分離性向上剤
【課題】 生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に、目的物質を分離精製でき、膜の透過速度低下させることが極めて少ない分離性向上剤を提供すること。
【解決手段】 少なくとも１つのチオール基を分子内に含有し、少なくとも１つのそれ以外の親水性基分子内に含有する化合物（Ａ）を含有することを特徴とするろ過性向上剤。化合物（Ａ）としては、式（１）で示される化合物が好ましい。
【化１】
［ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜２０の整数を表す。Ｂm+はｍ価のカチオンを表す。異なるｍ個の｛｝内の式で表される基において、ｎは同一でも異なっていてもよい。］
【解決手段】 少なくとも１つのチオール基を分子内に含有し、少なくとも１つのそれ以外の親水性基分子内に含有する化合物（Ａ）を含有することを特徴とするろ過性向上剤。化合物（Ａ）としては、式（１）で示される化合物が好ましい。
【化１】
［ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜２０の整数を表す。Ｂm+はｍ価のカチオンを表す。異なるｍ個の｛｝内の式で表される基において、ｎは同一でも異なっていてもよい。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離性向上剤に関する。さらに詳しくは、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド等の生理活性物質を含有する水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に使用する分離性向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーの発達により、タンパク質、核酸、ビタミン類、ホルモン、糖類等の生理活性物質を微生物を用いて製造することが盛んに行われている。微生物を用いた大量培養は、生理活性物質を大量に得ることができるため非常に有用であるが、製造コストが高く、各社さまざまな方法で改良をおこなっているのが現状である。製造コストのほとんどは、精製コストが占めるとも言われており、特に精製コストの低減が急務となっている。
【０００３】
例えば、大腸菌を用いて遺伝子組換えタンパク質を発現した場合、超音波等の物理的破砕、溶菌酵素による溶解及び界面活性剤による膜破壊等で、菌体から目的タンパク質を含む画分を抽出する。その後、膜分離及び／又はろ過で精製することで目的タンパク質の分離を行う。
【０００４】
しかしながら、この膜分離及びろ過工程で分離膜及びろ過膜が目詰まりする問題がある。膜が目詰まりすると、分離に時間を要するだけでなく、例えば限外ろ過の場合、必要以上の圧力がかかることによって膜が破れるといった問題がある。分離が不十分であった場合、混入した夾雑物によりタンパク質の安全性が著しく低下する等の危険性があるため、膜分離及びろ過工程は確実に迅速に行われる必要がある。
【０００５】
このような課題に対し、従来から膜が目詰まりする度に膜を取り替える方法がおこなわれてきた。また、コストを低減するために酸やアルカリで膜を洗浄して再生することが行われてきた。近年、膜分離及び／又はろ過をおこなう前にポリエチレングリコール水溶液で処理する方法（例えば特許文献１）が報告されている。
しかし、膜を取り替える方法では、時間がかかることと、大量の廃水が発生するので根本的な解決法にはなっておらず、ポリエチレングリコール水溶液で処理する方法は、効果が一時的なものであり持続性がない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２８９９２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に、目的物質を分離精製でき、膜及び／又はフィルターの透過速度を低下させることが極めて少ない分離性向上剤を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、タンパク質及び水を含んでなる生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に使用する分離性向上剤であって、少なくとも１つのチオール基を分子内に含有し、少なくとも１つのそれ以外の親水性基を分子内に含有する化合物（Ａ）を含有することを特徴とする分離性向上剤；その分離性向上剤の存在下で膜分離及び／又はろ過を行う工程を含む生理活性物質の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の分離性向上剤は、生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に、膜及び／又はフィルターの目詰まりを抑制することができ、膜及び／又はフィルターの透過速度が低下することが極めて少なく、目的の生理活性物質を容易に分離精製することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において分離性向上剤とは、膜及び／又はフィルターを使用して膜分離又はろ過をおこなう際に、被分離液が膜及び／又はフィルターを通過する際の透過速度が低下しないようにする目的で添加する薬剤のことを示す。分離性向上剤を使用することにより、膜分離及び／又はろ過中の膜及び／又はフィルターの目詰まりが低減され、十分な透過速度を確保することができる。その結果、例えば限外ろ過の場合、水及び低分子化合物を分離することができ、透析の場合、透析膜内の低分子化合物の濃度を低下させることができる。
【００１１】
ここで膜分離とは、膜を介した液／液界面で分離する操作を示し、このような方法の１例として透析が挙げられる。透析では、低分子の塩とタンパク質が溶解した水溶液から透析膜を通じて低分子の塩を分離することができる。ろ過とは、流動相をフィルター（例えば、膜）に通過させ、固相及び／又は半固相と、流動相とを分離する操作を示し、このような方法の１例として限外ろ過が挙げられる。限外ろ過では、低分子の塩とタンパク質が溶解した水溶液を限外ろ過膜に通じると、低分子の塩と水が通過しタンパク質だけを得ることができる。
【００１２】
ろ過に使用するフィルターとしては、ろ過膜が含まれる。
膜分離及びろ過に使用する膜としては、限外ろ過膜、精密ろ過膜、逆浸透膜、イオン交換膜及びゲルろ過膜等が挙げられ、市販されている膜を使用できる。
【００１３】
