低温発酵性酵母
【課題】
醤油醸造において、短期醸造、低温醸造及び淡色化を可能とする酵母、並びに当該酵母を用いた発酵食品の製造方法を提供する。
【解決手段】
ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属し、温度１０〜２０℃、ｐＨ５．５〜７．０及び食塩分１４〜２５（w/v）％の醤油発酵試験で、仕込みから２０〜５０日経過後にアルコール分が２．０〜３．０（v/v）％であり、全窒素分が１．０〜２．０（w/v）％であり、色度が４０〜６０番である生揚げを生産できる低温発酵性酵母。
醤油醸造において、短期醸造、低温醸造及び淡色化を可能とする酵母、並びに当該酵母を用いた発酵食品の製造方法を提供する。
【解決手段】
ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属し、温度１０〜２０℃、ｐＨ５．５〜７．０及び食塩分１４〜２５（w/v）％の醤油発酵試験で、仕込みから２０〜５０日経過後にアルコール分が２．０〜３．０（v/v）％であり、全窒素分が１．０〜２．０（w/v）％であり、色度が４０〜６０番である生揚げを生産できる低温発酵性酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醤油醸造において、低温かつ高ｐＨの条件であっても増殖、アルコール発酵が旺盛なジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属する酵母、及び当該酵母を使用する発酵飲食品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
醤油醸造では、仕込み直後のもろみを低温に維持する必要がある。これは、乳酸菌による有機酸生成を抑え、もろみのｐＨを高くすることにより、プロテアーゼ活性を維持、すなわち醤油らしい旨味を引き出すためである。従来の醤油酵母は、仕込み直後の低温かつ高ｐＨのもろみ環境では増殖、アルコール発酵能がきわめて低い。そのため、タンパク質の分解がおおむね終了する仕込み後約３０日ごろにもろみを加温し、酵母を添加してアルコール発酵を行う。しかし、醤油の着色は高温、高糖濃度、醸造期間の長期化により促進するため、これら一連のもろみ管理により、醤油が過度に着色してしまう。特に、醤油らしい香味を保ち、淡い色が特徴である淡口醤油では商品価値の低下を招いていた。
【０００３】
醤油の淡色化については次に示すような検討がなされている。
特開２００１−６１４３７号公報「再仕込み醤油の製造法」では、再仕込み醤油の製造において、もろみ品温を仕込み時から熟成終了まで一貫して１５〜２３℃に保持し、かつ低温発酵性酵母を添加することにより、淡麗で、醤油特有の芳醇な香りを濃厚に有する再仕込み醤油を得た。
また、特開平１０−１７９０８３号公報「濃厚醤油の製造法」では、低温での生育能に優れた耐塩性乳酸菌を添加することで、コクのあるうま味を有する本醸造淡色醤油が安定した品質で製造できた。
さらに、特開２００６−２１２０２３号公報「淡色濃厚低塩醤油の製造方法」では、醤油をＮＦ膜で脱色処理し、さらにＮＦ膜で濃縮することにより、淡色・濃厚・低塩である醤油を得た。
【特許文献１】特開２００１−６１４３７号公報
【特許文献２】特開平１０−１７９０８３号公報
【特許文献３】特開２００６−２１２０２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の技術では、淡色であっても酵母による発酵が不十分なため、醤油らしい香味、特に酵母による発酵香やアルコール香を有した醤油はなかった。また、従来の醤油酵母は、仕込み直後の低温かつ高ｐＨのもろみ環境では増殖、発酵能がきわめて低いため、仕込み直後に酵母を添加しても発酵せず、醸造期間が長期化するといった製造上の課題があった。さらに、樹脂や膜を用いて醤油を脱色する方法は、それらの処理が香味成分のバランスにも影響し、醤油が淡色であっても処理前と比べると官能的にも劣ってしまうという課題があった。
【０００５】
本発明者らは、醤油醸造において、もろみが低温かつ高ｐＨであっても速やかに醸造され、淡色かつ発酵香豊かな醤油の製造並びに醤油の短期醸造を可能とする新規な酵母を提供することを目的とする。また、本発明者らは当該酵母を用いた発酵飲食品又は醤油の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても、旺盛に増殖、発酵する酵母を育種し醤油醸造に使用することにより、淡色かつ発酵香豊かな醤油の製造並びに醤油の短期醸造が可能になると考え、鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属し、温度１０〜２０℃、ｐＨ５．５〜７．０及び食塩分１４〜２５（w/v）％の醤油発酵試験で、仕込みから２０〜５０日経過後に、アルコール分が２．０〜３．０（v/v）％であり、全窒素分が１．０〜２．０（w/v）％であり、色度が４０〜６０番である生揚げを生産できる低温発酵性酵母に関する。
