リポソーム組成物およびその使用方法
【課題】光増感剤及び化学治療剤を含有し、光励起により速やかに薬物を放出することができるとともに、光線力学的療法と化学療法との併用効果を有するリポソームを提供する。
【解決手段】安定性が高く、飽和脂肪酸鎖を有するリン脂質及びコレステロールを用いて、光増感剤を脂質二重層に内包する光感受性リポソームを設計する。光増感剤は光励起によりリン脂質と化学反応し、薬物のリポソームからの放出を促進する。リポソームは脂質二重層構造を有するため、リポソームは２種類の物質を同時に内包することができ、親水層に親水性薬物を内包すると同時に、疎水層に光増感剤を内包する。適当な波長の光源で疎水層に内包される光増感剤を励起させることによりリポソームの安定性に影響を与え、よって薬物を放出させる。一重項酸素及びフリーラジカルはリポソームから遊離するとともにがん細胞を攻撃し、光線力学的療法と化学療法との併用効果に達する。
【解決手段】安定性が高く、飽和脂肪酸鎖を有するリン脂質及びコレステロールを用いて、光増感剤を脂質二重層に内包する光感受性リポソームを設計する。光増感剤は光励起によりリン脂質と化学反応し、薬物のリポソームからの放出を促進する。リポソームは脂質二重層構造を有するため、リポソームは２種類の物質を同時に内包することができ、親水層に親水性薬物を内包すると同時に、疎水層に光増感剤を内包する。適当な波長の光源で疎水層に内包される光増感剤を励起させることによりリポソームの安定性に影響を与え、よって薬物を放出させる。一重項酸素及びフリーラジカルはリポソームから遊離するとともにがん細胞を攻撃し、光線力学的療法と化学療法との併用効果に達する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規リポソーム徐放システムの構築に関わる。特に、本発明は光増感剤をリポソームの脂質二重層に、放出制御されるべき薬物を親水層に内包させ、光励起により光線力学的作用を誘発して一重項酸素を生成させ、リポソームにおける薬物の放出率を向上し、がん細胞に対する毒殺作用を果たすものである。また、該一重項酸素及びフリーラジカルががん細胞を攻撃するため、光線力学的と化学的との併用療法の効果を達する。本発明は更に、新規抗がん剤及びその使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Banghamらは、１９６５年、透過性を有する脂質小胞体を発見し、１９６８年、SessaとWeissmannらはこの小胞体をリポソーム（liposome）と正式に名づけ、且つリポソームは一層又は複数層の脂質二重層膜（lipid bilayer）からなる小胞体であると定義した。
【０００３】
１９７０年から、リポソームは以下のような特性を有するため、好適なドラッグキャリアー（drug carrier）と認められるようになってきた。
（１）リポソームはリン脂質からなり、細胞膜の構成成分と同一であり、生体内で分解可能なため、毒性を持たず、蛋白質のように免疫反応を起こすこともなく、繰り返し使用可能である。
（２）リポソームに内包される薬物は緩慢な速度で放出され、薬動力学的プロフィールを変化させることにより薬物の治療効率を向上する。
（３）薬物をリポソームに内包させることにより、副作用を減少することができる。
（４）リポソームはその脂質構成、粒子サイズ、構造、調製方法などの変化により、さまざま異なる場合に適用することができる。
【０００４】
１９９０年代に、ＰＥＧ−ＰＥを（disteroylphosphotidyl-choline）リポソーム表面にグラフトし、リポソームの粒子径を２００ｎｍ以下に縮小すると、この種のリポソームは長時間にわたって血中に循環できることが発見された。さらに腫瘍組織が複数の新生血管を有し、且つその血管内皮細胞が緊密ではないため、この種の長期血中滞留型リポソーム（long-circulating liposomes）は内皮細胞の隙間を通過可能であり、腫瘍組織において比較的高い集積量があり、正常な組織の１０倍以上に達する。特許文献１において、リポソーム製法にＰＥＧ−ＰＥをできるだけ多く加えると、リポソームの凝集及び融合を防止できるので、リポソーム製剤の保存期間が延長されることを示唆している。
【０００５】
現在、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（登録商標）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）など、長期血中滞留型リポソームを利用して抗がん剤を内包する製品は既に市販化されている。この二種類の製剤はドキソルビシン（Doxorubicin）を内包するものであり、目下ＦＤＡにより認可された抗がん剤である。しかし、従来の長期血中滞留型リポソームは以下の不具合を有する。
【０００６】
１．リポソームの構成が安定しすぎており、通常完全飽和のリン脂質に高含量のコレステロールを加えるため、リポソームが標的組織に到達後、薬物が速やかに放出できなくなる。
２．ＰＥＧ−ＰＥはリポソーム中の薬物放出能力を阻害する可能性がある。
３．ＰＥＧ−ＰＥはリポソームの腫瘍組織及び細胞への進入能力を阻害する可能性がある。
【０００７】
リポソームが小さければ小さいほど、皮膚の角質層又は粘膜組織を容易に透過し、よって所望の部位に到達することは多くの研究で明らかになている。リポソームの製造及び保存過程に、如何にリポソームの凝集及び融合、ひいてはリポソーム内の薬物の浸透を回避することができるかは製剤の研究開発において重要な課題となる。このため、高安定性を有し且つ薬物の放出を精確に制御可能なリポソーム製法の設計は目下リポソームの研究開発における重要な目標の一つになっている。
【０００８】
目下、多くの研究者はリポソームの薬物放出を制御するために積極的に様々な方法を試みており、基本的にはリポソーム構造の不安定化を誘発することにある。
Grossweiner（１９８０）は卵黄ホスファチジルコリン（Egg PC：不飽和結合を有する）及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ：全て飽和結合）を用いて調製したリポソームを細胞膜のパターンとする。リポソームで蛍光物質のエオシン（Eosin）を内包し、さらにリポソームをメチルブルー溶液と混合させ、試験の結果から、リポソームに光を当てるとエオシンが放出されることを発見した。その結果、上述の方法によってエオシンを効果的に放出し、メチルブルーの励起により生成されたフリーラジカル及びスーパーオキシドアニオンラジカルがリン脂質の脂肪酸鎖を攻撃するため、不安定な脂質二重層が生成されることが分かった。この光増感剤がリポソーム内に位置していないので、脂肪酸鎖を攻撃するために一重項酸素とフリーラジカルとは脂質二重層まで透過しなければならないため、このようの現象は光化学効果の低減を招くことがある。
【０００９】
また、がん治療の臨床研究において手術による切除のほか、多くは化学療法でがん細胞を抑制するが、臨床研究から数回の化学療法による治療後、がん細胞が徐々に薬物耐性を生じることが発見されたため、がん治療法において、異なる化学治療剤又は治療方法を同時に併用するか、又は相互に交替することによりがん細胞を毒殺、抑制し、その中に光線力学的療法という療法がある。光線力学的療法は光増感剤、酸素及び光という３つの要素を含んでおり、光増感剤自体は人体に対する毒性がほとんどないが、光増感剤が腫瘍組織に集積する際、適当な波長と線量の光照射を受けた後、光増感剤はエネルギーを吸収し励起状態になると共に、エネルギーを近傍の酸素又は他の物質に移動させることで、細胞毒性を有する一重項酸素及びフリーラジカルを生成し、よってがん細胞を毒殺する。現在、リポソーム剤型のドキソルビシン（Doxorubicin）と光線力学的療法とを合わせて作用させることを提出した文献があったが、確かに腫瘍の抑制に対し良好な効果を有する。
【００１０】
目下のリポソーム調製技術によって安定性が高いリポソームを生産することを可能にしたが、標的位置におけるリポソームの速放を制御可能な有効な方法はまだない。このほか、現在光増感剤及び他の水溶性薬物を同一のリポソームに内包させる二重内包薬剤は一つもない。
【特許文献１】台湾特許第０８８１０１３５９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述に鑑みて、本発明は光増感剤及び化学治療剤を含有し、光励起により速やかに薬物を放出することができるとともに、光線力学的療法と化学療法との併用効果を有するリポソームを提供する。
本発明の目的及びメリットにつき、以下のように部分的に記述するか、又は記述から明らかに読み取ることができる。
本発明の目的は、主に光線力学的作用により薬物のリポソームからの放出速度及びがん細胞の毒殺率を向上させる、新規のリポソーム徐放システムを提供することにある。
