中皮腫の治療のためのＣＤＫ阻害物質
本発明は、中皮腫の治療に使用するための低分子量ＡＴＰ競合的ＣＤＫ阻害物質を提供する。化合物は、１つ以上の細胞傷害性または細胞増殖抑制性剤と共に投与することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子量ＡＴＰ競合的ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害物質の使用による、中皮腫患者の治療に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
悪性中皮腫は、アスベスト曝露に関連した局所浸潤性で急性致死的な腫瘍性疾患である。
【０００３】
中皮腫の転帰に寄与する多くの遺伝的欠陥がある。ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害物質２Ａ）のホモ接合体欠失は、中皮腫の約７５％に見出され、この癌における最も一般的な遺伝子変化であり得る［Ｈｉｒａｏ Ｔ，Ｂｕｅｎｏ Ｒ，Ｃｈｅｎ ＣＪ，Ｇｏｒｄｏｎ ＧＪ，Ｈｅｉｌｉｇ Ｅ，Ｋｅｌｓｅｙ ＫＴ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２００２；２３（７）：１１２７−１１３０；Ｗｈｉｔｓｏｎ ＢＡ，Ｋｒａｔｚｋｅ ＲＡ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２００６；２３９（２）：１８３−１８９］。予後に関して、ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａの損失は、中皮腫のより高悪性度の臨床的挙動と関連している［Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｎ，Ｔｏｙｏｏｋａ Ｓ，Ｙａｎａｉ Ｈ，Ｓｏｈ Ｊ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｎ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００８ ６２（１）：１２０−５；Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｂ，Ｒｅｉｃｈ Ｒ，Ｌａｚａｒｏｖｉｃｉ Ｐ，Ｆｌｏｒｅｎｅｓ ＶＡ，Ｒｉｓｂｅｒｇ Ｂ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｓ，Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；４４（２）：１５９−１６５］。
【０００４】
ｐ１６タンパク質は、サイクリン依存性キナーゼを阻害することによって、Ｇ１期における細胞周期停止を引き起こす。ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａの欠乏の結果として、Ｇ１／Ｓチェックポイント制御が失われ、網膜芽細胞腫抑制因子（ｐＲｂ）の過剰リン酸化およびＳ期への細胞進行が生じる。
【０００５】
さらにトロポミオシン（Ｔｈｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ）受容体キナーゼＡ（ＴＲＫＡ）もこの疾患の生物学において重大な役割を果たす。実際に、活性化ＴＲＫＡ（Ｐ−ＴＲＫＡ）の高頻度発現は悪性中皮腫で頻繁に見出され、主に滲出液に、および腹膜病変、若年患者に出現する腫瘍に見られる［Ｗｈｉｔｓｏｎ ＢＡ，Ｋｒａｔｚｋｅ ＲＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｌｅｕｒａｌ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２００６；２３９（２）：１８３−１８９］。
【０００６】
世界の中皮腫の発生率は上昇しており、外科的切除により効果を得られる患者はごくわずかである。治癒的切除が適用されない患者では、全生存期間中央値はおよそ６から７ヶ月である。治療選択肢は限定されている。大半の患者は、治療されても治療されなくても、局部疾患からの合併症で死亡する。単剤としてまたは組合せて販売されている化学治療剤は、生存に著しい影響を及ぼせないことが判明した。
【０００７】
現在の治療選択肢は、１４．１％の中程度の奏功率および１０．７ヶ月の全生存期間中央値を示した、単剤としてのペメトレキセド（商標アリムタ（登録商標）として販売）［Ｓｃａｇｌｉｏｔｔｉ ＧＶ，Ｓｈｉｎ ＤＭ，Ｋｉｎｄｌｅｒ ＨＬ，Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅｓ ＭＪ，Ｋｅｐｐｌｅｒ Ｕ，Ｍａｎｅｇｏｌｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３；２１（８）：１５５６−１５６１］またはペメトレキセドを含む白金誘導体（シスプラチンまたはカルボプラチン）との組合せ［Ｃａｓｔａｇｎｅｔｏ Ｂ，Ｂｏｔｔａ Ｍ，Ａｉｔｉｎｉ Ｅ，Ｓｐｉｇｎｏ Ｆ，Ｄｅｇｉｏｖａｎｎｉ Ｄ，Ａｌａｂｉｓｏ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２００８；１９：３７０−３７３］の使用を含む。
【０００８】
中皮腫の２次治療に承認された薬剤はない。化学療法選択肢は限定されており、ゲムシタビン、ビノレルビンおよび他の葉酸拮抗化合物を含む［Ｚｕｃａｌｉ ＰＡ，Ｃｅｒｅｓｏｌｉ ＧＬ，Ｇａｒａｓｓｉｎｏ Ｉ，Ｄｅ Ｖｉｎｃｅｎｚｏ Ｆ，Ｃａｖｉｎａ Ｒ，Ｃａｍｐａｇｎｏｌｉ Ｅ Ｃａｎｃｅｒ ２００８；１１２（７）：１５５５−１５６１］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｉｒａｏ Ｔ，Ｂｕｅｎｏ Ｒ，Ｃｈｅｎ ＣＪ，Ｇｏｒｄｏｎ ＧＪ，Ｈｅｉｌｉｇ Ｅ，Ｋｅｌｓｅｙ ＫＴ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２００２；２３（７）：１１２７−１１３０
【非特許文献２】Ｗｈｉｔｓｏｎ ＢＡ，Ｋｒａｔｚｋｅ ＲＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｌｅｕｒａｌ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２００６；２３９（２）：１８３−１８９
【非特許文献３】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｎ，Ｔｏｙｏｏｋａ Ｓ，Ｙａｎａｉ Ｈ，Ｓｏｈ Ｊ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｎ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００８ ６２（１）：１２０−５
