免疫刺激複合体の調製及びその使用
本発明は少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含む組成物であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含むものに関する。複合体は免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスであることができる。本発明は免疫調節剤及びアジュバント、免疫感作のための、例えばモノクローナル抗体の製造のための処方、及びワクチンの調製のためのかかる混合物の使用にも関する。少なくとも二種の部分を含む部分のキットであって、各部分が本発明による一種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスを含む部分のキットも開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含む組成物であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分を含むもの、及びワクチンを含む免疫感作のために使用される処方における免疫調節剤又はアジュバントとしてのこの組成物の使用に関する。特に、本発明は免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックスアジュバント化ワクチンにおけるキラヤサポニンの精製された、半精製された又は規定された画分の使用に関する。本発明によるサポニン調製物の使用は増大した耐性及び増大した免疫原性を有する製品を生ずる。調製物は免疫原性を調整して炎症、過敏感性及びアレルギー反応の増大した制御を与えるために用いられることができる。
【背景技術】
【０００２】
キラヤサポニンの免疫刺激特性は古くから知られており（Ｒａｍｏｎ １９２６）、キラヤサポニンは１９５０年代から商業的なワクチンにおいて遊離形態で、時にはＡｌ（ＯＨ）３と組合せて使用されてきた（Ｄａｌｓｇａａｒｄ １９７８，Ｍａら１９９４，Ｅｓｐｉｎｅｔ １９５１）。従来の遊離形態と比べて実質的により有効なキラヤサポニンの使用はＭｏｒｅｉｎらによって１９８４年のＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）技術に（ＥＰ ０１０９９４２Ｂ１，ＥＰ ０２４２３８０Ｂ１及びＥＰ ０１８０５６４Ｂ１）及び数年後にＩＳＣＯＭマトリックス技術に（Ｌｏｅｖｇｒｅｎ及びＭｏｒｅｉｎ １９８８，ＥＰ ０４３６６２０Ｂ１）記載された。免疫刺激複合体技術を用いて、ワクチン抗原はキラヤサポニン、コレステロール及びリン脂質からなる４０ｎｍの複合体に組入れられる。ＩＳＣＯＭマトリックス技術はキラヤサポニン：コレステロール：リン脂質複合体を抗原と混合された（関連されていない）状態で用いる。両方の技術はキラヤサポニンの溶血活性（局所的な副作用をもたらし、キラヤサポニン調製物の総合的な毒性に加えられる特性）を減少させるか又は消去する（Ｂｏｍｆｏｄら、１９９２）。
【０００３】
キラヤサポニン調製物は界面活性グリコシドの不均一な混合物であり、予期されかつ一貫性のあるアジュバント活性を持つ一群を見出す／規定することにおける深刻な問題は、キラヤ・サポナリア・モリナと表される「均一な」画分の単離及び特性決定に導いた（Ｄａｌｓｇａａｒｄ、１９７４）。この画分は広範囲の関連構造を含むことが後になって示され、逆相ＨＰＬＣによって画分／ピークへと更に精製された（Ｋｅｎｓｉｌ １９８８，１９９１，Ｋｅｒｓｔｅｎ １９９０ ＥＰ ０３６２２７９Ｂ２，ＥＰ ０５５５２７６Ｂ１）。この精製の動機は容易に特性決定され規定されるサポニンの均一な画分を生成させることのみならず、毒性の低い製品を規定することでもあった。急性毒性又は副作用は、ワクチン調製物におけるキラヤサポニンの獣医学的及び特にヒトに対する使用の両方についての主要な関心事であった。これらの目的は部分的にのみ達成された。即ち、精製された画分（例えばＱＡ−２１（ＥＰ ０３６２２７９Ｂ２））及び画分ＡとＣの組合せ（ＷＯ ９６／１１７１１、Ｉｓｃｏｔｅｃ特許）は実際、キラヤ・サポナリア・モリナと比べて化学的に規定されたが、それらはなおいくらかの毒性及び副作用を生じた。画分Ａが実質的に毒性を有さないという事実にもかかわらず、７０％の画分Ａと３０％の画分Ｃからなる混合物はキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの１００％と同程度の毒性を有していたか又はキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの１００％よりほんの少し毒性が低いだけであった。
【０００４】
本発明を導くための研究において、異なるキラヤサポニン画分は毒性が異なるのみならず、免疫調節特性も異なることが示された（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、ＥＰ ０３６２２７９Ｂ２）。これらの画分を組合せることによって異なる免疫調節能力が得られた。例えばＴｈ１誘導又はＴｈ２誘導能力が得られた。しかし、許容できる処方中で用いられるべき各画分の量を制限する副作用を減少させることが望ましい。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は別個の存在（粒子）としての免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックス中でのキラヤサポニンの少なくとも二種の精製されたピーク又は規定された画分の使用に関する。即ち、これらの画分は全く同一の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックス粒子では組合されず、異なる負荷を持つ粒子が一緒に混合されて免疫感作のための処方を構成する。それぞれがキラヤ・サポナリア・モリナの異なる画分を含む免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物はこれらのキラヤ・サポナリア・モリナ画分が同一の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックス粒子中に組入れられた場合より低い毒性を有することが驚くべきことに判明した。例えば画分Ａマトリックスと画分Ｃマトリックスの混合物、又は画分Ａマトリックスもしくは画分Ｃマトリックス単独の使用は同一の画分が同一の免疫刺激複合体マトリックス中に組入れられたときよりマウスにおいてかなり毒性が低かった（実施例４、表１）。さらに、免疫原性又は免疫調節特性はより調整しやすく、標的種及びワクチン抗原の必要性／要求の両方について最適化された改良されたワクチン処方を作る可能性がかなり増大する。
【０００６】
マウスはキラヤサポニンに対して特に敏感であり、過剰投与すると４日以内に、しばしば２４時間以内に死亡する。それ故、マウスは本発明に従って調製された処方の毒性及び免疫原性の効果を監視するために用いられた。キラヤサポニンに対する感受性の種間変異は大きく、許容可能な処方を得るための種最適化の必要性を反映するが、ワクチン処方の最適の免疫原性を得るための調整の必要性も反映する。例えばウマは多量のキラヤサポニンを投与しても死亡しないが、ウマは遊離のキラヤ・サポナリア・モリナ、キラヤ・サポナリア・モリナから製造された免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックス又はキラヤ・サポナリア・モリナの混合画分の注射後、発熱して局所的な副作用を示す傾向がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含む組成物であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｉｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）からの本質的に一種のサポニン画分を含む組成物に関する。免疫刺激複合体は免疫刺激複合体マトリックス又は免疫刺激複合体であることができる。
【０００８】
免疫刺激複合体は少なくとも一種のグリコシド、少なくとも一種の脂質及び少なくとも一種の抗原物質を含む。脂質は少なくともコレステロールの如きステロールであり、所望によりホスファチジルコリンであることができる。この複合体は一種以上の他の免疫調節（アジュバント活性）物質を含むこともでき、ＥＰ ０１０９９４２Ｂ１，ＥＰ ０２４２３８０Ｂ１及びＥＰ ０１８０５６４Ｂ１に記載されたようにして製造することができる。
【０００９】
免疫刺激複合体マトリックスは少なくとも一種のグリコシド及び少なくとも一種の脂質を含む。脂質は少なくともコレステロールの如きステロールであり、所望によりホスファチジルコリンであることができる。この複合体は一種以上の他の免疫調節（アジュバント活性）物質（サポニンである必要はない）を含むこともでき、ＥＰ ０４３６６２０Ｂ１に記載されたようにして製造することができる。
【００１０】
本発明による組成物は免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスのみを含むか又は免疫刺激複合体と免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含むことができる。異なる免疫刺激複合体及び／又は免疫刺激複合体マトリックスが混合されることができ、その場合キラヤ・サポナリア・モリナからの異なるサポニン画分が用いられる。
【００１１】
本発明は免疫調節剤の調製のための少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分を含む使用も包含する。
【００１２】
本発明の他の側面はワクチンの調製のための少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分及び少なくとも一種の抗原を含む使用である。
【００１３】
本発明のさらなる側面はアジュバントの調製のための少なくとも二種の免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分を含む使用である。
【００１４】
本発明に従って免疫刺激複合体マトリックス中に組入れられるか又は免疫刺激複合体マトリックスと関連される免疫原はヒト又は他の動物の如き（しかしこれらに限定されない）個体における免疫応答を誘導することができるいかなる化学物質であることができる。この免疫応答は細菌、ウイルス、マイコプラズマ又は他の微生物に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答を含むがこれらに限定されない。特異的な免疫原はタンパク質又はペプチド、炭水化物、多糖、リポ多糖又はリポペプチド、又はこれらの組合せであることができる。
【００１５】
特に、特異的な免疫原は天然のタンパク質又はタンパク質断片、又は合成のタンパク質又はタンパク質断片又はペプチドを含むことができる。特異的な免疫原は糖タンパク質、糖ペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、核タンパク質、核ペプチドを含むことができる。特異的な免疫原はペプチド−ペプチドコンジュゲートを含むことができる。特異的な免疫原は組換え核酸発現生成物を含むことができる。
【００１６】
かかる免疫原の例はＥＰ ０１０９９４２Ｂ１に列挙されており、ウイルス性又は細菌性肝炎、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、はしか、おたふくかぜ、風疹、ポリオ、肺炎双球菌、ヘルペス、呼吸器のシンシチアル（ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、血友病インフルエンザ、クラミジア、水痘−帯状疱疹ウイルス、狂犬病、又はヒトの免疫不全ウイルスに対して免疫応答を誘発することができるものを含むがこれらに限定されない。
【００１７】
抗原は免疫刺激複合体中に組入れられるか又は免疫刺激複合体もしくは免疫刺激複合体マトリックス上に結合されるか又は免疫刺激複合体及び／又は免疫刺激複合体マトリックスと混合されることができる。かかる免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスのいかなる混合物も使用されることができる。一種以上の抗原が用いられることができ、移送及び乗客（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ）抗原もＥＰ ９６００６４７−３（ＰＣＴ／ＳＥ ９７／００２８９）に記載のように用いられることができる。
【００１８】
用いられる脂質は特に出願人の特許ＥＰ ０１０９９４２Ｂ１（特に第３頁）に及び特許ＥＰ ０４３６６２０Ｂ１の第７頁第７行〜第２４行に記載されているものである。特にコレステロールの如きステロール及びホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンの如きリン脂質が用いられる。細胞結合成分に結合する脂質含有受容体（例えばコレラ毒受容体（ガングリオシドＧＭ１）を含む糖脂質）及びフコース化血群抗原が用いられることができる。細胞結合成分は粘膜標的化分子として作用し、脂質含有物質を含む複合体と単に混合されるだけで脂質含有物質に結合されることができる。かかる受容体及びかかる受容体を含む免疫刺激複合体はＷＯ ９７／３０７２８に記載されている。
【００１９】
用語「キラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分」は本明細書及び特許請求の範囲を通してキラヤ・サポナリアの半精製された又は規定されたサポニン画分又は実質的に精製された画分の総称として用いられる。この画分は、本質的に一種の画分を含む免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物が用いられたときに得られる良好な結果に負の影響を与えるいかなる他の画分も含まないということは重要である。サポニン調製物は所望により少量の、例えば４０重量％までの、３０重量％までの、２５重量％までの、２０重量％までの、１５重量％までの、１０重量％までの、７重量％までの、５重量％までの、２重量％までの、１重量％までの、０．５重量％までの、０．１重量％までの、他の化合物（他のサポニンや他のアジュバント材料の如き）を含むことができる。
【００２０】