また、当該低温発酵性酵母を用いた発酵飲食品又は醤油の製造方法に関する。
【０００７】
本発明において、食塩分、色度、アルコール分、全窒素分、酵母生菌数の分析は、「しょうゆ試験法」（財団法人 日本醤油研究所 しょうゆ試験法編集委員会 編）によって行う。
本発明において、醤油発酵試験とは低温発酵性酵母を選別するための試験である。そのもろみは、醤油麹容量１に対し、適宜調製した食塩水の容量１〜１．５の組成である。
本発明において、発酵飲食品とは、製造工程に微生物を用いることを特徴とするすべての飲料、食品をいう。
本発明において、醤油とは、日本農林規格で定義する、「しょうゆ」をいう。
本発明において、生揚げとは、日本農林規格で定義する、「発酵させ、及び熟成させた醤油もろみを圧搾して得られた状態のままの液体」をいう。
【０００８】
本発明の、ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属する低温発酵性酵母は、温度１０〜２０℃、ｐＨ５．５〜７．０及び食塩分１４〜２５（w/v）％の醤油発酵試験で、仕込みから２０〜５０日経過後に、アルコール分が２．０〜３．０（v/v）％であり、全窒素分が１．０〜２．０（w/v）％であり、色度が４０〜６０番である生揚げを生産できる性質を持つ。これら酵母のうち、低温発酵性酵母Ｋ８を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託した。受領日は平成１９年６月１日、受領番号はＦＥＲＭ ＡＰ−２１３０１である。
本発明は、前述の低温発酵性酵母を使用する発酵飲食品の製造方法である。
本発明は、前述の低温発酵性酵母を使用する醤油の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の低温発酵性酵母を用いると、酵母による醤油らしいアルコール発酵香を有し、かつ色の淡い醤油の製造が可能となる。また、醤油もろみの仕込み直後から酵母によるアルコール発酵が可能となるため、醤油の著しい短期醸造が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても、旺盛に発酵する酵母（以下、低温発酵性酵母）は以下の手法により分離できる。
分離源は、純粋培養酵母並びに発酵飲食品及びそのもろみから分離した酵母群を使用できる。分離源とする純粋培養酵母としては、エタノールを生成できる酵母すべてを用いることができ、特に耐塩性に優れているジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属する酵母が好ましい。また、分離源とする発酵飲食品及びそのもろみとしては、その製造工程に微生物を利用する飲料又は食品であれば何でも良いが、特に醤油や味噌などの含塩発酵飲食品が好ましい。
【００１１】
純粋培養酵母又は酵母群は分離前に変異処理を行っても差し支えない。変異処理としては、紫外線、Ｘ線、γ線などの放射線の照射、化学的変異誘発剤、例えば亜硝酸、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニシン、アクリジン色素誘導体を接触させる方法がある。
【００１２】
純粋培養酵母又は酵母群を生揚げ培養液に接種し、１０〜２０℃の温度条件にて１週間の集積培養を行う。この生揚げ培養液の組成は、例えば、ブドウ糖５０ｇ／ｌ、生揚げ１００ｍｌ／ｌ、クロラムフェニコール１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ５．５〜７．０であり、塩化ナトリウムは最終濃度５０〜２５０ｇ／ｌとなるよう調製する。
生揚げ培養液の塩化ナトリウム濃度が５０ｇ／ｌ未満では、耐塩性酵母以外の雑多な酵母が繁殖し、低温発酵性酵母の選択増殖はできない。また、２５０ｇ／ｌを越えると酵母が生育できないか生育が非常に遅くなり、培養期間が著しく長くなる。ｐＨは５．５〜７．０の範囲でなければ、低温発酵性酵母の選択増殖はできない。培養温度は１０℃未満では、酵母が生育できないか生育が非常に遅くなり、培養期間が著しく長くなる。また、２０℃を越えると、低温発酵性以外の酵母も生育し、低温発酵性酵母の選択増殖はできない。
この集積培養を、振とう培養又は静置培養にて３〜５回繰り返して行う。集積培養を繰り返す方法は、培養後の集積培養液を新たな培養液に１／１００〜１／１０００量接種することにより行う。
【００１３】
次に、ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）以外の酵母を排除するため、最終的に得られた集積培養液を耐塩性酵母培地に塗抹し３０℃にて３日間培養する。耐塩性酵母培地の組成は、例えば、ブドウ糖３０ｇ／ｌ、カザミノ酸４ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ０．５ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１８０ｇ／ｌ、オルソバニリン６〜１２ｍｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ、ｐＨ４．８である。
