レセプターのシグナル伝達の増強をもたらすＮＯＴＣＨ変異
【課題】癌の存在を同定するのを助け、ＮＯＴＣＨシグナル伝達のインヒビターに応答する癌細胞を同定することにおいて診断上有用であり、ＮＯＴＣＨシグナル伝達経路インヒビターによる直接的で合理的な癌処置を可能にする、ヒト腫瘍における新規な変異を同定する方法を提供する。
【解決手段】実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターであって、当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、特定のアミノ酸配列を含み、ただし、当該アミノ酸配列は、アミノ酸１５７１〜１６２２および／または１６７４〜１７３０および／またはアミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６に１以上の変異を有し、その結果、当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、γ−セクレターゼとのインキュベーションに応じて、変異していないＮＯＴＣＨ−１と比べて増強したシグナル伝達を示す、実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプター。
【解決手段】実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターであって、当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、特定のアミノ酸配列を含み、ただし、当該アミノ酸配列は、アミノ酸１５７１〜１６２２および／または１６７４〜１７３０および／またはアミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６に１以上の変異を有し、その結果、当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、γ−セクレターゼとのインキュベーションに応じて、変異していないＮＯＴＣＨ−１と比べて増強したシグナル伝達を示す、実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の援用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／５９８，５４６号（２００４年８月４日出願）および同第６０／６７２，０５３号（２００５年４月１８日出願）に対する優先権、およびこれらの利益を主張する。これらの先行出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、生物学的刺激に対する反応性の増大または他の刺激の必要性に依存しない構成的活性化のいずれかを生じる変異がなされた、ヒトＮＯＴＣＨレセプターに関する。これらの変異は、ＮＯＴＣＨレセプターの特定の十分に規定された領域に生じ、悪性転換のプロセスの一部として癌細胞によって体細胞的に獲得される。これらの癌細胞の増殖は、レセプターのシグナル伝達を妨害する因子を用いて遅延されるかまたは停止され得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＮＯＴＣＨレセプター１〜４は、調節されたタンパク質分解に依存する経路を通してシグナルを送る膜貫通レセプタータンパク質である。リガンド結合の後、このレセプターは、順に、ｉ）ＡＤＡＭファミリーのメタロプロテアーゼによって細胞外で切断され（非特許文献１；非特許文献２）；ｉｉ）膜貫通ドメインに対してちょうど内部にあるリジン残基でモノユビキチン化し（非特許文献３）；ｉｉｉ）エンドサイトーシスされ（非特許文献３）；そしてｉｖ）γ−セクレターゼ酵素によってタンパク質分解で切断される（非特許文献４）。この活性化プロセスの最終工程は、ＮＯＴＣＨレセプターの細胞内部分が、細胞核にトランスロケーションすることを可能にし、そこでその細胞内部分は、転写因子と相互作用して、遺伝子活性を変化させる。ＮＯＴＣＨレセプターのシグナル伝達は、細胞の分化および増殖、ならびにアポトーシスを制御すること（これらは、腫瘍性転化（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に関連して重要である３つのプロセスである）において重要な役割を果たすようである（特許文献１を参照のこと）。
【０００４】
ＮＯＴＣＨ−１遺伝子は、１％未満のＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）に見出される（７；９）染色体転座にその遺伝子が関与することを通じて発見された（非特許文献５）。ＮＯＴＣＨ−１は、胸腺細胞で高度に発現され（非特許文献５）、その胸腺細胞でＮＯＴＣＨ−１は、Ｔ細胞の運命を選択するようにリンパ系共通前駆細胞（ｃｏｍｍｏｎ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）を誘導する（非特許文献６）。その後、ＮＯＴＣＨ−１は、プレＴ細胞レセプター複合体の構築を促進し、この複合体は、ＣＤ４−／ＣＤ８− 胸腺細胞のＣＤ４＋／ＣＤ８＋ 発達段階への変異を伴う増殖性バースト（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ）を駆動することにおいて重要な役割を果たす（非特許文献７）。
【０００５】
その休止状態（ｒｅｓｔｉｎｇ ｓｔａｔｅ）において、成熟ＮＯＴＣＨ−１は、リガンド結合細胞外サブユニット（ＮＥＣ）および非共有結合で結合された膜貫通サブユニット（ＮＴＭ）から構成されるヘテロ二量体のレセプターである（非特許文献８；非特許文献９）。ＮＥＣは、上皮増殖因子様反復と、３つの反復されたＬｉｎ１２／ＮＯＴＣＨ反復と、保存された１０３アミノ酸の配列とから構成される、リガンド結合ドメインからなり（本明細書で以後、ヘテロ二量体化ドメインとしてＨＤと称する）、このドメインはＮＴＭの細胞外部分と結合するのに十分である。
【０００６】
ＮＯＴＣＨレセプターの生理学的活性化は、Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ−Ｌａｇ２（ＤＳＬ）ファミリーのリガンドがＮＥＣサブユニットに結合し、ＮＴＭサブユニットにおける連続的なタンパク質分解性切断のカスケードを惹起する場合に起こる。γ−セクレターゼ（プレセニリン−１もしくはプレセニリン−２、ニカストリン、ＡＰＨ−１、およびＰＥＮ−２を含む、多タンパク質複合体）によって触媒される最後の切断（非特許文献１０；非特許文献１１）は、膜からＮＴＭの細胞内部分（細胞内ＮＯＴＣＨまたはＩＣＮと呼ばれる）を放出し、この細胞内部分が細胞核にトランスロケーションすることを可能にする。そこで、その細胞内部分は、ＤＮＡ結合因子ＣＳＬおよびＭａｓｔｅｒｍｉｎｄファミリーの活性化補助因子と結合して、一時的な転写活性化複合体を形成する（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。その複合体の分解およびターンオーバー（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）は、ＳＥＬ−１０ファミリーのＦボックス因子によって調節されるようである（非特許文献１５）。
【０００７】
（７；９）転座は、ＩＣＮと類似する、Ｎ末端が欠失した構成的に活性なＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドをコードするＮＯＴＣＨ−Ｔ細胞レセプターβ融合遺伝子を生じ（非特許文献５；非特許文献１６；Ｄａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年５月３日電子出版））、これらのＮＯＴＣＨ−１の短縮型の構成的に活性な形態は、マウスモデルにおいてＴ−ＡＬＬを誘導する（非特許文献１７）。ＮＯＴＣＨ−１はまた、マウスＴ−ＡＬＬの発症をもたらす多段階経路においてＥ２Ａ−ＰＢＸ１トランスジーンおよびｃＭＹＣトランスジーンと共働する（ｃｏｏｐｅｒａｔｅ）、頻繁にレトロウイルスに挿入されるものの部位である（非特許文献１８；非特許文献１９）。さらに、ＮＯＴＣＨインヒビターは、ヒトおよびマウスのＮＯＴＣＨ−１に関連するＴ−ＡＬＬに由来する細胞株において、Ｇ０／Ｇ１細胞周期の阻止を生じ、これはＮＯＴＣＨシグナル伝達がこれらの白血病の持続的な増殖に必要とされることを示す（非特許文献２０）。
【０００８】
（７；９）転座は、Ｔ−ＡＬＬを有する患者のうちの非常に低い割合の患者と関連するのみである。ＮＯＴＣＨ−１に関連するさらなる変異の同定は、この型の癌の病原論にとって重要な意味を有する。ＮＯＴＣＨ−２、ＮＯＴＣＨ−３およびＮＯＴＣＨ−４における変異は、ヒト癌では同定されておらず、他の哺乳動物におけるこれらのＮＯＴＣＨレセプターの機能の異常な上昇がＴ−ＡＬＬ（ＮＯＴＣＨ−２およびＮＯＴＣＨ−３、非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）および乳癌（ＮＯＴＣＨ−４、非特許文献２４）を生じ得ることが知られている。ヒト腫瘍における新規な変異の同定は、癌の存在を同定するのを助けること、およびＮＯＴＣＨシグナル伝達のインヒビターに応答する癌細胞を同定することにおいて診断上有用であるはずであり、それによってＮＯＴＣＨシグナル伝達経路インヒビターによる直接的で合理的な癌処置を可能にする。
【特許文献１】米国特許第６，７０３，２２１号明細書
【非特許文献１】Ｂｒｏｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５：２０７−２１６（２０００）
【非特許文献２】Ｍｕｍｍら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５：１９７−２０６（２０００）
【非特許文献３】Ｇｕｐｔａ−Ｒｏｓｓｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６６：７３−８３（２００４）
【非特許文献４】Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３９８：５１８−５２２（１９９９）
【非特許文献５】Ｅｌｌｉｓｅｎら、Ｃｅｌｌ ６６：６４９−６６１（１９９１）
【非特許文献６】Ｒａｄｔｋｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：５４７−５５８
【非特許文献７】Ｗｏｌｆｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：８６９−８７９（２００２）
【非特許文献８】Ｒａｎｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１８２５−１８３５
【非特許文献９】Ｌｏｇｅａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８１０８−８１１２（１９９８）
【非特許文献１０】Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ３：８５−９７（２００２）
【非特許文献１１】Ｋｉｍｂｅｒｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：６３８２−６３８７（２００３）
【非特許文献１２】Ｗａｌｌｂｅｒｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２２：７８１２−７８１９（２００２）
【非特許文献１３】Ｆｒｙｅｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：１３９７−１４１１（２００２）
【非特許文献１４】Ｎａｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２１２３２−２１２３９（２００３）
【非特許文献１５】Ｏｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３５８４７−３５８５３（２００１）
【非特許文献１６】Ａｓｔｅｒら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５９：１２５−１３６（１９９４）
【非特許文献１７】Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−７５１５（２０００）
【非特許文献１８】Ｈｏｅｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３８３１−３８４２（２０００）
【非特許文献１９】Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ ９６：１９０６−１９１３（２０００）
【非特許文献２０】Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２３：６５５−６６４（２００３）
【非特許文献２１】Ｂｅｌｌａｖｉａら、Ｅｍｂｏ Ｊ．１９：３３３７−３３４８（２０００）
【非特許文献２２】Ｒｏｈｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８０７１−８０８０（１９９６）
【非特許文献２３】Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：６５５−６６４）
【非特許文献２４】ＣａｌｌａｈａｎおよびＲａｆａｔ，Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ６：２３−３６（２００１）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＮＯＴＣＨ−１レセプターの２つの特定の領域における変異が、レセプターのシグナル伝達の増強をもたらし、無制御の細胞増殖と関連するという、発見に基づく。第一の領域は、ヘテロ二量体化ドメイン内の領域であり、種間で高度に保存される多くのアミノ酸の存在によって特徴付けられる。そのアミノ酸（配列番号１の残基１５７１〜１６２２（配列識別番号について図１および図３を参照のこと））は、エキソン２６によってコードされ、ＮＯＴＣＨ−１タンパク質のＮＥＣサブユニット（すなわち、細胞外部分）内に見出される。無傷の（ｉｎｔａｃｔ）ＮＯＴＣＨ−１において、そのアミノ酸は、ＮＴＭサブユニット（すなわち、そのレセプターの膜貫通部分）に位置するエキソン２７（アミノ酸１６７４〜１７３０）によってコードされるアミノ酸に非共有結合される。このＨＤドメインのこれらの「ホットスポット」（すなわち、ＮＥＣサブユニットの１５７１〜１６２２およびＮＴＭサブユニットの１６７４〜１７３０）における変異（特に、非保存的変異）は、ＮＯＴＣＨ−１ヘテロ二量体を不安定化すると考えられる。これは、ＮＥＣの分解、ならびに連続的なメタロプロテアーゼ切断、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｉｏｎ）、エンドサイトーシス、およびγ−セクレターゼによる切断をもたらし、ＮＯＴＣＨ−１の細胞内部分の核トランスロケーションおよび標的遺伝子の活性化を可能にする。
【００１０】
無制御の細胞増殖をもたらす変異に関係する第二の領域は、ＰＥＳＴ領域（アミノ酸２４２３〜アミノ酸２５５６）を含むＮＯＴＣＨ−１のＣ末端部分（アミノ酸２３１１〜２５５６）である。これらの変異は、レセプターが活性化後（すなわち、レセプターがγ−セクレターゼ切断に起因して放出された後）に細胞内で分解される速度を低下させるようである。結果として、ＮＯＴＣＨ−１応答性遺伝子の転写は不適切に長期間継続し、再び、シグナル伝達の増強をもたらし、最終的に、無制御の増殖をもたらす。
【００１１】
ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインにおける変異がしばしば、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）を有する患者から得られる白血球細胞株および生物学的サンプル中に見出されることが発見されている。これらの細胞における無制御の増殖は、γ−セクレターゼインヒビターのようなＮＯＴＣＨシグナル伝達を妨害する因子を用いて阻止され得る。全体的に、行われた実験は、無制御の増殖を維持するための異常なＮＯＴＣＨ活性に依存する癌細胞の群が存在し、ＮＯＴＣＨ−１のＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメイン中の変異がγ−セクレターゼインヒビターもしくはＮＯＴＣＨ活性を低下させる他の因子に応答する可能性のある癌細胞を同定するために診断的に使用され得るという、結論を導いてきた。
【００１２】
その第一の局面において、本発明は、ＨＤドメインのホットスポット内の変異を除いて野生型ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸配列（本明細書で配列番号１として示される）を有する実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターに関する。これらの変異は、γ−セクレターゼによる切断に対する感受性が増大することによって、変異されていないＮＯＴＣＨ−１と比べて増大したレセプターのシグナル伝達がもたらされる。変異が生じる配列番号１の特定のホットスポット領域は、アミノ酸１５７１〜１６２２および／またはアミノ酸１６７４〜１７３０である。
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に精製された（実質的に純粋な）」とは、そのレセプタータンパク質（またはそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド）が天然で見出されるようなＮＯＴＣＨ−１に関連する生物学的成分から分離されていることを意味する。代表的に、実質的に純粋なタンパク質（またはポリヌクレオチド）は、サンプルの少なくとも８５％を占め、より高い割合が好ましい。多くの手段が、タンパク質サンプルまたは核酸サンプルの純度を評価するために利用可能であり、電気泳動、クマトグラフィーおよび分析用遠心分離による分析が挙げられる。用語「変異されていないＮＯＴＣＨ−１」とは、配列番号１の配列を有するＮＯＴＣＨ−１レセプター、およびこの配列を有するレセプターをコードするポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、これらの配列中の対立遺伝子改変体を包含し、この改変体は、通常は細胞中に見出されるが、異常なＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達にも、異常な無制御の細胞増殖にも関連しない。
【００１４】
変異がγ−セクレターゼのシグナル伝達の増強をもたらすかどうかを決定するために、本明細書の実施例の節で記載されるアッセイが使用され得る。最も好ましい方法は、ＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達に応答して刺激される調節エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド）でトランスフェクトされた細胞の使用に関する。細胞がγ−セクレターゼに曝される際のレポーター遺伝子の活性化は容易に測定され得、ＮＯＴＣＨ活性を反映し得る（例えば、Ｈｓｉｅｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９５２−９５９（１９９６）を参照のこと）。
【００１５】
種々の種からのＨＤアミノ酸配列の比較により、ホットスポットで高度に保存されるある一定の特定のアミノ酸位置の同定がなされている。これらの位置での変異（特に、非保存的変異）は、特に、ＮＯＴＣＨ−１のＮＥＣサブユニットとＮＴＭサブユニットとの間の相互作用を不安定化する可能性がある。用語「非保存的変異」とは、野生型アミノ酸が、異なる化学的特徴を有するアミノ酸で置換される変異を指す。非保存的置換の例としては、よく構成されたタンパク質ドメイン（すなわち、ＨＤドメイン）内の他のアミノ酸に代わってプロリンにする置換、非塩基性アミノ酸に代わって塩基性アミノ酸にする置換、非酸性アミノ酸に代わって酸性アミノ酸にする置換、非極性アミノ酸に代わって極性アミノ酸にする置換などが挙げられる。保存的変異と非保存的変異との区別は、当業者に十分に認識されている。変異がＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達の増強に関連するＨＤドメイン中の保存されたアミノ酸は、以下の位置：１５７１；１５７３；１５７５；１５７６；１５７８；１５７９；１５８３；１５８６；１５８８；１５９０；１５９３；１５９４；１５９５；１５９８；１６００−１６０７；１６１０−１６１８；１６７４；１６７５；１６７７；１６７９−１６８４；１６８６；１６９５；１６９６；１７０３；１７０６；１７１５；１７２０；１７２５；および１７２８に見出される。これらのすべての位置は、配列番号１に関して同定される。
【００１６】
本発明は、癌細胞の無制御の増殖に関連する特定の変異を包含する。ＨＤドメインに関して、この変異は、アミノ酸１５７１〜１６１８が配列番号１２〜配列番号２２、配列番号１０２〜配列番号１１８または配列番号１４５からなる群より選択される配列で置換される場合に生じる。癌細胞の増殖に関連する他の変異としては、配列番号２３〜配列番号２９または配列番号１１９〜配列番号１２７からなる群より選択される配列による、アミノ酸１５７１〜１６２２の置換が挙げられる。同様に、アミノ酸１６７４からアミノ酸１７３０までの配列は、配列番号７０〜配列番号７５または配列番号１２８〜配列番号１３７からなる群より選択される配列で置換され得る。
【００１７】
本発明者らはまた、ＮＯＴＣＨ−１のＣ末端部分（すなわち、アミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６）において生じる配列番号１における変異が、細胞をγ−セクレターゼに曝すことに応答してＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達の増強をもたらすことを見出した。これらのすべての変異は、未熟終止コドンまたは翻訳読み取り枠シフトの出現を引き起こし、したがって、ＰＥＳＴ領域（アミノ酸２４２３〜２５５６）に対応する配列のうちのいくつかもしくはすべての欠失をもたらす。これらの変異は、レセプターが分解される速度の低下をもたらすと考えられる。具体的な変異としては、配列番号３０〜配列番号５９または配列番号１３９〜配列番号１４４からなる群より選択される配列による、配列番号１におけるアミノ酸２３１１〜２５５６に対応する部分の置換が挙げられる。
【００１８】
ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメイン中の変異は、互いに独立して生じ得るか、または単一のＮＯＴＣＨ−１レセプターに存在し得る。例えば、実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得るかまたはこのアミノ酸配列からなり得るが、ここで、
ａ）そのレセプターは、以下の変異：
ｉ）上記配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１５７１〜アミノ酸１６１８の部分が、配列番号１２〜配列番号２２、配列番号１０２〜配列番号１１８、または配列番号１４５からなる群より選択される配列で置換されている；
ｉｉ）上記配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１５７１〜アミノ酸１６２２の部分が、配列番号２３〜配列番号２９、配列番号１１９〜配列番号１２７からなる群より選択される配列で置換されている；
ｉｉｉ）上記配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１６７４〜アミノ酸１７３０の部分が、配列番号７０〜配列番号７５または配列番号１２８〜配列番号１３７からなる群より選択される配列で置換されている；
のうちの少なくとも１つを有し；
ｂ）そしてさらに、そのレセプターは、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６の部分が配列番号３０〜配列番号５９または配列番号１３８〜配列番号１４４からなる群より選択される配列で置換されるように、さらに変異されている。
【００１９】
あるいは、実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得るかまたはこのアミノ酸配列からなり得るが、ここで、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列が、１５７１；１５７３；１５７５；１５７６；１５７８；１５７９；１５８３；１５８６；１５８８；１５９０；１５９３；１５９４；１５９５；１５９８；１６００〜１６０７；１６１０〜１６１８；１６７４；１６７５；１６７７；１６７９−１６８４；１６８６；１６９５；１６９６；１７０３；１７０６；１７１５；１７２０；１７２５；および１７２８からなる群より選択される１以上のアミノ酸位置で変異されており；そして
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列が、このアミノ酸配列のアミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６の部分が配列番号３０〜配列番号５９からなる群より選択される配列で置換されるように、さらに変異されている。
変異がＨＤおよびＰＥＳＴ領域の両方に存在する場合、これは、γ−セクレターゼに応答したシグナル伝達が特に増強されるレセプターをもたらす。
【００２０】
別の局面において、本発明は、上記の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターのいずれかをコードするポリヌクレオチドを包含する。その変異レセプターをコードする核酸配列は、ベクターに取り込まれ得、そのベクターにおいてその核酸配列はプロモーターに作動可能に連結される。用語「作動可能に連結」とは、一定の様式で結合される遺伝要素を指し、この様式は、その遺伝要素がその正常な機能を果たすのを可能にする様式である。例えば、遺伝子は、その転写があるプロモーターの制御下にあり、最終的に、その遺伝子によって正常にコードされたタンパク質が生成される場合、そのプロモーターに作動可能に連結されている。本発明は、変異レセプターをコードするベクター、およびそのベクターで形質転換された宿主細胞を包含する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、上記の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターのいずれかについて生物学的サンプルをアッセイすることによって、癌細胞の存在についてそのサンプルを診断的に試験する方法に関する。用語「生物学的サンプル」は、本明細書中で使用される場合、診断を行う際に医学の分野で一般に使用される様々な型のサンプルのすべてを包含する。したがって、この用語は、組織または流体、血液、血漿、血清、リンパ、尿などの生検サンプルを包含する。考察される癌の型に依存して、特定の型のサンプルが主に使用されるものになる。例えば、白血病について、血液、血漿または血清のサンプルが好まれる傾向にある。試験のために適切なサンプルの選択は、臨床医学において日常的である。
【００２２】
また、ＮＯＴＣＨ−１について記載される変異を含む領域と高レベルの同一性を有する領域を含むＮＯＴＣＨ−２レセプター、ＮＯＴＣＨ−３レセプターおよびＮＯＴＣＨ−４レセプターに適用される同じ方法が包含される。ＮＯＴＣＨ−１レセプター、ＮＯＴＣＨ−２レセプター、ＮＯＴＣＨ−３レセプターおよびＮＯＴＣＨ−４レセプターは、極めて高度に関連しており、種々の細胞型において非常に類似の機能もしくは同一の機能を果たす可能性があり、これらは、このレセプターファミリーの異なるメンバーが発現され、様々な組織および細胞型で優先的に用いられるという点で主に異なる。したがって、異なる組織で生じる癌は、ＮＯＴＣＨ−１レセプター、ＮＯＴＣＨ−２レセプター、ＮＯＴＣＨ−３レセプターまたはＮＯＴＣＨ−４レセプターのいずれかに影響を及ぼす非常に類似の型の変異を獲得し得、これらの癌が生じる組織によってどのレセプターサブタイプが発現されるかに依存して、腫瘍細胞増殖を促進するという点で同一の結果を伴う。したがって、本出願において、他に示されない限り、用語「ＮＯＴＣＨ」レセプターは、ＮＯＴＣＨ−１レセプター、ＮＯＴＣＨ−２レセプター、ＮＯＴＣＨ−３レセプターおよびＮＯＴＣＨ−４レセプターの各々に対して集合的に適用される診断的適用を指すように使用される。
【００２３】
