二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法
【課題】二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の位置特異的に酸化する酵素を用いることにより新規な二環芳香族ヒドロキシカルボン酸を効率的に生産する方法を開発すること、及び、該方法によって新規な二環芳香族ヒドロキシカルボン酸を開発すること。
【解決手段】本発明は、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼと二環芳香族カルボン酸とを反応させるステップを含む、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供する。前記二環芳香族カルボン酸は、２−ナフトエ酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、インドール−２−カルボン酸、インドール−６−カルボン酸及びキノリン−６−カルボン酸からなるグループから選択される場合がある。前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼは、配列番号１０又は１２のアミノ酸配列からなるタンパク質の場合がある。
【解決手段】本発明は、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼと二環芳香族カルボン酸とを反応させるステップを含む、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供する。前記二環芳香族カルボン酸は、２−ナフトエ酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、インドール−２−カルボン酸、インドール−６−カルボン酸及びキノリン−６−カルボン酸からなるグループから選択される場合がある。前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼは、配列番号１０又は１２のアミノ酸配列からなるタンパク質の場合がある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法と、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸を含む新規蛍光色素と、新規二環芳香族ヒドロキシカルボン酸とに関する。
【背景技術】
【０００２】
二環芳香族ヒドロキシカルボン酸は、医薬品、染料、ＥＬ素子、ポリマー等の原料として産業的に有用である。とくにヒドロキシ−２−ナフトエ酸（Ｈｙ２ＮＡ）は有用であり、そのうち、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸（３Ｈｙ２ＮＡ）と６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸（６Ｈｙ２ＮＡ）は２−ナフトールへのカルボキシル基の導入（コルベ・シュミット反応）により大量生産されており（上野製薬、非特許文献１）、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸（１Ｈｙ２ＮＡ）も和光純薬から試薬として市販されている。しかしながら、他の位置に水酸基が導入されたＨｙ２ＮＡは、その合成法が確立されていないことからも用途開発は進んでいないと考えられる。
【０００３】
Ｈｙ２ＮＡを合成する手法として、２−ナフトエ酸（２ＮＡ）に水酸基を導入する手法が最も簡便で工業的にも有効な製造法であり、位置選択性の高い酵素による合成法、特に酸化酵素（モノオキシゲナーゼ）を用いることが効果的である。２ＮＡを変換可能なモノオキシゲナーゼとしては、植物に広く存在するケイ皮酸モノオキシゲナーゼＣＹＰ７３が２ＮＡの６位を酸化して６Ｈｙ２ＮＡを生成することが報告されている（非特許文献２）。また、ブルクホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）由来のモノオキゲナーゼが２ＮＡの１位を酸化して１Ｈｙ２ＮＡを生成することが報告されている（非特許文献３）。しかし、２ＮＡの他の位置を特異的に酸化したＨｙ２ＮＡを生成する酵素は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｅｎｏ−ｆｃ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｈｅｍ０１．ｈｔｍＬ
【非特許文献２】Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２２４， ８３５−８４４ （１９９４）
【非特許文献３】ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ２７３， ２２−２７ （２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸を位置特異的に酸化する酵素を用いることにより新規な二環芳香族ヒドロキシカルボン酸を効率的に生産する方法を開発すること、及び、該方法によって新規な二環芳香族ヒドロキシカルボン酸を開発することが本発明の解決しようとする課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼと二環芳香族カルボン酸とを反応させるステップを含む、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供する。
【０００７】
本発明の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法において、前記二環芳香族カルボン酸は、ナフタレン、インドール及びキノリンのモノカルボン酸の場合がある。
【０００８】
本発明の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法において、前記二環芳香族カルボン酸は、環を構成する炭素原子のうち少なくとも１個に一酸素原子が付加される場合がある。
【０００９】
本発明の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法において、前記二環芳香族カルボン酸は、２−ナフトエ酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、インドール−２−カルボン酸、インドール−６−カルボン酸及びキノリン−６−カルボン酸からなるグループから選択される場合がある。
【００１０】
本発明の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法において、前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼは、（１）配列番号１０又は１２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列と７８％以上、あるいは、９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、あるいは、９０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。
【００１１】
本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結したものである。
【００１２】
本発明の特異的結合タグペプチドは、前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質が二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００１３】
本発明は２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換する酵素を提供する。
【００１４】
本発明は、２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換する酵素組成物を提供する。本発明の酵素組成物は、（１）配列番号１０又は１２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列と７８％以上、あるいは、９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、あるいは、９０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択されるタンパク質を含む。
【００１５】
本発明の酵素組成物は、電子伝達系タンパク質を含む場合がある。
【００１６】
本発明は、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸及び／又はその誘導体を含む、蛍光色素を提供する。
【００１７】
本発明は、本発明の蛍光色素を光透過性媒体に分散した、白色蛍光変換膜を提供する。
【００１８】
本発明は、本発明の白色蛍光変換膜と、発光素子部とからなる白色発光素子を提供する。
【００１９】
本発明は、３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸を提供する。
【００２０】
本発明は、３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸のエステル結合による重合体を提供する。
【００２１】
本発明は、３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸のエステル結合による重合体を含む合成樹脂組成物を提供する。
【００２２】
本発明の製造方法に用いる二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼと、本発明の２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換する酵素組成物に含まれるモノオキシゲナーゼとは、いずれも、いかなる生物種に由来するモノオキシゲナーゼタンパク質であってもよい。前記モノオキシゲナーゼタンパク質は、ダイズ根粒菌ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）等のブラディリゾビウム属根粒菌と、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）等のロドシュードモナス属紅色非硫黄細菌とを含む細菌と、糸状菌又は菌類と、古細菌と、植物と、動物とを含むいずれかの生物から由来する場合がある。本発明のモノオキシゲナーゼは、ダイズ根粒菌ブラディリゾビウム・ジャポニカムＵＳＤＡ１１０のＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＢＡＣ４６３１３、以下、「ＣＹＰ１９９Ａ１」という。）と、ロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９（ＡＴＣＣ登録番号：ＢＡＡ−９８）由来Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＣＡＥ２７３１２、以下、「ＣＹＰ１９９Ａ２」という。）とを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
ＣＹＰ１９９Ａ１遺伝子の１２０９個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号９に列挙され、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質の４０２個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号１０に列挙される。ＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子の１２１８個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号１１に列挙され、ＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の４０５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号１２に列挙される。ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質のアミノ酸配列はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のアミノ酸配列と７８％の相同性を有する。
【００２４】
本発明の２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換する酵素組成物に含まれる電子伝達系タンパク質は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の電子供与体が酸化する際に発生する電子を前記モノオキシゲナーゼに伝達することができることを条件として、いかなる電子伝達系タンパク質を用いてもよい。好ましい電子伝達系タンパク質は、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、ＡＴＣＣ登録番号：１７４５３）由来のプチダレドキシン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ００２５９、以下、「ｐｄｘ」という。）と、プチダレドキシンレダクターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ１６６４０、以下、「ｐｄＲ」という。）と、ロドシュードモナス・パルストリス由来のパルストリスレドキシン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＥ２７３１３、以下、「ｐｕｘ」という。）と、ホウレンソウ由来のフェレドキシン（以下、「Ｆｄｘ」という。）及びフェレドキシンレダクターゼ（以下、「ＦｄＲ」という。）とを含むが、これらに限定されない。Ｆｄｘ及びＦｄＲはともに、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ社から入手可能である（カタログ番号Ｆ３０１３及びＦ６０２８）。
【００２５】
本発明の酵素組成物は、前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼをエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡと、電子伝達系タンパク質のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ及び電子伝達系タンパク質をエンコードするＤＮＡは同一の発現ベクターに組み込まれてもよく、別々の発現ベクターに組み込まれてもよい。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼは補酵素としてヘム鉄を必要とし、本発明の電子伝達系タンパク質のうち、ＰｄＲ及びＦｄＲは補酵素としてフラビンを必要とし、Ｐｄｘ及びＦｄｘは鉄及びイオウを必要とする。前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ及び電子伝達系タンパク質は、それぞれの酵素活性を保持することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法に使用されてもよく、あるいは、精製された状態で前記製造方法に使用されてもよい。
【００２６】
本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較の対象となるアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。同様に、本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較の対象となるヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。
【００２７】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００２８】