本発明によるサポニン画分はＷＯ ９６／１１７１１に記載のＡ，Ｂ及びＣ画分、ＥＰ ０４３６６２０に記載のＢ３，Ｂ４及びＢ４ｂ画分、ＥＰ ０３６２２７９Ｂ２に記載の画分ＱＡ１−２２，Ｑ−ＶＡＣ（Ｎｏｒ−Ｆｅｅｄ，ＡＳ Ｄｅｎｍａｒｋ）、又はキラヤ・サポナリア・モリナスピコシド（Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ，Ｕｌｔｕｎａａｌｌｅｎ ２Ｂ，７５６ ５１ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）であることができる。
【００２１】
ＥＰ ０３６３２２７９Ｂ２の画分ＱＡ−１−２−３−４−５−６−７−８−９−１０−１１−１２−１３−１４−１５−１６−１７−１８−１９−２０−２１及び２２、特にＱＡ−７，１７−１８及び２１が用いられることができる。これらはＥＰ ０３６２２７９Ｂ２に、特に第６頁及び第８頁及び第９頁の実施例１に記載されている。
【００２２】
ＷＯ ９６／１１７１１に記載の画分Ａ，Ｂ及びＣは粗キラヤ・サポナリア・モリナ水性抽出物のクロマトグラフィー分離及び親油性画分を回収するための７０％アセトニトリル水溶液を用いた溶離により得られた親油性画分から調製される。この親油性画分は次に２５〜６０％のアセトニトリル酸性水溶液の勾配を用いた溶離での半精製ＨＰＬＣによって分離される。ここで「画分Ａ」又は「ＱＨ−Ａ」と称される画分は約３９％のアセトニトリルで溶離される画分であるか又はこの画分に相当する。ここで「画分Ｂ」又は「ＱＨ−Ｂ」と称される画分は約４７％のアセトニトリルで溶離される画分であるか又はこの画分に相当する。ここで「画分Ｃ」又は「ＱＨ−Ｃ」と称される画分は約４９％のアセトニトリルで溶離される画分であるか又はこの画分に相当する。
【００２３】
キラヤ・サポナリア・モリナの異なる画分を含む免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスを組合せることにより、毒性の少ない調製物を製造することが可能である。組成物の効果は受容体によって媒介される、即ち複合体を認識する抗原呈示細胞（ＡＰＣ）上の受容体によるように思われることも判明している。従って、キラヤ・サポナリア・モリナの二種の異なる画分が同一の免疫刺激複合体中に組入れられた場合、この複合体は画分１に対して親和性を有する受容体及び画分２に対して親和性を有する受容体に、即ち二組の受容体に結合するであろう。一方、画分が別個の免疫刺激複合体粒子又は免疫刺激複合体マトリックス粒子中にある場合、各粒子は対応する受容体に結合し、この受容体はそれが親和性を有する受容体に限られるであろう。ＡＰＣ上の二組の受容体が同一の粒子によって刺激された場合、これは副作用をもたらす強い効果を生ずるかもしれない。さらに、複合体が受容体を介してそれらの作用を発揮する方法は異なる種において異なるかもしれない。従って、キラヤ・サポナリア・モリナの異なる画分のそれらの含有量に基づいていかなる組合せの免疫刺激複合体の重量％も用いられることができる。
【００２４】
本発明によるサポニン調製物の使用は増大した耐性及び増大した免疫原性を有する製品を生ずる。調製物は免疫原性を調整して炎症、過敏感性及びアレルギー反応の増大した制御を与えるために用いられることができる。この調整は種依存であることができ、毒性、耐性及び免疫原性に影響を与えることができる。
【００２５】
いかなる比率の亜画分のキラヤ・サポナリア・モリナサポニンも用いられることができる。また、いかなる組合せの亜画分のキラヤ・サポナリア・モリナも用いられることができる。従って、二種以上の亜画分は免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスにそれぞれ組入れられることができ、本発明による混合物中で用いられることができる。
【００２６】
好ましくは、画分キラヤ・サポナリア・モリナ及び画分Ｑｕｉｌ Ｃが異なる免疫刺激複合体又はマトリックス中に別個に組入れられた免疫刺激複合体及び／又はマトリックスの混合物が用いられる。上述の通り、キラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ及びＣのそれらの含有量に基づく異なる免疫刺激複合体の重量％のいかなる組合せも用いられることができる。混合物は免疫刺激複合体中のキラヤ・サポナリア・モリナの合計画分Ａ及びＣの含有量に基づいて計算して０．１〜９９．９重量％の、５〜９５重量％の、１０〜９０重量％の、１５〜８５重量％の、２０〜８０重量％の、２５〜７５重量％の、３０〜７０重量％の、３５〜６５重量％の、４０〜６０重量％の、４５〜５５重量％の、５０〜５０重量％の、５５〜４５重量％の、６０〜４０重量％の、６５〜３５重量％の、７０〜３０重量％の、７５〜２５重量％の、８０〜２０重量％の、８５〜１５重量％の、９０〜１０重量％の、又は９５〜５重量％の免疫刺激複合体を含むことができ、この免疫刺激複合体はキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ（ここに規定される通り）を含み、各場合において残りの１００％までの免疫刺激複合体はキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃ（ここに規定される通り）を含む。
【００２７】
混合物は７５〜９９．５重量％の画分Ａ及び０．５〜２５重量％の画分Ｃを含むことができる。好ましくは、混合物は９０〜９９重量％の画分Ａ及び１〜１０重量％の画分Ｃを含む。特に好ましい調製物は約９１〜９８重量％の画分Ａ及び約２〜９重量％の画分Ｃ、特に約９２〜９６重量％の画分Ａ及び約４〜８重量％の画分Ｃを、免疫刺激複合体中のキラヤ・サポナリア・モリナの全画分Ａ及びＣの含有量に基づいて計算して含む。
【００２８】
上述の範囲は全て、いかなる種類のヒト又は動物種に投与するための処方においてキラヤ・サポナリア・モリナのいかなる画分のいかなる組合せのためにも用いられることができる。本発明による処方が投与されることができる動物種の例はネコ、イヌ、ウマ、トリ（例、オウム）の如きコンパニオンアニマル、家畜（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）の如き経済的に重要な種である。好ましくは５０重量％以上の画分Ｃがいかなる他の画分との組合せで、特に画分Ａとの組合せで用いられる。従って、５０．５〜９９．５重量％の画分Ｃ及び０．５〜４９．５重量％の画分Ａが用いられることができる。
【００２９】
ここに記述されるように調製されたとき、キラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ，Ｂ及びＣは規定可能な特性を有する化学的に親密に関連した分子のグループ又はファミリーをそれぞれ表す。それらが得られるクロマトグラフィー条件は、溶離プロファイルの観点でのバッチ対バッチ再現性と生物学的活性が高度に一致するような条件である。
【００３０】
本発明はワクチン組成物にまでその範囲を広げる。このワクチン組成物はその活性成分としての（ｉ）これまでの部分で幅広く記述された免疫原性の免疫刺激複合体、又は（ｉｉ）これまでの部分で幅広く記述された免疫刺激複合体マトリックス、並びに少なくとも一種の免疫原を、一種以上の薬学的に許容可能な担体及び／又は希釈剤と共に含む。
【００３１】
かかるワクチン組成物の処方はこの技術分野の当業者には周知である。好適な薬学的に許容可能な担体及び／又は希釈剤はいかなるそして全ての従来の溶媒、分散媒体、充填剤、固形担体、水溶液、被覆、抗細菌及び抗真菌剤、等張性の及び吸収を遅延させる薬剤等を含む。薬学的に活性のある物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は当該技術分野では周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡに記述されている。いかなる従来の媒体又は薬剤が活性成分と非適合性である範囲を除いては、本発明の薬学的組成物におけるその使用は予想される。追加の活性成分も組成物中に組み入れられることができる。
【００３２】
それぞれキラヤ・サポナリア・モリナの本質的に一種の画分を含む本発明による免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスは混合物として、又は同一の投与部位において別個に、又は異なる投与部位において同一もしくは異なる時間で投与されることができる。キラヤ・サポナリア・モリナの異なる画分は異なる免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックス中で、及び異なる組成物中で用いられることができる。
【００３３】
それ故、本発明は少なくとも二種の部分を含む部分のキットであって、各部分が一種の免疫刺激複合体又は一種の免疫刺激複合体マトリックスを含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分を含むものにも関する。キラヤ・サポナリア・モリナの異なる画分は異なる部分の異なる組成物中の異なる免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックスで用いられることができる。
【００３４】
本発明による組成物及び部分のキットはキラヤ・サポナリア・モリナからの画分以外の少なくとも一種の他のアジュバントを含むこともできる。これらのアジュバントは免疫刺激複合体及び／又は免疫刺激複合体マトリックスと混合されるか又はこれらの複合体中に組み入れられることができる。
【００３５】
免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックス中に組み入れられることができる他のアジュバントの例は所望の免疫調節効果を有する天然又は合成のいかなるアジュバントであり、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、脂肪酸、置換ＭＤＰ，ＭＤＰのトレオニル類似体；ＤＤＡ、硫酸デキストランの如きポリアニオン、サポニンの如きリポ多糖類（Ｑｕｉｌ Ａ以外の）である（“Ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．（１９８８）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２，８３−１０１；“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ”（１９８７）Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．９：５，５５１２−５５１６；“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ”，Ｂｅｒｅｎｄｔ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９８５），Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９３−２０１；“Ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ，Ｄ．Ｅ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，８５，３：１，４０−４４）。
【００３６】
投与の容易さ及び用量の均一性のためには組成物を用量単位形態で処方することが特に有利である。ここで用いられる用量単位形態は、治療されるヒト患者のための一体の用量として好適な物理的に区別される単位を意味する；各単位は要求される薬学的担体及び／又は希釈剤との関連で所望の治療効果を生ずるように計算された予め決められた量の活性成分を含む。
【００３７】
なお別の側面において、本発明は個体における免疫応答を誘発又は誘導する方法にまで範囲を広げる。この方法はこれまでの部分で幅広く記述されたようなワクチン組成物の免疫学的に有効な量を個体に投与することを含む。
【００３８】
既に述べた通り、個体はヒト又は他の動物であることができ、家畜（例えばヒツジ、ウシ又はウマ）、研究用試験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ又はモルモット）、コンパニオンアニマル（例えばイヌ又はネコ）又は野生動物を含むことができる。
【００３９】
「免疫学的に有効な量」は少なくとも部分的に所望の免疫応答を達成するために必要な量、又は治療される特定の症状の始まりを遅延させるために、進行を阻害するために、又は始まりもしくは進行を全体的に中止させるために必要な量を意味する。この量は治療される個体の健康状態及び物理的状態に依存して、治療される個体の分類群に依存して、抗体を合成する個体の免疫系の能力に依存して、ワクチンの所望の処方の保護の度合いに依存して、医療的状況の評価に依存して、及び他の関連性のある要因に依存して変化する。この量はルーチン試行を通して決定することができる比較的幅広い範囲内におさまることが予想される。
【００４０】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、他に明示されない限り、用語「含む」は述べられた要素又は一群の要素の含有を意味すると理解されるべきであり、いかなる他の要素又は一群の要素も除外するものではない。
【００４１】
本発明は以下の図面によって例示されるであろう。図中：
【００４２】
図１はＨＰＬＣによる画分Ａ，Ｂ及びＣの調製を示す。
【００４３】
図２は本文中に記述された通りのインフルエンザウイルスのミセルに対する抗原特異的抗体応答がＥＬＩＳＡで（対数力価）、ＩｇＧ１サブクラス（Ａ）で、及びＩｇＧ２ａサブクラス（Ｂ）でテストされたことを示す。マウス（雌のＮＭＲＩ）は０週目及び４週目に表２に記載のワクチン処方で、即ちグループ１〜８で免疫感作された。マウスは３週目及び６週目に採血された。抗体応答は６週目に採取された血液からテストされた。
【００４４】
図３は本文中に記述されたインフルエンザウイルスのミセルでインビトロで刺激された後に図２に記述された通り免疫感作の６週間後に採取された脾臓細胞によるサイトカインＩＬ−５（Ａ）及びＩＦＮ−γ（Ｂ）の生産として測定された細胞性免疫応答を示す。
【００４５】
図４はＢａｌｂ／Ｃマウスでの抗体応答を増大させるためにＯＶＡに補充された場合、マトリックス中の高用量（５０μｇ）のＱＨＣは毒性を有するが、免疫刺激複合体マトリックス中の高用量のＱＨＡは毒性を有さないことを示す（本文参照）。両方の処方は、全ＩｇＧ応答（Ａ）及びＩｇＧ２ａサブクラス（Ｂ）についてＥＬＩＳＡによって２回目の免疫感作後に３週目に測定された通り、ＯＶＡに対する類似の特異的抗体応答を増大させる。
【００４６】