【００１４】
次に、良好な生育を示すコロニーを単離し、上記耐塩性酵母培地にて数回継代培養を行い、高ｐＨ培養液に接種し１５〜２０℃にて静置培養した後、増殖性に優れた酵母を選別する。増殖性に優れた酵母を選別する方法は、例えば一定時間培養後に培養液の吸光度（ＯＤ660nm）の値を測定し、値の大きい酵母を選別することにより行う。高ｐＨ培養液の組成は、例えば、ブドウ糖３０ｇ／ｌ、カザミノ酸４ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ０．５ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１４０〜２５０ｇ／ｌ好ましくは１６０〜２００ｇ／ｌ、ｐＨ５．５〜７．０である。
塩化ナトリウムの濃度により酵母の増殖可能なｐＨ及び温度は変動する。従って、塩化ナトリウムの濃度が１４０〜２５０ｇ／ｌの範囲でなければ、塩化ナトリウム濃度の高い醤油もろみにおける、低温、高ｐＨ条件の酵母増殖能を正しく評価できない。
【００１５】
次に、選別した酵母について醤油もろみにおける発酵能を指標に、酵母をさらに選別する。すなわち、１０％食塩含有ＹＰＤ培地などの適当な合成培地又は麹汁培地に酵母を培養し、この酵母培養液、醤油麹、食塩水を混合しもろみを仕込む。そのもろみは、醤油麹の容量１に対し、適宜調製した食塩水の容量１〜１．５の組成である。酵母培養液のもろみへの添加は、仕込みと同時に行い、その量はもろみ仕込み時点で酵母生菌数１×１０４〜１０７／ｍｌ好ましくは、１×１０５〜１０６／ｍｌである。このとき、もろみの食塩分は１４〜２５（w/v）％、ｐＨは５．５〜７．０となる。
【００１６】
このもろみを温度１０〜２０℃、好ましくは１３〜１７℃となるよう制御し、２０〜５０日間、好ましくは２５〜３５日間発酵させる。もろみ温度が１０℃未満となると、低温発酵性酵母といえども増殖が著しく遅くなる。また、２０℃を超えると低温発酵性酵母以外の酵母も増殖し選別ができない。
発酵終了後の生揚げの色度、アルコール分、全窒素分を測定し、アルコール分を２．０〜３．０（v/v）％生産したものを、低温発酵性酵母として選別する。このとき、生揚げの色度は４０〜６０番、全窒素分は１．０〜２．０（w/v）％となる。
以下、実施例を示し本発明を説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
【実施例１】
【００１７】
発明者らは低温発酵性酵母を以下の方法により分離した。味噌醤油工場から収集した醤油もろみ、生揚げ、味噌などを、生揚げ培養液（ブドウ糖５０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム８３ｇ／ｌ、生揚げ１００ｍｌ／ｌ、クロラムフェニコール１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ６．０）に接種し、１５℃の温度条件にて１週間集積培養した。この集積培養を、振とう培養にて１回、次いで静置培養にて２回行った。得られた培養液を耐塩性酵母培地（ブドウ糖３０ｇ／ｌ、カザミノ酸４ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ０．５ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１８０ｇ／ｌ、オルソバニリン８ｍｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ、ｐＨ４．８）に塗抹し、３０℃で３日間培養した。次に良好な生育を示したコロニーについて、上述耐塩性酵母培地にて２回継代培養を行い、高ｐＨ培養液（ブドウ糖３０ｇ／ｌ、カザミノ酸４ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ０．５ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物、塩化ナトリウム１８０ｇ／ｌ、ｐＨ６．０）に接種し、１５℃において培養した後、培養液の吸光度（ＯＤ660nm）の値が大きかった酵母１３株を選別した。
【００１８】
選別した酵母について醤油醸造試験を実施した。すなわち、淡口醤油麹８３０ｍｌ、２４（w/v）％食塩水１０００ｍｌの配合にて原料を混合し、直後に酵母を１×１０６／ｍｌの酵母生菌数となるよう添加した。このとき、もろみの食塩分は１８（w/v）％、ｐＨは６．０であった。また、もろみの温度は１５℃一定とした。仕込みから３０日経過後に、もろみの酵母生菌数、生揚げのアルコール分、色度、全窒素分、ブドウ糖濃度を測定した。ブドウ糖濃度は、高速液体クロマトグラフによる絶対検量線法により定量した。
【００１９】