変異レセプターの存在は、タンパク質に対するアッセイまたはタンパク質をコードする遺伝子に対するアッセイのいずれかによって検出され得る。遺伝子に対するアッセイに関して、好ましい試験方法は、変異ＮＯＴＣＨレセプターをコードする全長ポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドの一部のいずれかを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅することである。増幅反応のために使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーは、実施例の節で記載されるが、当業者は、本明細書とともに含まれる配列情報および当該分野で公知の配列情報に基づいて他の適切なプライマーを容易に同定し得る。
【００２４】
あるいは、遺伝子変異は、野生型核酸とではなく変異核酸とハイブリッドを形成することを可能にする条件下で、プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出され得る。そのアッセイおよびそのアッセイで使用されるオリゴヌクレオチドの両方が、本発明によって包含される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５塩基の長さであるべきであり、ハイブリダイゼーションアッセイは、ストリンジェントな条件下で行われるべきである。本明細書で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」とは、約６０℃〜７０℃で、低い塩濃度（例えば、０．０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣｌに相当する濃度）で行われるハイブリダイゼーションを指す。
【００２５】
変異タンパク質自体を検出するように設計されたアッセイは、変異されていないＮＯＴＣＨレセプターに対する親和性よりも少なくとも１００倍大きい親和性で変異ＮＯＴＣＨレセプターに結合する抗体を用いて行われ得る。これらの抗体は、事実上モノクローナルまたはポリクローナルのいずれでもよく、変異を含むＮＯＴＣＨレセプターの領域に由来するペプチドで抗体産生動物を注射することによって作製され得る。この様式で作製され、変異レセプターに優先的に結合する抗体もまた、本発明の一部である。
【００２６】
本発明はまた、細胞を、ＮＯＴＣＨレセプターのシグナル伝達を妨害する有効量の因子（例えば、γ−セクレターゼインヒビター）に曝すことによって、上記の変異レセプターを用いて細胞の増殖を遅延または停止させるための方法に関する。適切なインヒビターの例としては、ＩＩＩ−３１−Ｃ、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル）（ＤＡＰＴ）、化合物Ｅ、Ｄ−らせん状ペプチド２９４、イソクマリン、ＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−エポキシド、および（Ｚ−ＬＬ）２−ケトンが挙げられる（Ｋｏｒｎｉｌｏｖａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１６４７９−１６４７３（２００３）を参照のこと）。用語「有効量」は、ＮＯＴＣＨ−１活性を有意に低下させるのに十分なインヒビターまたは他の因子の濃度（例えば、活性を少なくとも２０％低下させるのに十分な量）を示す。Ｎｏｔｃｈレセプター活性を阻害する有効量の因子の存在はまた、臨床的に反映されるはずである。例えば、癌細胞の増殖速度が処置前に生じる増殖の速度と比べて顕著な程度（例えば、少なくとも２０％）遅くされるはずである。
【００２７】
γ−セクレターゼインヒビターは、治療剤として有効であることが見出されているが、ＮＯＴＣＨ活性を阻害する他の因子もまた使用され得る。本明細書に記載される変異は、数種の効果を生じるはずであり、ｉ）メタロプロテアーゼ切断の増強；ｉｉ）モノユビキチン化（Ｅ３リガーゼによって行われる酵素段階）の増大；ｉｉｉ）エンドサイトーシスの増大；ｉｖ）γ−セクレターゼ切断の増強（すでに議論されるとおり）；ｖ）核トランスロケーションの増大；およびｖｉ）核ＮＯＴＣＨ転写活性化複合体の形成の増大が挙げられる。これらの工程のいずれかで作用する薬物は、癌細胞の増殖を停止させるはずである。ある因子（核複合体（ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１と呼ばれるタンパク質のドミナントネガティブ形態）のインヒビター）が、以前に記載されており、４つすべてのＮＯＴＣＨレセプターサブタイプを阻害する（Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２３：６５５−６６４（２００３））。
【００２８】
また、変異されたＮＯＴＣＨレセプターの存在によって誘導される異常な細胞増殖を試験化合物が阻害する能力について、その試験化合物をアッセイする方法が、本発明によっ
て包含される。この方法は、試験化合物を、上記の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターのうちのいずれかを発現する細胞とともにインキュベートする工程を包含する。そのような細胞は、生物学的サンプルから単離されるか、またはその変異レセプターをコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクトすることによって作製されるかのいずれであってもよい。インキュベーションは、γ−セクレターゼの存在下で行われ、そして生じるＮＯＴＣＨレセプター活性の量が決定される。レセプター活性を測定するための任意の方法が使用され得るが、Ｈｓｉｅｈら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９５２−９５９（１９９６））に記載されるルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイが好ましい。次いで、得られた結果が、本質的に同じ条件であるが試験化合物の非存在下で行われたアッセイからの結果と比較される。試験化合物によって生じる活性の低下は、それがＮＯＴＣＨレセプターインヒビターであり、そのレセプターを発現する細胞の増殖を制限するのに有用であり得ることを示唆する。これは、増加する濃度の試験化合物の存在下と非存在下とでそのような細胞の増殖を比較することによって直接確認され得る。
【００２９】
試験化合物がＮＯＴＣＨレセプター活性を阻害する能力を評価するように設計されたアッセイにおいて価値があることに加えて、変異ＮＯＴＣＨレセプターをコードするポリヌクレオチドは、上で議論されるハイブリダイゼーションアッセイで使用され得るプローブの供給源として、および診断アッセイにおけるコントロールとして、役割を果たし得る。変異レセプタータンパク質は、ＮＯＴＣＨの変異形態に特異的な抗体を生成するために使用され得、そしてサンプル中に存在するＮＯＴＣＨレセプターの量を定量するかまたはレセプターの正常形態と変異形態とを区別するかのいずれかのために設計された免疫アッセイにおいて、コントロールとしての役割を果たし得る。変異タンパク質およびその変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドの両方が、分化およびアポトーシスのような生物学的プロセスを研究する研究者にとって興味深いものでもあるはずである。
【００３０】
上で議論されるように、本発明は、変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードする単離された核酸分子を包含する。そのような核酸分子は、
以下：
ａ）本明細書に記載される変異アミノ酸配列のいずれかを含む変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、変異アミノ酸をコードするコドンを除いてそのヌクレオチド配列が配列番号７６のヌクレオチド配列である、ヌクレオチド配列；
ｂ）本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかを有する変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列をコードする変異ＮＯＴＣＨ−１と縮重するヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００３１】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるような１以上の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターのいずれかの存在について生物学的サンプルをアッセイすることによって、そのサンプルの発癌の潜在能力を決定する方法を包含する。変異レセプターの存在は、そのような変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターが存在しないサンプルと比べて増大された発癌の潜在能力を示す。
【００３２】
さらに、本発明は、変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターの異常な発現によって特徴付けられる状態を緩和するように設計された治療レジメンの進行を追跡するための方法を包含し、この方法は、
ａ）被験体に由来するサンプルをアッセイして、第一の時点での変異ＮＯＴＣＨ−１レセプター（または変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードする核酸）のレベルを決定する工程；
ｂ）第二の時点で同じレセプター（または核酸）のレベルをアッセイする工程；および
ｃ）第二の時点でのレベルを第一の時点で決定されたレベルと比較する工程
を包含する。変異タンパク質または変異核酸のレベルが低下することは、治療が効いていることの指標である。レベルが上昇することは、治療が効いていないことの指標である。
【００３３】
本発明はまた、ＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達の機能不全によって特徴付けられる病理学的障害の後退、進行または発症を決定するための方法を包含する。この方法は、その障害を有するかもしくはその障害を有すると疑われる患者から得られたサンプルを、本明細書に記載されるような１以上の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするヌクレオチド配列と実質的に相同であるヌクレオチド配列を有する相補的核酸ハイブリダイゼーションプローブとともにインキュベートする工程を包含する。プローブは、一般的に、配列番号１に示されるような正常形態と相互作用せず、レセプターの変異形態をコードする核酸と相互作用するように設計されるべきである。プローブとサンプル中に存在し得る任意の相補ｍＲＮＡ（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｍＲＮＡ）との間の結合は、上記患者における病理学的障害の後退、進行または発症を示すように使用される。あるいは、アッセイは、レセプターの変異形態に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を用いて行われ得る。変異レセプターレベルまたは変異レセプターをコードする核酸のレベルが上昇するにつれて、その障害が存在するかまたは進行している可能性もまた高まる。変異レセプターまたは核酸のレベルが低下することまたは無いことは、障害の後退または不在の指標である。
・本出願はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターであって、当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、
配列番号１のアミノ酸配列を含み、
ただし、当該アミノ酸配列は、アミノ酸１５７１〜１６２２および／または１６７４〜１７３０および／またはアミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６に１以上の変異を有し、その結果、当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、γ−セクレターゼとのインキュベーションに応じて、変異していないＮＯＴＣＨ−１と比べて増強したシグナル伝達を示す、
実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプター。
・（項目２）
上記１以上の変異を除いて、上記変異レセプターが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、項目１に記載の実質的に精製された変異レセプター。
・（項目３）
項目１に記載の実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターであって、ここで、上記１以上の変異が、以下：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１５７１〜アミノ酸１６１８の部分が、配列番号１２〜配列番号２２、配列番号１０２〜配列番号１１８、および配列番号１４５からなる群より選択される配列で置換されている；
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１５７１〜アミノ酸１６２２の部分が、配列番号２３〜配列番号２９、または配列番号１１９〜配列番号１２７からなる群より選択される配列で置換されている；
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１６７４〜アミノ酸１７３０の部分が、配列番号７０〜配列番号７５または配列番号１２８〜配列番号１３７からなる群より選択される配列で置換されている；
ｄ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６の部分が、配列番号３０〜配列番号５９または配列番号１３８〜配列番号１４４からなる群より選択される配列で置換されている；
のうちの１以上を含む、実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプター。
・（項目４）
上記１以上の変異を除いて、上記変異レセプターが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、項目２に記載の実質的に精製された変異レセプター。
・（項目５）
上記配列が、１５７１；１５７３；１５７５；１５７６；１５７８；１５７９；１５８３；１５８６；１５８８；１５９０；１５９３；１５９４；１５９５；１５９８；１６００〜１６０７；１６１０〜１６１８；１６７４；１６７５；１６７７；１６７９〜１６８４；１６８６；１６９５；１６９６；１７０３；１７０６；１７１５；１７２０；１７２５；および１７２８からなる群より選択される１以上のアミノ酸位置で変異されている、項目１に記載の実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプター。
・（項目６）
上記１以上の変異されたアミノ酸を除いて、上記レセプターが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、項目５に記載の実質的に精製されたレセプター。
・（項目７）
項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするヌクレオチド配列を含む、実質的に精製されたポリヌクレオチド。
・（項目８）
上記ポリヌクレオチドが、項目１に記載の変異レセプターをコードするヌクレオチド配列からなる、項目７に記載の実質的に精製されたポリヌクレオチド。
・（項目９）
実質的に精製されたポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドは、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で項目８に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズするが、変異されていないＮＯＴＣＨ−１をコードするポ
リヌクレオチドに同じ条件下でハイブリダイズしない、実質的に精製されたポリヌクレオチド。
・（項目１０）
項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、ベクター。
・（項目１１）
項目１０に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
・（項目１２）
項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターに、配列番号１の変異されていないＮＯＴＣＨ−１レセプターに対する親和性よりも少なくとも１００倍大きい親和性で結合する、抗体。
・（項目１３）
癌細胞の存在について生物学的サンプルを診断的に試験する方法であって、
項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターについて当該生物学的サンプルをアッセイする工程
を包含する、方法。
・（項目１４）
癌細胞の存在について生物学的サンプルを診断的に試験する方法であって、項目７に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞について当該生物学的サンプルをアッセイする工程を包含する、方法。
・（項目１５）
癌細胞の存在について生物学的サンプルを診断的に試験する方法であって、
項目８に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞について当該生物学的サンプルをアッセイする工程
を包含する、方法。
・（項目１６）
上記方法が、上記変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードする全長ポリヌクレオチド、または当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするポリヌクレオチドの一部のいずれかをＰＣＲ増幅することによって行われる、項目１５に記載の方法。
・（項目１７）
項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを有すると同定された細胞の増殖を遅延させるかまたは停止させる方法であって、
当該細胞を有効量のγ−セクレターゼインヒビターと接触させる工程
を包含する、方法。
・（項目１８）
癌について患者を処置する方法であって、
ａ）当該患者由来の生物学的サンプルを、項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを有する癌細胞の存在についてアッセイする工程；
ｂ）当該生物学的サンプルが当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを有すると見出された場合、当該患者をＮＯＴＣＨ−１レセプターのシグナル伝達を阻害する因子の有効量で処置する工程
を包含する、方法。
・（項目１９）
上記癌がＴ細胞急性リンパ芽球性白血病である、項目１８に記載の方法。
・（項目２０）
上記因子がγ−セクレターゼインヒビターである、項目１８に記載の方法。
・（項目２１）
試験化合物を、変異したＮＯＴＣＨ−１レセプターの存在によって誘導される異常な細胞増殖をその試験化合物が阻害する能力についてアッセイする方法であって、
ａ）当該試験化合物を、項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを発現する細胞とインキュベートする工程であって、当該インキュベーションがγ−セクレターゼの存在下で行われる、工程；
ｂ）工程ａ）のインキュベーションの結果として生じるレセプター活性の量を、当該試験化合物の非存在下で行われた同様のインキュベーションで生じる活性の量と比較する工程
；および
ｃ）当該試験化合物の存在下で観察された活性の量が当該試験化合物の非存在下で観察された活性の量よりも小さい場合、当該試験化合物が変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを発現する細胞の増殖を阻害するはずであると結論付ける工程
を包含する、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、レセプターのシグナル伝達の増強をもたらすヒトＮＯＴＣＨ−１レセプターにおける変異の同定に関する。これらの変異は、γ−セクレターゼインヒビターのようなＮＯＴＣＨ−１活性化を妨害する因子による処置にポジティブに応答する癌細胞に関連し、ＮＯＴＣＨ−１タンパク質の２つの特定の領域（ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメイン）内に位置する。ＮＯＴＣＨ−２レセプターサブタイプ、ＮＯＴＣＨ−３レセプターサブタイプおよびＮＯＴＣＨ−４レセプターサブタイプの対応する領域における類似の変異もまた、シグナル伝達の増強および異常な増殖をもたらすはずであることが予期される。
【００３５】
ＮＯＴＣＨ−１変異の存在を検出するように設計されるアッセイ（例えば、ＰＣＲ増幅に基づくアッセイ）は、異常なＮＯＴＣＨ−１レセプターのシグナル伝達が生じており、結果として無制御の増殖を示す可能性が高い細胞を含む組織サンプルを同定するために、診断的に使用され得る。この特定の異常性によって特徴付けられる癌は、γ−セクレターゼインヒビターのようなＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達を軽減する因子による処置を受け入れやすいはずである。本明細書に記載されるかまたは当該分野で（例えば、アルツハイマー病の処置における潜在的な用途に関連して）記載されているインヒビターのいずれもが、処置レジメンで使用され得る。診断アッセイおよび治療方法は、Ｔ−ＡＬＬに加えて他の型の癌に適用され得る。そのような癌としては、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、腎臓癌および胃腸（ＧＩ）管癌、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、多形性膠芽腫および脳の他のグリア癌、ならびに中皮腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
（Ｉ．変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするポリヌクレオチドの生成）
ヒトＮＯＴＣＨ−１の全長アミノ酸配列が図１に示され、配列識別番号の配列番号１を付与されている。これは、レセプターの正常な変異していない形態である。癌患者または癌細胞株に由来するサンプルに伴っていたＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインにおける変異は、図３に示される。ＨＤドメインのホットスポット中の特定の位置が異なる種間で高度に保存され（図３Ａを参照のこと）、γ−セクレターゼにより引き起こされる活性の増大をもたらす変異に対して特に感受性であることが留意されるべきである。
【００３７】
多くの方法が、本明細書で示される変異された配列を有するＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするポリヌクレオチドを生成するために利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、変異ＮＯＴＣＨ遺伝子を発現する細胞から単離されたｍＲＮＡを逆転写することによって調製されるｃＤＮＡライブラリーは、図１に示される配列に基づいて合成されたプローブを用いてスクリーニングされ得る。あるいは、所望の配列は、逆転写されたＲＮＡを増幅するＰＣＲによって得られ得る。ＰＣＲ用のプライマーは本明細書で示される配列を用いて構築され得、増幅に適していることが見出されている特定のオリゴヌクレオチドが実施例の節に記載される。正確な配列が増幅されたことの確認および特定の変異の存在の同定は、増幅産物を配列決定することによって得られ得る。
【００３８】
あるいは、核酸は、当該分野で周知の標準的な化学的合成方法を用いて生成され得る。一旦得られると、そのポリヌクレオチドは、レポータータンパク質を作製するための組換え方法で使用され得るか、潜在的な治療因子をスクリーニングする目的で細胞で発現され得るか、または診断アッセイでコントロールとして使用され得る。
【００３９】
（ＩＩ．変異レセプタータンパク質の生成）
ＮＯＴＣＨ−１レセプタータンパク質は、化学的方法用いて合成され得るか、または上記のポリヌクレオチドを用いて生成され得る。後者の場合、変異レセプターをコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主によって認識可能な転写シグナルおよび翻訳シグナルを含むベクター中に配置され得る。二本鎖形態のクローン化レセプター配列が、作動可能に結合されて発現ベクターに挿入される。レセプターをクローニングし発現させるために適切なベクターおよび技術は、分子生物学の分野で周知である。
【００４０】
発現ベクターは、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはウイルス移入のような方法によって、宿主細胞（好ましくは、哺乳類宿主細胞）に導入され得る。組換え変異レセプターを発現する細胞は、標準的な十分に確立された方法を用いて選択され得る。細胞中の変異レセプター核酸の存在を確認するための１つの単純な方法は、レセプターをコードするヌクレオチド配列に隣接することが公知のプライマーを用いるＰＣＲ増幅を行うことである。レセプターの存在はまた、ＮＯＴＣＨ−１の機能アッセイ（例えば、実施例の節および当該分野で記載されるルシフェラーゼアッセイ（Ｈｓｉｅｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９５２−９５９（１９９６）を参照のこと））を用いて確認され得る。一旦組換え変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを生成する細胞が同定されると、その細胞は、例えば、γ−セクレターゼとのインキュベーションによってシグナル伝達を軽減し得る因子を同定するように設計されるアッセイ、またはＮＯＴＣＨ−１インヒビターが無制御の細胞増殖を阻止する能力を測定するアッセイで、使用され得る。ＮＯＴＣＨ−１レセプターそれ自体は、診断アッセイで、またはそのようなアッセイで使用され得る変異レセプターに特異的な抗体を生成するために、使用され得る。
【００４１】
（ＩＩＩ．変異ＮＯＴＣＨレセプターに対する抗体）
本発明は、ＮＯＴＣＨレセプターの変異形態に特異的に結合する抗体、およびそのような抗体を生成するためのプロセスを包含する。「変異ＮＯＴＣＨレセプターに特異的に結合」する抗体は、そのレセプターの変異されていない形態に対する親和性よりもその変異形態に対して少なくとも１００倍高い親和性を有する抗体と定義される。そのような抗体を生成するためのプロセスは、全長変異レセプタータンパク質（または、好ましくは、変異が生じる領域を含む短いペプチド）を適切な動物に注射することを包含し得る。そのペプチドは、少なくとも５アミノ酸の長さであるべきであり、個々にかまたは組み合わせてかのいずれで注入されてもよい。
【００４２】
抗体を作製および選択するための方法は、標準的な参考資料（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（１９８２）； ；Ｋｅｎｎｅｔｔら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（１９８０）； およびＣａｍｐｂｅｌｌ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８４））によって証明されるように、当業者に周知である。
【００４３】
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、無傷の分子、および抗原に結合する能力を保持するフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を包含することが意味される。用語「抗体」はまた、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を指すと定義される。ポリクローナル抗体は、適切な抗原で免疫された動物の血清に由来する。モノクローナル抗体は、参考文献（例えばＨａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．５６３−６８１（１９８１））によって教示されるようなハイブリドーマ技術を用いて調製され得る。一般に、この技術は、免疫応答性動物（代表的には、マウス）を無傷のタンパク質またはそれに由来するフラグメントのいずれかを用いて免疫することを含む。次いで、その免疫された動物から脾細胞が抽出され、適切な骨髄腫細胞（例えば、ＳＰ２Ｏ細胞）と融合される。その後、得られたハイブリドーマ細胞が、ＨＡＴ培地に選択的に維持され、次いで、限界希釈によってクローニングされる（Ｗａｎｄｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１））。次いで、そのような選択を通して得られた細胞は、ＮＯＴＣＨ−１の変異形態または他のＮＯＴＣＨレセプターの変異形態に優先的に結合する抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされ得る。
