リアノジン受容体の単離および使用
鱗翅目タバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、同翅目モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）、トウモロコシウンカ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）を含む複数の昆虫ファミリーからリアノジン受容体ホモログをコードする遺伝子を特徴付けした。全長遺伝子を単離し、クローニングし、細菌細胞において増幅させた。昆虫細胞における発現により、組換えタンパク質が機能的カルシウム放出チャンネルに折り畳まれることが示された。遺伝子およびそれらの対応するポリペプチドは、他の有害生物のリアノジン受容体の単離、殺虫性活性化合物を同定するためのスクリーニングの開発、有害生物防除剤としての遺伝子のフラグメント、抗体産生のためのタンパク質のフラグメント、殺虫剤結合部位の構造の決定のためのタンパク質のフラグメントの使用、および受容体カルシウム放出機構に相互作用する他のメッセンジャーを介する細胞におけるカルシウム平衡を破壊する殺虫剤の同定を含むがそれらの限定されない多くの用途を有する。宿主細胞において組換えタンパク質を発現する毒性効果を克服するための方法について概説する。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００２年９月２３日に出願された米国仮出願第６０／４１２，７９５号および２００２年１１月１８日に出願された米国仮出願第６０／４２７，３２４号の利益を主張し、その内容全体は参考として本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、リアノジン受容体の分野にあり、特に、リアノジン受容体活性を調整するのに有用な組換え構築物およびそのような活性を調整する化合物を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脊椎動物および無脊椎動物筋肉細胞のカルシウムホメオスタシスは、正常な細胞活動に必須である。それは、細胞の形質膜上のカルシウム選択的チャンネルを介して移動する細胞外供給源由来のカルシウム、および筋小胞体の膜に位置するカルシウム活性型カルシウム放出チャンネルによって制御される内部貯蔵におけるカルシウムの平衡を保つことに関与する複雑なプロセスである。筋小胞体からのカルシウムの放出は、筋組織における興奮収縮連関（非特許文献１）ならびにカルシウムシグナル伝達事象の開始および伝播に極めて重要な役割を果たす。
【０００４】
細胞内部に存在するカルシウム活性型カルシウム放出チャンネルは、受容体と天然の殺虫性リアノジン（Ｒｙａｎｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ由来のアルカロイド）とに相互作用があるため、リアノジン受容体（Ｒｙｒ）と呼ばれる。リアノジン結合部位は、殺虫作用の潜在的標的としての昆虫のＣａ２＋放出チャンネルの特性を理解するための取組みにおいて研究されている（非特許文献２）。しかし、主な作用機序としてリアノジン受容体に作用する合成殺虫剤は、最近まで、発見されていなかった。有害生物種に対して極めて強力な活性を有するアントラニルアミドの誘導体に基づく化学は、カルシウム放出をもたらし、従って、昆虫細胞のカルシウム平衡を破壊する様式でこの受容体を活性化する。この破壊の結果として認められる生物体の応答は、心筋、骨格筋および咽頭筋を含む筋収縮から弛緩しないことであり、活動が低下し、餌を取らなくなる。
【０００５】
昆虫では、受容体−イオンチャンネルの唯一の１つの形態が存在することが報告されている。昆虫組織における研究により、受容体が哺乳動物ホモログに類似の特性およびサイズを有することが示されている（非特許文献３）。リアノジン受容体については、現在、異なる調節に供され、異なる組織分布を有する３種のアイソタイプ（１、２、および３型）が認識されている哺乳動物において、最も研究されている。
【０００６】
リアノジン受容体をコードするＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子の全長ゲノムＤＮＡ配列（非特許文献４）およびｃＤＮＡ配列（非特許文献５）は公知であり、公的データベース（ＮＣＢＩ受託番号Ｄ１７３８９）、他の無脊椎動物、例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（ＮＣＢＩ受託番号Ｄ４５８９９）およびタバコガ、鱗翅目有害生物（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ；非特許文献６）由来のリアノジン受容体のＣ末端の小さなセグメントから利用可能である。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来の配列は、クローニングされ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現され、電導性技術を使用して受容体−イオンチャンネルが機能的であることが示された（非特許文献５）。
【０００７】
【非特許文献１】ペッサ（Ｐｅｓｓａｈ）ら、（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１：８６４３−８６４８
【非特許文献２】レンベルグ（Ｌｅｈｍｂｅｒｇ）ら、（１９９４）Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４８：１４５−１５２
【非特許文献３】デンサー（Ｄｅｎｓｅｒ）ら、（１９９８）Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．５４：３４５−３５２
【非特許文献４】タケシマ（Ｔａｋｅｓｈｉｍａ）ら（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３３７：８１−８７
【非特許文献５】シュ（Ｘｕ）ら（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．７８：１２７０−１２８１
【非特許文献６】プエンテ（Ｐｕｅｎｔｅ）ら、（２０００）Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３０：３３５−３４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
昆虫などの有害生物による穀物の破壊は、相当な経済的損害および生産性の重大な減少を生じる。例えば、鱗翅目有害生物種は、多様な穀物種に対して年間５億ドルの被害を生じる。同翅目有害生物ではさらに２０億ドルかかる。最近、化学の２つの領域が鱗翅目有害生物の良好な駆除を示している。細胞内カルシウム変化および有害生物の生理学的応答の分析から、作用機序は、筋肉ならびに中枢神経系における内部カルシウム貯蔵の放出および終局的涸渇を介する正常な筋肉機能の破壊による。従って、多様なタイプの低分子量化学構造に対し、天然または組換え系のいずれかにおいてリアノジン受容体を発現する細胞の応答に基づいて、受容体およびそれと相互作用する潜在的な他の付随の成分は有害生物駆除の重要な標的であることが明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、または１４６よりなる群から選択されるポリペプチドと比較する場合、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するリアノジン受容体をコードする核酸配列よりなる核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチドフラグメントに関する。
【００１０】
第２の実施態様では、本発明は、単離された核酸フラグメントに関し、ここで、核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１２７、１２９、１４３、または１４５のヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１１】
第３の実施態様では、本発明は、上記核酸フラグメント、およびその相補体に関し、ここで、フラグメントまたはその部分は、宿主細胞におけるリアノジン受容体活性の過剰発現、アンチセンス阻害、または共抑制の目的ための組換え構築物に有用である。
【００１２】
第４の実施態様では、本発明は、少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された上記核酸フラグメントもしくはその相補体またはそれらのいずれかの部分を含んでなる組換えＤＮＡ構築物に関する。また、ゲノムにそのような組換えＤＮＡ構築物を含んでなる真核または原核宿主細胞も興味深い。有用な宿主細胞には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、Ｓｆ９、Ｓ２、アフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）、ＨＥＫ−２９３およびＣＨＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００１３】
第５の実施態様では、本発明は：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６と他のイオンチャンネルおよび受容体ポリペプチド配列とを比較し；
（ｂ）工程ａにおいて得られる４もしくはそれ以上のアミノ酸の保存配列を同定し；
（ｃ）工程ｂにおいて同定される保存配列に基づいて縮重オリゴマーを設計し；そして
（ｄ）工程ｃの縮重オリゴマーを使用して、配列依存的プロトコルによって、リアノジン受容体活性を有するポリペプチドをコードする配列を単離する
ことを含んでなる、リアノジン受容体および関連ポリペプチドをコードする核酸フラグメントを単離するための方法に関する。
【００１４】
第６の実施態様では、本発明は、ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列とは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％の同一性を有する、リアノジン受容体活性を有する単離されたポリペプチドに関する。当業者であれば、７５％〜１００％の任意の整数の同一性パーセントがリアノジン受容体様ポリペプチド配列を単離するのに有用であることを認識するであろう。
【００１５】
第７の実施態様では、本発明は、カルシウムホメオスタシスを調整する能力について、少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）上記の組換え構築物のいずれか１つで宿主細胞を形質転換し；
（ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ；
（ｃ）試験しようとする化合物で、工程（ａ）の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
（ｄ）カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内ホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる。
【００１６】
本方法において、該方法はリガンド結合アッセイであることができるが、これに限定されない。さらに、本方法は、そのような細胞から得られる形質転換された宿主細胞またはイオンチャンネルの機能的活性に対する化合物の効果を検出することによって、機能的活性を評価することに基づくことができる。
【００１７】
第８の実施態様では、本発明は、リアノジン受容体活性を調整する少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの化合物と上記の単離された核酸フラグメントのいずれか１つによりコードされるポリペプチドとを接触させ；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、（ａ）のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる。
【００１８】
本方法において、該方法はリガンド結合アッセイであることができるが、これに限定されない。さらに、本方法は有用であり得、ここで、ポリペプチドは１つを超える化合物と接触される。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様は、配列番号６３〜１１９のいずれかに記載の少なくとも２つのポリペプチド配列を含んでなる昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントであるが、但し、前記ポリペプチド配列が配列番号５６、１２０〜１２６のいずれをも含まない。
【００２０】
さらに別の実施態様は：
ａ）少なくとも１００アミノ酸を有する第１のポリペプチドをコードする単離された核酸配列を得て；
ｂ）第１のポリペプチド配列と、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択される比較ポリペプチド配列とを比較して、第１のポリペプチドと比較ポリペプチドとの間で１００％の配列同一性を有する領域を同定し、ここで、前記領域は比較ポリペプチドと同じ長さであり；そして
ｃ）異なる比較ポリペプチド配列で工程（ｂ）を反復し、ここで、前記異なる比較ポリペプチド配列は、１００％の配列同一性を有する第２の領域が見出されるまで、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択され、ここで、前記第２の領域は異なる比較ポリペプチドと同じ長さである
ことを含んでなる、昆虫イオンチャンネルをコードする核酸配列を同定するための方法であり得る。該方法は、１００〜６，０００アミノ酸の長さを有する第１のポリペプチドの長さによってさらに特徴付けられ得る。
【００２１】
本発明のなおさらなる実施態様は：
ａ）毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメント、および／またはインフレーム翻訳停止コドンを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメント、および／またはインフレーム翻訳停止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接され；そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。削除可能な配列は、ｌｏｘ部位などであるがこれに限定されない組換え酵素によって認識される任意の配列であってもよい。
【００２２】
本発明の関連実施態様は、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物自体を包含し得、ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメント、および／または少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンを含んでなり、さらにここで、転写終止核酸フラグメント、および／または少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接される。削除可能な配列は、ｌｏｘ部位などであるがこれに限定されない組換え酵素によって認識される任意の配列であってもよい。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、
ａ）毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え発現構築物で宿主を形質転換し、ここで、前記フラグメントはまた、前記フラグメントの発現を妨害するイントロンを含んでなり、そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。
【００２４】
さらに別の実施態様では、本発明は、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え発現構築物を包含し得、ここで、前記単離された核酸フラグメントはまた、毒性昆虫イオンチャンネルの発現を妨害するイントロンを含んでなる。
【００２５】
配列表の簡単な説明
本発明は、本出願の一部をなす下記の詳細な説明ならびに添付の図面および配列表によりさらに完全に理解することができる。
【００２６】
表１は、本明細書で記述されるポリペプチド、これらのポリペプチドの全部または実質的な部分を表すポリペプチドをコードする核酸フラグメントを含んでなるゲノムまたはｃＤＮＡクローンの呼称、および添付の配列表において使用される対応する識別名（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（配列番号）を列挙する。配列の説明およびそれに付属された配列表は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条に示されるような、特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示に適用される規則に従う。
【００２７】
【表１】
【００２８】
奇数番号の配列番号１、３、５、７、９、１２７、１２９、１４３、および１４５は、掲載された種由来のリアノジン受容体をコードする配列に対するポリヌクレオチド配列を表す。偶数番号の配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６は、対応する奇数番号のポリヌクレオチド配列から誘導される翻訳されたアミノ酸配列を表す。配列番号１１〜５５は、ＰＣＲ増幅、ならびに配列決定、多様な昆虫供給源由来のリアノジン受容体の単離および特徴付け中の実験に使用したヌクレオチドプライマーである。未注釈蚊ゲノム配列（配列番号５７）は、（本発明の著者らによって行われた分析によって）リアノジン受容体の一部をコードすると考えられる。配列番号５６、５８〜６２および１２０〜１２６は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースに存在するリアノジン受容体配列である。配列番号６３〜１１９は、昆虫リアノジン受容体において保存されていると考えられるアミノ酸配列モチーフである。配列番号１３１〜１４２は、発現ベクターへのクローニングのためのリアノジン受容体コーディング領域の増幅に使用されるＰＣＲプライマー配列およびオリゴヌクレオチドである（実施例７を参照のこと）。
【００２９】
配列表は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３０２１−３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ２１９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）（参考として本明細書に引用される）に記述されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ標準に従って規定される通り、ヌクレオチド配列文字の１文字記号およびアミノ酸の３文字記号を含有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用される記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に示される規則に従う。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本明細書において使用される「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖もしくは二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、場合により、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含有する。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから成り得る。ヌクレオチド（通常、５’一リン酸の形で見出される）については、次の一文字呼称で呼ばれる：（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対する）アデニル酸またはデオキシアデニル酸は「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸は「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸は「Ｇ」、ウリジル酸は「Ｕ」、デオキシチミジル酸は「Ｔ」、プリンは「Ｒ」（ＡまたはＧ）、ピリミジンは「Ｙ」（ＣまたはＴ）、ＧまたはＴは「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴは「Ｈ」、イノシンは「Ｉ」、ＡまたはＴは「Ｗ」、ＣまたはＧは「Ｓ」、および任意のヌクレオチドは「Ｎ」。
【００３１】
用語「機能的に等価であるサブフラグメント」および「機能的等価サブフラグメント」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、フラグメントまたはサブフラグメントが活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、遺伝子発現を改変または所定の表現型を産生する能力が保持されている単離された核酸フラグメントの一部分または部分配列を指す。例えば、フラグメントまたはサブフラグメントは、所望する表現型を形質転換した植物内に産生するためのキメラ構築物の設計に使用することができる。キメラ構築物は、活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、植物プロモーター配列に関係する適当な配向で、核酸フラグメントもしくはそのサブフラグメントを連結して共抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）またはアンチセンス的に使用するために設計することができる。
【００３２】
用語「相同性」、「相同的」、「実質的に類似」、「〜より本質的になる」、および「実質的に対応」は、本明細書において交換可能に使用される。それらは、１個以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介または所定の表現型を産生するための核酸フラグメントの能力に影響を及ぼさない核酸フラグメントを指す。これらの用語はまた、得られた核酸フラグメントの機能的性質を、当初の改質されていないフラグメントと比較して、実質的に改変しない１個以上のヌクレオチドの欠失または挿入のような本発明の核酸フラグメントの改質をも指す。従って、本技術分野の熟練者であれば、本発明が、特定の例示配列以上のものも包含することを認めることが理解される。
【００３３】
さらに、熟練者は、本発明に包含される本質的に類似した核酸配列は、中程度のストリンジェント条件（例えば、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下において、本明細書において例示する配列か、または本明細書に報告したヌクレオチド配列ならびに本発明の遺伝子およびプロモーターに機能的に等価なヌクレオチド配列の任意の部分にハイブリダイズする能力によっても規定されることを認める。ストリンジェンシー条件を調整して、遠い関係の生物体由来の相同配列などの中等度に類似のフラグメントから、近い関係の生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子などの、高度に類似のフラグメントまでをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。１組の好適な条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温、１５分間で開始し、次いで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃、３０分間で反復し、次いで、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、３０分間を２回反復する一連の洗浄を使用する。より好適な組のストリンジェントな条件は、より高い温度を使用し、ここで洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃にまで上昇させたことを除いて、上記の洗浄と同一である。もう１つの好適な組の高度にストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で最後の２回の洗浄を使用する。
【００３４】
標的（内因性）ｍＲＮＡと、標的ｍＲＮＡに相同性を有する構築物におけるＲＮＡ領域との間の実質的な類似性の程度について、そのような配列は、少なくとも２５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、より好ましくは１００ヌクレオチド長、さらに好ましくは２００ヌクレオチド長、最も好ましくは３００ヌクレオチド長であるべきであり、少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるべきである。
【００３５】
多くのレベルの配列同一性が、関連するポリペプチド配列を同定するのに有用であることが、当業者によって良好に理解されている。同一性パーセントの有用な例には、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または７５％〜１００％の任意の整数の百分率がある。配列のアライメントおよびパーセント同一性の計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを含むがそれに限定されない相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定してもよい。配列のマルチプルアライメントは、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用い、アライメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して実施する。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用するタンパク質配列のペアワイズアライメントおよびパーセント同一性の計算のためのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＬＡＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＬＡＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。大きなタンパク質配列では、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗプログラム（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら（１９９４）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：４６７３−４６８０）を使用した。デフォルトのパラメータを使用した（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、ＤＥＬＡＹ ＤＩＶＥＲＧＥＮＴ ＳＥＱ （％）＝３０、ＤＮＡ ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮ ＷＥＩＧＨＴ＝０．５０、ＰＲＯＴＥＩＮ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：Ｇｏｎｎｅｔ ２５０、ＤＮＡ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ）。ペアワイズアライメントもまた、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１０、ＰＲＯＴＥＩＮ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ）を使用した。
【００３６】
「遺伝子」は、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ構築物」、「組換え構築物」、または「組換え発現構築物」は、天然では通常は一緒に見出されない核酸フラグメントの組み合わせを指す。従って、組換え構築物は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源から由来するが、しかし、通常、天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでなり得る。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されないが、しかし遺伝子導入により宿主生物体内に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ構築物を含んでなることができる。「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノム中に導入されている遺伝子である。
【００３７】
「コーディング配列」は特定のアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を挙げることができるが、これらに限定されない。用語「インフレーム翻訳終止コドン」は、ＲＮＡ転写物の好適なリーディングフレーム内に存在するＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡ停止コドンを指す。
【００３８】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、近接およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはしばしばエンハンサーと称される。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することが可能でありかつプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるように挿入されたプロモーターの先天的エレメントまたは異種エレメントであり得るＤＮＡ配列である。プロモーター配列はまた、遺伝子の転写される部分内、および／または転写される配列の下流に位置することができる。プロモーターはそれらの全体がそのまま生来の遺伝子に由来してもよく、または、天然に見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントさえ含んでなることができる。当業者であれば、異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞タイプにおいて、あるいは発生の異なる段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解する。ほとんどの時点でのほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「構成的プロモーター」と称される。植物細胞において有用な多様なタイプの新規プロモーターが常に発見されており；多くの例をオカムロおよびゴールドベルグの総説（Ｏｋａｍｕｒｏ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９８９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ１５：１−８２）中に見出すことができる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全には規定されていないため、一部分の変形を持つＤＮＡフラグメントは、同一のプロモーター活性を有していることがあることもさらに認められている。用語「誘導性プロモーター」は、トランス作用因子によって活性化され得る通常、休止状態にあるプロモーターを指す。そのような因子の例として、タンパク質、化学物質、およびＤＮＡの局所構造を変更する因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
「イントロン」は、タンパク質配列の一部分をコードしていない遺伝子中に介在する配列である。従って、この配列はＲＮＡ中に転写はされるが、しかし切り取られて翻訳されない。この用語はまた、切除されたＲＮＡ配列についても使用される。「エキソン」は、転写され、遺伝子に由来する成熟したメッセンジャーＲＮＡ中に見いだされるが、しかし必ずしも最終の遺伝子産物をコードする配列の一部である必要はない。
【００４０】
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との間に配置されるＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響を及ぼすことができる。翻訳リーダー配列の例は記述されている（ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）およびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２２５）。
【００４１】
「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に配置されるＤＮＡ配列を指し、かつ、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸領域（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。異なる３’非コーディング配列の使用がインゲルベルヒト（Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ）ら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１：６７１−６８０により例示されている。
【００４２】
「ＲＮＡ転写物」はＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称される。またはそれは一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まずかつ細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡテンプレートに相補的でありかつ酵素である逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であり得るかまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて二本鎖に転換することもできる。「センス−ＲＮＡ」は、ｍＲＮＡを含み、そして、細胞内またはインビトロでタンパク質に翻訳させることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物もしくはｍＲＮＡの全部または一部に相補的でありかつ標的である単離された標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列での特異的な遺伝子転写物のいずれかの部分であることができる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは翻訳されなくてもよいが、しかし細胞の過程に対する影響をなお有し得る他のＲＮＡを指す。用語「相補体」および「逆相補体」は、ｍＲＮＡ転写物について本明細書において交換可能に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを規定することを意味する。
【００４３】
用語「内因性ＲＮＡ」は、天然に存在するかまたは天然には存在しない（即ち、組換え手段、変異誘発などによって導入されている）かに係わらず、本発明の組換え構築物による組換え前の宿主のゲノムに存在する任意の核酸配列によってコードされる任意のＲＮＡを指す。
【００４４】
用語「天然には存在しない」とは、天然において通常に見出されるものには一致しない人工物を意味する。
【００４５】
用語「操作可能に連結している」は、一方の機能が他方により調節されるような単一核酸フラグメント上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を調節することができる（即ち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結している。コーディング配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結することができる。別の例では、本発明の相補ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’側、もしくは標的ｍＲＮＡの３’側、もしくは標的ｍＲＮＡ内に直接的かまたは間接的に操作可能に連結することができ、あるいは、第１の相補領域は、標的ｍＲＮＡの５’側であり、その相補体は標的ｍＲＮＡの３’側である。
【００４６】
用語「転写終止核酸フラグメント」は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を停止させる核酸結合タンパク質によって認識される配列を含有するか、または二次構造を生じる核酸フラグメントを指す。
【００４７】
本明細書において使用される用語「発現」は、機能的最終産物の産生を指す。遺伝子の発現は、遺伝子の転写および前駆体または成熟タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳に関与する。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似する外来もしくは内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００４８】
用語「削除可能な配列」、「削除部位」、または「削除配列」は交換可能に使用され、Ｃｒｅなどの組換え酵素によって認識されるＬｏｘ配列などの任意の配列を指す。Ｃｒｅの活性は、組換えによって、より長いＤＮＡフラグメントから２つのＬｏｘ配列、およびＬｏｘ配列間の他の任意の核酸を取り出す。当業者であれば理解できるように、実施例７に記載のＣｒｅ／Ｌｏｘに匹敵し得るいくらかの削除系を使用することができる。削除系の例としては、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９９０）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２３：３６９−３７８）；Ｆｌｐ／Ｆｒｔ（ライズニック（Ｌｙｚｎｉｋ）ら（１９９３）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１：９６９−９７５）；クロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）ＴＭ／Ａｔｔ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ）；Ｇｉｎ／Ｇｉｘ（マエサー（Ｍａｅｓｅｒ）およびカーマン（Ｋａｈｍａｎｎ）（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３０：１７０−１７６）；ならびにＲ／ＲＳ（オノウチ（Ｏｎｏｕｃｈｉ）ら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：６３７３−６３７８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
当業者であれば理解できるように、削除部位によって隣接されたいくらかのフラグメントを使用して、本明細書に記載のものに等価な宿主細胞における発現を除去またはダウンレギュレートすることができる。そのようなフラグメントの例として、転写ターミネーター、Ｒｙｒコーディング配列と共にフレーム内にある停止コドン、転写リプレッサーによって認識されるオペレーター、翻訳アテニュエーター、およびアンチセンスまたは共抑制構築物に相互作用する配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
当業者であれば理解できるように、停止フラグメントは、本明細書に記載のものに等価なＲｙｒ ｃＤＮＡにおける異なる多くの位置に挿入することができる。適切な位置の例としては、遺伝子のプロモーターの上流、５’非翻訳リーダー、コーディング配列内、および３’非翻訳領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
当業者であれば認識できるように、リアノジン受容体遺伝子のコーディング領域内のイントロンの置き換えは、ＲＮＡ転写物からのイントロンの取り出しをプロセスすることが不可能である宿主細胞における活性なリアノジン受容体の発現を減弱し得る。
【００５２】
「成熟」タンパク質は、転写後にプロセシングされたポリペプチド（即ち、一次翻訳産物中に存在するいかなるプレ−もしくはプロペプチドが除去されている）を指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（即ち、プレ−およびプロペプチドがなお存在する）を指す。プレ−およびプロペプチドは、限定されるものでないが細胞内局在化シグナルであってもよい。
【００５３】
「モチーフ」、「部分配列」または「セグメント」は、より長い配列の一部を含む核酸またはアミノ酸の保存配列の短い領域を指す。例えば、そのような保存された部分配列は機能に対し重要であり、リアノジン受容体の新規のホモログを同定するために使用することが可能であると予想される。エレメントのいくつかまたは全部は推定リアノジン受容体において見出すことができることが予想される。また、与えられた任意のモチーフにおける１または２個の保存されたアミノ酸は、リアノジン受容体において異なり得ることも予想される。
【００５４】
本明細書において使用される用語「相同配列」とは、整列させた場合、１００％の同一性およびギャップを伴わない共線性を有する２つの配列を示すことを意味する。
【００５５】
「安定な形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝を生じる核およびオルガネラゲノムの両方を含む宿主ゲノムへの核酸フラグメントの移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」は、組込みもしくは安定な遺伝を伴わない遺伝子発現を生じる宿主生物体の核、またはＤＮＡ含有オルガネラへの核酸フラグメントの移入を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体は「トランスジェニック」生物体と称される。イネ、トウモロコシおよび他の単子葉植物の細胞形質転換の好適な方法は、粒子加速または「遺伝子銃」形質転換技術（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号明細書）、または導入遺伝子を含有する適切なＴｉプラスミドを使用するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介法（イシダ（Ｉｓｈｉｄａ Ｙ．）ら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。本明細書において使用される用語「形質転換」は、安定な形質転換および一過性形質転換の両方を指す。
【００５６】
用語「宿主細胞」は、単離された核酸フラグメントが安定もしくは一過的に導入されている任意の細胞または生物体を指す。宿主細胞は、より大きな生物体、組織培養における個体、または遊離生体生物体の部分であってもよい。宿主細胞の例として、細菌、真菌、昆虫、植物、および動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、かつ、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）：コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１９８９（以下「サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」）に、より詳細に記述される。
【００５８】
用語「組換え体」は、例えば、化学合成または遺伝子操作技術による核酸の単離されたセグメントの操作による配列の２つの異なる分離されたセグメントの人工的な組み合わせを指す。
【００５９】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の反復サイクルからなる、大量の特定ＤＮＡセグメントの合成のための技術である（パーキン・エルマー・シータス・インスツルメンツ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ））。代表的には、二本鎖ＤＮＡを加熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温でアニーリングし、次いで中間的な温度で延伸する。これらの３段の連続工程の１組が１サイクルをなす。
【００６０】
ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、短期間でテンプレートの複製を反復することによって、ＤＮＡを１００万倍に増幅するために使用される強力な技術である。（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５１：２６３〜２７３（１９８６）；エールリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）ら、欧州特許出願第５０，４２４号明細書；欧州特許出願第８４，７９６号明細書；欧州特許出願第２５８，０１７号明細書；欧州特許出願第２３７，３６２号明細書；ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）、欧州特許出願第２０１，１８４号明細書；ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；エールリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）、米国特許第４，５８２，７８８号明細書；およびサイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、米国特許第４，６８３，１９４号明細書）。プロセスは、ＤＮＡ合成を用意するために、特異的にインビトロ合成されたオリゴヌクレオチドの組を利用する。プライマーの設計は、解析を所望するＤＮＡの配列に依存する。該技術は、高温でテンプレートを融解し、テンプレート内の相補配列にプライマーをアニールさせ、次いで、ＤＮＡポリメラーゼでテンプレートを複製する多くのサイクル（通常２０〜５０）を介して行われる。
【００６１】
ＰＣＲ反応の産物は、アガロースゲル中での分離、続いて臭化エチジウム染色およびＵＶ透過による可視化によって分析される。あるいは、産物に標識を組み入れるために、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに添加することもできる。この場合、ＰＣＲの産物はゲルのＸ線フィルムへの暴露によって可視化される。放射性標識ＰＣＲ産物のさらなる利点は、個々の増幅産物のレベルを定量することができることである。
【００６２】
用語「組換え構築物」、「発現構築物」および「組換え発現構築物」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、当業者に周知の標準的方法論を使用して、細胞のゲノムに挿入することができる遺伝子材料の機能的単位を指す。そのような構築物はそれ自体であってもよく、またはベクターと組み合わせて使用してもよい。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者に周知である宿主植物を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。熟練者には本発明の単離された核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択および増殖させるために、ベクター上に存在すべき遺伝子エレメントは周知である。熟練者はまた、異なる独立した形質転換事象が、発現の異なるレベルおよびパターンとなり（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８；デ・アルメイダ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ）ら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２１８：７８−８６）、従って望ましい発現レベルおよびパターンを示す株を得るために多重事象をスクリーニングしなければならないことを認めるであろう。かかるスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析により達成できる。
【００６３】