結果を表１に示した。醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても旺盛に増殖、発酵し、仕込み後３０日でアルコール分を２．０〜３．０（v/v）％生産できる低温発酵性酵母を７株選別できた。選別した酵母を表１の評価欄の○印で示した。また、低温発酵性酵母７株のもろみ中における酵母生菌数は１．９〜４．０×１０７／ｍｌであり、得られた生揚げは、ブドウ糖濃度２．０〜３．３（w/v）％、色度４５番、全窒素分１．３（w/v）％であり、発酵香が豊かであった。これら低温発酵性酵母のうち、Ｋ８を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託した。受領日は平成１９年６月１日、受領番号はＦＥＲＭ ＡＰ−２１３０１である。
以上のことから低温発酵性酵母は、醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても、非常に優れた増殖、発酵能を示すことがわかる。これにより、仕込み後わずか３０日で醤油らしいアルコール発酵香を有し、かつ色の淡い生揚げを生産することができる。
【００２０】
（比較例１）
既存醤油用酵母であるジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属する酵母Ｓ３２を用いて、実施例１と同様の条件で醤油醸造試験を行った。仕込みから３０日経過後における分析結果を表１に示す。Ｓ３２は、もろみ中の酵母生菌数０．５×１０７／ｍｌ、生揚げのブドウ糖濃度５．７（w/v）％、アルコール分０．３（v/v）％であり、著しく増殖、発酵が遅れていることがわかる。また、仕込み後１２０日まで発酵を継続しても、アルコール分が１．１（v/v）％であり、醤油らしい発酵香を有した生揚げを生産することはできなかった。また、そのときの色度は３２番であり、長期間の醸造により着色が過度に進んでしまった。
【実施例２】
【００２１】
低温発酵性酵母Ｋ８を用いた醤油醸造試験を実施した。すなわち、淡口醤油麹２６ｌ、２４（w/v）％食塩水３４ｌの配合にて原料を混合し、直後に酵母を１×１０５／ｍｌの酵母生菌数となるよう添加した。このとき、もろみの食塩分は１８（w/v）％、ｐＨは６．０であった。また、もろみの温度は１３〜２０℃とした。仕込みから２８日経過後に、もろみの酵母生菌数、生揚げのアルコール分、色度、全窒素分を測定した。
その結果を表２に示した。低温発酵性酵母Ｋ８は、醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても旺盛に増殖、発酵し、仕込み後２８日で、もろみ中の酵母生菌数０．７４×１０７／ｍｌであり、得られた生揚げは、アルコール分２．０（v/v）％、色度４５番、全窒素分１．４（w/v）％であり、発酵香が豊かであった。
以上のことから低温発酵性酵母Ｋ８は、醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても、非常に優れた増殖、発酵能を示すことがわかる。これにより、仕込み後わずか２８日で醤油らしいアルコール発酵香を有し、かつ色の淡い生揚げを生産することができる。
【００２２】
（比較例２）
既存醤油用酵母であるジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属する酵母Ｓ３２を用いて、実施例２と同様の条件で醤油醸造試験を行った。仕込みから２８日経過後における分析結果を表２に示す。Ｓ３２は、もろみ中の酵母生菌数０．３×１０７／ｍｌ、生揚げのアルコール分０．６（v/v）％であり、著しく増殖、発酵が遅れていることがわかる。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明により、醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても、旺盛に発酵する酵母を育種し醤油醸造に使用することにより、淡色かつ発酵香豊かな醤油の製造並びに醤油の短期醸造が可能になった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醤油醸造において、低温かつ高ｐＨの条件であっても増殖、アルコール発酵が旺盛なジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属する酵母、及び当該酵母を使用する発酵飲食品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
醤油醸造では、仕込み直後のもろみを低温に維持する必要がある。これは、乳酸菌による有機酸生成を抑え、もろみのｐＨを高くすることにより、プロテアーゼ活性を維持、すなわち醤油らしい旨味を引き出すためである。従来の醤油酵母は、仕込み直後の低温かつ高ｐＨのもろみ環境では増殖、アルコール発酵能がきわめて低い。そのため、タンパク質の分解がおおむね終了する仕込み後約３０日ごろにもろみを加温し、酵母を添加してアルコール発酵を行う。しかし、醤油の着色は高温、高糖濃度、醸造期間の長期化により促進するため、これら一連のもろみ管理により、醤油が過度に着色してしまう。特に、醤油らしい香味を保ち、淡い色が特徴である淡口醤油では商品価値の低下を招いていた。
