免疫調節蛋白質の製造方法
【課題】ヒトリンパ球やヒト型ハイブリドーマ細胞等のヒトリンパ球類を用いて、免疫グ
ロブリンやサイトカイン等の免疫調節蛋白質を効率良く製造する方法を提供すること。
【解決手段】
［１］コラーゲンの存在下にヒトリンパ球類を培養することを特徴とする免疫調節蛋白質
の製造方法。
［２］前記ヒトリンパ球類が、ヒトリンパ球およびヒト型ハイブリドーマ細胞からなる群
より選ばれる少なくとも一種であり、
かつ前記免疫調節蛋白質が、免疫グロブリンおよびサイトカインからなる群より選ばれ
る少なくとも一種であることを特徴とする、上記［１］に記載の免疫調節蛋白質の製造方
法。
［３］前記免疫グロブリンが、ＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体からなる群より選ばれる少な
くとも一種であり、
かつ前記サイトカインが、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子からなる群より選ばれる
少なくとも一種であることを特徴とする上記［２］に記載の免疫調節蛋白質の製造方法。
ロブリンやサイトカイン等の免疫調節蛋白質を効率良く製造する方法を提供すること。
【解決手段】
［１］コラーゲンの存在下にヒトリンパ球類を培養することを特徴とする免疫調節蛋白質
の製造方法。
［２］前記ヒトリンパ球類が、ヒトリンパ球およびヒト型ハイブリドーマ細胞からなる群
より選ばれる少なくとも一種であり、
かつ前記免疫調節蛋白質が、免疫グロブリンおよびサイトカインからなる群より選ばれ
る少なくとも一種であることを特徴とする、上記［１］に記載の免疫調節蛋白質の製造方
法。
［３］前記免疫グロブリンが、ＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体からなる群より選ばれる少な
くとも一種であり、
かつ前記サイトカインが、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子からなる群より選ばれる
少なくとも一種であることを特徴とする上記［２］に記載の免疫調節蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫調節蛋白質の製造方法に関し、特に免疫グロブリンやサイトカイン等の免
疫調節蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンやサイトカイン等の免疫調節蛋白質は、体内診断薬、治療薬等の医薬分
野への応用が期待されている複合蛋白質の一つである。近年の分子生物学的手法の進展に
伴い人工的に前記免疫調節蛋白質を製造する方法が開発されてきている。
一方、前記免疫調節蛋白質を体内診断薬、治療薬等に応用するためには、短時間に効率
よく前記免疫調節蛋白質を製造することが必要である。
前記免疫調節蛋白質は、通常、ヒトリンパ球やヒト型ハイブリドーマ細胞等のヒトリン
パ球類により産生されるが、その生産効率は極めて低いという問題があった。
この様な問題に対応すべく、前記ヒトリンパ球類にミカン果汁を添加する、前記免疫調
節蛋白質の製造方法が提案されている（特許文献１）。
しかしながら、前記製造方法では前記免疫調節蛋白質の産生効率は未だ十分なものでは
なかった。
【特許文献１】特開平６−９８７６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ヒトリンパ球やヒト型ハイブリドーマ細胞等の前記ヒトリンパ球類を
用いて、免疫グロブリンやサイトカイン等の前記免疫調節蛋白質を効率良く製造する方法
を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは鋭意検討した結果、コラーゲンの存在下にヒトリンパ球やヒト型ハイブリ
ドーマ細胞等の前記ヒトリンパ球類を培養することにより、免疫グロブリンやサイトカイ
ン等の免疫調節蛋白質の産生効率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、
［１］コラーゲンの存在下にヒトリンパ球類を培養することを特徴とする免疫調節蛋白質
の製造方法を提供するものであり、
［２］前記ヒトリンパ球類が、ヒトリンパ球およびヒト型ハイブリドーマ細胞からなる群
より選ばれる少なくとも一種であり、
かつ前記免疫調節蛋白質が、免疫グロブリンおよびサイトカインからなる群より選ばれ
る少なくとも一種であることを特徴とする、上記［１］に記載の免疫調節蛋白質の製造方
法を提供するものであり、
［３］前記免疫グロブリンが、ＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体からなる群より選ばれる少な
くとも一種であり、
かつ前記サイトカインが、インターフェロンα、βおよびγならびに腫瘍壊死因子αか
らなる群より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする上記［２］に記載の免疫調
節蛋白質の製造方法を提供するものであり、
［４］前記コラーゲンが、ホワイトタイプクラゲ、チャイナタイプクラゲ、セミチャイナ
タイプクラゲ、キャノンボールタイプクラゲおよびボールタイプクラゲからなる群より選
ばれる少なくとも一種から得られたものを含むことを特徴とする、上記［１］〜［３］の
いずれかに記載の免疫調節蛋白質の製造方法を提供するものであり、
［５］コラーゲンを使用することを特徴とするヒトリンパ球類の培養方法を提供するもの
であり、
［６］コラーゲンの存在下に培養されたことを特徴とするヒトリンパ球類を提供するもの
であり、
［７］ヒトリンパ球類培養用コラーゲンを提供するものであり、
［８］ホワイトタイプクラゲ、チャイナタイプクラゲ、セミチャイナタイプクラゲ、キャ
ノンボールタイプクラゲおよびボールタイプクラゲからなる群より選ばれる少なくとも一
種から得られたものを含むことを特徴とする、上記［７］に記載のヒトリンパ球類培養用
コラーゲンを提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ヒトリンパ球やヒト型ハイブリドーマ細胞等の前記ヒトリンパ球類を
用いて、免疫グロブリンやサイトカイン等の前記免疫調節蛋白質を効率良く製造する方法
を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
まず本発明に使用するヒトリンパ球類について説明する。
本発明に使用するヒトリンパ球類としては、例えば、具体的にはＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ
細胞、マクロファージ等のヒトリンパ球、
ガン細胞とＢリンパ球とを細胞融合させたヒト型ハイブリドーマ細胞等が挙げられる。
この様なヒト型ハイブリドーマ細胞としては、例えば、具体的にはヒト肺ガン細胞とＢ
リンパ球とを細胞融合させたヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞等を挙げることができ
る。
本発明に使用するヒトリンパ球類は、単一種類の細胞からなるものに限定されず、二種
類以上の細胞からなるものであってもよい。
【０００８】
また前記ヒトリンパ球類は、一種もしくは二種以上を使用することができる。
【０００９】
次に本発明に使用するコラーゲンについて説明する。
本発明に使用するコラーゲンとしては特に限定はなく、自然界に存在するもの、人工的
に合成されたもの等を使用することができる。この様なコラーゲンとしては、例えば、植
物由来のもの、動物由来のもの等を挙げることができる。動物由来のコラーゲンとしては
、例えば、動物の骨、皮、皮膚、腱等に含まれるものを挙げることができる。
【００１０】