図５はＢａｌｂ／Ｃマウスでの抗体応答を増大させるためにＯＶＡに補充された場合のＱＨＡ及びＱＨＣマトリックスの相乗効果を示す（本文参照）。ＱＨＡ及びＣマトリックスの用量は以下の範囲であった：グループ１ではＡ又はＣはなし；グループ２ではＡが０．３μｇ、Ｃはなし；グループ３ではＡが０．３μｇ、Ｃが２μｇ；グループ４ではＡが１０μｇ、Ｃはなし；グループ５ではＡが１０μｇ、Ｃが２μｇ。ＯＶＡの用量は１０μｇであった。各グループについて８匹のマウスを用いた。これらのマウスはそれぞれの処方を用いて４週間空けて２回免疫感作された。抗体力価はＥＬＩＳＡによって以下のものに対して測定された：
Ａ − １回目の免疫感作の３週間後に全ＩｇＧに対して；
Ｂ − ２回目の免疫感作の２週間後にＩｇＧ２ａに対して；
Ｃ − ２回目の免疫感作の２週間後にＩｇＧ１に対して。
グループ４と５の間で極めて有意な差がある（Ｐ＜０．０００１）。
【００４７】
ここで言及するすべての文献は参照文献としてここに組み入れられる。本発明は以下の非限定的な実施例によって記述されるであろう。
【実施例】
【００４８】
キラヤ・サポナリア・モリナのサブフラグメントサポニンの調製
粗キラヤ・サポナリア・モリナ抽出物の画分Ａ，Ｂ及びＣへの精製
粗キラヤ樹皮抽出物の水溶液（０．５ｇ／ｍｌ）０．５ｍｌがｓｅｐ−ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，ＭＡ）上で予備処理される。
【００４９】
予備処理は充填されたｓｅｐ−ｐａｋカラムを１０％アセトニトリル酸性水溶液で洗浄して親水性物質を除去することを含む。ＱＨ−Ａ，ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃを含む親油性物質は次に７０％アセトニトリル水溶液によって溶離される。
【００５０】
ｓｅｐ−ｐａｋカラムからの親油性画分は次に半調製ＨＰＬＣカラム（ＣＴ−ｓｉｌ，Ｃ８，１０×２５０ｍｍ，ＣｈｏｒｍＴｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって分離される。サンプルは２５〜６０％のアセトニトリル酸性水溶液によってカラムを通して溶離される。三つの画分が分離中にＨＰＬＣカラムから収集される。これらの三つの画分の蒸発後の残余物質はＱＨ−Ａ，ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃを構成する。
【００５１】
ＱＨ−Ａ，ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃと称される画分はそれぞれ約３９，４７及び４９％のアセトニトリルで溶離された。抽出溶離プロファイル及び条件は図１に示される。
【００５２】
実施例２．免疫刺激複合体マトリックスの調製
材料
コレステロール（例えばＳｉｇｍａ Ｃ ８５０３）
ホスファチジルコリン（卵由来のもの、例えばＳｉｇｍａ Ｐ ３５５６）
ＭＥＧＡ−１０（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
キラヤサポニン画分Ａ及びＣ（特許ＷＯ ９６１１７１１）
０．２２μｍの滅菌フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）
ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸緩衝１５０ｍＭ生理食塩水、ｐＨ６．８〜７．４）
Ｓｌｉｄｅ−Ａ―ＬｙｚｅｒカセットＭＷカットオフ１２〜１４．０００（Ｐｉｅｒｃｅ）
【００５３】
ＭＥＧＡ−１０（ストック溶液）
８ｍｌの滅菌水を２．０ｇの乾燥固形ＭＥＧＡ−１０に添加することによって２０％（ｗ／ｗ）ストック溶液を作る。おだやかに加熱（３０〜５０℃）することによって溶解させる。０．２２ｎｍの滅菌フィルターを通して濾過し、少量ずつ小分けし、−２０℃で貯蔵する。
【００５４】
脂質混合物（１５ｍｇ／ｍｌ）
１００ｍｇの各コレステロール及びホスファチジルコリンを１０ｍｌの２０％ＭＥＧＡ−１０に溶解させる。脂質はゆっくりと撹拌されることにより３０〜６０℃でゆっくりと溶解する。０．２２ｎｍの滅菌フィルターを通して濾過し、少量ずつ小分けし、−２０℃で貯蔵する。冷凍後、脂質混合物は明澄になるまで４０℃まで加熱される必要がある。すべての溶液を２４±１℃に保温する。
【００５５】
サポニンストック溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）
１．０ｇのキラヤ・サポナリア・モリナ画分（Ａ又はＣが滅菌水に溶解される。少量ずつ小分けし、−２０℃で冷凍される。）。０．２２ｎｍの滅菌フィルターを通して濾過し、少量ずつ小分けし、−２０℃で貯蔵する。
【００５６】
異なる免疫刺激複合体マトリックス調製物は表１に概略を示したようにして製造される。混合物を以下の手順で調製する。
２ｍｌのＰＢＳを５０ｍｌのファルコンチューブに加える。
１．脂質混合物を加え、完全に混合する。
２．サポニンを加え、完全に混合する。
３．ＰＢＳを加えて１２．０ｍｌの最終容積にし、完全に混合する。
４．３０分間インキュベートする。
５．Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒに充填する。
６．２リットルのＰＢＳ（２４±１℃）の４回の交替に対して透析する（４８〜６０時間）。
７．Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒから吸引し、０．２２ｎｍの滅菌フィルターを通して濾過する。
【００５７】
免疫刺激複合体マトリックスの処方は陰性染色電子顕微鏡で検証され、キラヤサポニンの生ずる濃度はＨＰＬＣで決定された。
【００５８】
【表１】
【００５９】
実施例３．ＰＲ−８タンパク質ミセルの調製
１．１２ｍｇのＰＲ−８モノマー（１．５ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳで希釈して１．０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度にする。
２．０．２２ｎｍの滅菌フィルターを通して濾過する。
３．Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒに充填する。
４．２リットルのＰＢＳ（２４±１℃）の４回の交替に対して透析する（４８〜６０時間）。
５．Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒから吸引する。
【００６０】
実施例４．免疫感作の研究
この実施例は、比較研究において混合物マトリックス粒子からなる免疫刺激複合体マトリックスが最小の度合いの副作用を引き起こすということを示すために行われた。一組の粒子はＱＨＡを唯一のサポニンとして含み、他の組の粒子はＱＨＣを唯一のサポニンとして含み、実施例２に従って調製された。この処方は「粒子の混合物を有するマトリックス」と名付けられる。比較は特許ＷＯ ９６／１１７１１に記述された免疫刺激複合体マトリックス、即ち各粒子がＱＨＡとＱＨＣの両方を例えば７０％のＱＨＡと３０％のＱＨＣの比率で含む免疫刺激複合体マトリックスを用いて行われる。これは「すべてが一緒になった粒子を有するマトリックス」である。
【００６１】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスは免疫刺激複合体マトリックス処方「粒子の混合物を有するマトリックス」と混合された１μｇのＰＲ８ミセル（実施例３に記述のようにして調製された）で０日目及び４２日目に免疫感作され、「すべてが一緒になった粒子を有する免疫刺激複合体マトリックス」又は１００％のＱＨＡ又は１００％のＱＨＣを含む免疫刺激複合体マトリックスと比較され、表２に記述された。治療によって５０％以上のマウスが死亡したか又は許容不可能な副作用を受けたグループは間引かれ、さらなる研究から除外された。
【００６２】
血清サンプルはブースター投与の２週間後の５６日目にグループ１〜７ですべてのマウスから採取された。血清はＩｇＧ１（Ａ）及びＩｇＧ２ａ（Ｂ）サブクラスの抗原特異的抗体についてスクリーニングされた。図中のグループ８はワクチン化されなかったマウスを表す。結果は図２に示される。
【００６３】
２回目の採血後、脾臓が１グループあたり２匹のマウスから採用された（グループ２，４，５，６及び７）。脾臓細胞はＰＲ８ミセルを用いてインビトロで刺激され、ＩＬ-５（Ａ）及びＩＦＮ−γ（Ｂ）の抗原特異的誘導が測定された。図中のグループ８はワクチン化されなかったマウスを表す。結果は図３に示される。
【００６４】
表２
Ｂａｌｂ／Ｃマウスは０及び４２日目に免疫刺激複合体マトリックス処方「粒子の混合物を有するマトリックス」（ＭＩＸグループ１，２及び３）で免疫感作され、「すべてが一緒になった粒子を有する免疫刺激複合体マトリックス」（ＣＯＮＶグループ７，８，９，１０及び１１）と、又は１００％のＱＨＡを含む免疫刺激複合体マトリックス（グループ４及び５）もしくは１００％のＱＨＣを含む免疫刺激複合体マトリックス（グループ６及び１２）と比較された。
【００６５】
【００６６】
結果
ＰＲ８ミセルで免疫感作され８０％のＱＨＡ及び２０％のＱＨＣ（即ち１０μｇ）を含む高用量（５０μｇ）の免疫刺激複合体マトリックスでアジュバント投与されたマウスは１又は２日以内に死亡した。同様に、５０μｇの処方１００％ＱＨＣで免疫感作されたマウスも２日以内に死亡した。対照的に、５０μｇの処方１００％ＱＨＡで免疫感作されたマウスはいかなる気付かれる副作用なしに生存した。即ち、低用量のＱＨＣはＱＨＡと同じマトリックス粒子中に組入れられた場合、マウスを殺すのに十分であった（表２のＣＯＮＶグループ８）。４μｇ（８％）という低用量のＱＨＣが４６μｇ（９２％）のＱＨＡとＣＯＮＶマトリックス中で組合せられた場合でも、８匹のマウスのうち６匹が死亡した（表２のグループ９）。また、２μｇ（４％）のＱＨＣはＣＯＮＶマトリックス中でＱＨＡと組合わせられた場合、マウスを殺した（表２のグループ１０）。グループ６（表２）のマウスは１０μｇのＱＨＣをマトリックス中の１００％として（即ちＱＨＡを含まない）受取り、すべてのマウスが生存した。
【００６７】
従って、ＱＨＣが同じＣＯＮＶマトリックス粒子中でＱＨＡと組合わせられた場合、マウスはＱＨＣに対して一層感受性であった（グループ８，９及び１０）。
【００６８】
低用量のマトリックス、即ち７０％のＱＨＡと３０％のＱＨＣに分割された１０μｇの総サポニンを受取ったマウスはすべて生存した。この場合、マウスは３μｇのＱＨＣを受取った。
【００６９】
ＰＲ８ミセルで免疫感作され異なるマトリックス粒子を含む処方で、即ち一組のＱＨＡ及び一組のＱＨＣを含む粒子の混合物（ＭＩＸ）でアジュバント投与されたマウスは、ＣＯＮＶ処方よりずっと高用量のこのマトリックス処方に耐えて生存した。９２％のＱＨＡ（４６μｇ）及び８％のＱＨＣ（４μｇ）を有する処方を注射されたマウス（表２のグループ２（９２：８）又は２μｇのＱＨＣを含む９６：４の処方を注射されたマウス（表２のグループ３）はすべて生存した。この結果は対応する量のＱＨＡ及びＱＨＣをＣＯＮＶマトリックス中に含むグループ（表２のグループ９及び１０）が高い死亡率を生じたのとは対照的である。
【００７０】
従って、死亡率−毒性はＱＨＣをＱＨＡから物理的に分離してこれらを異なるマトリックス粒子中に分布させることによって回避することができる。
【００７１】
抗体応答の増大
結果は図２に示されている。抗原特異的応答はＩｇＧサブクラスに分割された。マウス（雌のＮＭＲＩ）は０及び４週目に表２に記載されるワクチン処方で免疫感作された。マウスは３週目及び６週目に採血された。６週目でのＩｇＧ１（１０ｌｏｇ Ｅｌｉｓａ 力価）応答はＡで示され、対応するＩｇＧ２応答はＢで示される。
【００７２】
この実験での重要な発見は、図２に示される通りＱＨＡ及びＱＨＣが異なる組の粒子内に分離された場合、抗体応答によって測定されるように免疫増強能力が維持又は増大されるということである。
【００７３】
図２には、粒子の混合物（ＭＩＸ）は、同一の比率の同一用量のＱＨＡ及びＱＨＣが同一粒子に、即ちＣＯＮＶ粒子に組入れられた場合と同様、ＰＲ８ミセルに対する同一レベルのＩｇＧ１抗体（図２Ａ）を増大されるということが示されている。しかし、高レベルのＩｇＧ２ａ抗体がＭＩＸ処方によって増大された。グループ２及び３（ＭＩＸ）はグループ９及び１０（ＣＯＮＶ）ＱＨＡ−ＱＨＣマトリックスと、及び１００％の低用量ＱＨＣマトリックス（グループ６）と、及び１００％のＱＨＡ高用量マトリックス（表２のグループ４）と比較される。グループ７のマウスは１０μｇという低用量（ＣＯＮＶ ７０：３０）、即ちマウスが受け入れることができる用量を注射され、強いＩｇＧ１（図２Ａ）応答を示したが、ＩｇＧ２ａ応答は低かった（図２Ｂ）。
【００７４】
従って、マトリックス粒子の混合物を有するマトリックス処方を用いる本発明は高用量で投与されても副作用を回避することができ、免疫応答をＣＯＮＶマトリックスより高レベルに増大させることができる。特に、ＩｇＧ２ａ応答が増大される。ＩｇＧ２ａ応答は例えばウイルスの如き細胞間寄生体に対する防御のために特に重要である。
【００７５】
細胞性免疫応答の増大
ＣＯＮＶマトリックス処方は許容される用量で細胞性免疫を増大させる能力がＭＩＸ処方より劣る（図３Ａ及びＢ）。ＭＩＸ処方（９２：８、グループ２）はＣＯＮＶ（７０：３０、グループ７）、ＱＨＡ−ＱＨＣ処方、又は１００％ＱＨＣマトリックス処方（グループ６）よりかなり高いＩＬ−５レベルを増大させる。混合物処方（９２：８、グループ９）もＱＨＣ１００％マトリックス（グループ６）又はＣＯＮＶ（７０：３０、グループ７）処方よりＩＦＮ−γをかなり良好に増大させる。
【００７６】
ＱＨＡはＩＬ−５及びＩＦＮ−γ生産によって測定される細胞性免疫応答を増大させる強い能力を有するが、抗体応答を増大させる能力は低いことに注意すべきである。
【００７７】
結局、本発明は、毒性及び副作用をかなり減少させ、免疫応答を増大させる能力を失うことなしにアジュバント活性分子の強い用量を可能にする免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックス処方の概念を規定する。
【００７８】
さらに、低いが許容可能な用量のＱＨＣマトリックス処方はＩｇＧ１応答を増大させる良好な能力を有するが、重要なＩｇＧ２ａ応答に関する能力は低い。細胞性免疫を誘導するＱＨＣマトリックスの能力も本発明のそれよりかなり低い。
【００７９】
ＱＨＡマトリックスは細胞性免疫を強く増大させるが、抗体性免疫を増大させる能力において本発明のものより劣る。
【００８０】
混合されたマトリックス粒子を用いる本発明はＩｇＧ２ａ抗体応答によって測定されかつ細胞性応答によって測定される通り、同一粒子中にＱＨＡ及びＱＨＣを含むマトリックス処方（ＣＯＶＮ）より優れている。
【００８１】
本発明は完全な免疫応答を増大させ、それ故、以前に記述されているマトリックス処方より優れる。これはこの実施例４によって示されている。
【００８２】
実施例５