【非特許文献４】Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｂ，Ｒｅｉｃｈ Ｒ，Ｌａｚａｒｏｖｉｃｉ Ｐ，Ｆｌｏｒｅｎｅｓ ＶＡ，Ｒｉｓｂｅｒｇ Ｂ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｓ，Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；４４（２）：１５９−１６５
【非特許文献５】Ｓｃａｇｌｉｏｔｔｉ ＧＶ，Ｓｈｉｎ ＤＭ，Ｋｉｎｄｌｅｒ ＨＬ，Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅｓ ＭＪ，Ｋｅｐｐｌｅｒ Ｕ，Ｍａｎｅｇｏｌｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３；２１（８）：１５５６−１５６１
【非特許文献６】Ｃａｓｔａｇｎｅｔｏ Ｂ，Ｂｏｔｔａ Ｍ，Ａｉｔｉｎｉ Ｅ，Ｓｐｉｇｎｏ Ｆ，Ｄｅｇｉｏｖａｎｎｉ Ｄ，Ａｌａｂｉｓｏ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２００８；１９：３７０−３７３
【非特許文献７】Ｚｕｃａｌｉ ＰＡ，Ｃｅｒｅｓｏｌｉ ＧＬ，Ｇａｒａｓｓｉｎｏ Ｉ，Ｄｅ Ｖｉｎｃｅｎｚｏ Ｆ，Ｃａｖｉｎａ Ｒ，Ｃａｍｐａｇｎｏｌｉ Ｅ Ｃａｎｃｅｒ ２００８；１１２（７）：１５５５−１５６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
実際に、中皮腫の治療のための新しい強力な薬剤に対して、極めて高度に満たされていない医療上の要求がある。本発明はこの問題に対処する。
【００１１】
本発明は、ＣＤＫおよびチロシンキナーゼ成長因子介在シグナル伝達経路の阻害によって中皮腫の病因に関与する主要な経路のうち２つを阻害することが可能であり、中皮腫増殖の阻害に効果的である、低分子量化合物を提供する。
【００１２】
所望の活性を示す本発明の化合物は、タンパク質キナーゼのＡＴＰポケットを標的とするように設計されたピラゾロキナゾリンである。この化合物は、ＣＤＫの強力なＡＴＰ競合的阻害物質であることが明らかになっている。この化合物は、ＴＲＫＡに対して著しい阻害効力を呈することが見出されている。
【００１３】
本発明の化合物は、この生物活性の観点から、中皮腫に罹患している患者集団の治療法の開発のための新たな方針を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
第１の態様において、本発明は、中皮腫の治療方法で有用な式（Ｉ）の化合物
【００１５】
【化１】
またはこの医薬的に許容される塩に関するものである。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「中皮腫」という用語は、胸膜、腹膜および心膜中皮腫ならびにすべての組織学的カテゴリ：上皮様、肉腫様および混合／２相性を含む。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物は、化学名８−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−１，４，４−トリメチル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｈ］キナゾリン−３−カルボン酸メチルアミドを有する。この化合物はＷＯ２００４１０４００７に記載されているように調製することが可能であり、プロテインキナーゼ阻害活性が与えられており、従って抗腫瘍剤として療法で有用である。特に式（Ｉ）の化合物の好ましい調製は、上掲の国際特許出願の実施例５８に記載されている。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容される塩は、無機酸または有機酸、例えば硝酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、過塩素酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸およびサリチル酸などによる酸添加塩を含む。
【００１９】
式（Ｉ）の化合物の考えられるすべての異性体およびこの混合物ならびに代謝産物および医薬的に許容されるバイオ前駆体（そうでなければプロドラッグと呼ばれる。）の両方は、請求される発明の範囲内である。プロドラッグは、インビボで式（Ｉ）による活性親ドラッグを放出する、任意の共有結合された化合物である。
【００２０】
式（Ｉ）による化合物の治療的有効量は、対象が前記化合物を用いた治療により効果を得る疾患または望ましくない状態を有すると決定されたときに、対象に投与され得る。医療または臨床従事者は、対象の疾患または状態の診断の一部として決定を下し得る。この化合物は、対照が状態の１つ以上を有する確率の低下として見なされ得る、このような状態の予防に使用され得る。
【００２１】
本明細書で使用する場合、化合物の「治療的有効量」は、この所期の目的を達成するのに十分な量を指す。有効量の決定は、所望の効果の達成に基づいて、十分に当業者の能力の範囲内である。有効量は、これに限定されるわけではないが、対象のサイズおよび／または対象が罹患している疾患もしくは望ましくない状態が進行した程度を含む因子に依存する。有効量は、化合物が対象に単回投薬量でまたは定期的に長期にわたって投与されるか否かにも依存する。
【００２２】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、対象の治療を目的としている。本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を含む。哺乳動物の例は、これに限定されるわけではないが、哺乳動物のクラスの任意のメンバー：ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種；農場動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；愛玩動物、例えばウサギ、イヌおよびネコ；げっ歯類、例えばラット、マウスおよびモルモットを含む実験動物などを含む。非哺乳動物の例は、これに限定されるわけではないが、鳥類、魚類などを含む。
【００２３】
「治療すること」という用語は、本明細書で使用する場合、治療上の効果を達成することを含む。治療上の効果とは、治療している根底にある疾患の根絶または改善を意味する。例えば癌患者において、治療上の効果は根底にある癌の根絶または改善を含む。また治療上の効果は、患者が根底にある疾患になお罹患しているかもしれないという事実にもかかわらず、患者に改善が見られるような、根底にある疾患に関連する生理的症状の１つ以上の根絶または改善によって達成される。
【００２４】
本発明の別の目的は、悪性中皮腫を治療する方法に用いる、（ａ）上で定義した式（Ｉ）の化合物および（ｂ）１つ以上の細胞傷害性または細胞増殖抑制性化学剤を含む治療的組合せである。
【００２５】