本発明の別の目的は新規抗がん剤及びその治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は光増感剤及び親水性物質を同時にリポソームに内包させる応用システムに関わる。該光感受性リポソーム製剤は安定なリポソームであり、且つ薬物のリポソームからの放出速度を制御することができる。また、本発明は光増感剤と化学治療剤との共通キャリアーを提供する。光励起された後、この種のリポソームは薬物放出制御の能力を有するだけでなく、光線力学的療法と化学療法との併用効果も有する。
【００１３】
本発明は、安定性が高く、飽和脂肪酸鎖を有するリン脂質及びコレステロールを用いて、光増感剤を脂質二重層に内包する光感受性リポソームを設計するものである。該光増感剤は光励起によりリン脂質と化学反応し、よって薬物のリポソームからの放出を促進する。リポソームは脂質二重層構造を有するため、本発明に係るリポソームは２種類の物質を同時に内包することができ、即ち、親水層に親水性薬物を内包すると同時に、疎水層に光増感剤を内包する。適当な波長の光源で疎水層に内包される光増感剤を励起させることにより一重項酸素及びフリーラジカルを生成し、リン脂質の炭素鎖の酸化反応、ひいては切断反応を引き起こし、これによりリポソームの安定性に影響を与え、よって薬物を放出させる。該一重項酸素及びフリーラジカルはリポソームから遊離するとともにがん細胞を攻撃し、光線力学的療法と化学療法との併用効果に達する。
【００１４】
本発明は光増感剤をリポソーム脂質二重層に内包するリポソームに関わり、該リポソームの親水層は例えば、ドキソルビシン（Doxorubicin）及びカルセイン（Calcein）などのモデル製剤（model drug）を内包するが、これに限定されるものではない。同時に、該リポソームの疎水層に例えば、ヘマトポルフィリン（ＨＰ：Hematoporphyrin）及びプロトポルフィリン（Ｐｐ：Protoporphyrin）などの光感受性物質を内包するが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
本発明のリポソーム組成物は、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ：1,2-Disteroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine）を飽和脂肪酸鎖含有リン脂質のパターンとし、コレステロール、ポリエチレングリコール−ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ：Polyethyleneglycol-derivated Distearoylphosphatidylethanolamine）を添加してリポソームの基本的な製法にし、更に脂質二重層に疎水性光感受性物質（例えば、ヘマトポルフィリン及びプロトポルフィリンがあるがこれらに限定されるものではない）を内包させ、親水層に水溶性薬物を内包させる。試験の結果として、前記リポソーム組成物は光源の照射で生成した一重項酸素及びフリーラジカルにより、リン脂質の脂肪酸鎖を切断できることが証明されている。該リポソームは薬物の放出を制御することができ、且つ光励起された後がん細胞に対する毒殺効果を効果的に向上することができる。
【００１６】
本発明は更に光増感剤を含有するリポソーム組成物の使用に関する方法を記述する。本発明に使用される光源は波長が比較的長い光源であり、例えば、波長が６００ｎｍ〜６７０ｎｍの光源であるがこれに限定されるものではない。前記光源は光増感剤を励起し且つリポソームの安定性を影響し、リポソームに内包される薬物を放出するようにさせ、そして生成された一重項酸素及びフリーラジカルがリポソームから同時に遊離してがん細胞を攻撃するため、光線力学的及び化学的の併用療法の効果を生じる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の他の特性は次に詳しく説明される具体的実施例により明らかになる。
以下の実施例は本発明の技術内容、即ち達成できる効果につき説明するが、本発明を限定するものではない。本発明に基づいて成した如何なる適宜変形及び修正も本発明の範囲に属するものである。
本発明は光感受性物質をリポソーム脂質二重層に内包するリポソームに関し、該リポソームの親水層は例えば、ドキソルビシン（Doxorubicin）及びカルセイン（Calcein）などの薬物を内包するが、これらに限定されるものではない。その疎水層に光増感剤を内包することで、該リポソーム脂質二重層を不安定化させ、リポソームにおける薬物の放出効率を向上する。
【００１８】
本発明に係るリポソーム組成物の脂質二重層には疎水性光増感剤が内包され、該疎水性光増感剤はポルフィリン（Porphyrin）からなる群より選ばれたものであるが、如何なる光増感剤に限定されるものではない。本発明の一実施例は、ヘマトポルフィリン（Ｈｐ：Hematoporphyrin）及びプロトポルフィリン（Ｐｐ：Protoporphyrin）からなる群より選ばれたプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ： Protoporphyrin ＩＸ）を用いるが、該リポソームの親水層に内包された水溶性薬物はドキソルビシンやカルセインなどを含むがこれらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明の別の目的は、特定波長の光源によりリポソームの脂質二重層内の光感受性物質を活性化させ、一重項酸素及びフリーラジカルを生成するようにし、リポソーム内の抗がん剤を放出させると共に、該一重項酸素及びフリーラジカルががん細胞を攻撃して毒殺作用を果たし、光線力学的及び化学的の併用療法の効果を生じることにある。
【００２０】
本発明の他の目的は、該リポソーム組成物の使用方法に関する。本発明は光源を用いて薬物の該リポソームからの放出効率を向上するものであり、本発明に使用される光源は、波長が６００ｎｍ〜６７０ｎｍの光源を含むがこれに限定されていない。本発明の一つの具体的な実施態様において赤外光を光源として用いるが、別の具体的な実施態様において、赤色発光ダイオードを光源として用いる。
【００２１】
図面について説明する。
図１は本発明の異なる構成のリポソームが４℃で保存される時の安定性分析である。ＤＳＰＣ：ＥｇｇＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ＝（◆）８：２：１：０．２μｍｏｌ、（■）９：１：１：０．２μｍｏｌ、（▲）１０：０：１：０．２μｍｏｌ、（×）１０：０：２：０．２μｍｏｌ、（＊）１０：０：３：０．２μｍｏｌ。
図２はＨｐを内包するリポソーム組成物が光励起された後、３７℃でＰＢＳにおいて放出する状況を示す。
図３はＰｐＩＸを内包するリポソーム組成物が光誘発された後、３７℃でＰＢＳにおいて放出する状況を示す。
【００２２】
図４は光増感剤を含有しないポリソーム組成物が３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はドキソルビシンである。
図５は光増感剤を含有しないポリソーム組成物が３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はカルセインである。
【００２３】
図６は光増感剤（Ｈｐ）を内包するポリソームが３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はドキソルビシンである。
図７は光増感剤（Ｈｐ）を内包するポリソームが３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はカルセインである。
【００２４】
図８はLiposomal Ｈｐとfree Ｈｐが（０Ｊ、２Ｊ、４Ｊ、６Ｊ、８Ｊ）の光で照射された後、ＣＬ１−０細胞株に対する細胞毒性の比較を示す。
図９はリポソーマルドキソルビシン（ＬＤ：Liposome Doxorubicin）、遊離ドキソルビシン（ＦＤ：Free Doxorubicin）、リポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン（ＬＤＨ：Liposomal-Dox-Hp）、リポソーマルＨｐ（ＬＨ：liposomal Ｈｐ）及び、光照射後のＬＤＨ（１Ｊ、１０Ｊ、２０Ｊ、３０Ｊ）などの異なる製法におけるＡ４３１細胞株に対する細胞毒性の比較を示す。
【００２５】
図１０はリポソーマルドキソルビシン（ＬＤ：Liposome Doxorubicin）、遊離ドキソルビシン（ＦＤ：Free Doxorubicin）、リポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン（ＬＤＨ：Liposomal-Dox-Hp）及び、光照射後のＬＤＨ（１Ｊ、１０Ｊ）などの異なる製法におけるＣＬ１−０細胞株に対する細胞毒性の比較を示す。