【０００３】
醤油の淡色化については次に示すような検討がなされている。
特開２００１−６１４３７号公報「再仕込み醤油の製造法」では、再仕込み醤油の製造において、もろみ品温を仕込み時から熟成終了まで一貫して１５〜２３℃に保持し、かつ低温発酵性酵母を添加することにより、淡麗で、醤油特有の芳醇な香りを濃厚に有する再仕込み醤油を得た。
また、特開平１０−１７９０８３号公報「濃厚醤油の製造法」では、低温での生育能に優れた耐塩性乳酸菌を添加することで、コクのあるうま味を有する本醸造淡色醤油が安定した品質で製造できた。
さらに、特開２００６−２１２０２３号公報「淡色濃厚低塩醤油の製造方法」では、醤油をＮＦ膜で脱色処理し、さらにＮＦ膜で濃縮することにより、淡色・濃厚・低塩である醤油を得た。
【特許文献１】特開２００１−６１４３７号公報
【特許文献２】特開平１０−１７９０８３号公報
【特許文献３】特開２００６−２１２０２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の技術では、淡色であっても酵母による発酵が不十分なため、醤油らしい香味、特に酵母による発酵香やアルコール香を有した醤油はなかった。また、従来の醤油酵母は、仕込み直後の低温かつ高ｐＨのもろみ環境では増殖、発酵能がきわめて低いため、仕込み直後に酵母を添加しても発酵せず、醸造期間が長期化するといった製造上の課題があった。さらに、樹脂や膜を用いて醤油を脱色する方法は、それらの処理が香味成分のバランスにも影響し、醤油が淡色であっても処理前と比べると官能的にも劣ってしまうという課題があった。
【０００５】
本発明者らは、醤油醸造において、もろみが低温かつ高ｐＨであっても速やかに醸造され、淡色かつ発酵香豊かな醤油の製造並びに醤油の短期醸造を可能とする新規な酵母を提供することを目的とする。また、本発明者らは当該酵母を用いた発酵飲食品又は醤油の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても、旺盛に増殖、発酵する酵母を育種し醤油醸造に使用することにより、淡色かつ発酵香豊かな醤油の製造並びに醤油の短期醸造が可能になると考え、鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属し、温度１０〜２０℃、ｐＨ５．５〜７．０及び食塩分１４〜２５（w/v）％の醤油発酵試験で、仕込みから２０〜５０日経過後に、アルコール分が２．０〜３．０（v/v）％であり、全窒素分が１．０〜２．０（w/v）％であり、色度が４０〜６０番である生揚げを生産できる低温発酵性酵母に関する。
また、当該低温発酵性酵母を用いた発酵飲食品又は醤油の製造方法に関する。
【０００７】
本発明において、食塩分、色度、アルコール分、全窒素分、酵母生菌数の分析は、「しょうゆ試験法」（財団法人 日本醤油研究所 しょうゆ試験法編集委員会 編）によって行う。
本発明において、醤油発酵試験とは低温発酵性酵母を選別するための試験である。そのもろみは、醤油麹容量１に対し、適宜調製した食塩水の容量１〜１．５の組成である。
本発明において、発酵飲食品とは、製造工程に微生物を用いることを特徴とするすべての飲料、食品をいう。
本発明において、醤油とは、日本農林規格で定義する、「しょうゆ」をいう。
本発明において、生揚げとは、日本農林規格で定義する、「発酵させ、及び熟成させた醤油もろみを圧搾して得られた状態のままの液体」をいう。
【０００８】
本発明の、ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属する低温発酵性酵母は、温度１０〜２０℃、ｐＨ５．５〜７．０及び食塩分１４〜２５（w/v）％の醤油発酵試験で、仕込みから２０〜５０日経過後に、アルコール分が２．０〜３．０（v/v）％であり、全窒素分が１．０〜２．０（w/v）％であり、色度が４０〜６０番である生揚げを生産できる性質を持つ。これら酵母のうち、低温発酵性酵母Ｋ８を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託した。受領日は平成１９年６月１日、受領番号はＦＥＲＭ ＡＰ−２１３０１である。
本発明は、前述の低温発酵性酵母を使用する発酵飲食品の製造方法である。
本発明は、前述の低温発酵性酵母を使用する醤油の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の低温発酵性酵母を用いると、酵母による醤油らしいアルコール発酵香を有し、かつ色の淡い醤油の製造が可能となる。また、醤油もろみの仕込み直後から酵母によるアルコール発酵が可能となるため、醤油の著しい短期醸造が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても、旺盛に発酵する酵母（以下、低温発酵性酵母）は以下の手法により分離できる。