前記動物としては、例えば、牛、豚、馬、羊、兎、鼠、鯨等の哺乳類、鶏等の鳥類、サ
ケ、マス、タラ等の魚類、クラゲ等の軟体動物類等が挙げられる。
本発明に使用するコラーゲンは、牛、兎等の哺乳類、クラゲ等の軟体動物類等に由来す
るものが好ましく、クラゲ由来のものであればさらに好ましい。
【００１１】
前記クラゲとしては、例えば、ホワイトタイプ、チャイナタイプ、セミチャイナタイプ
、キャノンボールタイプ、ボールタイプ等のクラゲが挙げられる。
【００１２】
前記動物からコラーゲンを採取する方法としては、例えば、前記動物や、その動物から
採取された骨、皮、皮膚、腱等の原料をあらかじめ裁断等の処理を施しておき、前記裁断
等の処理後のものを酸性水溶液により抽出する方法が挙げられる。
【００１３】
前記抽出に使用する酸性水溶液としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸類の水
溶液、シュウ酸、ギ酸、酢酸、酪酸等の有機酸類の水溶液が挙げられる。これらの中でも
取り扱い性の面から無機酸類の水溶液が好ましく、塩酸水溶液であればさらに好ましい。
また、前記酸性水溶液の水素イオン濃度は、ｐＨ２〜４の範囲であることが好ましく、
ｐＨ２．５〜３．５の範囲であれば更に好ましい。
【００１４】
前記酸性水溶液を用いてコラーゲンを抽出する際の温度は通常０〜１５０℃の範囲であ
るが、０〜１３０℃の範囲であれば好ましい。
前記酸性水溶液を用いてコラーゲンを抽出する際の圧力は大気圧に限られず、加圧下に
実施することができる。
【００１５】
また前記酸性水溶液を用いてコラーゲンを抽出する際の時間は、抽出する際の温度等の
諸条件により適宜決定されるが、通常５分〜２４時間の範囲である。
前記酸性水溶液によりコラーゲンを抽出した後、前記抽出操作に供した動物のコラーゲ
ン以外の部分、例えば肉、骨、皮、皮膚、腱の残渣等を除去する操作と、得られた抽出液
を水に対して透析する操作を行なうことにより前記コラーゲンを含む水溶液を得ることが
できる。
【００１６】
本発明に使用するコラーゲンは、自然界に存在する形態のものに限定されず、そのコラ
ーゲンを構成する蛋白質成分が熱により変成されたものであってもよい。前記熱により変
成されたものとしては、例えば、ゲラチン状のコラーゲンを挙げることができる。前記ゲ
ラチン状のコラーゲンは自然界に存在する形態のコラーゲンを加熱することにより得るこ
とができる。
抗体産生促進等の見地から、本発明に使用するコラーゲンはゲラチン状のものが好まし
い。前記ゲラチン状のコラーゲンは、自然界に存在する形態のコラーゲンを、通常８０〜
１５０℃程度に加熱することにより得ることができる。
【００１７】
次に本発明に係る免疫調節蛋白質の製造方法について説明する。
前記免疫調節蛋白質を製造するためには、前記ヒトリンパ球類を培養する操作が必要で
ある。
【００１８】
前記培養操作に使用する培地に特に限定はなく、細胞を培養する目的の培地であればい
かなるものであっても使用することができる。この様な培地としては、例えば、Ｅａｇｌ
ｅのＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙの５Ａまたは７Ａ培地、ＨａｍのＦ１０またはＦ１２培地、
１９９培地等や、これらの改良型の培地等を挙げることができる。この様な培地は一般に
基本合成培地等として入手することが可能である。
【００１９】
前記培地に対しては、ウシ血清等の血清を添加しても良いし、添加しなくても良い。本
発明においては、前記血清を添加しない無血清培地を使用することが血清成分による免疫
調節蛋白質の産生を促進する上で好ましい。
【００２０】
本発明に使用する培地には、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セ
レン酸ナトリウム等の各種添加剤を適宜添加することができる。
【００２１】
前記ヒトリンパ球を培養する際の温度は、通常３０〜４５℃の範囲であり、３５〜４２
℃の範囲であれば好ましく、３６〜３８℃の範囲であればさらに好ましい。
【００２２】
また、前記ヒトリンパ球を培養する際には、炭酸ガスが１〜１０体積％含まれる空気の
雰囲気下に、通常培養が行われる。前記炭酸ガスは３〜８体積％の範囲であれば好ましい
。
【００２３】
前記ヒトリンパ球を培養する際の湿度は、通常８０〜１００％の範囲であり、９０〜１
００％の範囲であれば好ましく、９５〜１００％の範囲であれば更に好ましい。
【００２４】
前記ヒトリンパ球を培養する際の時間は、前記免疫調節蛋白質の製造効率に応じて適宜
決定されるが、通常は５時間〜２週間の範囲である。
【００２５】
次に本発明の製造方法を実施するためには、前記ヒトリンパ球類に加えて前記コラーゲ
ンを使用することが必要である。
前記コラーゲンを使用することにより免疫調節蛋白質を効率よく製造することができる
。
【００２６】
本発明の製造方法に使用する前記コラーゲンの量は、ヒトリンパ球類５×１０４ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｌを基準として、通常５〜３０００μｇ／ｍｌの範囲である。使用する前記コラ
ーゲンの量は、前記免疫調整蛋白質の製造を促進する観点から、５〜２５００μｇ／ｍｌの範囲であれば好ましく、５〜１０００μｇ／ｍｌの範囲であればより好ましく、１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲であればさらに好ましい。
【００２７】
前記コラーゲンを使用して前記ヒトリンパ球類を培養することにより、前記免疫調整蛋
白質を増殖蓄積させることができる。
【００２８】
前記コラーゲンを使用して前記ヒトリンパ球類を培養する操作後に、アフィニティクロ
マトグラフィー等の液体クロマトグラフ法等による分離操作を行なうことにより、前記免
疫調整蛋白質を単離することができる。
【００２９】
本発明の製造方法により得られる免疫調節蛋白質としては、例えば、ＩｇＭ抗体、Ｉｇ
Ｇ抗体等の免疫グロブリン類、インターフェロンα、β、γ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα
）等のサイトカイン類等を挙げることができる。
前記製造方法により得られた免疫グロブリン類、サイトカイン類等は、例えば、免疫疾
患治療薬、免疫機能検査薬等に広く応用することができる。
【００３０】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
【００３１】
［参考例１：ホワイトタイプクラゲからのコラーゲン抽出操作］
漂白加工処理前のホワイトタイプのクラゲを細かく刻み、水素イオン濃度をｐＨ３に調
整した希塩酸水溶液を用いて、温度４℃にて一晩撹拌した。その後、１２１℃にて２０分
間の条件にてコラーゲンの抽出を実施した。
得られた抽出液を超純水に対して透析操作を行い、透析操作後の抽出液をフィルターに
より濾過してコラーゲンを含む水溶液を得た。以下、このコラーゲンを含む水溶液をホワ
イトタイプクラゲコラーゲン水溶液と呼ぶ。
【００３２】
［参考例２：セミチャイナタイプクラゲからのコラーゲン抽出操作］
参考例１における前記ホワイトタイプクラゲに換えてセミチャイナタイプクラゲを用い
た以外は全く同様の操作を行い、コラーゲンを含む水溶液を得た。以下、このコラーゲン
を含む水溶液をセミチャイナタイプクラゲコラーゲン水溶液と呼ぶ。
【００３３】
［参考例３：キャノンボールタイプクラゲからのコラーゲン抽出操作］
参考例１における前記ホワイトタイプクラゲに換えてキャノンボールタイプクラゲを用
いた以外は全く同様の操作を行い、コラーゲンを含む水溶液を得た。以下、このコラーゲ
ンを含む水溶液をキャノンボールタイプクラゲコラーゲン水溶液と呼ぶ。
【００３４】
［参考例４：ウシアキレス腱からのコラーゲン抽出操作］