【００４４】
本発明の抗体または抗体のフラグメントは、種々の免疫アッセイを用いて変異ＮＯＴＣＨレセプタータンパク質の存在を検出するために使用され得る。例えば、抗体は、ラジオイムノアッセイまたは免疫測定（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイ（「ツーサイト（ｔｗｏ ｓｉｔｅ）」アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイとしても公知）で使用され得る（Ｃｈａｒｄ，“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９７８）を参照のこと）。典型的な免疫測定アッセイにおいて、一定の量の非標識抗体が、試験される流体（例えば、血液、リンパ、細胞抽出物など）に不溶性の固体支持体に結合される。固定された抗体に対する抗原の最初の結合の後、一定量の検出可能に標識された第二の抗体（これは第一の抗体と同じであっても同じでなくてもよい）が添加されて、結合した抗原の検出および／または定量を可能にする（例えば、Ｋｉｒｋｈａｍら、Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｐｐ．１９９−２０６（１９７０）を参照のこと）。これらのアッセイの型の多くのバリエーションが当該分野で公知であり、変異ＮＯＴＣＨレセプターの検出のために使用され得る。
【００４５】
変異ＮＯＴＣＨレセプターに対する抗体もまた、無傷のレセプターまたはこれらのレセプターのフラグメントのいずれかの精製において使用され得る（一般に、Ｄｅａｎら、Ａ
ｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）を参照のこと）。代表的に、抗体は、クロマトグラフィーのマトリックス（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）上に固定される。次い
で、マトリックスはカラムに充填され、変異レセプターを含む調製物が、結合を促進する条件下（例えば、塩が少ない条件下）でカラムに通される。次いで、カラムは洗浄され、結合したレセプターが、抗体からの解離を促進する緩衝液（例えば、ｐＨまたは塩濃度が変化された緩衝液）を用いて溶出される。溶出したレセプタータンパク質は、例えば、透析によって選択した緩衝液に移され得、そして保管され得るかまたは直接使用され得る。好ましいレセプターは、上記のイムノアッセイで、またはアッセイで使用するための抗体の生成のために、使用され得る。
【００４６】
（ＩＶ．アッセイ方法）
生物学的サンプルが、本明細書で記載される変異が無制御の増殖をもたらす癌細胞を含むかどうかを決定するための診断アッセイは、タンパク質を分析するための上記のイムノアッセイを用いて、または、好ましくは、レセプターの変異形態をコードする核酸配列の存在についてサンプルをアッセイすることによって、のいずれかで行われ得る。核酸分析のために好ましい方法は、当該分野で周知の方法を用いて細胞から抽出されたポリ核酸をＰＣＲ増幅することによる。増幅は、以下の実施例の節に記載されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、または配列番号１として示されるＮＯＴＣＨ−１の配列に基づく他のオリゴヌクレオチドを用いて行われ得る。次いで、増幅されたＮＯＴＣＨレセプター生成物は配列決定され得て、その生成物がシグナル伝達の増強をもたらす変異を有するかどうかが決定され得る。
【００４７】
あるいは、ハイブリダイゼーションは、変異配列にのみ結合するプローブを用いて、ストリンジェントな条件で行われ得る。このプローブは、長さが最低限１５ヌクレオチドであるべきであり、ＮＯＴＣＨ−１の変異された領域をコードするポリヌクレオチド配列部分を含まなければならない。ストリンジェントな条件は、代表的に、６０℃〜７０℃の温度で、低い塩濃度（０．０２Ｍ〜０．１５Ｍ ＮａＣｌ）でのハイブリダイゼーションを含む。プローブを同定し標識するため、およびハイブリダイゼーションを行い結果を分析するための手順は、分子生物学の分野で周知である。
【００４８】
組換え変異ＮＯＴＣＨレセプターをコードするベクターで形質転換された宿主細胞もまた、レセプターによる不適切なシグナル伝達を減少する試験化合物を同定するように設計されるアッセイで使用され得る。このアッセイは、代表的に、γ−セクレターゼおよび試験化合物の存在下で細胞をインキュベートすることを含む。次いで、ＮＯＴＣＨレセプターのシグナル伝達が、アッセイ（例えば、本明細書に記載されるようなアッセイ）を用いて、または当該分野で公知の他のアッセイ（また、Ｈｓｉｅｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９５２−９５９（１９９６）を参照のこと）を用いて定量され得る。簡便な代替法として、無制御の増殖をもたらすＮＯＴＣＨ−１の変異形態を発現することが公知の細胞が、γ−セクレターゼおよび試験化合物の存在下および非存在下で培養されて、その化合物が増殖を防止し得る程度が決定され得る。
【００４９】
（Ｖ．処置方法）
γ−セクレターゼインヒビターは、アルツハイマー病に対する処置としてのその潜在的な用途に関心のある製薬会社によって開発されている。これらの同様のインヒビターが、無制御の増殖が本明細書に記載されるＮＯＴＣＨレセプター変異に関連する場合において、癌細胞を処置するために使用され得る。
【００５０】
治療レジメンは、患者から除去された癌細胞を含む生物学的サンプルを第一に試験してＮＯＴＣＨレセプターの変異形態が存在するかどうかを決定することを含む。次いで、そのサンプルが変異の存在を証明する患者は、γ−セクレターゼインヒビターを用いてか、またはＮＯＴＣＨレセプター活性を妨害する別の因子を用いて処置される。投与される投薬量は、処置される特定の状態、投与経路および臨床的考慮事項に依存し、これらは当該分野で周知である。投薬量は、有益な効果（例えば、腫瘍増殖の遅延）が検出されるまで、徐々に増加され得る。因子は、単一または複数のいずれかの投薬レジメンで提供され得、単独でまたは他の治療因子と組み合わせて与えられ得る。
【００５１】
変異ＮＯＴＣＨレセプターに関連する癌の処置は、任意の投与経路および投薬形態に適合し得る。処置される特定の状態に依存して、特定の投薬形態が他の形態よりもより簡便であるかまたは有効である傾向がある。例えば、局所投与は、皮膚癌の処置において好ましくあり得るが、白血病に対しては非経口投与が好ましい可能性がある。非経口用調製物および局所用調製物は別として、因子は、口腔（ｏｒａｌｌｙ）投与、経口（ｐｅｒｏｒａｌｌｙ）投与、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ）投与、鼻腔内投与、直腸投与、経膣投与、舌側（ｌｉｎｇｕａｌｌｙ）投与および経皮投与され得る。特定の投与形態としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、エアロゾル、坐剤、皮膚用パッチ、非経口剤（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、経口液体（懸濁剤、液剤および乳剤を含む）が挙げられる。徐放性投薬形態もまた、使用され得る。すべての投薬形態は、当該分野において標準的である方法を用いて調製され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）を参照のこと）。
【実施例】
【００５２】
本実施例は、ヒトＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）（すべての主要な分子発癌性サブタイプに由来する腫瘍ならびに小児および成人に発生している腫瘍を含む）の約６５％が、ＮＯＴＣＨ−１変異を有することを示唆する結果を提供する。これらの変異のほとんどが、細胞外ヘテロ二量体化ドメインをコードする領域で、Ｃ末端ＰＥＳＴ破壊ボックスを除去する切断として生じる。これらの変異は、ＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達の増強を引き起こし、そのような変異を有するＴ−ＡＬＬ細胞株は、ＮＯＴＣＨ−１経路インヒビターによって増殖が阻止される。
【００５３】
（緒言）
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）は、小児および青年が優先的に罹患する侵攻性の（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）新生物である。これは、一般に、獲得された染色体転座および他の遺伝的異常もしくは後成的異常に関連し、これは、転写因子の選択群（ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質ＴＡＬ１、ＴＡＬ２、ＬＹＬ１、およびＢＨＬＨＢ１、オーファンホメオボックスタンパク質ＨＯＸ１１およびＨＯＸ１１Ｌ２、ならびに融合タンパク質ＭＬＬ−ＥＮＬおよびＣＡＬＭ−ＡＦ１０を含む）の異常な発現をもたらす。これらのタンパク質の誤発現（単独または組み合わせ）は、Ｔ細胞の発生、増殖および生存の正常な経路を混乱させ、独特な遺伝子発現プロフィールを有するＴ−ＡＬＬのサブグループを規定する。それにもかかわらず、マウスモデルにおいてこれらのタンパク質のいずれか１つの発現が単独で増強されても、Ｔ−ＡＬＬを引き起こすには十分ではなく、この疾患に関する多段階の分子病原論が重視される。
【００５４】
（材料および方法）
（細胞株）
すべてのＴ−ＡＬＬ細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧおよび１００μ／ｍｌ ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、５％ＣＯ２下で３７℃にて培養した。Ｕ２ＯＳ細胞を、１０％ ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧおよび１００μ／ｍｌ ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２下で３７℃にて増殖させた。
【００５５】
（細胞株のγ−レダクターゼインヒビター処置）
γ−レダクターゼ活性を、増殖細胞に１μ／Ｍの最終濃度で化合物Ｅを添加することによって阻害した。モック（Ｍｏｃｋ）処理した培養物をビヒクルのみ（最終濃度０．０１％のＤＭＳＯ）に曝露した。以下のヒトＴ−ＡＬＬ細胞株を、化合物Ｅに対する感受性について試験した：Ｔ−ＡＬＬ−１、ＡＬＬ−ＳＩＬ、ＫＯＰＴ−Ｋ１、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＤＮＤ−４１、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ２、ＲＰＭＩ８４０２、ＴＨＰ−６、ＢＥ−１３、ＪＭ−Ｊｕｒｋａｔ、Ｊｕｒｋａｔ−Ｅ６、ＲＥＸ、ＣＥＭ、ＬＯＵＣＹ、ＤＵ−５２８、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、ＭＫＢ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ−１３、ＭＯＬＴ−１５、ＭＯＬＴ−１６、ＳＵＰＴ−７、ＳＵＰＴ−１１、ＳＵＰＴ−１３、Ｐ１２−Ｉｃｈｉｋａｗａ、ＫＡＲＰＡＳ−４５、ＤＳＭＺ−ＰＥＥＲおよびＰＦ−３８２。マウス細胞株Ｔ−６Ｅ（これは、活性化のためにγ−セクレターゼ切断を必要とする短縮型の膜係留形態ＮＯＴＣＨ−１で誘導したＴ−ＡＬＬに由来した）をポジティブコントロールとして使用した。
【００５６】
（レトロウイルス）
レトロウイルス発現プラスミド（ＭＳＣＶ−ＧＦＰ−ＩＣＮ１およびＭＳＣＶ−ドミナントネガティブＭａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１−ＧＦＰ）の構築、高力価の偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）両種向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）複製欠損型レトロウイルスの生成、およびスピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）手順を、以前に記載されるように行った（Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２３：６５５−６６４）。
【００５７】
（細胞周期分析）
細胞を、７０％冷エタノール中で一晩固定した後、ヨウ化プロピジウムで染色したか、またはＧＦＰ蛍光およびＤＮＡ含量測定を同時に測定する場合は、（製造業者によって示されるようま）完全培地中でＤＲＡＱ５（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ，Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ，ＵＫ）で染色した。ＤＮＡ含量をフローサイトメトリーによって確認し、細胞周期因子をマルチサイクルソフトウェア（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いて決定した。
【００５８】
（ＮＯＴＣＨ−１発現プラスミド）
ｐｃＤＮＡ３中のＮＯＴＣＨ−１発現プラスミドは以前に記載されている。一般的なＰＥＳＴ欠失を作製するために、Ｔ−ＡＬＬ細胞株ＡＬＬ−ＳＩＬのＰＥＳＴドメイン中の挿入変異をＰＣＲによって増幅し、配列決定によって同定し、次いで、ｐｃＤＮＡ３−ＮＯＴＣＨ−１にサブクローニングした。ＨＤドメインの部位特異的変異誘発を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。変異ＰＣＲプライマーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅウェブツールを用いて設計した。
【００５９】
（レセプター遺伝子アッセイ）
ＮＯＴＣＨ−１発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、以前に記載されるように（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−７５１５（２０００））、（ｉ）ＣＳＬ結合部位を含むプロモーターの制御下にある人工的ルシフェラーゼレポーター遺伝子および（ｉｉ）内部Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ制御遺伝子とともにＵ２ＯＳで、一過性トランスフェクトした。必要に応じて空のベクターを添加することによって、全ＤＮＡを定常に保った。すべてのトランスフェクションは三連で行い、各実験を少なくとも３回繰り返した。トランスフェクションの４４〜４８時間後に細胞溶解物を収集し、ルシフェラーゼアッセイを、製造業者の提案どおりにＴｕｒｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ照度計でＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。
【００６０】
（ＮＯＴＣＨ−１ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅）
Ｔ−ＡＬＬ細胞株から単離したＲＮＡ（１）μ／ｇを、製造業者の提案した条件のように、オリゴ−ｄＴプライミングおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２０μｌ反応物中でｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ増幅を、５０μｌの反応体積で、テンプレートとして１μｌのｃＤＮＡ、２０ｐＭｏｌの５’-ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＴＡＣＣＣＧＡ（配列番号７８）ＮＯＴＣＨ−１−特異的プライマーおよび５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＡ（配列番号７９）ＮＯＴＣＨ−１−特異的プライマー、０．２５μｌのＥｘ−Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）、１×反応緩衝液、１×ｄＮＴＰならびに７．５％ ＤＭＳＯを用いて行った。サイクルパラメータは、９４℃で３分間；９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間を３０サイクル；および７２℃で８分間、であった。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製し、Ｂａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩで消化し、ｐＳＰ７２に連結し、ＤＨ５α細胞を形質転換するために使用した。個々のコロニーからのミニプレップＤＮＡを、Ｔ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを用いて配列決定した。
【００６１】
（患者の材料）
Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＤａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで処置されたＴ−ＡＬＬを有する９６例の小児および若年成人に由来する冷凍保存されたリンパ芽球のサンプルを、診断時にインフォームドコンセントを行って入手した。各サンプルからのゲノムＤＮＡを、市販のキット（ＧＥＮＴＲＡ）で製造業者の指示に従って抽出した。ＲＮＡを、ＲＮＡ水性試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて製造業者の指示に従って、冷凍保存されたリンパ芽球から調製した。
【００６２】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
ＨＯＸ１１、ＨＯＸ１１Ｌ２、ＴＡＬ１、ＬＹＬ１、ＴＡＬ２およびＢＨＬＨＢ１の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、以前に記載されるように（Ｆｅｒｒａｎｄｏら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｌｌ １：７５−８７；Ｆｅｒｒａｎｄｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３６３：５３５−５３６）行った。ＭＬＬ−ＥＮＬ融合転写物およびＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合転写物のＲＴ−ＰＣＲベースの検出もまた、以前に記載されるように（Ｆｅｒｒａｎｄｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３６３：５３５−５３６；Ａｓｎａｆｉら、Ｂｌｏｏｄ １０２：１０００−１００６）行った。
【００６３】
（ゲノムＤＮＡ調製）
ゲノムＤＮＡを、製造業者の指示に従って、市販のキット（ＧＥＮＴＲＡ）での抽出によって原発性（ｐｒｉｍａｒｙ）Ｔ−ＡＬＬから調製した。ＤＮＡを、ＳＤＳ溶解／プロテイナーゼＫ消化、その後のフェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって、細胞株から調製した。ＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁し、分光光度的に定量し、−２０℃で保管した。
【００６４】
（変異検出）
ＮＯＴＣＨ−１のエキソン２６、エキソン２７およびエキソン３４における変異検出を、ＰＣＲベースの変性ＨＰＬＣによって、ＤＮＡＳｅｐ ＨＴカートリッジを備えるＷＡＶＥ ＤＮＡフラグメント分析システム（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて行った。変異分析用のアンプリコンを、以下のプライマーの組み合わせを用いて調製した。エキソン２６でコードされるＮＯＴＣＨ−１のＨＤドメインのＮ末端領域を、２つのアンプリコンに分割した。アンプリコンＨＤ−Ｎ１を、プライマーＨＤ−Ｎ１ＦＷ１：５’−ＡＧＣＣＣＣＣＴＧＴＡＣＧＡＣＣＡＧＴＡ（配列番号８０）、ＨＤ−Ｎ１ＲＶ１：５’−ＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣ（配列番号８１）を用いるＰＣＲによって、そしてプライマーＨＤ−Ｎ１ＦＷ２：５’−ＧＡＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＧＡＣＣＡ（配列番号８２）、ＨＤ−Ｎ１ＲＶ２：５’−ＴＣＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＴＡＧＴＡＧ（配列番号８３）を用いるネスト化ＰＣＲによって増幅した。アンプリコンＨＤ２を、プライマーＨＤ−Ｎ２ＦＷ１：５’−ＧＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧ（配列番号８４）、ＨＤ−Ｎ２ＲＶ１：５’−ＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＴＧ（配列番号８５）を用いるＰＣＲによって、そしてプライマーＨＤ−Ｎ２ＦＷ２：５’−ＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴ（配列番号８６）およびＨＤ−Ｎ２ＲＶ２：５’−ＣＧＣＣＧＧＧＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣ（配列番号８７）を用いるネスト化ＰＣＲによって増幅した。
【００６５】
エキソン２７でコードされるＮＯＴＣＨ １のＨＤドメインのＣ末端領域を、プライマーＨＤ−ＣＦＷ１：ＧＴＧＧＣＧＴＣＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡ（配列番号８８）およびＨＤ−ＣＲＶ１：ＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＣ（配列番号８９）を用いるＰＣＲによって、そしてプライマーＨＤ−ＣＦＷ２：ＣＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＴ（配列番号９０）およびＨＤ−ＣＲＶ２：ＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣ（配列番号９１）を用いるネスト化ＰＣＲによって増幅した。
【００６６】
ＮＯＴＣＨ−１のＰＥＳＴドメインとＴＡＤを含む連続的Ｎ領域とをコードするエキソン３４の配列を、３つのアンプリコンに分割した。アンプリコンＰＥＳＴ１およびＰＥＳＴ２を、プライマーＰＥＳＴＦＷ１：５’−ＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＧＧ（配列番号９２）およびＰＥＳＴＲＶ１：５’−ＡＡＣＡＴＧＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＴＣＣＴＣ（配列番号９３）を用いるＰＣＲによって、そしてプライマーＰＥＳＴ１ＦＷ：５’−ＡＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡ（配列番号９４）、ＰＥＳＴ１ＲＶ：５’−ＣＡＣＡＧＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧ（配列番号９５）、ならびにＰＥＳＴ２ＦＷ：５’−ＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＣＣＡＧＴＴＣ（配列番号９６）およびＰＥＳＴ２ＲＶ：５’−ＡＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＣ（配列番号９７）を用いるネスト化ＰＣＲによって増幅した。アンプリコンＴＡＤ１を、プライマーＴＡＤ１ＦＷ１：５’−ＡＧＡＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＴＣＧＴＣＴＣＴ（配列番号９８）、ＴＡＤ１ＲＶ１：５’−ＧＣＴＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣ（配列番号９９）を用いるＰＣＲによって、そしてプライマーＴＡＤ１ＦＷ２：５’−ＣＧＴＣＴＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴ（配列番号１００）およびＴＡＤ１ＲＶ２：５’−ＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＧＣＣＡＡＧＧＴ（配列番号１０１）を用いるネスト化ＰＣＲによって増幅した。ＤＨＰＬＣ分析の前に、変異対立遺伝子に対してヘテロ接合性のサンプル中でホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の形成を可能にするために、ネスト化ＰＣＲ産物を、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＰＴＣ−２２５）を用いて９５℃で５分間変性させ、４０℃までゆっくりと傾斜をつけた。
【００６７】
１サンプルあたり１５μｌ〜３０μｌのアニーリングしたＰＣＲフラグメントを、分析のためにＤＮＡＳｅｐ ＨＴカートリッジに注入した。生成物を、アンプリコンのサイズおよびＧＣ含量に基づいてＮａｖｉｇａｔｏｒソフトウェア（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）によって決定した線形のアセトニトリル勾配を用いて、一定の流速（１．５ｍｌ／分）で溶出させた。この勾配は、０．１ｍの酢酸トリメチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）緩衝液（ｐＨ７）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）と緩衝液Ｂ（２５％ アセトニトリルを含む０．１ｍ ＴＥＡＡ）とを混合することによって生成した。このシステムのＵＶ検出器によってモニタリングしたＤＮＡフラグメントの溶出プロフィールを使用して、クロマトグラフを作成した。各サンプルについての分析順序は以下のとおりであった：検出器のための時間経過 １．９分間、緩衝液Ｂの３％減少を伴うローディング段階 ０．１分間、１分間あたり２％の緩衝液Ｂの増加スロープでの線形勾配 ２．０分間、７５％アセトニトリルを用いる洗浄段階 ０．１分間、および次の注入の前の平衡 ０．１分間。ホモ二重鎖ピークおよびヘテロ二重鎖ピークを、反応中の残留ヌクレオチドとプライマーとによって生成された最初の注入ピークと、洗浄段階との間で検出した。
【００６８】
２７６〜４５２塩基対の範囲のネスト化ＰＣＲ産物についての融解プロフィールを、Ｎａｖｉｇａｔｏｒソフトウェアを用いて構築した。変異検出のための適切な部分的変性温度（これは、目的の領域に含まれる各塩基における３０％〜９８％のらせん構造の割合を生じた）を、全アンプリコンについて予測した：ＰＥＳＴ１、６６．５℃；ＰＥＳＴ２、６５．０℃；ＨＤ１、６７．０℃および６４．５℃；ＨＤ２、６７．０℃および６４．０℃；ならびにＴＡＤ１、６４．５℃および６３．９℃。あまり安定でないヘテロ二重鎖は、ホモ二重鎖よりも速く変性し、したがって、溶出プロフィールにおいて最初に現れる。したがって、通常のホモ二重鎖の前に溶出した種を表すクロマトグラフを有するサンプルで、直接配列決定を行った。
【００６９】
（結果）
ｔ（７；９）に関連するまれな場合を越えてヒトＴ−ＡＬＬにおけるＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達の果たし得る役割を評価するために、本発明者らは、最初に、ｔ（７；９）を欠くＴ−ＡＬＬ細胞株を、これらの細胞をγ−セクレターゼインヒビターで処理することによってＮＯＴＣＨ依存性について試験した（Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：６５５−６４）。本発明者らは、試験した３０個のヒトＴ−ＡＬＬ細胞株のうち５つがＧ０／Ｇ１細胞周期停止を示し、これは参照のＮＯＴＣＨ−１依存性のマウスＴ−ＡＬＬであるＴ６Ｅ細胞株の細胞周期停止と等しいかまたはそれを上回ることを観察した（図２Ａ）。γ−セクレターゼインヒビターによって引き起こされる増殖抑制は、ＩＣＮ１（γ−セクレターゼ切断後に放出されるフラグメントである）のレトロウイルス発現によって排除され（図２Ｂ）、ドミナントネガティブなＭａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１のレトロウイルス発現によって再現された（図２Ｃ）。まとめると、これらの結果は、これらの５つの細胞株の増殖がＮＯＴＣＨ媒介性シグナルに依存することを示した。