本明細書において使用する用語「リアノジン受容体」は、小胞体／筋小胞体に関連する内部カルシウム（ＣａまたはＣａ＋＋）放出チャンネル−受容体を指す。これらのチャンネルは、カルシウムイオンに対する選択性を示すことが公知である一方、カリウムなどであるがこれに限定されない他のカチオンは、これらのチャンネルを介して透過することができる。用語「リアノジン受容体」、「イオンチャンネル受容体」、「イオンチャンネル」、および「リアノジン様受容体」は、本発明のイオンチャンネル膜タンパク質のファミリーを包含することを意味する。該用語は本明細書において交換可能に使用される。リアノジン受容体は、イオンチャンネルとして役立つために必ずしもリアノジン結合活性を必要としない。本発明において記載された特徴を有する機能的イオンチャンネルは、タンパク質配列のアミノ酸変化によりリアノジンまたは他の化合物の結合が変更され得る場合でさえも、特許請求の範囲に含まれる。リアノジン受容体による他の非リアノジン化合物の結合は、リアノジン受容体の同じ、または異なる領域で生じてもよい。
【００６４】
「毒性核酸フラグメント」、「毒性リアノジン受容体核酸フラグメント」、または「毒性昆虫イオンチャンネル」は、生物体に存在する場合、生物体の成長および／または生存を危うくする単離された核酸フラグメントあるいはそのサブフラグメントを指す。毒性は、単離された核酸フラグメント自体、単離された核酸フラグメントから転写されるＲＮＡまたは単離された核酸フラグメントから誘導されるＲＮＡから翻訳されるタンパク質によってであり得る。遺伝子によって生じる成長欠陥は、毒性を生じる遺伝子の部分を改変する単離された核酸フラグメントまたはそのサブフラグメント内の変異によって軽減することができる。この場合、成長の減損は全体的に緩和され得るが、成長の減損は単離された核酸フラグメントの改変によって緩和されたに過ぎないため、本来の遺伝子はなお毒性であると考えられる。
【００６５】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６よりなる群から選択されるポリペプチドと比較する場合、少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するリアノジン受容体をコードする核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチドフラグメントに関する。
【００６６】
好適な実施態様では、アミノ酸配列同一性は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％または８０％〜１００％の任意の整数の百分率であり得る。
【００６７】
リアノジンアルカロイドおよびアントラニルアミド殺虫剤によって調整されるリアノジン受容体をコードする単離された核酸フラグメントは、鱗翅目、タバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、５つのアイソタイプ）および３種の同翅目昆虫、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、トウモロコシウンカ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）、およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離されている。これまで、タバコガ、鱗翅目有害生物種の由来のリアノジン受容体の全長核酸配列またはアミノ酸配列については知られておらず、これらの核酸配列のうち少なくとも２つの変異体が存在することも知られていなかった。ワタアブラムシ、トウモロコシウンカ、およびモモアカアブラムシ由来の同翅目の配列の例もまた、本発明の開示以前には知られていない。キイロショウジョウバエの配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａリアノジン受容体をコードする先に開示されたすべての核酸配列とは異なる新規の変異体である。
【００６８】
実施例において以下に記載のように、ＰＣＲならびにそれらのＤＮＡおよびアミノ酸配列を使用して、これらの有害生物種から核酸フラグメントを単離した。類似の作用機序を有する他の殺虫剤をスクリーニングするためのアッセイの開発のためのこれらの遺伝子の使用について説明する。殺虫剤アプリケーションのための単離された核酸フラグメント、そのサブフラグメントまたはこれらのフラグメントによってコードされるポリペプチドの使用についても開示する。
【００６９】
カルシウムホメオスタシスのモジュレーターの存在または非存在に応答する機能するリアノジン受容体を提供するために、単離された核酸フラグメントを細胞において発現させることができる。これは、内部カルシウム貯蔵の放出を活性化する、それらの放出または類似のリアノジンを遮断する、特定の濃度で開いた状態のイオンチャンネルを保持する、さらに高い濃度でチャンネルを遮断する化合物をスクリーニングするための基礎を提供し得る。
【００７０】
従って、別の実施態様では、本発明は、カルシウムホメオスタシスを調整する能力について、少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）本明細書に記載の組換え構築物で宿主細胞を形質転換し；
（ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ；
（ｃ）試験しようとする化合物で、工程（ａ）の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
（ｄ）カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内カルシウムホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる。
【００７１】
本明細書において使用する「調整」は、タンパク質の活性の機能の変更、この場合、カルシウムホメオスタシスの変更または上記のリアノジン受容体活性の変更を指す。
【００７２】
なおさらなる実施態様では、本発明は、リアノジン受容体活性を調整する少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの化合物と本発明の単離された核酸フラグメントによりコードされるポリペプチドとを接触させ；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、（ａ）のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる。
【００７３】
様々な種由来のリアノジン受容体は、サブユニットのホモテトラマーとして機能的であり、各サブユニットは約０．５ＭＤａのサイズである。タンパク質のＣ末端の２０％は、カルシウムイオンが内部カルシウム貯蔵から細胞質ゾル環境へ流動するチャンネルを構成する膜貫通領域を形成する（バート（Ｂｈａｔ）ら（１９９７）、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ７３：１３２９−３６）。膜の細胞質ゾル側に対するタンパク質の残りの８０％は、多くの他のタンパク質および細胞の低分子量成分と相互作用する。これらの成分の効果は、チャンネルの「開いた」または「閉じた」状態、従って、カルシウムの放出および内部貯蔵に対する細胞質ゾルにおけるイオンの均衡に有利に働くことによって、カルシウムの流動を調整することである。
【００７４】
特に筋肉組織においてカルシウム均衡を妨害する効果は、収縮および弛緩、即ち、興奮収縮連関（ＥＣＣ）に関与する正常なプロセスを破壊することである。例えば、ヒト心臓リアノジン２型受容体は、突然心停止症候群（マークス（Ｍａｒｋｓ）ら（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：３６５−７６））および悪性の低体温症（トン（Ｔｏｎｇ）ら（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：２６３２２−２６３２６）に関与している。
【００７５】
リアノジンが天然の昆虫駆除剤として使用されている一方、化合物の構造的複雑性のため肝心な商品化が妨げられている。リアノジン受容体複合体との相互作用を介して内部カルシウム貯蔵の放出を刺激する殺虫性活性を有する容易に合成された小さな化合物を同定することが所望され得る。
【００７６】
リアノジン受容体に相互作用することが見出されている他の小さな分子は、アントラニルアミド構造に基づく分子である。「ＧＮアナログ」と称されるこれらの分子の例を図２に示し、それらの使用を実施例９および１１に概説する。多くのタイプの化学および誘導体が、リアノジン受容体複合体の機能を変更するのに有用であり得ることが予想される。生物体に対する全体的効果はリアノジンの効果、つまり活動低下および麻痺に匹敵する一方、これらの他の分子は、カルシウム放出チャンネルを開放することによるリアノジンとは作用機序が異なる。このチャンネル活性化は、カルシウム貯蔵の涸渇をもたらすが、リアノジンは、サブコンダクタンス状態のチャンネルを欠如することによって作用する。これらの「ＧＮ」分子の結合部位もまた、リアノジンの結合部位とは異なることが見出されている。それにも係らず、図３および４に示されるような昆虫リアノジン受容体を発現する組換え細胞株においては、これらのリアノジン受容体を欠如するコントロール細胞とは異なり、カルシウム貯蔵を放出するこれらの分子の能力は、リアノジン受容体タンパク質自体が「ＧＮ」化学の結合部位であることをさらに支持する。
【００７７】
化合物のこの構造クラスの効果に基づけば、リアノジン受容体は新規の有害生物防除剤の発見に価値のある生化学的標的である。他の昆虫イオンチャンネル受容体と同様に、チャンネル受容体および従って細胞カルシウム均衡の機能的特性に影響を及ぼし得るタンパク質に対する潜在的に複数の結合部位が存在する。小さな分子結合部位に加えて、多数のタンパク質が両側上および小胞体膜（ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｍｅｍｂｒａｎｅ）内の受容体に相互作用する（再検討のためのマクリル（Ｍａｃｋｒｉｌｌ）（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３７：３４５−３６１を参照のこと）。これらの相互作用を妨害することが見出された化合物もまた、有害生物防除剤として有用であり得る。
【００７８】
無脊椎動物由来のＲｙｒ遺伝子は、すべての筋肉タイプおよびニューロンにおいて広範に発現されるため、化合物を活性化するための接近可能性が予想され得る。アントラニルアミドの作用機序の症候学は、昆虫、骨格、平滑および心臓のすべての筋細胞に対するこれらの化合物の直接効果に一致する。ゴキブリ神経細胞の蛍光画像化分析またはゴキブリの肢の筋肉を使用した結合研究は、ニューロンにおけるカルシウム流入、または肢筋肉調製物への結合と、昆虫有害説物スクリーニングにおけるこれらの化合物の活性との間に密接な相関関係があることを示す。
【００７９】
従って、筋ならびに神経細胞由来の組織調製物は、単離および結合研究のための昆虫受容体の供給源である。最も適切な細胞の選択は、例えば、調べられている化学の放射性標識類似体または市販されている放射性標識リアノジンの結合親和性を使用して、達成することができる。放射性リアノジンおよびＧＮ類似体を使用する結合研究を実施例９に提示する。これは、受容体調製中の放射性標識類似体の運命、または類似体もしくは誘導体の特定の分光特徴をモニターすることを含み得るが、これらに限定されない多くの方法で決定し得る。調製物の量は、カルシウム特異的蛍光インジケーターを使用して検出されるカフェインなどの特異的受容体モジュレーターによって誘導されるカルシウム流動からの蛍光強度に基づいて評価することができる。細胞内カルシウムの変化をモニターするのに有用なインジケーターの例として、ＦＵＲＡ−２、Ｆｌｕｏ−３、およびＦｌｕｏ−４が挙げられるが、周知でありかつ有用な代替物であり得る他の化合物も存在する。あるいは、調製物は、結合する放射性標識リガンドの量から決定される組織の単位重量あたりの機能的受容体の量に基づいて評価することができる。
【００８０】
不運にも、組織サンプルは、目的のすべての有害生物から効果的なスクリーニングまたは分析に必要な量だけ得られるわけではない。従って、組換え材料による研究の重要な利点は、多くの細胞タイプおよび背景で、任意の遺伝子の単一の変異体を発現し、従って、プロモーターの選択に依存する相対的に制御された量で均質な実験調製物を産生させる能力である。さらなる利点は、種特異的受容体は、しばしば、独特な結合部位を有し、従って、発現のために遺伝子のどの供給源を選択するかという点について、組換え系が柔軟性を与えることである。これは、予め選択された多様な条件においてシステムの応答の比較分析の手段を提供する。
【００８１】
これらの供給源のいずれかから由来する十分な量の有害生物受容体は、同じ作用機序を有する他の合成化合物または天然のリガンドを同定するための有用性を有するアッセイの基礎を形成する。細胞内カルシウム濃度のモニタリングに基づくアッセイの場合、イオンチャンネルの活性化またはその遮断を生じるモジュレーターを同定することができる。結合アッセイを使用して、標識された類似体が結合する特異的部位もしくは類似体の結合を変更するアロステリック部位で受容体またはイオンチャンネルに相互作用するそれらのモジュレーターを同定することができる。
【００８２】
結合アッセイでは、一方のパートナー分子が固定化され、他方は何らかの様式で（例えば、酵素もしくは蛍光タグなどの非放射性標識を使用するかまたは放射性標識を使用することによって）標識され、溶液中遊離で添加される。分子相互作用を可能にするためのインキュベーション、および洗浄工程後、適切な検出系を使用して、結合したリガンドの量を測定する。次いで、有意な結合を示すリガンドは、タンパク質が過剰であることを確実にし、１組の既知濃度、典型的に１０−２〜１０−１０Ｍの系列希釈のリガンドで実験を行うことによって、さらに研究することができる。
【００８３】
支持体材料上でエピトープまたは他のアフィニティータグを使用し、タグに対する適切な抗体または結合因子を該支持体に付着させて、タンパク質を固定化してもよい。例えば、特異的結合対のメンバーは、免疫または非免疫タイプであり得る。免疫特異的結合対は、抗原／抗体系またはハプテン／抗ハプテン系によって例示される。結合対の抗体メンバーは、ポリクローナルもしくはモノクローナルまたはそれらの免疫反応性フラグメントであるかに係わらず、当業者によく知られた従来の方法によって、産生させることができる。免疫反応性抗体フラグメントまたは免疫反応性フラグメントという用語は、抗体の結合領域を含有するフラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、ＦＣ部分を各フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントとして規定されるＦａｂ型フラグメントであってもよく、または無傷な抗体の重鎖成分を接続するジスルフィド結合の還元切断によって得られるいわゆる「半分子」であってもよい。特異的結合対の抗原メンバーが免疫原性でない、例えば、ハプテンである場合、それをキャリアタンパク質に共有結合させて免疫原性にすることができる。
【００８４】
非免疫結合対は、２つの成分が相互に対する天然の親和性を共有するが、抗体ではない系を含む。例示的な非免疫結合対には、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン、葉酸−葉酸結合タンパク質、相補的核酸プローブなどがある。また、相互に共有結合を形成する非免疫結合対も含まれる。例示的共有結合には、マレイミドおよびハロアセチル誘導体などのスルフヒドリル反応基ならびにイソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、スルホニルハロゲン化物などのアミン反応基ならびに３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）および３−（ジメチル−アミノ）安息香酸（ＤＭＡＢ）などのカプラー色素などが含まれる。
【００８５】
アッセイに使用される適切な支持体には、ポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポリスチレンなどの合成ポリマー支持体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、アミノ化またはカルボキシル化ポリスチレン；ポリアクリルアミド；ポリアミド；ポリビニルクロリドなど；ガラスビーズ；アガロース；ニトロセルロース；ナイロン；ポリビニリデンジフルオリド、表面修飾したナイロンなど。
【００８６】
親和性タグのさらなる１つの実施例は、強結合モジュレーターまたはエフェクターの類似体であり、エフェクターの結合部位を含んでなる受容体の残基に共有的に標識するために使用され得る光親和性標識である。小さな類似体は、光照射を使用してタンパク質を共有的に修飾し、親和性部分を活性化するように変更されているだけではなく、修飾されている受容体の領域のさらなる簡便な同定のために放射性標識を担持する。修飾された残基を担持する標識された受容体またはペプチドフラグメントのさらなる分析により、類似体結合部位を含んでなるタンパク質の領域を同定することができる。
【００８７】
受容体に直接的に対する作用を介するか、またはカルシウムシグナル伝達のプロセスに関与する付随タンパク質に対する作用を介する低分子量化合物および天然産物の同定のための機能アッセイが開発されている（マクリル（Ｍａｃｋｒｉｌｌ）（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３７：３４５−３６１）。さらなる方法は、平面状脂質二重層の記録、ならびに画像化およびインサイチュカルシウム濃度変化の蛍光モニタリング（ブリランテス（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ）ら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７７：５１３−５２３；マック（Ｍａｃｋ）ら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：２３２３６−２３２４９；チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：３２６０３−３２６１２；ロドニー（Ｒｏｄｎｅｙ）ら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１２４３０−１２４３５）を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
一旦、リアノジン受容体をコードする核酸フラグメントが最初に単離され、次いで適切なベクターにクローニングされたら、該リアノジン受容体をコードする核酸フラグメントを使用し得る多くの方法が存在する。そのような核酸フラグメントを単離するための方法には、生来のＲｙｒタンパク質を発現することが公知である細胞からＲＮＡを単離することが含まれるが、これらに限定されない。この場合、組織供給源は鱗翅目および同翅目有害生物由来である。他の有害生物には、無脊椎動物界および寄生病原体由来のすべての有害生物、例えば、動物の健康問題を引き起こす有害生物または考えられる家屋内有害生物が含まれるが、これらに限定されない。そのような有害生物の例として、ノミ、ダニ、ゴキブリ、蚊、線虫、マラリア原虫、ヒツジキンバエが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
オリゴヌクレオチドプライマーを設計および合成するのに十分なＤＮＡ配列が利用可能であり、次いで、当業者がこれらのプライマーを使用して、ＲＴ ＰＣＲによりＤＮＡを作製する場合、ＲＮＡを使用し得る。従って、ＤＮＡの配列は、他の広範な無脊椎動物から受容体遺伝子を単離することが可能なプライマーを設計することを可能にするのに役立つ。プライマーを遺伝子の５’および３’より外側の領域から設計する場合、遺伝子の全体を作製することができる。あるいは、遺伝子は、遺伝子の内部領域のＲＴ ＰＣＲ後に単離された多くのサブフラグメントから組み立てることができる。この場合、遺伝子より外側の末端領域を獲得することは手間が掛かることがあり、５’−ＲＡＣＥまたはインバースＰＣＲのような手順を用いる必要があり得る。ＲＮＡは全部のまたは、ｍＲＮＡなどのいくつかの特定のタイプを富化するために分画された材料であり得る。ＲＮＡは、一般に、多くの方法で発現および増幅され、例えば、ｃＤＮＡライブラリー、または１つを超えて存在する場合、すべてのバージョンの遺伝子を捕捉し得るライブラリー産生の変異体を作製し得る。
【００９０】
あるいは、本発明の単離された核酸フラグメントは完全な細胞、細胞溶解物、部分細胞成分から抽出し得、他の細胞材料から精製し得る。核材料の場合、核酸フラグメントは、ゲノム由来であり、従って、代替的配列アレンジメントおよび従って、機能的タンパク質の異なる変異体を提供する能力を付与し得る多くのイントロンを含有する可能性がある。この核酸フラグメントを使用して、ＢＡＣ、コスミド、フォスミドまたはゲノムライブラリーの他のバージョンを作製し、遺伝子のエキソンおよびイントロンのすべての変異体が利用可能であることを確実にし得る。
【００９１】
生来の遺伝子、キメラまたは変異原性変異体またはそれらのサブフラグメントをコードする核酸フラグメントもまたは、多くの企業により付与される既知の配列を使用して化学的に合成し得る。
【００９２】
転写制御に対する特異的プロモーター、特定の細胞コンパートメントに対する標的化のため、あるいは翻訳後修飾かまたは受容体およびイオンチャンネルのカルシウムホメオスタシスにも直接的もしくは間接的に関与する膜、二次メッセンジャー、もしくは付随タンパク質との相互作用を改変するための前駆配列などのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の外側またはＯＲＦの内部の他の有用性のある配列についても考慮され得る。核酸フラグメントと受容体タンパク質、例えば、ＧＦＰ、ルシフェラーゼをコードする他のＯＲＦとの融合は、細胞における遺伝子産物の位置決定を援助するか、または受容体の産生を援助するためのアプリケーションを有する。別の例では、β−ガラクトシダーゼを受容体と相互作用することが疑わしい異なるタンパク質と融合させることができる。次いで、アッセイ可能な受容体としてβ−ガラクトシダーゼ活性を使用して、受容体と融合タンパク質との間の相互作用を調べることができる。
【００９３】
生来の遺伝子または任意の変異体、キメラ、前駆体からインビボもしくはインビトロで転写されたＲＮＡは、多くのアプリケーション、例えば、カルシウムホメオスタシスおよび細胞シグナル伝達におけるさらなる機能を研究するための成熟タンパク質、前駆体またはサブフラグメントを産生させるためのインビトロ翻訳に有用であり得る。インビトロで作製されるタンパク質のサブフラグメントは、抗体を産生させること（チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１３４１４−２１）またはリガンドまたは付随タンパク質結合部位を同定するための生化学的分析（キャラウェイ（Ｃａｌｌａｗａｙ）ら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１５８７６−８４）に対する有用性を有し得る。
【００９４】
タンパク質の配列は、受容体の特定の変異体に特異的であるか、あるいは相同性のあるそれらの領域を使用して、多くの形態の受容体に一般に交差反応するかのいずれかである抗体を設計するのに役立つ。タンパク質配列のさらなる使用は、特定のプロテアーゼによる消化を受け易い領域を同定することである。タンパク質の結合分子を伴うかまたは伴わないサブフラグメントへの消化は、これらの分子が結合する部位をマップ化することを可能にし得る。小さな有機分子の受容体結合部位の性質について理解したことを使用して、異なる多くの計算モデリングアプローチに適用し、同じ部位を標的にし、他の所望される生物学的かつ環境毒性学的活性および属性を有することができる他の小さな分子を設計し得る。
【００９５】
任意の供給源から単離された受容体は、翻訳後修飾され、プロセシングを受け、タンパク質分解により切断されて、個別であるかまたはタンパク質の本体になお会合し、なお機能的であるサブフラグメントを形成する。ゲノムＤＮＡは複数のエキソンおよびイントロンからなる可能性があるため、メッセンジャーＲＮＡの１つおきにスプライシングされたバージョンにより、１つの遺伝子が異なる受容体−イオンチャンネルタイプを産生する可能性が存在する。これらの異なるサブタイプは、カルシウムホメオスタシスにおいて異なる機能的特性を有してもよい。
【００９６】
単離された核酸フラグメントまたはその変異体は、インフェクション目的のために、プラスミド、ウイルスまたはバイナリーベクターなどであるがそれらに限定されない任意の安定なベクターへクローニングしてもよい。単離された核酸フラグメントは、構成性であるかもしくは規定の条件に応答するかのいずれかである関連する細菌、酵母、植物、卵母細胞、昆虫、または哺乳動物細胞宿主において転写および翻訳を可能にする複数のプロモーター配列に結合され得る。組換え受容体を発現するそれらの細胞の選択は、カルシウム依存的蛍光の変化（詳細については実施例９を参照のこと）、またはイオンチャンネルコンダクタンスを介して決定されるリアノジン受容体機能の変動によって同定され得、これらは、スクリーニング目的のためか、またはカルシウムホメオスタシスおよびシグナル伝達に関与する成分のさらなる研究のために使用され得る。細胞はまた、さらなる生化学的研究のための機能的受容体の供給源であり得る。そのような研究から得られる結果としては、タンパク質の分画および精製、結合ドメインの特徴付けのためのサブフラグメント分析、キメラ受容体タンパク質を形成するための異なるリアノジン受容体由来の領域をコードするドメインの交換、変更されたイオンチャンネル活性を有するアイソタイプを単離するための受容体の変異誘発、変更されたリアノジンまたはＧＮ結合を有するアイソタイプを単離するための受容体の変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
別の態様では、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１２７、１２９、１４３、および１４５よりなる群から選択される単離されたヌクレオチドフラグメントに関する。また、この単離されたヌクレオチドフラグメントの相補体も興味深い。
【００９８】
さらなる別の態様では、本発明は、少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された上記の単離された核酸フラグメントもしくはその相補体またはそのようなフラグメントの部分もしくは相補体のいずれかを含んでなる組換えＤＮＡ構築物に関する。これらのＤＮＡ構築物は、形質転換された宿主細胞におけるリアノジン受容体活性の過剰発現、アンチセンス阻害、または共抑制の目的に有用である。
【００９９】
また、ゲノム中にそのようなキメラ構築物を含んでなる真核または原核宿主細胞も興味深い。有用な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｓ２、アフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）、ＨＥＫ−２９３およびＣＨＯが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、クローニングおよび形質転換の標準的方法を使用して、バキュロウイルス自体に導入してもよい（詳細について、実施例５を参照のこと）。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株Ｓｆ９、Ｓｆ２１、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞株は、トランスフェクション研究のために使用することができる。同時トランスフェクション実験由来の上清液体を使用して、組換えウイルスおよび／または発現されたタンパク質を単離してもよい（実施例５を参照のこと）。
【０１０１】
上記の考察された手順に加えて、当業者は、高分子（例えば、ＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構築、操作および単離、組換え生物体の作製ならびにクローンのスクリーニングおよび単離のための特定の条件および手順について記載している標準的な供給源材料をよく知っている（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）；マリガ（Ｍａｌｉｇａ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９９５）；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ，１、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９８）；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ，２、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、クラーク（Ｃｌａｒｋ）編、ニューヨーク州スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９７）を参照のこと）。
【０１０２】
なおさらなる態様では、本発明は、
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６と他のイオンチャンネルおよび受容体ポリペプチド配列とを比較し；
（ｂ）工程ａにおいて得られる４もしくはそれ以上のアミノ酸の保存配列を同定し；
（ｃ）工程ｂにおいて同定される保存配列に基づいて縮重オリゴマーを設計し；そして
（ｄ）工程ｃの縮重オリゴマーを使用して、配列依存的プロトコルによって、リアノジン受容体活性を有するポリペプチドをコードする配列を単離する
ことを含んでなる、リアノジン受容体および関連ポリペプチドをコードする核酸フラグメントを単離するための方法に関する。
【０１０３】
別の態様では、本発明は、リアノジン受容体活性を有する単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６のアミノ酸配列は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有する。当業者であれば、７５％〜１００％の任意の整数の同一性パーセントがリアノジン受容体用ポリペプチド配列を同定するのに有用であることを認識するであろう。
【０１０４】
別の実施態様では、本発明は、カルシウムホメオスタシスを調整する能力について、少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）上記の組換え構築物のいずれか１つか、または配列番号５６〜６２のいずれか１つを含有する任意の組換え構築物で宿主細胞を形質転換し；
（ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ；
（ｃ）試験しようとする化合物で、工程（ａ）の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
（ｄ）カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内カルシウムホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる。
【０１０５】
本方法において、該方法はリガンド結合アッセイであることができるが、これに限定されない。さらに、本方法は、そのような細胞から得られる形質転換された宿主細胞またはイオンチャンネルの機能的活性に対する化合物の効果を検出することによって、機能的活性を評価することに基づくことができる。
【０１０６】
さらなる実施態様では、本発明は、リアノジン受容体活性を調整する少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの化合物と上記の単離された核酸フラグメントのいずれか１つによりコードされるポリペプチドとを接触させ；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、（ａ）のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる。
【０１０７】
本方法において、該方法はリガンド結合アッセイであることができるが、これに限定されない。さらに、本方法は有用であり得、ここで、ポリペプチドは１つを超える化合物と接触される。
【０１０８】
昆虫特異的配列は、すべての昆虫配列の間で保存されているが、非昆虫配列の間には認められない相同的部分配列を見出すことによって、同定することができる。これらの配列の多くは、配列番号６３〜１１９において見出すことができる。本明細書において提示する配列が特徴付けられるより以前は、キイロショウジョウバエの配列が利用可能な唯一の昆虫の配列であり、これは、動物リアノジン受容体配列に極めて低い（５０％未満の）相同性を有したため、昆虫特異的配列は同定することができなかった。
【０１０９】
本発明のさらなる実施態様は、配列番号６３〜１１９のいずれかに記載の少なくとも２つのポリペプチド配列を含んでなる昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントであるが、但し、前記ポリペプチド配列が配列番号５６、１２０〜１２６のいずれをも含まない。
【０１１０】
さらに別の実施態様は：
ａ）少なくとも１００アミノ酸を有する第１のポリペプチドをコードする単離された核酸配列を得て；
ｂ）第１のポリペプチド配列と、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択される比較ポリペプチド配列とを比較して、第１のポリペプチドと比較ポリペプチドとの間で１００％の配列同一性を有する領域を同定し、ここで、前記領域は比較ポリペプチドと同じ長さであり；そして
ｃ）異なる比較ポリペプチド配列で工程（ｂ）を反復し、ここで、前記異なる比較ポリペプチド配列は、１００％の配列同一性を有する第２の領域が見出されるまで、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択され、ここで、前記第２の領域は異なる比較ポリペプチドと同じ長さである
ことを含んでなる、昆虫イオンチャンネルをコードする核酸配列を同定するための方法であり得る。該方法は、１００〜６，０００アミノ酸の長さを有する第１のポリペプチドの長さによってさらに特徴付けられ得る。
【０１１１】
本発明のなおさらなる実施態様は：
ａ）毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメント、および／またはインフレーム翻訳停止コドンを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメント、および／またはインフレーム翻訳停止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接され；そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。削除可能な配列は、ｌｏｘ部位などであるがこれに限定されない組換え酵素によって認識される任意の配列であってもよい。
【０１１２】
本発明の関連実施態様は、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物自体を包含し得、ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメント、および／または少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンを含んでなり、さらにここで、転写終止核酸フラグメント、および／または少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接される。削除可能な配列は、ｌｏｘ部位などであるがこれに限定されない組換え酵素によって認識される任意の配列であってもよい。
【０１１３】
本発明の別の実施態様は、
ａ）毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え発現構築物で宿主を形質転換し、ここで、前記フラグメントはまた、前記フラグメントの発現を妨害するイントロンを含んでなり、そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。
【０１１４】
さらに別の実施態様では、本発明は、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え発現構築物を包含し得、ここで、前記単離された核酸フラグメントはまた、毒性昆虫イオンチャンネルの発現を妨害するイントロンを含んでなる。
【実施例】
【０１１５】
本発明を以下の実施例でさらに規定するが、ここで、別の方法で述べない限り、部および百分率は重量によるものであり、また、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示している一方で、例示的方法によってのみ示されることが理解されるべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠の特徴を確かめることが可能であり、また、その技術思想および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。従って、本明細書に示されかつ記載されている改変の他にも本発明の多様な改変が存在することは、先の記載から当業者には明らかであろう。そのような改変についても添付の請求の範囲内にあることが意図される。
【０１１６】
本明細書に掲載した各参考文献の開示内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０１１７】
実施例１
タバコガからのリアノジン受容体核酸フラグメントの単離
液体Ｎ２中で新鮮凍結し、冷却モーターにおいて粉体に粉砕した２ｇの４齢および５齢タバコガ幼虫から全ＲＮＡを抽出した。粉体を２０ｍｌのトリゾル（ＴｒｉＺＯＬ）ＴＭで、１５秒間激しく振盪し、次いで、サンプルを３０℃で３分間インキュベーションすることによって、抽出した。２ｍｌのクロロホルムを添加し、振盪およびインキュベーション処置を反復した。サンプルを１２，０００ｇで１０分間、８℃でスピンし、水相を新しいチューブに移した。５ｍｌのイソプロピルアルコールおよび１．２Ｍ ＮａＣｌを含有する５ｍｌの０．８Ｍクエン酸ナトリウムを水性画分と混合し、室温で１０分間後、サンプルに二度目の遠心分離を行った。ペレットを１０ｍｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、懸濁液を７５００ｇで５分間、再度遠心分離し、２ｍｌの水に溶解する前に、得られたペレットを乾燥させた。オリゴＴプライム化ｃＤＮＡ合成では、テンプレートとしてこの全ＲＮＡ、および添付されているプロトコルに従って、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭから購入したｃＤＮＡ合成キットを使用した。
【０１１８】
タバコガリアノジン受容体をコードする単離された核酸フラグメントを、ＰＣＲに基づくプロトコルを使用して、クローニングした（配列番号１）。コーディング領域の３’末端の最後の４０５６塩基のみが公的データベースから利用可能である。完全な転写物を獲得することは、可能な限り５’末端に近い転写物の領域に対するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを意味する。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ由来の受容体のＤＮＡ配列類似性の分析、ならびに他の哺乳動物種との比較から、この目的のために、以下の縮重プライマーを設計し、合成した：
Ａ−Ｆ１：ＣＣＴＧＡＲＧＣＮＹＴＮＡＡＹＡＴＧＡＴ （配列番号１１）
Ａ−Ｆ２：ＧＡＴＣＣＴＡＡＲＧＴＮＹＴＮＧＡＹＧＴ （配列番号１２）
Ａ−Ｆ３：ＡＡＧＴＧＧＴＡＹＴＴＹＧＡＲＴＴＹＧＡ （配列番号１３）
Ａ−Ｒ１：ＴＣＧＡＡＹＴＣＲＡＡＲＴＡＣＣＡＹＴＴＮＣＣ （配列番号１４）
Ａ−Ｒ２：ＡＡＴＧＧＹＴＣＲＴＡＮＣＣＹＴＣＹＴＧ （配列番号１５）。
【０１１９】
「Ａ」と称されるプライマーは、５’末端から約１７２２ヌクレオチド〜３７０２ヌクレオチド（配列番号１）の配列の領域を含む。順方向および逆方向プライマーのすべての組み合わせを使用して、遺伝子のこの推定領域を増幅した。４μＭのそれぞれのプライマー、ｄＮＴＰ（２００μＭ）を１μｌのｃＤＮＡと共に使用して、ＰＣＲを行い、３５サイクルのＰＣＲに供した。ＰＣＲ条件は、９４℃で１５秒間、４５℃で３０秒間および７２℃で１分間であった。予想されるサイズのフラグメントを産生したプライマーの組み合わせは、Ａ−Ｆ２／Ａ−Ｒ２およびＡ−Ｆ３／Ａ−Ｒ２であった。増幅したバンドを、１．５％アガロースゲルから精製し、キットの供給されている標準プロトコルに従って、ｐＤｒｉｖｅ（登録商標）ＴＡクローニングベクター（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＴＭ）にサブクローニングした。ＰＣＲ産物の以後の配列決定により、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ配列と比較した場合、１７２２ヌクレオチド〜３７０２ヌクレオチド（配列番号１）間の遺伝子のこの領域は、首尾よく配置されていることを確認した。
【０１２０】
類似のアプローチを使用して、ヌクレオチド２７〜１４４３の間の５’末端より外側に近い遺伝の領域を同定した。
Ｄ−Ｆ１：ＧＡＧＣＡＧＧＡＹＧＡＹＧＴＮＷＳＮＴＴ （配列番号１６）
Ｄ−Ｆ２：ＧＣＴＧＣＴＧＡＲＧＧＮＴＴＹＧＧＮＡＡ （配列番号１７）
Ｄ−Ｆ３：ＧＧＴＧＡＲＧＣＮＴＧＹＴＧＧＴＧＧＡＣ （配列番号１８）
Ｄ−Ｒ１：ＧＴＣＣＡＣＣＡＲＣＡＮＧＣＹＴＣＮＣＣ （配列番号１９）
Ｄ−Ｒ２：ＡＣＴＣＫＴＡＣＹＴＴＹＴＣＮＣＣＹＴＣ （配列番号２０）
Ｄ−Ｒ３：ＧＧＴＡＴＴＧＴＴＡＲＲＣＡＹＴＣＲＴＣ （配列番号２１）
Ｄ−Ｒ４：ＴＴＴＡＧＴＡＣＮＣＣＹＴＣＹＴＣＹＴＧＲＡＡ （配列番号２２）
【０１２１】
順方向および逆方向プライマーのほぼすべての組み合わせが初期のラウンドの増幅に関与し、推定ＰＣＲ産物を直ちに、第２の、または「ネステッド」のラウンドの増幅に供した。この場合、第１のラウンドの産物の１／１００容積を、同じサイクリング条件でテンプレートとして使用した。このアプローチを使用して、Ｄ−Ｆ１／Ｄ−Ｒ３（Ｄ−Ｆ１／Ｄ−Ｒ２で入れ子状にした）；ＤＦ２／Ｄ−Ｒ３（続いてＤ−Ｆ３／Ｄ−Ｒ３）およびＤ−Ｆ２／Ｄ−Ｒ４（続いてＤ−Ｆ３／Ｄ−Ｒ３）は、アガロースゲル上で予想されたサイズのバンドを生じた。バンドを単離し、それらの配列をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒと比較した。
【０１２２】
配列のこれらの領域は、９９％を超える単離された核酸フラグメントが、ｃＤＮＡ調製物から回収され、唯一欠けているセグメントは、５’領域のはじめの２４塩基であった。このセクションおよび完全な遺伝子を得るために、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＴＭのマラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）（登録商標）増幅キットにおける記載のように５’ＲＡＣＥ手順を使用した。
ＷＬ３：ＣＡＣＡＣＡＣＴＧＣＧＡＣＡＧＡＴＣＡＧＧＣＧＧ （配列番号２３）
ＷＬ４：ＧＣＡＡＴＡＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＧ （配列番号２４）
【０１２３】
この全長配列に基づいて、新しいプライマーを設計した：
ｐＨＶＮ３−ＰａｃＩ：ＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＧＧＡＧ （配列番号２５）
ｐＲｈＣ１−ＰｍｅＩ：ＧＧＡＣＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＴＴＣＴＣＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＴＧＣ （配列番号２６）
【０１２４】
これらのプライマーは、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）ＴＭにより供給されるエキスパンド・ロング・テンプレートＰＣＲシステム（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）（登録商標）キットのプロトコルに従って、ロングＰＣＲ反応のために使用した。２段階ＰＣＲプロトコルを使用し、第１の段階は、次の反応条件、９４℃で５分間、次いで、１０秒間、９２℃、続いて、６８℃で１４分間の１０サイクルを使用した。次の段階は、１０秒間、９２℃、続いて、６８℃で、１４分間の１５サイクルで、各サイクルごとに２０秒間ずつ延長し、それぞれ５’および３’末端にＰａｃＩおよびＰｍｅＩの独特な制限部位を有する全長の単離された核酸フラグメントを生成した。
【０１２５】
１５．６ＫｂのＤＮＡフラグメントをインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭのｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングした。Ｈ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ Ｒｙｒ転写物の完全な配列を、プラスミドおよびＰＣＲ産物を使用する標準的な配列決定方法によって得た。
【０１２６】
リアノジン受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列は、ＢＬＡＳＴ検索を行うことによっても同定することができる。（基本的局所アライメント検索ツール（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）；アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）は、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全部の非冗長ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘイブンタンパク質データバンク（ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）由来の配列、スイスプロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベースの最近の主要な発表、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）中に含有される配列に対する類似性について検索する。国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用し、「ｎｒ」データベース中に含有される公的に利用可能な全部のＤＮＡ質配列に対する類似性について、実施例１を分析した。ＤＮＡ配列を全部の読み枠で翻訳し、そして、ＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギシュＷ．（Ｇｉｓｈ，Ｗ．）およびステイテスＤ．Ｊ．（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ３：２６６−２７２）を使用して、「ｎｒ」データベース中に含有される全部の公的に利用可能なタンパク質配列に対する類似性について比較した。便宜性のため、ＢＬＡＳＴにより算出されるような単に偶然で検索されたデータベース中に含有されたある配列に対するあるｃＤＮＡ配列の合致を観察するというＰ値（確率）を本明細書では「ｐＬｏｇ」値として報告し、これは報告されたＰ値の対数の負の数を表わす。従って、ｐＬｏｇ値が大きくなるほど、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡＳＴの「ヒット」が相同なタンパク質を表わす見込みが大きくなる。
【０１２７】
実施例２
モモアカアブラムシ由来のリアノジン受容体の単離された核酸フラグメントの再構築
液体Ｎ２中で新鮮凍結し、冷却モーターにおいて粉体に粉砕した０．５ｇのモモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）または任意の同翅目種から、全ＲＮＡを抽出した。粉体を２０ｍｌのトリゾル（ＴｒｉＺＯＬ）（登録商標）で、１５秒間激しく振盪し、次いで、サンプルを３０℃で３分間インキュベーションすることによって、抽出した。２ｍｌのクロロホルムを添加し、振盪およびインキュベーション処置を反復した。サンプルを１２，０００ｇで１０分間、８℃でスピンし、水相を新しいチューブに移した。５ｍｌのイソプロピルアルコールおよび１．２Ｍ ＮａＣｌを含有する５ｍｌの０．８Ｍクエン酸ナトリウムを水性画分と混合し、室温で１０分間後、サンプルに二度目の遠心分離を行った。ペレットを１０ｍｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、懸濁液を７５００ｇで５分間、再度遠心分離し、２ｍｌの水に溶解する前に、得られたペレットを乾燥させた。
【０１２８】
タバコガ遺伝子の５’配列を首尾よく生成した順方向および逆方向プライマーの「Ｄ」組の同じ組み合わせを先に記載の通りに使用した。最も３’側の領域を獲得するための第２の組のプライマーもまた、すべての既知のリアノジン受容体配列に高い相同性のある領域から設計した。
Ｅ−Ｆ１ ＧＧＡＧＧＴＧＧＮＡＴＨＧＧＮＧＡＹＧＡ （配列番号２７）
Ｅ−Ｆ２ ＡＴＣＡＴＣＧＡＹＧＣＮＴＴＹＧＧＮＧＡ （配列番号２８）
Ｅ−Ｒ１ ＡＡＲＣＡＲＴＣＮＣＣＮＡＣＮＧＧＲＡＡ （配列番号２９）
Ｅ−Ｒ２ ＡＣＮＧＧＲＡＡＲＡＡＲＴＣＣＣＡＲＣＡ （配列番号３０）
【０１２９】