この実施例では、ＱＨＡが良く許容され、強い免疫増大能力及び免疫調節能力を有することが強調される。卵白アルブミン（ＯＶＡ）は弱い抗原であり、Ｔｈ１型の応答を誘導しないので用いられた。ＱＨＡはＱＨＣと比較された。何故なら、ＱＨＣはヒトの臨床試験で評価されているからである。
【００８３】
材料及び方法
キラヤ・サポナリア・モリナサブフラグメントの調製は実施例１に記述されている。
免疫刺激複合体マトリックスの調製は実施例２に記述されている。
【００８４】
実験計画
グループは８匹のマウスからなり、１０μｇのＯＶＡ及びアジュバントとしての５０μｇのＱＨＡで４週間の間隔を空けて２回、皮下注射により（ｓ．ｃ．）免疫感作された。グループ２は同数のマウスを有し、同様の手順で免疫感作されたがアジュバントが５０μｇのＱＨＣである点が異なっていた。
【００８５】
示される免疫応答はブースター投与の２週間後に採取された血清からのものである。
【００８６】
抗体の決定
特異的ＯＶＡ血清抗体応答は、テスト抗原としてＥＬＩＳＡプレートを被覆するために１ｍｌあたり１０μｇのＯＶＡを用いる標準手順を用いて実施例４に記述されたようにして全ＩｇＧ応答及びＩｇＧ２ａサブクラス応答の両方についてＥＬＩＳＡによって決定された。
【００８７】
結果
ＯＶＡで免疫感作されＱＨＡマトリックスをアジュバントとして投与されたマウスはすべて生存し、不調のいかなる徴候も示さなかった。ＯＶＡで免疫感作されＱＨＣマトリックスをアジュバントとして投与された８匹のマウスのうち４匹のマウスは死亡した。即ち、死亡率は５０％であった。
【００８８】
総免疫応答に関してはグループ間で有意差はなかったが（図４Ａ）、ＥＬＩＳＡ力価はグループ１のマウス、即ちＱＨＡで免疫感作されたマウスの間で一層多くの変動があった。
【００８９】
ＥＬＩＳＡ力価がグループ２のマウス、即ちＱＨＣで免疫感作されたマウスの間で一層多く変動していたことを除いては、グループ１と２の間でＩｇＧ２ａサブクラスにおける平均力価に差はなかった（図４Ｂ）。
【００９０】
この実施例の第２の実験では、ＱＨＡマトリックスは他のアジュバントでの補足から利益を受けることができるかどうかが研究された。ＱＨＡマトリックス及びＱＨＣマトリックスの用量は以下の範囲であった：グループ１ではＡ又はＣはなし；グループ２ではＡが０．３μｇ、Ｃはなし；グループ３ではＡが０．３μｇ、Ｃが２μｇ；グループ４ではＡが１０μｇ、Ｃはなし；グループ５ではＡが１０μｇ、Ｃが２μｇ。ＯＶＡの用量は１０μｇであった。各グループについて８匹のマウスを用いた。これらのマウスはそれぞれの処方を用いて４週間空けて２回免疫感作された（図５Ａ，Ｂ及びＣ）。
【００９１】
血清は最初の免疫感作の３週間後に、及びブースター投与の２週間後に採取された。
【００９２】
特異的ＯＶＡ血清抗体応答は記述されたようにして（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｍ ａｎｄ Ｌｏｅｖｇｒｅｎ−Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ（１９９９） Ｉｓｃｏｍｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ １９，２８９４−２９００）全ＩｇＧ応答及びＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１サブクラス応答についてＥＬＩＳＡによって決定された。
【００９３】
結果
最初の免疫感作後、アジュバント投与されていないＯＶＡ又は２μｇのＱＨＣマトリックスを有するかもしくは有さない０．３μｇのＱＨＡマトリックスでアジュバント投与されたＯＶＡを受取ったマウスでは抗体応答は記録されなかった（図５Ａ）。
【００９４】
第２の免疫感作後、アジュバント投与されていないＯＶＡで免疫感作された８匹のマウスのうち３匹からＩｇＧ１サブクラスにおいて低い応答が検出されたが、ＩｇＧ２ａサブクラスにおいては応答が記録されなかった。最低のアジュバント用量のＱＨＡマトリックス、即ち２μｇのＱＨＣマトリックスを有するかもしくは有さない０．３μｇのＱＨＡマトリックスでも抗体応答は記録されなかった。２μｇのＱＨＣの低用量が１０μｇのＱＨＡに加えられた場合、ＩｇＧ２ａサブクラスにおける抗体応答の明らかな増大があった（図５Ｂ）。
【００９５】
結論
ＱＨＡマトリックスは強いＴＨ１型の応答を促進することによって示される通り、免疫刺激複合体マトリックス中に含まれる場合、極めて低い毒性を有しかつ強い調節効果を有する。これはアジュバント投与されていないＯＶＡ又は極めて低い用量のアジュバントを投与されたＯＶＡとは対照的であり、これらはＩｇＧ１サブクラスにおける抗体応答しか誘発しなかった。ＱＨＡマトリックスは低用量のＱＨＣマトリックスと相乗作用することも示される。これらの結果は重要である。何故なら、これは単純な方法でアジュバント効果を最適化しかつ副作用を最小化することを可能にするからである。このことは強いアジュバントを必要とするＯＶＡの如き弱い抗原について示される通りである。
【００９６】
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＨＰＬＣによる画分Ａ，Ｂ及びＣの調製を示す。
【図２Ａ】本文中に記述された通りのインフルエンザウイルスのミセルに対する抗原特異的抗体応答がＥＬＩＳＡで（対数力価）、ＩｇＧ１サブクラス（Ａ）でテストされたことを示す。
【図２Ｂ】本文中に記述された通りのインフルエンザウイルスのミセルに対する抗原特異的抗体応答がＥＬＩＳＡで（対数力価）、ＩｇＧ２ａサブクラス（Ｂ）でテストされたことを示す。
【図３Ａ】本文中に記述されたインフルエンザウイルスのミセルでインビトロで刺激された後に図２に記述された通り免疫感作の６週間後に採取された脾臓細胞によるサイトカインＩＬ−５（Ａ）の生産として測定された細胞性免疫応答を示す。
【図３Ｂ】本文中に記述されたインフルエンザウイルスのミセルでインビトロで刺激された後に図２に記述された通り免疫感作の６週間後に採取された脾臓細胞によるＩＦＮ−γ（Ｂ）の生産として測定された細胞性免疫応答を示す。
【図４】Ｂａｌｂ／Ｃマウスでの抗体応答を増大させるためにＯＶＡに補充された場合、マトリックス中の高用量（５０μｇ）のＱＨＣは毒性を有するが、免疫刺激複合体マトリックス中の高用量のＱＨＡは毒性を有さないことを示す。
【図５】Ｂａｌｂ／Ｃマウスでの抗体応答を増大させるためにＯＶＡに補充された場合のＱＨＡ及びＱＨＣマトリックスの相乗効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含む組成物であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分を含むもの、及びワクチンを含む免疫感作のために使用される処方における免疫調節剤又はアジュバントとしてのこの組成物の使用に関する。特に、本発明は免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックスアジュバント化ワクチンにおけるキラヤサポニンの精製された、半精製された又は規定された画分の使用に関する。本発明によるサポニン調製物の使用は増大した耐性及び増大した免疫原性を有する製品を生ずる。調製物は免疫原性を調整して炎症、過敏感性及びアレルギー反応の増大した制御を与えるために用いられることができる。
【背景技術】
【０００２】
キラヤサポニンの免疫刺激特性は古くから知られており（Ｒａｍｏｎ １９２６）、キラヤサポニンは１９５０年代から商業的なワクチンにおいて遊離形態で、時にはＡｌ（ＯＨ）３と組合せて使用されてきた（Ｄａｌｓｇａａｒｄ １９７８，Ｍａら１９９４，Ｅｓｐｉｎｅｔ １９５１）。従来の遊離形態と比べて実質的により有効なキラヤサポニンの使用はＭｏｒｅｉｎらによって１９８４年のＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）技術に（ＥＰ ０１０９９４２Ｂ１，ＥＰ ０２４２３８０Ｂ１及びＥＰ ０１８０５６４Ｂ１）及び数年後にＩＳＣＯＭマトリックス技術に（Ｌｏｅｖｇｒｅｎ及びＭｏｒｅｉｎ １９８８，ＥＰ ０４３６６２０Ｂ１）記載された。免疫刺激複合体技術を用いて、ワクチン抗原はキラヤサポニン、コレステロール及びリン脂質からなる４０ｎｍの複合体に組入れられる。ＩＳＣＯＭマトリックス技術はキラヤサポニン：コレステロール：リン脂質複合体を抗原と混合された（関連されていない）状態で用いる。両方の技術はキラヤサポニンの溶血活性（局所的な副作用をもたらし、キラヤサポニン調製物の総合的な毒性に加えられる特性）を減少させるか又は消去する（Ｂｏｍｆｏｄら、１９９２）。
【０００３】
キラヤサポニン調製物は界面活性グリコシドの不均一な混合物であり、予期されかつ一貫性のあるアジュバント活性を持つ一群を見出す／規定することにおける深刻な問題は、キラヤ・サポナリア・モリナと表される「均一な」画分の単離及び特性決定に導いた（Ｄａｌｓｇａａｒｄ、１９７４）。この画分は広範囲の関連構造を含むことが後になって示され、逆相ＨＰＬＣによって画分／ピークへと更に精製された（Ｋｅｎｓｉｌ １９８８，１９９１，Ｋｅｒｓｔｅｎ １９９０ ＥＰ ０３６２２７９Ｂ２，ＥＰ ０５５５２７６Ｂ１）。この精製の動機は容易に特性決定され規定されるサポニンの均一な画分を生成させることのみならず、毒性の低い製品を規定することでもあった。急性毒性又は副作用は、ワクチン調製物におけるキラヤサポニンの獣医学的及び特にヒトに対する使用の両方についての主要な関心事であった。これらの目的は部分的にのみ達成された。即ち、精製された画分（例えばＱＡ−２１（ＥＰ ０３６２２７９Ｂ２））及び画分ＡとＣの組合せ（ＷＯ ９６／１１７１１、Ｉｓｃｏｔｅｃ特許）は実際、キラヤ・サポナリア・モリナと比べて化学的に規定されたが、それらはなおいくらかの毒性及び副作用を生じた。画分Ａが実質的に毒性を有さないという事実にもかかわらず、７０％の画分Ａと３０％の画分Ｃからなる混合物はキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの１００％と同程度の毒性を有していたか又はキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの１００％よりほんの少し毒性が低いだけであった。
【０００４】
本発明を導くための研究において、異なるキラヤサポニン画分は毒性が異なるのみならず、免疫調節特性も異なることが示された（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、ＥＰ ０３６２２７９Ｂ２）。これらの画分を組合せることによって異なる免疫調節能力が得られた。例えばＴｈ１誘導又はＴｈ２誘導能力が得られた。しかし、許容できる処方中で用いられるべき各画分の量を制限する副作用を減少させることが望ましい。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は別個の存在（粒子）としての免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックス中でのキラヤサポニンの少なくとも二種の精製されたピーク又は規定された画分の使用に関する。即ち、これらの画分は全く同一の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックス粒子では組合されず、異なる負荷を持つ粒子が一緒に混合されて免疫感作のための処方を構成する。それぞれがキラヤ・サポナリア・モリナの異なる画分を含む免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物はこれらのキラヤ・サポナリア・モリナ画分が同一の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックス粒子中に組入れられた場合より低い毒性を有することが驚くべきことに判明した。例えば画分Ａマトリックスと画分Ｃマトリックスの混合物、又は画分Ａマトリックスもしくは画分Ｃマトリックス単独の使用は同一の画分が同一の免疫刺激複合体マトリックス中に組入れられたときよりマウスにおいてかなり毒性が低かった（実施例４、表１）。さらに、免疫原性又は免疫調節特性はより調整しやすく、標的種及びワクチン抗原の必要性／要求の両方について最適化された改良されたワクチン処方を作る可能性がかなり増大する。
【０００６】
マウスはキラヤサポニンに対して特に敏感であり、過剰投与すると４日以内に、しばしば２４時間以内に死亡する。それ故、マウスは本発明に従って調製された処方の毒性及び免疫原性の効果を監視するために用いられた。キラヤサポニンに対する感受性の種間変異は大きく、許容可能な処方を得るための種最適化の必要性を反映するが、ワクチン処方の最適の免疫原性を得るための調整の必要性も反映する。例えばウマは多量のキラヤサポニンを投与しても死亡しないが、ウマは遊離のキラヤ・サポナリア・モリナ、キラヤ・サポナリア・モリナから製造された免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックス又はキラヤ・サポナリア・モリナの混合画分の注射後、発熱して局所的な副作用を示す傾向がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含む組成物であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｉｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）からの本質的に一種のサポニン画分を含む組成物に関する。免疫刺激複合体は免疫刺激複合体マトリックス又は免疫刺激複合体であることができる。
【０００８】
免疫刺激複合体は少なくとも一種のグリコシド、少なくとも一種の脂質及び少なくとも一種の抗原物質を含む。脂質は少なくともコレステロールの如きステロールであり、所望によりホスファチジルコリンであることができる。この複合体は一種以上の他の免疫調節（アジュバント活性）物質を含むこともでき、ＥＰ ０１０９９４２Ｂ１，ＥＰ ０２４２３８０Ｂ１及びＥＰ ０１８０５６４Ｂ１に記載されたようにして製造することができる。
【０００９】
免疫刺激複合体マトリックスは少なくとも一種のグリコシド及び少なくとも一種の脂質を含む。脂質は少なくともコレステロールの如きステロールであり、所望によりホスファチジルコリンであることができる。この複合体は一種以上の他の免疫調節（アジュバント活性）物質（サポニンである必要はない）を含むこともでき、ＥＰ ０４３６６２０Ｂ１に記載されたようにして製造することができる。
【００１０】