【００７０】
ＮＯＴＣＨレセプターはＮＯＴＣＨ細胞外ドメインの物理的解離によって活性化され得る（Ｒａｎｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１８２５−３５；Ｋｒａｍｅｒ，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ ２０００，ＰＥ１）ので、本発明者らは、新たに同定されたＮＯＴＣＨ−１のＨＤドメインが機能獲得型（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）変異の部位であり得ると考えた。マウスＴ−ＡＬＬで観察されるレトロウイルス挿入の１つのクラスは、ネガティブな調節Ｃ末端ＰＥＳＴ配列の欠失を生じ（Ｈｏｅｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３８３１−４２；Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ ９６：１９０６−１３）、この挿入を発癌性ＮＯＴＣＨ−１変異についての第二の候補領域にする。著しいことに、これらのゲノム領域のＤＮＡ配列決定は、５つのＮＯＴＣＨ依存性細胞株のうちの４つにおけるＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異の両方を明らかにした。（ＮＯＴＣＨ−１のエキソン２６によってコードされる）ＨＤドメインに影響を与えるミスセンス変異は、脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプターにおいて不変である残基を伴い、アミノ酸残基の非保存的変化を生じた（図３Ａ〜図３Ｃ）。１つの細胞株、ＤＮＤ−４１は、同じＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子内に２つの異なるＨＤドメイン変異を有した。
【００７１】
ＰＥＳＴ変異（エキソン３４に見出される）は、ネガティブな調節Ｃ末端ＰＥＳＴドメインの部分的もしくは完全な欠失を生じると予測されるリーディングフレームのシフトを引き起こす短い挿入または欠失であった（図３Ｄおよび図３Ｅ）。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定により、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異が、試験した４つの細胞株の各々の同じＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子中にｃｉｓに存在することが明らかにされた。正常なＮＯＴＣＨ−１ ｃＤＮＡクローンもまた、各々の細胞株で同定され、これは、両方の対立遺伝子が発現されることを示す。これは、エキソン２６変異およびエキソン３４変異を有する細胞株が予期されるサイズのＮＴＭのポリペプチドおよびＮＴＭよりもわずかに小さいサイズのさらなる異常なポリペプチド含むことを明らかにしたウェスタンブロット分析の結果と一致する（図３Ｆ）。対照的に、エキソン２６およびエキソン３４を欠く細胞株ＴＡＬＬ−１は、予期されるサイズのＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドのみを含んでいた。
【００７２】
本発明者らは、ＮＯＴＣＨ−１のＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインについての本発明者らの変異分析を、診断時に９６例の小児および青年の骨髄から得られた冷凍保存された原発性Ｔ−ＡＬＬサンプルに拡張した。少なくとも１つの変異が４９の腫瘍（５１％）で同定され、２０の腫瘍（２０．８％）はＨＤドメイン変異のみを有し、１５の腫瘍（１５．６％）はＰＥＳＴドメイン変異のみを有し、そして１４の腫瘍（１４．６％）は、ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインの両方で変異を有した。変異は、ＨＯＸ１１、ＨＯＸ１１Ｌ２、ＴＡＬ１、ＬＹＬ１、ＭＬＬ−ＥＮＬまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０の誤発現に関連する腫瘍で見られ（ＨＯＸ１１（３例のうち２例）、ＨＯＸ１１Ｌ２（１３例のうち１０例、すなわち７７％）、ＴＡＬ１（３１例のうち１１例、すなわち３５％）、ＬＹＬ１（１４例のうち７例、すなわち５０％）、ＭＬＬ−ＥＮＬ（３例のうち１例）、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０（２例のうち１例））、これは、一緒にＴ−ＡＬＬの主要な分子サブタイプを規定する。原発腫瘍中のＨＤドメイン変異は、残基１５７４〜１６２２に広がる「ホットスポット」においてクラスター化し、ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株でもともと同定された３つのＬからＰへのミスセンス変異、ならびに１〜２個の残基の欠失および短い「インフレーム」挿入の各々を含んでいた（図３Ａ〜図３Ｂ）。ＰＥＳＴドメイン変異は、リーディングフレームのシフトを誘導する挿入または欠失、ならびに未熟終止コドンを生じる点変異を含んでいた（図３Ｄ〜図３Ｅおよび図６）。
【００７３】
Ｔ−ＡＬＬとは対照的に、８９個の原発性Ｂ−ＡＬＬサンプルでは変異は観察されなかった。変異はまた、そのＴ−ＡＬＬがＮＯＴＣＨ−１変異を有する患者から得られた４つの寛解骨髄サンプルには存在せず、これらの変異が生殖系列には存在しないが悪性クローン内で獲得されることを示す。多型はＮＯＴＣＨ−１のＨＤドメイン領域内で検出されていないが（ＮＣＢＩ ＳＮＰデータベース）、本発明者らにＴ−ＡＬＬで本発明者らが検出した保存残基中の変異が機能的な結果を有する可能性があることのさらなる推測をもたらす。
【００７４】
この課題に直接取り組むために、本発明者らは、一過性発現アッセイにおけるＮＯＴＣＨ感受性ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化に対する、共通するＨＤドメイン変異（ＰＥＳＴドメイン欠失を有するものおよびＰＥＳＴドメイン欠失を有さないもの）の効果を研究した（図４Ａ）。残基１５７５、１５９４または１６０１でのＨＤドメイン内の単一のＬからＰへの変異は、ルシフェラーゼ活性の３倍〜９倍の刺激を生じ、一方で孤立した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）ＰＥＳＴ欠失（アミノ酸２４７１での切断を生じるＡＬＬ−ＳＩＬ細胞株に見出される変異に対応する）は、約１．５倍〜２倍の刺激を生じた。より著しくは、ｃｉｓにおける各々のＨＤ変異および同じＰＥＳＴドメイン切断は、２０倍〜４０倍の転写活性化の刺激を生じた。対照的に、ｔｒａｎｓにおける同じ変異は、より低いレベルの刺激を生じ、これは単独で作用する各変異の平均に近かった。
【００７５】
図４に記載されるように行ったさらなるレポーター遺伝子アッセイは、これまで試験したすべてのＨＤドメインがＮＯＴＣＨ−１における機能の増強を表すことを示している。これらの機能アッセイで試験した変異は：
Ｖ１５７７Ｅ 配列番号１０２
Ｌ１５８６Ｑ 配列番号１０６
Ｆ１５９３Ｓ 配列番号１１７
Ｌ１５９７Ｈ 配列番号１０９
Ｒ１５９９Ｐ 配列番号１５
Ｉ１６１７Ｎ 配列番号１１５
Ｉ１６１７Ｔ 配列番号１１６
Ｖ１６７７Ｄ 配列番号１３５
Ｌ１６７９Ｐ 配列番号７１
Ｉ１６８１Ｎ 配列番号７３
Ａ１７０２Ｐ 配列番号１２９
Ｉ１７１９Ｔ 配列番号１２８
ｉｎｓ（ＲＬＧＳＬＮＩＰＹＫＩＥＡＶ） 配列番号１３７
である。
【００７６】
これらのデータは、増強された機能がＮＯＴＣＨ１のＨＤドメインに見出される変異の一般的特徴であることを示唆する。
【００７７】
ｃｉｓにおけるＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異の相乗的相互作用は、（ｉ）ＨＤドメイン変異がγ−セクレターゼ切断を促進し、ＩＣＮ１の生成速度を増加させ（ｉｉ）ＩＣＮ１のＰＥＳＴドメインを除去する切断がＮＯＴＣＨのこの活性化形態の半減期を増大させる、モデルと一致する（図４Ｂ）。ｔｒａｎｓでのこれらの変異によって生じる中程度のレベルの活性化は、おそらく、プロセシングおよびシグナル伝達に必要とされる因子について比較的弱い機能獲得型ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドと強い機能獲得型ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドとの間の競合を反映する。変異された膜貫通ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの刺激効果は、γ−セクレターゼインヒビターによって完全に排除され、シグナル伝達のために変異されたＮＴＭサブユニットの膜近傍部位でのタンパク質分解の要件を示す（図４Ａ）。対照的に、ＩＣＮ１によって生じる刺激（構成的に核刺激である）は、γ−セクレターゼ阻害により影響を受けなかった（図４Ａ）。
【００７８】
ごく最近、本発明者らは、Ｔ−ＡＬＬ以外の腫瘍において２つの変異を観察した。ＮＯＴＣＨ−１のエキソン２６における挿入変異は、急性骨髄性白血病の場合に見出された。これは、アミノ酸残基１５９３〜１５９４をＦＬからＬＳＬに変化させる。この変異は、図４Ａに示されるアッセイと類似するアッセイにおいてＮＯＴＣＨ−１がＣＳＬ感受性ルシフェラーゼ遺伝子を活性化する能力を刺激し、この変異がＮＯＴＣＨ−１機能を増大させることを示す。エキソン２７における新規なＮＯＴＣＨ−１変異は、ランゲルハンス細胞組織球増殖症（高度に保存された残基であるアミノ酸１６９３がＣからＲに変化する）の場合に見出された。同時に、これらのデータは、Ｔ−ＡＬＬで発見された変異と同一または機能的に類似する変異がヒト新形成の他の形態で見出されるという予測を支持する。
【００７９】
（考察）
Ｔ−ＡＬＬのあらゆる主要な分子発癌性サブタイプに見出される機能獲得型ＮＯＴＣＨ−１変異の有病率は、この腫瘍の病原論における無制御のＮＯＴＣＨシグナル伝達に対する卓越した役割を強く支持する。増殖のためにＮＯＴＣＨシグナルを必要とするようであるがＮＯＴＣＨ−１ ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴ領域変異を欠く少なくとも１つの細胞株（ＴＡＬＬ−１）の存在は、ＮＯＴＣＨ経路に関与するプレＴ細胞形質転換を説明する他の機構が存在することを示唆する。ＮＯＴＣＨ−１の他の領域に影響を及ぼす活性化変異がヒトＴ−ＡＬＬの事例で同定され得ることが、考えられ得る。
【００８０】
以前の研究は、ＮＯＴＣＨレセプターの活性化が、通常は、タンパク質分解を抑制するＮＥＣサブユニットの放出を通じて主に達成されることを示した（Ｒａｎｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１８２５−３５；Ｋｒａｍｅｒ，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ ２０００，ＰＥ１）。ＮＥＣ ＨＤドメインおよびＮＴＭの細胞外部分のみからなる組換え「ミニレセプター（ｍｉｎｉ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」は、フリン切断後に安定なヘテロ二量体を形成し、この領域において重大なサブユニット間の接触が存在することを示す。したがって、ＨＤドメイン変異は、ＮＥＣ／ＮＴＭヘテロ二量体を不安定化させることによ
って作用し得る。したがって、同様の効果が、ＮＴＭサブユニットの類似のヘテロ二量体化領域に生じる変異によって与えられる可能性がある。
【００８１】
数種の因子によって、Ｔ−ＡＬＬにおける高頻度のＮＯＴＣＨ−１変異が説明され得る。通常の早期Ｔ細胞発生の数個の段階の間のＮＯＴＣＨ−１シグナルの絶対的要件は、この経路の頻繁な関与の機能的根拠を提供する。さらに、方向付けられたＴ細胞前駆体におけるＶ−Ｄ−Ｊβ再構成の試みの間の異常な組換えによって作製されるｔ（７；９）とは異なり、本明細書で記載されるより一般的な点変異および挿入が、多分化能の造血前駆体（これもまた通常はＮＯＴＣＨ−１を発現する）で生じ得る（Ｃａｌｖｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４２５，８４１−６）。その場合、そのような変異は、娘細胞がＴ細胞の運命を選択するように誘導し（Ａｌｌｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：９９−１０６）、これによって、さらなる白血病誘発性事象（同じＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子に影響を及ぼすさらなる変異を含み得る）、ならびに他の重大な転写因子の誤発現をもたらす染色体事象、遺伝的事象および後成的事象の危険性のある細胞のプールを増加させると予測される。類似のＮＯＴＣＨ変異は、ＮＯＴＣＨレセプターが多くの正常な組織および種々の悪性腫瘍で発現されるので、特定のより一般的な型のヒト癌の分子病原論に関与する可能性がある（Ａｌｌｅｎｓｐａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：４６６−７６）。
【００８２】
本発明者ら知見は、ＮＯＴＣＨ経路をＴ−ＡＬＬにおける分子治療のための合理的な標的と同定する。約７５％の患者が現在、非常に集中的かつ細胞傷害性の化学療法レジメンでこの疾患の治療を受けているが（Ｐｕｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１５３５−４８）、難治性疾患を有する患者に対して新しい治療が必要とされ、毒性が低くより有効な薬物の組み合わせがすべてのＴ−ＡＬＬ患者に有益である。強力で特異的なγ−セクレターゼインヒビターの開発（Ｗｏｌｆｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１：８５９−６６）は、アルツハイマー病の病原論におけるこのプロテアーゼの関与に起因して、ＮＯＴＣＨ−１活性をブロックすることを目的とする癌治療の臨床試験を促進するはずである。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１−１】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−２】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−３】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−４】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−５】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−６】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−７】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図２Ａ】増殖にＮＯＴＣＨシグナルを必要とするＴ−ＡＬＬ細胞株の同定である。（２Ａ）感受性の細胞株の細胞周期分布に対するγ−セクレターゼインヒビター化合物Ｅ（ＧＳＩ、１μＭ）またはビヒクル単独（モック（ｍｏｃｋ））の効果。細胞を４〜８日間処理し、７０％冷エタノール中で固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生細胞を、前方／側方散乱基準（ｆｏｒｗａｒｄ／ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｃｒｉｔｅｒｉａ）によってゲートした。（２Ｂ）ＭＳＣＶ−ＧＦＰ−ＩＣＮ１レトロウイルスによるＧＳＩ誘導性細胞周期停止のレスキュー。（２Ｃ）ドミナントネガティブなＭＳＣＶ−ＧＦＰ−Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１レトロウイルスによる細胞周期停止の誘導。（２Ｂ）および（２Ｃ）において、コントロール培養物を、コントロールの空のＭＳＣＶ−ＧＦＰレトロウイルスまたは示された試験ウイルスで形質導入した。形質導入の２日後、培養物を２つに分け、化合物Ｅ（ＧＳＩ）またはＤＭＳＯビヒクル（モック（ｍｏｃｋ））のいずれかで、７〜１０日間処理した。次いで、培養物を収集し、ＤＮＡ色素ＤＲＡＱ５で染色した。これによって、選別されていないＧＦＰ−およびＧＦＰ＋の部分集団中のＤＮＡ含量のフローサイトメトリーによる測定を可能にする。最小限１５，０００の事象を集めて、各ＤＮＡ含量のヒストグラムを作成した。
【図２Ｂ】増殖にＮＯＴＣＨシグナルを必要とするＴ−ＡＬＬ細胞株の同定である。（２Ａ）感受性の細胞株の細胞周期分布に対するγ−セクレターゼインヒビター化合物Ｅ（ＧＳＩ、１μＭ）またはビヒクル単独（モック（ｍｏｃｋ））の効果。細胞を４〜８日間処理し、７０％冷エタノール中で固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生細胞を、前方／側方散乱基準（ｆｏｒｗａｒｄ／ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｃｒｉｔｅｒｉａ）によってゲートした。（２Ｂ）ＭＳＣＶ−ＧＦＰ−ＩＣＮ１レトロウイルスによるＧＳＩ誘導性細胞周期停止のレスキュー。（２Ｃ）ドミナントネガティブなＭＳＣＶ−ＧＦＰ−Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１レトロウイルスによる細胞周期停止の誘導。（２Ｂ）および（２Ｃ）において、コントロール培養物を、コントロールの空のＭＳＣＶ−ＧＦＰレトロウイルスまたは示された試験ウイルスで形質導入した。形質導入の２日後、培養物を２つに分け、化合物Ｅ（ＧＳＩ）またはＤＭＳＯビヒクル（モック（ｍｏｃｋ））のいずれかで、７〜１０日間処理した。次いで、培養物を収集し、ＤＮＡ色素ＤＲＡＱ５で染色した。これによって、選別されていないＧＦＰ−およびＧＦＰ＋の部分集団中のＤＮＡ含量のフローサイトメトリーによる測定を可能にする。最小限１５，０００の事象を集めて、各ＤＮＡ含量のヒストグラムを作成した。
【図２Ｃ】増殖にＮＯＴＣＨシグナルを必要とするＴ−ＡＬＬ細胞株の同定である。（２Ａ）感受性の細胞株の細胞周期分布に対するγ−セクレターゼインヒビター化合物Ｅ（ＧＳＩ、１μＭ）またはビヒクル単独（モック（ｍｏｃｋ））の効果。細胞を４〜８日間処理し、７０％冷エタノール中で固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生細胞を、前方／側方散乱基準（ｆｏｒｗａｒｄ／ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｃｒｉｔｅｒｉａ）によってゲートした。（２Ｂ）ＭＳＣＶ−ＧＦＰ−ＩＣＮ１レトロウイルスによるＧＳＩ誘導性細胞周期停止のレスキュー。（２Ｃ）ドミナントネガティブなＭＳＣＶ−ＧＦＰ−Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１レトロウイルスによる細胞周期停止の誘導。（２Ｂ）および（２Ｃ）において、コントロール培養物を、コントロールの空のＭＳＣＶ−ＧＦＰレトロウイルスまたは示された試験ウイルスで形質導入した。形質導入の２日後、培養物を２つに分け、化合物Ｅ（ＧＳＩ）またはＤＭＳＯビヒクル（モック（ｍｏｃｋ））のいずれかで、７〜１０日間処理した。次いで、培養物を収集し、ＤＮＡ色素ＤＲＡＱ５で染色した。これによって、選別されていないＧＦＰ−およびＧＦＰ＋の部分集団中のＤＮＡ含量のフローサイトメトリーによる測定を可能にする。最小限１５，０００の事象を集めて、各ＤＮＡ含量のヒストグラムを作成した。
【図３Ａ】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｂ−１】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｂ−２】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｂ−３】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｃ】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｄ−１】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｄ−２】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｄ−３】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｅ】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｆ】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｇ−１】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｇ−２】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図４Ａ】ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異はＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達を相乗的に活性化する。（４Ａ）レポーター遺伝子アッセイ。Ｕ２ＯＳ細胞を、以前に記載された（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）ように、指定されたｐｃＤＮＡ３プラスミド、ＮＯＴＣＨ応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子および内部Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部コントロールプラスミドを用いて２４ウェル形式で一過性に同時トランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３−ＩＣＮ１を用いる実験を除いて、１ウェルあたり２５ｎｇのｐｃＤＮＡ３プラスミドを使用し、ｐｃＤＮＡ３−ＩＣＮ１を用いる実験では、１ウェルあたり５ｎｇのプラスミドを使用した。全細胞溶解物における正規化ルシフェラーゼ活性を三連で決定し、空のベクターコントロールでトランスフェクトした細胞から調製した溶解物における活性と比較して表した。（４Ｂ）ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインの両方に関与する二重変異による相乗的ＮＯＴＣＨ−１活性化についてのモデル。
【図４Ｂ】ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異はＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達を相乗的に活性化する。（４Ａ）レポーター遺伝子アッセイ。Ｕ２ＯＳ細胞を、以前に記載された（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）ように、指定されたｐｃＤＮＡ３プラスミド、ＮＯＴＣＨ応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子および内部Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部コントロールプラスミドを用いて２４ウェル形式で一過性に同時トランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３−ＩＣＮ１を用いる実験を除いて、１ウェルあたり２５ｎｇのｐｃＤＮＡ３プラスミドを使用し、ｐｃＤＮＡ３−ＩＣＮ１を用いる実験では、１ウェルあたり５ｎｇのプラスミドを使用した。全細胞溶解物における正規化ルシフェラーゼ活性を三連で決定し、空のベクターコントロールでトランスフェクトした細胞から調製した溶解物における活性と比較して表した。（４Ｂ）ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインの両方に関与する二重変異による相乗的ＮＯＴＣＨ−１活性化についてのモデル。
【図５−１】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−２】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−３】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−４】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−５】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−６】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−７】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−８】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−９】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−１０】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−１１】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図６−１】ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異の編集。
【図６−２】ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異の編集。
【図６−３】ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異の編集。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の援用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／５９８，５４６号（２００４年８月４日出願）および同第６０／６７２，０５３号（２００５年４月１８日出願）に対する優先権、およびこれらの利益を主張する。これらの先行出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、生物学的刺激に対する反応性の増大または他の刺激の必要性に依存しない構成的活性化のいずれかを生じる変異がなされた、ヒトＮＯＴＣＨレセプターに関する。これらの変異は、ＮＯＴＣＨレセプターの特定の十分に規定された領域に生じ、悪性転換のプロセスの一部として癌細胞によって体細胞的に獲得される。これらの癌細胞の増殖は、レセプターのシグナル伝達を妨害する因子を用いて遅延されるかまたは停止され得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＮＯＴＣＨレセプター１〜４は、調節されたタンパク質分解に依存する経路を通してシグナルを送る膜貫通レセプタータンパク質である。リガンド結合の後、このレセプターは、順に、ｉ）ＡＤＡＭファミリーのメタロプロテアーゼによって細胞外で切断され（非特許文献１；非特許文献２）；ｉｉ）膜貫通ドメインに対してちょうど内部にあるリジン残基でモノユビキチン化し（非特許文献３）；ｉｉｉ）エンドサイトーシスされ（非特許文献３）；そしてｉｖ）γ−セクレターゼ酵素によってタンパク質分解で切断される（非特許文献４）。この活性化プロセスの最終工程は、ＮＯＴＣＨレセプターの細胞内部分が、細胞核にトランスロケーションすることを可能にし、そこでその細胞内部分は、転写因子と相互作用して、遺伝子活性を変化させる。ＮＯＴＣＨレセプターのシグナル伝達は、細胞の分化および増殖、ならびにアポトーシスを制御すること（これらは、腫瘍性転化（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に関連して重要である３つのプロセスである）において重要な役割を果たすようである（特許文献１を参照のこと）。