参考例１における前記ホワイトタイプクラゲに換えてウシアキレス腱を用いた以外は全
く同様の操作を行い、コラーゲンを含む水溶液を得た。以下、このコラーゲンを含む水溶
液をウシアキレス腱コラーゲン水溶液と呼ぶ。
【実施例１】
【００３５】
ヒトリンパ球類として、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ
５を用い、同体積の８５μｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた。
インスリン１０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン２０μｇ／ｍｌ、エタノールアミン２０μ
Ｍ、亜セレン酸ナトリウム２５ｎＭをそれぞれ添加した基本合成培地ＥＲＤＦを用いて、
３７℃の温度で、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下
にて、前記ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の存在下に前記ヒト型ハイブリドーマ
ＨＢ４Ｃ５を６時間培養した。
その結果、ＩｇＭ抗体が１５４ｎｇ／ｍｌ産生された。この結果は、前記ホワイトタイ
プクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合に比較して１９３倍の産生量であった。結果
を表１に示す。
なおＩｇＭ抗体の産生量の測定は、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により実施した。
【００３６】
【表１】
【実施例２】
【００３７】
濃度を変化させたホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いて、実施例１の場合と
同様にＩｇＭ抗体の産生量を測定した。結果を図１に示す。
【実施例３】
【００３８】
セミチャイナタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いて、実施例１の場合と同様にＩｇＭ
抗体の産生量を測定した。結果を表１に示す。
【実施例４】
【００３９】
濃度を変化させたキャノンボールタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いて、実施例１の
場合と同様にＩｇＭ抗体の産生量を測定した。結果を表１に示す。
【実施例５】
【００４０】
濃度を変化させたウシアキレス腱コラーゲン水溶液を用いて、実施例１の場合と同様に
ＩｇＭ抗体の産生量を測定した。結果を表１に示す。
【実施例６】
【００４１】
ヒトリンパ球類として、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヒト末梢血リンパ球を用い、同
体積の４５０μｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた。
ヒト末梢血は健常人の腕の静脈より採取した。前記ヒト末梢血からの前記ヒト末梢血リ
ンパ球の分離は、リンパ球分離液（ＬＳＭ）を用いた遠心分離法により行った。生理リン
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により２倍に希釈した前記ヒト末梢血を前記ＬＳＭ上に重層した
後、８００ｒｐｍ（回転／分）にて２０分間遠心分離し、ＬＳＭと前記ヒト末梢血との界
面に層状に分離したヒト末梢血リンパ球を回収し、前記ヒト末梢血リンパ球として使用し
た。
インスリン１０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン２０μｇ／ｍｌ、エタノールアミン２０
μＭ、亜セレン酸ナトリウム２５ｎＭをそれぞれ添加した基本合成培地ＥＲＤＦを用いて
、３７℃の温度で、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件
下にて、前記ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の存在下に前記ヒト末梢血リンパ球
を３日間培養した。
その結果、４５０μｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた場合、
前記ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合と比較して、ＩｇＭ抗体が
２．８倍多く産生され、ＩｇＧ抗体が１．４倍多く産生された。結果を図２および図３に
示す。
なおＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体の産生量の測定は、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によ
り実施した。
【実施例７】
【００４２】
濃度の異なる種々のホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を使用したこと、リポポリ
サッカライド（ＬＰＳ）１０μｇ／ｍｌをさらに追加して加えた以外は実施例６の場合と
同様の操作により、インターフェロンγの産生量を測定した。インターフェロンγの産生
量の測定は、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により実施した。
図４に示す通り、前記ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合と比較
して、インターフェロンγが１００倍多く産生された。
【実施例８】
【００４３】
ヒトリンパ球類として、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ
５を用い、同体積の１０μｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた他
は、実施例１の場合と同様の操作により、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５の生存率を７
日間追跡した。
ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いない場合と比較して、７日目のヒト型ハ
イブリドーマＨＢ４Ｃ５の生存率はほとんど変化しなかった。
一方、ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いない場合と比較して、培養後期の
ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５の生存率低下を抑制する働きが観測された。結果を図５
に示す。
また、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５の細胞増殖に関しては、培養１日目から５日目
にかけての平均細胞倍加時間は、ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いない場合
が３２．９時間であるのに対し、ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた場合は
２３．４時間であった。結果を図５に示す。
【実施例９】
【００４４】
１０μｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた他は、実施例１の場
合と同様の操作を行い、ＩｇＭ抗体の産生蓄積量の経時変化を調べたところ、培養７日目
までＩｇＭ抗体の産生蓄積量は増加した。結果を図６に示す。
【実施例１０】
【００４５】
実施例７の場合においてインターフェロンγの産生蓄積量の経時変化を調べたところ、