本発明による組成物は免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスのみを含むか又は免疫刺激複合体と免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含むことができる。異なる免疫刺激複合体及び／又は免疫刺激複合体マトリックスが混合されることができ、その場合キラヤ・サポナリア・モリナからの異なるサポニン画分が用いられる。
【００１１】
本発明は免疫調節剤の調製のための少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分を含む使用も包含する。
【００１２】
本発明の他の側面はワクチンの調製のための少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分及び少なくとも一種の抗原を含む使用である。
【００１３】
本発明のさらなる側面はアジュバントの調製のための少なくとも二種の免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分を含む使用である。
【００１４】
本発明に従って免疫刺激複合体マトリックス中に組入れられるか又は免疫刺激複合体マトリックスと関連される免疫原はヒト又は他の動物の如き（しかしこれらに限定されない）個体における免疫応答を誘導することができるいかなる化学物質であることができる。この免疫応答は細菌、ウイルス、マイコプラズマ又は他の微生物に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答を含むがこれらに限定されない。特異的な免疫原はタンパク質又はペプチド、炭水化物、多糖、リポ多糖又はリポペプチド、又はこれらの組合せであることができる。
【００１５】
特に、特異的な免疫原は天然のタンパク質又はタンパク質断片、又は合成のタンパク質又はタンパク質断片又はペプチドを含むことができる。特異的な免疫原は糖タンパク質、糖ペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、核タンパク質、核ペプチドを含むことができる。特異的な免疫原はペプチド−ペプチドコンジュゲートを含むことができる。特異的な免疫原は組換え核酸発現生成物を含むことができる。
【００１６】
かかる免疫原の例はＥＰ ０１０９９４２Ｂ１に列挙されており、ウイルス性又は細菌性肝炎、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、はしか、おたふくかぜ、風疹、ポリオ、肺炎双球菌、ヘルペス、呼吸器のシンシチアル（ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、血友病インフルエンザ、クラミジア、水痘−帯状疱疹ウイルス、狂犬病、又はヒトの免疫不全ウイルスに対して免疫応答を誘発することができるものを含むがこれらに限定されない。
【００１７】
抗原は免疫刺激複合体中に組入れられるか又は免疫刺激複合体もしくは免疫刺激複合体マトリックス上に結合されるか又は免疫刺激複合体及び／又は免疫刺激複合体マトリックスと混合されることができる。かかる免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスのいかなる混合物も使用されることができる。一種以上の抗原が用いられることができ、移送及び乗客（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ）抗原もＥＰ ９６００６４７−３（ＰＣＴ／ＳＥ ９７／００２８９）に記載のように用いられることができる。
【００１８】
用いられる脂質は特に出願人の特許ＥＰ ０１０９９４２Ｂ１（特に第３頁）に及び特許ＥＰ ０４３６６２０Ｂ１の第７頁第７行〜第２４行に記載されているものである。特にコレステロールの如きステロール及びホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンの如きリン脂質が用いられる。細胞結合成分に結合する脂質含有受容体（例えばコレラ毒受容体（ガングリオシドＧＭ１）を含む糖脂質）及びフコース化血群抗原が用いられることができる。細胞結合成分は粘膜標的化分子として作用し、脂質含有物質を含む複合体と単に混合されるだけで脂質含有物質に結合されることができる。かかる受容体及びかかる受容体を含む免疫刺激複合体はＷＯ ９７／３０７２８に記載されている。
【００１９】
用語「キラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分」は本明細書及び特許請求の範囲を通してキラヤ・サポナリアの半精製された又は規定されたサポニン画分又は実質的に精製された画分の総称として用いられる。この画分は、本質的に一種の画分を含む免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物が用いられたときに得られる良好な結果に負の影響を与えるいかなる他の画分も含まないということは重要である。サポニン調製物は所望により少量の、例えば４０重量％までの、３０重量％までの、２５重量％までの、２０重量％までの、１５重量％までの、１０重量％までの、７重量％までの、５重量％までの、２重量％までの、１重量％までの、０．５重量％までの、０．１重量％までの、他の化合物（他のサポニンや他のアジュバント材料の如き）を含むことができる。
【００２０】
本発明によるサポニン画分はＷＯ ９６／１１７１１に記載のＡ，Ｂ及びＣ画分、ＥＰ ０４３６６２０に記載のＢ３，Ｂ４及びＢ４ｂ画分、ＥＰ ０３６２２７９Ｂ２に記載の画分ＱＡ１−２２，Ｑ−ＶＡＣ（Ｎｏｒ−Ｆｅｅｄ，ＡＳ Ｄｅｎｍａｒｋ）、又はキラヤ・サポナリア・モリナスピコシド（Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ，Ｕｌｔｕｎａａｌｌｅｎ ２Ｂ，７５６ ５１ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）であることができる。
【００２１】
ＥＰ ０３６３２２７９Ｂ２の画分ＱＡ−１−２−３−４−５−６−７−８−９−１０−１１−１２−１３−１４−１５−１６−１７−１８−１９−２０−２１及び２２、特にＱＡ−７，１７−１８及び２１が用いられることができる。これらはＥＰ ０３６２２７９Ｂ２に、特に第６頁及び第８頁及び第９頁の実施例１に記載されている。
【００２２】
ＷＯ ９６／１１７１１に記載の画分Ａ，Ｂ及びＣは粗キラヤ・サポナリア・モリナ水性抽出物のクロマトグラフィー分離及び親油性画分を回収するための７０％アセトニトリル水溶液を用いた溶離により得られた親油性画分から調製される。この親油性画分は次に２５〜６０％のアセトニトリル酸性水溶液の勾配を用いた溶離での半精製ＨＰＬＣによって分離される。ここで「画分Ａ」又は「ＱＨ−Ａ」と称される画分は約３９％のアセトニトリルで溶離される画分であるか又はこの画分に相当する。ここで「画分Ｂ」又は「ＱＨ−Ｂ」と称される画分は約４７％のアセトニトリルで溶離される画分であるか又はこの画分に相当する。ここで「画分Ｃ」又は「ＱＨ−Ｃ」と称される画分は約４９％のアセトニトリルで溶離される画分であるか又はこの画分に相当する。
【００２３】
キラヤ・サポナリア・モリナの異なる画分を含む免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスを組合せることにより、毒性の少ない調製物を製造することが可能である。組成物の効果は受容体によって媒介される、即ち複合体を認識する抗原呈示細胞（ＡＰＣ）上の受容体によるように思われることも判明している。従って、キラヤ・サポナリア・モリナの二種の異なる画分が同一の免疫刺激複合体中に組入れられた場合、この複合体は画分１に対して親和性を有する受容体及び画分２に対して親和性を有する受容体に、即ち二組の受容体に結合するであろう。一方、画分が別個の免疫刺激複合体粒子又は免疫刺激複合体マトリックス粒子中にある場合、各粒子は対応する受容体に結合し、この受容体はそれが親和性を有する受容体に限られるであろう。ＡＰＣ上の二組の受容体が同一の粒子によって刺激された場合、これは副作用をもたらす強い効果を生ずるかもしれない。さらに、複合体が受容体を介してそれらの作用を発揮する方法は異なる種において異なるかもしれない。従って、キラヤ・サポナリア・モリナの異なる画分のそれらの含有量に基づいていかなる組合せの免疫刺激複合体の重量％も用いられることができる。
【００２４】
本発明によるサポニン調製物の使用は増大した耐性及び増大した免疫原性を有する製品を生ずる。調製物は免疫原性を調整して炎症、過敏感性及びアレルギー反応の増大した制御を与えるために用いられることができる。この調整は種依存であることができ、毒性、耐性及び免疫原性に影響を与えることができる。
【００２５】
いかなる比率の亜画分のキラヤ・サポナリア・モリナサポニンも用いられることができる。また、いかなる組合せの亜画分のキラヤ・サポナリア・モリナも用いられることができる。従って、二種以上の亜画分は免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスにそれぞれ組入れられることができ、本発明による混合物中で用いられることができる。
【００２６】
好ましくは、画分キラヤ・サポナリア・モリナ及び画分Ｑｕｉｌ Ｃが異なる免疫刺激複合体又はマトリックス中に別個に組入れられた免疫刺激複合体及び／又はマトリックスの混合物が用いられる。上述の通り、キラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ及びＣのそれらの含有量に基づく異なる免疫刺激複合体の重量％のいかなる組合せも用いられることができる。混合物は免疫刺激複合体中のキラヤ・サポナリア・モリナの合計画分Ａ及びＣの含有量に基づいて計算して０．１〜９９．９重量％の、５〜９５重量％の、１０〜９０重量％の、１５〜８５重量％の、２０〜８０重量％の、２５〜７５重量％の、３０〜７０重量％の、３５〜６５重量％の、４０〜６０重量％の、４５〜５５重量％の、５０〜５０重量％の、５５〜４５重量％の、６０〜４０重量％の、６５〜３５重量％の、７０〜３０重量％の、７５〜２５重量％の、８０〜２０重量％の、８５〜１５重量％の、９０〜１０重量％の、又は９５〜５重量％の免疫刺激複合体を含むことができ、この免疫刺激複合体はキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ（ここに規定される通り）を含み、各場合において残りの１００％までの免疫刺激複合体はキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃ（ここに規定される通り）を含む。
【００２７】
混合物は７５〜９９．５重量％の画分Ａ及び０．５〜２５重量％の画分Ｃを含むことができる。好ましくは、混合物は９０〜９９重量％の画分Ａ及び１〜１０重量％の画分Ｃを含む。特に好ましい調製物は約９１〜９８重量％の画分Ａ及び約２〜９重量％の画分Ｃ、特に約９２〜９６重量％の画分Ａ及び約４〜８重量％の画分Ｃを、免疫刺激複合体中のキラヤ・サポナリア・モリナの全画分Ａ及びＣの含有量に基づいて計算して含む。
【００２８】
上述の範囲は全て、いかなる種類のヒト又は動物種に投与するための処方においてキラヤ・サポナリア・モリナのいかなる画分のいかなる組合せのためにも用いられることができる。本発明による処方が投与されることができる動物種の例はネコ、イヌ、ウマ、トリ（例、オウム）の如きコンパニオンアニマル、家畜（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）の如き経済的に重要な種である。好ましくは５０重量％以上の画分Ｃがいかなる他の画分との組合せで、特に画分Ａとの組合せで用いられる。従って、５０．５〜９９．５重量％の画分Ｃ及び０．５〜４９．５重量％の画分Ａが用いられることができる。
【００２９】
ここに記述されるように調製されたとき、キラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ，Ｂ及びＣは規定可能な特性を有する化学的に親密に関連した分子のグループ又はファミリーをそれぞれ表す。それらが得られるクロマトグラフィー条件は、溶離プロファイルの観点でのバッチ対バッチ再現性と生物学的活性が高度に一致するような条件である。
【００３０】
本発明はワクチン組成物にまでその範囲を広げる。このワクチン組成物はその活性成分としての（ｉ）これまでの部分で幅広く記述された免疫原性の免疫刺激複合体、又は（ｉｉ）これまでの部分で幅広く記述された免疫刺激複合体マトリックス、並びに少なくとも一種の免疫原を、一種以上の薬学的に許容可能な担体及び／又は希釈剤と共に含む。
【００３１】
かかるワクチン組成物の処方はこの技術分野の当業者には周知である。好適な薬学的に許容可能な担体及び／又は希釈剤はいかなるそして全ての従来の溶媒、分散媒体、充填剤、固形担体、水溶液、被覆、抗細菌及び抗真菌剤、等張性の及び吸収を遅延させる薬剤等を含む。薬学的に活性のある物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は当該技術分野では周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡに記述されている。いかなる従来の媒体又は薬剤が活性成分と非適合性である範囲を除いては、本発明の薬学的組成物におけるその使用は予想される。追加の活性成分も組成物中に組み入れられることができる。
【００３２】
それぞれキラヤ・サポナリア・モリナの本質的に一種の画分を含む本発明による免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスは混合物として、又は同一の投与部位において別個に、又は異なる投与部位において同一もしくは異なる時間で投与されることができる。キラヤ・サポナリア・モリナの異なる画分は異なる免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックス中で、及び異なる組成物中で用いられることができる。
【００３３】
それ故、本発明は少なくとも二種の部分を含む部分のキットであって、各部分が一種の免疫刺激複合体又は一種の免疫刺激複合体マトリックスを含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの一種のサポニン画分を含むものにも関する。キラヤ・サポナリア・モリナの異なる画分は異なる部分の異なる組成物中の異なる免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックスで用いられることができる。
【００３４】
本発明による組成物及び部分のキットはキラヤ・サポナリア・モリナからの画分以外の少なくとも一種の他のアジュバントを含むこともできる。これらのアジュバントは免疫刺激複合体及び／又は免疫刺激複合体マトリックスと混合されるか又はこれらの複合体中に組み入れられることができる。