例示的な細胞増殖抑制性または細胞傷害性化学剤は、アルキル化剤、アルキル化様剤（即ち白金誘導体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン）、代謝拮抗剤（例えばペメトレキセド）、微小管阻害剤、ホルモン剤、免疫剤、インターフェロンタイプ剤、シクロオキシゲナーゼ阻害物質（例えばＣＯＸ−２阻害物質）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質、テロメラーゼ阻害物質、チロシンキナーゼ阻害物質、抗成長因子受容体剤、抗ＨＥＲ剤、抗ＥＧＦＲ剤、抗血管新生剤（例えば血管新生阻害物質）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害物質、ｒａｓ−ｒａｆシグナル伝達経路阻害物質、細胞周期阻害物質、他のｃｄｋ阻害物質、チューブリン結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害物質、トポイソメラーゼＩＩ阻害物質などを含む。
【００２６】
特に好ましい実施形態において、本発明は、悪性中皮腫を治療する方法に用いる、上記で定義した式（Ｉ）の化合物、白金誘導体およびペメトレキセドを含む治療的組合せを提供する。
【００２７】
本発明は、悪性中皮腫の治療に使用するための、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合された上で定義した式（Ｉ）の化合物を含む、医薬組成物にも関する。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明による医薬組成物は、１つ以上の細胞傷害性または細胞増殖抑制性剤をさらに含む。
【００２９】
特に好ましい実施形態において、本発明は、悪性中皮腫を治療する方法に用いる、上記に定義した式（Ｉ）の化合物、白金誘導体およびペメトレキセドを含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、通常は従来の方法に従って調製され、好適な医薬形で投与される。
【００３１】
例えば固体経口形は、活性化合物と共に、希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、スクロース、セルロース、コーンスターチもしくはジャガイモデンプン；潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、および／またはポリエチレングリコール；結合剤、例えばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはグリコール酸デンプンナトリウム；発泡混合物；染料；甘味料；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩；ならびに概して、医薬配合物で使用される非毒性および薬理的に不活性な物質を含有し得る。これらの医薬調製物は公知の方式で、例えば混合、造粒、打錠、糖衣、またはフィルムコートのプロセスによって製造され得る。
【００３２】
経口投与用の液体分散剤は例えばシロップ剤、乳剤または懸濁剤であり得る。
【００３３】
一例として、シロップ剤は担体として、サッカロースもしくはグリセリンを含むサッカロースならびに／またはマンニトールおよびソルビトールを含有し得る。
【００３４】
懸濁剤および乳剤は、担体の例として、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルアルコールを含有し得る。
【００３５】
治療用途では、式（Ｉ）の化合物は対象に１日に付き約１０ｍｇ／ｍ２体表から約４００ｍｇ／ｍ２体表の投薬レベルで投与される。約２０ｍｇ／ｍ２から２００ｍｇ／ｍ２の投薬レベルは、特に好適な範囲を構成する。ヒト成人対象では、１から２８の連続日での約２０ｍｇから約８００ｍｇ／用量、さらに好ましくは約４０ｍｇから約４００ｍｇ／用量の投薬量が非制限的な例として使用され得る。好ましい治療スケジュールは、２週間サイクルで７日間の治療日にわたる１５０ｍｇ／日の用量と、続いての７日間の休止から成る。サイクルは、疾患を制御するために要求される限り反復することができる。
【００３６】
本明細書で開示した用量よりも多いまたは少ない用量が必要に応じて使用されてもよい。しかしこのような投薬量は、使用する化合物の活性、治療する状態、投与方法、治療レジメン、個々の対象の要求、治療する状態の重症度および医師の判断に限定されない、幾つかの変動要因に応じて変更され得る。上の範囲が単に示唆であるのは、個々の治療レジメに関する変動要因の数が多く、これらの推奨値からかなり逸脱することは珍しくないためである。
【００３７】
本発明をいずれの制限も加えずにさらに説明する目的で、ここで以下の実施例を与える。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＭＳＴＯ−２１１Ｈ株化細胞における細胞周期進行に対する効果およびアポトーシスの誘発を評価するための、未治療細胞（Ｃ）および式（Ｉ）の化合物の２種類の用量（１および３μＭ）で治療した細胞（Ｔ）の細胞蛍光プロフィールを示す。
【図２】未治療細胞（Ｃ）および式（Ｉ）の化合物の２種類の用量（１および３μＭ）で治療した細胞（Ｔ）におけるタンパク質発現を示す。ホスホリル化Ｒｂタンパク質（ＣＤＫ２の直接基質）の量、サイクリンＡおよびｃｄｃ６（細胞周期進行の制御に関与するタンパク質）の量ならびにホスホリル化ＡＫＴ；ホスホリル化Ｓ６；ホスホリル化ｐ４４／４２ＭＡＰＫおよび全ｐ４４／４２ＭＡＰＫの量を評価して示した。
【００３９】
実施例
【実施例１】
【００４０】
キナーゼのシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）の構成
このアッセイにより、試験化合物によって得た特異的酵素のキナーゼ活性の阻害の測定が可能となる。異なるキナーゼを並行して試験することができる。
【００４１】
ビオチン化基質は、γ３３−ＡＴＰトレーサを含むＡＴＰの存在下で特異的キナーゼによってトランスホスホリル化される。反応の終りに、ホスホリル化基質を次にストレプトアビジンコートＳＰＡビーズを使用して捕捉する。高濃度の５Ｍ ＣｓＣｌ溶液を添加して、混合物を４時間インキュベートする。このことによりＳＰＡビーズは、取込まれていない放射性標識ＡＴＰを含有するＣｓＣｌ溶液の上部に浮遊する。
【００４２】
βカウンタを使用して、ホスホリル化の程度を測定する。これらのアッセイにおいて、式（Ｉ）の化合物は、ＣＤＫ２／サイクリンＡ複合体（ＩＣ５０＝４５ｎＭ）に対して強力な阻害活性を示し、密接に関連するＣＤＫ、即ちＣＤＫ１、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ５（それぞれＩＣ５０＝３９８、１６０および２６５ｎＭ）に対しても活性を示すが、トロポミオシン（Ｔｈｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ）受容体キナーゼＡ（ＴＲＫＡ）（ＩＣ５０＝５３ｎＭ）に対しては活性を示さなかった。
【実施例２】
【００４３】
インビトロでの中皮腫細胞中の式（Ｉ）の化合物の効果
ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２０５２およびＮＣＩ−Ｈ２８中皮腫株化細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ １６４０中で培養した。すべての実験で、細胞を化合物によって規定の期間治療した翌日に１×１０４／ｃｍ２の密度で播種して、次に報告された時間に収集した。
【００４４】
細胞増殖の阻害
治療の７２時間後に細胞を洗浄およびカウントした。細胞増殖を細胞アデノシン３リン酸監視システムによって判定した。細胞増殖を対象細胞と比較した。細胞増殖を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【００４５】
細胞周期進行およびアポトーシス誘発の分析
細胞を治療の２４時間後に洗浄して、冷メタノール７０％によって固定し、−２０℃にて貯蔵した。固定した細胞をＰＢＳで洗浄してメタノールを除去し、２５μ／ｍＬヨウ化プロピジウム、５μｇ／ｍＬ ＲＮアーゼ、および０．１２５μｇ／ｍＬノニデットＰ４０で染色した。細胞を暗所で６０分間室温に維持して、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ４コンピュータにインタフェースされたＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）システムによって、ＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）３．３ソフトウェアを用いて分析した。すべてのダブレットまたは凝集体をＦＬ３−Ａ／ＦＬ３−Ｗドットプロットに基づく適切なゲートによる分析の間に除去して、１０，０００個以上のゲート細胞でＤＮＡ含有量分析を行った。ＤＮＡヒストグラム（図１に示す。）は、ＭｏｄＦｉｔ ＬＴ（商標）を使用して分析した。
【００４６】
例として、図１に示すように、細胞周期進行は式（Ｉ）の化合物に影響を受け、１μＭで治療した細胞における明白なＧ１ブロックおよび３μＭで治療した細胞におけるサブＧ１ピークの上昇（アポトーシスの誘発）を生じる。
【００４７】
これらのアッセイの結果も表１に報告する。式（Ｉ）の化合物は、試験したすべての中皮腫細胞（第１列）で活性であった：０．２３から１．５６μＭの範囲にて増殖をＩＣ５０で阻害することが可能であり（第２列）、サブＧ１ ＤＮＡ含有量による細胞のパーセンテージの細胞蛍光分析によって測定されたようにアポトーシスを誘発することも可能であった（第３列）。
【００４８】
【表１】
【実施例３】
【００４９】
ウェスタンブロット分析による式（Ｉ）の化合物の作用機序の評価
治療した細胞を、ＳＤＳ試料緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、５％ ＳＤＳ）を添加することによって溶解させた。試料を９５℃に５分間加熱して、次にＵｌｔｒａｓｏｎｉｃ ２０００ ＡＲＴＥＫを使用して超音波処理した。溶解させた細胞を１３，０００ＲＰＭにて１０分間、遠心分離した。ＢＣＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）およびＢＳＡ標準曲線を使用してタンパク質定量を決定した。タンパク質抽出物２０μｇ／ウェルを添加して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル７．５から１０％（ＰＡＧＥ−ＰＬＵＳ ４０％コンセントレートＡＭＲＥＳＣＯ）によって分離した。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．３、１９２ｍＭグリシンおよび２０％メタノールを含有する緩衝液中のニトロセルロースフィルタ（Ｈｙｂｏｎｄ Ａｍｅｒｓｈａｍ）にゲルをブロットした。フィルタは、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％低脂肪乳で室温にて２時間飽和させて、次に１次モノクローナルを用いて４℃にて一晩インキュベートして、ＴＢＳ−Ｔ中での洗浄および２次抗マウス抗体を使用するインキュベーションを続けた。「Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ」Ｐｉｅｒｃｅを使用してバンドを描出した。
【００５０】
試験したすべての株化細胞で得られた結果により、式（Ｉ）の化合物が中皮腫の病因に関与する主な経路をどちらも妨害できることが示された。
【００５１】
細胞周期関連マーカーの減少は、試験したすべての中皮腫株化細胞で観察される。図２は例として、２４時間治療したＮＣＩ−Ｈ２８細胞（ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａに変異）における、式（Ｉ）の化合物の２回の用量によって得た結果を示す。Ｒｂホスホリル化ならびにサイクリンＡおよびｃｄｃ６発現の強力な阻害が明らかである。
【００５２】
式（Ｉ）の化合物がチロシンキナーゼ成長因子受容体が介在する経路も阻害する能力も評価された。ＮＣＩ−Ｈ２８細胞でのＡＫＴ；Ｓ６およびＭＡＰＫのホスホリル化の阻害も図２で報告されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子量ＡＴＰ競合的ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害物質の使用による、中皮腫患者の治療に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
悪性中皮腫は、アスベスト曝露に関連した局所浸潤性で急性致死的な腫瘍性疾患である。
【０００３】
中皮腫の転帰に寄与する多くの遺伝的欠陥がある。ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害物質２Ａ）のホモ接合体欠失は、中皮腫の約７５％に見出され、この癌における最も一般的な遺伝子変化であり得る［Ｈｉｒａｏ Ｔ，Ｂｕｅｎｏ Ｒ，Ｃｈｅｎ ＣＪ，Ｇｏｒｄｏｎ ＧＪ，Ｈｅｉｌｉｇ Ｅ，Ｋｅｌｓｅｙ ＫＴ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２００２；２３（７）：１１２７−１１３０；Ｗｈｉｔｓｏｎ ＢＡ，Ｋｒａｔｚｋｅ ＲＡ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２００６；２３９（２）：１８３−１８９］。予後に関して、ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａの損失は、中皮腫のより高悪性度の臨床的挙動と関連している［Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｎ，Ｔｏｙｏｏｋａ Ｓ，Ｙａｎａｉ Ｈ，Ｓｏｈ Ｊ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｎ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００８ ６２（１）：１２０−５；Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｂ，Ｒｅｉｃｈ Ｒ，Ｌａｚａｒｏｖｉｃｉ Ｐ，Ｆｌｏｒｅｎｅｓ ＶＡ，Ｒｉｓｂｅｒｇ Ｂ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｓ，Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；４４（２）：１５９−１６５］。