培養２日目までインターフェロンγの産生蓄積量は増加した。結果を図７に示す。
【実施例１１】
【００４６】
実施例７の場合においてならびに腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生蓄積量の経時変化
を調べたところ、培養５日目まで腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生蓄積量は増加した。
結果を図８に示す。
なお腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生量の測定は、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によ
り実施した。
【比較例】
【００４７】
１．６ｍｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲンを含有するホワイトタイプクラゲ
コラーゲン水溶液に対し、同体積の２５μｇ／ｍｌのコラゲナーゼで１０分間処理し、５
分間煮沸してコラゲナーゼの活性を失活させた後、実施例１の場合と同様に、５×１０４
ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５を６時間培養した。
この結果、ＩｇＭ抗体の産生量は、コラーゲン分解酵素であるコラゲナーゼによる処理
を実施しない場合と比較して、半分に低下した。
また、２５０μｇ／ｍｌのコラゲナーゼを用いた他は全く同様の条件によりヒト型ハイ
ブリドーマＨＢ４Ｃ５を６時間培養した後のＩｇＭ抗体の産生量を測定したところ、Ｉｇ
Ｍ抗体の産生量は、ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を使用しない場合と同程度で
あった。結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の濃度とＩｇＭ抗体の産生量との関係を示したグラフである（実施例２）。
【図２】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の濃度とＩｇＭ抗体の産生量との関係を示したグラフである（実施例６）。
【図３】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の濃度とＩｇＧ抗体の産生量との関係を示したグラフである（実施例６）。
【図４】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の濃度とインターフェロンγの産生量との関係を示したグラフである（実施例７）。
【図５】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液存在下における、培養時間ならびにヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５の生存率および生細胞密度との関係を示したグラフである（実施例８）。
【図６】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液存在下における、培養時間とＩｇＭ抗体の産生量との関係を示したグラフである（実施例９）。
【図７】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液存在下における、培養時間とインターフェロンγとの産生量との関係を示したグラフである（実施例１０）。
【図８】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液存在下における、培養時間と腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）との産生量との関係を示したグラフである（実施例１１）。
【符号の説明】
【００５０】
１、３ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のＩｇＭ抗体の産生
量
２、４ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のＩｇＭ抗体の産
生量
５ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のＩｇＧ抗体の産生量
６ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のＩｇＧ抗体の産生量
７ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のインターフェロンγの
産生量
８ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のインターフェロンγ
の産生量
９ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のヒト型ハイブリドーマ
ＨＢ４Ｃ５の生存率
１０ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のヒト型ハイブリドー
マＨＢ４Ｃ５の生存率
１１ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のヒト型ハイブリドーマ
ＨＢ４Ｃ５の生細胞密度
１２ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のヒト型ハイブリドー
マＨＢ４Ｃ５の生細胞密度
１３ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のＩｇＭ抗体の産生蓄積
量
１４ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のＩｇＭ抗体の産生蓄
積量
１５ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のインターフェロンγの
産生蓄積量
１６ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のインターフェロンγ
の産生蓄積量
１７ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合の腫瘍壊死因子α（ＴＮ
Ｆα）の産生蓄積量
１８ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合の腫瘍壊死因子α（
ＴＮＦα）の産生蓄積量
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫調節蛋白質の製造方法に関し、特に免疫グロブリンやサイトカイン等の免
疫調節蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンやサイトカイン等の免疫調節蛋白質は、体内診断薬、治療薬等の医薬分
野への応用が期待されている複合蛋白質の一つである。近年の分子生物学的手法の進展に
伴い人工的に前記免疫調節蛋白質を製造する方法が開発されてきている。
一方、前記免疫調節蛋白質を体内診断薬、治療薬等に応用するためには、短時間に効率
よく前記免疫調節蛋白質を製造することが必要である。
前記免疫調節蛋白質は、通常、ヒトリンパ球やヒト型ハイブリドーマ細胞等のヒトリン
パ球類により産生されるが、その生産効率は極めて低いという問題があった。
この様な問題に対応すべく、前記ヒトリンパ球類にミカン果汁を添加する、前記免疫調
節蛋白質の製造方法が提案されている（特許文献１）。
しかしながら、前記製造方法では前記免疫調節蛋白質の産生効率は未だ十分なものでは
なかった。