【０００４】
ＮＯＴＣＨ−１遺伝子は、１％未満のＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）に見出される（７；９）染色体転座にその遺伝子が関与することを通じて発見された（非特許文献５）。ＮＯＴＣＨ−１は、胸腺細胞で高度に発現され（非特許文献５）、その胸腺細胞でＮＯＴＣＨ−１は、Ｔ細胞の運命を選択するようにリンパ系共通前駆細胞（ｃｏｍｍｏｎ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）を誘導する（非特許文献６）。その後、ＮＯＴＣＨ−１は、プレＴ細胞レセプター複合体の構築を促進し、この複合体は、ＣＤ４−／ＣＤ８− 胸腺細胞のＣＤ４＋／ＣＤ８＋ 発達段階への変異を伴う増殖性バースト（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ）を駆動することにおいて重要な役割を果たす（非特許文献７）。
【０００５】
その休止状態（ｒｅｓｔｉｎｇ ｓｔａｔｅ）において、成熟ＮＯＴＣＨ−１は、リガンド結合細胞外サブユニット（ＮＥＣ）および非共有結合で結合された膜貫通サブユニット（ＮＴＭ）から構成されるヘテロ二量体のレセプターである（非特許文献８；非特許文献９）。ＮＥＣは、上皮増殖因子様反復と、３つの反復されたＬｉｎ１２／ＮＯＴＣＨ反復と、保存された１０３アミノ酸の配列とから構成される、リガンド結合ドメインからなり（本明細書で以後、ヘテロ二量体化ドメインとしてＨＤと称する）、このドメインはＮＴＭの細胞外部分と結合するのに十分である。
【０００６】
ＮＯＴＣＨレセプターの生理学的活性化は、Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ−Ｌａｇ２（ＤＳＬ）ファミリーのリガンドがＮＥＣサブユニットに結合し、ＮＴＭサブユニットにおける連続的なタンパク質分解性切断のカスケードを惹起する場合に起こる。γ−セクレターゼ（プレセニリン−１もしくはプレセニリン−２、ニカストリン、ＡＰＨ−１、およびＰＥＮ−２を含む、多タンパク質複合体）によって触媒される最後の切断（非特許文献１０；非特許文献１１）は、膜からＮＴＭの細胞内部分（細胞内ＮＯＴＣＨまたはＩＣＮと呼ばれる）を放出し、この細胞内部分が細胞核にトランスロケーションすることを可能にする。そこで、その細胞内部分は、ＤＮＡ結合因子ＣＳＬおよびＭａｓｔｅｒｍｉｎｄファミリーの活性化補助因子と結合して、一時的な転写活性化複合体を形成する（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。その複合体の分解およびターンオーバー（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）は、ＳＥＬ−１０ファミリーのＦボックス因子によって調節されるようである（非特許文献１５）。
【０００７】
（７；９）転座は、ＩＣＮと類似する、Ｎ末端が欠失した構成的に活性なＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドをコードするＮＯＴＣＨ−Ｔ細胞レセプターβ融合遺伝子を生じ（非特許文献５；非特許文献１６；Ｄａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年５月３日電子出版））、これらのＮＯＴＣＨ−１の短縮型の構成的に活性な形態は、マウスモデルにおいてＴ−ＡＬＬを誘導する（非特許文献１７）。ＮＯＴＣＨ−１はまた、マウスＴ−ＡＬＬの発症をもたらす多段階経路においてＥ２Ａ−ＰＢＸ１トランスジーンおよびｃＭＹＣトランスジーンと共働する（ｃｏｏｐｅｒａｔｅ）、頻繁にレトロウイルスに挿入されるものの部位である（非特許文献１８；非特許文献１９）。さらに、ＮＯＴＣＨインヒビターは、ヒトおよびマウスのＮＯＴＣＨ−１に関連するＴ−ＡＬＬに由来する細胞株において、Ｇ０／Ｇ１細胞周期の阻止を生じ、これはＮＯＴＣＨシグナル伝達がこれらの白血病の持続的な増殖に必要とされることを示す（非特許文献２０）。
【０００８】
（７；９）転座は、Ｔ−ＡＬＬを有する患者のうちの非常に低い割合の患者と関連するのみである。ＮＯＴＣＨ−１に関連するさらなる変異の同定は、この型の癌の病原論にとって重要な意味を有する。ＮＯＴＣＨ−２、ＮＯＴＣＨ−３およびＮＯＴＣＨ−４における変異は、ヒト癌では同定されておらず、他の哺乳動物におけるこれらのＮＯＴＣＨレセプターの機能の異常な上昇がＴ−ＡＬＬ（ＮＯＴＣＨ−２およびＮＯＴＣＨ−３、非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）および乳癌（ＮＯＴＣＨ−４、非特許文献２４）を生じ得ることが知られている。ヒト腫瘍における新規な変異の同定は、癌の存在を同定するのを助けること、およびＮＯＴＣＨシグナル伝達のインヒビターに応答する癌細胞を同定することにおいて診断上有用であるはずであり、それによってＮＯＴＣＨシグナル伝達経路インヒビターによる直接的で合理的な癌処置を可能にする。
【特許文献１】米国特許第６，７０３，２２１号明細書
【非特許文献１】Ｂｒｏｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５：２０７−２１６（２０００）
【非特許文献２】Ｍｕｍｍら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５：１９７−２０６（２０００）
【非特許文献３】Ｇｕｐｔａ−Ｒｏｓｓｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６６：７３−８３（２００４）
【非特許文献４】Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３９８：５１８−５２２（１９９９）
【非特許文献５】Ｅｌｌｉｓｅｎら、Ｃｅｌｌ ６６：６４９−６６１（１９９１）
【非特許文献６】Ｒａｄｔｋｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：５４７−５５８
【非特許文献７】Ｗｏｌｆｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：８６９−８７９（２００２）
【非特許文献８】Ｒａｎｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１８２５−１８３５
【非特許文献９】Ｌｏｇｅａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８１０８−８１１２（１９９８）
【非特許文献１０】Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ３：８５−９７（２００２）
【非特許文献１１】Ｋｉｍｂｅｒｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：６３８２−６３８７（２００３）
【非特許文献１２】Ｗａｌｌｂｅｒｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２２：７８１２−７８１９（２００２）
【非特許文献１３】Ｆｒｙｅｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：１３９７−１４１１（２００２）
【非特許文献１４】Ｎａｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２１２３２−２１２３９（２００３）
【非特許文献１５】Ｏｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３５８４７−３５８５３（２００１）
【非特許文献１６】Ａｓｔｅｒら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５９：１２５−１３６（１９９４）
【非特許文献１７】Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−７５１５（２０００）
【非特許文献１８】Ｈｏｅｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３８３１−３８４２（２０００）
【非特許文献１９】Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ ９６：１９０６−１９１３（２０００）
【非特許文献２０】Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２３：６５５−６６４（２００３）
【非特許文献２１】Ｂｅｌｌａｖｉａら、Ｅｍｂｏ Ｊ．１９：３３３７−３３４８（２０００）
【非特許文献２２】Ｒｏｈｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８０７１−８０８０（１９９６）
【非特許文献２３】Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：６５５−６６４）
【非特許文献２４】ＣａｌｌａｈａｎおよびＲａｆａｔ，Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ６：２３−３６（２００１）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＮＯＴＣＨ−１レセプターの２つの特定の領域における変異が、レセプターのシグナル伝達の増強をもたらし、無制御の細胞増殖と関連するという、発見に基づく。第一の領域は、ヘテロ二量体化ドメイン内の領域であり、種間で高度に保存される多くのアミノ酸の存在によって特徴付けられる。そのアミノ酸（配列番号１の残基１５７１〜１６２２（配列識別番号について図１および図３を参照のこと））は、エキソン２６によってコードされ、ＮＯＴＣＨ−１タンパク質のＮＥＣサブユニット（すなわち、細胞外部分）内に見出される。無傷の（ｉｎｔａｃｔ）ＮＯＴＣＨ−１において、そのアミノ酸は、ＮＴＭサブユニット（すなわち、そのレセプターの膜貫通部分）に位置するエキソン２７（アミノ酸１６７４〜１７３０）によってコードされるアミノ酸に非共有結合される。このＨＤドメインのこれらの「ホットスポット」（すなわち、ＮＥＣサブユニットの１５７１〜１６２２およびＮＴＭサブユニットの１６７４〜１７３０）における変異（特に、非保存的変異）は、ＮＯＴＣＨ−１ヘテロ二量体を不安定化すると考えられる。これは、ＮＥＣの分解、ならびに連続的なメタロプロテアーゼ切断、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｉｏｎ）、エンドサイトーシス、およびγ−セクレターゼによる切断をもたらし、ＮＯＴＣＨ−１の細胞内部分の核トランスロケーションおよび標的遺伝子の活性化を可能にする。
【００１０】
無制御の細胞増殖をもたらす変異に関係する第二の領域は、ＰＥＳＴ領域（アミノ酸２４２３〜アミノ酸２５５６）を含むＮＯＴＣＨ−１のＣ末端部分（アミノ酸２３１１〜２５５６）である。これらの変異は、レセプターが活性化後（すなわち、レセプターがγ−セクレターゼ切断に起因して放出された後）に細胞内で分解される速度を低下させるようである。結果として、ＮＯＴＣＨ−１応答性遺伝子の転写は不適切に長期間継続し、再び、シグナル伝達の増強をもたらし、最終的に、無制御の増殖をもたらす。
【００１１】
ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインにおける変異がしばしば、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）を有する患者から得られる白血球細胞株および生物学的サンプル中に見出されることが発見されている。これらの細胞における無制御の増殖は、γ−セクレターゼインヒビターのようなＮＯＴＣＨシグナル伝達を妨害する因子を用いて阻止され得る。全体的に、行われた実験は、無制御の増殖を維持するための異常なＮＯＴＣＨ活性に依存する癌細胞の群が存在し、ＮＯＴＣＨ−１のＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメイン中の変異がγ−セクレターゼインヒビターもしくはＮＯＴＣＨ活性を低下させる他の因子に応答する可能性のある癌細胞を同定するために診断的に使用され得るという、結論を導いてきた。
【００１２】
その第一の局面において、本発明は、ＨＤドメインのホットスポット内の変異を除いて野生型ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸配列（本明細書で配列番号１として示される）を有する実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターに関する。これらの変異は、γ−セクレターゼによる切断に対する感受性が増大することによって、変異されていないＮＯＴＣＨ−１と比べて増大したレセプターのシグナル伝達がもたらされる。変異が生じる配列番号１の特定のホットスポット領域は、アミノ酸１５７１〜１６２２および／またはアミノ酸１６７４〜１７３０である。
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に精製された（実質的に純粋な）」とは、そのレセプタータンパク質（またはそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド）が天然で見出されるようなＮＯＴＣＨ−１に関連する生物学的成分から分離されていることを意味する。代表的に、実質的に純粋なタンパク質（またはポリヌクレオチド）は、サンプルの少なくとも８５％を占め、より高い割合が好ましい。多くの手段が、タンパク質サンプルまたは核酸サンプルの純度を評価するために利用可能であり、電気泳動、クマトグラフィーおよび分析用遠心分離による分析が挙げられる。用語「変異されていないＮＯＴＣＨ−１」とは、配列番号１の配列を有するＮＯＴＣＨ−１レセプター、およびこの配列を有するレセプターをコードするポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、これらの配列中の対立遺伝子改変体を包含し、この改変体は、通常は細胞中に見出されるが、異常なＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達にも、異常な無制御の細胞増殖にも関連しない。
【００１４】
変異がγ−セクレターゼのシグナル伝達の増強をもたらすかどうかを決定するために、本明細書の実施例の節で記載されるアッセイが使用され得る。最も好ましい方法は、ＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達に応答して刺激される調節エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド）でトランスフェクトされた細胞の使用に関する。細胞がγ−セクレターゼに曝される際のレポーター遺伝子の活性化は容易に測定され得、ＮＯＴＣＨ活性を反映し得る（例えば、Ｈｓｉｅｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９５２−９５９（１９９６）を参照のこと）。
【００１５】
種々の種からのＨＤアミノ酸配列の比較により、ホットスポットで高度に保存されるある一定の特定のアミノ酸位置の同定がなされている。これらの位置での変異（特に、非保存的変異）は、特に、ＮＯＴＣＨ−１のＮＥＣサブユニットとＮＴＭサブユニットとの間の相互作用を不安定化する可能性がある。用語「非保存的変異」とは、野生型アミノ酸が、異なる化学的特徴を有するアミノ酸で置換される変異を指す。非保存的置換の例としては、よく構成されたタンパク質ドメイン（すなわち、ＨＤドメイン）内の他のアミノ酸に代わってプロリンにする置換、非塩基性アミノ酸に代わって塩基性アミノ酸にする置換、非酸性アミノ酸に代わって酸性アミノ酸にする置換、非極性アミノ酸に代わって極性アミノ酸にする置換などが挙げられる。保存的変異と非保存的変異との区別は、当業者に十分に認識されている。変異がＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達の増強に関連するＨＤドメイン中の保存されたアミノ酸は、以下の位置：１５７１；１５７３；１５７５；１５７６；１５７８；１５７９；１５８３；１５８６；１５８８；１５９０；１５９３；１５９４；１５９５；１５９８；１６００−１６０７；１６１０−１６１８；１６７４；１６７５；１６７７；１６７９−１６８４；１６８６；１６９５；１６９６；１７０３；１７０６；１７１５；１７２０；１７２５；および１７２８に見出される。これらのすべての位置は、配列番号１に関して同定される。
【００１６】
本発明は、癌細胞の無制御の増殖に関連する特定の変異を包含する。ＨＤドメインに関して、この変異は、アミノ酸１５７１〜１６１８が配列番号１２〜配列番号２２、配列番号１０２〜配列番号１１８または配列番号１４５からなる群より選択される配列で置換される場合に生じる。癌細胞の増殖に関連する他の変異としては、配列番号２３〜配列番号２９または配列番号１１９〜配列番号１２７からなる群より選択される配列による、アミノ酸１５７１〜１６２２の置換が挙げられる。同様に、アミノ酸１６７４からアミノ酸１７３０までの配列は、配列番号７０〜配列番号７５または配列番号１２８〜配列番号１３７からなる群より選択される配列で置換され得る。
【００１７】
本発明者らはまた、ＮＯＴＣＨ−１のＣ末端部分（すなわち、アミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６）において生じる配列番号１における変異が、細胞をγ−セクレターゼに曝すことに応答してＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達の増強をもたらすことを見出した。これらのすべての変異は、未熟終止コドンまたは翻訳読み取り枠シフトの出現を引き起こし、したがって、ＰＥＳＴ領域（アミノ酸２４２３〜２５５６）に対応する配列のうちのいくつかもしくはすべての欠失をもたらす。これらの変異は、レセプターが分解される速度の低下をもたらすと考えられる。具体的な変異としては、配列番号３０〜配列番号５９または配列番号１３９〜配列番号１４４からなる群より選択される配列による、配列番号１におけるアミノ酸２３１１〜２５５６に対応する部分の置換が挙げられる。
【００１８】
ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメイン中の変異は、互いに独立して生じ得るか、または単一のＮＯＴＣＨ−１レセプターに存在し得る。例えば、実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得るかまたはこのアミノ酸配列からなり得るが、ここで、
ａ）そのレセプターは、以下の変異：
ｉ）上記配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１５７１〜アミノ酸１６１８の部分が、配列番号１２〜配列番号２２、配列番号１０２〜配列番号１１８、または配列番号１４５からなる群より選択される配列で置換されている；
ｉｉ）上記配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１５７１〜アミノ酸１６２２の部分が、配列番号２３〜配列番号２９、配列番号１１９〜配列番号１２７からなる群より選択される配列で置換されている；
ｉｉｉ）上記配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１６７４〜アミノ酸１７３０の部分が、配列番号７０〜配列番号７５または配列番号１２８〜配列番号１３７からなる群より選択される配列で置換されている；
のうちの少なくとも１つを有し；
ｂ）そしてさらに、そのレセプターは、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６の部分が配列番号３０〜配列番号５９または配列番号１３８〜配列番号１４４からなる群より選択される配列で置換されるように、さらに変異されている。
【００１９】
あるいは、実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得るかまたはこのアミノ酸配列からなり得るが、ここで、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列が、１５７１；１５７３；１５７５；１５７６；１５７８；１５７９；１５８３；１５８６；１５８８；１５９０；１５９３；１５９４；１５９５；１５９８；１６００〜１６０７；１６１０〜１６１８；１６７４；１６７５；１６７７；１６７９−１６８４；１６８６；１６９５；１６９６；１７０３；１７０６；１７１５；１７２０；１７２５；および１７２８からなる群より選択される１以上のアミノ酸位置で変異されており；そして
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列が、このアミノ酸配列のアミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６の部分が配列番号３０〜配列番号５９からなる群より選択される配列で置換されるように、さらに変異されている。
変異がＨＤおよびＰＥＳＴ領域の両方に存在する場合、これは、γ−セクレターゼに応答したシグナル伝達が特に増強されるレセプターをもたらす。
【００２０】
別の局面において、本発明は、上記の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターのいずれかをコードするポリヌクレオチドを包含する。その変異レセプターをコードする核酸配列は、ベクターに取り込まれ得、そのベクターにおいてその核酸配列はプロモーターに作動可能に連結される。用語「作動可能に連結」とは、一定の様式で結合される遺伝要素を指し、この様式は、その遺伝要素がその正常な機能を果たすのを可能にする様式である。例えば、遺伝子は、その転写があるプロモーターの制御下にあり、最終的に、その遺伝子によって正常にコードされたタンパク質が生成される場合、そのプロモーターに作動可能に連結されている。本発明は、変異レセプターをコードするベクター、およびそのベクターで形質転換された宿主細胞を包含する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、上記の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターのいずれかについて生物学的サンプルをアッセイすることによって、癌細胞の存在についてそのサンプルを診断的に試験する方法に関する。用語「生物学的サンプル」は、本明細書中で使用される場合、診断を行う際に医学の分野で一般に使用される様々な型のサンプルのすべてを包含する。したがって、この用語は、組織または流体、血液、血漿、血清、リンパ、尿などの生検サンプルを包含する。考察される癌の型に依存して、特定の型のサンプルが主に使用されるものになる。例えば、白血病について、血液、血漿または血清のサンプルが好まれる傾向にある。試験のために適切なサンプルの選択は、臨床医学において日常的である。
【００２２】
また、ＮＯＴＣＨ−１について記載される変異を含む領域と高レベルの同一性を有する領域を含むＮＯＴＣＨ−２レセプター、ＮＯＴＣＨ−３レセプターおよびＮＯＴＣＨ−４レセプターに適用される同じ方法が包含される。ＮＯＴＣＨ−１レセプター、ＮＯＴＣＨ−２レセプター、ＮＯＴＣＨ−３レセプターおよびＮＯＴＣＨ−４レセプターは、極めて高度に関連しており、種々の細胞型において非常に類似の機能もしくは同一の機能を果たす可能性があり、これらは、このレセプターファミリーの異なるメンバーが発現され、様々な組織および細胞型で優先的に用いられるという点で主に異なる。したがって、異なる組織で生じる癌は、ＮＯＴＣＨ−１レセプター、ＮＯＴＣＨ−２レセプター、ＮＯＴＣＨ−３レセプターまたはＮＯＴＣＨ−４レセプターのいずれかに影響を及ぼす非常に類似の型の変異を獲得し得、これらの癌が生じる組織によってどのレセプターサブタイプが発現されるかに依存して、腫瘍細胞増殖を促進するという点で同一の結果を伴う。したがって、本出願において、他に示されない限り、用語「ＮＯＴＣＨ」レセプターは、ＮＯＴＣＨ−１レセプター、ＮＯＴＣＨ−２レセプター、ＮＯＴＣＨ−３レセプターおよびＮＯＴＣＨ−４レセプターの各々に対して集合的に適用される診断的適用を指すように使用される。
【００２３】
変異レセプターの存在は、タンパク質に対するアッセイまたはタンパク質をコードする遺伝子に対するアッセイのいずれかによって検出され得る。遺伝子に対するアッセイに関して、好ましい試験方法は、変異ＮＯＴＣＨレセプターをコードする全長ポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドの一部のいずれかを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅することである。増幅反応のために使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーは、実施例の節で記載されるが、当業者は、本明細書とともに含まれる配列情報および当該分野で公知の配列情報に基づいて他の適切なプライマーを容易に同定し得る。
【００２４】
あるいは、遺伝子変異は、野生型核酸とではなく変異核酸とハイブリッドを形成することを可能にする条件下で、プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって検出され得る。そのアッセイおよびそのアッセイで使用されるオリゴヌクレオチドの両方が、本発明によって包含される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５塩基の長さであるべきであり、ハイブリダイゼーションアッセイは、ストリンジェントな条件下で行われるべきである。本明細書で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」とは、約６０℃〜７０℃で、低い塩濃度（例えば、０．０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣｌに相当する濃度）で行われるハイブリダイゼーションを指す。
【００２５】
変異タンパク質自体を検出するように設計されたアッセイは、変異されていないＮＯＴＣＨレセプターに対する親和性よりも少なくとも１００倍大きい親和性で変異ＮＯＴＣＨレセプターに結合する抗体を用いて行われ得る。これらの抗体は、事実上モノクローナルまたはポリクローナルのいずれでもよく、変異を含むＮＯＴＣＨレセプターの領域に由来するペプチドで抗体産生動物を注射することによって作製され得る。この様式で作製され、変異レセプターに優先的に結合する抗体もまた、本発明の一部である。
【００２６】
本発明はまた、細胞を、ＮＯＴＣＨレセプターのシグナル伝達を妨害する有効量の因子（例えば、γ−セクレターゼインヒビター）に曝すことによって、上記の変異レセプターを用いて細胞の増殖を遅延または停止させるための方法に関する。適切なインヒビターの例としては、ＩＩＩ−３１−Ｃ、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル）（ＤＡＰＴ）、化合物Ｅ、Ｄ−らせん状ペプチド２９４、イソクマリン、ＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−エポキシド、および（Ｚ−ＬＬ）２−ケトンが挙げられる（Ｋｏｒｎｉｌｏｖａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１６４７９−１６４７３（２００３）を参照のこと）。用語「有効量」は、ＮＯＴＣＨ−１活性を有意に低下させるのに十分なインヒビターまたは他の因子の濃度（例えば、活性を少なくとも２０％低下させるのに十分な量）を示す。Ｎｏｔｃｈレセプター活性を阻害する有効量の因子の存在はまた、臨床的に反映されるはずである。例えば、癌細胞の増殖速度が処置前に生じる増殖の速度と比べて顕著な程度（例えば、少なくとも２０％）遅くされるはずである。
【００２７】
