ＧｌｃＮＳ：
２−ｄｅｏｘｙ−２−ｓｕｌｆａｍｉｎｏ−４−Ｏ−（４−ｄｅｏｘｙ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−ｅｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ：ΔＨｅｘＡ α１→４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）：
２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−４−Ｏ−（４−ｄｅｏｘｙ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−ｅｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−６−Ｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ＭＳＤ：
Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、ＤＳＤ：Ｇａｌ（６Ｓ）β１→３ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）。
【００１９】
本発明のステップ（１）においては、（ａ）生体試料を限外濾過フィルターで濾過し、フィルター上でＧＡＧ特異的酵素による消化を行なって消化物を得る手段と、（ｂ）生体試料をＧＡＧ特異的酵素による消化を行ない、得られた消化物を限外濾過フィルターで濾過する手段とが含まれる。ここで、（ｂ）の手段には、例えば、被験者の耳から採取した微量の血液を含んだ濾紙にＧＡＧ特異的消化を行ない、その消化物を限外濾過フィルターで濾過すればよい。
【００２０】
本発明で測定対象となる二糖類は、ケラタナーゼＩＩによりＫＳから分解されるＭＳＤ及びＤＳＤ、ヘパリチナーゼでＨＳから分解されるΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ及びΔＤｉＨＳ−６Ｓ、コンドロイチナーゼＢでＤＳから分解されるΔＤｉ−４Ｓである。
【００２１】
前記（ａ）酵素による消化で得られた消化物を遠心分離することにより得られた濾液又は（ｂ）で得られた濾液をＬＣ／ＭＳに注入し、二糖を分析する。遠心分離は、例えば５０００〜８０００ｘｇ、１０〜１５分間行なうのが好ましい。
【００２２】
ＬＣ／ＭＳにおける分析カラムとしては、前記二糖類が分離できるものであればよく、例えばＯＤＳ（Ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌａｎｅ）を固定相とした逆相ＨＰＬＣカラム、カーボングラファイト等を用いることができるが、分離能の点からカーボングラファイトを用いるのが特に好ましい。カーボングラファイトの市販品としては、例えばＨｙｐｅｒｃａｒｂ（２．０ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ，５μｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ製）等が挙げられる。カラムの長さを短くすることで二糖の溶出位置を早くすることも可能である。
【００２３】
本発明において移動相としては、二糖類の溶出位置を最適な位置にする点から、アルカリ性条件の溶液が好ましい。アルカリ性条件の溶液としては、ｐＨ７〜１１、さらにｐＨ８〜１０、さらにｐＨ９〜１０、特にｐＨ１０の水溶液と有機溶媒のグラジエント条件が好ましい。ｐＨをアルカリ性条件にするための塩としては、アンモニア水又はアンモニウム塩が好ましい。アンモニウム塩水溶液としては、重炭酸アンモニウム水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液、酢酸アンモニウム水溶液等が挙げられるが、重炭酸アンモニウム水溶液が特に好ましい。これらの塩濃度としては、溶出位置を考慮すると、３〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに３〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール等が挙げられる。最も好ましい条件は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液へ２８％アンモニア水を添加することによりｐＨ１０に調製した溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０））とアセトニトリルのグラジエント条件である。
【００２４】
図１及び図２に示すように、移動相のｐＨと塩濃度を調節することにより、ＭＳ分析する上で最適な溶出位置（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）にＧＡＧ由来の二糖を溶出することが可能である。さらに図３に示すように移動相のｐＨによりピーク形状を大幅に改善することが可能であった。この手法により従来では大変困難であった糖類の溶出位置をコントロールすることが可能であった。
【００２５】
これらのステップ（１）により、生体試料中のＧＡＧの濃度及び二糖組成が得られる。ステップ（２）は、これらの結果から、ムコ多糖症の診断、ムコ多糖症の各疾患（疾患の型）が判定できる。またムコ多糖症の治療効果の診断も可能である。ここで、ムコ多糖の分類を以下に示す。
【００２６】
【表１】
【実施例】
【００２７】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
本発明のアッセイ法により血漿及び血清を用いたスクリーニングが可能か否かを調べるため、ムコ多糖症の患者血漿とヒトのコントロール血漿を用いて、以下の実験を行なった。
【００２９】
血漿、血清試料の前処理方法：１）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）へ０．０１ｍＬの血漿あるいは血清試料を添加する。２）４，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。３）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）のコレクションチューブを新規のチューブに交換する。４）コンドロシン（生化学工業（株）製造、販売）の５０μｇ／ｍＬ水溶液を内部標準物質として０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。なお、全ての実験において、水は精製水とする。５）０．０２ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）をフィルター上へ添加する。６）ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼＢを各２ｍＵを含む酵素混合水溶液の０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。７）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。８）３７℃で１５時間、インキュベートで加温する。９）８，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。１０）濾過液に０．０２ｍＬの水を添加する。１１）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。１２）試料液をオートサンプラー用注入バイアルへ移す。
【００３０】