Ｄ−ＦおよびＤ−Ｒの組み合わせならびにＥ−ＦおよびＥ−Ｒの組み合わせを使用して作製されたバンドは、受容体の単離された核酸フラグメントのセグメントとして、それらの予想される起源に一致する配列を生成する。５’および３’末端より外側に対する残りの配列は、以下の５’ＲＡＣＥプライマー
Ｆ−Ｒ１：ＣＣＣＴＣＴＴＧＡＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣ （配列番号３１）
Ｆ−Ｒ２：ＣＧＴＣＣＧＧＴＧＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣ（配列番号３２）
Ｆ−Ｒ３：ＧＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣ（配列番号３３）
および３’ＲＡＣＥプライマー
Ｇ−Ｆ１：ＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧ （配列番号３４）
Ｇ−Ｆ２：ＧＣＧＧＴＡＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＧＡＣ （配列番号３５）
Ｇ−Ｆ３：ＧＴＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＣＡＣＴＣＡＣＧ （配列番号３６）
を用いる実施例１に記載のようなＲＡＣＥ手順を使用して得られる。
【０１３０】
ＲＡＣＥ産物の配列を使用して、リアノジン受容体の全長コーディング領域の開始および停止コドンの外側に、ＰｍｅＩおよびＰａｃＩの独特な制限部位を組み入れるためのプライマーを設計した。
【０１３１】
使用したプライマーは：
ｐＲｇＮ−ＰａｃＩ：ＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＴＣＧ （配列番号３７）
ｐＲｇＣ−ＰｍｅＩ：ＧＧＡＣＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＧＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＣ （配列番号３８）
であった。
従って、遺伝子の全長ｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端のＰａｃＩおよびＰｍｅＩ部位で単離した。
【０１３２】
１６ｋｂのＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングし、その後、全長リアノジン受容体コーディング領域を、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩ部位を有するベクターのＭＣＳのＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位の間が改変されたｐＩＢＶ５ＨｉｓまたはｐＦＡＳＴＢａｃへサブクローニングした（配列番号３９）。
【０１３３】
トランスポゾンとプライマーウォーキングとを併用した手順を使用して、全挿入配列決定を行った。使用したトランスポゾン系は、トランスポゾンのＴＥＴ１バージョン（ゴアリシン（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ）およびレズニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：７３６７−７３７４）を使用するエピセントレ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）ＴＭ由来のＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入キットであった。２００クローンを単離し、キットにおいて供給される順方向および逆方向プライマーを使用して３８０の配列を提供した。次いで、これらの領域からプライマーを設計し、遺伝子ウォーキングによってギャップを満たした。モモアカアブラムシ遺伝子の配列を配列番号３に示す。
【０１３４】
実施例３
ワタアブラムシおよびトウモロコシウンカ由来のリアノジン受容体の単離された核酸フラグメントの再構築
ワタアブラムシおよびトウモロコシウンカ由来のリアノジン受容体コーディング領域のｃＤＮＡは、本質的に実施例２に記載の通りに得た。実施例１において使用した同じＤプライマーの組および実施例２において使用したＥプライマーの組は、２種の同翅目種に対するほぼ全長配列を生成した。以下のプライマーを、ＲＡＣＥシリーズの実験に使用して、リアノジン受容体コーディング領域の５’および３’末端の配列を生成した。ワタアブラムシについて、使用した５’ＲＡＣＥプライマーは、
ＣＭＡ−ＤＲ１：ＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＡＧＴＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣ （配列番号４０）
ＣＭＡ−ＤＲ２：ＣＡＡＴＧＴＴＣＧＧＴＧＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＣ （配列番号４１）
ＣＭＡ−ＤＲ３：ＧＡＣＧＧＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＴＣＧＧＧＴＧＧ（配列番号４２）
であり、３’ＲＡＣＥプライマーは、
ＣＭＡ−ＥＦ１：ＣＴＧＣＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＧ（配列番号４３）
ＣＭＡ−ＥＦ２：ＣＣＧＣＡＣＧＧＴＴＴＴＧＡＣＡＣＧＣＡＣＧＴＴＣ （配列番号４４）
ＣＭＡ−ＥＦ３：ＣＣＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＧＴＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＣ（配列番号４５）
であった。
トウモロコシウンカについて、５’ＲＡＣＥプライマーは、
ＣＰＨ−ＤＲ１：ＣＣＧＡＡＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＡＡＣＡＣ （配列番号４６）
ＣＰＨ−ＤＲ２：ＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＡＣＣ （配列番号４７）
ＣＰＨ−ＤＲ３：ＣＧＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣ（配列番号４８）
であり、３’ ＲＡＣＥプライマーは、
ＣＰＨ−ＥＦ１：ＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＴＧＧＣ （配列番号４９）
ＣＰＨ−ＥＦ２：ＧＴＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＡＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣ （配列番号５０）
ＣＰＨ−ＥＦ３：ＧＣＡＴＡＡＴＣＴＣＧＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣ（配列番号５１）
であった。
【０１３５】
ワタアブラムシのリアノジン受容体コーディング領域の末端にＰａｃＩおよびＰｍｅ部位を組み入れるために設計したプライマーの配列は以下の通り：
ｐＲＣＭＡＮ−ＰａｃＩ：ＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴＣＧ （配列番号５２）
ｐＲＣＭＡＣ−ＰｍｅＩ：ＧＡＡＣＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＧＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＣ （配列番号５３）
であり、トウモロコシウンカのリアノジン受容体コーディング領域の末端にＰａｃＩおよびＰｍｅ部位を組み入れるために設計したそれらは以下の通りである：
ｐＲＣＰＨＮ−ＰａｃＩ：ＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＡＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧ （配列番号５４）
ｐＲＣＰＨＣ−ＰｍｅＩ：ＧＡＡＧＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＴＡＡＣＴＣＡＴＣ （配列番号５５）。
【０１３６】
両方の全長リアノジン受容体コーディング領域を再度、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭ）にクローニングし、その後、実施例２に記載のように、改変されたｐＩＢＶ５ＨｉｓまたはｐＦＡＳＴＢａｃへサブクローニングした。
【０１３７】
リアノジン受容体コーディング領域の配列を完了するために、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにおける挿入物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素の混合物で消化した。次いで、フラグメントを、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩまたはこれらの両方を組み合わせて消化した、３つのｐＢｌｕＳｃｒｉｐｔ ＫＳベクターへサブクローニングした。ベクターを、リアノジン受容体コーディング領域サブフラグメントの混合物の存在下で再連結した。ＣＭＡおよびＣＰＨリアノジン受容体コーディング領域のそれぞれについて、約４０個の個々のクローンを個々の細菌コロニーから単離し、挿入物を、ベクタープライマーを使用して、配列決定した。配列に残っていたギャップを、遺伝子ウォーキングによって満たした。
【０１３８】
実施例４
リアノジン受容体をコードするｃＤＮＡクローンの特徴付け
表３に列挙したクローンからのＥＳＴ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、当該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＮＣＢＩ一般識別番号（ＧｅｎｅｒａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１７３５２４７１、［配列番号５６］由来のリアノジン受容体タンパク質に対する類似性を示した。個々のＥＳＴについてのＢＬＡＳＴの結果（「ＥＳＴ」）、示されたｃＤＮＡクローンを含んでなるｃＤＮＡ挿入物全体の配列（「ＦＩＳ」）、２種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ」）、ＦＩＳおよび１種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ＊」）、またはＦＩＳ、コンティグもしくはＦＩＳおよびＰＣＲ由来のタンパク質全体をコードする配列（「ＣＧＳ」）を表３に示す。
【０１３９】
【表２】
【０１４０】
表４のデータは、配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６に記載のアミノ酸配列と、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＮＣＢＩ一般識別番号（ＧｅｎｅｒａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１７３５２４７１、［配列番号５６］由来のリアノジン受容体タンパク質との同一性パーセントの計算を示す。
【０１４１】
【表３】
【０１４２】
配列のアライメントおよびパーセント同一性の計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施した。配列のマルチプルアライメントは、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用い、アライメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して実施する。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用するペアワイズアライメントのためのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＬＡＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。大きなタンパク質配列では、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗプログラム（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら（１９９４）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：４６７３−４６８０）を使用した。デフォルトのパラメータを使用した（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、ＤＥＬＡＹ ＤＩＶＥＲＧＥＮＴ ＳＥＱ （％）＝３０、ＤＮＡ ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮ ＷＥＩＧＨＴ＝０．５０、ＰＲＯＴＥＩＮ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ）。ペアワイズアライメントもまた、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１０、ＰＲＯＴＥＩＮ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：Ｇｏｎｎｅｔ ２５０、ＤＮＡ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ）を使用した。配列のアライメント、ならびにＢＬＡＳＴスコアおよび確率は、本ｃＤＮＡクローンを含んでなる核酸フラグメントがリアノジン受容体タンパク質の実質的な部分をコードすることを示す。
【０１４３】
図１は、本明細書において開示された方法によって作製されたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）配列（配列番号１０）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｒｔ配列（ＮＣＢＩ一般識別番号（ＧｅｎｅｒａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１７３５２４７１、配列番号５６）、部分的リアノジン受容体をコードする蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）ゲノム配列決定プロジェクト由来の未注釈配列（ｇｉ２１３０１５５６、配列番号５７）、線虫由来のリアノジン受容体（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、ｇｉ１８７１４４７、配列番号５８）、ウニ（Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ、ｇｉ１８６５６１５５、配列番号５９）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ｇｉ１３５６９８５０、配列番号６０）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ｇｉ１２４５３７６、配列番号６１）、およびヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ｇｉ４５０６７５７、配列番号６２）に対するタバコガ、モモアカアブラムシ、ワタアブラムシ、およびトウモロコシウンカ（配列番号２、１２８、１３０、１４４および１４６、４、６、および８）のクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗを使用したアライメントを示す。昆虫特異的配列は、すべての昆虫配列の間で保存されているが、非昆虫配列の間には認められない相同的部分配列を見出すことによって、同定することができる。これらの配列の多くは、配列番号６３〜１１９において見出すことができる。本明細書において提示する配列が特徴付けられるより以前は、キイロショウジョウバエの配列が利用可能な唯一の昆虫の配列であり、これは、動物リアノジン受容体配列に極めて低い（５０％未満の）相同性を有したため、昆虫特異的配列は同定することができなかった。
【０１４４】
表５は、図１に示したリアノジン受容体配列のついにした比較に対する同一性パーセントを示す。
【０１４５】
【表４】
【０１４６】
実施例５
昆虫細胞株におけるリアノジン組換え構築物の一過的発現
異なる昆虫由来のリアノジン受容体をコードするｃＤＮＡを、それぞれ、実施例２に記載のように、ｐＩＢＶ５ＨｉｓまたはｐＦＡＳＴＢａｃにクローニングした。しかし、当業者であれば、真核細胞に感染させるための他の多様なベクターおよび手段が存在することを理解するであろう。特に、昆虫細胞インフェクションのためのバキュロウイルスに基づく系は有用であり、いずれの系も活性型の受容体タンパク質の完全な発現および修飾を可能にする。
【０１４７】
トランスフェクション研究のために使用したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株Ｓｆ９を、２７℃でインキュベートしたＴ−７５フラスコ中Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））において維持した。当業者であれば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株Ｓｆ２１またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株Ｓ２などの代替的細胞タイプを選択し得る。一般的取り扱いおよび増殖の目的のために、削り取りまたは振盪を介して細胞を懸濁し、細胞懸濁液のある容積をポリ−Ｌ−リジンで被覆した９６ウェルガラス底プレートの各ウェルに、７０〜８０％のコンフルエンスを提供するように、添加した。試験時まで、細胞をインキュベーターにおいて２７℃で維持した。
【０１４８】
Ｓｆ−９細胞を、２７℃で、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）１２５ｍｌポリカーボネート三角フラスコ中、ＳＦ９００−ＩＩ無血清培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号１０９０２−０８８、インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の１ｍｌあたり３１０万個細胞の密度まで増殖させた。１００万個の細胞を、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）６ウェル平底細胞培養ディッシュ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）３５１６）の１つのウェルに移した。ＳＦ９００−ＩＩ培地を使用して、ディッシュ内の最終容積を２ｍｌとし、細胞を２７℃で２１時間、インキュベートした。インキュベーション後、培地をディッシュから吸引し、予め２７℃に加温しておいた１ｍｌのＳＦ９００−ＩＩ培地で置き換えた。
【０１４９】
インセクトセレクトＢＳＤシステム（ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ ＢＳＤ Ｓｙｓｔｅｍ）マニュアル（インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に従って、一過的トランスフェクションを行った。セルフェクチン（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）試薬（インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、カタログ番号１０３６２−０１０）およびＳＦ９００−ＩＩ無血清培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号１０９０２−０８８、インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））をすべてのトランスフェクションに使用した。トランスフェクションは、トランスフェクション溶液を滴下で、ディッシュに添加し、４時間、室温で、緩徐に振盪しながらインキュベートすることによって、達成した。４時間のインキュベーション後、培地を、予め２７℃に加温しておいた２ｍｌのＳＦ９００−ＩＩ培地で置き換え、細胞を、試験の前に、２〜３日間、２７℃でインキュベートした。
【０１５０】
実施例６
微生物細胞におけるキメラ遺伝子の発現
本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡをＴ７大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＢＴ４３０に挿入することが可能である。本ベクターは、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーター系を使用するｐＥＴ−３ａ（ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３５）の一誘導体である。プラスミドｐＢＴ４３０は、最初に、それらの元の位置のｐＥＴ−３ａ中のＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を破壊することにより構築した。ＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を含有するオリゴヌクレオチドアダプターをｐＥＴ−３ａのＢａｍＨ Ｉ部位に挿入した。これは、該発現ベクターへの遺伝子の挿入のための付加的な独特なクローニング部位を持つｐＥＴ−３ａＭを創製した。次いで、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用して、翻訳開始の位置のＮｄｅＩ部位をＮｃｏＩ部位に変換した。この領域中のｐＥＴ−３ａＭのＤＮＡ配列５’−ＣＡＴＡＴＧＧを、ｐＢＴ４３０中の５’−ＣＣＣＡＴＧＧに変換した。
【０１５１】
ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを適切に消化して、該タンパク質をコードする核酸フラグメントを遊離させることができる。次いで、１％ヌシーブＧＴＧ（ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ）ＴＭ低溶融アガロースゲル（ＦＭＣ、ペンシルバニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ））上でこのフラグメントを精製してよい。緩衝液およびアガロースは、ＤＮＡフラグメントの可視化のため１０μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する。次いで、製造元の説明書に従ったジェラース（ＧＥＬａｓｅ）ＴＭ（エピセントレ・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））での消化により、該フラグメントをアガロースゲルから精製し、エタノール沈殿し、乾燥しそして２０μＬの水に再懸濁することが可能である。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（ＮＥＢ）、マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を使用して、適切なオリゴヌクレオチドアダプターを該フラグメントに連結してよい。連結されたアダプターを含有する該フラグメントは、上述されたとおり低溶融アガロースを使用して過剰のアダプターから精製することが可能である。ベクターｐＢＴ４３０は、上述された通り消化し、アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）で脱リン酸化し、そしてフェノール／クロロホルムでタンパク質を除去する。調製されたベクターｐＢＴ４３０およびフラグメントをその後、１６℃で１５時間連結し、次いでＤＨ５エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に形質転換することが可能である。形質転換体は、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する寒天プレート上で選択することができる。次いで、本ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する形質転換体を、制限酵素分析によりＴ７プロモーターに関して正しい配向についてスクリーニングする。
【０１５２】
高レベル発現のためには、Ｔ７プロモーターに関して正しい配向のｃＤＮＡ挿入物をもつプラスミドクローンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換することが可能である（スタディヤー（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら（１９８６）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。培養物は、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培地中で２５℃で増殖させる。およそ１の６００ｎｍの至適密度で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、誘導物質）を０．４ｍＭの最終濃度まで添加することが可能であり、そして、インキュベーションを２５℃で３時間継続することが可能である。次いで、遠心分離により細胞を収穫し、そして、０．１ｍＭのＤＴＴおよび０．２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する５０μＬのｐＨ８．０の５０ｍＭトリス−ＨＣｌに再懸濁する。少量の１ｍｍガラスビーズを添加し、そして微小プローブ超音波処理装置（ｍｉｃｒｏｐｒｏｂｅ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて混合物を各回約５秒間３回超音波処理することが可能である。該混合物を遠心分離し、そして上清のタンパク質濃度を測定する。培養物の可溶性画分からの１μｇのタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離することが可能である。ゲルを、期待される分子量で移動するタンパク質のバンドについて観察することができる。明らかに、当業者であれば、他の細菌発現ベクター、特に、ｃＤＮＡ挿入物をインフレームで融合した場合、組換えタンパク質のＮまたはＣ末端のいずれかでＨｉｓタグ、ＭＢＰまたはＧＳＴ伸張のような精製を援助することができるポリペプチドの伸張を提供する配列の様々な選択を付与するベクターを選択し得る。
【０１５３】
ｃＤＮＡ挿入物は、酵母細胞において発現させることもできる。酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））株ＹＰＨ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））においてコードされるポリペプチドの発現およびリアノジン感受性カルシウム輸送のための膜成分をアッセイすることによって、リアノジン受容体ポリペプチドを評価することができる。任意のｃＤＮＡクローン由来のプラスミドＤＮＡ（２００ｎｇ）を、本発明において記載のプライマーを使用して、ＰＣＲのためのテンプレートとして使用することができる。増幅は、１Ｍ最終濃度のＧＣメルト（ｍｅｌｔ）試薬を伴うＧＣメルト（ｍｅｌｔ）キット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して、実施する。増幅は、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）９７００サーモサイクラーにおいて、３０サイクルを以下の通りに行った：９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で２分間。次いで、増幅させた挿入物を、適切な制限酵素で消化されている改変されたｐＲＳ３１５プラスミド（ＮＣＢＩ一般識別番号（ＧｅｎｅｒａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）９８４７９８；シコースキー、Ｒ．Ｓ．（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．）およびヒーター、Ｐ．（Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．）（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２：１９−２７）と共にインキュベートする。プラスミドｐＲＳ３１５はＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間への両方向性ｇａｌ１／１０プロモーターの挿入によって、予め改変されている。次いで、挿入物がギャップ修復を介して再結合し、所望の形質転換された酵母株を形成する標準的な手順（ホア、Ｓ．Ｂ．（Ｈｕａ，Ｓ．Ｂ．）ら（１９９７）Ｐｌａｓｍｉｄ３８：９１−９６．）を使用して、プラスミドをＹＰＨ酵母株へ形質転換する。
【０１５４】
酵母細胞は、ポンポン（Ｐｏｍｐｏｎ）ら（ポンポン、Ｄ．（Ｐｏｍｐｏｎ，Ｄ．）ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．２７２：５１−６４）の方法の改変に従って、調製される。簡単に説明すると、酵母のコロニーは、１晩（飽和まで）、ＳＧ（−ロイシン）培地中３０℃で、良好な通気を伴い増殖される。この培養物の１：５０希釈液を、アデニンを補充した５００ｍＬのＹＰＧＥ培地中に作製し、３０℃で、良好な通気を伴い、１．６のＯＤ６００まで（２４〜３０時間）増殖させる。５０ｍＬの２０％ガラクトースを添加し、培養物を１晩、３０℃で増殖させる。細胞を、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＧＳ−３ローター中５，５００ｒｐｍで、５分間の遠心分離によって、回収する。細胞ペレットを５００ｍＬの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁し、次いで、３０℃で、さらに２４時間増殖させる。
【０１５５】
上記の遠心分離によって細胞を回収し、実施例９、１０、または１１において概説したアッセイのいずれかを使用して、リアノジン受容体活性の存在を決定する。
【０１５６】
実施例７
昆虫細胞におけるＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、および他のＲｙｒ ｃＤＮＡは、昆虫発現ベクター（例えば、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の制御下でベクター内に設置した場合、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対し、かなり毒性であるようである。これらの条件下、細胞は極めて緩徐に増殖し、フレームシフト変異が自発的に導入される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＲｙｒ遺伝子の任意の発現を完全に除去する２つのクローニングストラテジーは、増殖の問題を回避し得る。
【０１５７】
第１のストラテジーでは、昆虫アクチンプロモーターの制御下にＲｙｒ遺伝子を配置する改変されたｐＸＩＮＳＥＣＴ−ＤＥＳＴ３９ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へＲｙｒ遺伝子をクローニングする。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の増殖中におけるＲｙｒ遺伝子のリーキーな発現を除去するために、ベクターのＨｉｓタグのちょうど下流（但し、Ｒｙｒ遺伝子の上流）に「停止」フラグメントを配置した。この停止フラグメントは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ｒｒｎＢ遺伝子（オロス（Ｏｒｏｓｚ）ら（１９９１）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１：６５３−６５９）由来の強力な転写ターミネーターＴ１Ｔ２を含有する。ベクターのイニシエーターＡＴＧを伴うフレーム内の停止コドンもまたこの停止フラグメント内に存在する。Ｃｒｅ酵素の存在下で、停止フラグメント全体がベクターから切り出されて、単一のＬｏｘ部位の「フットプリント」を残すような直接的配向で、Ｌｏｘ部位が停止フラグメントに隣接している（オデル（Ｏｄｅｌｌ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（１９９４）Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｐｌａｎｔｓ；Ｊ．パスクロスキー（Ｊ．Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）；２１９〜２７０頁）。停止フラグメントのＣｒｅ仲介切り出しの後に、Ｒｙｒ遺伝子がイニシエーターＡＴＧと共にフレーム内に存在し、ＡＴＧとＲｙｒ遺伝子との間に停止コドンが存在しないように、停止ベクターを設計した。ベクター由来のＡＴＧ、Ｈｉｓタグ、およびａｔｔＢ１ならびに残留Ｌｏｘフットプリントおよび関連リンカー配列の組み合わせは、５３外来アミノ酸を成熟Ｒｙｒ遺伝子産物に付加する。ｐＨＥ７ベクターの構築については、図７において概説する。
【０１５８】
インビトロゲン・ゲートウェイ・エントリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ Ｅｎｔｒｙ）ＴＭベクターｐＥｎｔｒ２Ｂ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を改変して、ポリリンカーにＰｖｕＩ部位を追加した。ｐＥｎｔｒ２Ｂを、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化した。オリゴヌクレオチド、配列番号１３１（５’−ｇａｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｔｃｇｇｔａｃｃ−３’）および配列番号１３２（５’−ｃｇａｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇ −３’）をアニールし、消化したベクターに連結させて、ｐＥｎｔｒ２Ｂ／ＰｖｕＩを生成した。ｐＸＬＨｖ７由来のＨＶ Ｒｙｒ遺伝子を、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩで消化した。ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩをＰｖｕＩで部分消化し（ｐＥｎｔｒ２Ｂ／ＰｖｕＩには第２の部位が存在する）、ＥｃｏＲＶで完全に消化し、正確なフラグメントをゲル精製した。ＲｙｒフラグメントのＰａｃＩ粘着末端は、ＰｖｕＩ粘着末端に適合し、ＰｍｅＩおよびＥｃｏＲＶ末端は、両方とも平滑である。次いで、ｐＸＬＨｖ７由来の１５．４ｋｂのＲｙｒ遺伝子フラグメントを、ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩに連結して、ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩ／ＨＶ７を作製した。
【０１５９】
６つのオリゴヌクレオチド、配列番号１３３〜配列番号１３８をアニールすることによって、停止フラグメントを作製し、次いで、プライマー配列番号１３９（５’−ｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｇｃｇｃｔａ−３’）および配列番号１４０（５’−ｇａｇａｇａｇａｇｔｔｔａａａｔａａ−３’）を使用して、ＰＣＲ増幅を行った。得られた産物をＡｆｅＩおよびＤｒａＩで消化して、平滑末端を生成させ、ｐＸＩＮＳＥＣＴ−ＤＥＳＴ３９の独特なＡｆｅＩ部位に連結して、ｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸを生成した。
【０１６０】
ｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸを使用する代わりに、ｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸ由来の停止フラグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングして、ｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸを生成した。ｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸおよびｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸは機能的に類似であり、両方ともＣｒｅによって、取り出すことができる停止フラグメントを有する。１つの違いは、昆虫細胞においてＲｙｒ遺伝子の転写を制御するプロモーターがｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸではアクチンプロモーターであるが、ｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸではＯｐＩＥ２プロモーターであることである。また、ｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸは、安定にトランスフェクトされた細胞を選択させるブラスチシジン遺伝子を含有する。
【０１６１】
ヤガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）リアノジン受容体ｃＤＮＡを、製造者の推奨に従い、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のクロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）ＬＲ反応を使用して、ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩ／ＨＶ７からｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸへ移し、ｐＨＥ７を生成した。製造者の推奨に従うｐＨＥ７のＣｒｅ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））とのインビトロ反応は、正確に停止フラグメントを切り出し、後に予想されたとおりのＬｏｘフットプリントを残した。
【０１６２】
標的昆虫細胞におけるｐＨＥ７の停止フラグメントの切り出しは、それらを、Ｃｒｅの供給源としてｐＭＬＳ１０４（シーガル（Ｓｉｅｇａｌ）およびハートル（Ｈａｒｔｌ）（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４４：７１５−７２６）でＳＦ９細胞に同時トランスフェクトすることによって、達成した。代替的アプローチとして、ｐＨＥ７をＣｒｅ酵素と共にインビトロでインキュベートすることにより、停止フラグメントのＣｒｅ仲介切り出しを行った。これらの場合、ｐＭＬＳ１０４プラスミドは、ｐＨＥ７プラスミドでは同時トランスフェクトされなかった。Ｃｒｅ反応の条件は、クリエーターＤＮＡ（Ｃｒｅａｔｏｒ ＤＮＡ）クローニング・キット（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、クロンテック・プロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）ＰＴ３４６０−１）から採用した。それぞれ２５０ｎｇのｐＨＥ７プラスミドに対し、１００ｎｇのＣｒｅ組換え酵素（クロンテック・ラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）ＴＭ、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、カタログ番号８４８０−１）を１５分間の室温反応において使用した。反応は、１×Ｃｒｅ反応緩衝液およびクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＴＭから購入したＣｒｅ組換え酵素を供給した１×ＢＳＡを含んだ。１５分間の反応後、酵素を、７０℃で５分間の熱処理により変性させた。独特ではない（ｎｏｎ−ｕｎｉｑｕｅ）制限部位に対し若干の変更を加えることにより、ｐＨＥ７について記載のＣｒｅ認識エレメントの構成を有するが、ｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸにおいてＯｐＩＥ２プロモーターに融合された他の４つのＨｖクローン（ｐＨＩ２、ｐＨＩ３、ｐＨＩ６、ｐＨＩ７）を構築した。
【０１６３】
第２のアプローチでは、大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）におけるＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ Ｒｙｒの発現の毒性は、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））などの改変された昆虫発現ベクターを使用して、克服した。イントロンフラグメントは、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓゲノムＤＮＡ由来のプライマー（順方向プライマー：配列番号１４７、５’−ｃａｇｔａａａｇｃｔｔｇａｇｔｃａｔｇｇａａａｔｔｔａｇａｃ−３’；逆方向プライマー：配列番号１４８、５’−ｔｃｔｇｇａｔｃｃｔｇｇｔｔｔｇｇａａａａｔｇｇｇｇａ−３’）で増幅した。精製されたＰＣＲ産物をｐＩＢベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入した。改変されたベクターのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認し、ｐＸＬＨｖ７からＲｙｒ遺伝子を切り出し、イントロンの後方に挿入し（配列番号１４９）、ベクターｐＩＢｉＨｖ７を生成した。
【０１６４】
トランスフェクションプロトコル
すべての試薬、実験着衣および技術は、トランスフェクションの間中、無菌のものであった。プラスミドは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＴＭプラスミド・ミディ・プレップ・キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＴＭ、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、カタログ番号１２１４３）
【０１６５】
ＳＦ９細胞を、２７℃で、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）１２５ｍｌポリカーボネート三角フラスコ中、ＳＦ９００−ＩＩ無血清培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号１０９０２−０８８、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の１ｍｌあたり３１０万個細胞の密度まで増殖させた。１００万個の細胞を、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）６ウェル平底細胞培養ディッシュ（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州アクトン（Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）、カタログ番号３５１６）の１つのウェルに移した。ＳＦ９００−ＩＩ培地を使用して、ディッシュ内の最終容積を２ｍｌとし、細胞を２７℃で２１時間、インキュベートした。インキュベーション後、培地をディッシュから吸引し、予め２７℃に加温しておいた１ｍｌのＳＦ９００−ＩＩ培地で置き換えた。
【０１６６】
Ｃｒｅ認識エレメントを含有するベクターの場合、５μｇのｐＨＥ７プラスミド、５μｇのｐＭＬＳ１０４ Ｃｒｅプラスミドおよび０．５μｇのｌａｃＺレポータープラスミド、１５μｇのセルフェクチン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）試薬（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１０３６２−０１０）およびＳＦ９００−ＩＩ無血清培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号１０９０２−０８８、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を、５００μｌの全容積で合わせることによって、トランスフェクション溶液を１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブ中で混合した。溶液は、トランスフェクションのちょうど前に、１時間、室温でインキュベートした。
【０１６７】
トランスフェクション溶液をディッシュに滴下して、緩徐に振盪しながら４時間、室温でインキュベートすることによって、トランスフェクションを達成した。４時間後、培地を、予め２７℃に加温しておいた２ｍｌのＳＦ９００−ＩＩ培地で置き換え、細胞を３日間、２７℃でインキュベートした。
【０１６８】
Ｒｙｒ ｃＤＮＡの機能的発現は、実施例９に記載のように、すべてのクローン（ｐＨＥ７、ｐＨＩ２、ｐＨＩ３、ｐＨＩ６、またはｐＨＩ７）について観察された。ｐＨＩ７およびｐＨＥ７から観察される機能的発現の間に識別可能な差異は認められなかった。
【０１６９】
当業者であれば理解できるように、本明細書に記載の系に匹敵し得るいくらかの削除系を使用することができる。削除系の例として、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、Ｆｌｐ／Ｆｒｔ、クロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）ＴＭ／Ａｔｔ、Ｇｉｎ／Ｇｉｘ、およびＲ／ＲＳ（それぞれ、オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９９０）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２３：３６９−３７８；ライズニック（Ｌｙｚｎｉｋ）ら（１９９３）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１：９６９−９７５；インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ；マエサー（Ｍａｅｓｅｒ）およびカーマン（Ｋａｈｍａｎｎ）（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３０：１７０−１７６；ならびにオノウチ（Ｏｎｏｕｃｈｉ）ら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：６３７３−６３７８）が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらは、第２のストラテジーに記載の配列（配列番号．．．．）とは異なるゲノムＤＮＡ由来のイントロン配列の導入に基づく均質な削除系を含み得る。
【０１７０】
当業者であれば理解できるように、削除系によって結合されたいくらかのフラグメントを使用して、本明細書に記載のものに等価な宿主細胞における発現を除去またはダウンレギュレートすることができる。そのようなフラグメントの例として、転写ターミネーター、Ｒｙｒコーディング配列と共にフレーム内にある停止コドン、転写リプレッサーによって認識されるオペレーター、翻訳アテニュエーター、およびアンチセンスまたは共抑制構築物に相互作用する配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
当業者であれば理解できるように、停止フラグメントは、本明細書に記載のものに等価なＲｙｒ ｃＤＮＡにおける異なる多くの位置に挿入することができる。適切な位置の例としては、遺伝子のプロモーターの上流、５’非翻訳リーダー、コーディング配列内、および３’非翻訳領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
実施例８
昆虫細胞におけるＲｙｒ ｃＤＮＡの発現