【００２６】
（実施例１）
・リポソーム組成物の調製
リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを有機溶媒に溶解し、０．５ｍｇ／ｍｌの６００μｌのヘマトポルフィリンのエタノール溶液と混合し、減圧濃縮機に入れて有機溶媒を減圧除去した。有機溶媒の除去後、脂質膜が形成し、次に予熱されたドキソルビシン水溶液（６５℃）を加えて水和作用を行った。冷凍後解凍のプロセスを繰返し、超音波プローブ（２０分間、５０Ｗ）で該リポソームの粒径を制御し、最後に、Sephadex Ｇ−５０カラム（Bio-Rad Laboratories, Inc）で内包されていないリポソーム及び薬物を除去する。最後の溶液は、０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液に懸濁して４℃で保存される。
【００２７】
（実施例２）
・リポソーム組成物の保存安定性についての分析
上述の調製済リポソーム組成物を６群（一群で２００μｌ）に分けて、それぞれ１．５ｍｌの遠心チューブに密封させ、アルゴンを注入して４℃で暗い場所に保存した。薬物の浸透量（％）及び粒径の変化を分析するために、０、１、３、７、１５、３０日目に、１群のサンプルを採り出した。
Ｌｅａｋａｇｅ（％）＝ＥＬｐ／ＣＬｐ×１００％
ＥＬｐ＝試験群におけるリポソーム中の薬物含有量
ＣＬｐ＝対照群におけるリポソーム中の薬物含有量
（時間点は第０日である）
【００２８】
図１は３０日間保存された後該リポソームの安定性プロフィールを示す。本発明に係るリポソーム組成物（Ｃｈ１、Ｃｈ２、Ｃｈ３）の薬物浸透量はいずれも２０％以内で、特に、Ｃｈ３群の薬物浸透量は１０％以内だった。
【００２９】
（実施例３）
・リポソーム組成物の光による誘導放出についての分析
（１）光励起の光増感剤としてヘマトポルフィリン（Ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）を加える場合
上述の調製済のＨｐリポソーム組成物を、赤外発光ダイオード（ＬＥＤ）により照射量がそれぞれ１０、２０、３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射した後に透析バッグに入れて、使用された透析液はＰＢＳ、ｐＨ７．４、透析温度は３７℃である。１、２、４、６、８、１２、２４、３６、４８及び７２時間目に、光励起によって放出された後、透析バッグから１ｍｌの透析液を採り出して新し緩衝液に交換し、収集した溶液は放出されたドキソルビシンを含有し、その含有量は蛍光スペクトロメーターにより定量分析を行った。
【００３０】
図２は光照射後の放出結果を示す。ヘマトポルフィリンが添加されたリポソーム組成物は、そのドキソルビシンの放出速度が明らかに増加した。光照射後、該リポソームの放出曲線は２段階に分けられ、その放出速度は１２時間目において転換点になった。該リポソームは１０、２０、３０Ｊ／ｃｍ２の光照射後、その薬物放出率は７２時間目にそれぞれ３３％、５０％、５６％に達した。７２時間後、３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された試験群の薬物放出率は、コントロール群よりも約３６％高められた。このことから、光励起反応はドキソルビシンのリポソームからの放出速度を向上でき、且つ、そのドキソルビシンの放出速度は光照射の強度と正比例することが分かった。
【００３１】
（２）光励起の光増感剤としてプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）を加える場合
リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを有機溶媒に溶解し、ＰｐＩＸのエタノール溶液と混合させ、ロータリーエバポレーターによって有機溶媒を除去した。有機溶媒が除去された後、脂質膜が形成し、予熱されたドキソルビシンの水溶液（６５℃）を加えて水和作用を行った。次いで、冷凍後解凍のプロセスを繰返して、超音波（２０分間、５０ｗ）で該リポソームの粒径を制御し、最後に、SephadexＧ−５０カラムによって内包されていない薬物を除去した。最後の溶液は０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液中に懸濁して４℃で保存される。
【００３２】
上述の調製済のＰｐＩＸリポソーム組成物を、赤外発光ダイオード（ＬＥＤ）で照射量が１０、２０、３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射した後に透析バックに入れ、使用された透析液はＰＢＳ、ｐＨ７．４、透析温度は３７℃だった。１、２、４、６、８、１２、２４及び７２時間目に光励起により放出された後、透析バッグから１ｍｌの透析液を採り出して新鮮な緩衝液で交換した。収集された溶液は、放出されたドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を含有し、蛍光スペクトロメーターで定量分析を行った。
【００３３】
図３は、ドキソルビシンが３０Ｊの赤外光（６３５ｎｍ）により照射された、及び照射されていないリポソームの放出曲線を示す。菱形のマーク（◆）はコントロール群を、方型マーク（■）は試験群を表す。図３から分かるように、光照射後、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）の放出速度は明らかに増加した。
【００３４】
（実施例４）
・光励起後のリポソームの脂質二重層透過性の変化
いかなる薬物も含有しないリポソームを調製し、リポソーム組成物の製法はＤＳＰＣ：コレステロール（Cholesterol）：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ＝１０：３：０．２μＭで、その調製及び保存条件は上述のとおりである。１ｍｌのリポソーム溶液を、１ｍｌ、濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌの蛍光物質（ドキソルビシン及びカルセイン）と混合させ、試験群に光を照射（３０Ｊ／ｃｍ２の赤外ＬＥＤ）し、コントロール群を光照射しないとした。光照射量がリポソームの透過性を影響すれば、該蛍光物質は該リポソームに入ることになる。Sephadex Ｇ−５０カラムでリポソームと捕獲されていない蛍光物質を分離させ、更に蛍光スペクトロメーターによって捕獲されていない蛍光物質及び捕獲された蛍光物質を分析した。この透過性の変化は捕獲された蛍光物質を定量する方法で示されており、リン脂質の含有量で補正した。
【００３５】
光増感剤（Ｈｐ）を含有するリポソーム組成物を調製し、その脂質の製法はＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ＝１０：３：０．２μＭであり、また０．３ｍｇのＨｐが内包された。リポソームの調製及び保存条件はＨｐをリポソーム中に内包するほか、その他は上述の通りである。透過性の測定は上述の方法を採用した。
【００３６】
図４及び図５は光増感剤Ｈｐ（以下、「free Ｈｐ」で示す）が内包されていないリポソームの膜透過性の結果を示し、光増感剤Ｈｐを内包するリポソーム（以下、「Liposome Ｈｐ」で示す）の膜透過性の結果は図６及び図７で示されている。同一のFree Ｈｐ群において、リポソーム中の蛍光物質含有量は増加していないが、Liposome Ｈｐ群において、逆の結果になった。これらの結果は、赤外光（３０Ｊ／ｃｍ２）で照射されたLiposome Ｈｐはコントロール群と比較すると、リポソーム中のドキソルビシン又はカルセインの含有量が明らかに増加（約２倍増加）したことを証明した。
【００３７】
（実施例５）
・細胞培養及び細胞毒性の測定（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）
（１）細胞毒性の測定（一）
ＣＬ１−０細胞（約５０００個細胞）を９６孔の培養皿に入れて培地で培養した。２４時間培養した後、２μｇ／ｍｌＨｐ（free Ｈｐ又はLiposome Ｈｐ）を培養穴に入れた。２時間後、細胞を２、４、６、８Ｊ／ｃｍ２（６３５ｎｍ赤外光）光で照射し、更に２４時間培養してから、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ assay）を行なった。
【００３８】
（２）細胞毒性測定（二）