本発明の分離性向上剤は、タンパク質及び水を含む生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に使用するものであり、少なくとも１つのチオール基を分子内に含有し、少なくとも１つのそれ以外の親水性基を含有する化合物（Ａ）を含有する。
【００１４】
生理活性物質としては限定されないが、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン類及び糖類等が含まれる。
【００１５】
酵素としては、酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等が挙げられる。
【００１６】
組み換えタンパク質としては、タンパク製剤｛インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝及びワクチン（Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ワクチン等）等が挙げられる。
【００１７】
抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体等が挙げられる。
【００１８】
ペプチドとしては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド及びトリペプチド等が挙げられる。
【００１９】
アミノ酸としては、グルタミン酸、トリプトファン及びアラニン等が挙げられる。
【００２０】
核酸としては、イノシン酸等が挙げられる。
【００２１】
ビタミン類としては、ビタミンＫ等が挙げられる。
【００２２】
糖類としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びオリゴ糖等が挙げられる。
【００２３】
これらの生理活性物質のうち、生理活性維持の観点から、酵素及び組み換えタンパク質が好ましく、さらに好ましくは酵素である。
また、これらの生理活性物質は、２種以上を併用してもよい。
【００２４】
水としては、特に限定されない。水の電気伝導率（μＳ／ｃｍ；２５℃）は、安全性の観点から、０．０５５〜１が好ましく、さらに好ましくは０．０５６〜０．１、特に好ましくは０．０５７〜０．０８である。このような電気伝導率が小さい水としては、イオン交換水等が使用できる。
【００２５】
本発明において、化合物（Ａ）は少なくとも１つのチオール基を分子内に含有する。分子内のチオール基の数は、透過速度の低下抑制の観点から、１〜４が好ましく、さらに好ましくは１〜３、次にさらに好ましくは１〜２である。
【００２６】
本発明において、化合物（Ａ）は、さらに、少なくとも１つのチオール基以外の親水性基を分子内に含有する。
チオール基以外の親水性基としては、カルボキシル基、カルボキシレート基、硫酸基、サルフェート基、スルホン酸基、スルホネート基、リン酸基及びホスフェート基等が含まれる。親水性基の種類としては１種のみでもよく、２種以上でもよい。
カルボキシレート基、サルフェート基、スルホネート基及びホスフェート基には塩及びエステルが含まれる。塩としては無機塩基及び有機塩基との塩等が挙げられ、無機塩基及び有機塩基としては、後述の金属カチオン及び有機塩基カチオンが使用できる。エステルとしては脂肪族アルコールとのエステル等が挙げられる。
【００２７】
これらのうち、透過速度の低下抑制の観点で、カルボキシル基及びカルボキシレート基が好ましく、さらに好ましくはカルボキシレート基である。
【００２８】
分子内のチオール基以外の親水性基の数は、透過速度の低下抑制の観点から、１〜４が好ましく、さらに好ましくは１〜３、次にさらに好ましくは１〜２である。
【００２９】
本発明において、化合物（Ａ）は分子内にチオール基を少なくとも１つ有し、チオール基以外の親水性基を少なくとも１つ有する化合物であり、透過速度の低下抑制の観点から、チオール基を１つ有し、カルボキシレート基又はカルボキシル基を１つ有する化合物が好ましい。
【００３０】
化合物（Ａ）として、一般式（１）で示される化合物が挙げられ、透過速度の低下抑制の観点から、好ましい。
【化１】
【００３１】
式中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜２０の整数を表す。Ｂm+はｍ価のカチオンを表し、金属カチオン又は有機塩基カチオンが含まれる。異なるｍ個の｛｝内の式で表される基において、ｎは同一でも異なっていてもよい。
ｍは、透過速度の低下抑制の観点から、１〜４が好ましく、さらに好ましくは１〜３であり、特に好ましくは１〜２、最も好ましくは１である。
ｎは、透過速度の低下抑制の観点から、１〜８が好ましく、さらに好ましくは１〜３であり、最も好ましいのは１〜２である。
【００３２】
式（１）中の｛｝内の式で表されるアニオンは、チオール基を有する脂肪酸からプロトンを除いたアニオンであり、具体的には、メルカプトグリコール酸アニオン、メルカプトプロピオン酸アニオン、メルカプトブタン酸アニオン、メルカプトペンタン酸アニオン及びメルカプトヘキサン酸アニオンが挙げられる。透過速度の低下抑制の観点からメルカプトグリコール酸及びメルカプトプロピオン酸が好ましく、さらに好ましくはメルカプトプロピオン酸である。
【００３３】
これらのアニオンは１種であってもよいし、２種以上であってもよい。
【００３４】
金属カチオンとしては、アルカリ金属イオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属イオン（カルシウムイオン及びマグネシウムイオン等）等が挙げられる。
【００３５】
有機塩基カチオンとしては、１級アミンカチオン、２級アミンカチオン、３級アミンカチオン及び４級アンモニウムカチオンが挙げられる。
１級アミンカチオンとして具体的に、グアニジンカチオン、炭素数が１〜２２のモノアルキルアミンカチオン、炭素数が１〜１２のモノアルカノールアミンカチオン、アルギニンカチオン及びリシンカチオン等が挙げられる。
２級アミンカチオンとしては、炭素数が１〜２２のジアルキルアミンカチオン及び炭素数が１〜１２のジアルカノールアミンカチオン等が挙げられる。
３級アミンカチオンとしては、炭素数が１〜２２のトリアルキルアミンカチオン及び炭素数が１〜１２のトリアルカノールアミンカチオン等が挙げられる。
４級アンモニウムカチオンとしてはテトラメチルアンモニウムカチオン、テトラエチルアンモニウムカチオン及びテトラプロピルアンモニウムカチオン等が挙げられる。
【００３６】
これらのカチオンは単独で使用しても２種以上を併用しても良い。透過速度低下抑制の観点から、有機塩基カチオンが好ましく、さらに好ましくは１級アミンカチオン、次にさらに好ましくはグアニジンカチオンである。