検量線試料の前処理方法：１）ＫＳ標準溶液はＫＳ（ウシ角膜由来）（生化学工業（株）製造、販売）を用いて表１に示す濃度で作成する。２）ＨＳ標準溶液として、不飽和ヘパラン／ヘパリン−二糖キット（Ｈキット）（生化学工業（株）製造、販売）を使用し、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ＮＳを含む水溶液を表２に示す濃度で作成する。３）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）へ各０．０１ｍＬのＫＳ及びＨＳ標準溶液を添加する。４）コンドロシン（生化学工業（株）製造、販売）の５０μｇ／ｍＬ水溶液を内部標準物質として０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。５）０．０２ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）をフィルター上へ添加する。６）ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼＢを各２ｍＵを含む酵素混合水溶液の０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。７）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。８）３７℃で１５時間、インキュベートで加温する。９）８，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。１０）ブランク血漿あるいは血清をＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）へ添加後、８，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心し、ブランク濾過液を作成する。１１）０．０１ｍＬのブランク濾過液を９）で得られた濾過液に添加する。１２）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。１３）試料液をオートサンプラー用注入バイアルへ移す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】
以下に、使用したＬＳ／ＭＳ／ＭＳ装置を記載する。ＨＰＬＣ装置：ＨＰ１１００ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、オートサンプラ−：ＨＴＣ ＰＡＬ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）（Ｚｗｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、質量分析計：ＡＰＩ ４０００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）（Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００３４】
以下に、使用したＨＰＬＣ条件を記載する。分析カラム：Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ（２．０ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ，５μｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、移動相：（Ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０）、（Ｂ）Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、グラジエント条件：［Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）／Ｂ（％）］；［０／０］(［０．９／０］(［１．０／３０］(［６．０／３０］(［６．１／０］(［８．０／０］、流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４５℃、オートサンプラーへの注入量：０．０１ｍＬ。
【００３５】
以下に、使用したＭＳ／ＭＳ条件を記載する。イオン化法：Ｔｕｒｂｏ ｉｏｎｓｐｒａｙ、検出モード：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ）−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ、ターボスプレー温度：６５０℃、モニタリングイオン（ＣＩＤエネルギー）：Ｇａｌ β1-3ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）ｍ／ｚ ４６２．１−ｍ／ｚ ９７．０（ＣＩＤ：−８０ｅＶ）；Ｇａｌ（６Ｓ）β1-3ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）ｍ／ｚ ４６２．１−ｍ／ｚ ９７．０（ＣＩＤ：−８０ｅＶ）；ΔＤｉＨＳ−０Ｓ ｍ／ｚ ３７８．１−ｍ／ｚ １７４．９（ＣＩＤ：−２２ｅＶ）；ΔＤｉＨＳ−ＮＳ ｍ／ｚ ４１６．０−ｍ／ｚ １３７．９（ＣＩＤ：−３４ｅＶ）；ΔＤｉＨＳ−６Ｓ ｍ／ｚ ４５８．２−ｍ／ｚ ９７．１（ＣＩＤ：−５２ｅＶ）；Ｉ．Ｓ．ｍ／ｚ ３５４．０−ｍ／ｚ １１３．０（ＣＩＤ：−２２ｅＶ）。
【００３６】
濃度の算出は、検量線濃度とピーク面積比（各測定対象標準物質のピーク面積／内部標準物質のピーク面積）から最小二乗法による直線一次回帰式を求める。重み付けは１／検量線濃度とする。
【００３７】
三種類のコントロール血清を３日間、Ｎ＝５で測定した結果を表４及び表５に示す。
【００３８】
【表４】
【００３９】
【表５】
【００４０】
三種類のコントロール血漿を１日間、Ｎ＝５で測定した結果を表６及び表７に示す。
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】
【００４３】
表５及び表７内に示されるΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓ濃度は、ＤＳ由来のΔＤｉ−４ＳとＨＳ由来のΔＤｉＨＳ−６Ｓの総濃度である。
【００４４】
表４〜表７から明らかな通り、本法が精度の高い分析方法であることが示された。
【００４５】
ムコ多糖症の患者血漿とコントロール血漿の測定結果を表８及び表９に示す。
【００４６】
【表８】
【００４７】
【表９】
【００４８】
表８及び表９から明らかな通り、本法により臨床試料の測定が可能であり、スクリーニングに適用可能であることが示された。特にムコ多糖症のＩＶ型（表８内Ｎｏ．１１）でＫＳ濃度の高値が示された。またムコ多糖症のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型（表９内Ｎｏ．１〜１０）でＨＳ由来のΔＤｉＨＳ−０Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ＮＳ濃度の高値が示された。さらにムコ多糖症のＶＩ型（表９内Ｎｏ．１４）でＤＳ由来のΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓ濃度の高値が示された。
【００４９】