本発明の蛍光色素は、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む場合がある。また本発明の蛍光色素は、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の白色の蛍光を実質的に保持することを条件として、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸のいずれかの炭素原子又は酸素原子と共有結合を介して、あるいは、カルボキシル基又は水酸基とイオン結合その他の非共有結合を介して修飾されたいずれかの誘導体又は重合体を含む場合がある。本発明の蛍光色素は、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸のいずれかの誘導体又は重合体とからなるグループから選択される１つ又は２つ以上の物質を含む場合がある。
【００２９】
本明細書において「白色」とは、白色の他、赤、緑及び青の光の三原色が実質的に混合して白色に近い色として視認される蛍光を指す。
【００３０】
本発明の白色蛍光変換膜は、本発明の蛍光色素を光透過性媒体に分散したものである。前記光透過性媒体は、光透過性を有し、かつ膜形成性を有するものであればいかなるものでもかまわない。例えば高分子化合物や無機ガラス、さらには印刷用メジウムなどが用いられる。ここで、高分子化合物としては、例えばポリビニルピロリジノン，ポリアクリロニトリル，ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド），ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド），ポリビニルアルコール，ポリメチルメタクリレート，ポリスチレン，ポリカーボネート，ポリビニルアセテート，ポリ塩化ビニル，ポリブテン，ポリエチレングリコール、及びこれらの共重合体などが挙げられ、また、無機ガラスとしては、例えばホウ酸ガラスやシリカガラスなどが挙げられる。これらの光透過性媒体の中で、特に光透過性，膜形成性，その他物性などの点からポリビニルピロリジノンが好適である。また、本発明においては、上記光透過性媒体のうち１種類を用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
本発明の白色発光素子は、本発明の白色蛍光変換膜と、発光素子部とからなる。本発明の白色発光素子に用いる発光素子部は、本発明の蛍光色素の励起光スペクトルの範囲の波長の光を発光することを条件として、いかなるものでもかまわないが、本発明の蛍光色素の励起光スペクトルに属する３００ｎｍの近辺の紫外領域に発光極大波長があることが好ましい。このような発光素子部と組み合わせるとき、本発明の白色蛍光変換膜は紫外領域での励起光によって可視領域の広範な範囲の波長で蛍光を発生するので、肉眼で白色と認識される。したがって、本発明の白色発光素子は、ＯＡ機器用バックライト，時計用バックライト，各種ディスプレイ用バックライトなどの用途に好ましい。
【００３２】
本発明が提供する３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸は、キノリン骨格を有する新規のポリマー原料のモノマー化合物である。３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸は、カルボキシル基と水酸基との間でエステル結合を行うことにより重合することができる。また、他のモノマー化合物との共重合体を得ることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−１】本発明のナフトエ酸系化合物の化学構造。
【図１−２】本発明の他の二環芳香族カルボン酸化合物の化学構造。
【図２】７Ｈｙ２ＮＡのＨＭＢＣ分析結果を示す２次元スペクトル図。
【図３】８Ｈｙ２ＮＡのＨＭＢＣ分析結果を示す２次元スペクトル図。
【図４】ＣＹＰ１９９Ａ１酵素による２ＮＡの水酸化反応の産物の経時変化を示すグラフ。
【図５】ＣＹＰ１９９Ａ２酵素による２ＮＡの水酸化反応の産物の経時変化を示すグラフ。
【図６】８Ｈｙ２ＮＡ及び６Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトルを示す波形図。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子の発現ライブラリの構築
特定の基質を水酸化することのできるＰ４５０モノオキシゲナーゼを単離するために、さまざまな生物種由来のＰ４５０モノオキシゲナーゼを、その水酸化反応に必要な電子伝達系タンパク質とともに同一のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内で発現させるプラスミドのライブラリを構築した。
【００３６】
用いたＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子には、ダイズ根粒菌ブラディリゾビウム・ジャポニカムＵＳＤＡ１１０のＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＣＹＰ１９９Ａ１）と、ロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９（ＡＴＣＣ登録番号：ＢＡＡ−９８）由来Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＣＹＰ１９９Ａ２）とが含まれた。実施例２に示すスクリーニングの結果、ＣＹＰ１９９Ａ１及びＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子の産物が、２ＮＡを酸化してＨｙ２ＮＡを生成する酵素活性を示した。そこで、これらのＰ４５０モノオキシゲナーゼについて、その水酸化反応に必要な電子伝達系タンパク質とともに同一のエシェリヒア・コリ内で発現させるプラスミドの作製の手順を説明する。
【００３７】
ダイズ根粒菌ブラディリゾビウム・ジャポニカム及びロドシュードモナス・パルストリスのゲノム配列情報にもとづいて、ＣＹＰ１９９Ａ１遺伝子及びＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子を特異的に増幅するプライマーが設計された。前記プライマーの塩基配列は配列番号１−４に列挙される。ＣＹＰ１９９Ａ１遺伝子及びＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子の増幅は、それぞれの微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ）を用いて行った。４種類のデオキシヌクレオチドをそれぞれ０．２ｍＭ、プライマー０．５μＭ、それぞれの微生物の染色体ＤＮＡ２ｎｇ／μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ等を含む反応液は、９５°Ｃ３分を１回、９５°Ｃ３０秒、５５°Ｃ３０秒、７２°Ｃ１分１０秒を３０回（但し、１１回目からは、７２°Ｃでの反応時間を１回ごとに５秒ずつ延長する）、７２°Ｃ７分を１回の温度条件で反応され、終了後は４°Ｃで保存された。その後、増幅産物及びベクターｐＥＴ２１ａは制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断され、連結された後、エシェリヒア・コリＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株に導入された。ＣＹＰ１９９Ａ１遺伝子及びＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子がｐＥＴ２１ａに挿入されたプラスミドは、それぞれｐＥＴＡ１及びｐＥＴＡ２と名付けられた。
【００３８】
電子伝達系タンパク質として、シュードモナス・プチダ（ＡＴＣＣ登録番号：１７４５３）由来のプチダレドキシン（ｐｄｘ）及びプチダレドキシンレダクターゼ（ｐｄＲ）が用いられた。シュードモナス・プチダ菌のゲノム配列情報にもとづいて、ｐｄｘ遺伝子及びｐｄＲ遺伝子を特異的に増幅するプライマーが設計された。前記遺伝子を特異的に増幅するプライマーの塩基配列は配列番号５−８に列挙される。ｐｄｘ遺伝子及びｐｄＲ遺伝子の増幅は、シュードモナス・プチダの染色体ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ）を用いて行った。４種類のデオキシヌクレオチドをそれぞれ０．２ｍＭ、プライマー０．５μＭ、シュードモナス・プチダの染色体ＤＮＡ２ｎｇ／μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ等を含む反応液は、９４°Ｃ２分を１回、９４°Ｃ１５秒、５５°Ｃ３０秒、７２°Ｃ１分を３０回（但し、１１回目からは、７２°Ｃでの反応時間を１回ごとに５秒ずつ延長する）、７２°Ｃ７分を１回の温度条件で反応され、終了後は４°Ｃで保存された。その後、ｐｄｘの増幅産物及びベクターｐＥＴ２１ａは制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断され、連結された後、エシェリヒア・コリＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に導入された。ｐｄＲの増幅産物及びベクターｐＥＴ２１ａは制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｃＩで切断され、連結された後、エシェリヒア・コリＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株に導入された。ｐｄｘ遺伝子及びｐｄＲ遺伝子がｐＥＴ２１ａに挿入されたプラスミドは、それぞれｐＥＴｐｄｘ及びｐＥＴｐｄｒと名付けられた。前記ｐＥＴｐｄｘからＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切り出されたｐｄｘ遺伝子がｐＭＷ２１８ベクター（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社）のＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入され、さらに、ｐｄｘ遺伝子の挿入部位の５’側にあるＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ部位の間にｐＥＴｐｄｒからＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断されたｐｄＲ遺伝子が挿入された。ＥｃｏＲＩとＸｂａＩは平滑化後に連結された。こうして、ｐｄＲ遺伝子及びｐｄｘ遺伝子が、この順で５’から３’方向に直列に並んで挿入されたプラスミドｐＭＷｐｄｒ−ｐｄｘが得られた。ｐＥＴＡ１又はｐＥＴＡ２のいずれかと、ｐＭＷｐｄｒ−ｐｄｘとがエシェリヒア・コリＢＬ２１ Ｓｔａｒ （ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ社）に同時に導入され、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ及び電子伝達系が同一エシェリヒア・コリ内で共発現するプラスミドが作製された。同様にして、さまざまな生物種由来のＰ４５０モノオキシゲナーゼについて、その水酸化反応に必要な電子伝達系とともに同一のエシェリヒア・コリ内で発現させるプラスミドが作製され、これらを集めたＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子発現ライブラリが構築された。
【実施例２】
【００３９】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子発現ライブラリからの２ＮＡモノオキシゲナーゼのスクリーニング
２ＮＡモノオキシゲナーゼのスクリーニングは、２ＮＡ（図１−１、式１）を前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子発現ライブラリの各クローンの組換えエシェリヒア・コリの菌体とインキュベーションして、呈色試薬でＨｙ２ＮＡを生成するクローンを検出することによって実施された。前記組換えエシェリヒア・コリの菌体を調製するために、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子発現ライブラリの各クローンの組換えエシェリヒア・コリを１００μｇ／ｍＬ アンピシリン及び１００μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、２５°Ｃで１２時間培養した。さらに、１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、０．５ｍＭ ５−アミノレブリン酸及び０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４を添加して１２時間培養した。前記菌体は、集菌後に１０％（ｖ／ｖ） グリセロールを含む５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で洗菌し、湿菌体重量濃度が５０ｇ／Ｌになるように同バッファーに懸濁して２ＮＡとのインキュベーションに供された。前記調製菌体１体積部に、１００ｍＭ ２ＮＡ／ジメチルスルホキシド溶液及び１Ｍ ＮＡＤＨがそれぞれ０．０１体積部ずつ添加され、２５０μＬの反応液が調製された。前記反応液は３０°Ｃで３時間振とうしながらインキュベーションされた。前記インキュベーション後に、呈色試薬２，６−ジクロロキノン−４−クロロイミド又はファストブルーＢ塩が終濃度２ｍＭになるように添加された。前記菌体中のＰ４５０モノオキシゲナーゼが２ＮＡをＨｙ２ＮＡに水酸化した場合には、前記呈色試薬がＨｙ２ＮＡに作用して赤色又は青色の呈色反応が起こった。
【００４０】
結果
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子発現ライブラリについて前記呈色反応により２ＮＡモノオキシゲナーゼのスクリーニングを行ったところ、ｐＥＴＡ１及びｐＥＴＡ２を含む組換えエシェリヒア・コリの反応液で呈色反応がみられた。ｐＥＴＡ１で発現するＣＹＰ１９９Ａ１遺伝子の１２０９個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号９に列挙され、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質の４０２個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号１０に列挙される。ｐＥＴＡ２で発現するＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子の１２１８個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号１１に列挙され、ＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の４０５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号１２に列挙される。ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質のアミノ酸配列はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のアミノ酸配列と７８％の相同性を有する。
【実施例３】
【００４１】
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡ水酸化反応産物の構造決定
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡ水酸化反応産物の構造決定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳ）及び核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）を用いて行なわれた。
【００４２】
ＨＰＬＣ分析
実施例２に記載の反応液を用いて、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質を発現する組換えエシェリヒア・コリの菌体と２ＮＡとのインキュベーションを行った。インキュベーション後の前記反応液に５Ｎ ＨＣｌが終濃度１％（ｖ／ｖ）となるように添加され、酢酸エチルで抽出してＨＰＬＣ分析用サンプルが用意された。ＨＰＬＣ分析は、ＨＰＬＣ装置（アジレント社、１１００シリーズ）にカラム（ウォーターズ社、ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８ ＩＳ、カラム長４．６×２０ｍｍ、粒子径３．５μｍ）を装着して実施された。展開溶媒として、アセトニトリル、メタノール及び１０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ２．７）を２．５対２．５対９５の割合で混合したＡ液と、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）からなるＢ液とが用いられた。流速１ｍＬ／分で０分から３分までＢ液０％で流した後、３分から１２分までＢ液を直線勾配により７０％まで上昇させてサンプルを溶出させた。