【０００４】
ｐ１６タンパク質は、サイクリン依存性キナーゼを阻害することによって、Ｇ１期における細胞周期停止を引き起こす。ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａの欠乏の結果として、Ｇ１／Ｓチェックポイント制御が失われ、網膜芽細胞腫抑制因子（ｐＲｂ）の過剰リン酸化およびＳ期への細胞進行が生じる。
【０００５】
さらにトロポミオシン（Ｔｈｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ）受容体キナーゼＡ（ＴＲＫＡ）もこの疾患の生物学において重大な役割を果たす。実際に、活性化ＴＲＫＡ（Ｐ−ＴＲＫＡ）の高頻度発現は悪性中皮腫で頻繁に見出され、主に滲出液に、および腹膜病変、若年患者に出現する腫瘍に見られる［Ｗｈｉｔｓｏｎ ＢＡ，Ｋｒａｔｚｋｅ ＲＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｌｅｕｒａｌ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２００６；２３９（２）：１８３−１８９］。
【０００６】
世界の中皮腫の発生率は上昇しており、外科的切除により効果を得られる患者はごくわずかである。治癒的切除が適用されない患者では、全生存期間中央値はおよそ６から７ヶ月である。治療選択肢は限定されている。大半の患者は、治療されても治療されなくても、局部疾患からの合併症で死亡する。単剤としてまたは組合せて販売されている化学治療剤は、生存に著しい影響を及ぼせないことが判明した。
【０００７】
現在の治療選択肢は、１４．１％の中程度の奏功率および１０．７ヶ月の全生存期間中央値を示した、単剤としてのペメトレキセド（商標アリムタ（登録商標）として販売）［Ｓｃａｇｌｉｏｔｔｉ ＧＶ，Ｓｈｉｎ ＤＭ，Ｋｉｎｄｌｅｒ ＨＬ，Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅｓ ＭＪ，Ｋｅｐｐｌｅｒ Ｕ，Ｍａｎｅｇｏｌｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３；２１（８）：１５５６−１５６１］またはペメトレキセドを含む白金誘導体（シスプラチンまたはカルボプラチン）との組合せ［Ｃａｓｔａｇｎｅｔｏ Ｂ，Ｂｏｔｔａ Ｍ，Ａｉｔｉｎｉ Ｅ，Ｓｐｉｇｎｏ Ｆ，Ｄｅｇｉｏｖａｎｎｉ Ｄ，Ａｌａｂｉｓｏ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２００８；１９：３７０−３７３］の使用を含む。
【０００８】
中皮腫の２次治療に承認された薬剤はない。化学療法選択肢は限定されており、ゲムシタビン、ビノレルビンおよび他の葉酸拮抗化合物を含む［Ｚｕｃａｌｉ ＰＡ，Ｃｅｒｅｓｏｌｉ ＧＬ，Ｇａｒａｓｓｉｎｏ Ｉ，Ｄｅ Ｖｉｎｃｅｎｚｏ Ｆ，Ｃａｖｉｎａ Ｒ，Ｃａｍｐａｇｎｏｌｉ Ｅ Ｃａｎｃｅｒ ２００８；１１２（７）：１５５５−１５６１］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｉｒａｏ Ｔ，Ｂｕｅｎｏ Ｒ，Ｃｈｅｎ ＣＪ，Ｇｏｒｄｏｎ ＧＪ，Ｈｅｉｌｉｇ Ｅ，Ｋｅｌｓｅｙ ＫＴ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２００２；２３（７）：１１２７−１１３０
【非特許文献２】Ｗｈｉｔｓｏｎ ＢＡ，Ｋｒａｔｚｋｅ ＲＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｌｅｕｒａｌ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２００６；２３９（２）：１８３−１８９
【非特許文献３】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｎ，Ｔｏｙｏｏｋａ Ｓ，Ｙａｎａｉ Ｈ，Ｓｏｈ Ｊ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｎ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００８ ６２（１）：１２０−５
【非特許文献４】Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｂ，Ｒｅｉｃｈ Ｒ，Ｌａｚａｒｏｖｉｃｉ Ｐ，Ｆｌｏｒｅｎｅｓ ＶＡ，Ｒｉｓｂｅｒｇ Ｂ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｓ，Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；４４（２）：１５９−１６５
【非特許文献５】Ｓｃａｇｌｉｏｔｔｉ ＧＶ，Ｓｈｉｎ ＤＭ，Ｋｉｎｄｌｅｒ ＨＬ，Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅｓ ＭＪ，Ｋｅｐｐｌｅｒ Ｕ，Ｍａｎｅｇｏｌｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３；２１（８）：１５５６−１５６１
【非特許文献６】Ｃａｓｔａｇｎｅｔｏ Ｂ，Ｂｏｔｔａ Ｍ，Ａｉｔｉｎｉ Ｅ，Ｓｐｉｇｎｏ Ｆ，Ｄｅｇｉｏｖａｎｎｉ Ｄ，Ａｌａｂｉｓｏ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２００８；１９：３７０−３７３
【非特許文献７】Ｚｕｃａｌｉ ＰＡ，Ｃｅｒｅｓｏｌｉ ＧＬ，Ｇａｒａｓｓｉｎｏ Ｉ，Ｄｅ Ｖｉｎｃｅｎｚｏ Ｆ，Ｃａｖｉｎａ Ｒ，Ｃａｍｐａｇｎｏｌｉ Ｅ Ｃａｎｃｅｒ ２００８；１１２（７）：１５５５−１５６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
実際に、中皮腫の治療のための新しい強力な薬剤に対して、極めて高度に満たされていない医療上の要求がある。本発明はこの問題に対処する。
【００１１】
本発明は、ＣＤＫおよびチロシンキナーゼ成長因子介在シグナル伝達経路の阻害によって中皮腫の病因に関与する主要な経路のうち２つを阻害することが可能であり、中皮腫増殖の阻害に効果的である、低分子量化合物を提供する。
【００１２】
所望の活性を示す本発明の化合物は、タンパク質キナーゼのＡＴＰポケットを標的とするように設計されたピラゾロキナゾリンである。この化合物は、ＣＤＫの強力なＡＴＰ競合的阻害物質であることが明らかになっている。この化合物は、ＴＲＫＡに対して著しい阻害効力を呈することが見出されている。