一般式（１）で示される化合物としては、具体的には、メルカプトグリコール酸グアニジン塩、メルカプトプロピオン酸グアニジン塩、メルカプトブタン酸グアニジン塩、メルカプトペンタン酸グアニジン塩、メルカプトヘキサン酸グアニジン塩、メルカプトグリコール酸ナトリウム塩、メルカプトプロピオン酸ナトリウム塩、メルカプトブタン酸ナトリウム塩、メルカプトペンタン酸ナトリウム塩、メルカプトヘキサン酸ナトリウム塩、トリ（メルカプトグリコール酸）ジエチレントリアミン塩、トリ（メルカプトプロピオン酸）ジエチレントリアミン塩、トリ（メルカプトブタン酸）ジエチレントリアミン塩、トリ（メルカプトペンタン酸）ジエチレントリアミン塩、トリ（メルカプトヘキサン酸）ジエチレントリアミン塩、メルカプトプロパンスルホン酸グアニジン塩、メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム塩及びトリ（メルカプトプロパンスルホン酸）ジエチレントリアミン塩が挙げられる。
【００３７】
これらのうち、透過速度の低下抑制の観点から、メルカプトグリコール酸グアニジン塩及びメルカプトプロピオン酸グアニジン塩が好ましい。
【００３８】
本発明の分離性向上剤中の化合物（Ａ）の含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、分離性向上剤の重量に対して５０〜１００が好ましく、さらに好ましくは７５〜１００、次に更に好ましくは９０〜１００である。
【００３９】
本発明の分離性向上剤には、性能に悪影響を与えない範囲内で、化合物（Ａ）以外に界面活性剤、キレート剤、多価アルコール及び酵素等を含んでも良い。
【００４０】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤及び両イオン性界面活性剤が挙げられ、具体的にはＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ドデシル硫酸ナトリウム及びコールアミドプロピルプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）等の市販の界面活性剤が使用できる。含有量（重量％）は、化合物（Ａ）の重量に対し、透過速度の低下抑制の観点から、０〜１００が好ましく、さらに好ましくは０〜５０である。
【００４１】
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸等が挙げられる。含有量（重量％）は、化合物（Ａ）の重量に対し、透過速度の低下抑制の観点から、０〜３０が好ましく、さらに好ましくは０〜１０である。
【００４２】
多価アルコールとしては、グリセリン及びソルビトールが挙げられる。含有量（重量％）は、化合物（Ａ）の重量に対し、透過速度の低下抑制の観点から、０〜１００が好ましく、さらに好ましくは０〜３０である。
【００４３】
酵素としては、プロテアーゼ（トリプシン等）が挙げられる。含有量（重量％）は、化合物（Ａ）の重量に対し、透過速度の低下抑制の観点から、０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜５である。
【００４４】
本発明の分離性向上剤は、化合物（Ａ）以外に、必要により界面活性剤、キレート剤、多価アルコール及び酵素等を含有する場合、（Ａ）とそれ以外の成分を混合することで容易に製造できる。
【００４５】
本発明の別の実施態様は、上記分離性向上剤の存在下で生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する工程を含む生理活性物質の製造方法である。
【００４６】
本発明の分離性向上剤の存在下で、生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する工程を含む生理活性物質の製造方法について１例を以下に示す。
（１）培養した遺伝子組換え大腸菌を集菌後、超音波ホモジナイザーを用いて破砕する。
（２）遠心分離機で菌体破砕物を分離し、生理活性物質が溶解している上清を回収する。
（３）上清に分離性向上剤を加えて均一に混ぜる。
（４）透析チューブに（３）の水溶液を加え、透析を行う。
（５）透析チューブ内の水溶液をゲルろ過カラムにかけ、目的の生理活性物質が溶解した 画分を分取する。
【００４７】
分離性向上剤の使用量は、透過速度の低下抑制の観点から、生理活性物質の重量に対する分離性向上剤中の化合物（Ａ）の重量比が０．００１〜１００となるようにするのが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１０である。
【００４８】
本発明の分離性向上剤は、必要に応じて水で希釈して使用しても良い。水で希釈する場合、水の使用量は、分離性向上剤中の化合物（Ａ）の重量に基づき、５〜１０，０００（重量比）であり、ハンドリング性の観点から５〜１００が好ましい。水はイオン交換水が使用できる。
【００４９】
本発明の分離性向上剤は、その存在下で膜分離及び／又はろ過を行えばよく、膜分離及び／又はろ過を行う工程の直前に分離性向上剤を生理活性物質水溶液に加えても、膜分離及び／又はろ過の工程よりも前の工程で加えても、あるいは膜分離及び／又はろ過を行う工程で加えても良い。
【００５０】
本発明の分離性向上剤の存在下で膜分離及び／又はろ過を行う際、透過速度の低下抑制の観点から、４〜１０℃で行うことが好ましい。
【００５１】
本発明の生理活性物質の製造方法は、膜分離及び／又はろ過工程での膜詰まりが少ないので、容易に目的物質を精製することができる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特記しない限り部は重量部を意味し、％は重量％を意味する。
【００５３】
＜実施例１＞
（メルカプトプロピオン酸グアニジン塩の合成）
メルカプトプロピオン酸５．３ｇを２００ｍＬのビーカーに入れ、イオン水１００ｇを加えて溶解させ、炭酸グアニジン３．９ｇを少量ずつ加え、マグネチック攪拌子を用いて４０℃で１０分間攪拌した。その後、エバポレーターで乾固させて、メルカプトプロピオン酸グアニジン塩（Ａ−１）を得た。
【００５４】
＜実施例２＞
（メルカプトプロピオン酸ナトリウム塩の合成）
実施例１において、炭酸グアニジン３．９ｇを水酸化ナトリウム１．８ｇに変更する以外は実施例１と同様におこない、メルカプトプロピオン酸ナトリウム塩（Ａ−２）を得た。
【００５５】
＜実施例３＞
（メルカプトグリコール酸グアニジン塩の合成）