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ｐＩＢ４３Ｄ、配列番号９）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）（ｐＩＢ−ＧＡＰ７−１、配列番号３）、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（ｐＩＢ−ＣＭＡ４−３、配列番号５）、およびトウモロコシウンカ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ）（ｐＸＬ−ＣＰＨ９、配列番号７）由来のＲｙｒ ｃＤＮＡを、実施例７に記載のＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ由来のｃＤＮＡと同じ方法で、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ発現系に導入する。ｃＤＮＡは、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩでの消化によって、ベクターから放出させる。場合により、ｃＤＮＡに内部ＰｍｅＩが存在し、これらの場合、部分的ＰｍｅＩおよび完全ＰａｃＩ消化を実施して、全長ｃＤＮＡに対応するフラグメントをゲル精製する。ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩをＰｖｕＩで部分消化し（ｐＥｎｔｒ２Ｂ／ＰｖｕＩには第２の部位が存在する）、ＥｃｏＲＶで完全に消化し、正確なフラグメントをゲル精製した。ＲｙｒフラグメントのＰａｃＩ粘着末端は、ＰｖｕＩ粘着末端に適合し、ＰｍｅＩおよびＥｃｏＲＶ末端は、両方とも平滑である。次いで、Ｒｙｒ遺伝子を、ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩに連結して、ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩにそれぞれのｃＤＮＡを挿入する。
【０１７３】
製造者の推奨に従い、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のクロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）ＬＲ反応により、ｃＤＮＡをｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩからｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸまたはｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸへ移す。これらの発現ベクターを、ｐＭＬＳ１０４との組み合わせか、またはインビトロでのＣｒｅとの反応後に実施例７に記載のプロトコルを使用するかのいずれかで、ＳＦ９細胞に移し、Ｒｙｒの活性を実施例９〜１１に記載のように、アッセイする。
【０１７４】
同様に、当業者であれば、任意の供給源、昆虫またはそれ以外からＲｙｒ遺伝子を切り出し、イントロンを使用して、昆虫細胞によって認識され、細胞の正常なＲＮＡプロセシング装置によって切り出される細菌宿主における毒性遺伝子の任意の発現を終止するという点で第２のアプローチの概念を満足するベクターに連結させることが可能であり得る。細胞のトランスフェクションは、実施例５に記載のように達成され得る。
【０１７５】
実施例９
カルシウム放出アッセイ
主な昆虫細胞を使用するカルシウム画像化および取り込みプロトコル：
ビードル（Ｂｅａｄｌｅ）およびリーズ（Ｌｅｅｓ）（１９８８）（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１２３−１２７頁）の方法に従い、若干の変更を加えて、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）の胚ニューロン培養を確立した。簡単に説明すると、２６〜２７齢の卵鞘を回収し、表面を滅菌し、背中線の下から３分の１の距離から線に沿って切開した。頭部を取り出し、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に配置した。精巧なピンセットを使用して、４０個の脳を個々に取り出し、７００μｌの「５＋４」培地（「５＋４」培地は５部のシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地＋４部のゴキブリ規定培地イーグル（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）（アール（Ｅａｒｌｅ）の塩を有する）（ＢＭＥ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）ＴＭ、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有した）を含有する小さなガラスバイアルに配置した。ローチＢＭＥ（Ｒｏａｃｈ ＢＭＥ）（アール（Ｅａｒｌｅ）の塩を有する）は、５部のヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（１Ｍ）、１部のペニシリン／ストレプトマイシンおよび４４部のＢＭＥ（アール（Ｅａｒｌｅ）の塩を有する）を含有した。「５＋４」培地を新たに作製し、使用前に滅菌濾過（０．２μｍフィルター）した。脳は、連続粉砕装置により以下のように分離した：１）脳を標準的なパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペットで１０回通過させた；２）得られた組織懸濁液を、本来の直径の約半分にまで先端を火炎加工したパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペットでさらに５回通過させた；３）最後の５回は、本来の直径の半分よりわずかに小さくなるように先端を火炎加工したパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペットを使用して、実施した。反復ピペッターを使用して、得られた懸濁液の５μｌ容積を、予めポリ−Ｌ−リジン（０．２ｍｇ／ｍｌ溶液）で被覆した９６ウェルガラス底プレートの各ウェルの中心に分配した。２７〜２９℃で５０分間のインキュベーション中にウェルの底に細胞を付着させた。レイボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）のＬ−１５培地およびユンケル（Ｙｕｎｋｅｒ）の改変グレース（Ｇｒａｃｅ）の培地の１：１混合物の１５０μｌを添加し、使用するまでプレートを湿式インキュベーター中、２７〜２９℃で維持した。細胞を付着させた後、ウェルをレイボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）のＬ−１５培地およびユンケル（Ｙｕｎｋｅｒ）の改変グレース（Ｇｒａｃｅ）の培地の１：１混合物で満たした（レイボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）のＬ−１５培地およびグレース（Ｇｒａｃｅ）の培地は、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得、ユンケル（Ｙｕｎｋｅｒ）の改変グレース（Ｇｒａｃｅ）の培地は、５ｍｇのＬ−メチオニン、１０ｍｇのＬ−アラニン、１８２ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１ｇのアルブミン画分Ｖ、７ｍｌのウシ胎児血清、１０ｍｌのニワトリ胚抽出物、２ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および２ｍｇの２０−ヒドロキシエクジソン（添加前にエタノール中で調製）を１００ｍｌの最終容積で添加し、滅菌濾過（０．２μｍフィルター）することによって改変したグレース（Ｇｒａｃｅ）の培地によって作製した）。細胞は、試験時まで、高湿度インキュベーター中、２９℃で維持した。
【０１７６】
ゴキブリ神経細胞を使用するカルシウム画像化および取り込みプロトコルは以下の通りである：
細胞を、次の組成（ｍＭ）：ＮａＣｌ １９０；ＣａＣｌ２ ９；ＫＣｌ ３．１；プロベネシッド １；トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液 １０；ｐＨ７．２を有する標準的な生理食塩水で濯いだ。次いで、細胞を、カルシウム感受性フルオロプローブＦｌｕｏ−４ＡＭ（ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｂｅ Ｆｌｕｏ−４ ＡＭ）（２μＭ）およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７（０．００２％）を含有する標準的な生理食塩水中、４５分間、浴槽に置いた。次いで、細胞は試験前の少なくとも１５分間、標準的な生理食塩水で濯いだ。試験前の時間内に、標準的な生理食塩水を、有機カチオンチャンネルブロッカーのピモジド（１０μＭ）を含有する標準的な生理食塩水で置き換えて、電位依存性カルシウムチャンネルを介する外部カルシウムのカルシウムの流入を阻害した。９６ウェルプレートを、ニコン・ディアフォト（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ）顕微鏡上に装架したプライアー（Ｐｒｉｏｒ）ＴＭ電動ステージ上に配置し、２０×フルオアー（Ｆｌｕｏｒ）対物レンズ（ＮＡ ０．７５）を使用して、画像撮影した。９６ウェルプレート由来の個々のウェルを、連続的に４９５ｎｍの光で励起し、５３０ｎｍで放射した蛍光を、２ピクセルビニング（画像サイズ６７２×５１２ピクセル）を有するハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）ＯＲＣＡ ＥＲデジタルカメラを使用して、検出した。
【０１７７】
ユニバーサル・イメージング・コーポレーション（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のメタモルフ（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）ＴＭ画像ソフトウェア（ユニバーサル・イメージング（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ）、ペンシルバニア州ウエストチェスター（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））を使用して、取り込みコントロール、画像処理および画像解析を行った。各ウェルについて、一連の３枚の「コントロール」画像を取り込んだ。実験化合物を添加し、続いて、各ウェルについて４枚の「実験」画像を取り込んだ。最後に、ポジティブコントロール化合物（表７のグループ２由来のＧＮ類似体）を添加し、各ウェルについて２枚の「標準」画像を取り込んだ。実験およびポジティブコントロール化合物はマルチチャンネルピペッターを介して添加したが、自動流体システムを使用することも可能である。
【０１７８】
単一または複数の試験プレートの画像取り込みの完了後、それぞれの個々のウェルからの９枚の画像のスタックに対し、次の操作よりなる取り込み後の画像処理を実施した：（１）画像スタックにおける各ピクセルについての最大グレー値の複合よりなる「分類」画像を作成した。次いで、この「分類」画像を細胞の同定のために使用した。（２）細胞の蛍光をバックグランドまたは細胞破砕物の蛍光と区別するために、１１００〜４０９０の間の値を有するピクセルを含む閾値（１２ビット、４０９５の最大値）を設定した。（３）次の形態的基準を満たすことに基づいて、個々の細胞を同定した：（ａ）細胞の外辺部が９８〜７５０ピクセルの総面積を有すること、（ｂ）細胞の形状が、縦対横の比として測定して、本来、長円形または円形である（１．０〜２．５）こと、および（ｃ）細胞は、目的の領域（上記の第２の操作において閾値によって除外されたグレー値を有するピクセル）において「穴」が認められないこと。そのようなパラメータは、この細胞タイプについて実験的に最適化されている。
【０１７９】
上記の「分類」から、同定されたそれぞれの細胞の周縁に沿って目的の画像領域（ＲＩＯ）を作成し、それぞれのＲＯＩに対する平均ピクセル値を測定した。スタックのそれぞれの画像について、この測定を反復した。９６ウェルプレート上のそれぞれのウェルにわたって、類似の計算を行い、すべてのデータを、マイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）エクセル（Ｅｘｃｅｌ）ＴＭなどのスプレッドシートプログラムに記録した。内部カルシウム貯蔵の化合物刺激型放出の結果、遊離の細胞内［Ｃａ２＋］が増加し、それによって、フルオ−４（Ｆｌｕｏ−４）の蛍光放射が増大した。あるいは、フルオ−３ＡＭ（Ｆｌｕｏ−３ ＡＭ）、フラ−２ＡＭ（Ｆｕｒａ−２ ＡＭ）または他のカルシウム感受性フルオロプローブ（ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｂｅ）を使用することも可能である。
【０１８０】
組換え昆虫細胞株を使用するカルシウム画像化および取り込みプロトコル
昆虫リアノジン受容体を一過的に発現する組換え体Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株、Ｓｆ９の懸濁液の数滴を、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバースリップ上に配置し、付着させた。次いで、細胞を、次の組成（ｍＭ）：ＮａＣｌ １３０；ＫＣｌ ５．４；ＭｇＣｌ２ １．２；ＣａＣｌ２ １．０；ＮａＨＣＯ３ ４．２；ＮａＨ２ＰＯ４ ７．３；グルコース １０；スクロース ６３；ＭＥＳ ２０；ｐＨ６．３を有する標準的な生理食塩水で濯いだ。次いで、細胞を、カルシウム感受性フルオロプローブフラ−２ ＡＭ（ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｂｅ Ｆｕｒａ−２ ＡＭ）（２μＭ）、およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７（０．００２％）を含有する標準的な生理食塩水中、３０分間、浴槽に置いた。細胞は試験前の少なくとも１５分間、標準的な生理食塩水で濯いだ。細胞株は機能的な電位依存性カルシウムチャンネルを欠くため、試験は標準的な生理食塩水中で行った。
【０１８１】
４０×油浸対物レンズ（ＮＡ１．３）を有するニコン・ディアフォト（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ）顕微鏡を使用して、画像化研究を行った。画像取り込みおよび処理は、ユニバーサル・イメージング・コーポレーション（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ペンシルバニア州ウエストチェスター（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））由来のメタフルオル（ＭｅｔａＦｌｕｏｒ）ＴＭ画像化システムを使用して実施した。カルシウムの較正は、フラ−２（Ｆｕｒａ−２）に対し１４５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）によるグリンキーウィクス（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）式を使用して行った（グリンキーウィクス（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）ら、１９８５）。細胞付着カバースリップを密閉型チャンバに配置し、ペリスタポンプを使用して、生理食塩水で細胞を連続的に潅流した。潅流液を切り換えることにより、生理食塩水に溶解した試験化合物を適用した。
【０１８２】
安定な組換え体に関与する研究について、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、またはＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ由来の昆虫リアノジン受容体（あるいは、Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ、Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉなどの他の種由来の受容体）を発現するＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株、Ｓｆ９、（Ｓｆ２１、Ｓ２などの他の細胞株も使用することが可能である）を、Ｔ７５（または他の適切なサイズの）フラスコ中、補充されたグレース（Ｇｒａｃｅ）の昆虫培地中で増殖させた。細胞は、試験時まで、インキュベーター中、２２℃で維持した。細胞に、培養培地中カルシウム感受性フルオロプローブ、フラ−２ ＡＭ（ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｂｅ Ｆｕｒａ−２ ＡＭ）（１〜２μＭ）およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７（０．００２％）を３０分間、撹拌下で懸濁充填した。次いで、細胞を遠心分離し、ペレットを、ウェルあたり約１５０，０００〜２００，０００個の細胞（９６ウェルプレート）で、以下の組成（ｍＭ）：ＮａＣｌ １３０；ＫＣｌ ５．４；ＭｇＣｌ２ １．２；ＣａＣｌ２ １．０；ＮａＨＣＯ３ ４．２；ＮａＨ２ＰＯ４ ７．３；グルコース １０；スクロース ６３；ＭＥＳ ２０；ｐＨ ６．３を有する生理食塩水に再懸濁した。３０分間の平衡化期間後、デュアル波長励起（３４０ｎｍおよび３８０ｎｍ）を伴うモレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）のフレックスステーション（ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ）ＴＭシステムを使用して、細胞プレートを試験し、５１０ｎｍで蛍光放射を測定した。組み込み型流体素子を使用して、試験およびコントロールサンプルを添加し、細胞内カルシウムを２分間の期間、モニターした。
【０１８３】
上記のプロトコルを使用して、図３は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリアノジン受容体を一過的に発現する組換え体Ｓｆ９細胞上のリアノジン受容体アゴニスト、カフェイン（１０ｍＭ）およびＣｐｄ１６（１０および１００ｎＭ）に対する応答を実証する（図３）。同様に、Ｓｆ９細胞において一過的に発現される組換え体Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓリアノジン受容体は、図４に示されるように、カフェイン（１０ｍＭ）およびＣｐｄ５（３μＭ）による攻撃後、細胞質ゾル［Ｃａ２＋］の増加を示した。脂質のみ（−ＤＮＡ）をトランスフェクトされた細胞またはトランスフェクトされていない細胞は、カフェイン（１０ｍＭ）アントラニルアミド化学に対して有意な応答を示さなかった。一過的に発現する細胞で観察されるように、カフェインおよびアントラニルアミド化学は、図５に示されるように、組換え体Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓリアノジン受容体を発現する安定にトランスフェクトされたＳｆ９細胞において、カルシウム流動化を誘導する。さらに、図６では、野生型Ｓｆ９細胞がカフェインに対して非感受性である一方、組換え体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリアノジン受容体を発現する安定にトランスフェクトされたＳｆ９細胞は、用量依存性のカルシウム流動化を示す。
【０１８４】
あるいは、励起および蛍光放射取り込みならびに流体の取り扱いについては、モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）のＦＬＩＰＲＴＭシステムなどの全プレートに基づく画像化リーダーを使用して、得ることができる。
【０１８５】
上記のプロトコルを使用して、公開された文献からの多くの既知のリアノジン受容体因子は、（胚神経細胞における）生来のゴキブリリアノジン受容体および一過的または安定的に発現される組換え体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ受容体（Ｓｆ９細胞において発現される）に対して評価されており、結果を表６に示す。
【０１８６】
【表５】
【０１８７】
【表６】
【０１８８】
実施例１０
ゴキブリ筋膜の調製
放射性リガンド結合研究のためのゴキブリ大体筋由来の膜の調製のための手順については、本質的に、シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）ら（１９９６）Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４８：３７５−３８５に記載の通りである。関与する工程の簡単な説明は以下の通りである：
【０１８９】
６〜９週齢のゴキブリ由来の中肢および後肢を摘出し、直ちに液体窒素中に配置した。必要であれば、さらなる画分の前に、摘出した肢を−８０℃で数ヶ月間貯蔵することができる。典型的に、膜の調製は、約５５ｇ（湿重量）の摘出した肢から始めた。その後のすべての工程は４℃で行った。
【０１９０】
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４を、１ｇ（湿重量）の肢に対して９ｍｌの割合で添加した。ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）（ブリンクマン・インスツルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ニューヨーク州ウエストバリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））を、２分間、設定番号３で使用して、氷上で肢を均質化した。小皮（ｃｕｔｉｃｌｅ）のすべての画分を取り出すために、ホモジネートを、まず、２層のチーズクロスを介して、次いで、２層のチーズクロスの上に重ねた１層のガラスウールを介して通過させた。時々、すべての材料が通過する前に、粒子でチーズクロスが目詰まりした。そのような場合、新しいチーズクロス（およびガラスウール）を、残りの懸濁液のために使用した。ろ液を５０ｍｌ遠心チューブに回収し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ−３４ローター中、１，９５０×ｇｍａｘで２０分間、遠心分離した。懸濁液を回収し、３０分間、３０，０００×ｇｍａｘで遠心分離した。得られたペレットを緩衝液Ａ（１．５Ｍ ＫＣｌ、０．３Ｍスクロール、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。膜懸濁液を、ガラス−テフロン・ホモジナイザーを使用して、手動（約２５ストローク）で均質化した。懸濁液のタンパク質濃度を、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）ら（１９５１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５の方法で決定した。続いて、緩衝液Ａの添加によって、膜懸濁液を４μｇタンパク質／μｌに調整し、次いで、１ｍｌのアリコートで、−８０℃で貯蔵した。
【０１９１】
実施例１１
放射性リガンド結合アッセイ
使用したリアノジンは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス）から得た。
【０１９２】
以下の化合物の構造を図２および表７に示す。
【０１９３】
１−（３−クロロ−２−ピリジニル）−Ｎ−［２−メチル−６−［［（１−メチルエチル）アミノ］カルボニル］フェニル］−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド（Ｃｐｄ ５）は、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）（デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））で調製した。
【０１９４】
Ｎ−［４−ブロモ−２−メチル−６−［［（１−メチルエチル）アミノ］カルボニル］フェニル］−１−（２−フルオロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド（Ｃｐｄ ４）は、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）（デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））で調製した。
【０１９５】
［３Ｈ］−リアノジン（リアノジン［９，２１−３Ｈ（Ｎ）］）は、パーキンエルマーＴＭ・ライフ・サイエシズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＴＭ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））から得た。１−（２−フルオロフェニル）−Ｎ−［２−メチル−４−トリチオ−６−［［（１−メチルエチル）アミノ］カルボニル］フェニル］−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサイミド（Ｃｐｄ １）は、パーキンエルマーＴＭ・ライフ・サイエンシズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＴＭ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））によりＮ−［４−ブロモ−２−メチル−６−［［（１−メチルエチル）アミノ］カルボニル］フェニル］−１−（２−フルオロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド（Ｃｐｄ４）から２１Ｃｉ／ｍｍｏｌで調製された。
【０１９６】
ゴキブリ大腿筋膜に結合する［３Ｈ］−ＧＮ類似体［Ｃｐｄ１］：
飽和結合アッセイのために、アッセイ混合物（２００μｌ全容積／ウェル；９６ウェル、Ｕ底、ポリプロピレンプレート）は、１６３μｌの緩衝液Ｂ（０．３７５Ｍ ＫＣＬ、０．３Ｍスクロース、０．０００５Ｍ ＣａＣｌ２、０．０２０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、ＤＭＳＯ中多様な濃度のＣｐｄ１の１０μｌ、および２μｌのＤＭＳＯを含有した。「非特異的結合」の決定のために、ＤＭＳＯを、対応する「全」結合チューブにおける０．００１Ｍリアノジン＋Ｃｐｄ１の濃度の１，０００倍濃厚な濃度のＣｐｄ５を組み合わせた溶液（ＤＭＳＯ中）の２μｌで、置き換えた。アッセイは、２μｇ／μｌのゴキブリ筋膜（解凍および等容積の緩衝液Ｂの添加によって調製した）の２５μｌの添加で開始し、インキュベーションを６０分間、３２℃で行った。アッセイは、３回の反復測定で行った。
【０１９７】
選択された化合物によるＣｐｄ１の置き換えは、以下の通りであった：１６３μｌの緩衝液Ｂ、２μｌの０．００１Ｍリアノジン（ＤＭＳＯ中）および２５μｌのゴキブリ筋膜（上記のように２μｇ／μｌで調製した）を含有する各ウェルに対し、ＤＭＳＯ中の多様な濃度の選択された化合物の２μｌを添加した。化合物を、膜と共に、１０分間、３２℃で予めインキュベートさせた。プレインキュベーション後、ＤＭＳＯ中６２５ｎＭ Ｃｐｄ１の８μｌを添加し、インキュベーションを６０分間、３２℃で、進行させた。アッセイは、３回の反復測定で行った。
【０１９８】
インキュベーション後、アッセイを、氷冷緩衝液Ｂで終了させ、予め湿潤させたユニフィルター９６ＧＦ／Ｂ（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ９６ ＧＦ／Ｂ）フィルターマイクロプレート上で、ユニフィルター９６ハーベスター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ９６ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を使用して、直ちにろ過した。次いで、各アッセイウェルを、１０回、緩衝液Ｂで洗浄し、同じフィルターマイクロプレート上で回収した。次いで、フィルターマイクロプレートを真空オーブン中に、３２℃で、３時間配置し、続いて、５０μｌのマイクロシント０（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ０）（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を各ウェルに添加した。次いで、プレートを加熱密封し、トップカウント（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ）マイクロプレートシンチレーションカウンター（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を使用して、計数した。
【０１９９】
ゴキブリ大腿筋膜への［３Ｈ］−リアノジンの結合
飽和結合アッセイのために、アッセイ混合物（２００μｌ全容積／ウェル；９６ウェル、Ｕ底、ポリプロピレンプレート）は、１５５μｌの緩衝液Ａ（１．５Ｍ ＫＣＬ、０．３Ｍスクロース、０．０００５Ｍ ＣａＣｌ２、０．０２０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、エタノール中多様な濃度の［３Ｈ］−リアノジンの１０μｌ、および１０μｌのＤＭＳＯを含有した。「非特異的結合」の決定のために、ＤＭＳＯを、対応する全結合チューブにおける［３Ｈ］−リアノジンの濃度の１，０００倍濃厚な濃度の１０μｌのリアノジン（ＤＭＳＯ中）の１０μｌのリアノジンで、置き換えた。アッセイは、２μｇ／μｌのゴキブリ筋膜（解凍および等容積の緩衝液Ａの添加によって調製した）の２５μｌの添加で開始し、インキュベーションを６０分間、３２℃で行った。アッセイは、３回の反復測定で行った。
【０２００】
選択された化合物による［３Ｈ］−リアノジンの置き換えは、以下の通りであった：１５５μｌの緩衝液Ａ、および２５μｌのゴキブリ筋膜（上記のように２μｇ／μｌで調製した）を含有する各ウェルに対し、ＤＭＳＯ中の多様な濃度の選択された化合物の１０μｌを添加した。化合物を、膜と共に、１０分間、３２℃で予めインキュベートさせた。プレインキュベーション後、エタノール中２００ｎＭ［３Ｈ］−リアノジンの１０μｌを添加し、インキュベーションを６０分間、３２℃で、進行させた。アッセイは、３回の反復測定で行った。
【０２０１】
インキュベーション後、アッセイを、氷冷緩衝液Ａで終了させ、予め湿潤させたユニフィルター９６ＧＦ／Ｂ（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ９６ ＧＦ／Ｂ）フィルターマイクロプレート上で、ユニフィルター９６ハーベスター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ９６ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を使用して、直ちにろ過した。次いで、各アッセイウェルを、１０回、緩衝液Ａで洗浄し、同じフィルターマイクロプレート上で回収した。次いで、フィルターマイクロプレートを真空オーブン中に、３２℃で、３時間配置し、続いて、５０μｌのマイクロシント０（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ０）（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を各ウェルに添加した。次いで、プレートを加熱密封し、トップカウント（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ）マイクロプレートシンチレーションカウンター（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を使用して、計数した。
【０２０２】
実施例１２
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリアノジン受容体遺伝子のための発現ベクター
公開されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのリアノジン受容体遺伝子配列（ＮＣＢＩ受託番号Ｄ１７３８９）に基づいて、２つのプライマー（配列番号１４１、５’−ａｃｃａｃｃｔｔａａｔｔａａｔｔｃｃｇａｔｔｔｇｇａｇｇｃｇｃｔｇｃｇ−３’；および配列番号１４２、５’−ｇｃｃｔｃｃｇｔｔｔａａａｃｇａｃｃｇｔｃｃａｇｔｇｃｃａｇｔｇｔｇａａｇ−３’）を設計した。これらのプライマーは、実施例１の条件に従い、成虫Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））をテンプレートとして使用するロングＰＣＲ反応に使用した。全長リアノジン受容体遺伝子をｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングし、その後、全長遺伝子を、実施例２に記載のように、改変されたｐＩＢＶ５ＨｉｓまたはｐＦＡＳＴＢａｃへサブクローニングした。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、本明細書において開示された方法によって作製されたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）配列（配列番号１０）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｒｔ配列（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１７３５２４７１、配列番号５６）、蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）ゲノム配列決定プロジェクト由来の未注釈配列（ｇｉ２１３０１５５６、配列番号５７）、線虫由来のリアノジン受容体（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、ｇｉ１８７１４４７、配列番号５８）、ウニ（Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ、ｇｉ１８６５６１５５、配列番号５９）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ｇｉ１３５６９８５０、配列番号６０）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ｇｉ１２４５３７６、配列番号６１）、およびヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ｇｉ４５０６７５７、配列番号６２）と比較した鱗翅目種、タバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、配列番号２、１２８、１３０、１４４および１４６）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、配列番号４）、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、配列番号６）、およびトウモロコシウンカ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ、配列番号８）由来の５つのリアノジン受容体の推定アミノ酸配列のアライメントを示す。昆虫特異的配列は、すべての昆虫配列の間で保存されているが、非昆虫配列の間には認められない相同的部分配列を見出すことによって、同定することができる。これらの配列の多くは、配列番号６３〜１１９において見出すことができる。
【図２】図２は、実施例９において提示されるカルシウム放出アッセイ、または実施例１１において提示される放射性標識結合研究において使用された３つのクラスのアントラニルアミドの化学構造を示す。
【図３】図３は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリアノジン受容体を一過的に発現する組換えＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株（Ｓｆ９）からカフェインまたは化合物１６（表７）のいずれかによって誘発されるカルシウム応答の例を示す。トランスフェクション９６時間後、リアノジン受容体アゴニスト、カフェイン（１０ｍＭ）および化合物１６（１０および１００ｎＭ）で細胞を攻撃した。ＤＮＡを伴わないコントロール細胞におけるカフェイン（１０ｍＭ）または化合物１６（１０および１００ｎＭ）では、有意なカルシウム応答は観察されなかった。
【図４】図４は、組換えＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓリアノジン受容体を一過的に発現する組換えＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株（Ｓｆ９）からカフェインまたは化合物５（表７）のいずれかによって誘発されるカルシウム応答の例を示す。トランスフェクション７２時間後、リアノジン受容体アゴニスト、カフェイン（１０ｍＭ）および化合物５（３μＭ）で細胞を攻撃した。ＤＮＡを伴わないコントロール細胞におけるカフェイン（１０ｍＭ）または化合物５（３μＭ）では、有意なカルシウム応答は観察されなかった。
【図５】図５は、組換えＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓリアノジン受容体を一過的に発現する組換えＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株（Ｓｆ９）からカフェインまたは化合物１４（表７）のいずれかによって誘発されるカルシウム応答の例を示す。リアノジン受容体アゴニスト、カフェイン（１０ｍＭ）および化合物１４（１μＭ）で細胞を攻撃した。Ｓｆ９細胞をガラスカバースリップに付着させ、次いで、カルシウムプローブフラ−２ ＡＭ（Ｆｕｒａ−２ ＡＭ）で充填し、カルシウム画像化システムを使用してアッセイして、カルシウム流動をモニターした。
【図６】図６は、野生型Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９−ＷＴ）、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｓｆ９−ＤｒｙＲ）リアノジン受容体を安定的に発現する組換えＳｆ９細胞に関するカフェイン用量応答曲線を示す。Ｓｆ９細胞をカルシウムプローブフラ−２（Ｆｕｒａ−２）で充填し、次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートに配置し、組み込み型流体素子を有するモレキュラー・デバイス・フレックスステーションＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ’ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎＴＭ）プレートリーダーを使用してアッセイして、カルシウム流動をモニターした。
【図７】図７は、ｐＨＥ７の構築の略図を示す。明快にするために、ＤＮＡフラグメントは一定のスケールでは描いておらず、環状プラスミドを線状様式で示し、プラスミドの関連部分のみを示す。
【配列表】
【図１ＦＦ】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００２年９月２３日に出願された米国仮出願第６０／４１２，７９５号および２００２年１１月１８日に出願された米国仮出願第６０／４２７，３２４号の利益を主張し、その内容全体は参考として本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、リアノジン受容体の分野にあり、特に、リアノジン受容体活性を調整するのに有用な組換え構築物およびそのような活性を調整する化合物を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脊椎動物および無脊椎動物筋肉細胞のカルシウムホメオスタシスは、正常な細胞活動に必須である。それは、細胞の形質膜上のカルシウム選択的チャンネルを介して移動する細胞外供給源由来のカルシウム、および筋小胞体の膜に位置するカルシウム活性型カルシウム放出チャンネルによって制御される内部貯蔵におけるカルシウムの平衡を保つことに関与する複雑なプロセスである。筋小胞体からのカルシウムの放出は、筋組織における興奮収縮連関（非特許文献１）ならびにカルシウムシグナル伝達事象の開始および伝播に極めて重要な役割を果たす。
【０００４】
細胞内部に存在するカルシウム活性型カルシウム放出チャンネルは、受容体と天然の殺虫性リアノジン（Ｒｙａｎｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ由来のアルカロイド）とに相互作用があるため、リアノジン受容体（Ｒｙｒ）と呼ばれる。リアノジン結合部位は、殺虫作用の潜在的標的としての昆虫のＣａ２＋放出チャンネルの特性を理解するための取組みにおいて研究されている（非特許文献２）。しかし、主な作用機序としてリアノジン受容体に作用する合成殺虫剤は、最近まで、発見されていなかった。有害生物種に対して極めて強力な活性を有するアントラニルアミドの誘導体に基づく化学は、カルシウム放出をもたらし、従って、昆虫細胞のカルシウム平衡を破壊する様式でこの受容体を活性化する。この破壊の結果として認められる生物体の応答は、心筋、骨格筋および咽頭筋を含む筋収縮から弛緩しないことであり、活動が低下し、餌を取らなくなる。
【０００５】
昆虫では、受容体−イオンチャンネルの唯一の１つの形態が存在することが報告されている。昆虫組織における研究により、受容体が哺乳動物ホモログに類似の特性およびサイズを有することが示されている（非特許文献３）。リアノジン受容体については、現在、異なる調節に供され、異なる組織分布を有する３種のアイソタイプ（１、２、および３型）が認識されている哺乳動物において、最も研究されている。
【０００６】
リアノジン受容体をコードするＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子の全長ゲノムＤＮＡ配列（非特許文献４）およびｃＤＮＡ配列（非特許文献５）は公知であり、公的データベース（ＮＣＢＩ受託番号Ｄ１７３８９）、他の無脊椎動物、例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（ＮＣＢＩ受託番号Ｄ４５８９９）およびタバコガ、鱗翅目有害生物（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ；非特許文献６）由来のリアノジン受容体のＣ末端の小さなセグメントから利用可能である。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来の配列は、クローニングされ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現され、電導性技術を使用して受容体−イオンチャンネルが機能的であることが示された（非特許文献５）。
【０００７】
【非特許文献１】ペッサ（Ｐｅｓｓａｈ）ら、（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１：８６４３−８６４８
【非特許文献２】レンベルグ（Ｌｅｈｍｂｅｒｇ）ら、（１９９４）Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４８：１４５−１５２
【非特許文献３】デンサー（Ｄｅｎｓｅｒ）ら、（１９９８）Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．５４：３４５−３５２
【非特許文献４】タケシマ（Ｔａｋｅｓｈｉｍａ）ら（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３３７：８１−８７
【非特許文献５】シュ（Ｘｕ）ら（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．７８：１２７０−１２８１
【非特許文献６】プエンテ（Ｐｕｅｎｔｅ）ら、（２０００）Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３０：３３５−３４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
昆虫などの有害生物による穀物の破壊は、相当な経済的損害および生産性の重大な減少を生じる。例えば、鱗翅目有害生物種は、多様な穀物種に対して年間５億ドルの被害を生じる。同翅目有害生物ではさらに２０億ドルかかる。最近、化学の２つの領域が鱗翅目有害生物の良好な駆除を示している。細胞内カルシウム変化および有害生物の生理学的応答の分析から、作用機序は、筋肉ならびに中枢神経系における内部カルシウム貯蔵の放出および終局的涸渇を介する正常な筋肉機能の破壊による。従って、多様なタイプの低分子量化学構造に対し、天然または組換え系のいずれかにおいてリアノジン受容体を発現する細胞の応答に基づいて、受容体およびそれと相互作用する潜在的な他の付随の成分は有害生物駆除の重要な標的であることが明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、または１４６よりなる群から選択されるポリペプチドと比較する場合、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するリアノジン受容体をコードする核酸配列よりなる核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチドフラグメントに関する。
【００１０】
第２の実施態様では、本発明は、単離された核酸フラグメントに関し、ここで、核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１２７、１２９、１４３、または１４５のヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１１】
第３の実施態様では、本発明は、上記核酸フラグメント、およびその相補体に関し、ここで、フラグメントまたはその部分は、宿主細胞におけるリアノジン受容体活性の過剰発現、アンチセンス阻害、または共抑制の目的ための組換え構築物に有用である。
【００１２】
第４の実施態様では、本発明は、少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された上記核酸フラグメントもしくはその相補体またはそれらのいずれかの部分を含んでなる組換えＤＮＡ構築物に関する。また、ゲノムにそのような組換えＤＮＡ構築物を含んでなる真核または原核宿主細胞も興味深い。有用な宿主細胞には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、Ｓｆ９、Ｓ２、アフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）、ＨＥＫ−２９３およびＣＨＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００１３】
第５の実施態様では、本発明は：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６と他のイオンチャンネルおよび受容体ポリペプチド配列とを比較し；
（ｂ）工程ａにおいて得られる４もしくはそれ以上のアミノ酸の保存配列を同定し；
（ｃ）工程ｂにおいて同定される保存配列に基づいて縮重オリゴマーを設計し；そして
（ｄ）工程ｃの縮重オリゴマーを使用して、配列依存的プロトコルによって、リアノジン受容体活性を有するポリペプチドをコードする配列を単離する
ことを含んでなる、リアノジン受容体および関連ポリペプチドをコードする核酸フラグメントを単離するための方法に関する。
【００１４】
第６の実施態様では、本発明は、ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列とは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％の同一性を有する、リアノジン受容体活性を有する単離されたポリペプチドに関する。当業者であれば、７５％〜１００％の任意の整数の同一性パーセントがリアノジン受容体様ポリペプチド配列を単離するのに有用であることを認識するであろう。
【００１５】
第７の実施態様では、本発明は、カルシウムホメオスタシスを調整する能力について、少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）上記の組換え構築物のいずれか１つで宿主細胞を形質転換し；
（ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ；
（ｃ）試験しようとする化合物で、工程（ａ）の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
（ｄ）カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内ホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる。
【００１６】
本方法において、該方法はリガンド結合アッセイであることができるが、これに限定されない。さらに、本方法は、そのような細胞から得られる形質転換された宿主細胞またはイオンチャンネルの機能的活性に対する化合物の効果を検出することによって、機能的活性を評価することに基づくことができる。
【００１７】
第８の実施態様では、本発明は、リアノジン受容体活性を調整する少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの化合物と上記の単離された核酸フラグメントのいずれか１つによりコードされるポリペプチドとを接触させ；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、（ａ）のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる。