【００３５】
免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックス中に組み入れられることができる他のアジュバントの例は所望の免疫調節効果を有する天然又は合成のいかなるアジュバントであり、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、脂肪酸、置換ＭＤＰ，ＭＤＰのトレオニル類似体；ＤＤＡ、硫酸デキストランの如きポリアニオン、サポニンの如きリポ多糖類（Ｑｕｉｌ Ａ以外の）である（“Ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．（１９８８）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２，８３−１０１；“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ”（１９８７）Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．９：５，５５１２−５５１６；“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ”，Ｂｅｒｅｎｄｔ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９８５），Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９３−２０１；“Ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ，Ｄ．Ｅ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，８５，３：１，４０−４４）。
【００３６】
投与の容易さ及び用量の均一性のためには組成物を用量単位形態で処方することが特に有利である。ここで用いられる用量単位形態は、治療されるヒト患者のための一体の用量として好適な物理的に区別される単位を意味する；各単位は要求される薬学的担体及び／又は希釈剤との関連で所望の治療効果を生ずるように計算された予め決められた量の活性成分を含む。
【００３７】
なお別の側面において、本発明は個体における免疫応答を誘発又は誘導する方法にまで範囲を広げる。この方法はこれまでの部分で幅広く記述されたようなワクチン組成物の免疫学的に有効な量を個体に投与することを含む。
【００３８】
既に述べた通り、個体はヒト又は他の動物であることができ、家畜（例えばヒツジ、ウシ又はウマ）、研究用試験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ又はモルモット）、コンパニオンアニマル（例えばイヌ又はネコ）又は野生動物を含むことができる。
【００３９】
「免疫学的に有効な量」は少なくとも部分的に所望の免疫応答を達成するために必要な量、又は治療される特定の症状の始まりを遅延させるために、進行を阻害するために、又は始まりもしくは進行を全体的に中止させるために必要な量を意味する。この量は治療される個体の健康状態及び物理的状態に依存して、治療される個体の分類群に依存して、抗体を合成する個体の免疫系の能力に依存して、ワクチンの所望の処方の保護の度合いに依存して、医療的状況の評価に依存して、及び他の関連性のある要因に依存して変化する。この量はルーチン試行を通して決定することができる比較的幅広い範囲内におさまることが予想される。
【００４０】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、他に明示されない限り、用語「含む」は述べられた要素又は一群の要素の含有を意味すると理解されるべきであり、いかなる他の要素又は一群の要素も除外するものではない。
【００４１】
本発明は以下の図面によって例示されるであろう。図中：
【００４２】
図１はＨＰＬＣによる画分Ａ，Ｂ及びＣの調製を示す。
【００４３】
図２は本文中に記述された通りのインフルエンザウイルスのミセルに対する抗原特異的抗体応答がＥＬＩＳＡで（対数力価）、ＩｇＧ１サブクラス（Ａ）で、及びＩｇＧ２ａサブクラス（Ｂ）でテストされたことを示す。マウス（雌のＮＭＲＩ）は０週目及び４週目に表２に記載のワクチン処方で、即ちグループ１〜８で免疫感作された。マウスは３週目及び６週目に採血された。抗体応答は６週目に採取された血液からテストされた。
【００４４】
図３は本文中に記述されたインフルエンザウイルスのミセルでインビトロで刺激された後に図２に記述された通り免疫感作の６週間後に採取された脾臓細胞によるサイトカインＩＬ−５（Ａ）及びＩＦＮ−γ（Ｂ）の生産として測定された細胞性免疫応答を示す。
【００４５】
図４はＢａｌｂ／Ｃマウスでの抗体応答を増大させるためにＯＶＡに補充された場合、マトリックス中の高用量（５０μｇ）のＱＨＣは毒性を有するが、免疫刺激複合体マトリックス中の高用量のＱＨＡは毒性を有さないことを示す（本文参照）。両方の処方は、全ＩｇＧ応答（Ａ）及びＩｇＧ２ａサブクラス（Ｂ）についてＥＬＩＳＡによって２回目の免疫感作後に３週目に測定された通り、ＯＶＡに対する類似の特異的抗体応答を増大させる。
【００４６】
図５はＢａｌｂ／Ｃマウスでの抗体応答を増大させるためにＯＶＡに補充された場合のＱＨＡ及びＱＨＣマトリックスの相乗効果を示す（本文参照）。ＱＨＡ及びＣマトリックスの用量は以下の範囲であった：グループ１ではＡ又はＣはなし；グループ２ではＡが０．３μｇ、Ｃはなし；グループ３ではＡが０．３μｇ、Ｃが２μｇ；グループ４ではＡが１０μｇ、Ｃはなし；グループ５ではＡが１０μｇ、Ｃが２μｇ。ＯＶＡの用量は１０μｇであった。各グループについて８匹のマウスを用いた。これらのマウスはそれぞれの処方を用いて４週間空けて２回免疫感作された。抗体力価はＥＬＩＳＡによって以下のものに対して測定された：
Ａ − １回目の免疫感作の３週間後に全ＩｇＧに対して；
Ｂ − ２回目の免疫感作の２週間後にＩｇＧ２ａに対して；
Ｃ − ２回目の免疫感作の２週間後にＩｇＧ１に対して。
グループ４と５の間で極めて有意な差がある（Ｐ＜０．０００１）。
【００４７】
ここで言及するすべての文献は参照文献としてここに組み入れられる。本発明は以下の非限定的な実施例によって記述されるであろう。
【実施例】
【００４８】
キラヤ・サポナリア・モリナのサブフラグメントサポニンの調製
粗キラヤ・サポナリア・モリナ抽出物の画分Ａ，Ｂ及びＣへの精製
粗キラヤ樹皮抽出物の水溶液（０．５ｇ／ｍｌ）０．５ｍｌがｓｅｐ−ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，ＭＡ）上で予備処理される。
【００４９】
予備処理は充填されたｓｅｐ−ｐａｋカラムを１０％アセトニトリル酸性水溶液で洗浄して親水性物質を除去することを含む。ＱＨ−Ａ，ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃを含む親油性物質は次に７０％アセトニトリル水溶液によって溶離される。
【００５０】
ｓｅｐ−ｐａｋカラムからの親油性画分は次に半調製ＨＰＬＣカラム（ＣＴ−ｓｉｌ，Ｃ８，１０×２５０ｍｍ，ＣｈｏｒｍＴｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって分離される。サンプルは２５〜６０％のアセトニトリル酸性水溶液によってカラムを通して溶離される。三つの画分が分離中にＨＰＬＣカラムから収集される。これらの三つの画分の蒸発後の残余物質はＱＨ−Ａ，ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃを構成する。
【００５１】
ＱＨ−Ａ，ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃと称される画分はそれぞれ約３９，４７及び４９％のアセトニトリルで溶離された。抽出溶離プロファイル及び条件は図１に示される。
【００５２】
実施例２．免疫刺激複合体マトリックスの調製
材料
コレステロール（例えばＳｉｇｍａ Ｃ ８５０３）
ホスファチジルコリン（卵由来のもの、例えばＳｉｇｍａ Ｐ ３５５６）
ＭＥＧＡ−１０（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
キラヤサポニン画分Ａ及びＣ（特許ＷＯ ９６１１７１１）
０．２２μｍの滅菌フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）
ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸緩衝１５０ｍＭ生理食塩水、ｐＨ６．８〜７．４）
Ｓｌｉｄｅ−Ａ―ＬｙｚｅｒカセットＭＷカットオフ１２〜１４．０００（Ｐｉｅｒｃｅ）
【００５３】
ＭＥＧＡ−１０（ストック溶液）
８ｍｌの滅菌水を２．０ｇの乾燥固形ＭＥＧＡ−１０に添加することによって２０％（ｗ／ｗ）ストック溶液を作る。おだやかに加熱（３０〜５０℃）することによって溶解させる。０．２２ｎｍの滅菌フィルターを通して濾過し、少量ずつ小分けし、−２０℃で貯蔵する。
【００５４】
脂質混合物（１５ｍｇ／ｍｌ）
１００ｍｇの各コレステロール及びホスファチジルコリンを１０ｍｌの２０％ＭＥＧＡ−１０に溶解させる。脂質はゆっくりと撹拌されることにより３０〜６０℃でゆっくりと溶解する。０．２２ｎｍの滅菌フィルターを通して濾過し、少量ずつ小分けし、−２０℃で貯蔵する。冷凍後、脂質混合物は明澄になるまで４０℃まで加熱される必要がある。すべての溶液を２４±１℃に保温する。
【００５５】
サポニンストック溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）
１．０ｇのキラヤ・サポナリア・モリナ画分（Ａ又はＣが滅菌水に溶解される。少量ずつ小分けし、−２０℃で冷凍される。）。０．２２ｎｍの滅菌フィルターを通して濾過し、少量ずつ小分けし、−２０℃で貯蔵する。
【００５６】
異なる免疫刺激複合体マトリックス調製物は表１に概略を示したようにして製造される。混合物を以下の手順で調製する。
２ｍｌのＰＢＳを５０ｍｌのファルコンチューブに加える。
１．脂質混合物を加え、完全に混合する。
２．サポニンを加え、完全に混合する。
３．ＰＢＳを加えて１２．０ｍｌの最終容積にし、完全に混合する。
４．３０分間インキュベートする。
５．Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒに充填する。
６．２リットルのＰＢＳ（２４±１℃）の４回の交替に対して透析する（４８〜６０時間）。
７．Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒから吸引し、０．２２ｎｍの滅菌フィルターを通して濾過する。
【００５７】
免疫刺激複合体マトリックスの処方は陰性染色電子顕微鏡で検証され、キラヤサポニンの生ずる濃度はＨＰＬＣで決定された。
【００５８】
【表１】
【００５９】
実施例３．ＰＲ−８タンパク質ミセルの調製
１．１２ｍｇのＰＲ−８モノマー（１．５ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳで希釈して１．０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度にする。
２．０．２２ｎｍの滅菌フィルターを通して濾過する。
３．Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒに充填する。
４．２リットルのＰＢＳ（２４±１℃）の４回の交替に対して透析する（４８〜６０時間）。
５．Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒから吸引する。
【００６０】
実施例４．免疫感作の研究
この実施例は、比較研究において混合物マトリックス粒子からなる免疫刺激複合体マトリックスが最小の度合いの副作用を引き起こすということを示すために行われた。一組の粒子はＱＨＡを唯一のサポニンとして含み、他の組の粒子はＱＨＣを唯一のサポニンとして含み、実施例２に従って調製された。この処方は「粒子の混合物を有するマトリックス」と名付けられる。比較は特許ＷＯ ９６／１１７１１に記述された免疫刺激複合体マトリックス、即ち各粒子がＱＨＡとＱＨＣの両方を例えば７０％のＱＨＡと３０％のＱＨＣの比率で含む免疫刺激複合体マトリックスを用いて行われる。これは「すべてが一緒になった粒子を有するマトリックス」である。
【００６１】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスは免疫刺激複合体マトリックス処方「粒子の混合物を有するマトリックス」と混合された１μｇのＰＲ８ミセル（実施例３に記述のようにして調製された）で０日目及び４２日目に免疫感作され、「すべてが一緒になった粒子を有する免疫刺激複合体マトリックス」又は１００％のＱＨＡ又は１００％のＱＨＣを含む免疫刺激複合体マトリックスと比較され、表２に記述された。治療によって５０％以上のマウスが死亡したか又は許容不可能な副作用を受けたグループは間引かれ、さらなる研究から除外された。
【００６２】
血清サンプルはブースター投与の２週間後の５６日目にグループ１〜７ですべてのマウスから採取された。血清はＩｇＧ１（Ａ）及びＩｇＧ２ａ（Ｂ）サブクラスの抗原特異的抗体についてスクリーニングされた。図中のグループ８はワクチン化されなかったマウスを表す。結果は図２に示される。
【００６３】
２回目の採血後、脾臓が１グループあたり２匹のマウスから採用された（グループ２，４，５，６及び７）。脾臓細胞はＰＲ８ミセルを用いてインビトロで刺激され、ＩＬ-５（Ａ）及びＩＦＮ−γ（Ｂ）の抗原特異的誘導が測定された。図中のグループ８はワクチン化されなかったマウスを表す。結果は図３に示される。
【００６４】
表２
Ｂａｌｂ／Ｃマウスは０及び４２日目に免疫刺激複合体マトリックス処方「粒子の混合物を有するマトリックス」（ＭＩＸグループ１，２及び３）で免疫感作され、「すべてが一緒になった粒子を有する免疫刺激複合体マトリックス」（ＣＯＮＶグループ７，８，９，１０及び１１）と、又は１００％のＱＨＡを含む免疫刺激複合体マトリックス（グループ４及び５）もしくは１００％のＱＨＣを含む免疫刺激複合体マトリックス（グループ６及び１２）と比較された。
【００６５】
【００６６】
結果