Ａ４３１又はＣＬ１−５細胞（約５０００個細胞）を９６穴の培養皿の各穴に入れて、培地で培養した。２４時間培養した後、それぞれドキソルビシン、リポソーマルドキソルビシン（ＬＤ：liposomal-Doxorubicin）及びリポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン（ＬＤＨ：Liposomal-Doxorubicin-Hematoporphyrin）を各培養穴に入れ、薬物濃度を０．５μｇ／ｍｌのドキソルビシンと、０．３μｇ／ｍｌのＨｐにした。２時間培養した後、試験群の細胞を１、１０、２０、３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射し、７２時間培養した後、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ assay）を行なった。
【００３９】
細胞試験（一）の結果（図８）において、ＰＤＴ処理後のfree Ｈｐ及びLiposome ＨｐのＣＬ１−０肺腺癌細胞に対する毒性を比較すると、ＰＤＴ処理後、Liposome Ｈｐの癌細胞に対する毒殺効果はfree Ｈｐよりも明らかに高いことが分かった。この結果は、光線力学的療法が癌細胞に対し毒殺効果を有し、且つ該Liposome Ｈｐは光線力学的療法の癌細胞に対する毒殺効果を向上できることを証明した。
【００４０】
Ａ４３１細胞の試験結果（図９）において、ＬＤの細胞に対する毒性は同一濃度のＦＤよりも遥かに低く、ＬＤはほとんど毒性がないと言えるが、ＦＤはＡ４３１細胞に対し明らかな毒性を示し、ＦＤのミトコンドリアのの脱水素酵素活性は、コントロール群の約３０％であることが明らかになった。試験で調製されたリポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン（ＬＤＨ：liposomal-Doxorubicin-Hp）の毒性はＬＤとＦＤの間に介在し、そのミトコンドリアの脱水素酵素活性はコントロール群の約６０％であり、ＬＤＨは１、１０、２０、３０Ｊ／ｃｍ２の赤外光で照射された後、細胞に対する毒性は明らかに増加し、光照射の強度と正比例するようで、特に、３０Ｊ／ｃｍ２の群において、その細胞に対する毒性がほぼＦＤと同等で又は更に強く、ＬＤＨのミトコンドリアの脱水素酵素活性はコントロール群の約２５％である。この結果は、光照射後の抗がん剤のリポソームからの大量放出の結果又はＰＤＴ効果のため、細胞に対するＬＤＨの毒性は確かに増加したことを示した。細胞毒素試験（一）において、該リポソームが光線力学的療法の癌細胞に対する毒殺効果を向上できることが証明されたため、光線力学的療法と化学療法の癌細胞に対する毒殺効果を合わせるには、Ｈｐの量を高めるだけでこの効果を達成できるのである。
【００４１】
ＣＬ１−０細胞株の毒性測定（図１０）において、その結果はＡ４３１細胞の毒性測定と似ており、ＬＤの細胞に対する毒性は同一濃度のＦＤ製剤よりも遥かに低い。濃度が０．５μｇ／ｍｌのドキソルビシンにおいて、ＬＤはほとんど毒性がないと言えるが、ＦＤはＣＬ１−０細胞に対し顕著な毒性を示した。ＬＤＨは１及び１０Ｊ／ｃｍ２の赤外光により照射された後、細胞に対する毒性は明らかに増加し、この結果はＬＤＨリポソームが異なる癌細胞タイプに対して効果を有することを証明した。
【００４２】
本発明は前述の好適な実施例で開示したが、本発明を限定するものではなく、この技術を熟知した如何なる技術者も、本発明の精神と範囲を逸脱しない前提で、各種の変形や修飾を行うことができるため、本発明の保護範囲は本明細書に添付した特許請求の範囲に定義されるものを基準とする。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の異なる構成のリポソームが４℃で保存される時の安定性分析を示す概略図。
【図２】Ｈｐを内包するリポソーム組成物が光励起された後、３７℃でＰＢＳにおいて放出する状況を示す概略図。
【図３】ＰｐＩＸを内包するリポソーム組成物が光誘発された後、３７℃でＰＢＳにおいて放出する状況を示す概略図。
【図４】光増感剤を含有しないポリソーム組成物が３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はドキソルビシンを示す概略図。
【図５】光増感剤を含有しないポリソーム組成物が３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はカルセインを示す概略図。
【図６】光増感剤（Ｈｐ）を内包するポリソームが３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はドキソルビシンを示す概略図。
【図７】光増感剤（Ｈｐ）を内包するポリソームが３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はカルセインを示す概略図。
【図８】Liposomal Ｈｐとfree Ｈｐが（０Ｊ、２Ｊ、４Ｊ、６Ｊ、８Ｊ）の光で照射された後、ＣＬ１−０細胞株に対する細胞毒性の比較を示す概略図。
【図９】リポソーマルドキソルビシン、遊離ドキソルビシン、リポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン、リポソーマル Ｈｐ及び、光照射後のＬＤＨ（１Ｊ、１０Ｊ、２０Ｊ、３０Ｊ）などの異なる製法におけるＡ４３１細胞株に対する細胞毒性の比較を示す概略図。
【図１０】リポソーマルドキソルビシン、遊離ドキソルビシン、リポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン、及び光照射後のＬＤＨ（１Ｊ、１０Ｊ）などの異なる製法におけるＣＬ１−０細胞株に対する細胞毒性の比較を示す概略図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規リポソーム徐放システムの構築に関わる。特に、本発明は光増感剤をリポソームの脂質二重層に、放出制御されるべき薬物を親水層に内包させ、光励起により光線力学的作用を誘発して一重項酸素を生成させ、リポソームにおける薬物の放出率を向上し、がん細胞に対する毒殺作用を果たすものである。また、該一重項酸素及びフリーラジカルががん細胞を攻撃するため、光線力学的と化学的との併用療法の効果を達する。本発明は更に、新規抗がん剤及びその使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Banghamらは、１９６５年、透過性を有する脂質小胞体を発見し、１９６８年、SessaとWeissmannらはこの小胞体をリポソーム（liposome）と正式に名づけ、且つリポソームは一層又は複数層の脂質二重層膜（lipid bilayer）からなる小胞体であると定義した。
【０００３】
１９７０年から、リポソームは以下のような特性を有するため、好適なドラッグキャリアー（drug carrier）と認められるようになってきた。
（１）リポソームはリン脂質からなり、細胞膜の構成成分と同一であり、生体内で分解可能なため、毒性を持たず、蛋白質のように免疫反応を起こすこともなく、繰り返し使用可能である。
（２）リポソームに内包される薬物は緩慢な速度で放出され、薬動力学的プロフィールを変化させることにより薬物の治療効率を向上する。
（３）薬物をリポソームに内包させることにより、副作用を減少することができる。
（４）リポソームはその脂質構成、粒子サイズ、構造、調製方法などの変化により、さまざま異なる場合に適用することができる。
【０００４】
１９９０年代に、ＰＥＧ−ＰＥを（disteroylphosphotidyl-choline）リポソーム表面にグラフトし、リポソームの粒子径を２００ｎｍ以下に縮小すると、この種のリポソームは長時間にわたって血中に循環できることが発見された。さらに腫瘍組織が複数の新生血管を有し、且つその血管内皮細胞が緊密ではないため、この種の長期血中滞留型リポソーム（long-circulating liposomes）は内皮細胞の隙間を通過可能であり、腫瘍組織において比較的高い集積量があり、正常な組織の１０倍以上に達する。特許文献１において、リポソーム製法にＰＥＧ−ＰＥをできるだけ多く加えると、リポソームの凝集及び融合を防止できるので、リポソーム製剤の保存期間が延長されることを示唆している。
【０００５】
現在、Ｌｉｐｏ−Ｄｏｘ（登録商標）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）など、長期血中滞留型リポソームを利用して抗がん剤を内包する製品は既に市販化されている。この二種類の製剤はドキソルビシン（Doxorubicin）を内包するものであり、目下ＦＤＡにより認可された抗がん剤である。しかし、従来の長期血中滞留型リポソームは以下の不具合を有する。
【０００６】