【００４３】
ＨＰＬＣ分析の結果
ＣＹＰ１９９Ａ１及びＣＹＰ１９９Ａ２の反応液をＨＰＬＣで分析すると、ともに、保持時間７．１分（以下、「化合物Ａ」とする。）及び７．４分（以下、「化合物Ｂ」とする。）に顕著なピークがそれぞれ検出された（図示されない）。
【００４４】
ＨＰＬＣピーク分画の精製
２つのピーク分画で分離される化合物Ａ及び化合物Ｂは以下のとおり精製された。反応産物を大量に調製するための反応液は、組換えエシェリヒア・コリの菌体２０ｇ／Ｌと、５ｍＭ ２ＮＡと、５ｍＭ ＮＡＤＨと、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールとを含む５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）１００ｍＬが用意された。水酸化反応のためのインキュベーションは３０°Ｃで２４時間振とうして行なわれた。インキュベーション後に１％（ｖ／ｖ）になるように５Ｎ ＨＣｌが添加され、酢酸エチルで抽出された。ロータリーエバポレーターで酢酸エチルを除去した後に、残った固体を５０ｍＭ ギ酸を含むジメチルスルホキシドに溶解してＨＰＬＣ分離−フラクションコレクター分取用のサンプルとした。ＨＰＬＣ分離は、前記装置にカラム（ウォーターズ社、ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８、カラム長４．６×２５０ｍｍ、粒子径３．５μｍ）を装着して実施された。展開溶媒として５０ｍＭ ギ酸（Ａ液）と、５０ｍＭ ギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ液）とが用いられた。流速０．６ｍＬ／分で０分から４０分までＢ液を直線勾配により２０％から８０％まで上昇させてサンプルを溶出させた。化合物Ａ及び化合物Ｂはフラクションコレクターによりピーク分画としてそれぞれ回収された。回収物の純度を高めるために、ロータリーエバポレーターで展開溶媒を除去した後、各反応産物を５０ｍＭ ギ酸を含むジメチルスルホキシドに溶解して同一条件で再度ＨＰＬＣ分離−フラクションコレクター分取された。化合物Ａ及び化合物Ｂは、再度ロータリーエバポレーターで展開溶媒が除去された後に以下の質量分析に供された。
【００４５】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳ）
精製された化合物Ａ及び化合物Ｂの質量を測定するために質量分析計（サーモ社、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ ＦＴ）を用いてＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳ分析が行なわれた。前記ＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳ分析はエレクトロスプレーイオン化法によってネガティブモードで実施された。
【００４６】
ＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳの結果
化合物Ａ及び化合物Ｂはともに、質量数１８７．０３９７にピークを示した。この質量数は２ＮＡに１酸素原子が添加した化合物の水素原子脱離イオンの質量数（１８７．０３８５）に相当する。そこでこの結果から、化合物Ａ及び化合物Ｂは２ＮＡに１酸素原子が添加した化合物であることが明らかとなった（図示されない）。
【００４７】
核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）
精製された化合物Ａ及び化合物Ｂの構造を決定するためにＮＭＲ分析装置（ブルカー・バイオスピン社、ＡＶＡＮＣＥ６００）を用いてＮＭＲ分析が行なわれた。前記ＮＭＲ分析は、１３Ｃ ＮＭＲ分析と、１Ｈ ＮＭＲ分析と、ＣＯＳＹ（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）分析と、ＨＭＱＣ（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）分析と、ＨＭＢＣ（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｏｎｄ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）分析とを含み、それぞれのスペクトルデータが取得された。
【００４８】
化合物Ａの結果
ＨＭＢＣ分析によって化合物Ａでは、Ｈ−５からＣ−４、Ｈ−５からＣ−８ａ、Ｈ−５からＣ−７に渡るロングレンジカップリングが検出された（図２）。ＣＯＳＹ分析によって化合物Ａでは、Ｈ−３及びＨ−４の間と、Ｈ−５及びＨ−６の間とにカップリングが検出されたが、７位にはカップリングする水素基は検出されなかった（図示されない）。そこで、化合物Ａは２ＮＡの７位に水酸基が導入された７Ｈｙ２ＮＡ（図１、式２）と同定された。化合物Ａ、すなわち、７Ｈｙ２ＮＡの１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果は以下のとおりである。
【００４９】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）７．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，Ｈ−６）、７．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｈ−８）、７．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，１．５Ｈｚ，Ｈ−３）、７．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，Ｈ−５）、７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｈ−４）、８．３８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１）。
【００５０】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１０．８（Ｃ−８）、１２１．８（Ｃ−６）、１２２．９（Ｃ−３）、１２８．７（Ｃ−４）、１２９．３（Ｃ−２）、１２９．５（Ｃ−１）、１３０．１（Ｃ−５）、１３０．４（Ｃ−４ａ）、１３４．７（Ｃ−８ａ）、１５６．８（Ｃ−７）、１６８．６（Ｃ−２’）。
【００５１】
化合物Ｂの結果
ＨＭＢＣ分析によって化合物Ｂでは、Ｈ−１からＣ−２’、Ｈ−１からＣ−３、Ｈ−１からＣ−４ａ、Ｈ−１からＣ−８、Ｈ−６からＣ−４ａ、Ｈ−６からＣ−８にわたるロングレンジカップリングが検出された（図３）。ＣＯＳＹ分析によって化合物Ｂでは、Ｈ−３及びＨ−４の間、Ｈ−５及びＨ−６の間、Ｈ−６及びＨ−７の間とにカップリングが検出されたが、８位にはカップリングする水素基は検出されなかった（図示されない）。そこで、化合物Ｂは２ＮＡの８位に水酸基が導入された８Ｈｙ２ＮＡと同定された。化合物Ｂ、すなわち、８Ｈｙ２ＮＡの１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果は以下のとおりである。
【００５２】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）６．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４，１．０Ｈｚ，Ｈ−７）、７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−５）、７．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４，７．４Ｈｚ，Ｈ−６）、７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４）、７．９６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，１．７Ｈｚ，Ｈ−３）及び８．８６（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１）。
【００５３】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１０９．８（Ｃ−７）、１１９．１（Ｃ−５）、１２４．５（Ｃ−８ａ）、１２５．９（Ｃ−１）、１２６．２（Ｃ−３）、１２７．６（Ｃ−２）、１２８．６（Ｃ−４）、１３０．０（Ｃ−６）、１３７．２（Ｃ−４ａ）、１５５．３（Ｃ−８）、１６８．５（Ｃ−２’）。
【実施例４】
【００５４】
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡの７Ｈｙ２ＮＡ及び８Ｈｙ２ＮＡへの変換
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡの７Ｈｙ２ＮＡ及び８Ｈｙ２ＮＡへの変換を経時的に測定した。前記測定は、実施例２に記載の方法によってＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質を発現する組換えエシェリヒア・コリの菌体と、２ＮＡとを反応させ、実施例３に記載の方法によってＨＰＬＣ分析することによって実施された。
【００５５】
結果
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡの７位又は８位への水酸化反応を経時的に測定した結果を図４及び５に示す。組換えエシェリヒア・コリで発現するＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質は、反応開始時に１ｍＭあった２ＮＡを、３０分後には０．７ｍＭ、６０分後には０．４ｍＭ、１２０分後には０．１ｍＭに減少させ、１８０分後には全て酵素反応に消費された。この間に、７Ｈｙ２ＮＡの濃度は、３０分後で０．１ｍＭ、６０分後で０．１５ｍＭ、１２０分後で０．２ｍＭ、１８０分後で０．２５ｍＭに増加してプラトーに達した。また８Ｈｙ２ＮＡの濃度は、３０分後で０．１ｍＭ、６０分後で０．２ｍＭ、１２０分後で０．４５ｍＭ、１８０分後で０．５ｍＭに増加してプラトーに達した（図４）。反応産物の７Ｈｙ２ＮＡ及び８Ｈｙ２ＮＡの比率は３４対６６で、モル収率は８１％であった。この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ１は、効率的に２ＮＡを基質として水酸化反応を起こすが、８位の水酸基置換のほうが７位の水酸化置換より１．９倍選択的に起こることが明らかになった。
【００５６】
組換えエシェリヒア・コリで発現するＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質によって、反応開始時に１ｍＭあった２ＮＡは、３０分後には０．５ｍＭ、６０分後には０．２ｍＭに減少し、１２０分後には全て酵素反応に消費された。この間に、７Ｈｙ２ＮＡの濃度は、３０分後で０．１５ｍＭ、６０分後で０．２５ｍＭ、１２０分後で０．３ｍＭに増加してプラトーに達した。また８Ｈｙ２ＮＡの濃度は、３０分後で０．１５ｍＭ、６０分後で０．３ｍＭ、１２０分後で０．４５ｍＭに増加してプラトーに達した（図５）。反応産物の７Ｈｙ２ＮＡ及び８Ｈｙ２ＮＡの比率は３８対６２であり、モル収率は７５％であった。この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質はＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質と同様に効率的に２ＮＡを基質として水酸化反応を起こすこと、及び、ＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質は、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質と同様に、８位の水酸基置換のほうが７位の水酸化置換より１．６倍選択的に起こすことが明らかになった。
【００５７】
なお、電子伝達系タンパク質としてｐｄｘのかわりにロドシュードモナス・パルストリス由来のパルストリスレドキシン（ｐｕｘ）をＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質とともに同一のエシェリヒア・コリ内で発現させるプラスミドにおいても、８位の水酸基置換のほうが７位の水酸化置換より２倍選択的な２ＮＡのモノオキシゲナーゼ活性が検出された（図示されない）。そこで、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡの水酸化反応の基質位置の選択性は、電子伝達系タンパク質によって決定されるわけではないと結論された。
【実施例５】
【００５８】
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質によるさまざまな二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の生産
実施例２に記載の方法によって組換えエシェリヒア・コリで発現するＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の基質として２ＮＡのかわりにさまざまな二環芳香族カルボン酸を用いて、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の基質特異性を検討した。２ＮＡのかわりに基質として用いた二環芳香族カルボン酸は、１Ｈｙ２ＮＡ（式４）、３Ｈｙ２ＮＡ（式６）、６Ｈｙ２ＮＡ（式８）、インドール−２−カルボン酸（式１０）、インドール−６−カルボン酸（式１３）及びキノリン−６−カルボン酸（式１５）であった。それぞれの基質について、実施例３で説明された手順で反応産物の構造決定が行なわれた。
【００５９】
１Ｈｙ２ＮＡ（式４）を基質とした反応産物の構造解析の結果
１Ｈｙ２ＮＡ（式４）を基質としたＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による反応産物は、いずれの酵素でも主な反応産物は１種類だけで、１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果ともに同じ構造を示した。
【００６０】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７，２．１Ｈｚ，Ｈ−６）、７．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−４）、７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−８）、７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−３）、７．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−５）。
【００６１】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１３．１（Ｃ−８）、１１６．６（Ｃ−２）、１２６．０（Ｃ−４）、１２８．６（Ｃ−６）、１２９．５（Ｃ−３）、１３４．８（Ｃ−８ａ）、１３７．３（Ｃ−５）、１３９．０（Ｃ−４ａ）、１６３．４（Ｃ−７）、１６３．８（Ｃ−１）、１７２．４（Ｃ−２’）。
【００６２】
この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のいずれについても、１Ｈｙ２ＮＡ（式４）を基質とした反応産物は、１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（１，７ＤｉＨｙ２ＮＡ（式５））と同定された。
【００６３】
３Ｈｙ２ＮＡ（式６）を基質とした反応産物の構造解析の結果
３Ｈｙ２ＮＡ（式６）を基質としたＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の反応産物は、いずれの酵素でも主な反応産物は１種類だけで、１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果ともに同じ構造を示した。