実施例１において、メルカプトプロピオン酸５．３ｇをメルカプトグリコール酸４．７ｇに変更する以外は実施例１と同様におこない、メルカプトグリコール酸グアニジン塩（Ａ−３）を得た。
【００５６】
＜実施例４＞
（トリス−（メルカプトプロピオン酸）ジエチレントリアミン塩の合成）
実施例１において、メルカプトプロピオン酸５．３ｇをメルカプトグリコール酸４．７ｇに変更し、炭酸グアニジン３．９ｇをジエチレントリアミン１．９ｇに変更する以外は実施例１と同様におこない、トリス−（メルカプトプロピオン酸）ジエチレントリアミン塩（Ａ−４）を得た。
【００５７】
＜実施例５＞
（メルカプトプロパンスルホン酸グアニジン塩の合成）
実施例１において、メルカプトプロピオン酸５．３ｇをメルカプトプロパンスルホン酸７．６ｇに変更する以外は実施例１と同様におこない、メルカプトプロパンスルホン酸グアニジン塩（Ａ−５）を得た。
【００５８】
＜実施例６＞
大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ−２１株）を培養し、室温で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分）をおこない上清を捨て、集菌した。大腸菌のウェットセル５ｇに対し、バッファー（５０ｍＭＰＢＳ、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶液）２０ｇを加えて再懸濁させた。
大腸菌懸濁液を２００ｍｌのガラス製ビーカーに移し、氷水で冷却しながら超音波ホモジナイザー（１３０Ｗ、１０分）で菌体を破砕した。その後、４℃で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、２０分）し、上清を回収した。
上記大腸菌破砕液上清１ｇ（タンパク質含量１ｍｇ）に対し、実施例１で製造した化合物（Ａ−１）を０．１ｍｇ添加し、マグネチックスターラーで撹拌し均一混合し、測定用生理活性物質水溶液を得た。
【００５９】
＜実施例７〜１０＞
実施例６において、（Ａ−１）の代わりに（Ａ−２）〜（Ａ−５）を使用する以外は、実施例６と同様におこなった。
【００６０】
＜実施例１１＞
実施例６において、（Ａ−１）の添加量を０．００１ｍｇに変更する以外は実施例６と同様におこなった。
【００６１】
＜実施例１２＞
実施例６において、（Ａ−１）の添加量を１００ｍｇに変更する以外は実施例６と同様におこなった。
【００６２】
＜比較例１＞
実施例６において、（Ａ−１）をポリエチレングリコール（和光純薬工業社製、ポリエチレングリコール４０００）０．１ｍｇに変更する以外は実施例６と同様におこなった。
【００６３】
＜比較例２＞
比較例１において、ポリエチレングリコールの添加量を１０ｍｇに変更する以外は比較例１と同様におこなった。
【００６４】
＜比較例３＞
添加剤を何も加えないこと以外は比較例１と同様におこなった。
【００６５】
実施例６〜１２及び比較例１〜３で得られた測定用生理活性物質水溶液を使用して、下記評価方法により透析における透過速度及び限外ろ過における透過速度を評価した。結果を表１に示す。
【００６６】
［透析における透過速度］
透析よるナトリウムイオンの濃度低下の度合いを下記の方法で測定した。
上記の測定用生理活性物質水溶液１ｇを透析チューブ（和光純薬工業社製、商品名：ワコーダイアライシス サイズ２０）に入れ、１００ｍｌのイオン水が入った２００ｍｌビーカー内で透析をおこなった。１時間経過後の透析チューブ内の生理活性物質水溶液中のナトリウムイオン濃度をＩＣＰ発光分析装置（島津製作所社製、ＵＬＴＩＭＡ２）で測定した。
また、透析する前の生理活性物質水溶液中のナトリウムイオン濃度を同様に測定した。
【００６７】
透析における透過速度の評価を下記式で得られた数値を使用して下記基準に従っておこなった。
【００６８】
【数１】
【００６９】
５： ０．９５以上
４： ０．９０以上〜０．９５未満
３： ０．８０以上〜０．９０未満
２： ０．７０以上〜０．８０未満
１： ０．７０未満
【００７０】
［限外ろ過における透過速度］
限外ろ過よるナトリウムイオンの濃度低下の度合いを下記の方法で測定した。
上記の測定用生理活性物質水溶液５ｇを４℃に冷却し、限外ろ過膜｛日本ジェネティクス社製、商品名：スペクトラポア１（分画分子量６０００〜８０００）｝に通し、５倍濃縮した。５倍に濃縮できた時点で液を回収した。５倍濃縮後の生理活性物質水溶液中のナトリウムイオン濃度をＩＣＰ発光分析装置（島津製作所社製、ＵＬＴＩＭＡ２）で測定した。
また、限外ろ過で濃縮する前の生理活性物質水溶液中のナトリウムイオン濃度を同様に測定した。
【００７１】
限外ろ過における透過速度の評価を下記式で得られた数値を使用して下記基準に従っておこなった。
【００７２】
【数２】
【００７３】
５：０．９９以上
４：０．９８以上〜０．９９未満
３：０．９５以上〜０．９８未満
２：０．９０以上〜０．９５未満
１：０．９０未満
【００７４】
【表１】
【００７５】
表１より、従来提案されているポリエチレングリコールは透析及び限外ろ過において、透過速度の低下を抑制できず、透過速度が小さかった。一方で、本発明の分離性向上剤を添加すると、透析及び限外ろ過のどちらの場合でも透過速度が低下せず、透過速度が大きかった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の分離性向上剤は、膜分離及び／又はろ過における膜の目詰りを起こしにくく、透過速度の低下を抑制することができる。そのため、生理活性物質の発酵生産等において、分離精製工程に特に好適に使用することができる。
また、乳製品等の生産工場でのろ過フィルターを洗浄する洗浄剤としても使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離性向上剤に関する。さらに詳しくは、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド等の生理活性物質を含有する水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に使用する分離性向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーの発達により、タンパク質、核酸、ビタミン類、ホルモン、糖類等の生理活性物質を微生物を用いて製造することが盛んに行われている。微生物を用いた大量培養は、生理活性物質を大量に得ることができるため非常に有用であるが、製造コストが高く、各社さまざまな方法で改良をおこなっているのが現状である。製造コストのほとんどは、精製コストが占めるとも言われており、特に精製コストの低減が急務となっている。