高濃度が示されたΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓレベルは、ＤＳあるいはＨＳの高値を示す。しかしΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓの二糖組成比率が高い場合、ΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓの高値はＤＳの高値を反映する。すなわち各二糖濃度と組成比率を解析できる本法は、詳細な解析をする上で大変有用であることがわかった。
【００５０】
以上の結果より、本法はＫＳ、ＨＳ及びＤＳレベルを一斉に分析することが可能である。今後さらに、患者の年齢、症状とＫＳ、ＨＳ及びＤＳ濃度の関係を調べることで、１回の測定でムコ多糖症の各疾患の判別鑑定が可能と考えられた。
【００５１】
（実施例２）
本発明のアッセイ法により尿を用いたスクリーングが可能か否かを調べるため、ムコ多糖症の患者尿とヒトのコントロール尿を用いて、以下の実験を行なった。
【００５２】
尿試料の前処理方法：１）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）へ０．０１ｍＬの尿試料を添加する。２）４，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。３）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）のコレクションチューブを新規のチューブに交換する。４）コンドロシン（生化学工業（株）製造、販売）の５０μｇ／ｍＬ水溶液を内部標準物質として０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。５）０．０２ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）をフィルター上へ添加する。６）ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼＢを各２ｍＵを含む酵素混合水溶液の０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。７）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。８）３７℃で１５時間、インキュベートで加温する。９）８，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。１０）濾過液に０．０２ｍＬの水を添加する。１１）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。１２）試料液をオートサンプラー用注入バイアルへ移す。
【００５３】
検量線試料の前処理方法：１）ＫＳ標準溶液はＫＳ（ウシ角膜由来）（生化学工業（株）製造、販売）を用いて表１０に示す濃度で作成する。２）ＨＳ標準溶液として、不飽和ヘパラン／ヘパリン−二糖キット（Ｈキット）（生化学工業(株)製造、販売）を使用し、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ＮＳを含む水溶液を表１１に示す濃度で作成する。３）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）へ０．０１ｍＬのＫＳ及び０．０２ｍＬのＨＳ標準溶液を添加する。４）コンドロシン（生化学工業（株）製造、販売）の５０μｇ／ｍＬ水溶液を内部標準物質として０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。５）０．０２ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）をフィルター上へ添加する。６）ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼＢを各２ｍＵを含む酵素混合水溶液の０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。７）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。８）３７℃で１５時間、インキュベートで加温する。９）８，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。１０）ブランク尿を固相抽出カラムであるＢｏｎｄ Ｅｌｕｔｅ ＳＡＸ ｃｏｌｕｍｎ（５００ｍｇ／３ｍＬ）に素通りさせて、ブランク溶液を作成する。１１）０．０１ｍＬのブランク溶液を９）で得られた濾過液に添加する。１２）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。１３）試料液をオートサンプラー用注入バイアルへ移す。
【００５４】
【表１０】
【００５５】
【表１１】
【００５６】
尿試料の分析に関し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件と濃度算出方法は血漿及び血清の分析時と同じ方法で行なった。
三種類のコントロール尿を３日間、Ｎ＝５で測定した結果を表１２及び表１３に示す。
【００５７】
【表１２】
【００５８】
【表１３】
【００５９】
表１２及び表１３から明らかな通り、本法が精度の高い分析方法であることが示された。
【００６０】
ムコ多糖症の患者尿とコントロール尿の測定結果を表１４及び表１５に示す。
【００６１】
【表１４】
【００６２】
【表１５】
【００６３】
表１４及び表１５から明らかな通り、本法により臨床試料の測定が可能であり、スクリーニングに適用可能であることが示された。特にムコ多糖症のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型でＨＳ濃度の高値が、ムコ多糖症のＶＩ型でΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓ濃度が高値を示した。
特にムコ多糖症ＩＶ Ａ型（表１４内Ｎｏ．１６〜１８）とＩＶ Ｂ型（表１４内Ｎｏ．１９〜２１）ではＫＳ由来のＤＳＤ比率が異なる。すなわちＩＶ Ａ型ではＤＳＤの高い比率が示された。従って組成比率を解析することで、ＩＶ Ａ型とＩＶ Ｂ型を区別することが可能である。
【００６４】
以上の結果より、本法はＫＳ、ＨＳ及びＤＳレベルを一斉に分析することが可能である。今後さらに、患者の年齢、症状とＫＳ、ＨＳ及びＤＳ濃度の関係を調べることで、１回の測定でムコ多糖症の各疾患の判別鑑定が可能と考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】移動相ｐＨと溶出位置の関係を示す図である。
【図２】移動相の塩濃度と溶出位置の関係を示す図である。
【図３】移動相ｐＨのピーク形状と分離への影響を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ）の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムコ多糖症は、正式にはムコ多糖代謝異常症といい、先天的にムコ多糖分解酵素が欠損していることにより全身にムコ多糖の分解物が蓄積し、種々の臓器や組織が次第に損なわれる進行性の疾患である。ムコ多糖症は、欠損酵素によって大きく７つの型に分類されている。ムコ多糖症の多くは知的障害を伴い、進行性で、成人に達するまでに死亡する型もある。主な症状は、著しい骨の変化、短い首、関節が固くなる、粗い顔つき等であり、その他、角膜混濁、難聴、肝肥腫、心臓疾患、低身長等である。
【０００３】
ムコ多糖症の診断は、血液等の生体試料中のムコ多糖を測定することにより行なわれる。グリコサミノグリカンの測定法としては、以下の方法が知られている。
【０００４】