【００１８】
本方法において、該方法はリガンド結合アッセイであることができるが、これに限定されない。さらに、本方法は有用であり得、ここで、ポリペプチドは１つを超える化合物と接触される。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様は、配列番号６３〜１１９のいずれかに記載の少なくとも２つのポリペプチド配列を含んでなる昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントであるが、但し、前記ポリペプチド配列が配列番号５６、１２０〜１２６のいずれをも含まない。
【００２０】
さらに別の実施態様は：
ａ）少なくとも１００アミノ酸を有する第１のポリペプチドをコードする単離された核酸配列を得て；
ｂ）第１のポリペプチド配列と、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択される比較ポリペプチド配列とを比較して、第１のポリペプチドと比較ポリペプチドとの間で１００％の配列同一性を有する領域を同定し、ここで、前記領域は比較ポリペプチドと同じ長さであり；そして
ｃ）異なる比較ポリペプチド配列で工程（ｂ）を反復し、ここで、前記異なる比較ポリペプチド配列は、１００％の配列同一性を有する第２の領域が見出されるまで、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択され、ここで、前記第２の領域は異なる比較ポリペプチドと同じ長さである
ことを含んでなる、昆虫イオンチャンネルをコードする核酸配列を同定するための方法であり得る。該方法は、１００〜６，０００アミノ酸の長さを有する第１のポリペプチドの長さによってさらに特徴付けられ得る。
【００２１】
本発明のなおさらなる実施態様は：
ａ）毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメント、および／またはインフレーム翻訳停止コドンを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメント、および／またはインフレーム翻訳停止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接され；そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。削除可能な配列は、ｌｏｘ部位などであるがこれに限定されない組換え酵素によって認識される任意の配列であってもよい。
【００２２】
本発明の関連実施態様は、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物自体を包含し得、ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメント、および／または少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンを含んでなり、さらにここで、転写終止核酸フラグメント、および／または少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接される。削除可能な配列は、ｌｏｘ部位などであるがこれに限定されない組換え酵素によって認識される任意の配列であってもよい。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、
ａ）毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え発現構築物で宿主を形質転換し、ここで、前記フラグメントはまた、前記フラグメントの発現を妨害するイントロンを含んでなり、そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。
【００２４】
さらに別の実施態様では、本発明は、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え発現構築物を包含し得、ここで、前記単離された核酸フラグメントはまた、毒性昆虫イオンチャンネルの発現を妨害するイントロンを含んでなる。
【００２５】
配列表の簡単な説明
本発明は、本出願の一部をなす下記の詳細な説明ならびに添付の図面および配列表によりさらに完全に理解することができる。
【００２６】
表１は、本明細書で記述されるポリペプチド、これらのポリペプチドの全部または実質的な部分を表すポリペプチドをコードする核酸フラグメントを含んでなるゲノムまたはｃＤＮＡクローンの呼称、および添付の配列表において使用される対応する識別名（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（配列番号）を列挙する。配列の説明およびそれに付属された配列表は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条に示されるような、特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示に適用される規則に従う。
【００２７】
【表１】
【００２８】
奇数番号の配列番号１、３、５、７、９、１２７、１２９、１４３、および１４５は、掲載された種由来のリアノジン受容体をコードする配列に対するポリヌクレオチド配列を表す。偶数番号の配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６は、対応する奇数番号のポリヌクレオチド配列から誘導される翻訳されたアミノ酸配列を表す。配列番号１１〜５５は、ＰＣＲ増幅、ならびに配列決定、多様な昆虫供給源由来のリアノジン受容体の単離および特徴付け中の実験に使用したヌクレオチドプライマーである。未注釈蚊ゲノム配列（配列番号５７）は、（本発明の著者らによって行われた分析によって）リアノジン受容体の一部をコードすると考えられる。配列番号５６、５８〜６２および１２０〜１２６は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースに存在するリアノジン受容体配列である。配列番号６３〜１１９は、昆虫リアノジン受容体において保存されていると考えられるアミノ酸配列モチーフである。配列番号１３１〜１４２は、発現ベクターへのクローニングのためのリアノジン受容体コーディング領域の増幅に使用されるＰＣＲプライマー配列およびオリゴヌクレオチドである（実施例７を参照のこと）。
【００２９】
配列表は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３０２１−３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ２１９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）（参考として本明細書に引用される）に記述されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ標準に従って規定される通り、ヌクレオチド配列文字の１文字記号およびアミノ酸の３文字記号を含有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用される記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に示される規則に従う。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本明細書において使用される「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖もしくは二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、場合により、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含有する。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから成り得る。ヌクレオチド（通常、５’一リン酸の形で見出される）については、次の一文字呼称で呼ばれる：（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対する）アデニル酸またはデオキシアデニル酸は「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸は「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸は「Ｇ」、ウリジル酸は「Ｕ」、デオキシチミジル酸は「Ｔ」、プリンは「Ｒ」（ＡまたはＧ）、ピリミジンは「Ｙ」（ＣまたはＴ）、ＧまたはＴは「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴは「Ｈ」、イノシンは「Ｉ」、ＡまたはＴは「Ｗ」、ＣまたはＧは「Ｓ」、および任意のヌクレオチドは「Ｎ」。
【００３１】
用語「機能的に等価であるサブフラグメント」および「機能的等価サブフラグメント」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、フラグメントまたはサブフラグメントが活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、遺伝子発現を改変または所定の表現型を産生する能力が保持されている単離された核酸フラグメントの一部分または部分配列を指す。例えば、フラグメントまたはサブフラグメントは、所望する表現型を形質転換した植物内に産生するためのキメラ構築物の設計に使用することができる。キメラ構築物は、活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、植物プロモーター配列に関係する適当な配向で、核酸フラグメントもしくはそのサブフラグメントを連結して共抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）またはアンチセンス的に使用するために設計することができる。
【００３２】
用語「相同性」、「相同的」、「実質的に類似」、「〜より本質的になる」、および「実質的に対応」は、本明細書において交換可能に使用される。それらは、１個以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介または所定の表現型を産生するための核酸フラグメントの能力に影響を及ぼさない核酸フラグメントを指す。これらの用語はまた、得られた核酸フラグメントの機能的性質を、当初の改質されていないフラグメントと比較して、実質的に改変しない１個以上のヌクレオチドの欠失または挿入のような本発明の核酸フラグメントの改質をも指す。従って、本技術分野の熟練者であれば、本発明が、特定の例示配列以上のものも包含することを認めることが理解される。
【００３３】
さらに、熟練者は、本発明に包含される本質的に類似した核酸配列は、中程度のストリンジェント条件（例えば、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下において、本明細書において例示する配列か、または本明細書に報告したヌクレオチド配列ならびに本発明の遺伝子およびプロモーターに機能的に等価なヌクレオチド配列の任意の部分にハイブリダイズする能力によっても規定されることを認める。ストリンジェンシー条件を調整して、遠い関係の生物体由来の相同配列などの中等度に類似のフラグメントから、近い関係の生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子などの、高度に類似のフラグメントまでをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。１組の好適な条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温、１５分間で開始し、次いで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃、３０分間で反復し、次いで、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、３０分間を２回反復する一連の洗浄を使用する。より好適な組のストリンジェントな条件は、より高い温度を使用し、ここで洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃にまで上昇させたことを除いて、上記の洗浄と同一である。もう１つの好適な組の高度にストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で最後の２回の洗浄を使用する。
【００３４】
標的（内因性）ｍＲＮＡと、標的ｍＲＮＡに相同性を有する構築物におけるＲＮＡ領域との間の実質的な類似性の程度について、そのような配列は、少なくとも２５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、より好ましくは１００ヌクレオチド長、さらに好ましくは２００ヌクレオチド長、最も好ましくは３００ヌクレオチド長であるべきであり、少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるべきである。
【００３５】
多くのレベルの配列同一性が、関連するポリペプチド配列を同定するのに有用であることが、当業者によって良好に理解されている。同一性パーセントの有用な例には、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または７５％〜１００％の任意の整数の百分率がある。配列のアライメントおよびパーセント同一性の計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを含むがそれに限定されない相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定してもよい。配列のマルチプルアライメントは、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用い、アライメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して実施する。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用するタンパク質配列のペアワイズアライメントおよびパーセント同一性の計算のためのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＬＡＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＬＡＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。大きなタンパク質配列では、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗプログラム（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら（１９９４）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：４６７３−４６８０）を使用した。デフォルトのパラメータを使用した（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、ＤＥＬＡＹ ＤＩＶＥＲＧＥＮＴ ＳＥＱ （％）＝３０、ＤＮＡ ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮ ＷＥＩＧＨＴ＝０．５０、ＰＲＯＴＥＩＮ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：Ｇｏｎｎｅｔ ２５０、ＤＮＡ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ）。ペアワイズアライメントもまた、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１０、ＰＲＯＴＥＩＮ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ）を使用した。
【００３６】
「遺伝子」は、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ構築物」、「組換え構築物」、または「組換え発現構築物」は、天然では通常は一緒に見出されない核酸フラグメントの組み合わせを指す。従って、組換え構築物は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源から由来するが、しかし、通常、天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでなり得る。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されないが、しかし遺伝子導入により宿主生物体内に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ構築物を含んでなることができる。「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノム中に導入されている遺伝子である。
【００３７】
「コーディング配列」は特定のアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を挙げることができるが、これらに限定されない。用語「インフレーム翻訳終止コドン」は、ＲＮＡ転写物の好適なリーディングフレーム内に存在するＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡ停止コドンを指す。
【００３８】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、近接およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはしばしばエンハンサーと称される。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することが可能でありかつプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるように挿入されたプロモーターの先天的エレメントまたは異種エレメントであり得るＤＮＡ配列である。プロモーター配列はまた、遺伝子の転写される部分内、および／または転写される配列の下流に位置することができる。プロモーターはそれらの全体がそのまま生来の遺伝子に由来してもよく、または、天然に見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントさえ含んでなることができる。当業者であれば、異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞タイプにおいて、あるいは発生の異なる段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解する。ほとんどの時点でのほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「構成的プロモーター」と称される。植物細胞において有用な多様なタイプの新規プロモーターが常に発見されており；多くの例をオカムロおよびゴールドベルグの総説（Ｏｋａｍｕｒｏ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９８９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ１５：１−８２）中に見出すことができる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全には規定されていないため、一部分の変形を持つＤＮＡフラグメントは、同一のプロモーター活性を有していることがあることもさらに認められている。用語「誘導性プロモーター」は、トランス作用因子によって活性化され得る通常、休止状態にあるプロモーターを指す。そのような因子の例として、タンパク質、化学物質、およびＤＮＡの局所構造を変更する因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
「イントロン」は、タンパク質配列の一部分をコードしていない遺伝子中に介在する配列である。従って、この配列はＲＮＡ中に転写はされるが、しかし切り取られて翻訳されない。この用語はまた、切除されたＲＮＡ配列についても使用される。「エキソン」は、転写され、遺伝子に由来する成熟したメッセンジャーＲＮＡ中に見いだされるが、しかし必ずしも最終の遺伝子産物をコードする配列の一部である必要はない。
【００４０】
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との間に配置されるＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響を及ぼすことができる。翻訳リーダー配列の例は記述されている（ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）およびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２２５）。
【００４１】
「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に配置されるＤＮＡ配列を指し、かつ、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸領域（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。異なる３’非コーディング配列の使用がインゲルベルヒト（Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ）ら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１：６７１−６８０により例示されている。
【００４２】
「ＲＮＡ転写物」はＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称される。またはそれは一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まずかつ細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡテンプレートに相補的でありかつ酵素である逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であり得るかまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて二本鎖に転換することもできる。「センス−ＲＮＡ」は、ｍＲＮＡを含み、そして、細胞内またはインビトロでタンパク質に翻訳させることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物もしくはｍＲＮＡの全部または一部に相補的でありかつ標的である単離された標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列での特異的な遺伝子転写物のいずれかの部分であることができる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは翻訳されなくてもよいが、しかし細胞の過程に対する影響をなお有し得る他のＲＮＡを指す。用語「相補体」および「逆相補体」は、ｍＲＮＡ転写物について本明細書において交換可能に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを規定することを意味する。
【００４３】
用語「内因性ＲＮＡ」は、天然に存在するかまたは天然には存在しない（即ち、組換え手段、変異誘発などによって導入されている）かに係わらず、本発明の組換え構築物による組換え前の宿主のゲノムに存在する任意の核酸配列によってコードされる任意のＲＮＡを指す。
【００４４】
用語「天然には存在しない」とは、天然において通常に見出されるものには一致しない人工物を意味する。
【００４５】
用語「操作可能に連結している」は、一方の機能が他方により調節されるような単一核酸フラグメント上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を調節することができる（即ち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結している。コーディング配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結することができる。別の例では、本発明の相補ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’側、もしくは標的ｍＲＮＡの３’側、もしくは標的ｍＲＮＡ内に直接的かまたは間接的に操作可能に連結することができ、あるいは、第１の相補領域は、標的ｍＲＮＡの５’側であり、その相補体は標的ｍＲＮＡの３’側である。
【００４６】
用語「転写終止核酸フラグメント」は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を停止させる核酸結合タンパク質によって認識される配列を含有するか、または二次構造を生じる核酸フラグメントを指す。
【００４７】
本明細書において使用される用語「発現」は、機能的最終産物の産生を指す。遺伝子の発現は、遺伝子の転写および前駆体または成熟タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳に関与する。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似する外来もしくは内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００４８】
用語「削除可能な配列」、「削除部位」、または「削除配列」は交換可能に使用され、Ｃｒｅなどの組換え酵素によって認識されるＬｏｘ配列などの任意の配列を指す。Ｃｒｅの活性は、組換えによって、より長いＤＮＡフラグメントから２つのＬｏｘ配列、およびＬｏｘ配列間の他の任意の核酸を取り出す。当業者であれば理解できるように、実施例７に記載のＣｒｅ／Ｌｏｘに匹敵し得るいくらかの削除系を使用することができる。削除系の例としては、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９９０）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２３：３６９−３７８）；Ｆｌｐ／Ｆｒｔ（ライズニック（Ｌｙｚｎｉｋ）ら（１９９３）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１：９６９−９７５）；クロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）ＴＭ／Ａｔｔ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ）；Ｇｉｎ／Ｇｉｘ（マエサー（Ｍａｅｓｅｒ）およびカーマン（Ｋａｈｍａｎｎ）（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３０：１７０−１７６）；ならびにＲ／ＲＳ（オノウチ（Ｏｎｏｕｃｈｉ）ら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：６３７３−６３７８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
当業者であれば理解できるように、削除部位によって隣接されたいくらかのフラグメントを使用して、本明細書に記載のものに等価な宿主細胞における発現を除去またはダウンレギュレートすることができる。そのようなフラグメントの例として、転写ターミネーター、Ｒｙｒコーディング配列と共にフレーム内にある停止コドン、転写リプレッサーによって認識されるオペレーター、翻訳アテニュエーター、およびアンチセンスまたは共抑制構築物に相互作用する配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
当業者であれば理解できるように、停止フラグメントは、本明細書に記載のものに等価なＲｙｒ ｃＤＮＡにおける異なる多くの位置に挿入することができる。適切な位置の例としては、遺伝子のプロモーターの上流、５’非翻訳リーダー、コーディング配列内、および３’非翻訳領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
当業者であれば認識できるように、リアノジン受容体遺伝子のコーディング領域内のイントロンの置き換えは、ＲＮＡ転写物からのイントロンの取り出しをプロセスすることが不可能である宿主細胞における活性なリアノジン受容体の発現を減弱し得る。
【００５２】
「成熟」タンパク質は、転写後にプロセシングされたポリペプチド（即ち、一次翻訳産物中に存在するいかなるプレ−もしくはプロペプチドが除去されている）を指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（即ち、プレ−およびプロペプチドがなお存在する）を指す。プレ−およびプロペプチドは、限定されるものでないが細胞内局在化シグナルであってもよい。
【００５３】
「モチーフ」、「部分配列」または「セグメント」は、より長い配列の一部を含む核酸またはアミノ酸の保存配列の短い領域を指す。例えば、そのような保存された部分配列は機能に対し重要であり、リアノジン受容体の新規のホモログを同定するために使用することが可能であると予想される。エレメントのいくつかまたは全部は推定リアノジン受容体において見出すことができることが予想される。また、与えられた任意のモチーフにおける１または２個の保存されたアミノ酸は、リアノジン受容体において異なり得ることも予想される。
【００５４】
本明細書において使用される用語「相同配列」とは、整列させた場合、１００％の同一性およびギャップを伴わない共線性を有する２つの配列を示すことを意味する。
【００５５】
「安定な形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝を生じる核およびオルガネラゲノムの両方を含む宿主ゲノムへの核酸フラグメントの移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」は、組込みもしくは安定な遺伝を伴わない遺伝子発現を生じる宿主生物体の核、またはＤＮＡ含有オルガネラへの核酸フラグメントの移入を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体は「トランスジェニック」生物体と称される。イネ、トウモロコシおよび他の単子葉植物の細胞形質転換の好適な方法は、粒子加速または「遺伝子銃」形質転換技術（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号明細書）、または導入遺伝子を含有する適切なＴｉプラスミドを使用するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介法（イシダ（Ｉｓｈｉｄａ Ｙ．）ら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。本明細書において使用される用語「形質転換」は、安定な形質転換および一過性形質転換の両方を指す。
【００５６】
用語「宿主細胞」は、単離された核酸フラグメントが安定もしくは一過的に導入されている任意の細胞または生物体を指す。宿主細胞は、より大きな生物体、組織培養における個体、または遊離生体生物体の部分であってもよい。宿主細胞の例として、細菌、真菌、昆虫、植物、および動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、かつ、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）：コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１９８９（以下「サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」）に、より詳細に記述される。
【００５８】
用語「組換え体」は、例えば、化学合成または遺伝子操作技術による核酸の単離されたセグメントの操作による配列の２つの異なる分離されたセグメントの人工的な組み合わせを指す。
【００５９】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の反復サイクルからなる、大量の特定ＤＮＡセグメントの合成のための技術である（パーキン・エルマー・シータス・インスツルメンツ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ））。代表的には、二本鎖ＤＮＡを加熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温でアニーリングし、次いで中間的な温度で延伸する。これらの３段の連続工程の１組が１サイクルをなす。
【００６０】
ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、短期間でテンプレートの複製を反復することによって、ＤＮＡを１００万倍に増幅するために使用される強力な技術である。（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５１：２６３〜２７３（１９８６）；エールリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）ら、欧州特許出願第５０，４２４号明細書；欧州特許出願第８４，７９６号明細書；欧州特許出願第２５８，０１７号明細書；欧州特許出願第２３７，３６２号明細書；ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）、欧州特許出願第２０１，１８４号明細書；ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；エールリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）、米国特許第４，５８２，７８８号明細書；およびサイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、米国特許第４，６８３，１９４号明細書）。プロセスは、ＤＮＡ合成を用意するために、特異的にインビトロ合成されたオリゴヌクレオチドの組を利用する。プライマーの設計は、解析を所望するＤＮＡの配列に依存する。該技術は、高温でテンプレートを融解し、テンプレート内の相補配列にプライマーをアニールさせ、次いで、ＤＮＡポリメラーゼでテンプレートを複製する多くのサイクル（通常２０〜５０）を介して行われる。
【００６１】
ＰＣＲ反応の産物は、アガロースゲル中での分離、続いて臭化エチジウム染色およびＵＶ透過による可視化によって分析される。あるいは、産物に標識を組み入れるために、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに添加することもできる。この場合、ＰＣＲの産物はゲルのＸ線フィルムへの暴露によって可視化される。放射性標識ＰＣＲ産物のさらなる利点は、個々の増幅産物のレベルを定量することができることである。
【００６２】
用語「組換え構築物」、「発現構築物」および「組換え発現構築物」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、当業者に周知の標準的方法論を使用して、細胞のゲノムに挿入することができる遺伝子材料の機能的単位を指す。そのような構築物はそれ自体であってもよく、またはベクターと組み合わせて使用してもよい。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者に周知である宿主植物を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。熟練者には本発明の単離された核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択および増殖させるために、ベクター上に存在すべき遺伝子エレメントは周知である。熟練者はまた、異なる独立した形質転換事象が、発現の異なるレベルおよびパターンとなり（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８；デ・アルメイダ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ）ら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２１８：７８−８６）、従って望ましい発現レベルおよびパターンを示す株を得るために多重事象をスクリーニングしなければならないことを認めるであろう。かかるスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析により達成できる。
【００６３】
本明細書において使用する用語「リアノジン受容体」は、小胞体／筋小胞体に関連する内部カルシウム（ＣａまたはＣａ＋＋）放出チャンネル−受容体を指す。これらのチャンネルは、カルシウムイオンに対する選択性を示すことが公知である一方、カリウムなどであるがこれに限定されない他のカチオンは、これらのチャンネルを介して透過することができる。用語「リアノジン受容体」、「イオンチャンネル受容体」、「イオンチャンネル」、および「リアノジン様受容体」は、本発明のイオンチャンネル膜タンパク質のファミリーを包含することを意味する。該用語は本明細書において交換可能に使用される。リアノジン受容体は、イオンチャンネルとして役立つために必ずしもリアノジン結合活性を必要としない。本発明において記載された特徴を有する機能的イオンチャンネルは、タンパク質配列のアミノ酸変化によりリアノジンまたは他の化合物の結合が変更され得る場合でさえも、特許請求の範囲に含まれる。リアノジン受容体による他の非リアノジン化合物の結合は、リアノジン受容体の同じ、または異なる領域で生じてもよい。
【００６４】
「毒性核酸フラグメント」、「毒性リアノジン受容体核酸フラグメント」、または「毒性昆虫イオンチャンネル」は、生物体に存在する場合、生物体の成長および／または生存を危うくする単離された核酸フラグメントあるいはそのサブフラグメントを指す。毒性は、単離された核酸フラグメント自体、単離された核酸フラグメントから転写されるＲＮＡまたは単離された核酸フラグメントから誘導されるＲＮＡから翻訳されるタンパク質によってであり得る。遺伝子によって生じる成長欠陥は、毒性を生じる遺伝子の部分を改変する単離された核酸フラグメントまたはそのサブフラグメント内の変異によって軽減することができる。この場合、成長の減損は全体的に緩和され得るが、成長の減損は単離された核酸フラグメントの改変によって緩和されたに過ぎないため、本来の遺伝子はなお毒性であると考えられる。
【００６５】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６よりなる群から選択されるポリペプチドと比較する場合、少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するリアノジン受容体をコードする核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチドフラグメントに関する。
【００６６】
好適な実施態様では、アミノ酸配列同一性は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％または８０％〜１００％の任意の整数の百分率であり得る。
【００６７】
リアノジンアルカロイドおよびアントラニルアミド殺虫剤によって調整されるリアノジン受容体をコードする単離された核酸フラグメントは、鱗翅目、タバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、５つのアイソタイプ）および３種の同翅目昆虫、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、トウモロコシウンカ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）、およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離されている。これまで、タバコガ、鱗翅目有害生物種の由来のリアノジン受容体の全長核酸配列またはアミノ酸配列については知られておらず、これらの核酸配列のうち少なくとも２つの変異体が存在することも知られていなかった。ワタアブラムシ、トウモロコシウンカ、およびモモアカアブラムシ由来の同翅目の配列の例もまた、本発明の開示以前には知られていない。キイロショウジョウバエの配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａリアノジン受容体をコードする先に開示されたすべての核酸配列とは異なる新規の変異体である。
【００６８】
実施例において以下に記載のように、ＰＣＲならびにそれらのＤＮＡおよびアミノ酸配列を使用して、これらの有害生物種から核酸フラグメントを単離した。類似の作用機序を有する他の殺虫剤をスクリーニングするためのアッセイの開発のためのこれらの遺伝子の使用について説明する。殺虫剤アプリケーションのための単離された核酸フラグメント、そのサブフラグメントまたはこれらのフラグメントによってコードされるポリペプチドの使用についても開示する。
【００６９】
カルシウムホメオスタシスのモジュレーターの存在または非存在に応答する機能するリアノジン受容体を提供するために、単離された核酸フラグメントを細胞において発現させることができる。これは、内部カルシウム貯蔵の放出を活性化する、それらの放出または類似のリアノジンを遮断する、特定の濃度で開いた状態のイオンチャンネルを保持する、さらに高い濃度でチャンネルを遮断する化合物をスクリーニングするための基礎を提供し得る。
【００７０】
従って、別の実施態様では、本発明は、カルシウムホメオスタシスを調整する能力について、少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）本明細書に記載の組換え構築物で宿主細胞を形質転換し；
（ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ；
（ｃ）試験しようとする化合物で、工程（ａ）の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
（ｄ）カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内カルシウムホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる。
【００７１】
本明細書において使用する「調整」は、タンパク質の活性の機能の変更、この場合、カルシウムホメオスタシスの変更または上記のリアノジン受容体活性の変更を指す。
【００７２】
なおさらなる実施態様では、本発明は、リアノジン受容体活性を調整する少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの化合物と本発明の単離された核酸フラグメントによりコードされるポリペプチドとを接触させ；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、（ａ）のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる。
【００７３】
様々な種由来のリアノジン受容体は、サブユニットのホモテトラマーとして機能的であり、各サブユニットは約０．５ＭＤａのサイズである。タンパク質のＣ末端の２０％は、カルシウムイオンが内部カルシウム貯蔵から細胞質ゾル環境へ流動するチャンネルを構成する膜貫通領域を形成する（バート（Ｂｈａｔ）ら（１９９７）、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ７３：１３２９−３６）。膜の細胞質ゾル側に対するタンパク質の残りの８０％は、多くの他のタンパク質および細胞の低分子量成分と相互作用する。これらの成分の効果は、チャンネルの「開いた」または「閉じた」状態、従って、カルシウムの放出および内部貯蔵に対する細胞質ゾルにおけるイオンの均衡に有利に働くことによって、カルシウムの流動を調整することである。
【００７４】
特に筋肉組織においてカルシウム均衡を妨害する効果は、収縮および弛緩、即ち、興奮収縮連関（ＥＣＣ）に関与する正常なプロセスを破壊することである。例えば、ヒト心臓リアノジン２型受容体は、突然心停止症候群（マークス（Ｍａｒｋｓ）ら（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：３６５−７６））および悪性の低体温症（トン（Ｔｏｎｇ）ら（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：２６３２２−２６３２６）に関与している。
【００７５】
リアノジンが天然の昆虫駆除剤として使用されている一方、化合物の構造的複雑性のため肝心な商品化が妨げられている。リアノジン受容体複合体との相互作用を介して内部カルシウム貯蔵の放出を刺激する殺虫性活性を有する容易に合成された小さな化合物を同定することが所望され得る。
【００７６】
リアノジン受容体に相互作用することが見出されている他の小さな分子は、アントラニルアミド構造に基づく分子である。「ＧＮアナログ」と称されるこれらの分子の例を図２に示し、それらの使用を実施例９および１１に概説する。多くのタイプの化学および誘導体が、リアノジン受容体複合体の機能を変更するのに有用であり得ることが予想される。生物体に対する全体的効果はリアノジンの効果、つまり活動低下および麻痺に匹敵する一方、これらの他の分子は、カルシウム放出チャンネルを開放することによるリアノジンとは作用機序が異なる。このチャンネル活性化は、カルシウム貯蔵の涸渇をもたらすが、リアノジンは、サブコンダクタンス状態のチャンネルを欠如することによって作用する。これらの「ＧＮ」分子の結合部位もまた、リアノジンの結合部位とは異なることが見出されている。それにも係らず、図３および４に示されるような昆虫リアノジン受容体を発現する組換え細胞株においては、これらのリアノジン受容体を欠如するコントロール細胞とは異なり、カルシウム貯蔵を放出するこれらの分子の能力は、リアノジン受容体タンパク質自体が「ＧＮ」化学の結合部位であることをさらに支持する。
【００７７】
化合物のこの構造クラスの効果に基づけば、リアノジン受容体は新規の有害生物防除剤の発見に価値のある生化学的標的である。他の昆虫イオンチャンネル受容体と同様に、チャンネル受容体および従って細胞カルシウム均衡の機能的特性に影響を及ぼし得るタンパク質に対する潜在的に複数の結合部位が存在する。小さな分子結合部位に加えて、多数のタンパク質が両側上および小胞体膜（ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｍｅｍｂｒａｎｅ）内の受容体に相互作用する（再検討のためのマクリル（Ｍａｃｋｒｉｌｌ）（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３７：３４５−３６１を参照のこと）。これらの相互作用を妨害することが見出された化合物もまた、有害生物防除剤として有用であり得る。
【００７８】
無脊椎動物由来のＲｙｒ遺伝子は、すべての筋肉タイプおよびニューロンにおいて広範に発現されるため、化合物を活性化するための接近可能性が予想され得る。アントラニルアミドの作用機序の症候学は、昆虫、骨格、平滑および心臓のすべての筋細胞に対するこれらの化合物の直接効果に一致する。ゴキブリ神経細胞の蛍光画像化分析またはゴキブリの肢の筋肉を使用した結合研究は、ニューロンにおけるカルシウム流入、または肢筋肉調製物への結合と、昆虫有害説物スクリーニングにおけるこれらの化合物の活性との間に密接な相関関係があることを示す。
【００７９】
従って、筋ならびに神経細胞由来の組織調製物は、単離および結合研究のための昆虫受容体の供給源である。最も適切な細胞の選択は、例えば、調べられている化学の放射性標識類似体または市販されている放射性標識リアノジンの結合親和性を使用して、達成することができる。放射性リアノジンおよびＧＮ類似体を使用する結合研究を実施例９に提示する。これは、受容体調製中の放射性標識類似体の運命、または類似体もしくは誘導体の特定の分光特徴をモニターすることを含み得るが、これらに限定されない多くの方法で決定し得る。調製物の量は、カルシウム特異的蛍光インジケーターを使用して検出されるカフェインなどの特異的受容体モジュレーターによって誘導されるカルシウム流動からの蛍光強度に基づいて評価することができる。細胞内カルシウムの変化をモニターするのに有用なインジケーターの例として、ＦＵＲＡ−２、Ｆｌｕｏ−３、およびＦｌｕｏ−４が挙げられるが、周知でありかつ有用な代替物であり得る他の化合物も存在する。あるいは、調製物は、結合する放射性標識リガンドの量から決定される組織の単位重量あたりの機能的受容体の量に基づいて評価することができる。
【００８０】
不運にも、組織サンプルは、目的のすべての有害生物から効果的なスクリーニングまたは分析に必要な量だけ得られるわけではない。従って、組換え材料による研究の重要な利点は、多くの細胞タイプおよび背景で、任意の遺伝子の単一の変異体を発現し、従って、プロモーターの選択に依存する相対的に制御された量で均質な実験調製物を産生させる能力である。さらなる利点は、種特異的受容体は、しばしば、独特な結合部位を有し、従って、発現のために遺伝子のどの供給源を選択するかという点について、組換え系が柔軟性を与えることである。これは、予め選択された多様な条件においてシステムの応答の比較分析の手段を提供する。