【０００３】
例えば、大腸菌を用いて遺伝子組換えタンパク質を発現した場合、超音波等の物理的破砕、溶菌酵素による溶解及び界面活性剤による膜破壊等で、菌体から目的タンパク質を含む画分を抽出する。その後、膜分離及び／又はろ過で精製することで目的タンパク質の分離を行う。
【０００４】
しかしながら、この膜分離及びろ過工程で分離膜及びろ過膜が目詰まりする問題がある。膜が目詰まりすると、分離に時間を要するだけでなく、例えば限外ろ過の場合、必要以上の圧力がかかることによって膜が破れるといった問題がある。分離が不十分であった場合、混入した夾雑物によりタンパク質の安全性が著しく低下する等の危険性があるため、膜分離及びろ過工程は確実に迅速に行われる必要がある。
【０００５】
このような課題に対し、従来から膜が目詰まりする度に膜を取り替える方法がおこなわれてきた。また、コストを低減するために酸やアルカリで膜を洗浄して再生することが行われてきた。近年、膜分離及び／又はろ過をおこなう前にポリエチレングリコール水溶液で処理する方法（例えば特許文献１）が報告されている。
しかし、膜を取り替える方法では、時間がかかることと、大量の廃水が発生するので根本的な解決法にはなっておらず、ポリエチレングリコール水溶液で処理する方法は、効果が一時的なものであり持続性がない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２８９９２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に、目的物質を分離精製でき、膜及び／又はフィルターの透過速度を低下させることが極めて少ない分離性向上剤を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、タンパク質及び水を含んでなる生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に使用する分離性向上剤であって、少なくとも１つのチオール基を分子内に含有し、少なくとも１つのそれ以外の親水性基を分子内に含有する化合物（Ａ）を含有することを特徴とする分離性向上剤；その分離性向上剤の存在下で膜分離及び／又はろ過を行う工程を含む生理活性物質の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の分離性向上剤は、生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に、膜及び／又はフィルターの目詰まりを抑制することができ、膜及び／又はフィルターの透過速度が低下することが極めて少なく、目的の生理活性物質を容易に分離精製することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において分離性向上剤とは、膜及び／又はフィルターを使用して膜分離又はろ過をおこなう際に、被分離液が膜及び／又はフィルターを通過する際の透過速度が低下しないようにする目的で添加する薬剤のことを示す。分離性向上剤を使用することにより、膜分離及び／又はろ過中の膜及び／又はフィルターの目詰まりが低減され、十分な透過速度を確保することができる。その結果、例えば限外ろ過の場合、水及び低分子化合物を分離することができ、透析の場合、透析膜内の低分子化合物の濃度を低下させることができる。
【００１１】
ここで膜分離とは、膜を介した液／液界面で分離する操作を示し、このような方法の１例として透析が挙げられる。透析では、低分子の塩とタンパク質が溶解した水溶液から透析膜を通じて低分子の塩を分離することができる。ろ過とは、流動相をフィルター（例えば、膜）に通過させ、固相及び／又は半固相と、流動相とを分離する操作を示し、このような方法の１例として限外ろ過が挙げられる。限外ろ過では、低分子の塩とタンパク質が溶解した水溶液を限外ろ過膜に通じると、低分子の塩と水が通過しタンパク質だけを得ることができる。
【００１２】
ろ過に使用するフィルターとしては、ろ過膜が含まれる。
膜分離及びろ過に使用する膜としては、限外ろ過膜、精密ろ過膜、逆浸透膜、イオン交換膜及びゲルろ過膜等が挙げられ、市販されている膜を使用できる。
【００１３】
本発明の分離性向上剤は、タンパク質及び水を含む生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に使用するものであり、少なくとも１つのチオール基を分子内に含有し、少なくとも１つのそれ以外の親水性基を含有する化合物（Ａ）を含有する。
【００１４】
生理活性物質としては限定されないが、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン類及び糖類等が含まれる。
【００１５】
酵素としては、酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等が挙げられる。
【００１６】
組み換えタンパク質としては、タンパク製剤｛インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝及びワクチン（Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ワクチン等）等が挙げられる。
【００１７】
抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体等が挙げられる。
【００１８】
ペプチドとしては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド及びトリペプチド等が挙げられる。
【００１９】
アミノ酸としては、グルタミン酸、トリプトファン及びアラニン等が挙げられる。
【００２０】
核酸としては、イノシン酸等が挙げられる。
【００２１】
ビタミン類としては、ビタミンＫ等が挙げられる。
【００２２】
糖類としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びオリゴ糖等が挙げられる。
【００２３】
これらの生理活性物質のうち、生理活性維持の観点から、酵素及び組み換えタンパク質が好ましく、さらに好ましくは酵素である。
また、これらの生理活性物質は、２種以上を併用してもよい。
【００２４】
水としては、特に限定されない。水の電気伝導率（μＳ／ｃｍ；２５℃）は、安全性の観点から、０．０５５〜１が好ましく、さらに好ましくは０．０５６〜０．１、特に好ましくは０．０５７〜０．０８である。このような電気伝導率が小さい水としては、イオン交換水等が使用できる。
【００２５】