特許文献１には、グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧという）特異的分解酵素によってＧＡＧを二糖に分解し、当該二糖の組成を高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという）で分析することでＧＡＧを分析する方法が記載されている。非特許文献１には、尿中のケラタン硫酸（以下、ＫＳという）を特異的分解酵素であるケラタナーゼによってＫＳを二糖に分解し、当該二糖をＨＰＬＣで分析することでＫＳを分析する方法が記載されている。非特許文献２には、血漿及び血清中のＧＡＧを加水分解し、生成するガラクトースとアミノ糖をＨＰＬＣで分析することでＧＡＧを分析する方法が記載されている。非特許文献３には、血漿及び尿中のコンドロイチン硫酸（以下、ＣＳという）を、限外濾過フィルターで濾過した後に、フィルター上でコンドロイチナーゼＡＢＣによってＣＳを二糖に分解し、濾過液中の当該二糖をＨＰＬＣで分析することでＣＳを分析する方法が記載されている。非特許文献４には、組織中のＫＳを、エタノール沈殿法により前処理した後に、ケラタナーゼＩＩにより二糖に分解し、当該二糖を液体クロマトグラフィー／タンデムマス質量分析計（以下、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳという）へ注入し、ＫＳ由来の二糖組成について分析する方法が記載されている。非特許文献５には、組織中のヘパラン硫酸（以下、ＨＳという）を、エタノール沈殿法により前処理した後に、特異的分解酵素で二糖に分解し、当該二糖をＬＣ／ＭＳ／ＭＳへ注入し、ＨＳ由来の二糖組成について分析する方法が記載されている。特許文献２及び非特許文献６には、尿中のＧＡＧを１，９−ジメチルメチレンブルーを用いて測定し、ムコ多糖症の診断を行なう方法が記載されている。
また、特許文献３には、ＫＳ及びヒアルロン酸（以下、ＨＡという）をリガンドとする固相プレートを用いたアッセイ方法が記載されている。
【特許文献１】特開平４−１３５４９６号公報
【特許文献２】特開２００３−２６５１９６号公報
【特許文献３】特開平１０−１５３６００号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４６（１），９７−１０１（１９９８）
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７６５，１５１−１６０（２００１）
【非特許文献３】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０２，１６９−１７４（２００２）
【非特許文献４】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９０，６８−７３（２００１）
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７５４，１５３−１５９（２００１）
【非特許文献６】Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２６４，２４５−２５０（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来の分析方法は、測定濃度がばらつく、測定感度が低い、前処理操作が煩雑である、一種類のＧＡＧしか測定できない等の問題があり、ムコ多糖症の診断方法として満足できるものではなかった。
従って、本発明の目的は、生体試料中のグリコサミノグリカンを高感度かつ簡便に測定し、ムコ多糖症を正確に診断するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は生体試料中の複数のグリコサミノグリカンを同時に高感度で測定する方法を見出すべく種々検討した結果、限外濾過フィルターの使用及びＧＡＧ特異的酵素消化に加えてＬＣ／ＭＳ／ＭＳを組み合せることにより、生体試料中の複数のグリコサミノグリカンが高感度で同時に定量できることから、ムコ多糖症の診断が正確にできることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｅ）を提供するものである。
（Ａ）下記ステップ（１）及び（２）を含む、ムコ多糖症の診断方法。
（１）（ａ）生体試料を限外濾過フィルターで濾過し、フィルター上でＧＡＧ特異的酵素による消化を行なうか、又は（ｂ）生体試料をＧＡＧ特異的酵素による消化を行ない、得られた消化物を限外濾過フィルターで濾過した後、
得られた消化物を遠心分離して得られた濾過液を又は得られた濾過液ＬＣ／ＭＳ／ＭＳへ注入し、ＧＡＧ由来の二糖について分析するステップ。
（２）（１）の測定結果である定量濃度及び二糖組成を用いて、ムコ多糖症の診断、又はムコ多糖症の各疾患の判別鑑定を行なうステップ。
【０００８】
（Ｂ）（１）のステップにおいて、ＨＰＬＣの分析条件として、分析カラムにカーボングラファイトカラムを用い、移動相にアルカリ性条件の溶液を用いることで、ＭＳ分析する上で最適な溶出位置にＧＡＧ由来の二糖を溶出するものである上記（Ａ）記載の方法。
【０００９】
（Ｃ）（１）のステップにおいて、ＧＡＧを特異的に分解する酵素として、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼＢを同時に含む溶液により二糖を生成させ、ＫＳ、ＨＳ及びＤＳを一斉に分析するものである上記（Ａ）又は（Ｂ）記載の方法。
【００１０】
（Ｄ）（１）のステップにおいて、ＧＡＧを特異的に分解する酵素として、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼＢのいずれか１種を用いて二糖を生成させ、ＫＳ、ＨＳ、ＤＳのいずれか一種類又は二種類を分析するものである上記（Ａ）又は（Ｂ）記載の方法。
【００１１】
（Ｅ）（１）のステップにおいて、生体試料が血漿、血清、血液、尿、体液のいずれかである上記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法は、ムコ多糖症を、精度良く、高感度かつ簡便に診断できる方法である。これにより、全新生児についてムコ多糖症の検査を行なうことで、出世後の早期段階でムコ多糖症の発見が可能となる。早期段階で適切な酵素補充療法や遺伝子治療等を行なうことで、患者の病状を最小限に食い止めることが可能となる。
また、本発明の方法はムコ多糖症の診断の他、前述した治療時における治療効果の把握と治療方針の決定、さらには医薬品開発の薬効評価へも使用することが可能である。
さらに本発明の方法は、ＧＡＧに関連する疾患である変形性関節症、慢性関節リウマチ、角膜組織異常を伴う疾患、リウマチなどの炎症、癌、肝疾患におけるバイオマーカー測定法としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明方法のステップ（１）で使用する生体試料としては、ムコ多糖を含むものであれば制限されないが、血漿、血清、血液、尿、体液などが挙げられる。このうち、血漿又は血清が特に好ましい。
【００１４】
本発明で使用する限外濾過フィルターとしては、ムコ多糖を通過させず、ムコ多糖よりも分子量の小さい分子を通過させるフィルターであれば制限されないが、分子量５０００程度の分子を分離できるフィルターが好ましい。このような限外濾過フィルターの市販品としては、例えばＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いることができる。例えばＡｃｒｏＰｒｅｐ ９６ ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ（１０Ｋ）（ＰＡＬＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を使用した場合は多検体同時処理が可能である。