分離源は、純粋培養酵母並びに発酵飲食品及びそのもろみから分離した酵母群を使用できる。分離源とする純粋培養酵母としては、エタノールを生成できる酵母すべてを用いることができ、特に耐塩性に優れているジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属する酵母が好ましい。また、分離源とする発酵飲食品及びそのもろみとしては、その製造工程に微生物を利用する飲料又は食品であれば何でも良いが、特に醤油や味噌などの含塩発酵飲食品が好ましい。
【００１１】
純粋培養酵母又は酵母群は分離前に変異処理を行っても差し支えない。変異処理としては、紫外線、Ｘ線、γ線などの放射線の照射、化学的変異誘発剤、例えば亜硝酸、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニシン、アクリジン色素誘導体を接触させる方法がある。
【００１２】
純粋培養酵母又は酵母群を生揚げ培養液に接種し、１０〜２０℃の温度条件にて１週間の集積培養を行う。この生揚げ培養液の組成は、例えば、ブドウ糖５０ｇ／ｌ、生揚げ１００ｍｌ／ｌ、クロラムフェニコール１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ５．５〜７．０であり、塩化ナトリウムは最終濃度５０〜２５０ｇ／ｌとなるよう調製する。
生揚げ培養液の塩化ナトリウム濃度が５０ｇ／ｌ未満では、耐塩性酵母以外の雑多な酵母が繁殖し、低温発酵性酵母の選択増殖はできない。また、２５０ｇ／ｌを越えると酵母が生育できないか生育が非常に遅くなり、培養期間が著しく長くなる。ｐＨは５．５〜７．０の範囲でなければ、低温発酵性酵母の選択増殖はできない。培養温度は１０℃未満では、酵母が生育できないか生育が非常に遅くなり、培養期間が著しく長くなる。また、２０℃を越えると、低温発酵性以外の酵母も生育し、低温発酵性酵母の選択増殖はできない。
この集積培養を、振とう培養又は静置培養にて３〜５回繰り返して行う。集積培養を繰り返す方法は、培養後の集積培養液を新たな培養液に１／１００〜１／１０００量接種することにより行う。
【００１３】
次に、ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）以外の酵母を排除するため、最終的に得られた集積培養液を耐塩性酵母培地に塗抹し３０℃にて３日間培養する。耐塩性酵母培地の組成は、例えば、ブドウ糖３０ｇ／ｌ、カザミノ酸４ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ０．５ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１８０ｇ／ｌ、オルソバニリン６〜１２ｍｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ、ｐＨ４．８である。
【００１４】
次に、良好な生育を示すコロニーを単離し、上記耐塩性酵母培地にて数回継代培養を行い、高ｐＨ培養液に接種し１５〜２０℃にて静置培養した後、増殖性に優れた酵母を選別する。増殖性に優れた酵母を選別する方法は、例えば一定時間培養後に培養液の吸光度（ＯＤ660nm）の値を測定し、値の大きい酵母を選別することにより行う。高ｐＨ培養液の組成は、例えば、ブドウ糖３０ｇ／ｌ、カザミノ酸４ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ０．５ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１４０〜２５０ｇ／ｌ好ましくは１６０〜２００ｇ／ｌ、ｐＨ５．５〜７．０である。
塩化ナトリウムの濃度により酵母の増殖可能なｐＨ及び温度は変動する。従って、塩化ナトリウムの濃度が１４０〜２５０ｇ／ｌの範囲でなければ、塩化ナトリウム濃度の高い醤油もろみにおける、低温、高ｐＨ条件の酵母増殖能を正しく評価できない。
【００１５】
次に、選別した酵母について醤油もろみにおける発酵能を指標に、酵母をさらに選別する。すなわち、１０％食塩含有ＹＰＤ培地などの適当な合成培地又は麹汁培地に酵母を培養し、この酵母培養液、醤油麹、食塩水を混合しもろみを仕込む。そのもろみは、醤油麹の容量１に対し、適宜調製した食塩水の容量１〜１．５の組成である。酵母培養液のもろみへの添加は、仕込みと同時に行い、その量はもろみ仕込み時点で酵母生菌数１×１０４〜１０７／ｍｌ好ましくは、１×１０５〜１０６／ｍｌである。このとき、もろみの食塩分は１４〜２５（w/v）％、ｐＨは５．５〜７．０となる。
【００１６】
このもろみを温度１０〜２０℃、好ましくは１３〜１７℃となるよう制御し、２０〜５０日間、好ましくは２５〜３５日間発酵させる。もろみ温度が１０℃未満となると、低温発酵性酵母といえども増殖が著しく遅くなる。また、２０℃を超えると低温発酵性酵母以外の酵母も増殖し選別ができない。