【００１３】
本発明の化合物は、この生物活性の観点から、中皮腫に罹患している患者集団の治療法の開発のための新たな方針を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
第１の態様において、本発明は、中皮腫の治療方法で有用な式（Ｉ）の化合物
【００１５】
【化１】
またはこの医薬的に許容される塩に関するものである。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「中皮腫」という用語は、胸膜、腹膜および心膜中皮腫ならびにすべての組織学的カテゴリ：上皮様、肉腫様および混合／２相性を含む。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物は、化学名８−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−１，４，４−トリメチル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｈ］キナゾリン−３−カルボン酸メチルアミドを有する。この化合物はＷＯ２００４１０４００７に記載されているように調製することが可能であり、プロテインキナーゼ阻害活性が与えられており、従って抗腫瘍剤として療法で有用である。特に式（Ｉ）の化合物の好ましい調製は、上掲の国際特許出願の実施例５８に記載されている。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容される塩は、無機酸または有機酸、例えば硝酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、過塩素酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸およびサリチル酸などによる酸添加塩を含む。
【００１９】
式（Ｉ）の化合物の考えられるすべての異性体およびこの混合物ならびに代謝産物および医薬的に許容されるバイオ前駆体（そうでなければプロドラッグと呼ばれる。）の両方は、請求される発明の範囲内である。プロドラッグは、インビボで式（Ｉ）による活性親ドラッグを放出する、任意の共有結合された化合物である。
【００２０】
式（Ｉ）による化合物の治療的有効量は、対象が前記化合物を用いた治療により効果を得る疾患または望ましくない状態を有すると決定されたときに、対象に投与され得る。医療または臨床従事者は、対象の疾患または状態の診断の一部として決定を下し得る。この化合物は、対照が状態の１つ以上を有する確率の低下として見なされ得る、このような状態の予防に使用され得る。
【００２１】
本明細書で使用する場合、化合物の「治療的有効量」は、この所期の目的を達成するのに十分な量を指す。有効量の決定は、所望の効果の達成に基づいて、十分に当業者の能力の範囲内である。有効量は、これに限定されるわけではないが、対象のサイズおよび／または対象が罹患している疾患もしくは望ましくない状態が進行した程度を含む因子に依存する。有効量は、化合物が対象に単回投薬量でまたは定期的に長期にわたって投与されるか否かにも依存する。
【００２２】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、対象の治療を目的としている。本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を含む。哺乳動物の例は、これに限定されるわけではないが、哺乳動物のクラスの任意のメンバー：ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種；農場動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；愛玩動物、例えばウサギ、イヌおよびネコ；げっ歯類、例えばラット、マウスおよびモルモットを含む実験動物などを含む。非哺乳動物の例は、これに限定されるわけではないが、鳥類、魚類などを含む。
【００２３】
「治療すること」という用語は、本明細書で使用する場合、治療上の効果を達成することを含む。治療上の効果とは、治療している根底にある疾患の根絶または改善を意味する。例えば癌患者において、治療上の効果は根底にある癌の根絶または改善を含む。また治療上の効果は、患者が根底にある疾患になお罹患しているかもしれないという事実にもかかわらず、患者に改善が見られるような、根底にある疾患に関連する生理的症状の１つ以上の根絶または改善によって達成される。
【００２４】
本発明の別の目的は、悪性中皮腫を治療する方法に用いる、（ａ）上で定義した式（Ｉ）の化合物および（ｂ）１つ以上の細胞傷害性または細胞増殖抑制性化学剤を含む治療的組合せである。
【００２５】
例示的な細胞増殖抑制性または細胞傷害性化学剤は、アルキル化剤、アルキル化様剤（即ち白金誘導体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン）、代謝拮抗剤（例えばペメトレキセド）、微小管阻害剤、ホルモン剤、免疫剤、インターフェロンタイプ剤、シクロオキシゲナーゼ阻害物質（例えばＣＯＸ−２阻害物質）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質、テロメラーゼ阻害物質、チロシンキナーゼ阻害物質、抗成長因子受容体剤、抗ＨＥＲ剤、抗ＥＧＦＲ剤、抗血管新生剤（例えば血管新生阻害物質）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害物質、ｒａｓ−ｒａｆシグナル伝達経路阻害物質、細胞周期阻害物質、他のｃｄｋ阻害物質、チューブリン結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害物質、トポイソメラーゼＩＩ阻害物質などを含む。
【００２６】
特に好ましい実施形態において、本発明は、悪性中皮腫を治療する方法に用いる、上記で定義した式（Ｉ）の化合物、白金誘導体およびペメトレキセドを含む治療的組合せを提供する。
【００２７】
本発明は、悪性中皮腫の治療に使用するための、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合された上で定義した式（Ｉ）の化合物を含む、医薬組成物にも関する。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明による医薬組成物は、１つ以上の細胞傷害性または細胞増殖抑制性剤をさらに含む。
【００２９】
特に好ましい実施形態において、本発明は、悪性中皮腫を治療する方法に用いる、上記に定義した式（Ｉ）の化合物、白金誘導体およびペメトレキセドを含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、通常は従来の方法に従って調製され、好適な医薬形で投与される。
【００３１】