【００１５】
本発明で使用するＧＡＧ特異的酵素としては、グリコサミノグリカンを分解する酵素であればよいが、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸をそれぞれ特異的に分解する酵素が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合せて用いることができる。ケラタン硫酸分解酵素、ヘパラン硫酸分解酵素及びデルマタン硫酸分解酵素の３種を組み合せて用いた場合には、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の３種を一斉に分解できる。一方、これらの酵素のいずれか１種を用いれば、これらのグリコサミノグリカンの１種又は２種が分析できる。これらのＧＡＧ分解酵素としては、ケラタナーゼ、ヘパチリナーゼ及びコンドロイチナーゼが好ましい。これらのＧＡＧ特異的酵素の市販品としては、例えばケラタナーゼ、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、ヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼＩＩ、へパリナーゼ、コンドロイチナーゼＢ（生化学工業(株)製造、販売）などが挙げられる。またＨＳ分解酵素についてはＳｉｇｍａ社より同様の酵素が市販されており、使用することは可能である。これらのうち、ケラタナーゼＩＩ、ヘパチリナーゼ及びコンドロイチナーゼＢの３種を組み合せるか、これらのいずれか１種を用いるのが特に好ましい。
【００１６】
本発明で実施するＧＡＧ特異的酵素による酵素消化としては、例えば３０〜４０℃で１〜３０時間行なうことで完了する。特に３７℃で１５時間、インキュベーターにて加温するのが好ましい。
【００１７】
本発明の応用として、ＣＳあるいはＨＡを測定対象とする場合は、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、ヒアルロニダーゼＳＤによりＣＳあるいはＨＡを特異的に分解することでＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析することも可能である。
【００１８】
上記のＧＡＧ特異的酵素による酵素消化によって、グリコサミノグリカンが二糖類に分解される。ここで、二糖類の略号を以下に示す。
ΔＤｉＨＳ−０Ｓ：ΔＨｅｘＡ α１→４ＧｌｃＮＡｃ：
２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−４−Ｏ−（４−ｄｅｏｘｙ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−ｅｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ：ΔＨｅｘＡ α１→４ＧｌｃＮＳ：
２−ｄｅｏｘｙ−２−ｓｕｌｆａｍｉｎｏ−４−Ｏ−（４−ｄｅｏｘｙ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−ｅｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ：ΔＨｅｘＡ α１→４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）：
２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−４−Ｏ−（４−ｄｅｏｘｙ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−ｅｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−６−Ｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ＭＳＤ：
Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、ＤＳＤ：Ｇａｌ（６Ｓ）β１→３ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）。
【００１９】
本発明のステップ（１）においては、（ａ）生体試料を限外濾過フィルターで濾過し、フィルター上でＧＡＧ特異的酵素による消化を行なって消化物を得る手段と、（ｂ）生体試料をＧＡＧ特異的酵素による消化を行ない、得られた消化物を限外濾過フィルターで濾過する手段とが含まれる。ここで、（ｂ）の手段には、例えば、被験者の耳から採取した微量の血液を含んだ濾紙にＧＡＧ特異的消化を行ない、その消化物を限外濾過フィルターで濾過すればよい。
【００２０】
本発明で測定対象となる二糖類は、ケラタナーゼＩＩによりＫＳから分解されるＭＳＤ及びＤＳＤ、ヘパリチナーゼでＨＳから分解されるΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ及びΔＤｉＨＳ−６Ｓ、コンドロイチナーゼＢでＤＳから分解されるΔＤｉ−４Ｓである。
【００２１】
前記（ａ）酵素による消化で得られた消化物を遠心分離することにより得られた濾液又は（ｂ）で得られた濾液をＬＣ／ＭＳに注入し、二糖を分析する。遠心分離は、例えば５０００〜８０００ｘｇ、１０〜１５分間行なうのが好ましい。
【００２２】
ＬＣ／ＭＳにおける分析カラムとしては、前記二糖類が分離できるものであればよく、例えばＯＤＳ（Ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌａｎｅ）を固定相とした逆相ＨＰＬＣカラム、カーボングラファイト等を用いることができるが、分離能の点からカーボングラファイトを用いるのが特に好ましい。カーボングラファイトの市販品としては、例えばＨｙｐｅｒｃａｒｂ（２．０ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ，５μｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ製）等が挙げられる。カラムの長さを短くすることで二糖の溶出位置を早くすることも可能である。
【００２３】
本発明において移動相としては、二糖類の溶出位置を最適な位置にする点から、アルカリ性条件の溶液が好ましい。アルカリ性条件の溶液としては、ｐＨ７〜１１、さらにｐＨ８〜１０、さらにｐＨ９〜１０、特にｐＨ１０の水溶液と有機溶媒のグラジエント条件が好ましい。ｐＨをアルカリ性条件にするための塩としては、アンモニア水又はアンモニウム塩が好ましい。アンモニウム塩水溶液としては、重炭酸アンモニウム水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液、酢酸アンモニウム水溶液等が挙げられるが、重炭酸アンモニウム水溶液が特に好ましい。これらの塩濃度としては、溶出位置を考慮すると、３〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに３〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール等が挙げられる。最も好ましい条件は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液へ２８％アンモニア水を添加することによりｐＨ１０に調製した溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０））とアセトニトリルのグラジエント条件である。