【００８１】
これらの供給源のいずれかから由来する十分な量の有害生物受容体は、同じ作用機序を有する他の合成化合物または天然のリガンドを同定するための有用性を有するアッセイの基礎を形成する。細胞内カルシウム濃度のモニタリングに基づくアッセイの場合、イオンチャンネルの活性化またはその遮断を生じるモジュレーターを同定することができる。結合アッセイを使用して、標識された類似体が結合する特異的部位もしくは類似体の結合を変更するアロステリック部位で受容体またはイオンチャンネルに相互作用するそれらのモジュレーターを同定することができる。
【００８２】
結合アッセイでは、一方のパートナー分子が固定化され、他方は何らかの様式で（例えば、酵素もしくは蛍光タグなどの非放射性標識を使用するかまたは放射性標識を使用することによって）標識され、溶液中遊離で添加される。分子相互作用を可能にするためのインキュベーション、および洗浄工程後、適切な検出系を使用して、結合したリガンドの量を測定する。次いで、有意な結合を示すリガンドは、タンパク質が過剰であることを確実にし、１組の既知濃度、典型的に１０−２〜１０−１０Ｍの系列希釈のリガンドで実験を行うことによって、さらに研究することができる。
【００８３】
支持体材料上でエピトープまたは他のアフィニティータグを使用し、タグに対する適切な抗体または結合因子を該支持体に付着させて、タンパク質を固定化してもよい。例えば、特異的結合対のメンバーは、免疫または非免疫タイプであり得る。免疫特異的結合対は、抗原／抗体系またはハプテン／抗ハプテン系によって例示される。結合対の抗体メンバーは、ポリクローナルもしくはモノクローナルまたはそれらの免疫反応性フラグメントであるかに係わらず、当業者によく知られた従来の方法によって、産生させることができる。免疫反応性抗体フラグメントまたは免疫反応性フラグメントという用語は、抗体の結合領域を含有するフラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、ＦＣ部分を各フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントとして規定されるＦａｂ型フラグメントであってもよく、または無傷な抗体の重鎖成分を接続するジスルフィド結合の還元切断によって得られるいわゆる「半分子」であってもよい。特異的結合対の抗原メンバーが免疫原性でない、例えば、ハプテンである場合、それをキャリアタンパク質に共有結合させて免疫原性にすることができる。
【００８４】
非免疫結合対は、２つの成分が相互に対する天然の親和性を共有するが、抗体ではない系を含む。例示的な非免疫結合対には、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン、葉酸−葉酸結合タンパク質、相補的核酸プローブなどがある。また、相互に共有結合を形成する非免疫結合対も含まれる。例示的共有結合には、マレイミドおよびハロアセチル誘導体などのスルフヒドリル反応基ならびにイソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、スルホニルハロゲン化物などのアミン反応基ならびに３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）および３−（ジメチル−アミノ）安息香酸（ＤＭＡＢ）などのカプラー色素などが含まれる。
【００８５】
アッセイに使用される適切な支持体には、ポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポリスチレンなどの合成ポリマー支持体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、アミノ化またはカルボキシル化ポリスチレン；ポリアクリルアミド；ポリアミド；ポリビニルクロリドなど；ガラスビーズ；アガロース；ニトロセルロース；ナイロン；ポリビニリデンジフルオリド、表面修飾したナイロンなど。
【００８６】
親和性タグのさらなる１つの実施例は、強結合モジュレーターまたはエフェクターの類似体であり、エフェクターの結合部位を含んでなる受容体の残基に共有的に標識するために使用され得る光親和性標識である。小さな類似体は、光照射を使用してタンパク質を共有的に修飾し、親和性部分を活性化するように変更されているだけではなく、修飾されている受容体の領域のさらなる簡便な同定のために放射性標識を担持する。修飾された残基を担持する標識された受容体またはペプチドフラグメントのさらなる分析により、類似体結合部位を含んでなるタンパク質の領域を同定することができる。
【００８７】
受容体に直接的に対する作用を介するか、またはカルシウムシグナル伝達のプロセスに関与する付随タンパク質に対する作用を介する低分子量化合物および天然産物の同定のための機能アッセイが開発されている（マクリル（Ｍａｃｋｒｉｌｌ）（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３７：３４５−３６１）。さらなる方法は、平面状脂質二重層の記録、ならびに画像化およびインサイチュカルシウム濃度変化の蛍光モニタリング（ブリランテス（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ）ら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７７：５１３−５２３；マック（Ｍａｃｋ）ら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：２３２３６−２３２４９；チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：３２６０３−３２６１２；ロドニー（Ｒｏｄｎｅｙ）ら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１２４３０−１２４３５）を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
一旦、リアノジン受容体をコードする核酸フラグメントが最初に単離され、次いで適切なベクターにクローニングされたら、該リアノジン受容体をコードする核酸フラグメントを使用し得る多くの方法が存在する。そのような核酸フラグメントを単離するための方法には、生来のＲｙｒタンパク質を発現することが公知である細胞からＲＮＡを単離することが含まれるが、これらに限定されない。この場合、組織供給源は鱗翅目および同翅目有害生物由来である。他の有害生物には、無脊椎動物界および寄生病原体由来のすべての有害生物、例えば、動物の健康問題を引き起こす有害生物または考えられる家屋内有害生物が含まれるが、これらに限定されない。そのような有害生物の例として、ノミ、ダニ、ゴキブリ、蚊、線虫、マラリア原虫、ヒツジキンバエが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
オリゴヌクレオチドプライマーを設計および合成するのに十分なＤＮＡ配列が利用可能であり、次いで、当業者がこれらのプライマーを使用して、ＲＴ ＰＣＲによりＤＮＡを作製する場合、ＲＮＡを使用し得る。従って、ＤＮＡの配列は、他の広範な無脊椎動物から受容体遺伝子を単離することが可能なプライマーを設計することを可能にするのに役立つ。プライマーを遺伝子の５’および３’より外側の領域から設計する場合、遺伝子の全体を作製することができる。あるいは、遺伝子は、遺伝子の内部領域のＲＴ ＰＣＲ後に単離された多くのサブフラグメントから組み立てることができる。この場合、遺伝子より外側の末端領域を獲得することは手間が掛かることがあり、５’−ＲＡＣＥまたはインバースＰＣＲのような手順を用いる必要があり得る。ＲＮＡは全部のまたは、ｍＲＮＡなどのいくつかの特定のタイプを富化するために分画された材料であり得る。ＲＮＡは、一般に、多くの方法で発現および増幅され、例えば、ｃＤＮＡライブラリー、または１つを超えて存在する場合、すべてのバージョンの遺伝子を捕捉し得るライブラリー産生の変異体を作製し得る。
【００９０】
あるいは、本発明の単離された核酸フラグメントは完全な細胞、細胞溶解物、部分細胞成分から抽出し得、他の細胞材料から精製し得る。核材料の場合、核酸フラグメントは、ゲノム由来であり、従って、代替的配列アレンジメントおよび従って、機能的タンパク質の異なる変異体を提供する能力を付与し得る多くのイントロンを含有する可能性がある。この核酸フラグメントを使用して、ＢＡＣ、コスミド、フォスミドまたはゲノムライブラリーの他のバージョンを作製し、遺伝子のエキソンおよびイントロンのすべての変異体が利用可能であることを確実にし得る。
【００９１】
生来の遺伝子、キメラまたは変異原性変異体またはそれらのサブフラグメントをコードする核酸フラグメントもまたは、多くの企業により付与される既知の配列を使用して化学的に合成し得る。
【００９２】
転写制御に対する特異的プロモーター、特定の細胞コンパートメントに対する標的化のため、あるいは翻訳後修飾かまたは受容体およびイオンチャンネルのカルシウムホメオスタシスにも直接的もしくは間接的に関与する膜、二次メッセンジャー、もしくは付随タンパク質との相互作用を改変するための前駆配列などのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の外側またはＯＲＦの内部の他の有用性のある配列についても考慮され得る。核酸フラグメントと受容体タンパク質、例えば、ＧＦＰ、ルシフェラーゼをコードする他のＯＲＦとの融合は、細胞における遺伝子産物の位置決定を援助するか、または受容体の産生を援助するためのアプリケーションを有する。別の例では、β−ガラクトシダーゼを受容体と相互作用することが疑わしい異なるタンパク質と融合させることができる。次いで、アッセイ可能な受容体としてβ−ガラクトシダーゼ活性を使用して、受容体と融合タンパク質との間の相互作用を調べることができる。
【００９３】
生来の遺伝子または任意の変異体、キメラ、前駆体からインビボもしくはインビトロで転写されたＲＮＡは、多くのアプリケーション、例えば、カルシウムホメオスタシスおよび細胞シグナル伝達におけるさらなる機能を研究するための成熟タンパク質、前駆体またはサブフラグメントを産生させるためのインビトロ翻訳に有用であり得る。インビトロで作製されるタンパク質のサブフラグメントは、抗体を産生させること（チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１３４１４−２１）またはリガンドまたは付随タンパク質結合部位を同定するための生化学的分析（キャラウェイ（Ｃａｌｌａｗａｙ）ら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１５８７６−８４）に対する有用性を有し得る。
【００９４】
タンパク質の配列は、受容体の特定の変異体に特異的であるか、あるいは相同性のあるそれらの領域を使用して、多くの形態の受容体に一般に交差反応するかのいずれかである抗体を設計するのに役立つ。タンパク質配列のさらなる使用は、特定のプロテアーゼによる消化を受け易い領域を同定することである。タンパク質の結合分子を伴うかまたは伴わないサブフラグメントへの消化は、これらの分子が結合する部位をマップ化することを可能にし得る。小さな有機分子の受容体結合部位の性質について理解したことを使用して、異なる多くの計算モデリングアプローチに適用し、同じ部位を標的にし、他の所望される生物学的かつ環境毒性学的活性および属性を有することができる他の小さな分子を設計し得る。
【００９５】
任意の供給源から単離された受容体は、翻訳後修飾され、プロセシングを受け、タンパク質分解により切断されて、個別であるかまたはタンパク質の本体になお会合し、なお機能的であるサブフラグメントを形成する。ゲノムＤＮＡは複数のエキソンおよびイントロンからなる可能性があるため、メッセンジャーＲＮＡの１つおきにスプライシングされたバージョンにより、１つの遺伝子が異なる受容体−イオンチャンネルタイプを産生する可能性が存在する。これらの異なるサブタイプは、カルシウムホメオスタシスにおいて異なる機能的特性を有してもよい。
【００９６】
単離された核酸フラグメントまたはその変異体は、インフェクション目的のために、プラスミド、ウイルスまたはバイナリーベクターなどであるがそれらに限定されない任意の安定なベクターへクローニングしてもよい。単離された核酸フラグメントは、構成性であるかもしくは規定の条件に応答するかのいずれかである関連する細菌、酵母、植物、卵母細胞、昆虫、または哺乳動物細胞宿主において転写および翻訳を可能にする複数のプロモーター配列に結合され得る。組換え受容体を発現するそれらの細胞の選択は、カルシウム依存的蛍光の変化（詳細については実施例９を参照のこと）、またはイオンチャンネルコンダクタンスを介して決定されるリアノジン受容体機能の変動によって同定され得、これらは、スクリーニング目的のためか、またはカルシウムホメオスタシスおよびシグナル伝達に関与する成分のさらなる研究のために使用され得る。細胞はまた、さらなる生化学的研究のための機能的受容体の供給源であり得る。そのような研究から得られる結果としては、タンパク質の分画および精製、結合ドメインの特徴付けのためのサブフラグメント分析、キメラ受容体タンパク質を形成するための異なるリアノジン受容体由来の領域をコードするドメインの交換、変更されたイオンチャンネル活性を有するアイソタイプを単離するための受容体の変異誘発、変更されたリアノジンまたはＧＮ結合を有するアイソタイプを単離するための受容体の変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
別の態様では、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１２７、１２９、１４３、および１４５よりなる群から選択される単離されたヌクレオチドフラグメントに関する。また、この単離されたヌクレオチドフラグメントの相補体も興味深い。
【００９８】
さらなる別の態様では、本発明は、少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された上記の単離された核酸フラグメントもしくはその相補体またはそのようなフラグメントの部分もしくは相補体のいずれかを含んでなる組換えＤＮＡ構築物に関する。これらのＤＮＡ構築物は、形質転換された宿主細胞におけるリアノジン受容体活性の過剰発現、アンチセンス阻害、または共抑制の目的に有用である。
【００９９】
また、ゲノム中にそのようなキメラ構築物を含んでなる真核または原核宿主細胞も興味深い。有用な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｓ２、アフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）、ＨＥＫ−２９３およびＣＨＯが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、クローニングおよび形質転換の標準的方法を使用して、バキュロウイルス自体に導入してもよい（詳細について、実施例５を参照のこと）。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株Ｓｆ９、Ｓｆ２１、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞株は、トランスフェクション研究のために使用することができる。同時トランスフェクション実験由来の上清液体を使用して、組換えウイルスおよび／または発現されたタンパク質を単離してもよい（実施例５を参照のこと）。
【０１０１】
上記の考察された手順に加えて、当業者は、高分子（例えば、ＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構築、操作および単離、組換え生物体の作製ならびにクローンのスクリーニングおよび単離のための特定の条件および手順について記載している標準的な供給源材料をよく知っている（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）；マリガ（Ｍａｌｉｇａ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９９５）；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ，１、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９８）；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ，２、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、クラーク（Ｃｌａｒｋ）編、ニューヨーク州スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９７）を参照のこと）。
【０１０２】
なおさらなる態様では、本発明は、
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６と他のイオンチャンネルおよび受容体ポリペプチド配列とを比較し；
（ｂ）工程ａにおいて得られる４もしくはそれ以上のアミノ酸の保存配列を同定し；
（ｃ）工程ｂにおいて同定される保存配列に基づいて縮重オリゴマーを設計し；そして
（ｄ）工程ｃの縮重オリゴマーを使用して、配列依存的プロトコルによって、リアノジン受容体活性を有するポリペプチドをコードする配列を単離する
ことを含んでなる、リアノジン受容体および関連ポリペプチドをコードする核酸フラグメントを単離するための方法に関する。
【０１０３】
別の態様では、本発明は、リアノジン受容体活性を有する単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６のアミノ酸配列は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有する。当業者であれば、７５％〜１００％の任意の整数の同一性パーセントがリアノジン受容体用ポリペプチド配列を同定するのに有用であることを認識するであろう。
【０１０４】
別の実施態様では、本発明は、カルシウムホメオスタシスを調整する能力について、少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）上記の組換え構築物のいずれか１つか、または配列番号５６〜６２のいずれか１つを含有する任意の組換え構築物で宿主細胞を形質転換し；
（ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ；
（ｃ）試験しようとする化合物で、工程（ａ）の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
（ｄ）カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内カルシウムホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる。
【０１０５】
本方法において、該方法はリガンド結合アッセイであることができるが、これに限定されない。さらに、本方法は、そのような細胞から得られる形質転換された宿主細胞またはイオンチャンネルの機能的活性に対する化合物の効果を検出することによって、機能的活性を評価することに基づくことができる。
【０１０６】
さらなる実施態様では、本発明は、リアノジン受容体活性を調整する少なくとも１つの化合物を評価するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの化合物と上記の単離された核酸フラグメントのいずれか１つによりコードされるポリペプチドとを接触させ；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、（ａ）のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる。
【０１０７】
本方法において、該方法はリガンド結合アッセイであることができるが、これに限定されない。さらに、本方法は有用であり得、ここで、ポリペプチドは１つを超える化合物と接触される。
【０１０８】
昆虫特異的配列は、すべての昆虫配列の間で保存されているが、非昆虫配列の間には認められない相同的部分配列を見出すことによって、同定することができる。これらの配列の多くは、配列番号６３〜１１９において見出すことができる。本明細書において提示する配列が特徴付けられるより以前は、キイロショウジョウバエの配列が利用可能な唯一の昆虫の配列であり、これは、動物リアノジン受容体配列に極めて低い（５０％未満の）相同性を有したため、昆虫特異的配列は同定することができなかった。
【０１０９】
本発明のさらなる実施態様は、配列番号６３〜１１９のいずれかに記載の少なくとも２つのポリペプチド配列を含んでなる昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントであるが、但し、前記ポリペプチド配列が配列番号５６、１２０〜１２６のいずれをも含まない。
【０１１０】
さらに別の実施態様は：
ａ）少なくとも１００アミノ酸を有する第１のポリペプチドをコードする単離された核酸配列を得て；
ｂ）第１のポリペプチド配列と、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択される比較ポリペプチド配列とを比較して、第１のポリペプチドと比較ポリペプチドとの間で１００％の配列同一性を有する領域を同定し、ここで、前記領域は比較ポリペプチドと同じ長さであり；そして
ｃ）異なる比較ポリペプチド配列で工程（ｂ）を反復し、ここで、前記異なる比較ポリペプチド配列は、１００％の配列同一性を有する第２の領域が見出されるまで、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択され、ここで、前記第２の領域は異なる比較ポリペプチドと同じ長さである
ことを含んでなる、昆虫イオンチャンネルをコードする核酸配列を同定するための方法であり得る。該方法は、１００〜６，０００アミノ酸の長さを有する第１のポリペプチドの長さによってさらに特徴付けられ得る。
【０１１１】
本発明のなおさらなる実施態様は：
ａ）毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメント、および／またはインフレーム翻訳停止コドンを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメント、および／またはインフレーム翻訳停止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接され；そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。削除可能な配列は、ｌｏｘ部位などであるがこれに限定されない組換え酵素によって認識される任意の配列であってもよい。
【０１１２】
本発明の関連実施態様は、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物自体を包含し得、ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメント、および／または少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンを含んでなり、さらにここで、転写終止核酸フラグメント、および／または少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接される。削除可能な配列は、ｌｏｘ部位などであるがこれに限定されない組換え酵素によって認識される任意の配列であってもよい。
【０１１３】
本発明の別の実施態様は、
ａ）毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え発現構築物で宿主を形質転換し、ここで、前記フラグメントはまた、前記フラグメントの発現を妨害するイントロンを含んでなり、そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。
【０１１４】
さらに別の実施態様では、本発明は、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え発現構築物を包含し得、ここで、前記単離された核酸フラグメントはまた、毒性昆虫イオンチャンネルの発現を妨害するイントロンを含んでなる。
【実施例】
【０１１５】
本発明を以下の実施例でさらに規定するが、ここで、別の方法で述べない限り、部および百分率は重量によるものであり、また、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示している一方で、例示的方法によってのみ示されることが理解されるべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠の特徴を確かめることが可能であり、また、その技術思想および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。従って、本明細書に示されかつ記載されている改変の他にも本発明の多様な改変が存在することは、先の記載から当業者には明らかであろう。そのような改変についても添付の請求の範囲内にあることが意図される。
【０１１６】
本明細書に掲載した各参考文献の開示内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０１１７】
実施例１
タバコガからのリアノジン受容体核酸フラグメントの単離
液体Ｎ２中で新鮮凍結し、冷却モーターにおいて粉体に粉砕した２ｇの４齢および５齢タバコガ幼虫から全ＲＮＡを抽出した。粉体を２０ｍｌのトリゾル（ＴｒｉＺＯＬ）ＴＭで、１５秒間激しく振盪し、次いで、サンプルを３０℃で３分間インキュベーションすることによって、抽出した。２ｍｌのクロロホルムを添加し、振盪およびインキュベーション処置を反復した。サンプルを１２，０００ｇで１０分間、８℃でスピンし、水相を新しいチューブに移した。５ｍｌのイソプロピルアルコールおよび１．２Ｍ ＮａＣｌを含有する５ｍｌの０．８Ｍクエン酸ナトリウムを水性画分と混合し、室温で１０分間後、サンプルに二度目の遠心分離を行った。ペレットを１０ｍｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、懸濁液を７５００ｇで５分間、再度遠心分離し、２ｍｌの水に溶解する前に、得られたペレットを乾燥させた。オリゴＴプライム化ｃＤＮＡ合成では、テンプレートとしてこの全ＲＮＡ、および添付されているプロトコルに従って、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭから購入したｃＤＮＡ合成キットを使用した。
【０１１８】
タバコガリアノジン受容体をコードする単離された核酸フラグメントを、ＰＣＲに基づくプロトコルを使用して、クローニングした（配列番号１）。コーディング領域の３’末端の最後の４０５６塩基のみが公的データベースから利用可能である。完全な転写物を獲得することは、可能な限り５’末端に近い転写物の領域に対するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することを意味する。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ由来の受容体のＤＮＡ配列類似性の分析、ならびに他の哺乳動物種との比較から、この目的のために、以下の縮重プライマーを設計し、合成した：
Ａ−Ｆ１：ＣＣＴＧＡＲＧＣＮＹＴＮＡＡＹＡＴＧＡＴ （配列番号１１）
Ａ−Ｆ２：ＧＡＴＣＣＴＡＡＲＧＴＮＹＴＮＧＡＹＧＴ （配列番号１２）
Ａ−Ｆ３：ＡＡＧＴＧＧＴＡＹＴＴＹＧＡＲＴＴＹＧＡ （配列番号１３）
Ａ−Ｒ１：ＴＣＧＡＡＹＴＣＲＡＡＲＴＡＣＣＡＹＴＴＮＣＣ （配列番号１４）
Ａ−Ｒ２：ＡＡＴＧＧＹＴＣＲＴＡＮＣＣＹＴＣＹＴＧ （配列番号１５）。
【０１１９】
「Ａ」と称されるプライマーは、５’末端から約１７２２ヌクレオチド〜３７０２ヌクレオチド（配列番号１）の配列の領域を含む。順方向および逆方向プライマーのすべての組み合わせを使用して、遺伝子のこの推定領域を増幅した。４μＭのそれぞれのプライマー、ｄＮＴＰ（２００μＭ）を１μｌのｃＤＮＡと共に使用して、ＰＣＲを行い、３５サイクルのＰＣＲに供した。ＰＣＲ条件は、９４℃で１５秒間、４５℃で３０秒間および７２℃で１分間であった。予想されるサイズのフラグメントを産生したプライマーの組み合わせは、Ａ−Ｆ２／Ａ−Ｒ２およびＡ−Ｆ３／Ａ−Ｒ２であった。増幅したバンドを、１．５％アガロースゲルから精製し、キットの供給されている標準プロトコルに従って、ｐＤｒｉｖｅ（登録商標）ＴＡクローニングベクター（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＴＭ）にサブクローニングした。ＰＣＲ産物の以後の配列決定により、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ配列と比較した場合、１７２２ヌクレオチド〜３７０２ヌクレオチド（配列番号１）間の遺伝子のこの領域は、首尾よく配置されていることを確認した。
【０１２０】
類似のアプローチを使用して、ヌクレオチド２７〜１４４３の間の５’末端より外側に近い遺伝の領域を同定した。
Ｄ−Ｆ１：ＧＡＧＣＡＧＧＡＹＧＡＹＧＴＮＷＳＮＴＴ （配列番号１６）
Ｄ−Ｆ２：ＧＣＴＧＣＴＧＡＲＧＧＮＴＴＹＧＧＮＡＡ （配列番号１７）
Ｄ−Ｆ３：ＧＧＴＧＡＲＧＣＮＴＧＹＴＧＧＴＧＧＡＣ （配列番号１８）
Ｄ−Ｒ１：ＧＴＣＣＡＣＣＡＲＣＡＮＧＣＹＴＣＮＣＣ （配列番号１９）
Ｄ−Ｒ２：ＡＣＴＣＫＴＡＣＹＴＴＹＴＣＮＣＣＹＴＣ （配列番号２０）
Ｄ−Ｒ３：ＧＧＴＡＴＴＧＴＴＡＲＲＣＡＹＴＣＲＴＣ （配列番号２１）
Ｄ−Ｒ４：ＴＴＴＡＧＴＡＣＮＣＣＹＴＣＹＴＣＹＴＧＲＡＡ （配列番号２２）
【０１２１】
順方向および逆方向プライマーのほぼすべての組み合わせが初期のラウンドの増幅に関与し、推定ＰＣＲ産物を直ちに、第２の、または「ネステッド」のラウンドの増幅に供した。この場合、第１のラウンドの産物の１／１００容積を、同じサイクリング条件でテンプレートとして使用した。このアプローチを使用して、Ｄ−Ｆ１／Ｄ−Ｒ３（Ｄ−Ｆ１／Ｄ−Ｒ２で入れ子状にした）；ＤＦ２／Ｄ−Ｒ３（続いてＤ−Ｆ３／Ｄ−Ｒ３）およびＤ−Ｆ２／Ｄ−Ｒ４（続いてＤ−Ｆ３／Ｄ−Ｒ３）は、アガロースゲル上で予想されたサイズのバンドを生じた。バンドを単離し、それらの配列をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒと比較した。
【０１２２】
配列のこれらの領域は、９９％を超える単離された核酸フラグメントが、ｃＤＮＡ調製物から回収され、唯一欠けているセグメントは、５’領域のはじめの２４塩基であった。このセクションおよび完全な遺伝子を得るために、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＴＭのマラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）（登録商標）増幅キットにおける記載のように５’ＲＡＣＥ手順を使用した。
ＷＬ３：ＣＡＣＡＣＡＣＴＧＣＧＡＣＡＧＡＴＣＡＧＧＣＧＧ （配列番号２３）
ＷＬ４：ＧＣＡＡＴＡＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＧ （配列番号２４）
【０１２３】
この全長配列に基づいて、新しいプライマーを設計した：
ｐＨＶＮ３−ＰａｃＩ：ＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＧＧＡＧ （配列番号２５）
ｐＲｈＣ１−ＰｍｅＩ：ＧＧＡＣＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＴＴＣＴＣＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＴＧＣ （配列番号２６）
【０１２４】
これらのプライマーは、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）ＴＭにより供給されるエキスパンド・ロング・テンプレートＰＣＲシステム（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）（登録商標）キットのプロトコルに従って、ロングＰＣＲ反応のために使用した。２段階ＰＣＲプロトコルを使用し、第１の段階は、次の反応条件、９４℃で５分間、次いで、１０秒間、９２℃、続いて、６８℃で１４分間の１０サイクルを使用した。次の段階は、１０秒間、９２℃、続いて、６８℃で、１４分間の１５サイクルで、各サイクルごとに２０秒間ずつ延長し、それぞれ５’および３’末端にＰａｃＩおよびＰｍｅＩの独特な制限部位を有する全長の単離された核酸フラグメントを生成した。
【０１２５】
１５．６ＫｂのＤＮＡフラグメントをインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭのｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングした。Ｈ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ Ｒｙｒ転写物の完全な配列を、プラスミドおよびＰＣＲ産物を使用する標準的な配列決定方法によって得た。
【０１２６】
リアノジン受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列は、ＢＬＡＳＴ検索を行うことによっても同定することができる。（基本的局所アライメント検索ツール（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）；アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）は、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全部の非冗長ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘイブンタンパク質データバンク（ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）由来の配列、スイスプロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベースの最近の主要な発表、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）中に含有される配列に対する類似性について検索する。国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用し、「ｎｒ」データベース中に含有される公的に利用可能な全部のＤＮＡ質配列に対する類似性について、実施例１を分析した。ＤＮＡ配列を全部の読み枠で翻訳し、そして、ＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギシュＷ．（Ｇｉｓｈ，Ｗ．）およびステイテスＤ．Ｊ．（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ３：２６６−２７２）を使用して、「ｎｒ」データベース中に含有される全部の公的に利用可能なタンパク質配列に対する類似性について比較した。便宜性のため、ＢＬＡＳＴにより算出されるような単に偶然で検索されたデータベース中に含有されたある配列に対するあるｃＤＮＡ配列の合致を観察するというＰ値（確率）を本明細書では「ｐＬｏｇ」値として報告し、これは報告されたＰ値の対数の負の数を表わす。従って、ｐＬｏｇ値が大きくなるほど、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡＳＴの「ヒット」が相同なタンパク質を表わす見込みが大きくなる。
【０１２７】
実施例２
モモアカアブラムシ由来のリアノジン受容体の単離された核酸フラグメントの再構築
液体Ｎ２中で新鮮凍結し、冷却モーターにおいて粉体に粉砕した０．５ｇのモモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）または任意の同翅目種から、全ＲＮＡを抽出した。粉体を２０ｍｌのトリゾル（ＴｒｉＺＯＬ）（登録商標）で、１５秒間激しく振盪し、次いで、サンプルを３０℃で３分間インキュベーションすることによって、抽出した。２ｍｌのクロロホルムを添加し、振盪およびインキュベーション処置を反復した。サンプルを１２，０００ｇで１０分間、８℃でスピンし、水相を新しいチューブに移した。５ｍｌのイソプロピルアルコールおよび１．２Ｍ ＮａＣｌを含有する５ｍｌの０．８Ｍクエン酸ナトリウムを水性画分と混合し、室温で１０分間後、サンプルに二度目の遠心分離を行った。ペレットを１０ｍｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、懸濁液を７５００ｇで５分間、再度遠心分離し、２ｍｌの水に溶解する前に、得られたペレットを乾燥させた。
【０１２８】
タバコガ遺伝子の５’配列を首尾よく生成した順方向および逆方向プライマーの「Ｄ」組の同じ組み合わせを先に記載の通りに使用した。最も３’側の領域を獲得するための第２の組のプライマーもまた、すべての既知のリアノジン受容体配列に高い相同性のある領域から設計した。
Ｅ−Ｆ１ ＧＧＡＧＧＴＧＧＮＡＴＨＧＧＮＧＡＹＧＡ （配列番号２７）
Ｅ−Ｆ２ ＡＴＣＡＴＣＧＡＹＧＣＮＴＴＹＧＧＮＧＡ （配列番号２８）
Ｅ−Ｒ１ ＡＡＲＣＡＲＴＣＮＣＣＮＡＣＮＧＧＲＡＡ （配列番号２９）
Ｅ−Ｒ２ ＡＣＮＧＧＲＡＡＲＡＡＲＴＣＣＣＡＲＣＡ （配列番号３０）
【０１２９】
Ｄ−ＦおよびＤ−Ｒの組み合わせならびにＥ−ＦおよびＥ−Ｒの組み合わせを使用して作製されたバンドは、受容体の単離された核酸フラグメントのセグメントとして、それらの予想される起源に一致する配列を生成する。５’および３’末端より外側に対する残りの配列は、以下の５’ＲＡＣＥプライマー
Ｆ−Ｒ１：ＣＣＣＴＣＴＴＧＡＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣ （配列番号３１）
Ｆ−Ｒ２：ＣＧＴＣＣＧＧＴＧＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣ（配列番号３２）
Ｆ−Ｒ３：ＧＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣ（配列番号３３）
および３’ＲＡＣＥプライマー
Ｇ−Ｆ１：ＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧ （配列番号３４）
Ｇ−Ｆ２：ＧＣＧＧＴＡＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＧＡＣ （配列番号３５）
Ｇ−Ｆ３：ＧＴＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＣＡＣＴＣＡＣＧ （配列番号３６）
を用いる実施例１に記載のようなＲＡＣＥ手順を使用して得られる。
【０１３０】
ＲＡＣＥ産物の配列を使用して、リアノジン受容体の全長コーディング領域の開始および停止コドンの外側に、ＰｍｅＩおよびＰａｃＩの独特な制限部位を組み入れるためのプライマーを設計した。
【０１３１】
使用したプライマーは：
ｐＲｇＮ−ＰａｃＩ：ＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＴＣＧ （配列番号３７）
ｐＲｇＣ−ＰｍｅＩ：ＧＧＡＣＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＧＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＣ （配列番号３８）
であった。
従って、遺伝子の全長ｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端のＰａｃＩおよびＰｍｅＩ部位で単離した。
【０１３２】
１６ｋｂのＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングし、その後、全長リアノジン受容体コーディング領域を、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩ部位を有するベクターのＭＣＳのＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位の間が改変されたｐＩＢＶ５ＨｉｓまたはｐＦＡＳＴＢａｃへサブクローニングした（配列番号３９）。
【０１３３】
トランスポゾンとプライマーウォーキングとを併用した手順を使用して、全挿入配列決定を行った。使用したトランスポゾン系は、トランスポゾンのＴＥＴ１バージョン（ゴアリシン（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ）およびレズニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：７３６７−７３７４）を使用するエピセントレ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）ＴＭ由来のＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入キットであった。２００クローンを単離し、キットにおいて供給される順方向および逆方向プライマーを使用して３８０の配列を提供した。次いで、これらの領域からプライマーを設計し、遺伝子ウォーキングによってギャップを満たした。モモアカアブラムシ遺伝子の配列を配列番号３に示す。
【０１３４】
実施例３
ワタアブラムシおよびトウモロコシウンカ由来のリアノジン受容体の単離された核酸フラグメントの再構築
ワタアブラムシおよびトウモロコシウンカ由来のリアノジン受容体コーディング領域のｃＤＮＡは、本質的に実施例２に記載の通りに得た。実施例１において使用した同じＤプライマーの組および実施例２において使用したＥプライマーの組は、２種の同翅目種に対するほぼ全長配列を生成した。以下のプライマーを、ＲＡＣＥシリーズの実験に使用して、リアノジン受容体コーディング領域の５’および３’末端の配列を生成した。ワタアブラムシについて、使用した５’ＲＡＣＥプライマーは、
ＣＭＡ−ＤＲ１：ＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＡＧＴＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣ （配列番号４０）
ＣＭＡ−ＤＲ２：ＣＡＡＴＧＴＴＣＧＧＴＧＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＣ （配列番号４１）
ＣＭＡ−ＤＲ３：ＧＡＣＧＧＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＴＣＧＧＧＴＧＧ（配列番号４２）
であり、３’ＲＡＣＥプライマーは、
ＣＭＡ−ＥＦ１：ＣＴＧＣＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＧ（配列番号４３）
ＣＭＡ−ＥＦ２：ＣＣＧＣＡＣＧＧＴＴＴＴＧＡＣＡＣＧＣＡＣＧＴＴＣ （配列番号４４）
ＣＭＡ−ＥＦ３：ＣＣＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＧＴＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＣ（配列番号４５）
であった。
トウモロコシウンカについて、５’ＲＡＣＥプライマーは、
ＣＰＨ−ＤＲ１：ＣＣＧＡＡＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＡＡＣＡＣ （配列番号４６）
ＣＰＨ−ＤＲ２：ＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＡＣＣ （配列番号４７）
ＣＰＨ−ＤＲ３：ＣＧＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣ（配列番号４８）
であり、３’ ＲＡＣＥプライマーは、
ＣＰＨ−ＥＦ１：ＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＴＧＧＣ （配列番号４９）
ＣＰＨ−ＥＦ２：ＧＴＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＡＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣ （配列番号５０）
ＣＰＨ−ＥＦ３：ＧＣＡＴＡＡＴＣＴＣＧＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣ（配列番号５１）
であった。
【０１３５】
ワタアブラムシのリアノジン受容体コーディング領域の末端にＰａｃＩおよびＰｍｅ部位を組み入れるために設計したプライマーの配列は以下の通り：
ｐＲＣＭＡＮ−ＰａｃＩ：ＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴＣＧ （配列番号５２）
ｐＲＣＭＡＣ−ＰｍｅＩ：ＧＡＡＣＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＧＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＣ （配列番号５３）
であり、トウモロコシウンカのリアノジン受容体コーディング領域の末端にＰａｃＩおよびＰｍｅ部位を組み入れるために設計したそれらは以下の通りである：
ｐＲＣＰＨＮ−ＰａｃＩ：ＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＡＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧ （配列番号５４）
ｐＲＣＰＨＣ−ＰｍｅＩ：ＧＡＡＧＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＴＡＡＣＴＣＡＴＣ （配列番号５５）。
【０１３６】
両方の全長リアノジン受容体コーディング領域を再度、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭ）にクローニングし、その後、実施例２に記載のように、改変されたｐＩＢＶ５ＨｉｓまたはｐＦＡＳＴＢａｃへサブクローニングした。
【０１３７】
リアノジン受容体コーディング領域の配列を完了するために、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにおける挿入物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素の混合物で消化した。次いで、フラグメントを、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩまたはこれらの両方を組み合わせて消化した、３つのｐＢｌｕＳｃｒｉｐｔ ＫＳベクターへサブクローニングした。ベクターを、リアノジン受容体コーディング領域サブフラグメントの混合物の存在下で再連結した。ＣＭＡおよびＣＰＨリアノジン受容体コーディング領域のそれぞれについて、約４０個の個々のクローンを個々の細菌コロニーから単離し、挿入物を、ベクタープライマーを使用して、配列決定した。配列に残っていたギャップを、遺伝子ウォーキングによって満たした。
【０１３８】
実施例４
リアノジン受容体をコードするｃＤＮＡクローンの特徴付け
表３に列挙したクローンからのＥＳＴ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、当該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＮＣＢＩ一般識別番号（ＧｅｎｅｒａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１７３５２４７１、［配列番号５６］由来のリアノジン受容体タンパク質に対する類似性を示した。個々のＥＳＴについてのＢＬＡＳＴの結果（「ＥＳＴ」）、示されたｃＤＮＡクローンを含んでなるｃＤＮＡ挿入物全体の配列（「ＦＩＳ」）、２種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ」）、ＦＩＳおよび１種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ＊」）、またはＦＩＳ、コンティグもしくはＦＩＳおよびＰＣＲ由来のタンパク質全体をコードする配列（「ＣＧＳ」）を表３に示す。
【０１３９】
【表２】
【０１４０】
表４のデータは、配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６に記載のアミノ酸配列と、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＮＣＢＩ一般識別番号（ＧｅｎｅｒａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１７３５２４７１、［配列番号５６］由来のリアノジン受容体タンパク質との同一性パーセントの計算を示す。
【０１４１】
【表３】
【０１４２】