【特許文献１】特開平６−９８７６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ヒトリンパ球やヒト型ハイブリドーマ細胞等の前記ヒトリンパ球類を
用いて、免疫グロブリンやサイトカイン等の前記免疫調節蛋白質を効率良く製造する方法
を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは鋭意検討した結果、コラーゲンの存在下にヒトリンパ球やヒト型ハイブリ
ドーマ細胞等の前記ヒトリンパ球類を培養することにより、免疫グロブリンやサイトカイ
ン等の免疫調節蛋白質の産生効率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、
［１］コラーゲンの存在下にヒトリンパ球類を培養することを特徴とする免疫調節蛋白質
の製造方法を提供するものであり、
［２］前記ヒトリンパ球類が、ヒトリンパ球およびヒト型ハイブリドーマ細胞からなる群
より選ばれる少なくとも一種であり、
かつ前記免疫調節蛋白質が、免疫グロブリンおよびサイトカインからなる群より選ばれ
る少なくとも一種であることを特徴とする、上記［１］に記載の免疫調節蛋白質の製造方
法を提供するものであり、
［３］前記免疫グロブリンが、ＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体からなる群より選ばれる少な
くとも一種であり、
かつ前記サイトカインが、インターフェロンα、βおよびγならびに腫瘍壊死因子αか
らなる群より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする上記［２］に記載の免疫調
節蛋白質の製造方法を提供するものであり、
［４］前記コラーゲンが、ホワイトタイプクラゲ、チャイナタイプクラゲ、セミチャイナ
タイプクラゲ、キャノンボールタイプクラゲおよびボールタイプクラゲからなる群より選
ばれる少なくとも一種から得られたものを含むことを特徴とする、上記［１］〜［３］の
いずれかに記載の免疫調節蛋白質の製造方法を提供するものであり、
［５］コラーゲンを使用することを特徴とするヒトリンパ球類の培養方法を提供するもの
であり、
［６］コラーゲンの存在下に培養されたことを特徴とするヒトリンパ球類を提供するもの
であり、
［７］ヒトリンパ球類培養用コラーゲンを提供するものであり、
［８］ホワイトタイプクラゲ、チャイナタイプクラゲ、セミチャイナタイプクラゲ、キャ
ノンボールタイプクラゲおよびボールタイプクラゲからなる群より選ばれる少なくとも一
種から得られたものを含むことを特徴とする、上記［７］に記載のヒトリンパ球類培養用
コラーゲンを提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ヒトリンパ球やヒト型ハイブリドーマ細胞等の前記ヒトリンパ球類を
用いて、免疫グロブリンやサイトカイン等の前記免疫調節蛋白質を効率良く製造する方法
を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
まず本発明に使用するヒトリンパ球類について説明する。
本発明に使用するヒトリンパ球類としては、例えば、具体的にはＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ
細胞、マクロファージ等のヒトリンパ球、
ガン細胞とＢリンパ球とを細胞融合させたヒト型ハイブリドーマ細胞等が挙げられる。
この様なヒト型ハイブリドーマ細胞としては、例えば、具体的にはヒト肺ガン細胞とＢ
リンパ球とを細胞融合させたヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞等を挙げることができ
る。
本発明に使用するヒトリンパ球類は、単一種類の細胞からなるものに限定されず、二種
類以上の細胞からなるものであってもよい。
【０００８】
また前記ヒトリンパ球類は、一種もしくは二種以上を使用することができる。
【０００９】
次に本発明に使用するコラーゲンについて説明する。
本発明に使用するコラーゲンとしては特に限定はなく、自然界に存在するもの、人工的
に合成されたもの等を使用することができる。この様なコラーゲンとしては、例えば、植
物由来のもの、動物由来のもの等を挙げることができる。動物由来のコラーゲンとしては
、例えば、動物の骨、皮、皮膚、腱等に含まれるものを挙げることができる。
【００１０】
前記動物としては、例えば、牛、豚、馬、羊、兎、鼠、鯨等の哺乳類、鶏等の鳥類、サ
ケ、マス、タラ等の魚類、クラゲ等の軟体動物類等が挙げられる。
本発明に使用するコラーゲンは、牛、兎等の哺乳類、クラゲ等の軟体動物類等に由来す
るものが好ましく、クラゲ由来のものであればさらに好ましい。
【００１１】
前記クラゲとしては、例えば、ホワイトタイプ、チャイナタイプ、セミチャイナタイプ
、キャノンボールタイプ、ボールタイプ等のクラゲが挙げられる。
【００１２】
前記動物からコラーゲンを採取する方法としては、例えば、前記動物や、その動物から
採取された骨、皮、皮膚、腱等の原料をあらかじめ裁断等の処理を施しておき、前記裁断
等の処理後のものを酸性水溶液により抽出する方法が挙げられる。
【００１３】
前記抽出に使用する酸性水溶液としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸類の水
溶液、シュウ酸、ギ酸、酢酸、酪酸等の有機酸類の水溶液が挙げられる。これらの中でも
取り扱い性の面から無機酸類の水溶液が好ましく、塩酸水溶液であればさらに好ましい。
また、前記酸性水溶液の水素イオン濃度は、ｐＨ２〜４の範囲であることが好ましく、
ｐＨ２．５〜３．５の範囲であれば更に好ましい。
【００１４】
前記酸性水溶液を用いてコラーゲンを抽出する際の温度は通常０〜１５０℃の範囲であ
るが、０〜１３０℃の範囲であれば好ましい。
前記酸性水溶液を用いてコラーゲンを抽出する際の圧力は大気圧に限られず、加圧下に
実施することができる。
【００１５】
また前記酸性水溶液を用いてコラーゲンを抽出する際の時間は、抽出する際の温度等の
諸条件により適宜決定されるが、通常５分〜２４時間の範囲である。
前記酸性水溶液によりコラーゲンを抽出した後、前記抽出操作に供した動物のコラーゲ
ン以外の部分、例えば肉、骨、皮、皮膚、腱の残渣等を除去する操作と、得られた抽出液
を水に対して透析する操作を行なうことにより前記コラーゲンを含む水溶液を得ることが
できる。
【００１６】
本発明に使用するコラーゲンは、自然界に存在する形態のものに限定されず、そのコラ
ーゲンを構成する蛋白質成分が熱により変成されたものであってもよい。前記熱により変
成されたものとしては、例えば、ゲラチン状のコラーゲンを挙げることができる。前記ゲ
ラチン状のコラーゲンは自然界に存在する形態のコラーゲンを加熱することにより得るこ
とができる。
抗体産生促進等の見地から、本発明に使用するコラーゲンはゲラチン状のものが好まし
い。前記ゲラチン状のコラーゲンは、自然界に存在する形態のコラーゲンを、通常８０〜
１５０℃程度に加熱することにより得ることができる。
【００１７】
次に本発明に係る免疫調節蛋白質の製造方法について説明する。
前記免疫調節蛋白質を製造するためには、前記ヒトリンパ球類を培養する操作が必要で
ある。
【００１８】
前記培養操作に使用する培地に特に限定はなく、細胞を培養する目的の培地であればい
かなるものであっても使用することができる。この様な培地としては、例えば、Ｅａｇｌ
ｅのＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙの５Ａまたは７Ａ培地、ＨａｍのＦ１０またはＦ１２培地、
１９９培地等や、これらの改良型の培地等を挙げることができる。この様な培地は一般に
基本合成培地等として入手することが可能である。
【００１９】