【００２４】
図１及び図２に示すように、移動相のｐＨと塩濃度を調節することにより、ＭＳ分析する上で最適な溶出位置（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）にＧＡＧ由来の二糖を溶出することが可能である。さらに図３に示すように移動相のｐＨによりピーク形状を大幅に改善することが可能であった。この手法により従来では大変困難であった糖類の溶出位置をコントロールすることが可能であった。
【００２５】
これらのステップ（１）により、生体試料中のＧＡＧの濃度及び二糖組成が得られる。ステップ（２）は、これらの結果から、ムコ多糖症の診断、ムコ多糖症の各疾患（疾患の型）が判定できる。またムコ多糖症の治療効果の診断も可能である。ここで、ムコ多糖の分類を以下に示す。
【００２６】
【表１】
【実施例】
【００２７】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
本発明のアッセイ法により血漿及び血清を用いたスクリーニングが可能か否かを調べるため、ムコ多糖症の患者血漿とヒトのコントロール血漿を用いて、以下の実験を行なった。
【００２９】
血漿、血清試料の前処理方法：１）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）へ０．０１ｍＬの血漿あるいは血清試料を添加する。２）４，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。３）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）のコレクションチューブを新規のチューブに交換する。４）コンドロシン（生化学工業（株）製造、販売）の５０μｇ／ｍＬ水溶液を内部標準物質として０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。なお、全ての実験において、水は精製水とする。５）０．０２ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）をフィルター上へ添加する。６）ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼＢを各２ｍＵを含む酵素混合水溶液の０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。７）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。８）３７℃で１５時間、インキュベートで加温する。９）８，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。１０）濾過液に０．０２ｍＬの水を添加する。１１）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。１２）試料液をオートサンプラー用注入バイアルへ移す。
【００３０】
検量線試料の前処理方法：１）ＫＳ標準溶液はＫＳ（ウシ角膜由来）（生化学工業（株）製造、販売）を用いて表１に示す濃度で作成する。２）ＨＳ標準溶液として、不飽和ヘパラン／ヘパリン−二糖キット（Ｈキット）（生化学工業（株）製造、販売）を使用し、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ＮＳを含む水溶液を表２に示す濃度で作成する。３）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）へ各０．０１ｍＬのＫＳ及びＨＳ標準溶液を添加する。４）コンドロシン（生化学工業（株）製造、販売）の５０μｇ／ｍＬ水溶液を内部標準物質として０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。５）０．０２ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）をフィルター上へ添加する。６）ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼＢを各２ｍＵを含む酵素混合水溶液の０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。７）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。８）３７℃で１５時間、インキュベートで加温する。９）８，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。１０）ブランク血漿あるいは血清をＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）へ添加後、８，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心し、ブランク濾過液を作成する。１１）０．０１ｍＬのブランク濾過液を９）で得られた濾過液に添加する。１２）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。１３）試料液をオートサンプラー用注入バイアルへ移す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】
以下に、使用したＬＳ／ＭＳ／ＭＳ装置を記載する。ＨＰＬＣ装置：ＨＰ１１００ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、オートサンプラ−：ＨＴＣ ＰＡＬ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）（Ｚｗｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、質量分析計：ＡＰＩ ４０００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）（Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００３４】
以下に、使用したＨＰＬＣ条件を記載する。分析カラム：Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ（２．０ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ，５μｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、移動相：（Ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０）、（Ｂ）Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、グラジエント条件：［Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）／Ｂ（％）］；［０／０］(［０．９／０］(［１．０／３０］(［６．０／３０］(［６．１／０］(［８．０／０］、流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４５℃、オートサンプラーへの注入量：０．０１ｍＬ。
【００３５】