１．リポソームの構成が安定しすぎており、通常完全飽和のリン脂質に高含量のコレステロールを加えるため、リポソームが標的組織に到達後、薬物が速やかに放出できなくなる。
２．ＰＥＧ−ＰＥはリポソーム中の薬物放出能力を阻害する可能性がある。
３．ＰＥＧ−ＰＥはリポソームの腫瘍組織及び細胞への進入能力を阻害する可能性がある。
【０００７】
リポソームが小さければ小さいほど、皮膚の角質層又は粘膜組織を容易に透過し、よって所望の部位に到達することは多くの研究で明らかになている。リポソームの製造及び保存過程に、如何にリポソームの凝集及び融合、ひいてはリポソーム内の薬物の浸透を回避することができるかは製剤の研究開発において重要な課題となる。このため、高安定性を有し且つ薬物の放出を精確に制御可能なリポソーム製法の設計は目下リポソームの研究開発における重要な目標の一つになっている。
【０００８】
目下、多くの研究者はリポソームの薬物放出を制御するために積極的に様々な方法を試みており、基本的にはリポソーム構造の不安定化を誘発することにある。
Grossweiner（１９８０）は卵黄ホスファチジルコリン（Egg PC：不飽和結合を有する）及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ：全て飽和結合）を用いて調製したリポソームを細胞膜のパターンとする。リポソームで蛍光物質のエオシン（Eosin）を内包し、さらにリポソームをメチルブルー溶液と混合させ、試験の結果から、リポソームに光を当てるとエオシンが放出されることを発見した。その結果、上述の方法によってエオシンを効果的に放出し、メチルブルーの励起により生成されたフリーラジカル及びスーパーオキシドアニオンラジカルがリン脂質の脂肪酸鎖を攻撃するため、不安定な脂質二重層が生成されることが分かった。この光増感剤がリポソーム内に位置していないので、脂肪酸鎖を攻撃するために一重項酸素とフリーラジカルとは脂質二重層まで透過しなければならないため、このようの現象は光化学効果の低減を招くことがある。
【０００９】
また、がん治療の臨床研究において手術による切除のほか、多くは化学療法でがん細胞を抑制するが、臨床研究から数回の化学療法による治療後、がん細胞が徐々に薬物耐性を生じることが発見されたため、がん治療法において、異なる化学治療剤又は治療方法を同時に併用するか、又は相互に交替することによりがん細胞を毒殺、抑制し、その中に光線力学的療法という療法がある。光線力学的療法は光増感剤、酸素及び光という３つの要素を含んでおり、光増感剤自体は人体に対する毒性がほとんどないが、光増感剤が腫瘍組織に集積する際、適当な波長と線量の光照射を受けた後、光増感剤はエネルギーを吸収し励起状態になると共に、エネルギーを近傍の酸素又は他の物質に移動させることで、細胞毒性を有する一重項酸素及びフリーラジカルを生成し、よってがん細胞を毒殺する。現在、リポソーム剤型のドキソルビシン（Doxorubicin）と光線力学的療法とを合わせて作用させることを提出した文献があったが、確かに腫瘍の抑制に対し良好な効果を有する。
【００１０】
目下のリポソーム調製技術によって安定性が高いリポソームを生産することを可能にしたが、標的位置におけるリポソームの速放を制御可能な有効な方法はまだない。このほか、現在光増感剤及び他の水溶性薬物を同一のリポソームに内包させる二重内包薬剤は一つもない。
【特許文献１】台湾特許第０８８１０１３５９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述に鑑みて、本発明は光増感剤及び化学治療剤を含有し、光励起により速やかに薬物を放出することができるとともに、光線力学的療法と化学療法との併用効果を有するリポソームを提供する。
本発明の目的及びメリットにつき、以下のように部分的に記述するか、又は記述から明らかに読み取ることができる。
本発明の目的は、主に光線力学的作用により薬物のリポソームからの放出速度及びがん細胞の毒殺率を向上させる、新規のリポソーム徐放システムを提供することにある。
本発明の別の目的は新規抗がん剤及びその治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は光増感剤及び親水性物質を同時にリポソームに内包させる応用システムに関わる。該光感受性リポソーム製剤は安定なリポソームであり、且つ薬物のリポソームからの放出速度を制御することができる。また、本発明は光増感剤と化学治療剤との共通キャリアーを提供する。光励起された後、この種のリポソームは薬物放出制御の能力を有するだけでなく、光線力学的療法と化学療法との併用効果も有する。
【００１３】
本発明は、安定性が高く、飽和脂肪酸鎖を有するリン脂質及びコレステロールを用いて、光増感剤を脂質二重層に内包する光感受性リポソームを設計するものである。該光増感剤は光励起によりリン脂質と化学反応し、よって薬物のリポソームからの放出を促進する。リポソームは脂質二重層構造を有するため、本発明に係るリポソームは２種類の物質を同時に内包することができ、即ち、親水層に親水性薬物を内包すると同時に、疎水層に光増感剤を内包する。適当な波長の光源で疎水層に内包される光増感剤を励起させることにより一重項酸素及びフリーラジカルを生成し、リン脂質の炭素鎖の酸化反応、ひいては切断反応を引き起こし、これによりリポソームの安定性に影響を与え、よって薬物を放出させる。該一重項酸素及びフリーラジカルはリポソームから遊離するとともにがん細胞を攻撃し、光線力学的療法と化学療法との併用効果に達する。
【００１４】
本発明は光増感剤をリポソーム脂質二重層に内包するリポソームに関わり、該リポソームの親水層は例えば、ドキソルビシン（Doxorubicin）及びカルセイン（Calcein）などのモデル製剤（model drug）を内包するが、これに限定されるものではない。同時に、該リポソームの疎水層に例えば、ヘマトポルフィリン（ＨＰ：Hematoporphyrin）及びプロトポルフィリン（Ｐｐ：Protoporphyrin）などの光感受性物質を内包するが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
本発明のリポソーム組成物は、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ：1,2-Disteroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine）を飽和脂肪酸鎖含有リン脂質のパターンとし、コレステロール、ポリエチレングリコール−ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ：Polyethyleneglycol-derivated Distearoylphosphatidylethanolamine）を添加してリポソームの基本的な製法にし、更に脂質二重層に疎水性光感受性物質（例えば、ヘマトポルフィリン及びプロトポルフィリンがあるがこれらに限定されるものではない）を内包させ、親水層に水溶性薬物を内包させる。試験の結果として、前記リポソーム組成物は光源の照射で生成した一重項酸素及びフリーラジカルにより、リン脂質の脂肪酸鎖を切断できることが証明されている。該リポソームは薬物の放出を制御することができ、且つ光励起された後がん細胞に対する毒殺効果を効果的に向上することができる。
【００１６】
本発明は更に光増感剤を含有するリポソーム組成物の使用に関する方法を記述する。本発明に使用される光源は波長が比較的長い光源であり、例えば、波長が６００ｎｍ〜６７０ｎｍの光源であるがこれに限定されるものではない。前記光源は光増感剤を励起し且つリポソームの安定性を影響し、リポソームに内包される薬物を放出するようにさせ、そして生成された一重項酸素及びフリーラジカルがリポソームから同時に遊離してがん細胞を攻撃するため、光線力学的及び化学的の併用療法の効果を生じる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の他の特性は次に詳しく説明される具体的実施例により明らかになる。
以下の実施例は本発明の技術内容、即ち達成できる効果につき説明するが、本発明を限定するものではない。本発明に基づいて成した如何なる適宜変形及び修正も本発明の範囲に属するものである。
本発明は光感受性物質をリポソーム脂質二重層に内包するリポソームに関し、該リポソームの親水層は例えば、ドキソルビシン（Doxorubicin）及びカルセイン（Calcein）などの薬物を内包するが、これらに限定されるものではない。その疎水層に光増感剤を内包することで、該リポソーム脂質二重層を不安定化させ、リポソームにおける薬物の放出効率を向上する。
【００１８】