配列のアライメントおよびパーセント同一性の計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施した。配列のマルチプルアライメントは、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用い、アライメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して実施する。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用するペアワイズアライメントのためのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＬＡＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。大きなタンパク質配列では、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗプログラム（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら（１９９４）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：４６７３−４６８０）を使用した。デフォルトのパラメータを使用した（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、ＤＥＬＡＹ ＤＩＶＥＲＧＥＮＴ ＳＥＱ （％）＝３０、ＤＮＡ ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮ ＷＥＩＧＨＴ＝０．５０、ＰＲＯＴＥＩＮ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ）。ペアワイズアライメントもまた、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１０、ＰＲＯＴＥＩＮ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：Ｇｏｎｎｅｔ ２５０、ＤＮＡ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ）を使用した。配列のアライメント、ならびにＢＬＡＳＴスコアおよび確率は、本ｃＤＮＡクローンを含んでなる核酸フラグメントがリアノジン受容体タンパク質の実質的な部分をコードすることを示す。
【０１４３】
図１は、本明細書において開示された方法によって作製されたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）配列（配列番号１０）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｒｔ配列（ＮＣＢＩ一般識別番号（ＧｅｎｅｒａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１７３５２４７１、配列番号５６）、部分的リアノジン受容体をコードする蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）ゲノム配列決定プロジェクト由来の未注釈配列（ｇｉ２１３０１５５６、配列番号５７）、線虫由来のリアノジン受容体（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、ｇｉ１８７１４４７、配列番号５８）、ウニ（Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ、ｇｉ１８６５６１５５、配列番号５９）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ｇｉ１３５６９８５０、配列番号６０）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ｇｉ１２４５３７６、配列番号６１）、およびヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ｇｉ４５０６７５７、配列番号６２）に対するタバコガ、モモアカアブラムシ、ワタアブラムシ、およびトウモロコシウンカ（配列番号２、１２８、１３０、１４４および１４６、４、６、および８）のクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗを使用したアライメントを示す。昆虫特異的配列は、すべての昆虫配列の間で保存されているが、非昆虫配列の間には認められない相同的部分配列を見出すことによって、同定することができる。これらの配列の多くは、配列番号６３〜１１９において見出すことができる。本明細書において提示する配列が特徴付けられるより以前は、キイロショウジョウバエの配列が利用可能な唯一の昆虫の配列であり、これは、動物リアノジン受容体配列に極めて低い（５０％未満の）相同性を有したため、昆虫特異的配列は同定することができなかった。
【０１４４】
表５は、図１に示したリアノジン受容体配列のついにした比較に対する同一性パーセントを示す。
【０１４５】
【表４】
【０１４６】
実施例５
昆虫細胞株におけるリアノジン組換え構築物の一過的発現
異なる昆虫由来のリアノジン受容体をコードするｃＤＮＡを、それぞれ、実施例２に記載のように、ｐＩＢＶ５ＨｉｓまたはｐＦＡＳＴＢａｃにクローニングした。しかし、当業者であれば、真核細胞に感染させるための他の多様なベクターおよび手段が存在することを理解するであろう。特に、昆虫細胞インフェクションのためのバキュロウイルスに基づく系は有用であり、いずれの系も活性型の受容体タンパク質の完全な発現および修飾を可能にする。
【０１４７】
トランスフェクション研究のために使用したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株Ｓｆ９を、２７℃でインキュベートしたＴ−７５フラスコ中Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））において維持した。当業者であれば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株Ｓｆ２１またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株Ｓ２などの代替的細胞タイプを選択し得る。一般的取り扱いおよび増殖の目的のために、削り取りまたは振盪を介して細胞を懸濁し、細胞懸濁液のある容積をポリ−Ｌ−リジンで被覆した９６ウェルガラス底プレートの各ウェルに、７０〜８０％のコンフルエンスを提供するように、添加した。試験時まで、細胞をインキュベーターにおいて２７℃で維持した。
【０１４８】
Ｓｆ−９細胞を、２７℃で、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）１２５ｍｌポリカーボネート三角フラスコ中、ＳＦ９００−ＩＩ無血清培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号１０９０２−０８８、インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の１ｍｌあたり３１０万個細胞の密度まで増殖させた。１００万個の細胞を、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）６ウェル平底細胞培養ディッシュ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）３５１６）の１つのウェルに移した。ＳＦ９００−ＩＩ培地を使用して、ディッシュ内の最終容積を２ｍｌとし、細胞を２７℃で２１時間、インキュベートした。インキュベーション後、培地をディッシュから吸引し、予め２７℃に加温しておいた１ｍｌのＳＦ９００−ＩＩ培地で置き換えた。
【０１４９】
インセクトセレクトＢＳＤシステム（ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ ＢＳＤ Ｓｙｓｔｅｍ）マニュアル（インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に従って、一過的トランスフェクションを行った。セルフェクチン（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）試薬（インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、カタログ番号１０３６２−０１０）およびＳＦ９００−ＩＩ無血清培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号１０９０２−０８８、インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））をすべてのトランスフェクションに使用した。トランスフェクションは、トランスフェクション溶液を滴下で、ディッシュに添加し、４時間、室温で、緩徐に振盪しながらインキュベートすることによって、達成した。４時間のインキュベーション後、培地を、予め２７℃に加温しておいた２ｍｌのＳＦ９００−ＩＩ培地で置き換え、細胞を、試験の前に、２〜３日間、２７℃でインキュベートした。
【０１５０】
実施例６
微生物細胞におけるキメラ遺伝子の発現
本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡをＴ７大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＢＴ４３０に挿入することが可能である。本ベクターは、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーター系を使用するｐＥＴ−３ａ（ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３５）の一誘導体である。プラスミドｐＢＴ４３０は、最初に、それらの元の位置のｐＥＴ−３ａ中のＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を破壊することにより構築した。ＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を含有するオリゴヌクレオチドアダプターをｐＥＴ−３ａのＢａｍＨ Ｉ部位に挿入した。これは、該発現ベクターへの遺伝子の挿入のための付加的な独特なクローニング部位を持つｐＥＴ−３ａＭを創製した。次いで、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用して、翻訳開始の位置のＮｄｅＩ部位をＮｃｏＩ部位に変換した。この領域中のｐＥＴ−３ａＭのＤＮＡ配列５’−ＣＡＴＡＴＧＧを、ｐＢＴ４３０中の５’−ＣＣＣＡＴＧＧに変換した。
【０１５１】
ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを適切に消化して、該タンパク質をコードする核酸フラグメントを遊離させることができる。次いで、１％ヌシーブＧＴＧ（ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ）ＴＭ低溶融アガロースゲル（ＦＭＣ、ペンシルバニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ））上でこのフラグメントを精製してよい。緩衝液およびアガロースは、ＤＮＡフラグメントの可視化のため１０μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する。次いで、製造元の説明書に従ったジェラース（ＧＥＬａｓｅ）ＴＭ（エピセントレ・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））での消化により、該フラグメントをアガロースゲルから精製し、エタノール沈殿し、乾燥しそして２０μＬの水に再懸濁することが可能である。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（ＮＥＢ）、マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を使用して、適切なオリゴヌクレオチドアダプターを該フラグメントに連結してよい。連結されたアダプターを含有する該フラグメントは、上述されたとおり低溶融アガロースを使用して過剰のアダプターから精製することが可能である。ベクターｐＢＴ４３０は、上述された通り消化し、アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）で脱リン酸化し、そしてフェノール／クロロホルムでタンパク質を除去する。調製されたベクターｐＢＴ４３０およびフラグメントをその後、１６℃で１５時間連結し、次いでＤＨ５エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に形質転換することが可能である。形質転換体は、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する寒天プレート上で選択することができる。次いで、本ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する形質転換体を、制限酵素分析によりＴ７プロモーターに関して正しい配向についてスクリーニングする。
【０１５２】
高レベル発現のためには、Ｔ７プロモーターに関して正しい配向のｃＤＮＡ挿入物をもつプラスミドクローンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換することが可能である（スタディヤー（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら（１９８６）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。培養物は、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培地中で２５℃で増殖させる。およそ１の６００ｎｍの至適密度で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、誘導物質）を０．４ｍＭの最終濃度まで添加することが可能であり、そして、インキュベーションを２５℃で３時間継続することが可能である。次いで、遠心分離により細胞を収穫し、そして、０．１ｍＭのＤＴＴおよび０．２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する５０μＬのｐＨ８．０の５０ｍＭトリス−ＨＣｌに再懸濁する。少量の１ｍｍガラスビーズを添加し、そして微小プローブ超音波処理装置（ｍｉｃｒｏｐｒｏｂｅ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて混合物を各回約５秒間３回超音波処理することが可能である。該混合物を遠心分離し、そして上清のタンパク質濃度を測定する。培養物の可溶性画分からの１μｇのタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離することが可能である。ゲルを、期待される分子量で移動するタンパク質のバンドについて観察することができる。明らかに、当業者であれば、他の細菌発現ベクター、特に、ｃＤＮＡ挿入物をインフレームで融合した場合、組換えタンパク質のＮまたはＣ末端のいずれかでＨｉｓタグ、ＭＢＰまたはＧＳＴ伸張のような精製を援助することができるポリペプチドの伸張を提供する配列の様々な選択を付与するベクターを選択し得る。
【０１５３】
ｃＤＮＡ挿入物は、酵母細胞において発現させることもできる。酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））株ＹＰＨ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））においてコードされるポリペプチドの発現およびリアノジン感受性カルシウム輸送のための膜成分をアッセイすることによって、リアノジン受容体ポリペプチドを評価することができる。任意のｃＤＮＡクローン由来のプラスミドＤＮＡ（２００ｎｇ）を、本発明において記載のプライマーを使用して、ＰＣＲのためのテンプレートとして使用することができる。増幅は、１Ｍ最終濃度のＧＣメルト（ｍｅｌｔ）試薬を伴うＧＣメルト（ｍｅｌｔ）キット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して、実施する。増幅は、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）９７００サーモサイクラーにおいて、３０サイクルを以下の通りに行った：９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で２分間。次いで、増幅させた挿入物を、適切な制限酵素で消化されている改変されたｐＲＳ３１５プラスミド（ＮＣＢＩ一般識別番号（ＧｅｎｅｒａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）９８４７９８；シコースキー、Ｒ．Ｓ．（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．）およびヒーター、Ｐ．（Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．）（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２：１９−２７）と共にインキュベートする。プラスミドｐＲＳ３１５はＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間への両方向性ｇａｌ１／１０プロモーターの挿入によって、予め改変されている。次いで、挿入物がギャップ修復を介して再結合し、所望の形質転換された酵母株を形成する標準的な手順（ホア、Ｓ．Ｂ．（Ｈｕａ，Ｓ．Ｂ．）ら（１９９７）Ｐｌａｓｍｉｄ３８：９１−９６．）を使用して、プラスミドをＹＰＨ酵母株へ形質転換する。
【０１５４】
酵母細胞は、ポンポン（Ｐｏｍｐｏｎ）ら（ポンポン、Ｄ．（Ｐｏｍｐｏｎ，Ｄ．）ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．２７２：５１−６４）の方法の改変に従って、調製される。簡単に説明すると、酵母のコロニーは、１晩（飽和まで）、ＳＧ（−ロイシン）培地中３０℃で、良好な通気を伴い増殖される。この培養物の１：５０希釈液を、アデニンを補充した５００ｍＬのＹＰＧＥ培地中に作製し、３０℃で、良好な通気を伴い、１．６のＯＤ６００まで（２４〜３０時間）増殖させる。５０ｍＬの２０％ガラクトースを添加し、培養物を１晩、３０℃で増殖させる。細胞を、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＧＳ−３ローター中５，５００ｒｐｍで、５分間の遠心分離によって、回収する。細胞ペレットを５００ｍＬの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁し、次いで、３０℃で、さらに２４時間増殖させる。
【０１５５】
上記の遠心分離によって細胞を回収し、実施例９、１０、または１１において概説したアッセイのいずれかを使用して、リアノジン受容体活性の存在を決定する。
【０１５６】
実施例７
昆虫細胞におけるＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、および他のＲｙｒ ｃＤＮＡは、昆虫発現ベクター（例えば、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の制御下でベクター内に設置した場合、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対し、かなり毒性であるようである。これらの条件下、細胞は極めて緩徐に増殖し、フレームシフト変異が自発的に導入される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＲｙｒ遺伝子の任意の発現を完全に除去する２つのクローニングストラテジーは、増殖の問題を回避し得る。
【０１５７】
第１のストラテジーでは、昆虫アクチンプロモーターの制御下にＲｙｒ遺伝子を配置する改変されたｐＸＩＮＳＥＣＴ−ＤＥＳＴ３９ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へＲｙｒ遺伝子をクローニングする。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の増殖中におけるＲｙｒ遺伝子のリーキーな発現を除去するために、ベクターのＨｉｓタグのちょうど下流（但し、Ｒｙｒ遺伝子の上流）に「停止」フラグメントを配置した。この停止フラグメントは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ｒｒｎＢ遺伝子（オロス（Ｏｒｏｓｚ）ら（１９９１）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１：６５３−６５９）由来の強力な転写ターミネーターＴ１Ｔ２を含有する。ベクターのイニシエーターＡＴＧを伴うフレーム内の停止コドンもまたこの停止フラグメント内に存在する。Ｃｒｅ酵素の存在下で、停止フラグメント全体がベクターから切り出されて、単一のＬｏｘ部位の「フットプリント」を残すような直接的配向で、Ｌｏｘ部位が停止フラグメントに隣接している（オデル（Ｏｄｅｌｌ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（１９９４）Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｐｌａｎｔｓ；Ｊ．パスクロスキー（Ｊ．Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）；２１９〜２７０頁）。停止フラグメントのＣｒｅ仲介切り出しの後に、Ｒｙｒ遺伝子がイニシエーターＡＴＧと共にフレーム内に存在し、ＡＴＧとＲｙｒ遺伝子との間に停止コドンが存在しないように、停止ベクターを設計した。ベクター由来のＡＴＧ、Ｈｉｓタグ、およびａｔｔＢ１ならびに残留Ｌｏｘフットプリントおよび関連リンカー配列の組み合わせは、５３外来アミノ酸を成熟Ｒｙｒ遺伝子産物に付加する。ｐＨＥ７ベクターの構築については、図７において概説する。
【０１５８】
インビトロゲン・ゲートウェイ・エントリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ Ｅｎｔｒｙ）ＴＭベクターｐＥｎｔｒ２Ｂ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を改変して、ポリリンカーにＰｖｕＩ部位を追加した。ｐＥｎｔｒ２Ｂを、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化した。オリゴヌクレオチド、配列番号１３１（５’−ｇａｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｔｃｇｇｔａｃｃ−３’）および配列番号１３２（５’−ｃｇａｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇ −３’）をアニールし、消化したベクターに連結させて、ｐＥｎｔｒ２Ｂ／ＰｖｕＩを生成した。ｐＸＬＨｖ７由来のＨＶ Ｒｙｒ遺伝子を、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩで消化した。ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩをＰｖｕＩで部分消化し（ｐＥｎｔｒ２Ｂ／ＰｖｕＩには第２の部位が存在する）、ＥｃｏＲＶで完全に消化し、正確なフラグメントをゲル精製した。ＲｙｒフラグメントのＰａｃＩ粘着末端は、ＰｖｕＩ粘着末端に適合し、ＰｍｅＩおよびＥｃｏＲＶ末端は、両方とも平滑である。次いで、ｐＸＬＨｖ７由来の１５．４ｋｂのＲｙｒ遺伝子フラグメントを、ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩに連結して、ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩ／ＨＶ７を作製した。
【０１５９】
６つのオリゴヌクレオチド、配列番号１３３〜配列番号１３８をアニールすることによって、停止フラグメントを作製し、次いで、プライマー配列番号１３９（５’−ｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｇｃｇｃｔａ−３’）および配列番号１４０（５’−ｇａｇａｇａｇａｇｔｔｔａａａｔａａ−３’）を使用して、ＰＣＲ増幅を行った。得られた産物をＡｆｅＩおよびＤｒａＩで消化して、平滑末端を生成させ、ｐＸＩＮＳＥＣＴ−ＤＥＳＴ３９の独特なＡｆｅＩ部位に連結して、ｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸを生成した。
【０１６０】
ｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸを使用する代わりに、ｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸ由来の停止フラグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングして、ｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸを生成した。ｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸおよびｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸは機能的に類似であり、両方ともＣｒｅによって、取り出すことができる停止フラグメントを有する。１つの違いは、昆虫細胞においてＲｙｒ遺伝子の転写を制御するプロモーターがｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸではアクチンプロモーターであるが、ｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸではＯｐＩＥ２プロモーターであることである。また、ｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸは、安定にトランスフェクトされた細胞を選択させるブラスチシジン遺伝子を含有する。
【０１６１】
ヤガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）リアノジン受容体ｃＤＮＡを、製造者の推奨に従い、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のクロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）ＬＲ反応を使用して、ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩ／ＨＶ７からｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸへ移し、ｐＨＥ７を生成した。製造者の推奨に従うｐＨＥ７のＣｒｅ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））とのインビトロ反応は、正確に停止フラグメントを切り出し、後に予想されたとおりのＬｏｘフットプリントを残した。
【０１６２】
標的昆虫細胞におけるｐＨＥ７の停止フラグメントの切り出しは、それらを、Ｃｒｅの供給源としてｐＭＬＳ１０４（シーガル（Ｓｉｅｇａｌ）およびハートル（Ｈａｒｔｌ）（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４４：７１５−７２６）でＳＦ９細胞に同時トランスフェクトすることによって、達成した。代替的アプローチとして、ｐＨＥ７をＣｒｅ酵素と共にインビトロでインキュベートすることにより、停止フラグメントのＣｒｅ仲介切り出しを行った。これらの場合、ｐＭＬＳ１０４プラスミドは、ｐＨＥ７プラスミドでは同時トランスフェクトされなかった。Ｃｒｅ反応の条件は、クリエーターＤＮＡ（Ｃｒｅａｔｏｒ ＤＮＡ）クローニング・キット（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、クロンテック・プロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）ＰＴ３４６０−１）から採用した。それぞれ２５０ｎｇのｐＨＥ７プラスミドに対し、１００ｎｇのＣｒｅ組換え酵素（クロンテック・ラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）ＴＭ、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、カタログ番号８４８０−１）を１５分間の室温反応において使用した。反応は、１×Ｃｒｅ反応緩衝液およびクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＴＭから購入したＣｒｅ組換え酵素を供給した１×ＢＳＡを含んだ。１５分間の反応後、酵素を、７０℃で５分間の熱処理により変性させた。独特ではない（ｎｏｎ−ｕｎｉｑｕｅ）制限部位に対し若干の変更を加えることにより、ｐＨＥ７について記載のＣｒｅ認識エレメントの構成を有するが、ｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸにおいてＯｐＩＥ２プロモーターに融合された他の４つのＨｖクローン（ｐＨＩ２、ｐＨＩ３、ｐＨＩ６、ｐＨＩ７）を構築した。
【０１６３】
第２のアプローチでは、大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）におけるＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ Ｒｙｒの発現の毒性は、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））などの改変された昆虫発現ベクターを使用して、克服した。イントロンフラグメントは、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓゲノムＤＮＡ由来のプライマー（順方向プライマー：配列番号１４７、５’−ｃａｇｔａａａｇｃｔｔｇａｇｔｃａｔｇｇａａａｔｔｔａｇａｃ−３’；逆方向プライマー：配列番号１４８、５’−ｔｃｔｇｇａｔｃｃｔｇｇｔｔｔｇｇａａａａｔｇｇｇｇａ−３’）で増幅した。精製されたＰＣＲ産物をｐＩＢベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入した。改変されたベクターのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認し、ｐＸＬＨｖ７からＲｙｒ遺伝子を切り出し、イントロンの後方に挿入し（配列番号１４９）、ベクターｐＩＢｉＨｖ７を生成した。
【０１６４】
トランスフェクションプロトコル
すべての試薬、実験着衣および技術は、トランスフェクションの間中、無菌のものであった。プラスミドは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＴＭプラスミド・ミディ・プレップ・キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＴＭ、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、カタログ番号１２１４３）
【０１６５】
ＳＦ９細胞を、２７℃で、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）１２５ｍｌポリカーボネート三角フラスコ中、ＳＦ９００−ＩＩ無血清培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号１０９０２−０８８、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の１ｍｌあたり３１０万個細胞の密度まで増殖させた。１００万個の細胞を、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）６ウェル平底細胞培養ディッシュ（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州アクトン（Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）、カタログ番号３５１６）の１つのウェルに移した。ＳＦ９００−ＩＩ培地を使用して、ディッシュ内の最終容積を２ｍｌとし、細胞を２７℃で２１時間、インキュベートした。インキュベーション後、培地をディッシュから吸引し、予め２７℃に加温しておいた１ｍｌのＳＦ９００−ＩＩ培地で置き換えた。
【０１６６】
Ｃｒｅ認識エレメントを含有するベクターの場合、５μｇのｐＨＥ７プラスミド、５μｇのｐＭＬＳ１０４ Ｃｒｅプラスミドおよび０．５μｇのｌａｃＺレポータープラスミド、１５μｇのセルフェクチン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）試薬（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１０３６２−０１０）およびＳＦ９００−ＩＩ無血清培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号１０９０２−０８８、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を、５００μｌの全容積で合わせることによって、トランスフェクション溶液を１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブ中で混合した。溶液は、トランスフェクションのちょうど前に、１時間、室温でインキュベートした。
【０１６７】
トランスフェクション溶液をディッシュに滴下して、緩徐に振盪しながら４時間、室温でインキュベートすることによって、トランスフェクションを達成した。４時間後、培地を、予め２７℃に加温しておいた２ｍｌのＳＦ９００−ＩＩ培地で置き換え、細胞を３日間、２７℃でインキュベートした。
【０１６８】
Ｒｙｒ ｃＤＮＡの機能的発現は、実施例９に記載のように、すべてのクローン（ｐＨＥ７、ｐＨＩ２、ｐＨＩ３、ｐＨＩ６、またはｐＨＩ７）について観察された。ｐＨＩ７およびｐＨＥ７から観察される機能的発現の間に識別可能な差異は認められなかった。
【０１６９】
当業者であれば理解できるように、本明細書に記載の系に匹敵し得るいくらかの削除系を使用することができる。削除系の例として、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、Ｆｌｐ／Ｆｒｔ、クロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）ＴＭ／Ａｔｔ、Ｇｉｎ／Ｇｉｘ、およびＲ／ＲＳ（それぞれ、オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９９０）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２３：３６９−３７８；ライズニック（Ｌｙｚｎｉｋ）ら（１９９３）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１：９６９−９７５；インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ；マエサー（Ｍａｅｓｅｒ）およびカーマン（Ｋａｈｍａｎｎ）（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３０：１７０−１７６；ならびにオノウチ（Ｏｎｏｕｃｈｉ）ら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：６３７３−６３７８）が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらは、第２のストラテジーに記載の配列（配列番号．．．．）とは異なるゲノムＤＮＡ由来のイントロン配列の導入に基づく均質な削除系を含み得る。
【０１７０】
当業者であれば理解できるように、削除系によって結合されたいくらかのフラグメントを使用して、本明細書に記載のものに等価な宿主細胞における発現を除去またはダウンレギュレートすることができる。そのようなフラグメントの例として、転写ターミネーター、Ｒｙｒコーディング配列と共にフレーム内にある停止コドン、転写リプレッサーによって認識されるオペレーター、翻訳アテニュエーター、およびアンチセンスまたは共抑制構築物に相互作用する配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
当業者であれば理解できるように、停止フラグメントは、本明細書に記載のものに等価なＲｙｒ ｃＤＮＡにおける異なる多くの位置に挿入することができる。適切な位置の例としては、遺伝子のプロモーターの上流、５’非翻訳リーダー、コーディング配列内、および３’非翻訳領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
実施例８
昆虫細胞におけるＲｙｒ ｃＤＮＡの発現
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ｐＩＢ４３Ｄ、配列番号９）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）（ｐＩＢ−ＧＡＰ７−１、配列番号３）、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（ｐＩＢ−ＣＭＡ４−３、配列番号５）、およびトウモロコシウンカ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ）（ｐＸＬ−ＣＰＨ９、配列番号７）由来のＲｙｒ ｃＤＮＡを、実施例７に記載のＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ由来のｃＤＮＡと同じ方法で、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ発現系に導入する。ｃＤＮＡは、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩでの消化によって、ベクターから放出させる。場合により、ｃＤＮＡに内部ＰｍｅＩが存在し、これらの場合、部分的ＰｍｅＩおよび完全ＰａｃＩ消化を実施して、全長ｃＤＮＡに対応するフラグメントをゲル精製する。ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩをＰｖｕＩで部分消化し（ｐＥｎｔｒ２Ｂ／ＰｖｕＩには第２の部位が存在する）、ＥｃｏＲＶで完全に消化し、正確なフラグメントをゲル精製した。ＲｙｒフラグメントのＰａｃＩ粘着末端は、ＰｖｕＩ粘着末端に適合し、ＰｍｅＩおよびＥｃｏＲＶ末端は、両方とも平滑である。次いで、Ｒｙｒ遺伝子を、ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩに連結して、ｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩにそれぞれのｃＤＮＡを挿入する。
【０１７３】
製造者の推奨に従い、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のクロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）ＬＲ反応により、ｃＤＮＡをｐＥＮＴＲ２Ｂ／ＰｖｕＩからｐＤＥＳＴ３９／ＬＯＸまたはｐＩＢＤＥＳＴ／ＬＯＸへ移す。これらの発現ベクターを、ｐＭＬＳ１０４との組み合わせか、またはインビトロでのＣｒｅとの反応後に実施例７に記載のプロトコルを使用するかのいずれかで、ＳＦ９細胞に移し、Ｒｙｒの活性を実施例９〜１１に記載のように、アッセイする。
【０１７４】
同様に、当業者であれば、任意の供給源、昆虫またはそれ以外からＲｙｒ遺伝子を切り出し、イントロンを使用して、昆虫細胞によって認識され、細胞の正常なＲＮＡプロセシング装置によって切り出される細菌宿主における毒性遺伝子の任意の発現を終止するという点で第２のアプローチの概念を満足するベクターに連結させることが可能であり得る。細胞のトランスフェクションは、実施例５に記載のように達成され得る。
【０１７５】
実施例９
カルシウム放出アッセイ
主な昆虫細胞を使用するカルシウム画像化および取り込みプロトコル：
ビードル（Ｂｅａｄｌｅ）およびリーズ（Ｌｅｅｓ）（１９８８）（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１２３−１２７頁）の方法に従い、若干の変更を加えて、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）の胚ニューロン培養を確立した。簡単に説明すると、２６〜２７齢の卵鞘を回収し、表面を滅菌し、背中線の下から３分の１の距離から線に沿って切開した。頭部を取り出し、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に配置した。精巧なピンセットを使用して、４０個の脳を個々に取り出し、７００μｌの「５＋４」培地（「５＋４」培地は５部のシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地＋４部のゴキブリ規定培地イーグル（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）（アール（Ｅａｒｌｅ）の塩を有する）（ＢＭＥ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）ＴＭ、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有した）を含有する小さなガラスバイアルに配置した。ローチＢＭＥ（Ｒｏａｃｈ ＢＭＥ）（アール（Ｅａｒｌｅ）の塩を有する）は、５部のヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（１Ｍ）、１部のペニシリン／ストレプトマイシンおよび４４部のＢＭＥ（アール（Ｅａｒｌｅ）の塩を有する）を含有した。「５＋４」培地を新たに作製し、使用前に滅菌濾過（０．２μｍフィルター）した。脳は、連続粉砕装置により以下のように分離した：１）脳を標準的なパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペットで１０回通過させた；２）得られた組織懸濁液を、本来の直径の約半分にまで先端を火炎加工したパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペットでさらに５回通過させた；３）最後の５回は、本来の直径の半分よりわずかに小さくなるように先端を火炎加工したパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペットを使用して、実施した。反復ピペッターを使用して、得られた懸濁液の５μｌ容積を、予めポリ−Ｌ−リジン（０．２ｍｇ／ｍｌ溶液）で被覆した９６ウェルガラス底プレートの各ウェルの中心に分配した。２７〜２９℃で５０分間のインキュベーション中にウェルの底に細胞を付着させた。レイボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）のＬ−１５培地およびユンケル（Ｙｕｎｋｅｒ）の改変グレース（Ｇｒａｃｅ）の培地の１：１混合物の１５０μｌを添加し、使用するまでプレートを湿式インキュベーター中、２７〜２９℃で維持した。細胞を付着させた後、ウェルをレイボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）のＬ−１５培地およびユンケル（Ｙｕｎｋｅｒ）の改変グレース（Ｇｒａｃｅ）の培地の１：１混合物で満たした（レイボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）のＬ−１５培地およびグレース（Ｇｒａｃｅ）の培地は、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得、ユンケル（Ｙｕｎｋｅｒ）の改変グレース（Ｇｒａｃｅ）の培地は、５ｍｇのＬ−メチオニン、１０ｍｇのＬ−アラニン、１８２ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１ｇのアルブミン画分Ｖ、７ｍｌのウシ胎児血清、１０ｍｌのニワトリ胚抽出物、２ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および２ｍｇの２０−ヒドロキシエクジソン（添加前にエタノール中で調製）を１００ｍｌの最終容積で添加し、滅菌濾過（０．２μｍフィルター）することによって改変したグレース（Ｇｒａｃｅ）の培地によって作製した）。細胞は、試験時まで、高湿度インキュベーター中、２９℃で維持した。
【０１７６】
ゴキブリ神経細胞を使用するカルシウム画像化および取り込みプロトコルは以下の通りである：
細胞を、次の組成（ｍＭ）：ＮａＣｌ １９０；ＣａＣｌ２ ９；ＫＣｌ ３．１；プロベネシッド １；トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液 １０；ｐＨ７．２を有する標準的な生理食塩水で濯いだ。次いで、細胞を、カルシウム感受性フルオロプローブＦｌｕｏ−４ＡＭ（ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｂｅ Ｆｌｕｏ−４ ＡＭ）（２μＭ）およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７（０．００２％）を含有する標準的な生理食塩水中、４５分間、浴槽に置いた。次いで、細胞は試験前の少なくとも１５分間、標準的な生理食塩水で濯いだ。試験前の時間内に、標準的な生理食塩水を、有機カチオンチャンネルブロッカーのピモジド（１０μＭ）を含有する標準的な生理食塩水で置き換えて、電位依存性カルシウムチャンネルを介する外部カルシウムのカルシウムの流入を阻害した。９６ウェルプレートを、ニコン・ディアフォト（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ）顕微鏡上に装架したプライアー（Ｐｒｉｏｒ）ＴＭ電動ステージ上に配置し、２０×フルオアー（Ｆｌｕｏｒ）対物レンズ（ＮＡ ０．７５）を使用して、画像撮影した。９６ウェルプレート由来の個々のウェルを、連続的に４９５ｎｍの光で励起し、５３０ｎｍで放射した蛍光を、２ピクセルビニング（画像サイズ６７２×５１２ピクセル）を有するハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）ＯＲＣＡ ＥＲデジタルカメラを使用して、検出した。
【０１７７】
ユニバーサル・イメージング・コーポレーション（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のメタモルフ（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）ＴＭ画像ソフトウェア（ユニバーサル・イメージング（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ）、ペンシルバニア州ウエストチェスター（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））を使用して、取り込みコントロール、画像処理および画像解析を行った。各ウェルについて、一連の３枚の「コントロール」画像を取り込んだ。実験化合物を添加し、続いて、各ウェルについて４枚の「実験」画像を取り込んだ。最後に、ポジティブコントロール化合物（表７のグループ２由来のＧＮ類似体）を添加し、各ウェルについて２枚の「標準」画像を取り込んだ。実験およびポジティブコントロール化合物はマルチチャンネルピペッターを介して添加したが、自動流体システムを使用することも可能である。
【０１７８】
単一または複数の試験プレートの画像取り込みの完了後、それぞれの個々のウェルからの９枚の画像のスタックに対し、次の操作よりなる取り込み後の画像処理を実施した：（１）画像スタックにおける各ピクセルについての最大グレー値の複合よりなる「分類」画像を作成した。次いで、この「分類」画像を細胞の同定のために使用した。（２）細胞の蛍光をバックグランドまたは細胞破砕物の蛍光と区別するために、１１００〜４０９０の間の値を有するピクセルを含む閾値（１２ビット、４０９５の最大値）を設定した。（３）次の形態的基準を満たすことに基づいて、個々の細胞を同定した：（ａ）細胞の外辺部が９８〜７５０ピクセルの総面積を有すること、（ｂ）細胞の形状が、縦対横の比として測定して、本来、長円形または円形である（１．０〜２．５）こと、および（ｃ）細胞は、目的の領域（上記の第２の操作において閾値によって除外されたグレー値を有するピクセル）において「穴」が認められないこと。そのようなパラメータは、この細胞タイプについて実験的に最適化されている。
【０１７９】
上記の「分類」から、同定されたそれぞれの細胞の周縁に沿って目的の画像領域（ＲＩＯ）を作成し、それぞれのＲＯＩに対する平均ピクセル値を測定した。スタックのそれぞれの画像について、この測定を反復した。９６ウェルプレート上のそれぞれのウェルにわたって、類似の計算を行い、すべてのデータを、マイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）エクセル（Ｅｘｃｅｌ）ＴＭなどのスプレッドシートプログラムに記録した。内部カルシウム貯蔵の化合物刺激型放出の結果、遊離の細胞内［Ｃａ２＋］が増加し、それによって、フルオ−４（Ｆｌｕｏ−４）の蛍光放射が増大した。あるいは、フルオ−３ＡＭ（Ｆｌｕｏ−３ ＡＭ）、フラ−２ＡＭ（Ｆｕｒａ−２ ＡＭ）または他のカルシウム感受性フルオロプローブ（ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｂｅ）を使用することも可能である。