前記培地に対しては、ウシ血清等の血清を添加しても良いし、添加しなくても良い。本
発明においては、前記血清を添加しない無血清培地を使用することが血清成分による免疫
調節蛋白質の産生を促進する上で好ましい。
【００２０】
本発明に使用する培地には、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セ
レン酸ナトリウム等の各種添加剤を適宜添加することができる。
【００２１】
前記ヒトリンパ球を培養する際の温度は、通常３０〜４５℃の範囲であり、３５〜４２
℃の範囲であれば好ましく、３６〜３８℃の範囲であればさらに好ましい。
【００２２】
また、前記ヒトリンパ球を培養する際には、炭酸ガスが１〜１０体積％含まれる空気の
雰囲気下に、通常培養が行われる。前記炭酸ガスは３〜８体積％の範囲であれば好ましい
。
【００２３】
前記ヒトリンパ球を培養する際の湿度は、通常８０〜１００％の範囲であり、９０〜１
００％の範囲であれば好ましく、９５〜１００％の範囲であれば更に好ましい。
【００２４】
前記ヒトリンパ球を培養する際の時間は、前記免疫調節蛋白質の製造効率に応じて適宜
決定されるが、通常は５時間〜２週間の範囲である。
【００２５】
次に本発明の製造方法を実施するためには、前記ヒトリンパ球類に加えて前記コラーゲ
ンを使用することが必要である。
前記コラーゲンを使用することにより免疫調節蛋白質を効率よく製造することができる
。
【００２６】
本発明の製造方法に使用する前記コラーゲンの量は、ヒトリンパ球類５×１０４ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｌを基準として、通常５〜３０００μｇ／ｍｌの範囲である。使用する前記コラ
ーゲンの量は、前記免疫調整蛋白質の製造を促進する観点から、５〜２５００μｇ／ｍｌの範囲であれば好ましく、５〜１０００μｇ／ｍｌの範囲であればより好ましく、１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲であればさらに好ましい。
【００２７】
前記コラーゲンを使用して前記ヒトリンパ球類を培養することにより、前記免疫調整蛋
白質を増殖蓄積させることができる。
【００２８】
前記コラーゲンを使用して前記ヒトリンパ球類を培養する操作後に、アフィニティクロ
マトグラフィー等の液体クロマトグラフ法等による分離操作を行なうことにより、前記免
疫調整蛋白質を単離することができる。
【００２９】
本発明の製造方法により得られる免疫調節蛋白質としては、例えば、ＩｇＭ抗体、Ｉｇ
Ｇ抗体等の免疫グロブリン類、インターフェロンα、β、γ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα
）等のサイトカイン類等を挙げることができる。
前記製造方法により得られた免疫グロブリン類、サイトカイン類等は、例えば、免疫疾
患治療薬、免疫機能検査薬等に広く応用することができる。
【００３０】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
【００３１】
［参考例１：ホワイトタイプクラゲからのコラーゲン抽出操作］
漂白加工処理前のホワイトタイプのクラゲを細かく刻み、水素イオン濃度をｐＨ３に調
整した希塩酸水溶液を用いて、温度４℃にて一晩撹拌した。その後、１２１℃にて２０分
間の条件にてコラーゲンの抽出を実施した。
得られた抽出液を超純水に対して透析操作を行い、透析操作後の抽出液をフィルターに
より濾過してコラーゲンを含む水溶液を得た。以下、このコラーゲンを含む水溶液をホワ
イトタイプクラゲコラーゲン水溶液と呼ぶ。
【００３２】
［参考例２：セミチャイナタイプクラゲからのコラーゲン抽出操作］
参考例１における前記ホワイトタイプクラゲに換えてセミチャイナタイプクラゲを用い
た以外は全く同様の操作を行い、コラーゲンを含む水溶液を得た。以下、このコラーゲン
を含む水溶液をセミチャイナタイプクラゲコラーゲン水溶液と呼ぶ。
【００３３】
［参考例３：キャノンボールタイプクラゲからのコラーゲン抽出操作］
参考例１における前記ホワイトタイプクラゲに換えてキャノンボールタイプクラゲを用
いた以外は全く同様の操作を行い、コラーゲンを含む水溶液を得た。以下、このコラーゲ
ンを含む水溶液をキャノンボールタイプクラゲコラーゲン水溶液と呼ぶ。
【００３４】
［参考例４：ウシアキレス腱からのコラーゲン抽出操作］
参考例１における前記ホワイトタイプクラゲに換えてウシアキレス腱を用いた以外は全
く同様の操作を行い、コラーゲンを含む水溶液を得た。以下、このコラーゲンを含む水溶
液をウシアキレス腱コラーゲン水溶液と呼ぶ。
【実施例１】
【００３５】
ヒトリンパ球類として、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ
５を用い、同体積の８５μｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた。
インスリン１０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン２０μｇ／ｍｌ、エタノールアミン２０μ
Ｍ、亜セレン酸ナトリウム２５ｎＭをそれぞれ添加した基本合成培地ＥＲＤＦを用いて、
３７℃の温度で、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下
にて、前記ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の存在下に前記ヒト型ハイブリドーマ
ＨＢ４Ｃ５を６時間培養した。
その結果、ＩｇＭ抗体が１５４ｎｇ／ｍｌ産生された。この結果は、前記ホワイトタイ
プクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合に比較して１９３倍の産生量であった。結果
を表１に示す。
なおＩｇＭ抗体の産生量の測定は、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により実施した。
【００３６】
【表１】
【実施例２】
【００３７】
濃度を変化させたホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いて、実施例１の場合と
同様にＩｇＭ抗体の産生量を測定した。結果を図１に示す。
【実施例３】
【００３８】
セミチャイナタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いて、実施例１の場合と同様にＩｇＭ
抗体の産生量を測定した。結果を表１に示す。
【実施例４】
【００３９】
濃度を変化させたキャノンボールタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いて、実施例１の
場合と同様にＩｇＭ抗体の産生量を測定した。結果を表１に示す。
【実施例５】
【００４０】
濃度を変化させたウシアキレス腱コラーゲン水溶液を用いて、実施例１の場合と同様に
ＩｇＭ抗体の産生量を測定した。結果を表１に示す。
【実施例６】
【００４１】
ヒトリンパ球類として、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヒト末梢血リンパ球を用い、同
体積の４５０μｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた。
ヒト末梢血は健常人の腕の静脈より採取した。前記ヒト末梢血からの前記ヒト末梢血リ
ンパ球の分離は、リンパ球分離液（ＬＳＭ）を用いた遠心分離法により行った。生理リン
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により２倍に希釈した前記ヒト末梢血を前記ＬＳＭ上に重層した