本発明に係るリポソーム組成物の脂質二重層には疎水性光増感剤が内包され、該疎水性光増感剤はポルフィリン（Porphyrin）からなる群より選ばれたものであるが、如何なる光増感剤に限定されるものではない。本発明の一実施例は、ヘマトポルフィリン（Ｈｐ：Hematoporphyrin）及びプロトポルフィリン（Ｐｐ：Protoporphyrin）からなる群より選ばれたプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ： Protoporphyrin ＩＸ）を用いるが、該リポソームの親水層に内包された水溶性薬物はドキソルビシンやカルセインなどを含むがこれらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明の別の目的は、特定波長の光源によりリポソームの脂質二重層内の光感受性物質を活性化させ、一重項酸素及びフリーラジカルを生成するようにし、リポソーム内の抗がん剤を放出させると共に、該一重項酸素及びフリーラジカルががん細胞を攻撃して毒殺作用を果たし、光線力学的及び化学的の併用療法の効果を生じることにある。
【００２０】
本発明の他の目的は、該リポソーム組成物の使用方法に関する。本発明は光源を用いて薬物の該リポソームからの放出効率を向上するものであり、本発明に使用される光源は、波長が６００ｎｍ〜６７０ｎｍの光源を含むがこれに限定されていない。本発明の一つの具体的な実施態様において赤外光を光源として用いるが、別の具体的な実施態様において、赤色発光ダイオードを光源として用いる。
【００２１】
図面について説明する。
図１は本発明の異なる構成のリポソームが４℃で保存される時の安定性分析である。ＤＳＰＣ：ＥｇｇＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ＝（◆）８：２：１：０．２μｍｏｌ、（■）９：１：１：０．２μｍｏｌ、（▲）１０：０：１：０．２μｍｏｌ、（×）１０：０：２：０．２μｍｏｌ、（＊）１０：０：３：０．２μｍｏｌ。
図２はＨｐを内包するリポソーム組成物が光励起された後、３７℃でＰＢＳにおいて放出する状況を示す。
図３はＰｐＩＸを内包するリポソーム組成物が光誘発された後、３７℃でＰＢＳにおいて放出する状況を示す。
【００２２】
図４は光増感剤を含有しないポリソーム組成物が３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はドキソルビシンである。
図５は光増感剤を含有しないポリソーム組成物が３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はカルセインである。
【００２３】
図６は光増感剤（Ｈｐ）を内包するポリソームが３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はドキソルビシンである。
図７は光増感剤（Ｈｐ）を内包するポリソームが３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はカルセインである。
【００２４】
図８はLiposomal Ｈｐとfree Ｈｐが（０Ｊ、２Ｊ、４Ｊ、６Ｊ、８Ｊ）の光で照射された後、ＣＬ１−０細胞株に対する細胞毒性の比較を示す。
図９はリポソーマルドキソルビシン（ＬＤ：Liposome Doxorubicin）、遊離ドキソルビシン（ＦＤ：Free Doxorubicin）、リポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン（ＬＤＨ：Liposomal-Dox-Hp）、リポソーマルＨｐ（ＬＨ：liposomal Ｈｐ）及び、光照射後のＬＤＨ（１Ｊ、１０Ｊ、２０Ｊ、３０Ｊ）などの異なる製法におけるＡ４３１細胞株に対する細胞毒性の比較を示す。
【００２５】
図１０はリポソーマルドキソルビシン（ＬＤ：Liposome Doxorubicin）、遊離ドキソルビシン（ＦＤ：Free Doxorubicin）、リポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン（ＬＤＨ：Liposomal-Dox-Hp）及び、光照射後のＬＤＨ（１Ｊ、１０Ｊ）などの異なる製法におけるＣＬ１−０細胞株に対する細胞毒性の比較を示す。
【００２６】
（実施例１）
・リポソーム組成物の調製
リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを有機溶媒に溶解し、０．５ｍｇ／ｍｌの６００μｌのヘマトポルフィリンのエタノール溶液と混合し、減圧濃縮機に入れて有機溶媒を減圧除去した。有機溶媒の除去後、脂質膜が形成し、次に予熱されたドキソルビシン水溶液（６５℃）を加えて水和作用を行った。冷凍後解凍のプロセスを繰返し、超音波プローブ（２０分間、５０Ｗ）で該リポソームの粒径を制御し、最後に、Sephadex Ｇ−５０カラム（Bio-Rad Laboratories, Inc）で内包されていないリポソーム及び薬物を除去する。最後の溶液は、０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液に懸濁して４℃で保存される。
【００２７】
（実施例２）
・リポソーム組成物の保存安定性についての分析
上述の調製済リポソーム組成物を６群（一群で２００μｌ）に分けて、それぞれ１．５ｍｌの遠心チューブに密封させ、アルゴンを注入して４℃で暗い場所に保存した。薬物の浸透量（％）及び粒径の変化を分析するために、０、１、３、７、１５、３０日目に、１群のサンプルを採り出した。
Ｌｅａｋａｇｅ（％）＝ＥＬｐ／ＣＬｐ×１００％
ＥＬｐ＝試験群におけるリポソーム中の薬物含有量
ＣＬｐ＝対照群におけるリポソーム中の薬物含有量
（時間点は第０日である）
【００２８】
図１は３０日間保存された後該リポソームの安定性プロフィールを示す。本発明に係るリポソーム組成物（Ｃｈ１、Ｃｈ２、Ｃｈ３）の薬物浸透量はいずれも２０％以内で、特に、Ｃｈ３群の薬物浸透量は１０％以内だった。
【００２９】
（実施例３）
・リポソーム組成物の光による誘導放出についての分析
（１）光励起の光増感剤としてヘマトポルフィリン（Ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）を加える場合
上述の調製済のＨｐリポソーム組成物を、赤外発光ダイオード（ＬＥＤ）により照射量がそれぞれ１０、２０、３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射した後に透析バッグに入れて、使用された透析液はＰＢＳ、ｐＨ７．４、透析温度は３７℃である。１、２、４、６、８、１２、２４、３６、４８及び７２時間目に、光励起によって放出された後、透析バッグから１ｍｌの透析液を採り出して新し緩衝液に交換し、収集した溶液は放出されたドキソルビシンを含有し、その含有量は蛍光スペクトロメーターにより定量分析を行った。
【００３０】
図２は光照射後の放出結果を示す。ヘマトポルフィリンが添加されたリポソーム組成物は、そのドキソルビシンの放出速度が明らかに増加した。光照射後、該リポソームの放出曲線は２段階に分けられ、その放出速度は１２時間目において転換点になった。該リポソームは１０、２０、３０Ｊ／ｃｍ２の光照射後、その薬物放出率は７２時間目にそれぞれ３３％、５０％、５６％に達した。７２時間後、３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された試験群の薬物放出率は、コントロール群よりも約３６％高められた。このことから、光励起反応はドキソルビシンのリポソームからの放出速度を向上でき、且つ、そのドキソルビシンの放出速度は光照射の強度と正比例することが分かった。
【００３１】
（２）光励起の光増感剤としてプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）を加える場合
リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを有機溶媒に溶解し、ＰｐＩＸのエタノール溶液と混合させ、ロータリーエバポレーターによって有機溶媒を除去した。有機溶媒が除去された後、脂質膜が形成し、予熱されたドキソルビシンの水溶液（６５℃）を加えて水和作用を行った。次いで、冷凍後解凍のプロセスを繰返して、超音波（２０分間、５０ｗ）で該リポソームの粒径を制御し、最後に、SephadexＧ−５０カラムによって内包されていない薬物を除去した。最後の溶液は０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液中に懸濁して４℃で保存される。
【００３２】