ＰＲ８ミセルで免疫感作され８０％のＱＨＡ及び２０％のＱＨＣ（即ち１０μｇ）を含む高用量（５０μｇ）の免疫刺激複合体マトリックスでアジュバント投与されたマウスは１又は２日以内に死亡した。同様に、５０μｇの処方１００％ＱＨＣで免疫感作されたマウスも２日以内に死亡した。対照的に、５０μｇの処方１００％ＱＨＡで免疫感作されたマウスはいかなる気付かれる副作用なしに生存した。即ち、低用量のＱＨＣはＱＨＡと同じマトリックス粒子中に組入れられた場合、マウスを殺すのに十分であった（表２のＣＯＮＶグループ８）。４μｇ（８％）という低用量のＱＨＣが４６μｇ（９２％）のＱＨＡとＣＯＮＶマトリックス中で組合せられた場合でも、８匹のマウスのうち６匹が死亡した（表２のグループ９）。また、２μｇ（４％）のＱＨＣはＣＯＮＶマトリックス中でＱＨＡと組合わせられた場合、マウスを殺した（表２のグループ１０）。グループ６（表２）のマウスは１０μｇのＱＨＣをマトリックス中の１００％として（即ちＱＨＡを含まない）受取り、すべてのマウスが生存した。
【００６７】
従って、ＱＨＣが同じＣＯＮＶマトリックス粒子中でＱＨＡと組合わせられた場合、マウスはＱＨＣに対して一層感受性であった（グループ８，９及び１０）。
【００６８】
低用量のマトリックス、即ち７０％のＱＨＡと３０％のＱＨＣに分割された１０μｇの総サポニンを受取ったマウスはすべて生存した。この場合、マウスは３μｇのＱＨＣを受取った。
【００６９】
ＰＲ８ミセルで免疫感作され異なるマトリックス粒子を含む処方で、即ち一組のＱＨＡ及び一組のＱＨＣを含む粒子の混合物（ＭＩＸ）でアジュバント投与されたマウスは、ＣＯＮＶ処方よりずっと高用量のこのマトリックス処方に耐えて生存した。９２％のＱＨＡ（４６μｇ）及び８％のＱＨＣ（４μｇ）を有する処方を注射されたマウス（表２のグループ２（９２：８）又は２μｇのＱＨＣを含む９６：４の処方を注射されたマウス（表２のグループ３）はすべて生存した。この結果は対応する量のＱＨＡ及びＱＨＣをＣＯＮＶマトリックス中に含むグループ（表２のグループ９及び１０）が高い死亡率を生じたのとは対照的である。
【００７０】
従って、死亡率−毒性はＱＨＣをＱＨＡから物理的に分離してこれらを異なるマトリックス粒子中に分布させることによって回避することができる。
【００７１】
抗体応答の増大
結果は図２に示されている。抗原特異的応答はＩｇＧサブクラスに分割された。マウス（雌のＮＭＲＩ）は０及び４週目に表２に記載されるワクチン処方で免疫感作された。マウスは３週目及び６週目に採血された。６週目でのＩｇＧ１（１０ｌｏｇ Ｅｌｉｓａ 力価）応答はＡで示され、対応するＩｇＧ２応答はＢで示される。
【００７２】
この実験での重要な発見は、図２に示される通りＱＨＡ及びＱＨＣが異なる組の粒子内に分離された場合、抗体応答によって測定されるように免疫増強能力が維持又は増大されるということである。
【００７３】
図２には、粒子の混合物（ＭＩＸ）は、同一の比率の同一用量のＱＨＡ及びＱＨＣが同一粒子に、即ちＣＯＮＶ粒子に組入れられた場合と同様、ＰＲ８ミセルに対する同一レベルのＩｇＧ１抗体（図２Ａ）を増大されるということが示されている。しかし、高レベルのＩｇＧ２ａ抗体がＭＩＸ処方によって増大された。グループ２及び３（ＭＩＸ）はグループ９及び１０（ＣＯＮＶ）ＱＨＡ−ＱＨＣマトリックスと、及び１００％の低用量ＱＨＣマトリックス（グループ６）と、及び１００％のＱＨＡ高用量マトリックス（表２のグループ４）と比較される。グループ７のマウスは１０μｇという低用量（ＣＯＮＶ ７０：３０）、即ちマウスが受け入れることができる用量を注射され、強いＩｇＧ１（図２Ａ）応答を示したが、ＩｇＧ２ａ応答は低かった（図２Ｂ）。
【００７４】
従って、マトリックス粒子の混合物を有するマトリックス処方を用いる本発明は高用量で投与されても副作用を回避することができ、免疫応答をＣＯＮＶマトリックスより高レベルに増大させることができる。特に、ＩｇＧ２ａ応答が増大される。ＩｇＧ２ａ応答は例えばウイルスの如き細胞間寄生体に対する防御のために特に重要である。
【００７５】
細胞性免疫応答の増大
ＣＯＮＶマトリックス処方は許容される用量で細胞性免疫を増大させる能力がＭＩＸ処方より劣る（図３Ａ及びＢ）。ＭＩＸ処方（９２：８、グループ２）はＣＯＮＶ（７０：３０、グループ７）、ＱＨＡ−ＱＨＣ処方、又は１００％ＱＨＣマトリックス処方（グループ６）よりかなり高いＩＬ−５レベルを増大させる。混合物処方（９２：８、グループ９）もＱＨＣ１００％マトリックス（グループ６）又はＣＯＮＶ（７０：３０、グループ７）処方よりＩＦＮ−γをかなり良好に増大させる。
【００７６】
ＱＨＡはＩＬ−５及びＩＦＮ−γ生産によって測定される細胞性免疫応答を増大させる強い能力を有するが、抗体応答を増大させる能力は低いことに注意すべきである。
【００７７】
結局、本発明は、毒性及び副作用をかなり減少させ、免疫応答を増大させる能力を失うことなしにアジュバント活性分子の強い用量を可能にする免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックス処方の概念を規定する。
【００７８】
さらに、低いが許容可能な用量のＱＨＣマトリックス処方はＩｇＧ１応答を増大させる良好な能力を有するが、重要なＩｇＧ２ａ応答に関する能力は低い。細胞性免疫を誘導するＱＨＣマトリックスの能力も本発明のそれよりかなり低い。
【００７９】
ＱＨＡマトリックスは細胞性免疫を強く増大させるが、抗体性免疫を増大させる能力において本発明のものより劣る。
【００８０】
混合されたマトリックス粒子を用いる本発明はＩｇＧ２ａ抗体応答によって測定されかつ細胞性応答によって測定される通り、同一粒子中にＱＨＡ及びＱＨＣを含むマトリックス処方（ＣＯＶＮ）より優れている。
【００８１】
本発明は完全な免疫応答を増大させ、それ故、以前に記述されているマトリックス処方より優れる。これはこの実施例４によって示されている。
【００８２】
実施例５
この実施例では、ＱＨＡが良く許容され、強い免疫増大能力及び免疫調節能力を有することが強調される。卵白アルブミン（ＯＶＡ）は弱い抗原であり、Ｔｈ１型の応答を誘導しないので用いられた。ＱＨＡはＱＨＣと比較された。何故なら、ＱＨＣはヒトの臨床試験で評価されているからである。
【００８３】
材料及び方法
キラヤ・サポナリア・モリナサブフラグメントの調製は実施例１に記述されている。
免疫刺激複合体マトリックスの調製は実施例２に記述されている。
【００８４】
実験計画
グループは８匹のマウスからなり、１０μｇのＯＶＡ及びアジュバントとしての５０μｇのＱＨＡで４週間の間隔を空けて２回、皮下注射により（ｓ．ｃ．）免疫感作された。グループ２は同数のマウスを有し、同様の手順で免疫感作されたがアジュバントが５０μｇのＱＨＣである点が異なっていた。
【００８５】
示される免疫応答はブースター投与の２週間後に採取された血清からのものである。
【００８６】
抗体の決定
特異的ＯＶＡ血清抗体応答は、テスト抗原としてＥＬＩＳＡプレートを被覆するために１ｍｌあたり１０μｇのＯＶＡを用いる標準手順を用いて実施例４に記述されたようにして全ＩｇＧ応答及びＩｇＧ２ａサブクラス応答の両方についてＥＬＩＳＡによって決定された。
【００８７】
結果
ＯＶＡで免疫感作されＱＨＡマトリックスをアジュバントとして投与されたマウスはすべて生存し、不調のいかなる徴候も示さなかった。ＯＶＡで免疫感作されＱＨＣマトリックスをアジュバントとして投与された８匹のマウスのうち４匹のマウスは死亡した。即ち、死亡率は５０％であった。
【００８８】
総免疫応答に関してはグループ間で有意差はなかったが（図４Ａ）、ＥＬＩＳＡ力価はグループ１のマウス、即ちＱＨＡで免疫感作されたマウスの間で一層多くの変動があった。
【００８９】
ＥＬＩＳＡ力価がグループ２のマウス、即ちＱＨＣで免疫感作されたマウスの間で一層多く変動していたことを除いては、グループ１と２の間でＩｇＧ２ａサブクラスにおける平均力価に差はなかった（図４Ｂ）。
【００９０】
この実施例の第２の実験では、ＱＨＡマトリックスは他のアジュバントでの補足から利益を受けることができるかどうかが研究された。ＱＨＡマトリックス及びＱＨＣマトリックスの用量は以下の範囲であった：グループ１ではＡ又はＣはなし；グループ２ではＡが０．３μｇ、Ｃはなし；グループ３ではＡが０．３μｇ、Ｃが２μｇ；グループ４ではＡが１０μｇ、Ｃはなし；グループ５ではＡが１０μｇ、Ｃが２μｇ。ＯＶＡの用量は１０μｇであった。各グループについて８匹のマウスを用いた。これらのマウスはそれぞれの処方を用いて４週間空けて２回免疫感作された（図５Ａ，Ｂ及びＣ）。
【００９１】
血清は最初の免疫感作の３週間後に、及びブースター投与の２週間後に採取された。
【００９２】
特異的ＯＶＡ血清抗体応答は記述されたようにして（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｍ ａｎｄ Ｌｏｅｖｇｒｅｎ−Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ（１９９９） Ｉｓｃｏｍｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ １９，２８９４−２９００）全ＩｇＧ応答及びＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１サブクラス応答についてＥＬＩＳＡによって決定された。
【００９３】
結果
最初の免疫感作後、アジュバント投与されていないＯＶＡ又は２μｇのＱＨＣマトリックスを有するかもしくは有さない０．３μｇのＱＨＡマトリックスでアジュバント投与されたＯＶＡを受取ったマウスでは抗体応答は記録されなかった（図５Ａ）。
【００９４】
第２の免疫感作後、アジュバント投与されていないＯＶＡで免疫感作された８匹のマウスのうち３匹からＩｇＧ１サブクラスにおいて低い応答が検出されたが、ＩｇＧ２ａサブクラスにおいては応答が記録されなかった。最低のアジュバント用量のＱＨＡマトリックス、即ち２μｇのＱＨＣマトリックスを有するかもしくは有さない０．３μｇのＱＨＡマトリックスでも抗体応答は記録されなかった。２μｇのＱＨＣの低用量が１０μｇのＱＨＡに加えられた場合、ＩｇＧ２ａサブクラスにおける抗体応答の明らかな増大があった（図５Ｂ）。
【００９５】
結論
ＱＨＡマトリックスは強いＴＨ１型の応答を促進することによって示される通り、免疫刺激複合体マトリックス中に含まれる場合、極めて低い毒性を有しかつ強い調節効果を有する。これはアジュバント投与されていないＯＶＡ又は極めて低い用量のアジュバントを投与されたＯＶＡとは対照的であり、これらはＩｇＧ１サブクラスにおける抗体応答しか誘発しなかった。ＱＨＡマトリックスは低用量のＱＨＣマトリックスと相乗作用することも示される。これらの結果は重要である。何故なら、これは単純な方法でアジュバント効果を最適化しかつ副作用を最小化することを可能にするからである。このことは強いアジュバントを必要とするＯＶＡの如き弱い抗原について示される通りである。
【００９６】
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＨＰＬＣによる画分Ａ，Ｂ及びＣの調製を示す。
【図２Ａ】本文中に記述された通りのインフルエンザウイルスのミセルに対する抗原特異的抗体応答がＥＬＩＳＡで（対数力価）、ＩｇＧ１サブクラス（Ａ）でテストされたことを示す。
【図２Ｂ】本文中に記述された通りのインフルエンザウイルスのミセルに対する抗原特異的抗体応答がＥＬＩＳＡで（対数力価）、ＩｇＧ２ａサブクラス（Ｂ）でテストされたことを示す。
【図３Ａ】本文中に記述されたインフルエンザウイルスのミセルでインビトロで刺激された後に図２に記述された通り免疫感作の６週間後に採取された脾臓細胞によるサイトカインＩＬ−５（Ａ）の生産として測定された細胞性免疫応答を示す。
【図３Ｂ】本文中に記述されたインフルエンザウイルスのミセルでインビトロで刺激された後に図２に記述された通り免疫感作の６週間後に採取された脾臓細胞によるＩＦＮ−γ（Ｂ）の生産として測定された細胞性免疫応答を示す。
【図４】Ｂａｌｂ／Ｃマウスでの抗体応答を増大させるためにＯＶＡに補充された場合、マトリックス中の高用量（５０μｇ）のＱＨＣは毒性を有するが、免疫刺激複合体マトリックス中の高用量のＱＨＡは毒性を有さないことを示す。
【図５】Ｂａｌｂ／Ｃマウスでの抗体応答を増大させるためにＯＶＡに補充された場合のＱＨＡ及びＱＨＣマトリックスの相乗効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックスから選択される少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含む組成物であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）からの本質的に一種のサポニン画分を含む組成物。
【請求項２】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体及び／又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含み、前記画分が異なる複合体で異なるものであることができる請求項１記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも二種の部分を含む部分のキットであって、各部分が一種の免疫刺激複合体又は一種の免疫刺激複合体マトリックスを含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含み、前記画分が異なる複合体で異なるものであることができる部分のキット。
【請求項６】
キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分以外の少なくとも一種の他のアジュバントを含む請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
免疫調節剤の調製のための請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む使用。
【請求項８】
ワクチンの調製のための請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分及び少なくとも一種の抗原を含む使用。
【請求項９】
アジュバントの調製のための請求項３,５及び／又は６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ、画分Ｂ、画分Ｃ、スピコシド（ｓｐｉｃｏｓｉｄｅ）、Ｑ ＶＡＣ，Ｑｕｉｌ １−２１から選択されることを特徴とする使用。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ、キラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｂ、及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃから選択されることを特徴とする使用。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、混合物が画分Ａ及びＣの重量に基づいて計算してキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａの５０〜７０重量％及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの３０〜５０重量％を含むことを特徴とする使用。