例えば固体経口形は、活性化合物と共に、希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、スクロース、セルロース、コーンスターチもしくはジャガイモデンプン；潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、および／またはポリエチレングリコール；結合剤、例えばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはグリコール酸デンプンナトリウム；発泡混合物；染料；甘味料；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩；ならびに概して、医薬配合物で使用される非毒性および薬理的に不活性な物質を含有し得る。これらの医薬調製物は公知の方式で、例えば混合、造粒、打錠、糖衣、またはフィルムコートのプロセスによって製造され得る。
【００３２】
経口投与用の液体分散剤は例えばシロップ剤、乳剤または懸濁剤であり得る。
【００３３】
一例として、シロップ剤は担体として、サッカロースもしくはグリセリンを含むサッカロースならびに／またはマンニトールおよびソルビトールを含有し得る。
【００３４】
懸濁剤および乳剤は、担体の例として、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルアルコールを含有し得る。
【００３５】
治療用途では、式（Ｉ）の化合物は対象に１日に付き約１０ｍｇ／ｍ２体表から約４００ｍｇ／ｍ２体表の投薬レベルで投与される。約２０ｍｇ／ｍ２から２００ｍｇ／ｍ２の投薬レベルは、特に好適な範囲を構成する。ヒト成人対象では、１から２８の連続日での約２０ｍｇから約８００ｍｇ／用量、さらに好ましくは約４０ｍｇから約４００ｍｇ／用量の投薬量が非制限的な例として使用され得る。好ましい治療スケジュールは、２週間サイクルで７日間の治療日にわたる１５０ｍｇ／日の用量と、続いての７日間の休止から成る。サイクルは、疾患を制御するために要求される限り反復することができる。
【００３６】
本明細書で開示した用量よりも多いまたは少ない用量が必要に応じて使用されてもよい。しかしこのような投薬量は、使用する化合物の活性、治療する状態、投与方法、治療レジメン、個々の対象の要求、治療する状態の重症度および医師の判断に限定されない、幾つかの変動要因に応じて変更され得る。上の範囲が単に示唆であるのは、個々の治療レジメに関する変動要因の数が多く、これらの推奨値からかなり逸脱することは珍しくないためである。
【００３７】
本発明をいずれの制限も加えずにさらに説明する目的で、ここで以下の実施例を与える。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＭＳＴＯ−２１１Ｈ株化細胞における細胞周期進行に対する効果およびアポトーシスの誘発を評価するための、未治療細胞（Ｃ）および式（Ｉ）の化合物の２種類の用量（１および３μＭ）で治療した細胞（Ｔ）の細胞蛍光プロフィールを示す。
【図２】未治療細胞（Ｃ）および式（Ｉ）の化合物の２種類の用量（１および３μＭ）で治療した細胞（Ｔ）におけるタンパク質発現を示す。ホスホリル化Ｒｂタンパク質（ＣＤＫ２の直接基質）の量、サイクリンＡおよびｃｄｃ６（細胞周期進行の制御に関与するタンパク質）の量ならびにホスホリル化ＡＫＴ；ホスホリル化Ｓ６；ホスホリル化ｐ４４／４２ＭＡＰＫおよび全ｐ４４／４２ＭＡＰＫの量を評価して示した。
【００３９】
実施例
【実施例１】
【００４０】
キナーゼのシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）の構成
このアッセイにより、試験化合物によって得た特異的酵素のキナーゼ活性の阻害の測定が可能となる。異なるキナーゼを並行して試験することができる。
【００４１】
ビオチン化基質は、γ３３−ＡＴＰトレーサを含むＡＴＰの存在下で特異的キナーゼによってトランスホスホリル化される。反応の終りに、ホスホリル化基質を次にストレプトアビジンコートＳＰＡビーズを使用して捕捉する。高濃度の５Ｍ ＣｓＣｌ溶液を添加して、混合物を４時間インキュベートする。このことによりＳＰＡビーズは、取込まれていない放射性標識ＡＴＰを含有するＣｓＣｌ溶液の上部に浮遊する。
【００４２】
βカウンタを使用して、ホスホリル化の程度を測定する。これらのアッセイにおいて、式（Ｉ）の化合物は、ＣＤＫ２／サイクリンＡ複合体（ＩＣ５０＝４５ｎＭ）に対して強力な阻害活性を示し、密接に関連するＣＤＫ、即ちＣＤＫ１、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ５（それぞれＩＣ５０＝３９８、１６０および２６５ｎＭ）に対しても活性を示すが、トロポミオシン（Ｔｈｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ）受容体キナーゼＡ（ＴＲＫＡ）（ＩＣ５０＝５３ｎＭ）に対しては活性を示さなかった。
【実施例２】
【００４３】
インビトロでの中皮腫細胞中の式（Ｉ）の化合物の効果
ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２０５２およびＮＣＩ−Ｈ２８中皮腫株化細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ １６４０中で培養した。すべての実験で、細胞を化合物によって規定の期間治療した翌日に１×１０４／ｃｍ２の密度で播種して、次に報告された時間に収集した。
【００４４】
細胞増殖の阻害
治療の７２時間後に細胞を洗浄およびカウントした。細胞増殖を細胞アデノシン３リン酸監視システムによって判定した。細胞増殖を対象細胞と比較した。細胞増殖を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【００４５】
細胞周期進行およびアポトーシス誘発の分析
細胞を治療の２４時間後に洗浄して、冷メタノール７０％によって固定し、−２０℃にて貯蔵した。固定した細胞をＰＢＳで洗浄してメタノールを除去し、２５μ／ｍＬヨウ化プロピジウム、５μｇ／ｍＬ ＲＮアーゼ、および０．１２５μｇ／ｍＬノニデットＰ４０で染色した。細胞を暗所で６０分間室温に維持して、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ４コンピュータにインタフェースされたＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）システムによって、ＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）３．３ソフトウェアを用いて分析した。すべてのダブレットまたは凝集体をＦＬ３−Ａ／ＦＬ３−Ｗドットプロットに基づく適切なゲートによる分析の間に除去して、１０，０００個以上のゲート細胞でＤＮＡ含有量分析を行った。ＤＮＡヒストグラム（図１に示す。）は、ＭｏｄＦｉｔ ＬＴ（商標）を使用して分析した。
【００４６】
例として、図１に示すように、細胞周期進行は式（Ｉ）の化合物に影響を受け、１μＭで治療した細胞における明白なＧ１ブロックおよび３μＭで治療した細胞におけるサブＧ１ピークの上昇（アポトーシスの誘発）を生じる。