後、８００ｒｐｍ（回転／分）にて２０分間遠心分離し、ＬＳＭと前記ヒト末梢血との界
面に層状に分離したヒト末梢血リンパ球を回収し、前記ヒト末梢血リンパ球として使用し
た。
インスリン１０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン２０μｇ／ｍｌ、エタノールアミン２０
μＭ、亜セレン酸ナトリウム２５ｎＭをそれぞれ添加した基本合成培地ＥＲＤＦを用いて
、３７℃の温度で、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件
下にて、前記ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の存在下に前記ヒト末梢血リンパ球
を３日間培養した。
その結果、４５０μｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた場合、
前記ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合と比較して、ＩｇＭ抗体が
２．８倍多く産生され、ＩｇＧ抗体が１．４倍多く産生された。結果を図２および図３に
示す。
なおＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体の産生量の測定は、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によ
り実施した。
【実施例７】
【００４２】
濃度の異なる種々のホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を使用したこと、リポポリ
サッカライド（ＬＰＳ）１０μｇ／ｍｌをさらに追加して加えた以外は実施例６の場合と
同様の操作により、インターフェロンγの産生量を測定した。インターフェロンγの産生
量の測定は、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により実施した。
図４に示す通り、前記ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合と比較
して、インターフェロンγが１００倍多く産生された。
【実施例８】
【００４３】
ヒトリンパ球類として、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ
５を用い、同体積の１０μｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた他
は、実施例１の場合と同様の操作により、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５の生存率を７
日間追跡した。
ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いない場合と比較して、７日目のヒト型ハ
イブリドーマＨＢ４Ｃ５の生存率はほとんど変化しなかった。
一方、ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いない場合と比較して、培養後期の
ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５の生存率低下を抑制する働きが観測された。結果を図５
に示す。
また、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５の細胞増殖に関しては、培養１日目から５日目
にかけての平均細胞倍加時間は、ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いない場合
が３２．９時間であるのに対し、ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた場合は
２３．４時間であった。結果を図５に示す。
【実施例９】
【００４４】
１０μｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を用いた他は、実施例１の場
合と同様の操作を行い、ＩｇＭ抗体の産生蓄積量の経時変化を調べたところ、培養７日目
までＩｇＭ抗体の産生蓄積量は増加した。結果を図６に示す。
【実施例１０】
【００４５】
実施例７の場合においてインターフェロンγの産生蓄積量の経時変化を調べたところ、
培養２日目までインターフェロンγの産生蓄積量は増加した。結果を図７に示す。
【実施例１１】
【００４６】
実施例７の場合においてならびに腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生蓄積量の経時変化
を調べたところ、培養５日目まで腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生蓄積量は増加した。
結果を図８に示す。
なお腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生量の測定は、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によ
り実施した。
【比較例】
【００４７】
１．６ｍｇ／ｍｌのホワイトタイプクラゲコラーゲンを含有するホワイトタイプクラゲ
コラーゲン水溶液に対し、同体積の２５μｇ／ｍｌのコラゲナーゼで１０分間処理し、５
分間煮沸してコラゲナーゼの活性を失活させた後、実施例１の場合と同様に、５×１０４
ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５を６時間培養した。
この結果、ＩｇＭ抗体の産生量は、コラーゲン分解酵素であるコラゲナーゼによる処理
を実施しない場合と比較して、半分に低下した。
また、２５０μｇ／ｍｌのコラゲナーゼを用いた他は全く同様の条件によりヒト型ハイ
ブリドーマＨＢ４Ｃ５を６時間培養した後のＩｇＭ抗体の産生量を測定したところ、Ｉｇ
Ｍ抗体の産生量は、ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液を使用しない場合と同程度で
あった。結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の濃度とＩｇＭ抗体の産生量との関係を示したグラフである（実施例２）。
【図２】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の濃度とＩｇＭ抗体の産生量との関係を示したグラフである（実施例６）。
【図３】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の濃度とＩｇＧ抗体の産生量との関係を示したグラフである（実施例６）。
【図４】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液の濃度とインターフェロンγの産生量との関係を示したグラフである（実施例７）。
【図５】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液存在下における、培養時間ならびにヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５の生存率および生細胞密度との関係を示したグラフである（実施例８）。
【図６】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液存在下における、培養時間とＩｇＭ抗体の産生量との関係を示したグラフである（実施例９）。
【図７】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液存在下における、培養時間とインターフェロンγとの産生量との関係を示したグラフである（実施例１０）。