γ−セクレターゼインヒビターは、治療剤として有効であることが見出されているが、ＮＯＴＣＨ活性を阻害する他の因子もまた使用され得る。本明細書に記載される変異は、数種の効果を生じるはずであり、ｉ）メタロプロテアーゼ切断の増強；ｉｉ）モノユビキチン化（Ｅ３リガーゼによって行われる酵素段階）の増大；ｉｉｉ）エンドサイトーシスの増大；ｉｖ）γ−セクレターゼ切断の増強（すでに議論されるとおり）；ｖ）核トランスロケーションの増大；およびｖｉ）核ＮＯＴＣＨ転写活性化複合体の形成の増大が挙げられる。これらの工程のいずれかで作用する薬物は、癌細胞の増殖を停止させるはずである。ある因子（核複合体（ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１と呼ばれるタンパク質のドミナントネガティブ形態）のインヒビター）が、以前に記載されており、４つすべてのＮＯＴＣＨレセプターサブタイプを阻害する（Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２３：６５５−６６４（２００３））。
【００２８】
また、変異されたＮＯＴＣＨレセプターの存在によって誘導される異常な細胞増殖を試験化合物が阻害する能力について、その試験化合物をアッセイする方法が、本発明によっ
て包含される。この方法は、試験化合物を、上記の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターのうちのいずれかを発現する細胞とともにインキュベートする工程を包含する。そのような細胞は、生物学的サンプルから単離されるか、またはその変異レセプターをコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクトすることによって作製されるかのいずれであってもよい。インキュベーションは、γ−セクレターゼの存在下で行われ、そして生じるＮＯＴＣＨレセプター活性の量が決定される。レセプター活性を測定するための任意の方法が使用され得るが、Ｈｓｉｅｈら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９５２−９５９（１９９６））に記載されるルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイが好ましい。次いで、得られた結果が、本質的に同じ条件であるが試験化合物の非存在下で行われたアッセイからの結果と比較される。試験化合物によって生じる活性の低下は、それがＮＯＴＣＨレセプターインヒビターであり、そのレセプターを発現する細胞の増殖を制限するのに有用であり得ることを示唆する。これは、増加する濃度の試験化合物の存在下と非存在下とでそのような細胞の増殖を比較することによって直接確認され得る。
【００２９】
試験化合物がＮＯＴＣＨレセプター活性を阻害する能力を評価するように設計されたアッセイにおいて価値があることに加えて、変異ＮＯＴＣＨレセプターをコードするポリヌクレオチドは、上で議論されるハイブリダイゼーションアッセイで使用され得るプローブの供給源として、および診断アッセイにおけるコントロールとして、役割を果たし得る。変異レセプタータンパク質は、ＮＯＴＣＨの変異形態に特異的な抗体を生成するために使用され得、そしてサンプル中に存在するＮＯＴＣＨレセプターの量を定量するかまたはレセプターの正常形態と変異形態とを区別するかのいずれかのために設計された免疫アッセイにおいて、コントロールとしての役割を果たし得る。変異タンパク質およびその変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドの両方が、分化およびアポトーシスのような生物学的プロセスを研究する研究者にとって興味深いものでもあるはずである。
【００３０】
上で議論されるように、本発明は、変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードする単離された核酸分子を包含する。そのような核酸分子は、
以下：
ａ）本明細書に記載される変異アミノ酸配列のいずれかを含む変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、変異アミノ酸をコードするコドンを除いてそのヌクレオチド配列が配列番号７６のヌクレオチド配列である、ヌクレオチド配列；
ｂ）本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかを有する変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列をコードする変異ＮＯＴＣＨ−１と縮重するヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００３１】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるような１以上の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターのいずれかの存在について生物学的サンプルをアッセイすることによって、そのサンプルの発癌の潜在能力を決定する方法を包含する。変異レセプターの存在は、そのような変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターが存在しないサンプルと比べて増大された発癌の潜在能力を示す。
【００３２】
さらに、本発明は、変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターの異常な発現によって特徴付けられる状態を緩和するように設計された治療レジメンの進行を追跡するための方法を包含し、この方法は、
ａ）被験体に由来するサンプルをアッセイして、第一の時点での変異ＮＯＴＣＨ−１レセプター（または変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードする核酸）のレベルを決定する工程；
ｂ）第二の時点で同じレセプター（または核酸）のレベルをアッセイする工程；および
ｃ）第二の時点でのレベルを第一の時点で決定されたレベルと比較する工程
を包含する。変異タンパク質または変異核酸のレベルが低下することは、治療が効いていることの指標である。レベルが上昇することは、治療が効いていないことの指標である。
【００３３】
本発明はまた、ＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達の機能不全によって特徴付けられる病理学的障害の後退、進行または発症を決定するための方法を包含する。この方法は、その障害を有するかもしくはその障害を有すると疑われる患者から得られたサンプルを、本明細書に記載されるような１以上の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするヌクレオチド配列と実質的に相同であるヌクレオチド配列を有する相補的核酸ハイブリダイゼーションプローブとともにインキュベートする工程を包含する。プローブは、一般的に、配列番号１に示されるような正常形態と相互作用せず、レセプターの変異形態をコードする核酸と相互作用するように設計されるべきである。プローブとサンプル中に存在し得る任意の相補ｍＲＮＡ（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｍＲＮＡ）との間の結合は、上記患者における病理学的障害の後退、進行または発症を示すように使用される。あるいは、アッセイは、レセプターの変異形態に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を用いて行われ得る。変異レセプターレベルまたは変異レセプターをコードする核酸のレベルが上昇するにつれて、その障害が存在するかまたは進行している可能性もまた高まる。変異レセプターまたは核酸のレベルが低下することまたは無いことは、障害の後退または不在の指標である。
・本出願はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターであって、当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、
配列番号１のアミノ酸配列を含み、
ただし、当該アミノ酸配列は、アミノ酸１５７１〜１６２２および／または１６７４〜１７３０および／またはアミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６に１以上の変異を有し、その結果、当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターは、γ−セクレターゼとのインキュベーションに応じて、変異していないＮＯＴＣＨ−１と比べて増強したシグナル伝達を示す、
実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプター。
・（項目２）
上記１以上の変異を除いて、上記変異レセプターが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、項目１に記載の実質的に精製された変異レセプター。
・（項目３）
項目１に記載の実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターであって、ここで、上記１以上の変異が、以下：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１５７１〜アミノ酸１６１８の部分が、配列番号１２〜配列番号２２、配列番号１０２〜配列番号１１８、および配列番号１４５からなる群より選択される配列で置換されている；
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１５７１〜アミノ酸１６２２の部分が、配列番号２３〜配列番号２９、または配列番号１１９〜配列番号１２７からなる群より選択される配列で置換されている；
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１６７４〜アミノ酸１７３０の部分が、配列番号７０〜配列番号７５または配列番号１２８〜配列番号１３７からなる群より選択される配列で置換されている；
ｄ）配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸２３１１〜アミノ酸２５５６の部分が、配列番号３０〜配列番号５９または配列番号１３８〜配列番号１４４からなる群より選択される配列で置換されている；
のうちの１以上を含む、実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプター。
・（項目４）
上記１以上の変異を除いて、上記変異レセプターが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、項目２に記載の実質的に精製された変異レセプター。
・（項目５）
上記配列が、１５７１；１５７３；１５７５；１５７６；１５７８；１５７９；１５８３；１５８６；１５８８；１５９０；１５９３；１５９４；１５９５；１５９８；１６００〜１６０７；１６１０〜１６１８；１６７４；１６７５；１６７７；１６７９〜１６８４；１６８６；１６９５；１６９６；１７０３；１７０６；１７１５；１７２０；１７２５；および１７２８からなる群より選択される１以上のアミノ酸位置で変異されている、項目１に記載の実質的に精製された変異ＮＯＴＣＨ−１レセプター。
・（項目６）
上記１以上の変異されたアミノ酸を除いて、上記レセプターが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、項目５に記載の実質的に精製されたレセプター。
・（項目７）
項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするヌクレオチド配列を含む、実質的に精製されたポリヌクレオチド。
・（項目８）
上記ポリヌクレオチドが、項目１に記載の変異レセプターをコードするヌクレオチド配列からなる、項目７に記載の実質的に精製されたポリヌクレオチド。
・（項目９）
実質的に精製されたポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドは、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で項目８に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズするが、変異されていないＮＯＴＣＨ−１をコードするポ
リヌクレオチドに同じ条件下でハイブリダイズしない、実質的に精製されたポリヌクレオチド。
・（項目１０）
項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、ベクター。
・（項目１１）
項目１０に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
・（項目１２）
項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターに、配列番号１の変異されていないＮＯＴＣＨ−１レセプターに対する親和性よりも少なくとも１００倍大きい親和性で結合する、抗体。
・（項目１３）
癌細胞の存在について生物学的サンプルを診断的に試験する方法であって、
項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターについて当該生物学的サンプルをアッセイする工程
を包含する、方法。
・（項目１４）
癌細胞の存在について生物学的サンプルを診断的に試験する方法であって、項目７に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞について当該生物学的サンプルをアッセイする工程を包含する、方法。
・（項目１５）
癌細胞の存在について生物学的サンプルを診断的に試験する方法であって、
項目８に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞について当該生物学的サンプルをアッセイする工程
を包含する、方法。
・（項目１６）
上記方法が、上記変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードする全長ポリヌクレオチド、または当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするポリヌクレオチドの一部のいずれかをＰＣＲ増幅することによって行われる、項目１５に記載の方法。
・（項目１７）
項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを有すると同定された細胞の増殖を遅延させるかまたは停止させる方法であって、
当該細胞を有効量のγ−セクレターゼインヒビターと接触させる工程
を包含する、方法。
・（項目１８）
癌について患者を処置する方法であって、
ａ）当該患者由来の生物学的サンプルを、項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを有する癌細胞の存在についてアッセイする工程；
ｂ）当該生物学的サンプルが当該変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを有すると見出された場合、当該患者をＮＯＴＣＨ−１レセプターのシグナル伝達を阻害する因子の有効量で処置する工程
を包含する、方法。
・（項目１９）
上記癌がＴ細胞急性リンパ芽球性白血病である、項目１８に記載の方法。
・（項目２０）
上記因子がγ−セクレターゼインヒビターである、項目１８に記載の方法。
・（項目２１）
試験化合物を、変異したＮＯＴＣＨ−１レセプターの存在によって誘導される異常な細胞増殖をその試験化合物が阻害する能力についてアッセイする方法であって、
ａ）当該試験化合物を、項目１に記載の変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを発現する細胞とインキュベートする工程であって、当該インキュベーションがγ−セクレターゼの存在下で行われる、工程；
ｂ）工程ａ）のインキュベーションの結果として生じるレセプター活性の量を、当該試験化合物の非存在下で行われた同様のインキュベーションで生じる活性の量と比較する工程
；および
ｃ）当該試験化合物の存在下で観察された活性の量が当該試験化合物の非存在下で観察された活性の量よりも小さい場合、当該試験化合物が変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを発現する細胞の増殖を阻害するはずであると結論付ける工程
を包含する、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、レセプターのシグナル伝達の増強をもたらすヒトＮＯＴＣＨ−１レセプターにおける変異の同定に関する。これらの変異は、γ−セクレターゼインヒビターのようなＮＯＴＣＨ−１活性化を妨害する因子による処置にポジティブに応答する癌細胞に関連し、ＮＯＴＣＨ−１タンパク質の２つの特定の領域（ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメイン）内に位置する。ＮＯＴＣＨ−２レセプターサブタイプ、ＮＯＴＣＨ−３レセプターサブタイプおよびＮＯＴＣＨ−４レセプターサブタイプの対応する領域における類似の変異もまた、シグナル伝達の増強および異常な増殖をもたらすはずであることが予期される。
【００３５】
ＮＯＴＣＨ−１変異の存在を検出するように設計されるアッセイ（例えば、ＰＣＲ増幅に基づくアッセイ）は、異常なＮＯＴＣＨ−１レセプターのシグナル伝達が生じており、結果として無制御の増殖を示す可能性が高い細胞を含む組織サンプルを同定するために、診断的に使用され得る。この特定の異常性によって特徴付けられる癌は、γ−セクレターゼインヒビターのようなＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達を軽減する因子による処置を受け入れやすいはずである。本明細書に記載されるかまたは当該分野で（例えば、アルツハイマー病の処置における潜在的な用途に関連して）記載されているインヒビターのいずれもが、処置レジメンで使用され得る。診断アッセイおよび治療方法は、Ｔ−ＡＬＬに加えて他の型の癌に適用され得る。そのような癌としては、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、腎臓癌および胃腸（ＧＩ）管癌、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、多形性膠芽腫および脳の他のグリア癌、ならびに中皮腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
（Ｉ．変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするポリヌクレオチドの生成）
ヒトＮＯＴＣＨ−１の全長アミノ酸配列が図１に示され、配列識別番号の配列番号１を付与されている。これは、レセプターの正常な変異していない形態である。癌患者または癌細胞株に由来するサンプルに伴っていたＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインにおける変異は、図３に示される。ＨＤドメインのホットスポット中の特定の位置が異なる種間で高度に保存され（図３Ａを参照のこと）、γ−セクレターゼにより引き起こされる活性の増大をもたらす変異に対して特に感受性であることが留意されるべきである。
【００３７】
多くの方法が、本明細書で示される変異された配列を有するＮＯＴＣＨ−１レセプターをコードするポリヌクレオチドを生成するために利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、変異ＮＯＴＣＨ遺伝子を発現する細胞から単離されたｍＲＮＡを逆転写することによって調製されるｃＤＮＡライブラリーは、図１に示される配列に基づいて合成されたプローブを用いてスクリーニングされ得る。あるいは、所望の配列は、逆転写されたＲＮＡを増幅するＰＣＲによって得られ得る。ＰＣＲ用のプライマーは本明細書で示される配列を用いて構築され得、増幅に適していることが見出されている特定のオリゴヌクレオチドが実施例の節に記載される。正確な配列が増幅されたことの確認および特定の変異の存在の同定は、増幅産物を配列決定することによって得られ得る。
【００３８】
あるいは、核酸は、当該分野で周知の標準的な化学的合成方法を用いて生成され得る。一旦得られると、そのポリヌクレオチドは、レポータータンパク質を作製するための組換え方法で使用され得るか、潜在的な治療因子をスクリーニングする目的で細胞で発現され得るか、または診断アッセイでコントロールとして使用され得る。
【００３９】
（ＩＩ．変異レセプタータンパク質の生成）
ＮＯＴＣＨ−１レセプタータンパク質は、化学的方法用いて合成され得るか、または上記のポリヌクレオチドを用いて生成され得る。後者の場合、変異レセプターをコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主によって認識可能な転写シグナルおよび翻訳シグナルを含むベクター中に配置され得る。二本鎖形態のクローン化レセプター配列が、作動可能に結合されて発現ベクターに挿入される。レセプターをクローニングし発現させるために適切なベクターおよび技術は、分子生物学の分野で周知である。
【００４０】
発現ベクターは、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはウイルス移入のような方法によって、宿主細胞（好ましくは、哺乳類宿主細胞）に導入され得る。組換え変異レセプターを発現する細胞は、標準的な十分に確立された方法を用いて選択され得る。細胞中の変異レセプター核酸の存在を確認するための１つの単純な方法は、レセプターをコードするヌクレオチド配列に隣接することが公知のプライマーを用いるＰＣＲ増幅を行うことである。レセプターの存在はまた、ＮＯＴＣＨ−１の機能アッセイ（例えば、実施例の節および当該分野で記載されるルシフェラーゼアッセイ（Ｈｓｉｅｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９５２−９５９（１９９６）を参照のこと））を用いて確認され得る。一旦組換え変異ＮＯＴＣＨ−１レセプターを生成する細胞が同定されると、その細胞は、例えば、γ−セクレターゼとのインキュベーションによってシグナル伝達を軽減し得る因子を同定するように設計されるアッセイ、またはＮＯＴＣＨ−１インヒビターが無制御の細胞増殖を阻止する能力を測定するアッセイで、使用され得る。ＮＯＴＣＨ−１レセプターそれ自体は、診断アッセイで、またはそのようなアッセイで使用され得る変異レセプターに特異的な抗体を生成するために、使用され得る。
【００４１】
（ＩＩＩ．変異ＮＯＴＣＨレセプターに対する抗体）
本発明は、ＮＯＴＣＨレセプターの変異形態に特異的に結合する抗体、およびそのような抗体を生成するためのプロセスを包含する。「変異ＮＯＴＣＨレセプターに特異的に結合」する抗体は、そのレセプターの変異されていない形態に対する親和性よりもその変異形態に対して少なくとも１００倍高い親和性を有する抗体と定義される。そのような抗体を生成するためのプロセスは、全長変異レセプタータンパク質（または、好ましくは、変異が生じる領域を含む短いペプチド）を適切な動物に注射することを包含し得る。そのペプチドは、少なくとも５アミノ酸の長さであるべきであり、個々にかまたは組み合わせてかのいずれで注入されてもよい。
【００４２】
抗体を作製および選択するための方法は、標準的な参考資料（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（１９８２）； ；Ｋｅｎｎｅｔｔら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（１９８０）； およびＣａｍｐｂｅｌｌ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８４））によって証明されるように、当業者に周知である。
【００４３】
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、無傷の分子、および抗原に結合する能力を保持するフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を包含することが意味される。用語「抗体」はまた、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を指すと定義される。ポリクローナル抗体は、適切な抗原で免疫された動物の血清に由来する。モノクローナル抗体は、参考文献（例えばＨａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．５６３−６８１（１９８１））によって教示されるようなハイブリドーマ技術を用いて調製され得る。一般に、この技術は、免疫応答性動物（代表的には、マウス）を無傷のタンパク質またはそれに由来するフラグメントのいずれかを用いて免疫することを含む。次いで、その免疫された動物から脾細胞が抽出され、適切な骨髄腫細胞（例えば、ＳＰ２Ｏ細胞）と融合される。その後、得られたハイブリドーマ細胞が、ＨＡＴ培地に選択的に維持され、次いで、限界希釈によってクローニングされる（Ｗａｎｄｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１））。次いで、そのような選択を通して得られた細胞は、ＮＯＴＣＨ−１の変異形態または他のＮＯＴＣＨレセプターの変異形態に優先的に結合する抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされ得る。
【００４４】
本発明の抗体または抗体のフラグメントは、種々の免疫アッセイを用いて変異ＮＯＴＣＨレセプタータンパク質の存在を検出するために使用され得る。例えば、抗体は、ラジオイムノアッセイまたは免疫測定（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイ（「ツーサイト（ｔｗｏ ｓｉｔｅ）」アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイとしても公知）で使用され得る（Ｃｈａｒｄ，“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９７８）を参照のこと）。典型的な免疫測定アッセイにおいて、一定の量の非標識抗体が、試験される流体（例えば、血液、リンパ、細胞抽出物など）に不溶性の固体支持体に結合される。固定された抗体に対する抗原の最初の結合の後、一定量の検出可能に標識された第二の抗体（これは第一の抗体と同じであっても同じでなくてもよい）が添加されて、結合した抗原の検出および／または定量を可能にする（例えば、Ｋｉｒｋｈａｍら、Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｐｐ．１９９−２０６（１９７０）を参照のこと）。これらのアッセイの型の多くのバリエーションが当該分野で公知であり、変異ＮＯＴＣＨレセプターの検出のために使用され得る。
【００４５】
変異ＮＯＴＣＨレセプターに対する抗体もまた、無傷のレセプターまたはこれらのレセプターのフラグメントのいずれかの精製において使用され得る（一般に、Ｄｅａｎら、Ａ
ｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）を参照のこと）。代表的に、抗体は、クロマトグラフィーのマトリックス（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）上に固定される。次い
で、マトリックスはカラムに充填され、変異レセプターを含む調製物が、結合を促進する条件下（例えば、塩が少ない条件下）でカラムに通される。次いで、カラムは洗浄され、結合したレセプターが、抗体からの解離を促進する緩衝液（例えば、ｐＨまたは塩濃度が変化された緩衝液）を用いて溶出される。溶出したレセプタータンパク質は、例えば、透析によって選択した緩衝液に移され得、そして保管され得るかまたは直接使用され得る。好ましいレセプターは、上記のイムノアッセイで、またはアッセイで使用するための抗体の生成のために、使用され得る。
【００４６】
（ＩＶ．アッセイ方法）
生物学的サンプルが、本明細書で記載される変異が無制御の増殖をもたらす癌細胞を含むかどうかを決定するための診断アッセイは、タンパク質を分析するための上記のイムノアッセイを用いて、または、好ましくは、レセプターの変異形態をコードする核酸配列の存在についてサンプルをアッセイすることによって、のいずれかで行われ得る。核酸分析のために好ましい方法は、当該分野で周知の方法を用いて細胞から抽出されたポリ核酸をＰＣＲ増幅することによる。増幅は、以下の実施例の節に記載されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、または配列番号１として示されるＮＯＴＣＨ−１の配列に基づく他のオリゴヌクレオチドを用いて行われ得る。次いで、増幅されたＮＯＴＣＨレセプター生成物は配列決定され得て、その生成物がシグナル伝達の増強をもたらす変異を有するかどうかが決定され得る。
【００４７】