【００４７】
これらのアッセイの結果も表１に報告する。式（Ｉ）の化合物は、試験したすべての中皮腫細胞（第１列）で活性であった：０．２３から１．５６μＭの範囲にて増殖をＩＣ５０で阻害することが可能であり（第２列）、サブＧ１ ＤＮＡ含有量による細胞のパーセンテージの細胞蛍光分析によって測定されたようにアポトーシスを誘発することも可能であった（第３列）。
【００４８】
【表１】
【実施例３】
【００４９】
ウェスタンブロット分析による式（Ｉ）の化合物の作用機序の評価
治療した細胞を、ＳＤＳ試料緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、５％ ＳＤＳ）を添加することによって溶解させた。試料を９５℃に５分間加熱して、次にＵｌｔｒａｓｏｎｉｃ ２０００ ＡＲＴＥＫを使用して超音波処理した。溶解させた細胞を１３，０００ＲＰＭにて１０分間、遠心分離した。ＢＣＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）およびＢＳＡ標準曲線を使用してタンパク質定量を決定した。タンパク質抽出物２０μｇ／ウェルを添加して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル７．５から１０％（ＰＡＧＥ−ＰＬＵＳ ４０％コンセントレートＡＭＲＥＳＣＯ）によって分離した。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．３、１９２ｍＭグリシンおよび２０％メタノールを含有する緩衝液中のニトロセルロースフィルタ（Ｈｙｂｏｎｄ Ａｍｅｒｓｈａｍ）にゲルをブロットした。フィルタは、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％低脂肪乳で室温にて２時間飽和させて、次に１次モノクローナルを用いて４℃にて一晩インキュベートして、ＴＢＳ−Ｔ中での洗浄および２次抗マウス抗体を使用するインキュベーションを続けた。「Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ」Ｐｉｅｒｃｅを使用してバンドを描出した。
【００５０】
試験したすべての株化細胞で得られた結果により、式（Ｉ）の化合物が中皮腫の病因に関与する主な経路をどちらも妨害できることが示された。
【００５１】
細胞周期関連マーカーの減少は、試験したすべての中皮腫株化細胞で観察される。図２は例として、２４時間治療したＮＣＩ−Ｈ２８細胞（ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａに変異）における、式（Ｉ）の化合物の２回の用量によって得た結果を示す。Ｒｂホスホリル化ならびにサイクリンＡおよびｃｄｃ６発現の強力な阻害が明らかである。
【００５２】
式（Ｉ）の化合物がチロシンキナーゼ成長因子受容体が介在する経路も阻害する能力も評価された。ＮＣＩ−Ｈ２８細胞でのＡＫＴ；Ｓ６およびＭＡＰＫのホスホリル化の阻害も図２で報告されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性中皮腫を治療する方法に用いる、式（Ｉ）
【化１】
の化合物またはこの医薬的に許容される塩。
【請求項２】
悪性中皮腫を治療する方法に用いる、（ａ）請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物および（ｂ）１つ以上の細胞傷害性または細胞増殖抑制性化学剤を含む治療的組合せ。
【請求項３】
化学剤がペメトレキセドおよび白金誘導体である、請求項２に記載の治療的組合せ。
【請求項４】
悪性中皮腫の治療に用いる、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合された請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物。
【請求項５】
悪性中皮腫を治療する方法に用いる、一種または複数の細胞傷害性または細胞増殖抑制性化学剤をさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
化学剤がペメトレキセドおよび白金誘導体である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１】
悪性中皮腫を治療する方法に用いる、式（Ｉ）
【化１】
の化合物またはこの医薬的に許容される塩。
【請求項２】
悪性中皮腫を治療する方法に用いる、（ａ）請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物および（ｂ）１つ以上の細胞傷害性または細胞増殖抑制性化学剤を含む治療的組合せ。
【請求項３】
化学剤がペメトレキセドおよび白金誘導体である、請求項２に記載の治療的組合せ。
【請求項４】
悪性中皮腫の治療に用いる、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合された請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物。
【請求項５】
悪性中皮腫を治療する方法に用いる、一種または複数の細胞傷害性または細胞増殖抑制性化学剤をさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
化学剤がペメトレキセドおよび白金誘導体である、請求項５に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５０９８５９（Ｐ２０１２−５０９８５９Ａ）
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３６８８９（Ｐ２０１１−５３６８８９）
【出願日】平成２１年１１月２３日（２００９．１１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５６４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５８００６
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（３０７０１２４０３）ネルビアーノ・メデイカル・サイエンシーズ・エツセ・エルレ・エルレ (55)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２３日（２００９．１１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５６４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５８００６
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（３０７０１２４０３）ネルビアーノ・メデイカル・サイエンシーズ・エツセ・エルレ・エルレ (55)
【Ｆターム（参考）】
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