【００６４】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）７．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，Ｈ−６）、７．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−８）、７．２４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−４）、７．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−５）、８．３３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１）。
【００６５】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１０．３（Ｃ−８）、１１１．８（Ｃ−４）、１１６．０（Ｃ−２）、１２３．２（Ｃ−６）、１２８．３（Ｃ−５）、１２８．８（Ｃ−７）、１３１．１（Ｃ−１）、１３２．８（Ｃ−４ａ）、１５４．４（Ｃ−８ａ）、１５４．７（Ｃ−３）、１７２．６（Ｃ−２’）。
【００６６】
この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のいずれについても、３Ｈｙ２ＮＡ（式６）を基質とした反応産物は３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（３，７ＤｉＨｙ２ＮＡ（式７））と同定された。
【００６７】
６Ｈｙ２ＮＡ（式８）を基質とした反応産物の構造解析の結果
６Ｈｙ２ＮＡ（式８）を基質としたＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の反応産物は、いずれの酵素でも主な反応産物は１種類だけで、１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果ともに同じ構造を示した。
【００６８】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）７．１９（ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、７．２８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８）、７．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４）、７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−３）、８．２８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１）。
【００６９】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１０．２（Ｃ−５）、１１１．７（Ｃ−８）、１２３．３（Ｃ−３）、１２５．８（Ｃ−２）、１２６．５（Ｃ−４）、１２８．６（Ｃ−８ａ）、１２９．３（Ｃ−１）、１３２．１（Ｃ−４ａ）、１４８．４（Ｃ−７）、１５０．０（Ｃ−６）、１６８．８ （Ｃ−２’）。
【００７０】
この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のいずれについても、６Ｈｙ２ＮＡ（式８）を基質とした反応産物は６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（６，７ＤｉＨｙ２ＮＡ（式９））と同定された。
【００７１】
インドール−２−カルボン酸（式１０）を基質とした反応産物の構造解析の結果
組換えエシェリヒア・コリで発現するＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質によるインドール−２−カルボン酸（式１０）の水酸化反応では２種類の反応産物が得られた。
【００７２】
反応産物１
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）６．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，２．３Ｈｚ，Ｈ−６）、６．８９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）、６．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｈ−４）、７．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−７）。
【００７３】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１２．５（Ｃ−４）、１１４．４（Ｃ−３）、１２１．２（Ｃ−７）、１２３．８（Ｃ−６）、１３５．７（Ｃ−３ａ）、１３６．６（Ｃ−２）、１４０．２（Ｃ−７ａ）、１５９．３（Ｃ−５）、１７１．０（Ｃ−２’）。
【００７４】
反応産物２
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）６．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６，２．１Ｈｚ，Ｈ−５）、６．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｈ−７）、６．９６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）、７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−４）。
【００７５】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１０４．４（Ｃ−７）、１１５．９（Ｃ−３）、１１９．９（Ｃ−５）、１２８．６（Ｃ−３ａ）、１３０．７（Ｃ−４）、１３４．８（Ｃ−２）、１４６．８（Ｃ−７ａ）、１６３．６（Ｃ−６）、１７０．９（Ｃ−２’）。
【００７６】
この結果から、反応産物１は５−ヒドロキシインドール−２−カルボン酸（式１１）と同定された。また反応産物２は６−ヒドロキシインドール−２−カルボン酸（式１２）と同定された。
【００７７】
インドール−６−カルボン酸（式１３）を基質とした反応産物の構造解析の結果
インドール−６−カルボン酸（式１３）を基質としたＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の反応産物は、いずれの酵素でも主な反応産物は１種類だけで、１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果ともに同じ構造を示した。
【００７８】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）３．５６（ｓ，２Ｈ，Ｈ−３）、７．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−４）、７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，Ｈ−７）、７．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７，１．５Ｈｚ，Ｈ−５）。
【００７９】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）４４．０（Ｃ−３）、１１７．３（Ｃ−７）、１３０．８（Ｃ−５）、１３２．４（Ｃ−４）、１３８．２（Ｃ−６）、１３９．３（Ｃ−３ａ）、１５２．１（Ｃ−７ａ）、１７５．３（Ｃ−６’）、１８４．２（Ｃ−２）。
【００８０】
この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のいずれについても、インドール−６−カルボン酸（式１３）を基質とした反応産物は２−インドリノン−６−カルボン酸（式１４）と同定された。
【００８１】
キノリン−６−カルボン酸（式１５）を基質とした反応産物の構造解析の結果
キノリン−６−カルボン酸（式１５）を基質としたＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の反応産物は、いずれの酵素でも主な反応産物は１種類だけで、１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果ともに同じ構造を示した。
【００８２】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｈ−４）、７．９７−７．９８（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｓ，Ｈ−７，Ｈ−８）、８．４９（ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、８．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｈ−２）。
【００８３】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１７．３（Ｃ−４）、１２６．２（Ｃ−７）、１２９．３（Ｃ−４ａｏｒ６）、１２９．７（Ｃ−８）、１３０．１（Ｃ−４ａ，５ｏｒ６）、１３０．２（Ｃ−４ａ，５ｏｒ６）、１４４．８（Ｃ−８ａ）、１４６．９（Ｃ−２）、１５２．４（Ｃ−３）、６８．２（Ｃ−６’）。
【００８４】
この結果から、キノリン−６−カルボン酸（式１５）を基質とした反応産物は３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸（式１６）と同定された。３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸（式１６）はエステル結合により重合できるので、キノリン骨格を有する新規ポリマーの原料として、医薬品、染料、ＥＬ素子等に利用することができる。
【００８５】
以上のとおり、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質はいずれも、２ＮＡ（式１）及びインドール−２−カルボン酸（式１０）を基質とする場合には分子内の２つの異なる位置の炭素と反応するが、１Ｈｙ２ＮＡ（式４）、３Ｈｙ２ＮＡ（式６）、６Ｈｙ２ＮＡ（式８）、インドール−６−カルボン酸（式１３）及びキノリン−６−カルボン酸（式１５）を基質とする場合には、分子内の１つの位置の炭素だけと反応する。
【実施例６】
【００８６】
Ｈｙ２ＮＡの蛍光能評価
今回ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質によって酵素合成された７Ｈｙ２ＮＡ（式２）、８Ｈｙ２ＮＡ（式３）は、従来有機合成法による報告しかないが、有機合成法は多段階反応であり、反応選択性（位置選択性）が低いため、収率が低い。そこで、これらのＨｙ２ＮＡ化合物の物性、特に蛍光特性を検討した。
【００８７】
化合物の蛍光特性を評価するために、市販品の２ＮＡ（式２）、１Ｈｙ２ＮＡ（式４）、３Ｈｙ２ＮＡ（式６）及び６Ｈｙ２ＮＡ（式８）と、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質によって酵素合成された７Ｈｙ２ＮＡ（式２）及び８Ｈｙ２ＮＡ（式３）とを用いた。具体的には、前記化合物について１ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液を調製し、トランスイルミネーターを用いて励起波長３０２ｎｍの紫外線を照射して可視光領域での蛍光が発生するかどうかを肉眼で評価した。その結果、８Ｈｙ２ＮＡは強い白色の蛍光を示すことがわかった。
【００８８】
８Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトル分析
８Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトルは、２μＭ ジメチルスルホキシド溶液を調製し、蛍光分光光度計（日本分光、ＦＰ−７５０）を用いて励起波長３００ｎｍで測定した。６Ｈｙ２ＮＡの２μＭ ジメチルスルホキシド溶液を対照として用いた。
【００８９】
８Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトル分析の結果
図６に８Ｈｙ２ＮＡ及び６Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトル波形図を示す。蛍光強度は相対値（ａ．ｕ．）で示す。太い線で示す８Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトルは、３７０ｎｍでの蛍光強度が１０、４２０ｎｍでの蛍光強度が７５、４９０ｎｍでの蛍光強度が２５となる長波長側がややなだらかな曲線を描いた。これに対し細い線で示す６Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトルは、３４０ｎｍでの蛍光強度が１０、３７０ｎｍでの蛍光強度が２３０のピークに達し、４２０ｎｍでの蛍光強度が７５となる長波長側がややなだらかな曲線を描いて、５００ｎｍで蛍光が消失した。６Ｈｙ２ＮＡのピークの蛍光強度は８Ｈｙ２ＮＡのピークの蛍光強度よりも３倍高いが、４５０ｎｍ以上の可視領域ではほとんど蛍光がなかった。８Ｈｙ２ＮＡは３５０ｎｍから６００ｎｍまでの広範な波長領域で蛍光を発するため、肉眼で白く見えると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法と、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸を含む新規蛍光色素と、新規二環芳香族ヒドロキシカルボン酸とに関する。
【背景技術】
【０００２】
二環芳香族ヒドロキシカルボン酸は、医薬品、染料、ＥＬ素子、ポリマー等の原料として産業的に有用である。とくにヒドロキシ−２−ナフトエ酸（Ｈｙ２ＮＡ）は有用であり、そのうち、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸（３Ｈｙ２ＮＡ）と６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸（６Ｈｙ２ＮＡ）は２−ナフトールへのカルボキシル基の導入（コルベ・シュミット反応）により大量生産されており（上野製薬、非特許文献１）、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸（１Ｈｙ２ＮＡ）も和光純薬から試薬として市販されている。しかしながら、他の位置に水酸基が導入されたＨｙ２ＮＡは、その合成法が確立されていないことからも用途開発は進んでいないと考えられる。
【０００３】
Ｈｙ２ＮＡを合成する手法として、２−ナフトエ酸（２ＮＡ）に水酸基を導入する手法が最も簡便で工業的にも有効な製造法であり、位置選択性の高い酵素による合成法、特に酸化酵素（モノオキシゲナーゼ）を用いることが効果的である。２ＮＡを変換可能なモノオキシゲナーゼとしては、植物に広く存在するケイ皮酸モノオキシゲナーゼＣＹＰ７３が２ＮＡの６位を酸化して６Ｈｙ２ＮＡを生成することが報告されている（非特許文献２）。また、ブルクホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）由来のモノオキゲナーゼが２ＮＡの１位を酸化して１Ｈｙ２ＮＡを生成することが報告されている（非特許文献３）。しかし、２ＮＡの他の位置を特異的に酸化したＨｙ２ＮＡを生成する酵素は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｅｎｏ−ｆｃ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｈｅｍ０１．ｈｔｍＬ
【非特許文献２】Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２２４， ８３５−８４４ （１９９４）
【非特許文献３】ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ２７３， ２２−２７ （２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸を位置特異的に酸化する酵素を用いることにより新規な二環芳香族ヒドロキシカルボン酸を効率的に生産する方法を開発すること、及び、該方法によって新規な二環芳香族ヒドロキシカルボン酸を開発することが本発明の解決しようとする課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼと二環芳香族カルボン酸とを反応させるステップを含む、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供する。