あるいは、ハイブリダイゼーションは、変異配列にのみ結合するプローブを用いて、ストリンジェントな条件で行われ得る。このプローブは、長さが最低限１５ヌクレオチドであるべきであり、ＮＯＴＣＨ−１の変異された領域をコードするポリヌクレオチド配列部分を含まなければならない。ストリンジェントな条件は、代表的に、６０℃〜７０℃の温度で、低い塩濃度（０．０２Ｍ〜０．１５Ｍ ＮａＣｌ）でのハイブリダイゼーションを含む。プローブを同定し標識するため、およびハイブリダイゼーションを行い結果を分析するための手順は、分子生物学の分野で周知である。
【００４８】
組換え変異ＮＯＴＣＨレセプターをコードするベクターで形質転換された宿主細胞もまた、レセプターによる不適切なシグナル伝達を減少する試験化合物を同定するように設計されるアッセイで使用され得る。このアッセイは、代表的に、γ−セクレターゼおよび試験化合物の存在下で細胞をインキュベートすることを含む。次いで、ＮＯＴＣＨレセプターのシグナル伝達が、アッセイ（例えば、本明細書に記載されるようなアッセイ）を用いて、または当該分野で公知の他のアッセイ（また、Ｈｓｉｅｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９５２−９５９（１９９６）を参照のこと）を用いて定量され得る。簡便な代替法として、無制御の増殖をもたらすＮＯＴＣＨ−１の変異形態を発現することが公知の細胞が、γ−セクレターゼおよび試験化合物の存在下および非存在下で培養されて、その化合物が増殖を防止し得る程度が決定され得る。
【００４９】
（Ｖ．処置方法）
γ−セクレターゼインヒビターは、アルツハイマー病に対する処置としてのその潜在的な用途に関心のある製薬会社によって開発されている。これらの同様のインヒビターが、無制御の増殖が本明細書に記載されるＮＯＴＣＨレセプター変異に関連する場合において、癌細胞を処置するために使用され得る。
【００５０】
治療レジメンは、患者から除去された癌細胞を含む生物学的サンプルを第一に試験してＮＯＴＣＨレセプターの変異形態が存在するかどうかを決定することを含む。次いで、そのサンプルが変異の存在を証明する患者は、γ−セクレターゼインヒビターを用いてか、またはＮＯＴＣＨレセプター活性を妨害する別の因子を用いて処置される。投与される投薬量は、処置される特定の状態、投与経路および臨床的考慮事項に依存し、これらは当該分野で周知である。投薬量は、有益な効果（例えば、腫瘍増殖の遅延）が検出されるまで、徐々に増加され得る。因子は、単一または複数のいずれかの投薬レジメンで提供され得、単独でまたは他の治療因子と組み合わせて与えられ得る。
【００５１】
変異ＮＯＴＣＨレセプターに関連する癌の処置は、任意の投与経路および投薬形態に適合し得る。処置される特定の状態に依存して、特定の投薬形態が他の形態よりもより簡便であるかまたは有効である傾向がある。例えば、局所投与は、皮膚癌の処置において好ましくあり得るが、白血病に対しては非経口投与が好ましい可能性がある。非経口用調製物および局所用調製物は別として、因子は、口腔（ｏｒａｌｌｙ）投与、経口（ｐｅｒｏｒａｌｌｙ）投与、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ）投与、鼻腔内投与、直腸投与、経膣投与、舌側（ｌｉｎｇｕａｌｌｙ）投与および経皮投与され得る。特定の投与形態としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、エアロゾル、坐剤、皮膚用パッチ、非経口剤（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、経口液体（懸濁剤、液剤および乳剤を含む）が挙げられる。徐放性投薬形態もまた、使用され得る。すべての投薬形態は、当該分野において標準的である方法を用いて調製され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）を参照のこと）。
【実施例】
【００５２】
本実施例は、ヒトＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）（すべての主要な分子発癌性サブタイプに由来する腫瘍ならびに小児および成人に発生している腫瘍を含む）の約６５％が、ＮＯＴＣＨ−１変異を有することを示唆する結果を提供する。これらの変異のほとんどが、細胞外ヘテロ二量体化ドメインをコードする領域で、Ｃ末端ＰＥＳＴ破壊ボックスを除去する切断として生じる。これらの変異は、ＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達の増強を引き起こし、そのような変異を有するＴ−ＡＬＬ細胞株は、ＮＯＴＣＨ−１経路インヒビターによって増殖が阻止される。
【００５３】
（緒言）
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）は、小児および青年が優先的に罹患する侵攻性の（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）新生物である。これは、一般に、獲得された染色体転座および他の遺伝的異常もしくは後成的異常に関連し、これは、転写因子の選択群（ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質ＴＡＬ１、ＴＡＬ２、ＬＹＬ１、およびＢＨＬＨＢ１、オーファンホメオボックスタンパク質ＨＯＸ１１およびＨＯＸ１１Ｌ２、ならびに融合タンパク質ＭＬＬ−ＥＮＬおよびＣＡＬＭ−ＡＦ１０を含む）の異常な発現をもたらす。これらのタンパク質の誤発現（単独または組み合わせ）は、Ｔ細胞の発生、増殖および生存の正常な経路を混乱させ、独特な遺伝子発現プロフィールを有するＴ−ＡＬＬのサブグループを規定する。それにもかかわらず、マウスモデルにおいてこれらのタンパク質のいずれか１つの発現が単独で増強されても、Ｔ−ＡＬＬを引き起こすには十分ではなく、この疾患に関する多段階の分子病原論が重視される。
【００５４】
（材料および方法）
（細胞株）
すべてのＴ−ＡＬＬ細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧおよび１００μ／ｍｌ ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、５％ＣＯ２下で３７℃にて培養した。Ｕ２ＯＳ細胞を、１０％ ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧおよび１００μ／ｍｌ ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２下で３７℃にて増殖させた。
【００５５】
（細胞株のγ−レダクターゼインヒビター処置）
γ−レダクターゼ活性を、増殖細胞に１μ／Ｍの最終濃度で化合物Ｅを添加することによって阻害した。モック（Ｍｏｃｋ）処理した培養物をビヒクルのみ（最終濃度０．０１％のＤＭＳＯ）に曝露した。以下のヒトＴ−ＡＬＬ細胞株を、化合物Ｅに対する感受性について試験した：Ｔ−ＡＬＬ−１、ＡＬＬ−ＳＩＬ、ＫＯＰＴ−Ｋ１、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＤＮＤ−４１、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ２、ＲＰＭＩ８４０２、ＴＨＰ−６、ＢＥ−１３、ＪＭ−Ｊｕｒｋａｔ、Ｊｕｒｋａｔ−Ｅ６、ＲＥＸ、ＣＥＭ、ＬＯＵＣＹ、ＤＵ−５２８、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、ＭＫＢ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ−１３、ＭＯＬＴ−１５、ＭＯＬＴ−１６、ＳＵＰＴ−７、ＳＵＰＴ−１１、ＳＵＰＴ−１３、Ｐ１２−Ｉｃｈｉｋａｗａ、ＫＡＲＰＡＳ−４５、ＤＳＭＺ−ＰＥＥＲおよびＰＦ−３８２。マウス細胞株Ｔ−６Ｅ（これは、活性化のためにγ−セクレターゼ切断を必要とする短縮型の膜係留形態ＮＯＴＣＨ−１で誘導したＴ−ＡＬＬに由来した）をポジティブコントロールとして使用した。
【００５６】
（レトロウイルス）
レトロウイルス発現プラスミド（ＭＳＣＶ−ＧＦＰ−ＩＣＮ１およびＭＳＣＶ−ドミナントネガティブＭａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１−ＧＦＰ）の構築、高力価の偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）両種向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）複製欠損型レトロウイルスの生成、およびスピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）手順を、以前に記載されるように行った（Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２３：６５５−６６４）。
【００５７】
（細胞周期分析）
細胞を、７０％冷エタノール中で一晩固定した後、ヨウ化プロピジウムで染色したか、またはＧＦＰ蛍光およびＤＮＡ含量測定を同時に測定する場合は、（製造業者によって示されるようま）完全培地中でＤＲＡＱ５（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ，Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ，ＵＫ）で染色した。ＤＮＡ含量をフローサイトメトリーによって確認し、細胞周期因子をマルチサイクルソフトウェア（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いて決定した。
【００５８】
（ＮＯＴＣＨ−１発現プラスミド）
ｐｃＤＮＡ３中のＮＯＴＣＨ−１発現プラスミドは以前に記載されている。一般的なＰＥＳＴ欠失を作製するために、Ｔ−ＡＬＬ細胞株ＡＬＬ−ＳＩＬのＰＥＳＴドメイン中の挿入変異をＰＣＲによって増幅し、配列決定によって同定し、次いで、ｐｃＤＮＡ３−ＮＯＴＣＨ−１にサブクローニングした。ＨＤドメインの部位特異的変異誘発を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。変異ＰＣＲプライマーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅウェブツールを用いて設計した。
【００５９】
（レセプター遺伝子アッセイ）
ＮＯＴＣＨ−１発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、以前に記載されるように（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−７５１５（２０００））、（ｉ）ＣＳＬ結合部位を含むプロモーターの制御下にある人工的ルシフェラーゼレポーター遺伝子および（ｉｉ）内部Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ制御遺伝子とともにＵ２ＯＳで、一過性トランスフェクトした。必要に応じて空のベクターを添加することによって、全ＤＮＡを定常に保った。すべてのトランスフェクションは三連で行い、各実験を少なくとも３回繰り返した。トランスフェクションの４４〜４８時間後に細胞溶解物を収集し、ルシフェラーゼアッセイを、製造業者の提案どおりにＴｕｒｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ照度計でＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。
【００６０】
（ＮＯＴＣＨ−１ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅）
Ｔ−ＡＬＬ細胞株から単離したＲＮＡ（１）μ／ｇを、製造業者の提案した条件のように、オリゴ−ｄＴプライミングおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２０μｌ反応物中でｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ増幅を、５０μｌの反応体積で、テンプレートとして１μｌのｃＤＮＡ、２０ｐＭｏｌの５’-ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＴＡＣＣＣＧＡ（配列番号７８）ＮＯＴＣＨ−１−特異的プライマーおよび５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＡ（配列番号７９）ＮＯＴＣＨ−１−特異的プライマー、０．２５μｌのＥｘ−Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）、１×反応緩衝液、１×ｄＮＴＰならびに７．５％ ＤＭＳＯを用いて行った。サイクルパラメータは、９４℃で３分間；９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間を３０サイクル；および７２℃で８分間、であった。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製し、Ｂａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩで消化し、ｐＳＰ７２に連結し、ＤＨ５α細胞を形質転換するために使用した。個々のコロニーからのミニプレップＤＮＡを、Ｔ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを用いて配列決定した。
【００６１】
（患者の材料）
Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＤａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで処置されたＴ−ＡＬＬを有する９６例の小児および若年成人に由来する冷凍保存されたリンパ芽球のサンプルを、診断時にインフォームドコンセントを行って入手した。各サンプルからのゲノムＤＮＡを、市販のキット（ＧＥＮＴＲＡ）で製造業者の指示に従って抽出した。ＲＮＡを、ＲＮＡ水性試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて製造業者の指示に従って、冷凍保存されたリンパ芽球から調製した。
【００６２】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
ＨＯＸ１１、ＨＯＸ１１Ｌ２、ＴＡＬ１、ＬＹＬ１、ＴＡＬ２およびＢＨＬＨＢ１の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、以前に記載されるように（Ｆｅｒｒａｎｄｏら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｌｌ １：７５−８７；Ｆｅｒｒａｎｄｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３６３：５３５−５３６）行った。ＭＬＬ−ＥＮＬ融合転写物およびＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合転写物のＲＴ−ＰＣＲベースの検出もまた、以前に記載されるように（Ｆｅｒｒａｎｄｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３６３：５３５−５３６；Ａｓｎａｆｉら、Ｂｌｏｏｄ １０２：１０００−１００６）行った。
【００６３】
（ゲノムＤＮＡ調製）
ゲノムＤＮＡを、製造業者の指示に従って、市販のキット（ＧＥＮＴＲＡ）での抽出によって原発性（ｐｒｉｍａｒｙ）Ｔ−ＡＬＬから調製した。ＤＮＡを、ＳＤＳ溶解／プロテイナーゼＫ消化、その後のフェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって、細胞株から調製した。ＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁し、分光光度的に定量し、−２０℃で保管した。
【００６４】
（変異検出）
ＮＯＴＣＨ−１のエキソン２６、エキソン２７およびエキソン３４における変異検出を、ＰＣＲベースの変性ＨＰＬＣによって、ＤＮＡＳｅｐ ＨＴカートリッジを備えるＷＡＶＥ ＤＮＡフラグメント分析システム（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて行った。変異分析用のアンプリコンを、以下のプライマーの組み合わせを用いて調製した。エキソン２６でコードされるＮＯＴＣＨ−１のＨＤドメインのＮ末端領域を、２つのアンプリコンに分割した。アンプリコンＨＤ−Ｎ１を、プライマーＨＤ−Ｎ１ＦＷ１：５’−ＡＧＣＣＣＣＣＴＧＴＡＣＧＡＣＣＡＧＴＡ（配列番号８０）、ＨＤ−Ｎ１ＲＶ１：５’−ＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣ（配列番号８１）を用いるＰＣＲによって、そしてプライマーＨＤ−Ｎ１ＦＷ２：５’−ＧＡＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＧＡＣＣＡ（配列番号８２）、ＨＤ−Ｎ１ＲＶ２：５’−ＴＣＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＴＡＧＴＡＧ（配列番号８３）を用いるネスト化ＰＣＲによって増幅した。アンプリコンＨＤ２を、プライマーＨＤ−Ｎ２ＦＷ１：５’−ＧＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧ（配列番号８４）、ＨＤ−Ｎ２ＲＶ１：５’−ＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＴＧ（配列番号８５）を用いるＰＣＲによって、そしてプライマーＨＤ−Ｎ２ＦＷ２：５’−ＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴ（配列番号８６）およびＨＤ−Ｎ２ＲＶ２：５’−ＣＧＣＣＧＧＧＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣ（配列番号８７）を用いるネスト化ＰＣＲによって増幅した。
【００６５】
エキソン２７でコードされるＮＯＴＣＨ １のＨＤドメインのＣ末端領域を、プライマーＨＤ−ＣＦＷ１：ＧＴＧＧＣＧＴＣＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡ（配列番号８８）およびＨＤ−ＣＲＶ１：ＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＣ（配列番号８９）を用いるＰＣＲによって、そしてプライマーＨＤ−ＣＦＷ２：ＣＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＴ（配列番号９０）およびＨＤ−ＣＲＶ２：ＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣ（配列番号９１）を用いるネスト化ＰＣＲによって増幅した。
【００６６】
ＮＯＴＣＨ−１のＰＥＳＴドメインとＴＡＤを含む連続的Ｎ領域とをコードするエキソン３４の配列を、３つのアンプリコンに分割した。アンプリコンＰＥＳＴ１およびＰＥＳＴ２を、プライマーＰＥＳＴＦＷ１：５’−ＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＧＧ（配列番号９２）およびＰＥＳＴＲＶ１：５’−ＡＡＣＡＴＧＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＴＣＣＴＣ（配列番号９３）を用いるＰＣＲによって、そしてプライマーＰＥＳＴ１ＦＷ：５’−ＡＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡ（配列番号９４）、ＰＥＳＴ１ＲＶ：５’−ＣＡＣＡＧＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧ（配列番号９５）、ならびにＰＥＳＴ２ＦＷ：５’−ＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＣＣＡＧＴＴＣ（配列番号９６）およびＰＥＳＴ２ＲＶ：５’−ＡＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＣ（配列番号９７）を用いるネスト化ＰＣＲによって増幅した。アンプリコンＴＡＤ１を、プライマーＴＡＤ１ＦＷ１：５’−ＡＧＡＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＴＣＧＴＣＴＣＴ（配列番号９８）、ＴＡＤ１ＲＶ１：５’−ＧＣＴＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣ（配列番号９９）を用いるＰＣＲによって、そしてプライマーＴＡＤ１ＦＷ２：５’−ＣＧＴＣＴＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴ（配列番号１００）およびＴＡＤ１ＲＶ２：５’−ＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＧＣＣＡＡＧＧＴ（配列番号１０１）を用いるネスト化ＰＣＲによって増幅した。ＤＨＰＬＣ分析の前に、変異対立遺伝子に対してヘテロ接合性のサンプル中でホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の形成を可能にするために、ネスト化ＰＣＲ産物を、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＰＴＣ−２２５）を用いて９５℃で５分間変性させ、４０℃までゆっくりと傾斜をつけた。
【００６７】
１サンプルあたり１５μｌ〜３０μｌのアニーリングしたＰＣＲフラグメントを、分析のためにＤＮＡＳｅｐ ＨＴカートリッジに注入した。生成物を、アンプリコンのサイズおよびＧＣ含量に基づいてＮａｖｉｇａｔｏｒソフトウェア（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）によって決定した線形のアセトニトリル勾配を用いて、一定の流速（１．５ｍｌ／分）で溶出させた。この勾配は、０．１ｍの酢酸トリメチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）緩衝液（ｐＨ７）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）と緩衝液Ｂ（２５％ アセトニトリルを含む０．１ｍ ＴＥＡＡ）とを混合することによって生成した。このシステムのＵＶ検出器によってモニタリングしたＤＮＡフラグメントの溶出プロフィールを使用して、クロマトグラフを作成した。各サンプルについての分析順序は以下のとおりであった：検出器のための時間経過 １．９分間、緩衝液Ｂの３％減少を伴うローディング段階 ０．１分間、１分間あたり２％の緩衝液Ｂの増加スロープでの線形勾配 ２．０分間、７５％アセトニトリルを用いる洗浄段階 ０．１分間、および次の注入の前の平衡 ０．１分間。ホモ二重鎖ピークおよびヘテロ二重鎖ピークを、反応中の残留ヌクレオチドとプライマーとによって生成された最初の注入ピークと、洗浄段階との間で検出した。
【００６８】
２７６〜４５２塩基対の範囲のネスト化ＰＣＲ産物についての融解プロフィールを、Ｎａｖｉｇａｔｏｒソフトウェアを用いて構築した。変異検出のための適切な部分的変性温度（これは、目的の領域に含まれる各塩基における３０％〜９８％のらせん構造の割合を生じた）を、全アンプリコンについて予測した：ＰＥＳＴ１、６６．５℃；ＰＥＳＴ２、６５．０℃；ＨＤ１、６７．０℃および６４．５℃；ＨＤ２、６７．０℃および６４．０℃；ならびにＴＡＤ１、６４．５℃および６３．９℃。あまり安定でないヘテロ二重鎖は、ホモ二重鎖よりも速く変性し、したがって、溶出プロフィールにおいて最初に現れる。したがって、通常のホモ二重鎖の前に溶出した種を表すクロマトグラフを有するサンプルで、直接配列決定を行った。
【００６９】
（結果）
ｔ（７；９）に関連するまれな場合を越えてヒトＴ−ＡＬＬにおけるＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達の果たし得る役割を評価するために、本発明者らは、最初に、ｔ（７；９）を欠くＴ−ＡＬＬ細胞株を、これらの細胞をγ−セクレターゼインヒビターで処理することによってＮＯＴＣＨ依存性について試験した（Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：６５５−６４）。本発明者らは、試験した３０個のヒトＴ−ＡＬＬ細胞株のうち５つがＧ０／Ｇ１細胞周期停止を示し、これは参照のＮＯＴＣＨ−１依存性のマウスＴ−ＡＬＬであるＴ６Ｅ細胞株の細胞周期停止と等しいかまたはそれを上回ることを観察した（図２Ａ）。γ−セクレターゼインヒビターによって引き起こされる増殖抑制は、ＩＣＮ１（γ−セクレターゼ切断後に放出されるフラグメントである）のレトロウイルス発現によって排除され（図２Ｂ）、ドミナントネガティブなＭａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１のレトロウイルス発現によって再現された（図２Ｃ）。まとめると、これらの結果は、これらの５つの細胞株の増殖がＮＯＴＣＨ媒介性シグナルに依存することを示した。
【００７０】
ＮＯＴＣＨレセプターはＮＯＴＣＨ細胞外ドメインの物理的解離によって活性化され得る（Ｒａｎｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１８２５−３５；Ｋｒａｍｅｒ，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ ２０００，ＰＥ１）ので、本発明者らは、新たに同定されたＮＯＴＣＨ−１のＨＤドメインが機能獲得型（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）変異の部位であり得ると考えた。マウスＴ−ＡＬＬで観察されるレトロウイルス挿入の１つのクラスは、ネガティブな調節Ｃ末端ＰＥＳＴ配列の欠失を生じ（Ｈｏｅｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３８３１−４２；Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ ９６：１９０６−１３）、この挿入を発癌性ＮＯＴＣＨ−１変異についての第二の候補領域にする。著しいことに、これらのゲノム領域のＤＮＡ配列決定は、５つのＮＯＴＣＨ依存性細胞株のうちの４つにおけるＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異の両方を明らかにした。（ＮＯＴＣＨ−１のエキソン２６によってコードされる）ＨＤドメインに影響を与えるミスセンス変異は、脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプターにおいて不変である残基を伴い、アミノ酸残基の非保存的変化を生じた（図３Ａ〜図３Ｃ）。１つの細胞株、ＤＮＤ−４１は、同じＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子内に２つの異なるＨＤドメイン変異を有した。
【００７１】
ＰＥＳＴ変異（エキソン３４に見出される）は、ネガティブな調節Ｃ末端ＰＥＳＴドメインの部分的もしくは完全な欠失を生じると予測されるリーディングフレームのシフトを引き起こす短い挿入または欠失であった（図３Ｄおよび図３Ｅ）。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定により、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異が、試験した４つの細胞株の各々の同じＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子中にｃｉｓに存在することが明らかにされた。正常なＮＯＴＣＨ−１ ｃＤＮＡクローンもまた、各々の細胞株で同定され、これは、両方の対立遺伝子が発現されることを示す。これは、エキソン２６変異およびエキソン３４変異を有する細胞株が予期されるサイズのＮＴＭのポリペプチドおよびＮＴＭよりもわずかに小さいサイズのさらなる異常なポリペプチド含むことを明らかにしたウェスタンブロット分析の結果と一致する（図３Ｆ）。対照的に、エキソン２６およびエキソン３４を欠く細胞株ＴＡＬＬ−１は、予期されるサイズのＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドのみを含んでいた。
【００７２】