【０１８０】
組換え昆虫細胞株を使用するカルシウム画像化および取り込みプロトコル
昆虫リアノジン受容体を一過的に発現する組換え体Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株、Ｓｆ９の懸濁液の数滴を、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバースリップ上に配置し、付着させた。次いで、細胞を、次の組成（ｍＭ）：ＮａＣｌ １３０；ＫＣｌ ５．４；ＭｇＣｌ２ １．２；ＣａＣｌ２ １．０；ＮａＨＣＯ３ ４．２；ＮａＨ２ＰＯ４ ７．３；グルコース １０；スクロース ６３；ＭＥＳ ２０；ｐＨ６．３を有する標準的な生理食塩水で濯いだ。次いで、細胞を、カルシウム感受性フルオロプローブフラ−２ ＡＭ（ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｂｅ Ｆｕｒａ−２ ＡＭ）（２μＭ）、およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７（０．００２％）を含有する標準的な生理食塩水中、３０分間、浴槽に置いた。細胞は試験前の少なくとも１５分間、標準的な生理食塩水で濯いだ。細胞株は機能的な電位依存性カルシウムチャンネルを欠くため、試験は標準的な生理食塩水中で行った。
【０１８１】
４０×油浸対物レンズ（ＮＡ１．３）を有するニコン・ディアフォト（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ）顕微鏡を使用して、画像化研究を行った。画像取り込みおよび処理は、ユニバーサル・イメージング・コーポレーション（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ペンシルバニア州ウエストチェスター（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））由来のメタフルオル（ＭｅｔａＦｌｕｏｒ）ＴＭ画像化システムを使用して実施した。カルシウムの較正は、フラ−２（Ｆｕｒａ−２）に対し１４５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）によるグリンキーウィクス（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）式を使用して行った（グリンキーウィクス（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）ら、１９８５）。細胞付着カバースリップを密閉型チャンバに配置し、ペリスタポンプを使用して、生理食塩水で細胞を連続的に潅流した。潅流液を切り換えることにより、生理食塩水に溶解した試験化合物を適用した。
【０１８２】
安定な組換え体に関与する研究について、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、またはＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ由来の昆虫リアノジン受容体（あるいは、Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ、Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉなどの他の種由来の受容体）を発現するＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株、Ｓｆ９、（Ｓｆ２１、Ｓ２などの他の細胞株も使用することが可能である）を、Ｔ７５（または他の適切なサイズの）フラスコ中、補充されたグレース（Ｇｒａｃｅ）の昆虫培地中で増殖させた。細胞は、試験時まで、インキュベーター中、２２℃で維持した。細胞に、培養培地中カルシウム感受性フルオロプローブ、フラ−２ ＡＭ（ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｂｅ Ｆｕｒａ−２ ＡＭ）（１〜２μＭ）およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７（０．００２％）を３０分間、撹拌下で懸濁充填した。次いで、細胞を遠心分離し、ペレットを、ウェルあたり約１５０，０００〜２００，０００個の細胞（９６ウェルプレート）で、以下の組成（ｍＭ）：ＮａＣｌ １３０；ＫＣｌ ５．４；ＭｇＣｌ２ １．２；ＣａＣｌ２ １．０；ＮａＨＣＯ３ ４．２；ＮａＨ２ＰＯ４ ７．３；グルコース １０；スクロース ６３；ＭＥＳ ２０；ｐＨ ６．３を有する生理食塩水に再懸濁した。３０分間の平衡化期間後、デュアル波長励起（３４０ｎｍおよび３８０ｎｍ）を伴うモレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）のフレックスステーション（ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ）ＴＭシステムを使用して、細胞プレートを試験し、５１０ｎｍで蛍光放射を測定した。組み込み型流体素子を使用して、試験およびコントロールサンプルを添加し、細胞内カルシウムを２分間の期間、モニターした。
【０１８３】
上記のプロトコルを使用して、図３は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリアノジン受容体を一過的に発現する組換え体Ｓｆ９細胞上のリアノジン受容体アゴニスト、カフェイン（１０ｍＭ）およびＣｐｄ１６（１０および１００ｎＭ）に対する応答を実証する（図３）。同様に、Ｓｆ９細胞において一過的に発現される組換え体Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓリアノジン受容体は、図４に示されるように、カフェイン（１０ｍＭ）およびＣｐｄ５（３μＭ）による攻撃後、細胞質ゾル［Ｃａ２＋］の増加を示した。脂質のみ（−ＤＮＡ）をトランスフェクトされた細胞またはトランスフェクトされていない細胞は、カフェイン（１０ｍＭ）アントラニルアミド化学に対して有意な応答を示さなかった。一過的に発現する細胞で観察されるように、カフェインおよびアントラニルアミド化学は、図５に示されるように、組換え体Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓリアノジン受容体を発現する安定にトランスフェクトされたＳｆ９細胞において、カルシウム流動化を誘導する。さらに、図６では、野生型Ｓｆ９細胞がカフェインに対して非感受性である一方、組換え体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリアノジン受容体を発現する安定にトランスフェクトされたＳｆ９細胞は、用量依存性のカルシウム流動化を示す。
【０１８４】
あるいは、励起および蛍光放射取り込みならびに流体の取り扱いについては、モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）のＦＬＩＰＲＴＭシステムなどの全プレートに基づく画像化リーダーを使用して、得ることができる。
【０１８５】
上記のプロトコルを使用して、公開された文献からの多くの既知のリアノジン受容体因子は、（胚神経細胞における）生来のゴキブリリアノジン受容体および一過的または安定的に発現される組換え体Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ受容体（Ｓｆ９細胞において発現される）に対して評価されており、結果を表６に示す。
【０１８６】
【表５】
【０１８７】
【表６】
【０１８８】
実施例１０
ゴキブリ筋膜の調製
放射性リガンド結合研究のためのゴキブリ大体筋由来の膜の調製のための手順については、本質的に、シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）ら（１９９６）Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４８：３７５−３８５に記載の通りである。関与する工程の簡単な説明は以下の通りである：
【０１８９】
６〜９週齢のゴキブリ由来の中肢および後肢を摘出し、直ちに液体窒素中に配置した。必要であれば、さらなる画分の前に、摘出した肢を−８０℃で数ヶ月間貯蔵することができる。典型的に、膜の調製は、約５５ｇ（湿重量）の摘出した肢から始めた。その後のすべての工程は４℃で行った。
【０１９０】
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４を、１ｇ（湿重量）の肢に対して９ｍｌの割合で添加した。ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）（ブリンクマン・インスツルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ニューヨーク州ウエストバリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））を、２分間、設定番号３で使用して、氷上で肢を均質化した。小皮（ｃｕｔｉｃｌｅ）のすべての画分を取り出すために、ホモジネートを、まず、２層のチーズクロスを介して、次いで、２層のチーズクロスの上に重ねた１層のガラスウールを介して通過させた。時々、すべての材料が通過する前に、粒子でチーズクロスが目詰まりした。そのような場合、新しいチーズクロス（およびガラスウール）を、残りの懸濁液のために使用した。ろ液を５０ｍｌ遠心チューブに回収し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ−３４ローター中、１，９５０×ｇｍａｘで２０分間、遠心分離した。懸濁液を回収し、３０分間、３０，０００×ｇｍａｘで遠心分離した。得られたペレットを緩衝液Ａ（１．５Ｍ ＫＣｌ、０．３Ｍスクロール、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。膜懸濁液を、ガラス−テフロン・ホモジナイザーを使用して、手動（約２５ストローク）で均質化した。懸濁液のタンパク質濃度を、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）ら（１９５１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５の方法で決定した。続いて、緩衝液Ａの添加によって、膜懸濁液を４μｇタンパク質／μｌに調整し、次いで、１ｍｌのアリコートで、−８０℃で貯蔵した。
【０１９１】
実施例１１
放射性リガンド結合アッセイ
使用したリアノジンは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス）から得た。
【０１９２】
以下の化合物の構造を図２および表７に示す。
【０１９３】
１−（３−クロロ−２−ピリジニル）−Ｎ−［２−メチル−６−［［（１−メチルエチル）アミノ］カルボニル］フェニル］−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド（Ｃｐｄ ５）は、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）（デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））で調製した。
【０１９４】
Ｎ−［４−ブロモ−２−メチル−６−［［（１−メチルエチル）アミノ］カルボニル］フェニル］−１−（２−フルオロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド（Ｃｐｄ ４）は、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）（デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））で調製した。
【０１９５】
［３Ｈ］−リアノジン（リアノジン［９，２１−３Ｈ（Ｎ）］）は、パーキンエルマーＴＭ・ライフ・サイエシズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＴＭ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））から得た。１−（２−フルオロフェニル）−Ｎ−［２−メチル−４−トリチオ−６−［［（１−メチルエチル）アミノ］カルボニル］フェニル］−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサイミド（Ｃｐｄ １）は、パーキンエルマーＴＭ・ライフ・サイエンシズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＴＭ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））によりＮ−［４−ブロモ−２−メチル−６−［［（１−メチルエチル）アミノ］カルボニル］フェニル］−１−（２−フルオロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド（Ｃｐｄ４）から２１Ｃｉ／ｍｍｏｌで調製された。
【０１９６】
ゴキブリ大腿筋膜に結合する［３Ｈ］−ＧＮ類似体［Ｃｐｄ１］：
飽和結合アッセイのために、アッセイ混合物（２００μｌ全容積／ウェル；９６ウェル、Ｕ底、ポリプロピレンプレート）は、１６３μｌの緩衝液Ｂ（０．３７５Ｍ ＫＣＬ、０．３Ｍスクロース、０．０００５Ｍ ＣａＣｌ２、０．０２０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、ＤＭＳＯ中多様な濃度のＣｐｄ１の１０μｌ、および２μｌのＤＭＳＯを含有した。「非特異的結合」の決定のために、ＤＭＳＯを、対応する「全」結合チューブにおける０．００１Ｍリアノジン＋Ｃｐｄ１の濃度の１，０００倍濃厚な濃度のＣｐｄ５を組み合わせた溶液（ＤＭＳＯ中）の２μｌで、置き換えた。アッセイは、２μｇ／μｌのゴキブリ筋膜（解凍および等容積の緩衝液Ｂの添加によって調製した）の２５μｌの添加で開始し、インキュベーションを６０分間、３２℃で行った。アッセイは、３回の反復測定で行った。
【０１９７】
選択された化合物によるＣｐｄ１の置き換えは、以下の通りであった：１６３μｌの緩衝液Ｂ、２μｌの０．００１Ｍリアノジン（ＤＭＳＯ中）および２５μｌのゴキブリ筋膜（上記のように２μｇ／μｌで調製した）を含有する各ウェルに対し、ＤＭＳＯ中の多様な濃度の選択された化合物の２μｌを添加した。化合物を、膜と共に、１０分間、３２℃で予めインキュベートさせた。プレインキュベーション後、ＤＭＳＯ中６２５ｎＭ Ｃｐｄ１の８μｌを添加し、インキュベーションを６０分間、３２℃で、進行させた。アッセイは、３回の反復測定で行った。
【０１９８】
インキュベーション後、アッセイを、氷冷緩衝液Ｂで終了させ、予め湿潤させたユニフィルター９６ＧＦ／Ｂ（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ９６ ＧＦ／Ｂ）フィルターマイクロプレート上で、ユニフィルター９６ハーベスター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ９６ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を使用して、直ちにろ過した。次いで、各アッセイウェルを、１０回、緩衝液Ｂで洗浄し、同じフィルターマイクロプレート上で回収した。次いで、フィルターマイクロプレートを真空オーブン中に、３２℃で、３時間配置し、続いて、５０μｌのマイクロシント０（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ０）（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を各ウェルに添加した。次いで、プレートを加熱密封し、トップカウント（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ）マイクロプレートシンチレーションカウンター（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を使用して、計数した。
【０１９９】
ゴキブリ大腿筋膜への［３Ｈ］−リアノジンの結合
飽和結合アッセイのために、アッセイ混合物（２００μｌ全容積／ウェル；９６ウェル、Ｕ底、ポリプロピレンプレート）は、１５５μｌの緩衝液Ａ（１．５Ｍ ＫＣＬ、０．３Ｍスクロース、０．０００５Ｍ ＣａＣｌ２、０．０２０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、エタノール中多様な濃度の［３Ｈ］−リアノジンの１０μｌ、および１０μｌのＤＭＳＯを含有した。「非特異的結合」の決定のために、ＤＭＳＯを、対応する全結合チューブにおける［３Ｈ］−リアノジンの濃度の１，０００倍濃厚な濃度の１０μｌのリアノジン（ＤＭＳＯ中）の１０μｌのリアノジンで、置き換えた。アッセイは、２μｇ／μｌのゴキブリ筋膜（解凍および等容積の緩衝液Ａの添加によって調製した）の２５μｌの添加で開始し、インキュベーションを６０分間、３２℃で行った。アッセイは、３回の反復測定で行った。
【０２００】
選択された化合物による［３Ｈ］−リアノジンの置き換えは、以下の通りであった：１５５μｌの緩衝液Ａ、および２５μｌのゴキブリ筋膜（上記のように２μｇ／μｌで調製した）を含有する各ウェルに対し、ＤＭＳＯ中の多様な濃度の選択された化合物の１０μｌを添加した。化合物を、膜と共に、１０分間、３２℃で予めインキュベートさせた。プレインキュベーション後、エタノール中２００ｎＭ［３Ｈ］−リアノジンの１０μｌを添加し、インキュベーションを６０分間、３２℃で、進行させた。アッセイは、３回の反復測定で行った。
【０２０１】
インキュベーション後、アッセイを、氷冷緩衝液Ａで終了させ、予め湿潤させたユニフィルター９６ＧＦ／Ｂ（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ９６ ＧＦ／Ｂ）フィルターマイクロプレート上で、ユニフィルター９６ハーベスター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ９６ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を使用して、直ちにろ過した。次いで、各アッセイウェルを、１０回、緩衝液Ａで洗浄し、同じフィルターマイクロプレート上で回収した。次いで、フィルターマイクロプレートを真空オーブン中に、３２℃で、３時間配置し、続いて、５０μｌのマイクロシント０（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ０）（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を各ウェルに添加した。次いで、プレートを加熱密封し、トップカウント（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ）マイクロプレートシンチレーションカウンター（パーキンエルマーＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を使用して、計数した。
【０２０２】
実施例１２
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリアノジン受容体遺伝子のための発現ベクター
公開されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのリアノジン受容体遺伝子配列（ＮＣＢＩ受託番号Ｄ１７３８９）に基づいて、２つのプライマー（配列番号１４１、５’−ａｃｃａｃｃｔｔａａｔｔａａｔｔｃｃｇａｔｔｔｇｇａｇｇｃｇｃｔｇｃｇ−３’；および配列番号１４２、５’−ｇｃｃｔｃｃｇｔｔｔａａａｃｇａｃｃｇｔｃｃａｇｔｇｃｃａｇｔｇｔｇａａｇ−３’）を設計した。これらのプライマーは、実施例１の条件に従い、成虫Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））をテンプレートとして使用するロングＰＣＲ反応に使用した。全長リアノジン受容体遺伝子をｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＴＭ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングし、その後、全長遺伝子を、実施例２に記載のように、改変されたｐＩＢＶ５ＨｉｓまたはｐＦＡＳＴＢａｃへサブクローニングした。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、本明細書において開示された方法によって作製されたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）配列（配列番号１０）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｒｔ配列（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１７３５２４７１、配列番号５６）、蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）ゲノム配列決定プロジェクト由来の未注釈配列（ｇｉ２１３０１５５６、配列番号５７）、線虫由来のリアノジン受容体（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、ｇｉ１８７１４４７、配列番号５８）、ウニ（Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ、ｇｉ１８６５６１５５、配列番号５９）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ｇｉ１３５６９８５０、配列番号６０）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ｇｉ１２４５３７６、配列番号６１）、およびヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ｇｉ４５０６７５７、配列番号６２）と比較した鱗翅目種、タバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、配列番号２、１２８、１３０、１４４および１４６）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、配列番号４）、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、配列番号６）、およびトウモロコシウンカ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ、配列番号８）由来の５つのリアノジン受容体の推定アミノ酸配列のアライメントを示す。昆虫特異的配列は、すべての昆虫配列の間で保存されているが、非昆虫配列の間には認められない相同的部分配列を見出すことによって、同定することができる。これらの配列の多くは、配列番号６３〜１１９において見出すことができる。
【図２】図２は、実施例９において提示されるカルシウム放出アッセイ、または実施例１１において提示される放射性標識結合研究において使用された３つのクラスのアントラニルアミドの化学構造を示す。
【図３】図３は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒリアノジン受容体を一過的に発現する組換えＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株（Ｓｆ９）からカフェインまたは化合物１６（表７）のいずれかによって誘発されるカルシウム応答の例を示す。トランスフェクション９６時間後、リアノジン受容体アゴニスト、カフェイン（１０ｍＭ）および化合物１６（１０および１００ｎＭ）で細胞を攻撃した。ＤＮＡを伴わないコントロール細胞におけるカフェイン（１０ｍＭ）または化合物１６（１０および１００ｎＭ）では、有意なカルシウム応答は観察されなかった。
【図４】図４は、組換えＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓリアノジン受容体を一過的に発現する組換えＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株（Ｓｆ９）からカフェインまたは化合物５（表７）のいずれかによって誘発されるカルシウム応答の例を示す。トランスフェクション７２時間後、リアノジン受容体アゴニスト、カフェイン（１０ｍＭ）および化合物５（３μＭ）で細胞を攻撃した。ＤＮＡを伴わないコントロール細胞におけるカフェイン（１０ｍＭ）または化合物５（３μＭ）では、有意なカルシウム応答は観察されなかった。
【図５】図５は、組換えＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓリアノジン受容体を一過的に発現する組換えＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株（Ｓｆ９）からカフェインまたは化合物１４（表７）のいずれかによって誘発されるカルシウム応答の例を示す。リアノジン受容体アゴニスト、カフェイン（１０ｍＭ）および化合物１４（１μＭ）で細胞を攻撃した。Ｓｆ９細胞をガラスカバースリップに付着させ、次いで、カルシウムプローブフラ−２ ＡＭ（Ｆｕｒａ−２ ＡＭ）で充填し、カルシウム画像化システムを使用してアッセイして、カルシウム流動をモニターした。
【図６】図６は、野生型Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９−ＷＴ）、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｓｆ９−ＤｒｙＲ）リアノジン受容体を安定的に発現する組換えＳｆ９細胞に関するカフェイン用量応答曲線を示す。Ｓｆ９細胞をカルシウムプローブフラ−２（Ｆｕｒａ−２）で充填し、次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートに配置し、組み込み型流体素子を有するモレキュラー・デバイス・フレックスステーションＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ’ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎＴＭ）プレートリーダーを使用してアッセイして、カルシウム流動をモニターした。
【図７】図７は、ｐＨＥ７の構築の略図を示す。明快にするために、ＤＮＡフラグメントは一定のスケールでは描いておらず、環状プラスミドを線状様式で示し、プラスミドの関連部分のみを示す。
【配列表】
【図１ＦＦ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１２８、１３０、１４４、および１４６よりなる群から選択されるポリペプチドと比較する場合、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するリアノジン受容体をコードする核酸配列；または
（ｂ）（ａ）の相補体
を含んでなる単離されたヌクレオチドフラグメント。
【請求項２】
配列同一性が少なくとも８５％である請求項１に記載の単離された核酸フラグメント。
【請求項３】
配列同一性が少なくとも９０％である請求項１に記載の単離された核酸フラグメント。
【請求項４】
配列同一性が少なくとも９５％である請求項１に記載の単離された核酸フラグメント。
【請求項５】
ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列を含んでなる請求項１に記載の単離された核酸フラグメント。
【請求項６】
配列番号１、３、５、７、９、１２７、１２９、１４３、または１４５のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸フラグメント。
【請求項７】
少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された請求項１または５に記載の単離された核酸フラグメントを含んでなる組換え構築物。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え構築物を含んでなる形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｓ２、アフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）、ＨＥＫ−２９３およびＣＨＯよりなる群から選択される請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６と他のイオンチャンネルおよび受容体ポリペプチド配列とを比較し；
（ｂ）工程ａにおいて得られる４もしくはそれ以上のアミノ酸の保存配列を同定し；
（ｃ）工程ｂにおいて同定される保存配列に基づいて縮重オリゴマーを設計し；そして
（ｄ）工程ｃの縮重オリゴマーを使用して、配列依存的プロトコルによって、リアノジン受容体活性を有するポリペプチドをコードする配列を単離する
ことを含んでなる、リアノジン受容体および関連ポリペプチドをコードする核酸フラグメントを単離するための方法。
【請求項１１】
リアノジン受容体活性を有する単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、４、６、８、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列とが少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド。
【請求項１２】
該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、４、６、８、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列とが少なくとも８５％の同一性を有する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、４、６、８、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列とが少なくとも９０％の同一性を有する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、４、６、８、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列とが少なくとも９５％の同一性を有する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
該ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列を含んでなる請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
カルシウムホメオスタシスを調整する能力について、少なくとも１つの化合物を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項７に記載の組換え構築物で宿主細胞を形質転換し；
（ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ；
（ｃ）試験しようとする化合物で、工程（ａ）の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
（ｄ）カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内カルシウムホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる方法。
【請求項１７】
リアノジン受容体活性を調整する少なくとも１つの化合物を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの化合物と請求項１に記載の単離された核酸フラグメントによりコードされるポリペプチドとを接触させ；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、（ａ）のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる方法。
【請求項１８】
方法がリガンド結合アッセイである請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
該方法が形質転換された宿主細胞の機能的活性に対する化合物の効果を検出することによって機能的活性を評価することに基づく請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドが１つを超える化合物と接触される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号６３〜１１９のいずれかに記載の少なくとも２つのポリペプチド配列を含んでなる昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントであるが、但し、前記ポリペプチド配列が配列番号５６、１２０〜１２６のいずれをも含まない単離された核酸フラグメント。
【請求項２２】
ａ）少なくとも１００アミノ酸を有する第１のポリペプチドをコードする単離された核酸配列を得て；
ｂ）第１のポリペプチド配列と、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択される比較ポリペプチド配列とを比較して、第１のポリペプチドと比較ポリペプチドとの間で１００％の配列同一性を有する領域を同定し、ここで、前記領域は比較ポリペプチドと同じ長さであり；そして
ｃ）異なる比較ポリペプチド配列で工程（ｂ）を反復し、ここで、前記異なる比較ポリペプチド配列は、１００％の配列同一性を有する第２の領域が見出されるまで、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択され、ここで、前記第２の領域は異なる比較ポリペプチドと同じ長さである
ことを含んでなる、昆虫イオンチャンネルをコードする核酸配列を同定するための方法。
【請求項２３】
第１のポリペプチドが１００〜６，０００アミノ酸の長さを有する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接され；そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。
【請求項２５】
ａ）毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接され；そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。
【請求項２６】
ａ）毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは、少なくとも１つの転写終止核酸フラグメントおよび前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンより本質的になる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントおよび翻訳終止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接され；そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。
【請求項２７】
ａ）毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、前記フラグメントはまた、前記フラグメントの発現を妨害するイントロンを含んでなり、そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。
【請求項２８】
削除可能な配列はｌｏｘ配列である請求項２４、２５または２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接される組換え構築物。
【請求項３０】
毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接される組換え構築物。
【請求項３１】
毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、プロモーターは、少なくとも１つの転写終止核酸フラグメントおよび前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンより本質的になる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントおよび翻訳終止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接される組換え構築物。
【請求項３２】
削除可能な配列がｌｏｘ配列である請求項２９、３０または３１のいずれか１項に記載の組換え構築物。
【請求項３３】
毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、前記単離された核酸フラグメントはまた、毒性昆虫イオンチャンネルの発現を妨害するイントロンを含んでなる組換え構築物。
【請求項１】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１２８、１３０、１４４、および１４６よりなる群から選択されるポリペプチドと比較する場合、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するリアノジン受容体をコードする核酸配列；または
（ｂ）（ａ）の相補体
を含んでなる単離されたヌクレオチドフラグメント。
【請求項２】
配列同一性が少なくとも８５％である請求項１に記載の単離された核酸フラグメント。
【請求項３】
配列同一性が少なくとも９０％である請求項１に記載の単離された核酸フラグメント。
【請求項４】
配列同一性が少なくとも９５％である請求項１に記載の単離された核酸フラグメント。
【請求項５】
ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列を含んでなる請求項１に記載の単離された核酸フラグメント。
【請求項６】
配列番号１、３、５、７、９、１２７、１２９、１４３、または１４５のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸フラグメント。
【請求項７】
少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された請求項１または５に記載の単離された核酸フラグメントを含んでなる組換え構築物。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え構築物を含んでなる形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｓ２、アフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）、ＨＥＫ−２９３およびＣＨＯよりなる群から選択される請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、および１４６と他のイオンチャンネルおよび受容体ポリペプチド配列とを比較し；
（ｂ）工程ａにおいて得られる４もしくはそれ以上のアミノ酸の保存配列を同定し；
（ｃ）工程ｂにおいて同定される保存配列に基づいて縮重オリゴマーを設計し；そして
（ｄ）工程ｃの縮重オリゴマーを使用して、配列依存的プロトコルによって、リアノジン受容体活性を有するポリペプチドをコードする配列を単離する
ことを含んでなる、リアノジン受容体および関連ポリペプチドをコードする核酸フラグメントを単離するための方法。
【請求項１１】
リアノジン受容体活性を有する単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、４、６、８、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列とが少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド。
【請求項１２】
該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、４、６、８、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列とが少なくとも８５％の同一性を有する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、４、６、８、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列とが少なくとも９０％の同一性を有する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２、４、６、８、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列とが少なくとも９５％の同一性を有する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
該ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２８、１３０、１４４、または１４６のアミノ酸配列を含んでなる請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
カルシウムホメオスタシスを調整する能力について、少なくとも１つの化合物を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項７に記載の組換え構築物で宿主細胞を形質転換し；
（ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ；
（ｃ）試験しようとする化合物で、工程（ａ）の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
（ｄ）カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内カルシウムホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる方法。
【請求項１７】
リアノジン受容体活性を調整する少なくとも１つの化合物を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの化合物と請求項１に記載の単離された核酸フラグメントによりコードされるポリペプチドとを接触させ；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、（ａ）のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる方法。
【請求項１８】
方法がリガンド結合アッセイである請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
該方法が形質転換された宿主細胞の機能的活性に対する化合物の効果を検出することによって機能的活性を評価することに基づく請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドが１つを超える化合物と接触される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号６３〜１１９のいずれかに記載の少なくとも２つのポリペプチド配列を含んでなる昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントであるが、但し、前記ポリペプチド配列が配列番号５６、１２０〜１２６のいずれをも含まない単離された核酸フラグメント。
【請求項２２】
ａ）少なくとも１００アミノ酸を有する第１のポリペプチドをコードする単離された核酸配列を得て；
ｂ）第１のポリペプチド配列と、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択される比較ポリペプチド配列とを比較して、第１のポリペプチドと比較ポリペプチドとの間で１００％の配列同一性を有する領域を同定し、ここで、前記領域は比較ポリペプチドと同じ長さであり；そして
ｃ）異なる比較ポリペプチド配列で工程（ｂ）を反復し、ここで、前記異なる比較ポリペプチド配列は、１００％の配列同一性を有する第２の領域が見出されるまで、配列番号６３〜１１９よりなる群から選択され、ここで、前記第２の領域は異なる比較ポリペプチドと同じ長さである
ことを含んでなる、昆虫イオンチャンネルをコードする核酸配列を同定するための方法。
【請求項２３】
第１のポリペプチドが１００〜６，０００アミノ酸の長さを有する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接され；そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。
【請求項２５】
ａ）毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接され；そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。
【請求項２６】
ａ）毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは、少なくとも１つの転写終止核酸フラグメントおよび前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンより本質的になる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントおよび翻訳終止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接され；そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。
【請求項２７】
ａ）毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、前記フラグメントはまた、前記フラグメントの発現を妨害するイントロンを含んでなり、そして
ｂ）組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。
【請求項２８】
削除可能な配列はｌｏｘ配列である請求項２４、２５または２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接される組換え構築物。
【請求項３０】
毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接される組換え構築物。
【請求項３１】
毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、プロモーターは、少なくとも１つの転写終止核酸フラグメントおよび前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも１つのインフレーム翻訳終止コドンより本質的になる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントおよび翻訳終止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも１つの核酸配列によって各末端上において隣接される組換え構築物。
【請求項３２】
削除可能な配列がｌｏｘ配列である請求項２９、３０または３１のいずれか１項に記載の組換え構築物。
【請求項３３】
毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを５’から３’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、前記単離された核酸フラグメントはまた、毒性昆虫イオンチャンネルの発現を妨害するイントロンを含んでなる組換え構築物。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００６−５１６８８４（Ｐ２００６−５１６８８４Ａ）
【公表日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３８４０１（Ｐ２００４−５３８４０１）
【出願日】平成１５年９月２３日（２００３．９．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２９８３４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２７０４２
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
テフロン
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月２３日（２００３．９．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２９８３４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２７０４２
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
テフロン
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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