【０００７】
本発明の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法において、前記二環芳香族カルボン酸は、ナフタレン、インドール及びキノリンのモノカルボン酸の場合がある。
【０００８】
本発明の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法において、前記二環芳香族カルボン酸は、環を構成する炭素原子のうち少なくとも１個に一酸素原子が付加される場合がある。
【０００９】
本発明の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法において、前記二環芳香族カルボン酸は、２−ナフトエ酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、インドール−２−カルボン酸、インドール−６−カルボン酸及びキノリン−６−カルボン酸からなるグループから選択される場合がある。
【００１０】
本発明の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法において、前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼは、（１）配列番号１０又は１２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列と７８％以上、あるいは、９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、あるいは、９０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。
【００１１】
本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結したものである。
【００１２】
本発明の特異的結合タグペプチドは、前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質が二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００１３】
本発明は２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換する酵素を提供する。
【００１４】
本発明は、２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換する酵素組成物を提供する。本発明の酵素組成物は、（１）配列番号１０又は１２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列と７８％以上、あるいは、９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、あるいは、９０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択されるタンパク質を含む。
【００１５】
本発明の酵素組成物は、電子伝達系タンパク質を含む場合がある。
【００１６】
本発明は、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸及び／又はその誘導体を含む、蛍光色素を提供する。
【００１７】
本発明は、本発明の蛍光色素を光透過性媒体に分散した、白色蛍光変換膜を提供する。
【００１８】
本発明は、本発明の白色蛍光変換膜と、発光素子部とからなる白色発光素子を提供する。
【００１９】
本発明は、３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸を提供する。
【００２０】
本発明は、３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸のエステル結合による重合体を提供する。
【００２１】
本発明は、３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸のエステル結合による重合体を含む合成樹脂組成物を提供する。
【００２２】
本発明の製造方法に用いる二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼと、本発明の２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換する酵素組成物に含まれるモノオキシゲナーゼとは、いずれも、いかなる生物種に由来するモノオキシゲナーゼタンパク質であってもよい。前記モノオキシゲナーゼタンパク質は、ダイズ根粒菌ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）等のブラディリゾビウム属根粒菌と、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）等のロドシュードモナス属紅色非硫黄細菌とを含む細菌と、糸状菌又は菌類と、古細菌と、植物と、動物とを含むいずれかの生物から由来する場合がある。本発明のモノオキシゲナーゼは、ダイズ根粒菌ブラディリゾビウム・ジャポニカムＵＳＤＡ１１０のＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＢＡＣ４６３１３、以下、「ＣＹＰ１９９Ａ１」という。）と、ロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９（ＡＴＣＣ登録番号：ＢＡＡ−９８）由来Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＣＡＥ２７３１２、以下、「ＣＹＰ１９９Ａ２」という。）とを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
ＣＹＰ１９９Ａ１遺伝子の１２０９個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号９に列挙され、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質の４０２個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号１０に列挙される。ＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子の１２１８個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号１１に列挙され、ＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の４０５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号１２に列挙される。ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質のアミノ酸配列はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のアミノ酸配列と７８％の相同性を有する。
【００２４】
本発明の２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換する酵素組成物に含まれる電子伝達系タンパク質は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の電子供与体が酸化する際に発生する電子を前記モノオキシゲナーゼに伝達することができることを条件として、いかなる電子伝達系タンパク質を用いてもよい。好ましい電子伝達系タンパク質は、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、ＡＴＣＣ登録番号：１７４５３）由来のプチダレドキシン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ００２５９、以下、「ｐｄｘ」という。）と、プチダレドキシンレダクターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ１６６４０、以下、「ｐｄＲ」という。）と、ロドシュードモナス・パルストリス由来のパルストリスレドキシン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＥ２７３１３、以下、「ｐｕｘ」という。）と、ホウレンソウ由来のフェレドキシン（以下、「Ｆｄｘ」という。）及びフェレドキシンレダクターゼ（以下、「ＦｄＲ」という。）とを含むが、これらに限定されない。Ｆｄｘ及びＦｄＲはともに、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ社から入手可能である（カタログ番号Ｆ３０１３及びＦ６０２８）。
【００２５】
本発明の酵素組成物は、前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼをエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡと、電子伝達系タンパク質のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ及び電子伝達系タンパク質をエンコードするＤＮＡは同一の発現ベクターに組み込まれてもよく、別々の発現ベクターに組み込まれてもよい。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼは補酵素としてヘム鉄を必要とし、本発明の電子伝達系タンパク質のうち、ＰｄＲ及びＦｄＲは補酵素としてフラビンを必要とし、Ｐｄｘ及びＦｄｘは鉄及びイオウを必要とする。前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ及び電子伝達系タンパク質は、それぞれの酵素活性を保持することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法に使用されてもよく、あるいは、精製された状態で前記製造方法に使用されてもよい。
【００２６】
本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較の対象となるアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。同様に、本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較の対象となるヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。
【００２７】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００２８】
本発明の蛍光色素は、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む場合がある。また本発明の蛍光色素は、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の白色の蛍光を実質的に保持することを条件として、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸のいずれかの炭素原子又は酸素原子と共有結合を介して、あるいは、カルボキシル基又は水酸基とイオン結合その他の非共有結合を介して修飾されたいずれかの誘導体又は重合体を含む場合がある。本発明の蛍光色素は、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と、８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸のいずれかの誘導体又は重合体とからなるグループから選択される１つ又は２つ以上の物質を含む場合がある。
【００２９】
本明細書において「白色」とは、白色の他、赤、緑及び青の光の三原色が実質的に混合して白色に近い色として視認される蛍光を指す。
【００３０】
本発明の白色蛍光変換膜は、本発明の蛍光色素を光透過性媒体に分散したものである。前記光透過性媒体は、光透過性を有し、かつ膜形成性を有するものであればいかなるものでもかまわない。例えば高分子化合物や無機ガラス、さらには印刷用メジウムなどが用いられる。ここで、高分子化合物としては、例えばポリビニルピロリジノン，ポリアクリロニトリル，ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド），ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド），ポリビニルアルコール，ポリメチルメタクリレート，ポリスチレン，ポリカーボネート，ポリビニルアセテート，ポリ塩化ビニル，ポリブテン，ポリエチレングリコール、及びこれらの共重合体などが挙げられ、また、無機ガラスとしては、例えばホウ酸ガラスやシリカガラスなどが挙げられる。これらの光透過性媒体の中で、特に光透過性，膜形成性，その他物性などの点からポリビニルピロリジノンが好適である。また、本発明においては、上記光透過性媒体のうち１種類を用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
本発明の白色発光素子は、本発明の白色蛍光変換膜と、発光素子部とからなる。本発明の白色発光素子に用いる発光素子部は、本発明の蛍光色素の励起光スペクトルの範囲の波長の光を発光することを条件として、いかなるものでもかまわないが、本発明の蛍光色素の励起光スペクトルに属する３００ｎｍの近辺の紫外領域に発光極大波長があることが好ましい。このような発光素子部と組み合わせるとき、本発明の白色蛍光変換膜は紫外領域での励起光によって可視領域の広範な範囲の波長で蛍光を発生するので、肉眼で白色と認識される。したがって、本発明の白色発光素子は、ＯＡ機器用バックライト，時計用バックライト，各種ディスプレイ用バックライトなどの用途に好ましい。
【００３２】
本発明が提供する３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸は、キノリン骨格を有する新規のポリマー原料のモノマー化合物である。３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸は、カルボキシル基と水酸基との間でエステル結合を行うことにより重合することができる。また、他のモノマー化合物との共重合体を得ることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−１】本発明のナフトエ酸系化合物の化学構造。
【図１−２】本発明の他の二環芳香族カルボン酸化合物の化学構造。
【図２】７Ｈｙ２ＮＡのＨＭＢＣ分析結果を示す２次元スペクトル図。
【図３】８Ｈｙ２ＮＡのＨＭＢＣ分析結果を示す２次元スペクトル図。
【図４】ＣＹＰ１９９Ａ１酵素による２ＮＡの水酸化反応の産物の経時変化を示すグラフ。
【図５】ＣＹＰ１９９Ａ２酵素による２ＮＡの水酸化反応の産物の経時変化を示すグラフ。
【図６】８Ｈｙ２ＮＡ及び６Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトルを示す波形図。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子の発現ライブラリの構築
特定の基質を水酸化することのできるＰ４５０モノオキシゲナーゼを単離するために、さまざまな生物種由来のＰ４５０モノオキシゲナーゼを、その水酸化反応に必要な電子伝達系タンパク質とともに同一のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内で発現させるプラスミドのライブラリを構築した。
【００３６】
用いたＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子には、ダイズ根粒菌ブラディリゾビウム・ジャポニカムＵＳＤＡ１１０のＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＣＹＰ１９９Ａ１）と、ロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９（ＡＴＣＣ登録番号：ＢＡＡ−９８）由来Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＣＹＰ１９９Ａ２）とが含まれた。実施例２に示すスクリーニングの結果、ＣＹＰ１９９Ａ１及びＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子の産物が、２ＮＡを酸化してＨｙ２ＮＡを生成する酵素活性を示した。そこで、これらのＰ４５０モノオキシゲナーゼについて、その水酸化反応に必要な電子伝達系タンパク質とともに同一のエシェリヒア・コリ内で発現させるプラスミドの作製の手順を説明する。