発酵終了後の生揚げの色度、アルコール分、全窒素分を測定し、アルコール分を２．０〜３．０（v/v）％生産したものを、低温発酵性酵母として選別する。このとき、生揚げの色度は４０〜６０番、全窒素分は１．０〜２．０（w/v）％となる。
以下、実施例を示し本発明を説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
【実施例１】
【００１７】
発明者らは低温発酵性酵母を以下の方法により分離した。味噌醤油工場から収集した醤油もろみ、生揚げ、味噌などを、生揚げ培養液（ブドウ糖５０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム８３ｇ／ｌ、生揚げ１００ｍｌ／ｌ、クロラムフェニコール１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ６．０）に接種し、１５℃の温度条件にて１週間集積培養した。この集積培養を、振とう培養にて１回、次いで静置培養にて２回行った。得られた培養液を耐塩性酵母培地（ブドウ糖３０ｇ／ｌ、カザミノ酸４ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ０．５ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１８０ｇ／ｌ、オルソバニリン８ｍｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ、ｐＨ４．８）に塗抹し、３０℃で３日間培養した。次に良好な生育を示したコロニーについて、上述耐塩性酵母培地にて２回継代培養を行い、高ｐＨ培養液（ブドウ糖３０ｇ／ｌ、カザミノ酸４ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ０．５ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物、塩化ナトリウム１８０ｇ／ｌ、ｐＨ６．０）に接種し、１５℃において培養した後、培養液の吸光度（ＯＤ660nm）の値が大きかった酵母１３株を選別した。
【００１８】
選別した酵母について醤油醸造試験を実施した。すなわち、淡口醤油麹８３０ｍｌ、２４（w/v）％食塩水１０００ｍｌの配合にて原料を混合し、直後に酵母を１×１０６／ｍｌの酵母生菌数となるよう添加した。このとき、もろみの食塩分は１８（w/v）％、ｐＨは６．０であった。また、もろみの温度は１５℃一定とした。仕込みから３０日経過後に、もろみの酵母生菌数、生揚げのアルコール分、色度、全窒素分、ブドウ糖濃度を測定した。ブドウ糖濃度は、高速液体クロマトグラフによる絶対検量線法により定量した。
【００１９】
結果を表１に示した。醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても旺盛に増殖、発酵し、仕込み後３０日でアルコール分を２．０〜３．０（v/v）％生産できる低温発酵性酵母を７株選別できた。選別した酵母を表１の評価欄の○印で示した。また、低温発酵性酵母７株のもろみ中における酵母生菌数は１．９〜４．０×１０７／ｍｌであり、得られた生揚げは、ブドウ糖濃度２．０〜３．３（w/v）％、色度４５番、全窒素分１．３（w/v）％であり、発酵香が豊かであった。これら低温発酵性酵母のうち、Ｋ８を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託した。受領日は平成１９年６月１日、受領番号はＦＥＲＭ ＡＰ−２１３０１である。
以上のことから低温発酵性酵母は、醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても、非常に優れた増殖、発酵能を示すことがわかる。これにより、仕込み後わずか３０日で醤油らしいアルコール発酵香を有し、かつ色の淡い生揚げを生産することができる。
【００２０】
（比較例１）
既存醤油用酵母であるジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属する酵母Ｓ３２を用いて、実施例１と同様の条件で醤油醸造試験を行った。仕込みから３０日経過後における分析結果を表１に示す。Ｓ３２は、もろみ中の酵母生菌数０．５×１０７／ｍｌ、生揚げのブドウ糖濃度５．７（w/v）％、アルコール分０．３（v/v）％であり、著しく増殖、発酵が遅れていることがわかる。また、仕込み後１２０日まで発酵を継続しても、アルコール分が１．１（v/v）％であり、醤油らしい発酵香を有した生揚げを生産することはできなかった。また、そのときの色度は３２番であり、長期間の醸造により着色が過度に進んでしまった。
【実施例２】
【００２１】
低温発酵性酵母Ｋ８を用いた醤油醸造試験を実施した。すなわち、淡口醤油麹２６ｌ、２４（w/v）％食塩水３４ｌの配合にて原料を混合し、直後に酵母を１×１０５／ｍｌの酵母生菌数となるよう添加した。このとき、もろみの食塩分は１８（w/v）％、ｐＨは６．０であった。また、もろみの温度は１３〜２０℃とした。仕込みから２８日経過後に、もろみの酵母生菌数、生揚げのアルコール分、色度、全窒素分を測定した。