【図８】ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液存在下における、培養時間と腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）との産生量との関係を示したグラフである（実施例１１）。
【符号の説明】
【００５０】
１、３ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のＩｇＭ抗体の産生
量
２、４ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のＩｇＭ抗体の産
生量
５ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のＩｇＧ抗体の産生量
６ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のＩｇＧ抗体の産生量
７ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のインターフェロンγの
産生量
８ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のインターフェロンγ
の産生量
９ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のヒト型ハイブリドーマ
ＨＢ４Ｃ５の生存率
１０ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のヒト型ハイブリドー
マＨＢ４Ｃ５の生存率
１１ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のヒト型ハイブリドーマ
ＨＢ４Ｃ５の生細胞密度
１２ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のヒト型ハイブリドー
マＨＢ４Ｃ５の生細胞密度
１３ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のＩｇＭ抗体の産生蓄積
量
１４ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のＩｇＭ抗体の産生蓄
積量
１５ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合のインターフェロンγの
産生蓄積量
１６ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合のインターフェロンγ
の産生蓄積量
１７ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在する場合の腫瘍壊死因子α（ＴＮ
Ｆα）の産生蓄積量
１８ ホワイトタイプクラゲコラーゲン水溶液が存在しない場合の腫瘍壊死因子α（
ＴＮＦα）の産生蓄積量
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンの存在下にヒトリンパ球類を培養することを特徴とする免疫調節蛋白質の製
造方法。
【請求項２】
前記ヒトリンパ球類が、ヒトリンパ球およびヒト型ハイブリドーマ細胞からなる群より
選ばれる少なくとも一種であり、
かつ前記免疫調節蛋白質が、免疫グロブリンおよびサイトカインからなる群より選ばれ
る少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節蛋白質の製造方法
。
【請求項３】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体からなる群より選ばれる少なくと
も一種であり、
かつ前記サイトカインが、インターフェロンα、βおよびγならびに腫瘍壊死因子αか
らなる群より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項２に記載の免疫調節
蛋白質の製造方法。
【請求項４】
前記コラーゲンが、ホワイトタイプクラゲ、チャイナタイプクラゲ、セミチャイナタイ
プクラゲ、キャノンボールタイプクラゲおよびボールタイプクラゲからなる群より選ばれ
る少なくとも一種から得られたコラーゲンを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいず
れかに記載の免疫調節蛋白質の製造方法。
【請求項５】
コラーゲンを使用することを特徴とするヒトリンパ球類の培養方法。
【請求項６】
コラーゲンの存在下に培養されたことを特徴とするヒトリンパ球類。
【請求項７】
ヒトリンパ球類培養用コラーゲン。
【請求項８】
ホワイトタイプクラゲ、チャイナタイプクラゲ、セミチャイナタイプクラゲ、キャノン
ボールタイプクラゲおよびボールタイプクラゲからなる群より選ばれる少なくとも一種か
ら得られたコラーゲンを含むことを特徴とする、請求項７に記載のヒトリンパ球類培養用
コラーゲン。
【請求項１】
コラーゲンの存在下にヒトリンパ球類を培養することを特徴とする免疫調節蛋白質の製
造方法。
【請求項２】
前記ヒトリンパ球類が、ヒトリンパ球およびヒト型ハイブリドーマ細胞からなる群より
選ばれる少なくとも一種であり、
かつ前記免疫調節蛋白質が、免疫グロブリンおよびサイトカインからなる群より選ばれ
る少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節蛋白質の製造方法
。
【請求項３】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体からなる群より選ばれる少なくと
も一種であり、
かつ前記サイトカインが、インターフェロンα、βおよびγならびに腫瘍壊死因子αか
らなる群より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項２に記載の免疫調節
蛋白質の製造方法。
【請求項４】
前記コラーゲンが、ホワイトタイプクラゲ、チャイナタイプクラゲ、セミチャイナタイ
プクラゲ、キャノンボールタイプクラゲおよびボールタイプクラゲからなる群より選ばれ
る少なくとも一種から得られたコラーゲンを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいず
れかに記載の免疫調節蛋白質の製造方法。
【請求項５】
コラーゲンを使用することを特徴とするヒトリンパ球類の培養方法。
【請求項６】
コラーゲンの存在下に培養されたことを特徴とするヒトリンパ球類。
【請求項７】
ヒトリンパ球類培養用コラーゲン。
【請求項８】
ホワイトタイプクラゲ、チャイナタイプクラゲ、セミチャイナタイプクラゲ、キャノン
ボールタイプクラゲおよびボールタイプクラゲからなる群より選ばれる少なくとも一種か
ら得られたコラーゲンを含むことを特徴とする、請求項７に記載のヒトリンパ球類培養用
コラーゲン。
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−２０４２４８（Ｐ２００６−２０４２４８Ａ）
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３４６７（Ｐ２００５−２３４６７）
【出願日】平成１７年１月３１日（２００５．１．３１）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月３１日（２００５．１．３１）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
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