本発明において、化合物（Ａ）は少なくとも１つのチオール基を分子内に含有する。分子内のチオール基の数は、透過速度の低下抑制の観点から、１〜４が好ましく、さらに好ましくは１〜３、次にさらに好ましくは１〜２である。
【００２６】
本発明において、化合物（Ａ）は、さらに、少なくとも１つのチオール基以外の親水性基を分子内に含有する。
チオール基以外の親水性基としては、カルボキシル基、カルボキシレート基、硫酸基、サルフェート基、スルホン酸基、スルホネート基、リン酸基及びホスフェート基等が含まれる。親水性基の種類としては１種のみでもよく、２種以上でもよい。
カルボキシレート基、サルフェート基、スルホネート基及びホスフェート基には塩及びエステルが含まれる。塩としては無機塩基及び有機塩基との塩等が挙げられ、無機塩基及び有機塩基としては、後述の金属カチオン及び有機塩基カチオンが使用できる。エステルとしては脂肪族アルコールとのエステル等が挙げられる。
【００２７】
これらのうち、透過速度の低下抑制の観点で、カルボキシル基及びカルボキシレート基が好ましく、さらに好ましくはカルボキシレート基である。
【００２８】
分子内のチオール基以外の親水性基の数は、透過速度の低下抑制の観点から、１〜４が好ましく、さらに好ましくは１〜３、次にさらに好ましくは１〜２である。
【００２９】
本発明において、化合物（Ａ）は分子内にチオール基を少なくとも１つ有し、チオール基以外の親水性基を少なくとも１つ有する化合物であり、透過速度の低下抑制の観点から、チオール基を１つ有し、カルボキシレート基又はカルボキシル基を１つ有する化合物が好ましい。
【００３０】
化合物（Ａ）として、一般式（１）で示される化合物が挙げられ、透過速度の低下抑制の観点から、好ましい。
【化１】
【００３１】
式中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜２０の整数を表す。Ｂm+はｍ価のカチオンを表し、金属カチオン又は有機塩基カチオンが含まれる。異なるｍ個の｛｝内の式で表される基において、ｎは同一でも異なっていてもよい。
ｍは、透過速度の低下抑制の観点から、１〜４が好ましく、さらに好ましくは１〜３であり、特に好ましくは１〜２、最も好ましくは１である。
ｎは、透過速度の低下抑制の観点から、１〜８が好ましく、さらに好ましくは１〜３であり、最も好ましいのは１〜２である。
【００３２】
式（１）中の｛｝内の式で表されるアニオンは、チオール基を有する脂肪酸からプロトンを除いたアニオンであり、具体的には、メルカプトグリコール酸アニオン、メルカプトプロピオン酸アニオン、メルカプトブタン酸アニオン、メルカプトペンタン酸アニオン及びメルカプトヘキサン酸アニオンが挙げられる。透過速度の低下抑制の観点からメルカプトグリコール酸及びメルカプトプロピオン酸が好ましく、さらに好ましくはメルカプトプロピオン酸である。
【００３３】
これらのアニオンは１種であってもよいし、２種以上であってもよい。
【００３４】
金属カチオンとしては、アルカリ金属イオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属イオン（カルシウムイオン及びマグネシウムイオン等）等が挙げられる。
【００３５】
有機塩基カチオンとしては、１級アミンカチオン、２級アミンカチオン、３級アミンカチオン及び４級アンモニウムカチオンが挙げられる。
１級アミンカチオンとして具体的に、グアニジンカチオン、炭素数が１〜２２のモノアルキルアミンカチオン、炭素数が１〜１２のモノアルカノールアミンカチオン、アルギニンカチオン及びリシンカチオン等が挙げられる。
２級アミンカチオンとしては、炭素数が１〜２２のジアルキルアミンカチオン及び炭素数が１〜１２のジアルカノールアミンカチオン等が挙げられる。
３級アミンカチオンとしては、炭素数が１〜２２のトリアルキルアミンカチオン及び炭素数が１〜１２のトリアルカノールアミンカチオン等が挙げられる。
４級アンモニウムカチオンとしてはテトラメチルアンモニウムカチオン、テトラエチルアンモニウムカチオン及びテトラプロピルアンモニウムカチオン等が挙げられる。
【００３６】
これらのカチオンは単独で使用しても２種以上を併用しても良い。透過速度低下抑制の観点から、有機塩基カチオンが好ましく、さらに好ましくは１級アミンカチオン、次にさらに好ましくはグアニジンカチオンである。
一般式（１）で示される化合物としては、具体的には、メルカプトグリコール酸グアニジン塩、メルカプトプロピオン酸グアニジン塩、メルカプトブタン酸グアニジン塩、メルカプトペンタン酸グアニジン塩、メルカプトヘキサン酸グアニジン塩、メルカプトグリコール酸ナトリウム塩、メルカプトプロピオン酸ナトリウム塩、メルカプトブタン酸ナトリウム塩、メルカプトペンタン酸ナトリウム塩、メルカプトヘキサン酸ナトリウム塩、トリ（メルカプトグリコール酸）ジエチレントリアミン塩、トリ（メルカプトプロピオン酸）ジエチレントリアミン塩、トリ（メルカプトブタン酸）ジエチレントリアミン塩、トリ（メルカプトペンタン酸）ジエチレントリアミン塩、トリ（メルカプトヘキサン酸）ジエチレントリアミン塩、メルカプトプロパンスルホン酸グアニジン塩、メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム塩及びトリ（メルカプトプロパンスルホン酸）ジエチレントリアミン塩が挙げられる。
【００３７】
これらのうち、透過速度の低下抑制の観点から、メルカプトグリコール酸グアニジン塩及びメルカプトプロピオン酸グアニジン塩が好ましい。
【００３８】
本発明の分離性向上剤中の化合物（Ａ）の含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、分離性向上剤の重量に対して５０〜１００が好ましく、さらに好ましくは７５〜１００、次に更に好ましくは９０〜１００である。
【００３９】
本発明の分離性向上剤には、性能に悪影響を与えない範囲内で、化合物（Ａ）以外に界面活性剤、キレート剤、多価アルコール及び酵素等を含んでも良い。
【００４０】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤及び両イオン性界面活性剤が挙げられ、具体的にはＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ドデシル硫酸ナトリウム及びコールアミドプロピルプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）等の市販の界面活性剤が使用できる。含有量（重量％）は、化合物（Ａ）の重量に対し、透過速度の低下抑制の観点から、０〜１００が好ましく、さらに好ましくは０〜５０である。