【００３７】
ダイズ根粒菌ブラディリゾビウム・ジャポニカム及びロドシュードモナス・パルストリスのゲノム配列情報にもとづいて、ＣＹＰ１９９Ａ１遺伝子及びＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子を特異的に増幅するプライマーが設計された。前記プライマーの塩基配列は配列番号１−４に列挙される。ＣＹＰ１９９Ａ１遺伝子及びＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子の増幅は、それぞれの微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ）を用いて行った。４種類のデオキシヌクレオチドをそれぞれ０．２ｍＭ、プライマー０．５μＭ、それぞれの微生物の染色体ＤＮＡ２ｎｇ／μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ等を含む反応液は、９５°Ｃ３分を１回、９５°Ｃ３０秒、５５°Ｃ３０秒、７２°Ｃ１分１０秒を３０回（但し、１１回目からは、７２°Ｃでの反応時間を１回ごとに５秒ずつ延長する）、７２°Ｃ７分を１回の温度条件で反応され、終了後は４°Ｃで保存された。その後、増幅産物及びベクターｐＥＴ２１ａは制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断され、連結された後、エシェリヒア・コリＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株に導入された。ＣＹＰ１９９Ａ１遺伝子及びＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子がｐＥＴ２１ａに挿入されたプラスミドは、それぞれｐＥＴＡ１及びｐＥＴＡ２と名付けられた。
【００３８】
電子伝達系タンパク質として、シュードモナス・プチダ（ＡＴＣＣ登録番号：１７４５３）由来のプチダレドキシン（ｐｄｘ）及びプチダレドキシンレダクターゼ（ｐｄＲ）が用いられた。シュードモナス・プチダ菌のゲノム配列情報にもとづいて、ｐｄｘ遺伝子及びｐｄＲ遺伝子を特異的に増幅するプライマーが設計された。前記遺伝子を特異的に増幅するプライマーの塩基配列は配列番号５−８に列挙される。ｐｄｘ遺伝子及びｐｄＲ遺伝子の増幅は、シュードモナス・プチダの染色体ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ）を用いて行った。４種類のデオキシヌクレオチドをそれぞれ０．２ｍＭ、プライマー０．５μＭ、シュードモナス・プチダの染色体ＤＮＡ２ｎｇ／μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ等を含む反応液は、９４°Ｃ２分を１回、９４°Ｃ１５秒、５５°Ｃ３０秒、７２°Ｃ１分を３０回（但し、１１回目からは、７２°Ｃでの反応時間を１回ごとに５秒ずつ延長する）、７２°Ｃ７分を１回の温度条件で反応され、終了後は４°Ｃで保存された。その後、ｐｄｘの増幅産物及びベクターｐＥＴ２１ａは制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断され、連結された後、エシェリヒア・コリＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に導入された。ｐｄＲの増幅産物及びベクターｐＥＴ２１ａは制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｃＩで切断され、連結された後、エシェリヒア・コリＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株に導入された。ｐｄｘ遺伝子及びｐｄＲ遺伝子がｐＥＴ２１ａに挿入されたプラスミドは、それぞれｐＥＴｐｄｘ及びｐＥＴｐｄｒと名付けられた。前記ｐＥＴｐｄｘからＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切り出されたｐｄｘ遺伝子がｐＭＷ２１８ベクター（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社）のＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入され、さらに、ｐｄｘ遺伝子の挿入部位の５’側にあるＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ部位の間にｐＥＴｐｄｒからＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断されたｐｄＲ遺伝子が挿入された。ＥｃｏＲＩとＸｂａＩは平滑化後に連結された。こうして、ｐｄＲ遺伝子及びｐｄｘ遺伝子が、この順で５’から３’方向に直列に並んで挿入されたプラスミドｐＭＷｐｄｒ−ｐｄｘが得られた。ｐＥＴＡ１又はｐＥＴＡ２のいずれかと、ｐＭＷｐｄｒ−ｐｄｘとがエシェリヒア・コリＢＬ２１ Ｓｔａｒ （ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ社）に同時に導入され、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ及び電子伝達系が同一エシェリヒア・コリ内で共発現するプラスミドが作製された。同様にして、さまざまな生物種由来のＰ４５０モノオキシゲナーゼについて、その水酸化反応に必要な電子伝達系とともに同一のエシェリヒア・コリ内で発現させるプラスミドが作製され、これらを集めたＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子発現ライブラリが構築された。
【実施例２】
【００３９】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子発現ライブラリからの２ＮＡモノオキシゲナーゼのスクリーニング
２ＮＡモノオキシゲナーゼのスクリーニングは、２ＮＡ（図１−１、式１）を前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子発現ライブラリの各クローンの組換えエシェリヒア・コリの菌体とインキュベーションして、呈色試薬でＨｙ２ＮＡを生成するクローンを検出することによって実施された。前記組換えエシェリヒア・コリの菌体を調製するために、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子発現ライブラリの各クローンの組換えエシェリヒア・コリを１００μｇ／ｍＬ アンピシリン及び１００μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、２５°Ｃで１２時間培養した。さらに、１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、０．５ｍＭ ５−アミノレブリン酸及び０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４を添加して１２時間培養した。前記菌体は、集菌後に１０％（ｖ／ｖ） グリセロールを含む５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で洗菌し、湿菌体重量濃度が５０ｇ／Ｌになるように同バッファーに懸濁して２ＮＡとのインキュベーションに供された。前記調製菌体１体積部に、１００ｍＭ ２ＮＡ／ジメチルスルホキシド溶液及び１Ｍ ＮＡＤＨがそれぞれ０．０１体積部ずつ添加され、２５０μＬの反応液が調製された。前記反応液は３０°Ｃで３時間振とうしながらインキュベーションされた。前記インキュベーション後に、呈色試薬２，６−ジクロロキノン−４−クロロイミド又はファストブルーＢ塩が終濃度２ｍＭになるように添加された。前記菌体中のＰ４５０モノオキシゲナーゼが２ＮＡをＨｙ２ＮＡに水酸化した場合には、前記呈色試薬がＨｙ２ＮＡに作用して赤色又は青色の呈色反応が起こった。
【００４０】
結果
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子発現ライブラリについて前記呈色反応により２ＮＡモノオキシゲナーゼのスクリーニングを行ったところ、ｐＥＴＡ１及びｐＥＴＡ２を含む組換えエシェリヒア・コリの反応液で呈色反応がみられた。ｐＥＴＡ１で発現するＣＹＰ１９９Ａ１遺伝子の１２０９個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号９に列挙され、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質の４０２個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号１０に列挙される。ｐＥＴＡ２で発現するＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子の１２１８個の塩基からなるヌクレオチド配列は配列番号１１に列挙され、ＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の４０５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列は配列番号１２に列挙される。ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質のアミノ酸配列はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のアミノ酸配列と７８％の相同性を有する。
【実施例３】
【００４１】
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡ水酸化反応産物の構造決定
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡ水酸化反応産物の構造決定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳ）及び核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）を用いて行なわれた。
【００４２】
ＨＰＬＣ分析
実施例２に記載の反応液を用いて、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質を発現する組換えエシェリヒア・コリの菌体と２ＮＡとのインキュベーションを行った。インキュベーション後の前記反応液に５Ｎ ＨＣｌが終濃度１％（ｖ／ｖ）となるように添加され、酢酸エチルで抽出してＨＰＬＣ分析用サンプルが用意された。ＨＰＬＣ分析は、ＨＰＬＣ装置（アジレント社、１１００シリーズ）にカラム（ウォーターズ社、ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８ ＩＳ、カラム長４．６×２０ｍｍ、粒子径３．５μｍ）を装着して実施された。展開溶媒として、アセトニトリル、メタノール及び１０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ２．７）を２．５対２．５対９５の割合で混合したＡ液と、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）からなるＢ液とが用いられた。流速１ｍＬ／分で０分から３分までＢ液０％で流した後、３分から１２分までＢ液を直線勾配により７０％まで上昇させてサンプルを溶出させた。
【００４３】
ＨＰＬＣ分析の結果
ＣＹＰ１９９Ａ１及びＣＹＰ１９９Ａ２の反応液をＨＰＬＣで分析すると、ともに、保持時間７．１分（以下、「化合物Ａ」とする。）及び７．４分（以下、「化合物Ｂ」とする。）に顕著なピークがそれぞれ検出された（図示されない）。
【００４４】
ＨＰＬＣピーク分画の精製
２つのピーク分画で分離される化合物Ａ及び化合物Ｂは以下のとおり精製された。反応産物を大量に調製するための反応液は、組換えエシェリヒア・コリの菌体２０ｇ／Ｌと、５ｍＭ ２ＮＡと、５ｍＭ ＮＡＤＨと、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールとを含む５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）１００ｍＬが用意された。水酸化反応のためのインキュベーションは３０°Ｃで２４時間振とうして行なわれた。インキュベーション後に１％（ｖ／ｖ）になるように５Ｎ ＨＣｌが添加され、酢酸エチルで抽出された。ロータリーエバポレーターで酢酸エチルを除去した後に、残った固体を５０ｍＭ ギ酸を含むジメチルスルホキシドに溶解してＨＰＬＣ分離−フラクションコレクター分取用のサンプルとした。ＨＰＬＣ分離は、前記装置にカラム（ウォーターズ社、ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８、カラム長４．６×２５０ｍｍ、粒子径３．５μｍ）を装着して実施された。展開溶媒として５０ｍＭ ギ酸（Ａ液）と、５０ｍＭ ギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ液）とが用いられた。流速０．６ｍＬ／分で０分から４０分までＢ液を直線勾配により２０％から８０％まで上昇させてサンプルを溶出させた。化合物Ａ及び化合物Ｂはフラクションコレクターによりピーク分画としてそれぞれ回収された。回収物の純度を高めるために、ロータリーエバポレーターで展開溶媒を除去した後、各反応産物を５０ｍＭ ギ酸を含むジメチルスルホキシドに溶解して同一条件で再度ＨＰＬＣ分離−フラクションコレクター分取された。化合物Ａ及び化合物Ｂは、再度ロータリーエバポレーターで展開溶媒が除去された後に以下の質量分析に供された。
【００４５】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳ）
精製された化合物Ａ及び化合物Ｂの質量を測定するために質量分析計（サーモ社、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ ＦＴ）を用いてＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳ分析が行なわれた。前記ＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳ分析はエレクトロスプレーイオン化法によってネガティブモードで実施された。
【００４６】
ＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳの結果
化合物Ａ及び化合物Ｂはともに、質量数１８７．０３９７にピークを示した。この質量数は２ＮＡに１酸素原子が添加した化合物の水素原子脱離イオンの質量数（１８７．０３８５）に相当する。そこでこの結果から、化合物Ａ及び化合物Ｂは２ＮＡに１酸素原子が添加した化合物であることが明らかとなった（図示されない）。
【００４７】
核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）
精製された化合物Ａ及び化合物Ｂの構造を決定するためにＮＭＲ分析装置（ブルカー・バイオスピン社、ＡＶＡＮＣＥ６００）を用いてＮＭＲ分析が行なわれた。前記ＮＭＲ分析は、１３Ｃ ＮＭＲ分析と、１Ｈ ＮＭＲ分析と、ＣＯＳＹ（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）分析と、ＨＭＱＣ（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）分析と、ＨＭＢＣ（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｏｎｄ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）分析とを含み、それぞれのスペクトルデータが取得された。
【００４８】
化合物Ａの結果