以下に、使用したＭＳ／ＭＳ条件を記載する。イオン化法：Ｔｕｒｂｏ ｉｏｎｓｐｒａｙ、検出モード：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ）−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ、ターボスプレー温度：６５０℃、モニタリングイオン（ＣＩＤエネルギー）：Ｇａｌ β1-3ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）ｍ／ｚ ４６２．１−ｍ／ｚ ９７．０（ＣＩＤ：−８０ｅＶ）；Ｇａｌ（６Ｓ）β1-3ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）ｍ／ｚ ４６２．１−ｍ／ｚ ９７．０（ＣＩＤ：−８０ｅＶ）；ΔＤｉＨＳ−０Ｓ ｍ／ｚ ３７８．１−ｍ／ｚ １７４．９（ＣＩＤ：−２２ｅＶ）；ΔＤｉＨＳ−ＮＳ ｍ／ｚ ４１６．０−ｍ／ｚ １３７．９（ＣＩＤ：−３４ｅＶ）；ΔＤｉＨＳ−６Ｓ ｍ／ｚ ４５８．２−ｍ／ｚ ９７．１（ＣＩＤ：−５２ｅＶ）；Ｉ．Ｓ．ｍ／ｚ ３５４．０−ｍ／ｚ １１３．０（ＣＩＤ：−２２ｅＶ）。
【００３６】
濃度の算出は、検量線濃度とピーク面積比（各測定対象標準物質のピーク面積／内部標準物質のピーク面積）から最小二乗法による直線一次回帰式を求める。重み付けは１／検量線濃度とする。
【００３７】
三種類のコントロール血清を３日間、Ｎ＝５で測定した結果を表４及び表５に示す。
【００３８】
【表４】
【００３９】
【表５】
【００４０】
三種類のコントロール血漿を１日間、Ｎ＝５で測定した結果を表６及び表７に示す。
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】
【００４３】
表５及び表７内に示されるΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓ濃度は、ＤＳ由来のΔＤｉ−４ＳとＨＳ由来のΔＤｉＨＳ−６Ｓの総濃度である。
【００４４】
表４〜表７から明らかな通り、本法が精度の高い分析方法であることが示された。
【００４５】
ムコ多糖症の患者血漿とコントロール血漿の測定結果を表８及び表９に示す。
【００４６】
【表８】
【００４７】
【表９】
【００４８】
表８及び表９から明らかな通り、本法により臨床試料の測定が可能であり、スクリーニングに適用可能であることが示された。特にムコ多糖症のＩＶ型（表８内Ｎｏ．１１）でＫＳ濃度の高値が示された。またムコ多糖症のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型（表９内Ｎｏ．１〜１０）でＨＳ由来のΔＤｉＨＳ−０Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ＮＳ濃度の高値が示された。さらにムコ多糖症のＶＩ型（表９内Ｎｏ．１４）でＤＳ由来のΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓ濃度の高値が示された。
【００４９】
高濃度が示されたΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓレベルは、ＤＳあるいはＨＳの高値を示す。しかしΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓの二糖組成比率が高い場合、ΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓの高値はＤＳの高値を反映する。すなわち各二糖濃度と組成比率を解析できる本法は、詳細な解析をする上で大変有用であることがわかった。
【００５０】
以上の結果より、本法はＫＳ、ＨＳ及びＤＳレベルを一斉に分析することが可能である。今後さらに、患者の年齢、症状とＫＳ、ＨＳ及びＤＳ濃度の関係を調べることで、１回の測定でムコ多糖症の各疾患の判別鑑定が可能と考えられた。
【００５１】
（実施例２）
本発明のアッセイ法により尿を用いたスクリーングが可能か否かを調べるため、ムコ多糖症の患者尿とヒトのコントロール尿を用いて、以下の実験を行なった。
【００５２】
尿試料の前処理方法：１）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）へ０．０１ｍＬの尿試料を添加する。２）４，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。３）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）のコレクションチューブを新規のチューブに交換する。４）コンドロシン（生化学工業（株）製造、販売）の５０μｇ／ｍＬ水溶液を内部標準物質として０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。５）０．０２ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）をフィルター上へ添加する。６）ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼＢを各２ｍＵを含む酵素混合水溶液の０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。７）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。８）３７℃で１５時間、インキュベートで加温する。９）８，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。１０）濾過液に０．０２ｍＬの水を添加する。１１）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。１２）試料液をオートサンプラー用注入バイアルへ移す。
【００５３】
検量線試料の前処理方法：１）ＫＳ標準溶液はＫＳ（ウシ角膜由来）（生化学工業（株）製造、販売）を用いて表１０に示す濃度で作成する。２）ＨＳ標準溶液として、不飽和ヘパラン／ヘパリン−二糖キット（Ｈキット）（生化学工業(株)製造、販売）を使用し、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ＮＳを含む水溶液を表１１に示す濃度で作成する。３）ＵＬＴＲＡＦＲＥＥTM−ＭＣ（ＢＩＯＭＡＸ−５）へ０．０１ｍＬのＫＳ及び０．０２ｍＬのＨＳ標準溶液を添加する。４）コンドロシン（生化学工業（株）製造、販売）の５０μｇ／ｍＬ水溶液を内部標準物質として０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。５）０．０２ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）をフィルター上へ添加する。６）ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼＢを各２ｍＵを含む酵素混合水溶液の０．０２ｍＬをフィルター上へ添加する。７）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。８）３７℃で１５時間、インキュベートで加温する。９）８，０００ｘｇ、１５分間の条件で遠心する。１０）ブランク尿を固相抽出カラムであるＢｏｎｄ Ｅｌｕｔｅ ＳＡＸ ｃｏｌｕｍｎ（５００ｍｇ／３ｍＬ）に素通りさせて、ブランク溶液を作成する。１１）０．０１ｍＬのブランク溶液を９）で得られた濾過液に添加する。１２）約１０秒間、ボルテックミキサーにより混合する。１３）試料液をオートサンプラー用注入バイアルへ移す。
【００５４】
【表１０】
【００５５】
【表１１】
【００５６】
尿試料の分析に関し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件と濃度算出方法は血漿及び血清の分析時と同じ方法で行なった。