【００４１】
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸等が挙げられる。含有量（重量％）は、化合物（Ａ）の重量に対し、透過速度の低下抑制の観点から、０〜３０が好ましく、さらに好ましくは０〜１０である。
【００４２】
多価アルコールとしては、グリセリン及びソルビトールが挙げられる。含有量（重量％）は、化合物（Ａ）の重量に対し、透過速度の低下抑制の観点から、０〜１００が好ましく、さらに好ましくは０〜３０である。
【００４３】
酵素としては、プロテアーゼ（トリプシン等）が挙げられる。含有量（重量％）は、化合物（Ａ）の重量に対し、透過速度の低下抑制の観点から、０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜５である。
【００４４】
本発明の分離性向上剤は、化合物（Ａ）以外に、必要により界面活性剤、キレート剤、多価アルコール及び酵素等を含有する場合、（Ａ）とそれ以外の成分を混合することで容易に製造できる。
【００４５】
本発明の別の実施態様は、上記分離性向上剤の存在下で生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する工程を含む生理活性物質の製造方法である。
【００４６】
本発明の分離性向上剤の存在下で、生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する工程を含む生理活性物質の製造方法について１例を以下に示す。
（１）培養した遺伝子組換え大腸菌を集菌後、超音波ホモジナイザーを用いて破砕する。
（２）遠心分離機で菌体破砕物を分離し、生理活性物質が溶解している上清を回収する。
（３）上清に分離性向上剤を加えて均一に混ぜる。
（４）透析チューブに（３）の水溶液を加え、透析を行う。
（５）透析チューブ内の水溶液をゲルろ過カラムにかけ、目的の生理活性物質が溶解した 画分を分取する。
【００４７】
分離性向上剤の使用量は、透過速度の低下抑制の観点から、生理活性物質の重量に対する分離性向上剤中の化合物（Ａ）の重量比が０．００１〜１００となるようにするのが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１０である。
【００４８】
本発明の分離性向上剤は、必要に応じて水で希釈して使用しても良い。水で希釈する場合、水の使用量は、分離性向上剤中の化合物（Ａ）の重量に基づき、５〜１０，０００（重量比）であり、ハンドリング性の観点から５〜１００が好ましい。水はイオン交換水が使用できる。
【００４９】
本発明の分離性向上剤は、その存在下で膜分離及び／又はろ過を行えばよく、膜分離及び／又はろ過を行う工程の直前に分離性向上剤を生理活性物質水溶液に加えても、膜分離及び／又はろ過の工程よりも前の工程で加えても、あるいは膜分離及び／又はろ過を行う工程で加えても良い。
【００５０】
本発明の分離性向上剤の存在下で膜分離及び／又はろ過を行う際、透過速度の低下抑制の観点から、４〜１０℃で行うことが好ましい。
【００５１】
本発明の生理活性物質の製造方法は、膜分離及び／又はろ過工程での膜詰まりが少ないので、容易に目的物質を精製することができる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特記しない限り部は重量部を意味し、％は重量％を意味する。
【００５３】
＜実施例１＞
（メルカプトプロピオン酸グアニジン塩の合成）
メルカプトプロピオン酸５．３ｇを２００ｍＬのビーカーに入れ、イオン水１００ｇを加えて溶解させ、炭酸グアニジン３．９ｇを少量ずつ加え、マグネチック攪拌子を用いて４０℃で１０分間攪拌した。その後、エバポレーターで乾固させて、メルカプトプロピオン酸グアニジン塩（Ａ−１）を得た。
【００５４】
＜実施例２＞
（メルカプトプロピオン酸ナトリウム塩の合成）
実施例１において、炭酸グアニジン３．９ｇを水酸化ナトリウム１．８ｇに変更する以外は実施例１と同様におこない、メルカプトプロピオン酸ナトリウム塩（Ａ−２）を得た。
【００５５】
＜実施例３＞
（メルカプトグリコール酸グアニジン塩の合成）
実施例１において、メルカプトプロピオン酸５．３ｇをメルカプトグリコール酸４．７ｇに変更する以外は実施例１と同様におこない、メルカプトグリコール酸グアニジン塩（Ａ−３）を得た。
【００５６】
＜実施例４＞
（トリス−（メルカプトプロピオン酸）ジエチレントリアミン塩の合成）
実施例１において、メルカプトプロピオン酸５．３ｇをメルカプトグリコール酸４．７ｇに変更し、炭酸グアニジン３．９ｇをジエチレントリアミン１．９ｇに変更する以外は実施例１と同様におこない、トリス−（メルカプトプロピオン酸）ジエチレントリアミン塩（Ａ−４）を得た。
【００５７】
＜実施例５＞
（メルカプトプロパンスルホン酸グアニジン塩の合成）
実施例１において、メルカプトプロピオン酸５．３ｇをメルカプトプロパンスルホン酸７．６ｇに変更する以外は実施例１と同様におこない、メルカプトプロパンスルホン酸グアニジン塩（Ａ−５）を得た。
【００５８】
＜実施例６＞
大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ−２１株）を培養し、室温で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分）をおこない上清を捨て、集菌した。大腸菌のウェットセル５ｇに対し、バッファー（５０ｍＭＰＢＳ、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶液）２０ｇを加えて再懸濁させた。
大腸菌懸濁液を２００ｍｌのガラス製ビーカーに移し、氷水で冷却しながら超音波ホモジナイザー（１３０Ｗ、１０分）で菌体を破砕した。その後、４℃で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、２０分）し、上清を回収した。
上記大腸菌破砕液上清１ｇ（タンパク質含量１ｍｇ）に対し、実施例１で製造した化合物（Ａ−１）を０．１ｍｇ添加し、マグネチックスターラーで撹拌し均一混合し、測定用生理活性物質水溶液を得た。
【００５９】
＜実施例７〜１０＞
実施例６において、（Ａ−１）の代わりに（Ａ−２）〜（Ａ−５）を使用する以外は、実施例６と同様におこなった。
【００６０】
＜実施例１１＞
実施例６において、（Ａ−１）の添加量を０．００１ｍｇに変更する以外は実施例６と同様におこなった。
【００６１】
＜実施例１２＞