上述の調製済のＰｐＩＸリポソーム組成物を、赤外発光ダイオード（ＬＥＤ）で照射量が１０、２０、３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射した後に透析バックに入れ、使用された透析液はＰＢＳ、ｐＨ７．４、透析温度は３７℃だった。１、２、４、６、８、１２、２４及び７２時間目に光励起により放出された後、透析バッグから１ｍｌの透析液を採り出して新鮮な緩衝液で交換した。収集された溶液は、放出されたドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を含有し、蛍光スペクトロメーターで定量分析を行った。
【００３３】
図３は、ドキソルビシンが３０Ｊの赤外光（６３５ｎｍ）により照射された、及び照射されていないリポソームの放出曲線を示す。菱形のマーク（◆）はコントロール群を、方型マーク（■）は試験群を表す。図３から分かるように、光照射後、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）の放出速度は明らかに増加した。
【００３４】
（実施例４）
・光励起後のリポソームの脂質二重層透過性の変化
いかなる薬物も含有しないリポソームを調製し、リポソーム組成物の製法はＤＳＰＣ：コレステロール（Cholesterol）：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ＝１０：３：０．２μＭで、その調製及び保存条件は上述のとおりである。１ｍｌのリポソーム溶液を、１ｍｌ、濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌの蛍光物質（ドキソルビシン及びカルセイン）と混合させ、試験群に光を照射（３０Ｊ／ｃｍ２の赤外ＬＥＤ）し、コントロール群を光照射しないとした。光照射量がリポソームの透過性を影響すれば、該蛍光物質は該リポソームに入ることになる。Sephadex Ｇ−５０カラムでリポソームと捕獲されていない蛍光物質を分離させ、更に蛍光スペクトロメーターによって捕獲されていない蛍光物質及び捕獲された蛍光物質を分析した。この透過性の変化は捕獲された蛍光物質を定量する方法で示されており、リン脂質の含有量で補正した。
【００３５】
光増感剤（Ｈｐ）を含有するリポソーム組成物を調製し、その脂質の製法はＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ＝１０：３：０．２μＭであり、また０．３ｍｇのＨｐが内包された。リポソームの調製及び保存条件はＨｐをリポソーム中に内包するほか、その他は上述の通りである。透過性の測定は上述の方法を採用した。
【００３６】
図４及び図５は光増感剤Ｈｐ（以下、「free Ｈｐ」で示す）が内包されていないリポソームの膜透過性の結果を示し、光増感剤Ｈｐを内包するリポソーム（以下、「Liposome Ｈｐ」で示す）の膜透過性の結果は図６及び図７で示されている。同一のFree Ｈｐ群において、リポソーム中の蛍光物質含有量は増加していないが、Liposome Ｈｐ群において、逆の結果になった。これらの結果は、赤外光（３０Ｊ／ｃｍ２）で照射されたLiposome Ｈｐはコントロール群と比較すると、リポソーム中のドキソルビシン又はカルセインの含有量が明らかに増加（約２倍増加）したことを証明した。
【００３７】
（実施例５）
・細胞培養及び細胞毒性の測定（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）
（１）細胞毒性の測定（一）
ＣＬ１−０細胞（約５０００個細胞）を９６孔の培養皿に入れて培地で培養した。２４時間培養した後、２μｇ／ｍｌＨｐ（free Ｈｐ又はLiposome Ｈｐ）を培養穴に入れた。２時間後、細胞を２、４、６、８Ｊ／ｃｍ２（６３５ｎｍ赤外光）光で照射し、更に２４時間培養してから、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ assay）を行なった。
【００３８】
（２）細胞毒性測定（二）
Ａ４３１又はＣＬ１−５細胞（約５０００個細胞）を９６穴の培養皿の各穴に入れて、培地で培養した。２４時間培養した後、それぞれドキソルビシン、リポソーマルドキソルビシン（ＬＤ：liposomal-Doxorubicin）及びリポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン（ＬＤＨ：Liposomal-Doxorubicin-Hematoporphyrin）を各培養穴に入れ、薬物濃度を０．５μｇ／ｍｌのドキソルビシンと、０．３μｇ／ｍｌのＨｐにした。２時間培養した後、試験群の細胞を１、１０、２０、３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射し、７２時間培養した後、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ assay）を行なった。
【００３９】
細胞試験（一）の結果（図８）において、ＰＤＴ処理後のfree Ｈｐ及びLiposome ＨｐのＣＬ１−０肺腺癌細胞に対する毒性を比較すると、ＰＤＴ処理後、Liposome Ｈｐの癌細胞に対する毒殺効果はfree Ｈｐよりも明らかに高いことが分かった。この結果は、光線力学的療法が癌細胞に対し毒殺効果を有し、且つ該Liposome Ｈｐは光線力学的療法の癌細胞に対する毒殺効果を向上できることを証明した。
【００４０】
Ａ４３１細胞の試験結果（図９）において、ＬＤの細胞に対する毒性は同一濃度のＦＤよりも遥かに低く、ＬＤはほとんど毒性がないと言えるが、ＦＤはＡ４３１細胞に対し明らかな毒性を示し、ＦＤのミトコンドリアのの脱水素酵素活性は、コントロール群の約３０％であることが明らかになった。試験で調製されたリポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン（ＬＤＨ：liposomal-Doxorubicin-Hp）の毒性はＬＤとＦＤの間に介在し、そのミトコンドリアの脱水素酵素活性はコントロール群の約６０％であり、ＬＤＨは１、１０、２０、３０Ｊ／ｃｍ２の赤外光で照射された後、細胞に対する毒性は明らかに増加し、光照射の強度と正比例するようで、特に、３０Ｊ／ｃｍ２の群において、その細胞に対する毒性がほぼＦＤと同等で又は更に強く、ＬＤＨのミトコンドリアの脱水素酵素活性はコントロール群の約２５％である。この結果は、光照射後の抗がん剤のリポソームからの大量放出の結果又はＰＤＴ効果のため、細胞に対するＬＤＨの毒性は確かに増加したことを示した。細胞毒素試験（一）において、該リポソームが光線力学的療法の癌細胞に対する毒殺効果を向上できることが証明されたため、光線力学的療法と化学療法の癌細胞に対する毒殺効果を合わせるには、Ｈｐの量を高めるだけでこの効果を達成できるのである。
【００４１】
ＣＬ１−０細胞株の毒性測定（図１０）において、その結果はＡ４３１細胞の毒性測定と似ており、ＬＤの細胞に対する毒性は同一濃度のＦＤ製剤よりも遥かに低い。濃度が０．５μｇ／ｍｌのドキソルビシンにおいて、ＬＤはほとんど毒性がないと言えるが、ＦＤはＣＬ１−０細胞に対し顕著な毒性を示した。ＬＤＨは１及び１０Ｊ／ｃｍ２の赤外光により照射された後、細胞に対する毒性は明らかに増加し、この結果はＬＤＨリポソームが異なる癌細胞タイプに対して効果を有することを証明した。
【００４２】
本発明は前述の好適な実施例で開示したが、本発明を限定するものではなく、この技術を熟知した如何なる技術者も、本発明の精神と範囲を逸脱しない前提で、各種の変形や修飾を行うことができるため、本発明の保護範囲は本明細書に添付した特許請求の範囲に定義されるものを基準とする。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の異なる構成のリポソームが４℃で保存される時の安定性分析を示す概略図。
【図２】Ｈｐを内包するリポソーム組成物が光励起された後、３７℃でＰＢＳにおいて放出する状況を示す概略図。
【図３】ＰｐＩＸを内包するリポソーム組成物が光誘発された後、３７℃でＰＢＳにおいて放出する状況を示す概略図。
【図４】光増感剤を含有しないポリソーム組成物が３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はドキソルビシンを示す概略図。
【図５】光増感剤を含有しないポリソーム組成物が３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はカルセインを示す概略図。
【図６】光増感剤（Ｈｐ）を内包するポリソームが３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はドキソルビシンを示す概略図。
【図７】光増感剤（Ｈｐ）を内包するポリソームが３０Ｊ／ｃｍ２の光で照射された後、その脂質二重層の透過性の変化を示し、その内、膜透過性測定用の薬物はカルセインを示す概略図。
【図８】Liposomal Ｈｐとfree Ｈｐが（０Ｊ、２Ｊ、４Ｊ、６Ｊ、８Ｊ）の光で照射された後、ＣＬ１−０細胞株に対する細胞毒性の比較を示す概略図。