本発明者らは、ＮＯＴＣＨ−１のＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインについての本発明者らの変異分析を、診断時に９６例の小児および青年の骨髄から得られた冷凍保存された原発性Ｔ−ＡＬＬサンプルに拡張した。少なくとも１つの変異が４９の腫瘍（５１％）で同定され、２０の腫瘍（２０．８％）はＨＤドメイン変異のみを有し、１５の腫瘍（１５．６％）はＰＥＳＴドメイン変異のみを有し、そして１４の腫瘍（１４．６％）は、ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインの両方で変異を有した。変異は、ＨＯＸ１１、ＨＯＸ１１Ｌ２、ＴＡＬ１、ＬＹＬ１、ＭＬＬ−ＥＮＬまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０の誤発現に関連する腫瘍で見られ（ＨＯＸ１１（３例のうち２例）、ＨＯＸ１１Ｌ２（１３例のうち１０例、すなわち７７％）、ＴＡＬ１（３１例のうち１１例、すなわち３５％）、ＬＹＬ１（１４例のうち７例、すなわち５０％）、ＭＬＬ−ＥＮＬ（３例のうち１例）、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０（２例のうち１例））、これは、一緒にＴ−ＡＬＬの主要な分子サブタイプを規定する。原発腫瘍中のＨＤドメイン変異は、残基１５７４〜１６２２に広がる「ホットスポット」においてクラスター化し、ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株でもともと同定された３つのＬからＰへのミスセンス変異、ならびに１〜２個の残基の欠失および短い「インフレーム」挿入の各々を含んでいた（図３Ａ〜図３Ｂ）。ＰＥＳＴドメイン変異は、リーディングフレームのシフトを誘導する挿入または欠失、ならびに未熟終止コドンを生じる点変異を含んでいた（図３Ｄ〜図３Ｅおよび図６）。
【００７３】
Ｔ−ＡＬＬとは対照的に、８９個の原発性Ｂ−ＡＬＬサンプルでは変異は観察されなかった。変異はまた、そのＴ−ＡＬＬがＮＯＴＣＨ−１変異を有する患者から得られた４つの寛解骨髄サンプルには存在せず、これらの変異が生殖系列には存在しないが悪性クローン内で獲得されることを示す。多型はＮＯＴＣＨ−１のＨＤドメイン領域内で検出されていないが（ＮＣＢＩ ＳＮＰデータベース）、本発明者らにＴ−ＡＬＬで本発明者らが検出した保存残基中の変異が機能的な結果を有する可能性があることのさらなる推測をもたらす。
【００７４】
この課題に直接取り組むために、本発明者らは、一過性発現アッセイにおけるＮＯＴＣＨ感受性ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化に対する、共通するＨＤドメイン変異（ＰＥＳＴドメイン欠失を有するものおよびＰＥＳＴドメイン欠失を有さないもの）の効果を研究した（図４Ａ）。残基１５７５、１５９４または１６０１でのＨＤドメイン内の単一のＬからＰへの変異は、ルシフェラーゼ活性の３倍〜９倍の刺激を生じ、一方で孤立した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）ＰＥＳＴ欠失（アミノ酸２４７１での切断を生じるＡＬＬ−ＳＩＬ細胞株に見出される変異に対応する）は、約１．５倍〜２倍の刺激を生じた。より著しくは、ｃｉｓにおける各々のＨＤ変異および同じＰＥＳＴドメイン切断は、２０倍〜４０倍の転写活性化の刺激を生じた。対照的に、ｔｒａｎｓにおける同じ変異は、より低いレベルの刺激を生じ、これは単独で作用する各変異の平均に近かった。
【００７５】
図４に記載されるように行ったさらなるレポーター遺伝子アッセイは、これまで試験したすべてのＨＤドメインがＮＯＴＣＨ−１における機能の増強を表すことを示している。これらの機能アッセイで試験した変異は：
Ｖ１５７７Ｅ 配列番号１０２
Ｌ１５８６Ｑ 配列番号１０６
Ｆ１５９３Ｓ 配列番号１１７
Ｌ１５９７Ｈ 配列番号１０９
Ｒ１５９９Ｐ 配列番号１５
Ｉ１６１７Ｎ 配列番号１１５
Ｉ１６１７Ｔ 配列番号１１６
Ｖ１６７７Ｄ 配列番号１３５
Ｌ１６７９Ｐ 配列番号７１
Ｉ１６８１Ｎ 配列番号７３
Ａ１７０２Ｐ 配列番号１２９
Ｉ１７１９Ｔ 配列番号１２８
ｉｎｓ（ＲＬＧＳＬＮＩＰＹＫＩＥＡＶ） 配列番号１３７
である。
【００７６】
これらのデータは、増強された機能がＮＯＴＣＨ１のＨＤドメインに見出される変異の一般的特徴であることを示唆する。
【００７７】
ｃｉｓにおけるＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異の相乗的相互作用は、（ｉ）ＨＤドメイン変異がγ−セクレターゼ切断を促進し、ＩＣＮ１の生成速度を増加させ（ｉｉ）ＩＣＮ１のＰＥＳＴドメインを除去する切断がＮＯＴＣＨのこの活性化形態の半減期を増大させる、モデルと一致する（図４Ｂ）。ｔｒａｎｓでのこれらの変異によって生じる中程度のレベルの活性化は、おそらく、プロセシングおよびシグナル伝達に必要とされる因子について比較的弱い機能獲得型ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドと強い機能獲得型ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドとの間の競合を反映する。変異された膜貫通ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの刺激効果は、γ−セクレターゼインヒビターによって完全に排除され、シグナル伝達のために変異されたＮＴＭサブユニットの膜近傍部位でのタンパク質分解の要件を示す（図４Ａ）。対照的に、ＩＣＮ１によって生じる刺激（構成的に核刺激である）は、γ−セクレターゼ阻害により影響を受けなかった（図４Ａ）。
【００７８】
ごく最近、本発明者らは、Ｔ−ＡＬＬ以外の腫瘍において２つの変異を観察した。ＮＯＴＣＨ−１のエキソン２６における挿入変異は、急性骨髄性白血病の場合に見出された。これは、アミノ酸残基１５９３〜１５９４をＦＬからＬＳＬに変化させる。この変異は、図４Ａに示されるアッセイと類似するアッセイにおいてＮＯＴＣＨ−１がＣＳＬ感受性ルシフェラーゼ遺伝子を活性化する能力を刺激し、この変異がＮＯＴＣＨ−１機能を増大させることを示す。エキソン２７における新規なＮＯＴＣＨ−１変異は、ランゲルハンス細胞組織球増殖症（高度に保存された残基であるアミノ酸１６９３がＣからＲに変化する）の場合に見出された。同時に、これらのデータは、Ｔ−ＡＬＬで発見された変異と同一または機能的に類似する変異がヒト新形成の他の形態で見出されるという予測を支持する。
【００７９】
（考察）
Ｔ−ＡＬＬのあらゆる主要な分子発癌性サブタイプに見出される機能獲得型ＮＯＴＣＨ−１変異の有病率は、この腫瘍の病原論における無制御のＮＯＴＣＨシグナル伝達に対する卓越した役割を強く支持する。増殖のためにＮＯＴＣＨシグナルを必要とするようであるがＮＯＴＣＨ−１ ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴ領域変異を欠く少なくとも１つの細胞株（ＴＡＬＬ−１）の存在は、ＮＯＴＣＨ経路に関与するプレＴ細胞形質転換を説明する他の機構が存在することを示唆する。ＮＯＴＣＨ−１の他の領域に影響を及ぼす活性化変異がヒトＴ−ＡＬＬの事例で同定され得ることが、考えられ得る。
【００８０】
以前の研究は、ＮＯＴＣＨレセプターの活性化が、通常は、タンパク質分解を抑制するＮＥＣサブユニットの放出を通じて主に達成されることを示した（Ｒａｎｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１８２５−３５；Ｋｒａｍｅｒ，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ ２０００，ＰＥ１）。ＮＥＣ ＨＤドメインおよびＮＴＭの細胞外部分のみからなる組換え「ミニレセプター（ｍｉｎｉ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」は、フリン切断後に安定なヘテロ二量体を形成し、この領域において重大なサブユニット間の接触が存在することを示す。したがって、ＨＤドメイン変異は、ＮＥＣ／ＮＴＭヘテロ二量体を不安定化させることによ
って作用し得る。したがって、同様の効果が、ＮＴＭサブユニットの類似のヘテロ二量体化領域に生じる変異によって与えられる可能性がある。
【００８１】
数種の因子によって、Ｔ−ＡＬＬにおける高頻度のＮＯＴＣＨ−１変異が説明され得る。通常の早期Ｔ細胞発生の数個の段階の間のＮＯＴＣＨ−１シグナルの絶対的要件は、この経路の頻繁な関与の機能的根拠を提供する。さらに、方向付けられたＴ細胞前駆体におけるＶ−Ｄ−Ｊβ再構成の試みの間の異常な組換えによって作製されるｔ（７；９）とは異なり、本明細書で記載されるより一般的な点変異および挿入が、多分化能の造血前駆体（これもまた通常はＮＯＴＣＨ−１を発現する）で生じ得る（Ｃａｌｖｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４２５，８４１−６）。その場合、そのような変異は、娘細胞がＴ細胞の運命を選択するように誘導し（Ａｌｌｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：９９−１０６）、これによって、さらなる白血病誘発性事象（同じＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子に影響を及ぼすさらなる変異を含み得る）、ならびに他の重大な転写因子の誤発現をもたらす染色体事象、遺伝的事象および後成的事象の危険性のある細胞のプールを増加させると予測される。類似のＮＯＴＣＨ変異は、ＮＯＴＣＨレセプターが多くの正常な組織および種々の悪性腫瘍で発現されるので、特定のより一般的な型のヒト癌の分子病原論に関与する可能性がある（Ａｌｌｅｎｓｐａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：４６６−７６）。
【００８２】
本発明者ら知見は、ＮＯＴＣＨ経路をＴ−ＡＬＬにおける分子治療のための合理的な標的と同定する。約７５％の患者が現在、非常に集中的かつ細胞傷害性の化学療法レジメンでこの疾患の治療を受けているが（Ｐｕｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１５３５−４８）、難治性疾患を有する患者に対して新しい治療が必要とされ、毒性が低くより有効な薬物の組み合わせがすべてのＴ−ＡＬＬ患者に有益である。強力で特異的なγ−セクレターゼインヒビターの開発（Ｗｏｌｆｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１：８５９−６６）は、アルツハイマー病の病原論におけるこのプロテアーゼの関与に起因して、ＮＯＴＣＨ−１活性をブロックすることを目的とする癌治療の臨床試験を促進するはずである。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１−１】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−２】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−３】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−４】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−５】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−６】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図１−７】整列されたヒトＮＯＴＣＨレセプターの全長アミノ酸配列。示される配列は、ＮＯＴＣＨ−１（配列番号１）；ＮＯＴＣＨ−２（配列番号２）；ＮＯＴＣＨ−３（配列番号３）；およびＮＯＴＣＨ−４（配列番号４）である。
【図２Ａ】増殖にＮＯＴＣＨシグナルを必要とするＴ−ＡＬＬ細胞株の同定である。（２Ａ）感受性の細胞株の細胞周期分布に対するγ−セクレターゼインヒビター化合物Ｅ（ＧＳＩ、１μＭ）またはビヒクル単独（モック（ｍｏｃｋ））の効果。細胞を４〜８日間処理し、７０％冷エタノール中で固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生細胞を、前方／側方散乱基準（ｆｏｒｗａｒｄ／ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｃｒｉｔｅｒｉａ）によってゲートした。（２Ｂ）ＭＳＣＶ−ＧＦＰ−ＩＣＮ１レトロウイルスによるＧＳＩ誘導性細胞周期停止のレスキュー。（２Ｃ）ドミナントネガティブなＭＳＣＶ−ＧＦＰ−Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１レトロウイルスによる細胞周期停止の誘導。（２Ｂ）および（２Ｃ）において、コントロール培養物を、コントロールの空のＭＳＣＶ−ＧＦＰレトロウイルスまたは示された試験ウイルスで形質導入した。形質導入の２日後、培養物を２つに分け、化合物Ｅ（ＧＳＩ）またはＤＭＳＯビヒクル（モック（ｍｏｃｋ））のいずれかで、７〜１０日間処理した。次いで、培養物を収集し、ＤＮＡ色素ＤＲＡＱ５で染色した。これによって、選別されていないＧＦＰ−およびＧＦＰ＋の部分集団中のＤＮＡ含量のフローサイトメトリーによる測定を可能にする。最小限１５，０００の事象を集めて、各ＤＮＡ含量のヒストグラムを作成した。
【図２Ｂ】増殖にＮＯＴＣＨシグナルを必要とするＴ−ＡＬＬ細胞株の同定である。（２Ａ）感受性の細胞株の細胞周期分布に対するγ−セクレターゼインヒビター化合物Ｅ（ＧＳＩ、１μＭ）またはビヒクル単独（モック（ｍｏｃｋ））の効果。細胞を４〜８日間処理し、７０％冷エタノール中で固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生細胞を、前方／側方散乱基準（ｆｏｒｗａｒｄ／ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｃｒｉｔｅｒｉａ）によってゲートした。（２Ｂ）ＭＳＣＶ−ＧＦＰ−ＩＣＮ１レトロウイルスによるＧＳＩ誘導性細胞周期停止のレスキュー。（２Ｃ）ドミナントネガティブなＭＳＣＶ−ＧＦＰ−Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１レトロウイルスによる細胞周期停止の誘導。（２Ｂ）および（２Ｃ）において、コントロール培養物を、コントロールの空のＭＳＣＶ−ＧＦＰレトロウイルスまたは示された試験ウイルスで形質導入した。形質導入の２日後、培養物を２つに分け、化合物Ｅ（ＧＳＩ）またはＤＭＳＯビヒクル（モック（ｍｏｃｋ））のいずれかで、７〜１０日間処理した。次いで、培養物を収集し、ＤＮＡ色素ＤＲＡＱ５で染色した。これによって、選別されていないＧＦＰ−およびＧＦＰ＋の部分集団中のＤＮＡ含量のフローサイトメトリーによる測定を可能にする。最小限１５，０００の事象を集めて、各ＤＮＡ含量のヒストグラムを作成した。
【図２Ｃ】増殖にＮＯＴＣＨシグナルを必要とするＴ−ＡＬＬ細胞株の同定である。（２Ａ）感受性の細胞株の細胞周期分布に対するγ−セクレターゼインヒビター化合物Ｅ（ＧＳＩ、１μＭ）またはビヒクル単独（モック（ｍｏｃｋ））の効果。細胞を４〜８日間処理し、７０％冷エタノール中で固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生細胞を、前方／側方散乱基準（ｆｏｒｗａｒｄ／ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｃｒｉｔｅｒｉａ）によってゲートした。（２Ｂ）ＭＳＣＶ−ＧＦＰ−ＩＣＮ１レトロウイルスによるＧＳＩ誘導性細胞周期停止のレスキュー。（２Ｃ）ドミナントネガティブなＭＳＣＶ−ＧＦＰ−Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ様−１レトロウイルスによる細胞周期停止の誘導。（２Ｂ）および（２Ｃ）において、コントロール培養物を、コントロールの空のＭＳＣＶ−ＧＦＰレトロウイルスまたは示された試験ウイルスで形質導入した。形質導入の２日後、培養物を２つに分け、化合物Ｅ（ＧＳＩ）またはＤＭＳＯビヒクル（モック（ｍｏｃｋ））のいずれかで、７〜１０日間処理した。次いで、培養物を収集し、ＤＮＡ色素ＤＲＡＱ５で染色した。これによって、選別されていないＧＦＰ−およびＧＦＰ＋の部分集団中のＤＮＡ含量のフローサイトメトリーによる測定を可能にする。最小限１５，０００の事象を集めて、各ＤＮＡ含量のヒストグラムを作成した。
【図３Ａ】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｂ−１】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｂ−２】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｂ−３】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｃ】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｄ−１】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｄ−２】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｄ−３】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｅ】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｆ】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｇ−１】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図３Ｇ−２】γ−セクレターゼインヒビター感受性のＴ−ＡＬＬ細胞株および原発性ヒトＴ−ＡＬＬサンプルにおける、ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異。（３Ａ）脊椎動物ＮＯＴＣＨ−１レセプター間のエキソン２６ＨＤドメイン変異性「ホットスポット」領域の配列保存。反復性の変異の位置は、ボールド体およびイタリック体である。（３Ｂ）細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたミスセンス配列および欠失。１つの変異である配列番号１４５は、急性骨髄性白血病と関連していた。変異部位はボールド体およびイタリック体である。（３Ｃ）原発性Ｔ−ＡＬＬで同定されたＨＤドメイン中のインフレーム挿入。（３Ｄ）ＰＥＳＴドメイン変異。細胞株（下線）および原発性Ｔ−ＡＬＬにおける変異されたＮＯＴＣＨ−１対立遺伝子のアミノ酸配列が示される。終止コドンはアスタリスクで示される。（３Ｅ）ＰＥＳＴドメイン変異の模式的な説明。円（白色、原発性Ｔ−ＡＬＬ；黒色、細胞株）は、ＮＯＴＣＨ−１ポリペプチド配列が終結する位置に対応する。キー：ＮＥＣ、ＮＯＴＣＨ−１細胞外ドメイン；ＬＮＲ、Ｌｉｎ／ＮＯＴＣＨ反復；ＨＤ、ヘテロ二量体化ドメイン；ＮＴＭ、ＮＯＴＣＨ膜貫通サブユニット；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＡＮＫ、アンキリン反復ドメイン；ＴＡＤ、転写活性化ドメイン。（Ａ〜Ｄ）において、アミノ酸残基は、ヒトｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１のアミノ酸残基に対応する。（３Ｆ）ＮＯＴＣＨ依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に由来する溶解物のウェスタンブロット分析。全細胞抽出物を、細胞内転写活性化ドメインに対して産生したＮＯＴＣＨ−１抗体を用いて分析した（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）。ｐｒｏ−ＮＯＴＣＨ−１および正常なＮＴＭサブユニットの位置が示される。下側のパネルは、同じブロットのより長く曝露したものであり、正常なＮＴＭポリペプチドよりもサイズの小さいさらなるＮＯＴＣＨ−１ポリペプチドの存在を強調する。各レーンに２５μｇの総タンパク質をロードした。（３Ｇ）ＮＯＴＣＨ−１ ＴＭＴサブユニットのＨＤドメインをコードする、エキソン２７中の配列保存および変異。このＮＯＴＣＨのサブユニットは、ＮＥＣサブユニットのＨＤドメインであるエキソン２６に非共有結合している。変異部位は、ボールド体およびイタリック体である。ＴＡＬＬ ０４．３６について、配列中のｉは、すぐ下に示される１４個のアミノ酸の挿入部位を示す。
【図４Ａ】ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異はＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達を相乗的に活性化する。（４Ａ）レポーター遺伝子アッセイ。Ｕ２ＯＳ細胞を、以前に記載された（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）ように、指定されたｐｃＤＮＡ３プラスミド、ＮＯＴＣＨ応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子および内部Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部コントロールプラスミドを用いて２４ウェル形式で一過性に同時トランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３−ＩＣＮ１を用いる実験を除いて、１ウェルあたり２５ｎｇのｐｃＤＮＡ３プラスミドを使用し、ｐｃＤＮＡ３−ＩＣＮ１を用いる実験では、１ウェルあたり５ｎｇのプラスミドを使用した。全細胞溶解物における正規化ルシフェラーゼ活性を三連で決定し、空のベクターコントロールでトランスフェクトした細胞から調製した溶解物における活性と比較して表した。（４Ｂ）ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインの両方に関与する二重変異による相乗的ＮＯＴＣＨ−１活性化についてのモデル。
【図４Ｂ】ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異はＮＯＴＣＨ−１シグナル伝達を相乗的に活性化する。（４Ａ）レポーター遺伝子アッセイ。Ｕ２ＯＳ細胞を、以前に記載された（Ａｓｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：７５０５−１５）ように、指定されたｐｃＤＮＡ３プラスミド、ＮＯＴＣＨ応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子および内部Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部コントロールプラスミドを用いて２４ウェル形式で一過性に同時トランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３−ＩＣＮ１を用いる実験を除いて、１ウェルあたり２５ｎｇのｐｃＤＮＡ３プラスミドを使用し、ｐｃＤＮＡ３−ＩＣＮ１を用いる実験では、１ウェルあたり５ｎｇのプラスミドを使用した。全細胞溶解物における正規化ルシフェラーゼ活性を三連で決定し、空のベクターコントロールでトランスフェクトした細胞から調製した溶解物における活性と比較して表した。（４Ｂ）ＨＤドメインおよびＰＥＳＴドメインの両方に関与する二重変異による相乗的ＮＯＴＣＨ−１活性化についてのモデル。
【図５−１】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−２】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−３】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−４】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−５】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−６】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−７】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−８】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−９】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−１０】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図５−１１】全長ヒトＮＯＴＣＨ−１遺伝子配列（配列番号７６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１）。
【図６−１】ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異の編集。
【図６−２】ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異の編集。
【図６−３】ＨＤドメイン変異およびＰＥＳＴドメイン変異の編集。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書および図面に記載されるような、変異。
【請求項１】
本明細書および図面に記載されるような、変異。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図１−７】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ−１】
【図３Ｂ−２】
【図３Ｂ−３】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ−１】
【図３Ｄ−２】
【図３Ｄ−３】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ−１】
【図３Ｇ−２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図５−５】
【図５−６】
【図５−７】
【図５−８】
【図５−９】
【図５−１０】
【図５−１１】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図１−７】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ−１】
【図３Ｂ−２】
【図３Ｂ−３】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ−１】
【図３Ｄ−２】
【図３Ｄ−３】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ−１】
【図３Ｇ−２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図５−５】
【図５−６】
【図５−７】
【図５−８】
【図５−９】
【図５−１０】
【図５−１１】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【公開番号】特開２００９−５５９０７（Ｐ２００９−５５９０７Ａ）
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２００１１３（Ｐ２００８−２００１１３）
【出願日】平成２０年８月１日（２００８．８．１）
【分割の表示】特願２００７−５２４９８３（Ｐ２００７−５２４９８３）の分割
【原出願日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【出願人】（５０４４１２９４５）ザ ブライハム アンド ウイメンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (54)
【出願人】（５０２２０６７９５）ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１日（２００８．８．１）
【分割の表示】特願２００７−５２４９８３（Ｐ２００７−５２４９８３）の分割
【原出願日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【出願人】（５０４４１２９４５）ザ ブライハム アンド ウイメンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (54)
【出願人】（５０２２０６７９５）ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
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