実施例６において、（Ａ−１）の添加量を１００ｍｇに変更する以外は実施例６と同様におこなった。
【００６２】
＜比較例１＞
実施例６において、（Ａ−１）をポリエチレングリコール（和光純薬工業社製、ポリエチレングリコール４０００）０．１ｍｇに変更する以外は実施例６と同様におこなった。
【００６３】
＜比較例２＞
比較例１において、ポリエチレングリコールの添加量を１０ｍｇに変更する以外は比較例１と同様におこなった。
【００６４】
＜比較例３＞
添加剤を何も加えないこと以外は比較例１と同様におこなった。
【００６５】
実施例６〜１２及び比較例１〜３で得られた測定用生理活性物質水溶液を使用して、下記評価方法により透析における透過速度及び限外ろ過における透過速度を評価した。結果を表１に示す。
【００６６】
［透析における透過速度］
透析よるナトリウムイオンの濃度低下の度合いを下記の方法で測定した。
上記の測定用生理活性物質水溶液１ｇを透析チューブ（和光純薬工業社製、商品名：ワコーダイアライシス サイズ２０）に入れ、１００ｍｌのイオン水が入った２００ｍｌビーカー内で透析をおこなった。１時間経過後の透析チューブ内の生理活性物質水溶液中のナトリウムイオン濃度をＩＣＰ発光分析装置（島津製作所社製、ＵＬＴＩＭＡ２）で測定した。
また、透析する前の生理活性物質水溶液中のナトリウムイオン濃度を同様に測定した。
【００６７】
透析における透過速度の評価を下記式で得られた数値を使用して下記基準に従っておこなった。
【００６８】
【数１】
【００６９】
５： ０．９５以上
４： ０．９０以上〜０．９５未満
３： ０．８０以上〜０．９０未満
２： ０．７０以上〜０．８０未満
１： ０．７０未満
【００７０】
［限外ろ過における透過速度］
限外ろ過よるナトリウムイオンの濃度低下の度合いを下記の方法で測定した。
上記の測定用生理活性物質水溶液５ｇを４℃に冷却し、限外ろ過膜｛日本ジェネティクス社製、商品名：スペクトラポア１（分画分子量６０００〜８０００）｝に通し、５倍濃縮した。５倍に濃縮できた時点で液を回収した。５倍濃縮後の生理活性物質水溶液中のナトリウムイオン濃度をＩＣＰ発光分析装置（島津製作所社製、ＵＬＴＩＭＡ２）で測定した。
また、限外ろ過で濃縮する前の生理活性物質水溶液中のナトリウムイオン濃度を同様に測定した。
【００７１】
限外ろ過における透過速度の評価を下記式で得られた数値を使用して下記基準に従っておこなった。
【００７２】
【数２】
【００７３】
５：０．９９以上
４：０．９８以上〜０．９９未満
３：０．９５以上〜０．９８未満
２：０．９０以上〜０．９５未満
１：０．９０未満
【００７４】
【表１】
【００７５】
表１より、従来提案されているポリエチレングリコールは透析及び限外ろ過において、透過速度の低下を抑制できず、透過速度が小さかった。一方で、本発明の分離性向上剤を添加すると、透析及び限外ろ過のどちらの場合でも透過速度が低下せず、透過速度が大きかった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の分離性向上剤は、膜分離及び／又はろ過における膜の目詰りを起こしにくく、透過速度の低下を抑制することができる。そのため、生理活性物質の発酵生産等において、分離精製工程に特に好適に使用することができる。
また、乳製品等の生産工場でのろ過フィルターを洗浄する洗浄剤としても使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質及び水を含んでなる生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に使用する分離性向上剤であって、少なくとも１つのチオール基を分子内に含有し、少なくとも１つのそれ以外の親水性基を分子内に含有する化合物（Ａ）を含有することを特徴とする分離性向上剤。
【請求項２】
親水性基がカルボキシル基及び／又はカルボキシレート基である請求項１に記載の分離性向上剤。
【請求項３】
化合物（Ａ）が下記一般式（１）で表される化合物である請求項１に記載の分離性向上剤。
【化１】
［ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜２０の整数を表す。Ｂm+はｍ価のカチオンを表す。異なるｍ個の｛｝内の式で表される基において、ｎは同一でも異なっていてもよい。］
【請求項４】
Ｂm+がグアニジンカチオンである請求項３に記載の分離性向上剤。
【請求項５】
タンパク質及び水を含んでなる生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に、請求項１〜４のいずれかに記載の分離性向上剤の存在下で膜分離及び／又はろ過を行う工程を含むことを特徴とする生理活性物質の製造方法。
【請求項１】
タンパク質及び水を含んでなる生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に使用する分離性向上剤であって、少なくとも１つのチオール基を分子内に含有し、少なくとも１つのそれ以外の親水性基を分子内に含有する化合物（Ａ）を含有することを特徴とする分離性向上剤。
【請求項２】
親水性基がカルボキシル基及び／又はカルボキシレート基である請求項１に記載の分離性向上剤。
【請求項３】
化合物（Ａ）が下記一般式（１）で表される化合物である請求項１に記載の分離性向上剤。
【化１】
［ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜２０の整数を表す。Ｂm+はｍ価のカチオンを表す。異なるｍ個の｛｝内の式で表される基において、ｎは同一でも異なっていてもよい。］
【請求項４】
Ｂm+がグアニジンカチオンである請求項３に記載の分離性向上剤。
【請求項５】
タンパク質及び水を含んでなる生理活性物質水溶液を膜分離及び／又はろ過する際に、請求項１〜４のいずれかに記載の分離性向上剤の存在下で膜分離及び／又はろ過を行う工程を含むことを特徴とする生理活性物質の製造方法。
【公開番号】特開２００９−２６３２９６（Ｐ２００９−２６３２９６Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１６６９４（Ｐ２００８−１１６６９４）
【出願日】平成２０年４月２８日（２００８．４．２８）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２８日（２００８．４．２８）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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