【図９】リポソーマルドキソルビシン、遊離ドキソルビシン、リポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン、リポソーマル Ｈｐ及び、光照射後のＬＤＨ（１Ｊ、１０Ｊ、２０Ｊ、３０Ｊ）などの異なる製法におけるＡ４３１細胞株に対する細胞毒性の比較を示す概略図。
【図１０】リポソーマルドキソルビシン、遊離ドキソルビシン、リポソーマルドキソルビシンヘマトポルフィリン、及び光照射後のＬＤＨ（１Ｊ、１０Ｊ）などの異なる製法におけるＣＬ１−０細胞株に対する細胞毒性の比較を示す概略図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの親水層に内包される親水性薬物と、前記リポソームの脂質二重層に内包される疎水性薬物と、を備えたリポソーム組成物において、
前記疎水性薬物は光感受性物質であり、
前記リポソームは光源の照射下で、光線力学的な作用によって前記疎水性薬物の放出を誘導する、リポソーム組成物。
【請求項２】
前記光感受性物質はポルフィリン（Ｐｏｒｐｈｒｉｎ）である、請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
前記ポルフィリンは、ヘマトポルフィリン（Ｈｐ：Ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）である、請求項２に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】
前記ポルフィリンは、プロトポルフィリン（Ｐｐ：Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）である、請求項２に記載のリポソーム組成物。
【請求項５】
前記光源は赤外光である、請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項６】
前記赤外光の光源の波長は、６００ｎｍ〜６７０ｎｍである、請求項５に記載のリポソーム組成物。
【請求項７】
前記赤外光の光源の波長は、６３５ｎｍである、請求項６に記載のリポソーム組成物。
【請求項８】
前記赤外光の光源は、赤外発光ダイオードである、請求項５に記載のリポソーム組成物。
【請求項９】
リポソーム組成物の使用方法であって、
（ａ）光でリポソーム組成物を励起し、
（ｂ）前記光によって前記リポソームの脂質二重層における光感受性物質を励起し、
（ｃ）励起された光感受性物質がフリーラジカル及び一重項酸素を生成し、該リポソームの安定性を低下させ、
（ｄ）安定性が低下された前記リポソームから、このリポソームの親水層に内包された薬物を放出すること、
を含むリポソームの使用方法。
【請求項１０】
前記光は赤外線光源である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記赤外線光源の波長は、６００ｎｍ〜６７０ｎｍである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記赤外線光源は、赤外発光ダイオードである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記光感受性物質は、ポルフィリンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポルフィリンは、ヘマトポルフィリンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポルフィリンは、プロトポルフィリンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
リポソーム製法を用いて光線力学的療法と化学的療法との併用効果を生じる方法であって、
（ａ）光でリポソーム組成物を励起し、
（ｂ）前記リポソームの脂質二重層における光感受性物質を励起し、
（ｃ）励起された前記光感受性物質がフリーラジカル及び一重項酸素を生成し、該リポソームの安定性を低下させて細胞毒性効果をもたらし、
（ｄ）安定性が低下されたリポソームから、このリポソームの親水層に内包された薬物を放出すること、
を含む方法。
【請求項１】
リポソームの親水層に内包される親水性薬物と、前記リポソームの脂質二重層に内包される疎水性薬物と、を備えたリポソーム組成物において、
前記疎水性薬物は光感受性物質であり、
前記リポソームは光源の照射下で、光線力学的な作用によって前記疎水性薬物の放出を誘導する、リポソーム組成物。
【請求項２】
前記光感受性物質はポルフィリン（Ｐｏｒｐｈｒｉｎ）である、請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
前記ポルフィリンは、ヘマトポルフィリン（Ｈｐ：Ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）である、請求項２に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】
前記ポルフィリンは、プロトポルフィリン（Ｐｐ：Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）である、請求項２に記載のリポソーム組成物。
【請求項５】
前記光源は赤外光である、請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項６】
前記赤外光の光源の波長は、６００ｎｍ〜６７０ｎｍである、請求項５に記載のリポソーム組成物。
【請求項７】
前記赤外光の光源の波長は、６３５ｎｍである、請求項６に記載のリポソーム組成物。
【請求項８】
前記赤外光の光源は、赤外発光ダイオードである、請求項５に記載のリポソーム組成物。
【請求項９】
リポソーム組成物の使用方法であって、
（ａ）光でリポソーム組成物を励起し、
（ｂ）前記光によって前記リポソームの脂質二重層における光感受性物質を励起し、
（ｃ）励起された光感受性物質がフリーラジカル及び一重項酸素を生成し、該リポソームの安定性を低下させ、
（ｄ）安定性が低下された前記リポソームから、このリポソームの親水層に内包された薬物を放出すること、
を含むリポソームの使用方法。
【請求項１０】
前記光は赤外線光源である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記赤外線光源の波長は、６００ｎｍ〜６７０ｎｍである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記赤外線光源は、赤外発光ダイオードである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記光感受性物質は、ポルフィリンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポルフィリンは、ヘマトポルフィリンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポルフィリンは、プロトポルフィリンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
リポソーム製法を用いて光線力学的療法と化学的療法との併用効果を生じる方法であって、
（ａ）光でリポソーム組成物を励起し、
（ｂ）前記リポソームの脂質二重層における光感受性物質を励起し、
（ｃ）励起された前記光感受性物質がフリーラジカル及び一重項酸素を生成し、該リポソームの安定性を低下させて細胞毒性効果をもたらし、
（ｄ）安定性が低下されたリポソームから、このリポソームの親水層に内包された薬物を放出すること、
を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図８】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図８】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００７−２７７２１８（Ｐ２００７−２７７２１８Ａ）
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３４３１７６（Ｐ２００６−３４３１７６）
【出願日】平成１８年１２月２０日（２００６．１２．２０）
【出願人】（５０６４２２５６０）臺北醫學大學 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２０日（２００６．１２．２０）
【出願人】（５０６４２２５６０）臺北醫學大學 (1)
【Ｆターム（参考）】
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