【請求項１３】
請求項９記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、混合物が画分Ａ及びＣの重量に基づいて計算してキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａの３０〜５０重量％及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの５０〜７０重量％を含むことを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がＱｕｉｌ １−２１から選択されることを特徴とする使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックスから選択される少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含む組成物であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）からの本質的に一種の異なるサポニン画分を含む組成物。
【請求項２】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体及び／又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含み、前記画分が異なる複合体で異なるものであることができる請求項１記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも二種の部分を含む部分のキットであって、各部分が一種の免疫刺激複合体又は一種の免疫刺激複合体マトリックスを含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含み、前記画分が異なる複合体で異なるものであることができる部分のキット。
【請求項６】
キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分以外の少なくとも一種の他のアジュバントを含む請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
免疫調節剤の調製のための請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む使用。
【請求項８】
ワクチンの調製のための請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分及び少なくとも一種の抗原を含む使用。
【請求項９】
アジュバントの調製のための請求項３,５及び／又は６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ、画分Ｂ、画分Ｃ、スピコシド（ｓｐｉｃｏｓｉｄｅ）、Ｑ ＶＡＣ，Ｑｕｉｌ １−２１から選択されることを特徴とする使用。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ、キラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｂ、及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃから選択されることを特徴とする使用。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、混合物が画分Ａ及びＣの重量に基づいて計算してキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａの５０〜７０重量％及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの３０〜５０重量％を含むことを特徴とする使用。
【請求項１３】
請求項９記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、混合物が画分Ａ及びＣの重量に基づいて計算してキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａの３０〜５０重量％及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの５０〜７０重量％を含むことを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がＱｕｉｌ １−２１から選択されることを特徴とする使用。
【請求項１】
免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックスから選択される少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含む組成物であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）からの本質的に一種のサポニン画分を含む組成物。
【請求項２】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体及び／又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含み、前記画分が異なる複合体で異なるものであることができる請求項１記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも二種の部分を含む部分のキットであって、各部分が一種の免疫刺激複合体又は一種の免疫刺激複合体マトリックスを含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含み、前記画分が異なる複合体で異なるものであることができる部分のキット。
【請求項６】
キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分以外の少なくとも一種の他のアジュバントを含む請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
免疫調節剤の調製のための請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む使用。
【請求項８】
ワクチンの調製のための請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分及び少なくとも一種の抗原を含む使用。
【請求項９】
アジュバントの調製のための請求項３,５及び／又は６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ、画分Ｂ、画分Ｃ、スピコシド（ｓｐｉｃｏｓｉｄｅ）、Ｑ ＶＡＣ，Ｑｕｉｌ １−２１から選択されることを特徴とする使用。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ、キラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｂ、及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃから選択されることを特徴とする使用。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、混合物が画分Ａ及びＣの重量に基づいて計算してキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａの５０〜７０重量％及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの３０〜５０重量％を含むことを特徴とする使用。
【請求項１３】
請求項９記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、混合物が画分Ａ及びＣの重量に基づいて計算してキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａの３０〜５０重量％及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの５０〜７０重量％を含むことを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がＱｕｉｌ １−２１から選択されることを特徴とする使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫刺激複合体及び免疫刺激複合体マトリックスから選択される少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含む組成物であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）からの本質的に一種の異なるサポニン画分を含む組成物。
【請求項２】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体の混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
組成物が少なくとも二種の免疫刺激複合体及び／又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物を含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含み、前記画分が異なる複合体で異なるものであることができる請求項１記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも二種の部分を含む部分のキットであって、各部分が一種の免疫刺激複合体又は一種の免疫刺激複合体マトリックスを含み、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含み、前記画分が異なる複合体で異なるものであることができる部分のキット。
【請求項６】
キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分以外の少なくとも一種の他のアジュバントを含む請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
免疫調節剤の調製のための請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む使用。
【請求項８】
ワクチンの調製のための請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分及び少なくとも一種の抗原を含む使用。
【請求項９】
アジュバントの調製のための請求項３,５及び／又は６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用であって、各複合体がキラヤ・サポナリア・モリナからの本質的に一種のサポニン画分を含む使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ、画分Ｂ、画分Ｃ、スピコシド（ｓｐｉｃｏｓｉｄｅ）、Ｑ ＶＡＣ，Ｑｕｉｌ １−２１から選択されることを特徴とする使用。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａ、キラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｂ、及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃから選択されることを特徴とする使用。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、混合物が画分Ａ及びＣの重量に基づいて計算してキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａの５０〜７０重量％及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの３０〜５０重量％を含むことを特徴とする使用。
【請求項１３】
請求項９記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、混合物が画分Ａ及びＣの重量に基づいて計算してキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ａの３０〜５０重量％及びキラヤ・サポナリア・モリナの画分Ｃの５０〜７０重量％を含むことを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の少なくとも二種の免疫刺激複合体又は免疫刺激複合体マトリックスの混合物の使用において、キラヤ・サポナリア・モリナからのサポニン画分がＱｕｉｌ １−２１から選択されることを特徴とする使用。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００６−５１１４５１（Ｐ２００６−５１１４５１Ａ）
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５１９４６９（Ｐ２００４−５１９４６９）
【出願日】平成１５年７月７日（２００３．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００３／００１１８０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００４７６２
【国際公開日】平成１６年１月１５日（２００４．１．１５）
【出願人】（５０５００７４５６）イスコノヴァ アーベー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月７日（２００３．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００３／００１１８０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００４７６２
【国際公開日】平成１６年１月１５日（２００４．１．１５）
【出願人】（５０５００７４５６）イスコノヴァ アーベー (1)
【Ｆターム（参考）】
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