三種類のコントロール尿を３日間、Ｎ＝５で測定した結果を表１２及び表１３に示す。
【００５７】
【表１２】
【００５８】
【表１３】
【００５９】
表１２及び表１３から明らかな通り、本法が精度の高い分析方法であることが示された。
【００６０】
ムコ多糖症の患者尿とコントロール尿の測定結果を表１４及び表１５に示す。
【００６１】
【表１４】
【００６２】
【表１５】
【００６３】
表１４及び表１５から明らかな通り、本法により臨床試料の測定が可能であり、スクリーニングに適用可能であることが示された。特にムコ多糖症のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型でＨＳ濃度の高値が、ムコ多糖症のＶＩ型でΔＤｉ−４Ｓ，６Ｓ濃度が高値を示した。
特にムコ多糖症ＩＶ Ａ型（表１４内Ｎｏ．１６〜１８）とＩＶ Ｂ型（表１４内Ｎｏ．１９〜２１）ではＫＳ由来のＤＳＤ比率が異なる。すなわちＩＶ Ａ型ではＤＳＤの高い比率が示された。従って組成比率を解析することで、ＩＶ Ａ型とＩＶ Ｂ型を区別することが可能である。
【００６４】
以上の結果より、本法はＫＳ、ＨＳ及びＤＳレベルを一斉に分析することが可能である。今後さらに、患者の年齢、症状とＫＳ、ＨＳ及びＤＳ濃度の関係を調べることで、１回の測定でムコ多糖症の各疾患の判別鑑定が可能と考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】移動相ｐＨと溶出位置の関係を示す図である。
【図２】移動相の塩濃度と溶出位置の関係を示す図である。
【図３】移動相ｐＨのピーク形状と分離への影響を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ）の診断方法。
（１）（ａ）生体試料を限外濾過フィルターで濾過し、フィルター上でグリコサミノグリカン特異的酵素による消化を行なうか、又は（ｂ）生体試料をグリコサミノグリカン特異的酵素による消化を行ない、得られた消化物を限外濾過フィルターで濾過した後、
得られた消化物を遠心分離して得られた濾過液又は得られた濾過液を液体クロマトグラフィー／質量分析計へ注入し、グリコサミノグリカン由来の二糖について分析するステップ。
（２）（１）の測定結果である定量濃度及び二糖組成を用いて、ムコ多糖症の診断、ムコ多糖症の治療効果の化学診断、又はムコ多糖症の各疾患の判別鑑定を行なうステップ。
【請求項２】
（１）のステップにおいて、液体クロマトグラフィーの分析条件として、分析カラムにカーボングラファイトカラムを用い、移動相にアルカリ性条件の溶液を用いることで、分析する上で最適な溶出位置にグリコサミノグリカン由来の二糖を溶出するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
（１）のステップにおいて、グリコサミノグリカンを特異的に分解する酵素として、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼＢを同時に用いて二糖を生成させ、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸を一斉に分析するものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
（１）のステップにおいて、グリコサミノグリカンを特異的に分解する酵素として、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼＢのいずれか１種を用いて二糖を生成させ、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸のいずれか一種類又は二種類を分析するものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
（１）のステップにおいて、生体試料が血漿、血清、血液、尿、体液のいずれかである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
下記（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ）の診断方法。
（１）（ａ）生体試料を限外濾過フィルターで濾過し、フィルター上でグリコサミノグリカン特異的酵素による消化を行なうか、又は（ｂ）生体試料をグリコサミノグリカン特異的酵素による消化を行ない、得られた消化物を限外濾過フィルターで濾過した後、
得られた消化物を遠心分離して得られた濾過液又は得られた濾過液を液体クロマトグラフィー／質量分析計へ注入し、グリコサミノグリカン由来の二糖について分析するステップ。
（２）（１）の測定結果である定量濃度及び二糖組成を用いて、ムコ多糖症の診断、ムコ多糖症の治療効果の化学診断、又はムコ多糖症の各疾患の判別鑑定を行なうステップ。
【請求項２】
（１）のステップにおいて、液体クロマトグラフィーの分析条件として、分析カラムにカーボングラファイトカラムを用い、移動相にアルカリ性条件の溶液を用いることで、分析する上で最適な溶出位置にグリコサミノグリカン由来の二糖を溶出するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
（１）のステップにおいて、グリコサミノグリカンを特異的に分解する酵素として、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼＢを同時に用いて二糖を生成させ、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸を一斉に分析するものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
（１）のステップにおいて、グリコサミノグリカンを特異的に分解する酵素として、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ及びコンドロイチナーゼＢのいずれか１種を用いて二糖を生成させ、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸のいずれか一種類又は二種類を分析するものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
（１）のステップにおいて、生体試料が血漿、血清、血液、尿、体液のいずれかである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−１０２１１４（Ｐ２００８−１０２１１４Ａ）
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３５２２１４（Ｐ２００６−３５２２１４）
【出願日】平成１８年１２月２７日（２００６．１２．２７）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【出願人】（５０６３１８８０５）セント ルイス ユニバーシティ (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２７日（２００６．１２．２７）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【出願人】（５０６３１８８０５）セント ルイス ユニバーシティ (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【Ｆターム（参考）】
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