ＨＭＢＣ分析によって化合物Ａでは、Ｈ−５からＣ−４、Ｈ−５からＣ−８ａ、Ｈ−５からＣ−７に渡るロングレンジカップリングが検出された（図２）。ＣＯＳＹ分析によって化合物Ａでは、Ｈ−３及びＨ−４の間と、Ｈ−５及びＨ−６の間とにカップリングが検出されたが、７位にはカップリングする水素基は検出されなかった（図示されない）。そこで、化合物Ａは２ＮＡの７位に水酸基が導入された７Ｈｙ２ＮＡ（図１、式２）と同定された。化合物Ａ、すなわち、７Ｈｙ２ＮＡの１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果は以下のとおりである。
【００４９】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）７．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，Ｈ−６）、７．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｈ−８）、７．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，１．５Ｈｚ，Ｈ−３）、７．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，Ｈ−５）、７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｈ−４）、８．３８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１）。
【００５０】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１０．８（Ｃ−８）、１２１．８（Ｃ−６）、１２２．９（Ｃ−３）、１２８．７（Ｃ−４）、１２９．３（Ｃ−２）、１２９．５（Ｃ−１）、１３０．１（Ｃ−５）、１３０．４（Ｃ−４ａ）、１３４．７（Ｃ−８ａ）、１５６．８（Ｃ−７）、１６８．６（Ｃ−２’）。
【００５１】
化合物Ｂの結果
ＨＭＢＣ分析によって化合物Ｂでは、Ｈ−１からＣ−２’、Ｈ−１からＣ−３、Ｈ−１からＣ−４ａ、Ｈ−１からＣ−８、Ｈ−６からＣ−４ａ、Ｈ−６からＣ−８にわたるロングレンジカップリングが検出された（図３）。ＣＯＳＹ分析によって化合物Ｂでは、Ｈ−３及びＨ−４の間、Ｈ−５及びＨ−６の間、Ｈ−６及びＨ−７の間とにカップリングが検出されたが、８位にはカップリングする水素基は検出されなかった（図示されない）。そこで、化合物Ｂは２ＮＡの８位に水酸基が導入された８Ｈｙ２ＮＡと同定された。化合物Ｂ、すなわち、８Ｈｙ２ＮＡの１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果は以下のとおりである。
【００５２】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）６．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４，１．０Ｈｚ，Ｈ−７）、７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−５）、７．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４，７．４Ｈｚ，Ｈ−６）、７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４）、７．９６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，１．７Ｈｚ，Ｈ−３）及び８．８６（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１）。
【００５３】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１０９．８（Ｃ−７）、１１９．１（Ｃ−５）、１２４．５（Ｃ−８ａ）、１２５．９（Ｃ−１）、１２６．２（Ｃ−３）、１２７．６（Ｃ−２）、１２８．６（Ｃ−４）、１３０．０（Ｃ−６）、１３７．２（Ｃ−４ａ）、１５５．３（Ｃ−８）、１６８．５（Ｃ−２’）。
【実施例４】
【００５４】
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡの７Ｈｙ２ＮＡ及び８Ｈｙ２ＮＡへの変換
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡの７Ｈｙ２ＮＡ及び８Ｈｙ２ＮＡへの変換を経時的に測定した。前記測定は、実施例２に記載の方法によってＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質を発現する組換えエシェリヒア・コリの菌体と、２ＮＡとを反応させ、実施例３に記載の方法によってＨＰＬＣ分析することによって実施された。
【００５５】
結果
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡの７位又は８位への水酸化反応を経時的に測定した結果を図４及び５に示す。組換えエシェリヒア・コリで発現するＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質は、反応開始時に１ｍＭあった２ＮＡを、３０分後には０．７ｍＭ、６０分後には０．４ｍＭ、１２０分後には０．１ｍＭに減少させ、１８０分後には全て酵素反応に消費された。この間に、７Ｈｙ２ＮＡの濃度は、３０分後で０．１ｍＭ、６０分後で０．１５ｍＭ、１２０分後で０．２ｍＭ、１８０分後で０．２５ｍＭに増加してプラトーに達した。また８Ｈｙ２ＮＡの濃度は、３０分後で０．１ｍＭ、６０分後で０．２ｍＭ、１２０分後で０．４５ｍＭ、１８０分後で０．５ｍＭに増加してプラトーに達した（図４）。反応産物の７Ｈｙ２ＮＡ及び８Ｈｙ２ＮＡの比率は３４対６６で、モル収率は８１％であった。この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ１は、効率的に２ＮＡを基質として水酸化反応を起こすが、８位の水酸基置換のほうが７位の水酸化置換より１．９倍選択的に起こることが明らかになった。
【００５６】
組換えエシェリヒア・コリで発現するＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質によって、反応開始時に１ｍＭあった２ＮＡは、３０分後には０．５ｍＭ、６０分後には０．２ｍＭに減少し、１２０分後には全て酵素反応に消費された。この間に、７Ｈｙ２ＮＡの濃度は、３０分後で０．１５ｍＭ、６０分後で０．２５ｍＭ、１２０分後で０．３ｍＭに増加してプラトーに達した。また８Ｈｙ２ＮＡの濃度は、３０分後で０．１５ｍＭ、６０分後で０．３ｍＭ、１２０分後で０．４５ｍＭに増加してプラトーに達した（図５）。反応産物の７Ｈｙ２ＮＡ及び８Ｈｙ２ＮＡの比率は３８対６２であり、モル収率は７５％であった。この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質はＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質と同様に効率的に２ＮＡを基質として水酸化反応を起こすこと、及び、ＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質は、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質と同様に、８位の水酸基置換のほうが７位の水酸化置換より１．６倍選択的に起こすことが明らかになった。
【００５７】
なお、電子伝達系タンパク質としてｐｄｘのかわりにロドシュードモナス・パルストリス由来のパルストリスレドキシン（ｐｕｘ）をＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質とともに同一のエシェリヒア・コリ内で発現させるプラスミドにおいても、８位の水酸基置換のほうが７位の水酸化置換より２倍選択的な２ＮＡのモノオキシゲナーゼ活性が検出された（図示されない）。そこで、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による２ＮＡの水酸化反応の基質位置の選択性は、電子伝達系タンパク質によって決定されるわけではないと結論された。
【実施例５】
【００５８】
ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質によるさまざまな二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の生産
実施例２に記載の方法によって組換えエシェリヒア・コリで発現するＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の基質として２ＮＡのかわりにさまざまな二環芳香族カルボン酸を用いて、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の基質特異性を検討した。２ＮＡのかわりに基質として用いた二環芳香族カルボン酸は、１Ｈｙ２ＮＡ（式４）、３Ｈｙ２ＮＡ（式６）、６Ｈｙ２ＮＡ（式８）、インドール−２−カルボン酸（式１０）、インドール−６−カルボン酸（式１３）及びキノリン−６−カルボン酸（式１５）であった。それぞれの基質について、実施例３で説明された手順で反応産物の構造決定が行なわれた。
【００５９】
１Ｈｙ２ＮＡ（式４）を基質とした反応産物の構造解析の結果
１Ｈｙ２ＮＡ（式４）を基質としたＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質による反応産物は、いずれの酵素でも主な反応産物は１種類だけで、１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果ともに同じ構造を示した。
【００６０】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７，２．１Ｈｚ，Ｈ−６）、７．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−４）、７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−８）、７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−３）、７．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−５）。
【００６１】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１３．１（Ｃ−８）、１１６．６（Ｃ−２）、１２６．０（Ｃ−４）、１２８．６（Ｃ−６）、１２９．５（Ｃ−３）、１３４．８（Ｃ−８ａ）、１３７．３（Ｃ−５）、１３９．０（Ｃ−４ａ）、１６３．４（Ｃ−７）、１６３．８（Ｃ−１）、１７２．４（Ｃ−２’）。
【００６２】
この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のいずれについても、１Ｈｙ２ＮＡ（式４）を基質とした反応産物は、１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（１，７ＤｉＨｙ２ＮＡ（式５））と同定された。
【００６３】
３Ｈｙ２ＮＡ（式６）を基質とした反応産物の構造解析の結果
３Ｈｙ２ＮＡ（式６）を基質としたＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の反応産物は、いずれの酵素でも主な反応産物は１種類だけで、１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果ともに同じ構造を示した。
【００６４】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）７．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，Ｈ−６）、７．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−８）、７．２４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−４）、７．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−５）、８．３３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１）。
【００６５】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１０．３（Ｃ−８）、１１１．８（Ｃ−４）、１１６．０（Ｃ−２）、１２３．２（Ｃ−６）、１２８．３（Ｃ−５）、１２８．８（Ｃ−７）、１３１．１（Ｃ−１）、１３２．８（Ｃ−４ａ）、１５４．４（Ｃ−８ａ）、１５４．７（Ｃ−３）、１７２．６（Ｃ−２’）。
【００６６】
この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のいずれについても、３Ｈｙ２ＮＡ（式６）を基質とした反応産物は３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（３，７ＤｉＨｙ２ＮＡ（式７））と同定された。
【００６７】
６Ｈｙ２ＮＡ（式８）を基質とした反応産物の構造解析の結果
６Ｈｙ２ＮＡ（式８）を基質としたＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の反応産物は、いずれの酵素でも主な反応産物は１種類だけで、１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果ともに同じ構造を示した。
【００６８】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）７．１９（ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、７．２８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８）、７．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４）、７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−３）、８．２８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１）。
【００６９】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１０．２（Ｃ−５）、１１１．７（Ｃ−８）、１２３．３（Ｃ−３）、１２５．８（Ｃ−２）、１２６．５（Ｃ−４）、１２８．６（Ｃ−８ａ）、１２９．３（Ｃ−１）、１３２．１（Ｃ−４ａ）、１４８．４（Ｃ−７）、１５０．０（Ｃ−６）、１６８．８ （Ｃ−２’）。
【００７０】
この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のいずれについても、６Ｈｙ２ＮＡ（式８）を基質とした反応産物は６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（６，７ＤｉＨｙ２ＮＡ（式９））と同定された。
【００７１】
インドール−２−カルボン酸（式１０）を基質とした反応産物の構造解析の結果
組換えエシェリヒア・コリで発現するＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質によるインドール−２−カルボン酸（式１０）の水酸化反応では２種類の反応産物が得られた。
【００７２】
反応産物１
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）６．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，２．３Ｈｚ，Ｈ−６）、６．８９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）、６．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｈ−４）、７．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−７）。
【００７３】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１２．５（Ｃ−４）、１１４．４（Ｃ−３）、１２１．２（Ｃ−７）、１２３．８（Ｃ−６）、１３５．７（Ｃ−３ａ）、１３６．６（Ｃ−２）、１４０．２（Ｃ−７ａ）、１５９．３（Ｃ−５）、１７１．０（Ｃ−２’）。
【００７４】