その結果を表２に示した。低温発酵性酵母Ｋ８は、醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても旺盛に増殖、発酵し、仕込み後２８日で、もろみ中の酵母生菌数０．７４×１０７／ｍｌであり、得られた生揚げは、アルコール分２．０（v/v）％、色度４５番、全窒素分１．４（w/v）％であり、発酵香が豊かであった。
以上のことから低温発酵性酵母Ｋ８は、醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても、非常に優れた増殖、発酵能を示すことがわかる。これにより、仕込み後わずか２８日で醤油らしいアルコール発酵香を有し、かつ色の淡い生揚げを生産することができる。
【００２２】
（比較例２）
既存醤油用酵母であるジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属する酵母Ｓ３２を用いて、実施例２と同様の条件で醤油醸造試験を行った。仕込みから２８日経過後における分析結果を表２に示す。Ｓ３２は、もろみ中の酵母生菌数０．３×１０７／ｍｌ、生揚げのアルコール分０．６（v/v）％であり、著しく増殖、発酵が遅れていることがわかる。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明により、醤油もろみ仕込み直後の低温かつ高ｐＨの条件であっても、旺盛に発酵する酵母を育種し醤油醸造に使用することにより、淡色かつ発酵香豊かな醤油の製造並びに醤油の短期醸造が可能になった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属し、温度１０〜２０℃、ｐＨ５．５〜７．０及び食塩分１４〜２５（w/v）％の醤油発酵試験で、仕込みから２０〜５０日経過後に、アルコール分が２．０〜３．０（v/v）％であり、全窒素分が１．０〜２．０（w/v）％であり、色度が４０〜６０番である生揚げを生産できる低温発酵性酵母。
【請求項２】
ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）Ｋ８（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１３０１）である、請求項１記載の低温発酵性酵母。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の低温発酵性酵母を用いる発酵飲食品の製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の低温発酵性酵母を用いる醤油の製造方法。
【請求項１】
ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）に属し、温度１０〜２０℃、ｐＨ５．５〜７．０及び食塩分１４〜２５（w/v）％の醤油発酵試験で、仕込みから２０〜５０日経過後に、アルコール分が２．０〜３．０（v/v）％であり、全窒素分が１．０〜２．０（w/v）％であり、色度が４０〜６０番である生揚げを生産できる低温発酵性酵母。
【請求項２】
ジゴサッカロミセスロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）Ｋ８（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１３０１）である、請求項１記載の低温発酵性酵母。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の低温発酵性酵母を用いる発酵飲食品の製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の低温発酵性酵母を用いる醤油の製造方法。
【公開番号】特開２００８−３０１７５９（Ｐ２００８−３０１７５９Ａ）
【公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１５１５８５（Ｐ２００７−１５１５８５）
【出願日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 社団法人日本生物工学会九州支部主催「第１３回日本生物工学会九州支部大会（平成１８年１２月９日開催）」
【出願人】（５９１１５５２４２）鹿児島県 (56)
【出願人】（５０７１８７９２７）鹿児島県醤油醸造協同組合 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 社団法人日本生物工学会九州支部主催「第１３回日本生物工学会九州支部大会（平成１８年１２月９日開催）」
【出願人】（５９１１５５２４２）鹿児島県 (56)
【出願人】（５０７１８７９２７）鹿児島県醤油醸造協同組合 (1)
【Ｆターム（参考）】
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