反応産物２
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）６．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６，２．１Ｈｚ，Ｈ−５）、６．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｈ−７）、６．９６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）、７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−４）。
【００７５】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１０４．４（Ｃ−７）、１１５．９（Ｃ−３）、１１９．９（Ｃ−５）、１２８．６（Ｃ−３ａ）、１３０．７（Ｃ−４）、１３４．８（Ｃ−２）、１４６．８（Ｃ−７ａ）、１６３．６（Ｃ−６）、１７０．９（Ｃ−２’）。
【００７６】
この結果から、反応産物１は５−ヒドロキシインドール−２−カルボン酸（式１１）と同定された。また反応産物２は６−ヒドロキシインドール−２−カルボン酸（式１２）と同定された。
【００７７】
インドール−６−カルボン酸（式１３）を基質とした反応産物の構造解析の結果
インドール−６−カルボン酸（式１３）を基質としたＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の反応産物は、いずれの酵素でも主な反応産物は１種類だけで、１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果ともに同じ構造を示した。
【００７８】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）３．５６（ｓ，２Ｈ，Ｈ−３）、７．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−４）、７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，Ｈ−７）、７．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７，１．５Ｈｚ，Ｈ−５）。
【００７９】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）４４．０（Ｃ−３）、１１７．３（Ｃ−７）、１３０．８（Ｃ−５）、１３２．４（Ｃ−４）、１３８．２（Ｃ−６）、１３９．３（Ｃ−３ａ）、１５２．１（Ｃ−７ａ）、１７５．３（Ｃ−６’）、１８４．２（Ｃ−２）。
【００８０】
この結果から、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質のいずれについても、インドール−６−カルボン酸（式１３）を基質とした反応産物は２−インドリノン−６−カルボン酸（式１４）と同定された。
【００８１】
キノリン−６−カルボン酸（式１５）を基質とした反応産物の構造解析の結果
キノリン−６−カルボン酸（式１５）を基質としたＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質の反応産物は、いずれの酵素でも主な反応産物は１種類だけで、１Ｈ ＮＭＲ分析及び１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果ともに同じ構造を示した。
【００８２】
１Ｈ ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｈ−４）、７．９７−７．９８（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｓ，Ｈ−７，Ｈ−８）、８．４９（ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、８．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｈ−２）。
【００８３】
１３Ｃ ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ）１１７．３（Ｃ−４）、１２６．２（Ｃ−７）、１２９．３（Ｃ−４ａｏｒ６）、１２９．７（Ｃ−８）、１３０．１（Ｃ−４ａ，５ｏｒ６）、１３０．２（Ｃ−４ａ，５ｏｒ６）、１４４．８（Ｃ−８ａ）、１４６．９（Ｃ−２）、１５２．４（Ｃ−３）、６８．２（Ｃ−６’）。
【００８４】
この結果から、キノリン−６−カルボン酸（式１５）を基質とした反応産物は３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸（式１６）と同定された。３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸（式１６）はエステル結合により重合できるので、キノリン骨格を有する新規ポリマーの原料として、医薬品、染料、ＥＬ素子等に利用することができる。
【００８５】
以上のとおり、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質及びＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質はいずれも、２ＮＡ（式１）及びインドール−２−カルボン酸（式１０）を基質とする場合には分子内の２つの異なる位置の炭素と反応するが、１Ｈｙ２ＮＡ（式４）、３Ｈｙ２ＮＡ（式６）、６Ｈｙ２ＮＡ（式８）、インドール−６−カルボン酸（式１３）及びキノリン−６−カルボン酸（式１５）を基質とする場合には、分子内の１つの位置の炭素だけと反応する。
【実施例６】
【００８６】
Ｈｙ２ＮＡの蛍光能評価
今回ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質によって酵素合成された７Ｈｙ２ＮＡ（式２）、８Ｈｙ２ＮＡ（式３）は、従来有機合成法による報告しかないが、有機合成法は多段階反応であり、反応選択性（位置選択性）が低いため、収率が低い。そこで、これらのＨｙ２ＮＡ化合物の物性、特に蛍光特性を検討した。
【００８７】
化合物の蛍光特性を評価するために、市販品の２ＮＡ（式２）、１Ｈｙ２ＮＡ（式４）、３Ｈｙ２ＮＡ（式６）及び６Ｈｙ２ＮＡ（式８）と、ＣＹＰ１９９Ａ１タンパク質又はＣＹＰ１９９Ａ２タンパク質によって酵素合成された７Ｈｙ２ＮＡ（式２）及び８Ｈｙ２ＮＡ（式３）とを用いた。具体的には、前記化合物について１ｍＭ ジメチルスルホキシド溶液を調製し、トランスイルミネーターを用いて励起波長３０２ｎｍの紫外線を照射して可視光領域での蛍光が発生するかどうかを肉眼で評価した。その結果、８Ｈｙ２ＮＡは強い白色の蛍光を示すことがわかった。
【００８８】
８Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトル分析
８Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトルは、２μＭ ジメチルスルホキシド溶液を調製し、蛍光分光光度計（日本分光、ＦＰ−７５０）を用いて励起波長３００ｎｍで測定した。６Ｈｙ２ＮＡの２μＭ ジメチルスルホキシド溶液を対照として用いた。
【００８９】
８Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトル分析の結果
図６に８Ｈｙ２ＮＡ及び６Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトル波形図を示す。蛍光強度は相対値（ａ．ｕ．）で示す。太い線で示す８Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトルは、３７０ｎｍでの蛍光強度が１０、４２０ｎｍでの蛍光強度が７５、４９０ｎｍでの蛍光強度が２５となる長波長側がややなだらかな曲線を描いた。これに対し細い線で示す６Ｈｙ２ＮＡの蛍光スペクトルは、３４０ｎｍでの蛍光強度が１０、３７０ｎｍでの蛍光強度が２３０のピークに達し、４２０ｎｍでの蛍光強度が７５となる長波長側がややなだらかな曲線を描いて、５００ｎｍで蛍光が消失した。６Ｈｙ２ＮＡのピークの蛍光強度は８Ｈｙ２ＮＡのピークの蛍光強度よりも３倍高いが、４５０ｎｍ以上の可視領域ではほとんど蛍光がなかった。８Ｈｙ２ＮＡは３５０ｎｍから６００ｎｍまでの広範な波長領域で蛍光を発するため、肉眼で白く見えると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼと二環芳香族カルボン酸とを反応させるステップを含むことを特徴とする、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
前記二環芳香族カルボン酸は、ナフタレン、インドール及びキノリンのモノカルボン酸であることを特徴とする、請求項１に記載の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項３】
前記二環芳香族カルボン酸は、環を構成する炭素原子のうち少なくとも１個に一酸素原子が付加されることを特徴とする、請求項２に記載の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項４】
前記二環芳香族カルボン酸は、２−ナフトエ酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、インドール−２−カルボン酸、インドール−６−カルボン酸及びキノリン−６−カルボン酸からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の二環ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼは、
（１）配列番号１０又は１２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列と７８％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１ないし４に記載の二環ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項６】
２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換することを特徴とする酵素。
【請求項７】
（１）配列番号１０又は１２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列と７８％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択されるタンパク質を含むことを特徴とする、２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換する酵素組成物。
【請求項８】
電子伝達系タンパク質を含むことを特徴とする、請求項７に記載の酵素組成物。
【請求項９】
８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸及び／又はその誘導体を含むことを特徴とする、蛍光色素。
【請求項１０】
請求項９に記載の蛍光色素を光透過性媒体に分散したことを特徴とする、白色蛍光変換膜。
【請求項１１】
請求項１０に記載の白色蛍光変換膜と、発光素子部とからなることを特徴とする、白色発光素子。
【請求項１２】
３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸。
【請求項１３】
３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸のエステル結合による重合体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の重合体を含むことを特徴とする、合成樹脂組成物。
【請求項１】
二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼと二環芳香族カルボン酸とを反応させるステップを含むことを特徴とする、二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
前記二環芳香族カルボン酸は、ナフタレン、インドール及びキノリンのモノカルボン酸であることを特徴とする、請求項１に記載の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項３】
前記二環芳香族カルボン酸は、環を構成する炭素原子のうち少なくとも１個に一酸素原子が付加されることを特徴とする、請求項２に記載の二環芳香族ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項４】
前記二環芳香族カルボン酸は、２−ナフトエ酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、インドール−２−カルボン酸、インドール−６−カルボン酸及びキノリン−６−カルボン酸からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の二環ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
前記二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼは、
（１）配列番号１０又は１２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列と７８％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１ないし４に記載の二環ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項６】
２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換することを特徴とする酵素。
【請求項７】
（１）配列番号１０又は１２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列と７８％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号９又は１１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、二環芳香族カルボン酸モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択されるタンパク質を含むことを特徴とする、２−ナフトエ酸を７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸又は８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に変換する酵素組成物。
【請求項８】
電子伝達系タンパク質を含むことを特徴とする、請求項７に記載の酵素組成物。
【請求項９】
８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸及び／又はその誘導体を含むことを特徴とする、蛍光色素。
【請求項１０】
請求項９に記載の蛍光色素を光透過性媒体に分散したことを特徴とする、白色蛍光変換膜。
【請求項１１】
請求項１０に記載の白色蛍光変換膜と、発光素子部とからなることを特徴とする、白色発光素子。
【請求項１２】
３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸。
【請求項１３】
３−ヒドロキシキノリン−６−カルボン酸のエステル結合による重合体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の重合体を含むことを特徴とする、合成樹脂組成物。
【図１−１】
【図１−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−１５８１７７（Ｐ２０１０−１５８１７７Ａ）
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９３３（Ｐ２００９−９３３）
【出願日】平成２１年１月６日（２００９．１．６）
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月６日（２００９．１．６）
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
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